JP5624029B2 - シクロプロピルポリメラーゼ阻害剤 - Google Patents

Description

技術的分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の阻害剤であるヌクレオシド誘導体ならびにＨＣＶの処置又は予防におけるそれらの使用に関する。

発明の背景
ＨＣＶは、ヘパシウイルス（ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）属のウイルスのフラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科に属する一本鎖ポジティブセンス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルスである。初期の急性の感染に続き、感染した患者の大部分は慢性肝炎を発症し、それはＨＣＶが肝細胞中で優先的に複製するが、直接細胞障害性ではないからである。特に、激しいＴ−リンパ球反応の欠如及びウイルスが突然変異する高い傾向は、慢性の感染の高率を助長すると思われる。慢性肝炎は肝線維症に進行し、肝硬変、末期肝臓病及びＨＣＣ（肝細胞ガン）に導き得、それを肝臓移植の第１の原因としている。

６個の主要なＨＣＶ遺伝子型及び５０個より多いサブタイプがあり、それらは地理的に種々に分布する。遺伝子型１ＨＣＶはヨーロッパ及び米国で優勢な遺伝子型である。ＨＣＶの広範囲の遺伝子的異質性は、重要な診断的及び臨床的意味を有し、おそらくワクチン開発における困難性及び現在の治療の限られた有効性を説明する。

ＨＣＶの伝染は、例えば輸血又は静脈内薬物使用に続く汚染された血液又は血液製剤との接触を介して起こり得る。血液のスクリーニングにおいて用いられる診断的試験の導入は、輸血−後ＨＣＶ出現率を下げる傾向に導いた。しかしながら、末期肝臓病への遅い進行を考えると、現存する感染は重大な医学的及び経済的重荷を非常に長期間の間、与え続けるであろう。

現在の抗−ＨＣＶ医療標準は、リバビリンと組み合わされた（ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ））インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）に基づく。この組み合わせ治療は、遺伝子型１ウイルスに感染した患者の約５０％において、ならびに遺伝子型２及び３に感染した患者の約８０％において持続性のウイルス学的反応を生ずる。遺伝子型１ＨＣＶへの限られた有効性の他に、この組み合わせ治療は有意な副作用を有し、多くの患者においてあまり耐えられない。主な副作用にはインフルエンザ−様症状、血液学的異常及び神経精神医学的症状が含まれる。従って、より有効、簡便且つより耐えられる処置が必要である。

ＨＩＶ薬及び特にＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を用いる経験は、最適以下の薬物動態学及び複雑な投薬管理が、不注意のコンプライアンスの失敗を迅速に生ずることを教えた。これは代わって、ＨＩＶ管理におけるそれぞれの薬剤に関する２４時間トラフ濃度（ｔｒｏｕｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（最小血漿濃度）が、頻繁にその日の大きな部分に及んでＩＣ_９０又はＥＤ_９０閾値より低く下がることを意味する。少なくともＩＣ_５０そしてより現実的にはＩＣ_９０又はＥＤ_９０の２４時間トラフレベル（ｔｒｏｕｇｈ ｌｅｖｅｌ）は、薬剤逸脱突然変異体の出現を遅らせるのに必須であると思われる。そのようなトラフレベルを可能にするのに必要な薬物動態学及び薬剤代謝を達成することは、薬剤設計に厳しい挑戦を与える。

ＲＮＡポリジーンのＮＳ５Ｂ領域は、ウイルス複製に必須であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする。従ってこの酵素は、医薬品化学者の間で有意な興味を引いた。ＮＳ５Ｂのヌクレオシド及び非−ヌクレオシド阻害剤の両方が既知である。ヌクレオシド阻害剤は、鎖終結因子として、又はポリメラーゼへのヌクレオチド結合を妨害する競合阻害剤として働くことができる。鎖終結因子として機能するために、ヌクレオシド類似物は細胞により吸収され且つ生体内で三リン酸塩に転換されねばならない。この三リン酸塩への転換は通常細胞キナーゼにより媒介され、それはヌクレオシドポリメラーゼ阻害剤の可能性のあるものに追加の構造的な必要条件を与える。さらにこれは、ＨＣＶ複製の阻害剤としてのヌクレオシドの直接の評価を、その場リン酸化の可能な細胞に基づくアッセイ制限する。

ＨＣＶ ＲｄＲｐの阻害剤としてのヌクレオシドを開発するいくつかの試みが成されたが、一握りの化合物が臨床的開発に入りながら、登録へのすべての道を進んだものはなかった。今日までにＨＣＶを標的とするヌクレオシドが遭遇した問題の中に、毒性、突然変異誘発性、選択性の欠如、低い有効性、低いバイオアベイラビリティー、最適以下の投薬管理及び結果としての高い薬剤負荷（ｐｉｌｌ ｂｕｒｄｅｎ）ならびに製品のコストがある。

いくつかの特許及び特許出願ならびに科学的刊行物（ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）が、ＨＣＶ阻害活性を有するヌクレオシド類似物を開示している。特許文献１は、フラビウイルス感染の処置のための修飾２’及び３’−ヌクレオシドプロドラッグを開示している。特許文献２は、ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤としての４−アミノ−１−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−アジド−４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−メチル−テトラヒドロフラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン及びエステル誘導体を開示している。Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｅｉｓｕｋｅ ｅｔ ａｌ．は、非特許文献１において、β−Ｄ−２’−デオキシ−２’−フルオロ−２’Ｃ−メチルシチジン及びいくつかの類似物のリン酸化及びＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害を開示している。これらの化合物のいずれも２’−スピロシクロプロピル置換基を有していない。

副作用、限られた有効性、耐性の出現及びコンプライアンスの失敗のような現在のＨＣＶ治療の欠点の１つもしくはそれより多くを克服することができ、ならびに持続的なウイルス反応を向上させることができるＨＣＶ阻害剤が必要である。

国際公開第２００４／００２９９９号パンフレット 国際公開第２００８／０４３７０４号パンフレット

Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｅｉｓｕｋｅ ｅｔ ａｌ．著，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５１，ｎｏ．２，２００７年，ｐｐ．５０３−５０９

本発明は、以下のパラメーター：抗ウイルス有効性、好ましい耐性発現の側面、好ましいウイルス学的側面、好ましい毒性学的及び遺伝子毒性学的側面ならびに好ましい薬物動態学及び薬力学ならびに調製及び投与の容易さの１つもしくはそれより多くに関する有用
な性質を有するＨＣＶ阻害性４−アミノ−１−（７−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−５−オキサ−スピロ［２．４］ヘプチ−４−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オンに関する。１つのそのような化合物、すなわち２’デオキシ−２’−スピロシクロプロピルシチジンと呼ばれる−４−アミノ−１−（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−７−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−５−オキサ−スピロ［２．４］ヘプチ−４−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オンはＣａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７１，ｐｐ．４１３−４１６に記載されているが、ＨＣＶ阻害剤としてではない。

本発明の化合物は、それらが他のウイルスに対する、特にＨＩＶに対する活性がないことの故にも魅力的であり得る。ＨＩＶ感染患者は多くの場合にＨＣＶのような共−感染に苦しむ。ＨＩＶをも阻害するＨＣＶ阻害剤を用いるそのような患者の処置は、耐性ＨＩＶ株の出現に導き得る。

発明の記述
１つの側面において、本発明は、いずれかの可能な立体異性体を含む式Ｉ：

［式中：
Ｒ^２は水素又はＣ_１−Ｃ_４アルキルであり；
Ｒ^３及びＲ^４は独立して水素、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５及び−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２より成る群から選ばれるか；あるいは
Ｒ^３は水素であり、そしてＲ^４はモノホスフェート−、ジホスフェート−もしくはトリホスフェートエステルであるか；あるいはＲ^３は水素、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^５又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２であり、そしてＲ^４は式

の基であり、
各Ｒ^５は独立して水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル及びＣ_３−Ｃ_７シクロアルキルより成る群から選ばれ；
Ｒ^６は水素又はＣ_１−Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ^７は場合によりハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_３−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、ヒドロキシ及びアミノからそれぞれ独立して選ばれる１、２又は３個の置換基で置換されていることができるフェニルであるか、あるいはＲ^７はナフチルであるか；あるい
はＲ^７はインドリルであり；
Ｒ^８は水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、ベンジルであり；
Ｒ^８’は水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、ベンジルであるか；あるいは
Ｒ^８及びＲ^８’はそれらが結合する炭素原子と一緒になってＣ_３−Ｃ_７シクロアルキルを形成し；
Ｒ^９はＣ_１−Ｃ_６アルキル、ベンジル又はフェニルであり、ここで該フェニルは場合によりヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、アミノ、モノ−及びジＣ_１−Ｃ_６アルキルアミノからそれぞれ独立して選ばれる１、２又は３個の置換基で置換されていることができ；
但しＲ^２、Ｒ^３及びＲ^４はすべてが水素であることはない］
により示すことができる化合物又はその製薬学的に許容され得る塩もしくは溶媒和物を提供する。

さらに別の側面において、本発明は、ＨＣＶ感染を妨げるか又は処置するための、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４がすべて水素である式Ｉの化合物を含む本明細書で規定される式Ｉの化合物の使用に関する。あるいはまた、ＨＣＶ感染を妨げるか又は処置するための薬剤の製造のための、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４がすべて水素である式Ｉの化合物を含む本明細書で規定される式Ｉの化合物の使用を提供する。

基−ＮＨ−Ｃ（Ｒ^８）（Ｒ^８’）−Ｃ（＝Ｏ）−はアミノ酸残基を形成し、それは天然及び非−天然アミノ酸残基を含む。興味深いのは、Ｒ^８’が水素であるアミノ酸残基である。後者の場合においてＲ^８が水素以外である場合、Ｒ^８を有する不斉炭素原子における立体配置は、Ｌ−アミノ酸の立体配置であることができる。この立体配置をＳ−立体配置と称することもできる。例はアラニン（Ａｌａ）、すなわちＲ^８’が水素であり、Ｒ^８がメチルである場合；あるいはバリン（Ｖａｌ）、すなわちＲ^８’が水素であり、Ｒ^８がイソプロピルである場合；ロイシン（Ｌｅｕ）、すなわちＲ^８’が水素であり、Ｒ^８が−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２である場合；イソロイシン（Ｉｌｅ）、すなわちＲ^８’が水素であり、Ｒ^８が−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３である場合；及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、すなわちＲ^８’が水素であり、Ｒ^８がベンジルである場合；特にＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｉｌｅ及びＬ−Ｐｈｅである。Ｒ^８及びＲ^８’が、それらが結合する炭素原子と一緒になってＣ_３−Ｃ_７シクロアルキルを形成するアミノ酸残基の例は、１，１−シクロプロピルアミノ酸である。Ｒ^８及びＲ^８’が両方とも水素である場合、基−ＮＨ−Ｃ（Ｒ^８）（Ｒ^８’）−Ｃ（＝Ｏ）−はグリシン（Ｇｌｙ）を形成する。

基−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２はアミノ酸エステルを形成し、アミノ酸は側鎖を有していないか（Ｒ^６は水素である）、あるいはＣ_１−Ｃ_６アルキル側鎖を有する。そのようなアミノ酸はグリシン（Ｒ^６は水素である）、バリン（Ｒ^６はイソプロピルである）、ロイシン（Ｒ^６は−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２である）又はイソロイシン（Ｒ^６は−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３である）を含み、特にＬ−立体異性体、Ｈ−Ｌ−Ｖａｌ−、Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ又はＨ−Ｌ−Ｉｌｅを含む。

