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JPH0581600B1 - - Google Patents

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Publication number
JPH0581600B1
JPH0581600B1 JP1500565A JP50056589A JPH0581600B1 JP H0581600 B1 JPH0581600 B1 JP H0581600B1 JP 1500565 A JP1500565 A JP 1500565A JP 50056589 A JP50056589 A JP 50056589A JP H0581600 B1 JPH0581600 B1 JP H0581600B1
Authority
JP
Japan
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hcv
cdna
sequence
clone
polypeptide
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
JP1500565A
Other languages
English (en)
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JPH02500880A (ja
Inventor
Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27557988&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0581600(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of JPH02500880A publication Critical patent/JPH02500880A/ja
Publication of JPH0581600B1 publication Critical patent/JPH0581600B1/ja
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Description

明細書 技術分野 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
（NANBV）伝染の流行を処置するための材料お
よび方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、
診断用DNA断片、診断用タンパク、診断用抗体、
そしてNANB型肝炎の病因因子（すなわち、Ｃ
型肝炎ウイルス）に対する防御抗原および防御抗
体に関する。 本出願で引用される文献 Barrら（1986），Biotechniques４：428. Botstein（1979），Gene８：17. Brinton，M.A.（1986），THE VIRUSES：
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DNA，Part E. Wu（1987），Methods in Euzymology
Vol.155，RECOMBINANT DNA，Part F. Zoller（1982），Nucleic Acids Res.10：6487. 引用される特許 米国特許第4341761号 米国特許第4399121号 米国特許第4427783号 米国特許第4444887号 米国特許第4466917号 米国特許第4472500号 米国特許第4491632号 米国特許第4493890号 背景技術 非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）は、伝染性の疾
患であるか、あるいはウイルスが誘発すると考え
られている疾患群およびウイルスに関連する他の
形態の肝臓疾患とは区別し得る疾患群に属する。
これらの疾患には、周知の肝炎ウイルス（すなわ
ち、Ａ型肝炎ウイルス（HAV），Ｂ型肝炎ウイ
ルス（HBV），Δ型肝炎ウイルス（HDV）、およ
びサイトメガロウイルス（CMV）またはエプス
タイン−バーウイルス（EBV））により引き起こ
される疾患が包含される。NANBHは輸血した
個体において始めて同定された。ヒトからチンパ
ンジーへの伝染およびチンパンジー間における一
連の継代は、NANBHが１種または複数種の伝
染性感染因子いよるという証拠を与える。しかし
ながら、NANBHの原因である伝染性因子はま
だ同定されておらず、疾患の原因となる因子の数
も知られていない。 疫学的証拠によると、NANBHには次の３つ
の型があると示唆される：つまり、飲料水媒介の
流行型；血液または注射針に関連する型；および
散発（集団獲得（community acquired））型の
３つの型である。しかしながら、NANBHの原
因となり得る因子の数は知られていない。 NANBHの臨床における診断および同定は、
他のウイルスマーカーを排除することにより、ま
ず行われてきた。推定されるNANBV抗原およ
び抗体を検出するために用いられる方法には、寒
天ゲル拡散法、対向免疫電気泳動法、免疫蛍光顕
微鏡法、免疫電子顕微鏡法、放射性免疫検定法、
および酵素結合免疫吸着検定法などがある。しか
しながら、これらの検定法はいずれも、
NANBHに関する診断検査として用いるのに充
分感度が高く、特異的であり、かつ再現性がある
とは示されていない。 これまで、NANBH因子に関連する抗原抗体
系の同一性または特異性に関しては、明確ではな
く、しかも一致することはなかつた。これは、そ
の少なくとも一部は、以下のことが原因である：
つまり、個体におけるHBVの前感染または
NANBVとの同時感染；HBVに関連する溶解性
の粒子状抗原の周知の複雑さ；および肝臓細胞の
ゲノムへのHBV DNAの組込みである。さらに、
NANBHが１種より多くの病原体により引き起
こされる可能性、およびNANBHが誤診されて
きた可能性がある。また、血漿学的な検定法によ
り、NANBH患者の血清中に何が検出されるか
は不明であつた。寒天ゲル拡散法および対向免疫
電気泳動法によれば、血清検体間に時々生じる自
動免疫反応または非特異的なタンパク相互作用は
検出されるが、特異的なNANBV抗原−抗体反
応は示されないと考えられてきた。免疫蛍光法、
酵素結合免疫吸着検定法、および放射性免疫検定
法によれば、NANBH患者の血清中、ならびに
他の肝臓疾患おらび非肝臓疾患を有する患者にお
いても、しばしば存在するリウマチ因子様物質が
低レベルで検出されるようである。検出された反
応性のいくつかは、宿主により定まる細胞質抗原
に対して抗体を表現し得る。 NANBVの候補となるものは、数多く存在す
る。例えば、Prince（1983），Feistoneおよび
Hoofnagle（1984）、そしてOverby（1985，1986，
1987）による総説、ならびにIwarson（1987）に
よる論文を参照にされたい。しかしながら、これ
らの候補はNANBHの病因因子に相当するとい
う証拠はない。 NANBVのキヤリア、およびNANBVで汚染
された血液または血液製剤をスクリーニングしか
つ同定するための感度が高く特異的な方法が非常
に要求されている。輸血後肝炎（PTH）は輸血
された患者の約10％において発生する。この場
合、90％までがNANBHである。この疾患にお
ける大きな問題は、しばしば慢性的な肝臓損傷へ
進行することである（25〜55％）。 患者を看護し、血液および血液製剤による
NANBHの感染あるいは個体が緊密に接触する
ことにより起こるNANBHの感染を予防するた
めに、NANBVに関する核酸、抗原、および抗
体を検出する信頼性の高い診断手段および予診手
段が必要とされている。さらに、この疾患を予防
および／または処置するための効果的なワクチン
および免疫療法剤も必要とされている。 発明の開示 本発明は、新しく発見されたNANBV病因因
子であるＣ型肝炎ウイルス（HCV）の単離およ
び特徴付けに関する。さらに詳しくは、本発明
は、以下の特性を有する、少なくとも８個のアミ
ノ酸の連続する配列を含むポリペプチドを提供す
る： (1) 該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列
が少なくとも一つの部位を有し、該部位は、(a)
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体によつて結合さ
れ得、(b)既知のフラビウイルスに対する抗体と
反応しない；および、 (2) 該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列
が、後述の第４７図のアミノ酸配列から得られ
る。 本願において「Ｃ型肝炎ウイルス」という用語
は、詳しくは以下の３つの特徴により定義され
る： （）正鎖RNAゲノムを有し；（）該ゲ
ノムが、ポリペプチドをコードするオープン
リーデイングフレーム（ORF）を含み；そ
して、（）該ポリペプチドが、後述する第
１４図に示される１〜859個のアミノ酸配列
に対して少なくとも40％の相同性を有するア
ミノ酸配列を含み、 フラビウイルスと近縁であり、そして NANB肝炎を引き起こす。 本願において「抗体によつて結合され得」と
は、ポリペプチドが、公知の検出方法、例えば明
細書に記載の検出方法によつて検出可能な、抗体
との複合体を形成し得ることを意味する。ここで
抗体とは、NANB肝炎患者の身体成分、例えば
血清中に含まれる抗体を指す。 本発明のポリペプチドが含む、少なくとも８個
のアミノ酸の連続する配列は、公知のデータバン
クをコンピユータで調査しても、既知のアミノ酸
配列とは一致しなかつた。 HCV cDNAから誘導されたプローブを利用し
たHCVゲノムの性質、およびHCV cDNA内に
含まれる配列情報に関する研究は、HCVがフラ
ビウイルスまたはフラビ様ウイルスであることを
示唆している。 上記のHCV cDNAは、以下の新規な工程を包
有する方法により単離される：つまり、NANB
肝炎に感染した組織から調整されたcDNAライブ
ラリー由来の発現産物をスクリーニングする工
程；および非感染個体に比べて感染個体の血清と
のみ免疫学的に反応する産物を生産するクローン
を選択する工程である。 HCVから誘導されたcDNA配列の一例は、試
料中のウイルスの存在を診断するためのプローブ
として、および天然に存在するウイルスの変異型
を単離するためのプローブとして有用である。こ
れらのcDNAを用いれば、HCVゲノム内にコー
ドされているHCV抗原の有効なポリペプチド配
列を調整し、診断検査における標準または試薬と
して、および／またはワクチンの成分として有用
なポリペプチドを生産することができる。これら
のポリペプチド配列内に含まれるHCVエピトー
プに対する抗体は、ポリクローナル抗体およびモ
ノクローナル抗体のいずれもが、診断検査に、治
療薬として、抗ウイルス剤のスクリーニングに、
そしてこれらのcDNAから誘導されるNANBV
因子の単離に有用である。さらに、これらの
cDNAから誘導されるプローブを利用することに
より、HCVゲノムの他の部分を単離し、かつ配
列決定することができる。従つて、NANBHの
診断および／または処置、予防および治療の両方
に有用な追加のプローブおよびポリペプチドが提
供される。 本発明の他の局面は以下のとおりである：
HCVゲノムまたはHCV cDNAに由来するDNA
のオープンリーデイングフレーム（ORF）を有
する組換え発現系であつて、該ORFが所望の宿
主と適合し得る制御配列に対して作動可能なよう
に連結されている、組換え発現系；該組換え発現
系で形質転換された細胞；および該形質転換細胞
により生産されるポリペプチド。 本発明のさらに他の局面は以下のとおりであ
る：精製されたHCV；該精製HCVに由来するポ
リペプチドの調整物；精製されたHCVポリペプ
チド：およびHCVに含まれるエピトープと免疫
学的に同一であるとみなし得るエピトープを有す
る精製されたポリペプチド。 本発明には以下の局面も包含される：組換え
HCVポリペプチド；HCVゲノムまたはHCV
cDNAに由来する配列を有する組換えポリペプチ
ド；HCVエピトープを有する組換えポリペプチ
ド；およびHCVポリペプチドを有する融合ポリ
ペプチド。 キツトに関する本発明の局面は以下のようなキ
ツトである：HCV抗原の存在について試料を分
析するためのキツトであつて、適当な容器内に、
検出されるべきHCV抗原に対する抗体を有する
キツト；HCV抗原に対する抗体の存在について
試料を分析するためのキツトであつて、適当な容
器内に、HCV抗原に存在するHCVエピトープを
含むポリペプチドを有するキツトである。 本発明の他の局面は、固体担体に付着させた、
HCVエピトープを有するポリペプチド；および
固体担体に付着させた、HCVエピトープに対す
る抗体である。 本発明のさらに他の局面は以下のような方法で
ある：HCVエピトープを含むポリペプチドを生
産する方法であつて、HCVエピトープを含むポ
リペプチドをコードする配列を含む発現ベクター
で形質転換させた宿主細胞を、該ポリペプチドを
発現させる条件下でインキユベートすること、を
包含する生産方法：およびこの方法により生産さ
れた、HCVエピトープを含むポリペプチド。 免疫学的検定法もまた、本発明に包含される。
これらの免疫学的検定法には、以下のような工程
を包含するHCV抗原を検出するための免疫学的
検定法が包含される：HCV抗原を含んでいる疑
いのある試料を、検出されるべきHCV抗原に対
するプローブ抗体と共に、抗原−抗体複合体を形
成する条件下でインキユベートすること；および
該プローブ抗体を含む抗原−抗体複合体を検出す
ること。以下の工程を包含するHCV抗原に対す
る抗体を検出するための免疫学的検定法：抗
HCV抗体を含んでいる疑いのある試料を、HCV
のエピトープを含むプローブポリペプチドと共
に、抗体−抗原複合体を形成する条件下でインキ
ユベートすること；および該プローブ抗原を含む
抗体−抗原複合体を検出すること。 【図面の簡単な説明】 第１図は、クローン５−１−１におけるHCV
cDNA挿入物の二本鎖ヌクレオチド配列、および
この配列内にコードされたポリペプチドの推定ア
ミノ酸配列を示す。第２図は、クローン５−１−
１，８１，１−２、および９１の重複HCV
cDNA配列の相同性を示す。第３図は、重複する
クローン８１，１−２、および９１に由来する
HCV cDNAの複合配列、およびこの配列内にコ
ードされたアミノ酸配列を示す。第４図は、クロ
ーン８１におけるHCV cDNA挿入物の二本鎖ヌ
クレオチド配列、およびこの配列内にコードされ
たポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。第５
図は、その一部がクローン８１のNANBV
cDNAと重複するクローン３６のHCV cDNA配
列、おらびこの配列内にコードされたポリペプチ
ド配列を示す。第６図は、クローン３６および８
１のHCV cDNAの結合ORF、およびこのORF
内にコードされたポリペプチドを示す。第７図
は、その一部がクローン８１と重複するクローン
３２のHCV cDNA配列、およびこの配列にコー
ドされたポリペプチドを示す。第８図は、その一
部がクローン３６と重複するクローン３５の
HCV cDNA配列、およびこの配列内のコードさ
れたポリペプチドを示す。第９図は、クローン３
５，３６，８１，および３２のHCV cDNAの結
合ORF、およびこのORF内にコードされたポリ
ペプチドを示す。第１０図は、その一部がクロー
ン３５と重複するクローン３７ｂのHCV cDNA
配列、およびこの配列内にコードされたポリペプ
チドを示す。第１１図は、その一部がクローン３
２と重複するクローン３３ｂのHCV cDNA配
列、およびこの配列内にコードされたポリペプチ
ドを示す。第１２図は、その一部がクローン３７
ｂと重複するクローン４０ｂのHCV配列、およ
びこの配列内にコードされたポリペプチドを示
す。第１３図は、その一部がクローン３３ｂと重
複するクローン２５のHCV cDNA配列、および
この配列内にコードされたポリペプチドを示す。
第１４図は、クローン４０ｂ，３７ｂ，３５，３
６，８１，３２，３３ｂ，および２５ｃの広がる
ORFのヌクレオチド配列、およびこの配列内に
コードされたポリペプチドを示す。第１５図は、
その一部がクローン４０ｂおよび３３ｃと重複す
るクローン３３ｃのHCV cDNA配列、およびこ
の配列内にコードされたアミノ酸を示す。第１６
図は、その一部がクローン３３ｃと重複するクロ
ーン８ｈのHCV cDNA配列、およびこの配列内
にコードされたアミノ酸を示す。第１７図は、そ
の一部がクローン８ｈと重複するクローン７ｅの
HCV cDNA配列、およびこの配列内にコードさ
れたアミノ酸を示す。第１８図は、その一部がク
ローン２５ｃと重複するクローン１４ｃのHCV
cDNA配列、およびこの配列内にコードされたア
ミノ酸を示す。第１９図は、その一部がクローン
１４ｃと重複するクローン８ｆのHCV cDNA配
列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を
示す。第２０図は、その一部がクローン８ｆと重
複するクローン３３ｆのHCV cDNA配列、およ
びこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。第
２１図は、その一部がクローン３３ｆと重複する
クローン３３ｇのHCV cDNA配列、およびこの
配列内にコードされたアミノ酸を示す。第２２図
は、その一部がクローン７ｅと重複するクローン
７ｆのHCV cDNA配列、およびこの配列内にコ
ードされたアミノ酸を示す。第２３図は、その一
部がクローン７ｆと重複するクローン１１ｂの
HCV cDNA配列、およびこの配列内にコードさ
れたアミノ酸を示す。第２４図は、その一部がク
ローン１１ｂと重複するクローン１４ｉのHCV
cDNA配列、およびこの配列内にコードされたア
ミノ酸を示す。第２５図は、その一部がクローン
３３ｇと重複するクローン３９ｃのHCV cDNA
配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸
を示す。第２６図は、クローン１４ｉ，１１ｂ，
７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３
５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４
ｃ，８ｆ，３３ｆ，および３３ｇの整列した
cDNAに由来する複合HCV cDNA配列を示す。
さらに、この誘導された配列の拡張ORF内にコ
ードされたポリペプチドのアミノ酸配列が示され
ている。第２７図は、その一部がクローン１４ｉ
と重複するクローン１２ｆのHCV cDNA配列、
およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示
す。第２８図は、その一部がクローン３９ｃと重
複するクローン３５ｆのHCV cDNA配列、およ
びこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。第
２９図は、その一部がクローン３５ｆと重複する
クローン１９ｇのHCV cDNA配列、およびこの
配列内にコードされたアミノ酸を示す。第３０図
は、その一部がクローン１９ｇと重複するクロー
ン２６ｇの配列、およびこの配列内にコードされ
たアミノ酸を示す。第３１図は、その一部がクロ
ーン２６ｇと重複するクローン１５ｅの配列、お
よびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
第３２図は、クローン１２ｆから１５ｅを５′か
ら３′の方向に整列させることにより誘導された
複合cDNAの配列を示す；さらに、この連続
ORF内にコードされたアミノ酸を示す。 第３３図は、BB−NANB，HAV，および
HBVに感染したチンパンジー由来のチンパンジ
ー血清を用いた融合タンパクSOD−NANB5-1-1
のウエスタンブロツトの写真である。第３４図
は、NANBV，HAV，HBVに感染したヒト由
来の血清、および対象のヒトの由来の血清を用い
た融合タンパクSOD−NANB5-1-1のウエスタン
ブロツトの写真である。第３５図は、ベクター
pAB２４の有意な特徴を示す地図である。第３
６図は、融合ポリペプチドＣ１００−３のカルボ
キシル末端の推定アミノ酸配列、およびこの配列
をコードするヌクレオチドを示す。第３７図Ａ
は、酵母内で発現されたＣ１００−３を同定す
る、クーマシーブルーで染色されたポリアクリル
アミドゲルの写真である。第３７図Ｂは、
NANBVの感染したヒトに由来する血清を用い
たＣ１００−３のウエスタンブロツトを示す。第
３８図は、BB−NANBVに感染したチンパンジ
ーの肝臓から単離され、クローン８１のBB−
NANBV cDNAでプローブされたRNAのノー
ザンブロツトのオートラジオグラフを示す。第３
９図は、RNase ＡまたはDNase Ｉで処理され、
クローン８１のBB−NANBV cDNAでプロー
ブされたNANBVの核酸のオートラジオグラフ
を示す。第４０図は、抗NANB5-1-1を有する感
染血漿から得たNANBV粒子から抽出され、ク
ローン８１由来の32Ｐ標識化NANBV cDNAで
プローブされた核酸のオートラジオクラフを示
す。第４１図は、クローン８１のNANBV
cDNAから誘導された32Ｐ標識化（＋）鎖および
（−）鎖DNAプローブでプローブされた、単離
NANBV核酸を有するフイルターのオートラジ
オグラフを示す。第４２図は、HCV cDNAにコ
ードされたポリペプチドと、デング熱クラビウイ
ルス由来のNSタンパクとの相同性を示す。第４
３は、ELISAスクリーニング法で決定される、
任意抽出試料におけるHCV感染の分布ヒストグ
ラムを示す。第４４図は、ELISA検定法におい
て免疫グロブリン−酵素結合体の２つの形態を用
いた、任意抽出試料におけるHCV感染の分布ヒ
ストグラムを示す。第４５図はフラビウイルスの
NS１における保存配列から誘導されたプライマ
ー混合物の配列を示す。第４６図は、第２６図の
cDNAと重複するセグメントである、クローンｋ
９−１中のHCVcDNA配列およびそれにコード
されるアミノ酸を示す。 第４７図は、５′から３′方向に、ｋ９−１から
１５ｅにわたる並列したクローンに由来する複合
cDNAの配列、および連続するORF中にコード
されるアミノ酸配列を示す。 発明を実施する方法 定義 「Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis Ｃ virus）〕
という用語は、非Ａ非Ｂ型肝炎（NANBH）の
従来知られていなかつた病原因子に対して、この
分野の研究者が保留していた用語である。従つ
て、本願で用いる場合、「Ｃ型肝炎ウイルス」
（HCV）という用語はNANBHの病原因子を意
味し、またこのNANBHは、以前にはNANBV
および／またはBB−NANBVと呼ばれていたも
のである。本願では、HCV，NANBVおよび
BB−NANBVという用語を互換性のある語とし
て使用する。この用語法を拡張して、以前は
NANB肝炎（NANBH）と呼んでいたHCVによ
つて発病する疾患をＣ型肝炎と呼ぶ。本願では、
NANBHとＣ型肝炎という用語を互換性のある
語として使用してもよい。 「HCV」という用語は、本願で用いる場合、
NANBHを発病させるウイルス種および弱毒化
されたウイルス株または後者由来の欠損干渉粒子
を意味する。後に述べるように、HCVゲノムは、
RNAで構成されている。RNAを含有するウイル
スの隅発変異率が比較的高いということが知られ
ており、すなわち約10-3〜10-4／ヌクレオチドで
あると報告されている〔フイールズとナイブ
（Fields and Knipe）1986年〕。それ故、後に述
べるHCV種の中には、多くのウイルス株がある。
本願記載の組成物と方法によつて、種々の関連ウ
イルス株の増殖、同定、検出および単離を行うこ
とができる。さらに各種ウイルス株に対する診断
薬とワクチンを製造することができ、また薬学的
用途の抗ウイルス剤を、HCVの複製を阻害する
ということによりスクリーニングすることができ
る。 本願で提供する情報は、ある種のHCV株由来
のものであり、このウイルス株は以後CDC／
HCD１と呼ぶが、ウイルスの分離学者がこの種
に属する他のウイルス株を同定するのに充分なも
のである、本願に記載するように、本願の発明者
らは、HCVがフラビウイルス（Flavivirus）ま
たはフラビ様ウイルス（Flavi−like virus）で
あることを発見した。フラビウイルス粒子の形態
と組成は公知であり、ブリントン（Brinton，
1986年）が考察している。形態については、一般
にフラビウイルス類は、脂質二重層で覆われた中
心ヌクレオカプシドを有している。ビリオンは球
形で直径が約40〜50nmである。そのコアは直径
が約25〜30nmである。ビリオンのエンベローブ
の外面には、直径が約2nmの端末ノブ（terminal
knob）を有する約５〜10um長の突起を有する。 HCVは、本願に記載のcDNAが誘導される
HCVゲノム内のエピトープと免疫学的に同定可
能なエピトープをコードするが、このエピトープ
は本願に記載のcDNA内にコードされることが好
ましい。このエピトープは、他の公知のフラビウ
イルス類と比較した場合、HCVに特有のもので
ある。このエピトープの独自性は、HCVとの免
疫学的反応性と、他のフラビウイルス種との免疫
学的反応性の欠如とによつて決定することができ
る。免疫学的反応性を決定する方法は当該技術分
野では公知であり、例えば、放射性免疫検定法，
ELISA法、血球凝集反応法などがあり、分析技
術の適切ないくつかの例を本願に示す。 上記に加えて、ウイルス株をHCVとして同定
する際に、単独もしくは組合わせて、下記のパラ
メータを利用することができる。HCV株は、進
化論的に関連しているので、ヌクレオチドレベル
でのゲノムの全相同性は、約40％以上であり、好
ましくは約60％以上で、さらに好ましくは約80％
以上であり、さらに少なくとも約13のヌクレオチ
ドの対向する連続配列があると考えられる。推定
上のHCV株のゲノム配列とCDC／CH１HCVの
cDNA配列との同一性は、当該技術分野で公知の
技術によつて決定することができる。例えば、推
定上のHCV由来のポリヌクレオチドの配列情報
と、本願に記載のHCV cDNA配列とを直接比較
することによつて決定することができる。また例
えば、相同領域間の安定な二本鎖を形成する条件
下（例えば、Ｓ１消化の前に用いられる条件）で
ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーシヨンし、
次いで一本鎖に特異的なヌクアーゼの一種もしく
は複数種で切断し、次に切断によつて生成した断
片の大きさを測定することによつて決定すること
ができる。 HCV株の進化的類縁関係のために、推定上の
HCV株は、ポリペプチドのレベルの、その相同
性によつて同定可能である。一般にHCV株は、
ポリペプチドのレベルで、約40％以上相同であ
り、好ましくは約60％以上、さらに好ましくは80
％以上相同である。アミノ酸配列の相同性を決定
する技術は、当該技術分野で知られている。例え
ば、アミノ酸配列を直接決定して、本願に示した
配列と比較することができる。また例えば、推定
上のHCVのゲノム物質のヌクレオチド配列を決
定してもよく（通常、cDNA中間体を介して）、
これにコードされているアミノ酸配列は決定可能
で、対応する領域を比較することができる。 以上を考慮すると、本願において「Ｃ型肝炎ウ
イルス」という用語は、より詳細には、以下の３
つの特徴により定義される： （）正鎖RNAゲノムを有し；（）該ゲノ
ムが、ポリペプチドをコードするオープンリー
デイングフレーム（ORF）を含み；そして、
（）該ポリペプチドが、後述の第１４図に示
される１〜859個のアミノ酸配列に対して少な
くとも40％の相同性を有するアミノ酸配列を含
み、 フラビウイルスと近縁であり、そして NANB肝炎を引き起こす。 本願で使用される場合、指定された配列（例え
ば、HCV cDNA、特に第１〜３２図に例示した
配列）か、またはHCVゲノム「由来」のポリヌ
クレオチドは、少なくとも約６個の対応するヌク
レオチド配列からなり、好ましくは少なくとも約
８個のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくと
も約10〜12個のヌクレオチド、さらに好ましくは
少なくとも約15〜20個のヌクレオチドの配列から
なる対応するポリヌクレオチド配列を意味する。
つまり、これらのヌクレオチドは、指定されたヌ
クレオチドの配列の領域に相同か、または相補的
であつ。上記ポリヌクレオチドは誘導される領域
の配列は、HCVゲノムに特有の配列に相同また
は相補的であるのが好ましい。一つの配列が
HCVゲノムに特有のものであるか否かは当業者
に公知の技術で決定することができる。例えば、
その配列を、データバンク、例えばジーンバンク
（genebank）の配列と比較して、未感染の宿主ま
たは他の生物に存在するか否かを決定する。また
その配列は、公知の配列を有する他のウイルス因
子、すなわち、肝炎、例えば、HAV，HBVおよ
びHDVを誘発することが知られているウイルス
因子、ならびにフラビウイルス科のウイルス
（Fraviviridae）の他のメンバーと比較するとも
できる。また、誘導された配列が他の配列と一致
しているかまたは一致していないかは、適切な厳
密条件下でハイブリダイゼーシヨンさせることに
よつて決定することができる。核酸の配列の相補
性を決定するためのハイブリダイゼーシヨン技術
は、当該技術分野で公知であり、特に検討する。
例えば、マニアチスら（Maniatis et al，1982
年）の文献を参照せよ。さらにハイブリダイゼー
シヨンによつて形成された、不適正な二本鎖のポ
リヌクレオチドも公知の方法で決定することがで
き、この方法には、例えば、Ｓ１のようなヌクレ
アーゼによつて、二本鎖のポリヌクレオチドの一
本鎖領域を特異的に切断する方法がある。代表的
なDNA配列が「誘導される」領域は、例えば、
特異的なエピトープをコードする領域および転写
されない領域および／または翻訳されない領域を
含むが、これに限定されるものではない。 誘導されたポリヌクレオチドは、必らずしも、
提示されたヌクレオチド配列が物理的に誘導され
るとは限らず、いずれの方法で生成されていても
よい。例えば、化学合成法、DNA複製法、逆転
写法または転写法が挙げられ、これらの方法は、
ポリヌクレオチドが誘導される一種もしくは複数
の領域内の塩基配列が提供する情報に基づいて実
施される。さらに、指定された配列の領域に対応
する領域の組合わせは、当該技術分野で公知の方
法で改変され、意図する用途に合致させることが
できる。 同様に、指定された核酸の配列（例えば、第１
〜３２図に示す配列）またはHCVゲノム「から
誘導された」ポリペプチドもしくはアミノ酸配列
は、上記の配列にコードされているポリペプチド
のアミノ酸配列もしくはその一部分の配列（少な
くとも３〜５のアミノ酸、好ましくは少なくとも
８〜10のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも
11〜15のアミノ酸で構成された部分）と同じアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド、または上記の配
列にコードされているポリペプチドと免疫学的に
同定しうるポリペプチドを意味する。 組換え体ポリペプチドもしくは誘導されたポリ
ペプチドは、指定された核酸配列（例えば第１〜
２６図に示す配列）、またはHCVゲノムから必ら
ずしも翻訳される必要はなく、例えば化学合成法
もしくは組換え体発現系の発現もしくは変異
HCVからの単離を含むいずれの方法でも生成さ
れ得る。 本願で用いる「組換え体ポリヌクレオチド」と
いう用語は、ゲノム、cDNA、半合成もしくは合
成の起源のポリヌクレオチドを意味し、その起源
もしくは操作によつて、(1)天然もしくはライブラ
リーの形態でポリヌクレオチドが連結しているポ
リヌクレオチドの全体もしくは一部分と連結して
しないもの、および／または(2)天然にポリヌクレ
オチドが連結しているポリヌクレオチド以外のポ
リヌクレオチドに連結されているものを意味す
る。 本願で用いる「ポリヌクレオチド」という用語
は、任意の長さを持つたポリマー形態のヌクレオ
チド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌク
レオチド）を意味する。この用語は、分子の一次
構造のみを意味する。したがつて、この用語に
は、二本鎖DNAと一本鎖DNA、および二本鎖と
一本鎖のRNAが含まれる。またこの用語には、
例えばメチル化反応および／またはキヤツピング
によつて修飾された形態のポリヌクレオチドと、
未修飾のポリヌクレオチドが含まれる。 本願で用いる「cDNAに対応する配列を有する
HCV」という用語は、そのHCVが指定された
DNAの配列と相同もしくは相補的な関係にある
ポリヌクレオチド配列をもつていることを意味
し、cDNAに対する相同性もしくは相補性の程度
は、約50％以上、好ましくは少なくとも約70％、
さらに好ましくは少なくとも約90％である。対応
する配列は、長さが、少なくとも約70のヌクレオ
チド、好ましくは少なくとも約80％のヌクレオチ
ド、さらに好ましくは少なくとも約90ヌクレオチ
ドである。HCVの配列とcDNAとの対応は、当
該技術分野で公知の方法で決定することができ、
例えば配列された物質と記載されたcDNAとを直
接比較すること、またはハイブリダイゼーシヨン
し、一本鎖ヌクレアーゼで切断し、切断により生
成した断片の大きさを測定するという方法があ
る。 「精製されたウイルスポリヌクレオチド」とい
う用語は、HCVゲノムもしくはその断片を意味
し、この断片は、本質的に遊離の形態で、すなわ
ち、ウイルスのポリヌクレオチドが自然に連結さ
れているポリヌクレオチドの約50％未満、好まし
くは約70％未満、さらに好ましくは約90％未満を
含有している。ウイルス粒子からウイルスポリヌ
クレオチドを精製する方法は、当該技術分野で知
られており、例えば、ウイルス粒子をカオトロピ
ツク剤で破壊する方法、およびイオン交換クロマ
トグフイー、アフイニテイークロマトグフイー、
および密度による遠心沈降法によつてポリヌクレ
オチドとポリペプチドを分離する方法がある。 「精製されたウイルスポリペプチド」という用
語は、HCVポリペプチドもしくはその断片を意
味し、その断片は、本質的に遊離の形態で、ウイ
ルスポリペプチドは天然に連結されている細胞成
分の、約50％未満、好ましくは約70％未満、さら
に好ましくは約90％未満を含有している。ウイル
スポリペプチドを精製する技術は当該技術で公知
であり、この技術の例については後に考察する。 単細胞因子として培養される微生物もしくは高
等真該細胞計を示す「組換え体宿主細胞」、「宿主
細胞」、「細胞」、「細胞係」、「細胞培養物」などの
用語は、組換え体ベクターもしくは他の転移の
DNAの受容体として使用可能か、または使用さ
れてきた細胞を意味し、トランスフエクトされた
元の細胞の後代が含まれる。単一の親細胞の後代
は、偶発的または計画的な変異によつて、形態ま
たはゲノムもしくは全DNAの相補性が元の親細
胞と、必らずしも完全に同一ではない。所望のペ
プチドをコードするヌクレオチド配列が存在する
ように適切な性質によつて特徴づけられ、親細胞
に充分類似している親細胞の後代は、上記定義の
意味する後代に含まれ、上記用語で扱われる。 「レプリコン」は、遺伝要素であつて、例えば
プラスミド、染色体、ウイルスが含まれ、細胞内
でポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として
挙動し、すなわち自ら制御しながら複製を行うこ
とができる。 「ベクター」は、他のポリヌクレオチドのセグ
メントが結合しているレプリコンであつて、複製
を行い、および／または結合しているセグメント
を発現する。 「制御配列」は、ある種のポリヌクレオチド配
列を意味し、この配列が連結している、コード配
列を発現するのに必要なものである。このような
制御配列の性質は、宿主の生物によつて異なり、
このような制御配列には、原核細胞内では一般
に、プロモーター、リボソーム結合部位およびタ
ーミネーターが含まれ、真核細胞内では一般に、
プロモーター、ターミネーターおよびある場合に
はエンハンサーが含まれる。「制御配列」という
用語は、最小限、発現に必要なすべての要素を包
含し、さらに発現に有利な追加の要素、例えばリ
ーダー配列を包含し得る。 「作動可能に連結された」という用語は、上記
のような要素が、意図した方法で機能しうるよう
な関係に並置されていることを意味する。コード
配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制
御配列に適合した条件下でコード配列の発現が達
成されるように、連結される。 「読み取り枠」（ORF）は、ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の領域であり、こ
の領域は、コード配列の一部またはコード配列全
体を意味する。 「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に
置かれた場合に、mRNAに転写され、および／
またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチ
ド配列である。コード配列の境界は、5′末端の翻
訳開始コドンと、3′末端の翻訳停止コドンによつ
て決定される、コード配列は、mRNA、cDNA
および組換え体ポリヌクレオチド配列を含有する
が、これらに限定されるものではない。 「免疫学的に…と同定可能な」という用語は、
指定されたポリペプチド、通常はHCVタンパク
内に存在し、かつそのタンパクに特有のエピトー
プとポリペプチドが存在することを意味する。免
疫学的な同一性は、抗体の結合および／または結
合において競争によつて決定されるが、この技術
は当業者には知られていることであり、後述す
る。エピトープの独自性も、エピトープをコード
するポリヌクレオチド配列について、公知のデー
タバンク（例えば、ジーンバンク）をコンピユー
タで調査し、他の公知のタンパクとアミノ酸配列
を比較することによつて決定することができる。 本願で用いる「エピトープ」という用語は、ポ
リペプチドの抗原決定基を意味し、エピトープ
は、エピトープに特有の立体配置で３個のアミノ
酸を含有し得るが、エピトープは、一般に少なく
とも５個のこのようなアミノ酸で構成され、より
一般的には少なくとも８〜10個のこのようなアミ
ノ酸で構成されている。アミノ酸の立体配置の決
定法は、当該技術分野では公知であり、例えば、
Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴法があ
る。 ポリペプチドは、これに含まれている特異的な
エピトープが抗体を認識することによつて、抗体
と結合する場合、抗体と「免疫学的に反応性があ
る」。免疫学的反応性は、抗体結合反応、特に抗
体結合反応の速度論、および／または抗体が指向
しているエピトープを含有する公知のポリペプチ
ドを、競争者として用いる結合競争法によつて決
定される。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応
性であるか否がを決定する方法は、当該技術分野
で公知である。連続する６個のアミノ酸で構成さ
れるポリペプチドが抗体と結合することは公知で
ある（公表特許公報昭60−500684号）。従つて、
抗体と結合するために十分な長さを有するポリペ
プチドは、少なくとも６個、好ましくは少なくと
も８個の連続するアミノ酸から構成される。 本願に用い場合、「HCVエピトープを含有する
免疫原性を有するポリペプチド」という用語に
は、自然に発生するHCVポリペプチドもしくは
その断片、および他の手段（例えば、化学合成法
または組換え体生物内でのポリペプチドの発現）
によつて調製されるポリペプチドが包含される。 「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の分
子鎖を意味し、特定の長さの生産物を意味しな
い。したがつてポリペプチドの定義には、ペプチ
ド、オリゴペプチドおよびタンパクは包含され
る。またこの用語は、ポリペプチドの発現後修飾
物、例えば、グリコシル化物、アシル化物、リン
酸化物などを意味しない。 本願で用いる「形質転換」という用語は、外因
性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを
意味し、挿入法はどんな方法でもよく、例えば、
直接取込み法、形質導入法またはｆ−交配法があ
る。外因性ポリヌクレオチドは、組込まれていな
いベクター、例えば、プラスミドとして保持され
るか、または代わりに宿主ゲノムに組込まれても
よい。 本願で用いる「処理」という用語は、予防およ
び／または治療を意味する。 本願で用いる「個体」という用語は、脊椎動
物、特に哺乳動物種のメンバーを意味し、家畜、
競技甲動物、霊長動物およびヒトを含むが、これ
に限定されるものではない。 本願で用いる場合、核酸の「正鎖」は、ポリペ
プチドをコードする配列を含有している。また
「負鎖」は、「正鎖」の配列を相補する配列を含有
している。 本願で用いる、ウイルスの「正鎖ゲノム」は、
RNAまたはDNAにかかわらず、一本鎖のゲノム
であり、ウイルスのポリペプチドをコードする。
正鎖のRNAウイルスの例としては、トガウイル
ス科ウイルス（Togaviridae）、コロナウイルス
科ウイルス（Coronaviridae）、レトロウイルス
科ウイルス（Retroviridae）、ピコルナウイルス
科ウイルス（Picorna−viridae）およびカリチウ
イルス科ウイルス（Caliciviridae）がある。また
フラビウイルス科ウイルスも含まれるが、これは
以前にトガウイルス科に分類されていた〔フイー
ルドとナイプの文献（1986年）を参照〕。 本願で用いる「抗体を含有する身体成分」は、
問題の抗体の起源である個体の身体の成分を意味
する。抗体を含有する身体成分は、当該技術分野
で知られており、例えば、血漿、血清、脊髄液、
リンパ液、呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外部セ
クシヨン（section），涙、唾液、乳、白血球およ
び骨髄腫細胞が含まれるが、これに限定されるも
のでばない。 本願で用いる「精製されたHCV」は、ウイル
スが通常連結されている細胞構成要素および感染
組織中に存在する他の種のウイルスから単離され
たHCVの製剤を意味する。ウイルスを単離する
技術は、当業者には知られており、例えば、遠心
分離法およびアフイニテイークロマトグラフイー
が含まれるが、製剤HCVの製法については後述
する。 発明の構成 本発明の実施においては、特に指示されない限
り、当該分野で既知である分子生物学、微生物
学、組み換えDNA、および免疫学の従来の手法
が採用される。このような手法は、文献中に充分
に説明されている。例えば、次の文献を参照され
たい：Manistis，FitschおよびSambrook，
MOLECULAR CLONING；Ａ
LABORATIRY MANUAL（1982）；DNA
CLONING，巻および巻（D.N Glover編
集、1985）；OLIGONUCLEOTIDE
SYNTHESIS（Ｍ，Ｊ，Gait編集、1984）；
NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（B.D.
