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JP2023010881A - オリゴヌクレオチドの送達剤としての糖質コンジュゲート - Google Patents

オリゴヌクレオチドの送達剤としての糖質コンジュゲート Download PDF

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Abstract

【課題】オリゴヌクレオチド治療薬のインビボ送達の欠点に対処する、受容体特異的リガンドにコンジュゲートした新しいｉＲＮＡ剤およびこれらを調製する方法を提供する。
【解決手段】式（Ｉ）の少なくとも１つのサブユニットを含むｉＲＮＡ剤であって、式中、ＡおよびＢは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、またはＳであり；ＸおよびＹは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシ保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、親油性物質、ポリマー、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-リンカー-ＯＰ（Ｚ’’’）（Ｚ’’’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-式（Ｉ）、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-、または-リンカー-Ｒであり；ＲはＬＧ、-リンカー-ＬＧであるか、または明細書化学式７に示す分岐鎖としての複数の-リンカー-ＬＧを含む構造を有し、ＬＧは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖であり；ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；かつＺ’、Ｚ’’、Ｚ’’’、およびＺ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳである。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６０／９９２，３０９号（２００７年１２月４日出願）；米国仮特許出願第６１／０１３，５９７号（２００７年１２月１３日出願）；米国仮特許出願第６１／１２７，７５１号（２００８年５月１４日出願）；米国仮特許出願第６１／０９１，０９３号（２００８年８月２２日出願）；および米国仮特許出願第６１／０９７，２６１号（２００８年９月１６日出願）に対する優先権の利益を主張する。
本発明は、糖質コンジュゲートを用いた治療剤送達の分野に関する。特に、本発明は、新規の糖質コンジュゲートおよびｉＲＮＡ剤のインビボ送達に有利なこれらのコンジュゲートを含むｉＲＮＡ剤、ならびにインビボでの治療的使用に好適なｉＲＮＡ組成物を提供する。さらに、本発明は、これらの組成物を作製する方法、および例えば、さまざまな疾患状態の治療のために、これらの組成物を用いてこれらのｉＲＮＡ剤を細胞に導入する方法を提供する。
オリゴヌクレオチド化合物は、医学において重要な治療用途を有する。特定の疾患の原因となる遺伝子をサイレンシングするためにオリゴヌクレオチドを用いることができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳を阻害することによってタンパク質の生成を妨げる。重要なことに、遺伝子サイレンシング剤は、疾患と関連するタンパク質の機能を阻害する従来型の小有機化合物に取って代わるものとして有望視されている。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡは、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の生成を妨げるオリゴヌクレオチドである。
ＲＮＡ干渉、すなわち「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻止することができるという観察を説明するために、Ｆｉｒｅおよび同僚らが最初に作り出した用語である（非特許文献１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む、多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを導くものであり、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを壊す配列特異的な多成分ヌクレアーゼである、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって仲介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含有することが知られているが、この活性のタンパク質成分はまだ分かっていない。
ｓｉＲＮＡ化合物は、種々の診断目的および治療目的に有望な薬剤である。ｓｉＲＮＡ化合物は、遺伝子の機能を同定するために用いることができる。さらに、ｓｉＲＮＡ化合物は、疾患を引き起こす遺伝子をサイレンシングすることによって作用する新しいタイプの医薬品として大きな可能性を提供する。中枢神経学的疾患、炎症性疾患、代謝障害、腫瘍、感染性疾患、および眼疾患を含む多くの疾患を治療するための干渉ＲＮＡ治療剤を開発する研究が現在進行中である。
ｓｉＲＮＡは、潜在的な抗ウイルス治療薬として極めて有効であることが示されており、最近多くの例が公表されている。ウイルスゲノム中の標的に向けられるｓｉＲＮＡ分子は、インフルエンザ（非特許文献２～３）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（非特許文献４）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（非特許文献５）、Ｃ型肝炎ウイルス（非特許文献６～７）、およびＳＡＲＳコロナウイルス（非特許文献８）の動物モデルにおいて、ウイルス力価を数桁、飛躍的に低下させる。
アンチセンス法とは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのような細胞内核酸の正常な必須機能（例えば、タンパク質合成）が妨げられるような、比較的短いオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡまたはＤＮＡへの相補的なハイブリダイゼーションのことである。ハイブリダイゼーションは、ワトソン－クリック塩基対を介したＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドの配列特異的な水素結合である。このような塩基対を互いに相補的であると言う。
Ｃｏｈｅｎ（非特許文献９）によって論じられている、標的配列の発現レベルを変化させる天然に存在する事象には、２つの種類があると考えられる。第一の、ハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌクレオチド阻害剤が、標的核酸に結合し、その結果、単なる立体障害によって、必須タンパク質（ほとんどの場合、リボソーム）の核酸への結合が妨げられる終結事象を説明するものである。メチルホスホネートオリゴヌクレオチド（非特許文献１０）、およびα－アノマーオリゴヌクレオチドは、２つの最も広く研究されているアンチセンス剤であり、これらは、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を妨げる考えられている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列の発現レベルを変化させるもう１つの手段は、標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションと、それに続く細胞内ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの酵素的切断によるものである。２'-デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が標的ＲＮＡとハイブリダイズし、この二重鎖がＲＮアーゼＨ酵素を活性化して、ＲＮＡ鎖を切断し、それによって、このＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、この種のアンチセンス終結事象によって作用するアンチセンス薬剤の最も著明な例である。
