HU220204B - HCV polipeptidek és HCV polinukleotidok, ilyen polinukleotidokat tartalmazó vektorok és ezekkel transzformált gazdasejtek, valamint HCV fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok és immunvizsgálati készlet - Google Patents

Description

1

HU 220 204 B 2 A találmány olyan anyagokra és eljárásokra vonatko-zik, amelyek a nem A, nem B hepatitis vírus (NANBV)elterjedésének meghatározására és a vírus kiküszöbö-lésére alkalmasak. Pontosabban a találmány a NANBhepatitis etiológiai kialakítója, vagyis a hepatitis C ví-rus (HCV) elleni DNS-fragmentumokra, diagnosztikusfehérjékre, diagnosztikus antitestekre, valamint védőantigénekre és antitestekre vonatkozik.

Az alábbiakban ismertetjük azokat az irodalmi he-lyeket amelyekre hivatkozni fogunk.

Barr és munkatársai : Biotechniques 4, 928(1986);

Botstein: Gene#, 17(1979);

Brinton M. A.: a „THE VIRUSES: THE TOGA-VIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE” című kiadványban(sorozatszerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötet-szerkesztők: Schlesinger és Schlesinger; kiadó: Ple-num Press) 327-374. oldal (1986);

Broach: a „Molecular Biology of the Yeast Saccha-romyces” című kiadványban, 1. kötet, 445. oldal; ColdSpring Harbor Press (1981);

Broach és munkatársai: Meth. Enz. 101, 307(1983);

Chang és munkatársai: Natúré 198, 105(1977);

Chirgwin és munkatársai: Biochemistry 18,5294(1979);

Chomczynski és Sacchi: Analytical Biochemistry162, 156(1987);

Clewell és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.USA 62, 1159(1969);

Clewell: J. Bacteriol. 110, 667(1972);

Cohen (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,2110(1972);

Cousens és munkatársai: Gene 61, 265(1987);

De Boer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.USA 292, 128(1983);

Dreesman és munkatársai: J. Infect. Disease 151,761(1985);

Feinstone S. M. és Hoofnagle J. H.: New Engl.J. Med. 311, 185(1984);

Fields és Knipe: FUND AMENTAL V1ROLOGY(kiadó: Raven Press, New York) (1986);

Fiers és munkatársai: Natúré 273, 113(1978);

Gerety R. J. és munkatársai: a VIRAL HEPATITISAND LIVER DISEASE című kiadványban (szerkesz-tők: Vyas B. N.; Dienstag J. L., és Hoofnagle J. M.; ki-adó: Grune and Stratton Inc. 23-47. oldal (1984);

Goeddel és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 8,4057(1980);

Graham és Van dér Eb: Virology 52, 546(1978);

Grunstein és Hogness: Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73, 3961(1975);

Grych és munkatársai: Natúré 316, 74(1985);

Gubler és Hoffman: Gene 25, 263(1983);

Hammerling és munkatársai: „MONOCLONALANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS”;

Hess és munkatársai: J. Adv. Enzyme Reg. 7,149(1968);

Hinnen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.USA 75, 1929(1978);

Hitzeman és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255,2073(1980);

Holland és munkatársai: Biochemistry 17, 4900(1978);

Holland: J. Bioi. Chem. 256, 1385(1981);

Houghton és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 9, 247(1981);

Hunyh T. V. és munkatársai: a „DNA CLONINGTECHNIQUES; A PRACTICAL APPROACH” címűkiadványban (szerkesztő: Glover D.; kiadó: IRL Press,Oxford, Egyesült Királyság) 49-78. oldal;

Immun. Rév. 62, 185(1982);

Iwarson: British Medical J. 295, 946(1987);

Kennett és munkatársai: „MONOCLONAL ANTI-BODIES” (1980);

Laemmli: Natúré, 227, 680(1970);

Lee és munkatársai : Science 239, 1288(1988);

Maniatis T. és munkatársai: „MOLECULARCLONING; A LABORATORY MANUAL” (ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York)(1982);

Mayer és Walker szerkesztésében: „IMMUNOCHE-MICAL METHODS IN CELL AND MOLECULARBIOLOGY” (Academic Press, London) (1987);

Maxam és munkatársai: Methods in Enzymology65, 499(1980);

MacNamara és munkatársai: Science 226,1325(1984);

Messing és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 9,309(1981);

Messing: Methods in Enzymology 101,20-37(1983); METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press);

Michelle és munkatársai: Int. Symposium on ViralHepatitis;

Monath: a „THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAEAND FLAVOVIRIDAE” című kiadványban (sorozat-szerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötetszerkesz-tők: Schlesinger és Schlesinger, kiadó: Plenum Press),375440. oldal (1986);

Nagahuma és munkatársai: Anal. Biochem. 141,74(1984);

Neurath és munkatársai: Science 224, 392(1984);

Nisonoff és munkatársai: Clin. Immunoi. Immuno-pathol. 27, 397-406(1981);

Overby L. R.: Curr. Hepatol. 5, 49(1985);

Overby L. R.: Curr. Hepatol. 6, 65(1986);

Overby L. R.: Curr. Hepatol. 7, 35(1987);

Peleg: Natúré 227, 193(1969);

Pfefferkom és Shapiro: a „COMPREHENSIVEVIROLOGY” című sorozat 2. kötetében (szerkesztők:Fraenkel-Conrat és Wagner; kiadó: Plenum, NewYork) 171-230. oldal (1974);

Prince A. M.: Annu. Rév. Microbiol. 37, 217(1983);

Rice és munkatársai: a „THE VIRUSES: THETOGAVIRIDAE AND FLAVOVIRIDAE” című kiad-ványban (sorozatszerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wag-ner, kötetszerkesztők: Schlesinger és Schlesinger; ki-adó: Plenum Press) 279-328. oldal (1986);

Roehrig: a „THE VIRUSES: THE TOGAVI-RIDAE AND FLAVOVIRIDAE” című kiadványban(sorozatszerkesztők: Fraenkel-Conrat és Wagner, kötet- 2 1

HU 220 204 B 2 szerkesztők: Schlesinger és Schlesinger; kiadó: Ple-num Press) (1986);

Sadler és munkatársai: Gene 8, 279(1980);

Saiki és munkatársai: Natúré 324, 163(1986);

Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.USA 74, 5463(1977);

Schlesinger és munkatársai: J. Virol. 60,1153(1986);

Schreier M. és munkatársai: „HYBRIDOMA TECH-NIQUES” (1980);

Scopes: „PROTEIN PURIFICATION, PRINCIP-LES AND PRACTICE”, II. kiadás (Springer Verlag,New York) (1984);

Shimatake és munkatársai : Natúré 292, 128(1981);

Steimer és munkatársai: J. Virol. 58, 9(1986);

Stollar: a „TOGAVIRUSES” című kiadványban(szerkesztő: Schlesinger R. W., kiadó: Academic Press,New York), 584-622. oldal (1980);

Taylor és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta442, 324(1976);

Towbin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76, 4350 (1979);

Tsu és Herzenberg: a „SELECTED METHODS INCELLULARIMMUNOLOGY” című kiadványban (ki-adó: Freeman W. H. és Társa), 373-390. oldal (1980);

Vytdehaag és munkatársai: J. Immunoi. 134,1225(1985);

Valenzuela P. és munkatársai: Natúré 298,344(1982);

Valenzuela P. és munkatársai: a „HEPATITIS B”című kiadványban (szerkesztők: Millman J. és munka-társai, kiadó: Plenum Press) 225-236. oldal (1984);

Warner: DNA 3, 401(1984);

Wu és Grossman: Methods in Enzymology, 154.kötet, „RECOMBINANT DNA” „E” rész (1987);

Wu: Methods in Enzymology, 155. kötet, „RECOM-BINANT DNA”, „F” rész (1987);

Zoller: Nucleic Acids Rés. 10, 6487(1982);valamint a 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 4,493,890; lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadal-mi leírás. A nem A, nem B hepatitis (NANBH) átvihető beteg-ség vagy betegségek csoportja, amelyekről úgy vélik,hogy vírusok által indukált betegségek, és amelyek meg-különböztethetők a vírusokkal kapcsolatos májbeteg-ségek más formáitól, ideértve az ismert hepatitisvíru-sok, azaz a hepatitis A vírus (HAV), hepatitis B vírus(HBV), és delta-hepatitis-vírus által okozott betegsége-ket, valamint a citomegalovírus (CMV) vagy Epstein-Barr-vírus (EBV) által indukált hepatitist. A NANBH-telőször transzfúziót kapott egyénekben azonosították.Az átvitel emberből csimpánzba és a sorozatos átvitel csimpánzokban bizonyítékokat szolgáltatott arra, hogyaz NANBH valamilyen átvihető fertőző ágensnek vagyágenseknek tulajdonítható. Az NANBH-ért felelős átvi-hető ágenst azonban eddig még nem azonosították és asok ágens, amely ezt a betegséget okozhatja, ismeretlen. Járványtani megfigyelések azt sugallják, hogy azNANBH-nak három típusa van: a víz eredetű járvá-nyos típus; a vérrel vagy tűvel társult típus; és a szórvá-nyosan előforduló (közösségben szerzett) típus. Azágensek sokasága azonban, amelyek a NANBH-t okoz-hatják, még ismeretlen.

Az NANBH klinikai diagnózisát és azonosítását el-sődlegesen más vírusmarkerek kizárásával hajtják vég-re. Az alkalmazott eljárások között, amelyek a véltNANBH antigének és antitestek kimutatására szolgál-nak, találhatjuk az agargél-diffúziót, az ellen-immun-elektroforézist, immunfluoreszcens mikroszkópiát, im-mun-elektronmikroszkópiát, radioimmunassayt, és azenzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatot. Ezek-nek a vizsgálatoknak egyike sem bizonyult azonban ki-elégítően érzékenynek, fajlagosnak és reprodukálható-nak, hogy diagnosztikus vizsgálatként alkalmazhassukNANBH-hoz.

Mindeddig tehát sem teljes tisztázás, sem megegye-zés nincs az NANBH ágenseivel kapcsolatos antigén-antitest rendszerek azonosítását vagy fajlagosságát ille-tően. Ez, legalábbis részben, az NANBH-nek a HBV-vel való előzetes vagy együttes fertőzésének tulajdonít-ható az egyénekben, valamint a HBV-vel társult oldha-tó és szilárd antigének ismert komplex voltának, továb-bá a HBV-DNS integrálódásának a máj sejtek genom-jába. Ezenkívül az is lehetséges, hogy az NANBH-tegynél több fertőző ágens okozza, és az is lehetséges,hogy az NANBH-t rosszul diagnosztizálják. Nem vilá-gos az sem, mit mutatnak ki a szerológiai vizsgálatokaz NANBH-ban szenvedő betegek szérumában. Arra akövetkeztetésre jutottak, hogy az agargél-diffúziós ésellen-immunelektroforézises vizsgálatok kimutatnakolyan autoimmunválaszokat vagy nem fajlagos fehéqe-kölcsönhatásokat is, amelyek néha fellépnek szérum-minták között, és arra, hogy ezek nem képviselnek fajla-gos NANBH antigén-antitest reakciókat. Az immun-fluoreszcenciás, enzimmel kapcsolt immunszorbens ésradioimmunvizsgálatok, úgy tűnik, kimutatják a reu-matoid faktorszerű anyagok alacsony szintjét is, amelyanyagok gyakran jelen vannak az NANBH-ban szenve-dő betegek szérumában, valamint más máj- és nem máj-betegségekben szenvedő betegek szérumában. A kimu-tatott reaktivitások közül néhány képviselhet gazdaszer-vezet által meghatározott citoplazmás antigének elleniantitesteket is.

Számos jelölt van, amely NANBH okozójakéntszóba jöhet. Lásd például Prince (1983), Feinstoneés Hoofnagle (1984) és Overby (1985, 1986, 1987)összefoglaló közleményeit és Iwarson (1987) közlemé-nyét. Nincs azonban bizonyíték arra, hogy ezeknek a je-lölteknek bármelyike képviselné a NANBH etiológiaiágensét.

Jelentős az igény arra, hogy legyen érzékeny, fajla-gos módszer NANBH-hordozók és NANBH-vel fertő- 3 1

HU 220 204 B 2 zött vér vagy vérkészítmények átvizsgálására és azonosí-tására. A transzfúzió utáni hepatitis (PTH) a transzfúziótkapott betegeknek mintegy 10%-ánál fordul elő, és ezek-nek az eseteknek akár 90%-ában is az NANBH játssza aszerepet. Ebben a betegségben a fő gond a gyakori to-vábbfejlődés krónikus májkárosodássá (25-55%). A betegekről való gondoskodás, valamint azNANBH átvitelének megelőzése vérrel és vértermékek-kel vagy szorosabb személyi kontaktussal megfelelő diag-nosztikus és prognosztikus eszközöket igényel NANBH-vel kapcsolatos nukleinsavak, antigének és antitestek ki-mutatására. Ezenkívül igény van hatásos vakcinákraés immunterápiás szerekre a betegség megelőzéséreés/vagy kezelésére. A találmány az NANBH újonnan felfedezett etioló-giai ágensének, a hepatitis C vírusnak (HCV) az izolálá-sával és jellemzésével foglalkozik. Pontosabban a talál-mány a HCV genom részeit képező cDNS-replikacsa-ládra vonatkozik. A HCV genomja természetével kapcsolatos tanul-mányok, amelyek a HCV-cDNS-ből származó vizsgáló-mintákat, valamint a HCV-cDNS-en belül levő szek-venciainformációt alkalmazzák, azt sugallják, hogy aHCV flavivírus vagy flaviszeru vírus. A HCV-ből származó cDNS-szekvenciák részei al-kalmasak vizsgálómintaként, hogy diagnosztizáljuk a ví-rus jelenlétét mintákban, és izoláljuk a vírus természet-ben előforduló variánsait. Ezek a cDNS-ek a HCV ge-nomon vagy genomokon belül kódolt HCV antigénekpolipeptidek szekvenciáját is ismertetjük, így lehetővétesszük olyan polipeptidek termelését, amelyek stan-dardként vagy reagensként alkalmazhatók diagnoszti-kus vizsgálatokban és/vagy alkalmazhatók vakcinákkomponenseként. Az ezen a polipeptidszekvencián be-lül található HCV epitópok ellen irányuló mind mono-klonális, mind poliklonális antitestek szintén hasznosakdiagnosztikus vizsgálóanyagként, terápiás ágensekként,vírusellenes szerek átvizsgálására, és olyan NANBVágensek izolálására, amelyekből ezek a cDNS-ek szár-maznak. Ezenkívül az ezekből a cDNS-ekből származóvizsgálóminták alkalmazásával lehetséges a HCV ge-nom más részeit izolálni és szekvenciaelemzésnek alá-vetni, így további vizsgálómintákat és polipeptideket lét-rehozni, amelyek alkalmazhatók az NANBH diagnó-zisában és/vagy mind megelőző, mind terápiás kezelé-sében. Következésképpen a polinukleotidokkal kapcsolat-ban a találmány tárgya: izolált HCV polinukleotid; va-lamely, a HCV genomból vagy HCV-cDNS-ből szár-mazó szekvenciát tartalmazó rekombináns polinukleo-tid; a rekombináns polinukleotidok bármelyikét tartal-mazó rekombináns vektor; ezeknek a vektoroknak bár-melyikével transzformált gazdasejt.

Egy, a HCV genomból vagy HCV-cDNS-ből szár-mazó DNS nyitott leolvasókeretét (ORF) tartalmazórekombináns kifejezőrendszerben az ORF működőképe-sen össze van kapcsolva valamely, a kívánt gazdaszer-vezettel összeférhető kontrollszekvenciával. A találmány kiterjed továbbá a HCV epitóp ellenirányuló monoklonális antitestekre is. A találmány még további tárgya valamely polinuk- leotid vizsgálóminta HCV-hez. A találmány lehetővé teszi vizsgálókészletek össze-állítását. Az analizálóminták HCV-ből származó poli-nukleotidok jelenlétének kimutatására szolgálnak: ezeka kimutatandó HCV antigén ellen irányuló antitestet tar-talmaznak megfelelő tartályban. A találmány még további tárgya: eljárás valamelyHCV epitópot tartalmazó polipeptid előállítására,amely eljárás egy HCV epitópot tartalmazó polipeptidetkódoló szekvenciát tartalmazó valamely kifejezővektor-ral transzformált gazdasejtek indukálásából áll olyan kö-rülmények között, amelyek lehetővé teszik az említettpolipeptid kifejeződését. A találmány magában foglal immunvizsgálati eljárá-sokat is. Ezek között találjuk az immunesszét valamelyHCV antigén kimutatására, amely eljárás a mintának,amelyről feltételezhető, hogy GCV antigént tartalmaz,inkubálásából áll olyan vizsgáló antitestmintával, amelya kimutatandó HCV antigén ellen irányul, az inkubálástolyan körülmények között végezve, amely lehetővé te-szi egy antigén-antitest komplex képződését.

Az 1. ábra a HCV-cDNS-beiktatás kettős szálú nuk-leotidszekvenciáját mutatja be az 5-1-1. kiónban, va-lamint az ebben kódolt polipeptid aminosavszekven-ciáját. A 2. ábra az átfedő HCV-cDNS-szekvenciák ho-mológiáit mutatja be az 5-1-1.; 81.; 1-2. és 91. kió-nokban. A 3. ábra a81.; 1-2. és 91. átfedőklónokból szárma-zó összetett szekvenciát mutatja be, valamint az ebbenkódolt aminosavszekvenciát. A 4. ábra a HCV-cDNS-beiktatás kettős szálú nuk-leotidszekvenciáját mutatja be a 81. kiónban, valamintaz ebben kódolt polipeptid aminosavszekvenciáját.

Az 5. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a36. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 81. klónNANBV-cDNS-ét, és a 36. kiónon belül kódolt polipep-tidszekvenciát. A 6. ábra a HCV-cDNS-ek kombinált ORF-ját mu-tatja be a 36. és 81. kiónban, valamint az ebben kódoltpolipeptidet. A 7. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a32. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 81. kiónt, ésaz ebben kódolt polipeptidet. A 8. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a35. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 36. kiónt, ésaz ebben kódolt polipeptidet. A 9. ábra HCV-cDNS-ek kombinált ORF-jét mutat-ja be a 35., 36., 81. és 32. kiónokban, és az ebben kó-dolt polipeptidet. A 10. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a37b. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 35. kiónt, ésaz ebben kódolt polipeptidet.

All. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a33b. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 32. kiónt, ésaz ebben kódolt polipeptidet. A 12. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a40b. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 37b. kiónt,és az ebben kódolt polipeptidet. 4 1

HU 220 204 B 2 A 13. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a25c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 33b. kiónt, ésaz ebben kódolt polipeptidet. A 14. ábra annak az ORF-nek a nukleotidszekven-ciáját és a benne levő polipeptidszekvenciát mutatja be,amely ORF kiterjed a HCV-cDNS-ekig a 40b., 37b.,35., 36., 81., 32., 33b. és 25c. kiónokban. A 15. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a33c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 40b. és 33c.kiónokat, és az ebben kódolt aminosavakat. A 16. ábra a 8h. kiónban levő HCV-cDNS-szek-venciát mutatja be, a szegmenst, amely átfedi a 33c.kiónt, és az ebben kódolt aminosavakat. A 17. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a7e. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 8h. kiónt, ésaz ebben kódolt aminosavakat. A 18. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a14c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 25c. kiónt, ésaz ebben kódolt aminosavakat. A 19. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a8f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 14c. kiónt, ésaz ebben kódolt aminosavakat. A 20. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a33f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 8f. kiónt, ésaz ebben kódolt aminosavakat. A 21. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a33g. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 33f. kiónt, ésaz ebben kódolt aminosavakat. A 22. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a7f. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciát a7e. kiónban, és az ebben kódolt aminosavakat. A 23. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a11b. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciáta 7f. kiónban, és az ebben kódolt aminosavakat. A 24. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be aIli. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciát a11b. kiónban, és az ebben kódolt aminosavakat. A 25. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a39c. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a szekvenciáta 33g. kiónban, és az ebben kódolt aminosavszek-venciát. A 26. ábra egy összetett HCV-cDNS-szekvenciátmutat be, amely a 14i.; 11b.; 7f.; 7e.; 8h.; 33c.; 40b.;37b.; 35.; 36.; 81.; 32.; 33b.; 25c.; 14c.; 8f.; 33f.; és33g. kiónokban levő közös cDNS-ekből származik, to-vábbá bemutatja a származékszekvenciában levő kiter-jesztett ORF-ben kódolt polipeptid aminosavszekven-ciáját. A 27. ábra a HCV-cDNS-t mutatja be a 12f. kión-ban, a szegmenst, amely átfedi a 14i. kiónt, és az ebbenkódolt aminosavakat. A 28. ábra a HCV-cDNS-t mutatja be a 35f. kión-ban, a szegmenst, amely átfedi a 39c. kiónt, és az ebbenkódolt aminosavakat. A 29. ábra a HCV-cDNS-szekvenciát mutatja be a19g. kiónban, a szegmenst, amely átfedi a 35f. kiónt, ésaz ebben kódolt aminosavakat. A 30. ábra a 26g. klón szekvenciáját mutatja be, aszegmenst, amely átfedi a 19g. kiónt, és az ebben kó-dolt aminosavakat. A 31. ábra a 15e. klón szekvenciáját mutatja be, azta szegmenst, amely átfedi a 26g. kiónt, és az ebben kó-dolt aminosavakat. A 32. ábra egy összetett cDNS-t mutat be, amely a12f.-15e. kiónok egyesítéséből származik 5’->3’ irány-ban; ez bemutatja a folyamatos ORF-ben kódolt amino-savakat is. A 33. ábra az SOD-NANB5_,_| fúziós fehérje BB-NANB-vel, HAV-val és HBV-vel fertőzött csimpán-zokból származó csimpánzszérummal végzett Westem-folt elemzésének fényképe. A 34. ábra az SOD-NANBj-!-, fúziós fehérjeNANBV-vel, HAV-val és HBV-vel fertőzött emberek-ből és kontrollemberekből származó szérumokkal vég-zett Westem-foltelemzésének fényképe. A 35. ábra a pAB24 vektor jelentősebb vonásait be-mutató térkép. A 36. ábra a C100-3 fúziós polipeptid karboxi-terminális aminosavszekvenciáját, valamint az ezt kó-doló nuklentidszekvenciát mutatja be. A 37a. ábra Coomassie kékkel festett poliakrilamid-gélfényképe, amely az élesztőben kifejezett C100-3-atazonosítja. A 37b. ábra a C100-3-nak egy NANBV-vel fertő-zött emberből származó szérummal végzett Westem-folt elemzését mutatja. A 38. ábra BB-NANBV-vel fertőzött csimpánz má-jából izolált RNS Northem-foltjának autoradiogramjátmutatja be, ahol ezt a 81. klón BB-NANBV-cDNS-selvizsgáljuk. A 39. ábra az RNáz A-val vagy DNáz I-gyel kezeltés a 81. klón BB-NANBV-cDNS-ével vizsgáltNANBV nukleinsav autoradiogramját mutatja be. A 40. ábra fertőzött plazmából anti-NANB5_11-gyel befogott NANBV-részecskékből extrahált, és a 81.klónból való 32P-jelzett NANBV-cDNS-sel vizsgált nuk-leinsavak autoradiogramját mutatja be. A 41. ábra NANBV nukleinsavakból izolált és a 81.kiónban levő NANBV-cDNS-ből származó 32P-jelzettplusz és mínusz szálú DNS vizsgálómintákkal vizsgáltszűrők autoradiogramját mutatja be. A 42. ábra a homológiát mutatja be HCV-cDNS-ben kódolt polipeptid és a dengue-flavivírusból szárma-zó NS fehérje között. A 43. ábra a HCV-fertőzés eloszlásának hiszto-gramja véletlenszerű mintákból, amint ezt ELISA-át-vizsgálással határozzuk meg. A 44. ábra HCV-fertőzés eloszlásának hisztogramjavéletlenszerű mintákból, immunglobulinenzim-konju-gátum két konfigurációját alkalmazva ELlSA-vizsgá-latban. A 45. ábra flavivírusok NSl-ében levő megőrzöttszekvenciából származó primer keverék szekvenciáitmutatja be. A 46. ábra a k9-l. kiónban levő HCV-cDNS-szek-venciát mutatja be, a szegmenst, amely átfedi a 26. ábrá-ban levő cDNS-t, és bemutatja az ebben kódolt amino-savakat. A 47. ábra annak az összetett cDNS-nek a szekven-ciáját mutatja be, amely a k9-l.-15e. kiónok egyesíté- 5 1

HU 220 204 B 2 sével keletkezik 5’->3’ irányban; ez bemutatja a folya-matos ORF-ben kódolt aminosavakat is. A következőkben részletesen, a korlátozás szándé-ka nélkül ismertetjük a találmányt. I. Meghatározások A „hepatitis C vírus” (HCV) kifejezést a szakterüle-ten dolgozó szakemberek az NANBH eddig ismeretlenágensének tartották fenn. Következésképpen, ahogyanitt használjuk, a „hepatitis C vírus” (HCV) olyan ágens-re utal, amely az NANBH okozója, és amelyet koráb-ban NANBV-nek és/vagy BB-NANBV-nek neveztek.A HCV, NANBV és BB-NANBV kifejezéseket itt egy-másra bármikor kicserélhetően alkalmazzuk. Ennek aterminológiának a kiterjesztéseként a HCV által oko-zott betegséget, amelyet korábban NANB hepatitisnek(NANBH) neveztek, hepatitis C-nek nevezzük. AzNANBH és hepatitis C kifejezéseket egymásra bármi-kor kicserélhetően alkalmazzuk. A „HCV” kifejezés, amint itt alkalmazzuk, olyan ví-rust jelent, amely NANBH-t okoz, valamint jelenti en-nek legyengített törzsét vagy az ezekből származó nemteljes interferáló részecskéket. Amint alább bemutat-juk, a HCV genom RNS-ből áll. Ismeretes, hogy azRNS-tartalmú vírusok viszonylag magas aránybanrendelkeznek spontán mutációval, vagyis az irodalomszerint 10 3-10 4 nagyságrendben nukleotidonként[Fields és Knipe (1986)]. Ennek következtében ezekösszetett törzsek az alább leírt HCV-fajon belül. Az ittleírt készítmények és eljárások lehetővé teszik a külön-böző rokon törzsek szaporítását, azonosítását, kimutatá-sát és izolálását. Ezentúl ezek lehetővé teszik diagnosz-tikumok és vakcinák előállítását különböző törzsek-hez, és hasznosítást nyerhetnek farmakológiai alkalma-zású vírusellenes ágensekhez szolgáló átvizsgálómód-szerekben, amennyiben ezek gátolják a HCV repliká-cióját.

Az itt nyújtott információ, bár a HCV egy törzsébőlszármazik, amelyet ezután CDC/HCVl-nek nevezünk,elegendő ahhoz, hogy egy vírustaxonómusnak lehetővétegye más olyan törzsek azonosítását, amelyek ebbe afajba esnek. Amint itt leíijuk, felfedeztük, hogy a HCVflavivírus vagy flaviszerű vírus. A flavivírus-részecs-kék morfológiája és összetétele ismert, ezt Brinton(1986) közleménye tárgyalja. Általában a morfológiáttekintve a flavivírusok egy központi nukleokapszidottartalmaznak egy lipid kettős réteggel körülvéve. A vi-rionok gömb alakúak és mintegy 40-50 nm átmérő-jűek. Belsejük mintegy 25-30 nm átmérőjű. A virion-burkolat külső felülete mentén nyúlványok vannak,amelyek mintegy 5-10 nm hosszúak, a végükön mint-egy 2 nm átmérőjű gömbökkel. A HCV olyan epitópot kódol, amely immunológiai-lag azonosítható a HCV genomban kódolt epitóppal,amely genomból az itt leírt cDNS származik; az epitópelőnyösen egy itt leírt cDNS-ben kódolódik. Az epitópegyedi HCV-re, amikor már ismert flavivírusokkal ha-sonlítjuk össze. Az epitóp egyediségét HCV-vel valóimmunológiai reaktivitásával és más flavivírus fajokkalvaló immunológiai reaktivitás hiányával határozhatjukmeg. Az immunológiai reaktivitás meghatározásához való módszerek a szakterületen ismertek, ilyenek pél-dául a radioimmunesszé-, az ELISA-vizsgálat, a he-magglutináció, és itt a vizsgálatokhoz alkalmas techni-kákra számos példát adunk majd. A fentieken kívül az alábbi paraméterek alkalmazha-tók együtt vagy külön, hogy egy törzset HCV-nek azo-nosítsunk. Mivel a HCV törzsek fejlődéstani szempont-ból rokonok, várható, hogy a genomok általános ho-mológiája nukleotidszinten 40% vagy nagyobb, elő-nyösen 60% vagy nagyobb, még előnyösebben 80%vagy nagyobb; ezenkívül vannak legalább mintegy 13nukleotidból álló megfelelő összefüggő szekvenciák.A megegyezést a vélt HCV törzs genomszekvencia és aCDC/CH1 HCV-cDNS-szekvencia között olyan techni-kákkal határozhatjuk meg, amelyek a szakterületen is-mertek. így például ezt meg lehet határozni a véltHCV-szekvenciából való polinukleotidszekvencia in-formációja és az itt leírt HCV-cDNS-szekvencia vagy-szekvenciák közvetlen összehasonlításával. Ezt pél-dául meg lehet határozni a polinukleotidok hibridizálá-sával is olyan körülmények között, amelyek stabil dup-lexek képződését teszik lehetővé homológ területek kö-zött (például olyan körülmények között, amelyeket Stemésztés előtt alkalmazhatunk), ezt követi az emésztésegyedi szálakra fajlagos nukleázzal vagy nukleázokkal,ezt pedig az emésztett fragmentumok méretmeghatá-rozása követi. A HCV törzseinek fejlődéstani rokonsága miatt avélt HCV törzsek azonosíthatók homológiájukkal poli-peptidszinten. A HCV törzsek általában több mint mint-egy 40%-ban homológok, előnyösen több mint mintegy60%-ban homológok, és még előnyösebben több mint80%-ban homológok polipeptidszinten. A technikák azaminosavszekvencia-homológia meghatározására a szak-területen ismertek. így például az aminosavszekvenciátmeghatározhatjuk közvetlenül és összehasonlíthatjuk azitt szolgáltatott aminosavszekvenciával. Meghatározhat-juk például a feltételezett HCV genom anyagának nuk-leotidszekvenciáját is (általában valamely cDNS köztestermék révén); az ebben kódolt aminosavszekvenciátmeghatározhatjuk, és a megfelelő területeket összeha-sonlíthatjuk.

Amint itt használjuk, egy megnevezett szekvenciá-ból „származó” polinukleotidok, például a HCV-cDNS-ek, különösen azok, amelyek az 1-32. ábrákban vannakleírva, vagy egy HCV genomból „származó” polinuk-leotidok olyan polinukleotidszekvenciákra vonatkoz-nak, amelyek előnyösen 10-12 nukleotidból és még elő-nyösebben 15-20 nukleotidból állnak, amelyek megfe-lelnek a megnevezett nukleotidszekvenciának, vagyishomológok vagy komplementerek azzal. Annak a terü-letnek a szekvenciája, amelyből a polinukleotid szárma-zik, előnyösen egy olyan szekvenciával homológ vagykomplementer, amely egyedi egy HCV genomban. Ez aszekvencia akár egyedi a HCV genomban, akár nem,olyan technikákkal határozható meg, amelyek ismertekazok számára, akik a szakterületen jártasak. így példáula szekvenciát össze lehet hasonlítani adatbankokban, pél-dául a Genebankban levő szekvenciákkal, hogy megha-tározzuk, vajon ez jelen van-e nem fertőzött gazdaszer- 6 1

HU 220 204 B 2 vezetékben vagy más organizmusokban. A szekvenciátösszehasonlíthatjuk más víruságensek ismert szekven-ciáival is, beleértve azokat a vírusokat, amelyekről is-mert, hogy hepatitist idéznek elő (például HAV, HBVés HDV) és a Flaviviridae más tagjaival. A származék-szekvencia megegyezését vagy meg nem egyezését másszekvenciákkal hibridizálással is meghatározhatjuk al-kalmas szigorúságit körülmények között. A nukleinsav-szekvenciák komplementer voltának meghatározásáraszolgáló hibridizációs technikák a szakterületen ismer-tek, ezeket a későbbiekben tárgyaljuk [lásd még ezzelkapcsolatban Maniatis és munkatársai (1982) munká-ját]. Ezenkívül hibridizálással képzett duplex polinuk-leotidok hibás illesztését is meghatározhatjuk ismerttechnikákkal, ideértve például valamely nukleázzal, pél-dául Srgyel végzett emésztést, amely nukleáz fajlago-san emészti az egyszálú területeket duplex polinukleo-tidokban. Azok a területek, amelyekből tipikus DNS-szekvenciák „származhatnak”, lehetnek például olyan te-rületek (de nem csak ezekre korlátozódnak), amelyekspeciális epitópokat, valamint át nem írt és/vagy nemtranszlatált területeket kódolnak. A származék polinukleotidok nem szükségszerűenfizikailag származnak a bemutatott nukleotidszekven-ciából, hanem keletkezhetnek bármilyen módon, bele-értve például a kémiai szintézist; vagy DNS-repliká-ciót, vagy reverz transzkripciót, vagy olyan transzkrip-ciót, amely a bázisok szekvenciája által nyújtott infor-máción alapul, ahol a bázisok abban a területben van-nak, amelyből a polinukleotid származik. Ezenkívül anevezett szekvencia területeinek megfelelő területekkombinációi módosíthatók is úgy, amint ez a szakterüle-ten ismert, hogy ezek egybevágjanak a szándékolt alkal-mazással.

Hasonlóképpen egy megnevezett nukleinsavszek-venciából, például az 1-32. ábrákban levő szekven-ciákból „származó” polipeptid vagy aminosavszekven-cia, vagy egy HCV genomból „származó” szekvenciaegy polipeptidre vonatkozik, amelynek olyan amino-savszekvenciája van, amely azonos a nevezett szekven-ciában vagy annak egy részében kódolt polipeptid szek-venciájával, ahol a nevezett rész legalább 3-5 amino-savból, előnyösen 8-10 aminosavból, még előnyöseb-ben 11-15 aminosavból áll, vagy amely immunológiai-lag azonosítható a nevezett szekvenciában kódolt poli-peptiddel.

Egy rekombináns vagy származék polipeptid nemszükségszerűen egy megnevezett nukleinsavból, pél-dául az 1-26. ábrákban látható szekvenciákból, vagyegy HCV genomból fordítódik át; ez kialakítható bármi-lyen más módon is, ideértve a kémiai szintézist, vagyegy rekombináns kifejezőrendszer kifejezését, vagy azizolálást mutáns HCV-ből. A „rekombináns polinukleotid” kifejezést, amint itthasználjuk, genom, cDNS, félszintetikus, vagy szinteti-kus eredetű polinukleotid értelemben használjuk, amelyeredetét vagy a műveleteket tekintve: (1) nincs összeköt-ve annak a polinukleotidnak egészével vagy részével,amellyel ez a természetben össze van kötve vagy könyv-tárat képez; és/vagy (2) össze van kapcsolva olyan poli- nukleotiddal, amely különbözik azoktól, amelyekkel ez a természetben össze van kapcsolva. A „polinukleotid” kifejezés, ahogyan itt használjuk,nukleotidok bármilyen hosszúságú polimer formájáravonatkozik, amely nukleotidok lehetnek ribonukleoti-dok vagy dezoxiribonukleotidok. Ez a meghatározás amolekulának csak a primer szerkezetére utal. így ez akifejezés magában foglalja az egyszálú és kettős szálúDNS-eket, valamint az egyszálú és kettős szálú RNS-eket. Ez magában foglalja a polinukleotidok példáulmetilezéssel és/vagy helyettesítéssel módosított formáités nem módosított formáit.

Az „egy cDNS-nek megfelelő szekvenciát tartalma-zó HCV” kjfejezés, ahogyan itt használjuk, azt jelenti,hogy a HCV olyan polinukleotidszekvenciát tartalmaz,amely homológ vagy komplementer egy, a nevezettDNS-ben levő szekvenciához; a homológia vagy komp-lementer jelleg mértéke a cDNS-hez mintegy 50% vagynagyobb, előnyösen legalább mintegy 70%, még előnyö-sebben legalább mintegy 90%. A szekvenciák, amelyekmegfelelnek, legalább mintegy 70 nukleotid, előnyösenlegalább mintegy 80 nukleotid, még előnyösebben leg-alább mintegy 90 nukleotid hosszúságúak. A megegye-zést a HCV-szekvencia és a cDNS között a szakterüle-ten ismert technikákkal határozhatjuk meg, ideértve pél-dául a szekvenciaelemezésnek alávetett anyag közvetlenösszehasonlítását a leírt cDNS-ekkel, vagy a hibridizá-lást és az emésztést egyedi szálra fajlagos nukleázokkal,amelyet az emésztett fragmentumok méret szerinti meg-határozása követ. „Replikon” bármilyen genetikai elem, például plaz-mid, kromoszóma, vírus, amely polinukleotid repliká-ció autonóm egységeként viselkedik valamely sejten be-lül, vagyis replikációra képes saját szabályozása alatt. A „vektor” olyan replikon, amelyhez más polinuk-leotidszegmensek is vannak rögzítve úgy, hogy végre-hajtódjék a rögzített szegmensek replikációja és kifeje-ződése. A „szabályozószekvencia” kifejezés olyan polinuk-leotidszekvenciákra vonatkozik, amelyek szükségesekazon kódolószekvenciák kifejeződésének véghezvitelé-hez, amelyekhez ligáivá vannak. Az ilyen szabályozó-szekvenciák természete különbözik a gazdaszervezettőlfüggően; prokariótákban az ilyen szabályozószekven-ciák között találjuk általában a promotort, riboszomáliskötőhelyet és terminátorokat; eukariótákban az ilyenszabályozószekvenciák között találjuk általában a pro-motorokat, terminátorokat és bizonyos esetekben a fo-kozókat. A „szabályozószekvenciák” kifejezés szán-dékunk szerint magában foglal minimumként mindenolyan komponenst, amelynek jelenléte szükséges a kife-jezéshez, továbbá magában foglalhat további kompo-nenseket is, amelyek jelenléte előnyös, például vezető-szekvenciákat. A „működőképesen összekapcsolt” kifejezés olyanegymásmellettiségre vonatkozik, ahol az így leírt kom-ponensek olyan kapcsolatban vannak, amely lehetővé te-szi, hogy ezek a kívánt módon működjenek. Egy szabá-lyozószekvencia „működőképesen összekapcsolva” egykódolószekvenciával úgy van ligáivá, hogy a kódoló- 7 1

HU 220 204 B 2 szekvencia kifejeződését éljük el olyan körülmények kö-zött, amely összeférhető a szabályozószekvenciával. A „nyitott leolvasókeret” egy polinukleotidszekven-ciának olyan területe, amely egy polipeptidet kódol; eza terület egy kódolószekvenciának egy részét vagy egyteljes kódolószekvenciát képviselhet. A „kódolószekvencia” olyan polinukleotidszekven-cia, amely átíródik mRNS-sé és/vagy transzlatálódik va-lamely polipeptiddé, amikor megfelelő szabályozószek-venciák szabályozása alá helyezzük. A kódolószekven-cia határait a transzlációs startkodon határozza meg az5’-terminálisnál és a transzlációs stopkodon a 3’-termi-nálisnál. Egy kódolószekvencia magában foglalhatmRNS-, cDNS- és rekombináns polinukleotidszekven-ciákat, de a lehetőségek nem csak ezekre korlátozódnak.

Az „immunológiailag azonosítható” valamivel vagyvalamiként kifejezés olyan epitóp vagy epitópok és poli-peptid vagy polipeptidek jelenlétére utal, amelyek jelenvannak a megnevezett polipeptidben vagy polipeptidek-ben, általában HCV-fehéijékben, és egyediek abban.Az immunológiai azonosságot antitestkötéssel és/vagya kötésben való versengéssel határozhatjuk meg; ezek atechnikák ismeretesek azok számára, akik a szakterüle-ten átlagosan jártasak; ezeket a későbbiekben be is mu-tatjuk. Az epitóp egyediségét számítógépes kutatással ismeghatározhatjuk ismert adatbankokból, például a Ge-nebankból, a polinukleotidszekvenciákból, amelyek azepitópot kódolják, és az aminosavszekvencia-összeha-sonlításokból más ismert fehérjékkel.

Ahogyan itt alkalmazzuk, az „epitóp” kifejezés egypolipeptid antigén determinánsára utal; egy epitóp áll-hat 3 aminosavból olyan térbeli konformációban,amely egyedi az epitópra nézve, általában azonban egyepitóp legalább 5 ilyen aminosavból áll, de legáltaláno-sabban 8-10 ilyen aminosavból áll. Az aminosavak tér-beli konformációjának meghatározására szolgáló mód-szerek ismeretesek a szakirodalomban, ezek között ta-láljuk például a röntgensugár-krisztallográfiát és a két-dimenziós magmágneses rezonanciát.

Egy polipeptid akkor „immunológiailag reaktív” egyantitesttel, amikor egy antitesthez kötődik amiatt, hogyaz antitest felismeri azt a fajlagos epitópot, amelyet apolipeptid tartalmaz. Az immunológiai reaktivitást anti-testkötéssel határozhatjuk meg, pontosabban az antitest-kötés kinetikájával és/vagy egy kötésben való versengés-sel, versengőanyagként valamely ismert polipeptidet al-kalmazva, amely tartalmaz egy olyan epitópot, amely el-len az antitest irányul. Az a technika, amely annak meg-határozására szolgál, vajon egy polipeptid immunoló-giailag reaktív-e egy antitesttel, a szakterületen ismert.

Ahogyan itt használjuk, a „HCV epitópot tartalma-zó immunogén polipeptid” kifejezés természetben elő-forduló HCV polipeptideket vagy ezek fragmentumaitfoglalja magában, valamint más úton, például kémiaiszintézissel előállított polipeptideket, vagy rekombi-náns organizmusban kifejezett polipeptideket. A „polipeptid” kifejezés aminosavmolekula-láncok-ra vonatkozik, és nem utal a termék adott hosszára; ígya polipeptid definícióba beletartoznak a peptidek, oligo-peptidek és fehérjék egyaránt. Ez a kifejezés nem utal a polipeptid kifejeződés utáni módosításaira, példáula glikozilezésre, acetilezésre, foszforilezésre stb. sem. A „transzformálás” kifejezés, ahogyan itt használ-juk, egy exogén polinukleotid beiktatására utal vala-mely gazdaszervezetbe, tekintet nélkül a beiktatáshozalkalmazott módszerre; ez a módszer lehet például köz-vetlen felvétel, transzdukció vagy f-párosodás. Az exo-gén polinukleotidot fenntarthatjuk nem integrált vektor-ként, például plazmidként, de lehet integrálódva is agazdaszervezet-genomba.

Ahogyan itt használjuk, egy nukleinsav „pluszszá-la” azt a szekvenciát tartalmazza, amely a polipeptidetkódolja. A „mínuszszál” olyan szekvenciát tartalmaz, amelya „pluszszál” szekvenciával komplementer.

Amint itt alkalmazzuk, egy vírus „pozitív szálú ge-nom”-ja olyan, amelyben a genom akár RNS, akárDNS, egyszálú, és valamely polipeptidet vagy polipepti-deket kódol. Pozitív szálú RNS-vírusokra példák a To-gaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picomaviridae,és Caliciviridae. Idetartozik a Flaviviridae is, amelyetkorábban a Togaviridae-hoz osztályoztak [lásd Fieldsés Knipe (1986)].

Ahogyan itt használjuk, a „tisztított HCV” kifejezésolyan készítményre utal, amelyet elkülönítettünk azok-tól a sejtalkotó részektől, amelyekkel a vírus normáli-san egyesítve van és azoktól a más típusú vírusoktól,amelyek jelen lehetnek a fertőzött szövetben. A vírusokizolálására szolgáló technikák ismeretesek azok számá-ra, akik a szakterületen jártasak, ilyenek például a cent-rifúgálás és affinitáskromatográfia. A találmány gyakorlati megvalósításához, hacsakmásképpen nem jelezzük, a molekuláris biológia, mikro-biológia, rekombináns DNS-technika, és immunológiahagyományos technikáit alkalmazzuk, amely technikáka szakterületen való általános jártasság keretei közé tar-toznak. Az ilyen technikákat az irodalomban részlete-sen ismertetik, lásd például Maniatis, Fritsch és Sam-brook: MOLECULAR CLONING; A LABORATO-RY MANUAL (1982); DNA CLONING; I. és II. kötet(szerkesztő: Glover D. N.) (1985); OLIGONUCLEO-TIDE SYNTHESIS (szerkesztő: Gait M. J.) (1984);NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (szerkesztők:Hames B. D. és Higgins S. J.) (1984); TRANSCRIP-TION AND TRANSLATION (szerkesztők: HamesB. D. és Higgins S. J.) (1984); ANIMAL CELL CUL-TURE (szerkesztő: Freshney R. I.) (1986); IMMO-BILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986);Perbal B.: A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULARCLONING (1984); a „METHODS IN ENZYMO-LOGY” című sorozat (Academic Press, Inc.); GENETRANSFER VECTORS FÓR MAMMALIAN CELLS(szerkesztők: Miller J. H. és Calos Μ. P.) (Cold SpringHarbor Laboratory, 1987); Methods is Enzymology154. kötet (szerkesztők: Wu és Grossman); Methods inEnzymology 155. kötet (szerkesztő: Wu); IMMUNO-CHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLE-CULAR BIOLOGY (szerkesztők: Mayer és Walker)(Academic Press, London) (1987); Scopes: PROTEINPURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE 2. 8 1

HU 220 204 B 2 kiadás (Springer Verlag, New York, 1987); HAND-BOOK. OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,I-IV. kötet (szerkesztők: Weir D. M. és BlackwellC. C.) (1986).

Minden szabadalmi leírás, szabadalmi bejelentés ésközlemény, amelyet eddig említettünk vagy ezután em-lítünk, referenciaként épül be a jelen bejelentésbe. A találmány alkalmas anyagai és eljárásai szorosanhomológ nukleotidszekvenciák családjának elkészítésétteszik lehetővé, amely szekvenciákat HCV-vel fertőzöttcsimpánzok plazmájában jelen levő nukleinsavszekven-ciákból származó cDNS-könyvtárból izolálunk. A nuk-leotidszekvenciáknak ez a családja nem emberi és nemcsimpánz eredetű, mivel nem hibridizál sem humán,sem csimpánzgenom-DNS-sel nem fertőzött egyénekesetében, mivel a szekvenciák ezen családjának nukleo-tidjai csak HCV-vel fertőzött csimpánzok májában ésplazmájában vannak jelen, és mivel ez a szekvencianincs jelen a Genebankban. Ezenkívül ezeknek a szek-venciáknak a családja nem mutat szignifikáns homoló-giát azokhoz a szekvenciákhoz, amelyeket a HBV ge-nom tartalmaz. A család egyik tagjának a szekvenciája, amely az5-1-1. kiónon belül található, egy folytonos nyitottleolvasókerettel (ORF) bír, amely egy mintegy 50 ami-nosavas polipeptidet kódol. A HCV-vel fertőzött embe-rekből kapott szérumok tartalmaznak olyan antiteste-ket, amelyek ehhez a polipeptidhez kötődnek, míg anem fertőzött emberekből származó szérumok nem tar-talmaznak antitesteket erre a polipeptidre. Végül bár anem fertőzött csimpánzokból származó szérum nem tar-talmaz antitesteket erre a polipeptidre, az antitestek in-dukálódnak csimpánzokban akut NANBH-fertőzést kö-vetően. Ezenkívül antitestek erre a polipeptidre nemmutathatók ki HAV-val és HBV-vel fertőzött csimpán-zokban és emberekben. Ezen kritériumok alapján aszekvencia cDNS egy vírusszekvenciában, ahol a vírusaz NANBH okozója vagy azzal van összekapcsolva;ezt a cDNS-szekvenciát az 1. ábrában mutatjuk be.Amint a későbbiekben majd tárgyaljuk, az 5-1-1-benlevő cDNS-szekvencia annyiban különbözik a többi izo-lált cDNS szekvenciájától, hogy 28 többletbázispárt tar-talmaz. A cDNS-család más azonosított tagjainak egy össze-tett képződményét, amelyet úgy izoláltunk, hogy az5-1-1. kiónban levő cDNS egy fragmentumával ekvi-valens szintetikus szekvenciát alkalmaztunk vizsgáló-mintaként, a 3. ábrában mutatjuk be. A cDNS-családegyik tagját, amelyet a 81. kiónban levő cDNS-ből szár-mazó szintetikus szekvenciát alkalmazva izoláltunk, az5. ábrában mutatjuk be, és ennek a szekvenciának a81. klón szekvenciájával való összetett képződményéta 6. ábrában mutatjuk be. A cDNS-család más tagjait,ide értve azokat, amelyek a 12f., 14i., 11b., 7f., 7e., 8h.,33c., 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b., 25c., 14c., 8£,33£, 33g., 39c., 35f., 19g. és 15e. kiónokban jelen van-nak, a IV.A. fejezetben írjuk le. Az ezekben a kió-nokban levő cDNS-ek egy összetett képződményét ír-juk le a IV.A. 19. fejezetben, és mutatjuk be a 32. ábrá-ban. Az összetett cDNS azt mutatja, hogy ez egy folya- matos ORF-et tartalmaz, így egy poliproteint kódol. Ezaz adat egybevág azzal a véleménnyel, amelyet a későb-biekben tárgyalunk, hogy a HCV flavivírus vagy fla-viszerű vírus. A cDNS ezen családjának, amelyeket az 1-32. áb-rákban mutatunk be (ideértve a határértékeket is), hoz-záférhetősége lehetővé teszi DNS vizsgálóminták éspolipeptidek előállítását, amelyek alkalmazhatók aHCV-fertőzésnek tulajdonítható NANBH diagnosztizá-lásában és a véradók, az adott vér és vérkészítményekátvizsgálására fertőzöttségre. így például a szekven-ciák alapján mintegy 8-10 nukleotidos DNS-oligome-reket lehet szintetizálni, vagy nagyobbakat, amelyek al-kalmazhatók hibridizációs vizsgálómintaként a vírusge-nom jelenlétének kimutatására például olyan egyénekszérumában, amelyekről feltételezhető, hogy befogad-ták a vírust, vagy az adott vér átvizsgálására a vírus je-lenlétére. A cDNS-szekvenciák családja lehetővé teszia HCV-fajlagos polipeptidek tervezését és előállítását,amely polipeptidek diagnosztikus reagensként alkal-mazhatók NANBH során kialakuló antitestek jelenlé-tének kimutatására. A cDNS-ekből származó tisztí-tott polipeptidek elleni antitesteket is alkalmazhatjukvírusantigének kimutatására fertőzött egyénekben ésvérben.

Ezenkívül a cDNS-szekvenciák családja lehetővé te-szi a HCV genom további jellemzését.

Az ezekből a szekvenciákból származó polinukleo-tid vizsgálómintákat alkalmazhatjuk cDNS-könyvtárakátvizsgálására további átfedő cDNS-szekvenciákra,amelyeket viszont további átfedőszekvenciák megszer-zésére alkalmazhatunk. Hacsak a genom nincs szeg-mensekre osztva és a szegmensek nélkülözik a közösszekvenciákat, ezt a technikát alkalmazhatjuk a teljesgenom szekvenciájának összegyűjtésére. Ha azonban agenom szegmensekre van osztva, a genom további szeg-menseit a lambda-gtl 1 szerológiai átvizsgálóeljárás is-métlésével kaphatjuk meg, amely eljárást az itt leírtcDNS-klónok izolálására alkalmazzuk, vagy egy másikmódszer szerint a genom izolálásával kaphatjuk megtisztított HCV-részecskékből. A cDNS-szekvenciák családja és az ezekből a szek-venciákból származó polipeptidek, valamint az ezek el-len a polipeptidek ellen irányuló antitestek alkalmazha-tók a BB-NANBV ágens vagy ágensek izolálásában ésazonosításában is. így például a cDNS-ekből származópolipeptidekben levő HCV epitópok ellen irányuló anti-testeket alkalmazhatjuk olyan folyamatokban, amelyekaffmitáskromatográfián alapulnak, hogy a vírust izolál-juk. Egy másik eljárás szerint az antitesteket alkalmaz-hatjuk más technikákkal izolált vírusrészecskék azono-sítására. A vírusantigéneket és a genomanyagot az izo-lált vírusrészecskéken belül azután tovább jellemez-hetjük. A HCV-genom vagy -genomok további szekvencia-elemzéséből, valamint a HCV antigének további jellem-zéséből és a genom jellemzéséből kapott információklehetővé teszik további vizsgálóminták, polipeptidek ésantitestek tervezését és szintézisét, amelyeket lehet al-kalmazni NANBH által indukált HCV diagnózisához 9 1

HU 220 204 B 2 és megelőzéséhez, valamint vér és vérszármazék jelle-gű termékek átvizsgálására.

Az NANBH etiológiai ágense azonosítására és izo-lálására szolgáló eljárás keretében cDNS-könyvtáratalakítunk ki egy fertőzött egyénből származó fertőzöttszövetben jelen levő nukleinsavakból. A könyvtárategy olyan vektorban alkotjuk meg, amely lehetővéteszi a cDNS-ben kódolt polipeptidek kifejeződését.A vektort, amely az etiológiai ágens polipeptidjénekimmunológiailag reaktív fragmentumát fejezi ki, tar-talmazó gazdasejtek kiónjait a könyvtár kifejezési ter-mékeinek immunológiai átvizsgálásával választjuk ki.Az izolált kiónokat további immunológiai átvizsgálás-nak vetjük alá és izoláljuk azokat a cDNS-tartalmúvektorokat, amelyek olyan polipeptideket kódolnak,amelyek immunológiailag reagálnak fertőzött egyé-nekből és az ágenssel fertőzésre gyanús egyénekbőlkapott antitestekkel, de nem reagálnak a kontrollegyé-nekkel.

Az ennek az eljárásnak az eredményeképpen izoláltcDNS-ek, ezek kifejezési termékei, és a kifejezési ter-mék ellen irányuló antitestek hasznosak az etiológiaiágens jellemzésében és/vagy kinyerésében. Ezt az eljá-rást alkalmazzuk a HCV genomból származó cDNS-ekcsaládjának izolálására. II.A. A cDNS-szekvencia előállítása

Krónikus HCV-fertőzésben szenvedő és a vírus ma-gas titerét [vagyis legalább 106 csimpánz fertőző dó-zis/ml (CID/ml)] tartalmazó csimpánzból összegyűj-tött szérumot alkalmazunk vírusrészecskék izolálásá-ra; az ezekből a részecskékből izolált nukleinsavakatalkalmazzuk templátként a vírusgenomra vonatkozócDNS-könyvtár megalkotásában. A lambda-gtllolyan vektor, amelyet speciálisan arra fejlesztettek ki,hogy beiktatott (inszertált) cDNS-eket fejezzen kibéta-galaktozidázzal képezett fúziós polipeptidként, ésnagyszámú rekombináns fágot vizsgáljon át meghatá-rozott antigén ellen kialakított fajlagos antiszérumok-kal. A mintegy 200 bázispár átlagos méretű cDNS-ttartalmazó cDNS-készletből kialakított lambda-gtllcDNS-könyvtárat átvizsgáljuk olyan kódolt epitópok-ra, amelyek fajlagosan képesek kötődni olyan betegek-ből eredő szérumokkal, akiknél előzőleg NANB he-patitist tapasztaltak [Huynh T. V. és munkatársai(1985)]. Mintegy 106 fágot vizsgálunk át, és 5 pozitívfágot azonosítunk, tisztítunk, majd átvizsgáljuk köté-si fajlagosságra olyan szérumokhoz, amelyek más, aHCV ágenssel előzőleg fertőzött emberekből és csim-pánzokból származnak. A fágok egyike, az 5—1 — 1, kö-tődik a 8 megvizsgált humán szérum közül 5-höz. Ez akötés, úgy tűnik, szelektív azokból a betegekből szár-mazó szérumokra nézve, akik előzőleg NANB hepati-tisfertőzésen estek át, mivel 7 normális véradó széru-ma nem mutat ilyen kötést.

Az 5-1-1 rekombináns fágban a cDNS szekven-ciáját meghatározzuk, amint ezt az 1. ábrában bemutat-juk. Az ezzel a klónozott cDNS-sel kódolt polipeptidet,amely azonos transzlációs keretben van, mint a fúzióspolipeptid N-terminális béta-galaktozidáz része, a nuk-leotidszekvencia fölött mutatjuk be. Ez a transzlációs ORF tehát olyan epitópot kódol, amelyet NANB hepa-titisfertőzésben szenvedő betegekből származó széru-mok fajlagosan felismernek. A cDNS hozzáférhetősége az 5-1-1 rekombinánsfágban lehetővé teszi más kiónok izolálását, amelyek acDNS további szegmenseit és/vagy alternatív szegmen-seit tartalmazzák a vírusgenomhoz viszonyítva. A fen-tebb leírt lambda-gtll cDNS-könyvtárat átvizsgáljukegy olyan szintetikus polinukleotidot alkalmazva,amely a klónozott 5-1-1 cDNS-szekvenciájából szár-mazik. Ez az átvizsgálás három további kiónt termel,amelyeket 81.; 1-2. és 91. kiónnak azonosítunk; azezekben a kiónokban levő cDNS-eket szekvenciaelem-zésnek vetjük alá (lásd a IV.A.3. és IV.A.4. fejezete-ket). A homológiákat a négy független klón között a2. ábrában mutatjuk be, ahol a homológiákat függőle-ges vonalakkal jelezzük. Azokat a nukleotidszekven-ciákat, amelyek egyediként vannak jelen az 5-1-1.;81. és 91. kiónokban, kisbetűkkel jelöljük.