式Ｉの化合物のサブグループは、Ｒ^２が水素である本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは、Ｒ^３が水素である本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは、Ｒ^４が水素である本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは、Ｒ^３及びＲ^４の一方が水素であり、Ｒ^３及びＲ^４の他
方がアセチル、ピバロイル及び好ましくはイソブチリルから選ばれるか；あるいはＲ^３及びＲ^４の一方が水素であり、Ｒ^３及びＲ^４の他方がロイシル、イソロイシル及び好ましくはバリルから選ばれるか；あるいはＲ^３及びＲ^４の両方がアセチル、ピバロイル及び好ましくはイソブチリルから選ばれるか；あるいはＲ^３及びＲ^４の両方がロイシル、イソロイシル及び好ましくはバリルから選ばれる本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。１つの態様において、Ｒ^３は水素であり、Ｒ^４は上記で定義された通りである。別の態様において、Ｒ^４は水素であり、Ｒ^３は上記で定義された通りである。式Ｉの化合物の特別なサブグループは、Ｒ^３及びＲ^４が両方ともイソブチリル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ_３）_２）である本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは、Ｒ^３が水素又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５であり、Ｒ^４が式

の基である本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは、各Ｒ^５がＣ_１−Ｃ_６アルキル、特にメチル、イソプロピル（１−メチルエチル）、イソブチル（２−メチルプロピル）、ｓｅｃ−ブチル（１−メチルプロピル）である本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは、Ｒ^６が水素又はＣ_１−Ｃ_４アルキル、特に水素、メチル又はイソブチルである本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは：
（ａ）Ｒ^７が、場合によりハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_３−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、ヒドロキシ及びアミノからそれぞれ独立して選ばれる１又は２個の置換基で置換されていることができるフェニルであるか、あるいはＲ^７がナフチルであるか；あるいはＲ^７がインドリルであるか；
（ｂ）Ｒ^７が、場合によりハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_３−Ｃ_６アルケニル又はＣ_１−Ｃ_６アルコキシで置換されていることができるフェニルであるか、あるいはＲ^７がナフチルであるか；
（ｃ）Ｒ^７が、場合によりハロ又はＣ_１−Ｃ_６アルキルで置換されていることができるフェニルであるか、あるいはＲ^７がナフチルであるか；
（ｄ）Ｒ^７が、場合によりハロで置換されていることができるフェニルである
本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

１つの態様において、式Ｉの化合物又はそのサブグループのいずれか中の基インドリルは、５−インドリルである。

式Ｉの化合物のサブグループは、Ｒ^８が水素であり、Ｒ^８’がメチル又はＣ_１−Ｃ_６アルキル、例えばイソプロピル又はイソブチルである本明細書で定義される式Ｉの化合物又
は式Ｉの化合物のサブグループである。式Ｉの化合物のサブグループは、

部分がグリシル、アラニル又はバリル（Ｇｌｙ、Ａｌａ又はＶａｌ；特にＧｌｙ、Ｌ−Ａｌａ又はＬ−Ｖａｌ）である本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物のサブグループは、
（ａ）Ｒ^９がＣ_１−Ｃ_６アルキル又はベンジルであるか；
（ｂ）Ｒ^９がＣ_１−Ｃ_６アルキルであるか；
（ｃ）Ｒ^９がＣ_１−Ｃ_４アルキルであるか；あるいは
（ｄ）Ｒ^９がメチル、エチル又はｔ−ブチルである
本明細書で定義される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のサブグループである。

式Ｉの化合物は、特に炭素原子１’、３’及び４’においていくつかのキラリティーの中心を有する。これらの炭素原子における立体化学は固定されているが、化合物は、キラル中心のそれぞれにおいて少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、例えば９５％より過剰におけるエナンチオマー的純度を示すことができる。キラリティーは置換基中にも、例えばＲ^３及び／又はＲ^４が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２であり、Ｒ^６が水素以外である場合；あるいは例えば基

中にも存在し得、後者の基はＲ^８保有炭素（Ｒ^８及びＲ^８’が異なる場合）及びリン原子においてキラリティーを有し得る。リン中心はＲ_Ｐ又はＳ_Ｐあるいはラセミ体を含んでそのような立体異性体の混合物として存在し得る。キラルリン中心及びキラル炭素原子から生ずるジアステレオ異性体は同様に存在し得る。

本発明の態様は、遊離の形態又はその製薬学的に許容され得る酸付加塩もしくは溶媒和物の形態の両方における；２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルシチジンと示される化合物（Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４がすべて水素である式Ｉの化合物）；あるいはビス３’，５’−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルシチジンと示される化合物（Ｒ^２が水素であり、Ｒ^３及びＲ^４が両方とも−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５であり、ここでＲ^５はイソプロピルである式Ｉの化合物）の；ＨＣＶの阻害剤としての、あるいはＨＣＶ感染の処置又は予防における使用に関する。

１つの態様は、遊離の形態における本明細書下記の実施例の節で挙げられる化合物１、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３、４、５、６及び７と称される化合物に関する。別の態様は、これらの化合物ならびにその製薬学的に許容され得る塩及び溶媒和物に関する。特別な態様は、遊離の形態における化合物ビス３’，５’−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルシチジンに関する。さらに別の特別な態様は、ビス３’，５’−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルシチジン、その製薬学的に許容され得る酸付加塩及び溶媒和物に関する。

さらに別の側面において、本発明は、ＨＣＶ感染の処置又は予防（あるいは処置又は予防用の薬剤の製造）における使用のための式Ｉの化合物あるいはその製薬学的に許容され得る塩、水和物又は溶媒和物を提供する。本発明に従う処置又は予防の関係における代表的なＨＣＶ遺伝子型には、遺伝子型１ｂ（ヨーロッパで流行している）又は１ａ（北アメリカで流行している）が含まれる。本発明は、特に遺伝子型１ａ又は１ｂのＨＣＶ感染の処置又は予防方法も提供する。

式Ｉの化合物は限定された立体異性体として示される。当該技術分野において既知の方法、例えばＸ−線回折又はＮＭＲ及び／又は既知の立体化学の出発材料から示されることを用いて、そのような化合物の絶対立体配置を決定することができる。本発明に従う製薬学的組成物は、好ましくは示される立体異性体の実質的に立体異性体的に純粋な調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を含むであろう。

本明細書で言及する化合物及び中間体の純粋な立体異性体は、該化合物又は中間体の同じ基本的分子構造の他のエナンチオマーもしくはジアステレオマー形態を実質的に含まない異性体として定義される。特に「立体異性体的に純粋な」という用語は、少なくとも８０％の立体異性体過剰率（すなわち最小で９０％の一方の異性体及び最大で１０％の他方の可能な異性体）から最高で１００％の立体異性体過剰率（すなわち１００％の一方の異性体及び他方の異性体なし）を有する化合物又は中間体、さらに特定的には９０％から１００％までの立体異性体過剰率を有する、さらにもっと特定的には９４％から１００％までの立体異性体過剰率を有する、そして最も特定的には９７％から１００％までの立体異性体過剰率を有する化合物又は中間体に関する。「エナンチオマー的に純粋な」及び「ジアステレオマー的に純粋な」という用語は、類似して理解されるべきであるが、その場合には問題の混合物のそれぞれエナンチオマー過剰率及びジアステレオマー過剰率に関する。

本発明の化合物及び中間体の純粋な立体異性体は、当該技術分野において既知の方法の適用により得ることができる。例えばエナンチオマーを、光学的に活性な酸もしくは塩基とのそれらのジアステレオマー塩の選択的結晶化により互いから分離することができる。その例は酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸及びカンファースルホン酸である。あるいはまた、キラル固定相を用いるクロマトグラフィー法によりエナンチオマーを分離することができる。該純粋な立体化学的異性体を、適した出発材料の対応する純粋な立体化学的異性体から誘導することもでき、但し反応は立体特異的に起こる。好ましくは、特定の立体異性体が望まれる場合、該化合物は立体特異的製造方法により合成されるであろう。これらの方法は、有利にはエナンチオマー的に純粋な出発材料を用いるであろう。

式Ｉの化合物のジアステレオマー的ラセミ体を、通常の方法により別々に得ることができる。有利に用いることができる適した物理的分離法は、例えば選択的結晶化及びクロマトグラフィー、例えばカラムクロマトグラフィーである。

本発明は、本化合物上に存在する原子のすべての同位体を含むことも意図されている。同位体は、同じ原子番号を有するが異なる質量数を有する原子を含む。一般的な例として且つ制限ではなく、水素の同位体はトリチウム及びジューテリウムを含む。炭素の同位体はＣ−１３及びＣ−１４を含む。

製薬学的に許容され得る付加塩は、式Ｉの化合物の治療的に活性な無−毒性酸及び塩基付加塩の形態を含む。興味深いのは、本明細書に規定される式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物のいずれかのサブグループの遊離の（すなわち非−塩の）形態である。本明細書で用いられる場合、「遊離の形態」という用語は、塩の形態又は溶媒和物でない式Ｉの化合物を指す。

製薬学的に許容され得る酸付加塩は、適した酸を用いて遊離の形態を処理することにより簡単に得ることができる。適した酸は例えば無機酸、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの酸；あるいは有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわちエタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわちブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸（すなわちヒドロキシブタン二酸）、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸などの酸を含む。逆に、適した塩基を用いる処理により該酸付加塩の形態を遊離の形態に転換することができる。

酸性プロトンを含有する式Ｉの化合物を、適した有機及び無機塩基を用いる遊離の形態の処理により、それらの製薬学的に許容され得る金属もしくはアミン付加塩の形態に転換することもできる。適した塩基塩の形態は、例えばアンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など；有機塩基との塩、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩、ならびに例えばアルギニン、リシンなどのようなアミノ酸との塩を含む。逆に、適した酸を用いる処理により、該金属もしくはアミン付加塩の形態を遊離の形態に転換することができる。

「溶媒和物」という用語は、式Ｉの化合物ならびにその塩が形成することができるいずれの製薬学的に許容され得る溶媒和物を包含する。そのような溶媒和物は、例えば水和物、アルコラート、例えばエタノラート、プロパノラートなどである。

式Ｉの化合物のいくつかは、それらの互変異性体においても存在し得る。例えばアミド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）基の互変異性体はイミノアルコール（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）であり、それは芳香族性を有する環において安定になることができる。そのような形態は、本明細書に示される構造式中に明白に示されてはいないが、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。

本明細書で用いられる場合、基として又は基の一部としての「Ｃ_１−４アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有する飽和直鎖状もしくは分枝鎖状炭化水素基、例えばメチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−メチル−２−プロピルを定義する。「Ｃ_１−６アルキル」は、Ｃ_１−４アルキル基及び５もしくは６個の炭素原子を有するその高級同族体、例えば１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、２−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ペンチル、２−エチル−１−ブチル、３−メチル−２−ペンチルなどを包含する。Ｃ_１−６アルキルの中で興味深いのはＣ_１−４アルキルである。

「Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ」は、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルが上記で定義した通りである基−Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキルを意味する。Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシの例はメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ及びイソプロポキシである。

「Ｃ_３−７シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シ
クロヘキシル及びシクロヘプチルを含む。これらのサブグループはＣ_３−Ｃ_６シクロアルキルである。興味深いのはシクロプロピルである。

基として又は基の一部としての「Ｃ_３−６アルケニル」という用語は、飽和炭素−炭素結合及び少なくとも１個の二重結合を有し、且つ３〜６個の炭素原子を有する直鎖状及び分枝鎖状炭化水素基、例えば１−プロペニル、２−プロペニル（又はアリル）、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、２−メチル−２−ブテニル、２−メチル−２−ペンテニルなどを定義する。Ｃ_３−６アルケニルの中で興味深いのはＣ_３−４アルケニルである。Ｃ_３−６アルケニル又はＣ_３−４アルケニルの中で興味深いのは、１個の二重結合を有する基である。

ハロという用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードの総称である。

本明細書前記で用いられる場合、「（＝Ｏ）」又は「オキソ」という用語は、炭素原子に結合する場合にはカルボニル部分を形成する。原子は、その原子の原子価が許す場合のみに、オキソ基で置換され得ることに注目しなければならない。