これらのおよび他の核酸をベースにした治療を使用する機会は大いに有望であり、現在の伝統的な医学では対処できない医学的問題の解決策を提供する。増々多くの疾患関連遺伝子の場所と配列が同定されつつあり、種々の疾患についての核酸をベースにした治療法の臨床試験が、現在進行中である。
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の治療薬としての適用の進歩にも関わらず、改善された薬理学的特性（例えば、血清安定性、適切な臓器または細胞への送達、および膜貫通送達）を有するオリゴヌクレオチドが必要とされている。核酸およびオリゴヌクレオチドの膜貫通送達の改善に向けた努力において、タンパク質担体、抗体担体、リポソーム性送達系、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、ウイルスベクター、およびリン酸カルシウムを介する形質転換が利用されている。しかしながら、これらの技術の多くは、膜貫通輸送が可能な細胞の種類と、このような輸送を達成するのに必要な条件とによって限定される。
インビボでの細胞への効率的な送達には、特異的な標的化と細胞外環境、特に血清タンパク質からの相当な保護とが必要とされる。特異的な標的化を達成する１つの方法は、標的化部分をｉＲＮＡ剤にコンジュゲートさせることである。標的化部分は、ｉＲＮＡ剤を所要の標的部位に標的化するのに役立つ。標的化部分によって送達が改善され得る１つの方法は、受容体を介するエンドサイトーシス活性によるものである。この取込み機構は、膜構造の陥入を介してまたは送達系と細胞膜との融合によって、膜受容体に結合したｉＲＮＡ剤が、膜で囲まれた領域の内側に移動することを伴う。このプロセスは、特異的リガンドが受容体に結合した後の、細胞表面受容体または膜受容体の活性化によって開始される。受容体を介する多くのエンドサイトーシス系が知られ、研究されており、これには、糖（例えば、ガラクトース、マンノース、マンノース－６－リン酸）、ペプチド、およびタンパク質（例えば、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、ビタミンＢ１２、インスリン、および上皮増殖因子（ＥＧＦ））を認識するものが含まれる。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ－Ｒ）は、肝細胞に極めて大量に存在する高容量受容体である。ＡＳＧＰ－Ｒは、Ｎ-アセチル-Ｄ-ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に対してＤ-Ｇａｌよりも５０倍高い親和性を示す。これまでの研究により、ｎＭの親和性を得るには多価性が必要である一方、糖間で間隔が空いていることも非常に重要であることが示されている。
Ｄ－マンノースに対して高い親和性を有するマンノース受容体は、糖質をベースにしたもう１つの重要なリガンド－受容体ペアである。マンノース受容体は、マクロファージやおそらくは樹状細胞などの特定の細胞型で高発現している。これらの細胞に薬物分子を標的とするために、マンノースコンジュゲートおよびマンノシル化された薬物担体が首尾よく使用されている。例えば、非特許文献１１～１４を参照されたい。
コレステロールまたは脂肪酸などの親油性部分は、核酸などの親水性の高い分子に結合した場合、血漿タンパク質結合を大幅に向上させ、結果的に循環半減期を向上させることができる。さらに、リポタンパク質などの特定の血漿タンパク質への結合が、対応するリポタンパク質受容体（例えば、ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ受容体、またはスカベンジャー受容体ＳＲ－Ｂ１）を発現する特定の組織での取込みを増大させることが示されている。例えば、非特許文献１５～１６を参照されたい。標的化送達手法の細胞内トラフィッキングを改善するために、親油性コンジュゲートを標的化リガンドと組み合わせて使用することもできる。
Ｆｉｒｅら（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６-８１１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，１８８-２００ ２Ｇｅら（２００４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，８６７６-８６８１；Ｔｏｍｐｋｉｎｓら（２００４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，８６８２-８６８６ Ｔｈｏｍａｓら（２００５） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，４９５-５０５ Ｂｉｔｋｏら（２００５） Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，５０-５５ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら（２００５） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１００２-１００７ Ｋａｐａｄｉａ（２００３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，２０１４-２０１８ Ｗｉｌｓｏｎら（２００３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，２７８３-２７８８ Ｌｉら（２００５） Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，９４４-９５１ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８９，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ． Ｍｉｌｌｅｒら（１９８７） Ａｎｔｉ-Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，２，１１７-１２８ Ｂｉｅｓｓｅｎら（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２８０２４-２８０３０ Ｋｉｎｚｅｌら（２００３） Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．９，３７５-３８５ Ｂａｒｒａｔｔら（１９８６） Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８６２，１５３-６４ Ｄｉｅｂｏｌｄら（２００２） Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７，６５-７４ Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈ，Ｍ．Ｋ．，Ｒｕｍｐ，Ｅ．Ｔら（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，２７１７-２５ Ｗｏｌｆｒｕｍ，Ｃ．，Ｓｈｉ，Ｓ．ら（２００７） ２５，１１４９-５７
上記のようなオリゴヌクレオチド治療薬のインビボ送達の欠点に対処する、受容体特異的リガンドにコンジュゲートした新しいｉＲＮＡ剤およびこれらを調製する方法が明白に必要とされている。本発明は、この極めて重要な目的に関するものである。
一態様では、本発明は、少なくとも１つの糖質リガンド、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖とコンジュゲートしているｉＲＮＡ剤を提供する。糖質がコンジュゲートされたこれらのｉＲＮＡ剤は、特に、肝臓の実質細胞を標的とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２つ以上の糖質リガンド、好ましくは２つまたは３つの糖質リガンドを含む。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１つ以上のガラクトース部分を含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つ（例えば、２つまたは３つまたはそれより多く）のラクトース分子を含む（ラクトースは、ガラクトースに結合したグルコースである）。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つ（例えば、２つまたは３つまたはそれより多く）のＮ-アセチル-ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ-Ａｃ-グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）またはマンノース（例えば、マンノース－６－リン酸）を含む。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つのマンノースリガンドを含み、このｉＲＮＡ剤はマクロファージを標的とする。
