DE68927373T2

DE68927373T2 - Verfahren und mittel zum nachweis von nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE68927373T2
Application number: DE68927373T
Authority: DE
Inventors: Theodore Lakewood Co 80226 Jones; Rodney M. Louisville Co 80027 Richards
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1989-06-16
Publication date: 1997-03-20
Anticipated expiration: 2009-06-17
Also published as: JPH03501211A; AU3860189A; WO1989012696A1; ATE144556T1; JPH10309195A; NZ229672A; JP2801051B2; AU634969B2; EP0379559A1; HK1006858A1; EP0379559A4; EP0379559B1; CA1340160C; DE68927373D1

Description

Fortschritte auf dem Gebiet der Molekularbiologie in den letzten zwei Dekaden haben das Erkennen von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Testproben, die von einem Patienten oder einem anderen Menschen genommen wurden, ermöglicht. Solche Testproben umfassen Serum, Urin, Fäzes, Gewebe, Speichel, zerebrospinale Fluide, amniotische Fluide und andere Körperflüssigkeiten. Die Erfassung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen kann verwendet werden, um genetische Fehlordnungen oder Krankheiten zu identifizieren, ebenso wie das Vorliegen pathogener, bakteriell und virös zuzuordnender Krankheiten bei Menschen. Das Vorliegen von spezifischen Genen kann auch benutzt werden, um andere wichtige genetische Information zu erhalten, so wie das Vorliegen von Genen, die für Antigene kodieren, die für das Abstoßen von Transplantaten verantwortlich sind, ebenso wie genetische Information, die beim Krebsprüfen und beim onkogenen Testen und in der forensischen Medizin benutzt werden.
Die am meisten üblichen Techniken zum Erkennen einer bestimmten Gensequenz benutzen ein Phänomen, das als Nukleinsäure- Hybridisierung bekannt ist. Hybridisierung bezieht sich auf einen speziellen Typ der Rekombination oder des Anheftens einer einzelsträngigen Nukleotidseguenz an eine komplementäre Sequenz, um eine doppeisträngige Nukleinsäure zu bilden, oder einen Duplex, über eine nicht-kovalente Bindung. Wenn die ursprünglichen stränge eines normal doppelsträngigen DNA (Desoxyribonukleinsäure) Moleküls rekombinieren, wird der Rekombinationsprozeß als Renaturierung bezeichnet. Wenn Molekularmischung auftritt, wird der Prozeß als Hybridisierung bezeichnet. Hybridisierung kann auch bei RNA (Ribonukleinsäure) auftreten, die oft in der Natur sowohl als eine doppelsträngige und eine einzelsträngige Form gefunden wird. DNA:RNA-Hybride können durch Hybridisierung gebildet werden, ebenso wie DNA:DNA- und RNA:RNA-Hybride.
Bei typischen Hybridisierungstechniken wird eine einzelsträngige Sondensequenz verwendet, um das Gen oder die Nukleinsäuresequenz, die interessiert, durch Anheften oder Hybridisieren an die einzelsträngige Form der Target-Nukleinsäuresequenz ausgesucht. Wenn die Nukleinsäure in einer Testprobe doppelsträngig ist, wie es typischerweise der Fall bei natürlich auftretender DNA ist, muß die DNA denaturiert oder einzelsträngig gemacht werden, bevor irgendeine Form der Rekombination stattfinden kann. Die Targetsequenz ist ein ausgewählter Abschnitt der Nukleinsäuresequenz, die gesucht wird, die eindeutig charakteristisch für die Targetsequenz ist. Die Sonde wird so ausgewählt, daß sie eine einzeisträngige Nukleotidseguenz ist, die komplementär zu der Target-Nukleotidsequenz des Gens ist, das gesucht wird. Diese Oligonukleotid-Sonde wird mit einer erfaßbaren Markierung markiert und in Kontakt mit der denaturierten Nukleinsäure (DNA oder RNA) von einer Testprobe gebracht.
Bis in jüngster Zeit wurden hauptsächlich radioaktive Isotope von Atomen, so wie Wasserstoff (³H), Phosphor (³²p) oder Jod (²&sup5;J) als Sondenmarkierungen benutzt. Radioaktive Verbindungen wie diese jedoch leiden an vielen Unzulänglichkeiten, einschließlich der Notwendigkeit, extensive Sicherheitsvorkehrungen bei Probenprotokollen zu treffen, der Notwendigkeit teurer Ausrüstung und spezieller Abfallbehandlungsprozeduren, ebenso wie an hohen Benutzungskosten aufgrund der Instabilität des radioaktiven Materials. Als Ergebnis sind zunehmende Anstrengungen in jüngster Zeit gemacht worden, um alternative Markierungsschemen zu entwickeln, die nicht die Nachteile der Markierungen mit radioaktiven Isotopen haben. Folglich werden gegenwärtig zusätzlichen zu radioaktiven Markierungen nichtisotopisch markierte Sonden benutzt, obwohl nicht-radioaktive Markierungen bei einer klinischen Ausrüstung bevorzugt sind.

Beschreibung des Standes der Technik

Bei den Bemühungen, die Erfassung kleinster Mengen von Targetseguenzen zu verbessern, die in Testproben vorliegen, sind jüngst Entwicklungen in den Gebieten gemacht worden: (1) Verstärken des Signals, das heißt, Erhöhen der Empfindlichkeit des Sonden-Erfassungssystems; ebenso wie (2) Verstärken der Target-Nukleinsäuresequenz selbst, so daß sie in Mengen vorliegt, die ausreichen, unter Verwendung gegenwärtig verfügbarer radioaktiver und nicht-radioaktiver Verfahren einfach erfaßt zu werden. Die Verstärkung der Target-Nukleinsäuresequenz umfaßt im allgemeinen die wiederholte Reproduktion oder Replikation der gegebenen DNA- oder RNA-Target-Nukleinsäuresequenz.
Zwei Verfahren werden gegenwärtig routinemäßig zur Reproduktion oder Replikation verwendet, um vielfache Kopien einer Nukleinsäuresequenz aus einer kleinen Menge einer gegebenen, existierenden Target-Nukleinsäuresequenz zu erzeugen. Das erste Verfahren umfaßt das Klonen der Target-Nukleinsäuresequenz in einem geeigneten Wirtssystem. Dieses Verfahren benutzt traditionelle Klontechniken, wobei die gewünschte Nukleinsäure in einen geeigneten Vektor eingeführt wird, der nachfolgend benutzt wird, um den Wirt zu transformieren. Wenn der Wirt kultiviert wird, wird der Vektor repliziert, wobei zusätzliche Kopien der gewünschten Target-Nukleinsäuresequenz erzeugt werden. Die Target-Nukleinsäuresequenz, die in den Vektor eingeführt wird, kann entweder natürlich auftretend oder synthetisiert sein. Mit anderen Worten kann die gewünschte Target-Nukleinsäuresequenz in vitro synthetisiert werden und dann in einen Vektor eingeführt werden, der durch Wachstum vor jeder nachfolgenden Einfügung verstärkt wird, wie es in dem US-Patent Nr. 4,293,652 offenbart ist.
Die US-Patente Nrs. 4,683,195 und 4,683,202 offenbaren ein zweites Verfahren zum Verstärken der Menge an Target-DNA oder RNA aus einer Testprobe. Dieses besondere Verfahren ist als die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bezeichnet worden. Die PCR-Verstärkung verwendet zwei Oligonukleotid-Primer, die das DNA-Segment, das verstärkt werden soll, flankieren. Die Primer heften sich an ihre komplementären Sequenzen an gegenüberliegenden Strängen der Target-Nukleinsäuresequenz, wobei Extensionsprodukte (komplementär zu der Target-Sequenz) der angehefteten Primer bei Vorliegen von DNA-Polymerase gebildet werden. Die Primer sind so ausgerichtet, daß die DNA-Synthese durch die Polymerase über und durch den Bereich zwischen den Primern fortschreitet, was in der Wirkung die Menge des Target-DNA-Segmentes verdoppelt, das von den Primern flankiert wird.
Zyklen der Denaturierung der DNA durch Wärme, Anheften der Primer an ihre komplementären Sequenzen und Extension der angehefteten Primer mit DNA-Polymerase werden wiederholt, bis eine ausreichende Menge der Target-Nukleinsäuresequenz erzeugt ist, um zu einem meßbaren Signal in der Probe der Wahl zu führen. Da die Extensionsprodukte auch komplementär zu Primern sind und in der Lage sind Primer zu binden, verdoppelt jeder aufeinanderfolgende Zyklus im wesentlichen die Menge an DNA, die in dem vorangegangenen Zyklus synthetisiert worden ist, was zu einer exponentiellen Akkumulation der Target-Nukleinsäuresequenz führt.
Ein Nachteil des PCR-Verstärkungssystem ist, daß es die Verwendung eines Enzyms erfordert, um die Verstärkung zu erreichen. Enzyme zeigen eine inhärente vielfache Variation, zusätzlich zu dem unerwünschten Vorliegen von Nuklease-Verunreinigungen, und eine relativ kurze Lagerdauer. Es würde vorteilhaft sein, ein Verstärkungssystem zu haben, das wirksam sowohl DNA als auch RNA verstärken kann und das nicht auf die Verwendung eines enzymatischen Verfahrens der Verstärkung begrenzt ist.
Die EP-A-320 308, die EP-A-336 731 und die WO-A-89/09835 betreffen alle die Verstärkung der Target-Nukleinsäuresequenzen, bei der zwei Paare von Verstärkungssonden benutzt werden, die, wenn sie an eine Verstärkungssequenz hybridisiert werden, gebunden werden können, um ein Verstärkungsprodukt zu bilden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Vorliegendeerfindung betrifft ein Verfahren zum Erkennen einer Target-Nukleinsäuresequenz, die in einer Testprobe vorliegen kann. Das Verfahren kann sowohl eine Verstärkungsprozedur als auch eine Erfassungsprozedur benutzen.
Die Verstärkung wird durch die Verwendung einer Vielzahl von Paaren von Nukleinsäure-Verstärkungssonden erreicht, wobei die Elementsonden jedes Paares der Verstärkungssonden komplementär zueinander sind, wobei wenigstens ein gleiches Hybridisierungselement jedes Paares der Verstärkungssonden auch komplementär zu einem gegebenen Abschnitt der Target-Nukleinsäuresequenz ist, die als eine Matrix wirkt. Die Nukleinsäuresequenz des Hybridisierungselementes jedes Paars der Verstärkungssonden wird so gewählt, daß sie komplementär zu einem unterschiedlichen Abschnitt der Target-Nukleinsäuresequenz ist, wobei die hybridisierenden Verstärkungssonden im wesentlichen eine vorgegebene Länge der Target-Sequenz auf eine kontinuierliche Weise überdecken. Die hybridisierenden Verstärkungssonden hybridisieren ausreichend aneinander angenähert an die Targetsequenz, um es zu ermöglichen, daß die Sonden miteinander verbunden werden.
Wenn einmal die hybridisierenden Verstärkungssonden verbunden sind, kann das vollständige Verstärkungsprodukt durch Denaturierung getrennt werden und der Prozeß mit den verbleibenden Sonden oder einer neuen Vorgabe von Sonden wiederholt werden. Die Zyklen der Denaturierung des gebundenen Verstärkungsproduktes durch Wärme, des Anheftens der Verstärkungssonden an ihre komplementären Sequenzen und die Bindung der angehefteten Sonden werden wiederholt, bis eine ausreichende Menge der Target-Nukleinsäuresequenz erzeugt wird, um zu einem meßbaren Signal in der gewählten Probe zu führen.
Wenn drei oder mehr Paare von Verstärkungssonden benutzt werden, kann das Verstärkungsprodukt spezifisch erfaßt werden, indem zwei oder mehr Erkennungssonden verwendet werden, wobei jede Erkennungssonde komplementär zu einem Abschnitt jeder der zwei benachbart gelegenen Verstärkungssonden-Segmente des Verstärkungsproduktes ist. Das richtig aufgebaute Verstärkungsprodukt dient als eine Matrix auf eine Weise ähnlich der, der man sich durch die Target-Nukleinsäureseguenz bei der Verstärkungsprozedur bedient. Ein unrichtig aufgebautes Produkt kann bei dieser Prozedur nicht als eine Matrix arbeiten. Die Erkennungssonden hybridisieren an das Verstärkungsprodukt ausreichend angrenzend aneinander, um eine Wechselwirkung zu ermöglichen, die zwischen den hybridisierten Erkennungssonden stattfindet. Ausgewählte Erkennungssonden werden mit einer Markierung zur Verwendung beim Erkennen der Menge an richtig zusammengesetztem Verstärkungsprodukt versehen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