HamesおよびS.J.Higgins編集、1984）；
TRANSCRIPTION AND TRANSLATION
（B.D.HamesおよびS.J.Higgins編集、1984）；
ANIMAL CELL CULTURE（R.I.Freshney編
集、1986）；IMMOBILIZED CELLS AND
ENZYMES（IRL Press，1986）；B.Perbal，Ａ
PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR
CLONING（1984）；METHODS IN
ENZYMOLOGYのシリーズ）Academic Press，
Inc.）；GENE TRANSFER VECTORS FOR
MAMMALIAN CELLS（J.H.MillerおよびM.P.
Calos編集、1987，Cold Spring Harbor
Laboratory）；Methods in Enzymology
Vol.154およびVol.155（それぞれWuおよび
Grossman；Wu編集）、MayerおよびWalker編
集（1987）；IMMUNOCHEMICAL
METHODS IN CELL AND MOLECULAR
BIOLOGY（Academic Press，London），
Scopes，（1987）；PROTEIN
PURIFICATION：PRINCIPLES AND
PRACTICE，Second Edition（Springer−
Verleg，N.Y.），およびHANDBOOK OF
EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，〜
巻（Ｄ，Ｍ，WeirおよびC.C.Blackwell編、
1986）。 ここで述べられる前出および後述の特許出願お
よび公報は参考文献としてここに取り入れられて
いる。 本発明の有用な物質および方法は、HCV感染
チンパンジーの血漿中に存在する核酸配列由来の
cDNAライブラリーから単離されたヌクレオチド
配列と非常に相同なヌクレオチド配列群の供給に
より可能となる。このヌクレオチド配列群はヒト
あるいはチンパンジーの起源ではない。なぜな
ら、このヌクレオチド配列群は、非感染個体から
得られるヒトおよびチンパンジーのゲノムDNA
のいずれにもハイブリダイズせず、この配列群の
ヌクレオチドはHCV感染したチンパンジーの肝
臓および血漿にのみ存在し、そして、この配列は
遺伝子バンクには存在しないからである。さら
に、この配列群は、HCVゲノム内に含有される
配列に有意な相同性を示さない。 クローン５−１−１内に含有されるこの群のあ
る配列は、およそ50個のアミノ酸のポリペプチド
をコードする１つの連続的なオープンリーデイン
グフレーム（ORF）を有する。HCV感染者から
得られた血清にはこのポリペプチドの結合する抗
体が含有されている一方、非感染者から得られた
血清には、このポリペプチドに対する抗体が含有
されない。最終的には非感染チンパンジーから得
られた血清には、このポリペプチドに対する抗体
が含有されないが、この抗体は、急性NANBH
に感染したチンパンジーにおいて誘導される。さ
らに、このポリペプチドに対する抗体はHAVお
よびHBVに感染したチンパンジーおよびヒトに
おいては検出されない。これらの基準によると、
この配列はウイルスの配列に対するcDNAであ
り、このウイルスにより生じ、NANBHと関連
する配列である。このcDNA配列を第１図に示
す。後述のように、クローン５−１−１における
cDNA配列は、単離された他のcDNA（さらに28
個の塩基対を含有する）とは異なる。 他の同定されたDNA群（これらは、クローン
５−１−１におけるcDNAの断片と同等な合成配
列をプローブとして用い、単離された）との複合
配列を第３図に示す。クローン８１における
cDNA由来の合成配列を用いて単離されたcDNA
群の構成要素を第５図に示し、クローン８１の配
列とこの配列との複合配列を第６図に示す。
cDNA群の他の構成要素は、クローン１４ｉ，１
１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７
ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，
１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，および３３ｇ，および３
９ｃに存在する配列を含み、これらは、．Ａ節
で詳細に説明される。これらのクローン中の
cDNA複合配列は．A.18節で詳細に説明され
ており、第２６図に示される。cDNA複合配列は
ひとつの連続したORFを含有し、従つて、ポリ
タンパクをコードしていることが示される。この
データは、後に考察されるように、HCVがフラ
ビウイルスあるいはフラビ様ウイルスであるとい
う示唆と一致する。 第１図〜第３２図に包括して示すcDNA群が入
手可能となるため、DNAプローブの構築および
ポリペプチドを得ることが可能となる。上記ポリ
ペプチドは、HCV感染によるNANBHの診断に
おいて、そして、供血者、供給された血液および
血液産物が感染しているか否かについてスクリー
ニングすることにおいて、有用である。例えば、
この配列から、約８〜10個あるいはそれより長い
ヌクレオチドを有するDNAオリゴマーを合成す
ることが可能である。このDNAオリゴマーは、
例えばウイルスを保有している疑いがある被験者
血清におけるウイルスゲノムの存在を検出するた
めの、あるいは供給された血液についてウイルス
の存在の有無をスクリーニングするための、ハイ
ブリダイゼーシヨンプローブとして、有用であ
る。cDNA配列の群によりまた、NANBHにお
いて生じる抗体の存在を検出する診断用試薬とし
て有用なHCVに特異的なポリペプチドの設計お
よび産生が可能となる。cDNA由来の精製ポリペ
プチドに対する抗体は感染個体および血液中のウ
イルス抗原を検出するためにも用いられ得る。 これらのcDNA配列の知識により、HCVに対
するワクチンとしてそして抗体産生のためにも用
いられ得る、ポリペプチドの設計および調製が可
能となる。そしてこのポリペプチドは、次に、
HCV疾患に対する保護および／またはHCV感染
個体の治療に用いられ得る。 さらに、cDNA配列群によりHCVゲノムを、
より特徴づけることを可能にする。これらの配列
から得られたポリヌクレオチドプローブは、重複
している付加的なcDNA配列についてcDNAライ
ブラリーをスクリーニングするために用いられ
得、このcDNA配列はさらに、重複している別の
配列を得るためにも用いられ得る。ゲノムが分割
されており、そのセグメントが共通配列を欠いて
いる限り、この手法はゲノム全体の配列を得るた
めに用いられ得る。しかし、ゲノムが分割されて
いるならば、ゲノムの他のセグメントは、ここで
述べられているcDNAクローンを単離するために
用いられたλ−gt11の血清学的にスクリーニング
工程を繰り返すことにより、あるいは、精製
HCV粒子からのゲノムを単離することにより得
られ得る。 cDNA配列群およびこれら配列由来のポリペプ
チド、そして、これらペプチドに対する抗体もま
た、BB−NANBV因子の単離および同定に有用
である。例えば、cDNA由来のポリペプチドに含
まれるHCVエピトープに対する抗体は、アフイ
ニテイークロマトグラフイーをもとにした工程
で、ウイルスを単離するために用いられ得る。あ
るいは、この抗体は他の手法により単離されたウ
イルス粒子を同定するために用いられ得る。単離
されたウイルス粒子のウイルス抗原およびゲノム
物質が、さらに特徴づけられ得る。 HCVゲノムをさらに配列決定することによつ
て得られる情報により、およびHCV抗原がさら
に特徴づけられ、ゲノムが特徴づけられることに
より、付加的なプローブおよびポリペプチド、そ
して抗体の設計および合成が可能となる。これら
は、HCV誘発NANBHの診断、予防、および治
療に、そして感染血液および血液関連産物のスク
リーニングに用いられ得る。 抗原および抗体を含むHCVのプローブ、およ
びcDNA群が誘導されるゲノム由来のポリヌクレ
オチドが利用可能であることにより、HCVの生
物的性質を明らかにするにあたり主として用いら
れる組織培養係の発達が可能となつた。このこと
により、HCV複製、あるいはHCV感染を選択的
に阻害する抗ウイルス化合物に基づいた新しい治
療法が開発され得る。 NANBHの病因因子を同定および単離するた
めに用いられる本法は新規であり、次のような今
までに特徴づけられていない因子の同定および／
または単離に適用され得る。上記因子はゲノムを
含有し、ウイルス、ウイロイド、細菌類、菌類、
および寄生虫によつて引き起こされる疾患を包含
するさまざまな疾患に関連する因子である。この
方法ではcDNAライブラリーが、感染個体から得
られる感染組織中に存在する核酸から、調製され
た。このライブラリーは、cDNAをコードするポ
リペプチドを発現し得るベクター中に調製され
た。ベクターを含む宿主細胞のクローンは、病因
因子のポリペプチドの免疫反応性断片を発現し、
これは、推定される因子に以前に感染した別の個
体由来の抗体含有体成分を有するこのライブラリ
ーの発現産物を免疫学的にスクリーニングするこ
とによつて選択される。免疫学的なスクリーニン
グ法における工程は、次の工程を包含してい
た；：ベクターを含むcDNAの発現産物と、二次
的に感染した個体の抗体含有体成分とを相互作用
させる工程；および発現産物と二次感染個体の抗
体との間の抗原−抗体複合配列の形成を検出する
工程。単離されたクローンはさらに次のようにし
て免疫学的にスクリーニングされる：発現産物
を、推定される因子に感染した他の個体および推
定される因子に感染していない対照の個体の抗体
含有体成分と相互に作用させること、および、感
染個体由来の抗体との抗原−抗体複合配列の形成
を検出すること。そして、感染個体および該因子
に感染している疑いのある個体由来の抗体と免疫
学的に反応するが、対照の個体由来のものとは反
応しないポリペプチドをコードするcDNA含有ベ
クターが、単離される。cDNAライブラリーの構
築および免疫学的なスクリーニングに用いた感染
個体は同種である必要はない。 本法により単離されたDNA発現産物、そして
該発現産物に対する抗体は、病因因子の特徴づけ
および／または捕捉に有用である。さらに、詳細
に後述するように、この方法は、HCVゲノム由
来のcDNA群を単離するために、好適に利用され
る。 Ａ cDNA配列の調製 慢性HCV感染チンパンジー由来の貯留血清で
あつて、ウイルスを高力価で、つまり少なくとも
106チンパンジー感染量／ml（chimp infectious
doses／ml；CID／ml）を有する血清を、ウイル
ス粒子を単離するために用いた。そして、このウ
イルス粒子から単離した核酸を、ウイルスゲノム
に対するcDNAライブラリーの構築においてテン
プレートとして用いた。推定HCV粒子の単離お
よびλ−gt11におけるcDNAライブラリーの構築
のための手順は、．A.1節で考察されている。
λ−gt11は、β−ガラクトシダーゼを有する融合
ポリペプチドとして挿入cDNAを発現するため
に、そして、特定の抗原に対して生じた特異的な
抗血清で多数の組み換え体フアージをスクリーニ
ングするために、特に開発されたベクターであ
る。およその平均サイズが200塩基対のcDNAを
有するcDNAプールからのλ−gt11cDNAライブ
ラリーが以前にNANB肝炎にかかつたことのあ
る患者由来の血清に特異的に結合し得るようなコ
ードされたエピトープについてスクリーニングさ
れた。Huynh，T.V.ら（1985）。約106のフアー
ジがスクリーニングされ５個の陽性フアージが同
定、精製され、次にHCV因子に以前に感染した
異なるヒトおよびチンパンジーから得た血清に対
する結合の特異性がテストされた。このフアージ
の１つである５−１−１が、テストしたヒト血清
８個のうちの５個と結合した。７個の正常血清は
このような結合を示さなかつたので、この結合は
以前にNANB肝炎にかかつた患者由来の血清に
選択的であるらしい。 組換え体フアージ５−１−１におけるcDNA配
列が、決定され、それは第１図に示される。この
クローン化されたcDNAによつてコードされたポ
リペプチドは、融合ポリペプチドのＮ末端β−ガ
ラクトシダーゼ部分として同一の翻訳枠内にあ
り、その配列は、該ヌクレオチド配列の上に示さ
れる。従つて、翻訳ORFは、NANB肝炎に感染
した患者由来の血清によつて特別に認識されるエ
ピトープをコードする。 組換えフアージ５−１−１においてcDNAが利
用できるため、ウイルスゲノムに対するcDNAの
付加的な断片および／または他の断片を有する他
のクローンを単離することが可能となる。前出の
λ−gt11cDNAライブラリーは、クローン化され
た５−１−１cDNA配列由来の合成ポリヌクレオ
チドを用いてスクリーニングされた。このスクリ
ーニングにより、８１，１−２，および９１とし
て同定された３個の他のクローンが得られた。こ
れらのクローン内にあるcDNAは配列決定され
た。．A.3節および．A.4節を参照されたい。
４個の独立したクローン間の相同性を第２図に示
す。第２図では相同性が縦線により示されてい
る。クローン５−１−１，８１，および９１にお
いて独特のヌクレオチド配列を小文字で示す。 クローン５−１−１，８１，１−２，および９
１における組換え体フアージにクローン化された
cDNAは、相同性が高く、わずかに２個の領域に
おいて異なるにすぎない。第一に、クローン１−
２の67番目のヌクレオチドはチミジンである一
方、他の３個のクローンは、この位置にシチジン
を有する。しかし、この置き換えにより、コード
されたアミノ酸の性質は変化しない。 この４つのクローンの第２の違いは、クローン
５−１−１が、他のクローンには存在しないよう
な28の塩基対を5′末端に有していることである。
この特別な配列はクローニングにより5′末端に人
工的に形成されたものである。クローニングによ
り5′末端に形成される人工的な配列は、通常、
cDNA法の生成物中に観察される。 クローン８１におけるHCV cDNAの5′領域お
よび3′領域由来の合成配列は、クローン８１
cDNAと重複するλ−gt11のNANBV cDNAラ
イブラリー由来のcDNAスクリーニングおよび単
離に用いられた（．A.5節）。クローン３６お
よびクローン３２の中にそれぞれ存在する得られ
たcDNA配列は、第５図および第７図に示され
る。 同様に、クローン３６の5′領域に基づいた合成
ポリヌクレオチドは、クローン３６cDNAに重複
するλ−gt11 NANBV cDNAライブラリーか
らcDNAをスクリーニングし単離するのに用いら
れた（．A.8節）。合成ポリヌクレオチドプロ
ーブにハイブリダイズする組換えフアージ含有
cDNAの精製クローンはクローン３５と命名さ
れ、このクローンの中に含まれるNANBH
cDNA配列は第８図に示される。 重複cDNA配列を単離する手法を利用すること
によつて、上流および下流にHCV cDNAの付加
的な配列を有するクローンが得られた。これらの
クローンの単離は．Ａ節で後述する。 単離されたクローン内にコードされたHCV
cDNAのヌクレオチド配列の分析により、複合
cDNAがひとつの長い連続したORFを有するこ
とが示されている。第２６図に、これらのクロー
ンからの複合DNA配列を、それによりコードさ
れた推定されるHCVポリペプチドとともに、示
す。 cDNA配列を得るための方法の記述は、歴史的
に興味深い。得られた配列（およびその相補配
列）は本発明により提供され、その配列あるいは
その部分的な配列は合成法を用いて、あるいは、
合成法と、ここに記載したのと同様の方法を用い
た部分配列を得る方法と組み合わせて、調製され
る。 HCV cDNAライブラリーからの、そしてクロ
ーン５−１−１，８１，１−２および９１から複
製されるλ−gt11株は、American Type
Culture Collection（ATCC），12301 Parklawn
Dr.，Rockville，Maryland 20850，にブタペス
ト条約により寄託されており、次に受託番号を有
する。 【表】 本出願が米国特許として許可され発行される
と、これら寄託物を利用することに関する制限は
すべて最終的に取り除かれる。そして上記命名さ
れた寄託物は、37CFR1.14および35USC1.22によ
りコミツシヨナーによつて権利を与えられた上記
出願が係属している間は、入手可能である。さら
に、その寄託物は、寄託日から30年間、あるいは
寄託物の最終要求から５年間；あるいは、米国特
許の有効である期間のいずれか長い方の期間の
間、維持される。これらの寄託物およびここで述
べられている寄託物は便宜のためにのみ寄託され
たものであり、ここでの記載された内容により本
発明を実施することを意図していない。すべての
寄託物におけるHCV cDNA配列は、参考とし
て、ここに述べられている。 HCV λ−gt11ライブラリーからの重複cDNA
配列を単離することによりゲノムを「ウオーキン
グ（walking）」する上記記載により、全HCVゲ
ノムに対するcDNAを単離し得る方法が提供され
る。しかし、本明細書で提供される情報が与えら
れたとしても、これらのcDNAを単離する他の方
法は当業者には自明である。そのような方法のい
くつかはこの後の．Ａ節で述べられる。 Ｂ ウイルス性ポリペプチドおよびフラグメン
トの調製 第１〜３２図のcDNA配列を利用して、後述の
ように単離されたcDNA配列であつても、これら
の図のcDNA配列であつても、このようなcDNA
配列を利用し得るため、いすれかの鎖においてコ
ードされているポリペプチドの抗原的に活性な領
域をコードする発現ベクターの構築が可能とな
る。これらの抗原的に活性な領域はコートまたは
エンベローブ（外被）抗原、あるいはコア抗原由
来であり得、それには例えば、ポリヌクレオチド
結合タンパク、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、
およびウイルス粒子の複製および／または構築
（assembly）に必要とされる他のウイルス性タン
パクが包含される。所望のポリペプチドをコード
するフラグメントは従来の制限消化を用いてある
いは合成法により、cDNAクローンから誘導さ
れ、例えばタンパクβ−ガラクトシダーゼあるい
はスーパーオキサイドジスムターゼ（SOD）（好
ましくはSOD）のような融合配列の一部を有す
るベクター中に連結される。SODの融合配列を
有するポリペプチドの産生に有用な方法およびベ
クターは、1986年10月１日に公開されたヨーロツ
パ特許出願公開番号第0196056号に記載されてい
る。SODおよびHCVポリペプチドの融合ポリペ
プチドをコードするベクター（つまり
NANB5-1-1，NANB81およびＣ１００−３；
HCV cDNAの複合配列中にコードされている）
は、それぞれ．B.1，．B.2，および．B.4
節に記載されている。どちらのセンス鎖において
も、オープンリーデイングフレームを有する
HCV cDNAの所望の部分は、成熟タンパクある
いは融合タンパクのような組換えポリペプチドと
して得られる。あるいは、このcDNAにコードさ
れるポリペプチドは、化学合成により供給され得
る。 所望のポリペプチドをコードするDNAは、融
合型であつても成熟型であつても、分泌を可能に
するシグナル配列を有していてもいなくても、適
当な宿主に適した発現ベクターに組み込まれ得
る。真核生物および原核生物の両宿主が、組換え
ポリペプチドを形成するために現在用いられてい
る。より一般的な制御系および宿主細胞系を、後
述の．Ａ節にまとめて示す。このポリペプチド
は、次に、溶解した細胞あるいは培地から単離さ
れ、実際の使用に必要な程度にまで精製される。
精製には、当該分野で公知の手法が用いられ得、
それには例えば、塩分画、イオン交換樹脂でのク
トマトグラフイー、アフイニテイクロマトグラフ
イー、遠心分離などがある。例えば、Methods
in Enzymology の種々のタンパク精製法を参
照されたい。このようなポリペプチドは、診断用
として用いられ得るか、あるいは抗体を中和する
ようなポリペプチドはワクチンに処方され得る。
これらのポリペプチドに対して生じた抗体もま
た、診断薬として、あるいは受動免疫治療に用い
られ得る。さらに、後述の．Ｊ節で考察するよ
うに、これらポリペプチドに対する抗体は、
HCV粒子の単離および同定に有用である。 このHCV抗原はまた、HCVビリオンから単離
され得る。このビリオンは、組織培養物中の
HCV感染細胞、あるいは感染宿主中で増殖し得
る。 Ｃ 抗原性ポリペプチドの調製およびキヤリア
ーとの結合 ポリペプチドの抗原性領域は、通常は比較的小
さく、代表的には８〜10個あるいはそれを下まわ
る長さのアミノ酸である。せいぜい５個のアミノ
酸フラグメントが抗原性領域を特徴づけている。
これらのセグメントは、HCV抗原領域に対応す
る。従つて、このHCVのcDNAを基本的に用い
ると、HCVポリペプチドの短いセグメントをコ
ードするDNAは、融合タンパクとして、あるい
は単離ポリペプチドとして、組換え手法により発
現させることができる。さらに、短いアミノ酸配
列は、化学合成で都合よく得ることができる。合
成ポリペプチドが正しいエピトープを提供するた
めに正しく形成されているが、小さすぎて免疫原
生がない場合には、このポリペプチドは、適当な
キヤリアーと結合させることができる。 このような結合を得るための多くの手法が当該
分野では公知であり、それには、Pierce
Company，Rockford，Illinoisから入手されるＮ
−サクシイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プ
ロピオネート（SPDP）およびサクシイミジル４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボネート（SMCC）を用いてジスルフイド
結合を形成する方法が包含される（もしこのペプ
チドがスルフヒドリル基を欠いていれば、システ
イン残基を付加することにより、この方法が用い
られ得る）。これらの試薬は、その試薬自身とあ
るアンパクのペプチドのシステイン残基との間の
ジスルフイド結合、およびリジンのε−アミノ、
あるいはその他の遊離のアミノ基によるアミド結
合を生成する。このようなさまざなのジスフイ
ド／アミド形成試薬は公知である。例えば、
Immun.Rev.（1982）62：185を参照されたい。他
の二官能性カツプリング試薬は、ジスフイド結合
よりむしろチオエーテルを形成する。これらのチ
オ−エーテル生成試薬の多くは市販されており、
それには６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ
酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反
応性エステルが包含される。このカルボキシ基
は、そのカルボキシ基とコハク酸イミドとを、あ
るいは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スル
ホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによつ
て活性化される。上述の化合物の名称は、それが
全てであることを意味せず、その化合物の修飾物
もまた明らかに用いられ得る。 キヤリアーとしては、それ自身が宿主に対して
有害な抗体の産生を誘導しないものであれば、い
ずれのキヤリアーもが用いられ得る。適当なキヤ
リアーは、典型的には、大きく、ゆつくり代謝さ
れる高分子物質であり、それには例えば、タンパ
ク；ラテツクス機能付与セフアロース、アガロー
ス、セルロース、セルロースビーズなどの多糖
体；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのような
重合アミノ酸；アミノ酸共重合体；および不活性
ウイルス粒子がある（例えば、．Ｄ節を参照の
こと）。特に有用なタンパク基質には、血清アル
ブミン、キーホールリンペツトヘモシアニン、免
疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアル
ブミン、テタヌス毒素、および当業者に公知の他
のタンパクがある。 Ｄ HCV エピトープを有するハイブリツト
粒子免疫原の調製 HCVのエピトープの免疫原性はまた、粒子形
成タンパク（例えば、Ｂ型肝炎の表面抗原と結合
するタンパク）と融合もしくは結合させた哺乳動
物の系あるいは酵母の系で調製することによつて
増強される。NANBV エピトープが粒子形成
タンパクコード配列に直接結合している構築物
は、HCV エピトープに関して免疫原性のハイ
ブリツトを産生する。さらに、調製したすべての
ベクターはHBVに特異的なエピトープを有し、
例えばプレＳペプチドのように異なる度合の免疫
原性を有する。このように、HCV配列を有する
粒子形成タンパクから構築される粒子は、HCV
およびHBVに関して免疫原性である。 肝炎の表面抗原（HBSAg）は、S.cerevisiae
（Valenzuelaら、（1982））、および例えば哺乳動
物細胞）Valenzuela，P.ら（1984））において形
成され、結合して粒子となることが示されてい
る。このような粒子の形成は、単量体のサブユニ
ツトの免疫原性を増強することが示されてきた。
この構築物はまた、HBSAgの免疫的に優性なエ
ピトープを有し、それはプレ表面（プレＳ）領域
の55アミノ酸を含有する（Neurathら，（1984））。
酵母中に発現され得るプレＳ−HBSAg粒子の構
築物は、ヨーロツパ特許出願公開第174444号
（1986年３月19日公開）に開示されている。酵母
の発現のための異種ウイルス配列を有するハイブ
リツドは、ヨーロツパ特許出願公開第175261号
（1966年３月26日公開）に開示されている。これ
らの出願の出願人は本出願人と同一であり、参考
としてここに取り入れられている。 これらの構築物もまた、SV４０のジヒドロ葉
酸還元酵素ベクターを用いてチヤイニーズハムス
ター卵巣（CHO）細胞のような哺乳動物細胞中
で発現させることができる（Michelleら
（1984））。 さらに、粒子形成タンパクをコードする配列の
部分は、HCVエピトープをコードするコドンで
置き換えられ得る。この置き換えにおいては、酵
母あるいは哺乳動物中で免疫原性粒子を形成する
単位の集合を媒介するために必要とされない部分
は削除され得、このようにして、HCVエピトー
プと競合する部分から付加的なHBV抗原部位が
除去される。 Ｅ ワクチンの調製 ワクチンは、HCV cDNA由来の免疫原性ポリ
ペプチドおよび第１〜３２図のcDNA配列由来の
免疫原性ポリペプチド、あるいはこれらが対応す
るHCVゲノム由来の免疫原性ポリペプチドの１
種あるいはそれ以上から調製される。HCVおよ
びフラビウイルスの間に観察される相同性は、ワ
クチンとして最も有効でありそうなポリペプチド
と、それらがコードされているゲノム領域に関す
る情報を提供する。フラビウイルスゲノムの一般
的な構造は、Riceら（1986）により考察されて
いる。こフラビウイルスのゲノムRNAは、ウイ
ルス特異的mRNA種のみであると考えられ、こ
れは、３つのウイルスの構造タンパク（つまり、
Ｃ，ＭおよびＥ）、そして、２つの大きな非構造
タンパク（NV４およびNV５）およびより小さ
な非構造タンパクの複合体の対に翻訳される。フ
ラビウイルスの主要な中和エピトープは、Ｅ（外
被：envelope）タンパクに属することは公知で
ある（Roehrig（1986））。対応するHCV Ｅ遺伝
子およびおよびポリペプチドをコードする領域
は、フラビウイルスの対する相同性に基づいて、
予想され得る。このように、ワクチンはHCV Ｅ
のエピトープを有する組換えポリペプチドを含有
し得る。これらのポリペプチドは、細菌、酵母、
あるいは哺乳動物細胞において発現するか、ある
いは、ウイルス調製物から単離され得る。他の構
造タンパクもまた、保護抗HCV抗体を生じるエ
ピトープを有し得ることが予想される。このよう
に、Ｅ，Ｃ，およびＭのエピトープを有するポリ
ペプチドもまた、単独であるいは組み合わせて、
HCVワクチン中で用いられ得る。 上記に加えて、NS１（非構造タンパク１）で
免疫すると黄熱病から保護されることが示されて
いる（Schlesingerら（1986））。たとえ、その免
疫により中和抗体が生じないとしてもこのことは
正しい。このように、特に、このタンパクはフラ
ビウイルスの間で高い度合で保持されるらしいの
で、HCV NS１もまた、HCV感染に対して保護
作用を有するようである。さらに、たとえ非構造
タンパクが中和抗体の産生を行わないとしても、
非構造タンパクは、ウイルスの病原性に対して保
護作用を提供し得ることもまた示される。 上記の見解においては、HCVに対する多価の
ワクチンは１あるいはそれ以上の構造タンパク、
および／または１あるいはそれ以上の非構造タン
パクを含有し得る。これらのワクチンは、例え
ば、組換えHCVポリペプチドおよび／またはビ
リオンから単離されたポリペプチドを含有し得
る。さらに、ワクチンにおける不活性HCVの使
用を可能にする。不活性化は、ウイルス溶解物の
調製によるか、あるいはフラビウイルスの不活性
化を引き起こす当該分野で公知の他の方法（例え
ば、有機溶媒あるいは界面活性剤での処理、ある
いはホルマリンでの処理）により行われ得る。さ
らに、ワクチンはまた、弱毒化HCV株からも調
製され得る。弱毒化HCV株の調製は、後述され
る。 フラビウイルスにおけるタンパクのいくつかは
高度に保持された領域を有することは公知であ
り、従つて、いくつかの免疫学的交差反応性が
HCVと他のフラビウイルスとの間に予想される。
フラビウイルスとHCVとの共通のエピトープは、
これらの病原因子によつて引き起こされる１ある
いはそれ以上の障害に対する保護抗体を生じる可
能性がある。このように、この認識に基づく多目
的ワクチンを設計することができる。 活性成分として免疫原性のポリペプチドを含有
するワクチンの調製は、当業者に公知である。代
表的には、このようなワクチンは、液体溶液ある
いは懸濁液のいずれかとして、注射できるように
調製される。注射の前に液体に溶解あるいは懸濁
させるのに適当な固形物の形態としても調製され
得る。この調製物はまた、乳化することもでき、
あるいは、リポソームにカプセル化されるタンパ
クであつてもよい。この活性免疫原性成分は、薬
学的に受容され得、この活性成分と適合性のある
賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤とし
ては、例えば、水、生理食塩水、デキストロー
ス、グリセロース、エタノールなど、およびこれ
らの組み合わせがある。さらに必要に応じて、こ
のワクチンには少量の補助物質が含有され得、こ
れには、補湿剤あるいは乳化剤、PH緩衝剤、およ
び／またはこのワクチンの効果を増強するアジユ
バントがある。効果的なアジユバントの例として
は、次の物質があり、そしてこれらには限定され
ない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラ
ミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン
（the−MDP），Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−
Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
（CGP11637，nor−MDPとする）、Ｎ−アセチル
ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル
−Ｌ−アラニン−２−（1′−2′−ジパルミトイル
−sn−グリセロ−３−ヒドロキシホスリルオキ
シ）−エチルアミン（CGP19835A，MTP−PEと
する）、およびRIBI。上記RIBIは細菌から抽出
される３つの成分、モノホスホリン脂質Ａ、トレ
ハロースジミコール酸、および細胞壁骨格成分
（MPL＋TDM＋CWS）、を、２％スクアレン／
トウイーン80乳液中に含んでいる。アジユバント
の効果は、HCV抗原配列を有する免疫原性ポリ
ペプチドに対する抗体の量を測定することによつ
て決定され得る。このポリペプチドは、種々のア
ジユバントを含むワクチン中のこのポリペプチド
を投与することにより生じる。 このワクチンは、通常、非経口的に注射で投与
され、その形態は、例えば、皮下注射であつても
筋肉注射であつてもよい。他の投与形態に適当な
処方には座薬があり、場合によつては経口処方も
ある。座薬としては従来のバインダーおよび担体
が用いられ得、それには例えばポリアルキレング
リコールあるいはトリグリセリドがある。このよ
うな座薬は、活性成分を0.5〜10％、好ましくは
１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成され
る。経口処方物には、通常使用される賦形剤が含
有され、そのような賦形剤には例えば、精製グレ
ードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ス
テアリン酸マグネシウム、サツカリンナトリウ
ム、セルロース、炭酸マグネシウムなどがある。
これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、
カプセル剤、放出を維持するような処方、あるい
は粉剤の形態を有し、活性成分を10％〜95％、好
ましくは25％〜70％の割合で含有する。 このタンパクは、そのままであるいは塩の形
で、ワクチンに処方され得る。薬学的の受容され
得る塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ
基により形成される）が包含され、この塩は、無
機酸（例えば、塩酸あるいはリン酸）あるいは有
機酸（例えば酢酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン
酸など）を用いて形成される。遊離のカルボキシ
ル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニ
ア、水酸化カルシウム、あるいは水酸化鉄）およ
び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリ
メチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒ
スチジン、プロカインなど）からも誘導され得
る。 Ｆ ワクチンの用量および投与 このワクチンは投薬処方に適合するように、そ
して予防効果および／または治療効果が得られる
量で、投与される。投与される量は、一般に１回
の投与あたり抗原が5μg〜250μgであり、この投
与量は治療される個体、該個体の免疫系の抗体合
成能、および所望する保護の度合に依存する。投
与に必要とされる活性成分の正確な量は、医師の
判断によるものであり、それぞれの個体に特有で
あり得る。 このワクチンは、１回の投与計画で与えられる
か、あるいは好ましくは複数回の投与計画で与え
られ得る。複数回の投与計画では、最初のワクチ
ン投与は、１〜10回に分けて行なわれ、第２回目
の投与では免疫応答維持もしくは強化するために
第１回目とは別に所定の間隔をおいて引き続いて
１〜４ケ月投与され、そして必要であれば数カ月
後にさらに引続き投与が行なわれる。この投与形
態はまた、少なくとも部分的には、個人の必要量
によつて決定され、医師の判断による。 さらに、免疫原性のHCV抗原を有するワクチ
ンは、他の免疫調製因子、例えば免疫グロブリン
と組み合わせて投与され得る。 Ｇ HCVエピトープに対する抗体の調製 上述のようにして調製される免疫原性のポリペ
プチドは、ポリクローナル、および、モノクロー
ナルの両抗体を生産するのに用いられる。ポリク
ローナル抗体が所望であれば、選択される哺乳動
物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）
はHCVエピトープを有する免疫原性ポリペプチ
ドを用いて免疫される。免疫された動物から得ら
れる血清は回収され、公知の方法によつて処理さ
れる。HCVエピトープに対するポリクローナル
抗体を有する血清が他の抗原に対する抗体を含ん
でいる場合には、このポリクローナル抗体は免疫
アフイニテイクロマトグラフイーによつて精製さ
れ得る。ポリクローナルな抗血清を産生し、処理
する手法は、当該分野では公知であり、例えば
MayerおよびWalker（1987）を参照されたい。 あるいは、ポリクローナル抗体は、あらかじめ
HCVに感染させておいた哺乳動物から単離され
得る。感染個体の血清から得られるHCVエピト
ープに対する抗体を精製する方法の例は、．E.
