JP2801051B2 - 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬 - Google Patents
核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 ここ20年間に亘る分子生物学の分野における進歩は、
患者又は他の被験者から採取された検査試料中の特定の
核酸塩基配列を検出することを可能にしている。このよ
うな検査試料に、血清、尿、大便、組織、唾液、脳脊髄
液、羊水、及びその他の体液を含む。特定の核酸の塩基
配列の検出は、人間における病原菌による疾患及びウィ
ルス性関連疾患の存在を識別するだけでなく、遺伝子異
常又は遺伝病を識別するために使用される。特定の遺伝
子の存在は、癌及び腫瘍遺伝子検査並びに法医学に使用
される遺伝子情報を得るためだけでなく、移植拒絶反応
の原因となる抗原をコードする遺伝子の存在のような他
の関連的な遺伝子情報を得るためにも使用される。
患者又は他の被験者から採取された検査試料中の特定の
核酸塩基配列を検出することを可能にしている。このよ
うな検査試料に、血清、尿、大便、組織、唾液、脳脊髄
液、羊水、及びその他の体液を含む。特定の核酸の塩基
配列の検出は、人間における病原菌による疾患及びウィ
ルス性関連疾患の存在を識別するだけでなく、遺伝子異
常又は遺伝病を識別するために使用される。特定の遺伝
子の存在は、癌及び腫瘍遺伝子検査並びに法医学に使用
される遺伝子情報を得るためだけでなく、移植拒絶反応
の原因となる抗原をコードする遺伝子の存在のような他
の関連的な遺伝子情報を得るためにも使用される。
特定の遺伝子の塩基配列を検出するための量も一般的
な技術は、核酸ハイブリッド形成（nucleic acid hybri
dization）として知られる現象を利用する。ハイブリッ
ド形成とは、非共有結合によって二本鎖核酸又はデュプ
レックスを形成する、特定タイプの、相補的塩基配列に
よる一本鎖ヌクレオチド塩基配列の組換え又はアニーリ
ングを意味する。通常は二本鎖である最初のDNA（デオ
キシリボ核酸）分子鎖が組換えする場合には、その組換
えプロセスは再生（renaturation）と呼ばれる。分子混
合が生じる場合には、そのプロセスはハイブリッド形成
と呼ばれる。ハイブリッド形成は、二本鎖型及び一本鎖
型でともに自然界に頻繁に見出されるRNA（リボ核酸）
の場合にも起こる。DNA:DNA及びRNA:RNAハイブリッドだ
けでなく、DNA:RNAハイブリッドもハイブリッド形成に
よって形成され得る。
な技術は、核酸ハイブリッド形成（nucleic acid hybri
dization）として知られる現象を利用する。ハイブリッ
ド形成とは、非共有結合によって二本鎖核酸又はデュプ
レックスを形成する、特定タイプの、相補的塩基配列に
よる一本鎖ヌクレオチド塩基配列の組換え又はアニーリ
ングを意味する。通常は二本鎖である最初のDNA（デオ
キシリボ核酸）分子鎖が組換えする場合には、その組換
えプロセスは再生（renaturation）と呼ばれる。分子混
合が生じる場合には、そのプロセスはハイブリッド形成
と呼ばれる。ハイブリッド形成は、二本鎖型及び一本鎖
型でともに自然界に頻繁に見出されるRNA（リボ核酸）
の場合にも起こる。DNA:DNA及びRNA:RNAハイブリッドだ
けでなく、DNA:RNAハイブリッドもハイブリッド形成に
よって形成され得る。
典型的なハイブリッド形成技術では、標的核酸塩基配
列の一本鎖形にアニーリング又はハイブリッド形成する
ことによって、興味の対象である遺伝子又は核酸の塩基
配列を捜し出すために、一本鎖のプローブ塩基配列が使
用される。自然界に発生するDNAが典型的にそうである
ように、検査試料中の核酸が二本鎖である場合には、そ
のDNAは、あらゆる形の組換えが起こり得る前に、変性
されなければならず、即ち一本鎖にされなければならな
い。標的塩基配列とは、その標的塩基配列に得に特徴的
な、検索されるべき核酸塩基配列の選択部分である。プ
ローブは、探し求められる遺伝子の標的ヌクレオチド塩
基配列に対して相補的である一本鎖ヌクレオチド塩基配
列であるように選ばれる。このオリゴヌクレオチドのプ
ローブは検出可能な標識でマークされ、検査試料からの
変性核酸（DNA又はRNA）と接触させられる。
列の一本鎖形にアニーリング又はハイブリッド形成する
ことによって、興味の対象である遺伝子又は核酸の塩基
配列を捜し出すために、一本鎖のプローブ塩基配列が使
用される。自然界に発生するDNAが典型的にそうである
ように、検査試料中の核酸が二本鎖である場合には、そ
のDNAは、あらゆる形の組換えが起こり得る前に、変性
されなければならず、即ち一本鎖にされなければならな
い。標的塩基配列とは、その標的塩基配列に得に特徴的
な、検索されるべき核酸塩基配列の選択部分である。プ
ローブは、探し求められる遺伝子の標的ヌクレオチド塩
基配列に対して相補的である一本鎖ヌクレオチド塩基配
列であるように選ばれる。このオリゴヌクレオチドのプ
ローブは検出可能な標識でマークされ、検査試料からの
変性核酸（DNA又はRNA）と接触させられる。
最近まで、水素（3H）、リン（32P）又はヨウ素（125
I）のような原子の放射性同位体が、プローブ標識とし
て主として使用されてきた。しかし、これらのような放
射性化合物は、放射性材料の不安定性に起因する高額の
使用コストはもちろん、評価分析プロトコルの中に大規
模な安全予防策を組み入れる必要性と、並びに、高価な
装置及び特殊な廃棄物手続きの必要性とを含む多くの欠
点を有している。その結果として、放射性同位体標識の
欠点を有しない、それに代わる標識法を開発する努力
が、近年になって益々増加してきている。従って現在で
は、放射性標識に加えて、非同位体標識が付けられたプ
ローブが使用されるが、臨床環境では非放射性標識が好
ましい。
I）のような原子の放射性同位体が、プローブ標識とし
て主として使用されてきた。しかし、これらのような放
射性化合物は、放射性材料の不安定性に起因する高額の
使用コストはもちろん、評価分析プロトコルの中に大規
模な安全予防策を組み入れる必要性と、並びに、高価な
装置及び特殊な廃棄物手続きの必要性とを含む多くの欠
点を有している。その結果として、放射性同位体標識の
欠点を有しない、それに代わる標識法を開発する努力
が、近年になって益々増加してきている。従って現在で
は、放射性標識に加えて、非同位体標識が付けられたプ
ローブが使用されるが、臨床環境では非放射性標識が好
ましい。
従来技術の説明 検査試料内に存在する微量の標的塩基配列の検出を改
善する努力の中では、最近、（１）信号を増幅する、即
ち、プローブ検出システムの感度を高めること、及び
（２）現在使用可能な放射性及び非放射性の方法を用い
て容易に検出が可能な十分量の標的核酸塩基配列が存在
するように、標的核酸塩基配列自体を増幅させることと
いう方面で開発が行われて来ている。一般に、標的核酸
塩基配列の増幅は、所与のDNA又はRNA標的核酸塩基配列
の反復的な再生又は複製を含む。
善する努力の中では、最近、（１）信号を増幅する、即
ち、プローブ検出システムの感度を高めること、及び
（２）現在使用可能な放射性及び非放射性の方法を用い
て容易に検出が可能な十分量の標的核酸塩基配列が存在
するように、標的核酸塩基配列自体を増幅させることと
いう方面で開発が行われて来ている。一般に、標的核酸
塩基配列の増幅は、所与のDNA又はRNA標的核酸塩基配列
の反復的な再生又は複製を含む。
少量の所与の既存の標的核酸塩基配列から核酸塩基配
列の複数のコピーを作り出す再生又は複製のために、現
在では２つの方法が常套的に使用される。その第１の方
法は、その標的核酸塩基配列を適当な宿主系の中にクロ
ーン化することを含む。この方法は、後でその宿主を形
質転換するために使用する適当なベクターの中に所望の
拡酸を挿入する伝統的なクローニング技術を用いる。そ
の宿主が培養されると、そのベクターが複製され、さら
に所望の標的拡散塩基配列のコピーを産生する。そのベ
クターの中に挿入される標的核酸塩基配列は、自然に生
じたものであっても合成されたものであってもよい。言
い換えれば、米国特許第4,293,652号明細書に開示され
るように、所望の標的核酸塩基配列は試験管内で合成さ
れ、その後で、連続的に挿入する前に増殖されたベクタ
ーの中に核塩基配列を挿入することが可能である。
列の複数のコピーを作り出す再生又は複製のために、現
在では２つの方法が常套的に使用される。その第１の方
法は、その標的核酸塩基配列を適当な宿主系の中にクロ
ーン化することを含む。この方法は、後でその宿主を形
質転換するために使用する適当なベクターの中に所望の
拡酸を挿入する伝統的なクローニング技術を用いる。そ
の宿主が培養されると、そのベクターが複製され、さら
に所望の標的拡散塩基配列のコピーを産生する。そのベ
クターの中に挿入される標的核酸塩基配列は、自然に生
じたものであっても合成されたものであってもよい。言
い換えれば、米国特許第4,293,652号明細書に開示され
るように、所望の標的核酸塩基配列は試験管内で合成さ
れ、その後で、連続的に挿入する前に増殖されたベクタ
ーの中に核塩基配列を挿入することが可能である。
米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号明細書は、
検査試料からの標的DNA又はRNAの量を増幅させるための
第２の方法を開示している。特にこの方法はポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）と呼ばれている。PCR増幅法は、増幅
されるべきDNA断片の側面には配置する２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用する。これらのプライマー
は標的核酸塩基配列の対向鎖上でその相補的な塩基配列
へとアニールし、そのアニールされたプライマーの（標
的塩基配列に対して相補的な）伸長生成物が、DNAポリ
メラーゼの存在中で形成される。ポリメラーゼによるDN
A合成がプライマー間の領域を貫いて進行し、側面にプ
ライマーが配置された標的DNA断片の量を効果的に２倍
にするように、プライマーが配向される。
検査試料からの標的DNA又はRNAの量を増幅させるための
第２の方法を開示している。特にこの方法はポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）と呼ばれている。PCR増幅法は、増幅
されるべきDNA断片の側面には配置する２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用する。これらのプライマー
は標的核酸塩基配列の対向鎖上でその相補的な塩基配列
へとアニールし、そのアニールされたプライマーの（標
的塩基配列に対して相補的な）伸長生成物が、DNAポリ
メラーゼの存在中で形成される。ポリメラーゼによるDN
A合成がプライマー間の領域を貫いて進行し、側面にプ
ライマーが配置された標的DNA断片の量を効果的に２倍
にするように、プライマーが配向される。
選択されたアッセイにおいて測定可能な信号を得るの
に十分な量の標的核酸塩基配列が生成されるまで、DNA
の熱変性サイクル、相補的な塩基配列へのプライマーの
アニーリング、及びDNAポリメラーゼによるアニールさ
れたプライマーの伸長が繰り返される。伸長生成物もプ
ライマーに対して相補的であり且つプライマーを結合す
ることが可能であるため、連続的なサイクルの各々は先
行のサイクルで合成されたDNAの量を本質的に２倍に
し、標的核酸塩基配列を指数的に蓄積する。
に十分な量の標的核酸塩基配列が生成されるまで、DNA
の熱変性サイクル、相補的な塩基配列へのプライマーの
アニーリング、及びDNAポリメラーゼによるアニールさ
れたプライマーの伸長が繰り返される。伸長生成物もプ
ライマーに対して相補的であり且つプライマーを結合す
ることが可能であるため、連続的なサイクルの各々は先
行のサイクルで合成されたDNAの量を本質的に２倍に
し、標的核酸塩基配列を指数的に蓄積する。
PCR増幅システムの欠点の１つは、増幅を達成するた
めに酵素の使用を必要とするということである。酵素
は、望ましくないヌクレアーゼ汚染物質が存在すること
に加えて、その比較的短い貯蔵寿命及び品質に固有のロ
ット差を示す。DNA及びRNAの両方を効率的に増幅するこ
とが可能であり、並びに酵素増幅法の使用に限定されな
い増幅システムにもつことが有利であろう。
めに酵素の使用を必要とするということである。酵素
は、望ましくないヌクレアーゼ汚染物質が存在すること
に加えて、その比較的短い貯蔵寿命及び品質に固有のロ
ット差を示す。DNA及びRNAの両方を効率的に増幅するこ
とが可能であり、並びに酵素増幅法の使用に限定されな
い増幅システムにもつことが有利であろう。
発明の要約 本発明は、検査試料中に存在するかもしれない標的核
酸塩基配列を検出するための方法に係る。この方法は増
幅法と検出法をともに使用し得る。
酸塩基配列を検出するための方法に係る。この方法は増
幅法と検出法をともに使用し得る。
増幅は複数の対の核酸増幅プローブを使用することに
よって実現され、各対の増幅プローブの構成要素プロー
ブは、鋳型として働く標的核酸塩基配列の所与の部分に
対しても相補的である各対の増幅プローブの少なくとも
１つの同一のハイブリッド形成構成要素（hybridizing
member）と互いに相補的である。各対の増幅プローブの
ハイブリッド形成構成要素の核酸塩基配列は、標的核酸
塩基配列の異なる部分に対して相補的であるように、選
択され、ハイブリッド形成増幅プローブは隣接的な仕方
で、指定された長さの標的塩基配列をカバーすることが
重要である。ハイブリッド形成増幅プローブは、そのプ
ローブが互いに結合し得るのに十分互いに隣接している
標的塩基配列とハイブリッド形成する。
よって実現され、各対の増幅プローブの構成要素プロー
ブは、鋳型として働く標的核酸塩基配列の所与の部分に
対しても相補的である各対の増幅プローブの少なくとも
１つの同一のハイブリッド形成構成要素（hybridizing
member）と互いに相補的である。各対の増幅プローブの
ハイブリッド形成構成要素の核酸塩基配列は、標的核酸
塩基配列の異なる部分に対して相補的であるように、選
択され、ハイブリッド形成増幅プローブは隣接的な仕方
で、指定された長さの標的塩基配列をカバーすることが
重要である。ハイブリッド形成増幅プローブは、そのプ
ローブが互いに結合し得るのに十分互いに隣接している
標的塩基配列とハイブリッド形成する。
ハイブリッド形成増幅プローブが結合されると、完成
された増幅生成物を変性によって分離することが可能で
あり、及びこのプロセスは残りのプローブによって又は
新たなプローブの供給によって繰り返すことが可能であ
る。連結された増幅生成物の熱変性サイクル、増幅プロ
ーブのその相補的塩基配列へのアニーリング、及びアニ
ールされたプローブの連結反応は、選択されたアッセイ
において測定可能な信号を生じさせるのに十分な量の標
的核酸塩基配列が生成されるまで繰り返される。
された増幅生成物を変性によって分離することが可能で
あり、及びこのプロセスは残りのプローブによって又は
新たなプローブの供給によって繰り返すことが可能であ
る。連結された増幅生成物の熱変性サイクル、増幅プロ
ーブのその相補的塩基配列へのアニーリング、及びアニ
ールされたプローブの連結反応は、選択されたアッセイ
において測定可能な信号を生じさせるのに十分な量の標
的核酸塩基配列が生成されるまで繰り返される。
３つ以上の対の増幅プローブを使用する場合には、特