FIGUR 1 ist ein Schaubild, das die Verstärkung einer doppelsträngigen Targetsequenz veranschaulicht, wobei die Verstärkungsprozedur der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
FIGUR 2 ist ein Schaubild, das eine Ausführungsform der Erkennungsprozedur der vorliegenden Erfindung verwendet, wobei ein Antigen als eine Erkennungssondenmarkierung verwendet wird, um für die nachfolgende Abtrennung des Erkennungsproduktes zu sorgen, wobei immobilisierter Antikörper verwendet wird.
FIGUR 3 ist ein Schaubild der synthetischen Nukleotidsequenzen, die in den Beispielen 2 - 8 verwendet werden.
FIGUR 4 ist ein Autoradiogramm, das.die Produkte zeigt, die aus 10 Verstärkungszyklen einer 3omer Verstärkungssequenz herrühren, wobei zwei Paare von Verstärkungssonden benutzt werden.
FIGUR 5 ist ein Autoradiogramm, das die Produkte zeigt, die aus 10 Verstärkungszyklen einer 45mer-Verstärkungsssequenz herrühren, wobei drei Paare von Verstärkungssonden verwendet werden
FIGUR 6 ist ein Autoradiogramm, das das Erkennungsprodukt zeigt, erhalten durch Verwenden einer radiomarkierten Erkennungssonde in Kombination mit einer nichtmarkierten Erkennungssonde, um ein 45mer Verstärkungsprodukt zu erfassen.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Ein Verfahren zum Erkennen einer Target-Nukleinsäuresequenz, die in einer Testprobe vorliegen kann, wird gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann sowohl eine Verstärkungsprozedur als auch eine Erkennungsprozedur benutzen.
Wie hierin benutzt haben die folgenden Ausdrücke die unten angegebenen Definitionen.
Eine Verstärkungssonde ist eine Nukleinsäuresequenz, die entweder: (1) komplementär zu einem Abschnitt eines einzelnen Stranges einer doppelsträngigen Verstärkungssequenz; oder (2) komplementär oder identisch zu einem Abschnitt einer einzelsträngigen Verstärkungssequenz ist. Die Verstärkungssonden hybridisieren an die Verstärkungssequenz ausreichend angrenzend aneinander, um es zu ermöglichen, daß die Sonden miteinander verbunden werden. Jeder Verstärkungssonde ist länger als ein Nukleotid. Die Verstärkungssonde kann an einem oder beiden Enden modifiziert sein oder nicht, um an andere Verstärkungssonden gebunden zu werden.
Eine Nukleinsäuresequenz ist ein Desoxyribonukleotid oder ein Ribonukleotid, das im Hinblick auf: (1) das Phosphat-Rückgrat; (2) die Nukleoside; und/oder (3) den Zuckeranteil der Oligonukleotide modifiziert sein kann. Nukleinsäuresequenzen können Markierungen enthalten und können durch das Vorliegen anderer chemischer Anteile unterbrochen sein, solange die Hybridisierung noch auftreten kann.
Komplementär bezieht sich auf ausreichende Komplementarität, um das Auftreten der Hybridisierung zu ermöglichen. Vollständige Komplementarität ist nicht erforderlich.
Das gleiche Element einer Vielzahl von Paaren von Verstärkungssonden bezieht sich auf das Element jedes Paares von Sonden, das zusammen mit anderen "gleichen Elementen" in der Lage ist, ein vollständiges Verstärkungsprodukt zu bilden. Elemente von Verstärkungssondenpaaren werden mit dem Apostroph (')-Symbol bezeichnet, wenn das bezeichnete Element von dem unteren Strang herrührt.
Ein Verstärkungsprodukt ist die gebundene Nukleinsäuresequenz, die aus der Bindung einer Anzahl von Verstärkungssonden erzeugt wird, die ununterbrochen an eine Verstärkungssequenz hybridisiert sind.
Bindung bezieht sich auf das Verbinden von zwei oder mehr Verstärkungssonden oder Erkennungssonden. Die Bindung umfaßt enzymatische Prozesse, so wie diejenigen, die eine Ligase benutzen, zusätzlich zu chemischen Prozessen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf chemische Reaktionen, photochemische Reaktionen (z.B. Photokopplung), Thermozykloadditionen und Redoxreaktionen.
Ununterbrochen heißt nahe bei oder nahe in der Umgebung. In dem Fall von ununterbrochen hybridisierten Sonden brauchen die Enden der Sonden nicht aneinander zu stoßen, sondern können tatsächlich entweder beabstandet sein oder sich zu einem gewissen Grad überlappen.
Eine Targetsequenz ist die gesuchte Nukleinsäuresequenz.
Eine Verstärkungssequenz ist eine vorbestimmte Länge der Targetsequenz, die als eine Matrix für die Verstärkungssonden wirkt. Die Verstärkungssequenz kann die gesamte Länge der Targetsequenz oder einen repräsentativen Abschnitt davon aufweisen.
Eine Matrixsequenz ist die Nukleinsäuresequenz, an die eine Vielzahl von Verstärkungssonden oder eine Vielzahl von Erkennungssonden hybridisieren. In den ersten Zyklus der Verstärkungsprozedur wirkt die Verstärkungssequenz als die Matrixsequenz. In nachfolgenden Zyklen der Verstärkungsprozedur und bei der Erkennungsprozedur dient das Verstärkungsprodukt auch als eine Matrixsequenz.
Ein Verstärkungssondensegment ist der Abschnitt eines Verstärkungsproduktes, der aus einer einzigen Verstärkungssonde herrührt.
Eine hybridisierende Sonde ist eine Verstärkungssonde oder eine Erkennungssonde, die an eine Matrixsequenz hybridisiert. Im allgemeinen sind alle Verstärkungssonden und alle Erkennungssonden hybridisierende Sonden, mit der Ausnahme bestimmter Verstärkungssonden in dem ersten Zyklus der Verstärkung einer einzelsträngigen Verstärkungssequenz.
Eine Erkennungssonde ist eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu einem Abschnitt von jedem von zwei benachbart gelegenen Verstärkungssonden-Segmenten in einem Verstärkungsprodukt ist. Die Erkennungssonden hybridisieren an das Verstärkungsprodukt ausreichend angrenzend aneinander, um zu ermöglichen, daß eine Wechselwirkung zwischen den hybridisierten Sonden auftritt.
Ein Erkennungsprodukt ist die Nukleinsäuresequenz, die aus einer Anzahl ununterbrochen hybridisierter Erkennungssonden erzeugt wird. Das Erkennungsprodukt braucht nicht gebunden zu sein.
Ein falsches Verstärkungs-Nebenprodukt oder ein Nebenprodukt ist ein Produkt, das aus der Verbindung von Verstärkungssonden herrührt, welches nicht über die ursprünglichen Verstärkungssequenzen abgeleitet ist.
Eine Markierung ist ein Anteil, der an eine Erkennungssonde oder verstärkungssonde konjugiert ist, um ähnlich markierte Sonden von anderen Sonden zu unterscheiden. Die Markierung braucht nicht eine signalerzeugende Markierung zu sein, sondem kann z.B. eine Einrichtung zum Abtrennen des Produktes, das ausgemessen werden soll, und/oder eine Einrichtung für die nachfolgende Befestigung einer erfaßbaren Markierung bilden.
Eine erfaßbare Markierung ist eine signalerzeugende Markierung, die zur Erfassung in der Lage ist, entweder direkt oder durch ihre Wechselwirkung mit einer Substanz so wie einem Substrat (in dem Fall eines Enzyms) einer Lichtquelle (in dem Fall einer fluoreszierenden Verbindung) oder einer Elektronenvervielfacherröhre (in dem Fall einer radioaktiven chemolumineszierenden Verbindung).
Eine Näherungsmarkierung ist eine von wenigstens zwei Markierungen, die miteinander wechselwirken, um ein erfaßbares Signal zu erzeugen, wenn die Näherungsmarkierungen zusammengebracht werden. Typischerweise wird eine erste Näherungsmarkierung in Kombination mit einer entsprechenden Näherungsmarkierung benutzt, um ein erfaßbares Signal unter Bedingungen zu erzeugen, bei denen die beiden Näherungsmarkierungen nebeneinander liegen.
Ein Beispiel der Verstärkungsprozedur der vorliegenden Erfindung, bei der eine doppelsträngige Verstärkungssequenz benutzt wird, ist in Figur 1 veranschaulicht. Mit Bezug auf Figur 1 benutzt die Verstärkungsprozedur eine Vielzahl von Paaren von Verstärkungssonden [(B) (1) und (B) (2)]. Die Verstärkungssonden haben bevorzugt eine Länge von 10 bis 30 Nukleotiden, können jedoch irgendeine Länge haben, die ein Nukleotid übersteigt. Die Elemente jeden Paares der Verstärkungssonden sind so gewählt, daß sie zueinander komplementär sind, wobei wenigstens ein übereinstimmendes Element [(B) (1) oder (B) (2)] jedes Paares von Sonden auch komplementr zu einem vorbezeichneten Segment der Verstärkungssequenz [(A) (1) und (A) (2)] ist, die als eine Matrix wirkt. Die Nukleinsäuresequenzen der hybridisierenden Elemente jedes Paares von Verstärkungssonden wird so gewählt, daß sie zu einem unterschiedlichen Abschnitt der Verstärkungssequenz komplementär sind, so daß die hybridisierenden Verstärkungssonden, wenn sie an die Verstärkungssequenz hybridisiert werden, im wesentlichen die gesamte Länge der Verstärkungssequenz in einer ununterbrochenen Weise überdecken [(C) (1) und (C) (2)].
Wenn die Verstärkungssequenz doppelsträngig ist, werden beide Elemente jedes Paares von Verstärkungssonden notwendigerweise komplementär zu gegenüberliegenden Abschnitten der komplementären Stränge der Verstärkungssequenz sein; dchc die Verstärkungssonden AP&sub1;, AP&sub2; und AP&sub3; [(B) (1)] sind komplementär zu der Verstärkungssequenz AS' [(A) (2)], und die Verstärkungssonden AP&sub1;', AP&sub2;' und AP&sub3;' L(B) (2)] sind komplementär zu der Verstärkungssequenz AS [(A) (1)].
Die hybridisierenden Verstärkungssonden hybridisieren an die Verstärkungssequenz ausreichend eng aneinander, um es zu ermöglichen, daß die Enden der Verstärkungssonden gebunden werden. Ein Reaktionstyp, der in der Lage ist, die Bindung der Sonden zu bewirken, ist die enzymatische Wirkung einer Ligase auf Sonden, die an ihren 5'-Enden phosphoryliert worden sind. Andere Bindungsverfahren sind auch möglich. Im allgemeinen erfordern diese Verfahren die Verwendung eines bindenden Reagenzes, das eine Chemikahe, ein Enzym (so wie Ligase), Licht oder Wärme sein kann.
Bei einer Ausführungsform ist ein einzelner chemischer Anteil an die verbindenden Enden der Verstärkungssonden angebracht. Die Bindung kann bewirkt werden, indem ein bindendes Reagenz benutzt wird, um das gebundene Verstärkungsprodukt durch die Bildung eines zweiten Anteiles zu erzeugen. Bevorzugt wird das bindende Reagenz nur die Struktur des ersten chemischen Anteiles ändern, wobei zwei der ersten chemischen Anteile in enger Nachbarschaft liegen, so wie es beispielsweise der Fall sein würde, wenn zwei Verstärkungssonden, die mit dem ersten chemischen Anteil behaftet sind, an eine Matrix hybridisiert werden. Ein Beispiel des Verwendens eines ersten chemischen Anteiles, um diesen Typ der Bindung zu bewirken, ist die Verwendung von Sulfhydryl-Gruppen (-SH) wobei die Bindung durch Oxidation erreicht wird, um eine Disulfid-Verbindung (-S-S-) zu erzeugen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist ein erster chemischer Anteil an einem bindenden Ende einer Verstärkungssonde angebracht, wobei ein zweiter chemischer Anteil an dem gegenüberliegenden Ende einer weiteren Verstärkungssonde angebracht ist, die gebunden werden soll. Die Bindung wird durch die Bildung eines dritten chemischen Anteiles bewirkt, der in einigen Situationen auch als ein geänderter erster oder zweiter chemischer Anteil bezeichnet werden kann.