節で述べられており、これは、アフイニテイクロ
マトグラフイーに基づき、SODとcDNAクロー
ン５−１−１内にコードされたポリペプチドとの
融合ポリペプチドを利用する方法である。 HCVエピトープに対するモノクローナル抗体
もまた、当業者により容易に生産され得る。ハイ
ブリドーマによつてモノクローナル抗体を作成す
る一般的な方法は公知である。永久増殖性の抗体
産生細胞系は細胞融合によつて作成することがで
き、さらに、腫瘍原性DNAを用いたＢリンパ球
の直接形質転換、あるいはEpstein−Barrウイル
スを用いたトランスフエクシヨンのような他の手
法によつてもまた作成することができる。例え
ば、M.Schreierら（1980）；Hammerlingら
（1981）；Kennettら（1980）の文献を参照された
い。さらに、米国特許No.4341761；No.4399121；No.
4427783；No.4444887；No.4466917；No.4472500；No.
4491632；およびNo.4493890もまた、参照された
い。HCVエピトープに対して産生されるモノク
ローナル抗体のパネルには、種々の目的（例えば
アイソタイプ、エピトープ親和性など）に応じて
スクリーニングされ得る。 モノクローナルおよびポリクローナル両抗体
は、HCVエピトープに対して形成され、特に診
断において有用であり、中和抗体は受動免疫治療
に有用である。特にモノクローナル抗体は抗イン
デイオタイプの抗体を生じさせるために用いられ
得る。 抗イデイオタイプ抗体は、それに対して保護が
望まれる感染因子の抗原の「内的イメージ
（internal image）」を伴う免疫グロブリンであ
る。例えば、Nisonoff，A.ら（1985）および
Dreeseman（1985）を参照されたい。 抗イデイオタイプ抗体を生じさせるための手段
は、当該分野で公知である。例えば、Grzych
（1985），MacNamaraら（1984）、および
Uytdehaagら（1985）を参照されたい。これら
の抗イデイオタイプ抗体は、NANBHの治療、
およびHCV抗原の免疫原性領域を解明するのに
も有用である。 Ｈ 診断用オリゴヌクレオチドプローブおよび
キツト 単離されたHCV cDNAの開示部分（第１〜３
２図に示される部分を包含する）を基本として用
いて、約８個あるいはそれ以上のヌクレオチドを
有するオリゴマーが切断あるいは合成によつて調
製され得る。このオリゴマーは、HCVゲノムと
ハイブリダイズし、このウイルス性因子の同定、
さらにこのウイルス性ゲノムの特徴づけ、および
疾患個体のウイルスの検出に有用である。HCV
ポリヌクレオチドプローブ（天然あるいは誘導さ
れた）は、ハイブリダイゼーシヨンによつて独特
のウイルス配列を検出し得る長さである。６〜８
個のヌクレオチドが、その機能を果たし得る長さ
であるが、10〜12個のヌクレオチド配列が好適で
あり、約20のヌクレオチドが最も好適であると考
えられる。好ましくは、これら配列は、異種性を
欠いている領域由来である。これらプローブは自
動化オリゴヌクレオチド合成法を含む、定型的な
方法を用いて調製され得る。有用なプローブに
は、例えば、本明細書で開示されたクローン５−
１−１および付加的なクローン、そして、cDNA
ライブラリーをプローブする際に有用な後述の
種々のオリゴマーがある。HCVゲノムのどの独
特な部分の相補鎖も充分使用され得る。フラグメ
ントの長さが長くなるにつれて完全に相補性を有
する必要はなくなるのであるが、プローブとして
使用するには完全な相補性が望まれる。 診断用としてこのようなプローブを使用するに
は、血液あるいは血清のような分析されるべき生
物学的試料は、必要であれば、そこに含有されて
いる核酸を抽出するために処理される。この試料
から得られた核酸は、ゲル電気泳動あるいは他の
サイズ分離手段にかけられ得る。あるいは、この
核酸試料は、サイズ分離を行うことなくドツトブ
ロツトされ得る。次にこのプローブは標識化され
る。プローブを標識するために適当な標識物、お
よび方法は当該分野では公知であり、それには例
えば、ニツク翻訳あるいはキナーゼ処理で取り込
まれた放射性標識物、ビオチン螢光プローブ、お
よび化学発光プローブが含まれる。試料から抽出
された核酸は、次に、適当な厳密さのハイブリダ
イゼーシヨン条件下で、標識されたプローブと共
に処理される。 このプローブは、HCVゲノムに完全に相補的
に作成され得る。従つて、偽陽性を防ぐために、
通常、厳密性の高い条件が望まれる。しかし、プ
ローブが異種性を欠くウイルスゲノム領域と相補
性を有する場合のみに、厳密性の高い条件が使用
される。ハイブリダイゼーシヨンの厳密さは、ハ
イブリダイゼーシヨンおよび洗浄工程中の多くの
因子（温度、イオン強度、時間の長さおよびホル
ムアルデヒドの濃度を含む）により決定される。
これらの因子は、例えばManiatis，Ｔ（1982）に
より概説されている。 一般に、このHCVゲノム配列は、感染個体の
血清中に比較的低レベル（つまり、１mlあたり約
102〜103個の配列）で、存在する。このレベルは
ハイブリダイゼーシヨンアツセイにおいて増幅手
法が用いられることが必要であり得ることを示し
ている。そのような手法は当該分野では公知であ
る。例えばEnzo Biochemical Corporationの
「Bio−Bridge」システムでは、DNAプローブに
未修飾の3′−ポリ−dTテールを付加するために、
末端デオキシヌクレオチドトランスフエラーゼを
用いている。ポリdTテールを付加したプローブ
は標的となるヌクレオチド配列にハイブリダイズ
され、ついで、ビオチン修飾ポリＡにハイブリダ
イズされる。PCT出願84／03520および
EPA124221には次のような方法のDNAハイブリ
ダイゼーシヨンアツセイが記述されている：(1)被
分析物を、酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的
な単鎖DNAプローブにアニールする；および(2)
得られたテールが付加された二本鎖を酵素標識オ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。
EPA204510には次のような方法のDNAハイブリ
ダイゼーシヨンアツセイが記述されている。この
方法では、分析物であるDNAを、例えば、ポリ
dTテールのようなテールを有するプローブと接
触させ、次に増幅鎖と接触させる。この増幅鎖
は、プローブのテールとハイブリダイズするポリ
Ａ配列のような配列を有し、複数の標識鎖を結合
することが可能である。得の望ましい方法では、
まず血清中標的HCV配列が約10000倍、つまり約
106配列／mlとなるように、標的HCV配列の増幅
が行われる。これは、例えば、Saikiら（1986）
の方法によつて行なわれ得る。この増幅された配
列は、ハイブリダイゼーシヨンアツセイ法を用い
て検出され得る。このハイブリダイゼーシヨンア
ツセイ法は、本願出願人による係属中の米国出願
（1987年10月15日出願；代理人のDocketNo.2300−
0171）中に記載されており、これは、参考文献と
してここに取り入れられている。106／mlのレベ
ルで配列を検出するこのハイブリダイゼーシヨン
アツセイ法では、単鎖の分析すべき核酸に結合
し、多数の単鎖標識オリゴヌクレオチドにも結合
する核酸多量体を利用する。標識されたポリヌク
レオチドプローブを用いる、適当な溶液相のサン
ドイツチアツセイ、およびプローブの調製法は、
1987年６月16日に公開された本願出願人による
EPO225807に記載されており、これを参考文献
としてここに取り入れる。 このプローブは診断用キツト中に組み入れるこ
とができる。診断用キツトは、プローブDNAを
有し、このプローブDNAは標識されているか、
あるいはこのプローブDNAは標識されておらず、
標識用の成分がキツト中に入つている。このキツ
トにはまた、特定のハイブリダイゼーシヨンのプ
ロトコルに必要な他の試薬および材料（例えば、
標準品、およびこのテストを行なうための指示
書）が適当に包装されて含まれる。 イムノアツセイおよび診断用キツト HCV抗体を含有する血清と免疫的に反応すえ
るポリペプチド、およびこれらのポリペプチドの
HCV特異的エピトープに対して生じる抗体は、
イムノアツセイにおいて、例えば血液または血清
試料を包含する生物学的試料におけるHCV抗体
の存在、あるいはウイルスおよび／またはウイル
ス抗原の存在を検出するために有用である。上記
HCV抗体は、例えば、．Ａ節で記載されたク
ローン由来であり、あるいは、このクローン内に
コードされ、そしてそれらの複合体である。上記
HCV特異的エピトープに対して生じる抗体につ
いては、例えば、．Ｂ節を参照されたい。この
イムノアツセイの設計は多くの変更を行うことが
可能であり、これらアツセイの多様性については
当該分野では既知である。例えば、このイムノア
ツセイでは、１種のウイルス抗原が利用され得
る。このウイルス抗原は、例えば、．Ａ節で記
載のHCV cDNAを有するクローンのいずれか由
来のポリペプチド、あるいはこれらのクローンの
cDNA由来の複合cDNA由来のポリペプチド、あ
ついはこれらのクローンのcDNAが誘導される
HCVゲノム由来のポリペプチドである。あるい
は、このイムノアツセイには、これらの源由来の
ウイルス抗原の組合せが用いられ得る。例えば、
ウイルスのエピトープに対する１種のモノクロー
ナル抗体、ひとつのウイルスの抗原に対するモノ
クローナル抗体の組み合わせ、異なるウイルス抗
原に対する複数のモノクローナル抗体、同一のウ
イルス抗原に対するポリクローナル抗体、あるい
は異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗
体が使用され得る。プロトコルは、例えば、競合
分析法、力説分析法、あるいはサンドイツチタイ
プの分析法を基本とすることができる。このプロ
トコルではまた、固体支持体を用いるか、あるい
はこのプロトコルは、免疫沈殿法であり得る。ほ
とんどのアツセイは標識化抗体あるいはポリペプ
チドの使用を含む。この標識物には例えば、螢光
分子、化学発光分子、放射性分子あるいは染色分
子がある。このプローブからのシグナルを増幅す
るアツセイもまた公知である。その例としては、
ビオチンおよびアビジンを利用するアツセイ、お
よび酵素標識および酵素媒介イムノアツセイ（例
えば、ELISAアツセイ）がある。 HCVのフラビウイルスモデルにより、ビリオ
ンの構想タンパクに対する診断用エピトープの位
置の推定が可能となる。Ｃ，プレＭ，ＭおよびＥ
ドメインはすべて、ウイルス抗原を検出するため
に、特に診断用に、有意な可能性のあるエピトー
プを含有していると考えられる。同様に、非構造
タンパクのドメインは、重要な診断用エピトープ
（例えば、推定のポリメラーゼをコードするNS
５；および推定の補体結合抗原をコードするNS
１）を有することが予想される。これらの特異的
ドメイン由来のエピトープを有する組換えポリペ
プチドあるいはウイルスのポリペプチドは、感染
血液提供および感染患者におけるウイルス抗体の
検出に有用である。 さらに、Ｅおよび／またはＭタンパクに対する
抗体が、NANBHによつて引きおこされるHCV
患者および感染血液提供者のウイルス抗原を検出
するイムノアツセイにおいて用いられて得る。さ
らに、これら抗体は急性期のドナーおよび患者を
検定するのに非常に有用である。 免疫診断に適し、適切に標識された試薬を有す
るキツトが、適切な材料を適当な容器中に包装す
ることによつて得られる。この適切な材料には、
HCVエピトープを有する本発明のポリペプチド、
あるいはHCVエピトープに対する抗体、および
アツセイの遂行に用いられる他の試薬および物
質、さらにアツセイの指示書のセツトを含む。 Ｊ ウイルスゲノムに対するcDNAのプローブ
を用いた、ビリオンおよびウイルス抗原の他の
特性決定 ．A.節に記載したクローンのHCV cDNA配
列の情報は、第１図から第３２図に示すように、
HCVゲノムの配列とHCV因子の同定と単離とに
ついての情報をさらに得るために用いられ得、そ
の結果、ゲノム性質、ウイルス粒子の構造、およ
びウイルスは有する抗原の性質を含めたウイルス
の特性決定の助けになる。さらに、この情報によ
つて、付加的なポリヌクレオチドプローブ、
HCVゲノム由来のポリペプチド、およびHCVが
原因のNANBHの診断および／または治療に有
用なHCVエピトープに対応する抗体が得られる
ようになる。 上記クローンのcDNA配列の情報は、．Ａ節
に記載されたクローンのcDNAの起源である
HCVゲノムの未確定領域由来の他のcDNA配列
を単離するためのプローブを設計するのに有用で
ある。例えば、約８個またはそれ以上、好ましく
は20個またはそれ以上にヌクレオチドの配列を有
する標識化プローブは、第１，第３，第６，第
９，第１４および第３２図に示すHCV cDNA配
列の群5′末端または3′末端に近い領域由来のもの
であり、HCV cDNAライブラリーから重複
cDNA配列を単離するのに用いられ得る。上記ク
ローンのcDNAと重複するこれらの配列は、上記
クローンのcDNAの起源でないゲノムの領域由来
の配列も含んでいるが、．Ａ節に記載のクロー
ンのcDNAと必ずしも重複しない、他の重複断片
を同定するためのプローブを合成するのに利用す
ることができる。HCVゲノムの切断され、その
セグメントが共通の配列を欠いていなければ、ウ
イルスゲノム由来の重複cDNAを単離する技術を
利用して、全ウイルスゲノムの配列を決定するこ
とができる。これとは異なり、ゲノムが切断され
ていて共通配列を欠いている場合は、ゲノムの配
列は、．Ａ節に記載したクローンの単離および
配列決定の技術を用い、クローン５−１−１を単
離するのに用いたのと同様に、λ−gt11 HCVラ
イブラリーを血清学的にスクリーニングし、
cDNA単離物の配列を決定し、単離されたcDNA
を利用して重複断片を単離することによつて、決
定することができる。あるいは、ゲノムセグメン
トの特定決定は、精製されたHCV粒子から単離
されたウイルスゲノムで行うことができる。
HCV粒子を精製し、精製中の粒子を検出する方
法は後述する。ポリヌクレオチドのゲノムのウイ
ルス粒子からの単離工程は、当該技分野では公知
であり、利用される一方向を実施例．A.1.に示
す。単離されたゲノムのセグメントは、次に、ク
ローン化され配列決定され得る。このように、こ
こで提供される情報によつて、その性質にかかわ
りなく、HCVゲノムをクローン化し配列を決定
することができる。 cDNAライブラリーを構築する方法は、当該技
術分野では公知であり、すでに記載し、あるいは
後で述べられる。λ−gt11内にHCV cDNAライ
ブラリーを構築する方法は、．A.節ですでに
述べられている。しかし、核酸プローブでスクリ
ーニングするのに有用なcDNAライブラリーもま
た、当該技術分野で公知の他のベクター内、例え
ばλ−gt10〔ヒユインら（Huynhet al），1985年〕
内で構築することができる。第１〜３２図の
cDNA由来のプローブ、およびこれらのcDNA由
来のポリヌクレオチドから合成されたプローブに
よつて検出された、HCV由来のcDNAは、単離
されたポリヌクレオチドを、適当な制限酵素で切
断することによつて、クローンから単離し、配列
を決定することができる。例えば、クローン５−
１−１中のHCV cDNAと重複するHCV cDNA
の単離と配列決定とに使用される手法について
は、．A.3節および．A.4節を；クローン８
１中のHCV cDNAと重複するHCV cDNAの単
離と配列決定とについては、．A.5〜．A.7
節を；そして、他のクローン（クローン３６）お
よびクローン８１と重複するクローンの単離と配
列決定とについては、．A.8節および．A.9
節を参照されたい。 これらの重複HCV cDNA由来の配列情報は、
ウイルスゲノム内の相同領域と異なる領域とを決
定するのに有用であり、このことにより、異なる
種類のゲノムおよび／または欠陥粒子
（defective particles）の集団の存在を示すこと
ができる。．G.節に記載の手法を利用して、
HCVの単離（後述する）中に、生物学的試料中
のHCV，HCV抗原またはHCV核酸を検出する
ことはまた、ハイブリダイゼーシヨンプローブを
設計するのに有用である。さらに、重複cDNA
は、クローン５−１−１，３６，８１，９１およ
び１−２内ならびに．A.節に記載の他のクロ
ーン内にコードされているポリペプチドをコード
するHCVゲノム由来のポリペプチドを発現ベク
ターを作製するのに利用できる。HCVエピトー
プを有するこれらのポリペプチドを作製する技術
と、ポリペプチドに含有されているHCVエピト
ープに対応する抗体とその用途に関する技術と
は、クローン５−１−１，３２，３５，３６，１
−２，８１および９１に含まれるNANBV
cDNA配列由来のポリペプチドについて記載さ
れ、すでに検討されまた後にも検討される技術と
類似する。 クローン５−１−１，３２，３５，３６，８
１，９１，１−２および．A.節に記載の他の
クローンに含まれているcDNA配列の群内に、
HCVに特有のものと考えられるエピトープを含
有する抗原がコードされている。つまり、これら
の抗原に対する抗体がHAVもしくはHBVに感染
した固体に欠けており、そしてHCVに感染して
いない固体に欠けている（．A.節に示す血清
学的データ参照）。さらに、これらのcDNAの配
列情報と、HAV，HBV，HDVの配列および遺
伝子バンクのゲノム配列とを比較すると、これら
のcDNAと上記の起源のポリヌクレオチドの配列
とには最小の相同性が存在することが示されてい
る。このように、これらのクローンのcDNA内に
コードされている抗原に対する抗体は、感染した
固体から単離したBB−NANBV粒子を同定する
のに用いることができる。さらに、この抗体は、
NANBH因子の単離にも有用である。 HCV粒子は、BB−NANBVに感染した固体
由来の血清または細胞培養物から、以下のような
当該技術分野で公知の方法で単離することができ
る。公知野方法としては、例えば、沈降法もしく
は排除法のようなサイズ識別に基づく方法；密度
勾配による超遠心分離法のような密度に基づく方
法；ポリエチレングリコールのような試薬による
沈殿法；またはアニオンもしくはカチオン交換物
質、疎水性によつて結合する物質のような種々の
物質およびアフイニテイカラムのカラムによるク
ロマトグラフイー法がある。この分離工程中に、
HCVの存在は次のような方法で検知できる。す
なわち、先に述べたHCV cDNA由来のプローブ
を用いて、抽出されたゲノムをハイブリダイゼー
シヨン分析する方法；または第１〜３２図に示す
cDNA配列の群内にコードされたHCV抗原に対
する抗体および先に述べた重複HCV cDNA配列
内にコードされたHCV抗原に対する抗体をプロ
ーブとして用いる免疫検定法（，I.節参照）が
ある。抗体はモノクローナル抗体であつてもポリ
クローナル抗体であつてもよく、免疫検定法にこ
れら抗体を使用する前に精製することが望まし
い。クローン５−１−１内にコードされた抗原に
対するポリクローナル抗体の精製法は、．E.節
に記載されているが、類似の精製法を、他の
HCV抗原に対する抗体に利用することができる。 第１〜３２図に示すcDNAの群内にコードされ
たHCV抗原とに対する抗体は、固体の支持体に
固定されており、免疫アフイニテイクロマトグラ
フイーによるHCVの単離に有用である。免疫ア
フイニテイクロマトグラフイーの手法は、当該技
術分野で知られており、例えば、抗体を固体の支
持体に固定しその免疫選択活性を保持する方法が
ある。この方法には、抗体が支持体に吸着されて
いる方法〔例えば、カースタツク（Kurstak）の
ENZYME IMMUNODIAGNOSIS，31〜37頁参
照〕および抗体が支持体と共有結合されている方
法がある。一般に、これらの方法は、抗原を固体
支持体に共有結合させて使用する方法と同様であ
り、それは．C.節に概略記載されているが、ス
ペーサー茎が二官能性のカツプリング試薬に含ま
れ、抗体の抗原と結合する部位が近づきやいよう
になつている。 精製処理中に、HCVの存在が、すでに述べた
第１〜３２図に示すHCV cDNA配列の群および
重複HCV cDNA配列由来のポリヌクレオチドを
プローブとして利用する核酸ハイブリダイゼーシ
ヨン法によつて検出および／または確認される。
この場合、画分は、ウイルス粒子の崩壊を起こす
ような条件下で、例えば、キレート試薬の存在下
および．H.節にも記載したハイブリダイゼー
シヨン法によつて検出されるウイルス核酸の存在
下で、界面活性剤によつて処理される。単離され
た粒子がHCVを誘発する因子であるということ
は、単離されたウイルス粒子をチンパンジーに感
染させ、次いでNANBHの徴候が感染によるも
のであるいか否かを決定することによつて確認す
ることができる。 次に、精製された調製物から得たウイルス粒子
は、さらに特性決定される。そのゲノム核酸が精
製された。このゲノム核酸がRNaseに対して感
受性でDNase に感受性でないことから、そ
のウイルスがRNAゲノムで構成されていること
が明らかである（後述の．C.2.節参照）。その
ゲノム核酸のストランドの状態（strandedness）
および円形性（circularity）であるか非円形性で
あるかということは、公知の技術、例えばそれを
電子顕微鏡により視覚化すること、密度勾配によ
り移動させること、および沈降特性を調べること
によつて測定される。捕捉されたHCVゲノムは
HCV cDNAの負のストランドとハイブリダイズ
することから、HCVは正のスタランドのRNAゲ
ノムを含むことが明らかである（．H.1節参
照）。このような手法は、例えば、METHODS
IN ENZYMOLOGYに記載されている。さら
に、精製された核酸は、クローン化され、公知の
方法（例えば、ゲノム物質はRNAなので逆転写
法）によつて配列を決定することができる。例え
ば、マニアテイス（1982年）、およびクローバー
（Clover）（1985年）の文献を参照されたい。ウ
イルス粒子由来の核酸を利用すれば、それが切断
されていなくても、全ゲノムの配列を決定するこ
とができる。 １４ｉから３９ｃまでの結合クローン（第２６
図参照）の連続ORF内にコードされたポリペプ
チドの相同性の試験を行うと、HCVポリペプチ
ドは、フラビウイルス（flaviviruses）の保存さ
れた領域内の対応するタンパクと相同性のある領
域を有することが示される。この具体例は、．
H.3.節に示されている。この知見には、多くの重
要な効果がある。第１に、この情報は、HCVが
正のストランドのゲノムを有し、その大きさが約
10000ヌクレオチドであることを示す試験結果と
ともに、HCVがフラビウイルスかまたはフラビ
様ウイルスであることを示唆していると考えて矛
盾しない。一般に、フラビウイルスのビリオンと
ゲノムとは、比較的変化しない構造と組織を有
し、このことは公知である。ライスら（Rice et
al）（1986年）、およびブリントン エム エー
（Brinton M.A.），（1988年）を参照されたい。従
つて、ポリペプチドC.プレＭ／ＭおよびＷをコー
ドする構造遺伝子は、クローン１４ｉの上流の遺
伝子の5′末端に位置し得る。さらに、他のフラビ
ウイルスと比較することによつて、これらのタン
パクをコードする配列の正確な位置を予想するこ
とができる。 クローン１４ｉのゲノムの上流の配列の単離
は、本明細書に示した多くの方法により達成され
得、そのことは、当業者に自明である。例えば、
ゲノム“ウオーキング法（genome“Walking”
technique）が、クローン１４ｉ内のゲノムの
５′側にあるそのクローンと重複する他の配列を
単離するのに用いられ得るが、この方法によつ
て、付加的な配列の単離が行われる。この手法
は、後述の．A.節で十分に述べられている。
例えば、フラビウイルスは、保存されたエピトー
プと保存された核酸配列の領域とを有することが
知られている。保存された配列を含むポリヌクレ
オチドは、HCVゲノムを捕捉するプローブとし
て用いて、それを単離することができる。さら
に、これらの保存された配列は、第２２図に示す
HCV cDNA由来の配列とともに、ポリメラーゼ
の連鎖反応の技術を用いて、クローン１４ｉの配
列の上流のゲノム配列を増幅する系に使用するプ
ライマーを設計するのに利用される。この例は後
述される。 HCVの構造もまた、決定され、その成分が単
離され得る。その形態と大きさは、例えば電子顕
微鏡によつて決定され得る。コート抗原もしくは
エンベロープ抗原のような特異的なウイルスポリ
ペプチド抗原、または核酸結合タンパク、コア抗
原のような内部抗原、およびポリヌクレオチドポ
リメラーゼの同定と位置決定とは、例えば、抗原
が大きなもしくは小さなウイルス成分として存在
するか否かを測定すること、および単離された
cDNA内にプローブとしてコードされた特異的抗
原に対する抗体を利用すること、によつて行なわ
れ得る。この情報は、ワクチンを設計するのに有
用である。例えば、ワクチン調製物に外部抗原を
含有させることが好ましい。多価ワクチン
（multivalent vaccine）は、例えばＥのような構
造タンパクをコードするゲノム由来のポリペプチ
ド、および例えば非構造ポリペプチドもしくは構
造ポリペプチドのような、ゲノムの別の部分由来
のポリペプチドで構成されていてもよい。 Ｋ HCV複製用の細胞培養液系と動物モデル
系 HCVがフラビウイルスもしくはフラビ様ウイ
ルスであるという示唆によつて、HCV増殖法に
ついての情報が提供される。“フラビ様”という
用語は、そのウイルスが、フラビウイルスの公知
の保存された領域に対して有意の相同性を示し、
そして、そのゲノムの大部分が単一のORFであ
ることを意味する。フラビウイルスの培養法は、
当業者に公知である〔例えば、ブリントン（1986
年）およびストラー、ブイ（Stollar，V.）（1980
年）の総論を参照されたい〕。一般に、HCVを培
養するのに適切な細胞もしくは細胞としては、フ
ラビウイルスの複製を維持することが知られてい
るもの、例えば次のものがある：サル腎臓細胞系
（例えば、MK2，VERO）；ブタの腎臓細胞系
（例えば、PS）；ベビーハムスターの腎臓細胞系
（例えば、BHK）；ネズミマクロフアージ細胞系
（例えば、P388D1，MK1，Mm1）；ヒトクロフ
アージ細胞系（例えば、Ｕ−937）；ヒト末梢白血
球；ヒトの付着性単球；肝細胞もしくは肝細胞系
（例えば、HUH7，HEPG2）；胚もしくは胚細胞
系（例えば、ニワトリの胚繊維芽細胞）；または
無脊椎動物由来の細胞系。 上記無脊椎動物由来の細胞系として好ましいの
は昆虫由来のもの（例えば、シヨウジヨウバエの
細胞系）であり、さらに好ましいのは節足動物由
来のもので、例えば蚊の細胞系〔例えば、A.ア
ルボピクツス（A.Albopictus）、イーデス イー
ジプチー（Aedes aegypti）、クーテツクス ト
リテニオリンクス（Cutex tritaeniorhynchus）〕
もしくはダニ細胞系〔例えば、RML−14 ダー
マセンサー パルマペルツス（Dermacentor
parumaperyus）〕である。 一次肝細胞を培養しついでHCVに感染させて
もよいし、あるいは肝細胞培養物を感染した個体
（例えば、ヒトもしくはチンパンジー）の肝臓か
ら得てもよい。後者の場合は、生体内で感染した
細胞が生体外で継代された例である。さらに、
種々の永久増幅細胞化法を、肝細胞培養由来の細
胞系を得るために用いることができる。例えば、
一次肝臓培養物（肝細胞集団の集積の前後）は、
種々の細胞と融合され、安定性を保持する。例え
ば、永久的または半永久的細胞系を創製するため
に、培養物を、形質転換ウイルスに感染させる
か、または形質転換遺伝子でトランスフエクトさ
せる。さらに、例えば、肝臓培養物中の細胞は、
融合されて、確立された細胞系（例えば、
HepG2）となり得る。細胞融合法は、当該技術
分野で既知であり、例えば、ポリエチレングリコ
ール、センダイウイルスおよびエプスタイン−バ
ールウイルスのような融合因子が使用される。 上記に述べたように、HCVはフラビウイルス
もしくはフラビ様ウイルスである。従つて、細胞
系のHCV感染は、おそらく、細胞をフラビウイ
ルスに感染させる当該技術分野で公知の方法によ
つて達成することができる。これらの方法には、
例えば、細胞内にウイルスが侵入しうる条件下
で、細胞をウイルス調製物とともにインキユベー
トする方法がある。さらに、細胞を単離されたウ
イルスポリヌクレオチドでトランスフエクトする
ことによつてウイルスの産生物を得ることができ
る。トガウイルス（Togavirus）およびフラビウ
イルスのRNAが、種々の脊椎動物の細胞系〔フ
エフアーコーン（Pfefferkorn）およびシヤピロ
（Shapiro），1974年〕および蚊細胞系「ペレーグ
（Peleg），1969年〕に感染性であることが知られ
ている。組織培養細胞を、RNA二本鎖、正のス
トラドのRNAおよびDNA（cDNAを含む）でト
ランスフエクトする方法、当該技術分野では公知
であり、例えば、エレクトロポーレーシヨン法
（electroporation）、およびDEAE−デキストラ
ン（DEAE−Dextran）もしくはリン酸カルシウ
ムによる沈殿法を用いる手法がある。HCV
RNAの多くの起源を、完全ゲノムに対応する
HCV cDNAの転写を生体外で行うことによつて
得ることができる。この物質もしくはクローン化
されたHCV cDNAを用いたトランスフエクシヨ
ンによつて、ウイルスが複製されそしてウイルス
が生体外で増殖するようになるはずである。 培養細胞に加えて、動物モデル系がウイルス複
製に使用できるが、フラビウイルスが動物系に存
在するということは、当業者には公知である〔例
えば、モナース（Monath）による総説（1986
年）参照〕。従つて、HCVの複製は、チンパンジ
ーで起こるだけでなく、例えば、マーモセツトや
サツクリングマウスでも起こる。 Ｌ HCVに対する抗ウイルス剤のスクリーニ
ング HCVの細胞培養物と動物モデル系とを利用す
ることによつて、HCVの複製を阻害する抗ウイ
ルス剤、特に優先的に細胞を生育・増殖させる一
方でウイルスの複製を阻害する抗ウイルス剤をス
クリーニングすることができる。これらのスクリ
ーニング法は、当業者には知られている。一般
に、抗ウイルス剤は、ウイルスの複製を維持する
細胞培養系でウイルスの複製を阻害する効果と、
動物モデル系での感染性もしくはウイルス病原性
を阻害する効果（および低レベルの毒性）につい
て種々の濃度で試験される。 HCV抗原とHCVポリヌクレオチドを検出する
ためのここに記載された方法と組成物は、ウイル
ス複製に対する抗ウイルス剤の効果を検出する方
法として、細胞プラーク検定法もしくはID50検定
法の代わりにこれらの方法よりもおそらく高感度
の方法を提供することから、抗ウイルス剤のスク
リーニングに有用である。例えば、ここに記載し
たHCVポリヌクレオチドプローブは、細胞培養
で産生されたウイルス核酸を定量するのに利用で
きる。このことは、例えば感染した細胞の核酸と
標識したHCVポリヌクレオチドプローブとのハ
イブリダイゼーシヨンまたは競合ハイブリダイゼ
ーシヨンによつて達成することができた。例え
ば、また抗HCV抗体は、本明細書に記載の免疫
検定法を利用して細胞培養物中のHCV抗原を同
定および定量するのに利用できる。さらに、感染
細胞の培養物中のHCV抗原を競合検定法で定量
することは望ましいことであるから、本明細書に
記載したHCV cDNA内にコードされたポリペプ
チドは、これらの競合検定法に有用である。一般
に、HCV cDNA由来の組換え体HCVポリペプ
チドに標識化し、この標識化ポリペプチドと
HCVポリペプチドとの結合が細胞培養系内に産
生された抗原によつて阻害されるのを監視する。
さらに、これらの方法は、HCVが細胞系内で細
胞死を起こすことなく複製できる場合、特に有用
である。 Ｍ 弱毒化されたHCV株の調製 上記のことに加えて、組織培養系および／また
は動物モデル系を利用して弱毒化されたHCV株
を単離することができる。これらの株は、ワクチ
ン用もしくはウイルス抗原単離用に適している。
弱毒化ウイルス株は、細胞培養および／または動
物モデルでの複数の継代の後に単離可能である。
感染した細胞もしくは個体の弱毒化株の検出は、
当該技術分野で公知の方法で達成できる。それに
は、例えば、HCVにコードされたひとつまたは
それ以上のエピトープに対する工体をプローブと
して用いること、あるいは、少なくとも約８個の
ヌクレオチドのHCV配列を含むポリヌクレオチ
ドをプローブとして用いることが包含される。そ
の代わりにあるいはそれに加えて、弱毒化株は、
本明細書に記載のHCVのゲノム情報と、組換え
技術を利用して構築することができる。一般に、
例えば病原に関連するポリペプチドをコードする
がウイルスの複製は可能であるようなゲノム領域
を除去することを試みることができる。さらに、
このゲノム構築によつて、HCVに対する抗体の
中和を起こさせるエピトープの発現が可能にな
る。次いで、変化させたゲノムは、HCV複製が
可能な細胞と、ウイルス複製が可能な条件下で増
殖する細胞を形質転換するのに利用できる。弱毒
化HCV株は、ワクチン製造のみならずウイルス
抗原の商業的生産ソースとしても有用である。そ
の理由は、これらウイルスの処理が、ウイルス生
産を行う従業員に対してそれほど厳重な保護対策
をとらなくてもよいからである。 一般的方法 ウイルスからのゲノムの抽出、cDNAライブラ
リーの調製とプロービング、クローンの配列決
定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、ラジ
オイムノアツセイおよびELISA検定法のような
免疫検定の実施、培地での細胞の培養などに用い
られる一般的な方法は、当該技術分野で公知であ
り、これらの方法を記載した実験室のマニユアル
を入手することができる。しかし、一般的な指針
として、上記の方法およびこれを実施するのに有
用な材料を現在入手できるいくつかの出所を以下
に述べる。 Ａ 宿主および発現制御配列 原核および真核の宿主細胞は、指定された宿主
に適合する適切な制御配列が用いられた場合に、
所望のコード配列の発現に用いることができる。
原核細胞宿主のうち、エシエリヒア コリ（E.
