CN1059928C

CN1059928C - 利用大肠杆菌制备可用来检验c型肝炎之抗原蛋白的方法

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Publication number: CN1059928C
Application number: CN92111187A
Authority: CN
Inventors: 陈培哲; 陈定信
Original assignee: TIANJIN PUSHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN PUSHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 1992-09-29
Filing date: 1992-09-29
Publication date: 2000-12-27
Anticipated expiration: 2007-09-29
Also published as: CN1086264A

Abstract

本发明是利用大肠杆菌的表达系统，表达一段C型肝炎病毒(HCV)核心抗原部分的DNA片段。经过热诱导表达出来的蛋白质，能专一性地被大部分感染有非A非B型肝炎病人的血清所识别，但不被健康人血清所识别。利用此抗原蛋白进行的C型肝炎的诊断结果，与利用亚培试剂的抗C100-3诊断结果相比，本发明所制备的抗原蛋白比亚培试剂的诊断结果灵敏，且能相辅相成，降低假阴性的结果。因而由本发明所制备的抗原蛋白质，可作为检验C型肝炎的一种良好检验试剂。

Description

利用大肠杆菌制备可用来检验C型肝炎之抗原蛋白的方法

本发明属于制备检验C型肝炎抗原蛋白的方法。

自从1970年代引进对捐赠的血液做B型肝炎病毒的筛检之后，经由输血途径而感染的B型肝炎病例就已大幅减少。然而，还是有许多经由输血而感染的肝炎病例是由病毒所引起。造成这类的肝炎，通常不是A型肝炎病毒(Hepatitis A virus HAV)也不是B型肝炎病毒(HepatitisB virus；HBV)，故称为非A非B型肝炎(NANBH)。这种病毒所引起的肝炎成为目前临床上很严重的问题，因为它几乎占所有输血后感染的肝炎病例的90％以上。而且感染者多半会演变为慢性肝炎，进而发展成为肝硬化或肝癌。引起这种非A非B型肝炎的病毒，虽然长久以来许多人的努力研究，一度还是非常不清楚，直至美国Chiron公司，Choo等人(Seience 244；359-362，1989)发现了一个单股RNA病毒可能是造成这个非A非B型肝炎的主要病原后，才对输血感染的非A非B型肝炎有进一步的了解。现在这个RNA病毒被称为C型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)其实HCV在感染个体的血液中，存在甚微，故到目前为止都无法直接分离出病毒或由显微镜观察到这个病毒。这也是为什么长久以来都一直无法突破的原因。Choo等人则是利用由病人得来的血液直接拿去感染黑猩猩，再由黑猩猩血液中分离出的病毒RNA做成一个gt 11的基因库，然后利用病人的血清进行筛选。经由此法，他们找出一段HCV的DNA片断(5-1-1)，而这个片断所表达出来的抗原，虽然可与肝炎病患的血清有特殊的结合反应。这才开始有了关于HCV的研究。他们进一步将陆续找到的其他小cDNA片断连接在一起成为一段较长的cDNA，称之为C100-3。再以酵母菌的表达载体表达C100-3片断成为抗原蛋白以后，便以酶免疫分析法来检验大批由美国、意大利或日本得来的C型肝炎病患的血清样品，结果发现70-80％以上的血滑均与这个抗原反应。进一步证实大部分的非A非B型肝炎的确是由HCV所引起的。

经过多个实验室的努力，HCV的基因组(genome)目前已全部被克隆出来。它是一个约10kb长，正股的RNA所组成。利用序列相似性质(sequence homology)来分析，HCV非常类似于黄病毒(属)(flavivirus)及瘟病毒(属)(pestivirus)，但并非完全相同。这个病毒全长基因组仅可合成一个约3011个氨基酸长的蛋白质。显然这个长的蛋白质分子需再经过进一步的裂解(cleavage)而变为大大小小不同的病毒蛋白质。若以黄病毒(属)的基因组来看的话，它所形成的病毒蛋白质主要包括(由N端数起)：核心(nucleocapsid，C)，膜蛋白(membrane)，外套蛋白(envelope，E)及五个非结构蛋白(nonstructrural proteins，NS1-NS5)；而若由瘟病毒的基因组来看，则除了核心蛋白(C)以外，就是两个外套蛋白(E1及E2，均是醣蛋白(glycoprotein))，而非结构蛋白质则只有四个(NS2-NS5)。HCV则非常类似于后者的结构，即在核心蛋白之后，有两个糖蛋白(E1，NS1/E2)，其后是四个非结构蛋白(NS2-NS5)；其正确的结构及所合成的蛋白质大小及功能等仍有待确定。