Die Bindung kann durch die Verwendung eines bindenden Reagenzes auf eine Weise ähnlich der bewirkt werden, wo nur ein chemischer Anteil verwendet wird, um die bindenden Enden der Sonden zu modifizieren. Wenn zwei unterschiedliche chemische Anteile benutzt werden, kann das bindende Reagenz entweder mit dem ersten oder dem zweiten chemischen Anteil Wechselwirken, es ist jedoch bevorzugt, daß das bindende Reagenz die Struktur keiner der chemischen Anteile ändert, wenn nicht und bis die beiden chemischen Anteile in enge Nachbarschaft gebracht werden, so wie durch Hybridisierung. In dem Fall, daß Licht als das bindende Reagenz benutzt wird, braucht nur der erste der beiden chemischen Anteile mit dem Licht zu wechselwirken, um ein elektrisch angeregtes Molekül zu erzeugen, das dann mit dem entsprechenden chemischen Anteil über eine perizyklische Reaktion reagiert, um den verbindenden dritten chemischen Anteil zu erzeugen. Es ist bevorzugt, daß der angeregte chemische Anteil einen kurzlebigen angeregten Zustand hat, so daß er nur dann mit dem entsprechenden chemischen Anteil reagieren wird, wenn die beiden chemischen Anteile in enger Nachbarschaft liegen.
Es ist auch möglich, die Bindung bei Fehlen eines bindenden Reagenzes zu bewirken, wenn beispielsweise ein Nukleophil (N:) an dem bindenden Ende einer Verstärkungssonde befestigt wird, wobei eine verlassende Gruppe an dem gegenüberliegenden Ende einer weiteren Verstärkungssonde befestigt ist, die gebunden werden soll. Die Bindung tritt durch die Bildung des modifizierten Nukleophils (-N-) auf. In dieser Situation wird die Bindung einfach durch die enge Nähe (z.B. durch Hybridisierung) von N: und der gewählten verlassenden Gruppe bewirkt. Alternativ kann die verlassende Gruppe durch ein Reagenz aktiviert werden, so wie Licht oder ein Enzym, um die Bindung zu beschleunigen. Ein Beispiel dieses Types der Bindung wurde sein, wenn N: eine Sulfhydryl-Gruppe ist, und die verlassende Gruppe ist das Jod oder eine Jod-Azetyl-Gruppe. Dies ist ähnlich dem Typ der Chemie, der bei der Präparation von Peptiden und Proteinen verwendet wird, wo N: ein Amingruppe und die verlassende Gruppe ein aktives Ester ist.
Die Verwendung des Enzyms Ligase als ein bindendes Reagenz, um eine Hydroxylgruppe (erster chemischer Anteil) an eine Phosphatgruppe (zweiter chemischer Anteil) zu binden, um eine Phosphat-Ester-Verbindung (dritter chemischer Anteil) zu erzeugen, ist ein bevorzugtes Verfahren der Bindung, weil einer der beiden unterschiedlichen chemischen Anteile, der für die Bindung notwendig ist (d.h. die Hydroxyl-Gruppe) der Nukleinsäure-Sonde endogen ist. Wenn Ligase verwendet wird, um phosphorylierte Sonden zu verbinden, muß nur ein Ende der Sonde modifiziert werden.
Wenn einmal die einzelnen Verstärkungssonden gebunden sind, werden die sich ergebenden Verstärkungsprodukte getrennt oder einzelsträngig gemacht, durch Denaturierung des Verstärkungsproduktes [(D) (1) oder (D) (2) in dem Fall einer einzelsträngigen Verstärkungssequenz und (D) (1) und (D) (2) in dem Fall einer doppelsträngigen Verstärkungssequenz], und der Prozeß wird mit den verbleibenden Sonden oder einer neuen Versorgung mit Verstärkungssonden wiederholt.
Bei der ersten Wiederholung (zweiter Zyklus) des Prozesses wirkt das Verstärkungsprodukt selbst als eine Matrixsequenz für zusätzliche oder restliche Verstärkungssonden. Beispielsweise wirkt das Verstärkungsprodukt, das aus AP&sub1;', AP&sub2;' und AP&sub3;'[(D) (1)] gebildet wird, als eine Matrix für die AP&sub1;, AP&sub2; und AP&sub3;-Verstärkungssonden [(B) (1)] in dem zweiten Zyklus der Verstärkung einer einzelsträngigen Verstärkungssequenz. In dem Fall einer doppelsträngigen Verstärkungssequenz würde das Verstärkungsprodukt, das aus AP&sub1;, AP&sub2; und AP&sub3; [(D) (2)] gebildet wird, auch als eine Matrix für die AP&sub1;', AP&sub2;' und AP&sub3;'-Verstärkungssonden [(B) (2)] wirken. In nachfolgenden Zyklen wirken sowohl die (D) (1)- und (D) (2)-Verstärkungsprodukte als Matrizen bei der Verstärkung von entweder einer einzelsträngigen oder einer doppelsträngigen Verstärkungssequenz. Die wiederholte Erzeugung von zusätzlichen Verstärkungsprodukten, die als Matrizen in nachfolgenden Zyklen wirken, ermöglicht die exponentielle Akkumulation von Verstärkungsprodukt.
Der Zyklus der Denaturierung des Verstärkungsproduktes aus der Matrixsequenz, des Anheftens zusätzlicher oder restlicher Verstärkungssonden an ihre komplementären Sequenzen auf der Matrixsequenz und das Binden der angehefteten Verstärkungssonden wird wiederholt, bis eine ausreichende Menge des Verstärkungsproduktes erzeugt ist, das zu einem meßbaren Signal bei der Prüfung der Wahl erfolgt. Wenn Denaturierung durch Wärme benutzt wird, ist es bevorzugt, eine thermostabile Ligase zu verwenden.
Das Verstärkungsprodukt kann direkt durch Verwendung einer überlicherweise benutzten Zweistufenprozedur ausgemessen werden, die umfaßt: (1) denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) um (entsprechend der Größe) das Verstärkungsprodukt von nichtgebundenen und unvollständig gebundenen Rest-Verstärkungssonden abzutrennen; gefolgt von (2) Autoradiographie, um die abgetrennten Nukleinsäureprodukte sichtbar zu machen. Diese Prozedur kann benutzt werden, wenn eine oder mehrere der Verstärkungssonden mit einem radioaktiven Isotop so wie ³²P markiert ist.
Eines der Probleme, die inhärent mit der Verstärkungsprozedur der vorliegenden Erfindung verbunden sind, ist die potentielle Erzeugung von falschen Verstärkungs-Nebenprodukten, die Prüfungsergebnisse nachteilig beeinflussen können, die auf der Größenabtrennung basieren, so wie die zweistufige Prüfungsprozedur, die oben beschrieben ist. Falsche Verstärkungs-Nebenprodukte treten anfangs als das Ergebnis der Bindung von Verstärkungssonden auf, ohne daß man den Vorteil des Vorliegens einer Matrixsequenz hätte. Dieser Prozeß, auch als stumpfendige Bindung bekannt, kann in Lösung auftreten, wenn Verstär kungssonden, die im Überschuß für die Verstärkung der Verstärkungssequenz zur Verfügung stehen, sich unbeabsichtigt ausreichend ausrichten, so daß sie so nahe zueinander kommen, daß die Sonden gebunden werden können. Wenn fehlerhafte Verstärkungs-Nebenprodukte aus der Bindung von beiden Elementen eines komplementären Paares von Verstrkungssonden erzeugt werden, ist das Nebenprodukt in der Lage, sich selbst exponentiell zu reproduzieren. Ein fehlerhaftes Verstärkungs-Nebenprodukt zeigt nicht das Vorliegen der Targetsequenz in der Testprobe an, die sich in der Analyse befindet.
Der Hauptteil des fehlerhaften Verstärkungs-Nebenprodukts ist auf eine nichtspezifische Weise ausgerichtet, aufgrund des Fehlens der anfänglichen Beteiligung einer Verstärkungsmatrix, um die Sonden korrekt auszurichten. Die Erkennungsprozedur der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, zwischen richtig und unrichtig zusammengesetzten gebundenen Produkten zu unterscheiden, und minimiert daher, schließt jedoch nicht vollständig aus, die Wirkung fehlerhafter Verstärkungsprodukte bei endgültigen Prüfungsergebnissen. Dies ist der Fall daher, weil Unterscheidungsverfahren, so wie das der vorliegenden Erfindung immer noch nicht zwischen korrekt gebundenen fehlerhaften Verstärkungsprodukten und dem korrekt angeordneten wahren Verstärkungsprodukt, die von einer Matrix abgeleitet ist, unterscheiden können.
Die aussondernde Wirkung fehlerhafter Verstärkungs-Nebenprodukte kann jedoch weiter durch die Verwendung ansteigender Anzahlen von Paaren von Verstärkungssonden minimiert werden. Das Erhöhen der Anzahl der Paare von Sonden, die bei dem Verstärkungsprozeß benutzt werden, minimiert statistisch die Gelegenheit für die Sonden, sich unbeabsichtigt in der richtigen Weise für die fehlerhafte Bindung auszurichten. Beispielsweise, wenn man nur exponentiell wachsende fehlerhafte Verstärkungs-Nebenprodukte berücksichtigt, wird nur eines von sechzehn der fehlerhaften Verstärkungsprodukte als korrekt angeordnetes Produkt berechnet, das in einem Verstärkungssystem gebildet wird, welches drei Paare von Sonden benutzt. Das Verhältnis von richtig angeordneten fehlerhaften Verstärkungsprodukten zu dem gesamten fehlerhaften Verstärkungsprodukt, das bei einem Verstärkungssystem gebildet wird, welches vier Paare von Sonden benutzt, wird 1:352 sein.
Die Verkleinerung der Anzahl korrekt zusammengesetzter Nebenprodukte erhöht sich dramatisch mit dem Einfügen zusätzlicher Paare von Sonden. Zum Beispiel verringert sich das Verhältnis von korrekt zusammengesetzten Nebenprodukten zu gesamtem fehlerhaften Verstärkungs-Nebenprodukt auf 1:13.842, wenn fünf Paare von Verstärkungssonden benutzt werden. Zusätzlich wird sich auch die Anzahl fehlerhafter Verstärkungsprodukte, die die volle Länge des von der Matrix abgeleiteten Verstärkungsprodukts erreicht, auch mit zunehmender Anzahl von Paaren von Verstärkungs sonden abnehmen.
Wenigstens zwei Erkennungssonden werden gemäß der Erkennungsprozedur der vorliegenden Erfindung benutzt. Die Erkennungssonden sind so gestaltet, daß sie eine Verbindung von zwei Verstärkungssonden-Segmenten in einem richtig angeordneten Verstärkungsprodukt überspannen. Daher müssen wenigstens drei Paare von Verstärkungssonden in der Verstärkungsprozedur der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Verstärkungsprodukt zu erzeugen, das wenigstens drei Verstärkungssonden- Segmente hat. Bevorzugt sind die Erkennungssonden in der Länge mit den Verstärkungssonden vergleichbar.
Nach der ausreichenden Zyklusdurchführung, um eine erfaßbare Menge des Verstärkungsproduktes zu erzeugen, kann das richtig aufgebaute Verstärkungsprodukt gemäß der Erkennungsprozedur der vorliegenden Erfindung erfaßt werden. Die Verstärkungsprozedur erzeugt zwei komplementäre Verstärkungsprodukte, von denen eines oder beide gemäß der Erkennungsprozedur erfaßt werden können. Ein Beispiel des Verwendens der Erkennungsprozedur der vorliegenden Erfindung, um das Vorliegen eines der komplementären Verstärkungsprodukte zu erfassen, ist in Figur 2 veranschaulicht.
Mit Bezug auf Figur 2 benutzt die Erkennungsprozedur der vorliegenden Erfindung wenigstens zwei Erkennungssonden [(E)], wobei jede Erkennungssonde komplementär zu einem Abschnitt von jeder von zwei benachbart gelegenen Verstärkungssonden-Segmenten eines Verstärkungsproduktes ist. Bevorzugt, wenn n Paare von Verstärkungssonden in der Verstärkungsprozedur benutzt werden, werden n-1 Erkennungssonden in der Erkennungsprozedur benutzt.