一態様では、本発明は、糖質リガンドを含むｉＲＮＡ剤を特色とし、この糖質リガンドの存在は、ｉＲＮＡ剤の肝臓への送達を増大させることができる。したがって、糖質リガンドを含むｉＲＮＡ剤は、肝臓での発現が所望されない遺伝子を標的とするのに有用であり得る。例えば、糖質リガンドを含むｉＲＮＡ剤は、肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｆ型肝炎、Ｇ型肝炎、またはＨ型肝炎）による核酸発現を標的とすることができる。
一実施形態では、糖質がコンジュゲートされたｉＲＮＡ剤は、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子を標的とする。別の実施形態では、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤は、肝炎（例えば、急性肝炎もしくは慢性肝炎）、すなわち、肝臓の炎症を有するか、または肝臓の炎症を発症する危険性があるヒトに投与することができる。糖質がコンジュゲートされたｉＲＮＡ剤、例えば、ＨＣＶの遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤による治療の候補となるヒトは、ＨＣＶ感染を示す症状、例えば、黄疸、腹痛、肝肥大、および倦怠感を示すことがある。
一実施形態では、糖質がコンジュゲートされたｉＲＮＡ剤は、ＨＣＶの５’コア領域を標的とする。この領域は、開始メチオニンにまたがるリボソームの足指紋（ｔｏｅ－ｐｒｉｎｔ）のすぐ下流にある。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＨＣＶの非構造タンパク質（例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ｂ）のいずれか１つを標的とする。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＨＣＶのＥ１遺伝子、Ｅ２遺伝子、またはＣ遺伝子を標的とする。
別の実施形態では、糖質がコンジュゲートされたｉＲＮＡ剤は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を標的とし、このｉＲＮＡ剤は、ＨＢＶの遺伝子、例えば、ＨＢＶのプロテインＸ（ＨＢｘ）遺伝子の配列と実質的に同様の配列を有する。
糖質がコンジュゲートされたｉＲＮＡ剤は、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害、血液学的障害、代謝障害、および炎症を特徴とする障害を含む、他の肝障害を治療するために使用することもできる。肝臓の増殖障害は、例えば、良性または悪性の障害、例えば、癌（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝転移、または肝芽腫）であり得る。肝臓の血液学的障害または炎症障害は、例えば、凝固因子が関わる障害、補体を介する炎症、または線維化であり得る。肝臓の代謝疾患には、脂質異常症およびグルコース調節の異常が含まれる。一実施形態では、肝障害は、この肝障害に関与する遺伝子中の配列と実質的に同一の配列を有する１つ以上のｉＲＮＡ剤を投与することによって治療される。
一実施形態では、糖質がコンジュゲートされたｉＲＮＡ剤は、肝臓で発現する核酸、例えば、ＡｐｏＢ ＲＮＡ、ｃ－ｊｕｎ ＲＮＡ、β－カテニンＲＮＡ、またはグルコース－６－リン酸ｍＲＮＡを標的とする。
例えば、グルコース代謝関連障害、例えば、糖尿病（例えば、２型糖尿病）の治療のために、グルコース－６－リン酸を標的とするｉＲＮＡを対象に投与して、肝臓のグルコース産生を阻害することができる。このｉＲＮＡ剤を、この障害の危険性がある個体に投与して、この障害の発症またはこの障害の症状を遅延させることができる。
核酸への糖（単糖）のコンジュゲーション。二本鎖核酸の３’-末端（Ｉ）および５’-末端（ＩＩ）ならびに一本鎖核酸の３’-末端（ＩＩＩ）および５’-末端（ＩＶ）へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性があり；Ｑは、ＯまたはＳである。 核酸への糖（単糖）のコンジュゲーション。（Ｖ）両方の鎖（センスおよびアンチセンスまたはガイド鎖）の３’-末端；（ＶＩ）１つの鎖（センスまたはアンチセンス）の３’-末端および第２の相補鎖の５’-末端、ならびに（ＶＩＩ）両方の鎖の５’-末端へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。 核酸への糖（単糖）のコンジュゲーション。１つの鎖（センスまたはアンチセンス／ガイド鎖）の３’-末端および５’-末端へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。 核酸への糖（単糖）のコンジュゲーション。センス鎖またはアンチセンス鎖の３’-末端（ＩＸ）および５’-末端（Ｘ）へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション；ｑ＝０～１０。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。 核酸への糖（単糖）のコンジュゲーション。オリゴヌクレオチドの３’-末端と５’-末端（ＸＩ）；３’-末端（ＸＩＩ）、および５’-末端（ＸＩＩＩ）へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション；ｑ＝０～１０。 核酸への糖（単糖）のコンジュゲーション。追加のスペーサーで分離されている核酸へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション：ＸＩＶ－アルキルスペーサーおよび／またはＰＥＧスペーサー二本鎖核酸との３’-末端コンジュゲート；ＸＶ－アルキルスペーサーおよび／またはＰＥＧスペーサーとの５’-末端コンジュゲート；ＸＶＩおよびＸＶＩＩ－一本鎖核酸／オリゴヌクレオチドの対応する３’-末端コンジュゲートおよび５’-末端コンジュゲート。Ａ、Ｂは、アルキルスペーサーまたはＰＥＧスペーサー、およびその組合せを表し、Ｑ’＝ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、Ｓ-Ｓ、ＮＨ、またはＮＭｅである。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。 核酸への糖（単糖）のハイブリッドコンジュゲート。二本鎖核酸へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどおよび第２選択リガンドのコンジュゲーション：ＸＸ－３’-末端の連続的なコンジュゲーション；ＸＸＩ－センスまたはアンチセンス上の３’-末端リガンドと５’-末端プテロイン酸類似体；ＸＸＩＩ－センスまたはアンチセンス上の５’-末端リガンドと３’-末端プテロイン酸類似体；ＸＸＩＩＩ－センスもしくはアンチセンスの５’-末端上のプテロイン酸類似体およびアンチセンスもしくはセンスの３’-末端上の一般に好まれるリガンドまたはこれと逆のもの；ＸＸＩＶ－二本鎖核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’-末端への選択リガンドとプテロイン酸類似体の連続的なコンジュゲーション。Ｌは、選択リガンドである。 核酸への糖（単糖）のハイブリッドコンジュゲート。一本鎖核酸へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどおよび第２選択リガンドのコンジュゲーション：ＸＸＶ－３’-末端または５’-末端の連続的なコンジュゲーション；ＸＸＶＩ－３’-末端リガンドまたは５’-末端リガンドおよび５’-末端プテロイン酸類似体または３’-プテロイン酸類似体。Ｌは、一般に好まれるリガンドである。 核酸への糖（単糖）のコンジュゲート。スペーサー／テザーを有する脂質または脂質様分子（ＸＩＩＩ）およびスペーサー／テザーを有さない脂質または脂質様分子（ＸＩＸ）へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。 核酸への糖の結合。