「モノホスフェート、ジホスフェート又はトリホスフェートエステル」という用語は基：

を指す。

本明細書で用いられる場合、定義において用いられるいずれの分子部分の上の基の位置も、そのような部分が化学的に安定である限り、そのような部分の上のどこであることもできる。いずれかの可変項（ｖａｒｉａｂｌｅ）がいずれかの与えられる部分中に１回より多く存在する場合、この可変項の各定義は独立している。

本明細書で「式Ｉの化合物」又は「本化合物」という用語あるいは類似の用語が用いられる場合は常に、可能な立体化学的異性体を含む式Ｉの化合物ならびにそれらの製薬学的に許容され得る塩及び溶媒和物を含むものとする。

製造方法
Ｒ^３及びＲ^４が両方とも水素である式Ｉの化合物は本明細書で式Ｉ−ａにより示され、２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルウリジン１ｆから対応する２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルシチジン１ｇに、ウラシルからシトシンへの転換反応を行い、続いて保護基ＰＧを除去して所望の最終的な生成物Ｉ−ａを与えることにより製造され得る。このウラシルからシトシンへの転換反応は、ウラシル誘導体をＰＯＣｌ_３又はホスホロジクロリデート、例えばフェニルもしくは置換フェニルホスホロジクロリデート、例えば４−クロロフェニルホスホロジクロリデート及びトリアゾール又はテトラゾールと反応させることにより行うことができる。この反応を、塩基の存在下における反応に不活性な溶媒中で、例えばトリエチルアミンのような第３級アミンの存在下におけるジクロロ
メタンのようなハロゲン化炭化水素中で行うことができる。あるいはピリジンのような塩基性溶媒を用いることもできる。所望に応じて、得られる式

のトリアゾール又はテトラゾール誘導体を単離して精製することができる。後者をアンモニア又はＲ^２−ＮＨ_２で処理すると、対応するシトシン誘導体１ｇを与える。ＰＧ基の除去は、最後に所望の最終的な生成物Ｉに導く。本明細書で用いられる場合、ＰＧはヒドロキシ−保護基、特に本明細書下記に挙げる基の１つを示す。

上記の転換において用いられる中間体１ｆは、中間体１ｄ中のエキソ二重結合におけるシクロプロパン環形成反応及び続く中間体１ｅ中の窒素保護基の除去により得られる。シクロプロパン環形成は、エキソ二重結合へのジアゾメタンの付加、ならびに続く好ましくはベンゾフェノンのような光増感剤の存在下におけるシクロプロパン部分の形成及び窒素の排除を伴う光化学的転位を含む。これらの反応は、好ましくは反応に不活性な溶媒中で行われ、例えばジアゾメタン反応をジエチルエーテルのようなエーテル中で行うことができ、光化学的転位をベンゼン又はトルエンのような芳香族炭化水素あるいはアセトニトリルのような双極性非プロトン性溶媒あるいはそれらの混合物中で行うことができる。

中間体１ｄは、中間体１ｃからＷｉｔｔｉｇ反応により得られる。この反応において、エーテル、例えばジエチルエーテル又はテトラヒドロフランのような反応に不活性な溶媒中で、中間体１ｃをメチルトリフェニルホスホニウムハライド、好ましくはクロリド又はブロミドと反応させる。代わって中間体１ｃは、例えば無水酢酸の存在下にピリジン中で三酸化クロムを用いる中間体１ｂ中の２’−ヒドロキシ基の酸化反応により誘導される。１ａ中の４’及び５’−ヒドロキシ基の選択的保護は、中間体１ｂを与える。

副反応を避けるために、４’及び５’−ヒドロキシ基を好ましくはヒドロキシ保護基ＰＧで保護し、ウラシル部分中のアミノ（ＮＨ）官能基をアミノ保護基ＰＧ^１で保護する。ヒドロキシ保護基ＰＧは異なるかもしくは同じであることができるか、あるいは組み合わされて環状保護基を形成することができる。ＰＧは例えばトリアルキルシリル基、例えばトリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）又はトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）である。あるいは２個のＰＧ基は、組み合わされてポリアルキル化ジシロキサン−１，３−ジイル基、例えばテトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル（ＴＩＰＤＳ）を形成する。これらの基を酸又はフルオリドイオン（例えばＮａＦ又はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド−ＴＢＡＦ）により除去することができる。アミノ保護基でもあり得る別のヒドロキシ保護基は、トリチル基又は置換トリチル基、例えば４−メトキシ−トリチル（（４−メトキシフェニル）（ビスフェニル）メチル）であり、それは酸性条件下で、例えばエタノール／ＨＣｌを用いるか又は酢酸を用いる処理により除去される。

アミノ保護基ＰＧ^１は、それがＰＧ基に対して選択的に切断可能であるように選ばれる。用いられ得るアミノ保護基はベンゾイル基である。別のそのような基はジメチルアミノメチレン基であり、それはジメチルホルムアミドジメチルアセタールを用いて導入され得る。ジメチルアミノメチレン基は酸性条件下で、例えばエタノール／ＨＣｌを用いる処理により除去される。

上記の反応を以下の反応スキーム中に例示する。

式Ｉ−ａの化合物を、次いで以下の反応スキームに概述する通りにホスホルアミデートに転換することができる。化合物Ｉ−ａを塩基の存在下でホスホロクロリデート２ａと反応させてホスホルアミデートＩ−ｂを与える。この反応において用いることができる溶媒は、エーテル、例えばジエチルエーテル又はＴＨＦあるいはピリジンあるいはそれらの混合物を含む。反応の間に形成される酸を捕獲するために、Ｎ−メチルイミダゾールのような塩基を加えることができる。

Ｉ−ａのモノ−もしくはジ−エステルの合成を、本明細書下記のスキーム３に描く。このスキームにおいて、Ｒ^３ａ及びＲ^４ａは独立して−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２であるか、あるいは特にＲ^３ａ及びＲ^４ａは独立して−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５である。Ｒ^３ａ及びＲ^４ａが独立して−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２である場合、後者の基中のアミノは、好ましくは上記のアミノ保護基ＰＧ^１のいずれかのようなアミノ保護基により保護され、この基を−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ−ＰＧ^１により示すことができる。アミノ保護基を、そのような基の除去に適した反応条件を用いて除去することができる。例えばＰＧ^１はＢＯＣ基であることができ、酸性条件下で除去され得る。遊離のアミノ基がもはや続く反応段階を妨げ得ないいずれの段階にも、アミノ保護基を除去することができるが、通常は最後の段階で除去する。

中間体３ａ中のより反応性の５’−ヒドロキシ基を、中間体３ｂにおけるように選択的に保護することができ、それを次いで３ｃにエステル化し、それに３ｄへのウラシルからシトシンへの転換が続く。３ｄを脱保護して３’−モノエステルＩ−ｃを与える。Ｉ−ｃ中の５’−ヒドロキシのエステル化は、最終的な生成物Ｉ−ｄを与える。より反応性の５’−ヒドロキシを選択的にエステル化して基Ｒ^４を導入し、３ｅを与えることもでき、得られる５’−エステル中間体を続いて異なる酸を用いてエステル化し、それにより上記で定義された通りである基Ｒ^３ａを導入することができる。これらのエステル化反応は、ジ−エステル中間体３ｆを与え、それをウラシルからシトシンへの転換に供し、最終的な生成物Ｉ−ｄを与える。ウラシルからシトシンへの転換は、中間体１ｇの製造に関して上記に記載した方法を用いて行われる。

Ｒ^３ａが水素であり、Ｒ^４ａが上記で規定した通りのエステルである式Ｉの化合物はＩ−ｅにより示され、それは、中間体３ｂ中の遊離のヒドロキシを、他のヒドロキシ−保護基に対して選択的に切断可能なヒドロキシ−保護基で保護し、中間体４ａを与えることにより、製造され得る。その場合、次の段階は５’−ヒドロキシ保護基の除去を含み、中間体４ｂを与え、中間体４ｃへのエステル化反応が続く。続くウラシルからシトシンへの転換は対応する４’−ヒドロキシ保護シチジン誘導体４ｄを与え、それを脱保護して５’−置換４’−非置換誘導体Ｉ−ｅを与える。これらの反応をスキーム４に示し、スキームにおいて基ＰＧ^ａはＰＧと同じ意味を有するが、ＰＧがＰＧ^ａに対して選択的に切断可能であるように選ばれる。例えばＰＧはトリチル又は４−メトキシトリチル基であることができ、ＰＧ^ａはトリアルキルシリル基、例えばトリメチルシリル又はｔ．ブチルジメチルシ
リルであることができる。

Ｒ^３ａ及びＲ^４ａが同じエステル基である式Ｉの化合物は、下記でＩ−ｆにより示され、それは化合物３ａから、両方のヒドロキシ基を同じカルボン酸でエステル化することにより製造され得る。

出発材料３ａは、中間体１ｆ中のヒドロキシ保護基ＰＧを除去することにより製造され得、中間体１ｆは上記でスキーム１において例示した通りに製造され得る。

「アミノ保護」又は「Ｎ−保護基」という用語は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモ−ベンゾイル、４−ニトロベンゾイルなどのようなアシル基；ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなどのようなスルホニル基；ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロ−ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシ−カルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシ−カルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなどのようなカルバメート形成基；ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなどのようなアルキル基；ならびにトリメチルシリルなどのようなシリル基を含む。

ヒドロキシ−保護基はエーテル、例えばメチル、置換メチルエーテル、例えばメトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、ｔ−ブトキシメチル、２−メトキシエトキシメチルなど；シリルエーテル、例えばトリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリベンジルシリル、トリフェニルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリルなど；置換エチルエーテル、例えば１−エトキシメチル、１−メチル−１−メトキシエチル；ｔ−ブチル、アリル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ジフェニルメチル、トリチルなどを含む。エステルヒドロキシ保護基は、ホルメート、ベンジルホルメート、クロロアセテート、メトキシアセテート、フェノキシアセテート、ピバロエート、アダマントエート、メシトエート、ベンゾエートなどのようなエステルを含む。

さらに別の側面において、本発明は、本明細書で規定される式Ｉの化合物の治療的に有効な量及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物に関する。これに関し、治療的に有効な量は、感染した患者又は感染する危険にある患者において、ウイルス感染、特にＨＣＶウイルス感染に対して予防的に作用するか、それを安定化するか、又は減少させるのに十分な量である。さらにもっと別の側面において、本発明は本明細書で規定される製薬学的組成物の調製方法に関し、それは製薬学的に許容され得る担体を本明細書で規定される式Ｉの化合物の治療的に有効な量と緊密に混合することを含んでなる。

本発明の化合物又はそのいずれかのサブグループを、投与目的のための種々の製薬学的形態に調製することができる。適した組成物として、薬剤を全身的に投与するために通常用いられるすべての組成物を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物の調製のために、場合により付加塩の形態又は金属錯体にあることができる特定の化合物の活性成分として有効な量を、製薬学的に許容され得る担体と緊密な混合物において合わせ、その担体は、投与のために望ましい調製物の形態に依存して多様な形態をとることができる。望ましくはこれらの製薬学的組成物は、特に経口的、直腸的、経皮的又は非経口的注入による投与に適した単位投薬形態にある。例えば経口的投薬形態における組成物の調製において、通常の製薬学的媒体のいずれか、例えば懸濁剤、シロップ、エリキシル剤、乳剤及び溶液のような経口用液体調製物の場合、水、グリコール、油、アルコールなど；あるいは粉剤、丸薬、カプセル及び錠剤の場合、澱粉、糖類、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのような固体担体を用いることができる。それらの投与の容易さのために、錠剤及びカプセルは最も有利な経口的投薬単位形態物を与え、その場合には固体の製薬学的担体が用いられるのは明らかである。非経口用組成物の場合、担体は通常少なくとも大部分において無菌水を含んでなるが、例えば溶解性を助けるための他の成分が含まれることができる。例えば担体が食塩水、グルコース溶液又は食塩水とグルコース溶液の混合物を含んでなる注入可能な溶液を調製することができる。注入可能な懸濁剤も調製することができ、その場合には適した液体担体、懸濁化剤などを用いることができる。使用の直前に液体形態の調製物に転換されることが意図されている固体形態の調製物も含まれる。経皮的投与に適した組成物において、担体は場合により浸透促進剤及び／又は適した湿潤剤を含んでなることができ、それらは場合により小さい割合におけるいずれかの性質の適した添加剤と組み合わされていることができ、その添加剤は皮膚に有意な悪影響を導入しない。本発明の化合物を、溶液、懸濁剤又は乾燥粉剤の形態で、当該技術分野において既知のいずれかの送達系を用い、経口的吸入又は吹入を介して投与することもできる。