Bei der Erkennungsprozedur der vorliegenden Erfindung dient das Verstärkungsprodukt [(D) (1) und/oder (D) (2)] als eine Matrix auf eine Weise ähnlich der, wie sie die Verstärkungssequenz in dem ersten Zyklus der Verstärkungsprozedur und die Verstärkungssequenz und das verstärkungsprodukt in nachfolgenden Zyklen darstellen. Die Erkennungsprozedur, die in Figur 2 veranschaulicht ist, zeigt nur ein Verstärkungsprodukt [(D) (1)] als eine Matrixsequenz für die Erkennungssonden. Die Erkennungssonden hybridisieren an das bezeichnete Verstärkungsprodukt ausreichend benachbart zueinander [(F)], um zu ermöglichen, daß eine Wechselwirkung zwischen den hybridisierten Sonden auftritt. Die Wechselwirkung kann eine Bindungsreaktion sein, die die Enden der Erkennungssonden auf irgendeine Weise zusammenbindet, so wie früher im Zusammenhang mit der Bindung von Verstärkungssonden beschrieben worden ist. Wenn ein gebundenes Erkennungsprodukt gebildet wird [(G) in Figur 2], kann das gebundene Produkt anschließend von der Verstärkungsprodukt-Matrix durch Denaturierung getrennt werden, obwohl die Abtrennung nicht wesentlich ist.
Irgendeine Einrichtung zum Erfassen kann verwendet werden, die das Vorliegen eines richtig angeordneten Erkennungsproduktes erfordert. Wenn eine Erkennungssonde mit ³²P markiert ist, kann das Vorliegen eines gebundenen Erkennungsproduktes überprüft werden, indem PAGE benutzt wird, gefolgt durch eine Analyse mit einem Autoradiogramm. Wenn zwei Erkennungssonden benutzt werden, kann jede der beiden Erkennungssonden mit einer Markierung versehen werden.
Bei einer Ausführungsform die zwei markierte Erkennungssonden verwendet, ist einen Erkennungssonde an eine erfaßbare Markierung konjugiert, wobei die andere Erkennungssonde mit einer Einrichtung zum Entfernen des Erkennungsproduktes aus der Lösung versehen ist, so wie einem Liganden, der sich nachfolgend an seinen entsprechenden immobilisierten spezifischen Bindungspartner bindet. Bei der Erkennungsprozedur, die in Figur 2 gezeigt ist, ist eine der Erkennungssonden an ein Antigen konjugiert, das nachfolgend für die Entfernung des Erkennungsproduktes durch die Verwendung von immobilisiertem Antikörper [(H)] sorgt. Das Erkennungsprodukt kann dann aus der Lösung entfernt werden, indem das Erkennungsprodukt auf einem unlöslichen Träger [(1)] gefangen wird. Dieses Verfahren des Entfernens des markierten Erkennungsproduktes aus der Lösung kann auch stattfinden, während das Erkennungsprodukt noch an das Verstärkungsprodukt hybridisiert ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird die erste Erkennungssonde an eine erste Näherungsmarkierung konjugiert, wobei eine zweite Erkennungssonde an eine entsprechende zweite Näherungsmarkierung konjugiert ist. Die markierten Erkennungssonden hybridisieren ausreichend benachbart zueinander, um es zu ermöglichen, daß die beiden Näherungsmarkierungen miteinander wechselwirken, um ein erfaßbares Signal zu erzeugen. Beispielsweise kann die erste Näherungsmarkierung ein erstes Enzym sein, das ein Produkt erzeugt, welches als ein Substrat für ein zweites Enzym dient. Das zweite Enzym ist an die zweite Erkennungssonde als eine zweite Näherungsmarkierung konjugiert. Wenn die beiden Enzymmarkierten Erkennungssonden einander nahegebracht werden, wirkt das zweite Enzym auf das Produkt aus dem ersten Enzym, bevor das Produkt in Volumenlösung flüchten kann, um ein zweites Produkt zu erzeugen, das erfaßt werden kann.
Als Alternative kann ein Energie-Donator, so wie eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, als eine Näherungsmarkierung verwendet werden, mit einem Energie- Akzeptor, so wie Rhodamin, der als die zweite Näherungsmarkierung benutzt wird. Wenn zwei markierte Erkennungssonden einander nahegebracht werden, findet eine Energie-Übertragungsreaktion zwischen den beiden Näherungsmarkierungen statt, was zu einer meßbaren Aussendung von Energie führt. Noch andere Verfahren zum Messen der Menge der Erkennungsprodukte, die gebildet werden, werden den Fachleuten deutlich werden.
Die Erkennungsprozedur ist so gestaltet, daß sie von dem Vorliegen des Verstärkungsproduktes abhängt, das als eine Matrix dient, um die Erkennungssonden zusammenzubringen. Es ist jedoch möglich, daß eine einzelne ungebundene Verstärkungssonde (beispielsweise AP&sub2;' in Figur 2) in der Lage ist, sich allein mit den beiden Erkennungssonden zu binden, wenn die ungebundene Verstärkungssonde komplementär zu Abschnitten beider Erkennungssonden ist. Diese Erscheinung kann als eine "Brücken"-Wirkung bezeichnet werden. Es ist daher bevorzugt, die Länge der AP&sub2;'-Sonde so zu begrenzen, daß der Grad des überlappens der ungebundenen AP&sub2;'-Sonde mit den Erkennungssonden minimiert wird. Dies verringert die Neigung der ungebundenen AP&sub2;'-Sonde allein, die "Brücke" zu bilden, die die beiden Erkennungssonden bildet. Erhöhte Temperaturen, Puffer mit niedrigerer ionischer Stärke und/oder denaturierende Agenzien, so wie Formamid und Harnstoff, können bei der Bindereaktion als eine Alternative verwendet werden, um die Verstärkungssonden zu verkürzen, um die Bildung von Erkennungsprodukt durch den "überbrückenden" Effekt zu minimieren.
Die Erkennungsprozedur ist relativ einfach in Kombination mit der Verstärkungsprozedur zu verwenden. Die Erkennungsprozedur erfordert nur zwei zusätzliche Sondenreagenzien und einen zusätzlichen Zyklus der Hybridisierung. Die Hybridisierung der Erkennungssonden kann manchmal von Bindung gefolgt werden, ebenso wie von einem optionalen Denaturierungsschritt, abhängig von der bestimmten gewählten Prüfung. Anschließende Immobilisierung auf einen festen Trager ist schnell und erfordert nur wenig Eingriffszeit.
Die vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft wegen ihrer einmaligen Fähigkeit, die Einstellung einer Vielzahl von Parametern zu ermöglichen, um die ausgewählte Prozudur so maßzuschneidern, daß maximale Ansprechbarkeit für die spezielle Prüfung, die gewählt ist, zu erreichen. Beispielsweise kann die Anzahl der Paare von Verstärkungssonden eingestellt werden, um die Ansprechbarkeit einer Prüfung zu verbessern, die die Verstärkungsprozedur der vorliegenden Erfindung in Kombination mit der zweistufigen Prozedur von PAGE, gefolgt von Autoradiographie, benutzt.
Zusätzliche Parameter werden der Anderung zugänglich, indem man die Erkennungsprozedur in Kombination mit der Verstärkungsprozedur der vorliegenden Erfindung benutzt. Wenn sowohl die Verstärkungs als auch die Erkennungsprozedur in dasselbe Verfahren eingeschlossen werden, wird der Effekt unbeabsichtigter Erzeugung von fehlerhaften Verstärkungs-Nebenprodukten weitgehend minimiert, indem Nutzen aus der Fähigkeit des Erkennungsverfahren zur Diskriminierung gezogen wird, während eine ansteigende Anzahl von Paaren von Verstärkungssonden benutzt wird.
Die Reagenzien der vorliegenden Erfindung (Verstärkungssonden und Erkennungssonden) können synthetisiert werden, indem irgendeines einer Zahl verfügbarer Verfahren des Standes der Technik für die oligonukleotidsynthese benutzt wird, die den Fachleuten bekannt sind. Ein bevorzugtes Verfahren ist eine vierstufige Prozedur, die kommerziell verfügbare Reagenzien und einen automatisierten Synthetisierer benutzt. Diese vierstuf ige Prozedur umfaßt: (1) Wegnehmen des Schutzes von einem polymergebundenen, geschützten Startnukleosid (der ersten Nukleinsäure in der Sequenz); (2) Kondensieren des ungeschützten Startnukleosids mit einem geschützten Nukleosid-Phosphoramidit (zweite Nukleinsäure in der Sequenz); (3) Abdecken der unreagierten 5'-Hydroxylgruppen der Nukleotide; gefolgt von (4) Oxidation der neu geformten Phosphitbindung.
Diese vier Stufen werden aufeinanderfolgend wiederholt, um weitere Nukleinsäuren zu der teilweise synthetisierten polymergebundenen Oligonukleotidsequenz hinzuzufügen, bis das gewünschte Nukleotid vollständig ist. Bei jeder Wiederholung des Prozesses wird das zuletzt hinzugefügte Nukleosid-Phosphoramidit das Startnukleosid im nächsten Zyklus.
Um die endgültige synthetisierte Oligonukleotidkette von dem Polymer zu extrahieren, muß das Oligonukleotid zuerst von dem Polymer geschnitten werden, das als ein Anker für die Synthese dient. Das Abtrennen des Oligonukleotides kann durch Behandlung mit frischem konzentriertem Ammoniak bei Zimmertemperatur durchgeführt werden. Nach dem Dekantieren der Oligonukleotidlösung von dem Polymer wird die konzentrierte Ammoniaklösung typischerweise in einem abgedichteten Rohr über eine längere Zeitdauer erhitzt, um die Nukleosid-Schutzgruppe zu entfernen.
Die Oligonukleotidlösung kann dann mit organischen Lösemitteln, so wie 1-Butanol und Äthyläther, extrahiert wreden, wobei die optische Dichte jeder Lösung spektrophotometrisch bei 260 nm bestimmt wird, um die Konzentration des synthetisierten Oligonukleotids zu bestimmen. Die Oligonukleotidlösung kann dann zur Reinigung und zum Entsalzen heruntergetrocknet werden, wobei bekannte Verfahren der präparativen Elektrophorese oder Säulen-Chromatographieverfahren benutzt werden.
Wenn eine Ligase benutzt wird, um hybridisierte Sonden zu verbinden, können die Verstärkungssonden und die Erkennungssonden phosphoryliert werden, wobei irgendwelche der verfügbaren bekannten Verfahren benutzt werden. Ein bevorzugtes Verfahren istdie durch Polynukleotid-Kinase katalysierte Einfügung von Phosphor. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren geschieht über chemische Synthese, während die Oligonukleotidsonde noch an dem Synthesepolymer verankert ist, vor dem Entfernen des Oligonukleotides von dem Träger. Die Verwendung von radioaktivem Phosphor für die Phosphorylierung schafft auch ein Mittel zum nachfolgenden Sichtbarmachen der Verstärkungsprodukte durch Autoradiographie; dmh. durch eine radioaktive Markierung.
Diese Sonden der vorliegenden Erfindung können auch mit anderen Markierungen gemäß irgendeinem der bekannten Verfahren zum Anbringen dieser Markierungen versehen sein. Beispielsweise können Nukleinsäure-Sonden mit Fluoreszein an ihren 5'-Enden markiert werden, indem ein zweistufiger Prozeß verwendet wird, bei dem eine Amingruppe zunächst während der Synthese befestigt wird. Nach dem Entfernen des Oligo-Amins von dem Träger wird Fluoreszein an das Amin-modifizierte Oligonukleotid angebracht, indem eine Lösung von FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat) in DMSO (Dimethylsulfoxid) benutzt wird.