二本鎖核酸の３’-末端（ＸＸ）および５’-末端（ＸＸＩ）ならびに一本鎖核酸の３’-末端（ＸＸＩＩ）および５’-末端（ＸＸＩＩＩ）への３分岐のガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性があり；Ｑは、ＯまたはＳである。 核酸への糖（単糖）の結合。（ＸＸＩＶ）両方の鎖（センスおよびアンチセンスまたはガイド鎖）の３’-末端；（ＸＸＶ）１つの鎖（センスまたはアンチセンス）の３’-末端および第２の相補鎖の５’-末端、ならびに（ＸＸＶＩ）両方の鎖の５’-末端への３分岐のガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション；Ｒ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＱの定義については、図１を参照されたい。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。同様に、図３～図９の単分岐の糖部分（単数または複数）は、図１０と図１１に記載されている３分岐の糖部分（単数または複数）で置換されている。 核酸へのオリゴ糖のコンジュゲーション。二本鎖核酸の３’-末端（ＸＸＶＩＩ）および５’-末端（ＸＸＶＩＩＩ）ならびに一本鎖核酸の３’-末端（ＸＸＩＸ）および５’-末端（ＸＸＸ）へのガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどの類似体または誘導体のコンジュゲーション。二本鎖核酸は、２つの３’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの３’-末端に１つの突出を有するか、または突出を有さない可能性があり；Ｑは、ＯまたはＳである。同様に、図２～９の糖部分（単数または複数）は、図１２に記載されているオリゴ糖部分で置換されている。 切断可能なジスルフィド結合を有する３分岐ＧａｌＮＡｃ二本鎖オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 切断可能なジスルフィド結合を有する３分岐ＧａｌＮＡｃ二本鎖オリゴヌクレオチドコンジュゲート。 ガラクトース-ｓｉＲＮＡコンジュゲートのインビボでのａｐｏＢ遺伝子サイレンシング。 リン酸結合を介して１つに連結されているコレステロールと（ＧａｌＮＡｃ）３の構造。 糖脂質-ｓｉＲＮＡコンジュゲート戦略。 アシアロ糖タンパク質受容体の結合親和性と多価性。 単純モノマーからの多分岐コンジュゲートの合成。 ＬＤＬとＨＤＬの充填および肝臓標的化用の糖脂質－ｓｉＲＮＡコンジュゲート。 糖脂質－ｓｉＲＮＡコンジュゲート：合成。 ｓｉＲＮＡへの糖質コンジュゲーション用のモノマー。 ＧａｌＮＡｃビルディングブロックの合成。 ＧａｌＮＡｃビルディングブロックの合成（ＩＩ）。 肝標的化用のＧａｌＮＡｃクラスター。 ｓｉＲＮＡへのコンジュゲーション用の糖質（ＧａｌＮＡｃ）クラスター。 多価ＧａｌＮＡｃ-ｓｉＲＮＡコンジュゲート。 ５’コンジュゲーション用の糖質ビルディングブロック。 マンノースコンジュゲートのビルディングブロックの合成。 合成後の糖質コンジュゲートのビルディングブロック。 コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡとコレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングの比較。 コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡとコレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによる血清コレステロールレベルに対する効果の持続期間の比較。 コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡとコレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの取込みの比較。 コンジュゲートの設計検討の概略図。 コンジュゲートの設計の概略図。 ２分岐コンジュゲートと３分岐コンジュゲート。 本発明の２つの異なるコンジュゲート。 コンジュゲートにおけるジスルフィド結合のいくつかの例示的な配置。 糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＦＶＩＩのインビボサイレンシング。 糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＦＶＩＩのインビボサイレンシング。 糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＡｐｏＢのインビボサイレンシング。 糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＡｐｏＢのインビボサイレンシング。 糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＡｐｏＢのインビトロサイレンシング。 インビトロ取込み中の糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡとＡＳＧＲリガンドアシアロフェツイン（ＡＳＦ）との競合。 糖質コンジュゲートのインビトロでの受容体結合と取込み。 ガラクトースコンジュゲートとインビボ遺伝子サイレンシング。
本発明は、糖質部分をｉＲＮＡ剤にコンジュゲートさせることによって、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の特性を最適化することができるという発見に基づいている。多くの場合、糖質部分を、ｉＲＮＡ剤の修飾サブユニットに結合させる。例えば、ｉＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが結合している非糖質（好ましくは環状）担体と置換することができる。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットを、本明細書ではリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ぶ。環状担体は、炭素環系であってもよく（すなわち、環原子が全て炭素原子である）、または複素環系であってもよい（すなわち、１つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る）。環状担体は、単環系であってもよく、または２つ以上の環（例えば、融合環）を含有してもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよく、または１つ以上の二重結合を含有してもよい。
担体にはさらに、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザリング結合点」が含まれる。本明細書で使用される「骨格結合点」とは、リボ核酸の骨格（例えば、リン酸骨格、または修飾リン酸骨格（例えば、硫黄含有骨格））中への担体の組込みに好適である、官能基（例えば、ヒドロキシル基）、または一般に、利用可能な結合を指す。いくつかの実施形態での「テザリング結合点」（ＴＡＰ）とは、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは異なる）を指す。この部分は、例えば、糖質（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖）であることができる。任意で、選択された部分は、介在テザーによって環状担体に接続されている。したがって、環状担体は、多くの場合、別の化学的実体（例えば、構成環に対するリガンド）の組込みもしくはテザリングに好適な官能基（例えば、アミノ基）を含み、または一般に、別の化学的実体（例えば、構成環に対するリガンド）の組込みもしくはテザリングに好適な結合を提供する。
一態様では、本発明は、次式（ＣＩ）に示す構造を有する化合物を特色とする。
Figure 2023010881000001
 式中、
ＡおよびＢは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、保護基、任意で置換された脂肪族、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-ヌクレオシド、または-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-オリゴヌクレオチド（式中、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または任意で置換されたアルキルである）であり；