投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、前記の製薬学的組成物を単位投薬形態物において調製するのが特に有利である。本明細書で用いられる単位投薬形態物は、１回の投薬量として適した物理的に分離された単位を指し、各単位は所望の治療効果を生むために計算されたあらかじめ決められた量の活性成分を、必要な製薬学的担体と一緒に含有する。そのような単位投薬形態物の例は錠剤（刻み付き又はコーティング錠を含む）、カプセル、丸薬、座薬、粉剤小包、ウェハース、注入可能な溶液又は懸濁剤など、ならびに分離されたそれらの複数である。

式Ｉの化合物はＨＣＶに対する活性を示し、ＨＣＶ感染又はＨＣＶと関連する疾患の処置及び予防において用いられ得る。後者には、進行性肝線維症、炎症及び肝硬変に導く壊死、末期肝臓病ならびにＨＣＣが含まれる。本発明の化合物はさらに、ＨＣＶの突然変異株に対して活性であり得る。さらに、本発明の化合物は好ましい薬物動態学的側面を示すことができ、且つ許容され得る半減期、ＡＵＣ（曲線下の面積）及びピーク値を含むバイオアベイラビリティーの点で魅力的な性質を有することができ、そして不十分な迅速開始及び組織保持（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）のような好ましくない現象がない。

本発明の化合物は、例えば細胞毒性試験において示され得る通り、それらの低い毒性及
び好ましい選択指数の故にも魅力的である。さらに本発明の化合物は、他のウイルスに対する、特にＨＩＶに対する活性がない。共−感染患者において二重又は多重抗ウイルス効果を有する薬剤を用いることは、他のウイルスに対する最適以下の投薬を生じ得、それは今度は耐性ウイルス株の出現に導き得る。

式Ｉの化合物のＨＣＶに対する試験管内抗ウイルス活性を、Ｋｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：２００１年，４６１４−４６２４（引用することによりその記載事項は本明細書の内容となる）により記載されたさらなる修正を有し、実施例の節でさらに例示されるＬｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１９９９年，１１０−１１３に基づく細胞ＨＣＶレプリコン系において調べることができる。このモデルは、ＨＣＶに関する完全な感染モデルではないが、現在利用できる自律ＨＣＶ ＲＮＡ複製の最も頑健（ｒｏｂｕｓｔ）且つ有効なモデルとして広く受け入れられている。ＨＣＶ機能を特異的に妨げる化合物を、ＨＣＶレプリコンモデルにおいて細胞毒性もしくは静細胞効果を発揮し、結局ＨＣＶ ＲＮＡ又は連鎖リポーター酵素濃度を低下させる化合物から区別することが重要であることは、認識されるであろう。例えばレサズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）のような蛍光発光性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）レドックス色素を用いるミトコンドリア酵素の活性に基づく、細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の評価のためのアッセイが、技術分野で既知である。さらに、ホタルルシフェラーゼのような、連鎖リポーター遺伝子活性の非−選択的阻害の評価のための細胞逆選択物質（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎｓ）が存在する。発現が構成的に活性な遺伝子プロモーターに依存するルシフェラーゼリポーター遺伝子を、安定なトランスフェクションにより適した細胞型に備えることができ、そのような細胞を非−選択的阻害剤の除去のための逆選択物質（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｃｒｅｅｎ）として用いることができる。

可能な立体異性体を含む式Ｉの化合物、その製薬学的に許容され得る付加塩又は溶媒和物は、それらの抗ウイルス性、特にそれらの抗−ＨＣＶ性の故に、ＨＣＶに感染した温血動物、特に人間の処置において、ならびに温血動物、特に人間におけるＨＣＶ感染の予防のために有用である。本発明はさらに、ＨＣＶに感染したか、もしくはＨＣＶに感染する危険にある温血動物、特に人間の処置方法に関し、該方法は、本明細書に規定される式Ｉの化合物の抗−ＨＣＶ有効量を投与することを含んでなる。

従って本発明の化合物を薬剤として、特に抗−ＨＣＶ薬剤として又はＨＣＶ−阻害性薬剤として用いることができる。本発明は、ＨＣＶ感染の処置又は予防用の薬剤の製造における化合物の使用にも関する。該薬剤としての使用あるいは処置方法は、ＨＣＶ感染に関連する状態と戦うのに有効な量の本明細書で規定される式Ｉの化合物を、ＨＣＶ感染患者又はＨＣＶ感染し易い患者に全身的に投与することを含んでなる。

一般に、抗ウイルス的に有効な１日の量は、体重のｋｇ当たり約０．０１〜約７００ｍｇ又は体重のｋｇ当たり約０．５〜約４００ｍｇ又は体重のｋｇ当たり約１〜約２５０ｍｇ又は体重のｋｇ当たり約２〜約２００ｍｇ又は体重のｋｇ当たり約１０〜約１５０ｍｇであろうと思われる。必要な投薬量を２、３、４回もしくはそれより多い細分−投薬量として、１日を通じて適した間隔で投与するのが適しているかも知れない。該細分−投薬量を、例えば単位投薬形態物当たりに約１〜約５０００ｍｇ又は約５０〜約３０００ｍｇ又は約１００〜約１０００ｍｇ又は約２００〜約６００ｍｇ又は約１００〜約４００ｍｇの活性成分を含有する単位投薬形態物として調製することができる。

本発明は、式Ｉの化合物、その製薬学的に許容され得る塩又は溶媒和物ならびに他の抗ウイルス性化合物、特に他の抗−ＨＣＶ化合物の組み合わせにも関する。「組み合わせ」という用語は、ＨＣＶ感染の処置における同時、個別又は逐次的使用のための組み合わせ
調製物として、（ａ）上記で規定される式Ｉの化合物及び（ｂ）場合により他の抗−ＨＣＶ化合物を含有する製品に関することができる。

そのような組み合わせ中で用いられ得る抗−ＨＣＶ化合物には、ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶライフサイクル中の他の標的の阻害剤及び免疫調節剤ならびにそれらの組み合わせが含まれる。ＨＣＶポリメラーゼ阻害剤にはＮＭ２８３（バロピシタビン（ｖａｌｏｐｉｃｉｔａｂｉｎｅ））、Ｒ８０３、ＪＴＫ−１０９、ＪＴＫ−００３、ＨＣＶ−３７１、ＨＣＶ−０８６、ＨＣＶ−７９６及びＲ−１４７９、Ｒ−７１２８、ＭＫ−０６０８、ＶＣＨ−７５９、ＰＦ−８６８５５４、ＧＳ９１９０、ＸＴＬ−２１２５、ＮＭ−１０７、ＧＳＫ６２５４３３、Ｒ−１６２６、ＢＩＬＢ−１９４１、ＡＮＡ−５９８、ＩＤＸ−１８４、ＩＤＸ−３７５、ＭＫ−３２８１、ＭＫ−１２２０、ＡＢＴ−３３３、ＰＳＩ−７８５１、ＰＳＩ−６１３０、ＶＣＨ−９１６が含まれる。ＨＣＶプロテアーゼの阻害剤（ＮＳ２−ＮＳ３阻害剤及びＮＳ３−ＮＳ４Ａ阻害剤）にはＢＩＬＮ−２０６１、ＶＸ−９５０（テラプレビル（ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ））、ＧＳ−９１３２（ＡＣＨ−８０６）、ＳＣＨ−５０３０３４（ボセプレビル（ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ））、ＴＭＣ４３５３５０（ＴＭＣ４３５とも呼ばれる）、ＴＭＣ４９３７０６、ＩＴＭＮ−１９１、ＭＫ−７００９、ＢＩ−１２２０２、ＢＩＬＮ−２０６５、ＢＩ−２０１３３５、ＢＭＳ−６０５３３９、Ｒ−７２２７、ＶＸ−５００、ＢＭＳ６５００３２、ＶＢＹ−３７６、ＶＸ−８１３、ＳＣＨ−６、ＰＨＸ−１７６６、ＡＣＨ−１６２５、ＩＤＸ−１３６、ＩＤＸ−３１６が含まれる。ＨＣＶ ＮＳ５Ａ阻害剤の例はＢＭＳ７９００５２、Ａ−８３１、Ａ−６８９、ＮＩＭ−８１１であり、ＤＥＢＩＯ−０２５はＮＳ５Ｂシクロフィリン阻害剤の例である。

ＮＳ３ヘリカーゼを含むＨＣＶライフサイクル中の他の標的の阻害剤；メタロプロテアーゼ阻害剤；アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、例えばＩＳＩＳ−１４８０３及びＡＶＩ−４０６５；ｓｉＲＮＡ’ｓ、例えばＳＩＲＰＬＥＸ−１４０−Ｎ；ベクター−コードされたショートヘアピンＲＮＡ（ｖｅｃｔｏｒ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）；ＤＮＡザイム；ＨＣＶ特異的リボザイム、例えばヘプタザイム、ＲＰＩ．１３９１９；エントリー阻害剤、例えばＨｅｐｅＸ−Ｃ、ＨｕＭａｘ−ＨｅｐＣ；アルファグルコシダーゼ阻害剤、例えばセルゴシビル（ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ）、ＵＴ−２３１Ｂなど；ＫＰＥ−０２００３００２；及びＢＩＶＮ４０１。

免疫調節剤には、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン及びω−インターフェロンを含む天然及び組み換えインターフェロンイソ型化合物、例えばＩｎｔｒｏｎ Ａ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ（登録商標）、Ｃａｎｆｅｒｏｎ−Ａ３００（登録商標）、Ａｄｖａｆｅｒｏｎ（登録商標）、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍｏｆｅｒｏｎ（登録商標）、Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ ＭＰ（登録商標）、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ（登録商標）、ＩＦＮ−ｂｅｔａ（登録商標）及びＦｅｒｏｎ（登録商標）；ポリエチレングリコール誘導体化（ポリエチレングリコール化）インターフェロン化合物、例えばＰＥＧ インターフェロン−α−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））、ＰＥＧ インターフェロン−α−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））及びポリエチレングリコール化ＩＦＮ−α−ｃｏｎ１；長時間作用性調剤及びインターフェロン化合物の誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｓ）、例えばアルブミン−融合インターフェロン、アルブフェロン α；細胞中のインターフェロンの合成を刺激する化合物、例えばレシクイモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）；インターロイキン；１型ヘルパーＴ細胞反応の発現を強化する化合物、例えばＳＣＶ−０７；ＴＯＬＬ−様受容体アゴニスト、例えばＣｐＧ−１０１０１（アクチロン（ａｃｔｉｌｏｎ））及びイサトリビン（ｉｓａｔｏｒｉｂｉｎｅ）；チモシン α−１；ＡＮＡ−２４５；ＡＮＡ−２４６；ヒスタミン二塩酸塩；プロパゲルマニウム（ｐｒｏｐａｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テトラクロロデカオキシド；アンプリゲン（ａｍｐｌｉｇｅｎ）；ＩＭＰ−３２１；ＫＲＮ−７０００；抗体、例え
ばシバシル（ｃｉｖａｃｉｒ）及びＸＴＬ−６８６５；ならびに予防的及び治療的ワクチン、例えばＩｎｎｏ Ｖａｃ Ｃ及びＨＣＶ Ｅ１Ｅ２／ＭＦ５９が含まれる。