Beispiel 1

Präparation von Oligonukleotidsequenzen

Um die Leistungsfähigkeit der vorliegenden Erfindung zu zeigen, wurden verschiedene unterschiedliche synthetische Verstärkungssequenzen benutzt. Die synthetischen Verstärkungssequenzen sind innerhalb eines Pst 1-Fragmentes von HTLV-I mit 51 Basenpaaren enthalten, wie es in Figur 3 veranschaulicht ist. Verstärkungssonden und Erkennungssonden wurden auch synthetisiert, so daß sie den Nukleinsäuresequenzen entsprechen, die in Figur 3 gezeigt sind.
Alle Oligonukleotidsequenzen (Verstärkungssonden, Erkennungssonden und synthetische Verstärkungssequenzen) wurden synthetisiert, indem eine vierstufige Prozedur mit verschiedenen zwischengeschalteten Waschungen verwendet wurde, wie unten beschrieben. Die Synthesen wurden auf einem automatisierten Synthetisierer des Modells 380 von Applied Biosystems, Inc. (ABI, Foster City, Californien) durchgeführt, wobei kommerziell verfügbare Reagenzien benutzt wurden.
Polymergebundenes, durch Dimethoxyl-Trityl geschütztes Nukleotid (erste Nukleinsäure in der Sequenz) in Trägersäulen wurde zuerst von seiner 5'-Dimethoxy-Trityl-Schutzgruppe befreit, indem eine Lt sung 3%iger Trichloressigsäure in Dichlormethan durch die Säule eine Minute lang geleitet wurde. Das Polymer wurde dann mit Azetonitril gewaschen, gefolgt vom Spülen mit trockenem Azetonitril. Das Polymer, das das ungeschützte Nukleosid enthält, wurde dann, bevor zum nächsten (Kondensations-) Schritt fortgeschritten wurde, unter Argon gelegt.
Der Kondensationsschritt wurde durchgeführt, indem zuerst das Polymer mit Tetrazol in Azetonitril behandelt wurde. Das polymergebundene, ungeschützte Nukleosid wurde dann mit einem geschützten Cyanoäthyl-Nukleosid-Phosphoramidit (zweite Nukleinsäure in der Sequenz; ABI, Foster City, Californien) in Azetonitril reagiert. Die Kondensationsreaktion durfte 2, Minuten fortdauern, wobei die Reaktanten nachfolgend durch Filtrierung abgezogen wurden.
Der Kondensation folgte das Abdecken der unreagierten 5'- Hydroxylgruppen der Nukleoside, indem eine Lösung eine Minute lang durch die Säule laufengelassen wurde, die durch Mischen eines Teiles einer Mischung, die bei der ABI (Foster City, Californien) erhältlich ist, welche Essigsäureanhydrid und 2,6-Lutidin in THF (Tetrahydrofuran) enthält, und eines Teiles 1-Methylimidazol in THF (auch von ABI, Foster City, Californien, erhältlich) hergestellt wurde.
Anschließend an das Entfernen der Abdecklösung wurde das Polymer 1,5 Minuten lang mit einer oxidierenden Lösung (0,1 M I&sub2; in H&sub2;O/2,6-Lutidin/THF, 1:10:40) behandelt. Dem folgte ein Spülen mit Azetonitril. Der Zyklus begann wieder mit einem Entfernen des Schutzes mit Trichloressigsäure/Methylenchlorid und wurde wiederholt, bis die gewünschte Oligonukleotidsequenz erhalten wurde.
Die polymergebundene endgültige Oligonukleotidkette wurde mit frischem, konzentriertem Ammoniak bei Zimmertemperatur 2, Stunden lang behandelt. Nach dem Dekantieren der Lösung von dem Polymer wurde die konzentrierte Ammoniaklösung bei 60ºC 16 Stunden lang in einem abgedichteten Rohr erhitzt.
Jede Oligonukleotidlösung wurde mit 1-Butanol und Äthyläther extrahiert. Die Konzentration jeder extrahierten Lösung wurde spektrophotometrisch bestimmt, indem die Absorption bei 260 nm gemessen wurde. Ein Bruchteil jeder extrahierten Lösung, der 5,0 O.D. Einheiten synthetisierten oligonukleotides, wurde für die präparative Elektrophorese konzentriert und in ein 7 molares Harnstoffgel mit 15 % Polyacrylamid geladen. Nach der Elektrophorese wurde das Produktband durch eine UV-Schattenprozedur sichtbar gemacht, vom Gel geschnitten, mit Elutierungspuffer (300 mM Natriumazetat (NaOAc), 2,5 mM EDTA, 100 mM Trismhcl, pH-Wert 8,0) extrahiert und dann auf einer G-50 Sephadex(R) (Pharmacia LKB Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey)-Säule entsalzt, wobei TEAB-Eluant (Triethyl-Ammoniumbikarbonat) verwendet wurde, um das gereinigte Oligonukleotid zu liefern.

Beispiel 2

5 Verstärkungszyklen mit 2 Paaren von Sonden

Zwei Reaktionen wurden eingestellt, um die Leistungsfähigkeit der Verstärkungsprozedur nach fünf Zyklen der Verstärkung zu bewerten, wobei zwei Paare von Verstärkungssonden und enzymatische Bindung benutzt wurde. Die änderbaren Reaktanten wurden wie folgt eingestellt:
E. Coli-DNA-Ligasepuffer (ELB) wurde mit 10x Konzentration präpariert, so daß er 500 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 40 mM MgCl&sub2;, 10 mM EDTA (Äthylendiamin-Tetraessigsäure), 50 mM DTT (Dithiothreitol) enthielt und 500 ug/ml BSA (Rinderserum-Albumin) enthielt.
Ligase/NAD (β-Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid)-Reagenz wurde zu 1x Konzentration ELB präpariert, so daß es 130 uM NAD enthielt, wobei 2 uL des Reagenzes 1,6 Einheiten von E. coli Ligase enthielt (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana). Dieses Reagenz wurde auf nassem Eis für die Dauer der Verstärkungszyklen gelagert.
EDTA/Farbstoffreagenz wurde praparlert, so daß es 11,8 mM EDTA, 6,3 M Harnstoff, 0,02 % Bromphenolblau und 0,02 % Xylencyanol enthielt.
Die Verstärkungssonden AP&sub1;' und AP&sub2; wurden mit γ³²P-ATP (Adenosin-5'-Triphosphat) phosphoryliert, (mit kaltem Phosphor) eingestellt, damit sie eine spezifische Aktivität von ungefähr 700 Ci/mmol haben, und Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) eingestellt. Die Verwendung von radioaktivem Phosphor für die Phosphorylierung erfüllte eine doppelte Rolle des: (1) Phosphorylieren der Enden der Verstärkungssonden, die für die Bindung notwendig sind, um das Verstärkungsprodukt zu bilden; und (2) Bilden eines Mittels zum nachfolgenden Sichtbarmachen des Verstärkungsproduktes durch Autoradiographie.
Jede der Reaktionsmischungen wurde in einem Volumen von 13 ul in oben verschraubten Polypropylen-Mikrorohren mit Gummi-O- Ringen von 1,5 ml (Sarstedt, Inc., Princeton, New Jersey) gestartet, mit 1,15x ELB, und sie enthielt auch 1,5 Pikomol jeder der Verstärkungssonden AP&sub1;, ³²P-AP&sub1;', und AP&sub2;', zusätzlich zu der Menge an Verstärkungssequenz, wie oben bezeichnet.
Die Reaktionen I und II wurden fünf Verstärkungszyklen ausgesetzt, wie folgt:
1. Die Polypropylen-Mikrorohre wurden abgedichtet, in einen Testrohraufbau eingeklemmt und dann 5 Minuten lang in ein Wasserbad von 90ºC untergetaucht.
2. Die Reaktionsrohre wurden dann aus dem Wasserbad entfernt und konnten sich 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur absetzen, wonach die Rohre kurz (einige Sekunden) in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge rotiert wurden.
3. Zwei (2,0) uL des Ligase/NAD-Reagenzes wurden zu jedem Rohr hinzugefügt, und die Inhalte durch leichtes Bewegen gemischt. Die Bindung konnte 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur fortschreiten, um den Verstärkungszyklus zu vollenden.
4. Die Polypropylen-Mikrorohre wurden wieder kurz in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge rotiert, wobei die Schritte 1 - 3 viermal wiederholt wurden, um fünf Verstärkungszyklen zu vollenden.
Die Reaktionen wurden nach dem letzten Zyklus abgeschreckt, indem 23 uL des EDTA/Farbstoffreagenzes hinzugefügt wurden. Die abgeschreckten Reaktionsmischungen wurden dann bei 90ºC 5 Minuten lang bebrütet und dann schnell auf Eis abgekühlt. Die sich aus der Verstärkung ergebenden Produkte wurden elektrophoretisch analysiert, indem die Proben auf einem denaturierenden 15 %igen Polyacrylamid-Gel (PAGE) laufen gelassen wurden, wobei Standardtechniken benutzt wurden, die in der Technik bekannt sind, und durch Autoradiographie der radiomarkierten Produkte sichtbar gemacht.
Die Wirkungsgrade der Reaktion wurden abgeschätzt, indem die Menge der verbleibenden 15mer ungebundenen Verstärkungssonden mit den sich ergebenden 30mer Verstärkungsprodukten verglichen wurden, wie sie durch Integrieren der Signale durch Abtastlaser-Densitometrie mit einem Ultroscan XL-Laser-Densitometer (Pharmacia LKB Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey) bestimmt wurden.
Reaktion I erzeugte 145 Femtomol des 3omer Verstärkungsprodukte aus der ursprünglichen Menge von 10 Femtomol der Start- Verstärkungssequenz, was eine 14,5fache Verstärkung von einer theoretisch möglichen 32fachen Verstärkung gab, oder einen mittleren Wirkungsgrad von 71 % pro Zyklus.
Kein 30mer Verstärkungsprodukt wurde in Reaktion II erfaßt (Kontrolle ohne eine Start-Verstärkungssequenz AS&sub1;&submin;&sub2; und AS&sub1;&submin;&sub2;').