Ｊ１およびＪ２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、任意で置換されたアルキル、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり；かつ
式（ＣＩ）中の担体は、環状基または非環状基であり；環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択されることが好ましく；非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択されることが好ましい。
好ましい実施形態では、リガンドは、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖である。
一実施形態では、化合物は、次式（ＣＩＩ）に示すピロリン環系である。
Figure 2023010881000002
 式中、
Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、もしくはＳＯ２ＮＨであり；
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、およびＲ１８は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、-ＣＨ２ＯＲａ、またはＯＲｂであり、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-ヌクレオシド、または-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-オリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-ヌクレオシド、または-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-オリゴヌクレオチドであり；
Ｒ３０は、それぞれ存在ごとに独立して、-リンカー-ＲＬまたはＲ３１であり；
ＲＬは、水素またはリガンドであり；
Ｒ３１は、Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり；
Ｒ３２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、-ＲＬ、-リンカー-ＲＬ、またはＲ３１であり；
Ｚ１は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
Ｚ２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または任意で置換されたアルキルであり；かつ
ｈは、それぞれ存在ごとに独立して、１～２０である。
ピロリンをベースにしたクリック担体（ｃｌｉｃｋ-ｃａｒｒｉｅｒ）については、Ｒ１１が-ＣＨ２ＯＲａでかつＲ３がＯＲｂであるか；またはＲ１１が-ＣＨ２ＯＲａでかつＲ９がＯＲｂであるか；またはＲ１１が-ＣＨ２ＯＲａでかつＲ１７がＯＲｂであるか；またはＲ１３が-ＣＨ２ＯＲａでかつＲ１１がＯＲｂであるか；またはＲ１３が-ＣＨ２ＯＲａでかつＲ１５がＯＲｂであるか；またはＲ１３が-ＣＨ２ＯＲａでかつＲ１７がＯＲｂである。ある実施形態では、ＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂはジェミナル置換されていてもよい。４-ヒドロキシプロリンをベースにした担体については、Ｒ１１が-ＣＨ２ＯＲａでかつＲ１７がＯＲｂである。それゆえに、ピロリンをベースにした化合物と４-ヒドロキシプロリンをベースにした化合物は、結合回転がその特定の結合に関して制限されている（例えば、環が存在することによって生じる制限がある）結合（例えば、炭素－炭素結合）を含有し得る。したがって、ＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂは、上述の任意の組合せにおいて互いに対してシスであってもまたはトランスであってもよい。したがって、全てのシス／トランス異性体が明示的に含まれる。化合物は、１つ以上の不斉中心を含有する場合もあり、そのため、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ならびにジアステレオマー混合物として生じる。それらの化合物のすべてのこのような異性体形態が明示的に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＲａとＯＲｂを担持する中心は両方とも、Ｒ立体配置を有することができるか；両方ともＳ立体配置を有することができるか；または一方の中心がＲ立体配置を有することができかつ他方の中心がＲ立体配置を有することができ、また、これと逆のことが言える）。
一実施形態では、Ｒ１１がＣＨ２ＯＲａでかつＲ９がＯＲｂである。
一実施形態では、Ｒｂは固体担体である。
一実施形態では、式（ＣＩＩ）の担体は、ホスホロアミダイトであり、すなわち、ＲａまたはＲｂのうちの１つが、-Ｐ（Ｏ-アルキル）Ｎ（アルキル）２、例えば、-Ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）Ｎ（ｉ-プロピル）２である。一実施形態では、Ｒｂは、-Ｐ（Ｏ-アルキル）Ｎ（アルキル）２である。
実施形態では、化合物は、次式（ＣＩＩＩ）に示すようなリボース環系である。
Figure 2023010881000003
 式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、またはＣＲＰ ２であり；
Ｂは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、任意で置換されたされた天然または非天然のヌクレオ塩基、-リンカー-ＲＬと結合した任意で置換されたされた天然ヌクレオ塩基または-リンカー-ＲＬと結合した任意で置換されたされた非天然ヌクレオ塩基であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ＯＲ６、Ｆ、Ｎ（ＲＮ）２、または-Ｊ-リンカー-ＲＬであり；
Ｊは、存在しないか、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＳＯ、ＮＨＳＯ２、ＮＨＳＯ２ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり；
Ｒ６は、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-オリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-式（ＣＩＩＩ）、-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-オリゴヌクレオチド、または-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-式（ＣＩＩＩ）がであり；
ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたアルキニル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり；
ＲＰは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアルケニル任意で置換されたアルキニル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、または任意で置換されたヘテロアリールであり；
ＲＬは、水素またはリガンドであり；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または任意で置換されたアルキルであり；
ただし、ＲＬは、少なくとも１度は存在し、さらにＲＬは、少なくとも１度はリガンドである。
一実施形態では、式（ＣＩ）中の担体は、非環状基であり、「非環状担体」と呼ばれる。好ましい非環状担体は、下記の式（ＣＩＶ）または式（ＣＶ）に示す構造を有することができる。
一実施形態では、化合物は、次式（ＣＩＶ）に示す構造を有する非環状担体である。
Figure 2023010881000004
 式中、
Ｗは、存在しないか、Ｏ、Ｓ、および Ｎ（ＲＮ）（式中、ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたアルキニル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基である）であり；
Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、もしくはＳＯ２ＮＨであり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-オリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-ヌクレオシド、または-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-オリゴヌクレオチドであり；
Ｒ３０は、それぞれ存在ごとに独立して、リンカー-ＲＬまたはＲ３１であり；
ＲＬは、水素またはリガンドであり；
Ｒ３１は、-Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり；
Ｒ３２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、-ＲＬ、-リンカー-ＲＬ、またはＲ３１であり；
Ｚ１は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
Ｚ２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または任意で置換されたアルキルであり；
ｈは、それぞれ存在ごとに独立して、１～２０であり；かつ
ｒ、ｓ、およびｔは、それぞれ存在ごとに独立して、０、１、２、または３である。
rとsが異なる場合、第３炭素は、Ｒ配置かまたはＳ配置のいずれかであることができる。好ましい実施形態では、ｘとｙは１であり、ｚは０である（例えば、担体はセリノールをベースにしている）。非環状担体は、任意で、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、パーハロアルキルで置換することができる。
一実施形態では、化合物は、次式（ＣＶ）に示す構造を有する非環状担体である。
Figure 2023010881000005
 式中、
Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、もしくはＳＯ２ＮＨであり；
ＲａおよびＲｂは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-Ｏ-オリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）-式（Ｉ）、-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-ヌクレオシド、または-Ｐ（Ｚ１）（Ｏ-リンカー-ＲＬ）-Ｏ-オリゴヌクレオチドであり；
Ｒ３０は、それぞれ存在ごとに独立して、リンカー-ＲＬまたはＲ３１であり；
ＲＬは、水素またはリガンドであり；
Ｒ３１は、-Ｃ（Ｏ）ＣＨ（Ｎ（Ｒ３２）２）（ＣＨ２）ｈＮ（Ｒ３２）２であり；
Ｒ３２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、-ＲＬ、-リンカー-ＲＬ、またはＲ３１であり；
Ｚ１は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
Ｚ２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または任意で置換されたアルキルであり；
ｈは、それぞれ存在ごとに独立して、１～２０であり；かつ
ｒおよびｓは、それぞれ存在ごとに独立して、０、１、２、または３である。
ＲＲＭＳは、本明細書に記載される環状担体に加えて、同時係属および同時所有の米国出願第１０／９１６，１８５号明細書（２００４年８月１０日出願）、米国出願第１０／９４６，８７３号明細書（２００４年９月２１日出願）、および米国出願第１０／９８５，４２６号明細書（２００４年１１月９日出願）、米国出願第１０／８３３，９３４号明細書（２００７年８月３日出願）、米国出願第１１／１１５，９８９号明細書（２００５年４月２７日出願）、および米国出願第１１／１１９，５３３号明細書（２００５年４月２９日出願）に記載されている環状担体および非環状担体を含むことができ、これらの内容は各々、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
したがって、一態様では、本発明は、次式（Ｉ）に示す構造を有するモノマーを特色とする。
Figure 2023010881000006
 式中、
ＡおよびＢは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、またはＳであり；
ＲＮはそれぞれ存在ごとに独立して、ＨまたはＣ１-Ｃ６アルキルであり；
ＸおよびＹは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-リンカー-ＯＰ（Ｚ’’’）（Ｚ’’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-式（Ｉ）、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-、または-リンカー-Ｒであり；
ＲはＬＧであるかまたは以下に示す構造を有し：
Figure 2023010881000007
 ＬＧはそれぞれ存在ごとに独立して、リガンド、例えば、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’、およびＺ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳである。
「リンカー」という用語は、化合物の２つの部分を接続する有機部分である。リンカーは、典型的には、直接的な結合、または原子、例えば、酸素もしくは窒素、単位、例えば、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、または原子鎖、例えば、置換アルキルもしくは非置換アルキル、置換アルケニルもしくは非置換アルケニル、置換アルキニルもしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換アリールまたは非置換アリール、置換ヘテロアリールまたは非置換ヘテロアリール、置換複素環または非置換複素環によって中断または終結されることがあり；Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族、または置換脂肪族である）を含む。一実施形態では、リンカーは、１～２４個の原子、好ましくは４～２４個の原子、好ましくは６～１８個の原子、より好ましくは８～１８個の原子、および最も好ましくは８～１６個の原子である。
一実施形態では、リンカーは、-［（Ｐ-Ｑ’’-Ｒ）ｑ-Ｘ-（Ｐ’-Ｑ’’’-Ｒ’）ｑ’］ｑ”-Ｔ-であり、
式中、
Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ’、Ｒ’、およびＴは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ；ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ-、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 2023010881000008
 またはヘテロシクリルであり；
Ｑ’’およびＱ’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、-（ＣＨ２）ｎ-、-Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ＣＨ２）ｎ-、-（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１）（Ｒ２）-、-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２-、または-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-であり；
Ｘは、存在しないかまたは切断可能な結合基であり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、それぞれ存在ごとに独立して、０～２０であり、ここで、繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく；
ｎは、それぞれ存在ごとに独立して、１～２０であり；かつ
ｍは、それぞれ存在ごとに独立して、０～５０である。