に２つ以上の検出プローブを使用してその増幅生成物を
検出してもよく、各々の検出プローブは、その増幅生成
物内の隣接した位置にある２つの増幅プローブ断片の各
々の部分に対して相補的である。適正に結合された増幅
生成物は、増幅法において標的核酸塩基配列によって果
たされるのと同一の仕方で鋳型として働く。不適正に結
合された生成物は、この方法において鋳型として機能す
ることが不可能である。検出プローブは、ハイブリッド
形成される検出プローブとの間に相互作用を生起させ得
るのに十分互いに隣接している増幅生成物とハイブリッ
ド形成する。適正に結合された増幅生成物の量を検出す
るのに使用する標識が、選択された検出プローブに担持
されている。
に２つ以上の検出プローブを使用してその増幅生成物を
検出してもよく、各々の検出プローブは、その増幅生成
物内の隣接した位置にある２つの増幅プローブ断片の各
々の部分に対して相補的である。適正に結合された増幅
生成物は、増幅法において標的核酸塩基配列によって果
たされるのと同一の仕方で鋳型として働く。不適正に結
合された生成物は、この方法において鋳型として機能す
ることが不可能である。検出プローブは、ハイブリッド
形成される検出プローブとの間に相互作用を生起させ得
るのに十分互いに隣接している増幅生成物とハイブリッ
ド形成する。適正に結合された増幅生成物の量を検出す
るのに使用する標識が、選択された検出プローブに担持
されている。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明の増幅法を使用する、二本鎖の標的
塩基配列の増幅を示す図であり、 第２図は、固定化抗体を使用する検出生成物の分離を
行なえるように抗原を検出プローブ標識として使用す
る、本発明の検出生成物の実施態様の１つを説明する図
であり、 第３図は、実施例２〜８で使用される合成ヌクレオチ
ド塩基配列の図であり、 第４図は、２対の増幅プローブを使用する30マー増幅
塩基配列の10サイクルの増幅から得られた生成物を示す
オートラジオグラムであり、 第５図は、３対の増幅プローグを使用する45マー増幅
塩基配列の10サイクルの増幅から得られた生成物を示す
オートラジオグラムであり、 第６図は、45マーの増幅生成物を検出するために、１
つの非標識検出プローブと組み合わされた、放射性標識
を有する１つの検出プローブを使用して得られた検出生
成物を示すオートラジオグラムである。
塩基配列の増幅を示す図であり、 第２図は、固定化抗体を使用する検出生成物の分離を
行なえるように抗原を検出プローブ標識として使用す
る、本発明の検出生成物の実施態様の１つを説明する図
であり、 第３図は、実施例２〜８で使用される合成ヌクレオチ
ド塩基配列の図であり、 第４図は、２対の増幅プローブを使用する30マー増幅
塩基配列の10サイクルの増幅から得られた生成物を示す
オートラジオグラムであり、 第５図は、３対の増幅プローグを使用する45マー増幅
塩基配列の10サイクルの増幅から得られた生成物を示す
オートラジオグラムであり、 第６図は、45マーの増幅生成物を検出するために、１
つの非標識検出プローブと組み合わされた、放射性標識
を有する１つの検出プローブを使用して得られた検出生
成物を示すオートラジオグラムである。
発明の詳細な説明 検査試料中に存在するかもしれない標的核酸塩基配列
を検出するための方法の１つが、本発明により提供され
る。本発明の方法は増幅法及び検出法の双方を使用し得
る。
を検出するための方法の１つが、本発明により提供され
る。本発明の方法は増幅法及び検出法の双方を使用し得
る。
本明細書中で使用する用語の以下の定義を有する。
増幅プローブは、（１）二本鎖の増幅塩基配列の１つ
の鎖部分に対して相補的な、又は（２）一本鎖の増幅塩
基配列部分に対して同一もしくは相補的な核酸塩基配列
である。増幅プローブは、プローブが互いに結合し得る
のに十分互いに隣接している増幅塩基配列とハイブリッ
ド形成する。各々の増幅プローブの長さは１つのヌクレ
オチドの長さよりも大きい。増幅プローブは、他の増幅
プローブと結合するために、一方の末端において又は両
末端において修飾されていてもされていなくてもよい。
の鎖部分に対して相補的な、又は（２）一本鎖の増幅塩
基配列部分に対して同一もしくは相補的な核酸塩基配列
である。増幅プローブは、プローブが互いに結合し得る
のに十分互いに隣接している増幅塩基配列とハイブリッ
ド形成する。各々の増幅プローブの長さは１つのヌクレ
オチドの長さよりも大きい。増幅プローブは、他の増幅
プローブと結合するために、一方の末端において又は両
末端において修飾されていてもされていなくてもよい。
核酸塩基配列は、（１）ホスフェート主鎖に関して、
（２）ヌクレオシドに関して、及び／又は（３）オリゴ
ヌクレオチドの糖部分に関して修飾されていてもよいデ
オキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。
核酸塩基配列は標識を含むことが可能であり、ハイブリ
ッド形成が依然として起こり得る限りは、他の化学部分
（chemical moieties）によって断続されてもよい。
（２）ヌクレオシドに関して、及び／又は（３）オリゴ
ヌクレオチドの糖部分に関して修飾されていてもよいデ
オキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。
核酸塩基配列は標識を含むことが可能であり、ハイブリ
ッド形成が依然として起こり得る限りは、他の化学部分
（chemical moieties）によって断続されてもよい。
相補的とは、ハイブリッド形成を起こし得るのに十分
な相補性を意味する。完全な相補性は必要とされない。
な相補性を意味する。完全な相補性は必要とされない。
複数の対の増幅プローブの同一の構成要素とは、他の
「同一の構成要素」と共に、完全な増幅生成物を累積的
に形成することが可能な各プローブ対の構成要素を意味
する。増幅プローブ対の構成要素は、表示の構成要素が
下側の鎖から生じる場合には、プライム符号（′）で表
わされる。
「同一の構成要素」と共に、完全な増幅生成物を累積的
に形成することが可能な各プローブ対の構成要素を意味
する。増幅プローブ対の構成要素は、表示の構成要素が
下側の鎖から生じる場合には、プライム符号（′）で表
わされる。
増幅生成物とは、増幅塩基配列と隣接的にハイブリッ
ド形成する一連の増幅プローブとの連結反応から生成さ
れる。連結された核酸塩基配列である。
ド形成する一連の増幅プローブとの連結反応から生成さ
れる。連結された核酸塩基配列である。
連結反応とは、２つ以上の増幅プローブ又は検出プロ
ーブの結合を意味する。連結反応は、それだけに限定さ
れるわけではないが、化学反応、光化学反応（例えば光
結合）、熱付加環化反応、及びレドックス反応を含む化
学プロセスに加えて、例えばリガーゼを利用する酵素法
を含む。
ーブの結合を意味する。連結反応は、それだけに限定さ
れるわけではないが、化学反応、光化学反応（例えば光
結合）、熱付加環化反応、及びレドックス反応を含む化
学プロセスに加えて、例えばリガーゼを利用する酵素法
を含む。
隣接的とは隣りの又は近接のという意味である。隣接
的にハイブリッド形成されるプローブの場合には、その
プローブの末端は互いに隣接する必要はないが、実際に
は、間隔を開けて離れていてもよく、又はある程度重な
り合っていてもよい。
的にハイブリッド形成されるプローブの場合には、その
プローブの末端は互いに隣接する必要はないが、実際に
は、間隔を開けて離れていてもよく、又はある程度重な
り合っていてもよい。
標的塩基配列とは探索されるべき核酸塩基配列であ
る。
る。
増幅塩基配列は、増幅プローブの鋳型として働く、指
定された長さの標的塩基配列である。増幅塩基配列は標
的塩基配列の全長から成っていてもよく、又はそれを代
表する部分から成っていてもよい。
定された長さの標的塩基配列である。増幅塩基配列は標
的塩基配列の全長から成っていてもよく、又はそれを代
表する部分から成っていてもよい。
鋳型塩基配列は、複数の増幅プローブ又は複数の検出
プローブとハイブリッド形成する核酸塩基配列である。
増幅法の第１サイクルでは、増幅塩基配列は鋳型塩基配
列として作用する。増幅法の後続のサイクルにおいて及
び検出法において、増幅生成物も鋳型塩基配列として働
く。
プローブとハイブリッド形成する核酸塩基配列である。
増幅法の第１サイクルでは、増幅塩基配列は鋳型塩基配
列として作用する。増幅法の後続のサイクルにおいて及
び検出法において、増幅生成物も鋳型塩基配列として働
く。
増幅プローブ断片とは、単一の増幅プローブによって
生じた増幅生成物の断片的部分である。
生じた増幅生成物の断片的部分である。
ハイブリッド形成プローブは、鋳型塩基配列にハイブ
リッド形成する増幅プローブ又は検出プローブである。
一般的に、一本鎖増幅塩基配列の増幅の第１サイクルに
おける幾つかの増幅プローブを除いて、全ての増幅プロ
ーブ及び全ての検出プローブはハイブリッド形成プロー
ブである。
リッド形成する増幅プローブ又は検出プローブである。
一般的に、一本鎖増幅塩基配列の増幅の第１サイクルに
おける幾つかの増幅プローブを除いて、全ての増幅プロ
ーブ及び全ての検出プローブはハイブリッド形成プロー
ブである。
検出プローブは、増幅生成物の中に隣接して置かれた
２つの増幅プローブ断片の各々の部分に対して相補的で
ある核酸塩基配列である。検出プローブは、ハイブリッ
ド形成される検出プローブとの間で相互作用を生起し得
るのに十分互いに隣接している増幅生成物とハイブリッ
ド形成する。
２つの増幅プローブ断片の各々の部分に対して相補的で
ある核酸塩基配列である。検出プローブは、ハイブリッ
ド形成される検出プローブとの間で相互作用を生起し得
るのに十分互いに隣接している増幅生成物とハイブリッ
ド形成する。
検出生成物は、一連の隣接的にハイブリッド形成され
た検出プローブから生成された核酸塩基配列である。こ
の検出生成物は連結される必要はない。
た検出プローブから生成された核酸塩基配列である。こ
の検出生成物は連結される必要はない。
偽の増幅副産物又は副産物は、本来の増幅塩基配列に
よっては得られない、増幅プローブの連結反応の結果と
して生じる生成物である。
よっては得られない、増幅プローブの連結反応の結果と
して生じる生成物である。
標識とは、同一の標識の付いたプローブを他のプロー
ブから区別するために、検出プローブ又は増幅プローブ
に結合された部分である。標識は信号発生標識である必
要はないが、例えば、測定されるべき生成物の分離手段
及び／又は検出可能な標識を後で結合するための手段を
提供してもよい。
ブから区別するために、検出プローブ又は増幅プローブ
に結合された部分である。標識は信号発生標識である必
要はないが、例えば、測定されるべき生成物の分離手段
及び／又は検出可能な標識を後で結合するための手段を
提供してもよい。
検出可能な標識は、１つの基質（酵素の場合）、１つ
の光源（蛍光化合物の場合）、もしくは光電子増倍管
（放射性もしくは化学発光化合物の場合）のような物質
との相互作用を通して、又は直接的に、検出が可能な信
号発生標識である。
の光源（蛍光化合物の場合）、もしくは光電子増倍管
（放射性もしくは化学発光化合物の場合）のような物質
との相互作用を通して、又は直接的に、検出が可能な信
号発生標識である。
隣接標識（proximity label）とは、そうした標識が
一緒にされる場合に互いに相互反応して検出可能な信号
を発生させる、少なくとも２つの標識の１つである。典
型的には、第１及び第２の２つの隣接標識が互いに隣接
している条件の下で検出可能な信号を発生するために、
第１隣接標識が対応する第２隣接標識と組み合わせて使
用される。
一緒にされる場合に互いに相互反応して検出可能な信号
を発生させる、少なくとも２つの標識の１つである。典
型的には、第１及び第２の２つの隣接標識が互いに隣接
している条件の下で検出可能な信号を発生するために、
第１隣接標識が対応する第２隣接標識と組み合わせて使
用される。
二本鎖増幅塩基配列を使用する、本発明の増幅法の具
体例の１つが、第１図に示されている。第１図に関して
は、その増幅法は複数の増幅プローブ［（Ｂ）（１）及
び（Ｂ）（２）］を使用する。増殖プローブの長さは好
ましくは10〜30ヌクレオチドであるが、１つのヌクレオ
チドより大きければ、どんな長さであってもよい。各対
の増幅プローブの構成要素は互いに相補的であるように
選ばれ、プローブの各対の少なくとも１つの同一の構成
要素［（Ｂ）（１）又は（Ｂ）（２）］も、鋳型として
作用する増幅塩基配列［（Ａ）（１）及び（Ａ）
（２）］の指定された断片に対して相補的である。増幅
プローブの各対のハイブリッド形成構成要素の核酸塩基
配列は、その増幅塩基配列の異なる部分に対して相補的
であるように選ばれ、従って、ハイブリッド形成増幅プ
ローブは、その増幅塩基配列とハイブリッド形成する時
に、隣接的な仕方［（Ｃ）（１）及び（Ｃ）（２）］で
本質的にその増幅塩基配列の全体の長さをカバーする。
体例の１つが、第１図に示されている。第１図に関して
は、その増幅法は複数の増幅プローブ［（Ｂ）（１）及
び（Ｂ）（２）］を使用する。増殖プローブの長さは好
ましくは10〜30ヌクレオチドであるが、１つのヌクレオ
チドより大きければ、どんな長さであってもよい。各対
の増幅プローブの構成要素は互いに相補的であるように
選ばれ、プローブの各対の少なくとも１つの同一の構成
要素［（Ｂ）（１）又は（Ｂ）（２）］も、鋳型として
作用する増幅塩基配列［（Ａ）（１）及び（Ａ）
（２）］の指定された断片に対して相補的である。増幅
プローブの各対のハイブリッド形成構成要素の核酸塩基
配列は、その増幅塩基配列の異なる部分に対して相補的
であるように選ばれ、従って、ハイブリッド形成増幅プ
ローブは、その増幅塩基配列とハイブリッド形成する時
に、隣接的な仕方［（Ｃ）（１）及び（Ｃ）（２）］で
本質的にその増幅塩基配列の全体の長さをカバーする。
増幅塩基配列が二本鎖である場合には必ず、増幅プロ
ーブの各対の両構成要素は、その増幅塩基配列の相補鎖
の対向部分に対して相補的であろう、即ち、増幅プロー
ブAP1、AP2及びAP3［（Ｂ）（１）］が増幅塩基配列A
S′［（Ａ）（２）］に対して相補的であり、並びに、
増幅プローブAP１′、AP２′及びAP３′［（Ｂ）
（２）］が増幅塩基配列AS［（Ａ）（１）］に対して相
補的である。
ーブの各対の両構成要素は、その増幅塩基配列の相補鎖
の対向部分に対して相補的であろう、即ち、増幅プロー
ブAP1、AP2及びAP3［（Ｂ）（１）］が増幅塩基配列A
S′［（Ａ）（２）］に対して相補的であり、並びに、
増幅プローブAP１′、AP２′及びAP３′［（Ｂ）
（２）］が増幅塩基配列AS［（Ａ）（１）］に対して相
補的である。
ハイブリッド形成増幅プローブは、増幅プローブの末
端が連結されるのを可能にするのに十分互いに隣接した
増幅塩基配列とハイブリッド形成する。そのプローブの
連結反応をもたらすことが可能な１つのタイプの反応
は、その５′末端でリン酸化されているプローブに対し
てリガーゼを酵素的に作用させることである。連結反応
の他の方法も可能である。一般的に、これらの方法は連
結反応試薬の使用を必要とし、この試薬は化学試薬で
も、（リガーゼのような）酵素でも、光でも又は熱であ
ってもよい。
端が連結されるのを可能にするのに十分互いに隣接した
増幅塩基配列とハイブリッド形成する。そのプローブの
連結反応をもたらすことが可能な１つのタイプの反応
は、その５′末端でリン酸化されているプローブに対し
てリガーゼを酵素的に作用させることである。連結反応
の他の方法も可能である。一般的に、これらの方法は連