Beispiel 3

10 Verstärkungszyklen mit 2 Paaren von Sonden

Zwei Reaktionen wurden eingestellt, um den Wirkungsgrad der Verstärkungsprozedur nach zehn Zyklen der Verstärkung zu bewerten, wobei zwei Paare von Verstärkungssonden und enzymatische Bindung benutzt wurden. Die variablen Reaktanten wurden wie folgt eingestellt:
E. Coli-DNA-Ligasepuffer (ELB), Ligase/NAD-Reagenz und EDTA/Farbstoffreagenz wurden ebenso wie bei Beispiel 2 präpariert.
Die Verstärkungssonden AP&sub1;' und AP&sub2; wurden mit γ³²P-ATP und Polynukleotid-Kinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 700 Ci/mmol phosphoryliert.
Jede der Reaktionsmischungen wurde in einem Volumen von 13 ul gestartet, in oben verschraubten Polypropylen-Mikrorohren, 1,15x in ELB, und sie enthielten auch 2,0 Pikomol von jeder der Verstärkungssonden AP&sub1;, ³²P-AP&sub1;, ³²P-AP&sub2;' und AP&sub2;', zusätzlich zu der Menge an Verstärkungssequenz, wie sie oben bezeichnet ist.
Die Reaktionen I und II wurden zehn Verstärkungszyklen ausgesetzt, folgend der Prozedur, die in Beispiel 2 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die Schritte 1 - 3 neunmal wiederholt wurden.
Die Reaktionen wurden nach dem letzten Zyklus abgeschreckt, indem 33 uL EDTA/Farbstoffreagenz hinzugefügt wurden, gefolgt von einem Erhitzen auf 90ºC über 5 Minuten und nachfolgendem schnellen Abkühlen auf Eis. Die sich ergebenden Produkte wurden analysiert, indem die Reaktionsmischungen auf denaturierendem 15 %igen PAGE laufengelassen und dann durch Autoradiographie sichtbar gemacht wurden (Figur 4). Die Produktausbeuten wurden bestimmt, indem die relative Intensität der 30mer Verstärkungsprodukte mit den verbleibenden ismer Verstärkungssonden verglichen wurde, wie es durch die integrierten Signale aus der Abtastlaser-Densitometrie bestimmt wurde. (Anmerkung: es gibt zwei 30mer Banden aufgrund der unterschiedlichen Basenzusammensetzung der beiden sich ergebenden Stränge AS&sub1;&submin;&sub2; und AS&sub1;&submin;&sub2;'.)
Die Reaktion I lieferte 299 Femtomol des 30mer Verstärkungsproduktes aus der ursprünglichen Menge von einem Femtomol der Start-Verstärkungssequenz. Für die erreichte 288fache Verstärkung wurde berechnet, daß sie einen gesamten mittleren Wirkungsgrad von 76 % darstellt.
Das Autoradiogramm der Reaktion II (die Kontrolle ohne Verstärkungssequenz) zeigte keine erfaßbare 30mer Verstärkungsprodukte nach einer Stunde der Belichtung. Ein über Nacht (16 Stunden)-Autoradiogramm zeigte jedoch eine Spurenmenge des 30mer Produktes in Reaktion II, was die Produktbildung aus stumpfer Bindung beim Fehlen der Verstärkungsseguenz anzeigte. Es wurde aus der Abtastlaser-Densitometrie abgeschätzt, daß die Menge dieses Produktes etwa 14 Femtomol betrug.

Beispiel 4

5 Verstärkungszyklen mit 3 Paaren von Sonden

Zwei Reaktionen wurden aufgestellt, um den Wirkungsgrad der Verstärkungsprozedur nach fünf Verstärkungszyklen zu bewerten, wobei drei Paare von Verstärkungssonden und enzymatische Bindung benutzt wurde. Die variablen Reaktanten wurden wie folgt eingerichtet:
E. Coli-DNA-Ligasepuffer (ELB) und EDTA/Farbstoffreagenz wurden ebenso wie in Beispiel 2 prapariert.
Ligase/NAD-Reagenz wurde mit lx Konzentration in ELB präpariert, so daß es 130 uM NAD enthielt, wobei die Konzentration von E. coli-Ligase (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, Californien) 25 Einheiten/uL betrug. Dieses Reagenz wurde für die Dauer der Verstärkungszyklen auf nassem Eis gelagert.
Bei diesem Mal wurden die Verstärkungssonden AP&sub1;', AP&sub2;, AP&sub2;'und AP&sub3; phosphoryliert, indem eine nichtradioaktive Phosphoryl-Gruppe an dem 5'-Ende eingeführt wurde, wobei die radioaktive Markierung benutzt wurde, um die sich ergebenden Produkte nach der Verstärkung durch PAGE-Autoradiographie sichtbar zu machen, für die durch alternative Mittel gesorgt wurde. Die nichtradioaktive Phosphoryl-Gruppe wurde chemisch in die Verstärkungssonden AP&sub1;', AP&sub2;, AP&sub2;' und AP&sub3; eingeführt, während die Sonden noch auf dem Syntheseharz waren, vor dem Wegnehmen des Schutzes der Nukleotide, unter Verwendung von 5'-chemisch phosphorylierendem Reagenz (Glen Research Corporation, Herndon, Virginia). Horn, T. u.a., Tetrahedron Let., 27, 4705 (1986).
Um ein Mittel zum nachfolgenden Sichtbarmachen der Verstärkungsprodukte durch Autoradiographie zur Verfügung zu stellen, wurden die Verstärkungssonden AP&sub1; und AP&sub3;' mit γ³²P-ATP und Polynukleotid-Kinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) phosphoryliert, wobei radioaktiver Phosphor mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 7000 Ci/mmol benutzt wurde. Der Phosphorylierung folgte die Verdünnung der ³²P-AP&sub1;- und ³²P-AP&sub3;'-Sonden mit unphosphorylierten AP&sub1;- und AP&sub3;'-Sonden in einem Verhältnis von 1:10, um die gewünschte endgültige spezifische Aktivität von 700 Ci/mmol zu erreichen. Die radioaktiven Sonden wurden auf diese Weise präpariert, um ihre Beteiligung an ihren 5'-Enden in der stumpfendigen Anordnung von Zufallsprodukten beim Fehlen der Verstärkungssequenz zu minimieren; d.h. nur 1 von 10 der AP&sub1;- und AP&sub3;'-Sonden werden phosphoryliert und sind daher in der Lage, an einem Bindungsereignis beteiligt zu sein.
Jede der Reaktionsmischungen wurde in einem Volumen von 8 ul von oben verschraubten Polypropylen-Mikrorohren gestartet, lx in ELB, und sie enthielten auch 1,0 Pikomol von jeder der Verstärkungssonden ³²P-AP&sub1;, P-AP&sub1;', P-AP&sub2;, P-AP&sub2;', P-AP&sub3; und ³²PAP&sub3;', zusätzlich zu der Menge an Verstärkungssequenz, wie oben bezeichnet.
Die Reaktionen I und, II wurden fünf Verstärkungszyklen ausgesetzt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Anschließend an den letzten Verstärkungszyklus wurden die Reaktionen abgeschreckt, indem 18 uL des EDTA/Farbstoffreagenz hinzugefügt wurden. Dem wiederum folgte das Erhitzen der abgeschreckten Reaktionsmischungen bei 90ºC über 5 Minuten und dann das schnelle Abkühlen auf Eis. Die Inhalte jedes Reaktionsrohres wurden dann auf denaturierendem 15 %igem PAGE laufen gelassen, wobei die Reaktionsprodukte durch Autoradiographie sichtbar gemacht wurden. Die Ausbeuten wurden aus dem Verhältnis der verbleibenden 15mer-Verstärkungssonden zu gebundenen 45mer Verstärkungsprodukten abgeschätzt, wie es durch Abtastlaser-Densitometrie quantitativ bestimmt wurde.
Die Reaktion 1 erzeugte 64,5 Femtomol des 45mer-Verstärkungsproduktes aus 5 Femtomol Start-Verstärkungssequenz für eine 2,9fache verstärkung oder einen Mittelwert von 67 % Wirkungsgrad pro Zyklus. Die Reaktion II zeigte keine 45mer-Produkte, selbst nach über Nacht-Autoradiographie.

Beispiel 5

10 Verstärkungszyklen mit 3 Paaren von Sonden

Zwei Reaktionen wurden aufgestellt, um den Wirkungsgrad der Verstärkungsprozedur nach zehn Verstärkungszyklen zu bewerten, wobei drei Paare von Verstärkungssonden und enzymatische Bindung benutzt wurden. Die variablen Reaktanten wurden wie folgt eingerichtet:
E. Coli-DNA-Ligasepuffer (ELB) und EDTA/Farbstoffreagenz wurden ebenso wie in Beispiel 2 präpariert.
Ligase/NAD-Reagenz wurde zu 1x Konzentration ELB präpariert, so daß es 130 uM NAD enthielt, wobei die Konzentration von E. coli-Ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts) eine Einheit/uL war. Dieses Reagenz wurde auf nassem Eis über die Dauer der Verstärkungszyklen gelagert.
Alle Verstärkungssonden wurden wie in Beispiel 4 beschrieben phosphoryliert.
Jede der Reaktionsinischungen wurde in einem Volumen von 8 ul in oben verschraubten Polypropylen-Mikrorohren gestartet, 1x ELB, und sie enthielt auch 1,0 Pikomol von jeder der Verstärkungssonden ³²P-AP&sub1;, P-AP&sub1;', P-AP&sub2;, P-AP&sub2;', P-AP&sub3; und ³²PAP&sub3;', zusätzlich zu der Menge an Verstärkungssequenz, wie oben bezeichnet.
Beide Reaktionen wurden zehn Zyklen der Verstärkung ausgesetzt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Nach dem letzten Zyklus wurden die Reaktionen abgeschreckt, indem 28 uL des EDTA/Farbstoffreagenz hinzugefügt wurden, gefolgt vom Erhitzen bei 90ºC über 5 Minuten und nachfolgendem schnellen Abkühlen auf Eis.
Die Reaktionsmischungen wurden auf denaturierendem 15 %igen PAGE laufen gelassen, gefolgt von der Sichtbarmachung der Produkte durch Verwenden von Autoradiographie (Figur 5). Die Reaktion 1 erzeugte 244 Femtomol des 45mer Verstärkungsproduktes, wie durch die Abtastlaser-Densitometrietechnik bestimmt, die früher beschrieben worden war. Diese 122fache Verstärkung entspricht einem gesamten mittleren Wirkungsgrad von 62% pro Zyklus.
Über Nacht-Autoradiographie zeigte eine Spur von 45mer Verstärkungsprodukten aus der Reaktion II. Obwohl die benachbarten Spuren die densitometrische Quantifizierung der 45mer-Verstärkungsprodukte aus der Reaktion II verhinderten, wurde die Menge an 45mer-Produkt visuell zu ungefähr 0,4 Femtomol abgeschätzt. Dies steht in scharfem Kontrast zu den ungeführ 14 Femtomol des 3omer-Stumpfproduktes, das sich aus der Verstärkung bei zehn Zyklen ergab, wobei zwei Paare von Sonden benutzt wurden (Beispiel 3). Somit lieferte die Verwendung von drei Paaren von Sonden bei der Verstärkungsprozedur eine ungefähr 3sfache Verbesserung im Signal-zu-Rauschen-Verhältnis gegenüber der Benutzung von zwei Paaren von Sonden.