coli）が最も汎用される。原核細胞の発現制御配
列には、必要に応じてオペレーター部分を有する
プロモーター、およびリボソーム結合部位が含ま
れている。原核細胞の宿主に適合するトランスフ
アーベクターは、通常、例えば次のようなものに
由来する。つまり、アンピシリンおよびテトラサ
イクリンに対する耐性を与えるオペロンを有する
プラスミドであるpBR322および抗生物質耐性の
マーカーを与える配列を有する種々のpUCベク
ター由来である。これらのマーカーは、適宜選択
することによつて、好適な形質転換細胞を得るの
に利用できる。通常用いられる原核細胞の制御配
列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）お
よびラクトースプロモーター系〔チヤンら
（Chang et al）、1977年〕、トリプトフアン
（trp）プロモーター系〔ゴーデルら（Goeddel
et al）、1980年〕およびλ由来PLプロモーターお
よびＮ遺伝子リボソーム結合部位〔シマタケら
（Shimatake et al）、1981年〕、およびtrpおよび
lac UV5プロモーターの配列由来のハイブリツ
ドtacプロモーター〔ド ボールら（De Boer et
al）、1983年〕がある。上記の系は、特にE.
coliに適合する。必要であれば、バシラスもしく
はシユードモナス属の菌株のような他の原核宿主
を、対応する制御配列とともに用いてもよい。 真核宿主としては、酵母および培養系内の哺乳
動物の細胞がある。サツカロミセス セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）およびサツカロ
ミセス カールスベルゲンシス
（Saccharomyces carlsbergensis）が最も普通
に用いられる酵母宿主であり、便利な真菌宿主で
ある。酵母に適合するベクターは、栄養要求突然
変異体に原栄養性を与えるかまたは野性型菌株に
重金属に対する耐性を与えることによつて成功裏
に形質転換された形質転換体を選択することがで
きるようにするマーカーを保有する。酵母に適合
するベクターとしては、２ミクロンの複製起源
〔ブローチら（Broach et al）、1983年〕、CEN3
およびARS1の組み合わせ、または確実に複製を
行わせる他の手段（例えば、適切なフラグメント
を宿主細胞のゲノムに組込ませるような配列）を
採用することができる。酵母ベクターの制御配列
は、当該技術分野で公知であり、解糖酵素合成の
プロモーター〔ヘスら（Hess et al）、1968年；
ホーランドら（Holland et al）、1978年〕を含
み、このようなプロモーターには、３−ホスホグ
リセリン酸キナーゼ〔ハイツマン（Hitzeman）、
1980年〕に対するプロモーターが含まれる。ター
ミネーターには、例えばエノラーゼ遺伝子由来の
ターミネーター〔ホーランド（Holland）、1981
年〕が含まれ得る。特に有用な制御系は、グリセ
ルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）
プロモーターもしくはアルコール脱水素酵素
（ADH）調節性プロモーター、GAPDH由来のタ
ーミネーター、および分泌が所望の場合には、酵
母α因子由来のリーダー配列を含む系である。さ
らに、作動可能に連結されている転写調節領域お
よび転写開始領域は、野性型生物に本来関係しな
いものであつてもよい。これらの系については、
欧州特許公開第120551号（1984年10月３日公
開）；同第116201号（1984年８月22日公開）；およ
び同第164556号）（1985年12月18日公開）に詳細
に記載されており、これらはすべて本発明の出願
人によるものであり、本願に引用文献として記載
する。 発現のために宿主として利用可能な哺乳類の細
胞系は当該技術分野で知られており、the
American Type Culture Collection（ATCC）
から入手可能な多くの永久増殖化細胞系がある。
それには、Hela細胞、チヤイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞、ベビーハムスター腎臓
（BHK）細胞および多くの他の細胞系がある。哺
乳類の細胞に対する適切なプロモーターも当該技
術分野では公知であり、それには、シミアンウイ
ルス40（Simian Virus）（SV40）〔フイアース
（Fiers）、1978年〕、ラウス肉腫ウイルス
（RSV）、アデノウイルス（ADV）およびウシ乳
頭腫ウイルス（BPV）由来のプロモーターのよ
うなウイルスプロモーターが含まれる。哺乳類細
胞はまた、ターミネーター配列およびポリＡ付加
配列を必要とし、発現を増大させるエンハンサー
配列も含まれ、そして、遺伝子の増幅を引き起こ
す配列も望ましい。これらの配列は当該技術分野
で公知である。哺乳類の細胞で複製させるのに適
切なベクターには、ウイルスイレプリコン、また
はNANBVエピトープをコードする適当な配列
を宿主ゲノムに確実に組込む配列が含まれる。 Ｂ 形質転換 形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導
入する公知のいずれの方法によつても行なわれ得
る。それには例えば、ポリヌクレオチドをウイル
スにパツケージングし、次いでそのウイルスを宿
主細胞に形質導入する方法およびポリヌクレオチ
ドを直接取込む方法がある。使用される形質転換
法は、形質転換すべき宿主に依存する。例えば、
E. coli宿主細胞を、BB−NANBV配列を有す
るλgtllで形質転換することが後述の実施例の項
で述べられている。直接取込み法による細菌の形
質転換には、一般に、塩化カルシウムまたは塩化
ルビジウムによる処理が用いられる〔コーヘン
（Cohen）、1972年；マニアテイス、1982年〕。直
接取込み法による酵母の形質転換は、ヒネンら
（Hinnen et al）、1978年、の方法を用いて行わ
れ得る。直接取込み法による哺乳類の形質転換
は、グラハム（Graham）およびフアン デル
エプ（Van der Eb）1978年、のリン酸カルシウ
ム沈澱法またはこの方法の種々の公知の改変法を
用いて行われ得る。 Ｃ ベクターの構築 ベクターの構築には、当該技術分野で公知の技
術が用いられる。部位特異的なDNAの切断が、
適切な制御酵素を用い、これら市販の酵素のメー
カーによつて一般に規定されている条件下で処理
することによつて、実施される。一般に、約1μg
のプラスミドもしくはDNA配列は、約20μの
緩衝溶液中で１単位の酵素を用いて37℃の条件下
で１〜２時間インキユベートすることにより切断
される。制限酵素とともにインキユベートした
後、タンパクを、フエノール／クロロホルムによ
つて抽出して除去し、エタノールで沈澱させて
DNAが回収される。切断断片は、Methods in
Enzymology、65巻、499〜560頁、1980年、に記
載された一般的な方法に従つて、ポリアクリルア
ミドもしくはアガロースゲルを用いた電気泳動法
により分離することができる。 粘着末端を有する切断断片は、混合物に存在す
る適当なデオキシヌクレオチドトリホスフエート
（dNTP）の存在下で、E. coli DNAポリメラ
ーゼ（クレノー）を用いて平滑末端とされ得
る。SIヌクレアーゼによる処理も行なわれ得、一
本鎖DNA部分の加水分解が行われる。 T4 DNAリガーゼとATPとを用いて標準の緩
衝液および温度条件下で連結反応が行われる。粘
着末端の連結には、平滑末端の連結よりも、
ATPおよびリガーゼの必要量が少い。ベクター
断片が連結混合物の一部として用いられる場合に
は、ベクター断片は、最近アルカリホスフアクタ
ーゼ（BAP）または子ウシ腸アルカリホスフア
ターゼで処理され、5′末端のリン酸を除去して、
ベクターの再連結を防止することが多い。あるい
は、不必要な断片の制限酵素による切断を利用し
て連結を防止するのに利用することができる。 連結混合物は、E. coliのような適切なクロー
ニング宿主に形質転換され、次いで、例えば、抗
生物質耐性によつて成功裏に形質転換された形質
転換体が選択され、そして正しい構築物がスクリ
ーニングされる。 Ｄ 所望のDNA配列の構築 合成オリゴヌクレオチドは、ワーナー
（Warner）（1984年）が発表した自動オリゴヌク
レオチド合成装置を用いて調製され得る。必要に
応じて、合成DNA鎖は、反応の標準条件を用い
て、32P−ATPの存在下、ポリヌクレオチドキナ
ーゼで処理することによつて32Pで標識化され得
る。 DNA配列は、cDNAライブラリーから単離さ
れたものも含めて、公知の方法で修飾することが
できる。そのような方法としては、例えば、ゾラ
ー（Zoller）（1982年）が発表した部位特異的変
異誘発法がある。概略を述べると、修飾すべき
DNAを、一本鎖配列としてフアージにパツケー
ジングし、次にプライマーとして、修飾すべき
DNAの部分に相補的であり、それ自体の配列内
に所望の修飾が含まれている合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、DNAポリメラーゼで二本鎖DNA
に変換する。得られた二本鎖DNAは、フアージ
を保持する宿主細菌に形質転換される。形質転換
された最近の培養物（フアージの各鎖の複製物を
含む）は、寒天にプレートされてプラークが得ら
れる。理論的には、新しいプラークの50％が、変
異した配列を有するフアージを含有し、残りの50
％はもとの配列を有する。プラークのレプリカ
は、正しいストランドとハイブリダイゼーシヨン
可能であり、かつ未修飾の配列とはハイブリダイ
ゼーシヨンを行わない温度および条件下で、標識
化された合成プローブとハイブリダイゼーシヨン
を行なう。ハイブリダイゼーシヨンにより同定さ
れた配列は、回収されクローン化される。 Ｅ プローブによるハイブリダイゼーシヨン DNAライブラリーは、グリンスタイン
（Grunstein）およびホツグネス（Hogness）
（1975年）の方法を用いてプローブ化され得る。
簡単にのべれば、この方法においては、プローブ
化されるべきDNAは、ニトロセルロースフイル
タ上に固定され、変性され、そして、０〜50％ホ
ルムアミド、0.75MNaCl、75mM クエン酸ナ
トリウム、各々0.02％（wt／ｖ）のウシ血清アル
ブニン、ポリビニルピロリドンおよびフイコー
ル、50mMリン酸ナトリウム（PH6.5）、0.1％
SDS、そして100μg／mlキヤリヤーの変性DNA
を含有する緩衝液で、プレハイブリダイゼーシヨ
ンが行われる。緩衝液中のホルムアミドの濃度
（％）、およびプレハイブリダイゼーシヨンおよび
これに続くハイブリダイゼーシヨン工程の時間と
温度条件は、必要とされる厳密さに依存する。厳
密さがそれほど必要ではない条件下でのオリゴマ
ーのプローブは、一般に、ホルムアミドが低い濃
度であり、低温および長いハイブリダイゼーシヨ
ンの時間で用いられる。cDNAもしくはゲノムの
配列由来のような30もしくは40を越えるヌクレオ
チドを有するプローブを用いるときには、一般
に、例えば、約40〜42℃のような高温、および50
％ホルムアミドのような高濃度が採用される。プ
レハイブリダイゼーシヨンに続いて、5′末端32P
で標識したオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液
に添加し、この混合物中で、ハイブリダイゼーシ
ヨンの条件下にて、上記フイルターをインキユベ
ートする。洗浄後、処理されたフイルターをオー
トラジオグラフイーに付すとハイブリダイズした
プローブの位置が示される。もとの寒天プレート
上の、対応する位置のDNAを所望のDNAの起源
として利用する。 Ｆ 構築物の確認および配列決定 常套手段により、ベクターを構築する際には、
連結混合物を用いてE. coliHB101株もしくは他
の適当な宿主を形質転換し、成功裏に形質転換さ
れた形質転換体は、抗生物質耐性もしくは他のマ
ーカーによつて選択される。次に、得られた形質
転換体から、プラスミドが、クレウエルら
（Clewell et al.）（1969年）の方法により調製さ
れ、通常、さらに、クロラムフエニコールによる
増幅（クレウエル、1972年）が行なわれる。その
DNAは、単離され、通常、制限酵素分析法およ
び／または配列決定法により分析される。配列決
定は、サンガー（Sanger）ら（1977）の、そし
てさらにメシング（Messing）らにより述べられ
た（1981年）、ジデオキシ法、あるいはマキシム
らの方法（1980年）により実施され得る。GCに
富んだ領域において時おり観察されるバンドコン
プレツシヨンの問題は、バールら（Barr et al）
（1986年）の方法に従つて、Ｔ−デアゾグアノシ
ン（deazo−guanosine）を用いることによつて
克服された。 Ｇ 酵素連結イムノソルベント検定法
（ELISA法） ELISA法は、抗原もしくは抗体のいずれかの
濃度を測定するのに利用され得る。この方法は、
酵素と、抗原もしくは抗体との結合に依存し、定
量の標識として、結合した酵素の活性を用いる。
抗体を測定するには、既知の抗原を固相（例え
ば、マイクロプレートまたはプラスチツク製カツ
プ）に固定し、被検血清の希釈物とともにインキ
ユベートし、洗浄し、酵素で標識した抗免疫グロ
ブリンとともにインキユベートし、再び洗浄す
る。標識化するために好適な酵素は、当該技術分
野で公知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼがある。固相に結合した酵素活性は、特異
的な基質を添加し、そして生成物の生成または基
質の利用率を比色法で測定することによつて測定
される。結合した酵素の活性は、結合した抗体の
量の一次関数である。 抗原を測定するには、既知の特異的抗体を固相
に固定し、抗原を含む被検物質を添加し、インキ
ユベートした後、固相を洗浄し、第２の酵素で標
識した抗体を添加する。洗浄後、基質を添加し、
次いで酵素活性を比色法で測定し、抗原濃度に換
算する。 実施例 以下に述べるのは本発明の実施例である。この
実施例は説明のみを目的として提供するのであつ
て、本発明の範囲を制限するものではない。本発
明の開示内容を考慮すると、特許請求の範囲内の
多くの実施態様が当業者に明らかである。例え
ば、．A.節に述べる方法は、もし望まれるな
らば繰り返し得るが、特にその必要はない。なぜ
なら、本発明により提供される上方に基づいた所
望のヌクレオチド配列の構築のための技術が使用
可能であるためである。発現はE. coliで例示さ
れているが、．A.節でより十分に述べたよう
な他の系も使用され得る。ゲノム構造に由来する
付加的なエピトープも生産され得、以下に述べる
ように抗体を生産するのに用いられる。 Ａ HCV cDNAの調製、単離および配列決
定 Ａ １ HCV cDNAの調製 NANB因子の原材料は、慢性NANBHのチン
パンジーから得た血漿プールであつた。このチン
パンジーは、プールしたヒト血清由来の第８因子
濃縮物混入バツチ中のHCVで感染させて得られ
る別の慢性NANBのチンパンジー由来の血液で、
実験的に感染させられている。このチンパンジー
の血漿プールは、高レベルのアラニンアミノトラ
ンスフエラーゼ活性（この活性はHCV感染によ
る肝障害に起因する）を有する多くの固体の血漿
試料を合わせて調製されたものである。静脈注射
により投与されたこの血清プールの10-6倍希釈液
の１mlは、別のチンパンジーにNANBHを引き
起こしたので、そのCIDは少なくとも106／mlで
ある。つまり、高いウイルス感染力価を有する。 高力価血漿プール由来のcDNAライブラリー
を、以下のようにして調製した。まず、ウイルス
粒子を血漿から単離した。血漿の90mlを50mMト
リス−HCl（PH8.0）、1mM EDTA、100mM
NaClを含有する溶液310mlで希釈した。細胞破砕
物を、15000×ｇで20分間、20℃にて遠心分離す
ることにより除去した。次いで、得られた上清液
中のウイルス粒子を、ベツクマンSW28ローター
で28000rpm、５時間、20℃にて遠心分離するこ
とによりペレツトとした。ウイルスゲノムを遊離
させるために、ペレツトを１％ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、10mM EDTA、10mMトリス−
HCl（PH7.5）、および２mg／mlのプロテイナーゼ
Ｋを含有する溶液15mlに懸濁し、その後45℃にて
90分間インキユベートすることにより粒子を破砕
した。キヤリアーとして0.8μgのMS2バクテリオ
フアージRNAを添加し、フエノール：クロロホ
ルムの１：１混合液（フエノールは0.5Mトリス
−HCl（PH7.5）、0.1％（ｖ／ｖ）β−メルカプト
エタノール、0.1％（ｗ／ｖ）ヒドロキシキノリ
ンで飽和させたもの）で上記混合物を４回抽出
し、その後クロロホルムで２回抽出することによ
り核酸を単離した。2.5倍容積の無水エタノール
で−20℃にて一晩沈澱させるのに先立つて、水層
を１−ブタノールで濃縮した。ベツクマンSW41
ローターで40000rpm、90分間、４℃にて遠心分
離することにより核酸を回収し、0.05％（ｖ／
ｖ）ジエチルピロカーボネート処理およびオート
クレーブ処理してある水に溶解した。 上記方法により得られた核酸（＜2μg）を、
17.5mM CH3HgOHで変性させた。この変性さ
せた核酸を鋳型として用いてcDNAを合成し、
Huynh（1985）により記載されている方法を用い
てフアージλ−gt11のEcoＲ部位にクローン化
した。ただし、逆転写酵素によりcDNA第一鎖を
合成する間、ランダムプライマーをオリゴ（dT）
12−18で置き換えた（Taylorら（1976））。得ら
れた２本鎖cDNAをセフアロースCL−4Bカラム
でサイズに従つて分画し；平均サイズ約400，
300，200、および100塩基対の溶出された物質を、
それぞれcDNAプール１，２，３、および４とし
た。プール３のcDNAから、λ−gt11cDNAライ
ブラリーを作成した。 プール３から作成したλ−gt11cDNAライブラ
リーを、以前にNANBHにかかつたことのある
患者由来の血清と特異的に結合できるエピトープ
についてスクリーニングした。結合ヒト抗体を
125で放射性標識したヒツジ抗−ヒトｇ抗血
清を用いて検出したことを除いては、Huynhら
（1985）の方法を用い、約106個のフアージを患者
血清を用いてスクリーニングした。５個の陽性フ
アージが同定され、精製された。次いで、この５
個の陽性フアージを、同様の方法を用いて、以前
NANBH因子に感染したことのある８人の異な
るヒト由来の血清との結合の特異性について試験
した。４個のフアージが、たつた一人のヒト（つ
まり、フアージライブラリーの最初のスクリーニ
ングに用いられたヒト）の血清と免疫学的に反応
するポリペプチドをコードしていた。５番目のフ
アージ（５−１−１）は、８種の試験した血清の
うち５種と免疫学的に反応するポリペプチドをコ
ードしていた。さらに、このペプチドは、７人の
正常な血液提供者由来の血清と免疫学的に反応し
なかつた。それゆえ、クローン５−１−１は、
NANBの患者由来の血清により免疫学的に特異
的に認識されるポリペプチドをコードすることが
わかる。 Ａ ２組換え体フアージ５−１−１における
HCV cDNAの配列、および該配列内にコード
されるポリペプチドの配列 組換え体フアージ５−１−１のcDNAを、
Sangerら（1977）の方法により配列決定した。
本質的には、cDNAをEcoＲで切断し、ゲル電
気泳動を用いてサイズ分画することにより単離し
た。EcoＲ切断フラグメントをM13ベクターで
あるmp18およびmp19にサブクローン化し
（Messing（1983））、Sangerら（1977）のジデオ
キシ鎖終止法を用いて配列決定した。得られた配
列を第１図に示す。 第１図においてコードされるポリペプチドは、
HCV cDNAでコードされ、該ポリペプチドが融
合しているＮ−末端のβ−ガラクトシダーゼ部分
と同じ翻訳フレーム内にある。．A.節で示し
たように、５−１−１の翻訳オープンリーデイン
グフレーム（ORF）は、NANBHに感染した患
者およびチンパンジー由来の血清により特異的に
認識されるエピトープをコードする。 Ａ ３クローン５−１−１のcDNAにオーバ
ーラツプするHCV cDNAの単離 クローン５−１−１のcDNAにオーバーラツプ
するHCV cDNAを、第１図に示すようなクロー
ン５−１−１のHCV cDNAの配列由来の合成ポ
リヌクレオチドを用いて、．A.1.節で記述した
のと同様に作成したλ−gt11ライブラリーをスク
リーニングすることにより得た。スクリーニング
に用いたポリヌクレオチドの配列は、次のようで
あつた： 5′−TCC CTT GCT CGA TGT ACG
GTA AGT GCT GAG AGC ACT CTT
CCA TCT CAT CGA ACT CTC GGT
AGA GGA CTT CCC TGT CAG GT−
3′。 Huynh（1985）に記載の方法を用いて、λ−
gt11ライブラリーをこのプローブでスクリーニン
グした。約50000個のクローンのうち１個のクロ
ーンが、このプローブとハイブリダイズした。合
成プローブとハイブリダイズしたcDNAを有する
３個のクローンに、８１，１−２、および９１と
番号をつけた。 Ａ ４クローン５−１−１のcDNAにオーバ
ーラツプするHCV cDNAのヌクレオチド配列 クローン８１，１−２、および９１の３つの
cDNAのヌクレオチド配列は、．A.2.節で述べ
たのと本質的に同様にして決定した。これらのク
ローンの配列は、フアージ５−１−１のHCV
cDNA配列に関連しており、第２図で示される。
第２図は、検出されたHCVエピトープをコード
する鎖を示しており、ヌクレオチド配列における
相同性が配列間の垂直線により示されている。 クローン化されたHCV cDNAの配列は、オーバ
ーラツプ領域で高い相同性を有する（第２図を参
照のこと）。しかし、２つの領域には相違がある。
クローン１−２の67番目のヌクレオチドはチミジ
ンであるが、他の３つのクローンはこの位置にシ
チジン残基を有する。しかし、この位置をＣまた
はＴのいずれかが占める場合、同じアミノ酸がコ
ードされるということは注意すべきである。 第二の相違は、クローン５−１−１が、他の３
つのクローンには存在しない28塩基対を有するこ
とである。これらの塩基対は、５−１−１の
cDNA配列の開始部分に存在し、小文字で示され
ている。後述の．D.節で論じるラジオイムノ
アツセイのデータに基づくと、HCVエピトープ
はこの28bp領域でコードされ得るということが
可能である。 クローン８１，１−２、および９１に５−１−
１の28塩基対が存在しないということは、これら
のクローンのcDNAは欠損したHCVゲノムから
得られたということを意味し得る；あるいは、
28bp領域はクローン５−１−１の末端が人工的
に変化したものであり得る。 クローン８１および９１のヌクレオチド配列に
おける小文字の配列は、単にこれらの配列が他の
cDNAで見い出されていないことを示す。なぜな
らば、これらの領域にオーバーラツプするcDNA
はまだ単離されていないからである。 クローン５−１−１，８１，１−２、および９
１のオーバーラツプしているcDNA由来のHCV
cDNA複合配列を、第３図に示す。しかし、この
図では、クローン５−１−１に特有の28塩基対は
省略されている。この図は、複合HCV cDNAの
ORF内にコードされるポリペプチドの配列も示
す。 Ａ ５クローン８１のcDNAにオーバーラツ
プするHCV cDNAの単離 クロン８１ cDNAの配列の上流にあり、該配
列とオーバーラツプするHCV cDNA配列の単離
を、以下のようにして行つた。．A.1.節に記述
したようにして調製したλ−gt11 cDNAライブ
ラリーを、クローン８１の5′末端配列と相同性を
有する合成ポリヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズさせることによりスクリーニングした。ク
ローン８１の配列を第４図に示す。スクリーニン
グに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は、次の
ようであつた： 5′ CTG TCA GGT ATG ATT GCC
GGC TTC CCG GAC 3′ 方法は、Huynh（1985）に記載されているのと
本質的に同じであつたが、厳密な条件下でライブ
ラリーのフイルターを２回洗浄した。すなわち、
５×SSC、0.1％ SDS中で55℃にてそれぞれ30
分間洗浄を行つた。約50000個のクローンのうち
１個のクローンがこのプローブとハイブリダイズ
した。この配列とハイブリダイズしたcDNAを有
する陽性組換え体フアージを単離・精製した。こ
のフアージにクローン３６という番号を付けた。 クローン８１のカルボキシル末端にオーバーラ
ツプする下流cDNA配列を、上流cDNA配列の単
離に用いたのと同様の方法を用いて単離した。た
だし、合成オリゴヌクレオチドプローブをクロー
ン８１の3′末端と相同性を有するように調製し
た。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチ
ドの配列は、次のようであつた： 5′ TTT GGC TAG TGG TTA GTG
GGC TGG TGA CAG 3′ この後者の配列とハイブリダイズしたcDNAを
有する陽性組換え体フアージを単離・精製し、ク
ローン３２という番号を付けた。 Ａ ６ クローン３６のHCV cDNAのヌク
レオチド配列 クローン３６のcDNAのヌクレオチド配列は、
本質的に．A.2.節に記述したようにして決定し
た。このcDNAの二本鎖配列、クローン８１の
HCV cDNAとオーバーラツプする該cDNAの領
域、およびORFによりコードされるポリペプチ
ドを第５図に示す。 クローン３６のORFは、クローン８１でコー
ドされるHCV抗原と同じ翻訳フレーム内にある。
このように、組合せて、クローン３６および８１
におけるORFは大きなHCV抗原の一部を表すポ
リペプチドをコードする。この推定HCVポリペ
プチドの配列、ならびに該配列をコードする二本
鎖DNA配列（クローン３６および８１のHCV
cDNAの結合ORF由来）を第６図に示す。 Ａ ７ クローン３２のHCV cDNAのヌク
レオチド配列 クローン３２のcDNAのヌクレオチド配列は、
クローン５−１−１の配列について．A.2.節で
記述したのと本質的に同様にして決定した。配列
のデータは、クローン３２組換え体フアージの
cDNAが、二つの異なる材料由来であることを示
した。cDNAの一つがフラグメントはHCVゲノ
ム由来の418ヌクレオチドを有し；他のフラグメ
ントはバクテリオフアージMS2ゲノム由来の172
ヌクレオチドを有していた。このバクテリオフア
ージMS2ゲノムは、λ−gt11血漿cDNAライブ
ラリーの調製の間キヤリアーとして用いたもので
ある。 HCVゲノムの配列に対応するクローン３２の
cDNAの配列を、第７図に示す。クローン８１の
配列とオーバーラツプする配列の領域、および
ORFによりコードされるポリペプチドもこの図
に示す。この配列は、クローン８１によりコード
されるHCV抗原と同じ翻訳フレーム内にある一
つの連続したORFを有する。 Ａ ８クローン３６のcDNAにオーバーラツ
プするHCV cDNAの単離 クローン３６ cDNAの配列の上流にあり、該
配列とオーバーラツプするHCV cDNA配列の単
離を、クローン８１のcDNAとオーバーラツプす
る配列について．A.5.節に記述したようにして
行つた。ただし、合成ポリヌクレオチドはクロー
ン３６の5′領域に基づいたものであつた。スクリ
ーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは、次の
ようであつた： 5′ AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG
CTC AAG CCC 3′ 約50000個のクローンのうち１個のクローンが、
このプローブとハイブリダイズした。この配列と
ハイブリダイズしたcDNAを有する組換え体フア
ージを単離・精製したクローンを、クローン３５
と命名した。 Ａ ９ クローン３５のHCV cDNAのヌク
レオチド配列 クローン３５のcDNAのヌクレオチド配列は、
本質的に．A.2.節で記述したようにして決定し
た。この配列、クローン３６のcDNA配列とオー
バーラツプした該配列の領域、および該配列にお
いてコードされる推定ポリペプチドを、第８図に
示す。 クローン３５は、明らかに一つの連続的な
ORFを有する。このORFは、クローン３６、ク
ローン８１、およびクローン３２によりコードさ
れるのと同じ翻訳フレーム内で、一つのポリペプ
チドをコードする。第９図は、クローン３５，３
６，８１、および３２にわたつて延びている長く
連続したORFの配列を、該配列でコードされる
推定HCVポリペプチドと共に示す。この配列は、
この結合配列は、同じλ−gt11 cDNAライブラ
リー由来の他の独立したcDNAクローンを用いて
確認されている。 Ａ 10クローン３５のcDNAにオーバーラツ
プするHCV cDNAの単離 クローン３５ cDNAの配列の上流にあり、該
配列とオーバーラツプするHCV cDNA配列の単
離を、クローン３６のcDNAとオーバーラツプす
る配列について．A.8.節に記述したようにして
行つた。ただし、合成ポリヌクレオチドはクロー
ン３５の5′領域に基づいたものであつた。スクリ
ーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは、次の
ようであつた： 5′ CAG GAT GCT GTC TCC CGC
ACT CAA CGT 3′ 約50000個のクローンのうち１個のクローンが、
このプローブとハイブリダイズした。この配列と
ハイブリダイズしたcDNAを有する組換え体フア
ージを単離・精製したクローンを、クローン３７
ｂと命名した。 Ａ 11 クローン３７ｂのHCVのヌクレオ
チド配列 クローン３７ｂのcDNAのヌクレオチド配列
は、本質的に．A.2.節で記述したようにして決
定した。この配列、クローン３５のcDNA配列に
オーバーラツプした該配列の領域、および該配列
においてコードされる推定ポリペプチドを、第１
０図に示す。 クローン３５の5′末端のヌクレオチドはＴであ
るが、クローン３７ｂの対応するヌクレオチドは
Ａである。．A.10.節に記述した、クローン３
７ｂを単離した工程の間に単離された他の３つの
独立したクローン由来のcDNAも、配列決定され
ている。これらのクローン由来のcDNAも、この
位置にＡを有する。このように、クローン３５の
5′末端のＴは、クローニング工程の人工産物であ
り得る。しばしばcDNA分子の5′末端に人工的に
変化したものが生じるということは、公知であ
る。 クローン３７ｂは明らかに、オーバーラツプし
ているクローン３５，３６，８１および３２にわ
たつて延びているORFにおいてコードされるポ
リペプチドの続きであるポリペプチドをコードす
る、一つの連続的なORFを有する。 Ａ 12クローン３２のcDNAにオーバーラツ
プするHCV cDNAの単離 クローン３２の下流のHCV cDNA配列の単離
は、以下のようにして行つた。まず、クローン
claを、クローン３２のHCV cDNA配列のヌク
レオチド配列に基づいた合成ハイブリダイゼーシ
ヨンプローブを用いて単離した。方法は、本質的
に．A.5.節に記述したとおりであつた。ただ
し、合成プローブの配列は次のようであつた： 5′ AGT GCA GTG GAT GAA CCG
GCT GAT AGC CTT 3′。 クローンcla由来のヌクレオチド配列を用いて、
別の合成ヌクレオチドを合成した。この合成ヌク
レオチドは次の配列を有していた： 5′ TCC TGA GGC GAC TGC ACC
AGT GGA TAA GCT 3′。 クローンcla由来の配列をプローブとしてを用
いたλ−gt11ライブラリーのスクリーニングは、
約50000個の陽性コロニーのうち１個のコロニー
をもたらした。このプローブとハイブリダイズし
たクローンを単離・精製し、クローン３３ｂと命
名した。 Ａ 13 クローン３３ｂのHCV cDNAのヌ
クレオチド配列 クローン３３ｂのcDNAのヌクレオチド配列
は、本質的に．A.2.節で記述したようにして決
定した。この配列、クローン３２のcDNAの配列
とオーバーラツプする該配列の領域、および該配
列においてコードされる推定ポリペプチドを、第
１１図に示す。 クローン３３ｂは明らかに、オーバーラツプし
ているクローン３７ｂ，３５，３６，８１および
３２のORFの延長である。一つの連続的なORF
を有する。クローン３３ｂでコードされるポリペ
プチドは、これらのオーバーラツプしているクロ
ーンの延長されたORFでコードされるのと同じ
翻訳フレーム内にある。 Ａ 14クローン３７ｂのcDNAおよびクロー
ン３３ｂのcDNAにオーバーラツプするHCV
cDNAの単離 クローン３７ｂおよびクローン３３ｂのcDNA
にオーバーラツプするHCV cDNAを単離するた
めに、これらのクローンのcDNA由来の次の合成
オリゴヌクレオチドプローブを用い、本質的に
．A.3.節に記述した方法を用いて、λ−gt11ラ
イブラリーをスクリーニングした。それぞれ、ク
ローン３７ｂおよび３３ｂの配列にオーバーラツ
プするHCV cDNA配列を有するコロニーを検出
するためのプローブは、次のようであつた： 5′ CAG GAT GCT GTC TCC CGC
ACT CAA CGT Ｃ 3′ および 5′ TCC TGA GGC GAC TGC ACC
AGT GGA TAA GCT 3′ 約50000個のクローンのうち１個のクローンが、
それぞれのプローブを用いて検出された。クロー
ン３７ｂのcDNAの上流にあり、該cDNAにオー
バーラツプするcDNAを有するクローンを、クロ
ーン４０ｂと命名した。クローン３３ｂのcDNA
の下流にあり、該cDNAにオーバーラツプする
cDNAを有するクローンを、クローン２５ｃと命
名した。 Ａ 15クローン４０ｂおよびクローン２５ｃ
のHCV cDNAのヌクレオチド配列 クローン４０ｂおよびクローン２５ｃのcDNA
のヌクレオチド配列は、．A.2.節で記述したの
と本質的に同様にして決定した。４０ｂおよび２
５ｃの配列、クローン３７ｂおよび３３ｂの
cDNAにオーバーラツプする該配列の領域、およ
びそこでコードされる推定ポリペプチドを、第１
２図（クローン４０ｂ）および第１３図（クロー
ン２５ｃ）に示す。 クローン４０ｂの5′末端のヌクレオチドはＧで
ある。しかし、．A.14.節で記述した、クロー
ン４０ｂを単離した工程の間に単離された他の独
立した５個のクローン由来のcDNAも配列決定さ
れている。これらのクローン由来のcDNAもま
た、この位置にＴを有する。このように、Ｇはク
ローニングの結果人工的に変化したものであるこ
とを意味し得る（．A.11.節の考察を参照のこ
と）。 クローン２５ｃの5′末端はACTであるが、ク
ローンcla（配列は示していない）、およびクロー
ン３３ｂのこの領域の配列はTCAである。この
違いはまた、クローン５−１−１の28個の過剰の
5′末端ヌクレオチドのように、クローニングの人
工産物を意味し得る。 クローン４０ｂおよび２５ｃはそれぞれ、明ら
かに、以前に配列決定したクローンの連続的な
ORFの延長であるORFを有する。クローン４０
ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ、
および２５ｃにわたつて延びているORFのヌク
レオチド配列、および該配列においてコードされ
る推定ポリペプチドのアミノ酸配列を、第１４図
に示す。この図では、可能性のある人工的に変化
したものは配列から省かれており、その代わり
に、オーバーラツプする複数のクローンの非5′末
端領域の対応する配列が示されている。 Ａ 16クローン３６，８１、および３２の
cDNAからの複合HCV cDNAの調製 複合HCV cDNAであるC100は、以下のよう
にして構築した。まず、クローン３６，８１、お
よび３２由来のcDNAをEcoRを用いて切り出
した。各クローン由来のcDNAのEcoRフラグ
メントを、ベクターpGEM3−blue（Promega
Biotec）のEcoR部位に個々にクローン化し
た。クローン３６，８１、および３２由来の
cDNAを有する得られた組換え体ベクターを、そ
れぞれpGEM3−blue／３６，pGEM3−blue／８
１、およびpGEM3−blue／３２と命名した。適
当な方向性を有するpGEM3−blue／８１組換え
体をNaeおよびNarで切断し、大きい（約
2850bp）フラグメントを精製した。そしてこの
フラグメントを、pGEM3−blue／３６から得た
小さな（約570bp）Nar／Nar制限フラグメ
ント精製物と連結した。このクローン３６および
８１由来のcDNAの複合配列を、これらのクロー
ンのオーバーラツプしているcDNAに含まれる、
連続的なHCV ORFを有する他のpGEM3−blue
ベクターを作成するのに用いた。次いで、約
680bpのフラグメントを切り離すために、この新
しいプラスミドをPvuおよびEcoRで切断し
た。次いで、このフラグメントを適当な方向性を
有するpGEM3−blue／３２プラスミドから単離
した小さな（580bp）Pvu／EcoRフラグメン
トと連結した。そして、クローン３６，８１、お
よび３２由来の複合cDNAを、．B.1.節に記述
されているベクターpSODcf1をEcoRで直線化
させたものに連結し、これを細菌においてクロー
ン５−１−１を発現するのに用いた。複合HCV
cDNAの約1270bpのEcoRフラグメント
（C100）を有する組換え体を選択し、プラスミド
由来のcDNAをEcoRで切断し、精製した。 Ａ 17クローン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７
ｅ，８ｈ，３３ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３
３ｇ、および３９ｃのHCV cDNAの単離およ
びヌクレオチド配列 クローン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，
３３ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ、および
３９ｃのHCV cDNAを．A.1節に記述した
HCV cDNAのλ−gt11ライブラリー由来のオー
バーラツプしたcDNAフラグメントを単離する方
法により単離した。使用した方法は、．A.3.節
に記述したのと本質的に同様であつた。ただし、
使用したプローブは、最後に単離したクローンの
ヌクレオチド配列の、複合HCV配列の5′末端お
よび3′末端から設計されたものである。以下に記
述するプローブとハイブリダイズするクローンの
頻度は、それぞれの場合で約50000個につき１個
であつた。 クローン１４ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，
１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ、および３９ｃの
HCV cDNAのヌクレオチド配列は、本質的に
．A.2.節に記述したのと同様にして決定した。
ただし、クローン５−１−１から単離したcDNA
の代わりにこれらのフアージから切り出した
cDNAを用いた。 クローン３３ｃは、クローン４０ｂのヌクレオ
チド配列に基づいたハイブリダイゼーシヨンプロ
ーブを用いて単離した。クローン４０ｂのヌクレ
オチド配列は、第１２図に示されている。３３ｃ
を単離するのに用いたプローブのヌクレオチド配
列は、次のようであつた： 5′ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA
ATT ACC ACT 3′。 クローン３３ＣのHCV cDNA配列、およびク
ローン４０ｂのHCV cDNA配列とのオーバーラ
ツプを、第１５図に示す。この図は、該配列でコ
ードされるアミノ酸も示す。 クローン８ｈは、クローン３３ｃのヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。こ
のプローブのヌクレオチド配列は、次のようであ
つた： 5′ AGA GAC AAC CAT GAG GTC
CCC GGT GTT Ｃ 3′。 クローン８ｈのHCV cDNAの配列、およびク
ローン３３ｃのHCV cDNAの配列とのオーバー
ラツプ、ならびに該配列でコードされるアミノ酸
を、第１６図に示す。 クローン７ｅは、クローン８ｈのヌクレオチド
配列に基づいたプローブを用いて単離した。この
プローブのヌクレオチド配列は、次のようであつ
た： 5′ TCG GAC CTT TAC CTG GTC
ACG AGG CAG 3′。 クローン７ｅのHCV cDNAの配列、クローン
８ｈとのオーバーラツプ、および該配列でコード
されるアミノ酸を、第１７図に示す。 クローン１４ｃは、クローン２５ｃのヌクレオ
チド配列に基づいたプローブを用いて単離した。
クローン２５ｃの配列を第１３図に示す。クロー
ン１４ｃの単離に用いたプローブは、次の配列を
有していた： 5′ ACC TTC CCC ATT AAT GCC
TAC ACC ACG GGC 3′。 クローン１４ｃのHCV cDNAの配列、該配列
のクローン２５ｃのHCV cDNAの配列とのオー
バーラツプ、および該配列でコードされるアミノ
酸を、第１８図に示す。 クローン８ｆは、クローン１４ｃのヌクレオチ
ド配列に基づいたプローブを用いて単離した。こ
のプローブのヌクレオチド配列は、次のようであ
つた： 5′ TCC ATC TCT CAA GGC AAC
TTG CAC CGC TAA 3′。 クローン８ｆのHCV cDNAの配列、該配列の
クローン１４ｃのHCV cDNAの配列とのオーバ
ーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸
を、第１９図に示す。 クローン３３ｆは、クローン８ｆに存在するヌ
クレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離
した。このプローブのヌクレオチド配列は、次の
ようであつた： 5′ TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC
CTC CAA AGT 3′。 クローン３３ｆのHCV cDNAの配列、該配列
のクローン８ｆのHCV cDNAの配列とのオーバ
ーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸
を、第２０図に示す。 クローン３３ｇは、クローン３３ｆのヌクレオ
チド配列に基づいたプローブを用いて単離した。
このプローブのヌクレオチド配列は、次のようで
あつた： 5′ GCG ACA ATA CGA CAA CAT
CCT CTG AGC CCG 3′。 クローン３３ｇのHCV cDNAの配列、該配列
のクローン３３ｆのHCV cDNAの配列とのオー
バーラツプ、および該配列でコードされるアミノ
酸を、第２１図に示す。 クローン７ｆは、クローン７ｅのヌクレオチド
配列に基づいたプローブを用いて単離した。この
プローブのヌクレオチド配列は、次のようであつ
た： 5′ AGC AGA CAA GGG GCC TCC
TAG GGT GCA TAA Ｔ 3′。 クローン７ｆのHCV cDNAの配列、該配列の
クローン７ｅとのオーバーラツプ、および該配列
でコードされるアミノ酸を、第２２図に示す。 クローン１１ｂは、クローン７ｆの配列に基づ
いたプローブを用いて単離した。このプローブの
ヌクレオチド配列は、次のようであつた： 5′ CAC CTA TGT TTA TAA CCA
TCT CAC TCC TCT 3′。 クローン１１ｂのHCV cDNAの配列、該配列
のクローン７ｆとのオーバーラツプ、および該配
列でコードされるアミノ酸を、第２３図に示す。 クローン１４ｉは、クローン１１ｂのヌクレオ
チド配列に基づいたプローブを用いて単離した。
このプローブのヌクレオチド配列は、次のようで
あつた： 5′ CTC TGT CAC CAT ATT ACA
AGC GCT ATA TCA 3′。 クローン１４ｉのHCV cDNAの配列、該配列
のクローン１１ｂとのオーバーラツプ、および該
配列でコードされるアミノ酸を、第２４図に示
す。 クローン３９ｃは、クローン３３ｇのヌクレオ
チド配列に基づいたプローブを用いて単離した。
このプローブのヌクレオチド配列は、次のようで
あつた： 5′ CTC GTT GCT ACG TCA CCA
CAA TTT GGT GTA 3′。 クローン３９ｃのHCV cDNAの配列、該配列
のクローン３３ｇとのオーバーラツプ、および該
配列でコードされるアミノ酸を、第２５図に示
す。 Ａ 18HCV cDNAを有する単離クローン由
来の複合HCV cDNA配列 複合HCV cDNA配列を作成するために、前述
の単離クローンのHCV cDNA配列を並べた。
5′から3′の方向に並べた単離クローンは：１４
ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７
ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，
１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇおよび３９ｃであ
る。 単離クローン由来の複合HCV cDNA配列、お
よび該配列でコードされるアミノ酸を、第２６図
に示す。 複合配列を作成するにあたり、以下の配列の異
質性が考慮されている。クローン３３ｃは、クロ
ーン４０ｂおよび３７ｃのcDNAとオーバーラツ
プする800塩基対のHCV cDNAを有する。クロ
ーン３３ｃにおいては、他の５つのオーバーラツ
プしているクローンと同様に、789番目のヌクレ
オチドはＧである。しかし、クローン３７ｂにお
いては（．A.11.節を参照のこと）、対応するヌ
クレオチドはＡである。この配列の違いは、該配
列でそれぞれＧまたはＡに対してコードされるア
ミノ酸は、CYSまたはTYRのいずれかであると
いう明らかな異質性をもたらす。この異質性は、
タンパクの折りたたみに関する重要な分枝を有し
得る。 クローン８ｈのHCV cDNAの２番目のヌクレ
オチド残基はＴである。しかし、以下に示すよう
に、クローン７ｅの対応する残基はＡであり；さ
らに、この位置のＡは、他の３つのオーバーラツ
プしている単離クローンでも見い出される。この
ように、クローン８ｈのＴ残基は、クローニング
の人工的な変化を意味し得る。それゆえ、第２６
図では、この位置の残基はＡとされる。 クローン８ｆのHCV cDNAの3′末端ヌクレオ
チドはＧである。しかし、クローン３ｆおよび他
の２つのオーバーラツプするクローンの対応する
残基はＴである。それゆえ、第２６図では、この
位置の残基はＴとされる。 クローン３３ｆのHCV cDNAの3′末端配列は
TTGCである。しかし、クローン３３ｇおよび
他の２つのオーバーラツプするクローンの対応す
る配列はATTCである。それゆえ、第２６図で
は、対応する領域はATTCで示される。 クローン３３ｇのHCV cDNAの４番目のヌク
レオチド残基はＴである。しかし、クローン３３
ｆおよび他の２つのオーバーラツプするクローン
の対応する残基はＡである。それゆえ、第２６図
では、対応する残基はＡで示される。 クローン１４ｉの3′末端はAAである。しかし、
クローン１１ｂおよび他の３つのクローンの対応
するジヌクレオチドはTAである。それゆえ、第
２６図では、TA残基が示されている。 他の配列の異質性の解明については、前述で考
察している。 複合HCV cDNAを調べると、該cDNAが一つ
の大きなORFを有することが示される。このこ
とは、ウイルスのゲノムが、翻訳と同時に、また
その後プロセツシングされる大きなポリペプチド
に翻訳されるということを示唆する。 Ａ 19クローン１２ｆ，３５ｆ，１９ｇ，２
６ｇ、および１５ｅのHCV cDNAの単離およ
びヌクレオチド配列 クローン１２ｆ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ、お
よび１５ｅのHCV cDNAを、本質的に．
A.17.節に記述した方法により単離した。ただし、
プローブは以下に示すようであつた。クローンが
このプローブとハイブリダイズする頻度は、それ
ぞれの場合で約50000個につき１個であつた。こ
れらのクローンのHCV cDNAのヌクレオチド配
列は、本質的に．A.2.節に記述したようにして
決定した。ただし、クローン５−１−１から単離
したcDNAの代わりに、指示したクローン由来の
cDNAを用いた。 第２６図のHCV cDNAの上流のcDNAを有す
るクローン１２ｆの単離は、クローン１４ｉのヌ
クレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーシヨ
ンプローブを用いて行つた。このプローブのヌク
レオチド配列は、次のようであつた： 5′ TGC TTG TGG ATG ATG CTA
CTC ATA TCC CAA 3′。 クローン１２ｆのHCV cDNAの配列、該配列
のクローン１４ｉとのオーバーラツプ、および該
配列でコードされるアミノ酸を、第２７図に示
す。 第２６図のHCV cDNA下流のcDNAを有する
クローン３５ｆの単離は、クローン３９ｃのヌク
レオチド配列に基づいたハイブリダイゼーシヨン
プローブを用いて行つた。このプローブのヌクレ
オチド配列は、次のようであつた： 5′ AGC AGC GGC GTC AAA AGT
GAA GGC TAA CTT 3′。 クローン３５ｆの配列、該配列のクローン３９
ｃの配列とのオーバーラツプ、および該配列でコ
ードされるアミノ酸を、第２８図に示す。 クローン１９ｇの単離は、クローン３５ｆの
3′配列に基づいたハイブリダイゼーシヨンプロー
ブを用いて行つた。このプローブのヌクレオチド
配列は、次のようであつた： 5′ TTC TCG TAT GAT ACC CGC
TGC TTT GAC TCC 3′。 クローン１９ＧのHCV cDNA配列、該配列の
クローン３５ｆの配列とのオーバーラツプ、およ
び該配列でコードされるアミノ酸を、第２９図に
示す。 クローン２６ｇの単離は、クローン１９ｇの
3′配列に基づいたハイブリダイゼーシヨンプロー
ブを用いて行つた。このプローブのヌクレオチド
配列は、次のようであつた： 5′ TGT GTG GCG ACG ACT TAG
TCG TTA TCT GTG 3′。 クローン２６ｇのHCV cDNA配列、該配列の
クローン１９ｇの配列とのオーバーラツプ、およ
び該配列でコードされるアミノ酸を、第３０図に
示す。 クローン１５ｅは、クローン２６ｇの3′配列に
基づいたハイブリダイゼーシヨンプローブを用い
て単離した。このプローブのヌクレオチド配列
は、次のようであつた： 5′ CAC ACT CCA GTC AAT TCC
TGG CTA GGC AAC 3′。 クローン１５ｅのHCV cDNA配列、該配列の
クローン２６ｇの配列とのオーバーラツプ、およ
び該配列でコードされるアミノ酸を、第３１図に
示す。 この節で記述したクローンは、．A.節で記
述した期間および条件でATCCに寄託されてお
り、以下の受託番号が授与されている。 λ−gt11 ATCC番号 寄託日 クローン１２ｆ クローン３５ｆ クローン１５ｅ 前述の単離クローンのHCV cDNA配列は、複
合HCV cDNA配列を作成するのに並べられてい
る。5′から3′の方向に並べられた単離クローン
は：１２ｆ，１４ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３
ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，
３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３
ｇ，３９ｃ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ、および１
５ｅである。 単離クローン由来の複合HCV cDNA配列、お
よび該配列でコードされるアミノ酸を、第３２図
に示す。 Ａ 20クローン１２ｆのHCV cDNA配列上
流のcDNA配列を単離する別の方法 上流の配列の逆転写を開始させるために、クロ
ーン１２ｆのHCV cDNA由来の第３２図の
5′HCV配列のほとんどに基づいて、逆転写酵素
の小さな合成オリゴヌクレオチドプライマーを合
成し、HCVゲノムRNA中の対応する配列に結合
させるのに用いる。プライマー配列はクローン１
２ｆの既知の5′末端配列に近いが、プライマー配
列上流のプローブ配列の設計を許容するのに十分
に下流である。プライミングおよびクローニング
の公知の標準法が用いられる。得られたcDNAラ
イブラリーは、プライミング部位（クローン１２
ｆの明らかにされた配列から推定される）の上流
の配列を用いてスクリーニングされる。HCVゲ
ノムRNAは、NANBHのチンパンジー由来の血
漿または肝臓試料、またはNANBHのヒト由来
の類似の試料のいずれかから得られる。 Ａ 21HCVゲノムの5′末端領域から配列を
単離するための、尾部付加（tailing）を利用
した別の方法 HCV RNAゲノムの5′最末端配列を単離する
ために、逆転写の初回cDNA生成物（これは、鋳
型RNAにより二本鎖とされる）を、オリゴＣで
尾部付加処理する。これは、この生成物をCTP
存在下でターミナルトランスフエラーゼとインキ
ユベートすることにより行われる。cDNAの第一
鎖の相補鎖を生成させる第２回のcDNA合成は、
逆転写酵素反応のプライマーとしてオリゴＧを用
いて行われる。ゲノムHCV RNAの材料源は、
．A.20.節で記述したのと同様である。ターミ
ナルトランスフエラーゼを用いた尾部付加処理、
および逆転写酵素反応のための方法は、
Maniatisら（1982）と同様である。次いで、
cDNA生成物をクローン化し、スクリーニング
し、そして配列決定する。 Ａ 22HCVゲノムの3′末端領域から配列を
単離するための、尾部付加を利用した別の方法 この方法は、フラビウイルスのRNAのcDNA
をクローニングするために以前に使用された方法
に基づいている。この方法では、RNAは、3′末
端の二次構造を除去するために変性条件に置かれ
る。そして、その後rATPを基質として用い、ポ
リＡポリメラーゼで尾部付加処理される。ポリＡ
を尾部付加処理したRNAの逆転写は、オリゴdT
をプライマーとして用い、逆転写酵素により触媒
される。cDNAの第２鎖を合成し、cDNA生成物
をクローン化し、スクリーニングし、そして配列
決定する。 Ａ 23大きなcDNAインサートを有するλ−
gt11 HCV cDNAライブラリーの作成 λ−gt11ライブラリーを作成し、スクリーニン
グするのに用いた方法は、．A.1.節に記述した
のと本質的に同様である。ただし、ライブラリー
はセフアロースCL−4Bカラムから溶出した大き
なサイズのcDNAのプールから作成した。 Ａ 24プライマーとして合成オリゴマーを用
いたHCV cDNAライブラリーの作成 新しいHCV cDNAライブラリーは、．A.1.