結反応試薬の使用を必要とし、この試薬は化学試薬で
も、（リガーゼのような）酵素でも、光でも又は熱であ
ってもよい。
１つの実施態様では、単一の化学部分が増幅プローブ
の結合末端に取り付けられる。連結反応は第２の部分の
形成によって連結された増幅生成物を生成するために連
結反応試薬を使用することによって行ってもよい。例え
ば、第１化学部分に結合された２つの増幅プローブが鋳
型にハイブリッド形成される場合のように、第１化学部
分の２つが非常に隣接している場合には、連結反応試薬
は第１化学部分の構造を変えるだけであるのが好まし
い。このタイプの連結反応を実施するために第１化学部
分を使用することの一具体例は、酸化によってジスルフ
ィド結合（−Ｓ−Ｓ−）の生成を達成する連結反応にお
いてスルフヒドリル基（−SH）を使用することである。
の結合末端に取り付けられる。連結反応は第２の部分の
形成によって連結された増幅生成物を生成するために連
結反応試薬を使用することによって行ってもよい。例え
ば、第１化学部分に結合された２つの増幅プローブが鋳
型にハイブリッド形成される場合のように、第１化学部
分の２つが非常に隣接している場合には、連結反応試薬
は第１化学部分の構造を変えるだけであるのが好まし
い。このタイプの連結反応を実施するために第１化学部
分を使用することの一具体例は、酸化によってジスルフ
ィド結合（−Ｓ−Ｓ−）の生成を達成する連結反応にお
いてスルフヒドリル基（−SH）を使用することである。
別の実施態様では、第１化学部分が１つの増幅プロー
ブの接続末端に取り付けられ、及び、第２化学部分が、
連結されるべき別の増幅プローブの対向する末端に取り
付けられる。連結反応は第３化学部分の形成によって生
じ、場合によっては、この第３化学部分は改変された第
１又は第２化学部分とみなされてもよい。
ブの接続末端に取り付けられ、及び、第２化学部分が、
連結されるべき別の増幅プローブの対向する末端に取り
付けられる。連結反応は第３化学部分の形成によって生
じ、場合によっては、この第３化学部分は改変された第
１又は第２化学部分とみなされてもよい。
連結反応は、ただ１つの化学部分を使用してそのプロ
ーブの接続末端を修飾する場合と同じ仕方で、連結反応
試薬を使用することによって行うことが可能である。２
つの異なった化学部分を使用する場合には、連結反応試
薬は第１又は第２化学部分のどちらとでも相互作用する
ことができるが、その２つの化学部分がハイブリッド形
成による場合のように非常に隣接しないと、この連結反
応試薬はどちらの化学部分の構造も改変しない。光を連
結反応試薬として使用する場合には、電気的に励起され
た分子を生じるために、２つの第１化学部分の１つだけ
がその光と相互作用する必要があり、その後で、この励
起された分子は、ペリ環状反応によってその対応する化
学部分と反応して、結合する第３化学部分を生成させ
る。前記２つの化学部分がきわめて隣接した状態にある
場合にだけ、この活性化学部分がその対応する化学部分
と反応するように、この活性化学部分が短寿命の励起状
態を有することが好ましい。
ーブの接続末端を修飾する場合と同じ仕方で、連結反応
試薬を使用することによって行うことが可能である。２
つの異なった化学部分を使用する場合には、連結反応試
薬は第１又は第２化学部分のどちらとでも相互作用する
ことができるが、その２つの化学部分がハイブリッド形
成による場合のように非常に隣接しないと、この連結反
応試薬はどちらの化学部分の構造も改変しない。光を連
結反応試薬として使用する場合には、電気的に励起され
た分子を生じるために、２つの第１化学部分の１つだけ
がその光と相互作用する必要があり、その後で、この励
起された分子は、ペリ環状反応によってその対応する化
学部分と反応して、結合する第３化学部分を生成させ
る。前記２つの化学部分がきわめて隣接した状態にある
場合にだけ、この活性化学部分がその対応する化学部分
と反応するように、この活性化学部分が短寿命の励起状
態を有することが好ましい。
又、例えば、求核試薬（N:）が１つの増幅プローブの
１つの接続末端に取り付けられ、及び、連結されるべき
別の増幅プローブの対向末端に脱離基が取り付けられる
場合には、連結反応試薬が無くても連結反応を行うこと
が可能である。連結反応は、修飾された求核試薬（−Ｎ
−）の形成によって生じる。この場合には、連結反応
は、N:と選ばれた脱離基との（例えば、ハイブリッド形
成による）著しい接近だけによって生じる。或いは、連
結反応を促進するために、その脱離基は光又は酵素のよ
うな試薬によって活性化されてもよい。このタイプの連
結反応の一例は、N:がスルフヒドリル基であり、及び脱
離基がヨウドアセチル基上のヨウ素である場合であろ
う。これは、N:がアミン基であり且つ脱離基が活性エス
テルである場合の、ペプチド及びタンパク質の調製に使
用されるタイプの化学と同様である。
１つの接続末端に取り付けられ、及び、連結されるべき
別の増幅プローブの対向末端に脱離基が取り付けられる
場合には、連結反応試薬が無くても連結反応を行うこと
が可能である。連結反応は、修飾された求核試薬（−Ｎ
−）の形成によって生じる。この場合には、連結反応
は、N:と選ばれた脱離基との（例えば、ハイブリッド形
成による）著しい接近だけによって生じる。或いは、連
結反応を促進するために、その脱離基は光又は酵素のよ
うな試薬によって活性化されてもよい。このタイプの連
結反応の一例は、N:がスルフヒドリル基であり、及び脱
離基がヨウドアセチル基上のヨウ素である場合であろ
う。これは、N:がアミン基であり且つ脱離基が活性エス
テルである場合の、ペプチド及びタンパク質の調製に使
用されるタイプの化学と同様である。
ヒドロキシル基（第１化学部分）をリン酸基（第２化
学部分）に結合して、リン酸エステル結合（第３の化学
部分）を生じさせるために、連結反応試薬として酵素リ
ガーゼを使用することは、連結反応に必要な２つの異な
った化学部分の１つ（即ち、ヒドロキシル基）が核酸プ
ローブに内在的であるが故に、好ましい連結反応方法で
ある。リガーゼを用いてリン酸化されたプローブを結合
する場合には、そのプローブの１つの末端だけを修飾す
る必要がある。
学部分）に結合して、リン酸エステル結合（第３の化学
部分）を生じさせるために、連結反応試薬として酵素リ
ガーゼを使用することは、連結反応に必要な２つの異な
った化学部分の１つ（即ち、ヒドロキシル基）が核酸プ
ローブに内在的であるが故に、好ましい連結反応方法で
ある。リガーゼを用いてリン酸化されたプローブを結合
する場合には、そのプローブの１つの末端だけを修飾す
る必要がある。
その個々の増幅プローブが連結されると、その結果得
られた増幅生成物は、一本鎖増幅塩基配列の場合にはそ
の増幅生成物［（Ｄ）（１）又は（Ｄ）（２）］の変性
によって、また二本鎖増幅塩基配列の場合にはその増幅
生成物［（Ｄ）（１）及び（Ｄ）（２）］の変性によっ
て分離され、即ち一本鎖にされる。そして、このプロセ
スは残りのローブによって、又は増幅プローブの新たな
供給によって反復される。
られた増幅生成物は、一本鎖増幅塩基配列の場合にはそ
の増幅生成物［（Ｄ）（１）又は（Ｄ）（２）］の変性
によって、また二本鎖増幅塩基配列の場合にはその増幅
生成物［（Ｄ）（１）及び（Ｄ）（２）］の変性によっ
て分離され、即ち一本鎖にされる。そして、このプロセ
スは残りのローブによって、又は増幅プローブの新たな
供給によって反復される。
このプロセスの第１の反復（第２サイクル）では、そ
の増幅生成物自体が追加の又は残余の増幅プローブのた
めの鋳型塩基配列として働く。例えば、一本鎖増幅塩基
配列の増幅の第２サイクルでは、AP１′、AP２′及びAP
３′［（Ｄ）（１）］から形成される増幅生成物が、AP
1、AP2及びAP3増幅プローブ［（Ｂ）（１）］の鋳型と
して働く。二本鎖増幅塩基配列の場合には、AP1、AP2及
びAP3［（Ｄ）（２）］から形成される増幅生成物も、A
P１′、AP２′及びAP３′増幅プローブ［（Ｂ）
（２）］の鋳型として働く。その後続のサイクルでは、
（Ｄ）（１）及び（Ｄ）（２）増幅生成物の両方が、一
本鎖増幅塩基配列又は二本鎖増幅塩基配列のどちらの増
幅においても鋳型として働く。後続サイクルにおいて鋳
型として作用する追加の増幅生成物の反復的な生成は、
増幅生成物の指数的蓄積を可能にする。
の増幅生成物自体が追加の又は残余の増幅プローブのた
めの鋳型塩基配列として働く。例えば、一本鎖増幅塩基
配列の増幅の第２サイクルでは、AP１′、AP２′及びAP
３′［（Ｄ）（１）］から形成される増幅生成物が、AP
1、AP2及びAP3増幅プローブ［（Ｂ）（１）］の鋳型と
して働く。二本鎖増幅塩基配列の場合には、AP1、AP2及
びAP3［（Ｄ）（２）］から形成される増幅生成物も、A
P１′、AP２′及びAP３′増幅プローブ［（Ｂ）
（２）］の鋳型として働く。その後続のサイクルでは、
（Ｄ）（１）及び（Ｄ）（２）増幅生成物の両方が、一
本鎖増幅塩基配列又は二本鎖増幅塩基配列のどちらの増
幅においても鋳型として働く。後続サイクルにおいて鋳
型として作用する追加の増幅生成物の反復的な生成は、
増幅生成物の指数的蓄積を可能にする。
鋳型塩基配列からの増幅生成物の変性、追加の又は残
余の増幅プローブの、鋳型塩基配列上のその相補的塩基
配列へのアニーリング、及びそのアニールされた増幅プ
ローブの連結反応から成るサイクルは、選ばれたアッセ
イにおいて測定可能な信号を生じさせるのに十分なだけ
の量の増幅生成物が生成されるまで繰り返される。熱変
性を使用する場合には、熱安定リガーゼを使用すること
が好ましい。
余の増幅プローブの、鋳型塩基配列上のその相補的塩基
配列へのアニーリング、及びそのアニールされた増幅プ
ローブの連結反応から成るサイクルは、選ばれたアッセ
イにおいて測定可能な信号を生じさせるのに十分なだけ
の量の増幅生成物が生成されるまで繰り返される。熱変
性を使用する場合には、熱安定リガーゼを使用すること
が好ましい。
通常用いられる２段階法を使用して増幅生成物を直接
測定してもよい。この方法は、（１）連結されていない
及び不完全にしか連結されていない残余の増幅プローブ
からの増幅生成物を（サイズに従って）分離するため
の、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）と、
及びそれに続く、（２）分離された核酸生成物を視覚化
するためのオートラジオグラフィーとを含む。１つ以上
の増幅プローブを32Pのような放射性同位体で標識する
場合に、この方法を使用することができる。
測定してもよい。この方法は、（１）連結されていない
及び不完全にしか連結されていない残余の増幅プローブ
からの増幅生成物を（サイズに従って）分離するため
の、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）と、
及びそれに続く、（２）分離された核酸生成物を視覚化
するためのオートラジオグラフィーとを含む。１つ以上
の増幅プローブを32Pのような放射性同位体で標識する
場合に、この方法を使用することができる。
本発明の増幅法に固有の問題の１つは、上述の２段階
アッセイ法のようなサイズによる分離に基づくアッセイ
結果に逆効果をもたらすかもしれない偽の増幅副生成物
を生成する可能性があるということである。最初は、偽
の増幅副生成物は、鋳型塩基配列の介在しない増幅プロ
ーブの連結反応の結果として生じる。平滑末端連結反応
（blunt end ligation）としても公知なこのプロセス
は、増幅塩基配列の増幅のために過剰に与えられた増幅
プローブが、そのプローブが連結されるのを可能にする
のに十分なだけ互いに隣接して偶然に配列される場合に
は、溶液中で起こり得る。偽の増幅副生成物が、相補的
な対を成す増幅プローブの両方の構成要素の連結反応か
ら生成される場合には、その副生成物はその副生成物自
体を指数的に再生することが可能である。偽の増幅副生
成物は、分析下の検査試料において標的塩基配列の存在
を示さない。
アッセイ法のようなサイズによる分離に基づくアッセイ
結果に逆効果をもたらすかもしれない偽の増幅副生成物
を生成する可能性があるということである。最初は、偽
の増幅副生成物は、鋳型塩基配列の介在しない増幅プロ
ーブの連結反応の結果として生じる。平滑末端連結反応
（blunt end ligation）としても公知なこのプロセス
は、増幅塩基配列の増幅のために過剰に与えられた増幅
プローブが、そのプローブが連結されるのを可能にする
のに十分なだけ互いに隣接して偶然に配列される場合に
は、溶液中で起こり得る。偽の増幅副生成物が、相補的
な対を成す増幅プローブの両方の構成要素の連結反応か
ら生成される場合には、その副生成物はその副生成物自
体を指数的に再生することが可能である。偽の増幅副生
成物は、分析下の検査試料において標的塩基配列の存在
を示さない。
偽の増幅副生成物の大半は、適正にそのプローブを配
列させる増幅鋳型による最初の関与がないために、非特
異的な仕方で配向される。本発明の検出法は、適正に結
合された連結生成物と非適正に結合された連結生成物と
を識別することが可能であり、従って、最終的なアッセ
イ結果に対する偽の増幅生成物の影響を、完全には取り
除かないものの、最小化する。これは、本発明方法のよ
うな識別方法が、正しく連結された偽の増幅生成物と、
鋳型から誘導された正しく結合された真の増幅生成物と
を依然として識別できないからである。
列させる増幅鋳型による最初の関与がないために、非特
異的な仕方で配向される。本発明の検出法は、適正に結
合された連結生成物と非適正に結合された連結生成物と
を識別することが可能であり、従って、最終的なアッセ
イ結果に対する偽の増幅生成物の影響を、完全には取り
除かないものの、最小化する。これは、本発明方法のよ
うな識別方法が、正しく連結された偽の増幅生成物と、
鋳型から誘導された正しく結合された真の増幅生成物と
を依然として識別できないからである。
しかし、偽の増幅副生成物の有害な影響は、増幅プロ
ーブの対の数を増加して使用することによって更に最小
化することが可能である。増幅プロセスで使用されるプ
ローブの対の数を増加させることは、偽の連結反応に適
した仕方でそのプローブが偶然に配列する機会を統計学
的に減少させる。例えば、指数的に増大する偽の増幅副
生成物だけを考慮するならば、３対のプローブを使用す
る増幅システムでは、その偽の増幅副生成物の1/16だけ
が、形成された正しい結合の生成物として計算される。
４対のプローブを使用する増幅システムでは、正しい結
合の偽の増幅生成物対形成される偽の増幅生成物全体の
比は、1:352となるだろう 正しく結合された副生成物の数は、追加のプローブ対
を含ませることによって劇的に減少する。例えば５対の
プローブを使用する場合には、正しい結合の偽の増幅生
成物対偽の増幅生成物全体の比は、1:13,842まで低下す
る。さらに、鋳型によって誘導された増幅生成物の全長
（full length）に達する偽の増幅生成物の数も、増幅
プローブ対の数が増加するにつれて減少するだろう。
ーブの対の数を増加して使用することによって更に最小
化することが可能である。増幅プロセスで使用されるプ
ローブの対の数を増加させることは、偽の連結反応に適
した仕方でそのプローブが偶然に配列する機会を統計学
的に減少させる。例えば、指数的に増大する偽の増幅副
生成物だけを考慮するならば、３対のプローブを使用す
る増幅システムでは、その偽の増幅副生成物の1/16だけ
が、形成された正しい結合の生成物として計算される。
４対のプローブを使用する増幅システムでは、正しい結
合の偽の増幅生成物対形成される偽の増幅生成物全体の