Beispiel 6

Erkennungsprozedur unter Verwendung von einer markierten Erkennungssonde

Zwei Reaktionen wurden aufgestellt, um das Erkennungssystem der vorliegenden Erfindung zu zeigen, wobei eine markierte Erkennungssonde und enzymatische Bindung der Erkennungssonden verwendet wurden, um ein gebundenes Erkennungsprodukt zu erzeugen. Die variablen Reaktanten wurden wie folgt eingerichtet:
Ligase/NAD-Reagenz wurde ebenso wie in Beispiel 5 präpariert.
EDTA/Farbstoffreagenz wurde so präpariert, daß es 20 mM EDTA, 6,1 M Harnstoff, 0,02 % Bromphenolblau und 0,02 % Xylenzyanol enthielt.
Die Erkennungssonde DP&sub2; wurde mit γ³²P-ATP und Polynukleotid- Kinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 7000 Ci/mmol phosphoryliert.
Sowohl Reaktion I als auch Reaktion II wurden in einem Volumen von 23 uL gestartet, 1,09x in ELB, mit 100 Femtomol von beiden der Erkennungssonden DP&sub1; und ³²P-DP&sub2;, die zu den zwei Reaktionsmischungen hinzugefügt wurden
Die Reaktionsmischungen wurden bei 90ºC über 5 Minuten bebrütet und durften dann bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang verschweißen. Zwei (2,0) uL des Ligase/NAD-Reagenz wurden zu jedem Polypropylen-Mikrorohr hinzugefügt und die Inhalte durch leichtes Bewegen gemischt. Die Bindung durfte 5 Minuten bei Zimmertemperatur fortschreiten, um die Bildung des Erkennungsprodukte zu vervollständigen. Die Reaktionen wurden durch den Zusatz von 25 uL des EDTA/Farbstoffreagenz abgeschreckt. Diesem folgte das Erhitzen auf 90 ºC über 5 Minuten und das nachfolgende schnelle Abkühlen auf Eis. Die radioaktiven Produkte wurden getrennt, indem die Reaktionsmischungen auf denaturierendem 15 %igem PAGE laufen gelassen wurden, und durch Autoradiographie sichtbar gemacht (Figur 6). Die Reaktion 1 erzeugte das erwartete 3omer-Erkennungsprodukt. Es gab kein Anzeigen gebundenen Materials in Reaktion II.

Beispiel 7

Markieren von Sonden mit Fluoreszein

Die Verstärkungssonde AP&sub1; wurde an ihrem 5'-Ende mit Fluoreszein markiert, indem ein zweistufiger Prozeß verwendet wurde, wobei eine Amingruppe zuerst während der Synthese angebracht wurde, durch Verwenden eines 5'-Amino-Modifizierers C6 (Glen Research Corporation, Herndon, Virginia) als letztem Zyklus der Synthese. B.A. Connolly, Nucleic Acids Res., 15, 3131 (1987). Der 5'-Amino-Modifizierer ist ein β-Cyanoethyl- Phosphoramidit, das, wenn es aktiviert ist (z.B. mit 1 H- Tetrazol) an das 5'-Ende des Oligonukleotides auf eine Weise koppelt, die ähnlich der Kopplung eines Nukleosid-Phosphoramidits mit dem Oligonukleotid ist. Die primäre Amingruppe ist durch eine Monomethoxy-Trityl-Gruppe geschützt, die nachfolgend in dem Zyklus des Wegnehmens des Schutzes durch Verwendung von Trichloressigsaäure entfernt wird. Nach der Kopplung, der Oxidation, dem Wegnehmen des Schutzes und dem Entfernen des Oligo-Amins von dem Träger (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde Fluoreszein angebracht, wie unten beschrieben.
Vier (4,0) O.D. Einheiten rohen Oligonukleotids wurden zur Trockenheit in einem SpeedVac(R) Verdampfer (Savant Instruments, Inc., Farmingdale, New York) verdampft. Ein 50 ul- Anteil 80 %igen Äthanols wurde dann zu dem Rest hinzugefügt, wonach die Probe wieder verdampft wurde. Der rohe oligo-Amin- Rest wurde in 25 ul 100 mM Natriumbikarbonat/Natriumkarbonat (NaHCO&sub3;/Na&sub2;CO&sub3;)-Puffer, eingestellt auf einen pH-Wert von 9,5, gelöst. Dazu wurden 25 ul einer Lösung von FITC (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wisconsin) in DMSO in einer Konzentration von 10,0 mg/ml hinzugefügt. Die sich ergebende Mischung wurde einige Sekunden lang verwirbelt, dann einige Sekunden lang zentrifugiert und durfte dann im Dunklen 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur reagieren.
Um die Ausbeute an mit Fluoreszein markiertem Oligonukleotid zu maximieren, wurde die Reaktion wiederholt, dem FITC ausgesetzt, indem weitere 25 ul des NaHCO&sub3;/Na&sub2;CO&sub3;-Puffers (pH-Wert 9,5) und weitere 25 ul der FITC-Lösung in DMSO (10 mg/ml) hinzugefügt wurden. Die Reaktion durfte zusätzliche 15 Minuten bei Zimmertemperatur fortschreiten. Dieses wurde zwei weitere Male wiederholt, mit der Ausnahme, daß nach der letzten Behandlung die Reaktion 1,5 Stunden anstatt von 15 Minuten fortschreiten durfte.
Das mit Fluoreszein markierte Produkt wurde ausgefllt, indem 22 ul 3M NaOAc und 900 ul 100 %igen Äthanols hinzugefügt wurden, gefolgt von Kühlen bei -20ºC über 20 Minuten, dann Zentrifugieren bei 4ºC über 20 Minuten und schließlich Dekantieren des Überstandes. Das ausgefällte Produkt wurde dann mit 150 ul 80 %igen Äthanols gewaschen, kurz im Vakuum getrocknet und in 50 ul des belastenden (denaturierenden) Puffers (6,3 M Harnstoff, 0,02 % Bromphenol blau und 0,02 % Xylencyanol) resuspendiert. Die Mischung wurde durch Kochen über 5 Minuten denaturiert, dann schnell in einem Eisbad abgekühlt und auf einem 15 %igen präparativen Polyacrylamidgel laufen gelassen. Das mit Fluoreszein versetzte Produkt wurde durch Fluoreszenz unter langwelligem ultraviolettem Licht sichtbar gemacht, von dem Gel geschnitten und 36 Stunden lang bei Zimmertemperatur elutiert, wobei ein Eluatpuffer benutzt wurde, der 300 mM NaOAc, 2,5 mM EDTA und 100 mM Tris HCl bei einem pH-Wert von 8,0 enthielt. Das gereinigte Produkt wurde entsalzt, indem der Überstand über eine G50/50 Sephadex(R)-Säule (Sigma Chemical Company, StC Louis, Missouri) geleitet wird, wobei 10 mM TEAB als ein Eluant benutzt wurden. Fraktionen, die Oligonukleotid enthielten (wie durch UV-Absorption bei 260 nm bestimmt), wurden kombiniert, verdampft und in Tris HCl/EDTA (10 mM Tris HCl, 0,1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) resuspendiert. Die Konzentration der sich ergebenden Lösung wurde durch UV-Absorption bestimmt, wobei das Vorliegen von Fluoreszein auf dem Oligonukleotid durch UV-Absorption bei 495 nm bestätigt wurde.

Beispiel 8

Erkennungsprozedur unter Verwendung von zwei markierten Erkennungssonden

Vier Reaktionen wurden aufgestellt, um das Erkennungssystem der vorliegenden Erfindung zu zeigen, wobei zwei markierte Erkennungssonden und enzymatische Bindung der Erkennungssonden benutzt wurden, um ein gebundenes Erkennungsprodukt zu erzeugen. (Siehe beispielsweise Figur 2, wo das "Ag" Fluoreszein ist und "Ab" Anti-Fluoreszein-Antikörper ist). Die variablen Reaktanten wurden wie folgt eingerichtet:
Ligase/NAD-Reagenz wurde auflx Konzentration in ELB präpariert, so daß es 130 uM NAD enthielt, wobei 2 uL des Reagenzes 2,0 Einheiten von E. coli-Ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts) enthielt.
EDTA/Farbstoffreagenz wurde ebenso wie in Beispiel 6 präpariert.
Einfangpuffer, 1x in SSPE und 0,01 %ig in ATC (basisch behandeltes Kasein; Livesay, J:H: und R.A. Donald, Clin. Chim. Acta, 123 193 (1982)), wurde präpariert, indem 8,7 g NaCl, 1,38 g NaH&sub2;PO&sub4;CH&sub2;O Monobase, 370 mg EDTA und 100 mg ATC in 800 ml H&sub2;O gelöst wurden. Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,8 mit 5 N NaOH eingestellt, wonach das Volumen auf 1 L gebracht wurde.
Die Verstärkungssonde AP&sub2; wurde mit γ-³²P-ATP und Polynukleotid-Kinase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 7000 Ci/mmol phosphoryliert.
Die Verstärkungssonde AP&sub1; wurde mit Fluoreszein an dem 5'-Ende markiert, wobei die Prozedur, die in Beispiel 7 beschrieben ist, verwendet wurde.
Magnetische Schaf-Anti-Fluoreszein-Mikrokugeln wurden von Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, Mass., erhalten.
In diesem Beispiel wirken Fl-AP&sub1; und ³²P-AP&sub2; als Erkennungsprimer, die verwendet werden, um AS&sub1;&submin;&sub2;'zu messen. DP&sub1;' wirkt als eine potentielle "Brücke".
Jede Reaktion lief doppelt in einem Startvolumen von 8 uL, wobei die Reaktionsmischungen dahingehend identisch waren, daß sie 100 Femtomol sowohl von Fl-AP&sub1; und ³²P-AP&sub2; enthielten und 1,25x in ELB waren. Alle Reaktionsmischungen wurden denaturiert, indem die Mischungen bei 90ºC 5 Minuten lang bebrütet wurden, wobei dann die Nukleinsäuresequenzen bei Zimmertemperatur 5 Minuten lang anhaften konnten. Um die hybridisierten Erkennungssonden zu binden, wurden 2,0 uL des Ligase/NAD-Reagenz zu jedem Polypropylen-Mikrorohr hinzugefügt, und die Inhalte durch leichtes Bewegen gemischt. Die Bindung durfte 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur fortschreiten. Die Bindungsreaktionen wurden dann durch den Zusatz von 300 ul Einfangpuffer abgeschreckt.
Magnetische Mikrokügelchen (Perlen), die mit Anti-Fluoreszein- Antikörper überzogen waren, wurden in 75 x 12 mm Testrohre gelegt, wobei jedes Rohr 50 ul der Perlen enthielt. Die Perlen wurden dann zweimal gewaschen, indem 500 ul des Einfangpuffers hinzugefügt und die Lösungen einige Sekunden bewegt wurden, wonach die Perlen herausgenommen wurden, indem die Waschlösungen, die die Perlen enthielten, in eine magnetische Abtrenneinheit von Corning (Ciba-Corning Diagnostics, Medf ield, Massachusetts) für 5 Minuten bei Zimmertemperatur gebracht wurden. Die wässrigen Anteile der Waschlösungen wurden dann hinauspipettiert, wobei die Perlen in den Testrohren verblieben.
Jede der abgeschreckten Reaktionsmischungen wurde in eine der die Perlen enthaltenden Testrohre pipettiert, wobei die Perlen dann die mit Fluoreszein markierten Produkte über eine Dauer von etwa 15 Minuten bei 50ºC einfangen konnten, bei unterbrochener Bewegung. Die Perlen, die mit Fluoreszein markiertes Produkt enthielten, wurden von dem Überstand abgetrennt und dann zweimal auf dieselbe Weise gewaschen, auf die die mit Anti-Fluoreszein-Antikörper überzogenen Perlen anfangs gewaschen wurden. Die gewaschenen Perlen, die mit Fluoreszein markiertes Produkt enthielten, wurden dann in Polypropylen-Mikrorohre übertragen, indem sie in 300 ul Einfangpuffer suspendiert wurden und indem die Suspension in die Polypropylen- Mikrorohre pipettiert wurde. Die Proben wurden 1 Minute lang ausgezählt, wobei ein Flüssigkeits-Szintillationszähler Beckman LS-6800 benutzt wurde. Die sich ergebenden Daten sind in Tabelle gezeigt. Tabelle 1
Wie es aus den Daten ersichtlich ist, wurde eine lineare Antwort, relativ zu der Menge an vorliegendem Verstärkungsprodukt, aus dieser Probe erhalten. Das Vorliegen einer potentiellen "Brücke " (Reaktion IV) lieferte etwas Signal, jedoch war die Signalgröße minimal verglichen zu dem Signal, das erhalten wurde, wenn 1,0 Femtomol des Verstärkungsproduktes als das Target für die Erkennungssonden verwendet wurde (Reaktion II).
Verschiedene weitere Beispiele und Modifikationen der vorangehenden Beschreibung und der Beispiele werden einem Fachmann deutlich, nachdem er die vorliegende Offenbarung gelesen hat, ohne daß er sich vom Gedanken und Rahmen der Erfindung entfernt, und es ist die Absicht, daß alle solche Beispiele oder Modifikationen in den Umfang der angefügten Ansprüche eingeschlossen sind.