節に記述した感染チンパンジーの血漿プール由来
のRNAから、ならびにこの感染動物の肝臓由来
のポリA+RNA画分から調製されている。cDNA
は、GublerおよびHoffman（1983）により記述さ
れているのと本質的に同様にして構築した。ただ
し、最初のcDNA鎖合成のためのプライマーは、
前述のHCVゲノムの配列に基づいた二つの合成
オリゴマーであつた。クローン１１ｂおよび７ｅ
の配列に基づいたプライマーは、それぞれ、 5′ CTG GCT TGA AGA ATC 3′ および 5′ AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC
3′ であつた。得られたcDNAは、λバクテリオフア
ージベクターにクローン化し、配列が第３２図の
HCV配列に基づいた種々の他の合成オリゴマー
を用いてスクリーニングした。 ＢHCV cDNAでコードされるポリペプチド
の発現および発現された生成物のHCV誘導抗
原としての同定 Ｂ １クローン５−１−１においてコードさ
れるポリペプチドの発現 クローン５−１−１においてコードされる
HCVポリペプチド（．A.2.節を参照のこと、
前出）を、スーパーオキシドジスムターゼ
（SOD）との融合ポリペプチドとして発現させ
た。これは、以下のように、クローン５−１−１
のcDNAインサートを発現ベクターpSODcfl
（Steimerら（1986））にサブクローン化すること
により行つた。 まず、pSODcflから単離したDNAをBamH
およびEcoRで処理し、これらの制限酵素によ
り作られる直線状のDNAに以下のリンカーを結
合させた： 5′GAT CCT GGA ATT CTG ATA Ａ
3′ 3′ GA CCT TAA GAC TAT
TTT AA 5′ クローニングの後、インサートを有するプラス
ミドを単離した。 インサートを有するプラスミドを、EcoRで
切断した。クローン５−１−１のHCV cDNAイ
ンサートをEcoRで切断し、このEcoR直線化
プラスミドDNAに連結した。このDNA混合物
を、E. coli D1210株（Sadlerら（1980））を形
質転換するのに用いた。第１図に示した、ORF
の発現について正しい方向性を有する５−１−１
cDNAでの組換え体は、制限酵素切断地図作製お
よびヌクレオチド配列決定により同定した。 IPTGの存在下で細菌を生育させることによ
り、１個のクローン由来の組換え体細菌が、
SOD NANB5-1-1ポリペプチドを発現するよう
に誘導された。 Ｂ ２クローン８１においてコードされるポ
リペプチドの発現 クローン８１に含まれるHCV cDNAを、SOD
−NANB81融合ポリペプチドとして発現させた。
この融合ポリペプチドをコードするベクターを調
製するための方法は、SOD−NANB5-1-1をコー
ドするベクターを作製するのに用いたのと類似の
方法であつた。ただし、HCV cDNAの材料源は
クローン８１であり、これは．A.3節で記述し
たように単離され、cDNA配列が．A.4節で記
述したように決定されたものである。クローン８
１のHCV cDNAのヌクレオチド配列、および該
配列でコードされるポリペプチドの推定アミノ酸
配列を、第４図に示す。 クローン８１のHCV cDNAインサートを
EcoRで切断し、リンカー（．B.1.節を参照
のこと）を有し、かつEcoRでの処理により直
線化されたpSODcflに連結した。このDNA混合
物を、E. coli D1210株を形質転換するのに用
いた。第４図に示されるORFの発現について正
しい方向でクローン８ HCV cDNAを有する
組換え体を、制限酵素切断地図作製およびヌクレ
オチド配列決定により同定した。 IPTGの存在下で細菌を生育させることによ
り、１個のクローン由来の組換え体細菌が、
SOD NANB81ポリペプチドを発現するように誘
導された。 Ｂ ３クローン５−１−１においてHCVお
よびNANBH関連抗原としてコードされるポ
リペプチドの同定 クローン５−１−１のHCV cDNA内にコード
されるポリペプチドを、NANBHに感染したチ
ンパンジーおよびヒトの血清が融合ポリペプチド
SOD−NANB5-1-1と免疫学的に反応することを
証明することにより、NANBH関連抗原として
同定した。このSOD−NANB5-1-1は、そのＮ末
端にスーパーオキサイドジスムターゼを、そして
そのＣ末端にフレーム内（in−frame）の５−１
−１抗原を有する。この同定は、以下のような
“ウエスタン”ブロツテイング法（Towbinら
（1979））により行つた。 ．B.1.節で記述した、SOD−NANB5-1-1を
コードする発現ベクターで形質転換した細菌の組
換え体株を、IPTGの存在下で生育させることに
より融合ポリペプチドを発現するように誘導し
た。全部の細菌溶解物を、Laemmli（1970）に従
つて、SDS存在下でポリアクリルアミドゲルに通
して電気泳動を行つた。分離されたペプチドは、
ニトロセルロースフイルターに移した（Towbin
ら（1979））。次いで、このフイルターを細片に切
断し、この細片を異なるチンパンジーおよびヒト
の血清と個々にインキユベートした。結合した抗
体は、．A.1.節に記述したように、125−標識
ヒツジ抗ヒトｇと共にさらにインキユベートす
ることにより検出した。 ウエスタンブロツトに用いたチンパンジー血清
の特徴付け、およびオートラジオグラフイーを行
つた細片の写真に示される結果を、第３３図に示
す。ポリペプチドを含むニトロセルロース細片
を、急性NANBH（ハツチンソン株）感染（レー
ン１−１６）、Ａ型肝炎感染（レーン１７−２
４）、およびＢ型肝炎感染（レーン３４−４４）
の間の異なつた時期におけるチンパンジーから得
た血清とインキユベートした。レーン２５および
４５は、陽性の対照を示す。該対照では、免疫ブ
ロツトを、λ−gt11cDNAライブラリーのオリジ
ナルスクリーニングにおいて組換え体クローン５
−１−１を同定するのに用いた（．A.1.節を参
照のこと）患者由来の血清とインキユベートし
た。 第３３図の対照レーン２５および４５における
目視しうるバンドは、抗体がSOD融合ポリペプ
チドのNANB5-1-1部分に結合していることを示
す。これらの抗体は、単独のSODとの結合を示
さない。なぜならば、単独のSODもこれらの試
料における陰性の対照として含まれており、
SOD−NANB5-1-1融合ポリペプチドよりも有意
に速く移動するバンドとして現れるからである。 第３３図のレーン１−１６は、４匹のチンパン
ジーの血清試料中の抗体の結合を示し；この血清
は、NANBHに感染する直前およびその後の急
性感染の期間中に得たものである。図からわかる
ように、SOD−NANB5-1-1ポリペプチドと免疫
学的に反応する抗体は、感染性のHCV接種材料
の投与前および感染の急性期の早い時期に得た血
清試料には存在しなかつた。ところが、４匹の動
物は全て、急性期後期またはその後の時期に、最
終的にこのポリペプチドに対する循環抗体を誘導
した。番号３および４のチンパンジーの場合の免
疫ブロツトで観察される付加的なバンドは、宿主
の細菌タンパクに結合したバツクグラウンドによ
るものであつた。 NANBHに感染したチンパンジー由来の血清
で得られた結果とは対照的に、融合ポリペプチド
のNANB5-1-1部分に対する抗体の発生は、HAV
に感染した４匹にチンパンジーまたはHBVに感
染した３匹のチンパンジーでは観察されなかつ
た。これらの場合における唯一の結合は、HCV
に感染した試料でも生じる、宿主の細菌タンパク
に結合したバツクグラウンドであつた。 ウエスタンブロツトに用いたヒト血清の特徴付
け、およびオートラジオグラフを行つた細片の写
真に示される結果を、第３４図に示す。ポリペプ
チドを含むニトロセルロース細片を、NANBH
（レーン１−２１）、HAV（レーン３３−４０）、
およびHBV（レーン４１−４９）に感染している
間の異なつた時期におけるヒトから得た血清とイ
ンキユベートした。レーン２５および５０は、陽
性の対照を示す。該対照では、免疫ブロツトを、
前述のλ−gt11ライブラリーのオリジナルスクリ
ーニングで用いた患者由来の血清とインキユベー
トした。レーン２２−２４および２６−３２は、
血清を“正常な”血液提供者から得た、“非感染
の”対照を示す。 第３４図からわかるように、λ−gt11ライブラ
リーをスクリーニングするのに用いた血清を含む
９人のNABH患者由来の血清は、融合ポリペプ
チドのNANB5-1-1部分に対する抗体を含有して
いた。NANBHの３人の患者由来の血清は、こ
れらの抗体を含有しなかつた。これらの患者に抗
NANB5-1-1抗体が将来発生する可能性はある。
異なつたNANBV因子に起因するこの反応の欠
如が、非反応血清を採取した個体に病気を引き起
こし得ることもまた、可能である。 第３４図はまた、HAVおよびHBVに感染した
多くの患者由来の血清が抗NANB5-1-1抗体を含
有していないこと、およびこれらの抗体は“正常
な”対照由来の血清にも存在しないことも示す。
あるHAV患者（レーン３６）は抗NANB5-1-1抗
体を有するように見えるが、この患者は以前に
HCVに感染していたということが可能である。
なぜならば、NANBHの発生率は非常に高く、
しばしば潜在性であるからである。 これらの血清学的な研究は、BB−NANBVに
感染した患者および動物由来の血清により特異的
に認識されるエピトープを、クローン５−１−１
のcDNAがコードすることを示している。さら
に、cDNAは霊長類のゲノム由来ではないらし
い。クローン５−１−１またはクローン８１から
作製されたハイブリダイゼーシヨンプローブは、
唯一のシングルコピー遺伝子が検出され得る条件
下で、非感染個体由来の対照のヒトおよびチンパ
ンジーのゲノムDNAの“サザン”プロツトにハ
イブリダイズしなかつた。これらのプローブはま
た、対照のウシのゲノムDNAのサザンブロツト
にもハイブリダイズしなかつた。 Ｂ ４クローン３６，８１および３２の複合
HCV cDNAにおいてコードされるポリペプチ
ドの発現 クローン３６，８１および３２にわたるORF
でコードされるHCVポリペプチドを、SODとの
融合ポリペプチドとして発現させた。これは、複
合cDNAであるC100をヒトのスーパーオキサイ
ドジスムターゼ遺伝子を有する発現カセツトに挿
入すること、発現カセツトを酵母の発現ベクター
に挿入すること、および酵母でポリペプチドを発
現させることにより行つた。 クローン３６，８１および３２由来の複合
C100 cDNAを有する発現カセツトを、約1270bp
のEcoRフラグメントをベクターpS3−56
（pS356とも呼ばれる）のEcoR部位に挿入する
ことにより構築し、プラスミドpS3−56C100を作
製した。C100の構築は、前述の．A.16節に記
述されている。 pBR322の誘導体であるベクターpS3−56は、
ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子上
流のADH2／GAPDHハイブリツド酵母プロモー
ター、および下流のGAPDH転写終結信号を含む
発現カセツトを有する。これらの制限要素および
スーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する
同様のカセツトは、Cousensら（1987）、および
本発明の出願人による同時係属のヨーロツパ特許
出願第196056号（1986年10月１日公開）に記載さ
れている。しかしながら、pS3−56のカセツトは
Cousensら（1987）のカセツトとは異なる。pS3
−56のカセツトはCousensら（1987）のカセツト
とは異なる。pS3−56のカセツトには、異種のプ
ロインシユリン遺伝子および免疫グロブリンのヒ
ンジが欠失しており、かつスーパーオキサイドジ
スムターゼのgln154にEcoR部位を有するアダ
プター配列が続いている。このアダプターの配列
は次のようである： 5′−AAT TTG GGA ATT CCA TAA
TGA Ｇ −3′ AC CCT TAA GGT
ATT ACT CAG CT。 EcoR部位は、カセツトを有するベクターか
ら発現する場合には、次のアミノ酸配列を有する
オリゴペプチドリカーを介してスーパーオキサイ
ドジスムターゼに融合するポリペプチドを生じ
る、異種配列の挿入を可能にしている： −asn−leu−gly−ile−arg−。 pS356の試料は、ブタペスト条約のもとに1988
年４月29日にアメリカンタイプカルチヤーコレク
シヨン（ATCC）、12301 Parklawn Dr.，
Rockville，Maryland 20853に寄託されており、
受託番号第67683号が与えられている。寄託物を
入手し得る期間および寄託物の入手方法、ならび
に寄託物の保持については、NANBV−cDNA
を有する株について．A.節で明記したのと同
様である。この寄託は便宜のみを意図しており、
本明細書の記述により本発明を実施するためのも
のではない。この寄託物を、参照としてここに引
用する。 正しい方向でC100 cDNAインサートを有する
組換え体を単離した後、C100 cDNAを有する発
現カセツトをpS3−56C100からBamHで切り出
し、このカセツトを有する約3400bpのフラグメ
ントを単離・精製した。次いで、このフラグメン
トを酵母ベクターpAB24のBamH部位に挿入
した。 重要な特徴を第３５図に示すプラスミド
pAB24は、複製のための完全な2μ配列［Broach
（1981）］およびpBR322配列を有する酵母シヤト
ルベクターである。このプラスミドは、プラスミ
ドYEp24［Botsteinら（1979）］由来の酵母URA3
遺伝子、およびプラスミドpC1／１由来の酵母
LEU2d遺伝子も有する。EPO公開第116201号公
報。プラスミドpAB24は、部分的な2μ配列を除
去するためにYEp24をEcoRで消化し、このベ
クターを再連結することにより構築した。得られ
たプラスミドYEP24deltaRを、Claで切断す
ることにより直線化し、Claで直線化されてい
る完全な2μプラスミドと連結した。次いで、得
られたプラスミドpCBouをXbaで切断し、
8605bpのベクターフラグメントをゲルで単離し
た。この単離されたXbaフラグメントを、
pC1／１から単離されたLEU2d遺伝子を有する
4460bpのXbaフラグメントと連結した。この
LEU2d遺伝子の方向は、URA3遺伝子と同じ方向
である。発現の挿入は、pBR322配列の唯一の
BamH部位であつた。従つて、テトラサイク
リンに対する細菌の抵抗性についての遺伝子を阻
止している。 SOD−C100発現カセツトを有する組換え体プ
ラスミドpAB24C100−３を、酵母JSC308株およ
びその他の株に導入した。細胞をHinnenら
（1978）により記載されているように形質転換し、
ura−選択プレートにプレーテイングした。単一
のコロニーをleu−選択培地に接種し、飽和状態
となるまで増殖させた。この培養物は、１％グル
コースを含有するYEPで生育させることにより、
SOD−C100ポリペプチド（C100−３と呼ぶ）を
発現するように誘導された。 JSC308株は、ADR1遺伝子座に組み込まれて
いる遺伝子型がMAT＠，leu2，ura3（del）
DM15（GAP／ADR1）である。JSC308において
は、正の活性化遺伝子産物ADR1の過剰な発現
は、発現された異種タンパクがADH2 UAS調節
システムにより合成される場合には、過度の抑制
解除（hyperdereperession）（ADR1野生型対照
に関連する）と、そのようなタンパクの非常に高
い収量とをもたらす。酵母JSC308株の構築は、
係属中の米国特許出願番号（代理人Docket No.
2300−0229）に開示されており、この特許出願を
本願と同時に出願し、これを参照文献としてここ
に引用する。JSC308の試料は、ブタペスト条約
の下に1988年５月５日に、 ATCCに寄託されており、受託番号第20879号
が与えられている。寄託物を入手し得る期間およ
び寄託物の入手方法、ならびに寄託物の保持につ
いては、HCV cDNAを有する株について．A.
節で明記したのと同じである。 pAB24C100−３でコードされる完全なC100−
３融合ポリペプチドは、アミノ末端にヒトSOD
の154個のアミノ酸と、EcoR部位を有する合成
アダプター由来の５個のアミノ酸残基と、C100
cDNA由来の363個のアミノ酸残基と、クローン
３２のHCV cDNAに隣接したMS2ヌクレオチド
配列由来の５個のカルボキシ末端アミノ酸とを有
するはずである。（．A.7.節を参照のこと）。
SODの最後から２つ目のAla残基で始まる、この
ポリペプチドのカルボキシ末端の推定アミノ酸配
列を、第３６図に示す。このポリペプチドのこの
部分をコードするヌクレオチド配列も同様に示
す。 Ｂ ５C100内にコードされるポリペプチド
のNANBH関連抗原としての同定 酵母JSC308株内のプラスミドpAB24C100−３
から発現するC100−３融合ポリペプチドを、サ
イズについて特徴付けした。そして、C100内に
コードされるポリペプチドを、その慢性
NANBHのヒト由来の血清との免疫学的反応性
によりNANBH−関連抗原として同定した。 ．B.4.節で記述したように発現するC100−３
ポリペプチドは、以下のようにして分析した。酵
母JSC308細胞をpAB24またはpAB24C100−３で
形質転換し、外来プラスミドがコードするポリペ
プチドを発現するように誘導した。培養物
（OD650onが約20）1ml中の誘導酵母細胞を
10000rpmで１分間遠心分離することによりペレ
ツトとし、それらを２容量の溶液および１容量の
ガラスビーズ（直径0.2ミリミクロン）とともに
激しく渦巻攪拌（10×１分）することにより細胞
溶解させた。この溶液は、50mMトリス−HCl
（PH8.0）、1mM EDTA，1mMフエニルメチルス
ルホニルフルオリド（PMSF）、および1μg／ml
ペプスタチンを含有していた。C100−３ポリペ
プチドを含有する細胞溶解物中の不溶性物質を、
遠心分離（10000rpm、５分間）により集め、
LaemmliのSDS試料緩衝液中で５分間煮沸する
ことにより溶解させた。〔Laemmli（1970）を参
照のこと〕。誘導された酵母培養物0.3ml中の量に
相当する量のポリペプチドを、Laemmli（1970）
に従い、SDS存在下で10％ポリアクリルアミドゲ
ルにより電気泳動を行つた。タンパク標準物質を
一緒にゲル電気泳動した。発現されたポリペプチ
ドを含有するゲルは、クマシーブリリアントブル
ーで染色するか、またはpAB24および
pAB24C100−３から発現されたポリペプチドの
免疫学的反応性を決定するために慢性NANBH
の患者由来の血清を用いて、．B.2.節で記述し
たような“ウエスタン”ブロツトに供した。 結果を第３７図に示す。第３７図Ａでは、ポリ
ペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色し
た。pAB24で形質転換したJSC308由来の不溶性
ポリペプチド、およびpAB24C100−３で形質転
換したJSCの異なる二つのコロニー由来の不溶性
ポリペプチドを、それぞれレーン１（pAB24）、
ならびにレーン２および３に示す。レーン２およ
び３とレーン１との比較は、pAB24C100−３で
形質転換したJSC308由来の分子量が約54000ダル
トンに相当するポリペプチドの、誘導された発現
を示す。このポリペプチドは、pAB24で形質転
換したJSC308では誘導されない。このポリペプ
チドを矢印で示す。 第３７図Ｂは、pAB24（レーン１）または
pAB24C100−３（レーン２）で形質転換した
JSC308で発現される、不溶性ポリペプチドのウ
エスタンブロツトの結果を示す。pAB24から発
現されるポリペプチドは、NANBHのヒト由来
の血清と免疫学的な反応性を示さなかつた。しか
しながら、矢印で示したように、pAB24C100−
３で形質転換したJSC308は、ヒトNANBH血清
と免疫学的に反応する約54000ダルトンのポリペ
プチドを発現した。レーン２の、免疫学的に反応
性のあるその他のポリペプチドは、この約54000
ダルトンのポリペプチドの分解産物および／また
は凝集物であり得る。 Ｂ ６ 融合ポリペプチドC100−３の精製 Ｎ末端にSODを、そしてＣ末端にフレーム内
（in−frame）のC100 HCV−ポリペプチドを有
する融合ポリペプチドC100−３を、ポリペプチ
ドが発現された宿主酵母細胞抽出物の不溶性画分
を分別抽出することにより精製した。 融合ポリペプチドC100−３を、．B.4.節に記
述したように、pAB24C100−３で形質転換した
酵母JSC308株で発現させた。次いで、酵母細胞
をホモジナイズすることにより溶解させ、溶解物
中の不溶性物質をPH12.0で抽出した。そして、残
つた不溶性画分中のC100−３を、SDSを含有す
る緩衝液に可溶化した。 酵母溶解物を、本質的にNagahumaら（1984）
に従つて調製した。20mMトリスHCl（PH8.0），
1mMジチオスレイトール、および1mMフエニル
メチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含有す
る溶液（緩衝液Ａ）中に、33％細胞（ｖ／ｖ）の
割合で、酵母細胞懸濁液を調製した。この懸濁液
の所定量（15ml）を等量のガラスビーズ（直径
0.45−0.50mm）と混合し、この混合物をSuper
Mixer（Lab Line Instruments，Inc.）の最高速
度で８分間渦巻攪拌した。このホモジネートおよ
びガラスビーズを分離し、もとの細胞沈澱物と同
様に、ガラスビーズを等量の緩衝液Ａで３回洗浄
した。洗浄液とホモジネートとを合わせた後、ホ
モジネートを7000×ｇで15分間、４℃で遠心分離
し、ペレツトをもとの細胞沈澱物の２倍量に相当
する量の緩衝液Ａに再懸濁し、7000×ｇで15分間
遠心分離して物質を再びペレツトとすることによ
り、溶解物中の不溶性物質を得た。この洗浄工程
を３回繰り返した。 溶解物からの不溶性物質は、以下のようにして
PH12.0で抽出した。ペレツトを0.5M NaCl，
1mM EDTAを含有する緩衝液に懸濁した。ここ
で、懸濁液の容量は、もとの細胞沈澱物の1.8倍
量に相当した。懸濁液のPHは、0.2容量の0.4Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（PH12.0）を添加すること
により調整した。混合した後、懸濁液を7000×ｇ
で15分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した。
この抽出を２回繰り返した。抽出したペレツト
は、もとの細胞沈澱物の２倍量に相当する懸濁液
量を用い、該ペレツトを0.5M NaCl，1mM
EDTAに懸濁し、次いで7000×ｇで15分間、４
℃で遠心分離することにより洗浄した。 ペレツト抽出物中のC100−３ポリペプチドは、
SDSで処理することにより可溶化した。このペレ
ツトをもとの細胞沈澱物の容量の0.9容量に相当
する量の緩衝液Ａに懸濁し、0.1容量の２％SDS
を添加した。懸濁液を混合した後、7000×ｇで15
分間、４℃で遠心分離した。得られたペレツトを
SDSで３回以上抽出した。C100−３を含有する、
得られた上清をプールした。 この工程により、C100−３は酵母ホモジネー
トの不溶性画分から10倍以上精製され、ポリペプ
チドの回収率は50％以上を越える。 融合ポリペプチドの精製調製物は、Laemmli
（1970）に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分析した。この分析に基づくと、ポリペ
プチドはその鈍度が80％を越え、見かけの分子量
約54000ダルトンを有していた。 ＣHCV cDNAにハイブリダイズする、感染
個体のRNAの同定 Ｃ １HCV cDNAにハイブリダイズする、
NANBHのチンパンジーの肝臓内のRNAの同
定 以下のように、NANBHのチンパンジーの肝
臓由来のRNAは、ノーザンブロツトによりクロ
ーン８１に含有されるHCV cDNAとハイブリダ
イズする種類のRNAを含有することが示された。 RNAを、高力価の血漿が得られたチンパンジ
ーの肝臓の生検材料から単離した（．A.1.節を
参照のこと）。これには、哺乳動物細胞からの全
RNAの単離、ならびに該RNAのポリA+画分お
よびポリA-画分への分離についてManiatisら
（1982）に記載された技術を用いた。これらの
RNA画分を、ホルムアルデヒド／アガロースゲ
ル（１％ｗ／ｖ）での電気泳動に供し、ニトロセ
ルロース膜に移した。（Maniatisら（1982））。ニ
トロセルロースフイルターを、クローン８１由来
の放射性標識HCV cDNA（インサートのヌクレ
オチド配列については、第４図を参照のこと）と
ハイブリダイズさせた。放射性標識プローブを調
製するために、クローン８１から単離したHCV
cDNAインサートを、DNAポリメラーゼを用
いたニツクトランスレーシヨン（Maniatisら
（1982））により32Pで放射性標識した。ハイブリ
ダイゼーシヨンは、10％（ｗ／ｖ）デキストラン
スルフエート、50％（ｗ／ｖ）脱イオン化ホルム
アミド、750mM NaCl，75mM クエン酸ナト
リウム、20mM Na2HPO4（PH6.5）、0.1％ SDS，
0.2％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（BSA）、
0.02％（ｗ／ｖ）フイコール−400，0.02％
（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、100μg／mlの
超音波処理および変性処理によりせん断したサケ
精子DNA、および106CPM／mlのニツクトラン
スレーシヨンしたcDNAプローブを含有する溶液
中で18時間、42℃で行つた。 プローブで処理したフイルターのオートラジオ
グラフを、第３８図に示す。レーン１は、32P−標
識した制限フラグメントマーカーを含有する。レ
ーン２−４は、以下のようなチンパンジー肝臓の
RNAを含有する：レーン２は、30μgの全RNA
を含有し；レーン３は、30μgのポリA-RNAを含
有し；そしてレーン４は、20μgのポリA+RNAを
含有する。第３８図に示すように、NANBHの
チンパンジーの肝臓は、HCV cDNAプローブに
ハイブリダイズし、かつ約5000ヌクレオチドから
約11000ヌクレオチドの大きさと考えられる、ポ
リA+RNA分子関連の異種集団を含有する。
HCV cDNAにハイブリダイズするこのRNAは、
細菌ゲノムおよび／または細菌ゲノムの特異的転
写物を意味し得る。 以下の．C.2.節に記述した実験は、HCVは
一つのRNAゲノムを有するという示唆と一致す
る。 Ｃ ２感染個体から得た血清中のHCV由来
RNAの同定 ．A.1.節で記述したように、核酸を、高力価
のチンパンジーNANBH血漿から単離した粒子
から抽出した。単離した核酸の一定量（もとの血
漿の１mlに相当する）を、20μlの50mM Hepes
（PH7.5），１mm EDTAおよび16μg／ml酵母可溶
性RNAに再懸濁した。試料は、５分間煮沸した
後、直ちに凍結することにより変性させ、
RNase Ａ（5μl；25mM EDTA溶液、40mM
Hepes（PH7.5）に0.1mg／ml RNase Ａを含有す
る）またはDNase Ｉ（5μl；10mM MgCl2，
25mM Hepes（PH7.5）中に１単位のDNaseを
含有する）で処理した。対照の試料は、酵素なし
でインキユベートした。インキユベーシヨンの
後、2μg／ml酵母可溶性RNAを含有する230μlの
氷冷２×SSCを添加し、試料をニトロセルロース
フイルターで濾過した。このフイルターを、ニツ
クトランスレーシヨンにより32P−標識したクロ
ーン８１由来のcDNAプローブとハイブリダイズ
させた。第３９図は、このフイルターのオートラ
ジオグラフを示す。ハイブリダイゼーシヨンのシ
グナルは、DNase処理試料および対照試料（そ
れぞれ、レーン２および１）で検出されたが、
RNaseで処理した試料（レーン３）では検出さ
れなかつた。このように、RNase Ａ処理により
粒子から単離した核酸が分解され、DNase Ｉ処
理は何の影響もなかつたので、この証拠により、
HCVゲノムがRNAにより構成されるということ
が強く示唆される。 Ｃ ３NANBHを有するチンパンジーから
得られる肝臓および血漿試料におけるHCV核
酸配列由来の増幅HCV核酸配列の検出 NANBHを有するチンパンジーの肝臓および
血漿中に存在するHCV核酸、および対照のチン
パンジーにおけるHCV核酸は、基本的にSaikiら
81986）が記述したポリメラーゼ鎖反応（PCR）
の手法を用いて増幅された。このプライマーオリ
ゴヌクレオチドは、クローン８１、あるいはクロ
ーン３６および３７におけるHCV cDNA由来で
あつた。この増幅された配列は、適当なcDNAオ
リゴマー（これは、２つのプライマーの間の領域
を有するが２つのプライマーを含まない）をプロ
ーブとして用い、ゲル電気泳動およびサザンブロ
ツテイングによつて検出された。 増幅系によつて調べられるHCV配列を含む
RNA試料は、NANBHを保有する３匹のチンパ
ンジーおよび２匹の対照のチンパンジーの肝臓の
生体試料から単離された。RNA画分の単離は、
．C.1節に記載したグアニジウムチオシアネー
ト法により行なつた。 増幅系によつて調べられるべきRNA試料もま
た、２匹のNANBH保有チンパンジーおよび１
匹の対照チンパンジー、さらに対照のチンパンジ
ーから得られる貯留した血漿から単離された。１
匹の感染チンパンジーは、106と同等かそれを越
えるCID／mlを有し、他の感染チンパンジーは、
105と同等かそれを越えるCID／mlを有する。 この核酸は、次のようにして血漿から抽出し
た。血漿の0.1mlのもしくは0.01mlを10μg／mlの
ポリアデニル酸を含有するTENB／プロテイナ
ーゼＫ／SDS溶液（0.05M Tris−HCl，PH8.0，
0.001M EDTA，0.1 Ｍ NaCl，１mg／mlプロ
テイナーゼＫ、および0.5％SDS）で最終体積が
1.0mlになるように希釈し、37℃にて60分間イン
キユベートした。このプロテイナーゼＫによる分
解の後、フエノール飽和TE（10.0mM Tris−
HCl，PH8.0，1mM EDTA）を用いた抽出によ
り、脱タンパクした。遠心分離によりフエノール
層を分離し、0.1％のSDSを含むTENBで再抽出
した。それぞれの抽出で得られる水相をプール
し、等容量のフエノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール〔１：１（99：２）〕溶液で２度抽
出し、その後等容量のクロロホルム／イソアミル
アルコール（99：１）の混液を用いて、２度抽出
した。遠心分離により相分離し、水相を、酢酸ナ
トリウムの最終濃度が0.2Mとなるようにし、エ
タノールを２倍量添加することにより核酸を沈澱
させた。沈澱した核酸は、SW41のローターで
38Kにて４℃で60分間超遠心分離を行なうことに
より回収した。 上記に加えて、高力価のチンパンジーの血漿お
よびプールされた対照の血漿のどちらか一方を、
ChomcyzskiおよびSacchi（1987）の方法により、
50μgのポリＡ担体を用いて抽出した。この方法
では、酸グアニジウムチオシアナート
（acidguanidinium thiocyanate）抽出を使用す
る。RNAを、エツペンドルフ マイクロフユー
ジ中で、４℃にて10分間、10000RPMにて遠心分
離することにより、回収した。 ２つの場合においては、PCR反応における
cDNAの合成に先立つて、プロテイナーゼＫ／
SDS／フエノール法によつて血漿から抽出された
核酸は、さらにＳおよびＳエルチツプ−Ｒ（Ｓ
Elutip−Ｒ）カラムに結合させ、このカラムから
溶出させることにより精製した。それに続く工程
は製造者の指示により行なつた。 PCR反応の鋳型として用いられたcDNAは、
上述のように調製された核酸（全核酸または全
RNA）から誘導された。エタノール沈澱に続き、
沈澱した核酸を乾燥し、蒸留水処理したDEPCに
再懸濁した。核酸の２次構造を、試料を65℃にて
10分間加温することによつて引き離し、そして、
速やかに試料を氷で冷却した。cDNAは、肝臓、
あるいは10〜100μの血漿から抽出された核酸
（あるいはRNA）から得られる総チンパンジー
RNA1〜3μgを用いて合成された。この合成は逆
転写酵素を利用し、製造者BRLによつて詳細に
述べられているプロトコールを用い、25μの反
応液中で行われた。cDNA合成用のプライマー
は、後述のPCR反応でもまた利用されているプ
ライマーであつた。cDNA合成のすべての反応混
合物には、RNAase阻害剤であるRNASINTM
（Fisher／Promega）を23U含有していた。
cDNA合成に続き、この反応混合物を水で希釈
し、10分間煮沸し、氷上ですばやく冷却した。 このPCR反応は、1μgのRNase Ａの添加を除
いては、製造者（Cetus−Perkin−Elmer）の指
示に従つて行なつた。この反応は、最終容量が
100μとなるように行なわれた。このPCRは、
37℃，72℃、および94℃の条件下で、35サイクル
にわたつて行なわれた。 cDNA合成用プライマーおよびPCR反応プラ
イマーは、クローン８１、クローン３６、あるい
はクローン３７ｂのいずれかにおけるHCV
cDNA配列から得られた。（クローン８１，３６
および３７ｂのHCV cDNA配列は、第４図、第
５図および第１０図にそれぞれ示されている。）
クローン８１由来の２個の16量体プライマーの配
列は次のとおりである： 5′ CAA TCA TAC CTG ACA Ｇ 3′。 および 5′ GAT AAC CTC TGC CTG Ａ 3′。 クローン３６から得られるプライマーの配列は
次のとおりである： 5′ GCA TGT CAT GAT GTA Ｔ 3′。 クローン３７ｂから得られるプライマーの配列
は次のとおりである： 5′ ACA ATA CGT GTG TCA Ｃ 3′。 このPCR反応において、このプライマーの対
は、クローン８１由来の２つの16量体プライマー
対；あるいはクローン３６由来の16量体プライマ
ーとクローン３７ｂ由来の16量体プライマーとの
対のいずれによつても構成される。 このPCR反応生産物は、該生産物をアルカリ
ゲル電気泳動にかけサザンブロツテイングを行
い、プライマーと重複しないHCV cDNA領域由
来の32P標識内部のオリゴヌクレオチドプローブ
により増幅されたHCV cDNA配列を検出するこ
とによつて分析された。このPCR反応混合物を
フエノール／クロロホルムで抽出し、核酸を、塩
およびエタノールを用いて水相から沈澱さた。沈
澱させた核酸を遠心分離で回収し、蒸留水に溶解
させた。試料の一部は、1.8％アルカリアガロー
スゲルで電気泳動を行つた。60，108および161の
ヌクレオチド長の一本鎖DNAを、分子量マーカ
ーとして、同時に電気泳動にかけた。電気泳動
後、このゲル中のDNAを、Biorad Zeta
ProbeTM紙に移した。プレハイブリダイゼーシヨ
ンおよびハイブリダイゼーシヨン、および洗浄条
件は、製造者（Biorad）によつて規定される条
件に従つた。 増幅されたHCV cDNA配列のハイブリダイゼ
ーシヨン検出に用いられたプローブは次のとおり
である。PCRプライマーの対がクローン８１由
来であるときには、２つのプライマーの配列の間
の領域に位置する配列に対応する配列を有する
108量体であつた。このPCRプライマー対がクロ
ーン３６および３７ｂ由来であるとき、このプロ
ーブはクローン３５由来の、ニツク翻訳された
HCV cDNA挿入物であつた。このプライマーは
クローン３７挿入物の155〜170ヌクレオチドおよ
びクローン３６挿入物の206〜268ヌクレオチド由
来である。クローン３５におけるHCV cDNA挿
入物の3′末端は、クローン３６の挿入物の１〜
186のヌクレオチドと重複しており、そして、ク
ローン３５挿入物の5′末端はクローン３７ｂの挿
入物の207〜269ヌクレオチドと重複する。（第５、
第８、および第１０図を比較されたい。）このよ
うに、クローン３５中のcDNAの挿入物は、クロ
ーン３６および３７ｂ由来のプライマーの配列間
の領域部分にまでおよび、これらプライマーを含
む増幅配列のためのプローブとして有用である。 肝臓試料由来のRNAの分析は、プライマーお
よびプローブの両セツトを利用する上記方法に従
つて行なつた。３匹のNANBH保有チンパンジ
ーの肝臓由来のRNAは、予期されるサイズの増
幅配列（８１および３６および３７ｂにおいて、
それぞれ161および586ヌクレオチド）について
は、ハイブリダイゼーシヨンの結果が陽性であ
り、他方、対照のチンパンジーについては、ハイ
ブリダイゼーシヨンの結果が陰性であつた。この
実験を３回繰りかえしたところ同じ結果が得られ
た。 血漿から得られる核酸およびRNAの分析もま
た、クローン８１由来のプライマーおよびプロー
ブを利用する上記方法により行なわれた。この血
漿は、２匹のNANBH保有チンパンジー由来の
血漿、対照のチンパンジー由来の血漿、そして対
照のチンパンジーから得られるプールされた血漿
である。両NANBH血漿は、核酸／RNAを有
し、PCR増幅アツセイで陽性の結果が得られ、
他方、両対照血漿は陰性の結果が得られた。これ
らの結果は数回繰り返して得られた。 Ｄ感染個体由来の血清中のHCV抗体を検出
するためのラジオイムノアツセイ HCV抗原に対する抗体を検出する固相ラジオ
イムノアツセイは、TsuおよびHerzenberg
（1980）の方法を基にして開発された。マイクロ
タイタープレート（Immulon ２，
Removawellstrips）をHCVエピトープを有する
精製ポリペプチドで被覆する。この被覆プレート
は、HCVエピトープに対する抗体を有する疑い
のあるヒト血清試料、あるいは適当な対照試料と
ともにインキユベートされる。インキユベートを
行なう間に、抗体が存在するのであれば、該抗体
は固相抗原に免疫学的に結合する。非結合物質を
除去し、そしてこのマイクロタイタープレートを
洗浄後、ヒト抗体−NANBV抗原複合体は、125I
標識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキ
ユベートすることによつて検出される。結合しな
かつた標識抗体を吸引によつて除去し、そしてプ
レートを洗浄する。個々のウエルの放射能が測定
される。結合ヒト抗HCV抗体の量はウエル中の
放射能に比例する。 Ｄ １融合ポリペプチドSOD−NANB5-1-1
の精製 ．B.1.節に記載の組換え体細菌中で発現する
融合ポリペプチドSOD−NANB5-1-1は、組換え
体E. coliから、尿素で細胞抽出物を分画抽出す
ることによつて、次いで、次のように陰イオンお
よび陽イオン交換カラムでのクロマトグラフイー
にかけることによつて精製された。 １の培養物から得られる溶解細胞を、0.01M
トリス−HCl，PH8.0、を含有する10mlの20％
（ｗ／ｖ）シユークロース中に再懸濁し、0.4mlの
0.5M EDTA，PH8.0、を添加した。０℃にて５
分後、この混合物を4000×ｇにて10分間遠心分離
した。得られたペレツトを0.05M トリス−
HCl，PH8.0、1mMフエニルメチルスルホニルフ
ルオライド（PMSF）およびペプスタチンＡ
1μg／mlを含有する10mlの25％（ｗ／ｖ）シユー
クロース液に懸濁させ、次いで、0.5mlのリゾチ
ーム（10mg／ml）を添加し、０℃で10分間インキ
ユベートした。0.05M トリス−HCl，PH8.0，
1mM EDTA中に１％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ−
100を含む溶液10mlを添加後、この混合液を、
時々振盪しながらひきつづき０℃にて10分間イン
キユベートした。得られた粘稠な溶液を、20ゲー
ジの滅菌皮下注射針を６回通すことにより、ホモ
ジナイズし、13000×ｇにて25分間遠心分離した。
ペレツト化した物質を、0.01M トリス−HCl
（PH8.0）５mlに懸濁させ、この懸濁液を、4000×
ｇにて10分間遠心分離した。SOD−NANB5-1-1
融合タンパクを含有するペレツトを、0.02M ト
リス−HCl（PH8.0）、1mMジチオスレイトール
（緩衝液Ａ）中に6M尿素を含む溶液５mlに溶解さ
せ、緩衝液Ａで平衡化したＱ−セフアロース フ
アースト フローカラムにかけた。ポリペプチド
は、緩衝液ＡのNaCl中の0.0〜0.3Mのリニアグラ
ジエントで溶出した。溶出後、各画分を、SOD
の存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けて分析し、SOD−NANB5-1-1の含量を決定し
た。このポリペプチドを含有する画分をプール
し、0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH6.0）、
1mMジオチスレイトール、に6M尿素を含む緩衝
液（緩衝液Ｂ）に対して透析した。この透析試料
を、緩衝液Ｂで平衡化したＳ−セフアロース フ
アースト フローカラムにかけ、ポリペプチドを
緩衝液Ｂ中でNaCl0.0〜0.3Mのリニアグラジエン
トで溶出させた。この画分を、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分析し、SOD−NANB5-1-1の
存在を調べ、適当な画分をプールした。 このSOD−NANB5-1-1ポリペプチドの最終調
製物を、SDSの存在下で、ポリアクリルアミド電
気泳動にかけて調べた。この分析によれば、この
調製物は、80％を越える純度であつた。 Ｄ ２ 融合ポリピプチドSOD−NANB81
の精製 ．B.2.節で記載の組換え体細菌中で発現した
融合ポリペプチドSOD−NANB81は、組換え体
E. coliから、尿素を用いた細胞抽出物の分画抽
出により、次いで、融合ポリペプチドSOD−
NANB5-1-1を単離するために記載された工程
（．D.1.節を参照されたい）を用いて、陰イオ
ンおよび陽イオン交換カラムクロマトグラフイー
を行なうことにより精製された。 SOD−NANB81ポリペプチドの最終調製物は、
SDSの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動
によつて調べられた。この分析によれば、この調
製物は50％を越える純度であつた。 Ｄ ３固相ラジオイムノアツセイによる
HCVエピトープに対する抗体の検出 NANBHを有すると診断された32人の患者か
ら得られる血清試料を、ラジオイムノアツセイ
（RIA）によつて分析し、融合ポリペプチドSOD
−NANB5-1-1およびSOD−NANB81中に存在す
るHCVエピトープに対する抗体が検出されるか
否か決定した。 マイクロタイタープレートをSOD−
NANB5-1-1あるいはSOD−NANB81（それぞれ、
．D.1節および．D.2節に従つて、部分精製
されている）で被覆した。この分析は、次のよう
にして行なわれた。 0.125Mホウ酸緩衝液、PH8.3，0.075M NaCl
（BBS）中に0.1〜0.5μgのSOD−NANB5-1-1ある
いはSOD−NANB81を含む100μを、マイクロ
タイタープレート（Dynatech Immulon ２
Removawell Strips）の各ウエルに添加した。
このプレートを湿潤チヤンバー内で４℃にて一晩
インキユベートし、その後、このタンパク溶液を
除去し、0.02％ トリトンＸ−100を含有する
BBS（BBST）で３度このウエルを洗浄した。非
特異的な結合を防ぐために、このウエルを牛血清
アルブミン（BSA）で被覆した。この操作は、
BSAを５mg／mlの割合でBBSに溶解させた溶液
100μ添加し、次いで、室温で１時間インキユ
ベートすることによつて行なつた。このインキユ
ベートの後、BSA溶液を除去した。被覆された
ウエル中のポリペプチドを血清と反応させ、該血
清含有ウエルを37℃にて１時間インキユベートし
た。上記血清との反応は、10mg／mlBSAを含有
する含0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、PH7.2、
0.15M NaCl、（PBS）中に１：100の割合に希釈
された血清試料100μを添加することにより行
なつた。インキユベートの後、この血清試料を吸
引除去し、このウエルをBBSTで５回洗浄した。
この融合ポリペプチドに結合した抗NANB5-1-1
およびNANB81は、125I標識F′（ab）2ヒツジ抗ヒト
IgGをこの被覆ウエルに結合させることにより、
決定された。標識プローブ（比活性５〜20μCi／
μg）100μを各ウエルに添加し、このプレート
を、37℃にて１時間インキユベートした。次い
で、過剰のプローブを吸引除去し、BBSTで５回
洗浄した。各ウエルに結合した放射能の量を、γ
線を検出するカウンターでカウントし決定した。 NANBH保有個体における抗NANB5-1-1およ
びNANB81の検出結果を、表１に示す。 【表】 【表】 【表】 表１からわかるように、NANBHを保有して
いると診断された患者から得られた32の血清のう
ち19が、SOD−NANB5-1-1およびSOD−
NANB81に存在するHCVエピトープに対する抗
体について陽性であつた。 しかし、陽性であつた血清試料は、SOD−
NANB5-1-1およびNANB81と同様に免疫学的に
反応性を有しているわけではなかつた。No.１の患
者から得られた血清試料は、SOD−NANB81に
対しては陽性であつたがSOD−NANB5-1-1に対
しては陽性ではなかつた。No.10，15および17の患
者から得られた血清試料はSOD−NANB5-1-1に
対しては陽性であつたが、SOD−NANB81に対
しては陽性ではなかつた。No.３，８，11および12
の患者から得られた血清試料はSOD−
NANB5-1-1およびSOD−NANB81の両融合ポリ
ペプチドと同程度に反応するが、これに対してNo.