Az 5-1-1.; 81.; 1-2. és 91. kiónokban levő rekom-bináns fágokban jelen levő klónozott cDNS-ek nagy-mértékben homológok és csak két területben különböz-nek. Először a 67. számú nukleotid az 1-2. kiónbantimidin-, míg a további három klón citidingyököt tartal-maz ezen a helyen. Ez a helyettesítés azonban nem vál-toztatja meg a kódolt aminosav természetét.

Egy további különbség a kiónok között az, hogy az5-1-1. klón 28 bázispárt tartalmaz 5'-terminálisán,amely a többi kiónban nincs jelen. A többletszekvencialehet egy 5’-terminális klónozási „termék”; 5’-termi-nális klónozási termékek gyakran figyelhetők meg acDNS-eljárások termékeiben. A 81. kiónban levő HCV-cDNS 5'-területéből és3'-területéből származó szintetikus szekvenciákat alkal-mazunk a lambda-gtll NANBV cDNS-könyvtárbólvaló olyan cDNS-ek átvizsgálására és izolálására, ame-lyek átfedik a 81. klón-cDNS-t (IV.A.5. fejezet). Azígy létrejövő cDNS-ek szekvenciáit, amely cDNS-ek a36., illetve 32. kiónban vannak, az 5., illetve 7. ábrábanmutatjuk be.

Hasonlóképpen a 36. klón 5'-területén alapuló szin-tetikus polinukleotidot alkalmazunk a lambda-gtllNANBV cDNS-könyvtárból származó cDNS-ek átvizs-gálására és izolálására, amely cDNS-ek átfedik a 36.klón-cDNS-t (IV.A.8. fejezet). Egy rekombináns fágottartalmazó cDNS tisztított kiónját, amely hibridizál aszintetikus polinukleotid vizsgálómintához, 35. kiónnaknevezzük, és az ezen a kiónon belül található NANBVcDNS-szekvenciát a 8. ábrában mutatjuk be. Átfedő cDNS-szekvenciák izolálásának ezt a techni-káját alkalmazva további felfelé és lefelé levő cDNS-szekvenciákat tartalmazó kiónokat kapunk. Ezeknek akiónoknak az izolálását a későbbiekben a IV.A. fejezet-ben írjuk le.

Az izolált kiónokon belül kódolt HCV-cDNS-ek nuk-leotidszekvenciájának elemzése azt mutatja, hogy azösszetett cDNS egy hosszú, folyamatos ORF-et tartal-maz. A 26. ábra mutatja be az ezekből a kiónokból össze-tett cDNS szekvenciáját az ebben kódolt vélt HCV poli-peptiddel együtt. 10 1

HU 220 204 B 2 A HCV-cDNS-könyvtárból és az 5-1-1.; 81.;1-2. és 91. klónokból replikáit lambda-gtll törzseketaz American Type Culture Collectionnél (ATCC;12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) de-ponáltuk a Budapesti Szerződés feltételei szerint; ezekaz alábbi letéti számot kapták: lambda-gtll HC V-cDN S-köny vtár 81. klón 91. klón 1-2. klón 5-1-1. klón A letét napja1987. december 1.1987. november 17.1987. november 17.1987. november 17.1987. november 18. 10 ATCC40394 40388 40389 40390 40391

Ezek a deponált törzsek és más, itt említett deponálttörzsek csak a könnyebb alkalmazást szolgálják, ésnem feltétlenül szükségesek a jelen találmány gyakor-latba vételéhez a leírás alapján. Az összes deponáltanyagban levő HCV-cDNS-szekvenciák referenciakéntépülnek be a jelen bejelentésbe. A fenti leírás, amelyben a genomot „sétáltatjuk” át-fedő cDNS-szekvenciákat izolálva a HCV lambda-gtl 1könyvtárból, olyan eljárást nyújt, amellyel a teljesHCV genomnak megfelelő cDNS-ek izolálhatok. Az ittmegadott információk alapján más, ezeknek a cDNS-eknek az izolálására szolgáló eljárások nyilvánvalókazok számára, akik a szakterületen jártasak (lásd aIV.A. fejezetet is). II.B. Viruspolipeptidek és fragmentumaik előállítása A cDNS-szekvenciák hozzáférhetősége, akár azo-ké, amelyeket az 1-32. ábrákban levő cDNS-szekven-ciák alkalmazásával izolálunk (amint ezt később leír-juk), akár az ezekben az ábrákban levő cDNS-szekven-ciáké, lehetővé teszik a bármelyik szálban kódolt poli-peptid antigén szempontból aktív területét kódoló kife-jezővektorok megalkotását. Ezek az antigén szempont-ból aktív területek származhatnak a burkoló vagy „bu-rok”-antigénekből, vagy a belső antigénekből, ideértvepéldául a polinukleotidkötő fehéijéket, polinukleotidpolimerázt vagy polimerázokat és más olyan vírusfehér-jéket, amelyek szükségesek a vírusrészecskék repliká-ciójához és/vagy összeállításához. A kívánt polipepti-deket kódoló fragmentumok a cDNS-klónokból állítha-tók elő hagyományos restrikciós emésztést vagy szinte-tikus eljárásokat alkalmazva, és olyan vektorokba van-nak ligáivá, amelyek tartalmazhatják például fúziósszekvenciák részeit; ilyen fúziós szekvenciák lehetnekpéldául a béta-galaktozidáz vagy szuperoxiddiszmutáz(SÓD), előnyösebb az SÓD. Azok az eljárások és vekto-rok, amelyek olyan polipeptidek előállítására alkalma-sak, amelyek SÓD fúziós szekvenciáit tartalmazzák, azEP 0196056 számú közzétételi iratban vannak leírva.SÓD és HCV polipeptidek fúziós polipeptidjeit, vagyisaz NANB5_1_l-et, NANBgl-et és C100-3-at - ame-lyek HCV-cDNS-ek összetett termékében kódolód-nak - kódolóvektorokat a IV.B.l., IV.B.2., illetve IV.B.4.fejezetekben írjuk le. Egy nyitott leolvasókeretet tartal-mazó HCV-cDNS bármilyen kívánt részét, bármelyik„értelmes” szálban, megkaphatjuk rekombináns poli-peptidként, úgymint érett, vagy fúziós fehérjét; egy má-sik módszer szerint a cDNS-ben kódolt polipeptidet ké-miai szintézissel kaphatjuk meg. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A kívánt polipeptidet kódoló DNS-t, akár fúziósvagy érett formában van, akár tartalmaz egy szignál-szekvenciát a kiválasztás lehetővé tételére, akár nem,ligálhatjuk bármilyen megfelelő gazdaszervezethez al-kalmas kifejezővektorba. Mind eukarióta, mind proka-rióta rendszerek alkalmazhatók rekombináns polipepti-dek képzésére; több közös szabályozórendszer és gazda-sejtvonal összefoglalása szerepel a III.A. fejezetben.A polipeptidet azután a lizált sejtekből vagy a tenyész-közegből izoláljuk, és addig a mértékig tisztítjuk,amely szándékolt felhasználásához szükséges. A tisztí-tás a szakterületen ismert technikákkal lehetséges, pél-dául sófrakcionálással, ioncserélő gyantán végzett kro-matografálással, affinitáskromatográfíával, centrifügá-lással és hasonlókkal. A Methods in Enzymology címűsorozat számos módszert közöl fehérjék tisztítására. Azilyen polipeptidek alkalmazhatók diagnosztikumként,vagy azokat, amelyek semlegesítő antitesteket idéznekelő, vakcinákká szerelhetjük ki. Az ezek ellen a polipep-tidek elleni antitesteket is alkalmazhatjuk diagnoszti-kumként, vagy passzív immunterápiához. Ezenkívül,amint ezt a későbbi II.J. fejezetben leírjuk, az ezenpolipeptidek elleni antitestek alkalmasak HCV-részecs-kék izolálására és azonosítására. A HCV antigének izolálhatok HCV-virionokból is.A virionok HCV-vel fertőzött sejtekben szövettenyé-szetben, vagy valamely fertőzött gazdaszervezetben te-nyészthetők. II.C. Antigén polipeptidek előállítása

Valamely polipeptid antigén területe általában vi-szonylag kicsiny - tipikusan 8-10 aminosav hosszúsá-gú vagy rövidebb. Akár 5 aminosavból álló fragmentu-mok is jellemezhetnek már egy antigén területet. Követ-kezésképpen a HCV-cDNS-ét alkalmazva alapként aHCV polipeptidek rövid szegmenseit kódoló DNS-eketakár fúziós fehérjeként, akár izolált polipeptidként fe-jezhetjük ki. Ezenkívül rövid aminosavszekvenciákatkönnyen megkaphatunk kémiai szintézissel. II.D. HCV epitópok elleni antitestek előállítása A fentebb leírtak szerint előállított immunogén poli-peptideket alkalmazhatjuk mind poliklonális, mind mo-noklonális antitestek előállítására. Ha poliklonális anti-testeket kívánunk előállítani, egy kiválasztott emlőst(például egeret, nyulat, kecskét, lovat stb.) immunizá-lunk valamely, HCV epitópot vagy epitópokat hordozóimmunogén polipeptiddel. Az immunizált állatból a szé-rumokat összegyűjtjük, és ismert eljárások szerint ke-zeljük. Ha egy HCV epitóp elleni poliklonális antiteste-ket tartalmazó szérum más antigén elleni antitestekettartalmaz, a poliklonális antitesteket immun-affmitás-kromatográfiával tisztíthatjuk. A poliklonális antiszé-rumok tisztítására és feldolgozására szolgáló technikáka szakterületen ismertek, lásd például Mager és Walkermunkáját (1987).

Egy másik módszer szerint poliklonális antiteste-ket izolálhatunk olyan emlősből, amelyet előzőlegHCV-vel fertőztünk. Az V.E. fejezetben adunk példátHCV epitópok elleni antitestek tisztítására fertőzöttegyénekből származó szérumból, az eljárás affinitás-kromatográfián alapul, és SÓD fúziós polipeptidet és 11 1

HU 220 204 B 2 egy, az 5-1-1. cDNS-klónon belül kódolt polipepti-det hasznosít. HCV epitópok ellen irányuló monoklonális antites-teket bárki, aki a szakterületen járatos, könnyen készít-het. Az általános módszertan monoklonális antitestekelőállítására hibridómákkal jól ismert. Nem pusztulóvátett, antitesttermelő sejtvonalakat alakíthatunk ki sejtfú-zióval vagy más technikákkal, például B-limfociták köz-vetlen transzformálásával onkogén DNS-sel, vagyEpstein-Barr vírussal végzett átfertőzéssel [lásd pél-dául Schreier M. és munkatársai (1980); Haemmerlingés munkatársai (1981); Kennett és munkatársai (1980);a 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887;4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 és 4,493,890 lajstrom-számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírá-sok]. HCV epitópok ellen termelt monoklonális antites-tek paneljeit különböző tulajdonságokra vizsgálhatjukát (például izotípus, epitópaffmitás stb.). II.E. Diagnosztikus oligonukleotid vizsgálóminták éskészletek

Alapként az izolált HCV bemutatott részleteit alkal-mazva, ideértve azokat, amelyeket az 1-32. ábrákbanmutatunk be, mintegy 8 vagy több nukleotidból állóoligomereket állítunk elő, vagy kimetszéssel vagy szin-tézissel, amely oligomerek hibridizálnak a HCV ge-nommal, és alkalmasak a víruságens vagy -ágensekazonosítására, a vírusgenom vagy -genomok továbbijellemzésére, valamint a vírus vagy vírusok kimutatásá-ra beteg egyénekben. Ezek a HCV polinukleotidokhozszolgáló vizsgálóminták (természetesek vagy származé-kok) olyan hosszúságúak, hogy hibridizálással lehetsé-ges legyen egy egyedi vírusszekvencia kimutatása.6-8 nukleotid már munkába fogható hosszúság,10-12 nukleotid előnyös, és mintegy 20 nukleotid tű-nik optimálisnak. Ezek a szekvenciák előnyösen olyanterületekből származnak, amelyek nélkülözik a hetero-gén jelleget. Ezeket a vizsgálómintákat rutinmódszere-ket alkalmazva állíthatjuk elő, ideértve az automatizáltoligonukleotidszintézis eljárásait. Az alkalmas vizs-gálóminták között találjuk például az 5 -1 -1. kiónt, va-lamint több, itt ismertetett kiónt, továbbá különböző oli-gomereket, amelyek cDNS-könyvtárak átvizsgálásáraalkalmasak, ilyeneket a későbbiekben ismertetünk.A komplementaritás a HCV genom bármely egyedi ré-szére megfelelő lehet. Vizsgálómintaként való alkalma-záshoz teljes komplementaritás kívánatos, bár ez szük-ségtelen is lehet, amikor a fragmentum hossza megnö-vekszik.

Abból a célból, hogy az ilyen vizsgálómintákatdiagnosztikumként alkalmazhassuk, az analizálandóbiológiai mintát, például vért vagy szérumot, kezeljük,ha kívánatos, hogy extraháljuk a bennük levő nuklein-savakat. A mintából származó nukleinsavakat gélelekt-roforézisnek vagy más méret szerinti elkülönítésnekvetjük alá; egy másik módszer szerint a nukleinsava-kat foltként feljuttathatjuk méret szerinti elkülönítésnélkül. A vizsgálómintákat azután jelzéssel látjuk el.A megfelelő jelzések, és az eljárások a vizsgálómintákjelzésére ismeretesek a szakterületen, ezek között talál-juk például a radioaktív jelzést, amelyet hézag- (nick-) transzlációval vagy kinázos kezeléssel vezetünk be, abiotint, a fluoreszcens vizsgálómintákat és a kemi-lumineszcens vizsgálómintákat. A mintából kivontnukleinsavakat azután megfelelő szigorúságú hibridi-zációs körülmények között kezeljük a jelzett vizsgáló-mintával. A vizsgálómintákat a HCV genom teljes komple-mentereként készíthetjük el. Általában várható, hogy a HCV genomszekvenciáka fertőzött egyének szérumában viszonylag alacsonyszinten vannak jelen; ez mintegy ΙΟ2—103 szekven-cia/ml. Ez a szint szükségessé teheti, hogy sokszorozásitechnikákat alkalmazzunk a hibridizációs vizsgálatok-ban. Az ilyen technikák a szakterületen ismertek. ígypéldául az Enzo Biochemical Corporation „Bio-Bridge” rendszere terminális dezoxinukleotid-transzfe-rázt alkalmaz, hogy nem módosított 3’-poli-dT-far-kakat adjon egy DNS-vizsgálómintához. A poli-dT-fa-rokkal ellátott vizsgálóminta hibridizál a cél-nukleotid-szekvenciához, majd egy biotinnal módosított poli-A-hoz. Az EP 124221 számú közzétett bejelentés olyanDNS-hibridizációs vizsgálatot ír le, amelyben: (1) azelemzendő anyagot egy olyan egyszálú DNS-vizsgáló-mintához kötik, amely komplementer egy enzimmel jel-zett oligonukleotiddal; és (2) az így létrejövő, farokkalellátott duplexet egy enzimmel jelzett oligonukleotid-hoz hibridizálják. Az EP 204510 közzétett bejelentésolyan DNS-hibridizációs vizsgálatot ír le, amelyben avizsgálandó DNS-t egy olyan vizsgálómintával hozzukérintkezésbe, amelynek farka, például poli-dT-farka ésegy sokszorozószála van, amelynek olyan szekvenciájavan, amely hibridizál a vizsgálóminta farkához, példáulpoli-A-szekvencia, és amely képes a jelzett szálak több-ségéhez kötődni. Egy különösen alkalmas technika elő-ször magában foglalhatja a cél-HCV-szekvenciák sok-szorozását a szérumban mintegy 10 000-szeresre, vagy-is mintegy 106 szekvencia/ml-re. Ez kivihető példáulSaiki és munkatársai technikájával (1986). Ez a hibridi-zációs vizsgálat, amely kimutathatja a szekvenciákat106/ml szinten, olyan nukleinsavmultimereket alkal-maz, amelyek egy egyszálú vizsgálandó nukleinsavhozkötődnek, és amelyek kötődnek egyszálú jelzett oligo-nukleotidok sokaságához is. Egy megfelelő oldatfázisúszendvicsvizsgálat, amelyet alkalmazhatunk a jelzettpolinukleotid vizsgálómintákkal, és eljárások az ilyenvizsgálóminták előállítására az EP 225 807 számú köz-zétételi iratban vannak leírva. A vizsgálóminták diagnosztikus készletekbe lehet-nek csomagolva. A diagnosztikus készletek tartalmazhat-ják a vizsgálóminta-DNS-t, amely jelezve lehet; egy má-sik eljárás szerint a vizsgálóminta-DNS jelzetlen és a jel-zéshez szükséges alkotórészek a készletben találhatók.A készlet tartalmazhat más alkalmasan becsomagolt rea-genseket és anyagokat is, amelyek a szóban forgó hibri-dizációs munkamenethez szükségesek, például standar-dok, valamint útmutatások a vizsgálat kivitelezésére. II.F. Immunesszé- és diagnosztikus készletek

Mindkét polipeptid, amely immunológiailag reagála HCV antitesteket tartalmazó szérummal, példáulazokkal az antitestekkel, amelyek a IV.A. fejezetben le- 12 1

HU 220 204 B 2 írt kiónokból származnak vagy azon belül kódolnak,vagy ezek származékaival (lásd a IV.A. fejezetet), ésazokkal az antitestekkel, amelyek az ezekben a polipep-tidekben levő HCV-fajlagos epitópok ellen alakulnakki, alkalmazhatók immunesszékben HCV antitestek je-lenlétének kimutatására vagy a vírus és/vagy vírusanti-gének kimutatására biológiai mintákban, ideértve avér- vagy szérummintákat. Az immunesszék tervezésé-ben sokféle változat érvényesülhet, ezek a szakterüle-ten jól ismertek. így például alkalmazható egy vírusanti-gén, például egy olyan polipeptid, amely a IV.A. feje-zetben leírt HCV-cDNS-t tartalmazó kiónok bármelyi-kéből származó polipeptid, vagy abból a HCV genom-ból származó polipeptid, amely genomból a cDNS ezek-ben a kiónokban származik; egy másik módszer szerintaz immunesszé az ezekből a forrásokból származóvírusantigének kombinációját alkalmazhatja. Lehet al-kalmazni például olyan monoklonális antitestet, amelyegy vírusepitóp vagy -epitópok ellen irányul; egy vírus-antigén ellen irányuló monoklonális antitestek kombiná-cióját; azonos vírusantigén ellen irányuló poliklonálisantitesteket; vagy eltérő vírusantigének ellen irányulópoliklonális antitesteket. A munkamenet alapulhat pél-dául versengésen, vagy közvetlen reakción, vagy szend-vics típusú vizsgálatokon. A munkamenetek alkalmaz-hatnak például szilárd rögzítőanyagokat is, vagy végez-hető a vizsgálat immunkicsapással is. A legtöbb vizsgá-lat magában foglalja jelzett antitest vagy polipeptid al-kalmazását; a jelzés lehet például fluoreszcens, kemilu-mineszcens, radioaktív vagy festékmolekula. Ismerete-sek olyan vizsgálatok is, amelyekben a vizsgálómintá-ból származó szignálok sokszorozva vannak, ilyenekrepéldák azok a vizsgálatok, amelyek biotint vagy avidintalkalmaznak, valamint az enzimjelzett és enzimközvetí-tett immunesszék, mint például az ELISA-vizsgálatok. A HCV flavivírusmodellje lehetővé teszi a becslése-ket a diagnosztikus epitópok valószínű elhelyezkedésétilletően a virion szerkezeti fehérjéknél. A C, pre-M ésE tartományok valószínűleg mind tartalmaznak vírus-antigének kimutatására jelentős potenciállal bíró epitó-pokat, amelyek elsősorban diagnózis céljára szolgálhat-nak. Hasonlóképpen a nem szerkezeti fehérjék tartomá-nyai is várhatóan tartalmaznak fontos diagnosztikus epi-tópokat (például N55, amely egy vélt polimerázt kódol;és NS1, amely egy vélt komplementkötő antigént kó-dol). Azok a rekombináns polipeptidek, vagy víruspoli-peptidek, amelyek epitópokat foglalnak magukbanezekből a fajlagos tartományokból, alkalmasak lehet-nek vírusantitestek kimutatására véradók vagy fertőzöttbetegek vérében.

Olyan készleteket, amelyek immundiagnózishoz al-kalmasak és tartalmazzák a megfelelő jelzett reagen-seket, a megfelelő anyagok megfelelő csomagolásbanmegfelelő tárolóedényekbe való elhelyezésével alakít-hatunk ki, beleértve a jelen találmány szerinti polipep-tideket, amelyek HCV epitópokat tartalmaznak, vagyolyan antitesteket, amelyek HCV epitópok ellen irá-nyulnak, a további reagensekkel és anyagokkal, ame-lyek a vizsgálat kivitelezéséhez szükségesek, valaminta vizsgálati instrukciók megfelelő leírásával együtt. II.F. A HCV genom, virionok és vírusantigének további jellemzése a virusgenomhoz tartozó cDNS-böl szárma- zó vizsgálómintákat alkalmazva A HCV-cDNS-szekvencia-információkat, amelyeka IV.A. fejezetben található kiónokban és az 1-32. áb-rákban találhatók, alkalmazhatjuk további információkgyűjtésére a HCV genom szekvenciájával kapcsolat-ban, valamint a HCV ágens azonosításához és izolálásá-hoz, így ezek segítséget nyújthatnak a jellemzéshez, be-leértve a genom természetét, a vírusrészecskék szerke-zetét és azoknak az antigéneknek a szerkezetét, ame-lyekből ezek össze vannak állítva. Ezek az információkviszont további polinukleotid vizsgálómintákhoz, HCVgenomból származó polipeptidekhez és HCV epitópokellen irányuló olyan antitestekhez vezethetnek, ame-lyek alkalmasak lehetnek a HCV által okozott NANBHdiagnózisához és/vagy kezeléséhez. A fentebb említett kiónokban levő cDNS-szekven-cia-információk alkalmasak vizsgálóminták tervezésé-re további cDNS-szekvenciák izolálására, amelyek an-nak a HCV genomnak vagy genomoknak még nem defi-niált területeiből származnak, amelyekből a IV.A. feje-zetben leírt kiónokban levő cDNS-ek származnak. ígypéldául mintegy 8 vagy több nukleotidot, előnyösen20 vagy több nukleotidot, amelyek az 1., 3., 6., 9., 14.és 32. ábrákban bemutatott HCV-cDNS-szekvenciákcsaládjának 5’-terminálisához vagy 3’-terminálisáhozközeli területből származnak, tartalmazó szekvenciáttartalmazó jelzett vizsgálómintákat alkalmazhatunk át-fedő cDNS-szekvenciák izolálására HCV-cDNS-könyv-tárakból. Ezek a szekvenciák, amelyek a cDNS-eket át-fedik a fentebb említett kiónokban, de amelyek olyanszekvenciákat is tartalmaznak, amelyek azokból a ge-nomterületekből erednek, amelyekből cDNS-ek a fen-tebb említett kiónokban nem származnak, alkalmazha-tók ezután vizsgálóminták szintéziséhez más, olyan át-fedőfragmentumok izolálásához, amelyek nem szükség-szerűen fedik át a IV.A. fejezetben leírt kiónokban levőcDNS-eket. Hacsak a HCV genom nincs szegmentálvaés a szegmensekből hiányoznak a közös szekven-ciák, lehetséges a teljes vírusgenom vagy -genomokszekvenciaelemzése a vírusgenomból vagy -genomok-ból származó átfedő cDNS-ek izolálásának technikájátalkalmazva. Bár ez nem valószínű, ha a genom olyanszegmensekből álló genom, amelyekből hiányoznak aközös szekvenciák, a genom szekvenciáját úgy határoz-hatjuk meg, hogy lambda-gtl 1 HCV-cDNS-könyvtáratszerológiai módszerekkel vizsgáljuk át, amint ezt az5 -1 -1. klón izolálásánál alkalmazzuk, a cDNS-izolátu-mokat szekvenciaelemzésnek vetjük alá, és az izoláltcDNS-eket alkalmazzuk átfedőfragmentumok izolálásá-ra, azt a technikát alkalmazva, amelyet a kiónok izolálá-sára, és szekvenciaelemzésére a IV.A. fejezetben írunkle. Az izolált genomszekvenciákat azután klónozhat-juk, és szekvenciájukat elemezhetjük. így az itt nyújtottinformációval lehet a HCV genomot vagy genomokatklónozni, és szekvenciájukat elemezni természetüktőlfüggetlenül. A cDNS-könyvtárak megalkotásának eljárásai isme-retesek a szakterületen. A HCV-cDNS-könyvtárak meg- 13 1

HU 220 204 B 2 alkotására szolgáló egyik eljárást a IV.A. fejezetben tár-gyaljuk. A cDNS-könyvtárak azonban, amelyek alkal-masak nukleinsav vizsgálóminták átvizsgálására, meg-alkothatok más, a szakterületen ismert vektorban is, pél-dául lambda-gtlO-ben [Huynh és munkatársai (1985)].Az 1-32. ábrákban levő cDNS-ekből származó, vizs-gálómintákkal kimutatott és az ezekből a cDNS-ekbőlszármazó polinukleotidokból szintetizált vizsgálómin-tákból eredő HCV eredetű cDNS-t a klónból izolálhat-juk az izolált polinukleotid emésztésével megfelelő rest-rikciós enzimmel vagy enzimekkel, majd szekvencia-elemzésnek vethetjük alá (lásd a IV.A.3. és IV.A.4. feje-zeteket azoknak a HCV-cDNS-eknek az izolálására ésszekvenciaelemzésére alkalmazott technikákkal kapcso-latban, amelyek átfednek HCV-cDNS-t az 5-1-1.kiónban; a IV.A.5-IV.A.7. fejezeteket azoknak aHCV-cDNS-eknek az izolálására és szekvenciaelemzé-sére alkalmazott technikákkal kapcsolatban, amelyek át-fednek HCV-cDNS-t a 81. kiónban; és a IV.A.8. ésIV.A.9. fejezeteket egy olyan klón izolálásával és szek-venciaelemzésével kapcsolatban, amely egy másikolyan kiónt (36. klón) fed át, amely a 81. kiónt fedi át).

Az ezekből az átfedő HCV-cDNS-ekből eredő szek-venciainformációk alkalmasak a vírusgenomon vagy-genomokon belül a homológia és heterogenitás terüle-teinek meghatározására, amelyek jelezhetik a genom kü-lönböző törzseinek jelenlétét és/vagy a hiányos részecs-kék populációjának jelenlétét. Ez alkalmas hibridizá-ciós vizsgálóminták tervezésére is HCV vagy HCV anti-gének vagy HCV nukleinsavak kimutatására biológiaimintákban, és a HCV izolálása során, azt a technikát al-kalmazva, amelyet a II.D. fejezetben írtunk le. Az átfe-dő cDNS-eket alkalmazhatjuk kifejező vektorok megal-kotására is olyan HCV genomból vagy genomokbólszármazó polipeptidekhez, amely genomok az 5-1-1.;36.; 81.; 91.; és 1—2. kiónokban és más, a IV.A. fejezet-ben leírt kiónokban kódolt polipeptideket is kódolnak.Az ezeknek a HCV epitópokat tartalmazó polipeptidek-nek megalkotására szolgáló technikák, valamint az eze-ken belül található HCV epitópok ellen irányuló antites-tekhez szolgáló technikák, valamint ezek alkalmazásaianalógok azzal, amelyet az 5-1-1.; 32.; 35.; 36.; 1-2.;81. és 91. kiónokon belül található NANBV cDNS-szek-venciákból származó polipeptideknél leírunk.

Az 5-1-1.; 32.; 35.; 36.; 81.; 91.; 1-2. és más, aIV.A. fejezetben leírt kiónokban található cDNS-szek-venciáján belül kódolva vannak olyan epitópot tartal-mazó antigének, amelyek egyedinek tűnnek. HCV-re;vagyis azok az antitestek, amelyek ezek ellen az antigé-nek ellen irányulnak, hiányoznak azokból az egyének-ből, amelyek HAV-val vagy HBV-vel vannak fertőz-ve, valamint azokból az egyénekből, akik nincsenekHCV-vel fertőzve (lásd a szerológiai adatokat, ame-lyeket a IV.B. fejezetben mutatunk be). Sőt ezencDNS-ek szekvenciainformációjának összehasonlítása aHAV-, HBV-, HDV-szekvenciákkal és a Genebank-ban levő szekvenciákkal azt is jelzi, hogy csak minimá-lis homológia létezik ezek között a cDNS-ek és a fen-ti forrásokból származó polinukleotidszekvenciákközött. HCV-részecskéket izolálhatunk BB-NANBV-vel fer-tőzött egyének szérumaiból vagy sejttenyészetekből aszakterületen ismert bármely eljárással, ideszámítva pél-dául a méretelkülönítésen alapuló technikákat, példáulaz ülepítési vagy kizárásos eljárásokat, vagy a sűrűségenalapuló technikákat, például az ultracentrifugálást sűrű-séggradiensben, vagy a kicsapást bizonyos szerekkel,például polietilénglikollal, vagy a kromatográfiát külön-böző anyagokon, például anion- vagy kationcserélőanyagokon, és olyan anyagokon, amelyek hidrofobicitásalapján körnek, valamint affinitásoszlopokon. Az izolálá-st eljárás során a HCV jelenlétét az extrahált genom hib-ridizációs elemzésével mutathatjuk ki, olyan vizsgáló-mintákat alkalmazva, amelyek a fentebb leirt HCV-cDNS-ekből származnak, vagy immunesszével mutat-hatjuk ki (lásd a II.F. fejezetet), vizsgálómintaként olyanantitesteket alkalmazva, amelyek az 1-32. ábrákban be-mutatott cDNS-szekvenciák családján belül kódoltHCV antigének ellen irányulnak, vagy amelyek a fen-tebb tárgyalt átfedő HCV-cDNS-szekvenciákon belülkódolt HCV antigének ellen irányulnak. Az antitestek le-hetnek monoklonálisok vagy poliklonálisok, és kívána-tos lehet az antitestek megtisztítása az immunesszébenvaló felhasználásuk előtt. Az 5-1-1. kiónon belül kó-dolt antigén vagy antigének ellen irányuló polikloná-lis antitestek tisztítási munkamenetét a IV.E. fejezetbenújuk le. A tisztítási munkamenet során a HCV jelenlétét nuk-leinsavhibridizálással mutathatjuk ki és/vagy igazolhat-juk, vizsgálómintaként az 1-32. ábrákban bemutatottHCV-cDNS-szekvenciák családjából származó, vala-mint a fentebb leírt átfedő HCV-cDNS-szekvenciákbólszármazó polinukleotidokat alkalmazva. A tisztított készítményekből való vírusrészecskéketazután tovább jellemezhetjük. A genom nukleinsavattisztítjuk. RNázra való érzékenysége és DNáz I-re valóérzéketlensége alapján úgy tűnik, hogy a vírus RNS-genomból áll (lásd a későbbi IV.C.2. példát). Az össze-fonódottságot és kör alakba szervezettséget vagy köralakba nem szervezettséget olyan technikákkal határoz-hatjuk meg, amelyek a szakterületen ismertek, ilyenekpéldául ennek megjelenítése elektronmikroszkópiával,ennek vándorlása sűrűséggradiensben, és ennek ülepe-dési jellemzői. A befogott HCV genom hibridizálá-sa alapján a HCV-cDNS-ek negatív szálaihoz úgy tű-nik, hogy a HCV egy pozitív szálú RNS-genomból áll-hat (lásd a IV.H.l fejezetet). Ezek olyan technikák,amelyeket például a METHODS IN ENZYMOLOGYcímű sorozatban ismertetnek. Ezenkívül a tisztítottnukleinsavakat klónozhatjuk és szekvenciájukat ele-mezhetjük ismert technikákkal, ideértve a reverz transz-kripciót, mivel a genomanyag RNS [lásd például Ma-niatis (1982) és Glover (1985)]. A vírusrészecskékbőlszármazó nukleinsavakat alkalmazva lehetséges a tel-jes genom szekvenciaelemzése, akár szegmentálvavan, akár nincs. A 14i-39c. kombinált kiónok (lásd 26. ábra) fo-lyamatos ORF-jein belül kódolt polipeptid homológiá-jának vizsgálata azt mutatja, hogy a HCV polipep-tid homológiaterületeket tartalmaz a flavivírusok meg- 14 1

HU 220 204 B 2 őrzött területeiben levő megfelelő fehérjékkel.Erre példát is adunk meg a IV.H.3 fejezetben. Ez afelfedezés nagyon fontos következményekkel jár.Először ez a bizonyíték azokkal az eredményekkelegyütt, amelyek azt mutatják, hogy a HCV pozitív szá-lú genomot tartalmaz, amelynek mérete mintegy10 000 nukleotid, egybevág azzal a sejtéssel, hogy aHCV flavivírus vagy flaviszerű vírus. A flavivírusvirionok és genomjaik viszonylag következetes szer-kezettel és szerveződéssel bírnak, amelyek ismertek[lásd Rice és munkatársai (1980) és Brinton M. A.(1988)]. így a C, pre-M/M és E polipeptideket kódolóstruktúrgének a genom 5'-terminálisában helyezked-hetnek el a 14i. klóntól fölfelé. Ezenkívül az összeha-sonlítást alkalmazva más flavivírusokkal, előre jelez-hetjük az ezeket a fehérjéket kódoló szekvenciák pon-tos elhelyezkedését. A 14i. kiónban levő szekvenciáktól fölfelé levőszekvenciák izolálását sokféle módon végezhetjük,amelyek az itt megadott információk alapján nyilván-valóak azok számára, akik a szakterületen jártasak. ígypéldául a genom-„sétáltatási” technikát alkalmazhatjuktovábbi szekvenciák izolálására, amelyek 5'-iránybanvannak a 14i. kiónban levő szekvenciáktól, de amelyekátfedik ezt a kiónt; ez viszont további szekvenciák izolá-lásához vezet. Ezt a technikát a IV.A. fejezetben tár-gyaljuk. Ismeretes például az is, hogy a flavivírusoknakvannak megőrzött epitopjaik, és megőrzött nuklein-savszekvenciák területeivel is rendelkeznek. A megőr-zött szekvenciákat tartalmazó polinukleotidokat olyanvizsgálómintaként alkalmazhatjuk, amelyek a HCVgenomhoz kötődnek, így lehetővé válik ezek izolálása.Ezenkívül ezeket a megőrzött szekvenciákat azokkalegyütt, amelyek a 22. ábrában bemutatott HCV-cDNS-ből származnak, alkalmazhatjuk primerek tervezéséreolyan rendszerekben való felhasználásra, amelyek sok-szorozzák a 14i. kiónban levő szekvenciáktól fölfe-lé levő genomszekvenciákat, a polimeráz-láncreakciótechnológiát alkalmazva. Erre a későbbiekben adunkpéldát. A HCV szerkezetét is meghatározhatjuk és kompo-nenseiket izolálhatjuk. A morfológiát és méretét meg-határozhatjuk például elektronmikroszkópiával. A faj-lagos víruspolipeptidantigének, például a burkolativagy „boríték”-antigének, vagy belül levő antigének,mint például nukleinsavkötő fehérjék, belső (mag)anti-gének és polinukleotid polimerázok azonosítása és el-helyezkedése szintén meghatározható például azt meg-határozva, vajon az antigének nagyobb vagy kisebb ví-ruskomponensekként vannak-e jelen, vagy olyan anti-testeket alkalmazva vizsgálómintaként, amelyek azizolált cDNS-eken belül kódolt fajlagos antigének el-len irányulnak. Ez az információ hasznos vakcinák ter-vezésében, így például előnyös, ha külső antigén ta-lálható egy vakcinakészítményben. Multivalens vakci-nák tartalmazhatnak egy szerkezeti fehérjét, például E.fehérjét, kódológenomból származó polipeptidet, vala-mint a genom egy másik részéből való polipepti-det, például valamely szerkezeti vagy nem szerkezetipolipeptidet. III. Általános módszerek A genomnak a vírusból való kivonásában, egycDNS-könyvtár előállításában és átvizsgálásában, kió-nok szekvenciaelemzésében, kifejezővektorok megal-kotásában, sejtek transzformálásában, immunológiaivizsgálatok, például radioimmunesszé- és ELISA-vizs-gálatok kivitelezésében, sejtek tenyészetben való nö-vesztésében stb. alkalmazott általános technikák ismere-tesek a szakterületen, és számos laboratóriumi kézi-könyv áll rendelkezésre, amely ezeket a technikákat le-írja. Általános vezérfonalként azonban az alábbiakbanismertetünk néhány forrást, amely az ilyen munkamene-tekhez rendelkezésre áll, és bizonyos anyagokat, ame-lyek ezek kivitelezéséhez alkalmazhatók. III.A. Gazdaszervezetek és kifejező szabályozószek-venciák

Mind prokarióta, mind eukarióta gazdasejteket al-kalmazhatunk kívánt kódolószekvenciák kifejeződésé-hez, amikor megfelelő szabályozószekvenciákat, ame-lyek összeférhetők a tervezett gazdaszervezettel, alkal-mazunk. A prokarióta gazdaszervezetek közül az E. co-lit alkalmazzuk a leggyakrabban. A prokariótákhoz al-kalmazott kifejezést szabályozó szekvenciák között ta-láljuk a promotorokat, amelyek kívánt esetben operátor-részeket tartalmaznak, és riboszómakötő helyeket.A prokarióta gazdaszervezetekkel összeférhető transz-fer vektorok általában például a pBR322-ből származ-nak, amely ampicillin- és tetraciklinrezisztenciát átadóoperonokat tartalmazó plazmid, vagy a pUC vektorok-ból származnak, amelyek szintén tartalmaznak antibioti-kumrezisztencia-markereket átadó szekvenciákat. Eze-ket a markereket alkalmazhatjuk a sikeres transzfor-mánsok kinyerésére szelekció révén. Az általánosan al-kalmazott prokarióta szabályozószekvenciák között ta-láljuk a béta-laktamáz (penicillináz) és laktóz promotor-rendszereket [Chang és munkatársai (1977)], a tripto-fán (trp) promotorrendszert [Goeddel és munkatársai(1980)], a lambda eredetű PL promotort és N génriboszómakötő helyet [Shimatake és munkatársai(1981) és a hibrid tac promotort (De Boer és munkatár-sai (1983)], amely a trp és lac UVS promotorok szek-venciáiból származik. A felsorolt rendszerek különösenösszeférhetők E. colival; ha szükséges, más prokariótagazdaszervezeteket is alkalmazhatunk, például Bacillusvagy Pseudomonas törzseket, megfelelő szabályozó-szekvenciákkal.

Az eukarióta gazdaszervezetek magukban foglal-ják az élesztőket és emlőssejteket a tenyésztőrendsze-rekben. A Saccharomyces cerevisiae és a Saccharo-myces carlsbergensis a leggyakrabban alkalmazottélesztő gazdaszervezetek, és alkalmas gomba-gazda-szervezetek. Az élesztővel összeférhető vektorokolyan markereket hordoznak, amelyek lehetővé teszika sikeres transzformánsok kiválasztását olyan módon,hogy prototrófiát adnak auxotróf mutánsoknak, vagyrezisztenciát nyújtanak nehézfémekre vad típusú tör-zseknél. Az élesztővel összeférhető vektorok alkal-mazhatják a 2 mikronos replikációs origót [Broach ésmunkatársai (1983)], a CEN3 és ARS1 kombináció-ját, vagy más olyan eszközöket, amelyek replikációt 15 1

HU 220 204 B 2 biztosítanak, például olyan szekvenciákat, amelyekegy megfelelő fragmentum beépülését eredményezika gazdasejtgenomba. Az élesztővektorokhoz való sza-bályozóvektorok ismeretesek a szakterületen, ezekközé tartoznak a glikolitikus enzimek szintéziséheztartozó promotorok [Hess és munkatársai (1968); Hol-land és munkatársai (1978)], közöttük a 3-foszfogli-cerátkináz [Hitzeman (1980)]. Terminátorok is érten-dők ide, például azok, amelyek az enolázgénből szár-maznak [Holland (1981)]. Különösen alkalmas kont-rollrendszerek azok, amelyek a gliceraldehid-3-fosz-fát-dehidrogenáz (GAPDH) promotort vagy alkohol-dehidrogenáz (ADH) szabályozható promotort tartal-maznak; terminátorokat, amelyek szintén a GAPDH-ból származnak, és ha kiválasztás kívánatos, vezető-szekvenciákat élesztő alfa-faktorból. Ezenkívül az át-írásszabályozó terület és az átírásbeindító terület, ame-lyek működőképesen kapcsolódnak, olyanok lehet-nek, amelyek a természetben nem kapcsolódnak összevad típusú mikroorganizmusokban. Ilyen rendszere-ket ír le részletesen az EPO 120,511 számú európaiszabadalmi közzétételi irat (közzétéve 1984. október3-án), az EPO 116,201 számú európai szabadalmi köz-zétételi irat (közzétéve 1984. augusztus 22-én), és azEPO 164,556 számú európai szabadalmi közzétételiirat (közzétéve 1985. december 18-án); ezeket mind ajelen találmány bejelentői jelentették be, és a jelen be-jelentésbe referenciaként épülnek be. A kifejezéshez gazdaszervezetként rendelkezésreálló emlőssejtvonalak ismeretesek a szakterületen,ezek között találunk sok nem pusztulóvá tett sejtvona-lat, amelyek az American Type Culture Collectionnél(ATCC) rendelkezésre állnak, ilyenek a HeLa-sejtek,kínaihörcsögpetefészek- (CHO-) sejtek, újszülötthör-csögvese (BHK-) sejtek, és egy sor más sejtvonal. Azemlőssejtekhez való alkalmas promotorok a szakterüle-ten szintén ismeretesek, ezek között találunk víruspro-motorokat, például a Simian Vírus 40-ből (SV40)[Fiers (1978)], Rous-szarkómavírusból (RSV), adeno-vírusból (ADV) és szarvasmarha-papillómavírusból(BPV) való promotorokat. Az emlőssejtek igényelhet-nek terminátorszekvenciákat és poli-A hozzátett szek-venciákat; fokozószekvenciák, amelyek növelik a kife-jeződést, szintén lehetnek bennük; továbbá kívánato-sak lehetnek olyan szekvenciák is, amelyek a gén sok-szorozását idézik elő. Ezek a szekvenciák a szakterüle-ten ismeretesek. Az emlőssejtekben való replikációhozalkalmas vektorok között lehetnek vírusreplikonok,vagy olyan szekvenciák, amelyek biztosítják azNANBV epitópokat kódoló megfelelő szekvenciák in-tegrálását a gazdaszervezet-genomba. III.B. Transzformálások A transzformálás történhet bármely ismert eljárás-sal, amely polinukleotidok bevezetésére szolgál vala-mely gazdasejtbe; ilyen eljárások például a polinuk-leotid „becsomagolás”-a valamely vírusba, és valamelygazdasejt átfertőzése a vírussal; vagy a polinukleotidközvetlen felvétele. Az alkalmazott transzformálásimunkamenet függ a transzformálandó gazdaszervezet-től. így például az E. coli gazdasejtek transzformálását a BB-NANBV-szekvenciákat tartalmazó lambda-gtll-gyel a példák között tárgyaljuk. A baktériumok transz-formálása közvetlen felvétellel általában kalcium- vagyrubídium-kloriddal végzett kezelést tartalmaz [Cohen(1972); Maniatis (1982)]. Az élesztők transzformálásaközvetlen felvétellel kivitelezhető Hinnen és munkatár-sai (1978) eljárásával.

Az emlőssejtek transzformálását közvetlen felvétel-lel Graham és Van dér Eb (1978) kalcium-foszfátos ki-csapási eljárásával végezhetjük, vagy ennek különbözőismert módosításaival. III.C. Vektor létrehozása A vektorok megalkotása olyan technikákat alkal-maz, amelyek a szakterületen ismertek. A helyspeci-fikus DNS-hasítást a megfelelő restrikciós enzimekkelvégzett kezeléssel hajtjuk végre olyan körülmények kö-zött, amelyet ezen kereskedelmi forgalomban kaphatóenzimek gyártói általában előírnak. Általában mintegy1 mikrogramm plazmidot vagy DNS-szekvenciát hasí-tunk 1 egység enzimmel mintegy 20 mikroliter puffer-oldatban 1-2 órás inkubálási idő alatt 37 °C hőmérsék-leten. A restrikciós enzimmel végzett inkubálás után afehérjét fenol/kloroformos extrahálással eltávolítjuk, ésa kinyert DNS-t etanollal kicsapjuk. A hasított fragmen-tumokat poliakrilamid- vagy agaróz-gélelektroforézistalkalmazva elkülönítjük, az alábbi irodalmi helyen talál-ható általános eljárás szerint: Methods in Enzymology65, 499-560 (1980). A tapadós végű hasítási fragmentumokat tompa vé-gűvé tehetjük E. coli DNS-polimerázI-et (Klenow) al-kalmazva a keverékben levő megfelelő dezoxinukleo-tid-trifoszfátok (dNTP-k) jelenlétében. Alkalmazhatjuka kezelést SÍ nukleázzal, amely mindenféle egyszálúDNS-rész hidrolízisét eredményezi. A ligálást standard puffereket és hőmérsékleti kö-rülményeket használva és T4 DNS-ligázt, valamintATP-t alkalmazva hajtjuk végre; a tapadósvég-ligálá-sok kevesebb ATP-t és kevesebb ligázt igényelnek,mint a tompavég-ligálások. Amikor a ligálási keverékrészeként vektorfragmentumokat alkalmazunk, a vek-torfragmentumot gyakran kezeljük bakteriális alkali-kus foszfatázzal (BAP) vagy borjúbél alkalikus foszfa-tázzal, hogy eltávolítsuk az 5’-foszfátot, és így meg-akadályozzuk a vektor újraligálását; egy másik eljárásszerint a nem kívánt fragmentumok restrikciós enzi-mes emésztését alkalmazhatjuk a ligálás megakadályo-zására. A ligálási keveréket megfelelő klónozó gazdaszer-vezetbe, például E. coliba transzformáljuk, és sikerestranszformánsokat szelektálunk például antibiotikumre-zisztencia alapján, és ezeket a korrekt konstrukcióra át-vizsgáljuk. III.D. Kívánt DNS-szekvenciák megalkotása

Szintetikus oligonukleotidokat állíthatunk elő auto-matizált oligonukleotid-szintetizáló berendezést al-kalmazva, amint ezt Warner (1984) leírja. Ha szüksé-ges, a szintetikus szálakat jelezhetjük 32P-vel polinuk-leotidkinázzal végzett kezeléssel 32P-ATP jelenlé-tében, a reakcióhoz standard körülményeket alkal-mazva. 16 1

HU 220 204 B 2 A DNS-szekvenciákat, beleértve a cDNS-könyvtá-rakból izolált szekvenciákat is, ismert technikákkal mó-dosíthatjuk, beleértve például a helyre irányuló muta-genezist, amint ezt Zoller leírja (1982). Röviden: a mó-dosítandó DNS-t fágba burkoljuk egyszálas szekvencia-ként, és kettős szálú DNS-sé alakítjuk DNS-polime-rázzal, primerként olyan szintetikus oligonukleotidot al-kalmazva, amely a DNS módosítandó részével komp-lementer, és rendelkezik a kívánt módosítással sajátszekvenciájába beépítve. Az így létrejövő kettős szálúDNS-t fágsegítő gazdabaktériumba transzformáljuk.A transzformált baktériumok tenyészeteit, amelyek afág egyes szálainak replikáit tartalmazzák, agarra szé-lesztjük, hogy tarfoltokat kapjunk. Elméletileg az új tar-foltok 50%-a olyan fágot tartalmaz, amely a mutáltszekvenciával bír, és a további 50% az eredeti szekven-ciával bír. A tarfoltok replikáit jelzett szintetikus vizs-gálómintákhoz hibridizáljuk olyan hőmérsékleten ésolyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik ahibridizálást a korrekt szállal, de nem teszik lehetővé anem módosított szekvenciával. Azokat a szekvenciá-kat, amelyeket hibridizálással azonosítunk, kinyerjükés klónozzuk. III.E. Hibridizálás vizsgálómintával A DNS-könyvtárakat átvizsgálhatjuk Gruensteinés Hogness (1975) munkamenetét alkalmazva. Rövi-den ismertetve ebben az eljárásban az átvizsgálandóDNS-t nitro-cellulóz-szűrőkön immobilizáljuk, denatu-ráljuk, és előhibridizáljuk olyan pufferral, amely0-50% formamidot, 0,75 mol/1 NaCl-t, 75 mmol/1 Na-citrátot, 0,02-0,02% (tömeg/térfogat) szarvasmarha-szérumalbumint, poli(vinil-pirrolidon)-t és Ficollt,50 mmol/1 Na-foszfátot (pH 6,5), 0,1% SDS-t (nát-rium-lauril-szulfát) és 100 mikrogramm/ml hordozódenaturált DNS-t tartalmaz. A formamid százaléka apufferban, valamint az előhibridizálási, majd hibridizá-lási lépések időbeli és hőmérsékleti feltételei a kívántszigorúságtól függnek. Azoknál az oligomer vizsgáló-mintáknál, amelyek alacsonyabb szigorúsági feltétele-ket igényelnek, általában kisebb százalékban alkalma-zunk formamidot, és rövidebb hibridizációs időt és ala-csonyabb hőmérsékletet alkalmazunk. Azoknál a hibri-dizációs mintáknál, amelyek több mint 30 vagy 40nukleotidot tartalmaznak, például azoknál, amelyekcDNS- vagy genomszekvenciákból származnak, ál-talában magasabb hőmérsékletet, például mintegy40-42 °C-t alkalmazunk, és magasabb arányban alkal-mazunk formamidot, például 50%-ban. Az előhibridi-zálást követően 5’-32P-vel jelzett oligonukleotid vizs-gálómintát adunk a pufferhoz, és a szűrőket ebben a ke-verékben inkubáljuk hibridizációs körülmények kö-zött. Mosás után a kezelt szűrőket autoradiográfiánakvetjük alá, hogy kimutassuk a hibridizált vizsgálómin-ta elhelyezkedését; az eredeti agarlemezen megfelelőelhelyezkedésben levő DNS-t alkalmazzuk a kívántDNS forrásaként. III.F. A konstrukció igazolása és szekvenciaelemzés

Rutinszerűen készített vektorkonstrukcióknál aligációs keveréket E. coli HB101 törzsbe vagy más al-kalmas gazdaszervezetbe transzformáljuk, és antibioti- kumrezisztenciával vagy más markerekkel a sikerestranszformánsokat szelektáljuk. A transzformánsokbólazután plazmidokat állítunk elő Clewell és munkatár-sai eljárásával (1969), általában klór-amfenikolos sok-szorozást követően [Clewell (1972)]. A DNS-t izolál-juk és elemezzük általóban restrikciós enzimes elem-zéssel és/vagy szekvenciaelemzéssel. A szekvencia-elemzés történhet Sanger és munkatársai didezoxieljá-rásával (1977), amint ezt Messing is leírta (1981),vagy Maxam és munkatársai eljárásával (1980). A kö-tés-összecsúszással kapcsolatos gondokat, amelyeknéha megfigyelhetők GC-ben gazdag területekben, T-dezoxiguanozin alkalmazásával küszöböljük ki Bánés munkatársai szerint (1986). III. G. Enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálat

Az enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatot(ELISA) alkalmazhatjuk vagy az antigén, vagy az anti-test koncentrációjának meghatározására. Ez az eljárásegy enzim hozzákapcsolásától függ vagy egy antigén-hez, vagy egy antitesthez, és a kötött enzim aktivitásátalkalmazza mennyiségi jelként. Abból a célból, hogyaz antitestet mérjük, az ismert antigént szilárd fázishozrögzítjük (például mikrolemezhez vagy műanyagedényhez), inkubáljuk a vizsgált szérum hígításaival,mossuk, inkubáljuk egy enzimmel jelzett antiimmun-globulinnal, és ismét mossuk. Azok az enzimek, ame-lyek a jelzéshez alkalmasak, a szakterületen ismertek,ide tartozik például a torma-peroxidáz. A szilárd fázis-hoz kötött enzimaktivitást a fajlagos szubsztrátum hoz-záadásával és a termékképződés vagy szubsztrátum-felhasználás kolorimetriás meghatározásával mérjük.A kötött enzimaktivitás a kötött antitest mennyiségénekközvetlen függvénye.

Abból a célból, hogy antigént mérjünk, egy ismert,fajlagos antitestet rögzítünk szilárd fázishoz, az anti-gént tartalmazó vizsgálandó anyagot hozzáadjuk, inku-bálás után a szilárd fázist mossuk, és egy második, en-zimmel jelzett antitestet adunk hozzá. Mosás utánszubsztrátumot adunk hozzá, és az enzimaktivitást kolo-rimetriásan megbecsüljük, majd az antigénkoncentrá-cióra vonatkoztatjuk. IV. Példák

Az alábbiakban példákat adunk meg a jelen talál-mányra, amelyek csak a bemutatás célját szolgálják, ésnem korlátozzák a találmány oltalmi körét. A jelen le-írás fényében számos kiviteli mód születhet az igény-pontok oltalmi körén belül, amelyek nyilvánvalóakazok számára, akik a szakterületen jártasak. Meg lehetismételni például a IV.A. fejezetben leírt eljárásokat,ha így kívánatos, de nem feltétlenül szükséges, mivelszámos technika áll rendelkezésre kívánt nukleotidszek-venciák megalkotásához a jelen találmányban nyújtottinformációk alapján. A kifejezést a példákban E. coli-ban valósítjuk meg, azonban más rendszerek is állnakrendelkezésre, amint ezt a III.A. fejezetben részleteseb-ben leírtuk. A genomszerkezetből származó további epi-tópok is előállíthatok és felhasználhatók antitestek ki-alakítására, amint ezt a későbbiekben ismertetjük. IV.A. HCV-cDNS előállítása, izolálása és szekvencia-elemzése 17 1

HU 220 204 B 2 IV.A.l. HCV-cDNS előállítása

Az NANB ágens forrása krónikus NANBH-banszenvedő csimpánzból származó plazmagyűjtemény.A csimpánzot előzőleg kísérleti úton fertőztük másik,krónikus NANBH-ban szenvedő csimpánzból szárma-zó vénei, ahol viszont ez a másik csimpánz összegyűj-tött humán szérumból származó, 8. koncentrációjú fak-torú fertőzött törzstenyészetben levő HCV-vel végzettfertőzés következtében fertőzött. A csimpánzplazma-gyűjteményt több plazmaminta egyesítésével kapjuk,amely minták magas alanin-aminotranszferáz-aktivi-tás-szintekkel bírnak; ez az aktivitás májkárosodás ered-ménye, amely a HCV-fertőzés során alakul ki. Mivel 1 ml ennek az összegyűjtött szérumnak a 10 6 hígításá-ból iv. beadva NANBH-t okoz egy másik csimpánzban,ennek CID-értéke legalább 106/ml, azaz ennek igen ma-gas a vírustitere. A magas titerű plazmagyűjteményből a cDNS-könyvtárat az alábbi módon alakítjuk ki. Először a ví-rusrészecskéket izoláljuk a plazmából; egy 90 ml-esaliquotot hígítunk 310 ml oldattal, amely 50 mmol/1trisz-HCl-t (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA-t és 100 mmol/1NaCl-ot tartalmaz. A törmeléket 20 percen át 20 °Chőmérsékleten 150 000xg-nél végzett centrifugálás-sal távolítjuk el. Az így létrejövő felülúszóban a vírus-részecskéket centrifugálással üledékbe visszük Beck-man SW28 rotorban 28 000 fordulat/percnél 5 órán át20 °C hőmérsékleten. Abból a célból, hogy a vírusge-nomot kiszabadítsuk, a részecskéket összezúzzukolyan módon, hogy az üledéket 15 ml oldatban, amely1% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS), 10 mmol/1EDTA-t, 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), valamint 2 mg/ml K-proteinázt tartalmaz, szuszpendáljuk, majd45 °C hőmérsékleten 90 percen át inkubáljuk. A nuk-leinsavakat úgy izoláljuk, hogy hordozóként 0,8 mik-rogramm MS2 bakteriofág-DNS-t adunk hozzá, ésa keveréket négyszer extraháljuk fenol: kloroform1:1 elegyével [ahol a fenol 0,5 mol/1 trisz-HCl-t (pH7,5), 0,1% (térfogat/térfogat) béta-merkapto-etanoltés 0,1% (tömeg/térfogat) hidroxi-kinolont tartalmazóoldattal van telítve], majd kétszer extraháljuk kloro-formmal. A vizes fázist 1-butanollal koncentráljuk,majd 2,5 térfogat abszolút etanollal kicsapjuk egy éj-szakán át -20 °C hőmérsékleten. A nukleinsavakatcentrifugálással nyerjük ki Beckman SW41 rotorban40 000 fordulat/percnél 90 percig 4 °C hőmérsékle-ten, és olyan vízben oldjuk fel, amelyet előzőleg0,05% (tömeg/térfogat) dietil-pirokarbonáttal kezel-tünk és autoklávoztunk. A fenti munkamenettel kapott nukleinsavat(-2 mikrogramm) 17,5 mmol/1 CH3HgOH-val denatu-ráljuk; cDNS-t szintetizálunk, templátként ezt a dena-turált nukleinsavat alkalmazva, és lambda-gtll fágEcoRI helyébe klónozzuk a Huynh (1985) által leírteljárásokkal, azzal a kivétellel, hogy random prime-rek helyettesítik az oligo(dT)12-18-at az első cDNS-szál szintézise során reverz transzkriptázzal [Taylorés munkatársai (1976)]. Az így létrejövő kettős szálúcDNS-eket méret szerint frakcionáljuk SepharoseCL-4B oszlopra; a mintegy 400, 300, 200 és 100 bázispár átlagméretű eluált anyagot az 1., 2., 3., illetve 4. cDNS-gyűjteményekbe gyűjtjük. A lambda-gtllcDNS-könyvtárat a 3. gyűjteményben levő cDNS-bőlalakítjuk ki. A 3. gyűjteményből kialakított lambda-gtll cDNS-könyvtárat olyan epitópokra vizsgáljuk át, amelyek faj-lagosan kötődnek olyan betegből származó szérumok-kal, akik korábban már átestek NANBH-n. Mintegy106 fágot vizsgálunk át betegszérummal Huynh és mun-katársai (1985) eljárását alkalmazva, azzal a különbség-gel, hogy kötött humán antitestet olyan juh-antihumánIg-antiszérumokkal mutatunk ki, amelyet előzőleg ra-dioaktívan jeleztünk 125I-vel. Öt pozitív fágot azonosí-tunk és tisztítunk. Az öt pozitív fágot azután átvizsgál-juk kötési fajlagosságra 8 különböző emberből szárma-zó szérumhoz, akik előzőleg fertőzve voltak NANBHágenssel; az átvizsgáláshoz ugyanazt az eljárást alkal-mazzuk. A fágok közül négy olyan polipeptidet kódol,amely immunológiailag csak egy humán szérummalreagál, vagyis csak egy olyan szérummal, amelyet a fág-könyvtár primer átvizsgálásához alkalmazunk. Az ötö-dik fág (5-1-1.) olyan polipeptidet kódol, amely avizsgált 8 szérum közül öttel reagál. Ezenkívül ez apolipeptid nem reagál immunológiailag 7 normális vér-adó szérumával. Ennélfogva úgy tűnik, hogy az 5-1-1.klón olyan polipeptidet kódol, amelyet fajlagosan im-munológiailag felismernek az NANBH-betegekbőlvaló szérumok. IV.A.2. A HCV-cDNS-szekvenciái a rekombináns5-1-1. fágban, és az ezen a szekvencián belül kódoltpolipeptid szekvenciái

Az 5-1-1. rekombináns fágban levő cDNS-t szek-venciaelemzésnek vetjük alá Sanger és munkatársai(1977) eljárásával. Az eljárás lényegét ismertetve, acDNS-t EcoRI-gyel kimetsszük és méret szerinti frakcio-nálással, gélelektroforézissel izoláljuk. Az EcoRI rest-rikciós fragmentumokat az mpl8 és mpl9 M13 vekto-rokba szubklónozzuk, és szekvenciaelemzésnek vetjükalá, Sanger és munkatársai (1977) didezoxilánctermi-nációs eljárását alkalmazva. A kapott szekvenciát az1. ábrában mutatjuk be.