比は、1:352となるだろう 正しく結合された副生成物の数は、追加のプローブ対
を含ませることによって劇的に減少する。例えば５対の
プローブを使用する場合には、正しい結合の偽の増幅生
成物対偽の増幅生成物全体の比は、1:13,842まで低下す
る。さらに、鋳型によって誘導された増幅生成物の全長
（full length）に達する偽の増幅生成物の数も、増幅
プローブ対の数が増加するにつれて減少するだろう。
本発明の検出法によれば、少なくとも２つの検出プロ
ーブが使用される。検出プローブは、正しく結合された
増幅生成物内の２つの増幅プローブ断片の継目を繋ぐよ
うに設計される。従って、少なくとも３つの増幅プロー
ブ断片を有する増幅生成物を生成するために、少なくと
も３対の増幅プローブが本発明の増幅法で使用されなけ
ればならない。検出プローブの長さは増幅プローブの長
さに匹敵することが好ましい。
ーブが使用される。検出プローブは、正しく結合された
増幅生成物内の２つの増幅プローブ断片の継目を繋ぐよ
うに設計される。従って、少なくとも３つの増幅プロー
ブ断片を有する増幅生成物を生成するために、少なくと
も３対の増幅プローブが本発明の増幅法で使用されなけ
ればならない。検出プローブの長さは増幅プローブの長
さに匹敵することが好ましい。
検出可能な量の増幅生成物を生成するのに十分なサイ
クリングの後で、正しく結合された増幅生成物が本発明
の検出法に従って検出されてよい。その増幅法は２つの
相補的な増幅生成物を生成し、その両方又はどちらか一
方が検出法に従って検出されてよい。相補的な増幅生成
物の１つの存在を検出するために本発明の検出法を使用
する１つの具体例が、第２図に示される。
クリングの後で、正しく結合された増幅生成物が本発明
の検出法に従って検出されてよい。その増幅法は２つの
相補的な増幅生成物を生成し、その両方又はどちらか一
方が検出法に従って検出されてよい。相補的な増幅生成
物の１つの存在を検出するために本発明の検出法を使用
する１つの具体例が、第２図に示される。
第２図に関しては、本発明の検出法は少なくとも２つ
の検出プローブ［（Ｅ）］を使用し、各々の検出プロー
ブは、増幅生成物の、隣接した位置にある２つの増幅プ
ローブ断片の各々の部分と相補的である。ｎ対の増幅プ
ローブを増幅法で使用する場合には、ｎ−１個の検出プ
ローブが検出法で使用される。
の検出プローブ［（Ｅ）］を使用し、各々の検出プロー
ブは、増幅生成物の、隣接した位置にある２つの増幅プ
ローブ断片の各々の部分と相補的である。ｎ対の増幅プ
ローブを増幅法で使用する場合には、ｎ−１個の検出プ
ローブが検出法で使用される。
本発明の検出法では、増幅生成物［（Ｄ）（１）及び
／又は（Ｄ）（２）］は、増幅法の第１サイクルにおけ
る増幅塩基配列によって並びに後続のサイクルにおける
増幅塩基配列及び増幅生成物によって果たされるものと
同様の仕方で鋳型として働く。第２図に示す検出法は、
検出プローブ用の鋳型塩基配列として、１つの増幅生成
物［（Ｄ）（１）］だけを示している。その検出プロー
ブは、ハイブリッド形成されたプローブ間で相互作用を
生起させ得るのに十分互いに隣接した［（Ｆ）］、指定
された増幅生成物にハイブリッド形成する。その相互作
用は、増幅プローブの連結反応に関して前述したような
あらゆる仕方で検出プローブの末端を互いに結合する連
結反応であってもよい。連結された検出生成物が形成さ
れる場合には［第２図の（Ｇ）］、その連結された生成
物は、その後で、変性によって増幅生成物鋳型から分離
されてもよい。しかし、この分離は必須なものではな
い。
／又は（Ｄ）（２）］は、増幅法の第１サイクルにおけ
る増幅塩基配列によって並びに後続のサイクルにおける
増幅塩基配列及び増幅生成物によって果たされるものと
同様の仕方で鋳型として働く。第２図に示す検出法は、
検出プローブ用の鋳型塩基配列として、１つの増幅生成
物［（Ｄ）（１）］だけを示している。その検出プロー
ブは、ハイブリッド形成されたプローブ間で相互作用を
生起させ得るのに十分互いに隣接した［（Ｆ）］、指定
された増幅生成物にハイブリッド形成する。その相互作
用は、増幅プローブの連結反応に関して前述したような
あらゆる仕方で検出プローブの末端を互いに結合する連
結反応であってもよい。連結された検出生成物が形成さ
れる場合には［第２図の（Ｇ）］、その連結された生成
物は、その後で、変性によって増幅生成物鋳型から分離
されてもよい。しかし、この分離は必須なものではな
い。
正しく結合された増幅生成物の存在を求めるあらゆる
検出手段が利用されてよい。１つの検出プローブが32P
で標識される場合には、連結された検出生成物の存在を
PAGEを用いてアッセイし、その後オートラジオグラムを
用いて解析することができる。２つの検出プローブを使
用する場合には、その２つの検出プローブの各々に標識
を付けてもよい。
検出手段が利用されてよい。１つの検出プローブが32P
で標識される場合には、連結された検出生成物の存在を
PAGEを用いてアッセイし、その後オートラジオグラムを
用いて解析することができる。２つの検出プローブを使
用する場合には、その２つの検出プローブの各々に標識
を付けてもよい。
２つの標識検出プローブを使用する１つの実施態様で
は、一方の検出プローブは検出可能な標識に結合され、
他方の検出プローブには、対応する固定化された特定の
結合相手にその後で結合する配位子のような検出生成物
を用得から取り出すための手段が与えられる。第２図に
示される検出法では、その検出プローブの１つが、固定
化抗体［（Ｈ）］の使用によって検出生成物の取出しを
可能にする抗原に結合される。その後で、検出生成物を
不溶性の担体［（Ｉ）］上に捕獲することによって、そ
の検出生成物を溶液から取り出すことができる。標識さ
れた検出生成物を溶液から取り出すこの方法も、その検
出生成物が依然として増幅生成物にハイブリッド形成さ
れている間に行ってよい。
は、一方の検出プローブは検出可能な標識に結合され、
他方の検出プローブには、対応する固定化された特定の
結合相手にその後で結合する配位子のような検出生成物
を用得から取り出すための手段が与えられる。第２図に
示される検出法では、その検出プローブの１つが、固定
化抗体［（Ｈ）］の使用によって検出生成物の取出しを
可能にする抗原に結合される。その後で、検出生成物を
不溶性の担体［（Ｉ）］上に捕獲することによって、そ
の検出生成物を溶液から取り出すことができる。標識さ
れた検出生成物を溶液から取り出すこの方法も、その検
出生成物が依然として増幅生成物にハイブリッド形成さ
れている間に行ってよい。
別の実施態様では、第１検出プローブが第１隣接標識
に結合され、第２検出プローブが対応する第２隣接標識
に結合される。その標識された検出プローブは、検出可
能な信号を生じるように、その２つの隣接標識が互いに
相互作用するのを可能にするのに十分なだけ隣接してハ
イブリッド形成する。例えば、その第１隣接標識は、第
２酵素の基質として働く生成物を生成する第１酵素であ
ってよい。その第２酵素は第２隣接標識として第２検出
プローブに結合されてよい。その２つの酵素標識された
検出プローブが隣接する場合には、第１酵素からの生成
物がバルク溶液の中へ逃散する前に、第２酵素がその生
成分に作用して検出され得る第２生成物を生成する。
に結合され、第２検出プローブが対応する第２隣接標識
に結合される。その標識された検出プローブは、検出可
能な信号を生じるように、その２つの隣接標識が互いに
相互作用するのを可能にするのに十分なだけ隣接してハ
イブリッド形成する。例えば、その第１隣接標識は、第
２酵素の基質として働く生成物を生成する第１酵素であ
ってよい。その第２酵素は第２隣接標識として第２検出
プローブに結合されてよい。その２つの酵素標識された
検出プローブが隣接する場合には、第１酵素からの生成
物がバルク溶液の中へ逃散する前に、第２酵素がその生
成分に作用して検出され得る第２生成物を生成する。
或いは、蛍光化合物又は化学発光化合物のようなエネ
ルギー供与体を、第１隣接標識として使用してもよく、
ローダミンのようなエネルギー受容体を第２隣接標識と
して利用してもよい。標識された２つの検出プローブを
隣接させる場合には、エネルギー移動反応がその２つの
隣接標識の間で起こり、その結果、測定可能なエネルギ
ー放出を生じる。形成された検出生成物の量を測定する
ための更に他の方法は、当業者には明らかであろう。
ルギー供与体を、第１隣接標識として使用してもよく、
ローダミンのようなエネルギー受容体を第２隣接標識と
して利用してもよい。標識された２つの検出プローブを
隣接させる場合には、エネルギー移動反応がその２つの
隣接標識の間で起こり、その結果、測定可能なエネルギ
ー放出を生じる。形成された検出生成物の量を測定する
ための更に他の方法は、当業者には明らかであろう。
検出法は、検出プローブを結合させるための鋳型とし
て働く増幅生成物の存在に依存して設計されている。し
かし、単一の非連結増幅プローブがその２つの検出プロ
ーブの双方の部分に対して相補的である場合には、そう
した単一の非連結増殖プローブ（例えば、第２図のAP
２′）が単独で２つの検出プローブを結合することを可
能にする。この現象は「架橋（bridging）」効果と呼ぶ
ことができる。従って、検出プローブと非連結AP２′プ
ローブとの重なり度合いが最小化されるように、AP２′
プローブの長さを制限することが好ましい。これは、非
連結AP２′プローブが単独で２つの検出プローブを結合
する「架橋」を形成する傾向を減少させる。「架橋」効
果による検出生成物の形成を最小化するために、高
温、、低イオン強度緩衝液、及び／又はホルムアミドや
尿素のような変性剤を、短い増幅プローブの代替物とし
て連結反応に使用してもよい。
て働く増幅生成物の存在に依存して設計されている。し
かし、単一の非連結増幅プローブがその２つの検出プロ
ーブの双方の部分に対して相補的である場合には、そう
した単一の非連結増殖プローブ（例えば、第２図のAP
２′）が単独で２つの検出プローブを結合することを可
能にする。この現象は「架橋（bridging）」効果と呼ぶ
ことができる。従って、検出プローブと非連結AP２′プ
ローブとの重なり度合いが最小化されるように、AP２′
プローブの長さを制限することが好ましい。これは、非
連結AP２′プローブが単独で２つの検出プローブを結合
する「架橋」を形成する傾向を減少させる。「架橋」効
果による検出生成物の形成を最小化するために、高
温、、低イオン強度緩衝液、及び／又はホルムアミドや
尿素のような変性剤を、短い増幅プローブの代替物とし
て連結反応に使用してもよい。
検出法は、増幅法と組み合わせて使用するために比較
的単純である。検出法はさらに２つのプローブ試薬とハ
イブリッド形成のさらに１つのサイクルだけを必要とす
る。検出プローブのハイブリッド形成の後に連結反応が
続き、幾つかの事例では、選ばれた特定のアッセイに応
じて、適宜変性段階も続く。それに続く固体担体上への
固定化は急速であり、僅かしか実施時間を必要としな
い。
的単純である。検出法はさらに２つのプローブ試薬とハ
イブリッド形成のさらに１つのサイクルだけを必要とす
る。検出プローブのハイブリッド形成の後に連結反応が
続き、幾つかの事例では、選ばれた特定のアッセイに応
じて、適宜変性段階も続く。それに続く固体担体上への
固定化は急速であり、僅かしか実施時間を必要としな
い。
選ばれた特定のアッセイにおいて最大の感度を達成す
るように選択された方法を適合させるために、多数のパ
ラメータを調整することが可能な独特の能力の故に、本
発明は特に有利である。例えば、PAGE及びそれに続くオ
ートラジオグラフィーの２段階法と組み合わせた本発明
の増幅法を使用するアッセイの感度を改善するために、
増幅プローブの対の数を調製することが可能である。
るように選択された方法を適合させるために、多数のパ
ラメータを調整することが可能な独特の能力の故に、本
発明は特に有利である。例えば、PAGE及びそれに続くオ
ートラジオグラフィーの２段階法と組み合わせた本発明
の増幅法を使用するアッセイの感度を改善するために、
増幅プローブの対の数を調製することが可能である。
本発明の増幅法と組み合わせて検出法を使用すること
によって、さらに操作用のパラメータを得ることができ
る。増幅法と検出法の双方を同一の方法に組み入れる場
合には、偽の増幅副生成物が偶然生成することの影響
は、増幅プローブの対の数を増加して使用しその検出方
法の識別能力を利用することによって、著しく最小化さ
れる。
によって、さらに操作用のパラメータを得ることができ
る。増幅法と検出法の双方を同一の方法に組み入れる場
合には、偽の増幅副生成物が偶然生成することの影響
は、増幅プローブの対の数を増加して使用しその検出方
法の識別能力を利用することによって、著しく最小化さ
れる。
本発明の試薬（増幅プローブ及び検出プローブ）は、
当業者に公知の多数の利用可能な従来技術のオリゴヌク
レオチド合成方法のいずれか１つを使用して、合成され
てもよい。好ましい方法の１つは、市販の試薬及び自動
合成装置を使用する４段階法である。この４段階法は、
（１）ポリマー結合によって保護された出発ヌクレオチ
ド（塩基配列中の第１の核酸）の脱保護と、（２）その
脱保護された出発ヌクレオシドと、保護されたヌクレオ
シドホスホラミジト（nucleoside phosphoramidite）
（塩基配列中の第２の核酸）との縮合と、（３）そのヌ
クレオシドの未反応５′−ヒドロキシ基のキャップ形成
（capping）と、それに続く、（４）新たに形成された
ホスファイト結合の酸化とを含む。
当業者に公知の多数の利用可能な従来技術のオリゴヌク
レオチド合成方法のいずれか１つを使用して、合成され
てもよい。好ましい方法の１つは、市販の試薬及び自動
合成装置を使用する４段階法である。この４段階法は、
（１）ポリマー結合によって保護された出発ヌクレオチ
ド（塩基配列中の第１の核酸）の脱保護と、（２）その
脱保護された出発ヌクレオシドと、保護されたヌクレオ
シドホスホラミジト（nucleoside phosphoramidite）
（塩基配列中の第２の核酸）との縮合と、（３）そのヌ
クレオシドの未反応５′−ヒドロキシ基のキャップ形成
（capping）と、それに続く、（４）新たに形成された
ホスファイト結合の酸化とを含む。
それに続いて、部分的に合成されたポリマー結合オリ
ゴヌクレオチド塩基配列に更に核酸を付加するために、
望ましいヌクレオチドが完成するまで、これらの４つの
段階が繰り返される。そのプロセスの各々の反復におい
て、最後に付加されたヌクレオシドホスホラミジトがそ
の次のサイクルにおける出発ヌクレオシドとなる。
ゴヌクレオチド塩基配列に更に核酸を付加するために、
望ましいヌクレオチドが完成するまで、これらの４つの
段階が繰り返される。そのプロセスの各々の反復におい
て、最後に付加されたヌクレオシドホスホラミジトがそ
の次のサイクルにおける出発ヌクレオシドとなる。
最終的な合成オリゴヌクレオチド鎖をそのポリマーか
ら抽出するために、得られたオリゴヌクレオチドを、合
成するためのアンカーとして働いたポリマーから先ず最
初に分離しなければならない。そのオリゴヌクレオチド
の分離は、室温で、新鮮な濃アンモニアを用いて処理す
ることによって実施し得る。そのポリマーからオリゴヌ
クレオチド溶液をデカントした後、典型的には、密封さ
れたチューブの中で長時間、濃アンモニア溶液を加熱し
てそのヌクレオシド保護基を除去する。その後、そのオ
リゴヌクレオチド溶液を、１−ブタノール及びエチルエ
ーテルのような有機溶剤を用いて抽出し、更に、合成さ
れたオリゴヌクレオチドの濃度を決定するために、その