他の抗ウイルス剤にはリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ニタゾクサニド（ｎｉｔａｚｏｘａｎｉｄｅ）；テルビブジン（ｔｅｌｂｉｖｕｄｉｎｅ）；ＮＯＶ−２０５；タリバビリン（ｔａｒｉｂａｖｉｒｉｎ）；内部リボソームエントリーの阻害剤；広範囲ウイルス阻害剤、例えばＩＭＰＤＨ阻害剤ならびにミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）及びＶＸ−４９７（メリメポジブ（ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ））、ＶＸ−１４８及び／又はＶＸ−９４４を含むがこれらに限られないその誘導体；あるいは上記のいずれかの組み合わせが含まれる。

該組み合わせ中で用いるための特定の薬剤には、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、ポリエチレングリコール化インターフェロン−α又はリバビリンならびにＨＣＶエピトープを標的とする抗体、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ＳｉＲＮＡ）、リボザイム、ＤＮＡザイム、アンチセンスＲＮＡ、例えばＮＳ３プロテアーゼ、ＮＳ３ヘリカーゼ及びＮＳ５Ｂポリメラーゼの低分子アンタゴニストに基づく治療薬が含まれる。

さらに別の側面において、本明細書で規定される式Ｉの化合物及び抗−ＨＩＶ化合物の組み合わせを提供する。後者は、好ましくは薬剤代謝及び／又は薬物動態学にバイオアベイラビリティーを向上させる正の効果を有するＨＩＶ阻害剤である。そのようなＨＩＶ阻害剤の例はリトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）である。従って本発明は、（ａ）式Ｉの化合物又はその製薬学的に許容され得る塩もしくは溶媒和物；及び（ｂ）リトナビル又はその製薬学的に許容され得る塩を含んでなる組み合わせをさらに提供する。化合物リトナビル、その製薬学的に許容され得る塩ならびにその製造方法は、国際公開第９４／１４４３６号パンフレットに記載されている。米国特許第６，０３７，１５７号明細書及びそこで引用されている参照文献：米国特許第５，４８４，８０１号明細書、米国特許第０８／４０２，６９０号明細書、国際公開第９５／０７６９６号パンフレット及び国際公開第９５／０９６１４号パンフレットは、リトナビルの好ましい投薬形態物を開示している。

本発明は、上記で規定した式Ｉの化合物及び他の薬剤、例えば抗−ＨＣＶもしくは抗−ＨＩＶ剤を含む抗ウイルス剤、特に上記のものを組み合わせる段階を含んでなる本明細書に記載の組み合わせの調製方法にも関する。

該組み合わせは、ＨＣＶに感染した哺乳類におけるＨＣＶ感染の処置のための薬剤の製造において用途を見出すことができ、該組み合わせは特に上記で規定した式Ｉの化合物ならびにインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、ポリエチレングリコール化インターフェロン−α又はリバビリンを含んでなる。あるいは本発明は、本明細書に規定される組み合わせの有効量をＨＣＶに感染した哺乳類に投与することを含んでなる、ＨＣＶに感染した哺乳類、特に人間の処置方法を提供する。特に該処置は該組み合わせの全身的投与を含んでなり、有効量は、ＨＣＶ感染と関連する臨床的状態の処置において有効である量である。

１つの態様において、上記で記載した活性成分及び上記で記載した担体を含む製薬学的組成物の形態で上記の組み合わせを調製する。活性成分のそれぞれを別に調製し、調剤を共−投与することができるか、あるいは両方及び必要ならさらに別の活性成分を含有する１つの調剤を与えることができる。前者の場合、ＨＣＶ治療における同時、個別もしくは逐次的使用のための組み合わせ調製物として組み合わせを調製することもできる。該組成物は上記の形態のいずれをとることもできる。１つの態様において、両方の成分を固定投薬組み合わせ（ｆｉｘｅｄ ｄｏｓａｇｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のような１つの投
薬形態物において調製する。特別な態様において、本発明は（ａ）可能な立体異性体を含む式Ｉの化合物又はその製薬学的に許容され得る塩もしくはその製薬学的に許容され得る溶媒和物の治療的に有効な量ならびに（ｂ）リトナビル又はその製薬学的に許容され得る塩の治療的に有効な量ならびに（ｃ）担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。

本発明の組み合わせのそれぞれの成分を、治療の経過中の異なる時点に個別に、あるいは分けられたもしくは単一の組み合わせ形態において同時に投与することができる。本発明はすべてのそのような同時もしくは交互処置の管理を包含するものとし、「投与する」という用語はそれに従って解釈されるべきである。好ましい態様において、個別の投薬形態物が同時に投与される。

１つの態様において、本発明の組み合わせは、式Ｉの化合物のバイオアベイラビリティーを、単独で該式Ｉの化合物が投与される時のバイオアベイラビリティーに対して臨床的に向上させるのに十分である量のリトナビル又はその製薬学的に許容され得る塩を含有する。あるいは本発明の組み合わせは、ｔ_１／２、Ｃ_ｍｉｎ、Ｃ_ｍａｘ、Ｃ_ｓｓ、１２時間におけるＡＵＣ又は２４時間におけるＡＵＣから選ばれる式Ｉの化合物の薬物動態学的変数の少なくとも１つを、単独で式Ｉの化合物が投与される時の該少なくとも１つの薬物動態学的変数に対して向上させるのに十分である量のリトナビル又はその製薬学的に許容され得る塩を含有する。

本発明の組み合わせを、該組み合わせ中に含まれる各成分に関して特異的な投薬量範囲内で人間に投与することができる、例えば上記で規定した式Ｉの化合物及びリトナビル又は製薬学的に許容され得る塩は、０．０２〜５．０ｇ／日の範囲内の投薬量レベルを有していることができる。式Ｉの化合物対リトナビルの重量比は、約３０：１〜約１：１５又は約１５：１〜約１：１０又は約１５：１〜約１：１又は約１０：１〜約１：１又は約８：１〜約１：１又は約５：１〜約１：１又は約３：１〜約１：１又は約２：１〜１：１の範囲内であることができる。式Ｉの化合物及びリトナビルを１日１回もしくは２回、好ましくは経口的に共−投与することができ、ここで投薬量当たりの式Ｉの化合物の量は上記の通りであり；そして投薬量当たりのリトナビルの量は１〜約２５００ｍｇ又は約５０〜約１５００ｍｇ又は約１００〜約８００ｍｇ又は約１００〜約４００ｍｇ又は４０〜約１００ｍｇのリトナビルである。

本明細書で引用するすべての参照文献は、引用することによりその記載事項が本発明の内容となる。

実施例
以下の実施例において、化合物名はＣｈｅｍｄｒａｗ Ｕｌｔｒａ^ＴＭ ソフトウェア，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｏｆｔ，ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０．７により作成された（ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）。

４−アミノ−１−（７−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−５−オキサ−スピロ［２．４］ヘプチ−４−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（１）

段階１：１−（（６ａＲ，８Ｒ，９Ｒ，９ａＳ）−９−ヒドロキシ−２，２，４，４−テトライソプロピル−６ａ，８，９，９ａ−テトラヒドロ−６Ｈ−フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン−８−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ−１）
ピリジン（３００ｍＬ）中のＤ−ウリジン（２０ｇ）及び１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（１．０１８当量）の混合物を、室温で６４時間撹拌した。ピリジンを真空中（３０℃）で除去した。残留物を１００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中に再溶解し、水で洗浄し（３ｘ７５ｍＬ）、無水ＭｇＳＯ_４を用いて乾燥し、濾過し
た。濾液を蒸発乾固し、次の反応においてそのまま用いた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．１６分，ｍ／ｚ：４８７（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階２：１−（（６ａＲ，８Ｒ，９ａＲ）−２，２，４，４−テトライソプロピル−９−オキソテトラヒドロ−６Ｈ−フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン−８−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ−２）
中間体Ｉ−１（１９．９３ｇ）を２００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解し、ピリジン（１当量）及び無水酢酸（２．９１当量）を加え、続いてＣｒＯ_３（２．７５当量）を加えた。混合物を室温で撹拌し、３０分後に穏やかな還流が観察された。９０分撹拌した後、ＬＣ−ＭＳは反応生成物Ｉ−２が生成し（５０％）、且つ出発材料Ｉ−１が残っている（５０％）ことを示した。２時間の追加の撹拌は５５％の生成物Ｉ−２を生じ、４５％のＩ−１が残った。さらに１０ｍＬのピリジン、５ｍＬの無水酢酸及び５グラムのＣｒＯ_３を加え、混合物をさらに室温で終夜撹拌した。ＬＣ−ＭＳは少しの進行を示した。暗褐色の溶液を１３００ｍＬの酢酸エチル中に注ぎ、残留物をジカライトのパッドを介して濾過した。沈殿を追加の酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を蒸発乾固した。ＣＨ_２Ｃｌ_２からＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル １：１を用いるカラムクロマトグラフィーにより、中間体Ｉ−２を精製した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、２個のスポットを示した。従ってヘプタンからヘプタン／アセトン ７：３を用いるカラムクロマトグラフィーにより中間体Ｉ−２を再精製した。生成物を含有する画分を集め、蒸発させ、８．５グラムの白色の固体（Ｉ−２）を生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．３１分，ｍ／ｚ：４８５（Ｍ＋Ｈ）^＋，注：ケトンの水和物も観察された：ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．２０分，ｍ／ｚ：５０３（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階３：１−（（６ａＲ，８Ｒ，９ａＳ）−２，２，４，４−テトライソプロピル−９−メチレンテトラヒドロ−６Ｈ−フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン−８−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ−３）
ＮａＨ（０．８９７ｇ）を１５ｍＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に懸濁させ、Ａｒ下で６５℃に１．５時間加熱した。メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（１２．８４ｇ）を撹拌しながら加え、続いて３０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ及び１５ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた。混合物を室温で１．５時間撹拌した。黄／オレンジ色の混合物が生成した。次いで２０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中に溶解された中間体Ｉ−２（６．９７ｇ）を、シリンジを介して滴下し、全体を室温で１．５時間及び次いで５０℃で１時間撹拌した。次いで混合物を室温に冷ました。ジカライトの栓上で沈殿を濾過し、濾液を濃縮し（ＴＨＦを除去するため）、残留物をＣＨＣｌ_３と水（それぞれ３００ｍＬ）に分配した。有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ_３で再抽出した。合わせた層をジカライトの栓上で濾過し、濃縮した。生成物を、溶離剤としてＣＨ_２Ｃｌ_２からＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル ７：３を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。蒸発は２．９７ｇの中間体Ｉ−３を白色の固体として生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．５６分，ｍ／ｚ：４８３（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階４：３−ベンゾイル−１−（（６ａＲ，８Ｒ，９ａＳ）−２，２，４，４−テトライソプロピル−９−メチレンテトラヒドロ−６Ｈ−フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン−８−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ−４）
中間体Ｉ−３（２．４ｇ）を２０ｍＬの乾燥ピリジンと一緒に２回蒸発させた。次いでそれを３０ｍＬの乾燥ピリジン中に再溶解した。ジ−イソプピルエチルアミン（３当量）を加え、続いてベンゾイルクロリド（１．５当量）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した。ピリジンを真空中で３０℃より低温において蒸発させ、１５０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２を加えた。得られる混合物を５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３で２回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させ、残留物を真空中で６４時間乾燥した。中間体Ｉ−
４を、溶離剤としてＣＨ_２Ｃｌ_２からＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル ８：２を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。蒸発の後、２．８９ｇのＩ−４が白色の泡として得られた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．７９分，ｍ／ｚ：５８７（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階５：３−ベンゾイル−１−（（３’Ｒ，６ａＲ，８Ｒ，９ａＳ）−２，２，４，４−テトライソプロピル−４’，５’，６，６ａ，８，９ａ−ヘキサヒドロスピロ［フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン−９，３’−ピラゾール］−８−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン及びそのエピマー、３−ベンゾイル−１−（（３’Ｓ，６ａＲ，８Ｒ，９ａＳ）−２，２，４，４−テトライソプロピル−４’，５’，６，６ａ，８，９ａ−ヘキサヒドロスピロ［フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン−９，３’−ピラゾール］−８−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ−５）
ジエチルエーテル及び２−（２−エトキシエトキシ）エタノール中のＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−ｐ−トルエンスルホンアミド（ＤＩＡＺＡＬＤ）（４．８６２ｇ）及びＫＯＨ（２．９ｇ）から生成するジアゾメタンを、氷−水浴中で冷却されたジエチルエーテル（２０ｍＬ）中のＩ−４（１．０７２ｇ）の撹拌溶液中に蒸留した。蒸留が完了したら、ＴＬＣ又はＬＣ−ＭＳが反応の完了を示すまで、黄色の溶液を室温で撹拌した。混合物を蒸発乾固して、１．１４９ｇの白色の泡を生じた。ＬＣ−ＭＳはエピマー（Ｉ−５）の３：１混合物を示し、それを次の反応においてそのまま用いた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．６７及び３．６８分，ｍ／ｚ：６２９（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階６：３−ベンゾイル−１−（（６ａ’Ｒ，８’Ｒ，９ａ’Ｓ）−２’，２’，４’，４’−テトライソプロピルヘキサヒドロスピロ［シクロプロパン−１，９’−フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン］−８’−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ−６）
５ｍＬの乾燥ベンゼン／ＣＨ_３ＣＮ １：１中に溶解された中間体Ｉ−５（２５０ｍｇ）及びベンゾフェノン（１当量）の混合物を、Ａｒ下に室温で撹拌した。ＬＣ−ＭＳが出発材料の完全な転換を示すまで、１５０Ｗのハロゲンランプを用いて混合物を照射した。混合物を蒸発乾固し、溶離剤としてＣＨ_２Ｃｌ_２を用いるカラムクロマトグラフィーにより中間体Ｉ−６を精製した。純粋な画分の蒸発の後、Ｉ−６を透明な油として得た（１５０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．９１分，ｍ／ｚ：６０１（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階７：１−（（６ａ’Ｒ，８’Ｒ，９ａ’Ｓ）−２’，２’，４’，４’−テトライソプロピルヘキサヒドロスピロ［シクロプロパン−１，９’−フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン］−８’−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（Ｉ−７）
中間体Ｉ−６（１５０ｍｇ）を３ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中に溶解し、１０ｍＬのＮＨ_３／メタノールを加えた。混合物を１時間撹拌し、蒸発乾固し、溶離剤としてＣＨ_２Ｃｌ_２からＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル ９：１を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製した。蒸発の後、無色の油が得られ、それはジエチルエーテルを用いる磨砕及び蒸発の後、８７ｍｇの中間体Ｉ−７を白色の泡として生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．６６分，ｍ／ｚ：４９７（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階８：４−アミノ−１−（（６ａ’Ｒ，８’Ｒ，９ａ’Ｓ）−２’，２’，４’，４’−テトライソプロピルヘキサヒドロスピロ［シクロプロパン−１，９’−フロ［３，２−ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン］−８’−イル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オン（Ｉ−８）
Ｉ−７（１．０ｇ）の溶液を２０ｍＬの乾燥ピリジン中に溶解し、溶液を氷−浴中で冷却した。４−クロロフェニルホスホロジクロリデート（１．５当量）を滴下し、溶液を５分間冷却して撹拌した。次いでテトラゾール（３当量，ＣＨ_３ＣＮ中の０．４５Ｍ溶液）
を滴下した。氷−浴を除去し、ＬＣ−ＭＳがさらなる進行を示さなくなるまで、反応を進行させた。さらに１当量の４−クロロフェニルホスホロジクロリデートを加え、混合物を室温でさらに３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、出発材料が残されていないことを示した。混合物を蒸発乾固し（＜４０℃）、残留物をＣＨ_２Ｃｌ_２（７５ｍＬ）中に取り上げ、飽和ＮａＨＣＯ_３で２回洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて有機相を乾燥し、濾過し、蒸発させた。前の反応の残留物を、２５ｍＬのジオキサン中のＮＨ_３溶液（０．５Ｍ）中に溶解した。ＬＣ−ＭＳにより反応が完了したと判断されるまで一定の間隔で、追加のジオキサン中のＮＨ_３を加えた。完了したら、混合物を蒸発乾固した。溶離剤としてＣＨ_２Ｃｌ_２からＣＨ_２Ｃｌ_２／メタノール ９：１を用いるカラムクロマトグラフィーにより中間体Ｉ−８を精製した。蒸発の後、Ｉ−８が黄からオレンジ色の粘着性の固体として得られた（８４０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．４２分，ｍ／ｚ：４９６（Ｍ＋Ｈ）^＋。