Claims

1. Verfahren zum Verstärken einer Verstärkungssequenz einer Target-Nukleinsäuresequenz, umfassend:

(a) das in Kontakt Bringen der Verstärkungssequenz mit wenigstens drei Paaren von Verstärkungssonden, wobei die Elementsonden jedes der Paare der Verstärkungssonden komplementär zueinander sind und wenigstens ein gleiches Hybridisierungselement jedes Paares der Sonden auch komplementär zu einem unterschiedlichen Abschnitt der Verstärkungssequenz ist, wobei die Verstärkungssequenz als eine Matrixsequenz wirkt;

(b) das Ermöglichen, daß die hybridisierenden Elemente der Verstärkungssonden an die Matrixsequenz hybridisieren, wobei die Verstärkungssonden sich an die Verstärkungssequenz auf eine ununterbrochene Weise binden;

(c) das Bewirken, daß die hybridisierten Verstärkungssonden sich miteinander verbinden, um ein Verstärkungsprodukt zu bilden;

(d) das Bewirken der Trennung des Verstärkungsproduktes von der Targetsequenz; und

(e) das Wiederholen der Schritte (a) bis (d), wobei das Verstärkungsprodukt auch als eine Matrixsequenz in nachfolgenden Zyklen der Schritte (a) bis (d) wirkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die hybridisierten Verstärkungssonden durch die Wirkung eines Enzymes verbunden werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Enzym eine Ligase ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die hybridisierten Verstärkungssonden durch eine chemische Reaktion verbunden werden.

5. Verfahren zum Erfassen eines Verstärkungsproduktes mit drei oder mehr gebundenen Verstärkungssonden-Segmenten, umfassend:

(a) das in Kontakt Bringen des Verstärkungsproduktes mit wenigstens zwei Erkennungssonden, wobei jede der Erkennungssonden komplementär zu einem Abschnitt jeder der beiden gebundenen Verstärkungssonden-Segmente ist, die in dem Verstärkungsprodukt benachbart gelegen sind;

(b) das Ermöglichen, daß jede der Erkennungssonden an zwei benachbart gelegene Verstärkungssonden-Segmente des Verstärkungsproduktes hybridisieren, wobei die Erkennungssonden sich an das Verstärkungsprodukt ausreichend aneinander genähert binden, um zu ermöglichen, daß eine Wechselwirkung zwischen den hybridisierten Erkennungssonden auftritt;

(c) Erfassen des Vorliegens der hybridisierten Erkennungssonden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem wenigstens eine der Erkennungssonden markiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem eine der Erkennungssonden mit einer ersten Näherungsmarkierung markiert ist und die andere der Erkennungssonden mit einer zweiten Näherungsmarkierung markiert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 5, weiterhin umfassend:

(a) das Bewirken, daß die hybridisierten Erkennungssonden sich aneinander binden, um ein gebundenes Erkennungsprodukt zu bilden; und

(b) das Erfassen des Vorliegens des gebundenen Erkennungsproduktes.

9. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die hybridisierten Erkennungssonden durch die Wirkung eines Enzyms aneinander gebunden werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Enzym eine Ligase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die hybridisierten Erkennungssonden durch eine chemische Reaktion aneinander gebunden werden.

12. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem eine der Erkennungssonden mit einer erfaßbaren Markierung markiert ist und die andere der Erkennungssonden mit einer Einrichtung zum Entfernen des gebundenen Erkennungsproduktes aus der Lösung markiert ist.

13. Verfahren zum Erfassen einer Target-Nukleinsäuresequenz, die in einer Testprobe vorliegen kann, umfassend:

(a) das in Kontakt Bringen der Testprobe mit wenigstens drei Paaren von Nukleinsäure-Verstärkungssonden, wobei die Elementsonden jedes Paares von Verstärkungssonden komplementär zueinander sind und wenigstens ein gleiches hybridisierendes Element jedes Paares der Sonden auch komplementär zu einem unterschiedlichen Abschnitt einer Verstärkungssequenz der Target- Nukleinsäuresequenz ist; wobei die Verstärkungssequenz als eine Matrixsequenz wirkt;

(b) das Ermöglichen, daß die hybridisierenden Elemente der Verstärkungssonden an die Matrixsequenz hybridisieren, wobei die Verstärkungssonden sich auf eine ununterbrochene Weise an die Verstärkungssequenz binden;

(c) das Binden der hybridisierten Verstärkungssonden, um ein Verstärkungsprodukt zu bilden, wobei jede der gebundenen Verstärkungssonden ein Verstärkungssonden-Segment des Verstärkungsproduktes bildet;

(d) das Bewirken der Abtrennung des Verstärkungsproduktes von der Matrixsequenz;

(e) das in Kontakt Bringen des Verstärkungsproduktes mit wenigstens zwei Erkennungssonden, wobei jede der Erkennungssonden komplementär zu einem Abschnitt jeder der beiden Verstärkungssonden-Segmente ist, die benachbart in dem Verstärkungsprodukt liegen;

(f) das Ermöglichen, daß jede der Erkennungssonden an zwei benachbart gelegene Versttrkungssonden-Segmente des Verstärkungsproduktes hybridisieren, wobei die Erkennungssonden sich an das Verstärkungsprodukt ausreichend aneinander genähert binden, um zu ermöglichen, daß eine Wechselwirkung zwischen den hybridisierten Erkennungssonden auftritt;

(g) das Erfassen des Vorliegens der hybridisierten Erkennungs sonden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Verstärkungssequenz mit n Paaren von Verstärkungssonden in Kontakt gebracht wird und das Verstärkungsprodukt mit n-1 Erkennungssonden in Kontakt gebracht wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13, weiter umfassend:

(b) das Erfassen des Vorliegens des gebundenen Erkennungsproduktes.

16. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die hybridisierten Verstärkungssonden durch die Wirkung eines Enzymes aneinander gebunden werden.

17. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Enzym eine Ligase ist.

18. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die hybridisierten Verstärkungssonden durch eine chemische Reaktion aneinander gebunden werden.

19. Reagenz zur Verwendung bei der Verstärkung einer Verstärkungssequenz, mit wenigstens drei Paaren von Nukleinsäure Verstärkungssonden, wobei die Elementsonden jedes Paares der Verstärkungssonden komplementär zueinander sind und wenigstens ein gleiches hybridisierendes Element jedes Paares der Verstärkungssonden auch komplementär zu einem gegebenen Abschnitt der Verstärkungssequenz ist, wobei die Nukleinsäuresequenzen jedes Paares der Verstärkungssonden so gewählt sind, daß sie komplementär zu einem unterschiedlichen Abschnitt der Verstärkungssequenz sind, wobei die Verstärkungssonden in der Lage sind, an die Verstärkungssequenz auf eine ununterbrochene Weise ausreichend benachbart zueinander zu hybridisieren, um es zu ermöglichen, daß die Sonden miteinander verbunden werden.

20. Reagenz zur Verwendung bei der Erfassung eines Verstärkungsproduktes, wobei das Verstärkungsprodukt drei oder mehr gebundene Verstärkungssonden-Segmente hat, wobei das Reagenz wenigstens zwei Nukleinsäure-Erkennungssonden aufweist, wobei jede der Erkennungssonden komplementär zu einem Abschnitt jeder der beiden gebundenen Verstärkungssonden-Segmente ist, die benachbart in dem Verstärkungsprodukt liegen, wobei wenigstens eine der Verstärkungssonden mit einer Markierung versehen ist, wobei die Erkennungssonden in der Lage sind, an das Verstärkungsprodukt ausreichend benachbart zueinander zu hybridisieren, um es zu ermöglichen, daß eine Wechselwirkung zwischen den Erkennungssonden auftritt.

21. Ausrüstung zur Verwendung bei der Erfassung einer Target-Nukleinsäuresequenz, die in einer Testprobe vorliegen kann, mit:

(a) wenigstens drei Paaren von Verstärkungssonden, wobei die Elementsonden jedes Paares der Verstärkungssonden komplementär zueinander sind und wenigstens ein gleiches hybridisierendes Element jedes Paares von Verstärkungssonden auch komplementär zu einem Abschnitt einer Verstärkungssequenz der Target- Nukleinsäuresequenz ist, wobei die Verstärkungssequenz als eine Matrixsequenz wirkt und die Verstärkungssonden in der Lage sind, auf eine ununterbrochene Weise ausreichend aneinander genähert zu hybridisieren, um es den Sonden zu ermöglichen, sich aneinander zu binden, um ein Verstärkungsprodukt zu bilden, derart daß die Verstärkungsprodukte aus gebundenen Verstärkungssonden-Segmenten gebildet werden; und

(b) wenigstens zwei Erkennungssonden, wobei jede der Erkennungssonden komplementär zu einem Abschnitt von jedem der beiden Verstärkungssonden-Segmente des Verstärkungsproduktes ist, die benachbart in dem Verstärkungsprodukt liegen, wobei wenigstens eine der Erkennungssonden mit einer Markierung versehen ist, wobei die Erkennungssonden in der Lage sind, an das Verstärkungsprodukt ausreichend aneinander genähert zu hybridisieren, um es zu ermöglichen, daß eine Wechselwirkung zwischen den hybridisierten Erkennungssonden auftritt.