溶液の各々の光学密度を260nmで分光学的に測定する。
それに続いて、調製用電気泳動又はカラムクロマトグラ
フィー法という公知の方法を使用して精製及び脱塩する
ために、オリゴヌクレオチド溶液を乾燥してもよい。
ら抽出するために、得られたオリゴヌクレオチドを、合
成するためのアンカーとして働いたポリマーから先ず最
初に分離しなければならない。そのオリゴヌクレオチド
の分離は、室温で、新鮮な濃アンモニアを用いて処理す
ることによって実施し得る。そのポリマーからオリゴヌ
クレオチド溶液をデカントした後、典型的には、密封さ
れたチューブの中で長時間、濃アンモニア溶液を加熱し
てそのヌクレオシド保護基を除去する。その後、そのオ
リゴヌクレオチド溶液を、１−ブタノール及びエチルエ
ーテルのような有機溶剤を用いて抽出し、更に、合成さ
れたオリゴヌクレオチドの濃度を決定するために、その
溶液の各々の光学密度を260nmで分光学的に測定する。
それに続いて、調製用電気泳動又はカラムクロマトグラ
フィー法という公知の方法を使用して精製及び脱塩する
ために、オリゴヌクレオチド溶液を乾燥してもよい。
リガーゼを用いてハイブリッド形成されたプローブを
結合する場合には、増幅プローブ及び検出プローブを、
使用可能な公知の方法のいずれかを使用してリン酸化し
てもよい。好ましい方法の１つは、ポリヌクレオチドキ
ナーゼを触媒とするリンの取り込みである。別の好まし
い方法は、オリゴヌクレオチドをその担体から取り出す
前に、そのオリゴヌクレオチドプローブが合成ポリマー
に依然として固着されている間に化学合成によって行う
ものである。又、リン酸化のために放射性リンを使用す
ることは、増幅生成物をその後でオートラジオグラフィ
ーによって即ち放射性標識によって視覚化するための手
段をも提供する。
結合する場合には、増幅プローブ及び検出プローブを、
使用可能な公知の方法のいずれかを使用してリン酸化し
てもよい。好ましい方法の１つは、ポリヌクレオチドキ
ナーゼを触媒とするリンの取り込みである。別の好まし
い方法は、オリゴヌクレオチドをその担体から取り出す
前に、そのオリゴヌクレオチドプローブが合成ポリマー
に依然として固着されている間に化学合成によって行う
ものである。又、リン酸化のために放射性リンを使用す
ることは、増幅生成物をその後でオートラジオグラフィ
ーによって即ち放射性標識によって視覚化するための手
段をも提供する。
本発明のプローブは又、他の標識を結合するために、
公知の方法に従って他の標識を与えてもよい。例えば、
核酸プローブは２段階法を用いてその５′末端にフルオ
レセインで標識してもよく、この方法ではアミノ基が合
成の間に最初に結合される。担体からのオリゴアミンの
除去の後に、FITC（フルオレセインイソチオシアネー
ト）のDMSO（ジメチルスルホキシド）溶液を使用して、
フルオレセインをアミン修飾オリゴヌクレオチドに結合
する。
公知の方法に従って他の標識を与えてもよい。例えば、
核酸プローブは２段階法を用いてその５′末端にフルオ
レセインで標識してもよく、この方法ではアミノ基が合
成の間に最初に結合される。担体からのオリゴアミンの
除去の後に、FITC（フルオレセインイソチオシアネー
ト）のDMSO（ジメチルスルホキシド）溶液を使用して、
フルオレセインをアミン修飾オリゴヌクレオチドに結合
する。
実施例 １ オリゴヌクレオチド塩基配列の調製 本発明の効果を実証するために、幾つかの異なった合
成増幅塩基配列を使用した。第３図に示すように、合成
増幅塩基配列は、HILV−Ｉの51塩基対Pst1断片の中に含
まれる。増幅プローブ及び検出プローブも、第３図に示
した核酸塩基配列に対応するように合成された。
成増幅塩基配列を使用した。第３図に示すように、合成
増幅塩基配列は、HILV−Ｉの51塩基対Pst1断片の中に含
まれる。増幅プローブ及び検出プローブも、第３図に示
した核酸塩基配列に対応するように合成された。
全てのオリゴヌクレオチド塩基配列（増幅プローブ、
検出プローブ、及び合成増幅塩基配列）は、後述するよ
うに、数回の中間洗浄を伴う４段階法を使用して合成し
た。合成は、市販の試薬を使用し、Applied Biosystems
社（ABI,Foster City,California）のModel 380自動合
成装置を用いて行った。
検出プローブ、及び合成増幅塩基配列）は、後述するよ
うに、数回の中間洗浄を伴う４段階法を使用して合成し
た。合成は、市販の試薬を使用し、Applied Biosystems
社（ABI,Foster City,California）のModel 380自動合
成装置を用いて行った。
最初に、担体カラム内のポリマー結合ジメトキシルト
リチルによって保護されたヌクレオシド（塩基配列中の
第１核酸）から、ジクロロメタン中にトリクロロ酢酸を
３％含む溶液を１分間そのカラム中を通過させることに
よって、その５′−ジメトキシトリチル保護基が除去さ
れた。その後で、そのポリマーをアセトニトリルで洗浄
し、次いで乾燥アセトニトリルですすいだ。その後、脱
保護されたヌクレオシドを含むそのポリマーは、次の
（縮合）段階に進む前に、アルゴン下に置かれた。
リチルによって保護されたヌクレオシド（塩基配列中の
第１核酸）から、ジクロロメタン中にトリクロロ酢酸を
３％含む溶液を１分間そのカラム中を通過させることに
よって、その５′−ジメトキシトリチル保護基が除去さ
れた。その後で、そのポリマーをアセトニトリルで洗浄
し、次いで乾燥アセトニトリルですすいだ。その後、脱
保護されたヌクレオシドを含むそのポリマーは、次の
（縮合）段階に進む前に、アルゴン下に置かれた。
縮合段階は、最初にそのポリマーをアセトニトリル中
のテトラゾールで処理することによって行った。次に、
ポリマーを結合した脱保護ヌクレオシドを、アセトニト
リル中で、保護されたシアノエチルヌクレオシドホスホ
ラミジト（塩基配列中の第２核酸;ABI,Foster City,Cal
ifornia）と反応した。この縮合反応を2.0分間実施し、
その後で反応物を濾過によって取り出した。
のテトラゾールで処理することによって行った。次に、
ポリマーを結合した脱保護ヌクレオシドを、アセトニト
リル中で、保護されたシアノエチルヌクレオシドホスホ
ラミジト（塩基配列中の第２核酸;ABI,Foster City,Cal
ifornia）と反応した。この縮合反応を2.0分間実施し、
その後で反応物を濾過によって取り出した。
縮合後、THF（テトラヒドロフラン）中に無水酢酸及
び2,6−ルチジンを含む、ABI（Foster City,Californi
a）から市販の混合物１部と、THF中の１−メチルイミダ
ゾール（ABI.Foster City,Californiaから市販）１部と
を混合することによって調製した溶液を、該カラムの中
を１分間に亘って通過させることによって、ヌクレオシ
ドの未反応５′−ヒドロキシル基をキャップした。
び2,6−ルチジンを含む、ABI（Foster City,Californi
a）から市販の混合物１部と、THF中の１−メチルイミダ
ゾール（ABI.Foster City,Californiaから市販）１部と
を混合することによって調製した溶液を、該カラムの中
を１分間に亘って通過させることによって、ヌクレオシ
ドの未反応５′−ヒドロキシル基をキャップした。
キャップ形成溶液を取り出した後、そのポリマーを1.
5分間に亘って酸化溶液（H2O中の0.1MI2/2,6−ルチジン
/THF,1:10:40）で処理した。この後、アセトニトリルで
すすいだ。トリクロロ酢酸／塩化メチレン脱保護からサ
イクルが再び始まり、所望のオリゴヌクレオチド塩基配
列が得られるまでこのサイクルを繰り返した。
5分間に亘って酸化溶液（H2O中の0.1MI2/2,6−ルチジン
/THF,1:10:40）で処理した。この後、アセトニトリルで
すすいだ。トリクロロ酢酸／塩化メチレン脱保護からサ
イクルが再び始まり、所望のオリゴヌクレオチド塩基配
列が得られるまでこのサイクルを繰り返した。
最終のポリマー結合オリゴヌクレオチド鎖を新鮮な濃
アンモニアを用いて室温で２時間処理した。そのポリマ
ーから溶液をデカントした後、密閉チューブ中でその濃
アンモニア溶液を60℃で16時間加熱した。
アンモニアを用いて室温で２時間処理した。そのポリマ
ーから溶液をデカントした後、密閉チューブ中でその濃
アンモニア溶液を60℃で16時間加熱した。
オリゴヌクレオチド溶液の各々を１−ブタノール及び
エチルエーテルを用いて抽出した。抽出された各々の溶
液の濃度を、260nmでの吸収を測定することによって分
光学的に測定した。5.0O.D.単位の合成オリゴヌクレオ
チドを含む各抽出溶液のアリコートを調製用電気泳動に
掛けるために濃縮し、15％ポリアクリルアミド７モル尿
素ゲル中に載置した。電気泳動後、生成物バンドをU.V.
シャドウイングによって視覚化し、前記ゲルから切り取
り、溶離緩衝液（300mM酢酸ナトリウム（NaOAc）,2.5mM
EDTA、100mM Tris−HCl,pH8.0）を用いて抽出し、その
後、TEAB溶離液（重炭酸トリエチルアンモニウム）を使
用して、Ｇ−50 Sephader （Pharmacia LKB Biotech.I
nc.,Piscataway.New Jersey）カラムで脱塩し、精製オ
リゴヌクレオチドを得た。
エチルエーテルを用いて抽出した。抽出された各々の溶
液の濃度を、260nmでの吸収を測定することによって分
光学的に測定した。5.0O.D.単位の合成オリゴヌクレオ
チドを含む各抽出溶液のアリコートを調製用電気泳動に
掛けるために濃縮し、15％ポリアクリルアミド７モル尿
素ゲル中に載置した。電気泳動後、生成物バンドをU.V.
シャドウイングによって視覚化し、前記ゲルから切り取
り、溶離緩衝液（300mM酢酸ナトリウム（NaOAc）,2.5mM
EDTA、100mM Tris−HCl,pH8.0）を用いて抽出し、その
後、TEAB溶離液（重炭酸トリエチルアンモニウム）を使
用して、Ｇ−50 Sephader （Pharmacia LKB Biotech.I
nc.,Piscataway.New Jersey）カラムで脱塩し、精製オ
リゴヌクレオチドを得た。
実施例 ２ ２対のプローブを用いた、５サイクルの増幅 ２対の増幅プローブ及び酵素による連結反応を使用す
る、５サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。
る、５サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。
増幅塩基配列の量 反応I :各10fmolのAS1-2及びAS１−２′。
反応II:増幅塩基配列なし。
添加試薬： E.coli DNAリガーゼ緩衝液（ELB）が、500mM Tris−
HCl（pH8.0）,40mM MgCl2、10mM EDTA（エチレンジアミ
ン四酢酸）,50mM DTT（ジチオスレイトール）、及び500
μg/mlのBSA（牛血清アルブミン）を含むように、10x濃
度で調製された。
HCl（pH8.0）,40mM MgCl2、10mM EDTA（エチレンジアミ
ン四酢酸）,50mM DTT（ジチオスレイトール）、及び500
μg/mlのBSA（牛血清アルブミン）を含むように、10x濃
度で調製された。
リザーゼ/NAD（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド）試薬が、130μM NDAを含むようにELB中で1x濃
度で調製され、その試薬の２μは1.6単位のE.coli Li
gase（BoehringerMannheim Biochemicals,Indianapoli
s,Indiana）を含んだ。この試薬を増幅サイクルの持続
時間の間は濡れた氷の上に保存した。
オチド）試薬が、130μM NDAを含むようにELB中で1x濃
度で調製され、その試薬の２μは1.6単位のE.coli Li
gase（BoehringerMannheim Biochemicals,Indianapoli
s,Indiana）を含んだ。この試薬を増幅サイクルの持続
時間の間は濡れた氷の上に保存した。
EDTA/染料試薬が、11.8mM EDTA,6.3M尿素,0.02％ブロ
モフェノールブルー，及び0.02％キシレンシアノールを
含むように調製された。
モフェノールブルー，及び0.02％キシレンシアノールを
含むように調製された。
増幅プローブAP１′及びAP2を、約700Ci/mmolの比活
性を有するように（低温リンで）調整されたγ−32P−A
TP（アデノシン−５′−三リン酸）と、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Bochringer Mannheim Biochemicals,India
napolis,Indiana）とを用いてリン酸化した。リン酸化
のために放射性リンを使用することは、２つの役割を、
即ち（１）連結反応に必要な増幅プローブ末端をリン酸
化して増幅生成物を形成すること、及び（２）それに続
く、オートラジオグラフィーによる増幅生成物の視覚化
のための手段を提供することという２つの役割を果たし
た。
性を有するように（低温リンで）調整されたγ−32P−A
TP（アデノシン−５′−三リン酸）と、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Bochringer Mannheim Biochemicals,India
napolis,Indiana）とを用いてリン酸化した。リン酸化
のために放射性リンを使用することは、２つの役割を、
即ち（１）連結反応に必要な増幅プローブ末端をリン酸
化して増幅生成物を形成すること、及び（２）それに続
く、オートラジオグラフィーによる増幅生成物の視覚化
のための手段を提供することという２つの役割を果たし
た。
反応混合物の各々を、ゴム製Ｏリング付きのスクリュ
ートップ式1.5mlポリプロピレンマイクロチューブ（Sar
stedt,Inc.,Princeton,New Jersey）中容量13μで、E
LB中1.15x濃度で開始し、このとき、上記の増幅塩基配
列の量に加えて、各1.5pmolの増幅プローブAP1,32P−AP
１′,32P−AP2及びAP２′を含有させた。
ートップ式1.5mlポリプロピレンマイクロチューブ（Sar
stedt,Inc.,Princeton,New Jersey）中容量13μで、E
LB中1.15x濃度で開始し、このとき、上記の増幅塩基配
列の量に加えて、各1.5pmolの増幅プローブAP1,32P−AP
１′,32P−AP2及びAP２′を含有させた。
反応Ｉ及びIIを、次のような５つのサイクルの増幅に
掛けた。
掛けた。
1. 前記ポリプロピレンマイクロチューブを密閉し、試
験管ラックに固定し、その後で、５分間、90℃の水浴の
中に入れた。
験管ラックに固定し、その後で、５分間、90℃の水浴の
中に入れた。
2. 次いで、前記反応チューブを水浴から取り出し、室
温に５分間静置し、その後、そのチューブをエッペンド
ルフミクロ遠心機で短時間（数秒）遠心した。
温に５分間静置し、その後、そのチューブをエッペンド
ルフミクロ遠心機で短時間（数秒）遠心した。
3. 2.0μのリガーゼ/NAD試薬を各々のチューブに加
え、その内容物を軽い撹拌によって混合した。連結反応
を室温で５分間進行させて、増幅サイクルを完了させ
た。
え、その内容物を軽い撹拌によって混合した。連結反応
を室温で５分間進行させて、増幅サイクルを完了させ
た。
4. 前記ポリプロピレンマイクロチューブを再びエッペ
ンドルフミクロ遠心機で短時間遠心し、段階１〜３を４
回繰り返して５つのサイクルの増幅を完了させた。