段階９：４−アミノ−１−（７−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−５−オキサ−スピロ［２．４］ヘプチ−４−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（１）
中間体Ｉ−８（８４０ｍｇ）を２５ｍＬのＴＨＦ中に溶解した。テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ；２当量）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで真空中で蒸発させた。溶離剤としてＣＨＣｌ_３／メタノール ９：１からＣＨＣｌ_３／メタノール ３：１を用いるカラムクロマトグラフィーにより、化合物を２回精製した。生成物含有画分の蒸発の後、化合物１（３００ｍｇ）が白色の固体として得られた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：１．２５分，ｍ／ｚ：２５４（Ｍ＋Ｈ）^＋。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ ０．３１−０．５９（ｍ，３Ｈ），０．９３−１．０２（ｍ，１Ｈ），３．５１−３．６５（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｄ，Ｊ＝４．８９Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｔ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），４．９８（ｔ，Ｊ＝４．９９Ｈｚ，１Ｈ），５．１２（ｄ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ，１Ｈ），５．７２（ｄ，Ｊ＝７．４３Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），７．１３（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．２４Ｈｚ，１Ｈ）。

（２Ｓ）−ベンジル ２−（（（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−７−ヒドロキシ−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−６−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル）アミノ）プロパノエート（２ａ）

化合物１（１００ｍｇ）を、（２Ｓ）−ベンジル ２−（クロロ（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（２７９ｍｇ，２．０当量）と一緒に乾燥ＴＨＦ／ピリジン中に溶解した。混合物を−７８℃に冷却した。Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（２５９ｍｇ，８当量）を加え、この混合物を−７８℃で１５分間撹拌し、次いで室温で終夜撹拌した。得られる混合物を蒸発乾固した。１０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、残留物を１０ｍＬの０．５Ｎ ＨＣｌで洗浄した。有機層を分離し、１０ｍＬの水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。溶離剤としてＣＨ_２Ｃｌ_２からＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ ９−１を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより化合物を精製した。（この溶離剤中でＲｆ＝０．２）。黄色の固体が得られ、それを溶離剤としてＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ ８−２を用いるカラムクロマトグラフィーを用いて再精製した。蒸発及び真空中における終夜の乾燥の後、８０ｍｇ（３３．４％）の２ａが得られた（ジアステレオマーの混合物）。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．３７分，ｍ／ｚ：５６９（Ｍ−Ｈ）⁻。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ ０．３１−０．４１（ｍ，１Ｈ），０．４３−０．５８（ｍ，２Ｈ），０．９５−１．０６（ｍ，１Ｈ），１．２０−１．３１（ｍ，３Ｈ），３．８２−４．０１（ｍ，３Ｈ），４．０９−４．２３（ｍ，１Ｈ），４．２３−４．３６（ｍ，１Ｈ），４．９８−５．１５（ｍ，２Ｈ），５．２９−５．３９（ｍ，１Ｈ），５．７０（ｄ，Ｊ＝７．４３Ｈｚ，１Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），６．１３（ｄｄ，Ｊ＝１２．８１，１０．４７Ｈｚ，１Ｈ），７．０８−７．２５（ｍ，６Ｈ），７．２９−７．３９（ｍ，６Ｈ），７．５４（ｄ，１Ｈ）。

類似の方法で以下の化合物を製造した：
（２Ｓ）−ベンジル ２−（（（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−７−ヒドロキシ−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−６−イル）メトキシ）（４−クロロフェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（２ｂ）

ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．６５分，ｍ／ｚ：６０３（Ｍ−Ｈ）⁻。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ ０．３０−０．４３（ｍ，１Ｈ），０．４４−０．６０（ｍ，２Ｈ），０．９５−１．０６（ｍ，１Ｈ），１．２０−１．３１（ｍ，３Ｈ），３．８４−４．０１（ｍ，３Ｈ），４．０９−４．２３（ｍ，１Ｈ），５．０４−５．１４（ｍ，２Ｈ），５．２９−５．３９（ｍ，１Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝７．６３Ｈｚ，１Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），６．１２−６．２７（ｍ，１Ｈ），７．０８−７．２６（ｍ，５Ｈ），７．２７−７．４３（ｍ，７Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝７．２４Ｈｚ，１Ｈ）。

（２Ｓ）−エチル ２−（（（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソピ
リミジン−１（２Ｈ）−イル）−７−ヒドロキシ−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−６−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）−３−フェニルプロパノエート（２ｃ）

（２Ｓ）−メチル ２−（（（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−７−ヒドロキシ−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−６−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（２ｄ）

（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−６−（イソブチリル−オキシメチル）−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−７−イルイソブチレート（３）

中間体Ｉ−７（１１．００ｇ，２２．１４ミリモル）をＴＨＦ（２８０ｍＬ）中に溶解し、ＴＢＡＦ（５９．８ｍＬ，５９．８ミリモル）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。ピリジン、メタノール及び水の混合物（８０ｍＬ，３：１：１）を加え、続いてピリジン、メタノール及び水の混合物（３２０ｍＬ，３：１：１）中の強力に酸性のカチオン交換剤、Ｄｏｗｅｘ ５０ Ｗｘ４（１２８ｇ）を加えた。反応混合物を４５分間撹拌し、濾過した。Ｄｏｗｅｘ残留物をピリジン、メタノール及び水の混合物（３２０ｍＬ，３：１：１）で２回洗浄し、合わせた濾液を減圧下で濃縮した。混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより、酢酸エチル中の０から１０％メタノールの勾配溶離によって精製し、中間体Ｉ−９（５．５９７ｇ，８４％）を白色の泡として生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：２．０５分，ｍ／ｚ＝２５３（Ｍ−Ｈ）⁻。

中間体Ｉ−９（５．１６ｇ，２０．３０ミリモル）を乾燥ピリジン（１００ｍＬ）中に溶解し、冷水を用いて外部から溶液を冷却した。イソ酪酸無水物（１６．８５ｍＬ，１０１ミリモル）を加え、室温で終夜反応を進行させた。再び反応物を冷水で外部から冷却し、メタノールの添加により過剰のイソ酪酸無水物をクエンチングした。室温で２０分間撹拌し、揮発性物質を蒸発させた後、酢酸エチルを加え、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２ｘ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、真空中で濃縮して、Ｉ−１０（７．６８ｇ，９６％）を白色の固体として与えた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：２．２６分，ｍ／ｚ＝
３９３（Ｍ−Ｈ）⁻。

乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）中のＩ−１０（７．６８ｇ，１９．４７ミリモル）、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（１５．２０ｇ，２２０ミリモル）及びトリエチルアミン（３０．７ｍＬ，２２０ミリモル）の冷却された混合物に、ＰＯＣｌ_３（４．７２ｍＬ，５０．６ミリモル）を加えた。混合物を室温で２．５時間撹拌した。冷水の添加により過剰のＰＯＣｌ_３をクエンチングし、有機層を分離し、真空中で濃縮した。混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより、ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル９０：１０から８５：１５の勾配溶離によって精製し、中間体Ｉ−１１（７．５ｇ，８６％）を生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：２．３８分，ｍ／ｚ＝４４６（Ｍ＋Ｈ）^＋。