２，４，７および９の患者から得られる血清試料
においては、SOD−NANB81に対するよりも
SOD−NANB5-1-1に対する反応の方が、２〜３
倍反応性が高かつた。これらの結果により
NANB5-1-1およびNANB81が少なくとも３個の
異なるエピトープを有し得ることが示唆される。
つまり、各ポリペプチドが少なくとも１個の独特
のエピトープを有し、そして、２個のポリペプチ
ドが少なくとも１個のエピトープを共有している
ことが可能である。 Ｄ ４ NANBHについての固相RIAの特
異性 NANBHについての固相RIAの特異性は、
HAVあるいはHBVに感染した患者から得られる
血清および対照個体から得られる血清の分析を行
なうことにより試験された。部分精製された
SOD−NANB5-1-1およびSOD−NANB81を使用
する分析は、実施例．D.3節に記載した方法に
より行なわれた。但し、血清は、HAVあるいは
HBVを有しているとあらかじめ診断された患者
から得られた血清であるか、あるいは血液バンク
の提血者である個体から得られた血清である。
HAVおよびHBV感染患者からの血清についての
結果を表１に示す。HAV感染患者から得られた
11個の血清試料、およびHBV感染患者から得ら
れた20個の血清試料を用いて、RIAにより試験が
行なわれた。表１に示すように、これら血清のい
ずれもがBB−NANBVエピトープを有する融合
ポリペプチドとの陽性の免疫反応を行わなかつ
た。 NANB5-1-1抗原を用いたRIAが、対照個体か
ら得られる血清の免疫学的反応性を決定するため
に用いられた。正常血液提供者集団から得られる
230個の血清検体のかち、２個だけがRIAにおい
て陽性反応を示した（データは示されていない）。
これら血清サンプルの源である２人の血液提供者
は、以前にHCVにさらされた可能性がある。 Ｄ ５NANBH感染進行中における
NANB5-1-1の反応性 ２人の患者および４匹のチンパンジーの
NANBH感染進行中における抗NANB5-1-1抗体
の存在が、．D.3節に記載されたRIA法を用い
て追跡された。さらに、感染チンパンジーにおい
て、HAVおよびHBVの感染進行中における抗
NANB5-1-1抗体の有無を決定するためにRIAが
用いられた。 その結果を表２に示す。この結果により、チン
パンジーおよびヒトにおいては、抗NANB5-1-1
抗体は、NANBH感染の急性症状の発現に従つ
て検出された。抗NANB5-1-1抗体は、HAVある
いはHBVに感染したチンパンジーから得られる
血清試料では検出されなかつた。このように、抗
NANB5-1-1抗体は、個体がHCVにさらされたこ
とを示すマーカーとしての働きを有する。 【表】 【表】 〓
T＝最初にサンプリングした日
ＥNANB5-1-1に対するポリクローナル血清
抗体の精製 SOD−NANB5-1-1ポリペプチドと、NANBH
の患者由来の血清試料中の抗体との特異的な免疫
学的反応性に基づいて、NANB5-1-1中のエピト
ープと免疫学的に反応する血清抗体の精製法が開
発された。この方法はアフイニテイークロマトグ
ラフイーを利用する方法である。精製された
SOD−NANB5-1-1ポリペプチド（．D.1.節参
照）を、不溶性の支持体に結合させたが、その結
合は、固定されたポリペプチドが、NANB5-1-1
に対する抗体の親和性を保持するような結合であ
る。血清試料中の抗体は、マトリツクスに結合し
たポリペプチドに吸収される。洗浄して、非特異
的に結合した物質と未結合の物質を除去した後、
PHの変更および／またはカオトロピツク試薬（例
えば尿素）によつて、結合した抗体を、これが結
合しているSOD−HCVポリペプチドから脱離さ
せる。 結合SOD−NANB5-1-1を含有するニトロセル
ロース膜を下記のようにして調製した。ニトロセ
ルロースの膜〔2.1cmのザルトリウス
（Sartorius）、微細孔の径：0.2μm〕を、BBSで
３分間ずつ３回洗浄した。精製した製剤を、
BBS中、室温で２時間かまたは４℃で一夜イン
キユベートすることによつてSOD−NANB5-1-1
を上記の膜に結合させた。未結合の抗原を含有す
る溶液を除去し、フイルターをBBSで３分間ず
つ３回洗浄した。膜に残つている活性部位を、５
mg／mlのBSA溶液とともに30分間インキユベー
トすることにより、BSAでブロツクした。得ら
れた膜を、BBSで５回、蒸留水で３回洗浄して、
過剰のBSAを除去した。ウイルス抗原とBSAを
含有する膜を、次に、0.05Mの塩酸グリシン（PH
2.5）．0.10M NaCl（Gly CHL）で15分間処理し、
次いでPBSで３分間ずつ３回洗浄した。 NANBHに感染した個体由来の血清との融合
ポリペプチドを含有する膜を、２時間インキユベ
ートすることによつて、ポリクローナル抗
NANB5-1-1抗体を単離した。インキユベーシヨ
ン後、フイルターをBBSで５回、蒸留水で２回
洗浄した。次いで結合している抗体を、各フイル
ターから、GlyHClを５回、３分間ずつ用いて溶
離した。各溶離液を、2.0MトリスHCl緩衝液
（PH8.0）の入つている試験管に集めて、溶離液の
PHを8.0に調整した。アフイニテイークロマトグ
ラフイーで処理した後の抗NANB5-1-1抗体の回
収率は約50％である。 結合ウイルス抗原を含有するニトロセルロース
膜は、結合容量はそれほど減少することなしに数
回使用することができる。膜を再使用するには、
抗体を溶離した後、膜をBBSで３回３分間ずつ
洗浄する。次いでBBS中、４℃で貯蔵する。 Ｆ精製ヒトポリクローナル抗−HCV抗体を
用いて感染血漿からHCV粒子を捕獲する方
法；捕獲された粒子中の核酸のHCV cDNAへ
のハイブリダイゼーシヨン Ｆ １ヒトポリクローナル抗−HCV抗体を
用いて感染血漿からHCV粒子を捕獲する方法 NANBHに感染したチンパンジーの感染性血
漿中に存在するタンパク−核酸複合体を、ポリス
チレンビーズに結合させた精製ヒトポリクローナ
ル抗HCV抗体を用いて精製した。 ポリクローナル抗NANB5-1-1抗体は、クロー
ン５−１−１にコードされたSOD−HCVポリペ
プチドを用いて、NANBHに感染したヒト由来
の血清から精製した。精製法は．E.節に記載の
方法を用いた。 精製抗NANB5-1-1抗体を、ポリスチレンビー
ズ（直径1/4”、鏡面仕上げ、Precision Plastic
Ball Co.，シカゴ、イリノイ）に、各々、室温で
一夜、１mlの抗体〔ホウ酸緩衝食塩水（PH8.5）
中1μg／ml〕とともにインキユベートすることに
よつて結合させた。一夜インキユベーシヨンした
後に、ビーズを、TBST（50mMトリスHCl PH
8.0緩衝液、150mM NaCl，0.05％（Ｖ／Ｖ）
Tween20）で１回洗浄し、次に10mg／mlBSAを
含有するリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した。 精製抗NANB5-1-1抗体を全ヒト免疫グロブリ
ンと取替えること以外は、同様にして対照のビー
ズを調製した。 ビーズに結合させた抗NANB5-1-1抗体を用い
て、NANBHに感染したチンパンジーの血漿か
ら、HCVを次のようにして捕獲した。使用した、
NANBHに感染したチンパンジーの血漿につい
ては．A.1.節に記載してある。NANBVに感染
したチンパンジーの血漿の一部（１ml）を、抗
NANB5-1-1抗体または対照の免疫グロブリンで
コートした５個のビーズの各々と、37℃で３時間
インキユベートした。得られたビーズをTBST
で３回洗浄した。 Ｆ ２捕獲された粒子中の核酸のNANBV
−cDNAへのハイブリダイゼーシヨン 抗NANB5-1-1抗体によつて捕獲された粒子か
ら遊離した核酸成分を、クローン８１由来の
HCV cDNAとハイブダイゼーシヨンさせて分析
した。 ．F.1.節に記載したのと同様にして、HCV
粒子をNANBHに感染したチンパンジーの血清
から捕獲した。該粒子から核酸を遊離させるため
に、洗浄したビーズを、プロテイナーゼＫ（１
mg／ml）、10mMトリスHCl PH7.5緩衝液、
10mM EDTA0.25％（Ｗ／Ｖ）SDS，10μg／ml
の可溶性酵母RNAを含有する溶液の0.2ml／ビー
ズとともに、37℃で60分間インキユベートし、次
いで上澄み溶液を取出した。この上澄み液をフエ
ノールとクロロホルムで抽出し、次いで核酸をエ
タノールで、一夜−20℃にて沈殿させた。この核
酸の沈殿を、遠心分離して熱め、乾燥し、50mM
Hepes，PH7.5に溶解させた。抗NANB5-1-1抗体
でコートされたビーズから得た試料および全ヒト
免疫グロブリンを含有する対照ビーズで得た試料
からの可溶性核酸の二つの部分をヒトロセルロー
スフエルターに吸い取らせた。これらのフイルタ
ーを、クローン８１中の精製HCV cDNA断片で
作製した、32Pで標識し、ニツクトランスレーシヨ
ンを行つたプローブとハイブツドさせた。プロー
ブ調製法およびハイブリダイゼーシヨン法は、
．C.1.節に記載してある。 抗NANB5-1-1抗体を含有するビーズによつて
捕獲された粒子由来の核酸を含有するプローブさ
れたフイルターのオートラジオグラフを第４０図
に示す。抗NANB5-1-1抗体を用いて得た抽出物
（A1，A2）から、対照の抗体抽出物（A3，A4）
および対照の酵母RNA（B1，B2）に比べて明確
なハイブリダイゼーシヨンシグナルを得た。精製
クローン８１cDNA断片の1pg，5pgおよび10pg
からなる標準物をそれぞれCl−３に示す。 これらの結果は、抗NANB5-1-1抗体によつて
NANBH血漿から捕獲された粒子が、クローン
８１内のHCV cDNAとハイブリダイゼーシヨン
する核酸を含有することを示し、その結果これら
のクローン中のcDNAは、NANBHの病原体か
ら誘導されるという別の証拠を提供している。 ＧC100−３と精製抗NANB5-1-1抗体との免
疫学的反応性 C100−３融合ポリペプチドと抗NANB5-1-1抗
体との免疫学的反応性を、放射性免疫検定法によ
つて測定したが、この検定法では、固相に結合し
た抗原が、精製抗NANB5-1-1抗体に投与され、
生成した抗原抗体複合物が、125Iで標識したヒツ
ジ抗ヒト抗体で検出された。C100−３ポリペプ
チドの免疫学的反応性を、SOD−NANB5-1-1抗
原のそれと比較した。 融合ポリペプチドC100−３を、．B.5.節と
．B.6.節にそれぞれ記載したのと同様にして合
成し精製した。融合ポリペプチドSOD−
NANB5-1-1を．B.1.節と．D.1.節にそれぞ
れ記載したのと同様にして合成し精製した。精製
抗NANB5-1-1抗体を、．E.節に記載したのと
同様にして得た。 0.125Mホウ酸ナトリウム緩衝液（PH8.3）、
0.075M NaCl（BBS）中、種々の量の精製C100
−３抗原を含有する100μのアリコツトを、マ
イクロタイタープレート（Dynatech Immulon
２ Removawell Strips）の各ウエルに添加し
た。このプレートを加湿チヤンバー内で、一夜４
℃にてインキユベートした。次いでタンパク溶液
を除き、ウエルを0.02％のTriton Ｘ−100含有の
BBS（BBST）で３回洗浄した。非特異的結合を
防止するために、５mg／mlのBSAを含有する
BBS溶液を100μ添加することによつて、ウエ
ルをBSAでコートし、次いで室温で１時間イン
キユベートした後、過剰のBSA溶液を除去した。
ウエル当り1μgの抗体を添加することによつて、
コートされたウエル内のポリペプチドを、精製抗
NANB5-1-1抗体と反応させ、次いでその試料を
37℃で１時間インキユベートした。インキユベー
トした後、過剰の溶液を吸引によつて除去し、ウ
エルをBBSTで５回洗浄した。125Iで標識した
F′（ab）2ヒツジ抗ヒトIgGを、コートされたウエ
ルに結合させることによつて、融合ポリペプチド
に結合した抗NANB5-1-1を測定した。標識した
プローブ（比放射能：５〜20μCi／mg）の100μ
ずつを各ウエルに添加し、そのプローブを37℃で
１時間インキユベートし、過剰のプローブを吸引
で除去し、BBSTで５回洗浄した。各ウエルに結
合した放射能の量は、γ線を検出するカウンター
で計数することによつて測定した。 C100の精製抗NANB5-1-1との免疫学的反応性
を、NANB5-1-1の精製抗体との免疫学的反応性
と比較した結果を表３に示す。 【表】 表３の結果は、抗NANB5-1-1が、C100−３ポ
リペプチドのC100の部分内のエピトープを認識
するということを示している。したがつて
NANB5-1-1とC100は共通のエピトープをもつて
いる。これらの結果は、このNANBVエピトー
プをコードするcDNA配列が、クローン５−１−
１とクローン８１の両者に存在する配列であると
いうことを示唆している。 Ｈ HCVの特性決定 Ｈ １HCVゲノムのストランドの状態
（strandedness）の特定決定 抗NANB5-1-1抗体でコートしたポリスチレン
ビーズに捕獲された粒子から核酸の画分を単離
し、次に単離した核酸が、HCV cDNAの正鎖お
よび／または負鎖とハイブリダイゼーシヨンする
か否かを測定することによつて、HCVゲノムを
そのストランドの状態について特性決定した。 ．F.1.節に記載したようにして、免疫学的に
精製した抗NANB5-1-1抗体でコートしたポリス
チレンビーズを用いて、HCVに感染したチンパ
ンジーの血漿から、粒子を捕獲した。粒子の核酸
成分を、．F.2.節に記載した方法を用いて遊離
させた。３mlの高力価血漿と当量の単離されたゲ
ノム核酸のアリコツトを、ニトロセルロースフイ
ルターに吸い取らせた。対照として、クローン８
１由来の変性HCV cDNA（2pg）のアリコツトを
同じフイルターに吸い取らせた。そのフイルター
を、HCV cDNAからクローン化された一本鎖
DNAの、正鎖または負鎖の32Pで標識した混合物
でプローブした。なお該cDNAは、クローン４０
ｂ，８１および２５ｃから切り出されたものであ
る。 EcoRIでクローン８１，４０ｂおよび２５ｃか
らHCV cDNAを切り出し、そのcDNA断片を
M13ベクターのmp18とmp19内でクローン化する
ことによつて、一本鎖のプローブを得た〔メシン
グ（Messing）1983年〕。そのM13クローンの塩
基配列を決定し、そのクローンがHCV cDNA由
来のDNAの正鎖もしくは負鎖をもつているかど
うかを決定した。塩基配列の決定は、サンガーら
（Sanger et al）（1977年）のジデオキシチエーン
ターミネーシヨン法で行つた。 捕獲された粒子から単離されたHCVゲノムの
一部を含有する二重のフイルターの各セツトを、
HCV cDNA由来の正鎖また負鎖のプローブとハ
イブリダイゼーシヨンさせた。第４１図は、
NANBVゲノムを、クローン８１，４０ｂおよ
び２５ｃ由来のプローブの混合物でプローブして
得たオートラジオグラフを示す。この混合物は、
ハイブリダイゼーシヨン検定法の感度を増大させ
るために用いた。パネルの試料を、正鎖プロー
ブの混合物とハイブリダイゼーシヨンさせた。パ
ネルの試料を、負鎖のプローブ混合物でハイブ
リダイゼーシヨンさせることによつてプローブし
た。免疫ブロツト法に付したパネルの試料を表４
に示す。 【表】 ＊ 記述していない試料
第４１図の結果から分かるように、負鎖の
DNAプローブだけが、単離されたHCVゲノムと
ハイブリダイゼーシヨンする。この結果は、ゲノ
ムがRNaseには感受性であるがDNaseには感受
性でないという結果（．C.2.節参照）と併せ
て、NANBVのゲノムが正鎖のRNAであること
を示唆している。 これらのデータと、推定上のNANBVの物理
化学的性質に関する他の実験室のデータは、
HCVがフラビウイルス科に属する可能性がある
ことを示している。しかし、HCVが、新種のウ
イルス因子に相当する可能性も無視できなかつ
た。 Ｈ ２PCRで増幅された場合、クローン８
１由来のHCV cDNAとハイブリダイゼーシヨ
ンする捕獲粒子の塩基配列の検出法 捕獲粒子のRNAを、．H.1.節に記載したの
と同様にして得た。クローン８１由来のHCV
cDNAとハイブリダイゼーシヨンする塩基配列の
分析を、第．C.3節に記載したのと同様にして
PCR増幅法を利用して行つたが、ハイブリダイ
ゼーシヨンプローブはクローン８１ cDNA塩基
配列由来のキナーゼで活性化されたオリゴヌクレ
オチドを用いた。試験結果は、増幅された塩基配
列がクローン８１由来のHCV cDNAプローブと
ハイブリダイゼーシヨンすることを示した。 Ｈ ３デング熱フラビウイルス
（MNWWVD1）の非構造タンパクと、３９Ｃ
に結合されたクローン１４ｉのORFによつて
コードされるHCVポリペプチドとの間の相同
性 ３９Ｃによつて結合されたクローン１４ｉの
HCV cDNAは、第２６図に示すように一つの連
続ORFを含有している。これにコードされたポ
リペプチドを、デング熱フラビウイルス
（MNWVD1）の非構造ポリペプチドの領域との
配列相同性について分析した。この分析は、デイ
ホツフ（Dayhoff）のタンパクデータベースを用
い、コンピユータで行つた。結果を第４２図に示
すが、図中、記号（：）は厳密な相同性を示し、
記号（．）は塩基配列が若干置換されていること
を示し、ダツシユ記号は、最大の相同性を得るた
め塩基配列中に挿入されたスペースを示す。この
図から分かるように、HCV cDNAにコードされ
た塩基配列と、デング熱フラビウイルス非構造タ
ンパクとの間には有意な相同性がある。第４２図
に示す相同性に加えて、cDNAの3′末端の領域に
コードされたポリペプチドセグメントには、分析
した結果、デング熱ポリメラーゼの塩基配列と相
同性の塩基配列が含まれていた。RNA依存性
RNAポリメラーゼに対して必須であると考えら
れる標準的なGly−Asp−Asp（GDD）配列が、
HCV cDNAにコードされたポリペプチドに含ま
れ、その位置がデング熱２ウイルス内の位置と一
致しているということは重要なことである（デー
タは記載していない）。 Ｈ ４HCV cDNAは、NANBHに感染し
た組織内には検出できない ２種の研究結果は、HCV−DNAが、
NANBHに感染した個体由来の組織内には検出
できないことを示唆している。これらの結果は、
．C.と．H.1.と．H.2.の各節に記載した結
果と併せて、HCVがDNAを含有するウイルスで
はなく、その複製にはcDNAを含まないという証
拠を提供している。 Ｈ ４ ａ サザンブロツト法 NANBHに感染したチンパンジーの肝臓が、
検出可能なHCV−DNA（もしくはHCV−
cDNA）を含有しているか否かを決定するため
に、この起源から単離したDNAの制限酵素によ
る断片をサザンブロツト法に付して、ブロツト物
を32Pで標識したHCV cDNAでプローブした。
上記の標識したHCV cDNAは、感染チンパンジ
ーの肝臓由来のブロツトされたDNAとハイブリ
ダイゼーシヨンをしないという結果を示した。ま
た同じ標識HCV cDNAは、正常なチンパンジー
の肝臓由来の対照のブロツトされたDNAともハ
イブリダイゼーシヨンをしなかつた。これに対し
て、陽性対照においては、β−インターフエロン
遺伝子の標識したプローブが、制御酵素で切断し
たヒト胎盤DNAのサザンブロツト法に付したも
のと強くハイブリダイゼーシヨンした。これらの
系は、標識したプローブで検出すべき遺伝子の単
一コピーを検出するために設計された。 NANBHに感染した２頭のチンパンジーの肝
臓からDNAを単離した。対照のDNAを、未感染
のチンパンジー肝臓とヒト胎盤から単離した。
DNAの抽出は、基本的にはマニアテイスら
（1982年）の方法によつて行い、そのDNA試料
は、単離工程中、RNAseで処理した。 各DNA試料は、メーカーの説明書に従つて、
EcoRI，MboIまたHinc（12μg）で処理した。
切断したDNAを１％中性寒天ゲルで電気泳動し、
ニトリセルロース上にサザンブロツトし、次いで
ブロツトされた物質は、適当なニツクトランスレ
ーシヨンされたプローブcDNAとハイブリダイゼ
ーシヨンした（３×106cpm／mlのハイブリダイ
ゼーシヨンミツクス）。感染チンパンジーの肝臓
と正常な肝臓由来のDNAは、クローン３６と８
１由来の32Pで標識したHCV cDNAとハイブリ
ダイゼーシヨンし、またヒト胎盤由来のDNAは
β−インターフエロン遺伝子由来の32Pで標識し
たDNAとハイブリダイゼーシヨンした。ハイブ
リダイゼーシヨン後、ブロツトしたものを、厳密
条件下、すなわち、0.1×SSCと0.1％SDSを含む
溶液を用い65℃で洗浄した。 β−インターフエロン遺伝子DNAを、ホート
ンら（Houghton et al）（1981年）が記述してい
るのと同様にして調製した。 Ｈ ４ ｂ PCR法による増幅 HCV−DNAが、NANBHに感染したチンパ
ンジーの肝臓内に検出できるか否かを決定するた
めに、DNAをその組織から単離し、プライマー
とクローン８１のHCV cDNA由来のプローブポ
リヌクレオチドを用いて、PCR増幅検出法に付
した。陰性対照は、未感染HepG2組織の培養細
胞と、未感染と思われるヒト胎盤とから単離した
DNA試料を用いた。陽性対照は、陰性対照にク
ローン８１由来のHCV cDNA挿入物の比較的少
ない既知量（250分子）を添加した試料を用いた。 さらに、NANBHに感染したチンパンジーの
同じ肝臓から単離したRNA画分が、HCV
cDNAプローブに対して相補的な配列をもつてい
ることを確認するために、PCR増幅検出法を、
単離したRNA試料にも用いた。 この研究では、DNAは′．H.4.a節に記載の
方法で単離し、RNAは、チヤーギンら
（Chirgwin et al）（1981年）が記述しているの
と同様にして抽出した。 DNAの試料を、２頭の感染チンパンジーの肝
臓、未感染のHepG2細胞およびヒト胎盤から単
離した。各DNAの1μgをメーカーの説明書にし
たがつてHindで切断した。逆転写酵素工程を
省略したことを除いて、．C.3節に記載したの
と基本的に同様にして、上記の切断試料を、
PCR増幅法に付し、増幅したHCV cDNAを検出
した。PCRプライマーとプローブは、HCV
cDNAクローン８１由来のものであり、．C.3.