检验血液中心的血液样品，势必是一个防止HCV所造成输血后感染肝炎的主要策略。为此，Chiron公司已将其所得的HCV DNA片断(C100-3)克隆在一个酵母菌表达载体内做成一个检验试剂。事实上这个载体上还有一段类超氧化歧化酶(superoxide dismutase)(SOD)的基因。HCV的片断与SOD形成一融合蛋白(fusion protein)，由SOD的154个氨基酸与HCV的363个氨基酸所组合而成。这个C100-3是一个非结构蛋白区域(NS-4及部分之NS-3)所剪接下来的，其序列在不同国家所分离出的HCV基因组(genome)上均非常相似故用以检验不同HCV分型相当有效。但这个检验试剂也并非完美无缺，因为事实上，C100-3所测出的HCV发生率也只有70-80％左右的C型肝炎而已。为什么会如此呢？可能因为NS-4是一个非结构蛋白，当病毒感染个体之后，要引发抗体出现，来对抗这些非结构蛋白质，所需要的时间较长，或许要达半年以后才会出现，故而利用C100-3来测定时，有可能造成假阴性的结果。而且，当病人血液呈现较低反应数值时，同样是利用Chiron抗原所做成的Abbott及Ortho两家产品，常就出现互相矛盾的结果。另外，又有些有自体免疫(auto-immune)疾病的人，其血清可能已存有对SOD的抗体，故用此检验试剂来检测时，必有假阻性的结果。

本发明的目的是要提供一种制备可用来检验C型肝炎病毒(HCV)的抗原蛋白质的方法，并以此抗原作为HCV检验试剂用以补偿目前HCV检验试剂的缺点，提供更准确的检验结果。

本发明针对目前对HCV的了解，以及目前所用试剂的缺点，特别选择了以结构蛋白为主要的基因(在此指核心蛋白，nucleocapsid)，利用大肠杆菌表达载体，以重组基因的技术，从而表达出大量的抗原蛋白。而且此抗原蛋白不具有任何其他额外的、不必要的序列。

本发明首先从选定的非A非B型肝炎病人的血液中，分离出病毒RNA，再利用日本文献(Jpn.J.Exp.Med.60：167-177，1990)所发表的部分HCV序列，以化学合成法合成一对引子，用RNA反转录及聚合酶连锁反应(RT-PCR)的方法先行合成一段HCV的cDNA片断。这个片断包涵了5’未译区(untranslated region)，及核心蛋白(core)区域。由PCR得来的cDNA片断，并进行全长的DNA定序工作，而得到这部分属于台湾地区的HCV isolate的序列。经与美国发表的序列，或日本发表的序列相比较，大约有95％的同原性。然后再根据自己定序出来的序列，在推测的核心蛋白的区域内，合成另一对引子，并在其C端引子的序列后特意添加一TAA为转译终止子(termination codon)，再利用PCR技术，合成核心蛋白基因的片断，然后直接将此段DNA殖入于大肠菌表达载体的λP转录起动子(promoter，P)。这个起动子在大肠杆菌内表达能力很强。为避免它表达太早而影响菌体的生长，我们将这个载体殖入一株含有cI 857抑制子基因的宿主内。这个cI 857基因会制造一种对温度敏感的抑制子-cI。平常在30℃-32℃培养条件时，这个抑制子会抑制Promoter的表达，但若将温度升至42℃时，抑制子即会变性而失去抑制的作用。P起动子故而可以表达其所携带的基因。利用这个表达系统，经过热处理几个小时后，而得到足量的核心抗原蛋白质。然后将细菌用机械方法打破，即可纯化，分离出此蛋白质，以作为检验试剂之用。

由大肠杆菌所制备的核心蛋白质，利用聚乙酰胺凝胶电泳法分离之后，再以西方墨迹法(west blot)，用C型肝炎病患者的血清来进行结合反应，就可用作检测C型肝炎之用。附图说明：

图1：为由RT-PCR所制备HCV cDNA片断的核甘酸及氨基酸序列

图中核甘酸的序列是根据DNA定序而得，全长共584bp，图的右边代表每行序列最后一个核甘酸的相对位置。RT-PCR反应时所用的引子序列(A1及A2)及第二步特别为了核心抗原部分时所做的PCR反应而用的引子序列(C1及C2)分别以方格框起或以箭号表示。作为第二步PCR反应的3’端引子则多含一个转译终止子序列(TAA)以使蛋白质转译能完成以及一个Sal I(GTCGAC)序列。核心抗原的转译起始点(ATG)由第212个核甘酸位置开始。