中間体Ｉ−１１（７．４９ｇ，１６．８１ミリモル）をＴＨＦ（２００ｍＬ）中に溶解し、濃ＮＨ_４ＯＨ水溶液（１５ｍＬ）で処理した。３．５時間後、揮発性物質を減圧下で除去した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の０から５％メタノールを用いる勾配溶離によって、混合物を精製した。生成物を酢酸エチル中に溶解し、混合物を水（２ｘ）及びブライン（２ｘ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過の後、真空中で濃縮し、化合物３（５．５９７ｇ，８４％）を白色の泡として生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：１．９５分，ｍ／ｚ＝３９４（Ｍ＋Ｈ）^＋。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ ０．３６−０．４６（ｍ，１Ｈ）０．６４−０．７５（ｍ，１Ｈ）０．７７−０．９２（ｍ，２Ｈ）１．０６−１．１５（ｍ，１２Ｈ）２．５３−２．６６（ｍ，２Ｈ）４．１８−４．３６（ｍ，３Ｈ）４．９８−５．０２（ｍ，１Ｈ）５．７７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）６．２５（ｓ，１Ｈ）７．２５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）７．２９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）７．５５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）

（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−７−ヒドロキシ−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−６−イル）メチルイソブチレート（４）

乾燥ピリジン（１５ｍＬ）中の中間体Ｉ−９（３５０ｍｇ，１．３７７ミリモル）の溶液を氷−水浴上で冷却し、（クロロ（４−メトキシフェニル）メチレン）ジベンゼン（９００ｍｇ，２．９１ミリモル）を加えた。反応混合物を融解する氷−水浴上に放置し、次いで室温で終夜撹拌した。過剰のメタノールを加え、３０分後、反応混合物を濃縮し、乾燥し、次の反応においてそのまま用いた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：２．４８分，ｍ／ｚ＝５２５（Ｍ−Ｈ）⁻。

乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の上記の残留物の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルクロロジメチルシラン（ＴＢＤＭＳＣＩ；３１１ｍｇ，２．０６５ミリモル）及びイミダゾール（１６９ｍｇ，２．４７８ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。翌日の間に合計で６当量のＴＢＤＭＳＣＩ及びイミダゾールを加え、さらに終夜撹拌を続けた。メタノールを用いて混合物をクエンチングし、揮発性物質を部分的に除去し、酢酸エチルで希釈し、混合物を水（２ｘ）及びブラインで洗浄した。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過の後、真空中で濃縮した。混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより、ＣＨ_２Ｃｌ_２からＣＨ_２Ｃｌ_２／メタノール １９：１を用いる勾配溶離によって精製し、中間体Ｉ−１３を生じ、それをそのまま続く反応において用いた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．７０分，ｍ／ｚ＝６３９（Ｍ−Ｈ）⁻。

中間体Ｉ−１３を８０％酢酸水溶液（１０ｍＬ）中に溶解し、混合物を室温で撹拌した。８時間後、揮発性物質を蒸発させ、混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより、ＣＨ_２Ｃｌ_２から４％メタノール／ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いる勾配溶離よって精製した。溶媒の蒸発は中間体Ｉ−１４（３１８ｍｇ，７３％）を与えた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：２．４６分，ｍ／ｚ＝３６７（Ｍ−Ｈ）⁻。

中間体Ｉ−１４（３１８ｍｇ，０．８６３ミリモル）を乾燥ピリジン（８ｍＬ）中に溶解し、冷水を用いて溶液を外部から冷却した。シリンジを介してイソ酪酸無水物（４３０μｌ，２．５９ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。メタノールの添加により過剰のイソ酪酸無水物をクエンチングし、次いで揮発性物質を除去した。酢酸エチルを加え、溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過の後、真空中で濃縮し、中間体Ｉ−１５（３０７ｍｇ，８１％）を生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．０分，ｍ／ｚ＝４３７（Ｍ−Ｈ）⁻。

中間体Ｉ−１５（３０７ｍｇ，０．７００ミリモル）、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（５４６ｍｇ，７．９１ミリモル）及びトリエチルアミン（１．１ｍＬ，７．９１ミリモル）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（７ｍＬ）中に溶解し、０℃で冷却した。反応温度を２５℃より低く保ちながら、ＰＯＣｌ_３（０．１７０ｍＬ，１．８２０ミリモル）を加えた。混合物を終夜撹拌した。３．０当量の１Ｈ−１，２，４−トリアゾール及びトリエチルアミンならびにＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）を加え、混合物を室温でさらに３時間撹拌した。冷水を注意深く加えることにより、過剰のＰＯＣｌ_３をクエンチングした。有機低層を分離し、真空下における蒸発により濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、ＣＨ_２Ｃｌ_２から４％メタノール／ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いる勾配溶離によって混合物を精製し、中間体Ｉ−１６（２００ｍｇ，５８％）を生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．０９分，ｍ／ｚ＝４９０（Ｍ＋Ｈ）^＋。

中間体Ｉ−１６（２００ｍｇ，０．４０８ミリモル）をＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解し、濃ＮＨ_４ＯＨ水溶液（０．５ｍＬ）で処理した。７時間後、揮発性物質を除去し、混合物を減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、ＣＨ_２Ｃｌ_２から５％メタノール／ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いる勾配溶離によって混合物を精製した。溶媒の蒸発の後、中間体Ｉ−１７（１７９ｍｇ，１００％）が得られた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：２．７４分，ｍ／ｚ＝４３８（Ｍ＋Ｈ）^＋。

ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の中間体Ｉ−１７（１７９ｍｇ，０．４０９ミリモル）及び酢酸（１４７ｍｇ，２．４５４ミリモル）の溶液に、ＴＢＡＦ（１２２７μＬ，１．２２７ミリモル，ＴＨＦ中の１Ｍ）を加えた。混合物を室温で撹拌した。撹拌を２時間続け、次いで溶媒を除去した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、メタノール／ＣＨ_２Ｃｌ_２４％から８％を用いる勾配溶離によって混合物を精製した。生成物（１００ｍｇ）をＴＨＦ
（１０ｍＬ）中のＣａＣＯ_３（６０ｍｇ）及びＤｏｗｅｘ ５０ Ｗｘ４（２００ｍｇ）と混合し、室温で２時間撹拌した。混合物を濾過し、揮発性物質の蒸発の後、シリカゲルクロマトグラフィー（勾配溶離：クロロホルム中の０から１５％メタノール）によって再精製し、化合物４を白色の固体として生じた（５９ｍｇ，４４％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：１．０８分，ｍ／ｚ＝３２４（Ｍ＋Ｈ）^＋。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ ０．３６−０．４５（ｍ，１Ｈ）０．４６−０．５７（ｍ，２Ｈ）０．９６−１．０５（ｍ，１Ｈ）１．１０（ｄ（ａｐｐ．）），Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）２．５８（ｈ（ａｐｐ．）），Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ）３．８６−３．９１（ｍ，１Ｈ）３．９７−４．０１（ｍ，１Ｈ）４．２１（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．９Ｈｚ，１Ｈ）４．３３（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．３Ｈｚ，１Ｈ）５．３４（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）５．７４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ）７．０６−７．２８（ｍ，２Ｈ）７．５７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）。

（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−７−イルイソブチレート（５）

中間体Ｉ−１２（２５０ｍｇ，０．４７５ミリモル）を乾燥ピリジン（１０ｍＬ）中に溶解し、冷水を用いて溶液を外部から冷却した。シリンジを介してイソ酪酸無水物（２３６μｌ，１．４２４ミリモル）を溶液に加え、反応物を室温で２時間撹拌した。さらにイソ酪酸無水物（２３６μｌ，１．４２４ミリモル）を加え、混合物をさらに２時間撹拌した。さらにイソ酪酸無水物（２３６μｌ，１．４２４ミリモル）を加え、混合物を終夜撹拌した、続いてメタノールの添加により過剰のイソ酪酸無水物をクエンチングした。溶液を室温で２０分間撹拌し、次いで濃縮乾固した。残留物を酢酸エチル（３０ｍＬ）中に取り上げ、溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、固体を濾過し、溶媒を蒸発により除去した。Ｉ−１８を無色の油として生じ、それを次の反応においてそのまま用いた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：３．０７分。

反応温度を２５℃より低く保ちながら、中間体Ｉ−１８（２５０ｍｇ，０．４１９ミリモル）、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（３２７ｍｇ，４．７３ミリモル）、トリエチルアミン（６６１μｌ，４．７３ミリモル）及びＣＨ_２Ｃｌ_２（６．０ｍＬ）の冷却された混合物にＰＯＣｌ_３（１０２μｌ，１．０８９ミリモル）を加えた（白色の沈殿を生じた）。反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応が完了したら、冷Ｈ_２Ｏの注意深い添加
により過剰のＰＯＣｌ_３をクエンチングした。有機層を分離し、真空下における蒸発により濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、勾配溶離ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル
９０：１０から８５：１５によって混合物を精製し、中間体Ｉ−１９を油として生じた（２００ｍｇ，７４％）。：Ｒｔ：３．１５分。

中間体Ｉ−１９（２００ｍｇ，０．３０９ミリモル）をＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解し、濃ＮＨ_４ＯＨ水溶液（０．６ｍＬ）で処理した。４時間後、さらなる濃ＮＨ_４ＯＨ水溶液（０．３ｍＬ）を加え、混合物を終夜撹拌した。溶媒を真空中で除去し、油を酢酸エチル中に取り上げ、水及びブラインで洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４を用いる乾燥、濾過及び揮発性物質の蒸発の後、残留物（Ｉ−２０）を次の反応においてそのまま用いた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：２．８６分，ｍ／ｚ＝５９４（Ｍ−Ｈ）⁻。

中間体Ｉ−２０（１８０ｍｇ，０．３０２ミリモル）を８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を室温で撹拌した。９時間後、揮発性物質を除去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより、ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％から１５％メタノールを用いる勾配溶離によって混合物を精製した。得られる残留物を、ｉＰｒ_２Ｏを用いて磨砕し、真空中で乾燥した。化合物５（６０．８ｍｇ，６２％）を生じた。ＬＣ−ＭＳ：Ｒｔ：１．２５分，ｍ／ｚ＝３２４（Ｍ＋Ｈ）^＋。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ ０．３３−０．４１（ｍ，１Ｈ）０．６２−０．７１（ｍ，１Ｈ）０．７４−０．８２（ｍ，２Ｈ）１．０８−１．１４（ｍ，６Ｈ）２．５５−２．６４（１Ｈ，ｍ）３．６２−３．６８（ｍ，２Ｈ）３．９９−４．０４（ｍ，１Ｈ）４．９８−５．０３（ｍ，１Ｈ）５．１２（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）５．７６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）６．２７（ｓ，１Ｈ）７．１４−７．３３（ｍ，２Ｈ）７．８０（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）

（２Ｓ）−ベンジル ２−（（（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−７−ヒドロキシ−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−６−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル−アミノ）プロパノエートのイソブチリルエステル（６）

化合物５を乾燥ＴＨＦ／ピリジン中に、（２Ｓ）−ベンジル ２−（クロロ（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（２．０当量）と一緒に溶解した。混合物を−７８℃に冷却した。Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）（８当量）を加え、混合物を−７８℃で１５分間撹拌し、次いで室温で終夜撹拌した。混合物を蒸発乾固した。１０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、残留物を１０ｍＬの０．５Ｎ ＨＣｌで洗浄した。有機層を分離し、１０ｍＬの水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。溶離剤としてＣ
Ｈ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨの勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより化合物を精製した。

同じ方法に従い、しかし（２Ｓ）−エチル ２−（クロロ（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエートから出発して、（２Ｓ）−エチル ２−（（（（４Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４−（４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−７−ヒドロキシ−５−オキサスピロ［２．４］ヘプタン−６−イル）メトキシ）（フェノキシ）ホスホリル−アミノ）プロパノエートのイソブチリルエステル（７）も製造した：