節に記載されている。増幅する前に、陽性対照に
ついては、各DNAの試料1μgは、クローン８１
から単離したHCV cDNA挿入物の250分子を添
加することによつて「スパイク」された。 HCV配列が、NANBHに感染したチンパンジ
ーの肝臓から単離したRNAに存在しているか否
かを決定するために、0.4μgの全RNAを含有する
試料を、陰性対照試料のいくつかから逆転写酵素
の工程を省略すること以外は、．C.3.節に記載
したのと同様の増幅法に付した。PCRプライマ
ーとプローブは、上記の記載と同様に、HCV
cDNAクローン８１由来のものであつた。 その結果、HCV cDNAプローブに相補的な増
幅された配列は、感染チンパンジーの肝臓由来の
DNA中には検出できず、また陰性対照にも検出
できなかつた。これとは異なり、感染チンパンジ
ーの肝臓由来のDNAを含む試料が増幅される前
にHCV cDNAでスパイクされた場合、クローン
８１の配列がすべての陽性対照の試料に検出され
た。さらに、RNAの研究では、増幅されたHCV
cDNAクローン８１の配列が、逆転写酵素を用い
た時にのみ検出されたが、これは、この結果が
DNA汚染が原因でないことを強く示唆している。 これらの結果は、NANBHに感染したチンパ
ンジー由来の肝細胞が、HCV DNAを全く含有
しないか、または検出不可能な濃度で含有してい
ることを示している。スパイク法の研究によれ
ば、HCV DNAが存在する場合、それは0.06コ
ピー／肝細胞よりはるかに低い濃度である。これ
に対し、同じ肝臓試料由来の全RNAのHCV配列
は、PCR法によつて容易に検出された。 Ｉ試験抗原としてHCV c100−３を用いる、
HCV感染のELISA法による決定 全試料を、HCV c100−3ELISA法を用いて検
定した。この検定法は、HCV c100−３抗原
（．B.5節に記載したのと同様にして合成し精
製した）と、マウスモノクローナル抗ヒトIgGの
ホースラデイツシユペルオキシダーゼ（HRP）
複合体とを利用する。 HCV c100−３抗原でコートしたプレートを次
のようにして調製した。コーテイング緩衝液
（50mM ホウ酸ナトリウム、PH9.0）の21ml／プ
レート、BSA（25μg／ml）およびc100−３
（2.50μg／ml）を含有する溶液を、Removeawell
Immulonプレート（Dynatech Corp.）に添加
する直前に調製した。５分間混合後、上記溶液
0.2ml／ウエルをプレートに添加した。プレート
をカバーし２時間37℃でインキユベートし、次い
で溶液を吸引して除去した。ウエルを400μの
洗浄緩衝液〔100mMリン酸ナトリウム（PH7.4），
140mM塩化ナトリウム、0.1％（Ｗ／Ｖ）カゼイ
ン、１％（Ｗ／Ｖ）Triton Ｘ−100，0.01％
（Ｗ／Ｖ）Thimerosal〕で１回洗浄した。洗浄液
を除いた後、後コート溶液200μ／ウエル
〔10mMリン酸ナトリウム（PH7.2），150mM塩化
ナトリウム、0.1％（Ｗ／Ｖ）カゼインおよび
2mMフツ化フエニルメチルスルホニル
（PMSF）〕を添加し、プレートをゆるくカバーし
て蒸発を防止し、室温で30分間放置した。次にウ
エルから吸引して溶液を除き、保存加熱せずに一
夜凍結乾燥した。得られたプレートを、密封した
アルミニウムパウチ内に２〜８℃で貯蔵する。 ELISA法で決定するために、20μの血清試料
または対照試料を、200μの試料希釈剤
〔100mMリン酸ナトリウム（PH7.4），500mM塩
化ナトリウム、1mM EDTA，0.1％（Ｗ／Ｖ）
カゼイン、0.015％（Ｗ／Ｖ）Therosal），１％
（Ｗ／Ｖ）Triton Ｘ−100，100μg／ml 酵母エ
キス〕の入つたウエルに添加した。プレートを密
封し、37℃で２時間インキユベートし、その後溶
液を吸引して除き、400μの洗浄緩衝液〔0.05％
のTween20を含有するリン酸緩衝食塩水
（PBS）〕でウエルを洗浄した。洗浄したウエル
を、200μのマウス抗ヒトIgG−HRP複合体を
含有する、オルト複合体希釈剤〔10mMリン酸ナ
トリウム（PH7.2），150mM塩化ナトリウム、50
％（Ｖ／Ｖ）胎仔ウシ血清、１％（Ｖ／Ｖ）熱処
理ウマ血清、1mM K3Fe（CN）60.05％（Ｗ／Ｖ）
Tween 20，0.02％（Ｗ／Ｖ）Tghimerosal〕の
溶液で処理した。37℃で１時間処理を行い、溶液
を吸引によつて除去し、ウエルを洗浄緩衝液で洗
い、緩衝液を吸引で除去した。結合した酵素接合
体の量を測定するために、200μの基質溶液
（10mgの０−フエニレンジアミン二塩酸塩／５ml
の展開剤溶液）を添加した。展開剤溶液は、リン
酸によつてPH5.1に調節された50mMのクエン酸
ナトリウムと、0.6μ／mlの30％H2O2を含有し
ている。基質溶液が入つたプレートを、暗所内
で、30分間室温でインキユベートし、反応は50μ
／mlの4N硫酸を添加して停止させ、ODを測定
した。 下記の実施例は、HCV C100−３抗原を利用
するマイクロタイタープレートのスクリーニング
ELISA法が高い特異性を有することを示す。こ
のことは、初期反応率が約１％で、反復反応率が
任意のドナーについて約0.5％であることによつ
て証明されている。この検定法は、感染の急性期
後および疾患の慢性期の両方における免疫応答を
検出することができる。さらに、この検定法は、
NANBHに対する代理試験についてマイナスの
評価をされているいくつかの試料を検出すること
ができる。なおこれらの試料は、NANBHの病
歴を持つ個体またはNANBH伝染に関係がある
ドナー由来のものである。 以下の実施例では、次の略号が用いられる。 ALT アラニンアミノ転移酵素 抗−HBc HBcに対する抗体 抗−HBsAg HBsAgに対する抗体 HBc Ｂ型肝炎コア抗原 ABsAg Ｂ型肝炎表面抗原 IgG 免疫グロブリンＧ IgM 免疫グロブリンＭ IU／Ｌ 国際単位／ NA 入手不能 NT 試験せず Ｎ 試料の大きさ Neg 陰性 OD 光学密度 Pos 陽性 Ｓ／CO シグナル／カツトオフ SD 標準偏差 ｘ 平均値 WNL 標準限界内 Ｉ １ 任意のドナー集団におけるHCVの
感染 任意のドナーから得た1056試料（新鮮な血清）
を、Irwin Memorial Blood Band（米国、カリ
フオルニア州、サンフランシスコ）から得た。こ
れらの試料によつて得た試験結果を、OD値の分
布を示すヒストグラムにまとめる。（第４３図）。
第４３図から分かるように、４試料が３より大き
い値を示し、１試料が１と３の間、５試料が0.4
と１の間、および残りの1046試料が0.4より小さ
い値を示し、これらの試料の90％以上が0.1より
小さい。 反応性であつた任意試料についての試験結果を
表５に示す。平均値＋５標準偏差に等しいカツト
オフ値を用いた場合、1056試料中の10試料（0.95
％）が最初反応性であつた。これらの試料中５試
料（0.47％）は、前記のELISA法を用いて２回目
の検定を行つたところ繰り返し反応性を示した。
また表５は、繰り返し反応性を示した各試料に対
してALTおよび抗HBd状態を示している。特に
興味深いのは、繰り返し反応性であつた５試料全
部が、NANBHに対する両代理試験で陰性であ
り、一方HCV ELISA法では陽性であつたとい
うことである。 【表】 【表】 Ｉ ２ チンパンジー血清試料 11匹のチンパンジーから得た血清試料を、
HCV c100−３を用いたELISA法により試験し
た。これらのチンパンジーのうち４匹には、疾患
管理センター（the Centers for Disease
Control）のDaniel Bradley博士と共同して確立
された方法に従つて、第因子の汚染バツチに由
来するNANBH（おそらくは、ハツチンソン
（Hutchinson）株であると推測される）を感染さ
せた。対照として、他の４匹のチンパンジーには
HAVを、そして３匹にはHBVを感染させた。血
清試料は、感染後の様々な時期に採取した。 これらの結果は、表６に要約されているが、ハ
ツチンソン株のNANBHに感染させたすべての
チンパンジーにおいて実証された抗体の血清転換
を示している。感染の急性期（ALT レベルが
有意に上昇し、続いて正常レベルに戻ることから
示される）の後は、HCV c100−３に対する抗体
がNANBHに感染させた４匹のチンパンジーの
うち４匹の血清中で検出し得るようになつた。こ
れら試料は、すでに．B.3節で考察したよう
に、ウエスタン（Western）分析および放射性免
疫検定法（RIA）により陽性であることが示され
ている。これとは対照的に、HAVまたはHBVに
感染させた対照のチンパンジーはELISA法にお
ける反応性を示した。 【表】 【表】 Ｉ ３パネル１：慢性ヒトNANBHキヤリ
アから得られた保証感染性血清 コードされたパネルは、22個の独自の試料から
構成されていた。ただし、これらの試料は、各々
につき二重検定を行うので、合計で44個であつ
た。これらの試料は、慢性NANBHキヤリアか
ら得た保証感染性血清、関係供血清から得た感染
性血清、および急性NANBH患者から得た感染
性血清からのものであつた。さらに、非常に由来
が明確な陰性対照群、および他の疾患対照群から
も試料を得た。このパネルは、国立衛生研究所
（National Institutes of Health，Bethesda，
Maryland）のHealth and Human Service部の
H.Alter博士から提供された。このパネルは、数
年前にAlter博士により構築され、推定NANBH
検定の適合パネルとして、Alter博士により使用
されてきた。 上記の全パネルをELISA法で２度分析し、そ
の結果を評価するためにAlter博士に送付した。
評価の結果を表７に示す。この表には、二重検定
の一方の組の結果が示されているが、二重検定試
料の各々について同じ値が得られた。 表７に示すように、チンパンジーモデルにおい
て感染性であると証明された６個の血清は非常に
陽性であつた。７番目の感染性血清は、急性
NANBHの場合の試料に対応しており、この
ELISAにおいて反応性ではなかつた。正常ALT
レベルを有し、かつチンパンジーでの研究結果が
不明確であつた関係供血者から得た試料は、上記
分析において反応性ではなかつた。急性
NANBHの１個体から得た３個の他の一連の試
料も反応性ではなかつた。非常に由来が明確な陰
性対照群からの全ての試料は、少なくとも10回の
献血で肝炎の疑いがなかつた供血者から得たもの
であるが、上記のELISAにおいて反応性ではな
かつた。最後に、検査試料のうち４個は、他人に
より開発された推定NANBH検定において陽性
であると以前は評価されていたが、これらの分析
では確定できなかつた。これらの４個の試料は上
記のHCV ELISA法では陰性と判定された。 【表】 Ｉ ４ パネル２：供血者／受血者の
NANBH 前記のコードされたパネルは、輸血に関連する
NANBHについて供血者および受血者が明確な
10事例からなり、試料の合計は188であつた。各
事例は、受血者に対する数人またはすべての供血
者の試料、およびこの受血者から得た（輸血後、
３ヵ月、６ヵ月、および12ヵ月目に採血した）一
連の試料からなるものであつた。また、輸血前に
予め受血者から採血された血液試料も含まれてい
た。コードされたパネルは、NIHのH.Alter博士
により提供されたものであり、結果は評価を行う
ために同博士へ送付した。 これらの結果は、表８に要約したが、ELISA
法により、輸血に関連するNANBHの10事例の
うち９事例において、抗体血清転換が検出された
ことを示している。事例４の試料（血清転換が全
く検出されなかつた）は、前記ELISA法におい
て、一貫して反応性に乏しかつた。10個の受血者
試料のうち２個は、輸血後３ヵ月で反応性があつ
た。12ヵ月では、事例４を除いて、すべての試料
が反応性であつた。さらに、少なくとも１人の抗
体陽性供血者が10事例のうち７事例に見い出さ
れ、事例10には２人の陽性供血者が存在した。ま
た、事例10では、輸血前に採血した受血者の血液
はHCV抗体について陽性であつた。この受血者
から得た１ヵ月目の採血試料は反応性レベルの境
界線まで低下したが、４ヵ月および10ヵ月目の採
血試料では陽性レベルにまで上昇した。一般に、
Ｓ／COが0.4であれば、陽性であると考えられ
る。従つて、この事例では、個体が事前にHCV
感染していたことを示している。 反応性である（すなわち、陽性である）すべて
の試料に対するALTおよびHBcの状態を表９に
要約する。この表から明らかなように、供血者試
料の1/8は、代理マーカーに対しては陰性であつ
たが、HCV抗体ELISA法では反応性であつた。
他方、受血者試料（輸血後12ヵ月まで引き続き採
血された）は、高いALTを有するか、または抗
HBcが陽性であるか、あるいはその両方であつ
た。 【表】 【表】 【表】 【表】 Ｉ ５高危険率グループの試料における
HCV感染の決定 高危険率グループから得られた試料は、HCV
c100−３抗原に対する反応性を決定するELISA
法を用いてモニターされた。これらの試料は、
Gary Tegtmeier博士（Community Blood
Bank，Kansas City）から得られた。結果を表
10に要約する。 この表に示されているように、反応性の最も高
い試料は、血友病者から得られる（76％）。さら
に、ALTが上昇し、抗HBcについて陽性の個体
から得られた試料は、51％が反応性であると評価
されたが、この値は、臨床データから予想される
値と一致しており、このグループ内には
NANBHが流行していた。HCVに対する抗体の
発生率は、ALTが高いだけの供血者、Ｂ型肝炎
コアに対する抗体について陽性であるだけの供血
者、そして任意の志願供血者に比べてALTが高
いか、あるいは抗コア抗体を有するということ以
外の理由で拒否された供血者においても高かつ
た。 【表】 Ｉ ６HCV c100−３ ELISA法における
第２抗体として抗IgGまたは抗IgMモノクロー
ナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いた
比較研究 抗IgGモノクローナル複合体を用いたELISA法
の測定感度は、抗IgMモノクローナル複合体を用
いるか、あるいはこれら両者をＨ鎖およびＬ鎖の
両方に特異的であると報告されたポリクローナル
抗血清で置き換えることにより得られる測定感度
と比較された。以下の研究が行われた。 Ｉ ６ ａ 血清転換者から得られた一連の
試料 NANB血清転換者の３つの事例から得られた
一連の試料を、HCV c100−３ ELISA法で研
究した。このELISA法では、酵素複合体に抗IgG
モノクロール抗体だけを用いるか、または抗IgM
モノクローナル抗体と組合わせて用いるか、ある
いはポリクローナル抗血清を用いた。これらの試
料は、Cladd Stevens博士（N.Y.Blood Center，
N.Y.C.，N.Y.）により提供された。試料の歴史
を表11に示す。 抗IgGモノクローナル抗体−酵素複合体を用い
て得られた結果を表12に示す。これらのデータ
は、事例１，２、および３の各試料１−４，２−
８、および３−５において、最初に強い反応性が
検出されることを示している。 抗IgGモノクローナル複合体および抗IgM複合
体の組合わせを用いて得られた結果を表13に示
す。抗IgMに対する抗IgGの３つの異なる割合で
試験した；抗IgGの希釈率１：10000は終始一定
であつた。抗IgMモノクローナル複合体の試験さ
れた希釈率は、１：30000，１：60000、および
１：120000であつた。これらのデータは、抗IgG
だけを用いた研究と同様に、試料１−４，２−
８、および３−５において、最初の強い反応性が
検出されることを示している。 抗IgGモノクローナル複合体（希釈率１：
10000）、またはTagoポリクローナル複合体（希
釈率１：80000）、あるいはJacksonポリクローナ
ル複合体（希釈率１：80000）を用いたELISA法
で得られた結果を表14に示す。これらのデータ
は、３種類の形態をすべて用いると、試料１−
４，２−８、および３−５において、最初の強い
反応性が検出されることを示している：Tagoの
ポリクローナル抗体は最も低いシグナルを与え
た。 上に与えた結果は、（ALT上昇により明らかと
なる）疾患の急性期後の同時期に、３種類の形態
により、反応性の試料が検出されることを示して
いる。また、これらの結果は、抗IgGモノクロー
ナル−酵素複合体を用いたHCV c100−３
ELISA法の感度が、該酵素複合体について試験
された他の形態と同等またはそれ以上であること
を示している。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 Ｉ ６ ｂ 任意抽出の供血者から得られた
試料 任意抽出の供血者から得られた試料（．I.1.
節参照）を、HCV感染について、HCV c100−
３ ELISA法によりスクリーニングした。この
とき、抗体−酵素複合体は、抗IgGモノクローム
複合体またはポリクローナル複合体のいずれかで
あつた。スクリーニングされた試料の総数は、ポ
リクローナル複合体およびモノクローナル複合体
に対して、それぞれ1077個および1056個であつ
た。スクリーニング結果の要約を表15に示す。ま
た、試料の分布を第４４図のヒストグラムに示
す。 平均値および標準偏差の計算は、シグナルが
1.5を超えるような試料を除いて行つた。すなわ
ち、ポリクローナル複合体を利用した場合の計算
には1073個のOD値を用い、抗IgGモノクローナ
ル複合体を利用した場合の計算には1051個のOD
値を用いた。表15から明らかなように、ポリクロ
ーナル複合体を用いた場合には、平均値が0.0493
から0.0931にシフトし、標準偏差は0.074から
0.0933に増加した。また、これらの結果は、ｘ＋
5SDという基準を用いて分析のカツトオフ値を定
義すれば、ELISA法におけるポリクローナル酵
素複合体の形態が、より高いカツトオフ値を必要
とすることを示している。このことは、モノクロ
ーナル系に比べて分析特異性が低いことを示して
いる。さらに、第４４図のヒストグラムから明ら
かなように、抗IgGモノクローナル複合体を用い
たELISA法で任意抽出の供血者をスクリーニン
グした場合には、市販のポリクローナル標識を用
いた分析に比べて、陰性および陽性の結果の分布
間が大きく分離する。 【表】 Ｊ様々な地域のNANBH患者におけるHCV
血清転換の検出 高いALT値に基づくとNANBH保持の疑いが
あるが、HAVおよびHBV試験においては陰性で
ある患者から得られた血清を、HCV c100−３抗
原をマイクロタイタープレートのスクリーニング
抗原として用いたこと以外は実質的に．D.節
で述べたように、RIA法を用いてスクリーニング
した。表16に示された結果から明らかなように、
RIAにより、陽性試料が高い割合で検出された。 【表】 Ｋ「集団獲得型」NANBHの患者における
HCV血清転換の検出 明白でない（すなわち、輸血、静脈注射による
薬剤使用、乱婚などが危険因子として同定されな
い）100人のNANBH患者から得た血清は、M.
Alter博士（the Center for Disease Control）
およびJ.Dieustag博士（Harvard University）
から提供された。これらの試料を、HCV c100−
３抗原をマイクロタイタープレートに付着させる
スクリーニング用抗原として用いたこと以外は実
質的に．D.節で述べたように、RIA法を用いて
スクリーニングした。得られた結果は、100個の
血清試料のうち55個の試料が、HCV c100−３抗
原と免疫学的に反応する抗体を有することを示し
た。 上述の結果は、「集団獲得型」NANBHもま
た、HCVにより引き起こされることを示唆して
いる。また、HCVがフラビウイルス属（その大
部分は節足動物により伝染する）と関係のあるこ
とがここで示されているので、「集団獲得型」の
場合におけるHCVの伝染もまた、節足動物によ
る伝染に起因することが示唆される。 ＬNANBHの伝染に関係のある供血者の
HCV抗体および代用マーカーの発生率の比較 NANBH陽性の疑いのある供血者から輸血さ
れ、NANBHとなつた受血者が、抗HCV抗体陽
性に血清転換するかどうかを決定し得る見込みが
ある研究を実施した。NANBH感染のマーカー
として現在使われている代用マーカー（すなわ
ち、高いALT値および抗コア抗体の存在）の異
常について供血者を試験した。さらに、抗HCV
抗体の存在についても供血者を試験した。抗
HCV抗体の存在は、．K.節で述べた放射性免
疫検定法を用いて決定した。この研究の結果を表
17に示す。この表には以下の項目が示されてい
る：患者の番号（第１列）；患者の血清中におけ
る抗HCV抗体の存在（第２列）；患者の輸血回
数、各輸血は異なる供血者によるものである（第
３列）；供血者の血清中における抗HCV抗体の存
在（第４列）；そして、供血者の代用マーカーの
異常（第５列）（NT、すなわち…試験していな
いことを意味する）（ALTは高いトランスアミナ
ーゼであり、抗HBcは抗コア抗体である）。 表17の結果は、HCV抗体試験が、感染供血者
を検出するのに、代用マーカー試験より正確であ
ることを示している。NANBHの症状を示す10
人の患者のうち９人を試験したところ、抗HCV
抗体血清転換に関して陽性であつた。陽性の疑い
のある11人の供血者のうち（NANBHキヤリア
である疑いのある２人の別々の個体から輸血され
たのは患者６であるが）、９人は抗HCV抗体に関
して陽性であり、１人は陽性の境界線上であり、
（患者１に対する供血者は）不明確であつた。こ
れに対し、高ALT試験を用いると、10人の供血
者のうち６人が陰性であり、抗コア抗体試験を用
いると、10人の供血者のうち５人が陰性であつ
た。しかしながら、非常に重要なことは、３つの
場合（患者８、患者９、および患者10に対する供
血者の場合）において、ALT試験および抗HBc
試験の結果が一致しなかつたことである。 【表】 Ｍフラビウイルスのゲノム配列の保存領域か
ら誘導されたPCRおよびプライマーを利用し
たHCV cDNA配列のクローニングの増幅 HCVがフラビウイルスまたフラビ様ウイルス
であることを示唆している上記の結果は、PCR
技術と、フラビウイルスの保存アミノ酸配列をコ
ードする領域から誘導されたプライマーとを利用
して、特徴付けられていないHCV cDNA配列を
クローニングすることを可能にする。一般に、プ
ライマーの一方は定義されたHCVゲノム配列か
ら誘導され、配列決定されていないHCVポリヌ
クレオチド領域に隣接する他方のプライマーはフ
ラビウイルスゲノムの保存領域から誘導される。
フラビウイルスゲノムは、フラビウイルスゲノム
の5′側領域にコードされるNS1ポリペプチドおよ
びＥポリペプチド内に保存配列を有することが知
られている。これらの領域をコードする対応配列
は、第２６図に示すHCV cDNA配列の上流にあ
る。従つて、HCVゲノムのこの領域から誘導さ
れたcDNA配列を単離するには、これらのフラビ
ウイルスポリペプチド内の保存配列から誘導され
る上流プライマーが設計される。下流プライマー
はHCV cDNAの既知部分の上流側端部から誘導
される。 コードが縮重しているので、フラビウイルスプ
ローブと、対応するHCVゲノム配列との間には
不一致が存在し得る。従つて、Lee（1988）によ
り述べられた方法と同様の方法を用いる。Leeの
方法は、アミノ酸配列の逆転写産物に相補的な混
合オリゴヌクレオチドプライマーを利用する；混
合プライマーの配列は保存アミノ酸配列に関する
すべてのコドン縮重を考慮したものである。 ３組のプライマー混合物は、デング熱−２，４
（Ｄ−２，４）、日本脳炎（JEV）、黄熱病（YF）、
および西ナイルウイルス（WN）を包含する数種
のフラビウイルスに見い出されるアミノ酸相同性
に基づいて生じたものである。最も上流の保存配
列から誘導されたプライマー混合物（5′−１）は
アミノ酸配列gly−trp−glyに基づいており、こ
のアミノ酸配列は、Ｄ−2P JEV，YE、および
WNのＥタンパク中に見い出される保存配列asp
−arg−gly−trp−gly−aspNの一部である。次
のプライマー混合物（5′−２）はＥタンパク中に
ある下流保存配列phe−asp−gly−asp−ser−tyr
−ileu−phe−gly−asp−ser−tyr−ileuに基づい
ており、phe−gly−aspから誘導される；保存配
列は、Ｄ−２，JEV，YE、およびWNに存在す
る。第３のプライマー混合物（5′−３）はアミノ
酸配列arg−ser−cysに基づいており、このアミ
ノ酸配列は、Ｄ−２，Ｄ−４，JEV，YF、およ
びWNのNSIタンパク中にある保存配列cys−cys
−arg−ser−cysの一部である。5′−３中で混合
物を形成する各プライマーを第４５図に示す。保
存領域から誘導された様々な配列に加えて、各混
合物中の各プライマーもまた、制限酵素Hind，
Mbo、およびEcoRに対する部位をコードす
る配列を含む5′末端の定常領域を有する。 下流プライマーssc５ｈ２０Ａはクローン５ｈ
のヌクレオチド配列から誘導されており、この配
列はクローン１４ｉおよび１１ｂの配列と重複す
る配列を有するHCV cDNAを含む。ssc５ｈ２
０Ａの配列は、 5′ GTA ATA TGG TGA CAT AGT
CA 3′ である。他方のプライマーssc５ｈ３４Ａも
また、使用し得る。このプライマーはクロー
ン５ｈの配列から誘導され、さらに制限酵素
部位を形成する5′末端のヌクレオチドを有す
る。従つて、クローニングが容易になる。
ssc５ｈ３４Ａの配列は、 5′ GAT CTC TAG AGA AAT CAA
TAT GGT GAC AGA GTC Ａ 3′ である。 Saikiら（1986）により最初に述べられたPCR
反応は、cDNAの鋳型が、．C.2.節で述べたよ
うにHCV感染したチンパンジーの肝臓から単離
されたRNAであるか、あるいは．A.1.節で述
べたようにHCV感染したチンパンジー血清から
単離されたウイルス粒子から単離されたRNAで
あること以外は、実質的にLeeら（1988）が述べ
たようにして行われる。さらに、アニール条件は
第１回目の増幅ではあまり厳密でなくてもよい
（0.6M NaCl、および25℃）。なぜなら、HCV配
列とアニールするプライマー部分は、わずか９個
のヌクレオチドであり、不一致が存在し得るから
である。また、ssc５ｈ３４Ａを用いた場合には、
HCVゲノムから誘導されなかつた付加配列はプ
ライマー−鋳型ハイブリツドを不安定化する傾向
がある。第１回目の増幅後は、アニール条件は非
常に厳密である（0.066M NaCl、および32℃〜
37℃）。なぜなら、増幅される配列は、この段階
では、プライマーに相補的な領域またはプライマ
ーの重複部分である領域を有するからである。さ
らに、最初の10サイクルの増幅は、クレノー酵素
を用い、この酵素に適したPCR条件下で実施
される。これらのサイクルが完了した後、試料を
抽出し、Cetus／Perkin−Elmerにより供給され
ているキツト指示書に従つて、Tagポリメラーゼ
で処理する。 増幅後、増幅されたHCV cDNA配列は、クロ
ーン５ｈから誘導されたプローブを用いたハイブ
リダイゼーシヨンにより検出される。このプロー
ブは、プライマーを誘導するのに用いた配列の上
流にある配列から誘導されるが、プライマーを誘
導したクローン５ｈの配列とは重複しない。この
プローブの配列は、 5′ CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA
CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG
TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG
GTT GAT GGC GC 3′ である。 産業上の応用性 本発明は、ここに開示された様々な表現で、多
くの産業上の用途を有する。これらの用途のいく
つかは次のとおりである。HCV cDNAは、試料
中のHCV核酸を検出するためのプローブの設計
に用いられる。cDNAから誘導されたプローブ
は、例えば化学的な合成反応においてHCV核酸
を検出するのに用いられる。これらのプローブは
また、培養細胞系または動物モデル系においてウ
イルスの複製を阻害する際に抗ウイルス剤の効果
を決定するためのスクリーニングプログラムに用
いられる。HCVポリヌクレオチドプローブは、
ヒトにおいてウイルス核酸を検出するのにも有用
であり、従つてヒトにおけるHCV感染の診断薬
の主成分として役立ち得る。 上記のことに加えて、ここで与えられるcDNA
は、HCVのエピトープを有するポリペプチドを
合成するための情報および手段を提供する。これ
らのポリペプチドはHCV抗原に対する抗体を検
出するのに有用である。HCV感染に対する一連
の免疫検定法は、HCVエピトープを有する組換
え体ポリペプチドに基づくものである。これらの
免疫検定法は、ここで説明されており、
NANBHを誘発するHCVを診断したり、HCVに
より引き起こされる伝染性肝炎について血液銀行
における供血者をスクリーニングしたり、また伝
染性の供血者に由来する汚染された血液を検出し
たりする産業上の用途が見い出される。ウイルス
抗原はまた、動物モデル系における抗ウイルス剤
の効力をモニターするのにも有用である。さら
に、ここに開示されたHCV cDNAから誘導され
たポリペプチドは、HCV感染を処置するための
ワクチンとして有用である。 HCV cDNAから誘導されたポリペプチドは、
上述の用途の他にも、抗HCV抗体を生じさせる
のにも有用である。従つて、これらのペプチドは
抗HCVワクチンに使用され得る。しかしながら、
HCVポリペプチドで免疫した結果、生産される
抗体もまた、試料中のウイルス抗原の存在を検出
するのに有用である。従つて、これらのペプチド
は、化学系におけるHCVポリペプチドの生産を
分析するために用いられ得る。抗HCV抗体はま
た、抗ウイルス剤が組織培養系で試験されるスク
リーニングプログラムにおいて、これらの抗ウイ
ルス剤の効力をモニターするのに用いられる。こ
れらの抗HCV抗体はまた、受動免疫療法や、供
血者および受血者の両方においてウイルス抗原を
検出することにより、NANBHを引き起こす
HCVを診断するのにも用いられる。抗HCV抗体
の他の重要な用途には、ウイルスおよびウイルス
ポリペプチドを精製するためのアフイニテイーク
ロマトグラフイーにおける使用がある。精製され
たウイルスおよびウイルスポリペプチドの調製物
はワクチンに用いられ得る。しかしながら、精製
されたウイルスはまた、HCVを複製する細胞培
養系の開発に有用である。 HCVに感染した細胞を有する細胞培養系は多
くの用途を有する。これらの細胞培養系は、通常
は力価の低いウイルスであるHCVの比較的大規
模な生産に用いられ得る。これらの培養系はま
た、このウイルスの分子生物学的な解明にも有用
であり、抗ウイルス剤の開発をもたらす。これら
の細胞培養系はまた、抗ウイルス剤の効力をスク
リーニングする際にも有用である。さらに、
HCV許容性の細胞培養系は、弱毒化したHCV株
の生産に有用である。 便宜的には、抗HCV抗体およびHCVポリペプ
チドは、天然物であつても組換え体であつても、
キツトに組み込まれ得る。 HCV cDNAを単離するのに用いられる方法
は、個体の感染組織から誘導されたcDNAライブ
ラリーを発現ベクター中に調製すること、および
非感染個体ではなく他の感染個体に由来する抗体
含有身体構成成分中の抗体と免疫学的に反応する
発現産物を生産するクローンを選択することを包
含する。この方法は、ゲノム成分からなる、これ
まで特徴付けられていない他の疾患関連因子から
誘導されたcDNAの単離にも適用できる。この方
法により、次には、これらの因子が単離され、か
つ特徴付けられ、またこれらの他の疾患関連因子
に対する診断用の薬剤およびワクチンがもたらさ
れ得る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の特性を有する、少なくとも８個のアミ
    ノ酸の連続する配列を含むポリペプチド： (1) 該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列
    が少なくとも一つの部位を有し、該部位は、(a)
    Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体によつて結合さ
    れ得、(b)既知のフラビウイルスに対する抗体と
    反応しない： および、 (2) 該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列
    が、以下のアミノ酸配列から得られる： 【表】 【表】 【表】 ２ 前記少なくとも８個のアミノ酸の連続する配
    列が、以下の(a)，(b)もしくは(c)のアミノ酸配列か
    ら得られる、請求項１に記載のポリペプチド： 【表】 【表】 ３ 請求項１または２に記載のポリペプチドを含
    むＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出するため
    のイムノアツセイ用試薬。 ４ 前記試薬が、固相に固定されている、請求項
    ３に記載のイムノアツセイ用試薬。 ５ 請求項３または４に記載のイムノアツセイ用
    試薬を適当な容器中に含むイムノアツセイキツ
    ト。 ６ Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出するた
    めのイムノアツセイであつて、 (a) 請求項３または４にいずれかに記載のイムノ
    アツセイ用試薬を提供すること； (b) 抗体−抗原複合体を形成させる条件下で、生
    物学的サンプルを該イムノアツセイ用試薬とイ
    ンキユベートすること；および (c) 該イムノアツセイ用試薬を含む抗体−抗原複
    合体を検出すること、 を含む、イムノアツセイ。 ７ 請求項６に記載のイムノアツセイであつて、
    前記抗体−抗原複合体が、該複合体を酵素標識あ
    るいは放射性標識した抗ヒトイムノグロブリン抗
    体とインキユベートすることによつて検出され
    る、イムノアツセイ。
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