图2：为表达质体pG408N-C的结构

图中空格部分代表P起动子，为一段约380bp的DNA片断。阴影部分则代表HCV的cDNA片断(36bp)。园圈的细线部分代表pGEM-4的质体部分。

图3：为HGV抗原蛋白质在大肠杆菌内的表达分析

含有表达体质的大肠杆菌宿主分别经过30℃培养条件，或42℃热处理15分钟后再培养于37℃下3小时，然后把全部菌体离心回收以2X cracking缓冲液溶解，再用12.5％的SDS-聚乙酰胺胶将蛋白质分离(见实例2及3)。To代表未经热处理诱导，Ta代表经过热处理诱导。M代表已知蛋白质大小的标记。箭头所指为的HCV核心抗原的位置。

图4：为利用慢性C型肝炎病患者血清进行西方墨迹法分析

其中类似图3中所述的方法，菌体蛋白质在经过电泳胶分离后，即以四位病人(1-4)及一位正常人(5)的血清进行西方墨迹法分析(见实例3)。箭头所指则代表经过热诱导而表达出来的蛋白质，其能够为病人血清所认别，但在(N)正常人的血清中，这个新表达出来的蛋白质则不能被识别。实例1：HCV核心抗原蛋白质的cDNA片断的克隆

为筛选台湾区HCV病毒的cDNA，根据最近发表的日本病毒株的部分序列(Jpn.J.Exp.Med.60：167-177，1990)，分别作成两个引子A1及A2(见图1)。并利用这对引子，以医院病患血液中的病毒为材料，进行RT-PCR。

首先将100μl的患者血清置于试管中，并加入500μl的变性溶液(4M硫氰酸钠盐；25mM柠檬酸钠pH7.0；0.5％ Sarcosyl；0.1Mβ-巯基乙醇)混合均匀，依次加入60μl 2M柠檬酸钠(PH4.0)，600μl以水饱和的酚，以及120μl的氯仿∶异戊醇(49∶1)，剧烈混合30秒以后，在冰上静置15分钟。然后以10000rpm.4℃下离心10分钟，取出上层液至另一新试管内，加入等体积的异丙醇及10μg的糖原后，混合均匀，于-20℃静置过夜(或-70℃，1小时)以沉淀RNA。再以12000rpm.4℃，离心20分钟，将上清液除去，以75％酒精洗去RNA沉淀中的盐分后，以真空干燥器除去剩余的酒精。将RNA溶于适量(约5μl)的水中，并准备进行RT-PCR。

RT-PCR第一步先进行反转录反应。将前述RNA加水至6.5μl，以沸水煮5分钟后，迅速置于冰水冷却，稍许离心后，加入反应试剂：10X PCR缓冲液2μl；10mM dATP 2μl；10mM dTTP 2μl；10mM dCTP2μl；10mM dGTP 2μl；random hecamer(100ng/μl)2μl；RNasin(40u/μl)0.5μl 2μl；MuL V RT(200u/μl)1μl；[10X PCR缓冲液成分如下：500mM KCl，100mM Tris-HCl pH8.3，15mM MgCl₂，0.1％(W/V)明胶(可省略)]混合均匀，于37℃下反应1小时。而后将样品加热5分钟，迅速置于冰上冷却备用，然后PCR专用的试管中，加入下列试剂：38μl H₂O，4.5μl 10XPCR缓冲液，A1及A2引子各1μl(100ng/ul)，0.5μl Tag DNA聚合酶(5u/μl)，及5μl上述之反转录反应产物。当所有试剂混合均匀后，在液面加入50μl的矿物油随即将试管置于thermal cycler仪器(Perkin Elmer Cetus)内，设定反应条件为：94℃，30秒；60℃，30秒；及74℃，90秒为一循环。

经过35个循环后而得大量的0.587kb的cDNA片断。然后将此cDNA片断克隆入pGem-4Z载体，得一pHCV C-4的质体然后再利用Sanger的方法进行DNA定序(见图1)。由图1中的序列我们知道HCV的蛋白质转译是由第212个核甘酸的位置(ATG)开始的。若与黄病毒(属)的序列比较，核心蛋白在全长的蛋白质的N端。而由文献推测，核心抗原大约含有190个左右的氨基酸(J.Gen，Virol，71；3027-3033，1990)，由此得之我们制得到的cDNA片断仅含其N端的119氨基酸序列。