ンドルフミクロ遠心機で短時間遠心し、段階１〜３を４
回繰り返して５つのサイクルの増幅を完了させた。
最終サイクルの後、23μのEDTA/染料試薬を加える
ことによって、その反応を止めた。止められた反応混合
物を、その後、90℃で５分間インキュベーションし、次
に氷上で急冷した。増幅によって得られた生成物を、当
業者に公知の標準的な技術を用いて、変性作用のある15
％ポリアクリルアミドゲル（PAGE）上の試料を電気泳動
により移動させることによって分析し、及び放射性標識
された生成物をオートラジオグラフィーによって視覚化
した。
ことによって、その反応を止めた。止められた反応混合
物を、その後、90℃で５分間インキュベーションし、次
に氷上で急冷した。増幅によって得られた生成物を、当
業者に公知の標準的な技術を用いて、変性作用のある15
％ポリアクリルアミドゲル（PAGE）上の試料を電気泳動
により移動させることによって分析し、及び放射性標識
された生成物をオートラジオグラフィーによって視覚化
した。
反応効率は、UltroScanTMXLレーザーデンシトメータ
ー（Pharmacia LKB Biotech,Inc.,Piscataway,New Jers
ey）を用いてレーザーデンシトメトリーを走査し信号を
積分することによって測定される場合の、残存している
15マー非連結増幅プローブの量を、得られた30マー増幅
生成物の量と比較することによって減算された。
ー（Pharmacia LKB Biotech,Inc.,Piscataway,New Jers
ey）を用いてレーザーデンシトメトリーを走査し信号を
積分することによって測定される場合の、残存している
15マー非連結増幅プローブの量を、得られた30マー増幅
生成物の量と比較することによって減算された。
反応Ｉは、出発増幅塩基配列の10fmolという最初の量
から、145fmolの30マー増幅生成物を生成し、理論的に
可能な32倍の増幅に対して14.5倍の増幅をもたらし、即
ち、サイクル当たり71％という平均効率をもたらした。
から、145fmolの30マー増幅生成物を生成し、理論的に
可能な32倍の増幅に対して14.5倍の増幅をもたらし、即
ち、サイクル当たり71％という平均効率をもたらした。
反応II,30マー増幅生成物は全く検出されなかった
（出発増幅塩基配列AS1-2及びAS１−２′を含有しない
対照である）。
（出発増幅塩基配列AS1-2及びAS１−２′を含有しない
対照である）。
実施例 ３ ２対のプローブを用いる、10サイクルの増幅 ２対の増幅プローブ及び酵素による連結反応を使用す
る、10サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。
る、10サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。
増幅塩基配列の量 反応I :各1fmolのAS1-2及びAS１−２′。
反応II:増幅塩基配列なし。
添加試薬： E.coli DNAリガーゼ緩衝液（ELB），リガーゼ/NAD試
薬、及びEDTA/染料を実施例２の場合と同様に調製し
た。
薬、及びEDTA/染料を実施例２の場合と同様に調製し
た。
増幅プローブAP１′及びAP2を、γ−32P−ATP及びポ
リヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim Bioche
micals,Indianapolis,indiana）とを用いて、約700Ci/m
molの比活性でリン酸化した。
リヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim Bioche
micals,Indianapolis,indiana）とを用いて、約700Ci/m
molの比活性でリン酸化した。
反応混合物の各々を、スクリュートップ式ポリプロピ
レンマイクロチューブ中容量13μで、ELB中1.15x濃度
で開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加え
て、各2.0pmolの増幅プローブAP1,32P−AP１′,32P−AP
２′及びAP２′を含ませた。
レンマイクロチューブ中容量13μで、ELB中1.15x濃度
で開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加え
て、各2.0pmolの増幅プローブAP1,32P−AP１′,32P−AP
２′及びAP２′を含ませた。
反応Ｉ及びIIを、段階１〜３を９回繰り返したという
ことを除いて、実施例２に記載した手順に従う10サイク
ルの増幅に掛けた。
ことを除いて、実施例２に記載した手順に従う10サイク
ルの増幅に掛けた。
最終サイクルの後、33μのEDTA/染料試薬を加える
ことによって、その反応を止め、その後90℃で５分間加
熱し、氷上で急冷した。増幅によって得られた生成物
を、変性作用のある15％PAGE上の反応混合物を泳動する
ことによって分析し、及びオートラジオグラフィーによ
って視覚化した（第４図）。
ことによって、その反応を止め、その後90℃で５分間加
熱し、氷上で急冷した。増幅によって得られた生成物
を、変性作用のある15％PAGE上の反応混合物を泳動する
ことによって分析し、及びオートラジオグラフィーによ
って視覚化した（第４図）。
生成物の収率は、走査レーザーデンシトメトリーから
の積分信号によって測定される場合の、得られた30マー
増幅生成物の相対強度を、残存している15マー非連結増
幅プローブのものと比較することによって決定された
（注：得られた２つの鎖AS1-2及びAS１−２′の異なっ
た塩基組成に起因する２つの30マーバンドが存在し
た）。
の積分信号によって測定される場合の、得られた30マー
増幅生成物の相対強度を、残存している15マー非連結増
幅プローブのものと比較することによって決定された
（注：得られた２つの鎖AS1-2及びAS１−２′の異なっ
た塩基組成に起因する２つの30マーバンドが存在し
た）。
反応Ｉは、出発増幅塩基配列1fmolという最初の量か
ら、288fmolの30マー増幅生成物を生成した。達成され
た288倍の増幅は、計算により76％の全平均効率を表わ
す。
ら、288fmolの30マー増幅生成物を生成した。達成され
た288倍の増幅は、計算により76％の全平均効率を表わ
す。
反応II（増幅塩基配列を含有しない対照である）のオ
ートラジオグラムは、１時間の照射後、検出可能な30マ
ー増幅生成物を全く示さなかった。しかし。一晩（16時
間）照射したオートラジオグラムは反応IIにおいて微量
の30マー生成物を示し、増幅塩基配列の非存在中での平
滑末端連結反応による生成物形成を示した。この生成物
の量は、レーザーデンシトメトリーを走査することによ
り約14fmolと概算された。
ートラジオグラムは、１時間の照射後、検出可能な30マ
ー増幅生成物を全く示さなかった。しかし。一晩（16時
間）照射したオートラジオグラムは反応IIにおいて微量
の30マー生成物を示し、増幅塩基配列の非存在中での平
滑末端連結反応による生成物形成を示した。この生成物
の量は、レーザーデンシトメトリーを走査することによ
り約14fmolと概算された。
実施例 ４ ３対のプローブを用いた、５サイクルの増幅 ３対の増幅プローブ及び酵素による連結反応を使用す
る、５つのサイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価す
るために、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次
のように確定した。
る、５つのサイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価す
るために、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次
のように確定した。
増幅塩基配列の量 反応I :各5fmolのAS1-3及びAS１−３′。
反応II:増幅塩基配列なし。
添加試薬： E.coli DNAリガーゼ緩衝液（ELB）及びEDTA/染料を
実施例２の場合と同様に調製した。
実施例２の場合と同様に調製した。
リガーゼ/NAD試薬を130μM NDAを含むようにELB中で1
x濃度で調製し、E.coli Ligase（ICN Biomcdicals,In
c.,CostaMesa.California）の濃度は25単位／μとし
た。この試薬は増幅サイクルの持続時間中濡れた氷の上
に保存された。
x濃度で調製し、E.coli Ligase（ICN Biomcdicals,In
c.,CostaMesa.California）の濃度は25単位／μとし
た。この試薬は増幅サイクルの持続時間中濡れた氷の上
に保存された。
この実施例では、非放射性ホスホリル基を５′−末端
に導入することによって増幅プローブAP１′,AP2,AP
２′及びAP3をリン酸化し、更に、PAGEオートラジオグ
ラフィーによって増幅後に得られた生成物を視覚化する
ために使用される放射性標識を、別の手段によって与え
られた。この非放射性ホスホリル基を増幅プローブAP
１′,AP2,AP２′及びAP3に化学的に導入し、この間それ
らのプローブは、５′−Chemical Phosphorylating Rea
gent（Glen Research Corpotation,Herndon,Vorginia）
を使用するヌクレオチド脱保護前には、依然として合成
樹脂上にあった［Horn,T.ら、Tetraheron Let.,27,4705
（1986）］。
に導入することによって増幅プローブAP１′,AP2,AP
２′及びAP3をリン酸化し、更に、PAGEオートラジオグ
ラフィーによって増幅後に得られた生成物を視覚化する
ために使用される放射性標識を、別の手段によって与え
られた。この非放射性ホスホリル基を増幅プローブAP
１′,AP2,AP２′及びAP3に化学的に導入し、この間それ
らのプローブは、５′−Chemical Phosphorylating Rea
gent（Glen Research Corpotation,Herndon,Vorginia）
を使用するヌクレオチド脱保護前には、依然として合成
樹脂上にあった［Horn,T.ら、Tetraheron Let.,27,4705
（1986）］。
その後でオートラジオグラフィーによって増幅生成物
を視覚化するための手段を提供するために、増幅プロー
ブAP1及びAP３′を約7000Ci/mmolの比活性で放射性リン
を使用するγ−32P−ATP及びポリヌクレオチドキナーゼ
（Boehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,In
diana）を用いて、リン酸化した。
を視覚化するための手段を提供するために、増幅プロー
ブAP1及びAP３′を約7000Ci/mmolの比活性で放射性リン
を使用するγ−32P−ATP及びポリヌクレオチドキナーゼ
（Boehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,In
diana）を用いて、リン酸化した。
リン酸化に続いて、所望の最終比活性700Ci/mmolを達
成するために、32P−AP1及び32P−AP３′プローブを、
非リン酸化AP1及びAP３′プローブを用いて1:10の比に
希釈した。増幅塩基配列の非存在中でのランダム生成物
の平滑末端アセンブリへの増幅プローブ５′−末端の参
入を最小化するために、この方法で増幅プローブを調製
した。即ち、AP1及びAP３′プローブの10分の１だけが
リン酸化され、従ってそれだけが連結反応事象に関与す
ることが可能となる。
成するために、32P−AP1及び32P−AP３′プローブを、
非リン酸化AP1及びAP３′プローブを用いて1:10の比に
希釈した。増幅塩基配列の非存在中でのランダム生成物
の平滑末端アセンブリへの増幅プローブ５′−末端の参
入を最小化するために、この方法で増幅プローブを調製
した。即ち、AP1及びAP３′プローブの10分の１だけが
リン酸化され、従ってそれだけが連結反応事象に関与す
ることが可能となる。
反応混合物の各々を、スクリュートップ式ポリプロピ
レンマイクロチューブ中容量８μで、ELB中1x濃度で
開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加えて、
各1.0pmolの増幅プローブ32P−AP1,P−AP１′,P−AP2,P
−AP２′,P−AP3及び32P−AP３′を含有させた。
レンマイクロチューブ中容量８μで、ELB中1x濃度で
開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加えて、
各1.0pmolの増幅プローブ32P−AP1,P−AP１′,P−AP2,P
−AP２′,P−AP3及び32P−AP３′を含有させた。
反応Ｉ及びIIを、実施例２で説明したように、５つの
サイクルの増幅に掛けた。
サイクルの増幅に掛けた。
最終増幅サイクルの後、18μのEDTA/染料試薬を加
えることによってその反応を止めた。それに続き、この
停止されて反応混合物を90℃で５分間加熱し、その後で
氷上で急冷した。次に、各々の反応チューブ内の内容物
を、変性作用のある15％PAGE上で泳動し、その反応生成
物をオートラジオグラフィーによって視覚化した。その
収率は、レーザーデンシトメトリーを走査することによ
って定量する場合の、残存する15マー増幅プローブ対45
マー連結増幅生成物の比から概算された。
えることによってその反応を止めた。それに続き、この
停止されて反応混合物を90℃で５分間加熱し、その後で
氷上で急冷した。次に、各々の反応チューブ内の内容物
を、変性作用のある15％PAGE上で泳動し、その反応生成
物をオートラジオグラフィーによって視覚化した。その
収率は、レーザーデンシトメトリーを走査することによ
って定量する場合の、残存する15マー増幅プローブ対45
マー連結増幅生成物の比から概算された。
反応Ｉは、出発増幅塩基配列5fmolから、64.5fmolの4
5マー増幅生成物を生成し、12.9倍の増幅をもたらし、
即ち、サイクル当たり67％という平均効率をもたらし
た。反応IIは、夜通しのオートラジオグラフィーの後で
さえ、45マー増幅生成物を全く示さなかった。
5マー増幅生成物を生成し、12.9倍の増幅をもたらし、
即ち、サイクル当たり67％という平均効率をもたらし
た。反応IIは、夜通しのオートラジオグラフィーの後で
さえ、45マー増幅生成物を全く示さなかった。
実施例 ５ ３対のプローブを用いた、10サイクルの増幅 ３対の増幅プローブ及び酵素により連結反応を使用す
る、10サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。
る、10サイクルの増幅を伴う増幅法の効率を評価するた
めに、２つの反応を実施した。可変的な反応物を次のよ
うに確定した。
増幅塩基配列の量 反応I :各2fmolのAS1-3及びAS１−３′。
反応II:増幅塩基配列なし。
添加試薬： E.coli DNAリガーゼ緩衝液（ELB）及びEDTA/染料を
実施例２の場合と同様に調製した。
実施例２の場合と同様に調製した。
リガーゼ/NAD試薬を、130μM NDAを含むようにELB中
で1x濃度で調製し、E.coli Ligse（New England Biolab
s Lnc.,Beverly,Massachusetts）の濃度を１単位／μ
とし、この試薬は増幅サイクルの持続時間中濡れた氷の
上に保存された。