Az 1. ábrában kódolt polipeptid, amely a HCV-cDNS-ben kódolódik, ugyanabban a transzlációs keret-ben van, mint az N-terminális béta-galaktozidáz rész,amelyhez fuzionálva van. Amint a IV.A. fejezetben be-mutatjuk, az 5-1-1. transzlációs nyitott leolvasóke-rete (ORF) olyan epitópot vagy epitópokat kódol, ame-lyeket az NANBH-fertőzésben szenvedő betegek-ből és csimpánzokból való szérumok fajlagosan felis-mernek. IV.A.3. Az 5-1-1. klánban levő cDNS-sel átfedőHCV-cDNS izolálása

Az 5-1-1. kiónban levő cDNS-sel átfedő HCV-cDNS-eket kapunk olyan módon, hogy ugyanazt alambda-gtll könyvtárat, amelyet a IV.A.l. fejezetbenleírtak szerint alkottunk meg, az 5-1-1. kiónban levő,az 1. ábrában bemutatott HCV-cDNS-szekvenciábólszármazó szintetikus polinukleotiddal átvizsgáljuk. Azátvizsgáláshoz alkalmazott polinukleotid szekvenciájaaz alábbi: 18 1

HU 220 204 B 2

5’-TCC CTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT GAG AGC ACT CTT CCA TCT CAT CGA ACTCAG GT-3’ A lambda-gtl 1 könyvtárat ezzel a vizsgálómintával 5átvizsgáljuk, a Huynh (1985) által leírt eljárást alkal-mazva. 50 000 kiónonként mintegy 1 hibridizál a vizs-gálómintával. Azt a három kiónt, amely olyan cDNS-eket tartalmaz, amelyek hibridizálnak a szintetikus vizs-gálómintával, 81., 1-2., és 91. névvel látjuk el. 10 IV.A.4. Az 5-1-1. klánban levő cDNS-sel átfedőHCV-cDNS-ek nukleotidszekvencia-elemzése A 81., 1-2., és 91. kiónokban jelen levő háromcDNS nukleotidszekvenciáit lényegében úgy határoz-zuk meg, amint ezt a IV.A.2. fejezetben leírtuk. Ezek- 15nek a kiónoknak a szekvenciáját az 5 -1 -1 fágban levőHCV-cDNS-szekvenciához viszonyítva a 2. ábrábanmutatjuk be, amely bemutatja a kimutatott HCV epitó-pot kódoló szálat, és ahol a homológiákat a nukleotid-szekvenciában függőleges vonallal jelöljük a szekven- 20ciák között. A klónozott HCV-cDNS-ek szekvenciái nagymér-tékben homológok az átfedőterületekben (lásd a 2. áb-rát). A két területben azonban vannak különbségek. A 67. nukleotid az 1-2. kiónban timidin míg a másik 25három klón citidingyököt tartalmaz ezen a helyen. Megkell jegyeznünk azonban, hogy azonos aminosav kó-dolódik, akár C, akár T foglalja el ezt a helyet. A második különbség az, hogy az 5-1-1. klón 28olyan bázispárt is tartalmaz, amely nincs jelen a másik 30három kiónban. Ezek a bázispárok az 5-1-1-ben levőcDNS-szekvencia rajtjánál fordulnak elő, és ezeket kis-betűkkel jelöljük. A radioimmunesszéadatok alapján,amelyet később a IV.D. fejezetben tárgyalunk, lehetsé-

5’- CTG TCA GGT ATG ATT

Az eljárás lényegében azonos azzal, amelyet Huynhleírt (1985), azzal a különbséggel, hogy a könyvtárhozalkalmazott szűrőknek két mosást adunk szigorú körül- 40mények között, vagyis a mosásokat 5xSSC-t és 0,1%SDS-t tartalmazó oldattal végezzük 30-30 percig. 50 000 klónból mintegy 1 hibridizálódik ezzel a vizs-gálómintával. Egy pozitív rekombináns fágot, amelytartalmazza azt a cDNS-t, amely a szekvenciával hibri- 45dizál, izolálunk és tisztítunk. Ezt a fágot 36. kiónnak ne-vezzük el.

5’-TTT GGC TAG TGG TTA I

Egy pozitív rekombináns fágot, amely olyancDNS-t tartalmaz, amely hibridizál ez utóbbi szek-venciával, izolálunk és tisztítunk, ezt nevezzük 32.kiónnak. IV.A.6. A 36. klánban levő HCV-cDNS nukleotidszek- 55venciája A 36. kiónban levő cDNS nukleotidszekvenciáját lé-nyegében úgy határozzuk meg, amint ezt a IV.A.2.fejezetben leírtuk. Ennek, a cDNS-nek a kettős szálúszekvenciáit, ennek a 81. kiónban levő HCV-cDNS-sel 60

GGT AGA GGA CTT CCC TGT ges, hogy egy HCV epitóp kódolódik ebben a 28 bp-sterületben.

Az 5-1-1. 28. bázispárjának hiánya a 81., 1-2. és91. klónokból azt is jelentheti, hogy a cDNS ezekben akiónokban hiányos HCV genomokból származik; egymásik változat szerint a 28 bp-s terület egy mesterségesterminális képződmény lehet az 5-1-1. kiónban. A kisbetűs szekvenciák a 81. és 91. kiónok nukleo-tidszekvenciájában egyszerűen azt jelzik, hogy ezeket aszekvenciákat nem találjuk meg más cDNS-ekben, mi-vel az ezeket a területeket átfedő cDNS-eket még nemizoláltuk.

Az 5-1-1., 81., 1-2., és 91. kiónokban levő átfe-dő cDNS-ekből származó összetett HCV-cDNS-szekvenciát a 3. ábrában mutatjuk be. Ebben az ábrá-ban azonban az 5-1-1. klón egyedi 26 bázispárját el-hagyjuk. Az ábra bemutatja az összetett HCV-cDNSORF-jén belül kódolt polipeptid szekvenciáját is.1V.A.5. A 81. klánban levő cDNS-sel átfedő HCV-cDNS-ek izolálása A 81. kiónban levő cDNS-től felfelé levő és azzalátfedő HCV-cDNS-szekvenciák izolálását az alábbimódon végezzük. A lambda-gtl 1 cDNS-könyvtá-rat, amelyet úgy állítottunk elő, amint ezt a IV.A.l. fe-jezetben leírtuk, átvizsgáljuk olyan szintetikus poli-nukleotid vizsgálómintával, amely a 81. klón 5’-terminális szekvenciájával homológ. A 81. klón szek-venciáját a 4. ábrában mutatjuk be. Az átvizsgáláshozalkalmazott szintetikus polinukleotid szekvenciája azalábbi: GCC GGC TTC CCG GAC-3’

Lefelé levő cDNS-szekvenciákat, amelyek átfedika 81. kiónban levő karboxil-végszekvenciákat, izolá-lunk olyan munkamenetet alkalmazva, amely hasonlóa felfelé levő cDNS-szekvenciák izolálásának munka-menetéhez, azzal a különbséggel, hogy olyan szinteti-kus vizsgálómintát állítunk elő, amely a 81. klón 3'-ter-minális szekvenciájához homológ. Az átvizsgáláshozalkalmazott szintetikus polinukleotid szekvenciája azalábbi: íTG GGC TGG TGA CAG-3’ átfedő területeit és az ORF által kódolt polipeptidet az 5. ábrában mutatjuk be. A 36. kiónban levő ORF azonos transzlációs keret-ben van, mint a 81. kiónban kódolt HCV antigén. ígykombinálva a 36. és 81. kiónokban levő ORF-ek olyanpolipeptidet kódolnak, amelyek egy nagy HCV antigénrészét képviselik. Ennek a vélt HCV polipeptidnek ésaz ezt kódoló kettős szálú DNS-nek, amely a 36. és 81.kiónokban levő HCV-cDNS-ek kombinált ORF-jeibőlszármazik, a szekvenciáját a 6. ábrában mutatjuk be. 19 1

HU 220 204 B 2 IV.A.7. A 32. klánban levő HCV-cDNS nukleotidszek-venciája A 32. kiónban levő cDNS nukleotidszekvenciá-ját lényegében úgy határozzuk meg, amint ezt aIV.A.2. fejezetben leírtuk az 5-1-1. szekvenciánál.A szekvenciaadatok azt jelzik, hogy a 32. rekombi-náns fágban levő cDNS két különböző forrásból szár-mazik. A cDNS egyik fragmentuma a HCV genombólszármazó 418 nukleotidból áll; a másik fragmentumaz MS2 bakteriofág genomból származó 172 nuk-leotidból áll, amelyet előzőleg hordozóként alkalmaz-tunk a lambda-gtll plazmid-cDNS-könyvtár elkészíté-se során. A 32. kiónban levő cDNS szekvenciáját, amelymegfelel a HCV genom szekvenciájának, a 7. ábrában mutatjuk be. Azoknak a szekvenciáknak a tartományát,amelyek átfedik a 81. klón szekvenciáját, és az ORF ál-tal kódolt polipeptid szekvenciáját szintén jelöljük azábrában. Ez a szekvencia egy folyamatos ORF-et tartal- 5 máz, amely azonos transzlációs keretben van, mint a81. klón által kódolt HCV antigén. IV.A.8. A 36. klánban levő cDNS-sel átfedő HCV-cDNS-ek izolálása A 36. kiónban levő cDNS-től felfelé levő és azzal át- 10 fedő HCV-cDNS-szekvenciák izolálását úgy végezzük,amint ezt a IV.A.5. fejezetben leírtuk azoknál a szek-venciáknál, amelyek átfedik a 81. klón-cDNS-t, azzal akivétellel, hogy a szintetikus polinukleotid a 36. klón5’-területén alapul. Az átvizsgáláshoz alkalmazott szin- 15 tetikus polinukleotid szekvenciája az alábbi: 5’-AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC-3’ 50 000 kiónból mintegy 1 hibridizálódik a vizsgálómin-tával. Azt az izolált, tisztított rekombináns fágklónt,amely tartalmazza azt a cDNS-t, amely ehhez a szek-venciához hibridizál, 35. kiónnak nevezzük. IV.A.9. A 35. klánban levő HCV-cDNS nukleotidszek-venciája A 35. kiónban levő cDNS nukleotidszekvenciáját lé-nyegében úgy határozzuk meg, amint ezt a IV.A.2. feje-zetben leírtuk. A szekvenciát, ennek átfedőterületét a36. kiónban levő szekvenciával, és az ebben kódolt véltpolipeptidet a 8. ábrában mutatjuk be. A 35. klón láthatóan egy egyedi, folyamatos ORF-et tartalmaz, amely egy polipeptidet kódol ugyanabbana transzlációs keretben, mint a 36. klón, 81. klón és 32.klón által kódolt polipeptidek. A 9. ábra mutatja be a 5 ’ -CAG GAT GCT GTC T< hosszú, folyamatos ORF-et, amely végigterjed a 35., 36., 81. és 32. kiónokon, és bemutatja az ebben kódoltvélt HCV polipeptidet. A kombinált szekvenciát azo-nos lambda-gtll cDNS-könyvtárból származó más,független cDNS-eket alkalmazva igazoljuk. IV.A.10. A 35. klánban levő cDNS-sel átfedő HCV-cDNS-ek izolálása A 35. kiónban levő cDNS-től felfelé levő és azzal át-fedő HCV-cDNS-szekvenciák izolálását úgy végezzük,amint ezt a IV.A.8. fejezetben azoknál a szekvenciák-nál leírtuk, amelyek átfedik a 36. klón-cDNS-t, azzal akivétellel, hogy a szintetikus polinukleotid a 35. klón5’-területén alapul. Az átvizsgáláshoz alkalmazott szin-tetikus polinukleotid szekvenciája az alábbi: CGC ACT CAA CGT- 3’ 50 000 kiónból mintegy 1 klón hibridizál a vizsgálómin-tával. A rekombináns fág izolált, tisztított kiónját, amelytartalmazza azt a cDNS-t, amely ehhez a szekvenciáhozhibridizál, 37. kiónnak nevezzük. IV.A.ll. A 37b. klánban levő HCV nukleotidszekven-ciája A 37b. kiónban levő cDNS nukleotidszekvenciájátlényegében úgy határozzuk meg, amint ezt a IV.A.2. fe-jezetben leírtuk. A szekvenciát, ennek átfedőterületét a 4535. kiónban jelen levő cDNS-sel, és az ebben kódoltvélt polipeptidet a 10. ábrában mutatjuk be. A 35. klón 5’-terminális nukleotidja T, míg a 37b.kiónban az ennek megfelelő nukleotid A. A háromfüggetlen kiónt, amelyeket ennek az eljárásnak a so- 50rán izolálunk, amelyben a 37b. kiónt izoláljuk, és ame-lyet a IV.A. 10. fejezetben írtunk le, szintén szekvencia-elemzésnek vetjük alá. Az ezekből a klónokból valócDNS-ek szintén A-t tartalmaznak ezen a helyen. így a

5’-AGT GCA GTG GAT GAA T 5'-terminális a klónozási munkamenet mesterségesterméke lehet. Ismeretes, hogy mesterséges termékekgyakran felbukkannak a cDNS-molekulák 5'-terminá-lisánál. A 37b. klón láthatóan egy folyamatos ORF-et tartal-maz, amely olyan polipeptidet kódol, amely abban azORF-ben kódolt polipeptid folytatása, amely ORF vé-gigterjed a 35., 36., 81. és 32. átfedőkiónokon. IV.A.12. A 32. klánban levő cDNS-sel átfedő HCV-cDNS izolálása A 32. kióntól lefelé levő HCV-cDNS-szekvenciákizolálását az alábbiak szerint végezzük. Először a clakiónt izoláljuk olyan szintetikus hibridizáló vizsgáló-mintát alkalmazva, amely a 32. kiónban levő cDNS-szekvencia nukleotidszekvenciáján alapul. Az eljárás lé-nyegében az, amelyet a IV.A.5. fejezetben leírtunk, az-zal a különbséggel, hogy a szintetikus vizsgálómintaszekvenciája az alábbi: :CG GCT GAT AGC CTT-3’ A cla klónból való nukleotidszekvenciát alkalmaz-va egy másik szintetikus nukleotidot szintetizálunk,amely az alábbi szekvenciával bír: 60 20 1

HU 220 204 B 2 5’-TTC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT-3’ A cla klón eredetű szekvenciát alkalmazva vizsgáló-mintaként a lambda-gtl 1 átvizsgálása mintegy 1 pozi-tív telepét szolgáltat 50 000-ből. Egy izolált, tisztítottkiónt, amely ezzel a vizsgálómintával hibridizál, 33b.kiónnak nevezünk. IV.A. 13. A 33b. klánban levő HCV-cDNS nukleotid-szekvenciája A 33b. kiónban levő cDNS nukleotidszekvenciájátlényegében úgy határozzuk meg, amint ezt a IV.A.2. fe-jezetben leírtuk. A szekvenciát, ennek átfedőterületét a32. kiónban levő cDNS szekvenciájával, és az ebben kó-dolt polipeptid vélt szerkezetét all. ábrában mutatjukbe. A 33b. klón láthatóan egy folyamatos ORF-et tartal-maz, amely a 37b., 35., 36., 81. és 82. átfedőkiónokban levő ORF-ek kiterjesztése. A 33b. kiónban kódolt poli- 5 peptid azonos transzlációs keretben van, mint ezeknekaz átfedőkiónoknak a kiterjesztett ORF-jében kódoltpolipeptid. IV.A.14. A 33b. klánban levő cDNS-sel és a 37b. klán-ban levő cDNS-sel átfedő HCV-cDNS-ek izolálása 10 Abból a célból, hogy olyan HCV-cDNS-eket izolál-junk, amelyek átfedik a 37b. és 33b. kiónokban levőcDNS-eket, az alábbi szintetikus oligonukleotid vizs-gálómintákat, melyek az ezekben a kiónokban levőcDNS-ekből származnak, alkalmazzuk a lambda-gtl 1 15 könyvtár átvizsgálására, lényegében a IV.A.3. fejezet-ben leírt eljárást alkalmazva. Az alkalmazott vizsgáló-minták : 5’-CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C-3’és 5’-TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT-3’, ezekkel mutatunk ki olyan telepeket, amelyek a 37 b.,illetve 33b. kiónokban levő cDNS-eket átfedő HCV-cDNS-szekvenciákat tartalmaznak. Mintegy 1 telepet mu-tatunk ki 50000 telepből az egyes vizsgálómintákkal.Egy olyan kiónt, amely a 37b. kiónban levő cDNS-től fel-felé levő és ezt átfedő cDNS-t tartalmaz, 40b. kiónnak ne-vezünk. Egy olyan kiónt, amely a 33b. kiónban levőcDNS-től lefelé levő és ezt átfedő cDNS-t tartalmaz, 25c.kiónnak nevezünk. IV.A.15. A 41b. klánban és 25c. klánban levő HCV-cDNS nukleotidszekvenciái A 40b. kiónban és 25c. kiónban levő cDNS-ek nuk-leotidszekvenciáit lényegében úgy határozzuk meg,amint ezt a IV.A.2. fejezetben leírtuk. A 41 b. és 25c.szekvenciáit, az átfedőterületeiket a 37b. és 33b. kió-nokban levő cDNS-ekkel, és a bennük kódolt vélt poli-peptideket a 12. ábrában (40b. klón), illetve a 13. ábrá-ban (25c. klón) mutatjuk be. A 40b. klón 5’-terminális nukleotidja G. Öt másikfüggetlen klónból, amelyeket annak a munkamenetnek asorán izoláltunk, amellyel a 40b. kiónt izoláltuk, amintezt a IV.A.14. fejezetben leírtuk, származó cDNS-eketszintén szekvenciaelemzésnek vetünk alá. Az ezekbőla kiónokból való cDNS-ek T-t tartalmaznak ezen ahelyen. így a G valószínűleg mesterséges klónozásiterméket képvisel (lásd a tárgyalást a IV.A.ll. fejezet-ben). A 25c. kiónban az 5’-terminális ACT, de a cla kión-ban (a szekvenciát nem mutatjuk be) és a 33b. kiónbanennek a területnek a szekvenciája TCA. Ez a különb-ség szintén képviselhet mesterséges klónozási termé-ket, akárcsak a 28 többlet 5’-terminális nukleotid az5-1-1. kiónban. A 40b. és 25c. kiónok egyaránt nyilvánvalóanolyan ORF-et tartalmaznak, amely az előzőekben szek-venciaelemzett kiónokban levő folyamatos ORF kiter-jesztése. A 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b. és 25c. kiónokon keresztül terjedő ORF nukleotidszekven-ciáját, és az ebben kódolt vélt polipeptid aminosav-szekvenciáját a 14. ábrában mutatjuk be. Az ábrában alehetséges mesterséges termékeket elhagyjuk a szek-venciából, helyette a többszörösen átfedő kiónok nem5’-terminális területeinek megfelelő szekvenciáit mu-tatjuk be. IV.A.16. Összetett HCV-cDNS előállítása a 36., 81. és32. klánokban levő cDNS-ekből A C100 összetett HCV-cDNS-t az alábbiak szerintalkotjuk meg. Először a 36., 81. és 32. klónokból acDNS-eket EcoRI-gyel kimetsszük. Az egyes kiónokbóla cDNS EcoRI-fragmentumát egyenként klónozzuk apGEM3-blue vektor (Promega Biotec) EcoRI helyébe.Az így létrejövő rekombináns vektorokat, amelyek a 36., 81. és 32. kiónokból való cDNS-eket tartalmaz-zák, pGEM3-blue/36-nak, pGEM3-blue/81-nek, illetvepGEM3-blue/32-nek nevezzük. A pGEM3-blue/81 meg-felelően orientált rekombinánsát Nael-gyel és Narl-gyelemésztjük, és a nagy (~2850 bp) fragmentumot tisztít-juk és ligáljuk a pGEM3-blue/36-ból való tisztított kis(-570 bp) Nael/NarI restrikciós fragmentumhoz. A 36.és 81. klónokból való cDNS-eknek ezt az összetett ter-mékét alkalmazzuk további pGEM-blue vektor kialakítá-sára, amely az ezeken a kiónokon belül levő átfedőcDNS-eken belül levő folyamatos HCV-ORF-et tartal-mazza. Ezt az új plazmidot azután PvuII-vel és EcoRI-gyel emésztjük, hogy egy mintegy 680 bp-s fragmentu-mot szabadítsunk ki, amelyet azután a megfelelőenorientált pGEM3-blue/32 plazmidból izolált kis(580 bp) PvuII/EcoRI fragmentummal ligálunk, és a 36., 81., és 32. klónokból való összetett cDNS-t az EcoRI-gyel linearizált pSODcfl vektorba ligáljuk, amelyet aIV.B.l. fejezetben írunk le, és amelyet az 5-1-1. klónkifejezésére alkalmazunk baktériumokban. Olyanrekombinánsokat szelektálunk, amelyek az összetettHCV-cDNS (C100) -1270 bp-s EcoRI-fragmentumát 21 1

HU 220 204 B 2 tartalmazzák, és ezekből a plazmidokból a cDNS-tEcoRI-gyel kihasítjuk és tisztítjuk. IV.A.17. A 14i„ 11b., 7f, 7e„ 8h„ 33c„ 14c., 8f„ 33f, 33g. és 39c. klánokban levő HCV-cDNS-szekvenciákizolálása és nukleotidszekvenciái 5 A 14i., 11b., 7f., 7e., 8h., 33c., 14c., 8f., 33f., 33g.és 39c. klóitokban levő HCV-cDNS-eket az átfedőcDNS-ek HCV-cDNS-ek lambda-gtll könyvtárábólvaló izolálásának technikájával izoláljuk, amint ezt aIV.A. 1. fejezetben leírjuk. Az alkalmazott technika lé- 10nyegében az, amelyet a IV.A.3. fejezetben leírtunk, az-zal a különbséggel, hogy az alkalmazott vizsgálómin-tákat a kombinált HCV-szekvenciák 5’- és 3’-végébőlvaló utolsó izolált kiónok nukleotidszekvenciájából

5’-ATC AGG ACC GGG GTG A 33c. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját, ésa 40b. kiónban levő szekvenciával való átfedést a15. ábrában mutatjuk be, amely bemutatja az ezen belül 20kódolt aminosavakat is.

5’-AGA GAC AAC CAT GAG A 8h. kiónban levő HCV-cDNS-szekvenciát és a 2533c. kiónban levő szekvenciával való átfedést, vala-mint az ebben kódolt aminosavakat a 16. ábrában mutat-juk be.

5’-TCG GAC CTT TAC CTG A 7e. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját, a 8h.kiónnal való átfedést, és az ebben kódolt aminosavakata 17. ábrában mutatjuk be. A 14c. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izolál- 35juk, amely a 25c. kiónban levő nukleotidok szekvenciá-

5’-ACC TTC CCC ATT AAT A 14c. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját, 40a 25c. kiónban levő szekvenciával való átfedését, ésa benne kódolt aminosavakat a 18. ábrában mutat-juk be.

5’-TCC ATC TCT CAA GGC A 8f. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját,a 14c. kiónban levő szekvenciával való átfedését, ésa benne kódolt aminosavakat a 19. ábrában mutat-juk be. 50

5’-TCC ATG GCT CGC TTC A 33f. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját,a 8f. kiónban levő szekvenciával való átfedését, és 55a benne kódolt aminosavakat a 20. ábrában mutat-juk be.

5’-GCG ACA ATA CGA CAA tervezzük. Azoknak a kiónoknak a gyakorisága, ame-lyek az alább leírt vizsgálómintákkal hibridizálnak,mintegy 1 az 50 000-ben mindegyik esetben. A 14i., 7f, 7e., 8h., 33c., 14c., 8f., 33f., 33g. és 39c.kiónokban levő HCV-cDNS-ek nukleotidszekvenciáitlényegében úgy határozzuk meg, amint ezt a IV.A.2. fe-jezetben leírjuk, azzal a kivétellel, hogy az ezekből afágokból kimetszett cDNS-ek helyettesítik az5-1-1 fágból izolált cDNS-t. A 33c. kiónt olyan hibridizáló vizsgálómintát alkal-mazva izoláljuk, amely a 40b. kiónban levő nukleotidszekvenciáján alapul. A 40b. klón nukleotidszekvenciá-ját a 12. ábrában mutatjuk be. A 33c. izolálásához alkal-mazott vizsgálóminta nukleotidszekvenciája az alábbi: AGA ACA ATT ACC ACT-3’ A 84. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izo-láljuk, amely a 33c. kiónban levő nukleotidszekven-cián alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája azalábbi: GTC CCC GGT GTT C-3’ A 7e. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izolál-juk, amely a 8h. kiónban levő nukleotidok szekvenciá-ján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája azalábbi: GTC ACG AGG CAC-3’ ján alapul. A 25c. klón szekvenciáját a 13. ábrában mu-tatjuk be. A 14c. klón izolálásában alkalmazott vizs-gálóminta az alábbi szekvenciával bír: GCC TAC ACC ACG GGC-3’ A 8f. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izolál-juk, amely a 14c. kiónban levő nukleotidok szekvenciá-ján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája azalábbi: AAC TTG CAC CGC TAA-3’ A 33f. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izolál-juk, amely a 8f. kiónban levő nukleotidok szekvenciá-ján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája azalábbi: CAC CTC CAA AGT- 3’ A 33g. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izo-láljuk, amely a 33f. kiónban levő nukleotidok szekven-ciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciájaaz alábbi: CAT CCT CTG AGC CCG-3’ 22 1

HU 220 204 B 2 A 33g. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját,a 33f. kiónban levő szekvenciával való átfedését, ésa benne kódolt aminosavakat a 21. ábrában mutat-juk be.

5’-AGC AGA CAA GGG GCC A 7f. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját,a 7e. kiónban levő szekvenciával való átfedését, ésa benne kódolt aminosavakat a 22. ábrában mutat- 10juk be.

5’-CAC CTA TGT TTA TAA A 11b. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját, 15a 7f. kiónban levő szekvenciával való átfedését, ésa benne kódolt aminosavakat a 23. ábrában mutat-juk be.

5’-CTC TGT CAC CAT ATT A 14i. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját,a 11b. kiónban levő szekvenciával való átfedését, ésa benne kódolt aminosavakat a 24. ábrában mutat-juk be. 25

5’-CTC GTT GCT ACG TCA A 39c. kiónban levő HCV-cDNS szekvenciáját,a 33g. kiónban levő szekvenciával való átfedését, és 30a benne kódolt aminosavakat a 25. ábrában mutat-juk be. IV.A.18. HCV-cDNS-t tartalmazó izolált klánokbólszármazó összetett HCV-cDNS-szekvenciák A fentebb leírt izolált kiónokban levő HCV-cDNS- 35szekvenciákat felsorakoztatjuk, hogy egy összetettHCV-cDNS-szekvenciát alkossunk meg. Az izolált kió-nok, amelyek 5’->3’ irányban felsorakoznak, az aláb-biak: 14i„ 7fi, 7e., 8h., 33c., 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b., 25c., 14c., 8f., 33f., 33g. és 39c. 40

Egy, az izolált kiónokból származó HCV-cDNSösszetett szekvenciát, és az ebben kódolt aminosavakat,a 26. ábrában mutatjuk be.

Az összetett szekvencia megalkotásában az aláb-bi szekvenciaheterogenitásokat vesszük figyelembe. 45A 33c. egy 800 bázispáros HCV-cDNS-t tartalmaz,amely átfedi a 40b. és 37c. kiónokban levő cDNS-eket. A 33c. kiónban, valamint 5 másik átfedőkiónban a 789.nukleotid G. A 37b. kiónban azonban (lásd a IV.A.ll.fejezetet) a megfelelő nukleotid A. Ez a szekvencia- 50különbség nyilvánvaló heterogenitást alakít ki az eb-ben kódolt aminosavakban, amely vagy CYS, vagyTYR lehet a G, illetve az A esetében. Ez a heterogeni-tás fontos eltérést jelenthet a fehérje összehajtogatásaszempontjából. 55 A 8h. HCV-cDNS-ben levő 2. nukleotidgyök T.Amint azonban fentebb bemutattuk, a 7e. kiónban amegfelelő gyök A; és A-t találunk 3 másik izolált átfe-dőkiónban. így a T gyök a 8h. kiónban egy mester-séges klónozási terméket képviselhet. Ennek megfe- 60 A 7f. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izolál-juk, amely a 7e. kiónban levő nukleotidok szekvenciá-ján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája azalábbi: TCC TAG GGT GCA TAA T-3’ A 11b. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izo-láljuk, amely a 7f. kiónban levő nukleotidok szekven-ciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciájaaz alábbi: CCA TCT CAC TCC TCT-3’ A 14i. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izolál-juk, amely a 1 lb. kiónban levő nukleotidok szekvenciá-ján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája azalábbi: ACA AGC GCT ATA TCA-3’ A 39c. kiónt olyan vizsgálómintát alkalmazva izolál-juk, amely a 33g. kiónban levő nukleotidok szekvenciá-ján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszekvenciája azalábbi: CCA CAA TTT GGT GTA-3’ lelően a 26. ábrában a gyököt ebben a helyben A-nakjelöljük. A 8f. klón HCV-cDNS-ében a 3’-terminális nuk-leotid G. A 33f. kiónban azonban - és még 2 másikátfedőkiónban - a megfelelő szekvencia T. Ennek meg-felelően a 26. ábrában a gyököt ebben a helyben T-nekjelöljük. A 33f. kiónban a HCV-cDNS 3’-terminális szek-venciája TTGC. A 33g. kiónban és még két má-sik átfedőkiónban azonban ez ATTC. Ennek megfe-lelően a 26. ábrában a megfelelő területeket ATTCképviseli. A 33g. kiónban a HCV-cDNS 4. nukleotidgyöke T.A 33f. kiónban és még 2 másik átfedőkiónban azonbana megfelelő gyök A. Ennek megfelelően a 26. ábrábana megfelelő gyököt A-nak jelöljük. A 14i. kiónban levő 3’-terminális AA, míg a lib-ben és három másik kiónban a megfelelő dinukleotidTA. Ennek megfelelően a 26. ábrában a TA gyököt tün-tetjük fel. A további szekvenciaheterogenitások megoldásátfentebb tárgyaltuk.

Az összetett HCV-cDNS vizsgálata azt jelzi, hogyez egy nagy ORF-et tartalmaz. Ez azt sugallja, hogya vírusgenom egy nagy polipeptiddé transzlatálódik,amely feldolgozódik a transzlációval együtt, vagy aztkövetően. IV.A.19. A 12f, 35f, 19g., 26g., és 15e. klánokban levőHCV-cDNS-ek izolálása és nukleotidszekvenciái A 12f., 35fi, 19g., 26g., és 15e. kiónokban le-vő HCV-cDNS-eket lényegében azzal a technikávalizoláljuk, amelyet a IV.A.17. fejezetben leírtunk, az- 23 1

HU 220 204 B 2 zal a különbséggel, hogy a vizsgálóminták az alábbleírtak. A kiónok, amelyek a vizsgálómintákkal hib-ridizálnak, gyakorisága mintegy 1 az 50 000-ben,mindegyik esetben. A HCV-cDNS-ek nukleotidszek-venciáját ezekben a kiónokban lényegében úgy ha- 5tározzuk meg, amint ezt a IV.A.2. fejezetben leír-tuk, azzal a kivétellel, hogy a jelzett kiónokból való

5’-TGC TTG TGG ATG ATG A 12f. klón HCV-cDNS-szekvenciáját, a 14i. kión-nal való átfedését, és a benne kódolt aminosavakat a27. ábrában mutatjuk be. A 35f. klón, amely a 26. ábrában levő HCV-cDNS-től lefelé levő cDNS-t tartalmazza, izolálását a 39c. 15

5’-AGC AGC GGC GTC AAA A 35f. klón HCV-cDNS-szekvenciáját, a 39c. kión-ban levő szekvenciával való átfedését, és a benne kó- 20dőlt aminosavakat a 28. ábrában mutatjuk be. A 19g. klón izolálását olyan hibridizáló vizsgáló-mintát alkalmazva hajtjuk végre, amely a 35f. klón 3’

5’-TTC TCG TAT GAT ACC A 19g. klón HCV-cDNS-szekvenciáját, a 35f. kión-ban levő szekvenciával való átfedését, és a benne kó-dolt aminosavakat a 29. ábrában mutatjuk be. A 26g. klón izolálását olyan hibridizáló vizsgáló- 30mintát alkalmazva hajtjuk végre, amely a 19g. klón 3’

5’-TGT GTG GCG ACG ACT A 26g. klón HCV-cDNS-szekvenciáját, a 19g. 35kiónban levő szekvenciával való átfedését, és a bennekódolt aminosavakat a 30. ábrában mutatjuk be. A 15e. klón izolálását olyan hibridizáló vizsgáló-mintát alkalmazva hajtjuk végre, amely a 26g. klón 3’

5’-CAC ACT CCA GTC AAT A 15e. klón HCV-cDNS-szekvenciáját, a 26g. kión-ban levő szekvenciával való átfedését, és a benne kó-dolt aminosavakat a 31. ábrában mutatjuk be. 45

Az ebben a fejezetben leírt kiónokat az ATCC-néldeponáltuk olyan feltételek és körülmények között, ame-lyeket a II.A. fejezetben írtunk le; ezek az alábbi depo-nálási számot kapták: lambda-gtl 1 ATCC szám A deponálás dátuma 12f. klón 40514 1988. november 10. 35f. klón 40511 1988. november 10. 15e. klón 40513 1988. november 10. k9-l. klón 40512 1988. november 10, A fentebb leírt izolált kiónokban levő HCV-cDNS-szekvenciákat egymás mellé sorakoztatjuk fel, hogyösszetett HCV-cDNS-szekvenciát alkossunk meg. Azizolált kiónok, amelyek 5’—>3’ irányban egymás mel-lett sorakoznak, az alábbiak: 12f., 14i., 7f., 7e., 8h., cDNS-ek helyettesítik az 5-1-1. klónból izolált cDNS-eket. A 12f. klón, amely a 26. ábrában levő HCV-cDNS-től felfelé levő cDNS-t tartalmazza, izolálását olyan hib-ridizáló vizsgálómintát alkalmazva végezzük, amely a14i. kiónban levő nukleotidok szekvenciáján alapul.A vizsgálóminta szekvenciája az alábbi: CTA CTC ATA TCC CAA-3’ kiónban levő nukleotidok szekvenciáján alapuló hibridi-záló vizsgálómintát alkalmazva hajtjuk végre. A vizsgá-lóminta nukleotidszekvenciája az alábbi: AGT GAA GGC TAA CTT-3’ szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszek-venciája az alábbi: CGC TGC TTT GAC TCC-3’ szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszek-venciája az alábbi: TAG TCG TTA TCT GTG-3’ szekvenciáján alapul. A vizsgálóminta nukleotidszek-venciája az alábbi: TCC TGG CTA GGC AAC-3’ 33c., 40b., 37b., 35., 36., 81., 32., 33b., 25c., 14c., 8f.,33f„ 33g., 39c., 35f„ 19g„ 26g. és 15e.

Az izolált klónokból származó összetett HCV-cDNS-szekvenciát és a benne kódolt aminosavakat a32. ábrában mutatjuk be. IV.A.20. Másik eljárás a 12f. klánban levő HCV-cDNS-szekvenciától felfelé levő cDNS-szekvenciák izo-lálására A 32. ábrában levő legtöbb 5’ HCV-szekvenciáraalapozva, amely a 12f. kiónban levő HCV-cDNS-bőlszármazik, reverz transzkriptáz kis szintetikus oligo-nukleotid primerjeit szintetizáljuk és alkalmazzuka HCV genom RNS-ben levő megfelelő szekvencia kö-tésére, hogy beindítsuk a felfelé levő szekvenciákreverz transzkripcióját. A primer szekvenciák proxi-málisak a 12f. klón ismert 5’-terminális szekvenciájá- 24 1

HU 220 204 B 2 hoz, de megfelelően lefelé vannak ahhoz, hogy lehető-vé tegyék a primer szekvenciáktól lefelé levő vizs-gálóminta-szekvenciák tervezését. A beindítás és kló-nozás ismert, standard eljárásait alkalmazzuk. Az ígylétrejövő cDNS-könyvtárat olyan szekvenciákkal vizs-gáljuk át, amelyek a beindítóhelyektől lefelé vannak(amint ezt a 12f. kiónban levő megvilágított szekven-ciából következik). A HCV genom RNS-t NANBH-ban szenvedő csimpánzok plazma- vagy májmintáibólnyerjük, vagy NANBH-ban szenvedő emberek ha-sonló mintáiból. IV.A.21. Másik eljárás farokképzést alkalmazva aHCV genom 5 '-terminális területéből való szekvenciákizolálására

Abból a célból, hogy a HCV-RNS genom többlet-5’-terminális szekvenciáit izoláljuk, a reverz transzkrip-ció első menetének cDNS-termékét, amely a templát-RNS-sel képez duplexet, oligo C farokkal látjuk el. Eztúgy hajtjuk végre, hogy a terméket terminális transz-ferázzal inkubáljuk CTP jelenlétében. A cDNS-szinté-zis menetét, amely a cDNS első szálának kiegészítésétadja, a reverztranszkriptáz-reakcióhoz printerként oligoG-t hasznosítva hajtjuk végre. A genom HCV-RNS for-rásai azok, amelyeket a IV.A.20. fejezetben leírtunk.A farokképzési eljárást terminális transzferázzal, és areverz transzkriptázos reakciót úgy végezzük, amint aztManiatis és munkatársai leírták (1982). A cDNS-termé-keket azután klónozzuk, átvizsgáljuk, és szekvenciáju-kat elemezzük. IV.A.22. Másik eljárás farokképzést alkalmazva aHCV genom 3 '-terminális területéből való szekvenciákizolálására

Ez az eljárás flavivírus RNS-cDNS-einek klónozá-sához korábban alkalmazott eljárásokon alapul. Ebbenaz eljárásban az RNS-t denaturáló körülményeknek vet-jük alá, hogy eltávolítsuk a szekunder szerkezeteket a3'-terminálisnál, majd farokkal látjuk el poli-A polime-rázzal, szubsztrátumként rATP-t alkalmazva. A poli-Afarokkal ellátott RNS reverz transzkripcióját reverztranszkriptázzal katalizáljuk, primerként oligo dT-t alkal-mazva. A cDNS második szálait szintetizáljuk, a cDNS-termékeket klónozzuk, átvizsgáljuk, és szekvenciájukatmeghatározzuk. IV.A.23. Nagyobb cDNS-beiktatásokat tartalmazólambda-gtll HCV-cDNS-könyvtárak megalkotása A lambda-gtl 1 könyvtárak megalkotására és átvizs-gálására alkalmazott eljárások lényegében azok, ame-lyeket a IV.A.l. fejezetben leírtunk, azzal a különbség-gel, hogy a könyvtárat a Sepharose CL-4B oszlopróleluált nagyobb méretű cDNS-ek gyűjteményéből alakít-juk ki. IV.A.24. HCV-cDNS-könyvtárak megalkotása, primer-ként szintetikus oligomereket alkalmazva Új HCV-cDNS-könyvtárakat állítunk elő a IV.A.l.fejezetben leírt fertőző csimpánzplazma-gyűjtemény-ből származó RNS-ből és ennek a fertőzött állatnak amájából származó poli A+ RNS-frakcióból. A cDNS-tlényegében úgy alkotjuk meg, amint ezt Gubler és Hoff-mann (1983) leírták, azzal a kivétellel, hogy az elsőcDNS-szál szintéziséhez való primerek szintetikus oli- gomerek, amelyek a fentebb leírt HCV genom szekven- ciáján alapulnak. A 11b., illetve 7e. klón szekvenciáján alapuló primerek az alábbiak: 5’-CTG GCT TG A AGA ATC-3’ és 5’-AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC-3’

Az így létrejövő cDNS-eket lambda-bakteriofág-vek-torokba klónozzuk, és különböző más szintetikus oligo-merekkel vizsgáljuk át, amelyek szekvenciái a 32. ábrá-ban levő HCV-szekvencián alapulnak. IV.B. A HCV-cDNS-eken belül kódoltpolipeptidek kife-jezése és a kifejezett termék azonosítása HCV indukáltantigénként IV.B.l. Az 5-1-1. klánban kódoltpolipeptidkifejezése

Az 5-1-1. kiónon (lásd a korábbi IV.A.2. fejeze-tet) belül kódolt HCV polipeptidet szuperoxiddiszmu-tázzal (SÓD) képzett fúziós polipeptidként fejezzük ki.Ezt az 5-1-1. klón cDNS-beiktatás szubklónozásávalhajtjuk végre a pSODcfl kifejezővektorba [Steimer ésmunkatársai (1986)] az alábbiak szerint.

Először a pSODcfl-ból izolált - DNS-t BamHI-gyel és EcoRI-gyel kezeljük, és az alábbi kapcsolótEgáljuk a restrikciós enzimek által létrehozott lineárisDNS-be: 5’-GAT CCT GGA ATT CTG ΑΤΑ A-3’ 3’-GA CCT TAA GAC TAT TTT AA-5’ A klónozás után a beiktatást tartalmazó plazmidot izo-láljuk. A beiktatást tartalmazó plazmidot EcoRI-gyel hasít-juk. Az 5-1-1. kiónban levő HCV-cDNS-beiktatástEcoRI-gyel kimetsszük, és ebbe az EcoRI-gyel lineari-zált plazmid-DNS-be Egáljuk. A DNS-keveréket alkal-mazzuk E. coli D1210 törzs [Sadler és munkatársai(1980)] transzformálására. Azokat a rekombinánsokat,amelyek az 1. ábrában bemutatott ORF-kifejeződésrenézve korrekt orientációban tartalmazzák az 5-1-1.cDNS-t, restrikciós térképezéssel és nukleotidszekven-cia-elemzéssel azonosítjuk.

Az egyik kiónból való rekombináns baktériumokatindukálunk, hogy fejezzenek ki SOD-NANB5_i_[ poli-peptidet a baktériumok növesztésével, IPTG jelenlé-tében. IV.B.2 A 81. klánban kódolt polipeptid kifejezése A 81. kiónon belül levő HCV-cDNS-t SOD-NANB8i fúziós polipeptidként fejezzük ki. Az eljárásezt fúziós polipeptidet kódoló vektor előállítására ana-lóg azzal, amelyet az SOD-NANB5_l_ret kódoló vek-tor megalkotásánál alkalmazunk, azzal a különbséggel,hogy a HCV-cDNS forrása a 81. klón, amelyet úgy izo-lálunk, amint ezt a IV.A.3. fejezetben leírtuk, és amely-nél a cDNS-szekvenciát úgy határozzuk meg, amint ezta IV.A.4. fejezetben leírtuk. A 81. kiónban levő HCV-cDNS nukleotidszekvenciáját és az ebben kódolt po-lipeptid vélt aminosavszekvenciáját a 4. ábrában mutat-juk be. A 81. kiónban levő HCV-cDNS-beiktatást EcoRI-gyel kimetsszük, és a pSODcfl-be Egáljuk, amely tartal-mazza a kapcsolót (lásd a IV.B.l. fejezetet), és amelyEcoRI-gyel végzett kezeléssel linearizálva van. A DNS-keveréket alkalmazzuk az E. coli D1210 törzs transzfor- 25 1

HU 220 204 B 2 málására. A 4. ábrában bemutatott ORF kifejeződéséhezmegfelelő orientációban levő 81. HCV-cDNS-klónnalbíró rekombinánsokat restrikciós térképezéssel és nuk-leotidszekvencia-elemzéssel azonosítjuk.

Az egyik kiónból való rekombináns baktériumokatindukáljuk úgy, hogy SOD-NANB81 polipeptid fejeződ-jék ki, amikor a baktériumokat IPTG jelenlétében nö-vesztjük. IV.B.3. Az 5-1-1. klánon belül kódolt polipeptid, mintHCV-vel és NANBH-val társult antigén azonosítása

Az 5-1-1. klón HCV-cDNS-én belül kódolt poli-peptidet úgy azonosítjuk NANBH-hez társult antigén-ként, hogy bemutatjuk: az NANBH-val fertőzött csim-pánzok és emberek szérumai immunológiailag reagál-nak az SOD-NANB5_|_! fúziós polipeptiddel, amelypolipeptid szuperoxiddiszmutázt tartalmaz N-termi-nálisánál és keretben levő 5-1-1. antigén C-termi-nálisánál. Ezt „Westerri’-foltképzéssel hajtjuk végre[Towbin és munkatársai (1979)] az alábbiak szerint.

Az SOD-NANB511 polipeptidet kódoló kifejező-vektorral transzformált baktériumok egy rekombinánstörzsét, amelyet a IV.B.l. fejezetben írunk le, indukál-juk fúziós polipeptid kifejezésére olyan módon, hogyIPTG jelenlétében növesztjük. A teljes baktériumlizá-tumot elektroforézisnek vetjük alá poliakrilamidgéle-ken SDS jelenlétében Laemmli (1970) szerint. Az elkü-lönített polipeptideket nitro-cellulóz-szűrőkre visszükát [Towbin és munkatársai (1979)]. A szűrőket azutánvékony csíkokra hasítjuk, és a csíkokat egyenkéntinkubáljuk különböző csimpánz- és humán szérumok-kal. A kötött antitesteket 125I-vel jelzett juh-antihumánIg-vel végzett további inkubálással mutatjuk ki, amintezt a IV. A.l fejezetben leírjuk. A Westem-foltképzéshez alkalmazott csimpánz-szérumok jellemzését, és az eredményeket, amelyeketaz autoradiográfíának alávetett csíkok fényképeibenmutatunk be, a 33. ábra szemlélteti. A polipeptidekettartalmazó nitro-cellulóz-csíkokat csimpánzokból szár-mazó szérumokkal inkubáljuk, ahol a szérumok akutNANBH (Hutchinson törzs) fertőzéseknek (1-16. csí-kok), hepatitis A fertőzésnek (17-24. és 26-33. csí-kok), és hepatitis B fertőzéseknek (34-44. csíkok) ki-tett állatokból, különböző időpontokból származnak.A 25. és 45. csíkok pozitív kontrollok, amelyekben azimmunfoltokat abból a betegből származó szérummalinkubáljuk, amelyet az 5-1-1. rekombináns klón azo-nosítására alkalmaztunk a lambda-gtll cDNS-könyvtáreredeti átvizsgálásában (lásd a IV.A.l. fejezetet). A 33. ábrában a 25. és 45. kontrollcsíkokban láthatócsík az SÓD fúziós polipeptid NANB5_1„1 része elleniantitestek kötését tükrözi. Ezek az antitestek nem mutat-nak kötést SOD-re önmagában, mivel ez negatív kont-rollt is jelent ezekben a mintákban, és olyan módon tű-nik fel, mint az SOD-NANB5_!_| fúziós polipeptidnéljelentősen gyorsabban vándorló csík. A 33. ábra 1-16. csíkjai antitestek kötését mutatjákbe 4 csimpánz szérummintáiban; a szérumokat közvet-lenül az NANBH-val végzett fertőzés előtt vesszük,majd egymás után az akut fertőzés során. Amint az áb-rából látható, míg azok az antitestek, amelyek immuno- lógiailag reagálnak az SOD-NANB5_!_i polipeptiddel,hiányoznak a fertőző HCV inokulum beadása előtt vettés a fertőzés korai akut fázisa során vett szérumminták-ból, addig mind a 4 állat végül is indukál ezen polipep-tid elleni cirkuláló antitesteket az akut fázis utolsó ré-szében és az akut fázist követően. A 3. és 4. számúcsimpánzok esetében az immunfoltokon megfigyelt to-vábbi csíkok a gazda bakteriális fehéij ékhez való háttér-kötésnek tulajdoníthatók.

Az NANBH-vel fertőzött csimpánzokból való széru-mokkal kapott eredményekkel ellentétben a fúziós poli-peptid NANB5_,_! része elleni antitestek kifejlődésétnem figyeltük meg 4 olyan csimpánznál, amelyekHAV-vel voltak fertőzve, vagy 3 olyan csimpánznál,amelyek HBV-vel voltak fertőzve. Ezekben az esetek-ben az egyetlen kötés a háttérkötés a gazda bakteriálisfehérjéhez, amely a HCV-vel fertőzött mintákban is elő-fordul. A Westem-foltképzéshez alkalmazott humán széru-mok jellemzését és az eredményeket, amelyek autora-diográfiának alávetett csíkok fényképeiben láthatók, a34. ábrában szemléltetjük. A polipeptideket tartalmazónitro-cellulóz-csíkokat emberekből származó szérumok-kal inkubáljuk, ahol szérumok különböző időpontokbólszármaznak a NANBH-val (1-21. csíkok), HAV-val(33-40. csíkok) és HBV-vel (41-49. csíkok) végzettfertőzés során. A 25. és 50. csíkok pozitív kontrollokatjelentenek, amelyekben az immunfoltokat olyan beteg-ből származó szérummal inkubáljuk, akit a lambda-gtll könyvtár eredeti átvizsgálásánál alkalmaztunk,amint ezt fentebb leírtuk. A 22-24. és 26-32. csíkokolyan „nem fertőzött” kontrollokat mutatnak, amelyek-ben a szérum „normális” véradóktól ered.

Amint a 34. ábrában látható, kilenc NANBH beteg-ből származó szérum, ide értve a lambda-gtl 1 könyvtárátvizsgálásához alkalmazott szérumot, tartalmazza a fú-ziós polipeptid NANB5_!_i része elleni antitesteket. Há-rom, NANBH-ban szenvedő betegből származó szé-rum nem tartalmazza ezeket az antitesteket. Lehetsé-ges, hogy az anti-NANBs_1 _j antitestek későbbi idő-pontban fejlődnek csak ki ezekben a betegekben. Az islehetséges, hogy a reakció hiánya egy, a betegséget elő-idéző, de eltérő NANBV ágens következménye, és anem válaszoló szérumok ilyen ágenst tartalmaznak. A 34. ábra azt is megmutatja, hogy a HAV-val ésHBV-vel fertőzött betegekből származó szérumok nemtartalmaznak anti-NANB5_!_| antitesteket, és hogy ezekaz antitestek nincsenek jelen a „normális” kontrollokbólszármazó szérumokban sem. Bár az egyik HAV beteg(36. csík), úgy tűnik, tartalmaz anti-NANB5_i_, antites-teket, lehetséges, hogy ez a beteg előzőleg HCV-vel isvolt fertőzve, mivel az egybeesés NANBH-val nagyonnagy és mivel ez gyakran csak szubklinikai jellegű.

Ezek a szerológiai tanulmányok azt jelzik, hogy az5-1-1. kiónban levő cDNS olyan epitópokat kódol,amelyeket BB-NANBV-vel fertőzött betegekből és álla-tokból kapott szérumok fajlagosan felismernek. Ezenkí-vül, úgy tűnik, a cDNS nem a főemlős genomból szár-mazik. Egy, az 5 -1 -1. kiónból vagy 81. kiónból készí-tett hibridizáló vizsgálóminta nem hibridizál nem fertő- 26 1

HU 220 204 B 2 zött egyénekből származó kontroll humán és csimpánzgenom DNS „Southení’-foltjaival olyan körülményekközött, ahol egyedi, egymásolatú gének kimutathatók.Ezek a vizsgálóminták nem hibridizálnak kontroli-szarvasmarha genom DNS Southem-foltjaihoz sem. 5IV.B.4. A 36., 81. és 32. klánokban levő HCV-cDNS-ekösszetett termékeiben kódolt polipeptidek kifejezéseA HCV polipeptidet, amely a 36., 81. és 32. kió-nokon keresztül terjedő ORF-ben kódolódik, SOD-valképzett fúziós polipeptidként fejezzük ki. Ezt a C100 10összetett cDNS beiktatásával hajtjuk végre a humánszuperoxiddiszmutáz gént tartalmazó kifejezőkazet-tában, majd a kifejezőkazetta beiktatásával valamelykifejezővektorba, és a polipeptid kifejezésével élesz-tőben. 15 A 36., 81. és 32. klónokból származó összetettC100 cDNS-t tartalmazó kifejezőkazettát úgy alkotjukmeg, hogy ~1270 bp-s EcoRI-fragmentumot beiktatjuka pS3-56 (vagy más néven pS356) vektor EcoRI helyé-

5’-AAT TTG GGA ATT CCAAC CCT TAA GGT

Az EcoRI hely lehetővé teszi olyan heterológ szek-venciák beiktatását, amely - amikor a kazettát tartalma- 25zó vektorból kifejeződik - olyan polipeptidet termel,amely szuperoxiddiszmutázhoz van fuzionálva az aláb-bi aminosavszekvenciát tartalmazó oligopeptid-kap-csoló útján: -asn-leu-gly-ile-arg-. 30 A pS356 egyik mintáját 1988. április 29-én deponál-tuk a Budapesti Szerződés feltételei között az Ameri-can Type Culture Collectionnél (ATCC 12301 Park-lawn Drive, Rockville, Maryland 20853), ahol ez azATCC 67683 deponálási számot kapta. A feltételek és 35körülmények a deponált törzsek hozzáférhetőségét ésmegszerzését illetően ugyanazok, mint amelyet a II.A.fejezetben leírtunk az NANBV-cDNS-eket tartalmazótörzsekkel kapcsolatban. Ez a deponált törzs kizárólaga kényelmesebb megoldást szolgálja, és nem feltétlenül 40szükséges a jelen találmány gyakorlati megvalósításá-ban a jelen leírás alapján. A deponált törzsek a jelen be-jelentésbe referenciaként épülnek be.