一実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合基を含む。
ある実施形態では、リンカーは、分岐状リンカーである。分岐状リンカーの分岐点は、少なくとも三価であり得るが、四価、五価、もしくは六価の原子、またはこのような複数の原子価を示す基であってもよい。ある実施形態では、分岐点は、-Ｃ、-ＣＨ、-Ｃ（ＣＨ２-）（ＣＨ２-）ＣＨ２-、-Ｃ（Ｈ）（ＣＨ２-）ＣＨ２-、-Ｎ、-Ｎ（Ｑ）-Ｃ、-Ｏ-Ｃ、-Ｓ-Ｃ、-ＳＳ-Ｃ、-Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）-Ｃ、-ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）-Ｃ、-Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）-Ｃ、または-Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ-Ｃであり、式中、Ｑはそれぞれ存在ごとに独立して、Ｈまたは任意で置換アルキルである。他の実施形態では、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール誘導体である。
切断可能な結合基
切断可能な結合基とは、細胞外では十分に安定であるが、標的細胞内に入ると切断され、リンカーが結び付いている２つの部分を放出する基のことである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、対象の血液中または（例えば、血液中もしくは血清中で見られる条件を模倣もしくは代表するように選択することができる）第２の参照条件下よりも少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍以上速く、標的細胞内または（例えば、細胞内条件を模倣もしくは代表するように選択することができる）第１の参照条件下で分解される。
切断可能な結合基は、切断因子（例えば、ｐＨ、レドックス電位、または分解分子の存在）の影響を受けやすい。一般に、切断因子は、血清中または血液中よりも細胞内により高いレベルまたは活性で広まるかまたは多く見られる。このような分解因子の例としては、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤（例えば、細胞内に存在する、レドックス切断可能な結合基を還元によって分解することができるメルカプタン）を含む、特定の基質のために選択されるかまたは基質特異性がないレドックス剤；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を作り出すことができる薬剤（例えば、５以下のｐＨを生じさせる薬剤）；一般酸として作用することによって、酸切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的である可能性がある）、およびホスファターゼが挙げられる。
切断可能な結合基（例えば、ジスルフィド結合）は、ｐＨによる影響を受けやすい可能性がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均の細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームのｐＨは、より酸性で、５．５～６．０の範囲であり、リソソームのｐＨは、さらにより酸性で、５．０前後である。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有しており、その結果、カチオン性脂質を細胞内のリガンドから放出するか、または所望の細胞区画中に放出する。
リンカーは、特定の酵素によって切断され得る切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基の種類は、標的される細胞によって決まり得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に結合させることができる。肝臓細胞はエステラーゼが豊富であり、それゆえに、リンカーはエステラーゼが豊富でない細胞型よりも効果的に肝臓細胞で切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、ペプチダーゼが豊富な細胞型（例えば、肝臓細胞および滑膜細胞）を標的とする場合に使用することができる。
一般に、候補となる切断可能な結合基の好適性は、候補となる結合基を切断する分解因子（または条件）の能力を試験することによって評価することができる。また、候補となる切断可能な結合基を、血液中でのまたは標的以外の他の組織と接触させたときの切断に抵抗する能力について試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件の間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、この場合、第１の条件は、標的細胞内での切断を示すように選択され、第２の条件は他の組織または生体液（例えば、血液もしくは血清）での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系で、細胞で、細胞培養で、器官培養もしくは組織培養で、または動物全体で行なうことができる。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行ない、さらなる評価によって動物全体で確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、少なくとも２倍、４倍、１０倍、または１００倍速く細胞内で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）切断される。
レドックス切断可能な結合基
切断可能な結合基の１つのクラスは、還元または酸化によって切断されるレドックス切断可能な結合基である。還元切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（-Ｓ-Ｓ-）である。候補となる切断可能な結合基が、好適で「還元切断可能な結合基」であるかどうか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化剤とともに使用するのに好適であるかどうかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または細胞（例えば、標的細胞）で観察される切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を用いる他の還元剤とともにインキュベートすることによって評価することができる。候補は、血液条件または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価することもできる。好ましい実施形態では、候補化合物は、血液中で最大限で１０％切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、少なくとも２倍、４倍、１０倍、または１００倍速く、細胞内で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）分解される。候補化合物の切断の速度を、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で、標準的な酵素動力学アッセイを用いて測定し、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較することができる。
リン酸ベースの切断可能な結合基
リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）-Ｓ-である。好ましい実施形態は、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）-Ｓ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｓ）（Ｈ）-Ｏ-、-Ｓ-Ｐ（Ｏ）（Ｈ）-Ｓ-、-Ｏ-Ｐ（Ｓ）（Ｈ）-Ｓ-である。好ましい実施形態は、-Ｏ-Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）-Ｏ-である。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。
酸切断可能な結合基