で1x濃度で調製し、E.coli Ligse（New England Biolab
s Lnc.,Beverly,Massachusetts）の濃度を１単位／μ
とし、この試薬は増幅サイクルの持続時間中濡れた氷の
上に保存された。
すべての増幅プローブを実施例４で説明した通りにリ
ン酸化した。
ン酸化した。
反応混合物の各々を、スクリュートップ式ポリプロピ
レンマイクロチューブ中容量８μで、ELB中1x濃度で
開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加えて、
各1.0pmolの増幅プローブ32P−AP1,P−AP１′,P−AP2,P
−AP２′,P−AP3及び32P−AP３′を含ませた。
レンマイクロチューブ中容量８μで、ELB中1x濃度で
開始し、このとき、上記の増幅塩基配列の量に加えて、
各1.0pmolの増幅プローブ32P−AP1,P−AP１′,P−AP2,P
−AP２′,P−AP3及び32P−AP３′を含ませた。
両方の反応を実施例３で説明した通りに10サイクルの
増幅を掛けた。最後のサイクルの後で28μのEDTA/染
料試薬を加えることによってその反応を止め、その後90
℃で５分間加熱し、更に、氷上で急冷した。
増幅を掛けた。最後のサイクルの後で28μのEDTA/染
料試薬を加えることによってその反応を止め、その後90
℃で５分間加熱し、更に、氷上で急冷した。
反応混合物を、変性作用のある15％PAGE上に泳動さ
せ、それに続いて、オートラジオグラフィーによって視
覚化した（第５図）。反応Ｉは、前述の走査レーザーデ
ンシトメトリー技術によって測定されるように、244fmo
lの45マー増幅生成物を生成した。この122倍の増幅はサ
イクル当たり62％の全平均効率に相当する。
せ、それに続いて、オートラジオグラフィーによって視
覚化した（第５図）。反応Ｉは、前述の走査レーザーデ
ンシトメトリー技術によって測定されるように、244fmo
lの45マー増幅生成物を生成した。この122倍の増幅はサ
イクル当たり62％の全平均効率に相当する。
夜通しのオートラジオグラフィーは反応IIからの微量
の45マー増幅生成物を示した。隣接するレーンが反応II
からの45マー増幅生成物のデンシトメトリー測定を妨害
したけれども、その45マー生成物の量は視覚的に約0.4f
molと概算された。これは、２対のプローブを使用する1
0サイクルの増幅から得られた約14fmolの30マー平滑末
端生成物（第３図）とは非常に対照的である。従って、
増幅法における３つのプローブの使用は、２つのプロー
ブの使用に比べて、SN比（signal to noise ratio）に
おいて約35倍の利益を与えた。
の45マー増幅生成物を示した。隣接するレーンが反応II
からの45マー増幅生成物のデンシトメトリー測定を妨害
したけれども、その45マー生成物の量は視覚的に約0.4f
molと概算された。これは、２対のプローブを使用する1
0サイクルの増幅から得られた約14fmolの30マー平滑末
端生成物（第３図）とは非常に対照的である。従って、
増幅法における３つのプローブの使用は、２つのプロー
ブの使用に比べて、SN比（signal to noise ratio）に
おいて約35倍の利益を与えた。
実施例 ６ １つの標識された検出プローブを使用する検出法 １つの標識された検出プローブと連結された検出生成
物を生成するための検出プローブの酵素的連結反応とを
使用する本発明の検出システムを実証するために、２つ
の反応を実施した。可変的な反応物を次のように確定し
た。
物を生成するための検出プローブの酵素的連結反応とを
使用する本発明の検出システムを実証するために、２つ
の反応を実施した。可変的な反応物を次のように確定し
た。
増幅生成物の量 反応I :10.0fmolのAS１−３′。
反応II:1000fmolのAP２′ 添加試薬： リガーゼ/NAD試薬を実施例５の場合と同様に調製し
た。
た。
EDTA/染料試薬を、20mM EDTA,6.1M尿素,0.02％ブロモ
フェノールブルー，及び0.02％キシレンシアノールを含
むように調製した。
フェノールブルー，及び0.02％キシレンシアノールを含
むように調製した。
検出プローブDP2を、γ−32P−ATP及びポリヌクレオ
チドキナーゼ（Boehringer Mannheim Biochemicals,Ind
ianapolis,Indiana）を用いて、約7000Ci/mmolの比活性
にリン酸化した。
チドキナーゼ（Boehringer Mannheim Biochemicals,Ind
ianapolis,Indiana）を用いて、約7000Ci/mmolの比活性
にリン酸化した。
反応Ｉ及び反応IIの双方を、容量23μで、ELB中1.0
9x濃度で開始し、このとき検出プローブDP1及び32P−DP
2の各々を100fmolずつその２つの反応混合物を加えた。
9x濃度で開始し、このとき検出プローブDP1及び32P−DP
2の各々を100fmolずつその２つの反応混合物を加えた。
その反応混合物を、90℃で５分間インキュベーション
し、その後、室温で15分間アニーリングした。2.0μ
のリガーゼ/NAD試薬を各ポリプロピレンマイクロチュー
ブに加え、その内容物を軽い撹拌によって混合した。連
結反応を室温で５分間進行させて検出生成物の生成を完
了させた。25μのEDTA/染料試薬を加えることによっ
て反応を止めた。次いで、停止させた反応混合物を90℃
で５分間加熱し、氷上で急冷した。その後、その放射性
生成物を、変性作用のある15％PAGE上で反応混合物を泳
動することによって分離し、その放射性生成物をオート
ラジオグラフィーによって視覚化した（第６図）。反応
Ｉは、予想された30マー検出生成物を生成した。反応II
では、連結された物質の徴候は無かった。
し、その後、室温で15分間アニーリングした。2.0μ
のリガーゼ/NAD試薬を各ポリプロピレンマイクロチュー
ブに加え、その内容物を軽い撹拌によって混合した。連
結反応を室温で５分間進行させて検出生成物の生成を完
了させた。25μのEDTA/染料試薬を加えることによっ
て反応を止めた。次いで、停止させた反応混合物を90℃
で５分間加熱し、氷上で急冷した。その後、その放射性
生成物を、変性作用のある15％PAGE上で反応混合物を泳
動することによって分離し、その放射性生成物をオート
ラジオグラフィーによって視覚化した（第６図）。反応
Ｉは、予想された30マー検出生成物を生成した。反応II
では、連結された物質の徴候は無かった。
実施例 ７ フルオレセインを用いたプローブの標識化 増幅プローブAP1の５′末端を、２段階法を用いてフ
ルオレセインで標識し、このとき合成の最終サイクルに
５′−Amino−Modifier C6（Glen Research Corporatio
n,Herndon,Virginia）を使用して、合成の間に最初に１
つのアミン基を結合させた［B.A.Connoly,Nicleic Acid
Res.，15,3131（1987）］。その５′−アミノ修飾剤は
β−シアノエチルホスホラミジトであり、これは（例え
ば1H−テトラゾールによって）活性化されると、ヌクレ
オシドホスホラミジトとオリゴヌクレオチドとの結合と
同様の仕方でオリゴヌクレオチドの５′末端と結合す
る。第１アミン基はモノメトキシトリチル基で保護さ
れ、その後で、このモノメトキシトリチル基は、トリク
ロロ酢酸を使用する脱保護サイクルの中で取り除かれ
る。（実施例１で説明したように）結合、酸化、脱保
護、及び担体からのオリゴアミンの除去の後で、フルオ
レセインを後述のようにして結合させた。
ルオレセインで標識し、このとき合成の最終サイクルに
５′−Amino−Modifier C6（Glen Research Corporatio
n,Herndon,Virginia）を使用して、合成の間に最初に１
つのアミン基を結合させた［B.A.Connoly,Nicleic Acid
Res.，15,3131（1987）］。その５′−アミノ修飾剤は
β−シアノエチルホスホラミジトであり、これは（例え
ば1H−テトラゾールによって）活性化されると、ヌクレ
オシドホスホラミジトとオリゴヌクレオチドとの結合と
同様の仕方でオリゴヌクレオチドの５′末端と結合す
る。第１アミン基はモノメトキシトリチル基で保護さ
れ、その後で、このモノメトキシトリチル基は、トリク
ロロ酢酸を使用する脱保護サイクルの中で取り除かれ
る。（実施例１で説明したように）結合、酸化、脱保
護、及び担体からのオリゴアミンの除去の後で、フルオ
レセインを後述のようにして結合させた。
4.0O.D.単位の粗オリゴヌクレオチドを、SpeedVac
Evaporator（Savant Insruments,Inc.,Farmingdale,New
York）で蒸発乾固した。その後、80％エタノール50μ
をその残留物に加え、次いでその試料を再び蒸発させ
た。その粗オリゴアミン残留物を、pH9.5に調整された1
00mM炭酸水素ナトリウム／炭酸ナトリウム（NaHCO3/Na2
CO3）緩衝液25μに溶解した。これに、濃度10.0mg/ml
でFITC（Aldrich Chemical Company,Inc.,Milwaukee,Wi
sconsin）のDMSO溶液25μ加えた。得られた混合物を
数秒間激しく撹拌し、その後で数秒間遠心し、更に、室
温で15分間、暗所で反応させた。
Evaporator（Savant Insruments,Inc.,Farmingdale,New
York）で蒸発乾固した。その後、80％エタノール50μ
をその残留物に加え、次いでその試料を再び蒸発させ
た。その粗オリゴアミン残留物を、pH9.5に調整された1
00mM炭酸水素ナトリウム／炭酸ナトリウム（NaHCO3/Na2
CO3）緩衝液25μに溶解した。これに、濃度10.0mg/ml
でFITC（Aldrich Chemical Company,Inc.,Milwaukee,Wi
sconsin）のDMSO溶液25μ加えた。得られた混合物を
数秒間激しく撹拌し、その後で数秒間遠心し、更に、室
温で15分間、暗所で反応させた。
フルオレセインで標識されたオリゴヌクレオチドの収
率を最大にするために、更に25μのNaHCO3/Na2CO3（p
H9.5）緩衝液と更に25μのFITCのDMSO溶液（10mg/m
l）とを加えることによって、繰り返しFITCと反応させ
た。反応を室温で15分間行った。最終処理においては15
分間ではなくて1.5時間その反応を進行させたことを除
けば同じ仕方で、この反応を更に２回繰り返した。
率を最大にするために、更に25μのNaHCO3/Na2CO3（p
H9.5）緩衝液と更に25μのFITCのDMSO溶液（10mg/m
l）とを加えることによって、繰り返しFITCと反応させ
た。反応を室温で15分間行った。最終処理においては15
分間ではなくて1.5時間その反応を進行させたことを除
けば同じ仕方で、この反応を更に２回繰り返した。
フルオレセインで標識した生成物を、22μの3M NaO
Ac及び900μの100％エタノールを加えることによって
沈澱させ、その後で−20℃で20分間冷却し、それに続い
て、４℃で20分間遠心し、最後に上清をデカントした。
次に、その沈澱生成物を150μの80％エタノールで洗
浄し、真空下で短時間乾燥し、更に、50μの試料載置
用（変性）緩衝液（6.3M尿素,0.02％ブロモフェノール
ブルー，及び0.02％キシレンシアノール）中に再懸濁し
た。その混合物を５分間煮沸することによって変性さ
せ、その後で氷浴で急冷し、更に、15％の調製用ポリア
クリルアミドゲル上で泳動した。そのフルオレセイン標
識生成物を長波長の紫外線下の蛍光によって視覚化し、
そのゲルから切り取り、更に、300mM NaOAc,2.5mM EDTA
及び100mM Tris−HClをpH8.0で含む溶離緩衝液を使用し
て、室温で36時間溶離した。その精製された生成物を、
10mM TEABを溶離剤として使用するG50/50 Sephadex カ
ラム（Sigma Chemical Company.St.Louis,Missouri）上
にその上清を流すことによって脱塩した。（260nmでの
U.V.吸収によって測定される）オリゴヌクレオチドを含
む画分を集めて、蒸発させ、及びTris−HCl/EDTA（10mM
Tris−HCl,0.1mM EDTA,pH8.0）中に再懸濁した。得ら
れた溶液の濃度をU.V.吸収によって決定し、そのオリゴ
ヌクレオチド上のフルオレセインの存在を495nmでのU.
V.吸収によって確認した。
Ac及び900μの100％エタノールを加えることによって
沈澱させ、その後で−20℃で20分間冷却し、それに続い
て、４℃で20分間遠心し、最後に上清をデカントした。
次に、その沈澱生成物を150μの80％エタノールで洗
浄し、真空下で短時間乾燥し、更に、50μの試料載置
用（変性）緩衝液（6.3M尿素,0.02％ブロモフェノール
ブルー，及び0.02％キシレンシアノール）中に再懸濁し
た。その混合物を５分間煮沸することによって変性さ
せ、その後で氷浴で急冷し、更に、15％の調製用ポリア
クリルアミドゲル上で泳動した。そのフルオレセイン標
識生成物を長波長の紫外線下の蛍光によって視覚化し、
そのゲルから切り取り、更に、300mM NaOAc,2.5mM EDTA
及び100mM Tris−HClをpH8.0で含む溶離緩衝液を使用し
て、室温で36時間溶離した。その精製された生成物を、
10mM TEABを溶離剤として使用するG50/50 Sephadex カ
ラム（Sigma Chemical Company.St.Louis,Missouri）上
にその上清を流すことによって脱塩した。（260nmでの
U.V.吸収によって測定される）オリゴヌクレオチドを含
む画分を集めて、蒸発させ、及びTris−HCl/EDTA（10mM
Tris−HCl,0.1mM EDTA,pH8.0）中に再懸濁した。得ら
れた溶液の濃度をU.V.吸収によって決定し、そのオリゴ
ヌクレオチド上のフルオレセインの存在を495nmでのU.
V.吸収によって確認した。
実施例 ８ ２つの標識された検出プローブを使用する検出法 ２つの標識された検出プローブと連結された検出生成
物を生成するための検出プローブの酵素的連結反応とを
使用する、本発明の検出システムを実証するために、４
つの反応を行った。（例えば、「Ag」がフルオレセイン
であり及び「Ab」が抗フルオレセイン抗体である第２図
を参照のこと）。
物を生成するための検出プローブの酵素的連結反応とを
使用する、本発明の検出システムを実証するために、４
つの反応を行った。（例えば、「Ag」がフルオレセイン
であり及び「Ab」が抗フルオレセイン抗体である第２図
を参照のこと）。
その可変的な反応物を次のように確定した。
増殖生成物の量 反応I :10fmolのAS１−２′。
反応II :1fmolのAS１−２′。
反応III:AS１−２′なし（対照）。
反応IV :1000fmolのDP１′。
添加試薬： リガーゼ/NAD試薬を、130μM NADを含むようにELB中1
x濃度で調製し、このとき２μのその試薬は2.0単位の
E.coli Ligase（New England Biolabs,Inc.,Beverly,Ma
ssachusetts）を含んだ。
x濃度で調製し、このとき２μのその試薬は2.0単位の
E.coli Ligase（New England Biolabs,Inc.,Beverly,Ma
ssachusetts）を含んだ。
EDTA/染料試薬を実施例６と同様に調製した。
1xのSPPE及びATC［アルカリ処理ガゼイン;Livesay,J.