Miután olyan rekombinánsokat izoláltunk, amelyekkorrekt orientációban tartalmazzák a C100 cDNS-t, a 45C100 cDNS-t tartalmanó kifejezőkazettát kimetsszükBamHI-gyel a pS3-56C)W)-ból, és egy ~3400 bp-s frag-mentumot, amely a kazettát tartalmazza, izolálunk éstisztítunk. Ezt a fragmentumot azután a pAB24 élesztő-vektor BamHI helyébe iktatjuk. 50 A pAB24, amelynek jelentősebb vonásait a 35. ábrá-ban mutatjuk be, élesztő „ingázó”-vektor, amely tartal-mazza a replikációhoz a teljes 2 mikronos szekvenciát[Broach (1981)], és tartalmaz pBR322 szekvenciákat. Eztartalmazza az YEp24 plazmidból [Botstein és munkatár- 55sai (1979)] származó élesztő URA3 gént, és a pCl/1plazmidból származó élesztő LEU2d gént (116,201 szá-mú európai szabadalmi közzétételi irat). A pAB24 plaz-midot úgy alkotjuk meg, hogy az YEp24-et EcoRI-gyelemésztjük, és a vektort újraligáljuk, hogy eltávolítsuk a 60 be, így alakítva ki a pS3-56cl()0 plazmidot. A Cl 00 megalkotását a fenti IV.A.16. fejezetben írtuk le. A pS3-56 vektor, amely pBR322 származék, olyankifejezőkazettát tartalmaz, amely az ADH2/GAPDHhibrid élesztőpromotorból áll a humán szuperoxiddisz-mutáz géntől fölfelé, és egy GAPDH transzkripciósterminátorból lefelé. Egy hasonló kazettát, amely eze-ket a szabályozóelemeket tartalmazza, valamint aszuperoxiddiszmutáz gént, írnak le Cousens és munka-társai (1987), és a folyamatban levő 196,056 számú eu-rópai szabadalmi közzétételi irat (közzétéve 1986. októ-ber 1-jén), amelynek bejelentői közösek a jelen talál-mány bejelentőivel. A pS3-56 kazetta azonban külön-bözik Cousens és munkatársai (1987) kazettájától,amennyiben a heterológ proinzulin gén és az immunglo-bulin „illesztés” ki van iktatva, és annyiban, hogy aszuperoxiddiszmutáz glu154-ét olyan adaptorszekvenciaköveti, amely egy EcoRI helyet tartalmaz. Az adaptorszekvenciája az alábbi:

TAA TGA G ATT ACT CAG CT- 3’ részleges 2 mikronos szekvenciákat. Az így létrejöttplazmidot, az YEP24deltaRI-t Clal-gyel végzett emész-téssel linearizáljuk, és ligáljuk a komplett 2 mikronosplazmiddal, amelyet előzőleg Clal-gyel linearizáltunk.Az így létrejött plazmidot, a pCBou-t, azután Xbal-gyelemésztjük és a 8605 bp-s vektorftagmentumot gélen izo-láljuk. Ezt az izolált Xbal fragmentumot a pC 1/1 -bői izo-lált LEU2d gént tartalmazó 4460 bp-s Xbal fragmentum-mal ligáljuk; a LEU2d gén orientációja ugyanabban azirányban van, mint az URA3 gén. A kifejeződés beiktatá-sa a pBR322 szekvencia egyedi BamHI helyén van, ígymegszakítva a tetraciklin iránti baktériumrezisztenciátszolgáló gént. A pAB24C100-3 rekombináns plazmidot, amelytartalmazza az SOD-C100 kifejezőkazettát, JSC 308élesztőtörzsbe, valamint más élesztőtörzsekbe transzfor-máljuk. A sejteket úgy transzformáljuk, amint eztHinnen és munkatársai (1978) leírták; és ura-szelektívlemezekre szélesztjük. Egyedi telepeket izolálunk leu-szelektív tápközegekre, és telítettségig növesztjük. A te-nyészetet SOD-C100 polipeptid (amelyet C100-3-nakis neveznek) kifejezésére indukáljuk, 1% glükózt tartal-mazó YEP-ben növesztve. A JSC 308 törzs MAT+, leu2, ura3(del),DM15(GAP/ADR1) geno- típusú, az ADRI lokusználintegrálva. A JSC 308-ban a pozitív aktivátor génter-mék, az ADRI, túlkifejezése hiperderepressziót ered-ményez (az ADRI vad típusú kontrolihoz viszonyítva),és a kifejezett heterológ fehérjék jelentősen magasabbkitermeléseit eredményezi, amikor az ilyen fehérjéketADH2 UAS szabályozórendszer révén szintetizáljuk.A JSC 308 élesztőtörzs megalkotását a még függőbenlevő 2300-0229 sorozatszámon bejelentett szabadalmileírás ismerteti, amelyet ezzel együtt jelentettünk be, ésamely a jelen bejelentésbe referenciaként épül be.A JSC 308 egyik mintáját 1988. május 5-én deponáltukaz ATCC-nél a Budapesti Szerződés feltételei szerint, 27 1

HU 220 204 B 2 ahol ez az ATCC 20879 számot kapta. A deponálás fel-tételeit és a deponált törzs hozzáférhetőségét, valaminta deponált törzs fenntartását illetően a II.A. fejezetbenismertették a mérvadók, amint ezt a HCV-cDNS-ekettartalmazó törzseknél leírtuk. A pAB24C100-3-ban kódolt komplett C100-3 fú-ziós polipeptid tartalmazza a humán SÓD 154 aminosa-vát az aminoterminálisnál, az EcoRI helyet tartalmazószintetikus adaptorból származó 5 aminosavat, aCl00 cDNS-ből származó 363 aminosavgyököt, és azMS2 nukleotidszekvenciából származó 5 karboxitermi-nális aminosavat a 32. kiónban levő HCV-cDNS-szek-venciával érintkezve (lásd a IV.A.7. fejezetet). Ezenpolipeptid karboxiterminálisának vélt aminosavszek-venciáját, amely az SÓD utolsó előtti Alá gyökénél kez-dődik, a 36. ábrában mutatjuk be; a polipeptidnek ezt arészét kódoló nukleotidszekvenciát szintén bemutatjuk.IV.B.5. A C100-on belül kódolt polipeptid azonosításaNANBH-val társult antigénként A pAB24100-3 plazmidból a JSC 308 élesztőtörzs-ben kifejezett C100-3 fúziós polipeptidet jellemezzükméret szerint, és a C100-on belül kódolt polipeptidetNANBH-val társult antigénként azonosítjuk immunoló-giai reaktivitásuk alapján krónikus NANBH-ban szen-vedő ember szérumával. A C100-3 polipeptidet, amelyet úgy fejezünk ki,amint ezt a IV.B.4. példában leírtuk, az alábbiak szerintelemezzük. Élesztő JSC 308 sejteket transzformálunkpAB24-gyel vagy pAB24C100-3-mal, és úgy indukál-juk, hogy a heterológ plazmid kifejezze a kódolt poli-peptidet. Az 1 ml tenyészetben (OD65o nm~20) levő in-dukált élesztősejteket 10 000 fordulat/perccel 1 percenát végzett centrifúgálással üledékbe visszük, és lizáljukélénken forgatva Vortex-készüléken 2 térfogat oldat és1 térfogat üveggyöngy (0,2 millimikron átmérő) jelen-létében. Az oldat 50 mmol/1 trisz-HCl-t, (pH 8,0),1 mmol/1 EDTA-t, 1 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluo-ridot (PMSF) és 1 mikrogramm/ml pepsztatint tartal-maz. A lizátumban levő oldhatatlan anyagot, amely ma-gában foglalja a C100-3 polipeptidet, centrifúgálással(10 000 fordulat/perc, 5 perc) összegyűjtjük, és felold-juk 5 percig forralva Laemmli SDS mintapufferral[lásd Laemmli (1970)]. Az indukált élesztőtenyészet0,3 ml-nyi mennyiségével ekvivalens mennyiségű poli-peptidet elektroforézisnek vetünk alá 10%-os poliak-rilamidgélen SDS jelenlétében [Laemmli (1970)]. Fe-hérjestandardokat elektroforetizálunk a géleken ezek-kel együtt. A kifejezett polipeptideket tartalmazó géle-ket vagy Coomassie-brilliantkékkel festjük, vagy „Wes-tem”-foltképzésnek vetjük alá, amint ezt a IV.B.2. feje-zetben leírtuk, krónikus NANBH-ban szenvedő beteg-ből kapott szérumot alkalmazva, hogy meghatározzuka pAB24-ből és pAB24C100-3-ból kifejezett polipepti-dek immunológiai reaktivitását.

Az eredményeket a 37. ábrában mutatjuk be.A 37a. ábrában a polipeptideket Coomassie-brilliant-kékkel festjük. A pAB24-gyel transzformált JSC 308-ból és a pAB24C100-3-mal transzformált JSC két kü-lönböző telepéből való oldhatatlan polipeptideket az 1.csíkban (pAB24), illetve a 2. és 3. csíkban mutatjuk be. A 2. és 3. csíkok összehasonlítása az 1. vonallal egy~54 000 D molekulatömegnek megfelelő indukált poli-peptidet mutat, amely a pAB24C100-3-mal transzfor-máit JSC 308-ból származik; ez a PAB24-gyel transz-formáit JSC 308-ban nem indukálódik. Ezt a polipep-tidet nyíllal jelöljük. A 37b. ábra a pAB24-gyel (1. csík) vagypAB24C100-3-mal (2. csík) transzformált JSC 308-ban kifejezett oldhatatlan polipeptidek Westem-foltjai-nak eredményeit mutatja be. A pAB24-ből kifejezettpolipeptidek immunológiailag nem reaktívak egyNANBH-ban szenvedő emberből való szérummal.Amint a nyíl jelzi, a pAB24C100-3-mal transzformáltJSC 308 egy olyan ~54 000 D molekulatömegű polipep-tidet fejez ki, amely viszont immunológiailag reagál ahumán NANBH szérummal. A további immunológiai-lag reaktív polipeptidek a 2. vonalban lehetnek ennek a~54 000 D-os polipeptidnek bomlási vagy aggregáló-dási termékei. IV.B.6. A C100-3 fúziós polipeptid tisztítása A C100-3 fúziós polipeptidet, amely az N-terminá-lisánál SOD-t tartalmaz és C-terminálisánál azonos ke-retben Cl00 HCV polipeptidet, tisztítjuk az extraháltgazda élesztősejtek, amelyekben a polipeptid kifeje-ződik, oldhatatlan frakciójának differenciálextrak-ciójával. A C100-3 fúziós polipeptidet a pAB24C100-3-mal transzformált JSC 308 élesztőtörzsben fejezzük ki,amint ezt a IV.B.4. fejezetben kifejtjük. Az élesztősejte-ket azután homogenizálással lizáljuk, a lizátumbanlevő oldhatatlan anyagot pH 12,0-nél extraháljuk, és amaradék oldhatatlan frakcióban levő C100-3-at SDS-ttartalmazó pufferban szolubilizáljuk.

Az élesztőlizátumot lényegében úgy állítjuk elő,amint ezt Nagahuma és munkatársai (1984) leírják.Olyan élesztősejt-szuszpenziót állítunk elő, amelyben33% (térfogat/térfogat) sejtet szuszpendálunk olyan ol-datban („A” puffer), amely 20 mmol/1 trisz-HCl-t (pH8,0), 1 mmol/1 ditiotreitolt és 1 mmol/1 fenil-metil-szul-fonil-fluoridot (PMEF) tartalmaz. A szuszpenzió (15 ml)egy aliquotját összekeverjük azonos térfogatú üveg-gyönggyel (0,45-0,50 mm átmérő), és a keveréket Vor-tex-berendezésen [Super Mixer (Láb Line Instruments,Inc.)] csúcssebességnél 8 percig forgatjuk. A homoge-nizátumokat és az üveggyöngyöket elkülönítjük, és azüveggyöngyöket háromszor mossuk azonos térfogatú„A” pufferban, mint az eredeti betöltött sejtek térfogata.A mosóoldatok és a homogenizátum egyesítése után alizátumban levő oldhatatlan anyagot a homogenizátum7000xg-nél, 15 percen át 4 °C hőmérsékleten végzettcentrifúgálásával, az üledéknek az eredetileg betöltött sej-tek kétszeres térfogatával azonos térfogatú „A” puffer-ban való újraszuszpendálásával, és az így kapott anyag-nak 7000xg-nél 15 percen át végzett centrifúgálásávalkapjuk meg. Ezt a mosási munkamenetet háromszor is-mételjük. A lizátumból az oldhatatlan anyagot pH 12,0-nélextraháljuk az alábbiak szerint. Az üledéket olyan puf-ferban szuszpendáljuk amely 0,5 mol/1 NaCl-ot és1 mmol/1 EDTA-t tartalmaz, ahol a szuszpendáló térfo- 28 1

HU 220 204 B 2 gat az eredetileg betöltött sejtek 1,8-szerese. A szusz-penzió pH-ját beállítjuk 0,2 térfogat 0,4 mol/l-es Na-foszfát-puffer (pH 12,0) hozzáadásával. Összekeverésután a szuszpenziót 7000xg-nél centrifugáljuk 15 per-cig 4 °C hőmérsékleten, és a felülúszót eltávolítjuk. Azextrahálást kétszer megismételjük. Az extrahált üledé-ket mossuk olyan módon, hogy szuszpendáljuk ezeket0,5 mol/1 NaCl-ot és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó oldat-ban az eredeti betöltött sejtek kétszeres térfogatánakmegfelelő szuszpendáló térfogatot alkalmazva, ezt pe-dig centrifugálás követi 7000xg-nél 15 percen át 4 °Chőmérsékleten.

Az extrahált üledékben levő C100-3 polipeptidetSDS-sel végzett kezeléssel szolubilizáljuk. Az üledéke-ket az eredeti betöltött térfogat 0,9-szeres térfogatávalazonos mennyiségű „A” pufferban szuszpendáljuk és0,1 térfogat 2%-os SDS-t adunk hozzá. Miután a szusz-penziót összekevertük, 7000xg-nél centrifugáljuk15 percen át 4 °C hőmérsékleten. Az így létrejött üledé-ket még háromszor extraháljuk SDS-sel. Az így létrejö-vő felülúszókat, amelyek C100-3-at tartalmaznak,összegyűjtjük.

Ez a munkamenet a C100-3-at több mint tízszere-sen tisztítja az élesztőhomogenizátum oldhatatlan frak-ciójából, és a polipeptid kinyerése 50%-nál több. A fúziós polipeptid tisztított készítményét poliak-rilamid-gélelektroforézissel elemezzük Laemmli (1970)szerint. E szerint az elemzés szerint a polipeptid 80%-nál nagyobb tisztaságú, és látszólagos molekulatömege~54 000 D. IV.C. RNS kimutatása fertőzött egyénekben, amelyRNS hibridizál a HCV-cDNS-hezIV.C.l. NANBH-ban szenvedő csimpánz májában levőRNS azonosítása, amely RNS HCV-cDNS-sel hibridizál NANBH-ban szenvedő csimpánz májából szárma-zó RNS-ben az alábbiak szerint mutatunk ki olyanRNS-fajtát, amely Northem-foltképzéssel hibridizál a81. kiónon belül levő HCV-cDNS-hez.

Annak a csimpánznak, amelyből a nagy titerű plaz-ma származik (lásd a IV.A.l. fejezetet), a májából biop-sziával mintát veszünk, és ebből RNS-t izolálunk azt atechnikát alkalmazva, amelyet Maniatis és munkatársai(1982) írtak le a teljes RNS izolálására emlőssejtekbőlés ezek elkülönítésére poli-A+ és poli-A- frakciókra.Ezeket az RNS-frakciókat elektroforézisnek vetjük aláformaldehid/agaróz gélen [1% (tömeg/térfogat) és nitro-cellulózra visszük át [Maniatis és munkatársai (1982)].A nitro-cellulóz-szűrőket a 81. kiónból való radioaktí-van jelzett HCV-cDNS-sel hibridizáljuk (lásd a 4. ábráta beiktatás nukleotidszekvenciájával kapcsolatban). Ab-ból a célból, hogy radioaktív vizsgálómintát állítsunkelő, a 81. kiónból izolált HCV-cDNS-beiktatást radioak-tívan jelezzük 32P-vel hézag- (nick-) transzláció segítsé-gével DNS polimeráz I-et alkalmazva [Maniatis és mun-katársai (1982)]. A hibridizálást 18 órán át végezzük42 °C hőmérsékleten olyan oldatban, amely 10% (tö-meg/térfogat) dextrán-szulfátot, 50% (tömeg/térfogat)ionmentesített formamidot, 750 mmol/1 NaCl-ot,75 mmol/I Na-citrátot, 20 mmol/1 Na2HPO4-et (pH6,5), 0,1% SDS-t, 0,02% (tömeg/térfogat) szarvasmar- ha-szérumalbumint (BSA), 0,02% (tömeg/térfogat) Fi-coll-400-at, 0,02% (tömeg/térfogat) poli(vinil-pirroli-don)-t, 100 mikrogramm/ml lazacsperma-DNS-t (ame-lyet előzőleg ultrahangos kezeléssel nyírtunk és denatu-ráltunk) és 106 CPM/ml hézag- (nick-) transzlatáltcDNS vizsgálómintát tartalmaz.

Az átvizsgált szűrő autoradiogramját a 38. ábránmutatjuk be. Az 1. csík tartalmazza a 32P-vel jelzettrestrikciós fragmentummarkereket. A 2-4. csíkok tar-talmazzák a csimpánzmáj-RNS-eket az alábbiak sze-rint: a 2. csík 30 mikrogramm teljes RNS-t tartalmaz; a3. csík 30 mikrogramm poli-A- RNS-t tartalmaz; ésa 4. csík 20 mikrogramm poli-A+ RNS-t tartalmaz.Amint a 38. ábrában látható, az NANBH-ban szenvedőcsimpánz mája rokon poli-A+ RNS-molekulák hetero-gén populációját tartalmazza, amelyek a HCV-cDNSvizsgálómintához hibridizálnak, és amelyek, úgy tűnik,mintegy 5000 nukleotid és mintegy 11 000 nukleotidközti méretűek. Ez az RNS, amely a HCV-cDNS-selhibridizál, a vírusgenomokat és/vagy a vírusgenom faj-lagos átiratait képviselheti. A IV.C.2. fejezetben a későbbiekben leírt kísérletegybevág azzal a feltételezéssel, hogy a HCV egy RNSgenomot tartalmaz. IV.C.2. HCV eredetű RNS azonosítása fertőzött egye-dek szérumában

Nagy titerű csimpánz-NANBH-plazmából izolált ré-szecskékből nukleinsavakat extrahálunk, amint ezt aIV.A.l. fejezetben leírtunk. Az izolált nukleinsavakbólaliquotokat (1 ml eredeti plazmának megfelelőket) újra-szuszpendálunk 20 mikroliter olyan oldatban, amely50 mmol/1 Hepes-t (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA-t és16 mikrogramm/ml oldható élesztő-RNS-t tartalmaz.A mintákat denaturáljuk 5 perces fonalással, amelyetazonnal fagyasztás követ, majd RNáz A-val [5 mik-roliter, amely 0,1 mg/ml RNáz A-t, 25 mmol/1 EDTA-tés 40 mmol/1 Hepes-t (pH 7,5) tartalmaz], vagy DNáz I-gyel [5 mikroliter, amely 10 mmol/1 MgCl2-ot és25 mmol/1 Hepes-t (pH 7,5) tartalmazó oldatban 1 egy-ség DNáz I-et tartalmaz] kezeljük; a kontrollmintá-kat enzim nélkül inkubáljuk. Az inkubálást követően230 mikroliter jéghideg 2 x SSC-t, amely még 2 mik-rogramm oldható élesztő-RNS-t is tartalmaz, adunk hoz-zá, és a mintákat nitro-cellulóz-szűrőn szüljük. A szűrő-ket a 81. klónból való cDNS vizsgálómintákkal hibridi-záljuk, amely vizsgálómintákat előzőleg 32P-vel jelez-tünk hézag- (nick-) transzláció segítségével. A 39. ábraa szűrő autoradiogramját mutatja be. A hibridizációsjelzései kimutathatók a DNázzal kezelt és kontrollmin-tákban (2., illetve 1. csíkok), de nem mutathatók ki azRNázzal kezelt mintában (3. csík). így mivel az RNáz-kezelés elroncsolja a részecskékből izolált nukleinsava-kat, és a DNáz I kezelésnek nincs hatása, ez a bizonyí-ték erősen sugallja, hogy a HCV genom RNS-ből áll.IV.C.3. HCV-nukleinsavszekvenciákból származó amp-lifikált (a továbbiakban: kibővített) HCV-nukleinsav-szekvenciák kimutatása NANBH-ban szenvedő csimpán-zokból való máj- és plazmamintákban NANBH-ban szenvedő csimpánzok és kontrollcsim-pánzok májában és plazmájában jelen levő HCV-nuk- 29 1

HU 220 204 B 2 leinsavakat megsokszorozni lényegében azt a polime-ráz-láncreakciós technikát (PCR) alkalmazva, amelyetSaihi és munkatársai (1986) leírtak. A primer oligonuk-leotidok a 81. kiónban, vagy 36. és 37. kiónban levőHCV-cDNS-ből származnak. A kibővített szekven-ciákat gélelektroforézissel és Southem-foltképzéssel mu-tatjuk ki, vizsgálómintaként a megfelelő cDNS oligo-mert alkalmazva abból a területből való szekvenciával,amely a két primer között van, de a két prímért nem fog-lalja magában. A kibővítési módszerrel vizsgálandó HCV-szekven-ciákat tartalmanó RNS-mintákat három, NANBH-banszenvedő csimpánz és két kontrollcsimpánz májbiop-sziás mintájából izoláljuk. Az RNS-frakció izolálását aIV.C.l fejezetben leírt guanidium-tiocianátos eljárássalvégezzük.

Az RNS mintáit, amelyet a kibővítési rendszerrel ki-bővíteni szándékozunk, izoláljuk két, NANBH-banszenvedő csimpánz plazmájából és egy kontrollcsim-pánz plazmájából, valamint kontrollcsimpánzokból szár-mazó plazmák gyűjteményéből. Az egyik fertőzött csim-pánznak 106 vagy nagyobb a CID/ml értéke, és a másik-nak 105 vagy nagyobb a CID/ml értéke. A nukleinsavakat a plazmából az alábbiak szerintvonjuk ki. Vagy 0,1 ml, vagy 0,01 ml plazmát hígítunk1,0 ml végső térfogatra TENB/K-proteináz/SDS oldat-tal [0,05 mol/1 trisz-HCl (pH 8,0), 0,001 mol/1 EDTA,0,1 mol/1 NaCl, 1 mg/ml K-proteináz, és 0,5 SDS],amely még 10 mikrogramm/ml poliadenilsavat is tartal-maz, és inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 60 percig. Ezután a K-proteináz-emésztés után az így létrejövő plaz-mafrakciókat fehérjementesítjük TE-vel [10,0 mmol/1trisz-HCl (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA] telített fenollalvégzett extrahálással. A fenolos fázist centrifugálássalelkülönítjük és újból extraháljuk 0,1% SDS-t is tartalma-zó TENB-vel. Az egyes extrakciókból így kapott vizesfázisokat egyesítjük és kétszer extraháljuk azonos térfo-gatú keverékkel, amely fenolt, kloroformot és izoamil-alkoholt tartalmaz (1:1, illetve 99:2 arányban), majdkétszer extraháljuk azonos térfogatú másik keverékkel,amely kloroformot és izoamil-alkoholt tartalmaz (99:1arányban). A centrifugálással végzett fáziselkülönítéstkövetően a vizes fázist végső koncentrációként 0,2 mó-lossá tesszük Na-acetátra, és a nukleinsavakat két térfo-gat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A kicsapott nuklein-savakat SW 41 rotorban 38K-nál 60 percen át 4 °C hő-mérsékleten végzett ultracentrifugálással kinyerjük. A fentieken kívül a magas titerű csimpánzplazmátés az összegyűjtött kontrollplazmát egy másik eljárásszerint 5 mikrogramm poli-A hordozóval extraháljukChomczyzski és Sacchi (1987) eljárása szerint. Ez az el-járás savas guanidium-tiocianátos extrahálást alkalmaz.Az RNS-t 10 000 fordulat/percnél, Eppendorf-mikro-centrifugában 10 percig, 4 °C hőmérsékleten végzettcentrifugálással nyerjük ki. Két esetben a cDNS szintézise előtt a PCR-reak-cióban a K-proteináz (SDS) fenolos eljárással plazmá-ból extrahált nukleinsavakat tovább tisztítjuk S és SElutip-R oszlopokhoz való kötéssel és erről leoldással.Az eljárást a gyártók előírásait követve hajtjuk végre. A PCR-reakcióban templátként alkalmazott cDNS-ek a fentebb leírtak szerint készített nukleinsavakból ké-szülnek (vagy teljes nukleinsavak, vagy RNS-ek). Azetanolos kicsapást követően a kicsapott nukleinsavakatszárítjuk és újból szuszpendáljuk DEPC-vel kezelt desz-tillált vízben. A nukleinsavakban levő szekunder szerke-zeteket 65 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett keze-léssel szétzúzzuk, és a mintákat jégen azonnal lehűtjük.cDNS-t szintetizálunk 1-3 mikrogramm, májból eredőteljes csimpánz-RNS-t alkalmazva, vagy 10-100 mik-roliter plazmából extrahált nukleinsavakból (vagyRNS-ből). A szintézis reverz transzkriptázt alkalmaz és25 mikroliter reakció-térfogatban megy végbe, a gyártó(BRL) által pontosított munkamenetet alkalmazva.A cDNS-szintézisben szolgáló primerek azok, amelye-ket a fentebb leírt PCR-reakcióban is alkalmazunk.A cDNS-szintézishez alkalmazott összes reakciókeve-rék 23 egység RNáz inhibitort tartalmaz [RNASIN(Fisher/Promega)]. A cDNS-szintézist követően a reak-ciókeverékeket vízzel hígítjuk, 10 percig forraljuk, és jé-gen gyorsan lehűtjük. A PCR-reakciókat lényegében úgy hajtjuk végre,ahogyan ezt a gyártók (Cetus, Perkin-Elmer) útmutatóileírják, azzal a különbséggel, hogy 1 mikrogrammRNáz A-t adunk hozzá. A reakciót 100 mikroliter végsőtérfogatban hajtjuk végre. A PCR-t 35 ciklusban hajtjukvégre, 37 °C, 72 °C és 94 °C menetrendet alkalmazva. A primerek a cDNS-szintézishez és a PCR-reak-ciókhoz vagy a 81. vagy a 36. vagy a 37b. kiónban levőHCV-cDNS-szekvenciákból származnak. (A 81., 36. és37b. kiónok HCV-cDNS-szekvenciáit a 4., 5., illetve10. ábrában mutatjuk be). A 81. klónból származó két16-mer primer szekvenciája az alábbi: 5’-CAA TCA TAC CTG ACA G-3’és 5’-GAT AAC CTC TGC CTG A-3’ A 36. kiónból származó primer szekvenciája azalábbi: 5’-GCA TGT CAT GAT GTA T-3’ A 37b. klónból származó primer szekvenciája azalábbi: 5’-ACA ATA CGT GTG TCA C-3’ A PCR-reakciókban a primer párok vagy a 81. klón-ból származó két 16-merből, vagy a 36. klónból szár-mazó 16-merből és a 37b. klónból származó 16-merbőlállnak. A PCR-reakciótermékeket a termékek alkalikusgélelektroforézissel végzett elkülönítésével elemezzük,ahol az elkülönítést Southem-foltképzés követi, majd akibővített HCV-cDNS-szekvenciákat kimutatjuk HCV-cDNS olyan területéből származó, 32P jelzett belső oli-gonukleotid vizsgálómintával, amely terület nem fediát a prímért. A PCR-reakciókeverékeket fenol/kloro-formmal extraháljuk és a nukleinsavakat a vizes fázis-ból sóval és etanollal kicsapjuk. A kicsapott nukleinsa-vakat centrifugálással összegyűjtjük, és desztillált víz-ben feloldjuk. A minták aliquotjait elektroforézisnekvetjük alá 1,8%-os agarózgéleken. 60, 108 és 161 nuk-leotid hosszúságú egy szálú DNS-eket molekulatömeg-markerként együtt elektroforetizálunk a géleken. Elekt- 30 1

HU 220 204 B 2 roforézis után a gélen levő DNS-eket átvisszük „BioradZeta Probe” papírra. Az előhibridizálást, hibridizálástés a mosási körülményeket a gyártó (Biorad) útmutatá-sai szerint alakíthatjuk ki. A kibővített HCV-cDNS-szekvenciák hibridizációskimutatásához alkalmazott vizsgálóminták az alábbiak.Amikor a PCR primerek páija a 81. klónból származik,a vizsgálóminta olyan szekvenciának megfelelő 108-mer, amely szekvencia a két primer szekvenciája köztiterületen helyezkedik el. Amikor a PCR primerek párjaa 36. és 37b. klónokból származik, a vizsgálómintaa 35. klónból származó, hézag- (nick-) transzlatáltHCV-cDNS-beiktatás. A primerek a 37b. klónbeiktatás155-170. nukleotidjaiból, és a 36. klónbeiktatás206-268. nukleotidjaiból származnak. A 35. kiónbanlevő HCV-cDNS-beiktatás 3’-vége átfedi a 37b. kión-ban levő 207-269. nukleotidokat (vesd össze az 5., 8.és 10. ábrákat). így a 35. kiónban levő cDNS-beiktatásátfogja a 36. és 37b. eredetű primerek szekvenciája köz-ti terület egy részét, és alkalmas vizsgálómintakéntazokhoz a kibővített szekvenciákhoz, amelyek ezeket aprintereket magukban foglalják. A májmintákból származó RNS elemzését a fentimunkamenet szerint végezzük mind a primerek, mind avizsgálóminták készletét alkalmazva. Az NANBH-banszenvedő három csimpánz májából való RNS pozitívhibridizációs eredményeket mutat a várt méretű (161.és 586. nukleotid a 81-nél, illetve 36-nál és 37b-nél) ki-bővített szekvenciákra, míg a kontrollcsimpánzok nega-tív hibridizációs eredményeket mutatnak. Ugyanezeketaz eredményeket érjük el akkor is, amikor a kísérletetháromszor megismételjük. A plazmából való nukleinsavak és RNS elemzésé-hez szintén a fenti munkamenetet alkalmazzuk, a 81.klónból származó printereket és vizsgálómintát alkal-mazva. A plazmák az alábbiak: két, NANBH-ban szen-vedő csimpánzból való plazma; egy kontrollcsimpánz-ból való plazma, és kontrollcsimpánzból összegyűjtöttplazma. Mindkét NANBH-plazma olyan nukleinsava-kat/RNS-eket tartalmaz, amelyek pozitív eredményeketadnak a PCR-kibővítési vizsgálatban, míg mindkétkontrollplazma negatív eredményeket nyújt. IV.D. Radioimmunesszé HCV antitestek kimutatásárafertőzött egyénekből való szérumokban

Szilárd fázisú radioimmunasszét fejlesztünk ki HCVantigének ellen antitestek kimutatására, Tsu ésHerzenberg (1980) közleménye alapján. Mikrotitrálóle-mezeket (Immulon 2, Removawell csíkok) burkolunkbe HCV epitópokat tartalmazó tisztított polipeptidekkel.A burkolt lemezeket vagy humán szérummintákkalinkubáljuk, amelyekről feltételezhető, hogy HCV epitó-pok elleni antitesteket tartalmaznak, vagy megfelelőkontrolokkal inkubáljuk. Az inkubálás során az antitest,ha van jelen, immunológiailag kötődik a szilárd fázisúantigénhez. A nem kötött anyag eltávolítása és a mikro-titrálólemezek mosása után humán antitest - NANBVantigén komplexeket mutatunk ki 125I-vel jelzett juh-antihumán immunglobulinnal végzett inkubálással.A nem kötött, jelzett antitestet leszívással eltávolítjuk,és a lemezeket mossuk. A radioaktivitást az egyes üre- gekben mérjük; a kötött humán anti-HCV antitestmennyisége arányos az üregben levő radioaktivitással.IV.D.l. Az SOD-NANB5_!_! fúzióspolipeptid tisztítása

Az SOD-NANB5_,_1 fúziós polipeptidet, amelyetrekombináns baktériumokban fejezünk ki, amint ezt aIV.B.l. fejezetben leírtuk, a rekombináns E. coliból asejtextraktumok karbamiddal végzett differenciálext-rakciójával tisztítjuk, amelyet anion- vagy kationcse-rélő oszlopon végzett kromatográfia követ az alábbiakszerint. 1 liter tenyészetből való fagyasztott sejteket újra-szuszpendálunk 10 ml 20%-os (tömeg/térfogat) sza-charózoldatban, amely 0,01 mol/1 trisz-HCl-t (pH 8,0)tartalmaz, és 0,4 ml 0,5 mol/l-es EDTA-oldatot (pH8,0) adunk hozzá. 5 perces állás után 0 °C hőmérsékle-ten a keveréket 4000xg-nél 10 percig centrifugáljuk.Az így létrejövő üledéket 10 ml 25%-os (tömeg/térfo-gat) szacharózban szuszpendáljuk, amely 0,05 mol/1trisz-HCl-t (pH 8,0), 1 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) és 1 mikrogramm/ml pepsztatin A-tis tartalmaz, majd 0,5 ml lizozimot (10 mg/ml) adunkhozzá, és 0 °C hőmérsékleten 10 percig inkubáljuk.10 ml 1% (térfogat/térfogat) Triton X-100 hozzáadásaután, amely 0,05 mol/1 trisz-HCl-t (pH 8,0) és 1 mmol/1EDTA-t tartalmazó oldatban van, a keveréket további10 percen át inkubáljuk 0 °C hőmérsékleten, alkalman-ként rázogatva. Az így létrejövő viszkózus oldatot ho-mogenizáljuk olyan módon, hogy hatszor átnyomjuksteril, 20-as kaliberű injekciós fecskendőn, és centrifu-gáljuk 13 OOOxg-nél 25 percen át. Az üledékbe vittanyagot 5 ml 0,01 mol/literes trisz-HCl-ben (pH 8,0)szuszpendáljuk, és a szuszpenziót 4000 x g-nél centrifu-gáljuk 10 percen át. Az üledéket, amely SOD-NANB5 r lfúziós fehérjét tartalmaz, feloldjuk 5 ml 6 mol/l-es kar-bamidban, amely 0,02 mol/1 trisz-HCl-t (pH 8,0) és1 mmol/1 ditiotreitolt tartalmazó oldatban („A” puffer)van, és ezt „A” pufferral kiegyensúlyozott Q-Sepha-rose Fast-Flow oszlopra tápláljuk. A polipeptideket„A” pufferban levő 0,0-0,3 mol/1 NaCl lineáris gra-dienssel eluáljuk. Az eluálás után a frakciókat poliak-rilamid-gélelektroforézissel elemezzük SDS jelenlété-ben, hogy meghatározzuk SOD-NANBs.^j-tartalmu-kat. Az ezt a polipeptidet tartalmazó frakciókat össze-gyűjtjük, és dializáljuk 0,02 mol/1 nátrium-foszfát-puf-fert (pH 6,0) és 1 mmol ditiotreitolt tartalmazó oldat-ban („B” puffer) levő 6 mmol/1 karbamiddal szemben.A dializált mintát „B” pufferral kiegyensúlyozott S-Se-pharose Fast-Flow oszlopra tápláljuk, és a polipeptide-ket „B” pufferban levő 0,0-0,3 mol/1 NaCl lineáris gra-diensével eluáljuk. A frakciókat poliakrilamid-gélelekt-roforézissel elemezzük SOD-NANB5„1_1 jelenlétére,és a megfelelő frakciókat összegyűjtjük.

Az SOD-NANB5_1_1 polipeptid végső készítmé-nyét elektroforézissel megvizsgáljuk poliakrilamidgé-len SDS jelenlétében. E szerint az elemzés szerint a ké-szítmény tisztasága 80%-nál több. IV.D.2. Az SOD-NANB^j fúziós polipeptid tisztítása

Az SOD-NANB81 fúziós polipeptidet, amelyet re-kombináns baktériumokban fejezünk ki, amint ezt aIV.B.2. fejezetben leírtuk, a rekombináns E. coliból a 31 1

HU 220 204 B 2 sejtextraktumok karbamiddal végzett differenciálextrak-ciójával tisztítjuk, amelyet anion- vagy kationcserélő osz-lopon végzett kromatográfia követ, azt a munkamenetetalkalmazva, amelyet az SOD-NANB5fúziós poli-peptid izolálásánál leírtunk (lásd a IV.D.l. fejezetet).

Az SOD-NANBgl polipeptid végső készítményételektroforézissel megvizsgáljuk poliakrilamidgélenSDS jelenlétében. E szerint az elemzés szerint a készít-mény tisztasága 50%-nál több. IV.D.3. HCV epitópok elleni antitestek kimutatása szi-lárd fázisú radioimmunesszével 32 betegből, akikről azt diagnosztizálták, hogyNANBH-ban szenvednek, származó szérummintátelemzőnk radioimmunesszével (RIA), hogy meghatá-rozzuk, vajon az SOD-NANB5_|_! és SOD-NANBglfúziós polipeptidekben jelen levő HCV epitópok elleniantitestek kimutathatók-e.

Mikrotitrálólemezeket burkolunk be olyan SOD-NANB5_1_1-gyel vagy SOD-NANB81-gyel, amelyetrészlegesen megtisztítottunk a IV.D.l., illetve IV.D.2.fejezetekben leírtak szerint. A vizsgálatokat az aláb-biak szerint hajtjuk végre. 0,1-0,5 mikrogramm SOD-NANBs_|_|-et vagySOD-NANB81-et tartalmazó 100 mikroliteres aliquo-tokat, amelyek 0,125 mol/l-es Na-borát-puffert (pH8,3) és 0,075 mol/1 NaCl-ot tartalmazó oldatban (BBS)vannak, adunk egy mikrotitrálólemez (Dynatech Im-mulon 2, Removawell csíkok) egyes üregeihez. A le-mezt 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán átnedves kamrában, amely után a fehérjeoldatot eltávolít- juk, és az üreget háromszor mossuk 0,02% TritonΧ-100-at tartalmazó BBS-sel (BBST). Abból a célból,hogy megelőzzük a nem fajlagos kötéseket, az ürege-ket szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) burkoljukBBS-ben levő BSA 5 mg/ml-es oldatából 100 μΐ hozzá-adásával, amelyet 1 órás inkubálás követ szobahőmér-sékleten; ez után az inkubálás után a BSA-oldatot eltá-volítjuk. A burkolt üregekben levő polipeptideket rea-gáltatjuk szérummal olyan módon, hogy 1:100 arány-ban 0,01 mol/1 Na-foszfát-puffert (pH 7,2) és0,15 mol/1 NaCl-ot tartalmazó oldattal (PBS) - amelymég 10 mg/ml BSA-t is tartalmaz - hígított szérum-mintából 100 mikrolitert adunk hozzá, és a szérumottartalmazó üregeket 1 órán át inkubáljuk 37 °C hőmér-sékleten. Inkubálás után a szérummintákat leszívatás-sal eltávolítjuk, és az üregeket ötször mossuk BBST-vel. A fúziós polipeptidekhez kötött anti-NANB5_[_|és anti-NANB81-et a 125I-vel jelzett F’(ab)2 juh-anti-humán IgG kötésével határozzuk meg a beburkolt üre-gekhez. A jelzett vizsgálóminta 100 mikroliteresaliquotjait (fajlagos aktivitás 5-20 mikrocurie/mikro-gramm) hozzáadjuk az egyes üregekhez, és a lemeze-ket 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, ezt köve-ti a fölösleges vizsgálóminta eltávolítása leszívatással,és 5 mosás BBST-vel. Az egyes üregekben kötött radio-aktivitás mennyiségét olyan számlálóban (counter)mérjük, amely gamma-sugárzást mutat ki.

Az anti-NANB5_1_1 és anti-NANB81 kimutatásá-nak eredményeit NANBH-ban szenvedő egyénekbenaz 1. táblázatban mutatjuk be. 1. táblázat

Anti-5-1 -1 és anti-81 kimutatása NANB, HAV és HBV hepatitises betegek szérumaiban

Betcg-rcfercnciaszám Diagnózis S/N Anti-5-1-1 Anti-81 1.28' Krónikus NANB, ÍVD2 0,77 4,20 Krónikus NANB, ÍVD 1,14 5,14 Krónikus NANB, ÍVD 2,11 4,05 2.29' AVH3, NANB, szórványos 1,09 1,05 Krónikus, NANB 33,09 11,39 Krónikus, NANB 36,22 13,67 3.30' AVH, NANB, ÍVD 1,90 1,54 Krónikus NANB, ÍVD 34,17 30,28 Krónikus NANB, ÍVD 32,45 30,84 4.31 Krónikus NANB, PT4 16,09 8,05 5.32' Késői AVH NANB, ÍVD 0,69 0,94 Késői AVH NANB, ÍVD 0,73 0,68 6.33' AVH, NANB, ÍVD 1,66 1,96 AVH, NANB, ÍVD 1,53 0,56 7.34' Krónikus NANB, PT 34,40 7,55 Krónikus NANB, PT 45,55 13,11 Krónikus NANB, PT 41,58 13,45 Krónikus NANB, PT 44,20 15,48 8.35' AVH, NANB, ÍVD 31,92 31,95 Most „gyógyult” NANB, AVH 6,87 4,45 9.36 Késői AVH NANB PT 11,84 5,79 32

HU 220 204 B 1. táblázat (folytatás)

Beteg-referenciaszám Diagnózis S/N Anti-5-1-1 Anti-81 10.37 AVHNANB, ÍVD 6,52 1,33 11.38 Késői AVHNANB, PT 39,44 39,18 12.39 Krónikus NANB, PT 42,22 37,54 13.40 AVH, NANB, PT 1,35 1,17 14.41 Krónikus NANB, PT 0,35 0,28 15.42 AVH, NANB, ÍVD 6,25 2,34 16.43 Krónikus NANB, PT 0,74 0,61 17.44 AVH, NANB, PT 5,40 1,83 18.45 Krónikus, NANB, PT 0,52 0,32 19.46 AVH, NANB 23,35 4,45 20.47 AVH, „A” típus 1,60 1,35 21.48 AVH, „A” típus 1,30 0,66 22.49 AVH, „A” típus 1,44 0,74 23.50 Jelenleg gyógyult AVH, „A” típus 0,48 0,56 24.51 AVH, „A” típus Gyógyult AVH, „A” típus 0,68 0,80 0,64 0,65 25.52 Most gyógyult AVH, „A”típus Most gyógyult AVH, „A” típus 1,38 0,80 1,04 0,65 26.53 AVH, „A” típus Most gyógyult AVH, „A” típus 1,85 1,02 1,16 0,88 27.54 AVH, „A” típus 1,35 0,74 28.55 Késői AVH, HBV 0,58 0,55 29.56 Krónikus HBV 0,84 1,06 30.57 Késői AVH, HBV 3,20 1,60 31.58 Krónikus HBV 0,47 0,46 32.59' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 0,73 0,43 0,60 0,44 33.60' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 1,06 0,75 0,92 0,68 34.61' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 1,66 0,63 0,61 0,36 35.62' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 1,02 0,41 0,73 0,42 36.63' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 1,24 1,55 1,31 0,45 37.64' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 0,82 0,53 0,79 0,37 38.65' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 0,95 0,70 0,92 0,50 39.66' AVH, HBV Gyógyult AVH, HBV 1,03 1,71 0,68 1,39 1 Szérum-sorozatminták, amelyek ezekből a betegekből rendelkezésre állnak. 2 ÍVD=Intravénás gyógyszeralkalmazók. 3 AVH=Akut vírushepatitis. 4 PT=Transzfúzió után. 33 1

HU 220 204 B 2

Amint az 1. táblázatból látható, a 32 szérum közül,amelyek NANBH-ban szenvedő betegnek diagnosz-tizált betegekből származnak, 19 pozitív az SOD-NANBS_ i rben és SOD-NANBgrben jelen levő HCVepitópok ellen irányuló antitestek szempontjából.

Azok a szérumminták azonban, amelyek pozitívak,immunológiailag nem egyformán reaktívak SOD-NANB5_j |-gyel és SOD-NANBgrgyel. Az 1. számúbetegből való szérumminták pozitívak SOD-NANBgl-re, de SOD-NANB5_1_1-re nem. A 10., 15. és 17. szá-mú betegekből származó szérumminták pozitívakSOD-NANB5_1_ |-re, de SOD-NANBgl-re nem. A 3., 8., 11. és 12. betegekből származó szérumminták egy-formán reagálnak mindkét fúziós polipeptiddel, míg a 2., 4., 7. és 9. betegekből származó szérumminták 2-3-szor erősebb reakciót mutatnak SOD-NANB5_i_rhez,mint SOD-NANBgj-hez. Ezek az eredmények azt su-gallják, hogy a NANB5_|_, és NANBgl legalább 3 kü-lönböző epitópot tartalmaznak, azaz lehetséges, hogyaz egyes polipeptidek legalább 1 egyedi epitópot tartal-maznak, és hogy a két polipeptid legalább 1 polipep-tiden osztozik. IV.D.4. A szilárd fázisú RIA fajlagossága NANBH-ra A szilárd fázisú RIA-vizsgálatok fajlagosságátNANBH-ra úgy vizsgáljuk, hogy a vizsgálatot elvégez-zük HAV-val vagy HBV-vel fertőzött egyének széru-mán és kontrollegyének szérumán. A részlegesen tisztí-tott SOD-NANB5_i_ret és SOD-NANBgl-et alkalma-zó vizsgálatokat lényegében úgy hajtjuk végre, amintezt a IV.D.3. fejezetben leírtuk, azzal a kivétellel, hogya szérum olyan betegekből való, akikről előzőleg diag-nosztizálták, hogy HAV-ban vagy HBV-ben szenved-nek, vagy olyan egyénekből való, akik vérbankban vér- adók. A HAV-val és HBV-vel fertőzött betegekbőlvaló szérumokhoz tartozó eredményeket az 1. táblázat-ban adjuk meg. A Rí A-vizsgálatot 11 HAV-val fertő-zött beteg szérummintát és 20 HBV-vel fertőzött betegszérummintát alkalmazva hajtjuk végre. Amint az 1.táblázatban bemutatjuk, ezeknek a szérumoknak egyi-ke sem alakít ki pozitív immunológiai reakciót a BB-NANBV epitópokat tartalmazó fúziós polipeptidekkel.

Az NANB5 ]_j antigént alkalmazó RIA-vizsgála-tok kontrollegyénekből való szérum immunológiai reak-tivitásának meghatározására alkalmazzuk. A normálisvéradó populációból kapott 230 szérummintából csak2 adott pozitív eredményt a RIA-vizsgálatban (adatokatnem mutatunk be). Lehetséges, hogy az a két véradó,akikből ezek a szérumminták származnak, korábban kivolt téve HCV-nek. IV.D.5. AzNANB5_i_l reaktivitása azNANBH-fertőzéssorán

Az anti-NANB5„i_| antitestek jelenlétét 2 beteg és4 csimpánz NANBH-fertőzésének menete során követ-jük RIA-vizsgálatot alkalmazva, amint ezt a IV.D.3. fe-jezetben leírtuk. Ezenkívül a RIA-vizsgálatot arra is al-kalmazzuk, hogy meghatározzuk az antiNANB5_i_tjelenlétét vagy hiányát a HAV- és HBV-fertőzés mene-te során fertőzött csimpánzokban.

Az eredmények, amelyeket a 2. táblázatban muta-tunk be, azt mutatják, hogy csimpánzoknál és embe-reknél anti-NANB5_! | antitesteket mutatunk ki azNANBH-fertőzés akut fázisának beindulását követően.Nem mutatunk ki anti-NANB5_]_j antitesteket HAV-val vagy HBV-vel fertőzött csimpánzokból való szérum-mintákban. így ezek az anti-NANB5_, ) antitestek szol-gálnak markerként a HCV-vel fertőzött egyénekhez. 2. táblázat

Szérumkonverzió hepatitises betegekből és csimpánzokból való egymás utáni szérummintákban,5-1-1 antigént alkalmazva

Beteg/csimpánz A minta dátuma (nap)(0=az inokulálás napja) Hcpatitisvirus Anti-5-1-1 (S/N) ALT (mu/ml) 29. beteg y* NANB 1,09 1180 T+180 33,89 425 T+280 36,22 - 30. beteg T NANB 1,90 1830 T+307 34,17 290 T+799 32,45 276 1. csimpánz 0 NANB 0,87 9 76 0,93 71 118 23,67 19 154 32,41 - 2. csimpánz 0 NANB 1,00 5 21 1,08 52 73 4,64 13 138 25,01 - 3. csimpánz 0 NANB 1,08 8 43 1,44 205 53 1,82 14 159 11,87 6 34 1

HU 220 204 B 2 2. táblázat (folytatás)

Bctcg/csimpánz A minta dátuma (nap)(0=az inokulálás napja) Hepatitisvírus Anti-5-1-1 (S/N) ALT (mu/ml) 4. csimpánz -3 55 83 140 NANB 1,12 1,25 6,60 17,51 11 132 5. csimpánz 0 HAV 1,12 4 25 1,25 147 40 6,60 18 268 17,51 5 6. csimpánz -8 HAV 0,85 - 15 - 106 41 0,81 10 129 1,33 - 7. csimpánz 0 HAV 1,17 7 22 1,60 83 115 1,55 5 139 1,60 - 8. csimpánz 0 HAV 0,77 15 26 1,98 130 74 1,77 8 205 1,27 5 9. csimpánz -290 HBV 1,74 - 379 3,29 9 435 2,77 6 10. csimpánz 0 111-118 (gyűjtemény)205 240 HBV 2,35 2,74 2,05 1,78 8 96-155 (gyűjtemény) 9 13 11. csimpánz 0 28-56 (gyűjtemény) 169 223 HBV 1,82 1,26 0,52 11 8-100 (gyűjtemény) 9 10 * T=a kezdeti mintavétel napja. IV.E. NANBS_\_} ellenipoliklonális szérum antitestektisztítása

Az SOD-NANB5_1_1 polipeptid fajlagos immunoló-giai reaktivitása alapján az NANBH-ban szenvedő bete-gekből való szérummintákban levő antitestekkel eljárástfejlesztünk ki olyan szérum antitestek tisztítására, ame-lyek immunológiailag reagálnak az NANB5_1_1-benlevő epitóppal vagy epitopokkal. Ez az eljárás affinitás-kromatográfiát használ. Tisztított SOD-NANB5_,_,polipeptidet (lásd a IV.D.l. fejezetet) oldhatatlan hordo-zóanyaghoz rögzítünk; a rögzítés olyan, hogy az im-mobilizált polipeptid megőrzi affinitását az NANBS1elleni antitesthez. A szérummintában levő antitestek ab-szorbeálódnak a mátrixhoz kötött polipeptidhez. A mo-sás után, amelynek az a célja, hogy eltávolítsuk a nemfajlagosan kötött anyagokat és nem kötött anyagokat, akötött antitesteket kiszabadítjuk a kötött SOD-HCV po-lipeptidből a pH megváltoztatásával és/vagy kaotróp rea-gensekkel, például karbamiddal. Kötött SOD-NANB51_|-et tartalmazó membráno-kat készítünk az alábbiak szerint. Nitro-cellulóz-memb- ránt (2,1 cm-es Sartorius, 0,2 mikron pórusmérettel) mo-sunk háromszor 3 percig BBS-sel. Az SOD-NANB5_1_1a membránhoz kötődik a tisztított készítmény inku-bálásával BBS-ben szobahőmérsékleten 2 órán át; egymásik eljárás szerint ezt 4 °C hőmérsékleten inkubáljukegy éjszakán át. A nem kötött antigént tartalmazó olda-tot eltávolítjuk, és a szűrőt háromszor mossuk BBS-sel,mosásonként 3 percig. A membránon megmaradó aktívhelyeket BSA-val blokkoljuk 5 mg/ml BSA-oldattal30 percen át végzett inkubálással. A fölösleges BSA-t amembrán mosásával távolítjuk el, BBS-sel ötször ésdesztillált vízzel háromszor mosva. A vírusantigént ésBSA-t tartalmazó membránt azután 0,05 mol/1 glicin-hidrokloridot (pH 2,5) és 0,10 mol/1 NaCl-ot tartalmazóoldattal (GlyHCl) 15 percig kezeljük, majd három per-cig mossuk PBS-sel.

Poliklonális anti-NANB5 | _| antitesteket izolálunkolyan módon, hogy a fúziós polipeptidet tartalmazómembránokat inkubáljuk NANB-vel fertőzött egyének-ből származó szérummal 2 órán át. Az inkubálás után aszűrőket mossuk ötször BBS-sel, és kétszer desztillált 35 1

HU 220 204 B 2 vízzel. A kötött antitesteket azután az egyes szűrőkrőleluáljuk ötször GlyHCl-lel, elucióként 3-3 percig. Azeluátumok pH-ját 8-ra állítjuk be, az egyes eluátumokat2,0 mol/l-es trisz-HCl-t (pH 8,0) tartalmazó kémcsőbengyűjtve. Az anti-NANBs_1_1 antitest kinyerése affini-táskromatográfia után mintegy 50%. A kötött vírusantigént tartalmazó nitro-cellulóz-membránokat többször felhasználhatjuk észrevehetőcsökkenés nélkül a kötési kapacitásban. Abból a célból,hogy a membránt újból alkalmazzuk, miután az antites-teket eluáltuk, a membránokat háromszor három percigmossuk BBS-sel. Ezeket azután BBS-ben tároljuk 4 °Chőmérsékleten. IV.F. HCV-részecskék befogása fertőzött plazmából,tisztított humán poliklonális anti-HCV antitesteket al-kalmazva; a befogott részecskékben levő nukleinsavakhibridizálása HCV-cDNS-hez. IV.F.l. A HCV-részecskék befogása fertőzött plazmá-ból, humán poliklonális anti-HCV antitesteket alkal-mazva

Egy NANBH-ban szenvedő csimpánz fertőzött plaz-májában jelen levő fehéije-nukleinsav komplexeket izo-lálunk, olyan tisztított humán poliklonális anti-HCV an-titesteket alkalmazva, amelyek polisztirolgyöngyökhözvannak kötve.

Poliklonális anti-NANB5_[_, antitesteket tisztítunkegy NANBH-ban szenvedő ember szérumából, az5-1-1. kiónban kódolt SOD-HCV polipeptidet alkal-mazva. A tisztítási eljárás az, amelyet a IV.E. fejezet-ben írtunk le. A tisztított anti-NANB5_! ! antitesteket poliszti-rolgyöngyökhöz [1/4” (~0,64 cm) átmérő, tükörfényesfelület, Precision Plastic Ball Co., Chicago, Illinois] köt-jük szobahőmérsékleten inkubálva egy éjszakán át 1 mlantitesttel [1 mikrogramm/ml boráttal pufferolt fi-ziológiás konyhasóoldatban (pH 8,5)]. Az egy éjszakánát végzett inkubálást követően a gyöngyöket mossukegyszer TBST-vel [50 mmol/1 trisz-HCl (pH 8,0),150 mmol/1 NaCl, 0,05% (térfogat/térfogat)Tween-20], majd olyan, foszfáttal pufferolt fiziológiáskonyhasóoldattal (PBS), amely 10 mg/ml BSA-t is tar-talmaz,

Kontrollgyöngyöket készítünk azonos módon, az-zal a kivétellel, hogy a tisztított anti-NANB5_1_1 anti-testeket teljes humán immunglobulinnal helyettesítjük. A HCV befogását NANBH-val fertőzött csimpánz-plazmából a gyöngyökhöz kötött anti-NANB5_| _ ret al-kalmazva a következőképpen hajtjuk végre. EgyNANBH-val fertőzött csimpánzból való plazmát alkal-mazunk, amelyet a IV.A.l. fejezetben leírtunk. AzNANBV-vel fertőzött csimpánzplazma egy aliquotját(1 ml) inkubáljuk 3 órán át 37 °C hőmérsékleten 5-5gyönggyel, amelyek vagy anti-NANB5_|_! antitestek-kel, vagy kontroll immunglobulinokkal vannak bevon-va. A gyöngyöket háromszor mossuk TBST-vel. IV.F.2. Nukleinsavak hibridizálása a befogott részecs-kékben NANBV-cDNS-hez

Az anti-NANB5_| j-gyel befogott részecskékből ki-bocsátott nukleinsavkomponenseket a 81. klónból szár-mazó HCV-cDNS-hez hibridizáljuk. HCV-részecské- ket fogunk be NANBH-val fertőzött csimpánzplazmá-ból, amint ezt a IV.F.1. fejezetben lettjük. Abból a cél-ból, hogy a részecskékből a nukleinsavakat kiszabadít-suk, a mosott gyöngyöket 60 percig inkubáljuk 37 °Chőmérsékleten 0,2 ml/gyöngy oldattal, amely 1 mg/mlK-proteinázt, 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH 7,5),10 mmol/1 EDTA-t, 0,25% (tömeg/térfogat) SDS-t,10 mikrogramm/ml oldható élesztő-RNS-t tartalmaz,és a felülúszó oldatot eltávolítjuk. A felülúszót fenollalés kloroformmal extraháljuk, és a nukleinsavakat eta-nollal kicsapjuk egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten.A nukleinsavcsapadékot centrifugálással összegyűjt-jük, szárítjuk, és feloldjuk 50 mmol/1 Hepes-ben (pH7,5). Az oldható nukleinsavak párhuzamos aliquotjaitaz anti-NANB5 j_, antitestekkel burkolt gyöngyökbőlkapott mintákból és a teljes humán immunglobulint tar-talmazó kontrollgyöngyökből kapott mintákból nit-ro-cellulóz-szűrőkre szűrjük. A szűrőket 32P-vel jelzett,hézag- (nick-) transzlatált, a 81. kiónban levő tisztítottHCV-cDNS-fragmentumból készített vizsgálómintávalhibridizáljuk. Az eljárást a vizsgálóminta előállításáraés a hibridizálásra a IV.C.l. fejezetben írjuk le.

Egy vizsgálómintával vizsgált, az anti-NANBj.,.,antitesteket tartalmazó gyöngyökkel befogott részecs-kékből származó nukleinsavakat tartalmazó szűrőautoradiogramját a 40. ábrában mutatjuk be. Az anti-NANB5_!_, antitestek (Ab A2) alkalmazásával kapottkivonat tiszta hibridizálójeleket ad a kontroll antitestki-vonathoz (A3, A4) és a kontroll élesztő-RNS-hez (BbB2) viszonyítva. 1 pg, 5 pg és 10 pg tisztított 81. klón-cDNS-fragmentumot tartalmazó standardokat is muta-tunk be a Cl-3-ban.

Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy azNANBH-plazmából anti-NANBs_,_| antitestekkel be-fogott részecskék olyan nukleinsavakat tartalmaznak,amelyek hibridizálnak a 81. kiónban levő HCV-cDNS-sel, és így további bizonyítékot mutatnak arra néz-ve, hogy az ezekben a kiónokban levő cDNS-ek azNANBH-hoz tartozó etiológiai ágensből származnak.IV.G. C100-3 immunológiai reaktivitása tisztítottanti-NANB^i ! antitestekkel A C100-3 fúziós polipeptid immunológiai reaktivitá-sát anti-NANB5_|_1 antitestekkel radioimmunesszévelhatározzuk meg, amelyben az antigéneket, amelyek szi-lárd fázishoz vannak kötve, tisztított anti-NANB5_1_1-gyel hozzuk össze, és az antigén-antitest komplexet 125I-vel jelzett juh-antihumán antitestekkel mutatjuk ki.A Cl00-3 polipeptid immunológiai reaktivitását össze-hasonlítjuk az SOD-NANBj i , antigén reaktivitásával. A C100-3 fúziós polipeptidet úgy szintetizáljuk éstisztítjuk, amint ezt a IV.B.5. illetve IV.B.6. fejezetben le-írjuk. Az SOD-NANB5_|_! fúziós polipeptidet úgy szin-tetizáljuk és tisztítjuk, amint ezt a IV.B.l. és IV.D.l. feje-zetben leírjuk. A tisztított anti-NANB5_antitesteketúgy kapjuk meg, amint ezt a IV.E. fejezetben leírjuk. Különböző mennyiségű tisztított antigén 0,125 mol/1Na-borát-puffert (pH 8,3) és 0,075 mol/1 NaCl-ot tartal-mazó oldatban (BBS) levő 100 mikroliteres aliquotjaitadjuk egy mikrotitrálólemez (Dynatech Immulon 2,Removawell csíkok) egyes üregeibe. A lemezeket egy 36 1

HU 220 204 B 2 éjszakán át inkubáljuk nedves kamrában, amely után afehérjeoldatot eltávolítjuk és az üregeket háromszormossuk 0,02% Triton Χ-100-at tartalmazó BBS-sel(BBST). Abból a célból, hogy megakadályozzuk a nemfajlagos kötést, az üregeket BSA-val burkoljuk BSA5 mg/ml-es, BBS-ben levő 100 mikroliteres oldatánakhozzáadásával, amelyet inkubálás követ szobahőmérsék-leten 1 órán át, amely után a BSA-oldat fölöslegét eltá-volítjuk. A burkolt üregekben levő polipeptideket tisztí-tott anti-NANBs_1_1 antitestekkel reagáltatjuk 1 mikro-gramm antitest/üreg hozzáadásával, és a minták 1 óránát 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálásával. Inkubá-lás után a fölösleges oldatot leszívással eltávolítjuk, ésaz üregeket ötször mossuk BBST-vel. A fúziós polipep- tidekhez kötött anti-NANB5_! ret a 125I-vel jelzett F’(ab)2 juh-antihumán IgG kötésével határozzuk meg a burkolt üregekhez. A jelzett vizsgálóminta (fajlagos akti- vitás: 5-20 mikrocurie/mikrogramm) 100 mikroliteres 5 aliquotjait adjuk az egyes üregekhez, és a lemezeket37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át, ezt követi afölösleges vizsgálóminta eltávolítása leszívással és 5 mo-sás BBST-vel. Az egyes üregekben kötött radioaktivitásmennyiségét olyan számlálóban (counter) számláljuk, 10 amely gamma-sugárzást mutat ki. A C100 immunológiai reaktivitásának eredményeit tisztított anti-NANB5_11-gyel összehasonlítva azNANB5_t_( reaktivitásával a tisztított antitestekkel, a3. táblázatban mutatjuk be. 3. táblázat C100-3 immunológiai reaktivitása összehasonlítva NANB5_!_! reaktivitásával, immunesszével mérve AG (ng) RIA (cpm/esszc) 400 320 240 160 60 0 nanb5,, 7332 6732 4954 4050 3051 57 C100-3 7450 6985 5920 5593 4096 67 A 3. táblázat eredményei azt mutatják, hogy az anti-NANBj i , felismer egy epitópot a C100-3 polipeptidC100 részében. így az NANB5_[_| és a C100 osztozikközös epitópon vagy epitópokon. Az eredmények aztsugallják, hogy az ezt az NANBV epitópot vagy epitó- 30pokat kódoló cDNS-szekvencia olyan, amely jelen vanmind az 5-1-1., mind a 81. kiónban. IV.H. A HCVjellemzése IV.H.l. A HCV genom szálazottságánakjellemzése A HCV genomot szálazottságát illetően úgy jelle-mezzük, hogy izoláljuk az anti-NANB5_1_1 antitesttelburkolt polisztirolgyöngyökön befogott részecskékbőla nukleinsavfrakciót, és meghatározzuk, vajon az izo-lált nukleinsav a HCV-cDNS plusz és/vagy mínusz szá-lával hibridizál. A részecskéket HCV-vel fertőzött csimpánzplazmá-ból fogjuk be immuntisztított anti-NANB5_|_i antitest-tel burkolt polisztirolgyöngyöket alkalmazva, amint ezta IV.F.l. fejezetben leírtuk. A részecskék nukleinsav-komponensét kiszabadítjuk olyan módon, amint ezt a 45IV.F.2. fejezetben leírtuk. 3 ml nagy titerű plazmávalekvivalens izolált genom nukleinsavaliquotokat vi-szünk fel foltként nitro-cellulóz-szűrőkre. Kontrollként81. kiónból (2 pikogramm) származó denaturált HCV-cDNS aliquotjait is felvisszük ugyanazokra a szűrőkre. 50A szűrőket HCV-cDNS-ből klónozott egyszálú DNSplusz vagy mínusz szálainak 32P-vel jelzett keverékévelvizsgáljuk át; a cDNS-eket a 40b., 81. és 25c. klónok-ból metsszük ki.

Az egyszálú vizsgálómintákat a HCV-cDNS-ek 55EcoRI-gyel végzett kimetszésével kapjuk meg a 91., 40b. és 25c. kiónokból, majd a cDNS-ffagmentumokM13 vektorokba, pontosabban mpl8 és mpl9 vektorok-ba [Messing (1983)] való klónozásával. Az M13 kió-nokat szekvenciaelemzésnek vetjük alá, hogy meghatá- 60 rozzuk, vajon ez a HCV-cDNS-ekből származó DNSplusz vagy mínusz szálát tartalmazza. A szekvencia-elemzést Sanger és munkatársai didezoxiláncterminá-ciós eljárásával (1977) végezzük. A befogott részecskékből izolált HCV genomaliquotjait tartalmazó párhuzamos szűrők egyes készle-teit a HCV-cDNS-ekből származó plusz vagy mínuszszálú vizsgálómintákkal hibridizáljuk. A 41. ábra mutat-ja be a NANBV genomnak a 81., 40b. és 25c. klónok-35 ból származó vizsgálóminták keverékével végzett át-vizsgálásával kapott autoradiogramokat. Ezt a keveré-ket használjuk arra a célra, hogy növeljük a hibridizá-ciós vizsgálat érzékenységét. Az I. panelban levő mintá-kat a plusz szál vizsgálóminta-keverékkel hibridizál-40 juk. A II. panelban levő mintákat a mínusz szál vizs-gálóminta-keverékkel hibridizáljuk. A minták összeállí-tását az immunfoltvizsgálat paneljeiben a 4. táblázat-ban mutatjuk be. 4. táblázat

Sor A B 1. HCV genom ♦ 2. - * 3. * 81. cDNS 4. * 81. cDNS * Le nem írt minta.

Amint a 41. ábrában levő eredményekből látható,csak a mínusz szál DNS vizsgálóminta hibridizál az izo-lált HCV genommal. Ez az eredmény, azzal az ered-ménnyel együtt, amely azt mutatja, hogy a genom érzé-keny RNázra, de nem érzékeny DNázra (lásd a IV.C.2. 37 1

HU 220 204 B 2 fejezetet), azt sugallja, hogy az NANBV genomja pozi-tív szálú RNS.

Ezek az adatok, és más laboratóriumok adatai a fel-tételezett NANBV-k fizikokémiai tulajdonságait il-letően egybevágnak azzal a lehetőséggel, hogy a HCVa Flavivirodae tagja. Az a lehetőség sincs azonban ki-zárva, hogy a HCV a víruságensek új családját kép-viseli. IV.H.2. Szekvenciák kimutatása befogott részecskék-ben, amelyek, amikor PCR-rel kibővítjük, a 81. klánbólszármazó HCV-cDNS-hez hibridizálnak A befogott részecskékben levő RNS-t úgy kapjukmeg, amint ezt a IV.H.l. fejezetben leírtuk. Azokhoz aszekvenciákhoz, amelyek a 81. klónból származóHCV-cDNS-hez hibridizálnak, az elemzést a PCR-kibő-vítési eljárást alkalmazva hajtjuk végre, amint ezt aIV.C.3. fejezetben leírtuk, azzal a különbséggel, hogy ahibridizációs vizsgálóminta a 81. klón cDNS-szekven-ciából származó, kinázzal kezelt oligonukleotid. Azeredmények azt mutatják, hogy a kibővített szekven-ciák hibridizálnak a 81. klón eredetű HCV-cDNS vizs-gálómintával. IV.H.3. Homológia a dengue-flavivírus (MNfVWVDl)nem szerkezeti fehérjéje és a 14i-39c. klánok egyesítettORF-je által kódolt HCVpolipeptidek között A 14i-39c. kiónok kombinált HCV-cDNS-ei egyfolyamatos ORF-et tartalmaznak, amint ezt a 26. ábrá-ban bemutatjuk. Az ebben kódolt polipeptidet szekven-ciahomológiára elemezzük a dengue flavivírusban(MNWWVD1) levő nem szerkezeti polipeptid vagypolipeptidek területével. Az elemzés a Daghoff fehérje-adatbázisokat alkalmazza, és számítógéppel végezzük.Ezeket az eredményeket a 42. ábrában mutatjuk be,ahol a (:) jel pontos homológiát jelent, és a (.) jel kon-zervatív helyettesítést jelez a szekvenciákban; a szagga-tott vonalak a szekvenciába beiktatott térközöket jelzik,hogy a legnagyobb homológiát érjük el. Amint az ábrá-ból látható, jelentős homológia van a HCV-cDNS-benkódolt szekvencia és a dengue-vírus nem szerkezetipolipeptidje vagy polipeptidjei között. A 42. ábrábanbemutatott homológián kívül a cDNS 3’-vége felé levőterületben kódolt polipeptidszegmens elemzése szinténmutat olyan szekvenciákat, amelyek homológok a den-gue-polimerázban levő szekvenciákhoz. Ennek követ-kezménye az a felfedezés, hogy a hiteles Gly-Asp-Asp(GDD) szekvencia, amelyről úgy gondoljuk, hogy nél-külözhetetlen az RNS-függő RNS-polimerázokban,megtalálható a HCV-cDNS-ben kódolt polipeptidben,olyan elhelyezkedésben, amely egybevág a dengue-2-vírusban levő elhelyezkedéssel. IV.H.4. ELlSA-meghatározás HCV-fertőzésre, vizsgáló-antigénként HCV C100-3-at alkalmazva

Az összes mintát a HCV-C100-3 ELISA-t alkal-mazva vizsgáljuk meg. Ez a vizsgálat a HCV-C100-3antigént (amelyet úgy szintetizálunk és tisztítunk,amint ezt a IV.B.5, fejezetben leírtuk), és az egér mo-noklonális antihumán IgG torma-peroxidáz (HRP) kon-jugátumát alkalmazza. A HCV-C100-3 antigénnel burkolt lemezeket azalábbiak szerint állítjuk elő. Burkolópuffert [50 mmol/1 nátrium-borát (pH 9,0), 21 ml/lemez), BSA-t (25 mik-rogramm/ml) és C100-3-at (2,50 mikrogramm/ml)] tar-talmazó oldatot készítünk közvetlenül a RemovawellImmulon I lemezekhez (Dynatech Corp.) való hozzá-adás előtt. 5 perces keverés után 0,2 ml/üreg oldatotadunk a lemezekhez, lefedjük és 2 órán át inkubáljuk37 °C hőmérsékleten, amely után az oldatot leszívássaleltávolítjuk. Az üregeket egyszer mossuk 400 mikrolitermosópufferral [100 mmol/1 nátrium-foszfát (pH 1,4),140 mmol/1 nátrium-klorid, 0,1% (tömeg/térfogat) ka-zein, 1% (tömeg/térfogat) Triton X-100, 0,01% (tö-meg/térfogat) timerozál]. A mosóoldat eltávolítása után200 mikroliter/üreg „burkolás utáni” oldatot [10 mmol/1nátrium-foszfát (pH 7,2), 150 mmol/1 nátrium-klorid,0,1% (tömeg/térfogat) kazein és 2 mmol/1 fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF)] adunk hozzá, a lemezeket szo-rosan lezárjuk, hogy az elpárolgást megakadályozzuk,és szobahőmérsékleten állni hagyjuk 30 percig. Az üre-geket azután leszívjuk, hogy az oldatot eltávolítsuk, ésszárazra liofilezzük egy éjszakán át anélkül, hogy az köz-ben felmelegedne. Az így készített lemezeket 2-8 °Chőmérsékleten leforrasztott alumíniumdobozban tárol-hatjuk.

Abból a célból, hogy az ELISA-meghatározást végre-hajtsuk, 20 mikroliter szérummintát vagy kontrollmintátadunk egy olyan üreghez, amely 200 mikroliter mintahí-gítót [100 mmol/1 nátrium-foszfát (pH 7,4), 500 mmol/1nátrium-klorid, 1 mmol/1 EDTA, 0,1% (tömeg/térfogat)kazein, 0,015% (tömeg/térfogat) timerozál, 1% (tö-meg/térfogat) Triton X-100,100 mikrogramm/ml élesz-tőkivonat] tartalmaz. A lemezeket leforrasztjuk és 37 °Chőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, ezután az oldatot le-szívással eltávolítjuk, és az üregeket 400 mikrolitermosópufferral [foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasó-oldat (PBS), amely 0,05% Tween-20-at tartalmaz] mos-suk. A mosott üregeket 200 mikroliter egér-antihumánIgG-HRP konjugátummal kezeljük, amely „Ortho”konjugátum hígítóban van [10 mmol/1 nátrium-foszfát(pH 7,2), 150 mmol/1 nátrium-klorid, 50% (térfogat/tér-fogat) boqúembrió-szérum, 1% (térfogat/térfogat) hővelkezelt lószérum, 1 mmol/1 K3Fe(CN)6, 0,05% (tö-meg/térfogat) Tween-20, 0,02% (tömeg/térfogat) time-rozál]. A kezelést 1 órán át végezzük 37 °C hőmérsékle-ten, az oldatot leszívással eltávolítjuk, az üregeket mosó-pufferral mossuk, amelyet szintén leszívással távolítunkel. Abból a célból, hogy meghatározzuk a kötött enzim-konjugátum mennyiségét, 200 mikroliter szubsztrá-tumoldatot (10 mg o-fenilén-diamin-dihidroklorid, 5 mlkifejlesztőoldatban) adunk hozzá. A kifejlesztőoldat50 mmol/1 nátrium-citrátot (pH 5,1-re beállítva foszfor-savval) és 0,6 mikroliter/ml 30%-os H2O2-t tartalmaz.A szubsztrátumoldatot tartalmazó lemezeket sötétbeninkubáljuk 30 percig szobahőmérsékleten, a reakciót50 mikroliter/ml 4 n kénsav hozzáadásával leállítjuk, ésaz optikai sűrűségeket mérjük. IV.I. Kibővítés HCV-cDNS-szekvenciák klónozásáhoza flavivírusgenom-szekvenciák megőrzött területeibőlszármazó primereket és PCR-technikát alkalmazva

Az előzőekben bemutatott eredmények, amelyek aztsugallják, hogy a HCV flavivírus vagy flaviszerű vírus, 38 1

HU 220 204 B 2 lehetővé tesznek egy stratégiát nem jellemzett HCV-cDNS klónozásához a PCR-technikát alkalmazva, ésolyan primereket alkalmazva, amelyek flavivírusokbanlevő, megőrzött aminosavszekvenciákat kódoló területek-ből származnak. A primerek egyike általában meghatáro- 5zott HCV genom szekvenciából származik, és a másikprimer, amely egy szekvenciaelemzésnek alá nem vetettHCV polinukleotid területét szegélyezi, a flavivírusge-nom egy megőrzött területéből származik. A flavivírus-genomokról ismert, hogy megőrzött szekvenciákat tártál- 10maznak az NSl-en és az E polipeptideken belül, ame-lyek a flavivírusgenom 5’ területén belül kódolódnak.

Az ezeket a területeket kódoló megfelelő szekvenciák a26. ábrában bemutatott HCV-cDNS-szekvenciától fölfe-lé fekszenek. így abból a célból, hogy a HCV genom eb- 15bői a területéből származó szekvenciákat izoláljunk, fel-felé levő primereket tervezünk, amelyek az ezeken aflavivíruspolipeptideken belül levő megőrzött szekven-ciákból származnak. A lefelé levő primerek a HCV-cDNS ismert részének felfelé levő végéből származnak. 20 A kód degenerációja következtében valószínű, hogylesznek hibás illesztések a flavivírus vizsgálóminták ésa megfelelő HCV genom szekvenciák között. Ennekmegfelelően olyan stratégiát alkalmazunk, amelyet Leeírt le (1988). A Lee-féle munkamenet olyan kevert öli- 25gonukleotid primereket alkalmaz, amelyek komplemen-terek egy aminosavszekvencia reverz transzlációs ter-mékéhez; a szekvenciák a kevert primerekben számítás-ba vesznek minden kodondegenerációt a megőrzött ami-nosavszekvenciánál.

Primer keverékekből három készletet alakítuk kiszámos flavivirusban talált aminosavhomológia alap-ján, a flavivírusok közé értve a trópusi nátha- láz-2,4- 5’-GAT CTC TAG AGA AAT ( A PCR-reakciót, amelyet eredetileg Saiki és munka-társai írtak le (1986), lényegében úgy hajtjuk végre,amint ezt Lee és munkatársai leírták (1988), azzal a ki-vétellel, hogy a cDNS-hez szolgáló templát olyan RNS, 40amelyet HCV-vel fertőzött csimpánz májából izolál-tunk, amint ezt a IV.C.2. fejezetben leírtuk, vagy HCV-vel fertőzött csimpánzszérumból izolált vírusrészecs-kékből izoláltunk, amint ezt a IV.A.l. fejezetben leír-tuk. Ezenkívül az összeforrasztási körülmények kevés- 45bé szigorúak a kibővítés első menetében (0,6 mol/1NaCl és 25 °C hőmérséklet), mivel a primemek az a ré-sze, amely a HCV-szekvenciához forr, csak 9 nukleo-tid, és nem lehetnek hibás illesztések. Ezenkívül hassc5h34A-t használunk, a további szekvenciák, ame- 50lyek nem a HCV genomból származnak, hajlamosak aprimer templát hibrid destabilizálására. A kibővítéselső menete után az összeforrasztási körülmények szi-gorúbbak lehetnek (0,066 mol/1 NaCl és 32-37 °C), mi-

5’-CCC AGC GGC GTA CGC GCTGTG TGG CGG TGT TGT TCT (D-2,4), japán enkefalitiszvírus (JEV), sárgaláz- (YF),és nyugatnílusi vírus (WN) vírusait. A legtöbb fölfelélevő megőrzött szekvenciából származó primer keve-rék (5’-l) a gly-trp-gly aminosavszekvencián alapul,amely része a D-2, JEV, YF és WN E fehéijéjében meg-található asp-arg-gly-trp-gly-asp-N megőrzött szekven-ciának. A következő primer keverék (5’-2) az E fehéqé-ben lefelé levő konzervált szekvencián, a phe-asp-gly-asp-ser-tyr-leu-phe-gly-asp-ser-tyr-leu szekvencián ala-pul, és a phe-gly-asp-ból ered; a megőrzött szekvenciaa D-2-ben, JEV-ben és WN-ben van jelen. A harmadikprimer keverék (5 ’-3) az arg-ser-cys aminosavszekven-cián alapul, amely a D-2, D-4, JEV, YF és WN N51 fe-hérjéjében levő cys-cys-arg-ser-cys megőrzött szekven-cia része. Az egyes primereket, amelyek az 5’-3 keveré-ket képezik, a 45. ábrában mutatjuk be. A megőrzött te-rületekből származó különböző szekvenciákon kívül azegyes keverékekben levő egyes primerek egy konstansterületet is tartalmaznak az 5’-végnél, amely a HindlII,Mbol és EcoRI restrikciós enzimekhez szolgáló helye-ket kódoló szekvenciát tartalmaz. A lefelé levő primer, az ssc5h20A, az 5h. kiónbanlevő nukleotidszekvenciát tartalmazza, amely olyanszekvenciákkal bíró HCV-cDNS-t tartalmaz, amelyekátfedik a 14i. és 1 lb. kiónokban levő szekvenciákat. Azssc5h20A szekvenciája az alábbi: 5’-GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA-3’.

Egy másik prímért is alkalmazhatunk, az ssc5h34A-t.Ez a primer az 5h. kiónban levő szekvenciából szárma-zik, és ezenkívül olyan nukleotidokat tartalmaz az5’-végnél, amely restrikciós enzim helyet alkot, ígymegkönnyíti a klónozást. Az ssc5h34A szekvenciája azalábbi: TAT GGT GAC AGA GTC A-3’. vei a kibővített szekvenciák most olyan területeket tar-talmaznak, amelyek komplementerek a primerekkelvagy másolatai a primereknek. Ezenkívül a kibővítéselső 10 ciklusa a Klenow-enzim I-gyel fut, az ehhez azenzimhez alkalmas PCR-körülmények között. Ezekneka ciklusoknak a teljessé válása után a mintákat extrahál-juk, és Taq-polimerázzal futtatjuk a készletben leírt út-mutatások szerint, amely útmutatások a Cetus/Perkin-Elmer készlethez tartoznak. A kibővítés után a kibővített HCV-cDNS-szekven-ciákat hibridizálással mutatjuk ki az 5h. klónból szár-mazó vizsgálómintát alkalmazva. Ez a vizsgálómin-ta azokból a szekvenciákból származik, amelyek fölfe-lé vannak azoktól, amelyeket a primer kinyeréséhez al-kalmazunk, és nem fedik át az 5h. klón eredetű prime-rek szekvenciáit. A vizsgálóminta szekvenciája azalábbi: GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTCCGT CGG GTT GAT GGC GC-3’ 39

Claims (47)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. 01 CGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATATTACA GCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATAATGT

   ArgTyrlleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGln 361 AGCGCT ATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGAA

   TCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCTT

   1 TACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTG ATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCAC

   Se rGl yGl yAl aTyrAspIlel lelleCy sAspGluCysHi sSerThrAs pAlaTh r Se r 1 2 1 CTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATC

   GAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAG

   I1eLeuGlyI1eGlyThrVa1LeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuVa1Va1 18 1 CATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGT

   GTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACA

   LeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThrValProHis Pr oAsnI1eGluGluVa1 241 GCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGT

   CGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCA

   AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLy sAlalleProLeuGluValile 301 TGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAAT

   ACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTA

   Ly sGlyGlyArgHi sLeuI1ePheCy sHi s Se r Ly sLysLy sCysAs pGluLeuAlaAla 361 CAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGC

   GTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCG

   LysLeuVa1A1aLeuGlyI1eAsnAlaVa1AlaTyrTyrArgGlyLeuAspVa1 Se rVa1 421 AAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGT

   TTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCA

   11eProThrSe rGlyAspVa1VaIVaIVa1A1aTh rAspAlaLeuMe tThrGlyTyrThr 481 CATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATAC

   GTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATG

   GlyAspPheAspSe rVa1I1eAspTyrAsnThrCysVa1ThrGlnThrValAspPheSer 541 CGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTACAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAG

   GCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGATGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTC

   HU 220 204 Β

   LeuAspPr oTh r PheThrI1eGluTh rlleThrLeuProGlyAspAlaVa1 Se rArgThr 601 CCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCAC

   GGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTG

   Gl nAr gArgGlyArgThrGlyArgGlyLy sProGlylleTyrArgPheValAlaProGly 661 TCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGG

   AGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCC

   GluAr gPr oSerGl yMe t PheAspSe rSe rVa1LeuCy sGluCy sTyrAspAlaGlyCy s 721 GGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTÁTGACGCAGGCTG

   CCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGAC

   AlaTr pTyrGluLeuThr Pr oAlaGluThrThrVa1Ar gLeuAr gAl aTy rMe tAsnThr 781 TGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACAC

   ACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTG

   Pr oGl yLeuPr oVaICysGlnAs pHi sLeuGluPheTr pGluGlyVa1PheThrGlyLeu 841 CCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCT

   GGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGA

   ThrHi s I 1eAspAlaHi sPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyr 901 CACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTA

   GTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAAT

   LeuVa 1A1aTyrGlnAlaThrVa1CysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTr pAs p 961 CCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGA

   GGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCT

   Gl nMe tTrpLysCysLeuI1eAr gLeuLys Pr oTh rLeuHi sGlyProThrProLeuLeu 1021 CCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCT

   GGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGA

   Tyr ArgLeuGlyAlaVa1G1nAsnGluIleThrLeuThrHi s Pr oVaIThrLysTyrIle 1081 ATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACAT

   TATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTA

   Me tTh rCysMe t Se rAlaAs pLeuGluVaIVa1Th r Se rTh rTr pVa1LeuVa1G1yGly 1141 CATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGG

   GTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCC

   ValLeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysVa1Va1I1eVa1G1yArg 1201 CGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAG

   GCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTC

   ValValLeuSerGlyLys Pr oAla I1e11ePr oAspArgGluVa1LeuTy rArgGluPhe 1261 GGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTT

   CCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAA

   AspGl uMe tGl uGl uCy sSe rGl nHi sLeuPr oTyrll eGl uGl nGl yMe tMe t LeuAl a 1321 CGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGC

   GCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCG

   GluGlnPheLy sGlnLy sAlaLeuG1yLeuLeuGlnThrAlaSe rAr gGlnAlaGluVa1 1381 CGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGT

   GCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCA

   I1eAlaProAlaVa1G1nThrAsnTr pGlnLysLeuGluThr PheTr pAl aLysHisMe t 1441 TATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATAT

   ATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATA

   HU 220 204 Β

   TrpAsnPheIleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnPr o GTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCC CACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGG

   Al a 11eAl aSe rLeuMe tAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGln CGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCA GCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGT

   ThrLeuLeuPheAsnI1eLeuGlyGlyTrpVa1A1aAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAla AACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGC TTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACG

   Al aThrAlaPheVa1G1yAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGly CGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGG GCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCC

   LysValLeuIleAs ρ11eLeuAlaGlyTy rGlyAlaGlyVa1AlaGlyAlaLeuVa1Ala GAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGC CTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCG

   PheLys11 eMe t Se rGlyGluVa1Pr oSe rThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAla ATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGC TAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCG

   I leLeuSerProGlyAlaLeuVa1Va1G1yVa1ValCysAlaAla I1eLeuArgArgHi s CATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCA GTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGT

   Va 1G1 yPr oGlyGluGlyAlaVa1G1nTr pMe tAsnArgLeuI1eAlaPheAlaSe rArg CGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCG GCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGC

   Gl yAsnHi sValSerProThrHi sTyrValProGluSe rAspAlaAlaAlaArgVaITh r GGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCAC CCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTG

   AlalleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHi sGlnTrpIleSer TGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAG ACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTC

   Se rGluCv sThrThrProCysSerGlySerTr pLeuArgAsp11eTr pAspT r ρ11eCy s CTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATG GAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATAC

   GluVa1LeuSe rAspPheLy sThrTr pLeuLy sAlaLy sLeuMe t Pr oGlnLeuPr oGly CGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGG GCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACC

   IleProPheValSerCysGlnArgGlyTyrLysGlyVa1T r pAr gVa1As pGlyI1 eMe t GATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCAT CTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTA

   Hi sThrArgCysHi sCysGlyAlaGluI1eThrGlyHi sVa1LysAsnGlyThrMe tArg GCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAG CGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTC

   I1eVa1G1yPr oArgThrCysArgAsnMetTrpSerGlyTh rPheProIleAsnAlaTyr GATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTA CTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGAT

   HU 220 204 Β

   ThrThrGlyProCysThr Pr oLeuPr oAlaPr oAsnTyrThr PheAlaLeuTr pArgVa1 2401 CACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGT

   GTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCA

   Se r Al aGluGluTyrVa1G1uI1eAr gGlnVa1G1yAspPheHi sTyrVaIThrGI yMe t 2461 GTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTAT

   CAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATA

   Th rThrAspAsnLeuLysCy s Pr oCy sGlnVa1Pr oSe r Pr oGluPhe PheThrGl u 2 5 21 GACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT

   CTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA

   1. HCV polinukleotid izolált alakban, azzal jellemezve, hogy olyan egybefüggő nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely képes szelektíven hibridizálódni a hepatitis C vírus (HCV) genomjához vagy annak komplementeréhez.
2. 2. ÁBRA

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   2. Az 1. igénypont szerinti HCV polinukleotid, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia az ATCC No. 40394 szám alatt letétbe helyezett HCV-cDNS által kódolt.
3. 3..Á3RA -Az 5-1-1.₅ 31,, 91. és 1-2. DÚS transzlációja

   GlyCysValValIleValGlyArgValValL-euSerGlyLysProAlallelleProAsD 1 CTGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTG

   GACCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGAC

   T.

   ArcGluValLeuTyrArgGluPheAspGlul''etGluGluCysSerGlnHisLeuProTyr 61 ACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGT

   TGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCA

   A

   IleGluGlnGlyMetHetLeiiAlaGluGlnPheLysGlnLysAlsLeuGlyLeuLeuGln 121 ACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGC

   7GTAGCTCGT?CCCTACTACGAGCGGC?CG?CAAGTTCG~C?TCCC-GGAGCCGGAGGACG

   ThrA.laSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaVálGlnThrAsnTrDGlnLysLeu 181 agaccgcgtcccgtcaggcagaggttatcgcccctgctgtccagaccaaczggcaaaaac

   TCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTG

   GluThxPheTrpAlaLysHisKetTrpAsnPhelleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGly 241 TCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGC-AACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGG

   AGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCC

   LeuSerThrLeuProGlyAsnProAlalleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAlaVal 301 GCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTG

   CGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAÁCTACCGAAAATGTCGACGAC

   ThrSerProLeuThrThrSerGln 361 TCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAA

   AGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTT

   HU 220 204 B

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   IggcctcctgcttgaactgcteggegagcjATCATACCTGACAGGGAAG llllllllllllllillll

   GTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAG llllllllllllllllllllllllllllllllll ctggctgcgtGGTCATAGTCGGCAGGGTCGTCTTCTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAG lllllllllllllllllllllll Ulilllllllllllllllllllllllllllllll

   GGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAG a TCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGC lllllllllllllllllllllllllllllilllllllllllllNillllllllllllllllllllllllll fi TCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACITACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGC llllllillllllllllllllllllllllillllllllilllllSIIIIIIIÍlllllllllllllllllll 'I’CCTCTACCGAGAGT'rCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGC

   Iliim iimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiimiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

   TCCTCTAtCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGC

   120 TCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCC llllllllllllllllllllllllllllllllllll

   100 TCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCC iiiiimii mii iiiiii mii iiiiiiiiiiiiiiiiiii iii nm nm imin imin

   H 2 TCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTPATCGCCC

   Ul 11111 (I f f II111II111II (I UHI 11

   132 TCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCC

   100 CTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGA nm ι mi mi ii imimmimmniimmi minin mi mim mim

   214 CTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGA 252 TACAA'rACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGfcaaeeccgceattgctteattgatggottttacagctg iimiiiiimumiiimummu

   286 TACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGG

   324 ctgtcaccagcccactaaccactagccaaa

   3. Az 1. igénypont szerinti HCV polinukleotid, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő nukleotidszekvencia az alábbi HCV-cDNS által kódolt (47. ábra):

   HU 220 204 Β

   G1 yCy s Pr oGluArgLeuAlaSe rCysAr gPr oLeuThrAspPheAspGlnGlyTr pGly CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC

   ProlleSerTyrAlaAsnGlySe rGlyPr oAspGlnAr gPr oTyrCy sTr pHisTyrPro CCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG

   ProLys ProCysGly11eVa1Pr oAlaLysSe rValCysGlyPr oVa1TyrCys PheTh r CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT

   ProSe rProVa1Va1Va1G1yThrThrAspArgSe rGlyAlaProThrTyrSe rTrpGly CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC

   G1uAsnAspThrAspVa1PheVa1LeuAsnAsnThrArgPr oProLeuGlyAsnTrpPhe GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA

   G1yCysThrTr pMe tAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaPr oPr oCysVa1 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC

   I1eGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHi sCysProThrAspCys PheArgLy sHi sPr o TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG

   AspAl aThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpIleTh r Pr oArgCysLeuVa1Asp CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC

   TyrProTyrArgLeuTrpHi sTyrProCysThrIleAsnTyrThrIlePheLysI1eArg ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT

   Me tTyrVa1G1yGlyVa1G1uHi sArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC

   ArgCysAspLeuGluAs pArgAspAr gSe rGluLeuSe r Pr oLeuLeuLeuThrThrTh r AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT

   G1nTr pGlnVa1LeuPr oCysSe r PheThrThrLeuPr oAlaLeuSerThrGlyLeulle CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT

   Hi sLeuHisGlnAsnI1eValAspValGlnTyrLeuTyrGlyValGlySerSerlleAla TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC

   SerTrpAlalleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG

   ValCysSerCysLeuTr pMe tMe tLeuLeuIleSe rGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT

   HU 220 204 Β

   LeuVa 1I1eLeuAsnAlaAlaSe rLeuAlaGlyThrHi sGlyLeuVa1 Se r PheLeuVa1 90 1 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG

   TGGAGVATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC

   PhePheCys PheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpVa1Pr oGlyAlaValTyrThrPhe 961 TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT

   ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA

   TyrGlyMe tTr pPr oLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuPr oGlnArgAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC

   AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG

   AspThrGluVa1AlaAlaSerCysGlyGlyVa1Va1LeuVa1G1yLeuMe tAlaLeuThr 1081 TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA

   ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT

   LeuSerProTyrTyrLy sAr gTyrlleSerTr pCysLeuT r pTr pLeuGlnTyr PheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC

   GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG

   Th rAr gVa 1G1uAlaGlnLeuHi sVa1Tr p11eProProLeuAsnVa1ArgGlyGlyArg 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC

   ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG

   AspAlaVa1I1eLeuLeuMe tCy sAlaValHi sPr oThrLeuVa1PheAspI1eThrLy s 1261 GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA

   CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT

   LeuLeuLeuAlaVa1PheGlyPr oLeuTrp11eLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC

   TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG

   Tyr PheVa1ArgVa1G1nGlyLeuLeuAr gPheCy sAlaLeuAlaAr gLy sMe tI1eGly 1381 CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG

   GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC

   G1 yHi sTyrVa1G1 nMe tValIlelleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrVa1Tyr 1441 GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT

   CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA

   AsnHi sLeuThr Pr oLeuArgAspTrpAlaHi sAsnGlyLeuArgAspLeuAlaVa1Ala 15 01 ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG

   TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC

   Va 1G1uProVaIVa1PheSe rGl nMe tGluThrLysLeuI1eThrTrpGlyAlaAs pTh r 1561 CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATA

   GACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTAT

   Al aAl aCysGlyAspI lelieAsnGlyLeuPr oVa1 Se rAlaArgArgGlyArgGlu11e 1621 CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGA

   GGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCT

   LeuLeuGlyProAlaAspGl yMe tVa1SerLysGlyTrpArgLeuLeuAlaProIleThr 1681 TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA

   ATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGT

   Al aTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysI1eI1eThrSe rLeuThrGlyArg 1741 CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCC

   GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG

   HU 220 204 Β

   AspLy sAsnGlnVa1G1uGlyGluValGlnlleValSerThrAlaAlaGlnTh r PheLeu 1801 GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC

   CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG

   AlaThrCysIleAsnGlyVaICysTrpThrValTyrHi sGlyAlaGlyThrArgThr11e 1861 TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA

   ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGT

   Al aSe r Pr oLysGlyPr oVa111eGl nMe tTyrThrAsnVa1AspGlnAs pLeuVa1G1y 1921 TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGG

   AGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACC

   Tr pPr oAlaPr oGlnGlySe rArgSe rLeuThr Pr oCysTh rCysGlySe r Se rAspLeu 1981 GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC

   CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG

   TyrLeuVaIThrArgHi sAlaAspVa1I1eProVa1ArgArgArgGlyAspSerArgGly 2041 TTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG

   AAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCC

   Se rLeuLeuSe r Pr oAr gPr oIleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeu 2101 GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT

   CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA

   Cy s Pr oAlaGlyHi sAlaVa1G1yI1ePheArgAlaAlaVaICy sThrArgGlyVa1Ala 2161 TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG

   ACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACC

   Ly sAlaVa1As pPhe11e Pr oVa1G1uAsnLeuGluTh rTh rMe t Ar gSe r Pr oVa 1Phe 2221 CTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGT

   GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA

   ThrAs pAsnSe r Se r Pr oPr oVa1Va1Pr oGlnSe r PheGlnVa1AlaHi sLeuHi sAla 2281 TCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG

   AGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTAC

   ProThrGlySerGlyLysSerThrLysValPr oAlaAlaTy rAlaAlaGlnGlyTy rLys 2341 CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA

   GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT

   Va1LeuVa1LeuAsnPr oSe rVa1AlaAlaThrLeuGlyPheGlyAl aTyrMe t Se rLy s 2401 AGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCA

   TCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGT

   AlaHi sGly11eAspProAsnI1eArgThrGlyValArgThrIleThrThrGlySerPro 2461 AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC

   TCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGG

   IleThrTyrSerThrTyrGlyLys PheLeuAlaAs pGlyGlyCy sSerGlyGlyAlaTyr 2521 CCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTT

   GGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAA

   Aspl1e11e11eCysAspGluCysHi sSe rThrAspAlaThrSerlleLeuGlylleGly 2581 ATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCG

   TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC

   ThrVa1LeuAs pGlnAlaGluThrAlaGlyAlaAr gLeuVaIValLeuAlaThrAlaThr 2641 GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA

   CGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGT

   HU 220 204 Β

   ProProGlySerValThrValProHi s Pr oAsnI1eGluGluValAlaLeuSerThrThr 2701 CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA

   GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT

   GlyGlulleProPheTyrGlyLysAlal1eProLeuGluVa1I1eLysGlyGlyArgHi s 2 761 CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC

   GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG

   LeüllePheCysHi sSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuVa1AlaLeu 2821 ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT

   TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA

   GlyI1eAsnAlaVa1AlaTyrTyrArgGlyLe uAspValSerValIleProThrSerGly 2881 TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCG

   ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC

   AspVaIValValValAlaThrAs pAlaLeuMe tThrGlyTyrThrGlyAs pPheAs pSe r 2941 GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT

   CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA

   ValiieAspCysAsnTh rCy sVa1Th rGlnThrValAspPheSer LeuAspPr oTh r Phe 3001 CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT

   GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA

   Thr I 1eGluTh rI1eThrLeuPr oGlnAs pAlaVa1 Se rAr gTh rGlnAr gAr gGlyAr g 3061 TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA

   AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT

   Th rGlyArgGlyLys Pr oGlylleTyrArgPheValAla Pr oGlyGluArgPr oSe rGly 3121 GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG

   CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC

   Me tPheAspSerSerValLeuCy sGluCy sTy rAs pAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 3181 GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC

   CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG

   Th r Pr oAlaGluTh rThrVa1Ar gLeuArgAlaTy rMe tAs nTh rProGlyLeuProVal 3241 TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG

   AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC

   Cy sGlnAspHi sLeuGluPheTr pGluGlyValPheThrGlyLeuThrHi sIleAs pAla 3301 TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG

   ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC

   HisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuPr oTyrLeuVa1AlaTyrGln 3361 CCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC

   GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG

   Al aTh rVaICysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTr pAspGl nMe tTr pLy sCy s 3421 AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT

   TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA

   LeülieAr gLeuLy s Pr oTh r LeuHi sGlyPr oThr Pr oLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 3481 GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG

   CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC

   Va1G1nAsnGluI1eThrLeuThrHi sProValThrLysTyrl1eMe tThrCysMe t Se r 3541 CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT

   GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA

   HU 220 204 Β

   Al aAs pLeuGluVaIValThrSerThrTr pVa1LeuVa1G1yGlyVa1LeuAlaAlaLeu 3601 CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT

   GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA

   AlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysVa1Va1I1eVa1G1yArgVa1Va1LeuSe rGly 3661 TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG

   ACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGC

   LysProAlallellePr oAs pArgGluVa1LeuTy rAr gGluPheAs pGl uMe tGluGlu 3721 GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG

   CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC

   CysSe rGlnHi sLeuPr oTyr11eGluGlnGl yMe tMe tLe uAlaGluGlnPheLy sGln 3781 AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC

   TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG

   LysAlaLeuGlyLeuLeuGlnTh rAlaSe rAr gGlnAlaGluVa1I1eAlaPr oAlaVa1 3841 AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTG

   TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC

   GlnTh rAsnTr pGlnLysLeuGluTh r PheTr pAlaLy sHi sMe t Tr pAsnPheI1eSe r 3901 TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA

   AGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT

   GlyI1eGlnTy rLeuAlaGlyLeuSe rTh rLeuPr oGlyAs nPr oAlalleAlaSerLeu 3961 GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT

   CACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTA

   Me tAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGlnThrLeuLeuPheAsn 4021 TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA

   ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT

   11eLeuGlyGlyTr pVa1AlaAlaGlnLeuAlaAlaPr oGlyAlaAlaThrAlaPheVal 4081 ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG

   TGTAAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC

   GlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeulleAsp 4141 TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG

   ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC

   I 1eLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyVa1AlaGlyAlaLeuValAlaPheLysI1eMe tSer 4201 ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA

   TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT

   GlyGluVa1Pr oSe rTh rGluAs pLeuValAsnLeuLeuProAlalleLeuSerProGly 4261 GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG

   CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGC

   Al aLeuVa1Va1G1yVa1ValCy sAlaAla I1eLeuArgAr gHi sVa1G1yPr oGlyGlu 4321 GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG

   CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC

   GlyAlaVa1G1nTrpMe tAsnArgLeuI1eAlaPheAlaSe rArgGlyAsnHi sVa1 Se r 4381 AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT

   TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA

   Pr oTh rHisTyrValProGluSerAspAlaAlaAlaArgVaIThrAlalleLeuSerSer 4441 CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA

   GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT

   HU 220 204 Β

   LeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHi sGlnTrpIleSerSerGluCysThrThr 4501 GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA

   CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT

   Pr oCy sSe rGlySe rTr pLeuArgAsp11eTrpAspTr pI1eCy sGluVa1LeuSe rAsp 4561 CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG

   GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC

   PheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMe tProGlnLeuPr oGly1leProPheValSer 4621 ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGC.CACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT

   TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA

   CysGlnArgGlyTyrLysGlyVa1TrpArgVa1AspGlyI1eMe tHi sThrArgCysHi s 4681 CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC

   GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG

   CysGlyAlaGluI1eThrGlyHi sVaILysAsnGlyThrMe tArg11eVa1G1yPr oArg 4741 ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA

   TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT

   ThrCysArgAsnMe tTrpSe rGlyThr PhePr ο I1eAsnAlaTyrThrThrGlyPr oCys 4801 GGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCT

   CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA

   Thr Pr oLeuPr oAlaPr oAsnTyrTh rPheAlaLeuTr pAr gValSerAlaGluGluTyr

   861 GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT

   CATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA

   Va1G1uI1eArgGlnVa1G1yAspPheHi sTyrValThrGlyMe t Th rTh rAspAsnLeu 4921 ATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATC

   TACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAG

   LysCys Pr oCy sGlnVa1Pr oSe r Pr oGluPhe PheThrGluLeuAspGlyVa1ArgLeu 4981 TCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCC

   AGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGG

   Hi sAr gPheAl aProProCysLy s Pr oLeuLeuArgGluGluVa1 Se r PheAr gVa1G1y 5041 TACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAG

   ATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATC

   LeuHi sGluTyr Pr oVa1G1ySe rGlnLeuPr oCysGluPr oGluPr oAspVa1AlaVa1 5101 GACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCG

   CTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGC

   LeuThr Se rMe tLeuTh rAspProSerHisIleThrAlaGluAlaAlaGlyAr gAr gLeu 5161 TGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGT

   ACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCA

   AlaAr gGlySerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSer 5221 TGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCAT

   ACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTA

   LeuLysAl aThrCy sThrAlaAsnHi sAspSe r Pr oAspAlaGluLeu11eGluAlaAsn 5281 CTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCA

   GAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGT

   LeuLeuTr pArgGlnGl uMe tGlyGlyAsnIleThrArgValGluSerGluAsnLy sVa1

   341 ACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAG

   TGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTC

   HU 220 204 Β

   ValiieLeuAspSe r PheAs pPr oLeuVa1AlaGluGluAs pGluAr gGluIleSerVal 5401 TGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCG

   ACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGC

   Pr oAlaGlu11eLeuAr gLys Se rAr gArgPheAlaGlnAlaLeuProValTrpAlaArg 5461 TACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGC

   ATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCG

   Pr oAspTyrAsnPr oPr oLeuVa1G1uTh rTr pLy sLys Pr oAspTyrGluPr oPr oVa1 5521 GGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTG

   CCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGAC

   ValHi sGlyCy sProLeuProProProLysSerProProValPr oPr oPr oAr gLysLys 5581 TGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGA

   ACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCT

   ArgThrVa1ValLeuThrGluSe rThrLeuSe rThrAlaLeuAlaGluLeuAl aThrArg 5641 AGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCA

   TCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGT

   SerPheGlySerSerSerThrSerGlylleThrGlyAspAs nThrThrTh rSerSerGlu 5701 GAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTG

   CTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGAC

   ProAlaProSerGlyCy s Pr oPr oAspSe rAspAlaGluSe rTyr Se r Se rMe t Pr oPr o 5761 AGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCC

   TCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGG

   LeuGluGlyGluPr oGlyAs pPr oAs pLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerSer 5821 CCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTA

   GGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCAT

   GluAlaAs nAlaGluAspVa1ValCysCys Se rMe tSerTyrSerTr pTh rGlyAlaLeu 5 88 1 GTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCAC

   CACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTG

   Va1Thr Pr oCysAlaAlaGluGluGlnLysLeuPr ο I1eAs nAlaLeuSe rAsnSe rLeu 5941 TCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGT

   AGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCA

   LeuArgHi sHi sAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLys 6001 TGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGA

   ACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCT

   LysVa1Thr PheAspAr gLeuGlnVa1LeuAspSe rHi sTyrGlnAspVa1LeuLysGlu 6061 AGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGG

   TCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCC

   Va1LysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnLeuLeuSe rVa1G1uGluAlaCy s Se r 6121 AGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGGAAGCTTGCA

   TCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCCTTCGAACGT

   LeuThrPr oPr oHi sSe rAlaLysSe rLys PheGlyTyrGlyAl aLysAspValArgCys 6181 GCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTT

   CGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAA

   Hi sAlaArgLysAlaVaIThrHi sI1eAsnSe rVa1TrpLysAspLeuLeuGluAspAsn 6241 GCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTCTGGAAGACA

   CGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGT

   HU 220 204 Β

   ValThrProI1eAspThrThrI1 eMe tAlaLy sAsnGluVa1PheCy sVa1G1nPr oGlu 6301 ATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTG

   TACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGAC

   LysGlyGlyArgLy s Pr oAlaArgLeu11eVa1PhePr oAs pLeuGlyVa1ArgValCy s 6361 AGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGT

   TCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACA

   GluLysMe tAlaLeuTyrAspVa1Va1ThrLysLeuProLeuAlaVa ÍMe tGlySerSer 6421 GCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCT

   CGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGA

   TyrGlyPheGlnTyr Se r Pr oGlyGlnArgVa1G1uPheLeuVa1G1nAlaTr pLy sSe r 6481 CCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGT

   GGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCA

   Ly sLy sThr Pr oMe tGlyPheSerTyrAspThrArgCy sPheAspSe rThrVa1ThrGlu 6541 CCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTG

   GGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGAC

   Se rAsp11eArgThrGluGluAla 11eTyrGlnCy sCysAspLeuAspPr oGlnAlaArg 6601 AGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCC

   TCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGG

   ValAlalleLysSer LeuThrGluAr gLeuTyrValGlyGlyProLe uTh rAsnSe rArg 6661 GCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAA

   CGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTT

   GlyGluAsnCy sGlyTyrArgAr gCy sAr gAlaSe rGlyVa1LeuThrThr Se rCy sGly 6721 GGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTG

   CCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACAC

   AsnThrLeuThrCy sTyrI1eLy sAlaAr gAlaAlaCy sAr gAlaAlaGlyLeuGlnAs p 6781 GTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGG

   CATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCC

   CysThrMe t LeuValCy sGlyAspAspLeuVaIValIleCysGluSerAlaGlyValGln 6841 ACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCC

   TGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGG

   Gl uAspAlaAlaSe rLeuArgAlaPheThrGluAl aMe tThrArgTyrSerAlaProPro 6901 AGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCC

   TCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGG

   GlyAspProProGlnProGluTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSerSerAsnVal 6961 CTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACG

   GACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGC

   Se rVa1AlaHi sAs pGlyAlaGlyLysArgVa1TyrTyrLeuThrArgAspPr oTh rTh r 7021 TGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAA

   ACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTT

   Pr oLeuAlaArgAlaAlaTr pGluThrAlaArgHi sThr Pr oVa1AsnSe rTr pLeuGly 7081 CCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTGAATTCCTGGCTAG

   GGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATC

   Asn 11e11eMe tPheAlaProThrLeuTr pAlaArgMe tI1eLeuMe tThrHi sPhePhe 7141 GCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCT

   CGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGA

   HU 220 204 Β

   SerValLeuIleAlaAr gAs pGlnLeuGluGlnAlaLeuAs pCysGIulleTyrGlyAla 7201 TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG

   AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC

   CysTyrSerlleGluPr oLeuAspLeuPr oPr ο I1eI1eGlnAr gLe u 7261 CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG
4. 4. ÁBRA A 81. DBS transzlációja

   SerGlyLysProAlallelleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluKet 1 GTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGAT

   CAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTA

   GluGluCysSerGlnHisLeuProTyrlleGluGlnGlyKetMetLeuAlaGluGlnPhe 61 GGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTT ccttctcacgagagtcgtGaatggcatgtagctcgttccctactacgagcggctcgtcaa

   LysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaPro 121 CAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCC

   GTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGG

   AlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPhe 181 TGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTT

   ACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAA

   IleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuPróGlyAsnProAlalleAla 241 CATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGC

   GTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACG

   SerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGln 301 TTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAÁA

   AAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTT

   4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő szekvencia legalább 10 nukleotidból áll.
5. 5'-3-I -2 -3 -4 -5 -6 AAGCTTGATCGAATTC CGATCTTGC CGATCCTGC CGATCATGC CGATCGTGC CGAAGTTGC CGAAGCTGC -7 AGATCTTGC -8 AGATCCTGC -9 AGATCATGC -10 AGATCGTGC -11 AGAAGTTGC -12 AGAAGCTGC -13 CGATCTTGT -14 CGATCCTGT -15 CGATCATGT -16 CGATCGTGT -17 CGAAGTTGT -18 CGAAGCTGT -19 AGATCTTGT -20 AGATCCTGT -21 AGATCATGT -22 AGATCGTGT -23 AGAAGTTGT -24 AGAAGCTGT -25 CGCTCTTGC -26 CGCTCCTGC -27 CGCTCATGC -28 CGCTCGTGC -29 CGCAGTTGC -30 CGCAGCTGC -31 CGCTCTTGT -32 CGCTCCTGT -33 CGCTCATGT -34 CGCTCGTGT -35 CGCAGTTGT -36 CGCAGCTGT

   133

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   5- ABRA A 3S, EíJS transzlációja

   AspAlaHisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAla 1 GATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCG

   CTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGC

   TyrGlnAlaThrValCysAlaAraAlaGlnAlaProProProSerTrpAspGlnKetTrp 61 TACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGC-GACCAG ATGTGG

   ATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACC

   LysCysLeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeu 121 AAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTG

   TTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGAC

   GlyAlaValGlnAsnGlulleThrLeuThrHisProValThrLysTyrlleHetThrCys ISI GGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGC

   CCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACG

   MetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAla 241 ATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCT

   TACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGA

   AlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlvArgValValLeu 3 01 GCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTG

   CGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAAC

   ----------a 81.-gyei---------------SerGlyLysProAlallelleProAspArgGluValLeuTyrArg

   361 TCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCCAG

   AGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGG A.CTGTCCCTTCAGGAG ATGGCTC

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő szekvencia legalább 15 nukleotidból áll.
6. 6. ÁBRA A 36. és 81. DNS-ek kombinált ORF-je

   AspAlaHisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAla

   GATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCG

   CTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGC

   TyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAspGlnMetTrp

   TACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGG

   ATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACC

   LysCysLeulleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeu aagtctttgattcgcctcaagccgaccctccatgggccaacacccctcctatacagactg

   TTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGAC

   GlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrlleMetThrCys

   GGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGC

   CCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACG

   MetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAla

   ATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCT

   TACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGA

   AlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThxGlyCysValValIleVaLGlyArgValValLeu

   GCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTG

   CGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAAC

   SerGlyLysProAlallelleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMet

   TCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATG

   AGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTAC

   GluGluCysSerGlnHisLeuProTyrlleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPhe

   GAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTC

   CTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAG

   LysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaPro

   AAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCT

   TTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGA

   AlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPhe

   GCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTC

   CGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAG

   IleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlalleAla

   ATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCT

   TAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGA

   SerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGln

   TCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAA

   AGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTT

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő szekvencia legalább 20 nukleotidból áll.
7. 7. ABRA A 32, LiíS transzlációja

   ------átfedés a 81,-gyei----------------PheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGlnThxLeuLeuPheAsnlleLeu

   CTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAACATAT GAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTGTATA

   GlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheValGlyAla 61 TGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTGGGCG

   ACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGC-GGCCACGGCGATGACGGAAACACCCGC

   GlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAspIleLeu 121 CTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGG ACTGGGGAAGGTCCTCATAG ACATCC gaccgaatcgaccgcggcggtagccgtcacaacctgaccccttccaggagtatctgtagg

   AlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLyslleMetSerGlyGlu 181 TTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATG AGCGGTG

   AACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCGCCAC

   ValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlalleLeuSerProGlyAlaLeu 241 AGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGAGCCC

   TCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCTCGGG

   ValValGlyValValCysAlaAlalleLeuArgArgHisValGlyProGlyGluGlyAla 3 01 TCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCC-GCACGTTGGCCCGGGCGAGGGGG

   AGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTCCCCC

   ValGlnTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSer 361 CAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCC

   GTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGG

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   7. HCV polinukleotid, izolált formában, amely legalább 10 nukleotidból álló egybefüggő szekvenciát tartalmaz az ATCC No. 40394 szám alatt letétbe helyezett HCV-cDNS kódolószekvenciájából vagy annak komplementeréből.
8. 8. ÁBRA A 35- BHS transzlációja

   SerlleGluThxIleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThrGlnArgArgGlyArg 1 TCCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGG

   AGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCC

   ThrGlyArgGlyLysProGlyXleTyrArgPheValAlaProGlyGluArgProSerGly 61 ACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCGGC

   TGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGCCG

   MetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 121 ATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTAIGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGCTC

   TACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCGAG

   ThrProAlaGluThrThr'· alArgLe-'rgAlaTyrKetAs.-. rProGlyLeuProVal 181 ACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCGTG

   TGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGCAC

   CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAla 241 TGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATGCC

   ACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTAT.'.TCTACGG

   HisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGln 301 CACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAA

   GTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGGTT

   ----------------átfedés a 36.-tál------------------------AlaThrValCysAlaArgAlaGlrtAlaProProProSerTrpAspGlnKetTrpLysCys

   361 GCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCC2CTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGT CGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACA

   LeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 421 TTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCT

   AACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGA

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   8. HCV polinukleotid, izolált formában, amely legalább 10 nukleotidból álló egybefüggő szekvenciát tartalmaz az alábbi nukleotidszekvencia bármelyik szálából (47. ábra):

   Gl yCysPr oGluArgLeuAlaSe rCysArgPr oLeuThrAs pPheAspGlnGlyTrpGly 1 CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG

   GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC

   ProIleSerTyrAlaAsnGlySe rGlyPr oAspGlnArgPr oTyrCysTrpHisTyr Pro 61 GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC

   CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG

   Pr oLys Pr oCysGly11eVa1Pr oAlaLy s Se rValCysGlyPr oVa1Ty rCy s PheThr 121 CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA

   GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT

   Pr oSe r Pr oVa1Va1Va1G1yThrThrAspAr gSe rGlyAlaProThrTyrSerTr pGly 181 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG

   GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC

   GluAsnAspThrAs pVa1PheVa1LeuAsnAsnThrArgPr oPr oLeuGlyAsnTr pPhe 241 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT

   CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA

   GlyCysTh rTr pMe tAsnSe rTh rGlyPheTh rLysValCysGl yAlaPr oPr oCysVa1 301 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG

   AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC

   11eGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHi sCysProThrAspCysPheArgLysHi sPro 3 61 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC

   AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG

   AspAl aThrTyr Se rArgCysGlySerGlyProTrpIleTh r Pr oArgCy sLeuVa1Asp 421 CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG

   GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC

   TyrProTyrArgLeuTr pHi sTyrProCysThrI1eAsnTyrThrIlePheLysIleArg 481 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA

   TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT

   Me tTyrVa1G1yGlyVa1G1uHi sArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu 541 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG

   CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC

   HU 220 204 Β

   ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSe rGluLeuSe r Pr oLeuLeuLeuThrThrThr 60 1 AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA

   TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT

   G1nTrpGlnVa1LeuPr oCysSe r PheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle 661 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA

   GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT

   Hi sLeuHi sGlnAsn11eVa1AspValGlnTyrLeuTyrGlyVa lGlySerSerlleAla 721 TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG

   AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC

   SerTrpAlalleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAs pAlaArg 781 CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC

   GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG

   ValCysSerCysLeuTr pMe tMe tLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn 841 GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA

   CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT

   LeuVa 111eLeuAsnAlaAlaSe rLeuAlaGlyThrHi sGlyLeuValSer PheLeuVa1 901 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG

   TGGAGVATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC

   PhePheCys PheAlaTr pTyrLeuLy sGlyLy sTrpVa1Pr oGlyAlaVa1Ty rThr Phe 961 TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT

   ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA

   TyrGl yMe tTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnAr gAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC

   AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG

   AspThrGluVa1AlaAlaSe rCy sGlyGlyVa1Va1LeuVa1G1yLeuMe tAlaLeuThr 1081 TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA

   ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT

   LeuSerProTyrTyrLy sArgTyrI1e Se rTr pCy sLeuT r pTr pLeuGlnTyr PheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC

   GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG

   ThrArgVa1G1uAlaGlnLeuHi sValTrpIleProProLeuAsnVa1ArgGlyGlyArg 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC

   ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG

   AspAl aVa1I1eLeuLeuMe tCysAlaValHi s Pr oThrLeuVa1PheAspI1eThrLys 1261 GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA

   CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT

   LeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpI1eLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC

   TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG

   TyrPheVa1ArgVa1G1nGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLy sMe 111eGly 1381 CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG

   GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC

   GlyHi sTyrValGlnMe tValI lelleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyTh rTyrVa1Tyr 1441 GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT

   CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA

   HU 220 204 Β

   AsnHi sLeuThr Pr oLeuAr gAspTr pAlaHi sAsnGlyLeuArgAspLeuAlaVa1Ala 1501 ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG

   TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC

   Va 1G1uPr oVaIValPheSerGInMe tGluThrLysLeuIleThrTr pGlyAlaAs pTh r 1561 CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATA

   GACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTAT

   Al aAl aCy sGlyAspI1eI1eAsnGlyLeuPr oVa1 Se rAlaAr gAr gGlyArgGluI1e 1621 CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGA

   GGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCT

   LeuLeuGlyPr oAlaAs pGl yMe tVa1 Se rLysGlyTr pAr gLeuLeuAlaProIleThr 1681 TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA

   ATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGT

   Al aTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysI1eI1eThr Se rLeuThrGlyArg 1741 CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCC

   GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG

   As pLy sAsnGlnVa1G1uGlyGluVa1G1η I1eVa1 Se rThrAlaAlaGlnTh r PheLeu 1801 GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC

   CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG

   Al aThrCysI1eAsnGlyValCysTrpThrValTyrHi sGlyAlaGlyThrArgThrI1e 1861 TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA

   ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGT

   AlaSe r ProLysGlyPr oVa1I1eGl nMe tTyrTh rAs nVa1As pGlnAs pLeuVa1G1y 1921 TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGG

   AGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACC

   TrpProAlaProGlnGlySerArgSer LeuThr Pr oCy sThrCy sGlySerSerAspLeu 1981 GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC

   CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG

   Ty rLeuVa1ThrArgHi sAlaAs pVa111ePr oVa1ArgAr gArgGlyAspSe rArgGly 2041 TTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG

   AAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCC

   SerLeuLeuSe r Pr oAr gPr ο IleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyPr oLeuLeu 2101 GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT

   CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA

   Cy s Pr oAlaGlyHi sAlaVa1G1yI1e PheArgAlaAlaValCy sTh rArgGlyVa1Ala 2161 TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG

   ACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACC

   LysAlaValAspPhel1e Pr oVa1G1uAsnLeuGluThrTh rMe tArgSerProValPhe 2221 CTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGT

   GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA

   ThrAspAsnSerSerProProVaIValProGInSerPheGlnVa1AlaHi sLeuHi sAla 2281 TCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG

   AGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTAC

   ProThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLys 2341 CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA

   GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT

   HU 220 204 Β

   Va1LeuVa1LeuAsnPr oSe rVa1AlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMe t Se rLy s 2401 AGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCA

   TCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGT

   Al aHi sGl yI1eAspPr oAsnI1eArgThrGlyValArgThrlleThrThrGlySerPro 2461 AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC

   TCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGG

   IleThrTyrSerThrTyrGlyLys PheLeuAlaAspGlyGlyCy sSe rGlyGlyAlaTy r 2521 CCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTT

   GGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAA

   Asp11e11eI1eCysAspGluCysHi s Se rThrAspAlaThrSerlleLeuGlylleGly 2581 ATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCG

   TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC

   ThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuVa1ValLeuAlaThrAlaThr 2641 GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA

   CGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGT

   ProPr oGlySe rVa1ThrVa1Pr oHis ProAsnI1eGluGluValAlaLeuSerThrThr 2701 CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA

   GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT

   Gl yGluIleProPheTyrGlyLysAlal1ePr oLeuGluVa1I1eLy sGlyGlyAr gHi s 2761 CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC

   GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG

   LeüllePheCysHi sSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuVa1AlaLeu 2821 ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT

   TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA

   Gly11eAsnAlaVa1AlaTyrTy rArgGlyLeuAs pValSerValIleProThrSerGly 2881 TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCG

   ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC

   As pVaIValValValAlaThrAs pAlaLeuMetThrGlyTyrThrGlyAs pPheAspSe r 2941 GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT

   CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA

   ValiieAspCysAsnThrCysVaIThrGInThrValAspPheSerLeuAspProThrPhe 3001 CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT

   GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA

   ThrlleGluThrlleThrLeuPr oGlnAs pAlaValSerArgThrGlnArgArgGlyArg 3061 TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA

   AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT

   Th rGlyArgGlyLy s Pr oGly11eTyrAr gPheVa1AlaPr oGlyGluArgPr oSe rGly 3121 GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG

   CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC

   Me t PheAs pSe r Se rVa1LeuCy sGluCysTyrAs pAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 3181 GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC

   CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG

   ThrPr oAlaGluThrThrVa1ArgLeuArgAlaTy rMe tAsnThr Pr oGlyLeuProVa1 3241 TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG

   AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC

   HU 220 204 Β

   CysGlnAspHi sLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHi s11eAspAla 3 301 TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG

   ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC

   HisPheLeuSerGlnThrLy sGlnSe rGlyGluAsnLeuPr oTyrLeuVa1AlaTyrGln 3361 CCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC

   GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG

   Al aTh rValCy sAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTr pAspGlnMe tTr pLysCys 3421 AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT

   TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA

   LeülieArgLeuLys Pr oThrLeuHi sGlyPr oThr Pr oLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 3481 GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG

   CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC

   Va1G1nAsnGluIleThrLeuThrHi sPr oVa1Th rLy sTy rI1eMe tThrCysMe t Se r 3541 CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT

   GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA

   Al aAs pLeuGluVaIValThrSerThrTr pVa1LeuVa1G1yGlyVa1LeuAlaAlaLeu 3601 CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT

   GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA

   AlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCy sVaIVa1I1eVa1G1yArgVa1Va1LeuSe rGly 3661 TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG

   ACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGC

   LysProAlallelle Pr oAs pAr gGluVa1LeuTy rAr gGluPheAspGl uMe tGluGlu 3 721 GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG

   CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC

   Cy s Se rGlnHi sLeuPr oTyrI1eGluGlnGlyMe tMe t LeuAlaGluGlnPheLy sGln 3781 AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC

   TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG

   LysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSe rAr gGlnAlaGluVa111eAlaPr oAlaVa1 3841 AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTG

   TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC

   G1 nTh rAsnTrpGlnLy sLeuGluThr PheTrpAlaLy sHi sMe tTr pAsnPhe11e Se r 3901 TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA

   AGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT

   G1 y11eGlnTyrLeuAlaGlyLeuSe rThrLeuProGlyAsnPr oAlalleAlaSerLeu 3961 GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT

   CACCCTATGTTATGAAC CGC C CGAACAGTTGCGACGGAC CATTGGGGCGGTAACGAAGTA

   Me tAlaPheThrAlaAlaVa1Thr Se r Pr oLeuThrTh r Se rGlnTh rLeuLeuPheAsn 4021 TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA

   ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT

   11eLeuGlyGlyTr pVa1AlaAlaGlnLeuAlaAla Pr oGlyAlaAlaThrAlaPheVa1 4081 ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG

   TGTAAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC

   G1yAlaGlyLeuAlaGlyAlaAla I1eGlySe rVa1G1yLeuGlyLy sVa1Leu11eAsp 4141 TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG

   ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC

   HU 220 204 Β

   11eLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyVa1A1aGlyAlaLeuVa1A1aPheLys11 eMe t Se r 4201 ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA

   TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT

   Gl yGl uVa 1Pr oSe rTh rGluAs pLeuValAsnLeuLeuProAlalleLeuSerProGly 4261 GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG

   CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGC

   Al aLeuVa 1Va1G1yVa1ValCysAlaAla 11eLeuArgAr gHi sVa1G1yPr oGlyGlu 4321 GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG

   CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC

   Gl yAl aVa1G1nTr pMe tAsnAr gLeuI1eAlaPheAlaSe rArgGlyAsnHi sVa1 Se r 4381 AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT

   TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA

   Pr oThrHi sTyrVa1ProGluSe rAspAlaAlaAlaArgVaIThrAlalleLeuSerSer 4441 CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA

   GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT

   LeuThrVa IThrGInLeuLeuArgAr gLeuHi sGlnTrpIleSerSe rGluCy sTh rThr 4501 GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA

   CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT

   ProCysSerGlySerTrpLeuArgAspI1eTrpAspTrpI1eCysGluValLeuSerAsp 45 61 CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG

   GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC

   PheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMe t ProGlnLeuPr oGlylleProPheValSer 4621 ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT

   TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA

   Cy sGlnArgGlyTyrLy sGlyVa1Tr pArgVa1AspGlyI1eMe tHi sThrArgCysHi s 4681 CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC

   GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG

   CysGlyAlaGluI1eThrGlyHi sVa1LysAsnGlyThrMe tArgI1eVa1G1yProArg 4741 ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA

   TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT

   ThrCysArgAsnMe t Tr pSe rGlyTh r Phe Pr ο 11eAsnAlaTyrTh rThrGlyPr oCy s 4801 GGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCT

   CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA

   Th r Pr oLeuPr oAla Pr oAsnTyrThr PheAlaLeuTr pAr gVa1 Se rAlaGluGluTyr 4 861 GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT

   CATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA

   Va 1G1u11eArgGlnVa1G1yAspPheHi sTyrVa1ThrGl yMe tThrThrAspAsnLeu 4921 ATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATC

   TACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAG

   LysCysProCysGlnValProSerProGluPhePheThrGluLeuAspGlyValArgLeu 4981 TCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCC

   AGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGG

   Hi sArgPheAlaPr oProCy sLy sPr oLeuLeuArgGluGluVa1 Ser PheArgVa1G1y 5041 TACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAG

   ATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATC

   HU 220 204 Β

   LeuHi sGluTyrProValGlySerGlnLeuProCysGluProGluProAspVa1AlaVa1 5101 GACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCG

   CTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGC

   LeuThr Se rMe tLeuThrAspProSerHisIleThrAlaGluAlaAlaGlyArgArgLeu 5161 TGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGT

   ACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCA

   AlaArgGlySe r Pr oPr oSe rValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSer 5221 TGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCAT

   ACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTA

   LeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHi sAspSer Pr oAspAlaGluLeu11eGluAlaAsn 5281 CTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCA

   GAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGT

   LeuLeuTr pAr gGlnGl uMe tGlyGlyAsnI1eThrAr gVa1G1uSe rGluAsnLy sVa1 5341 ACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAG

   TGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTC

   Va111eLeuAspSe r PheAspPr oLeuVa1A1aGluGIuAspGluArgGluI1eSe rVa1 5401 TGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCG

   ACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGC

   Pr oAlaGlu11eLeuAr gLysSe rArgArgPheAlaGlnAlaLeuPr oVa1TrpAlaArg 5461 TACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGC

   ATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCG

   ProAspTyrAsnPr oPr oLeuVa1G1uThrTrpLysLys Pr oAspTyrGluPr oPr oVa1 5521 GGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTG

   CCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGAC

   ValHi sGlyCysPr oLeuProProProLy s Se r Pr oPr oVa1Pr oPr oPr oArgLysLys 5581 TGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGA

   ACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCT

   ArgThrValValLeuThrGluSerThrLeuSerThrAlaLeuAlaGluLeuAlaTh rArg 5641 AGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCA

   TCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGT

   SerPheGlySerSerSerThrSerGlylleThrGlyAspAs nThrTh rThr Se r Se rGlu 5701 GAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTG

   CTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGAC

   Pr oAlaProSerGlyCy s Pr oPr oAspSe rAs pAlaGluSe rTyr Se r Se rMe t Pr oPr o 5761 AGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCC

   TCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGG

   LeuGluGIyGluPr oGlyAs pPr oAspLeuSe rAspGlySerTrpSerThrValSerSer 5 821 CCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTA

   GGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCAT

   GluAlaAsnAlaGluAspVa1ValCysCysSe rMe t Se rTyrSe rTrpThrGlyAlaLeu 58 81 GTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCAC

   CACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTG

   Va 1Thr Pr oCy sAlaAlaGluGIuGInLy sLeuPr ο 11eAs nAlaLeuSerAsnSerLeu 5941 TCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGT

   AGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCA

   HU 220 204 Β

   LeuArgHi sHi sAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLys 6001 TGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGA

   ACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCT

   LysVa IThrPheAspArgLeuGInValLeuAspSerHi sTyrGlnAspValLeuLysGlu 6061 AGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGG

   TCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCC

   Va 1Ly sAlaAl aAlaSerLysValLysAlaAsnLeuLeuSe rVa1G1uGluAlaCysSe r 6121 AGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGGAAGCTTGCA

   TCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAAC’GATAGGCATCTCCTTCGAACGT

   LeuTh r Pr oPr oHi s Se rAlaLys Se rLys PheGlyTyrGlyAlaLy sAs pVa1ArgCy s 6181 GCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTT

   CGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAA

   Hi sAlaAr gLysAlaVa1ThrHi s11eAsnSe rVa1Tr pLy sAs pLeuLeuGluAspAsn 6241 GCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTCTGGAAGACA

   CGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGT

   ValThrPrο 11eAspThrThr11 eMe tAlaLysAsnGluVa1PheCysVa1G1nPr oGlu 6301 ATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTG

   TACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGAC

   LysGlyGlyArgLy s Pr oAlaArgLeu11eVa1Phe Pr oAs pLeuGlyVa1ArgVaICys 6361 AGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGT

   TCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACA

   G1uLysMe tAlaLeuTyrAs pVa1Va1ThrLysLeuProLeuAlaVa ÍMe tGlySerSer 6421 GCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCT

   CGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGA

   TyrGlyPheGlnTyr Se r Pr oGlyGlnArgVa1G1uPheLeuVa1G1nAlaTr pLy sSe r 6481 CCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGT

   GGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCA

   Ly sLysThr Pr oMe tGlyPheSerTyrAs pThrArgCy sPheAspSerThrValThrGlu 6541 CCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTG

   GGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGAC

   SerAspIleAr gThrGluGluAla I1eTyrGlnCy sCysAs pLeuAspPr oGlnAlaArg 6601 AGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCC

   TCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGG

   ValAlalleLysSe rLeuThrGluArgLeuTy rVa1G1yGlyPr oLeuThrAsnSe rAr g 6661 GCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAA

   CGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTT

   G1yGluAsnCy sGlyTyrArgArgCy sAr gAlaSe rGlyVa1 LeuThrTh r Se rCy sGly 6721 GGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTG

   CCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACAC

   AsnThrLeuThrCysTyrI1eLysAlaArgAlaAlaCysArgAlaAlaGlyLeuGlnAsp 6781 GTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGG

   CATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCC

   Cy sThrMe t LeuVaICysGlyAspAs pLeuVa1Va1I1eCy sGluSe rAlaGlyVa1G1n 6841 ACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCC

   TGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGG

   HU 220 204 Β

   GluAspAlaAlaSe rLeuAr gAlaPheThrGluAlaMe tThrArgTyrSerAlaProPro 6901 AGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCC

   TCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGG

   Gl yAs pPr oPr oGlnProGluTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSe r Se rAsnVaI 6961 CTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACG

   GACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGC

   Se rVa1AlaHi sAspGlyAlaGlyLysArgValTyrTyrLeuThrAr gAs pPr oTh rTh r 7021 TGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAA

   ACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTT

   ProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAlaArgHi sThr Pr oVa lAsnSe rTr pLeuGly 7081 CCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTGAATTCCTGGCTAG

   GGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATC

   AsnI1eI1 eMe t PheAlaPr oThrLeuTr pAlaArgMe 111eLeuMe tThrHi sPhePhe 7141 GCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCT

   CGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGA

   SerValLeuIleAlaArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAs pCysGIulleTyrGlyAla 7201 TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG

   AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC

   CysTyrSerIleGluPr oLeuAspLeuPr oPr ο I1eI1eGlnAr gLeu 7261 CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG
9. 9-2. ÁBRA

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   9-1/ÁBRA A 35-, 36., 81. és 32. LlíS-ek kombinált OR?-je

   Ser IleGluThr IleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThrGlnArgAxgGlyArg 1 TCCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGG

   AGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGC-CGTGAGTTGCAGCCCCGTCC

   ThrGlyArgGlyLysPróGlylleTyrArgPheValAlaProGlyGluArgProSerGly 61 ACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCGGC

   TGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGCCG

   MetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 121 ATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGCTC

   TACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCGAG

   ThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProVal 181 ACGCCCGCCG AGACTACAGTTAGGCTACG AGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG TG

   TGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATC-CTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGCAC

   CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAla 241 TGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATGCC

   ACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTACGG

   HisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGln 301 CACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAA

   GTG AAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGG AAGG AATGGACCATCGCATGGTT

   AlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAsDGlnMetTrpLysCys 361 GCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGT

   CGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACA

   LeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 4 21 TTG ATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAG ACTC-GGCGCT

   AACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGA

   ValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrlleKetThrCysMetSer 481 GTTCAG AATGAAATCACCCTG ACGCACCCAGTCACCAAATACATCA TG ACA TGC ATGTCG

   CAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACAGC

   Al aA s p Le uG 1 u Va iVa 1 Thr S e rThrTr p Va lLe uVa 1G1 yG 1 y Va 1 Le uA 1 a Al aLe u 541 GCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTTTG

   CGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAAAC

   AlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArgValValLeuSerGly 601 GCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGG

   CGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCC

   LysProAlallelleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGlu 661 AAGCCGGCAATCATACCTGACAGGG AAGTCCTCTACCG AG AGTTCG ATGAG ATGGAAG AG

   TTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTC

   CysSerGlnHisLeuProTyrlleGluGlnGlyMetrtetLeuAlaGluGlnPheLysGln 721 TGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAG

   ACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTC

   LysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaVal 781 AAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTGTC

   TTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAG

   HU 220 204 Β

   Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

   GlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPhelleSer 841 CAGACCAACTGGCAAAAACTCG AGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGT gtctggttgaccgtttttgagctctggaagacccgcttcgtatacaccttgaagtagtca

   GlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlalleAlaSerLeu 901 GGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTG

   CCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAAC

   MetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGlnThrLeuLeuPheAsn 961 ATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAAC

   TACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGACAAGTTG

   IleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheVal 1021 ATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTG

   TATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAACAC

   GlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAsp 1081 GGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGAC

   CCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTG

   IleLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlapheLysIleMetSer 1141 ATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGAGC

   TAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCG

   GlyGluValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlalleLeuSerProGly 1201 GGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGA

   CCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCT

   AlaLeuValValGlyValValCysAlaAlalleLeuArgArgHisValGlyProGlyGlu 1261 GCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAG

   CGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTC

   GlyAlaValGlnTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSer 1321 GGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCC

   CCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGG

   9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti HCV polinukleotid, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő szekvencia legalább 15 nukleotidból áll.
10. 10. ÁBRA A 37b. DNS transzlációja

    LeuAlaAlaLysLeuValAlaLeuGlylleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAsp 1 CTCGCCGCAAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGAC

    GAGCGGCGTTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTG

    ValSerValIleProThrSerGlyAspValValValValAlaThrAspAlaLeuKetThr 61 GTGTCCGTCATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACC

    CACAGGCAGTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGG

    GlyTyrThrGlyAspPheAspSerValIleAspTyrAsnThrCysValThrGlnThrVal 121 GGCTATACCGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTACAATACGTGTGTCACCCAGACAGTC

    CCGATATGGCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGATGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAG

    --------------------=—átfedés a AspPheSerLeuAspProThrPheThrlleGluThrlleThrLeuProGlnAspAlaVal

    181 GATTTCAGCCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTC CTAAAGTCGGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAG

    10. A 7. vagy 8. igénypont szerinti HCV polinukleotid, azzal jellemezve, hogy az egybefüggő szekvencia legalább 20 nukleotidból áll.
11. 11. ÁBRA A 331». BRS. transzláció ja

    -------átfedés a 32.vei-----------------------MetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSerProThrKisTyrVa1 1 GATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGT

    CTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCA

    ProGluSerAspAlaAlaAlaArgValThrAlalleLeuSerSerLeuThrValThrGln 61 GCCGG AGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCA

    CGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGT

    LeuLeuArgArgLeuHisGlnTrpIleSerSerGluCysThrThrProCysSerGlySer 121 GCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTC

    CGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAG

    TrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeu 181 CTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCT

    GACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGA

    LysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGlylleProPheValSerCysGlnArgGlyTyr 241 AAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTA

    TTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCAT

    LysGlyValTrpArgVal 301 TAAGGGGGTCTGGCGAGTG ATTCCCCCAGACCGCTCAC

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    11. Az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinuklentid, amely egy DNS polinukleotid.
12. 12. ÁBRA A 40b. 331ÍS' transzlációja

    AlaTyrMetSerLysAlaHisGlylleAspProAsnlleArgThrGlyValArgThrlle 1 GGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAAT

    CCGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTA

    ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCys 61 TACCACTGGCAGCCCCÁTCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTG

    ATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCAC

    SerGlyGlyAlaTyrAspIlellelleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSer 121 CTCGGGG 3GCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATC

    GAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAG

    XleLeuGlylleGlyThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValVal 181 CA7CTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGT

    GTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACA

    LeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThrValProHisProAsnlleGluGluVal 241 GCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGT

    CGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCA

    AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluValIle 301 TGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATeCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAAT

    ACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTA

    LysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAla 361 CAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCG ACGAACTCGCCGC

    GTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCG

    -----------------------átfedés a 37b.-vei----------------LysLeuValAlaLeuGlylleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerVal

    12. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinuklentid, amely egy RNS polinukleotid.
13. 13. .ÁBRA A 25c. idíS transzlációja

    CysSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHisGlnTrpIleSerSerGluCys 1 ACTGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGT

    TGACGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCA

    ThrThrProCysSerGlySerTrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeu 61 GTACCACTCCATGCTCCGGTTCCIGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGT

    CATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACA _______________átfedés a 33b.-vel------------------------εεΓΑερΡΗβυγΒΊΤϊΓΤΓρΣβιιυγΕΑίΒυγευβυΗβίΡΓοΟΙηυβυΡΓοΰΙγΙΙεΡΓοΡΗβ

    121 TGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCT ACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGA

    ValSerCysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArgGlyAspGlylleMetHisThrArg 181 TTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGGGGACGGCATCATGCACACTC

    AACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCCCCTGCCGTAGTACGTGTGAG

    CysHisCysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArglleValGly 241 GCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCG

    CGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGC

    ProArgTh’rCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyrThrThrGly 301 GTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGG

    CAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCC

    ProCysThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGlu 361 GCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAG

    CGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTC

    GluTyrValGluIleArgGlrtValGlyAspPheHisTyrValThrGlyMetThrThrAsp 4 21 AGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTG

    TCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGAC

    AsnLeuLysCysProCysGlnValProSerProGluPhePheThrGlu 4 81 ACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT

    TGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotid, amely szilárd fázishoz van rögzítve.
14. 14-3. ÁBRA

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    14-2. A3RA

    ValGlyProGlyGluGlyAlaValGlnTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArg

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    1921 CGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCG GCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGC

    GlyAsnHisValSerProThrHisTyrValProG'..uSerAspAlaAlaAlaArgValThr 1981 GGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCAC

    CCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTG

    AlalleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHisGlnTrpIleSer 2041 TGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAG

    ACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTC

    SerGluCysThrThrProCysSerGlySerTrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCys 2101 CTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATG

    GAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATAC

    GluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGly 2161 CGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGG

    GCTCCACAACTCGCTGA-’ATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACC

    IleProPheValSerCi'sGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArgValAspGlylleMet 2221 GATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCAT

    CTAGG3GAAACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTA

    HisThrArgCysHisCysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArg 2281 GCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAG

    CGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTC

    IleValGlyProArgThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyr 2341 GATCGTCGGÍCCTAGGACCT3CAGGAACATGTGGAC-TGGGACC7CCCCATTAATGCCTA

    CTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTG.TACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGAT

    ThrThrGlyProCysThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgVal .<01 CACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGT

    GTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCA

    SerAlaGluGluTyrValGluIleArgGlnValGlyAspPheHisTyrValThrGlyMet 2461 GTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTAT

    CAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATA

    ThrThrAspAsnLeuLysCysProCysGlnValProSerProGluPhePheThrGÍu 2521 GACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT

    CTGATGACTGTTAGAGTTTACGGC-CACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA

    14-1. ÁBRA a 40b.. 37b., 35., 36.,81., 32.,. 33b. és 25c. DNS-ek kombinált ORF-ie

    AlaTyrMetSerLysAlaHisGlylleAspProAsnlleArgThrGlyValArgThrlle 1. TGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAAT

    ACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTA

    ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCys 61 TACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTG

    ATGGTGACCGTCGGGGTÁGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCAC

    SerGlyGlyAlaTyrAspIlellelleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSer.

    121 CTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATC

    GAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAG

    IleLeuGlylleGlvThrValLeuAspGl r.AlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValVal 181 CATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGT

    GTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACA

    LeuAlaTJirAlaThrProProGlySerValThrValProHisProAsnlleGluGluVal 241 GCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGT

    CGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCA

    AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluValIle 301 TGCTCTGTCCAí CACCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAAT

    ACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTA

    LysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAla 361 CAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGT-JCGACGAACTCGCCGC

    GTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCG

    LysLeuValAlaLeuGlylleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerVal 4 21 AAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGT

    TTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCA

    IleProThrSerGlyAspValValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThr 481 CATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATAC

    GTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATG

    GlyAspPheAspSerValIleAspTyrAsnThrCysValThrGlnThrValAspPheSer.

    541 CGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTACAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAG

    GCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGATGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTC

    LeuAspProThrPheThrlleGluThrlleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThr 601 CCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCAC

    GGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTG

    GlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLysProGlylleTyrArgPneValAlaProGly 661 TCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGG

    AGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCC

    GluArgProSerGlyMetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCys 721 GGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTG

    CCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGAC

    AlaTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThr 781 TGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACAC

    ACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTG

    ProGlyLeuProValCysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeu 841 CCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCT

    GGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGA

    ThrHisIleAspAlaHisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyr 901 CACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTA

    GTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAAT

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    LeuVaLAlaTyrGlnAlaThrValCysAlaAigAlaGlnAlaProProProSerTrpAsp 961 CCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGIGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGA

    GGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCT

    GlnMetTrpLysCysLeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeu 1021 CCAGATGTGG AAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCT

    GGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGA

    TyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGluIleThxLeuThrHisProValThrLysTyrlle 1081 ATACAGACTGGGCGCTGTTCAG AATG AAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACAT

    TATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTA

    KetThrCysMetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGly 1141 CATG ACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGG

    GTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCC

    Va iLeuAl aAlaLeuAlaAla TyrCy sLeuSerThrGlyCy sValVa 11 leVa lGlyArg 1201 CGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAG

    GCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTC

    ValValLeuSerGlyLysProAlallelleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPhe 1261 GGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTT

    CCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAA

    AspGluMetGluGluCysSerGlnHisLeuProTyrlleGIuGlnGlyMetMetLeuAla 1321 CGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGC

    GCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCG

    GluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyUeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluVal 1381 CGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGT

    GCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCA

    IleAlaProAlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMet 1441 TATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATAT

    ATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATA

    TrpAsnPhelleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnPro 1501 GTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCC

    CACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGG

    AlalleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGln 1561 CGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCA

    GCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGT

    ThrLeuLeuPheAsnlleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAla 1621 AACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGC

    TTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACG

    AlaThrAlaPheValGlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGly 16 Sl. CGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGG

    GCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCC

    LysValLeuIleAspIleLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAla 1741 GAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGC

    CTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCG

    PheLy s I leMetS erG lyGl u Val P roSerThrGl uAs pLeuVa 1 As nLeuLeuP roAl a 1801 ATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGG ACCTGGTCAATCTACTGCCCGC

    TAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCG

    IleLeuSerProGlyAlaLeuValValGlyValValCysAlaAlalleLeuArgArgHis 1861 CATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCA

    GTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGT

    14. Minta, amely az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotidot tartalmaz.
15. 15. ÁBRA a 33c. transzlációja

    AlaValAspPhelleProValGluAsnLeuGluThrThrMfitArgSexProValPheThr 1 GGCGGXGGACTnATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGTTCAC

    CCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACAAGTG

    AspAsnSerSerProPxoValValProGlnSerPheGlnValAlaHisLeuHisAlaPro 61 GG ATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATGCTCC

    CCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTACGAGG

    ThrGlySexGlyLysSerThrI.ysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGljTyrLysVal 121 CACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGC2?CAGGGCTAIAAGGT

    GTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAITCCA

    LeuValLeuAsnProSexValAl aAl aThrLeuGly P heGlyAla TyrMetSerLysAla 181 GCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCAAGGC

    CGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGTTCCG

    ----átfedés a 40 b.—vei--Hi sGly IleAspPxoAsnI leArgThrGlyValArgThrlleThxThxGlySexProIle

    241 TCATGGG ATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCAT AGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGGGGTA

    ThrTyrSexThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCysSerGlyGlyAlaTyxAsp 301 CACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCG ACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTTATGA

    GTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAATACT

    IlellelleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSexIleleuGlylleGlyThr 361 CATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATTGGCAC

    GTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAACCGTG

    ValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValValLeuAlaThrAlaThrPro 421 TGTCCTTGACCAAGCAGAGÁCTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCACCCC

    ACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGTGGGG

    PrcGlySexValThxValProHisProAsnlleGluGluValAlaLeuSexThxThxGly 481 TCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGG AGGTTGCTCTGTCCACCACCGG

    AGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGTGGCC

    GluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluValIleLysGlyGlyArgHisLeu 541 AGAGATCCCTTITTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGACATCT

    TCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGT^GCCCCCCTCTGTAGA

    IlePheCysHisSexLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuValAlaLeuGly 601 CATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCATTGGG

    GTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTAACCC

    IleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerValIleProThrSerGlyAsp 661 CATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCGGCGA

    GTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGCCGCT

    ValValValValAlaThrAspAl aLeuKetThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSerVal 721 TGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACTCGGT

    ACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGAGCCA

    IleAspCysAsnThrCys 761 GATAGACTGCAATACGTGTG

    CTATCTGACGTTATGCACAC

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    15. A 14. igénypont szerinti minta, amely egy kimutatható jelölést tartalmaz.
16. 16. ÁBRA A 8h. DNS transzlációja

    ProCysThrCysGlySerSei AspLeuTyrLeuValThrArgHisAlaAspVal IlePro 1 CTCCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCAC'-riGATGTCATTC

    GAGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGGAAATGGACCAGTGCTCCGTC-í'íGCTACAGTAAG

    ValArgírgArgGlyAspSerArgGlySerLeuLeuSerProAraPxolleSerTyrLeu 61 CCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGGGCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACT

    GGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCCCGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGA

    LysGlySerSerGlyGlyProLeuLeuCysProAlaGlyHisAlaValGlyllePheArg 121 TGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTA

    ACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACAACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAAT -;-..átfedés a

    AlaAlaValCysThrArgGlyValAlaLysAlaValAspPhelleProValGluAsnLeu 181 GGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGGCTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACC

    CCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACCGAITCCGCCACCTGAAAIAGGGACACCTCTTGG

    c.-vei------GluThrThrMetArgSerProValPheThrAspAsaSer

    241 TAGAGACAACCATG AGGTCCCCGGTGTTCACGGATAACTCCTC ATCTCTGTTGGTACTCCAGGGSCCACAAGTCCCT?. 773AGGAG

    16. Vizsgálókészlet, amely egy, az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotidot tartalmaz egy megfelelő tartályban.
17. 17. ABRA A 7e. DNS transzlációja

    GlyTrpArgLeuLeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGly 1 GGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGG

    CCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGTGCCGCATCTGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCC

    CysIlelleThrSerLeuThrGlyArgAspLysAsnGlnValGluGlyGluValGlnlle 61 GTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGAT

    CACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTA

    ValSerThrAlaAlaGlnThrí-iieLeuAlaThiCysIleAsnGlyValCysTrpThrVal 121 TGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGT

    ACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACA

    TyrHisGlyAlaGlyThrArgThrlleAlaSerProLysGlyProValIleGlnMetTyr 181 CTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCATCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTA

    GATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGTAGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACAT

    ThrAsnValAspGlnAspLeuValGlyTrpProAlaProGlnGlySerArgSerLeuThr 241 TACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGGGCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGAC

    ATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACCCGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTG

    -- átfedés a Sh.-valProCysThrCysGlySerSerAspLeuTyrLeuValThrArgHis

    301 ACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACG TGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGGAAAIGGACCAGTGCTCCGTGC

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    17. Vizsgálókészlet, amely a 15. igénypont szerinti mintát tartalmazza egy megfelelő tartályban.
18. 18. ÁBRA A 14c. DNS transzlációja

    121

    181

    241

    301

    361 .421

    481

    AsntíetTrpSexGlyThrPheProIleAsnAlaTyCThrThiGlyProCysThrProLeu g?acatgtggagtgggaccttccccattaatgcctacaccacgggcccctgtacccccct

    CTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGA ____átfedés a 25c.-vei____

    ProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGluGluTyrValGlulle

    TCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAATACGTGGAGAT

    AGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTATGCACCTCTA

    AxgGlnVaiGlyAspPheHisTyrValThzGlyMetThxThrAspAsnlieuLysCysPro AAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATCTTAAATGCCC TTCCGTCCACCCCCTG AAGG TGATGCACTGCCCATACTGATGA CTG TTAGAATTTACGGG

    CysGlnValProSerProGluPhePheThrGluLeuAspGlyValArgLeuHisArgPhe

    GTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCCTACATAGGTT

    CACGGTCCAGGGTAGCGGGCITAAAAAGTGTCTTAAGCTGCCCCACGCGGATGTATCCAA

    AlaProProCysLysProLeuLeuArgGluGluValSerPheArgVaiGlyLeuHisGlu

    TGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAGGACTCCACGA

    ACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATCCTGAGGTGCT

    TyrProValGlySexGlnLeuProCysGluProGluProAspValAlaValLeuThrSer

    ATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCGTGTTCACGTC

    TATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGCACAACTGCAG

    MetLeuThrAspProSerHis IleThrAl aGluAlaAlaGlyArgArgLeuAlaArgGly CATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGTTGGCGAGGGG GTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCAACCGCTCCCC

    SerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAla

    ATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGC

    TAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCG

    ThrCysThrAlaAsnHisAspSerProAsp

    AACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGAT

    TTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTA

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    18. Polimeráz-láncreakció (PCR-) készlet, amely egy olyan indítómolekula- (primer) párt tartalmaz, amely képes egy PCR-reakcióban cDNS-szintézist beindítani és vezérelni, azzal jellemezve, hogy mindegyik indítómolekula egy, az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotid.
19. 19* ÁBRA A 8t. DNS transzlációja

    ----átfedés, a 14c.rvel -SexSéxSerAlaSeiGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHls

    AGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCAT TCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTA

    AspSerProAspAlaGluLeuIleGluAlaAsnLeuXeuTxpArgGlnGluMetGlyGly 61 GACICCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCAACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGC

    CTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGTTGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCG

    AsnlleThrArgValGluSexGluAsnLysValValIleLeuAspSerPheAspProLeu 121 AACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAGTGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTT

    TTGZAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTCACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAA

    ValAlaGluGluAspGluArgGluIleSerValProAlaGluíleLeuArgLysSerArg 181 GTGGCGGAGGAGGACGAGCGGG AGATCTCCGTÁCCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGG

    CACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGCATGGGCGTCTTTAGGAJCGCCnCAGAGCC

    ArgPheAlaGlDAlaLeuProValTrpAlaArgPraAspTyxAenProProLeuValGlu 241 AGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGCGGCCGGACTAIAACCCCCCGCTAGTGGAG

    TCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCGCCGGCCTGAIAITGGGGGGCGATCACCTC

    ThrTrpLysLysProAspTyrGliiProProValValHisGlyCysPrcLeui»roProPro 301 ACGTGG?AAA’.GCCCGAC7 i.CGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCA

    TGCACCTTT.·: zgggct: ; gcttggtggacaccaggtaccgacaggcgaaggtggaggt

    LysSerProProValPrc 361 AAGTCCCCTCCTGTGCCG

    TTCAGGGGAGGACACGGC

    19. A 18. igénypont szerinti PCR-készlet, amely továbbá egy olyan polinukleotidmintát tartalmaz, amely képes a HCV genomnak olyan részéhez szelektíven hibridizálódni, amely nem tartalmazza azt a HCV-szekvenciát, amelyből az indítómolekulák származnak.
20. 20 30 40 50

    HCV EYVVLLFLLLADARVCSCLWI4MLLISQAEAALENLVILNAASLAGTHGLVSFL'¹7FFCFA MNWVDl AVSFVTLITGNMSFRDLGRVMVMVGATMTDDIGMGVTYLALLAAFKVRPTFAAGLLLRKL 130 140 150 160 170 180 HCV 60 70 80 90 100 110 ΗΥΙΚβΚΚνΡΟΑνΥΤΓΥβΜΗΡΕΙΖιΠυΐΑΑΡΟΚΑΥΑΙΟΤΕνΑΑΒαΟσννυνΰΚΜΑυτυΒΡΥΥ MNWVDl TSKELMMTTIGIVLLSQSTIPETILELTDALALGMMVLKMVRKMEKYQLAVTIMAILCVP 190 200 210 220 230 240 HCV 120 130 140 150 160 170 KRYISWCLWWLQYFLTRVEAQLHVWIPPLNVRGGRDAVILLMCAVHPTLVFDITKLLLAV MNWVDl NAVILQNAWKVSCTILAWSVSPLFLTSSOQKADWIPLALTIKGLNPTAIF-LTTLSRTN 250 260 270 280 290 HCV 180 190 200 210 220 230 FGPLWILQASLLKVPYF-VRVQGLLRF-CALARKMIGGHYVQMVIIKLGALTGTY’VYNHL MNWVDl KKRSWPLNEAIMAVGMVSILASSLLKNDIPMTGPLVAGGLLTVCYV-LTGRSADLELERA 300 310 320 330 340 350 HCV 240 250 260 270 280 290 TPLRDWAHNGLRDLAVAVEPWFSQMETKLITWGADTAACGDIINGLPVSARRGREILLG MNWVDl ADVK-WEDQAEISGSSPILSITISE-DGSMSIKNEEEEQTLTILIRTGLLVISG---LFP 360 370 380 390 400 410 HCV 300 310 320 330 340 350 PADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQIVSTAAQTFLATC MNWVDl VSIPITAAAWYLWEVKKQRAGVLWDVPSPPPVGKAELEDGAYRIKQKGILGYSQIGAGVY 420 430 440 450 460 470 HCV 360 370 380 390 400 410 INGVCWTVYHGAGTRTIASPKGPVIQMYTNVDQDLV----GWPAPQGSRSLTPCTCGSSD MNWVDl KEGTFHTMWHVTRGAVLMHKGKRIEPSWADVKKDLVSCGGGWKLEGEWKEGEEVQVLALE 480 490 500 510 520 530 HCV 420 430 440 450 460 470 LYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPAGHAVGIFRAAVCTRGV MNWVDl .PGKNPRAVQTKPGLFKTN--AGTIGAVSLDFSPGTSGSPIIDKKGKWGLYGNGWTRSG 540 550 560 570 580 590 HCV 480 490 500 510 520 530 AKAVDFIPVENLETTMRSPVFTDNSSPPWPOSFQVAHLHAPTGSGKS—TKVPAAYAAQ MNWVDl AYVSAIAQTEK—SIEDNPEIEDDIFRK---RKLTI1ÍDLHPGAGKTKRYLPAIVRGAIKR 600 610 620 630 640 540 550 560 570 580

    129

    HU 220 204 B

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    HCV

    MNWVD1

    HCV

    MNWVD1

    HCV

    MlWvDl

    HCV

    MNWVD1

    HCV

    MNWVD1

    GYKVLVLNPS—VAATLGFGAYMSKAHGIDPNIRTGVRTITTGSPITYSTYGKFLADGGC

    GLRTLILAPTRWAAEMEEALRGLPIR YQTPAIRAEHTG RE IVDLMCHAT FTMRLL- S PV 650 660 670 680 690 700

    590 600 610 620 630 640

    SGGAYDIIICDECHSTDATSILGIGTVLDQAETAGARLWLATATPPGSVTVPHPNIEEV . .X..:: :: : . : . . . . : : . . . ::::::: . : : v.

    RVPKYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVE-MGEAAGIFMTATPPGSRD-PFPQSNAP

    710 720 730 740 750 760

    650 660 670 680 690 700

    ALSTTGEIPFYGKÁIPLEVIKGGRHLIFCKSKKKCDELAAXLVALGINAVAYYRGLDVSV

    IHDEEREIFERSWSSGHE'nVTDFXGKT'AíFVPSIKAGKDTAACLRKNGKK'.’TQLSRXTFD

    770

    780

    790

    800

    810

    820

    710 720 730 740 750 760

    IPTSGDVWVATDALMTGYTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETITLPQDAVSRT

    SEYVKTRINDWNFWTTDISEMGANFKAERVIDPRRCMKPVILTDGEERVILAGPMPVTH 830 840 850 860 870 880

    770 780 790 800 810 820 qrrgrtgrgkpgiyrfvapgerpsgmfdssvlcecydagcawyeltpaettvrlraymnt

    SS

    20. ÁBRA A 33f. DNS transzlációja

    ValTrpAlaArgProAspTyrAsaProPrdI>euValGluThrTrpLysLysProAspTyr 1 CGTTTGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAACCCGACTA

    GCAAACCCGCGCCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTTGGGCTGAT

    --átfedés a: 8f,~nél---GluProProValValRlsGiyCysProLeuProProProLysSerProProValProPro

    CGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGCCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCC GCTTGGTG S ACACCAGGTACCGACGGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGG

    ProArgLysLysArgThrValValXeuThrGluSerThrLeuSerThrAlaLeuAlaGlu 121 GCCTCGGAAGAAGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGA

    CGGAGCCTTCTTCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCT

    LeuAlaThrArgSerPheGlySerSerSerThrSerGlylleThrGlyAspAsnThrThr 181 GCTCGCCACCAGAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGAC

    CGAGCGGTGGTCTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTG

    ThrSerSerGluProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerPhe 241 AACA7GCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCG ACTCCGACGCTGAGTCCTTTGC ttgtaggagactcgggcggggaagaccgacgggggggctgaggctgcgactcaggaaacg

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    20. HCV polinukleotid, izolált formában, amely egy olyan polipeptidet kódol, amely legalább 10 aminosavból álló egybefüggő, a HCV genom nukleotidszekvenciája által kódolt szekvenciát és egy antigén determinánst tartalmaz.
21. 21 TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC

    SerTrpAlalleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg 781 CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTCCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC

    GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAGGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG

    134

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    VaLCysSerCysLeu'DrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn 841 GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAAGCGGCTTTGGAGA

    CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTTCGCCGAAACCTCT

    LeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuVal 901 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG

    TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC

    PhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPhe 961 TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATCTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT

    ACAAGAAGACGAAACGTACCATAGACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA

    TyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuFroGlnArgAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC

    AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACC-GC-GTCGCCCGCATGCGCG

    AspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThr 1081 tggacacggaggtggccgcgtcgtgtggcggtGttgttctcgtcgggttgatggcgctaa

    ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGATT

    LeuSerProTyrTyrLysAxgTyrIleSerTrpCysLeuTr.pTrpLeuGlnTyrPheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC

    GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG

    ThrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArg 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC

    ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG

    AspAl aValIleLeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuValPheAsDlleThr Lys 1261 GCGACGCTGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA

    CGCTGCGACAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT

    LeuLeuLeuAlaV'alPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAla 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAG

    TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTC

    21 TGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAA ACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTT

    Ke tG1uThrLysLeuIleThrTrpG1y 481 ATGGAGACCAAGCTCATCACGTCGGGGGC

    TACCTCIGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCG

    100

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    21. ÁBRA A 33g. DNS transzlációja

    AlaSexAxgSerPheGlySarSexSerThrSerGlyllerhrGlyAspAsnThrThrThr 1 gcctccagaagctttggcagctcctcaacttccggcattacgggcgacaatacgacaaca

    CGGAGGTCTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAAIGCCCGCTGTTATGCTGTTGT ___átfedés a 33f.-fel__

    SerSerGluProAlaProSérGlyCysProProÁspSerAspAlaGluSerTyrSerSer

    TCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCC AGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGG

    KetProProLeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrpSexThr 121 ATGCCCCCCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACG

    TACGGGGGGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGC

    ValSerSerGluAlaAsnAlaGluAspValValCysCysSetííetSerTyrSerTrpTht· 181 GTCAGTAGTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACA

    CAGTCATCACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGT

    GlyAlaLeuValThxProCysAlaAl'aGluGluGlnLysLeuProIleAsnAlaLeuSer 241 GGCGCACTCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACIGCCCAÍCAATGCACTAAGC

    CCGCGTGAGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCITGTCTTTGACGGGTAGTXACGTGATTCG

    AsnSerLeuLeuArgHisHisAsnLeuValTyrSerThxThrSerAxgSer 301 AACTCGTTGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTG

    TTGAGCAACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTGAC

    21 AAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGT TTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCA

    IleProThr 481 CATCCCGACCAG

    GTAGGGCTGGTC

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    21. A 20. igénypont szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő szekvencia legalább 15 aminosavból áll.
22. 22. ÁBRA A 7f. DNS transzlációja

    GlyThrTyrValTyrAspKisLeuThrProLeuArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArg 1 GGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGA

    CCGTGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCT

    AspLeuAlaValAlaValGluProValValPheSerGlnMetGluThrLysLeuIleThr 61 G ATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACG

    CTAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGC

    TrpGlyAlaAspThrAlaAlaCysGlyAspIlelleAsnGlyLeuProValSerAlaArg 121 TGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGC accccccgtctatggcggcgcacgccactgtagtagttgccgaacggacaaaggcgggcg

    ArgGlyArgGluIleLeiiLeuGlyProAlaAspGlyMetValSerLysGlyTrpArgLeu 181 AGGGGCCGGGAGATACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGTTGGAGGTTG

    TCCCCGGCCCTCTAIGACGAGCCCGGTCGGCTACCTIACCAGAGGTTCCCAACCTCCAAC

    LeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnGlnThxArgGlyLeuLeuGlyCysIlelleThr 241 CTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACC

    GACCGCGGGTAGTGCCGCATGCGGGT.CGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGG

    ----------------áfedés· 7e.-vel---------------------------SerLeuThrGlyArgAspLysAsnGlnValGluGlyGluValGlnlíeValSerThrAla

    301 AGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCT TCGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGA

    AlaGlnThrPheLeuAlaThrCysIleAsnGlyValCysTrp 361 GCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGG

    CGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACC

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    22. A 20. vagy a 21. igénypont szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő (aminosav-) szekvencia a következő szekvencia által kódolt (14. ábra):

    AlaTy rMe t Se rLy sAlaHi sGlyI1eAspPr oAsnI1eArgThrGlyVa1ArgThrI1e 1 TGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAAT

    ACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTA

    ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLys PheLeuAlaAs pGlyGlyCy s 61 TACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTG

    ATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCAC

    HU 220 204 Β

    Se rGl yGl yAl aTyrAspIlel lelleCy sAspGluCysHi sSerThrAs pAlaThr Se r 121 CTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATC

    GAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAG

    I1eLeuGly11eGlyTh rVa1LeuAspGlnAlaGluTh rAlaGlyAlaAr gLeuVa1Va1 181 CATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGT

    GTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACA

    LeuAl aThrAlaThrProProGlySerValThrValProHi s Pr oAsnI1eGluGluVa1 241 GCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGT

    CGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCA

    AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluValIle 30 1 TGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAAT

    ACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTA

    Ly sGl yGlyAr gHi sLeuI1e PheCy sHi s Se rLysLy sLysCy sAs pGluLeuAlaAla 361 CAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGC

    GTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCG

    LysLeuVa1AlaLeuGly11eAsnAlaValAlaTyrTyrAr gGlyLeuAs pVa1 Se rVa1 421 AAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGT

    TTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCA

    IleProThrSerGlyAs pVa1Va1Va1Va1AlaTh rAspAlaLeuMe tThrGlyTyrTh r 481 CATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATAC

    GTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATG

    GlyAs pPheAspSerVa1I1eAspTyrAsnThrCysVaIThrGlnThrValAspPheSer 541 CGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTACAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAG

    GCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGATGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTC

    LeuAspProThrPheThrIleGluThrI leThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThr 601 CCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCAC

    GGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTG

    GlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLy s Pr oGlyI1eTyrArgPheVa1A1aPr oGly 661 TCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGG

    AGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCC

    Gl uAr gPr oSe rGlyMe t PheAs pSe r Se rVa1LeuCysGluCy sTyrAspAlaGlyCys 721 GGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTG

    CCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGAC

    AlaTr pTyrGluLeuThr Pr oAlaGluThrTh rVa 1 ArgLeuAr gAlaTy rMe tAsnTh r 781 TGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACAC

    ACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTG

    Pr oGl yLeuPr oValCysGlnAspHi sLeuGluPheTrpGluGlyVa1PheThrGlyLeu 841 CCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCT

    GGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGA

    ThrHi s11eAspAlaHi sPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyr 901 CACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTA

    GTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAAT

    LeuVa 1AlaTyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTr pAsp 961 CCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGA

    GGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCT

    HU 220 204 Β

    GlnMe tTr pLysCysLeuI1eArgLeuLy s Pr oThrLeuHi sGlyPr oThr Pr oLeuLeu 1021 CCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCT

    GGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGA

    TyrArgLeuGlyAlaVa1G1nAsnGlu11eThrLeuThrHi sProValThrLysTyrlle 1081 ATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACAT

    TATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTA

    Me tThrCysMe t Se rAlaAspLeuGluVa1Va1ThrSe rThrTrpVa1LeuVa1G1yGly 1141 CATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGG

    GTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCC

    Va1LeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSe rThrGlyCysVa1Va1I1eVa1G1yArg 1201 CGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAG

    GCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTC

    VaIVa1LeuSe rGlyLys ProAla 11e11ePr oAspArgGluValLeuTyrArgGluPhe 1261 GGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTT

    CCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAA

    As pGl uMe tGluGluCy sSe rGlnHi sLeuProTyrlleGluGlnGl yMe tMe tLeuAla 1321 CGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGC

    GCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCG

    GluGlnPheLy sGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnTh rAla Se rArgGlnAlaGluVa1 1381 CGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGT

    GCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCA

    11eAl aPr oAlaVa1G1nThrAsnTr pGlnLy sLeuGluThr PheTr pAlaLysHi sMe t 1441 TATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATAT

    ATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATA

    T r pAsnPheIleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnPr o 1501 GTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCC

    CACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGG

    Ala I1eAlaSe rLeuMetAla PheTh rAlaAlaVa1Th r Se r Pr oLeuTh rThr Se rGln 1561 CGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCA

    GCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGT

    ThrLeuLeuPheAsnI1eLeuGlyGlyTr pVa1AlaAlaGlnLeuAlaAlaPr oGlyAla 1621 AACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGC

    TTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACG

    AlaThrAlaPheVa1G1yAlaGlyLeuAlaGlyAlaAla 11eGlySerVa1G1yLeuGly 1681 CGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGG

    GCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCC

    LysVa1LeuI1eAsp11eLeuAlaGlyTy rGlyAlaGlyVa1AlaGlyAlaLeuVa1Ala 1741 GAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGC

    CTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCG

    PheLys11eMe t Se rGlyGluVa1ProSe rThrGluAspLeuValAsnLeuLeuPr oAla 1801 ATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGC

    TAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCG

    IleLeuSerProGlyAlaLeuValValGlyValValCysAlaAla I1eLeuAr gArgHi s 1861 CATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTCCGCCGGCA

    GTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGT

    HU 220 204 Β

    Va1G1yPr oGlyGluGlyAlaVa1G1nTr pMe tAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArg 1921 CGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCG

    GCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGC

    GlyAsnHi sVa1 Se r Pr oTh rHisTyrValProGluSerAs pAlaAlaAlaAr gVaIThr 1981 GGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCAC

    CCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTG

    AlalleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHi sGlnTrpIleSer 2041 TGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAG

    ACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTC

    Se rGluCy sTh rTh rProCysSerGlySerTr pLeuArgAs pl 1eTr pAs pTrpIleCys 2101 CTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATG

    GAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATAC

    GluValLeuSerAspPheLysThrTr pLeuLysAlaLy sLeuMe tProGlnLeuProGly 2161 CGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGG

    GCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACC

    11e Pr oPheVa1 Se rCy sGlnAr gGlyTyrLy sGlyVa1Tr pArgVa1AspGlyI1 eMe t 2 221 GATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCAT

    CTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTA

    Hi sThrArgCysHi sCysGlyAlaGluI1eThrGlyHi sVa1LysAsnGlyThrMe tArg 2281 GCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAG

    CGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTC

    11eVa1G1yPr oArgTh rCysAr gAsnMe tTrpSe rGlyThr PheProIleAsnAlaTyr 2341 GATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTA

    CTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGAT

    Th rThrGlyPr oCy sThr Pr oLeuPr oAla Pr oAsnTyrTh r PheAlaLeuTr pArgVa1 2401 CACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGT

    GTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCA

    Se rAlaGluGluTyrValGluI1eArgGlnVa1G1yAs pPheHi sTyrValThrGlyMe t 2461 GTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTAT

    CAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATA

    Th rThrAs pAsnLeuLysCy s Pr oCysGlnVa1Pr oSe r Pr oGluPhe PheTh rGlu 2521 GACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT

    CTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA
23. 23.- ÁBRA A 11b. DNS. t ranszlációj a

    GlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAl aLeuThr LeuSerProTyrTyrLysArgTyr 1 GGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATATTACAAGCGCTAT

    CCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATA

    IleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGlnTyrPheLeuThrArgValGluAlaGlnLeuHis 61 ATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC; GACCAGAGTGG AAGCGCAACTGCAC

    TAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAGACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTG

    ValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArgAspAlaValIleLeuLeuMetCys 121 GTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGCGCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGT

    CACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCGCGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACA

    AlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLysLeuLeuLeuAlaValPheGlyPro 181 GCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCAAATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCC

    CGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGTTTAACGACGACCGGCAGAAG' 2TGGG

    L-suTrpIleLeuGlnAl aSerLeuLeuLysValFrcTyrPheValArgValGlnGlyLeu 241 C7TTGGATTCTTCAAC-CCAGTTTGCTTAAAGTACCCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTT

    GAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATGGGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAA

    LeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMetlleGlyGlyHisTyrValGlnMetValIle 301 CTCCGGTTCTGCGCGTTAG-CGCGG7AGATGATCGGAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATC

    GAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGCCTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAG

    IleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValTyrAsnHisLeuThrProLeuArgAsp 361 ATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCTTCGGG AC

    TAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTG

    ---------------------átfedés a 7f.-fel-—_;-----_:------------TrpAlaHisAsnGlyLeuArgAspLeuAlaValAlaValGluProValValPheSerGln

    23. A 20. vagy 21. igénypont szerinti HCV polinuk- 45 leotid, amelyben az egybefüggő szekvencia az alábbi szekvencia (47. ábra) által kódolt:

    GlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGly 1 CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG

    GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC

    ProlleSerTyrAlaAsnGlySe rGlyPr oAspGlnAr gPr oTyrCy sTr pHisTyrPro

    GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG

    ProLysProCysGlylleValPr oAlaLysSerValCysGlyPr oVa1TyrCy s PheTh r 121 CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA

    GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT

    HU 220 204 Β

    Pr oSe r Pr oVa1Va1Va1G1yTh rTh rAspAr gSe rGlyAlaPr oThrTyr Se rTr pGly 181 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG

    GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC

    GluAsnAspTh rAs pVa1PheVa1LeuAsnAsnTh rAr gPr oPr oLeuGlyAsnTr pPhe 241 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT

    CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA

    Gl yCysThrTrpMe tAsnSe rTh rGlyPheThrLysValCy sGlyAla Pr oPr oCy sVa1 301 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG

    AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC

    I1eGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHi sCy sPr oThrAspCy sPheArgLy sHi sPro 361 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC

    AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG

    AspAlaThrTyrSe rArgCysGlySe rGlyPr oTrpI1eThr ProArgCysLeuVa1Asp 421 CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG

    GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC

    TyrProTyrArgLeuTrpHi sTyrProCysThrI1eAsnTyrThr11ePheLys11eArg 481 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA

    TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT

    Me tTyrVa1G1yGlyVa1G1uHi sAr gLeuGluAlaAlaCysAsnT r pTh rAr gGlyGlu 541 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG

    CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC

    Ar gCy sAs pLeuGluAs pAr gAs pAr gSe rGluLeuSe r Pr oLeuLeuLeuThrThrTh r 601 AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA

    TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT

    GlnTr pGlnVa1LeuPr oCy sSe rPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle 661 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA

    GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT

    Hi sLeuHisGlnAsnI1eVa1AspValGlnTyrLeuTyrGlyValGlySerSerlleAla 721 TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG

    AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC

    Se rTr pAla I1eLy sTr pGluTyrVaIVa1LeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg

    81 CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC

    GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG

    ValCy sSe rCy sLeuTr pMe tMe t LeuLeu11eSe rGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn
24. 24. ÁBRA A 14í. DNS transzlációja

    GluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrp 1 GGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGT

    CCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACA

    MetMetLéuLeuIleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsnLeuValIleLeuAsnAla 61 GGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATG

    CCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGqCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTAC

    AlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuYalSerPheLeuValPhePheCysPheAlaTrp 121 CAGCATCCGTGGCGGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTTGCAT

    GTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAACGTA

    TyrLeuLysGlyLysTrpValPrcGlyAlaValTyrThrPheiyrGlyMetTrpProLeu 181 GGTATTTG AAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTAC ACCTTCTACGGG ATGTGGCCTC

    CCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACCGGAG

    LeuLeuUeuLeuLeuAlaLeuPrcGlnArgAlaTyrAlal^uAspThrGluValAlaAla 241 TCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTGGCCG

    AGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCACCGGC

    --------------------átfedés a 11b.-vei----------SerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyrTyrLys

    24. A 20. vagy a 21. igénypont szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő szekvencia az ATCC 40394 számon letétbe helyezett lambda-gtl 1 cDNS-könyvtáron belül kódolódik.
25. 25. ABRA A 39c. DNS transzlációja

    ProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerTyrSerSerMetProPro 1 CCAGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCCCC

    GGTCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGGGG

    LeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerSer 61 CTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACAGTCAGTAGT

    GACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGTCAGTCATCA ___________________-átfedés a 33g.-vel-----------------GluAlaAsnAlaGluAspValValCysCysSerMetSerTyrSerTrpThrGlyAlaLeu

    121 GAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCCTACTCTTGGACAGGCGCACTC CTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGGATGAGAACCTGTCCGCGTGAG

    ValThxProCysAlaAlaGluGluGlnLysLeuProlleAsnAlaLeuSerAsnSerLeu 181 GTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTGAGCAACTCGTTG

    CAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGACTCGTTGAGCAAC

    LeuAxgHisHisAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLys 241 CTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGAAG

    GATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCTTC

    LysValThrPheAspArgLeuGlnVaÍLeuAspSerHisTyrGlnAspValLeuLysGlu 301 AAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGG ACGTACTCAAGGAG

    TTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCCTC

    ValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnPhe 351 GTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTC

    CAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAAG

    101

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    25. A 20-24. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő szekvencia egy szerkezeten kívüli vírusfehérjét kódoló szekven60 cián belül kódolódik.