为了利用大肠杆菌来表达这段核心蛋白基因，再设计了另一对引子C1及C2(图1)，以pHCV C-4为模板，将属于核心蛋白范围的DNA序列，以PCR的方法再行扩增出来。PCR反应中所用的模板DNA为1ng，C1及C2引子各为1μg，加入10μl的10X PCR反应溶液及200μM的四种核甘酸(dATP，dGTP，dCTp及dTTP)后，即加水至100μl的体积及2.5units的Tag聚合酶。反应条件为94℃，1分钟；37℃，2分钟；72℃，3分钟为一循环，全部共进行25个循环而得大量的核心蛋白基因的片断。因其C2引子的3’端设计有Sal I的序列，故将PCR所扩增产生的核心抗原cDNA片断以Sal I限制酶切过后，即接入以PvuII及Sal I切过的表达载体pG408N，其上带有λP起动子，而得到新的质体pG408N-C(见图2)。实利2：HCV核心抗原蛋白的诱导表达

由实例1中所得的pG408N-C质体首先我们采用Hanahan的方法(J.Mol.Biol.165：557-580，1983)将大肠杆菌先在30℃条件下以5ml的M9-CA培养基(1升中含有：Na₂SO₄6g，KH₂PO₄3g，NaCl 0.5g，MgCl₂1g，上述经配好，调pH至7.4，经灭菌之后，再加入下列

无菌溶液；(1M MgSO₄2ml，1M CaCl₂ 0.1ml，20％葡萄糖10ml，20％ Casamino Acid 10ml)培养过夜，第二天再以1/20比例接种到10ml的新鲜M9-CA培养液内，继续在30℃培养约3-4小时，直到菌体浓度达到OD值＝0.3-0.5左右，接着把菌体置于42℃恒温水槽中15分钟。经过热处理后的菌体，再继续培养在37℃，3小时，即可离心沉淀下菌体。以上经过3小时热诱导的大肠杆菌内会有大量的核心抗原蛋白质的产生。反之，若仅在30℃培养的菌体内则无此蛋白质产生。利用聚乙酰胺胶电泳分析，此结果(图3)。这表明这个蛋白质的确是由Promoter起动子带动所表达出来的。实例3：HCV核心抗原蛋白质的分析

由于HCV蛋白质尚无任何单元抗体的生产，故为了鉴定实例2中所制备的蛋白质是否是HCV有关的抗原蛋白，我们只能以经过亚培检验试剂检定及临床结果已确定为C型肝炎之病患血清进行西方墨迹法的分析。首先我们取1ml分别在30℃培养或经过42℃热诱过的大肠杆菌液，经过离心，沉淀下菌体，再以2Xcracking，缓冲液(100mM Tris-HCl，pH6.8；2％SDS；20％丙三醇；20％β-巯基乙醇；4mM EDTA；0.01％溴酚蓝)加以冲调，使菌体浓度达OD＝10。然后煮沸5分钟，离心除去沉淀物，取出15μl加入准备好的含有0.1％SDS的12.5％聚乙酰胺胶，用电泳法，将大小不同的蛋白质分开，然后立即将胶上的蛋白质依其相对位置转印至硝化纤维纸(nitrocellulose)上。

此硝化纤纸再用5％BSA/TBS(0.05M Tris pH7.6；0.9％NaCl)做封阻，防止抗体随意吸附至纤维纸的其他空白处。然后把处理过的硝化纤维纸与病人血清(以3％BSA/TBS 1∶500稀释)作结合反应。反应后的硝化纤维纸立刻用清洗液(0.25％Tween-20/TBS)清洗6次(轻轻振荡，每次10分钟)，以除去没有与抗原蛋白质结合的抗体。清洗过的硝化纤维纸再以接有碱性磷酯酶的山羊抗人类Ig抗体(以3％BSA/TBS 1∶3000倍稀释)作第二次结合反应。反应后，同样以上述清洗液清洗6次，最后再用缓冲液A(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl.50mM MgCl₂)清洗一次，然后把硝化纤维纸浸于10ml的受质溶液(10ml缓冲液A+40μlNBT溶液+35μl X-磷酸盐溶液即成)，(NBT溶液：以70％的二甲替用酰胺(V/V)配制成75mg/ml的硝基蓝四唑盐；X-磷酸盐溶液：以70％的二甲替用酰胺(V/V)配制成50mg/ml的5-溴-4-氯-3-

基磷酸溶液)，做呈色反应。当硝化纤维纸呈色适当后，即可加入TE溶液(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)停止反应，最后再以水清洗，即可。实例4：