H.及びDonald,R.A.,Clin.Chim.Acta，123 19３（198
2）］0.01％を含む捕獲緩衝液（capture butter）を、
8.7gのNaCl,1.38gの一塩基性NaH2PO4・H2O,370mgのEDTA
及び100mgのATCを800mlのH2O中に溶解することによって
調製した。その溶液を5N NaOHでpH6.8に調整し、その後
容量を１とした。
H.及びDonald,R.A.,Clin.Chim.Acta，123 19３（198
2）］0.01％を含む捕獲緩衝液（capture butter）を、
8.7gのNaCl,1.38gの一塩基性NaH2PO4・H2O,370mgのEDTA
及び100mgのATCを800mlのH2O中に溶解することによって
調製した。その溶液を5N NaOHでpH6.8に調整し、その後
容量を１とした。
増幅プローブAP2を、γ−32P−ATP及びポリヌクレオ
チドキナーゼ（Boehringer Mannheim Biochemicals,ind
ianapolis,Indiana）を用いて、約7000Ci/mmolの比活性
にリン酸化した。
チドキナーゼ（Boehringer Mannheim Biochemicals,ind
ianapolis,Indiana）を用いて、約7000Ci/mmolの比活性
にリン酸化した。
増幅プローブAP1を、実施例７に記載した方法を用い
て、その５′末端上にフルオレセインで標識した。
て、その５′末端上にフルオレセインで標識した。
磁性ヒツジ抗フルオレセイン微小球状体をAdvanced M
agnetics,Inc.,cambridge,Mass.から得た。
agnetics,Inc.,cambridge,Mass.から得た。
この実施例では、F1−AP1及び32P−AP2は、AS
１−２′の測定のために使用される検出プライマーとし
て働く。DP１′は潜在的な「架橋」として働く。
１−２′の測定のために使用される検出プライマーとし
て働く。DP１′は潜在的な「架橋」として働く。
各反応を８μの出発容量で二重に行い、このときそ
れらの反応混合物は、各々100fmolのF1−AP1及び32P−A
P2を含み、並びにELB中1.25xであるという点で同一であ
った。それらの反応混合物のすべてを90℃で５分間イン
キュベーションすることによって変性し、その後、その
核酸塩基配列を室温で５分間アニーリングした。ハイブ
リッド形成された検出プローブを連結するために、2.0
μのリカーゼ/NAD試薬を各ポリプロピレンマイクロチ
ューブに加えて、その内容物を軽く撹拌して混合した。
室温で５分間、連結反応を進行させた。その後で、300
μの捕獲緩衝剤を加えることによってその連結反応を
止めた。
れらの反応混合物は、各々100fmolのF1−AP1及び32P−A
P2を含み、並びにELB中1.25xであるという点で同一であ
った。それらの反応混合物のすべてを90℃で５分間イン
キュベーションすることによって変性し、その後、その
核酸塩基配列を室温で５分間アニーリングした。ハイブ
リッド形成された検出プローブを連結するために、2.0
μのリカーゼ/NAD試薬を各ポリプロピレンマイクロチ
ューブに加えて、その内容物を軽く撹拌して混合した。
室温で５分間、連結反応を進行させた。その後で、300
μの捕獲緩衝剤を加えることによってその連結反応を
止めた。
抗フルオレセイン抗体で被覆した磁性微小球状体（ビ
ーズ）を75×12mm試験管の中に入れ、このとき各々の試
験管にはそのビーズ50μを含有させた。次に、500μ
の捕獲緩衝剤を加え及び数秒間その溶液を撹拌するこ
とによって、該ビーズを２回洗浄し、その後、該ビーズ
を含む洗浄溶液をCoring Magnetic Separator Unit（Ci
ba−Corning Diagnostics,Medfield,Massachusetts）内
に室温で５分間放置することによって該ビーズを清澄さ
せた。次いで、その試験管内に該ビーズを残したままそ
の洗浄溶液の水性部分をピペットで除去した。
ーズ）を75×12mm試験管の中に入れ、このとき各々の試
験管にはそのビーズ50μを含有させた。次に、500μ
の捕獲緩衝剤を加え及び数秒間その溶液を撹拌するこ
とによって、該ビーズを２回洗浄し、その後、該ビーズ
を含む洗浄溶液をCoring Magnetic Separator Unit（Ci
ba−Corning Diagnostics,Medfield,Massachusetts）内
に室温で５分間放置することによって該ビーズを清澄さ
せた。次いで、その試験管内に該ビーズを残したままそ
の洗浄溶液の水性部分をピペットで除去した。
反応を停止させた反応混合物の各々を、該ビーズを含
む試験管の１つの中にピペット注入し、そのビーズは、
間欠的に撹拌されながら50℃で約15分間、フルオレセイ
ン標識生成物を捕獲した。フルオレセイン標識生成物を
含むビーズをその上清から分離し、その後で、前記抗フ
ルオレセイン抗体被覆ビーズを洗浄したのと同じ仕方で
２回洗浄した。次いで、フルオレセイン標識生成物を含
む洗浄されたビーズを300μの捕獲緩衝液の中に懸濁
させ及びその懸濁液をポリプロピレンマイクロチューブ
の中にピペット注入することによって、該ビーズをポリ
プロピレンマイクロチューブに移した。その試料はBeck
man LS−6800液体シンチレーションカウンターを使用し
て１分間計数された。その結果を表１に示す。
む試験管の１つの中にピペット注入し、そのビーズは、
間欠的に撹拌されながら50℃で約15分間、フルオレセイ
ン標識生成物を捕獲した。フルオレセイン標識生成物を
含むビーズをその上清から分離し、その後で、前記抗フ
ルオレセイン抗体被覆ビーズを洗浄したのと同じ仕方で
２回洗浄した。次いで、フルオレセイン標識生成物を含
む洗浄されたビーズを300μの捕獲緩衝液の中に懸濁
させ及びその懸濁液をポリプロピレンマイクロチューブ
の中にピペット注入することによって、該ビーズをポリ
プロピレンマイクロチューブに移した。その試料はBeck
man LS−6800液体シンチレーションカウンターを使用し
て１分間計数された。その結果を表１に示す。
データから分かるように、存在する増幅生成物の量に
呼応した直線的応答がこのアッセイから得られた。潜在
的な「架橋」の存在（反応IV）は幾らかの信号を生成し
たが、その信号の量は、検出プローブのための標的とし
て1.0fmolの増幅生成物を使用して得られる信号（反応I
I）と比較して極微であった。
呼応した直線的応答がこのアッセイから得られた。潜在
的な「架橋」の存在（反応IV）は幾らかの信号を生成し
たが、その信号の量は、検出プローブのための標的とし
て1.0fmolの増幅生成物を使用して得られる信号（反応I
I）と比較して極微であった。
本発明の開示内容を理解した後には、本発明の思想及
び範囲から逸脱しない様々な他の実施例並びに前述の説
明及び実施例の変更が当業者には明らかであろうとし、
またそのような実施例又は変更のすべてが添付の請求の
範囲内に含まれることを意図するものである。
び範囲から逸脱しない様々な他の実施例並びに前述の説
明及び実施例の変更が当業者には明らかであろうとし、
またそのような実施例又は変更のすべてが添付の請求の
範囲内に含まれることを意図するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/10 C12Q 1/68 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (15)
- 【請求項１】３つ以上の連結核酸断片を有する核酸塩基
配列を検出するための方法であって、 （ａ）２つの検出プローブの各々が、前記核酸塩基配列
内で隣接した位置にある２つの前記連結核酸断片の各々
の一部分に対して相補的である、２つの前記検出プロー
ブと前記核酸塩基配列とを接触させること、 （ｂ）前記検出プローブの各々を、前記核酸塩基配列内
の隣接した位置にある２つの断片とハイブリッド形成さ
せること（このとき検出プローブは、ハイブリッド形成
するこれら検出プローブ間で相互作用が生起し得るよう
に互いに十分隣接して前記核酸塩基配列に結合する）、
及び （ｃ）前記のハイブリッド形成した検出プローブの存在
を検出すること を包含する方法。 - 【請求項２】前記検出プローブの少なくとも１つを標識
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記検出プローブの一方を第１隣接標識で
標識し、前記検出プローブのもう一方を第２隣接標識で
標識する請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】（ａ）前記のハイブリッド形成した検出プ
ローブを互いに結合させて連結検出生成物を生成させる
こと、及び （ｂ）前記連結検出生成物の存在を検出すること を更に包含する請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記のハイブリッド形成した検出プローブ
を酵素の作用によって互いに結合する請求項４に記載の
方法。 - 【請求項６】前記酵素がリガーゼである請求項５に記載
の方法。 - 【請求項７】前記のハイブリッド形成した検出プローブ
を化学反応によって互いに結合する請求項４に記載の方
法。 - 【請求項８】前記検出プローブの一方を検出可能な標識
で標識し、前記検出プローブのもう一方を前記連結検出
生成物を溶液から取り出すための手段で標識する請求項
４に記載の方法。 - 【請求項９】検査試料中に存在するかもしれない標的核
酸塩基配列を検出するための方法であって、 （ａ）複数の対の増幅プローブの各対の構成要素プロー
ブが互いに相補的であり、プローブの各対の少なくとも
１つの同一のハイブリッド形成構成要素が前記標的核酸
塩基配列の増幅塩基配列とも相補的である、複数の対の
核酸増幅プローブと前記検査試料とを接触させること、 （ｂ）前記増幅プローブの前記ハイブリッド形成構成要
素を前記増幅塩基配列の異なる部分とハイブリッド形成
させ、このとき前記増幅プローブを隣接的な仕方で前記
増幅塩基配列と結合させること、 （ｃ）前記のハイブリッド形成した増幅プローブを互い
に結合させて増幅生成物を生成させること、 （ｄ）前記増幅塩基配列から前記増幅生成物を分離する
こと、 （ｅ）２つの検出プローブの各々が、前記増幅生成物内
で隣接した位置にある２つの前記増幅プローブ断片の各
々の一部分に対して相補的である、２つの前記検出プロ
ーブと前記増幅生成物とを接触させること、 （ｆ）前記検出プローブの各々を、前記増幅生成物内の
隣接した位置にある２つの断片とハイブリッド形成させ
ること（このとき前記検出プローブは、ハイブリッド形
成するこれら検出プローブ間で相互作用が生起し得るよ
うに互いに十分隣接して前記増幅生成物に結合させ
る）、並びに （ｇ）前記のハイブリッド形成した検出プローブの存在
を検出すること を包含する方法。 - 【請求項１０】（ａ）前記のハイブリッド形成した検出
プローブを互いに結合させて連結検出生成物を形成する
こと、及び （ｂ）前記連結検出生成物の存在を検出すること を更に包含する請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】前記のハイブリッド形成した増幅プロー
ブを酵素の作用によって互いに結合させる請求項９に記
載の方法。 - 【請求項１２】前記酵素がリガーゼである請求項11に記
載の方法。 - 【請求項１３】前記のハイブリッド形成した増幅プロー
ブを化学反応によって互いに結合させる請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１４】２つの核酸検出プローブを含む、３つ以
上の連結核酸断片を有する核酸塩基配列の検出に使用す
るための試薬であって、前記検出プローブの各々が、前
記核酸塩基配列内で隣接した位置にある２つの前記連結
核酸断片の各々の一部分と相補的であり、前記検出プロ
ーブの少なくとも１つが標識を有しており、更に前記検
出プローブが、それらプローブ間で相互作用が生起し得
るように互いに十分隣接して前記核酸塩基配列とハイブ
リッド形成することが可能である試薬。 - 【請求項１５】検査試料中に存在するかもしれない標的
核酸塩基配列の検出に使用するためのキットであって、 （ａ）増幅プローブの各対の構成要素プローブが互いに
相補的であり、前記増幅プローブの各対の少なくとも１
つの同一のハイブリッド形成構成要素が前記標的核酸塩
基配列の増幅塩基配列とも相補的であり、かつ、増幅プ
ローブの各対の核酸塩基配列が前記増幅塩基配列の異な
る部分に相補的であるように選択され、更に前記増幅プ
ローブが、それらプローブが互いに結合して増幅生成物
を形成し得るのに互いに十分隣接するように隣接的な仕
方で前記増幅塩基配列とハイブリッド形成することが可
能である、複数の対の増幅プローブと、 （ｂ）当該検出プローブの各々が、前記増幅生成物内に
隣接して位置する前記増幅生成物の２つの増幅プローブ
断片の各々の一部分と相補的であり、前記検出プローブ
の少なくとも１つが標識を有しており、更に前記検出プ
ローブが、ハイブリッド形成する検出プローブ間で相互
作用が生起し得るように互いに十分隣接して前記増幅生
成物とハイブリッド形成することが可能である、２つの
検出プローブと を包含するキット。
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| US6004826A (en) * | 1988-07-20 | 1999-12-21 | David Segev | Repair-mediated process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| KR950013953B1 (ko) * | 1990-01-26 | 1995-11-18 | 애보트 래보라토리즈 | 리가제 연쇄 반응에 적용가능한 표적 핵산의 증폭 방법 |
| EP0453301A3 (en) * | 1990-04-20 | 1993-07-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Double receptor polynucleotide assay method |
| NZ245242A (en) * | 1992-01-17 | 1994-12-22 | Pioneer Hi Bred Int | Identifying variations between organisms by detecting polymorphisms in single sequence repeats |
| US6100099A (en) | 1994-09-06 | 2000-08-08 | Abbott Laboratories | Test strip having a diagonal array of capture spots |
| US5869252A (en) * | 1992-03-31 | 1999-02-09 | Abbott Laboratories | Method of multiplex ligase chain reaction |
| WO1994003636A1 (en) * | 1992-08-03 | 1994-02-17 | Abbott Laboratories | Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity |
| US6180338B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-01-30 | Beckman Coulter, Inc. | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences |
| US6207368B1 (en) | 1992-08-04 | 2001-03-27 | Beckman Coulter, Inc. | Methods and reagents for controlling chain extension and ligation chain reactions |
| US5681943A (en) * | 1993-04-12 | 1997-10-28 | Northwestern University | Method for covalently linking adjacent oligonucleotides |
| US6406841B1 (en) | 1993-07-01 | 2002-06-18 | Abbott Laboratories | Methods for the detection of HTLV-II antibodies employing novel HTLV-II NRA envelope peptides |
| US5571903A (en) * | 1993-07-09 | 1996-11-05 | Lynx Therapeutics, Inc. | Auto-ligating oligonucleotide compounds |
| US6113905A (en) * | 1995-01-06 | 2000-09-05 | The Regents Of The University Of California | Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases |
| US6015660A (en) * | 1995-01-06 | 2000-01-18 | The Regents Of The University Of California | Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases |
| US6077510A (en) * | 1995-01-06 | 2000-06-20 | Regents Of The University Of California | Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases |
| US5998175A (en) * | 1998-07-24 | 1999-12-07 | Lumigen, Inc. | Methods of synthesizing and amplifying polynucleotides by ligation of multiple oligomers |
| DE69921594T2 (de) * | 1998-07-24 | 2005-11-10 | Lumigen, Inc., Southfield | Methoden zur synthese von polynukleotiden durch ligation von multiplen oligomeren |
| US20060275782A1 (en) | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| DK1923471T3 (da) | 1999-04-20 | 2013-04-02 | Illumina Inc | Detektion af nukleinsyrereaktioner på bead-arrays |
| US8481268B2 (en) | 1999-05-21 | 2013-07-09 | Illumina, Inc. | Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays |
| US7611869B2 (en) | 2000-02-07 | 2009-11-03 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| EP1257668B1 (en) | 2000-02-16 | 2008-10-29 | Illumina, Inc. | Parallel genotyping of multiple patient samples |
| CA2426824A1 (en) | 2000-10-24 | 2002-07-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct multiplex characterization of genomic dna |
| EP2246438B1 (en) | 2001-07-12 | 2019-11-27 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US20040259100A1 (en) | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| WO2005003304A2 (en) | 2003-06-20 | 2005-01-13 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| JP2007538236A (ja) | 2004-05-21 | 2007-12-27 | アトノミックス アクティーゼルスカブ | ヒドロゲルを含む表面弾性波センサ |
| US7981606B2 (en) | 2005-12-21 | 2011-07-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Control for nucleic acid testing |
| EP2021514A2 (en) * | 2006-05-10 | 2009-02-11 | Dxterity Diagnostics | Detection of nucleic acid targets using chemically reactive oligonucleotide probes |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| JP2012531887A (ja) | 2009-04-01 | 2012-12-13 | ディクステリティー ダイアグノーティクス インコーポレイテッド | 化学的ライゲーション依存型プローブ増幅（ｃｌｐａ） |
| US8828688B2 (en) | 2010-05-27 | 2014-09-09 | Affymetrix, Inc. | Multiplex amplification methods |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| WO2013082164A1 (en) | 2011-11-28 | 2013-06-06 | Life Technologies Corporation | Enhanced ligation reactions |
| WO2012106546A2 (en) | 2011-02-02 | 2012-08-09 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Massively parallel continguity mapping |
| CA2836577C (en) | 2011-05-17 | 2019-06-25 | Dxterity Diagnostics Incorporated | Methods and compositions for detecting target nucleic acids |
| US9181583B2 (en) | 2012-10-23 | 2015-11-10 | Illumina, Inc. | HLA typing using selective amplification and sequencing |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| EP2971069B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-10-17 | Illumina, Inc. | Methods and systems for aligning repetitive dna elements |
| CA2898456C (en) | 2013-03-13 | 2020-11-10 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| CA2931533C (en) | 2013-12-09 | 2023-08-08 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
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| KR102001554B1 (ko) | 2014-01-16 | 2019-07-18 | 일루미나, 인코포레이티드 | 고형 지지체 상에서의 앰플리콘 제조 방법 및 시퀀싱 |
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| EP3175023B1 (en) | 2014-07-30 | 2025-02-19 | President and Fellows of Harvard College | Method for determining nucleic acids |
| WO2016040602A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Epicentre Technologies Corporation | Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv |
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| FI3872187T3 (fi) | 2017-04-23 | 2022-12-15 | Koostumuksia ja menetelmiä näytteiden identifioinnin parantamiseksi indeksoiduissa nukleiinihappokirjastoissa | |
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| ES2882608T3 (es) | 2017-04-23 | 2021-12-02 | Illumina Inc | Composiciones y métodos para mejorar la identificación de muestras en bibliotecas de ácidos nucleicos indexados |
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| US20200202977A1 (en) | 2017-07-31 | 2020-06-25 | Illumina, Inc. | Sequencing system with multiplexed biological sample aggregation |
| AU2018312560B2 (en) | 2017-08-01 | 2022-03-10 | Illumina, Inc. | Hydrogel beads for nucleotide sequencing |
| DK3752634T3 (da) | 2018-02-13 | 2022-10-24 | Illumina Inc | DNA Sequencing Using Hydrogel Beads / DNA-sekventering ved anvendelse af hydrogelkorn |
| CA3064622A1 (en) | 2018-04-02 | 2019-10-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing |
| WO2019204229A1 (en) | 2018-04-20 | 2019-10-24 | Illumina, Inc. | Methods of encapsulating single cells, the encapsulated cells and uses thereof |
| WO2019222688A1 (en) | 2018-05-17 | 2019-11-21 | Illumina, Inc. | High-throughput single-cell sequencing with reduced amplification bias |
| FI3810774T3 (fi) | 2018-06-04 | 2023-12-11 | Illumina Inc | Menetelmiä suuritehoisten yksittäissolutranskriptomikirjastojen valmistamiseksi |
| AU2019364545B2 (en) | 2018-10-26 | 2025-09-04 | Illumina, Inc. | Modulating polymer beads for DNA processing |
| WO2020112604A2 (en) | 2018-11-30 | 2020-06-04 | Illumina, Inc. | Analysis of multiple analytes using a single assay |
| EP3894583A4 (en) | 2018-12-13 | 2022-11-09 | President and Fellows of Harvard College | AMPLIFICATION METHODS AND SYSTEMS FOR MERFISH AND OTHER APPLICATIONS |
| MX2021003746A (es) | 2019-03-01 | 2021-06-23 | Illumina Inc | Genotecas de núcleos únicos y células únicas de alto rendimiento y métodos para elaborarlas y usarlas. |
| MX2021007803A (es) | 2019-07-12 | 2021-08-11 | Illumina Cambridge Ltd | Composiciones y metodos para preparar genotecas de secuenciacion de acido nucleico usando crispr/cas9 inmovilizadas en un soporte solido. |
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| AU2021249046A1 (en) | 2020-03-30 | 2022-10-20 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries |
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| CA2046919A1 (en) * | 1989-02-14 | 1990-08-15 | Mark P. Pasek | Oligonucleotide primer pairs for sequence independent gene amplification and methods which employ them |
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