生物学的実施例
レプリコンアッセイ
ＨＣＶ ＲＮＡ複製の阻害における活性に関し、ＨＣＶレプリコンとしても知られるＨＣＶ機能性細胞複製細胞系を阻害する化合物の同定を目的とする細胞アッセイにおいて式Ｉの化合物を調べた。細胞アッセイは、多重−標的スクリーニング（ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）戦略において、Ｋｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：２００１年，４６１４−４６２４により記載された修正を有するＬｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２８５：１９９９年，１１０−１１３により記載されたビシストロン性発現構築物（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に基づいた。

アッセイは、安定にトランスフェクションされた細胞系Ｈｕｈ−７ ｌｕｃ／ｎｅｏ（下記でＨｕｈ−Ｌｕｃと呼ぶ）を使用した。この細胞系は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）からの内部リボソーム侵入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）から翻訳された型１ｂＨＣＶの野生型ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域を含んでなり、それにリポーター部分(ＦｆＬ−ルシフェラーゼ）及び選択可能マーカー部分（ｎｅｏ^Ｒ，ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）が先行しているビシストロン性発現構築物をコードするＲＮＡを宿している。構築物は型１ｂＨＣＶからの５’及び３’ＮＴＲｓ（非−翻訳領域）により境界付けられている。Ｇ４１８（ｎｅｏ^Ｒ）の存在下におけるレプリコン細胞の培養の継続は、ＨＣＶ ＲＮＡの複製に依存する。自律的に且つ高いレベルまで複製され、中でもルシフェラーゼをコードするＨＣＶ ＲＮＡを発現する安定にトランスフェクションされたレプリコン細胞を、抗ウイルス性化合物のスクリーニングに用いた。

レプリコン細胞を、種々の濃度で加えられる試験化合物及び標準化合物の存在下で３８４ウェルプレートにおいて平板培養した。３日間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼ活性のアッセイ（標準的なルシフェラーゼアッセイ基質及び試薬ならびにＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶｉｅｗＬｕｘ^ＴＭ ｕｌｔｒａＨＴＳ ミクロプレートイメージャーを用いて）によりＨＣＶ複製を測定した。標準培養中のレプリコン細胞は、阻害剤の不在
下で高いルシフェラーゼ発現を有した。ルシフェラーゼ活性への化合物の阻害活性をＨｕｈ−Ｌｕｃ細胞上で監視し、各試験化合物に関する用量−反応曲線を可能にした。次いでＥＣ５０値を計算し、その値は、検出されるルシフェラーゼ活性、あるいはもっと特定的に、遺伝子的に連鎖したＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製する能力のレベルを５０％低下させるのに必要な化合物の量を示す。

細胞毒性
Ｈｕｈ７−ＣＭＶ−Ｌｕｃレプリコンアッセイにおいて、細胞毒性を決定した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）構成的プロモーターの制御下でルシフェラーゼリポーター遺伝子を用いて安定に形質転換されたたレプリコン細胞（ウェル当たり２５００個の細胞）を、試験化合物の濃厚液の存在下又は不在下で培養した。加湿された５％ＣＯ_２雰囲気下に３７℃において３日間インキュベーションした後、Ｌｕｃ活性の測定により細胞増殖を定量し、ＣＣ_５０値（細胞毒性，細胞成長の５０％阻害濃度）として表わした。３８４−ウェルプレートにおいて試験を行った。

ＨＩＶアッセイ
本発明の化合物を、野生型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するそれらの力価に関して調べた。以下の方法に従って行われる細胞アッセイを用いて、抗ウイルス活性を評価した。ヒトＴ−細胞系ＭＴ４を、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）及びＨＩＶ−特異的プロモーター、ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）を用いて処理した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。ＭＴ４ ＬＴＲ−ＥＧＦＰと称されるこの細胞系を、研究化合物の抗−ＨＩＶ活性の試験管内評価のために用いることができる。ＨＩＶ−１に感染した細胞において、Ｔａｔタンパク質が生産され、それはＬＴＲプロモーターを上方調節し（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ）、結局ＧＦＰリポーター生産の刺激に導き、進行するＨＩＶ−感染を蛍光測定により測定することを可能にする。５０％有効濃度（ＥＣ５０）のような有効濃度値を決定することができ、それは通常μＭにおいて表わされる。ＥＣ５０値は、ＨＩＶ−感染細胞の蛍光を５０％低下させる試験化合物の濃度として定義される。走査型顕微鏡を用いてＨＩＶ−１感染の監視を行った。画像分析は、ウイルス感染の非常に敏感な検出を可能にする。通常感染から約５日後に起こる細胞壊死の前に測定を行い、特に感染から３日後に測定を行った。表中の欄ＩＩＩＢは、野生型株ＩＩＩＢに対するＥＣ_５０値を挙げている。

以下の表中の結果は、本発明の化合物がＨＣＶに対する活性を示すが、ＨＩＶに対する活性がないことを示している。それらは毒性の点で好ましい結果を示し、許容され得る選択指数（ＥＣ_５０とＣＣ_５０の間の比）を有する。

Claims (17)

1. いずれかの可能な立体異性体を含む式Ｉ：
   

   

   ［式中：
   Ｒ^２は水素又はＣ_１−Ｃ_４アルキルであり；
   Ｒ^３及びＲ^４は独立して水素、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５及び−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２より成る群から選ばれるか；あるいは
   Ｒ^３は水素であり、そしてＲ^４はモノホスフェート−、ジホスフェート−もしくはトリホスフェートエステルであるか；あるいはＲ^３は水素、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^５又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２であり、そしてＲ^４は式
   

   

   の基であり、
   各Ｒ^５は独立して水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル及びＣ_３−Ｃ_７シクロアルキルより成る群か
   ら選ばれ；
   Ｒ^６は水素又はＣ_１−Ｃ_６アルキルであり；
   Ｒ^７は場合によりハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_３−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、ヒドロキシ及びアミノからそれぞれ独立して選ばれる１、２又は３個の置換基で置換されていることができるフェニルであるか、あるいはＲ^７はナフチルであるか；あるいはＲ^７はインドリルであり；
   Ｒ^８は水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、ベンジルであり；
   Ｒ^８’は水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、ベンジルであるか；あるいは
   Ｒ^８及びＲ^８’はそれらが結合する炭素原子と一緒になってＣ_３−Ｃ_７シクロアルキルを形成し；
   Ｒ^９はＣ_１−Ｃ_６アルキル、ベンジル又はフェニルであり、ここで該フェニルは場合によりヒドロキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、アミノ、モノ−及びジＣ_１−Ｃ_６アルキルアミノからそれぞれ独立して選ばれる１、２又は３個の置換基で置換されていることができ；
   但しＲ^２、Ｒ^３及びＲ^４はすべてが水素であることはない］
   の化合物又はその製薬学的に許容され得る塩もしくは溶媒和物。
2. Ｒ^２が水素である請求項１に従う化合物。
3. Ｒ^３及びＲ^４が水素である請求項１に従う化合物。
4. Ｒ^３が水素であり、Ｒ^４が式
   

   

   の基である請求項１〜２のいずれかに従う化合物。
5. Ｒ^７が場合によりハロ又はＣ_１−Ｃ_６アルキルで置換されていることができるフェニルであるか、あるいはＲ^７がナフチルである請求項１〜２のいずれか又は請求項４に従う化合物。
6. Ｒ^８が水素であり、Ｒ^８’が水素又はＣ_１−Ｃ_６アルキルである請求項１〜２のいずれか又は請求項４もしくは５に従う化合物。
7. Ｒ^３及びＲ^４の一方が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５であり、Ｒ^３及びＲ^４の他方が水素であるか；あるいはＲ^３及びＲ^４の両方が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５であり；そしてＲ^５がＣ_１−Ｃ_６アルキルである請求項１〜２のいずれか又は請求項４もしくは５に従う化合物。
8. Ｒ^５がイソプロピルである請求項７の化合物。
9. Ｒ^９がＣ_１−Ｃ_６アルキル又はベンジルである請求項１〜２のいずれか又は請求項４〜８に従う化合物。
10. 化合物が式：
    

    

    を有する請求項１の化合物。
11. 化合物が遊離の形態にある請求項１０の化合物。
12. 請求項１〜１１のいずれかで定義された式Ｉの化合物の抗−ウイルス的に有効な量及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
13. ＨＣＶ阻害剤としての使用のための請求項１〜１１のいずれかで定義された式Ｉの化合物。
14. 式Ｉの化合物においてＲ^２、Ｒ^３及びＲ^４がすべて水素である請求項１３に従うＨＣＶ阻害剤としての使用のための式Ｉの化合物。
15. 化合物が遊離の形態にある請求項１４に従うＨＣＶ阻害剤としての使用のための式Ｉの化合物。
16. 請求項１〜１１のいずれかで定義された式Ｉの化合物を別のＨＣＶ阻害剤と一緒に含んでなる製薬学的組成物。
17. （ａ）２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルウリジン１ｆから対応する２’−デオキシ−２’−スピロシクロプロピルシチジン１ｇに、ウラシルからシトシンへの転換反応を行い、続いて保護基ＰＧを除去して化合物Ｉ−ａを与えることにより、ここで式Ｉ−ａにより示されるＲ^３及びＲ^４が両方とも水素である式Ｉの化合物を製造するか：
    

    

    （ｂ）化合物Ｉ−ａを塩基の存在下でホスホロクロリデート２ａと反応させてホスホルアミデートＩ−ｂを与えることにより、Ｒ^３が水素であり、Ｒ^４が
    

    

    である式Ｉの化合物を製造するか：
    

    

    （ｃ）中間体３ａ中の５’−ヒドロキシ基を選択的に保護して中間体３ｂを与え、それを次いで中間体３ｃにエステル化し、続いてウラシルからシトシンへの転換を行って中間体３ｄとし；後者を脱保護して３’−モノエステルＩ−ｃとすることによるか；あるいはＩ−ｃ中の５’−ヒドロキシをエステル化して化合物Ｉ−ｄとすることによるか；あるいは中間体３ａ中の５’−ヒドロキシ基を選択的にエステル化し、かくして基Ｒ^４ａを導入して中間体３ｅを生ぜしめ、中間体３ｅを続いて異なる酸を用いてエステル化し、それにより基Ｒ^３ａを導入してジ−エステル中間体３ｆを与え、それをウラシルからシトシンへの転換に供して化合物Ｉ−ｄを与えることにより、
    式Ｉの化合物を製造し、ここでＲ^１は水素であり、Ｒ^３は水素であり、Ｒ^４はここでＲ^４ａにより示される−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２であり、該化合物は式Ｉ−ｃにより示されるか；あるいはＲ^３及びＲ^４は互いに独立して−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^５又は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２であり、下記でそれぞれＲ^３ａ及びＲ^４ａにより示され、該化合物は式Ｉ−ｄにより示され；且つ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ^６−ＮＨ_２中のアミノ基は、後で除去され得るアミノ保護基で保護されていることができるか：
    

    

    （ｄ）基ＰＧ^ａがＰＧと同じ意味を有するが、それが基ＰＧに対して選択的に切断可能であるように選ばれる以下のスキームにおいて示される通り；中間体３ｂ中の遊離のヒドロキシを、他のヒドロキシ保護基に対して選択的に切断可能なヒドロキシ保護基で保護し、中間体４ａを生ぜしめ；５’−ヒドロキシ保護基を除去して中間体４ｂを与え；後者をエステル化して中間体４ｃとし；後者をウラシルからシトシンへの転換に供し、かくして４’−ヒドロキシ保護シチジン誘導体４ｄを得、それを脱保護して化合物Ｉ−ｅを与えることにより、式Ｉ−ｅにより示されるＲ^１が水素であり、Ｒ^３が水素であり、Ｒ^４が上記で規定した通りのＲ^４ａである式Ｉの化合物を製造するか：
    

    

    （ｅ）中間体３ａ中の両方のヒドロキシ基をエステル化することにより、式Ｉ−ｆにより示されるＲ^３ａ及びＲ^４ａが同じであり、上記で規定した通りである式Ｉの化合物を製造する：
    

    

    請求項１〜１１のいずれかで定義された式Ｉの化合物の製造方法。