经由上述实例中所叙述的方法，在本实例中利用pG408N-C表达质体以及含有cI 857基因的大肠杆菌宿主制备一种检测C型肝炎用的HCV核心抗原蛋白。经由此法所制备的核心抗原蛋白质产量约占菌体全部蛋白质之10％(图3)。这种蛋白质确可与经临床诊断为C型慢性肝炎的病人血清呈阳性反应，但不与正常人的血清反应(图4)，我们更进一步由台大医院所提供的63个慢性肝炎病人血清(均已经过亚培试剂检测其anti-C100-3的反应)来验证核心蛋白的效果。结果发现其中有46个(35阳性，11个阴性)的结果(76％)与亚培试剂所检测结果一致；而另有11个血清样品在亚培试剂无法灵敏测到的情况下，却能与我们所制备的核心抗原蛋白有很强的结合反应(见表1)。由于临床上这些病人均已呈现慢性肝炎症状，故显示仅用亚培试剂来检测，确有漏网之鱼，而本发明所制备的核心抗原却可以弥补这个缺陷。当然也有2个样品亚培试剂测出大于2，另有4个样品，在亚培试剂检测为低反应者(1.0＞OD＞0.4范围之内)，而在核心抗原部份却无明显反应者；这可能是因为亚培试剂的一误差范围之内的结果或此六位病患者尚未有anti-core的抗体产生；但这些推断仍有待以其他方法来证实之。最主要的是利用本抗原蛋白所诊断出来的结果，大体和由亚培试剂所诊断者相吻合(见表1)，而且本发明的核心抗原尚能明显侦测出11个亚培试剂所无法检测到的血清样品。另外12位正常人的血清测试结果都呈阴性反应。总而言之，利用核心抗原作为检验C型肝炎的试剂，可以弥补一些C100-3检验试剂所测不到的部份，提供一个更不具假阴性的诊断结果。表1：以西方墨迹法分析NANB肝炎病患对抗HCV核心抗

原的抗体反应

抗-HCV(C100-3)(a)	肝炎(b)	西方墨迹法阻性(c)
抗-HCV(C100-3)(a)	肝炎(b)	西方墨迹法阻性(c)	O.D＞2.0	慢性	14/16
2.0＞O.D.＞1.0	慢性	13/13	O.D＞2.0	慢性	14/16
2.0＞O.D.＞1.0	慢性	13/13	1.0＞O.D.＞0.4	慢性	8/12
抗C100-3 阴性	慢性	11/22	1.0＞O.D.＞0.4	慢性	8/12
抗C100-3 阴性	慢性	11/22	正常人比较组		0/12

注：a.以亚培试剂，anti-C100-3，所得的反应结果。

b.临床诊断的肝炎情形。

c.指病患血清对抗HCV的核心抗原的西方墨渍反应分析

结果。

Claims

1.一种利用大肠杆菌制备可用来检验C型肝炎病毒HCV的抗原蛋白质的方法，其特征在于所述的HCV抗原蛋白质具有以下的氨基酸序列：

Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys 10

Thr Lys Arg Asn Thr Arg Arg Arg Pro Gln 20

Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 30

Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 40

Gly Pro Arg leu Gly Val Arg Ala Thr Arg 50

Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly 60

Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Glu 70

Pro Glu Gly Arg Ala Trp Als Gln Pro Gly 80

Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly 90

Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro 100

Arg Gly Ser Arg Pro Asn Trp Gly Pro Thr 110

Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly 120

Ter；其制备方法包括下述步骤：

(a)合成一段HCV的cDNA片断；

(b)从该HCV的cDNA片断合成HCA的核心抗原cDNA片断；

(c)将该核心抗原cDNA片断克隆到以Pvu II及Sal I切过的表达质体pG408N的P1转录入起动子，而得到的质体pG408N-C；

(d)将所得到的pG408N-C质体转入含有c I857基因的大肠杆菌；

(e)将该菌在30℃下培养，菌浓度至0.D680＝0.3-0.5，再升温至40-43℃；

(f)再于36-38℃下培养；

(g)分离菌体而得到HCV的抗原蛋白质。

2.按照权利要求1所述利用大肠杆菌制备可用来检验C型肝炎HCV病毒的抗原蛋白的方法，其特征在于步骤(e)是再升温度至42℃。

3.按照权利要求1所述利用大肠杆菌制备可用来检验C型肝炎HCV病毒的抗原蛋白的方法，其特征在于步骤(f)是在37℃下培养。