    HU 220 204 Β
26. 26-6. ABRA

    107

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    26-5. ÁBRA

    106

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 Ν 15/38

    4861 CTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCAGAAGCTTTGGCAGCTCCT GACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGTCTTCGAAACCGTCGAGGA

    ThrSerGlylleThxGlyAspAsnThxThxThrSerSerGluProAlaProSerGlyCys 4921- CAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACÁTCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCT

    GTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGA

    ProProAspSerAspAlaGluSerTyrSerSerMetProProLeuGluGlyGluProGly 4981 GCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCCCCCTGGAGGGGGAGCCTG

    CGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGGGGGACCTCCCCCTCGGAC

    AspProAspLeuSerAspGlySerTrpSérThrValSerSerGluAlaAsnAlaGluAsp 5041 GGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTAGTGAGGCCAACGCGGAGG

    CCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCATCACTCCGGTTGCGCCTCC

    ValValCysCysSerMetSerTyrSerTrpThxGlyAlaLeuValThrProCysAlaAla 5101 ATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCACTCGTCACCCCGTGCGCCG

    TACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTGAGCAGTGGGGCACGCGGC

    GluGluGlnLysLeuProIleAsnAlaLeuSerAsnSerLeuLeuArgHisHisAsnLeu 5161' CGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGTTGCTACGTCACCACAATT

    GCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCAACGATGCAGTGGTGTTAA

    ValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnAxgGlnLysLysValThrPheAspArg 5221 TGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGAAGAAAGTCACATTTGACA

    ACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCTTCTTTCAGTGTAAACTGT

    LeuGlnValLeuAspSerHisTyrGlnAspValLeuLysGluValLysAlaAlaAlaSer 5281 GACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGGAGGTTAAAGCAGCGGCGT

    CTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCCTCCAATTTCGTCGCCGCA

    LysValLysAlaAsnLeu 5341 CAAAAGTGAAGGCTAACTTG GTTTTCACTTCCGATTGAAC

    26-3. ÁBRA

    104

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    2881 CAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATAC GTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATG

    AspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGluCysSerGlnHisLeuPro 2941 CTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTAC

    GACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATG

    TyrlleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeu 3001 CGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCC

    GCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGG

    GlnThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaYalGlnThrAsnTrpGlnLys 3061 TGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAA

    ACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTT

    LeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPhelleSerGlylleGlnTyrLeuAla 3121 AACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGG

    TTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACC

    GlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlalleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAla 3181 CGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTG

    GCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGAC

    ValThrSerProLeuThrThxSerGlnThrLeuLeuPheAsnlleLeuGlyGlyTrpVal 3241 CTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGG

    GACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCC

    AlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheValGlyAlaGlyLeuAlaGly 3301 TGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTG

    ACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGAC

    AlaAlalleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAspIleLeuAlaGlyTyrGly 3361 GCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATG

    CGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATAC

    AlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleKetSexGlyGluValProSerThr 3421 GCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCA

    CGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGT

    GluAspLeuYalAsnLeuLeuProAlalleLeuSexProGlyAlaLeuValValGlyVal 3481 CGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCG

    GCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGC

    ValCysAlaAlalleLeuArgArgHisValGlyProGlyGluGlyAlaValGlnTrpHet 3541 TGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGA

    ACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCT

    AsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSerProThrHisTyrValPro 3601 TGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGC

    ACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACG

    G luSerAspAlaAlaAlaArgValThrAla I leLeu SerS erLeuThrValThxGlnLeu 3661 CGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGC

    GCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCG

    LeuArgArgLeuHisGlnTrpIleSerSerGluCysThrThrProCysSerGlySerTrp 3721 TCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCT

    AGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGA

    LeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeuLys 3781 GGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAA

    CCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGATT

    AlaLysLeuMetProGlnLeuProGlylleProPheValSerCysGlnArgG Γ/Tyr Lys 3841 AAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATA

    TTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATAT

    2δ-4. ÁBRA

    105

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    GlyValTrpArgValAspGlylleMetHisThrArgCysHisCysGlyAlaGluIleThr 3901 AGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCA

    TCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGT

    GlyHisValLysAsnGlyThrMetArglleValGlyProArgThrCysArgAsnMetTrp 3961 CTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGT

    GACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACA

    SerGlyThrPheProIleAsnAlaTyrThrThrGlyProCysThrProLeuProAlaPro 4021 GGAGTGGG ACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGC

    CCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCG

    AsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGluGluTyrValGluIleArgGlnVal 4081 CGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGG

    GCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCC

    GlyAspPheHisTyrValThrGlyMetThrThxAspAsnLeuLysCysProCysGlnVal 4141 TGGGGG ACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGG

    ACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCC

    ProSerProGluPhePheThrGlüLeuAspGlyValArgLeuHisArgPheAlaProPro 4201 TCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCCTACATAGGTTTGCGCCCC

    AGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGGATGTATCCAAACGCGGGG

    CysLysProLeuLeuArgGluGluValSerPheArgValGlyLeuHisGluTyrProVal 4 261 CCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAGGACTCCACGAATACCCGG

    GGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATCCTGAGGTGCTTATGGGCC

    GlySerGlnLeuProCysGluProGluProAspValAlaValLeuThrSerMetLeuThr 4321 TAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCGTGTTGACGTCCATGCTCA

    ATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGCACAACTGCAGGTACGAGT

    AspProSerHis IleThrAl aGluAlaAlaGlyArgArgLeuAlaArgGlySerProPro 4381 CTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGTTGGCGAGGGGATCACCCC

    GACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCAACCGCTCCCCTAGTGGGG

    SerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThr 4441 CCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGCAACTTGCA

    GGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCGTTGAACGT

    AlaAsnHisAspSerProAspAlaGluLeuIleGluAlaAsnLeuLeuTrpArgGlnGlu 4501 CCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCAACCTCCTATGGAGGCAGG

    GGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGTTGGAGGATACCTCCGTCC

    MetGlyGlyAsnlleThrArgValGluSerGluAsnLysValValIleLeuAspSerPhe 4561 AGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAGTGGTGATTCTGGACTCCT

    TCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTCACCACTAAGACCTGAGGA

    AspProLeuValAlaGluGluAspGluArgGluIleSerValProAlaGluIleLeuArg 4621 TCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAG ATCTCCGTACCCGCAGAAATCCTGC

    AGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGCATGGGCGTCTTTAGGACG

    LysSerArgArgPheAlaGlnAlaLeuProValTrpAlaArgProAspTyrAsnProPro 4681 GGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCC

    CCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCGCCGGCCTGATATTGGGGG

    LeuValGluThrTrpLysLysProAspTyrGluProProValValHisGlyCysProLeu 4741 CGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGTCCGC

    GCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGACACCAGGTACCGACAGGCG

    ProProProLysSerProProValProProProArgLysLysArgThrValValLeuThr 4 801 TTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGAAGCGGACGGTGGTCCTCA

    AAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCTTCGCCTGCCACCAGGAGT

    GluSerThrLeuSerThrAlaLeuAlaGluLeuAlaThr.irgSerPheGlySerSerSer

    26-1. ÁBRA

    A 14i. , 11b., 7f-, 7e., 8h., 33c., 40b. 81., 32., 33b., 25c. , 14c., 8f. , 33.T. , DNS-ek kombinált ORF-je , 37b., 35. , 36 33g.,és 39c.

    GlúTyrVálVálEeüLeuPKeLeuLeuLfcüAlaAspAlaArgVálCysSerCysLeuTrp 1 gggagtacgtcgttctcctgttccttctgcttgcagacgcgcgcgtctgctcctgcttgt

    CCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACA

    MetMe tLeuLeu I le£ ?rGlnAl aGluAl aAl aLeuGluAs nLeuVal IleLeuAsnAla 61 GGATG ATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATG

    CCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTAC

    AlaSf-rLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuValPhePheCysPheAlaTrp 121 CAGCA5CCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTTGCAT

    GTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAACGTA

    TyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPheTyrGlyMetTrpProLeu 181 GGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCTTCTACGGGATGTGGCCTC

    CCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACCGGAG

    LeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeuAspThrGluValAlaAla 241 TCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGCTGGACÁCGGAGGTGGCCG

    AGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGC-GTCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCACCGGC

    SerCysGlyGiyValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyrTyrLys 301 CGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATATTACA

    GCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATAATGT

    361

    ArgTyrIleSerTrpCysLeuTrpTrpLeuGlnTyrPheLeuThr.\:*í?ValGluAlaGln

    AGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTCTGACCf-.GÁGTGGAAGCGC

    TCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAGACTGGTCTCACCTTCGCG

    LeuHisValTrpIleFroProLeuAsnValArgGlyGlyArgAspAlaValIleLeuLeu 4 21 AACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGCGCGACGCCGTCATCTTAC

    TTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCGCGCTGCGGCAGTAGAATG

    HetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLysLeuLeuLeuAlaValPhe 481 TCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTG ACATCACCAAATTGCTGCTGGCCGTCT

    AGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGTTTAACGACGACCGGCAGA

    GlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSerLe-iLeuLysValProTyrPheValArgValGln 541 TCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTACCCTACTTTGTGCGCGTCC

    AGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATGGGATGAAACACGCGCAGG

    GlyLeuLeu+rgPheCysAlaLeuAlaArgLysKetlleGlyGlyHisTyrYalGlnMet 601 AAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCGGAGGCCATTACGTGCAAA

    TTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGCCTCCGGTAATGCACGTTT

    ValIlelleLysLeuGlyAlaLeuThrC-lyThrTyrValTyrAsnHisLeuThrProLeu 661 TGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTC

    ACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAG

    ArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArcAíoLeuAlaValAlaValGluProValValPhe 721 TTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGÁGATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCT

    AAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGA

    SerGlnKetGluThrLysLeuIleThrTrpGlyAlaAspThrAlaAlaCysGlyAspIle 781 TCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACA

    AGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTATGGCGGCGCACGCCACTGT

    IleAsnGlyLeuProValSerAlaArgArffGlyArgGluIleLeuLeuGlyProAlaAsp 841 TCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGATACTGCTCGGGCCAGCCG

    AGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCTATGACGAGCCCGGTCGGC

    GlyKetValSerLysGlyTrpArgLeuLeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnGlnThr

    102

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    901 ATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGA TACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGTGCCGCATGCGGGTCGTCT

    ArgGlyLeuLeuGlyCysIlelleThrSerLeuThrGlyArgAspLysAsnGlnValGlu 961 CAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGG

    GTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACC

    GlyGluValGlnlleValSerThrAlaAlaGlnThrPheLeuAlaThrCysIleAsnGly 1021 AGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATG

    TCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTAC

    ValCysTrpThrValTyrHisGlyAlaGlyThrArgThrlleAlaSerProLysGlyPro 1091 GGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCATCGCGTCACCCAAGGGTC

    CCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGTAGCGCAGTGGGTTCCCAG

    ValIleGlnMetTyrThrAsnValAspGlnAspLeuValGlyTrpProAlaProGlnGly 1141 CTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGGGCTGGCCCGCTCCGCAAG

    GACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACCCGACCGGGCGAGGCGTTC

    SerArgSerLeuThrProCysThrCysGlySerSerAspLeuTyrLeuValThrArgHis 1201 GTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGC

    CATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGGAAATGGACCAGTGCTCCG

    AlaAspValIleProValAxgArgArgGlyAspSerArgGlySerLeuLeuSerProArg 1261 ACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGGGCAGCCTGCTGTCGCCCC

    TGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCCCGTCGGACGACAGCGGGG

    ProlleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeuCysProAlaGlyHisAla 1321 GGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGGCACG

    CCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACAACACGGGGCGCCCCGTGC

    ValGlyllePheArgAlaAlaValCysThrArgGlyValAlaLysAlaValAspPhelle 1391 CCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGGCTAAGGCGGTGGACTTTA

    GGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACCGATTCCGCCACCTGAAAT

    ProValGluAsnLeuGluThrThrMetArgSerProValPheThrAspAsnSerSerPro 1441 TCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGTTCACGGATAACTCCTCTC

    AGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACAAGTGCCTATTGAGGAGAG

    ProValValProGlnSerPheGlnValAlaHisLeuHisAlaProThrGlySerGlyLys 1501 CACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATGCTCCCACAGGCAGCGGCA

    GTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTACGAGGGTGTCCGTCGCCGT

    SerThrLy sValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLysVa lLeuValLeuAsnPro 1561 AAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATAAGGTGCTAGTACTCAACC

    TTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATATTCCACGATCATGAGTTGG

    SerValAláAlaThrLeuGlyPheGIyAlaTyrMetSerLysAlaHisGlylleAspPro 1621 CCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATC

    GGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAG

    AsnlleArgThrGlyValArgThrTleThrThrGlySerProlleThrTyrSerThrTyr 1681 CTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCT

    GATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGA

    GlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCysSexGlyGlyAlaTyrAspIlellelleCysAsp 1741 ACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTG

    TGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACAC

    GluCysHisSerThrAspAlaThrSerlleLeuGlylleGlyThrValLeuAspGlnAla 1801 ACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAG

    TGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTC

    GluThrAlaGlyAlaArgLeuValValLeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThr 1861 CAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCA

    GTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGT 26-2. Á3RA

    103

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    ValProHisProAsnlleGluGluValAlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyr 1921 CTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTT

    GACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGKGTGGZCTCTCTAGGGAAAAA

    GlyLysAlalleProLeuGluValIleLysGlyGlyAxgHisLeuIlePheCysHisSer 1981 ACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGG AGACATCTCATCTTCTGTCATT

    TGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAA

    LysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuValAlaLeuGlylleAsnAlaValAla 2041 CAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAÖCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGG

    GTTTCTTCTTCACGCTCCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACC

    TyrTyrArgGlyLeuAspValSerValIleProThxSerGlyAspValValValValAla 2101 CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGG

    GGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACC

    ThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSerValIleAspCysAsnThr 2161 CAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTGCAATA

    GTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGACGTTAT

    CysValThrGlnThrValAspPheSerLeuAspProThrPheThrlleGluThrlleThr 2221 CGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCA

    GCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGT

    LeuProGlnAspAlaValSerArgThiGlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLysPro 2281 CGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGC

    GCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCG

    GlylleTyrArgPheValAlaProGlyGiuArgProSerGlyMetPheAspSerSerVal 2341 CAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCG

    GTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGC

    LeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeuThxProAlaGluThrThr 2401 TCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTA

    AGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGAT

    ValAxgLeuAxgAlaTyrMetAsnThxProGlyLeuProValCysGlnAspHisLeuGlu 2461 CAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTG

    GTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAAC

    PheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAlaHisPheLeuSerGlnThr 2521 AATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGA

    TTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCT

    LysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGlnAlaThrValCysAlaArg 2581 CAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTA gtttcgtctcacccctcttggaAggaatggaccatcgcatggttcggtggcacacgcgat

    AlaGlnAlaProProProSerTrpAspGlnMetTrpLysCysLeuIleArgLeuLysPro 2641 GGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGC

    CCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCG

    ThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGlulleThr 2701 CCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCA

    GGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGT

    LeuThxHisProValThrLysTyrlleMetThxCysMetSerAlaAspLeuGluValVal 2761 CCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCG

    GGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGC

    ThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSer 2821 tcacg; GCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGT

    AGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACA

    ThrGlyCysValValIleValGlyArgValValLeuSerGlyLysProAlallellePro

    26. A 20-24. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotid, amelyben az egybefüggő szekvencia egy szerkezeti vírusfehérjét kódoló szekvencián belül kódolódik.
27. 27. ábra A 12f. DNS transzlációja

    IlePheLysIleArgMetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsn 1 CCATATTTAAAATCAGGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCA

    GGTATAAATTTTAGTCCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGT

    TrpThrArgGlyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeu 61 ACTGGACGCGGGGCGAACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGT

    TGACCTGCGCCCCGCTTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCA

    LeuLeuThrThrThrGlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeu 121 TACTGCTGACCACTACACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCT

    ATGACGACTGGTGATGTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGA

    SerThrGlyLeuIleHisLeuHisGlnAsnlleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyVal 181 TGTCCACCGGCCTCATCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGG

    ACAGGTGGCCGGAGTAGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCC

    GlySerSerlleAlaSerTrpAlalleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeu 241 TGGGGTCAAGCATCGCGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTC

    ACCCCAGTTCGTAGCGCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAG

    LeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGlu 301 TGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGG

    ACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCC

    -------------- átfedés a 14i.-vel -------------------------AlaAlaLeuGluAsnLeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeu

    361 AGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTC TCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAG

    Val

    421 TTGTATC AACATAG

    108

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 Ν 15/38

    27. Rekombináns vektor, amely az 1-13. vagy 5 20-26. igénypontok bármelyike szerinti HCV polinukleotidot tartalmazza.
28. 28. ÁBRA A 35£. DNS transzlációja

    -----------átfedés a 39c-—vei---------------LeuLysGluValLysAlaAlaAlaSsrLysValLysAlaAsnLeuLeuSerValGluGlu. 1 TGCTCAAGGAGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGG

    ACGAGTTCCTCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCC

    AlaCysSerLeuThrPreProHisSerAlaLysSerLysPheGlyTyrGlyAlaLysAsp 61 AAGCTTGCAGCCTGACGCCCGCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAG

    TTCGAACGTCGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTC

    ValArgCysHisAlaArcLvsAlaValThrHisIleAsnSerValTrpLysAspLeuLeu 121 ACGTCCGTTGCCATGCCAGÁAÁGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGaaagaccttc

    TGCAGGCAACGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAG

    GluAspAsnValThrProíleAspThrThrlleMetAlaLysAsnGluValPheCysVal 181 TGGAAGACAATGTAACACCAATAGACACTACCATCATCGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCG

    ACCTTCTGTTACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGC

    GlnProGluLysGlyGlyArgLysProAlaArgLeuIleValPheProAspLeuGlyVal 241 TTCAGCCTGAGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCG

    AAGTCGGACTCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGC

    ArgValCysGluLysMetAlaLeuTyrAspValValThrLysLeuProLeuAlaValMet 301 TGCGCGTGTGCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAÁAGCTCCCCTTGGCCGTGA

    ACGCGCACACGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACT

    GlySerSerTyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArgValGluPheLeuValGlnAla 361 TGGGAAGCTCCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAG

    ACCCTTCGAGGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTC

    TrpLysSerLysLysThrProMetGlyPheSerTyrAspThrArgCysPheAspSerThr •421 CGTGGAAGTCCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCA

    GCACCTTCAGGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGT

    ValThrGluSerAspIleArgThrGluGluAla 481 CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCA GTCAGTGACTCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGT

    109

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    28. A 27. igénypont szerinti rekombináns vektorral transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a rekombináns vektor egy, a HCV nukleotidszekvencia által kó- 10 dőlt polipeptidet kódoló szekvenciát és egy HCV antigén determinánst tartalmaz, és benne a kódolószekvencia működőképesen kötődik egy, a kódolószekvenciának a gazdasejt által való kifejeződését biztosító kontrollszekvenciához. 15

    Pr oLy s Pr oCy sGlyI1eVa1Pr oAlaLysSerValCy sGlyPr oValTyrCysPheThr 12 1 CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA

    GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT

    ProSerProValValVa1G1yThrThrAspArgSe rGlyAlaProThrTyrSe rTrpGly 1 8 1 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG

    GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC

    GluAsnAspTh rAs pVa1PheVa1LeuAsnAsnTh rArgPr oPr oLeuGlyAsnTr pPhe 241 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT

    CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA

    Gl yCy sThrTr pMe tAsnSerThrGlyPheThrLysValCy sGlyAlaProProCysVal 301 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG

    AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC

    I1eGlyGlyAlaGlyAsnAsnTh rLeuHi sCy s Pr oTh rAs pCy s PheArgLysHi s Pr o 361 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC

    AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG

    AspAlaThrTyr Se rArgCy sGlySerGlyProTrpIleTh r Pr oAr gCy sLeuVa1As p 421 CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG

    GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC

    TyrProTyrArgLeuTrpHi sTyrProCysThrI1eAsnTyrThr11ePheLysI1eArg 481 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA

    TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT

    Me tTyrVa1G1yGlyVa1G1uHi sArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu 541 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG

    CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC

    ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSe rGluLeuSe r Pr oLeuLeuLeuThrThrThr 601 AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA

    TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT

    GlnTrpGlnVa1LeuProCysSe r PheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle 66 1 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA

    GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT

    Hi sLeuHi sGlnAsnIleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyValGlySerSerlleAla 721 TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG

    AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC
29. 29. ábra

    A 19g. DNS transzlációja

    GluPheLeuYalGlnAlaTrpLysSerLysLysThrProMetGlyPheSerTyrAspThr 1 GAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGTCCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACC

    CTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCAGGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGG

    -------------átfedés a 35f.-fel----------------ArgCysPheAspSerThrValThrGluSerAspIleArgThrGluGluAlalleTyrGln

    CGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAA GCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGACTCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTT

    CysCysAspLeuAspProGlnAlaArgValAlalleLysSerLeuThrGluArgLeuTyr 121 TGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCCGCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTAT

    ACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGGCGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATA

    ValGlyGlyProLeuThrAsnSerArgGlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAla 181 GTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAAGGGGGG AGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCG

    CAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTTCCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGC

    SerGlyValLeuThrThrSerCysGlyAsnThrLeuThrCysTyrlleLysAlaArgAla 241 AGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTGGTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCA

    TCGCCGCATGACTGTTGATCGACACCATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGT

    AlaCysArgAlaAlaGlyLeuGlnAspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeuVal 301 GCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGGACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTC

    CGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCCTGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAG

    ValIleCysGluSerAlaGlyValGlnGluAspAlaAla 361 GTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCCAGGAGGACGCGGCGAG

    CAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGGTCCTCCTGCGCCGCTC

    110

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    29. Izolált HCV polipeptid, amely egy HCV antigén determinánst, valamint egy legalább 10 aminosavból álló, a HCV nukleotidszekvenciája által kódolt egybefüggő szekvenciát tartalmaz.
30. 30. ÁBRA A 26g. BHS transzlációja

    GlyGlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAlaSerGlyValLeuThrThrSerCys 1 GGGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCGGCGCAAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGT

    CCCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGTTCGCCGCATGACTGTTGATCGACA

    GlyAsnThrLeuThrCysTyrlleLysAlaArgAlaAlaCysArgAlaAlaGlyLeuGln 61 GGTAACACCCTCACTTGTTACATCAAGGCCCG AGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAG

    CCATTGTGGGAGTGAACAATGTAGTTCCGGGCTCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTC

    ------------átfedés a 13g.-vel---------------------------AspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeuValValIleCysGluSerAlaGlyVal

    121 gactgcaccatgctcgtgtgtggcgacgacttagtcgttatctgtgaaagcgcgggggtc CTGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAG

    GlnGluAspAlaAlaSerLeuArgAlaPheThrGluAlaMetThrArgTyrSerAlaPro 181 CAGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCC

    GTCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGG

    ProGlyAspProProGlnProGluTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSerSerAsn 241 CCTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAAC

    GGACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTG

    ValSerValAlaHisAspGlyAlaGlyLysArgValTyrTyrLeuThrArgAspProThr 301 GTGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAG AGGGTCTACTACCTCACCCGTG ACCCTACA

    CACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGT

    ThrProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAlaArgHisThrProValAsnSerTrpLeu 361 acccccctcgcgagagctgcgtgggagacagcaagacacactccagtcaattcctggcta

    TGGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGAT

    GlyAsnllelleMetPheAlaProThrLeuTrpAla 4 21 GGCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTG TGGGCG

    CCGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGC

    30. A 29. igénypont szerinti HCV polipeptid, amelyben az egybefüggő szekvencia legalább 15 aminosavból áll.
31. 31. ÁBRA A 15e. BHS transzlációja

    G ly Al aG lyLy s Ar gValTy r Ty rLeuThr Ar g As p P r oThrThr P r oLe uAl aAr gAl a 1 CGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAACCCCCCTCGCGAGAGC

    GCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTTGGGGGGAGCGCTCTCG

    ------------------átfedés a 26g,-vel---------------------AlaTrpGluThrAlaArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGlyAsnllelleMetPhe

    TGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAGGCAACATAATCATGTT ACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATCCGTTGTATTAGTACAA

    AlaProThrLeuTrpAlaArgMetlleLeuMetThrHisPhePheSerValLeuIleAla 121 TGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCTTTAGCGTCCTTATAGC

    ACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGAAATCGCAGGAATATCG

    ArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCysGluIleTyrGlyAlaCysTyrSerlleGlu 181 CAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGGCCTGCTACTCCATAGA

    GTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCCGGACGATGAGGTATCT

    ProLeuAspLeuProProIlelleGlnArgLeu 241 ACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC TGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG lll

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 Ν 15/38

    31. A 29. vagy a 30. igénypont szerinti HCV polipeptid, amelyben az aminosavak egybefüggő szekvenciája az ATCC-nél 40394 szám alatt letétbe helyezett lambda-gtl 1 könyvtáron belül kódolódik.
32. 32-7. ÁÍRA

    118

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    Sorszám. Csimpánz reierenciaszám 33- ÁBRA a fertőzés típusa MAGYARÁZAT A minta időpontja (nap) (0=az inokulálás ......napja) ALT (alanin aminotranszferáz szint a szérumokban . (ψ/ml) t 1 NANB 0 9 2 1 nanb 76 7 l 3 1 NANB 118 19 4 1 NANB 1S4 N/A 5 2 NANB 0 5 6 2 NANB 21 5 2' 7 2 NANB 73 13 8 2 NANB 138 N/A 9 3 NANB 0 8 10 3 NANB 4 3 205 1 i .3 NANB 53 14 1 2 3 NANB 159 6 1 3 4 NANB -3 1 1 1 4 4 NANB 5 5 132 1 5 4 NANB 83 IJ / A 16 4 NANB 140 Ν/Λ 1 7 5 HAV 0 4 19 5 HAV 25 147 19 5 HAV 40 l8 20 5 HAV 268 5 21 6 HAV -8 N/A 2 2 6 HAV 15 106 2 3 6 HAV 4 1 10 24 6 HAV 12? Ν/Λ 26 7 HAV 0 7 27 7 HAV 22 83 28 7 HAV 115 5 29 7 HAV 139 N/A 30 8 HAV 0 15 3 l 8 HAV 26 1 10 32 8 HAV 74 8 33 8 HAV 205 5 34 9 HBV -290 N/A 35 9 HBV 379 9 36 9 HBV 435 6 37 10 HBV 0 8 ..... 38 10 HBV 111-118 gyűjtemény 96- 156 gyűjtemény 39 10 HBV 205 9 40 10 HBV 240 13 4 1 42 11 11 HBV HBV 0 28-56 gyűjtemény 8-ioo gyűjtemény 4 3 11 KBV 169 9 44 1 1 HBV 223 10

    119

    HU 220 204 B

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    - 6ZI

    IV

    901 v£g&SSÍtíSSSgl 91 — . 4 - 8 — ^s aessassagg ssz sí eftHesesesi ov zw qawmnKre sz V 0 :shsgsfcs·' ·· <

    rvCD‘

    IO θ'

    32-2- ÁBRA

    113

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    1921 GTGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCG ATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAA CACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTT

    ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCys 1981 TTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGT

    AATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCA

    SerGlyGlyAlaTyrAspIlellelleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSer 2041 GCTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACAT

    CGAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTA

    IleLeuGlylleGlyThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValVal 2101 CCATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTG

    GGTAGAACCCGTAGCCGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAAC

    LeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThrValProHisProAsnlleGluGluVal 2161 TGCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGG

    ACGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCC

    AlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluValIle 2221 TTGCTCTGTCCACCACCGG AGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAA

    AACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATT

    LysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAla 2281 TCAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAG AAGAAGTGCGACGAACTCGCCG

    AGTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGC

    LysLeuValAlaLeuGlylleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerVal 2341 CAAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCG

    GTTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGC

    IleProThrSerGlyAspValValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThr 2401 TCATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATA

    AGTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATAT

    GlyAspPheAspSerValIleAspCysAsnThrCysValThxGlnThrValAspPheSer 2461 CCGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCA ggccgctgaagctgagccactatctgacgttatgcacacagtgggtctgtcagctaaagt

    LeuAspProThrPheThrlleGluThrlleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThr 2521 gccttg accctaccttcaccattgagacaatcacgctcccccaggatgctgtctcccgca cggaactgggatgcaagtggtaactctgttagtgcgaggcggtcctacgacagagggcgt

    GlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLysProGlylleTyrArgPheValAlaProGly 2581 ctcaacgtcggggcaggactggcagggggaagccaggcatctacagatttgtggcaccgg gagttgcagccccgtcctgaccgtcccccttcggtccgtagatgtctaaacaccgtggcc

    GluArgProSerGlyMetPheAspSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCys 2641 gggagcgcccctccggcatgttcgactcgtccgtcctctgtgagtgctatgacgcaggct ccctcgcggggaggccgtacaagctgagcaggcaggagacactcacgatactgcgtccga

    AlaTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThrValArgLeuArgAlaTyrMetAsnThr 2701 gtgcttggtatgagctcacgcccgccgagactacagttaggctacgagcgtacatgaaca cacgaaccatactcgagtgcgggcggctctgatgtcaatccgatgctcgcatgtacttgt

    ProGlyLeuProValCysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeu 2761 CCCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCC

    GGGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGG

    ThrHisIleAspAlaHlsPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyr 2821 TCACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTT

    AGTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAA

    LeuValAlaTyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAsp 2881 ACCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGG

    TGGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCC 32-3. ÁBRA

    114

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    GlnMetTrpLysCysLeulleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeu 2941 ACCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGC

    TGGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACG

    TyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrlle 3001 TATACÁGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACA

    ATATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGT

    MetThrCysMetSerAlaAspLettGluYálvaTTKrSerThrTrpValLeuValGlyGly 3061 TCATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCG

    AGTAGTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGC

    ValLeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIleValGlyArg 3121 GCGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGG1CATAGTGGGCA

    CGCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGT

    ValValLeuSerGlyLysProAlallelleProAspAxgGluValLeuTyrArgGluPhe 3181 GGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGT

    CCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGIATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCA

    AspGluMetGluGluCysSexGlnHisLeuProTyrlleGluGlnGlyMetMetLeuAla 3241 TCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCÁCTTACCGTACATCGAGCAAGGG ATGATGCTCG

    AGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGC

    GluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluVal 3301 CCG AGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAG ACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGG

    GGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCC

    IleAlaProAlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMet 3361 TTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCG AAGCATA

    AATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTAT

    TrpAsnPhelleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnPro 3421 TGTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACC

    ACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGG

    AlalleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGln 34 81 CCGCCATTGCTTCATTG ATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCC

    GGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGG

    ThrLeuLeuPheAsnlleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAla 3541 AAACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTG

    TTTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCAC

    AlaThrAlaPheValGlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGly 3601 CCGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGG

    GGCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACC

    LysValLeuIleAspIleLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAla 3661 GGAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGG

    CCTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACC r iíaLy s llel4a cSexGlyGluYalPtroSatrTliXGltiAspLatíValAsnlfStxl/GLtPtroAla 3721 CATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCG

    GTAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGC

    IleLeuSerProGlyAlaLeuValValGlyValValCysAlaAlalleLeuArgArgHis 3781 CCATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGC

    GGTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCG

    ValGlyProGlyGluGlyAlaValGlnTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArg 3841 ACGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCC

    TGCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGG

    GlyAsnHisValSerProThrHisTyrValProGluSerAspAlaAlaAlaArgValThr 32-4. ÁBRA

    115

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    3901 GGGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCA CCCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGT

    AlalleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHisGlnTrpIleSer 3961 CTGCCATACTCAGCAGCCTCACTCTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAA gacggtatgagtcgtcggagtgacattgggtcgaggactccgctgacgtggtcacctatt

    SerGluCysThrThrProCysSerGlySerTrpLeuArgAspíleTrpAspTrplleCys 4021 gctcggagtgtaccactccatgctccggttcctggctaagggacatctgggactggatat cgagcctcacatggtgaggtacgaggccaaggaccgattccctgtagaccctgacctata

    G lu Va 1 LeuSer AspPheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetProG 1 nLeu ProGly 4081 GCGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTG

    CGCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGAC

    IleProPheValSerCysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArgValAspGlylleMet 4141 GGATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCA

    CCTACGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGT

    HisThrArgCysHisCysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArg 4201 TGCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGA

    ACGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTCCCCTGCTACT

    IleValGlyProArgThrCy&ArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProIleAsnAlaTyr 4261 GGATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCT

    CCTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGA

    ThrThrGlyProCysThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgVal 4321 ACACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGG

    TGTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCC

    SerAlaGluGluTyrValGluIleArgGlnValGlyAspPheHisTyrValThrGlyMet 4381 TGTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTA

    ACAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCAT

    ThrThrAspAsnLeuLysCysProCysGlnValProSerProGluPhePheThrGluLeu 4441 TGACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAAT

    ACTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTA

    AspGlyValArgLeuHisArgPheAlaProProCysLysProLeuLeuArgGluGluVal 4 501 TGGACGGGGTGCGCCTACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGG

    ACCTGCCCCACGCGGATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCC

    SerPheArgValGlyLeuHisGluTyrProValGlySerGlnLeuProCysGluProGlu 4561 TATCATTCAGAGTAGGACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCG

    ATAGTAAGTCTCATCCTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGC

    ProAspValAlaValLeuThrSerMetLeuThrAspProSerHisIleThrAlaGluAla 4621 AACCGGACGTGGCCGTGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGG

    TTGGCCTGCACCGGCACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCC

    AlaGlyArgArgLeuAlaArgGlySerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGln 46B1 CGGCCGGGCGAAGGTTGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCC

    GCCGGCCCGCTTCCAACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGG

    LeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHisAspSerProAspAlaGlu 4741 AGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTG ATGCTG

    TCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGAC

    LeuIleGluAlaAsnLeuLeuTrpArgGlnGluMetGlyGlyAsnlleThrArgValGlu 4801 agctcatagaggccaacctcctatggaggcaggagatgggcggcaacatcaccagggttg tcgagtatctccggttggaggatacctccgtcctctacccgccgttgtagtggtcccaac

    SerGluAsnLysValValIleLeuAspSerPheAspProLeuValAlaGluGluAspGlu 4861 AGTCAGAAAACAAAGTGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACG

    TCAGTCTTTTGTTTCACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGC 32-5. ÁBRA

    116

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    ArgGluIleSerValProAlaGluIleLeuArgLysSerArgArgPheAlaGlnAlaLeu 4921 AGCGGGAGATCTCCGTACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCC

    TCGCCCTCTAGAGGCATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGG

    ProValTrpAlaArgProAspTyrAsnProProLeuValGluThrTrpLysLysProAsp 4961 TGCCCGTTTGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCG

    ACGGGCAAACCCGCGCCGGCCTGATÁTTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGC

    TyrGluProProValValHisGlyCysProLeuProProProLysSerProProValPro 5041 ACTACGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCfiCCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGC

    TGATGCTTGGTGGACACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACG

    ProProArgLysLysArgThrValValLeuThrGluSerThrLeuSerThrAla.LeuAla 5101 CTCCGCCTCGGAAGAAGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGG

    GAGGCGGAGCCTTCTTCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACC

    GluLeuAlaThrArgSerPheGlySerSerSerThrSerGlylleThrGlyAspAsnThr 5161 CCGAGCTCGCCACCAGAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATA

    GGCTCGAGCGGTGGTCTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTAT

    ThrThrSerSerGluProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerTyr 5221 CGACAACATCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCT

    GCTGTTGTAGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGA

    SerSerMetProProLeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrp 5281 ATTCCTCCATGCCCCCCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCAT

    TAAGGAGGTACGGGGGGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTA

    SerThrValSerSerGluAlaAsnAlaGluAspValValCysCysSerKetSerTyrSer 5341 GGTCAACGGTCAGTAGTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACT

    CCAGTTGCCAGTCATCACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGA

    TrpThrGlyAlaLeuValThrProCysAlaAlaGluGluGlnLysLeuFroIleAsnAla 5401 CTTGG ACAGGCGCACTCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATG

    GAACCTGTCCGCGTGAGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTAC

    LeuSerAsnSerLeuLeuArgHisHisAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAla 5461 CACTAAGCAACTCGTTGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTG

    GTGATTCGTTGAGCAACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCAC

    CysGlnArgGlnLysLysValThrPheAspArgLeuGlnValLeuAspSerHisTyrGln 5521 CTTGCCAAAGGCAGAAGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGÁCAGCCATTACC

    GAACGGTTTCCGTCTTCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGG

    AspValLeuLysGluValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnLeuJLeuSerVal 5581 AGGACGTACTCAAGGAGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCG

    TCCTGCATGAGTTCCTCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGC

    GluGluAlaCysSerLeuThrProProHisSerAlaLysSerLysPheGlyTyrGlyAla 5641 TAGAGGAAGCTTGCAGCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGG

    ATCTCCTTCGAACGTCGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCC

    LysAspValArgCysHisAlaArgLysAlaValThrHisIleAsnSerValTrDLysAsp 5701 CAAAAGACGTCCGTTGCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAG

    GTTTTCTGCAGGCAACGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTC

    LeuLeuGluAspAsnValThrProIleAspThrThrlleMetAlaLysAsnGluValPhe 5761 ACCTTCTGGAAGACAATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTT

    TGGAAGACCTTCTGTTACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAA

    CysValGlnProGluLysGlyGlyArgLysProAlaArgLeuIleValPheProAspLeu 5821 TCTGCGTTCAGCCTGAGAAGGGGGGTCGTAAGCCAG,CTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATC

    AGACGCAAGTCGGACTCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAG

    GlyValArgValCysGluLysMetAlaLeuTyrAspValValThrLysLeuProLeuAla 32-6. ÁBRA

    117

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    5881 TGGGCGTGCGCGTGTGCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGG ACCCGCACGCGCACACGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACC

    ValMetGlySerSerTyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArgValGluPheLeuVal 5941 CCG1 ’CGGAAGCTCCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACA.GCGGGTTGAATTCCTCG

    GGC/ rtCCCTTCGAGGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGC

    GlnAlaTrpLysSerLysLysThrProMetGlyPheSerTyrAspThrArgCysPheAsp 6001 TGCAAGCGTGGAAGTCCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTG

    ACGTTCGCACCTTCAGGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAAC

    SerThrValThrGluSerAspIleArgThrGluGluAlalleTyrGlnCysCysAspLeu 6061 ACTCCACAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACC

    TGAGGTGTCAGTGACTCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGG

    AspProGlnAlaArgValAlalleLysSerLeuThrGluArgLeuTyrValGlyGlyPro 6121 TCGACCCCCAAGCCCGCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCC

    AGCTGGGGGTTCGGGCGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGG

    LeuThrAsnSerArgGlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAlaSerGlyValLeu 6181 CTCTTACCAATTCAAGGGGGGAG AACTGCGGCTATCGC AGGTGCCGCGCGAGCGGCGTAC

    GAGAATGGTTAAGT7 CCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATG

    ThrTh.rSerCysGlyAsnThrLeuThrCysTyrlleLysAlaA.rgAlaAlaCysArgAla 6241 TGACAACTAGCTGTGGTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAG

    ACTGTTGATCGACACCATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTC

    AlaGlyLeuGlnAspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspL-euValValIleCysGlu 6301 CCGCAGGGCTCCAGGACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAC-TCGTTATCTGTG

    GGCGTCCCGAGGTCCTGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACAC

    SerAlaGlyValGlnGluAspAlaAlaSerLeuArgAlaPheThrGluAlaMetThrArg 6361 AAAGCGCGGGGGTCCAGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCA

    TTTCGCGCCCCCAGGTCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGT

    TyrSerAlaProProGlyAspProProGlnProGluTyrAspLeuGluLeuIleThrSer 6421 GGTACTCCGCCCCCCCTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACAT

    CCATGAGGCGGGGGGGACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTA

    CysSerSerAsnValSerValAlaHisAspGlyAlaGlyLysArgValTyrTyrLeuThr 64 81 CATGCTCCTCCAACGTGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCA

    GTACGAGGAGGTTGCACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGT

    AxgAspProThrThrProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAlaArgHisThrProVal 6541 CCCGTGACCCTACAACCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGC-GAGACAGCAAGACACACTCCAG

    GGGCACTGGGATGTTGGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTC

    AsnSerTrpLeuGlyAsnllelleMetPheAlaProThrLeuTrpAlaArgKetlleLeu 6601 TCAATTCCTGGCTAGGCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATAC

    AGTTAAGGACCGATCCGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATG

    MetThrHisPhePheSerValLeuIleAlaArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCys 6661 TGATGACCCATTTCTTTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATT

    ACTACTGGGTAAAGAAATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAA

    GlulleTyrGlyAlaCysTyrSerlleGluProLeuAspLeuProProIlelleGlnArg 6721 GCGAGATCTACGGGGCCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAA

    CGCTCTAGATGCCCCGGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTT

    Leu

    6781 GACTC CTGAG

    32-1. ÁBRA Λ 12f.-től 15c.-ig a DNS-ek kombinált ORF-jc

    IlePheLysIleArgMetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsn 1 CCATATTTAAAATCAGGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCA

    GGTATAAATTTTAGTCCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGT

    TrpThrArgGlyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeu 61 ACTGGACGCGGGGCGAACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGT

    TGACCTGCGCCCCGCTTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCA

    LeuLeuThrThrThrGlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeu 121 TACTGCTGACCACTACACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCT

    ATGACGACTGGTGATGTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGA

    SerThrGlyLeuIleHisLeuHisGlnAsnlleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyVal 181 TGTCCACCGGCCTCATCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGG

    ACAGGTGGCCGGAGTAGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCC

    GlySerSerlleAlaSerTrpAlalleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeu 241 TGGGGTCAAGCATCGCGTCCTGGGCCATTAAGTGGG AGTACGTCG TTCTCCTGTTCCTTC

    ACCCCAGTTCGTAGCGCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAG

    LeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeuIleSerGlnAlaGlu 301 TGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGG

    ACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCC

    AlaAlaLeuGluAsnLeuVa HleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeu 361 AGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTC tccgccgaaacctcttggagcattatgaattacgtcgtagggaccggccctgcgtgccag

    ValSecPheLeuValPhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValProGly 4 21 TTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCG

    AACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGC

    AlavalTyrThrPheTyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGln 481 GAGCGGTCTACACCTTCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCC

    CTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGG

    ArgAlaTyrAlaLeuAspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGly 541 AGCGGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCG

    TCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGC

    LeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyrTyrLysArgTyrlleSerTrpCysLcuTrpTrp 601 GGTTGATGGCGCTG ACTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGT

    CCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCA

    LeuGlnTyrPheLeu'rhrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsn 661 GGCTTCAGTATTTTCTGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCA

    CCGAAGTCATAAAAGACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGT valArgGlyGlyArgAspAlaValIleLeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuVal 721 ACGTCCGAGGGGGGCGCG ACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGG

    TGCAGGCTCCCCCCGCGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACC

    PheAspIleThrLysLeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSer 781 TATTTGACATCACCAAATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCA ataaactgtagtggtttaacgacgaccggcagaagcctggggaaacctaagaagttcggt

    LeuLeuLysValProTyrPheValArgValGlnGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAla 841 CTTTGCTTAAAGTACCCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAG

    CAAACGAATTTCATGGGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATC

    ArgLysMetlleGlyGlyHisTyrValGlnMetValIlelleLysLeuGlyAlaLeuThr 901 CGCGGAAGATGATCGGAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTA gcgccttctactagcctgcggtaatgcacgtttaccagtagtaattcaatccccgcgaat

    112

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    GlyThrTyrValTyrAsnHisLeuThrProLeuArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuAxg 961 CTGGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGC

    GACCGTGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACG

    AspLeuAlaValAlaValGluProValValPheSerGlnMetGluThrLysLeuIleThr

    1021 GAGATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCA

    CTCTAGACCGGCACCGAGATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGT

    TrpGlyAlaAspThrAlaAlaCysGlyAspIlelleAsnGlyLeuProValSerAlaArg 1081 CGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCC

    GCACCCCCCGTCTATGGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGG

    ArgGlyArgGlulleLeuLeuGlyProAlaAspGlyMetValSerLysGlyTrpArgLeu 1141 GCAGGGGCCGGGAGATAGTGCTCGGGCCAGCCGATÖGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGT

    CGTCCCCGGCCCTCTATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCA

    LeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysIlelleThr 1201 TGCTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCA

    ACGACCGCGGGTAGTG.CCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGT

    SerLeuThrGlyArgAspLysAsnGlnValGluGlyGluValGlnlleValSerThrAla 1261 CCAGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTG

    GGTCGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGAC

    AlaGlnThxPheLeuAlaThrCysIleAsnGlyValCysTrpThrValTyrHisGlyAla 1321 CTGCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATGGGGTG TGCTGGACTGTCTACCACGGGG

    GACGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCC

    GlyThrArgThrlleAlaSerProLysGlyProValIleGlnMetTyrThrAsnValAsp 1381 CCGGAACGAGG ACC ATCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAG ATGTATACCAATGTAG

    GGCCTTGCTCCTGGTAGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATC

    GlnAspLeuValGlyTrpProAlaProGlnGlySerArgSerLeuThrProCysThrCys 1441 ACCAAGACCTTGTGGGCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTT

    TGGTTCTGGAACACCCGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAA

    GlySerSerAspLeuTyrLeuValThrArgHisAlaAspValIleProValArgArgArg 1501 GCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGC

    CGCCGAGGAGCCTGGAAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCG

    GlyAs pSer ArgGlySerLeuLeuSer ProArg Pro IleSerTy rLeuLy sG ly Ser Ser 1561 GGGGTGATAGCAGGGGCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCT

    CCCCACTATCGTCCCCGTCGGACGACAGCGC-GGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGA

    GlyGlyProLeuLeuCysProAlaGlyHisAlaValGlyllePheArgAlaAlaValCys 1621 CGGGGGGTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGT

    GCCCCCCAGGCGACAACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACA

    ThrArgGlyValAlaLysAlaValAspPHelleProValGluAsnLeuGluThrThrMet 1681 GCACCCGTGGAGTGGCTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCA

    CGTGGGCACCTCACCGATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGT ArgSerProValPheThrAspAsnSerSerProProValValProGlnSerPheGlnVal 1741 TGAGGTCCCCGGTGTTCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAG AGCTTCCAGG

    ACTCCAGGGGCCACAAGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCC

    AlaHisLeuHisAlaProThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAla 1801 TGGCTCACCTCCATGCTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATG

    ACCGAGTGGAGGTACGAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATAC

    AlaGlnGlyTyrLysValLeuValLeuAsnProSerValAlaAlaThrLeuGlyPheGly 1861 CAGCTCAGGGCTATAAGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTG

    GTCGAGTCCCGATATTCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAAC

    AlaTyrMetSerLysAlaHisGlylleAspProAsnlleArgThrGlyValArgThrlle

    32. A 29. vagy a 30. igénypont szerinti HCV polipeptid, amelyben az egybefüggő szekvencia az alábbi szekvenciában kódolódik (47. ábra):

    HU 220 204 Β

    Se rTrpAla I1eLy sTrpGluTyrVa1Va1LeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAs pAlaArg CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG

    Va lCy sSe rCysLeuTr pMe tMe tLeuLeuIleSe rGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT

    LeuVa 111eLeuAsnAlaAlaSe rLeuAlaGlyThrHi sGlyLeuVa1 Se r PheLeuVa1 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG TGGAGVATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC

    Phe PheCy s PheAlaTr pTyrLeuLy sGlyLy sTr pVa1Pr oGlyAlaVa1TyrTh r Phe TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA

    Ty rGl yMe tTr pPr oLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuPr oGlnArgAlaTyrAlaLeu TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG

    AspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGlyValValLeuValGlyLeuMe tAlaLeuTh r TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT

    LeuSerProTyrTyrLy sArgTyrI1eSe rTr pCysLeuTr pTr pLeuGlnTyr PheLeu CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG

    ThrArgValGluAlaGlnLeuHi sValTrpIleProProLeuAsnVa1ArgGlyGlyArg TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG

    AspAlaVa1I1eLeuLeuMe tCysAlaValHi s Pr oTh rLeuVa1PheAspI1eThrLys GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT

    LeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpI1eLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG

    Tyr PheVa1ArgVa1G1nGlyLeuLeuArgPheCy sAlaLeuAlaAr gLysMe 111eGly CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC

    GlyHisTyrVa1G1 nMe tVa1I1e11eLysLeuGlyAlaLeuThrGlyTh rTy rVa1Ty r GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA

    AsnHi sLeuThr Pr oLeuAr gAspTr pAlaHi sAsnGlyLeuArgAspLeuAlaVa1Ala ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC

    ValGluProValValPhe Se rGl nMe tGluThrLy sLeuI1eTh rTrpGlyAlaAspTh r CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATA GACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTAT

    AlaAlaCy sGlyAspI1e11eAsnGlyLeuProValSerAlaArgArgGlyArgGluI1e CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGA GGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCT

    HU 220 204 Β

    LeuLeuGl yPr oAl aAspGl yMe tVa1 Se rLy sGlyTr pArgLeuLeuAl aProIleThr 1681 TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA

    ATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGT

    Al aTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysIlelleThrSe rLeuThrGlyArg 1741 CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCT AACTGGCC

    GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG

    AspLy sAsnGlnVa1G1uGlyGluVa1G1η I1eVa1 Se rTh rAlaAlaGlnThr PheLeu 18 01 GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC

    CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG

    AlaThrCys11eAsnGlyValCysTrpThrValTyrHi sGlyAlaGlyThrArgThrI1e 18 61 TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA

    ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGT

    AlaSerProLysGlyPr oVa1I1eGl nMe tTyrThrAsnVa1AspGlnAspLeuVa1G1y 1921 TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGG

    AGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACC

    TrpProAlaProGlnGlySe rAr gSe rLeuThr Pr oCy sThrCysGlySe r Se rAspLeu 1981 GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC

    CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG

    TyrLeuVa1Th rArgHi sAlaAspVa1I1ePr oVa1ArgArgAr gGlyAspSe rArgGly 2041 TTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG

    AAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCC

    Se rLeuLeuSe r Pr oArgPr oIleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeu 2101 GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT

    CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA

    Cy s Pr oAlaGlyHi sAlaVa1G1yI1ePheArgAlaAlaValCy sThrArgGlyVa1Ala 2161 TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG

    ACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACC

    LysAlaValAspPheI1e Pr oVa1G1uAsnLeuGluThrTh rMe tArgSe r Pr oVa1Phe 2221 CTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGT

    GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA

    ThrAspAsnSe r Se r Pr oPr oVaIValProGInSerPheGInVa1AlaHi sLeuHi sAla 2281 TCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG

    AGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTAC

    Pr oTh rGlySe rGlyLys Se rTh r LysVa1Pr oAlaAlaTy rAlaAlaGlnGlyTyrLy s 2341 CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA

    GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT

    Va1LeuVa1LeuAsnPr oSe rVa1AlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTy rMe t Se rLy s 2401 AGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCA

    TCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGT

    AlaHi sGly11eAspProAsnI1eArgThrGlyValArgThrlleThrThrGlySerPro 2461 AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC

    TCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGG

    I1eThrTyr Se rThrTyrGlyLys PheLeuAlaAspGlyGlyCysSe rGlyGlyAlaTyr 2521 CCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTT

    GGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAA

    HU 220 204 Β

    Asp 11e11e11eCy sAspGluCy sHi sSe rThrAs pAlaThrSerlleLeuGl y11eGl y ATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCG TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC

    Th rVa 1LeuAspGlnAlaGluTh rAlaGlyAlaArgLeuVa1Va1LeuAlaThrAlaThr GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA CGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGT

    ProProGlySerValThrValProHi sProAsnI1eGluGluValAlaLeuSerThrThr CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT

    GlyGluIleProPheTyrGlyLysAla I1ePr oLeuGluVa1I1eLysGlyGlyArgHi s CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG

    Leu11ePheCysHi sSe rLy sLy sLysCy sAspGluLeuAlaAlaLy sLeuVa1AlaLeu ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA

    Gl y 11 eAsnAl aVa1AlaTyrTyrArgGlyLeuAspVa1 Se rVa111ePr oTh r Se rGly TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCG ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC

    As pVa1Va1Va1Va1AlaTh rAspAlaLeuMe t Th rGlyTyrThrGlyAspPheAs pSe r GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA

    ValiieAs pCy sAsnThrCysVa1Th rGlnThrVa1As pPheSe rLeuAspPr oThr Phe CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA

    Th rI1eGluTh rlleThrLeuProGlnAs pAlaVa1 Se rAr gThrGlnArgArgGlyArg TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT

    ThrGlyArgGlyLy s Pr oGlyI1eTyrAr gPheVa1A1a Pr oGlyGluAr gPr oSe rGly GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC

    Me t PheAspSe r Se rVa1LeuCy sGluCy sTy rAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG

    Thr Pr oAlaGluTh rTh rVa1ArgLeuArgAlaTy rMe tAsnTh r Pr oGlyLeuPr oVa1 TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC

    CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyVa1PheThrGlyLeuThrHi sI1eAspAla TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC

    HisPheLeuSerGlnThrLysGlnSe rGlyGluAsnLeuPr oTyrLeuVa1AlaTyrGln CCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG

    Al aTh rValCy sAlaAr gAlaGlnAlaProProProSerTr pAspGl nMe tTr pLy sCy s AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA

    HU 220 204 Β

    LeülieArgLeuLy s Pr oThrLeuHi sGlyProThrProLeuLeuTyrAr gLeuGlyAla GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC

    Va1G1nAsnGlu11eThrLeuThrHi sPr oVa1ThrLy sTyr11eMe tThrCy sMe t Ser CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA

    Al aAspLeuGluVa1VaIThr Se rThrTrpVa1LeuVa1G1yGlyVa1LeuAlaAlaLeu CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA

    AlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysVa1Va1I1eVa1G1yArgVa1Va1LeuSe rGly TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG ACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGC

    Lys Pr oAla I1e11e Pr oAs pArgGluVa1LeuTyrArgGluPheAs pGl uMe tGluGlu GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC

    Cy s Se rGlnHi sLeuPr oTyrI1eGluGlnGl yMe tMe tLeuAlaGluGlnPheLysGln AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG

    Ly sAl aLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSe rArgGlnAlaGluVa1I1eAla Pr oAlaVa1 AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTG TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC

    GlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHi sMe tTrpAsnPheI1eSer TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA AGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT

    Gly11eGlnTyrLeuAlaGlyLeuSe rThrLeuPr oGlyAs nPr oAla I1eAlaSe rLeu GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT CACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTA

    Me tAlaPheThrAlaAlaVaIThr Se r ProLeuThrThrSerGlnThrLeuLeuPheAsn TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT

    I1eLeuGlyGlyTrpVa1A1aAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheVa1 ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG TGTAAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC

    GlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerVa1G1yLeuGlyLysValLeuIleAsp TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC eLeuAl aGlyTyrGlyAlaGlyVa1AlaGlyAlaLeuVa1AlaPheLy sI1 eMe t Se r ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT

    GlyGluVa1Pr oSe rThrGluAspLeuVa1AsnLeuLeuPr oAlalleLeuSerProGly GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGC

    AlaLeuVa1Va1G1yVa1Va1Cy sAlaAla I1eLeuArgArgHi sVa1G1yPr oGlyGlu GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC

    HU 220 204 Β

    G1 yAl aVa1G1nTr pMe tAsnAr gLeuIleAlaPheAlaSerAr gGlyAsnHi sVa1 Se r AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA

    Pr oThrHi sTyrValPr oGluSe rAspAlaAlaAlaAr gVaIThrAlalleLeuSerSer CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT

    LeuThrVaIThrGlnLeuLeuArgArgLeuHi sGlnTrpIleSerSerGluCysTh rThr GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT

    Pr oCysSe rGlySe rTr pLeuArgAspI1eTrpAspTr pI1eCy sGluVa1LeuSe rAsp CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC

    PheLysThrTrpLeuLysAlaLy sLeuMe tProGlnLeuProGlyl1e Pr oPheVa1 Se r ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA

    CysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArgValAspGlyI1 eMe tHi sThrArgCysHi s CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG

    CysGlyAlaGluI1eThrGlyHi sVa1LysAsnGlyThrMe tArgI1eVa1G1yProArg ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT

    Th rCysArgAsnMe tTr pSe rGlyTh r Phe Pr ο I1eAsnAlaTyrThrThrGlyPr oCy s GGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCT CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA

    ThrProLeuProAla Pr oAsnTyrTh rPheAlaLeuTr pAr gVa1 Se rAlaGluGluTyr GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT CATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA

    Va 1G1uI1eArgGlnVa1G1yAspPheHi sTyrVaIThrGIyMe tThrThrAspAsnLeu ATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATC TACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAG

    LysCysProCysGlnVa1ProSerProGluPhePheThrGluLeuAspGlyValArgLeu TCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCC AGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGG

    Hi sAr gPheAla Pr oPr oCy sLy s Pr oLeuLeuAr gGluGluVa1 Se r PheAr gVa1G1y TACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAG ATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATC

    LeuHi sGluTy r Pr oVa1G1ySe rGlnLeuPr oCy sGluPr oGluPr oAspVa1AlaVa1 GACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCG CTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGC

    LeuThrSerMe tLeuThrAspPr oSe rHis11eThrAlaGluAlaAlaGlyArgArgLeu TGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGT ACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCA

    AlaArgGlySerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSer TGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCAT ACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTA

    HU 220 204 Β

    LeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHi sAspSe rProAspAlaGluLeuI1eGluAlaAsn CTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCA GAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGT

    LeuLeuTr pAr gGl nGl uMe tGlyGlyAsn11eThrAr gVa1G1uSe rGluAsnLysVa1 ACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAG TGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTC

    ValiieLeuAspSe r PheAs pPr oLeuVa1AlaGluGluAs pGluAr gGlu11eSe rVa1 TGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCG ACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGC

    ProAl aGluI1eLeuArgLy sSe rArgArgPheAlaGlnAlaLeuPr oVa 1TrpAlaArg TACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGC ATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCG

    ProAspTyrAsnPr oPr oLeuVa1G1uThrTrpLysLys Pr oAspTyrGluPr oProVa1 GGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTG CCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGAC

    ValHi sGlyCys Pr oLeuPr oPr oPr oLysSe r Pr oPr oVa1Pr oPr oPr oAr gLysLys TGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGGCTCGGAAGA ACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCT

    ArgThrValValLeuThrGluSerThrLeuSerThrAlaLe uAlaGluLeuAlaTh rArg AGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCA TCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGT

    SerPheGlySerSerSerThrSerGlylleThrGlyAspAsnThrThrThr Se r Se rGlu GAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTG CTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGAC

    Pr oAl aProSerGlyCys Pr oPr oAspSe rAs pAlaGluSerTyrSe r Se rMe t Pr oPr o AGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCC TCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGG

    LeuGluGlyGluPr oGlyAs pPr oAspLeuSe rAspGlySerTrpSerThrValSerSer CCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTA GGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCAT

    G1 uAlaAsnAlaGluAspVa1ValCysCy s Se rMe tSerTyrSerTr pThrGlyAlaLeu GTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCAC CACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTG

    Va 1Thr Pr oCysAlaAlaGluGluGlnLy sLeuPr ο 11eAsnAlaLeuSe rAsnSe rLeu TCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGT AGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCA

    LeuArgHi sHi sAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLys TGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGA ACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCT

    LysVa1Thr PheAspArgLeuGlnVa1LeuAspSerHi sTyrGlnAspVa1LeuLysGlu AGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGG TCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCC

    Va ILysAlaAlaAlaSe rLysVa1LysAlaAsnLeuLeuSe rVa1G1uGluAlaCysSe r AGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGGAAGCTTGCA TCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCCTTCGAACGT

    HU 220 204 Β

    LeuTh rProProHisSerAlaLysSerLysPheGlyTyrGlyAlaLysAs pVa 1ArgCys 6181 GCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTT

    CGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAA

    Hi sAl aAr gLysAl aValThrHisIleAsnSe rVa1T r pLysAspLeuLeuGluAspAsn 6241 GCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTCTGGAAGACA

    CGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGT

    ValThrProIleAspThrTh r11 eMe tAlaLysAsnGluValPheCysValGlnPr oGlu 6301 ATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTG

    TACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGAC

    Ly sGlyGlyAr gLys Pr oAlaAr gLeuI1eVa1Phe Pr oAspLeuGlyVa1Ar gValCy s 6 361 AGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGT

    TCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACA

    GluLysMe tAlaLeuTyrAspVa1Va1ThrLysLeuProLeuAlaVa ÍMe tGlySerSer 6421 GCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCT

    CGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGA

    TyrGlyPheGlnTyrSe r Pr oGlyGlnArgVa1G1uPheLeuVa1G1nAlaTrpLysSe r 6481 CCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGT

    GGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCA

    Ly sLysTh r Pr oMe tGlyPheSe rTyrAspTh rAr gCy s PheAspSe rTh rVa1Th rGlu 65 41 CCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTG

    GGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGAC

    Se rAs pI1eArgTh rGluGIuAla I1eTyrGlnCy sCysAs pLeuAspPr oGlnAlaArg 6601 AGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCC

    TCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGG

    Va 1 Al a I1eLysSe rLeuThrGluArgLeuTyrVa1G1yGlyPr oLeuThrAsnSe rArg 6661 GCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAA

    CGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTT

    Gl yGluAsnCy sGlyTyrArgArgCysArgAlaSerGlyValLeuThrThrSerCysGly 6 721 GGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTG

    CCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACAC

    AsnThrLeuThrCysTyrI1eLysAlaArgAlaAlaCysArgAlaAlaGlyLeuGlnAsp 6781 GTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGG

    CATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCC

    CysThrMe tLeuValCysGlyAspAspLeuVa1Va1I1eCysGluSerAlaGlyVa1G1n 6841 ACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCC

    TGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGG

    Gl uAs pAlaAlaSe rLeuAr gAlaPheTh rGluAl aMe tThrArgTyrSerAlaProPro 6901 AGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCC

    TCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGG

    Gl yAspPr oPr oGlnPr oGluTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSerSe rAsnVa1 6961 CTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACG

    GACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGC

    Se rVa 1AlaHi sAspGlyAlaGlyLy sArgVa1TyrTyrLeuThrArgAspPr oTh rThr 7021 TGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAA

    ACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTT

    HU 220 204 Β

    Pr o LeuAl aAr gAl aAlaTrpGluThrAlaArgHi sThr Pr oVa1AsnSe rTrpLeuGly 7081 CCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTGAATTCCTGGCTAG

    GGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATC

    Asn I 1e11eMe t PheAlaProThrLeuTrpAlaArgMe tI1eLeuMe tThrHi sPhePhe 7141 GCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCT

    CGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGA

    SerValLeuIleAlaArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCy sGluIleTyrGlyAla 7201 TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG

    AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC

    CysTyrSerIleGluPr oLeuAs pLeuProProIlelleGlnArgLeu 7261 CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG
33. 33-2. ÁBRA

    CSIMPÁNZOK z

    <

    z z

    <

    z

    - V81 61 8U 12 ';· 's· 92 6 ··· · · 0 H Λ . > -1 < < Q

    z <

    z

    I

    Ι'Ί

    OVI 11 08 2 Z El 99 < Z 6 E- 931

    íz o

    KJ z

    *<

    n_

    120

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    33. A 29. vagy a 30. igénypont szerinti polipeptid, amelyben az aminosavak egybefüggő szekvencia az alábbi szekvenciában kódolódik (14. ábra):

    Al aTyrMe t Se rLysAlaHi sGly11eAspPr oAsnI1eArgThrGlyVa1ArgThrI1e 1 TGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAAT

    ACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTA

    ThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLys PheLeuAlaAspGlyGlyCys
34. 34-1. ÁBRA .asseesKa.· s^assaK...

    122

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    Clal* 1

    34. ÁBRA MAGYARÁZAT

    Sorszám a beteg rencias zárni⁶ aiegnózis AjjT szint 1 l¹ NANB 1354 2 ll NANB 31 3 2 ¹ NANB 14 4 2¹ NANB 79 5 2l NANB 26 6 3l NANB 78 7 3l NANB 87 8 3l NANB 25 9 4 ¹ NANB 60 10 4* NANB 13 11 5l NANB- 293 12 5l NANB 101 13 6 ¹ NANB 474 14 6^l NANB 318 15 7l NANB 20 1b 7l NANB 163 17 8¹ NANB 44 18 8l NANB 50 19 9 NANB N/A 20 10 NANB N/A 2 1 11 NANB N/A 22 12 normál N/A 23 13 normál N/A 24 14 normál N/A 26 30174 Kormai N/A 27 30105 normál N/A 28 30072 norma'l N/A 29 30026 normá1 N/A 30 30146 norma 1 N/A 31 30250 normál N/A 32 3007 l norma' 1 N/A 33 15 akutHAv N/A 34 16 akutHAv N/A 35 17 akutHAv N/A 36 18 akutHAv N/A 37 48088 akutHAv N/A 38 4 7288 akutRAV N/A 39 4 7050 akutHAv N/A 40 46997 akutHAv N/A 4 1 19 k onvaleszcens hbv N/A 42 20 (anti-HBSag+ve; N/A 4 3 21 anti-HBCag+ve) N/A 44 22 (anti-HBSag+ve; N/A 45 23 anti-HBCag+ve) N/A 46 24 (anti-HBSag+ve; N/A 4 7 25 anti-HBCag+ve) N/A 4 8 26 (anti-HBSag+ve; N/A 49 27 anti-HBSag+ve) N/A

    - Zi-o vizsgáltunk ezekb szerűm mm '3gymás után be vegekből

    121

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    34. A 29-33. igénypontok bármelyike szerinti HCV polipeptid, amelyben az egybefüggő szekvencia egy nem HCV aminosavszekvenciával van fuzionáltatva.
35. 35. ÁBRA

    Hind3 7 ³stl 212 mai 1113 ind3 1173

    Bamhl 1519 Sphl 1706 all 1795

    Pvul 9675 —.

    pAB24

    2u

    123

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    35. klóméi---------------SerArgThrGlnArgArgGlyArgThr

    241 TCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGGACTG AGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCCTGAC

    35. A 29-33. igénypontok bármelyike szerinti HCV polipeptid, amelyet kémiai szintézissel állítunk elő.
36. 36-2. ÁBRA

    125

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    37a. ÁBRA

    37b. ÁBRA

    36-1. ÁBRA SOD-CIOO fúziós polipeptid COOH-terminálisa

    --------SÓD-----------COOH] [-adaptor----] [NANBH polipeptid >

    AlaCysGlyValIleGlylleAlaGlnAsnLeuGlylleArgAspAlaHisPheLeuSer gcttgtggtgtaattgggatcgcccagaatttgggaattcgggatgcccactttctatcc CGAACACCACATTAACCCTAGCGGGTCTTAAACCCTTAAGCCCTACGGGTGAAAGATAGG >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

    GlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGlnAlaThrValCys 61 CAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGC

    GTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACG

    AlaArgAlaGlnAlaProProProSerTrpAspGlnMetTrpLysCysLeuIleArgLeu 121 GCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTC

    CGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAG

    LysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGlu 181 AAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAA

    TTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTT

    IleThrLeuThrHisProValThrLysTyrlleMetThrCysMetSerAlaAspLeuGlu 241 ATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAG

    TAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTC

    ValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCys 301 GTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGC

    CAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACG

    LeuSerThrGlyCyáValValIleValGlyArgValValLeuSerGlyLysProAlalle 361 CTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATC

    GACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAG

    IleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGluCysSerGlnHis 421 ATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCAC

    TATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTG

    LeuProTyrlleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGly 481 TTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGC

    AATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCG

    LeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaValGlnThrAsnTrp 541 CTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGG

    GAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACC

    GlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisMetTrpAsnPhelleSerGlylleGlnTyr 601 CAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATAC

    GTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATG

    LeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlalleAlaSerLeuMetAlaPheThr 661 TTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACA

    AACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGT

    AlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGlnThrLeuLeuPheAsnlleLeuGlyGly 721 GCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGG

    CGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCC

    TrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheValGlyAlaGlyLeu 781 TGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTA

    ACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAAT

    AlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAspIleLeuAlaGly 841 GCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGG

    124

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    CGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCC

    TyrGlyAlaGlyValAlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSerGlyGluValPro 901 TATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCC

    ATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGG

    SerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlalleLeuSerProGlyAlaLeuValVal 961 TCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGG AGCCCTCGTAGTC

    AGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAG

    GlyValValCysAlaAlalleLeuArgArgHisValGlyProGlyGluGlyAlaValGln 1021 GGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAG

    CCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTC <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<NANBHJ[---extra

    TrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSerProValHisHis

    1081 TGGATG AACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCCAGTCCATCAT ACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGGTCAGGTAGTA

    -----j

    LysArgOP

    1141 AAGCGTTGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGGCCCAAAT TTCGCAACTGCGAGGGATGCCCACCTGACACCTCTCTGTCCCGTGACGATTCCGGGTTTA

    1201 CTCAGCCATGCATCGAGGGGTACAATCCGTATGGCCAACAACTAGCGCGTACGTAAAGTC GAGTCGGTACGTAGCTCCCCATGTTAGGCATACCGGTTGTTGATCGCGCATGCATTTCAG

    1261 TCCTTTCTCGATGGTCCATACCTTAGATGCGTTAGCATTAATCCGAATTC AGGAAAGAGCTACCAGGTATGGAATCTACGCAATCGTAATTAGGCTTAAG

    36. A 29-33. igénypontok bármelyike szerinti HCV polipeptid, amelyet rekombináns polinukleotid expresszióval állítunk elő.
37. 37. Immunesszékészlet, amely a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmaz egy megfelelő tartályban.
38. 38. Anti-HCV antitestkészítmény, amely a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidben levő HCV antigén determinánshoz kötődő antitesteket tartalmaz, és amely (a) egy tisztított poliklonális antitestkészítmény vagy (b) egy monoklonális ellenanyag-készítmény.
39. 39. ÁBRA

    126

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    127

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    39. A 38. igénypont szerinti készítmény, amelyben az anti-HCV antitestek szilárd fázishoz vannak kötve.
40. 40. ÁBRA

    ABC ABC

    41a. ÁBRA 41b. ÁBRA

    128

    40. Immunesszékészlet, amely a 38. vagy 39. igénypont szerinti anti-HCV antitestkészítményt tartalmaz egy megfelelő tartályban.
41. 41. A 29-36. igénypontok bármelyike szerinti HCV polipeptid, amely HCV-fertőzés esetén használható.

    41 GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA

    CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT

    LeuVa1I1eLeuAsnAlaAlaSe rLeuAlaGlyTh rHi sGlyLeuVa1 Se r PheLeuVa1 901 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG

    TGGAGVATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGC

    PhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpVa1Pr oGlyAlaValTyrThr Phe

    61 TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCT

    ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA

    Ty rGl yMe tTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC

    AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG

    HU 220 204 Β

    AspThrGluVa1AlaAlaSe rCysGlyGlyVaIVa1LeuVa1G1yLeuMe tAlaLeuThr 1081 TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA

    ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT

    LeuSerProTyrTyrLysArgTyrlleSe rTrpCysLeuT r pTrpLeuGlnTyrPheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTC

    GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG

    Th rAr gVa1G1uAlaGlnLeuHi sValTr ρ11e Pr oPr oLeuAsnVa1Ar gGlyGlyAr g 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC

    ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG

    AspAlaVa111eLeuLeuMe tCysAlaValHi sProThrLeuVa1PheAspI1eThrLys 1261 GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA

    CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT

    LeuLeuLeuAlaVa1PheGlyPr oLeuTr ρI1eLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC

    TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG

    TyrPheValArgVa1G1nGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMe 111eGly 1381 CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCG

    GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC

    GlyHi sTyrVa1G1 nMe tValI lelleLysLeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValTyr 1441 GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT

    CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA

    AsnHi sLeuThrProLeuArgAspTrpAlaHi sAsnGlyLeuArgAspLeuAlaVa1A1a 1501 ATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGG

    TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC

    Va 1G1uPr oVa1Va1PheSe rGlnMe tGluTh rLy sLeuI1eTh rTr pGlyAlaAspTh r 1561 CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATA

    GACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTAT

    Al aAlaCysGlyAspI lelieAsnGlyLeuPr oVa1 Se rAlaArgAr gGlyAr gGluI1e 1621 CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGA

    GGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCT

    LeuLeuGlyPr oAlaAs pGlyMe tValSerLysGlyTr pAr gLeuLeuAlaProIleThr 16 81 TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA

    ATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGT

    AlaTyrAlaGlnGlnTh rArgGlyLeuLeuGlyCy sI1eI1eTh r Se rLeuTh rGlyArg 1741 CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCC

    GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG

    As pLy sAsnGlnVa1G1uGlyGluVa1G1η I1eVa1 Se rTh rAlaAlaGlnThr PheLeu 1801 GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC

    CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG

    Al aThrCys11eAsnGlyValCysTrpThrValTyrHi sGlyAlaGlyThrArgThr11e 1861 TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA

    ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGT

    AlaSerProLysGlyPr oVa111eGl nMe tTy rTh rAsnVa1AspGlnAspLeuVa1G1y 1921 TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGG

    AGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACC

    HU 220 204 Β

    TrpPr oAlaProGlnGlySerArgSerLeuTh r Pr oCy sTh rCysGlySerSerAspLeu GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG

    TyrLeuVaITh rAr gHi sAlaAspVa1I1e Pr oVa1Ar gAr gAr gGlyAspSe r Ar gGly TTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG AAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCC

    SerLeuLeuSe r Pr oArgPr oIleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeu GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA

    Cy s Pr oAl aGlyHi sAlaVa1G1yI1e PheArgAlaAlaValCy sTh rAr gGlyVa1Ala TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG ACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACC

    Ly sAl aVa 1 AspPheI1ePr oVa1G1uAsnLeuGluThrTh rMe tAr gSe r Pr oVa1Phe CTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGT GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA

    Thr AspAsnSe r Se r Pr oPr oVa1Va1Pr oGlnSe r PheGlnValAlaHisLeuHisAla TCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG AGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTAC

    Pr oTh rGlySe rGlyLy sSe rThrLysVa1Pr oAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLy s CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT

    Va 1LeuVa1LeuAsnPr oSe rVa1AlaAlaTh rLeuGlyPheGlyAlaTy rMe t Se rLy s AGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCA TCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGT

    AlaHi sGlyI1eAspProAsnI1eArgThrGlyValArgThrIleThrThrGlySerPro AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC TCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGG leThrTyrSerThrTyrGlyLys PheLeuAlaAspGlyGlyCy sSe rGlyGlyAlaTy r CCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTT GGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAA

    AspI1e11eI1eCysAspGluCysHi sSerThrAspAlaThrSerIleLeuGlylleGly ATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCG TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC

    ThrVa1LeuAspGlnAlaGluTh rAlaGlyAlaArgLeuVa1Va1LeuAlaThrAlaThr GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA CGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGT

    ProProGlySerValThrValProHi s Pr oAsnI1eGluGluVa1AlaLeuSe rTh rTh r CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT

    GlyGluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluVallleLysGlyGlyArgHi s CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG

    LeüllePheCysHi sSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuVa1AlaLeu ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA

    HU 220 204 Β

    Gl y I 1 eAsnAl aVa 1 Al aTyrTyrArgGlyLe uAs pValSerValIleProThrSerGly TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCG ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC

    AspVaIValValValAlaThrAspAlaLeuMe tThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSe r GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA

    ValiieAspCysAsnTh rCy sVaITh rGlnTh rVa1As pPheSe rLeuAspPr oThr Phe CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA

    Thr 11 eGluThrI1eTh rLeuPr oGlnAspAlaVa1 Se rArgThrGlnArgArgGlyAr g TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT

    Th rGl yAr gGlyLy s Pr oGlyI1eTy rAr gPheVa1AlaPr oGlyGluArg Pr oSe rGly GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC

    Me t PheAs pSerSerValLeuCysGluCy sTy rAs pAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG

    Th r Pr oAlaGluThrThrVa1ArgLeuAr gAlaTy rMe tAsnTh r Pr oGlyLeuPr oVa1 TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC

    Cy sGl nAs pHi sLeuGluPheTr pGluGlyVa1PheThrGlyLeuThrHi sI1eAs pAla TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC

    Hi sPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuPr oTy rLeuVa1AlaTyrGln CCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGGGAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG

    Al aThrVa1CysAlaArgAlaGlnAlaPr oPr oPr oSe rTr pAspGl nMe tTr pLysCys AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA

    LeülieArgLeuLys Pr oTh rLeuHi sGlyProThrProLeuLe uTy rAr gLeuGlyAla GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC

    Va 1G1nAsnGluI1eThrLeuTh rHi s Pr oVa1Th r Ly sTyrI1eMe tThrCy sMe t Se r CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA

    AlaAspLeuGluVaIValThrSerThrTr pVa1LeuVa1G1yGlyVa1LeuAlaAlaLeu CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA

    AlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysVa1Va1I1eVa1G1yArgVaIValLeuSerGly TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGGTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG ACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCACCAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGC

    LysProAlallelle Pr oAs pArgGluVa1LeuTy rAr gGluPheAspGl uMe tGluGlu GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC

    HU 220 204 Β

    CysSerGlnHi sLeuProTyrI1eGluGlnGl yMe tMe tLeuAlaGluGlnPheLysGln AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG

    Ly sAl aLeuGlyLeuLeuGlnTh rAlaSe rArgGlnAlaGluVa111eAla Pr oAlaVa1 AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTG TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC

    G1nThrAsnTr pGlnLysLeuGluThr PheTr pAlaLy sHisMe tTrpAsnPhe11e Se r TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA AGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT

    GlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnPr oAlalleAlaSerLeu GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT CACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTA

    Me t Al aPheThrAlaAlaVa1ThrSe r ProLeuThrThr Se rGlnThrLeuLeuPheAsn TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT

    11eLeuGlyGlyTrpVa1AlaAlaGlnLeuAlaAlaPr oGlyAlaAlaTh rAlaPheVa1 ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG TGTAAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC

    G1 yAl aGlyLeuAlaGlyAlaAlalIeGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAsp TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC

    I 1eLeuAl aGlyTyrGlyAlaGlyVa1AlaGlyAlaLeuValAlaPheLysIl eMe t Se r ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT

    G1yGluValProSerThrGluAs pLeuValAsnLeuLeuProAlalleLeuSerProGly GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGC

    AlaLeuVa1Va1G1yVa1ValCysAlaAla I1eLeuArgArgHi sVa1G1yProGlyGlu GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC

    G1 yAl aVa1G1nTrpMe tAs nArgLeu11eAlaPheAlaSe rArgGlyAsnHi sVa1 Se r AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA

    Pr oThrHi sTyrVa1Pr oGluSe rAspAlaAlaAlaArgVaIThrAlalleLeuSerSer CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT

    LeuThrVa1ThrGlnLeuLeuArgArgLeuHi sGlnTrpIleSerSerGluCysThrThr GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGCACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT

    ProCysSerGlySe rTrpLeuArgAspI1eTrpAspTrpI1eCysGluValLeuSerAsp CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC

    PheLysThrTr pLe uLysAlaLysLeuMe tProGlnLeuProGlylleProPheValSer ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA

    HU 220 204 Β

    Cy sGl nAr gGl yTy r Ly sGl yVa 1 Tr pAr gVa 1 AspGl y I 1 eMe tHi sThr Ar gCy sHi s CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG

    Cy sGl yAlaGluI1eTh rGlyHi sVa1Ly sAsnGlyThrMe tArglleValGlyPr oArg ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT

    ThrCy sAr gAsnMe tTr pSe rGlyThr PhePr ο 11eAsnAlaTyrThrThrGlyPr oCys GGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCT CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA

    Thr Pr oLeuPr oAlaPr oAsnTyrThr PheAlaLeuTrpArgVa1 Se rAlaGluGluTyr GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT CATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA

    Va 1G1 u I 1 eAr gGl nVa 1G1 yAspPheHi sTy r Va 1 Th rGl yMe t Thr Thr As pAsnLeu ATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATC TACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAG

    LysCysPr oCysGlnVa1Pr oSe rPr oGluPhePheThrGluLeuAspGlyVa1ArgLeu TCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCC AGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGG

    Hi sAr gPheAl aPr oPr oCy sLy s Pr oLeuLeuArgGluGluValSerPheArgValGly TACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAG ATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATC

    LeuHi sGluTy r Pr oVa1G1ySe rGlnLeuPr oCy sGluPr oGluPr oAspVa1AlaVa1 GACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCG CTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGC

    LeuThr Se rMe t LeuThrAspPr oSe rHi sI1eThrAlaGluAlaAlaGlyAr gArgLeu TGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGT ACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCA

    Al aAr gGlySerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSer TGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCAT ACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTA

    LeuLysAlaThrCy sTh rAlaAsnHi sAs pSe r Pr oAs pAlaGluLeu11eGluAlaAsn CTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCA GAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGT

    LeuLeuTrpArgGlnGl uMe tGlyGlyAsn11eTh rArgVa1G1uSe rGluAs nLysVa1 ACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAG TGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTC

    ValiieLeuAs pSe r PheAs pPr oLeuVa1AlaGluGluAspGluArgGluI1eSe rVa1 TGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCG ACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACACCGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGC

    ProAl aGlu11eLeuArgLysSe rArgArgPheAlaGlnAlaLeuPr oValTrpAlaArg TACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGATTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGC ATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCTAAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCG

    Pr oAspTyrAsnPr oPr oLeuVa1G1uTh rTr pLy sLys Pr oAspTyrGluPr oPr oVa1 GGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACGTGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTG CCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGCACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGAC

    HU 220 204 Β

    Va1HisGlyCys Pr oLeuPr oPr oPr oLy s Se r Pr oPr oVa1Pr oPr oPr oArgLysLy s TGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAGTCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGA ACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTCAGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCT

    Ar gTh rVa1Va1LeuTh rGluSerThrLeuSerThrAlaLeuAlaGluLeuAlaTh rArg AGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCA TCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGT

    SerPheGlySerSerSerThrSerGlylleThrGlyAspAsnThrTh rThr Se r Se rGlu GAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTG CTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGAC

    Pr oAl aPr oSe rGlyCy s Pr oPr oAspSe rAspAlaGluSerTyrSe r Se rMe t Pr oPr o AGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCC TCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGG

    LeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSe rAspGlySerTrpSerThrValSerSer CCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTA GGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCAT

    Gl uAl aAsnAlaGluAspVa1ValCy sCy sSe rMe t Se rTy r Se rTr pThrGlyAlaLeu GTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGCTCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCAC CACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTG

    Va1Thr Pr oCysAlaAlaGluGluGlnLy sLeuPr ο I1eAsnAlaLeuSerAsnSerLeu TCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGT AGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCA

    LeuAr gHi sHi sAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCy sGlnAr gGlnLy s TGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGA ACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCT

    Ly sVa1Th r PheAspArgLeuGlnVa1LeuAs pSe rHi sTy rGlnAspValLeuLysGlu AGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGG TCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCC

    Va1LysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnLeuLeuSerVa1G1uGluAlaCy s Se r AGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGGAAGCTTGCA TCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCCTTCGAACGT

    LeuTh r Pr oPr oHi sSe rAlaLy s Se rLy s PheGlyTyrGlyAlaLysAspVa1ArgCys GCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTT CGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAA

    Hi sAlaArgLysAlaValThrHi síleAsnSerValTrpLysAspLeuLeuGluAspAsn GCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTGTGGAAGACA CGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGT

    VaIThr Pr ο I1eAspThrThrI1 eMe tAlaLysAsnGluVa1PheCysVa1G1nProGlu ATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTG TACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGAC

    LysGlyGlyArgLys ProAlaArgLeu11eVa1PhePr oAspLeuGlyVa1ArgValCys AGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATCGTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGT TCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACA

    Gl uLy sMe tAlaLeuTyrAspValValThrLysLeuProLeuAlaVa ÍMe tGlySerSer GCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCT CGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGA

    HU 220 204 Β

    TyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArgVa1G1uPheLeuVa1G1nAlaTrpLys Se r 6481 CCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGT

    GGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCA

    Ly sLy sThr Pr oMe tGlyPheSe rTyrAspTh rArgCysPheAspSe rTh rVa1Th rGlu 6541 CCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTG

    GGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGAC

    SerAspI1eArgThrGluGluAla 11eTyrGlnCysCy sAspLeuAspProGlnAlaArg 6601 AGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCC

    TCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGG

    Va 1A1 a 11eLysSerLeuThrGluArgLeuTyrVa1G1yGlyProLeuThrAsnSerArg 6661 GCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAA

    CGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTT

    G1yGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArgAlaSe rGlyVa1LeuThrThrSe rCysGly 67 21 GGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTG

    CCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACAC

    As nThrLeuThrCysTyrI1eLysAlaArgAlaAlaCysAr gAlaAlaGlyLeuGlnAsp 6 781 GTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGG

    CATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCC

    Cy sTh rMe t LeuValCy sGlyAspAspLeuVaIVa1I1eCysGluSe rAlaGlyVa1G1n 6841 ACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCC

    TGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGG

    G1 uAs pAlaAlaSe rLeuAr gAla PheThrGluAl aMe tThrArgTyrSerAlaProPro 6901 AGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCC

    TCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGG

    G1 yAspPr oPr oGlnPr oGluTyrAs pLeuGluLeuIleThrSerCysSerSe rAsnVa1 6961 CTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACG

    GACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGC

    SerValAlaHisAs pGlyAlaGlyLysArgVa1TyrTyrLeuThrAr gAs pPr oThrThr 7021 TGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAA

    ACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTT

    Pr oLe uAlaArgAlaAlaTr pGluTh rAlaArgHi sTh r Pr oVa1AsnSe rTrpLeuGly 7081 CCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTGAATTCCTGGCTAG

    GGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATC

    Ásni lel 1 eMe tPheAlaProThrLeuTr pAlaAr gMe tI1eLeuMe tTh rHi s Phe Phe 7141 GCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCT

    CGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCT\CTATGACTACTGGGTAAAGA

    SerValLeülieAlaArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCysGlulleTyrGlyAla 7201 TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG

    AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC

    CysTyrSerlleGluPr oLeuAs pLeuProProIlelleGlnArgLeu 7261 CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG
42. 42-2. ABRA

    130

    HU 220 204 B

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    42-1. HU 220 204 B Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38 ÁBRA

    Homológia a 14i. - 39c. kolónok kombinált_ORP-je_áltál _kódolt HCV ^olipeptjjl _és_a_ Djj^ue_fl_^vivíruj_J_ÍHWyi)lJi__nem2Sze_rkezeti fehérjéje között

    42. A 29-36. igénypontok bármelyike szerinti, HCV-fertőzés elleni gyógyszer előállítására használható HCV polipeptid.
43. 43. ÁBRA

    VÉLETLENSZERŰ MINTÁK ELOSZLÁSA

    C100-3Ag ELISA preklinikai késsiet 416 ng C100/ÜREG, 2 ÓRA 37°C, 20 fik. MINTA

    ELOSZLÁS

    OD © 492nm

    131

    HU 220 204 B

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    43. Eljárás HCV-fertőzés elleni gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy a 29-36. igénypontok bármelyike szerinti HCV polipeptidet használjuk fel.

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    l.ÁlítA Az 5-1-1; DNS transzlációja

    AlaSerCysLeuAsnCysSerAlaSerllelleProAspArgGluValLeuTyrArgGlu 1 GGCCTCCTGCTTGAACTGCTCGGCGAGCATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGA

    CCGGAGGACGAACTTGACGAGCCGCTCGTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCT

    PheAspGluMetG luGluCy s SerG InHi sLeuProTy r I leGluGlnGXyHetKetLeu 61 gt-tcgatgagatggaagagtgctctcagcacttaccgtacatcgagcaagggatgatgct

    CAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGA

    AlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeu 121 CGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCC

    GCGGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGG
44. 44. ÁBRA

    O.D. értékek eloszlása véletlenszerűen vett véradó mintákból, amelyeket két.ELISA összeállítással vizsgáltunk

    C10.0-3Ag ELISA MoAB poliklonálissal szemben

    637

    I I MoAB = 1056 poli = 1077

    ELOSZLÁS

    300 - 250 - 200- 150- 100- 50-

    OD © 492nm

    132

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38 v ál tózó szekvencia
45. 45. ÁBRA név közös szekvencia .
46. 46-2. ABRA

    135

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    471. ÁBRA A k9-l„-15e. DNS-ek kombinált ORP-je

    GlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGly 1 CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG

    GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC

    ProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyProAspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrPro 61 GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC

    CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG

    ProLysProCysGlylleValProAlaLysSerVc ..GysGlyProValTyrCysPheThr 121 CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA

    GGGGTTTTGGAACGCCA7AACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT

    ProSerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly 181 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG

    GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC

    GluAsnAspThrAspValPheValLeuAsnAsnThxArgProProLeuGlyAsnTrpPhe 241 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT

    CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA

    GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVal 301 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG

    AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC

    IleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysPrcThrAspCysPheArgLysHisPro 361 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC

    AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG

    AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlyProTrpIleThrProArgCysLeuValAsp 421 CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG

    GCCTGCGGTGTATGAGAGeCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC

    TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThrlleAsnTyrThrllePheLysIleArg 4 81 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACCATATTTAAAATCA

    TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGT

    MetTyrValGlyGlyValGluKisArgLeuGluAlaAiaCysAsnTrpThrArgGlyGlu 541 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG

    CCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC

    AxgCysAspLeuGluAspArgAsDArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr 601 AACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA

    TTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT

    GlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle 661 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA

    GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT

    HisLeuHisGlnAsnlleValAsDValGlnlyrLeuTyrGlyValGlySerSerlleAla 721 TCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAGTACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCG

    AGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTCATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGC

    SerTrpAlalleLysTrpGluTyrValValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArg 781 CGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTTCTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGC

    GCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAAGAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCG

    ValCysSerCysLeuTrpMetHetLeuLeulleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsn 841 GCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTCATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGA

    CGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAGTATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCT

    LeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAlaGlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuVal

    901 ACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCCGGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCG

    TGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGGCCCTGCG7GCCAGAACATAGGAAGGAGC

    136

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    PhePheCvsPheAlaTrpTyrLeuLysGlyLysTrpValProGlyAlaValTyrThrPhe 961 TGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGTAAGTGGGTGCCCGG AGCGGTCTACACCT

    ACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCATTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGA

    TyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeu 1021 TCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTGTTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGC

    AGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGACAACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCG

    AsDThxGluValAlaAlaSerCysGlyGlyYalYalLeuValGlyLeuMetAlaLeuThx 1081 TGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGTGTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGA

    ACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCACAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACT

    LeuSerProTyrTyrLysArgTyrlleSerTrpCysILeúTrpTrpLeuGlnTyrPheLeu 1141 CTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGCTGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTAT.TTTC

    GAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCGACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAG

    ThrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrpIleProProLeuAsnValArgGlyGlyArg 1201 TGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGGATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGC

    ACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACCTAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCG

    AspAlaValIleLeuLeuMetCysAlaValHisProThrLeuValPheAspIleThrLys 1261 GCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTACACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCA

    CGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACATGTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGT

    LeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrpIleLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValPro 1321 AATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGGATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTAC

    TTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGC-GAAACCTAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATG

    TyrPheValArgValGlnGlyLeuLeuArgPheCysAlaLeuAlaArgLysMetlleGly 1381 CCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGGTTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATG ATCG

    GGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCCAAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGC

    GlyKisTyrValGlnMetValIlelleLysLeuGlyAlaJLeuThrGlyThrTyrValTyr 14 41 GAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAGTTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTT

    CTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTCAATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAA

    AsnHisLeuThxProLeuArgAspTrpAlaHisAsnGlyLeuArgAsDLeuAlaValAla 1501 ATA^.CCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCGCACAACGGCTTGCG AGATCTGG CCGTGG

    TATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGCGTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACC

    ValGluProValValPheSerGlnMetGluThrLysEeuIleThrTrpGlyAlaAspThr 1551 CTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAGACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAG ATA

    GACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTCTGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTAT

    AlaAlaCysGlyAspIlelleAsnGlyLeuProValSerAlaArgArgGlyArgGluIle 1621 CCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTGCCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGG AGA

    GGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAACGGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCT

    LeuLeuGlyProAlaAspGlyMetValSerLysGlyTrpAxgLeuLeuAlaProIleThr 1681 TACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCCAAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCA

    ATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGGTTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGT

    AlaTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeuGlyCysIlelleThrSerLeuThrGlyArg 1741 CGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTAGGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCC

    GCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGATCCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGG

    AspLysAsnGlnValGluGlyGluValGlnlleValSerThrAlaAlaGlnThrPheLeu 1801 GGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAGATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCC

    CCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTCTAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGG

    AlaThrCysIleAsnGlyValCysTrpThrValTyrHisGlyAlaGlyThrArgThrlle 1861 TGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACTGTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCA

    ACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGACAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGT

    AlaSerProLysGlyProValIleGlnMetTyrThrAsnValAspGlnAspLeuValGly

    47-2. ÁBRA

    137

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    1921 TCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGG AGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTACATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACC

    TrpPrcAlaProGlnGlySerArgSerLeuThrProCysThrCysGlySerSerAspLeu 1981 GCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTGACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACC

    CGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAACTGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGG

    TyrLeuValThrArgHisAlaAspValIleProValArgArgÁrgGlyAspSerArgGly 2041 TTTACCTGGTCACG AGGCACGCCG ATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGG

    AAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAAGGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCC

    SerLeuLeuSerProArgProIleSerTyrLeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeu 2101 GCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTACTTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGT

    CGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACA

    CysProAlaGlyHisAlaValGlyllePheArgAlaAlaValCysThrArgGlyValAla 2161 TGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTTAGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGG

    ACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAATCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACC

    LysAlaValAspPhelIeProValGluAsnLeuGIuThrThxMetArgSerProValPhe 2221 CTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAACCTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGT

    GATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTGGATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACA

    ThrAspAsnSerSerProProValValProGlnSerPheGlnValAlaHisLeuHisAla 2281 TCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCCCAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATG

    AGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGGGTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTAC

    ProThrGlySerGlyLysSerThrLysValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLys 2341 CTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTCCCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATA

    GAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAGGGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATAT

    ValLeuValLeuAsnProSerValAlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMetSerLys 2401 AGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCAACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCA

    TCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGTTGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGT

    AlaHisGlylleAspProAsnlleArgThrGlyValArgThrlleThrThrGlySerPro 2461 AGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACCGGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCC

    TCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGGCCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGG

    IleThrTyrSerThxTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyCysSerGlyGlyAlaTyr 2521 CCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTTGCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTT

    GGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAACGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAA

    AspIlellelleCysAspGluCysHisSerThrAspAlaThrSerlleLeuGlylleGly 2581 ATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCCACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCG

    TACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGGTGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGC

    ThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValValLeuAlaThrAlaThr 2641 GCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGGGCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCA

    CGTGACAGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCCCGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGT

    ProProGlySerValThr’/alProHisProAsnlleGluGluValAlaLeuSerThrThr 2701 CCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCCAACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCA

    GGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGGTTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGT

    GlyGluIleProPheTyrGlyLysAlalleProLeuGluValIleLysGlyGlyArgHls 2761 CCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATCCCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGAC

    GGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAGGGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTG

    LeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuValAlaLeu 2821 ATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGCGACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCAT

    TAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACGCTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTA

    GlylleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerValIleProThrSerGly 2881 TGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCCGTCATCCCGACZAGCG

    ACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCAGAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGC

    47-3. ÁBRA

    138

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    AspValValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSer 2941 GCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTCATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACT

    CGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAGTACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGA

    ValIleAsDCysAsnThrCysValThrGlnThiValAspPheSerLeuAspProThrPhe 3001 CGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAGACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCT

    GCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTCTGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGA

    ThrlleGluThrlleThrLeuProGlnAspAlaValSerArgThxGlnArgArgGlyArg 3061 TCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGATGCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCA

    AGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTACGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGT

    ThrGlyArgGlyLysProGlylleTyrArgPheValAlaProGlyGluArgProSerGly 3121 GGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGATTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCG

    CCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCTAAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGC

    MetPheAsDSerSerValLeuCysGluCysTyrAspAlaGlyCysAlaTrpTyrGluLeu 3181 GCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGCTATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGC

    CGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACGATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCG

    ThrProAlaGluThrThrValAxgLeuArgAlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProVal 3241 TCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGAGCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCG

    AGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCTCGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGC

    CysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGlyValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAla 3301 TGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGCGTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATG

    ACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCGCAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTAC

    HisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGlyGluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGln 3361 CCCACTTTCTATCCCAG ACAAAGCAGAGTGGGG AGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACC

    GGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCCCTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGG

    AlaThrValCysAlaArgAlaGlhAlaPrcProProSerTroAspGlnHetTrpLysCys 3421 AAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCTCCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGT

    TTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGAGGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCA

    LeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGlyProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAla 3481 GTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGGCCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCG

    CAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCCGGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGC

    ValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisProValThrLysTyrlleMetThrCysMetSer 3541 CTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCAGTCACCAAATACATCATGACATGCATGT

    GACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGTCAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACA

    AlaAspLeuGluValValThrSerThrTrpValLeuValGlyGlyValLeuAlaAlaLeu 3601 CGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGGGTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTT

    GCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACCCACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAA

    AlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysValValIIeValGlyArgValValLeuSerGly 3661 TGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTGG.TCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCG

    ACCGGGGCATAAcGG Αί-ΑυΤ-ΐΆ^Τυ^ΰ ACGchv_v_AG χήχ ChuCvG iCuc AGCAvjArtcAukjv.

    LysProAlallelleProAspArgGluValLeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGlu 3721 GGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTCCTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAG

    CCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAGGAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTC

    CysSerGlnHisLeuProTyrlleGluGlnGlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGln 3781 AGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAAGGGATG ATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGC

    TCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTTCCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCG

    LysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSerArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaVal 3841 AGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCCCGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCC7GCTG

    TCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGGGCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGAC

    GlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPheTrpAlaLysHisXetTrDAsnPhelleSer

    47-4. ÁBRA

    139

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    3901 TCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTCTGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCA AGGTCTGGTIGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAGACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGT

    GlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThrLeuProGlyAsnProAlalleAlaSerLeu 3961 GTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACGCTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCAT

    CACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGCGACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTA

    MetAlaPheThrAlaAlaValThrSerProLeuThrThrSerGlnThrLeuLeuPheAsn 4021 TGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCACTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCA

    ACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGTGATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGT

    IleLeuGlyGlyTrpValAlaAlaGlnLeuAlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheVal 4081 ACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTCGCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTG

    TGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAGCGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAAC

    GlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlalleGlySerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAsp 4141 TGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGCAGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAG

    ACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCGTCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATC

    I leLeuAl aG ly Ty rG lyAl aG ly Val Al aG lyAl a LeuVa 1 AlaPheLy s I1 eMetSer 4201 ACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCGGGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGA

    TGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGCCCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACT

    GlyGluValProSerThrGluAspLeuValAsnLeuLeuProAlalleLeuSerProGly 4261 GCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTCAATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCG

    CGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAGTTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGC

    AlaLeuValValGlyValValCysAlaAlalleLeuAxgArgHisValGlyProGlyGlu 4321 GAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCAATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCG

    CTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGTTATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGC

    GlyAlaValGlnTrpMetAsnArgLeuIleAlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSer 4381 AGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATAGCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTT

    TCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTATCGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAA

    ProThrHisTyrValProGluSerAspAlaAlaAlaArgValThrAlalleLeuSerSer 4441 CCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCAGCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCA

    GGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGTCGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGT

    LeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeuHisGlnTrpIleSerSerGluCysThrThr 4501 GCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTGC ACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCA

    CGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGACGTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGT

    ProCysSerGlySerTrpLeuArgAspIleTrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAsp 4561 CTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCG

    GAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAGACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGC

    PheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMetProGlnLeuProGlylleProPheValSer 4621 ACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATGCCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGT

    TGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTACGGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACA

    CysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpAxgValAspGlylleMetHisThrArgCysHis 4681 CCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGAGTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCC

    GGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCTCACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGG

    CysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLysAsnGlyThrMetArglleValGlyProArg 4741 ACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAAAACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTA

    TGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTTTTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGAT

    ThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPheProlleAsnAlaTyrThrThxGlyProCys 4801 GGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTCCCCATXAATGCCTACACCACGGGCCCCT

    CCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAGGGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGA

    ThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPheAlaLeuTrpArgValSerAlaGluGluTyr 4861 GTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTCGCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAAT

    CATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAGCGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTA

    47-5. ÁBRA

    140

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    ValGluIleArgGlnValGlyAspPheHisTyrValThrGlyMetThrThrAspAsnLeu 4 921 ATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCACTACGTGACGGGTATGACTACTGACAATC

    TACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTGATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAG

    LysCysProCysGlnValProSerProGluPhePheThrGluLeuAspGlyValArgLeu 4981 TCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAATTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCC

    AGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTTAAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGG

    KisArgPheAlaProProCysLysProLeuLeuArgGluGluValSerPheArgValGly 5041 TACATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTGCTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAG

    ATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAACGACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATC

    LeuHisGluTyrProValGlySerGlnLeuProGysGluProGlu-ProAspValAlaVal 5101 GACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTACCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCG

    CTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAATGGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGC

    LeuThrSerMetheuThrAsDproSerh'isIleThrAlaGluAlaAlaGlyArgArgLeu 5161 TGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCATATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGT

    ACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTATATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCA

    AlaArgGlySerProProSerValAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSer 5221 TGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGCTCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCAT

    ACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCGAGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTA

    LeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHisAspSerPrcAspAlaGluLeuIleGluAlaAsn 5281 CTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGACTCCCCTGATGCTGAGCTCATAG AGGCCA

    GAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTGAC-GGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGT

    LeuLeuTrpArgGlnGluMetGlyGlyAsnlleThrArgValGluSerGluAsnLysVal 5341 ACCTCCTATGGAGGCAC-GAGATGGGCGGCAACATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAG

    TGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTGTAGTC-GTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTC

    ValIleLeuAspSerPheAspProLeuVaLAlaGluGluAspGluArgGluIleSerVal 54 01 TGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTGGCGGAGGAC-GACGAGCGGGAGATCTCCG accactaagacctgaggaagctaggcgaacaccgcctcctcctgctcgccctctagaggc

    ProAlaGluIleLeuArgLysSerArgArgPheAlaGlnAlaLeuProValTrpAlaArg 5461 tacccgcagaaatcctgcggaagtctcggagattcgcccaggccctgcccgtttgggcgc atgggcgtctttaggacgccttcagagcctctaagcgggtccgggacgggcaaacccgcg

    ProAspTyrAsnProProLeuValGluThrTroLysLysProAspTyrGluProProVal 5521 ggccggactataaccccccgctagtggagacgtggaaaaagcccgactacgaaccacctg ccggcctgatattggggggcgatcacctctgcacctttttcgggctgatgcttggtggac

    ValHisGlyCysProLeuProProProLysSerProProValProProProArgLysLys 5581 tggtccatggctgtccgcttccacctccaaagtcccctcctgtgcctccgcctcggaaga accaggtaccgacaggcgaaggtggaggtttcaggggaggacacggaggcggagccttct

    ArgThrValValLeuThrGluSerThrLeuSerThrAlaLeuAlaGluLeuAlaThrArg 5641 AGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTATCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCA

    TCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGATAGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGT

    SerPheGlySerSerSexThrSerGlylleThrGlyAspAsnThrThrThrSerSerGlu 5701 GAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATTACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTG

    CTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAATGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGAC

    ProAlaProSerGlyCysProProAspSerAspAlaGluSerTyrSerSerMetProPro 5761 AGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCCGACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCC

    TCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGGCTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGG

    LeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerSer 5821 CCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTTAGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTA

    GGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAATCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCAT

    GluAlaAsnAlaGluAspValValCysCysSerMetSerryrSerTrpThrGlyAlaLeu

    47-6.. ÁS5A

    141

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 Ν 15/38

    5881 gtgaggccaacgcggaggatgtcgtgtgctgctcaatgtcttactcttggacaggcgcac CACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACGAGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTG

    ValThrProCysAlaAlaGluGluGlnLysLeuProIleAsnAlaLeuSerAsnSerLeu 5941 TCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAACTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGT

    AGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTTGACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCA

    LeuArgHisHisAsnLeuValTyrSerThrThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLys 6001 TGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACCACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGA

    ACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGGTGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCT

    LysValThrPheAspArgLeuGlnValLeuAspSerHisTyrGlnAspValLeuLysGlu 6061 AGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTGGACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGG

    TCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGACCTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCC

    ValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAlaAsnLeuLeuSerValGluGluAlaCysSer 6121 AGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCTAACTTGCTATCCGTAGAGG AAGCTTGCA

    TCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGATTGAACGATAGGCATCTCCTTCGAACGT

    LeuThrProProHisSerAlaLysSerLysPheGlyTyrGlyAlaLysAspValArgCys 6181 GCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAGTTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTT

    CGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTCAAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAA

    HisAlaArgLysAlaValThrHisIleAsnSerValTrpLysAspLeuLeuGluAspAsn 6241 GCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAACTCCGTGTGGAAAGACCTTCTGGAAGACA

    CGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTGAGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGT valThrProIleAspThrThrileMetAlaLysAsnGluValPheCysValGlnProGlu 6301 ATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCTAAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTG

    TACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGATTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGAC

    LysGlyGlyArgLysProAlaArgLeuIleValPheProAspLeuGlyValArgValCys 6361 AGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCA'fCGTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGT

    TCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAGCACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACA

    GluLysMetAlaLeuTyrAspValValThrLysLeuProLeuAlaValXetGlySerSer 6421 GCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACAAAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCT

    CGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGTTTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGA

    TyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArgValGluPheLeuValGlnAlaTrpLysSer 6481 CCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGGGTTGAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGT

    GGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCCCAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCA

    LysLysThrProMetGlyPheSerTyrAspThrArgCysPheAspSerThrValThrGlu 6541 CCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGATACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTG

    GGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTATGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGAC

    SerAspIleArgThiGluGluAlalleTyrGlnCysCysAspLeuAspProGlnAlaArg 6601 AGAGCG ACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTACCAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCC

    TCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATGGTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGG

    ValAlalleLysSerLeuThrGluArgLeuTyrValGlyGlyProLeuThrAsnSerArg 6661 GCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTTTATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAA

    CGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAAATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTT

    GlyGluAsnCysGlyTyrAxgArgCysArgAlaSerGlyValLeuThrThrSerCysGly 6721 GGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGCGCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTG

    CCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCGCGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACAC

    AsnThrLeuThxCysTyrlleLysAlaArgAlaAlaCysArgAlaAlaGlyLeuGlnAsp 6781 GTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGG

    CATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCCCGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCC

    CysThrMetLeuValCysGlyAspAspLéuValValIleCysGluSerAlaGlyYalGln 6841 ACTGCACCATGCTCGTGTGTGG CGACGACTTAGTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCC

    TGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAATCAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGG

    47-7. ÁBRA

    142

    HU 220 204 Β

    Int. Cl.⁷: C 12 N 15/38

    GluAspAlaAlaSerLeuArgAlaPheThrGluAlaMetThrArgTyrSerAlaProPro 6901 AGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACGGAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCC

    TCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGCCTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGG

    GlyAspProProGlnProGluTyrAspLeuGluLeuIleThrSerCysSerSerAsnVal 6 9 61 CTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTGGAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACG

    GACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAACCTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGC

    SerValAlaHisAspGlyAlaGlyLysArgValTyrTyxLeuThrArgAspProThrThr 7021 TGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGGGTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAA

    ACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCCCAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTT

    ProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAlaArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGly 7081 CCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCAAGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAG

    GGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGTTCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATC

    AsnllelleMetPheAlaProThrLeuTrpAlaArgMetlleLeuMetThrHisPhePhe 7141 GCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGGGCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCT

    CGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACCCGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGA

    SerValLeuIleAlaArgAspGlnLeuGluGlnAlaLeuAspCysGluIleTyrGlyAla 7201 TTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAACAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGG

    AATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTTGTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCC

    CysTyrSerXleGluProLeuAspLeuProProIlelleGlnArgLeu 7261 CCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCTCCAATCATTCAAAGACTC GGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGAGGTTAGTAAGTTTCTGAG

    46-1. ÁBRA A k9-l DNS transzlációja

    GlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGly 1 CAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGACCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGG

    GTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCTGGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCC

    ProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyProAspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrPro 61 GCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCCGACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACC

    CGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGGCTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGG

    ProLysProCysGlylleValProAlaLysSerValCysGlyProValTyrCyspheThr 121 CCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAGAGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCA

    GGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTCTCACACACACCAGGCCATATAACGAAGT

    ProSerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGly 181 CTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGACAGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGG

    GAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTGTCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCC

    GluAsnAspThrAsDValPheValLeuAsnAsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPhe 241 GTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAACAATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGT

    CACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTGTTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCA

    GlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPheThrLysValCysGlyAlaProProCysVal 301 TCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTCACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTG

    AGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAGTGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACAC

    IleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHisCysProThrAspCysPheArgLysHisPro 361 TCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCACTGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATC

    AGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTGACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAG

    AspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGlvProTrpIleThrPrcArgCysLeuValAsp 4 21 CGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGTCCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCG

    GCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCAGGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGC

    TyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCysThxIleAsnTyrThrllePheLysIleArg 481 ACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGTACCATCAACTACACTATATTTAAAATCA

    TGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACATGGTAGTTGATGTGATATAAATTTTAGT

    MetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeuGluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGlu 541 GGATGTACGTGGGAGGGGTCGAGCACAGGCTGGAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCG

    CCTACATGCACCCTCCCCAGCTCGTGTCCGACCTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGC

    ArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThr 601 AACGTTGCGATCTGGAAGATAGGGACAGGTCCGAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTA

    TTGCAACGCTAGACCTTCTATCCCTGTCCAGGCTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGAT

    GlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIle 661 CACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACAACCCTGCCAGCCTTGTCCACCGGCCTCA

    GTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGTTGGGACGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGT

    -----átfedés a 12f.-15e.DNS-ek kombinált ORF-jével---HisLeuHisGlnAsnlleValAspValGlnTyrLeuTyrGlyValGiySerSerlleAla
47. 47-8.. ÁBRA

    143