酸切断可能な結合基とは、酸性条件下で切断される結合基のことである。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、またはそれ未満）の酸性環境において、または一般酸として作用することができる酵素などの薬剤によって切断される。細胞において、特定の低ｐＨのオルガネラ（例えば、エンドソームおよびリソソーム）は、酸切断可能な結合基に対する切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式-Ｃ＝ＮＮ-，、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または-ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、または三級アルキル基（例えば、ジメチル、ペンチル、もしくはｔ－ブチル）である場合である。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。
エステルベースの結合基
エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例としては、アルキレン基、アルケニルレン基、およびアルキニレン基が挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な結合基は、一般式-Ｃ（Ｏ）Ｏ-または-ＯＣ（Ｏ）-を有する、これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。
ペプチドベースの結合基
ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基とは、アミノ酸の間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じさせるペプチド結合のことである。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（-Ｃ（Ｏ）ＮＨ-）は含まれない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じさせる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断可能基は、通常、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じさせるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチドベースの切断可能な結合基は一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－（式中、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である）を有する。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。本明細書で使用される場合、「糖質」とは、少なくとも６個の炭素原子を有する１つ以上の単糖単位（線状、分岐状、もしくは環状であり得る）から構成され、各々の炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合しているそれ自体が糖質である化合物か、または各々が少なくとも６個の炭素原子を有する１つ以上の単糖単位（線状、分岐状、もしくは環状であり得る）から構成され、各々の炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合している糖質部分をその一部として有する化合物のいずれかを指す。代表的な糖質には、糖類（単糖、二糖、三糖、および約４～９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）、ならびに多糖類（例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖ゴム）が含まれる。具体的な単糖には、Ｃ５以上（好ましくはＣ５～Ｃ８）の糖；二糖および三糖には、２つまたは３つの単糖単位（好ましくはＣ５～Ｃ８）を有する糖が含まれる。
「単糖」という用語は、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ－フシトール、Ｌ－フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ－ガラクトサミニトール、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース－６－リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノス－ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース－６－リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロースの基を含む。単糖は、Ｄ体またはＬ体であることができる。単糖はさらに、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環状形態の環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ－置換単糖（非末端炭素原子における水素を炭素で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などであってもよい。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換することができるということが理解される。
「二糖」、「三糖」、および「多糖」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２－デオキシリボース、２－デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖（ｇａｌｔｏ-ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β－マルトース、マルトリオース、マンナン－オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α－トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロースなどの基を含む。さらに、「二糖」、「三糖」、および「多糖」などは、さらに置換することができるということが理解される。二糖には、アミノ糖およびその誘導体、特に、Ｃ-４'位で誘導体化されたミカミノースまたはＣ-６'位で誘導体化された４デオキシ－３－アミノグルコースも含まれる。
一実施形態では、化合物は、次式（Ｉ’）に示す構造を有する。
Figure 2023010881000009
 式中、
ＡおよびＢは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、またはＳであり；
ＸおよびＹは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-Ｒ１-Ｑ’-Ｒ２-ＯＰ（Ｚ’’’）（Ｚ’’’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-式（Ｉ）、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-、または-Ｑ-Ｒであり；
Ｒは、Ｌ１であるか、または次式（ＩＩ）～（Ｖ）に示す構造を有し：
Figure 2023010881000010
 ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０～２０を表し、ここで、繰り返し単位は、同一であっても異なっていてもよく；
ＱおよびＱ’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、-（Ｐ７-Ｑ７-Ｒ７）ｐ-Ｔ７-、または-Ｔ７-Ｑ７-Ｔ７’-Ｂ-Ｔ８’-Ｑ８-Ｔ８であり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｐ７、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃ、Ｔ７、Ｔ７’、Ｔ８、およびＴ８’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
Ｂは-ＣＨ２-Ｎ（ＢＬ）-ＣＨ２-であり；
ＢＬは-ＴＢ-ＱＢ-ＴＢ’-Ｒｘであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃ、Ｑ７、Ｑ８、およびＱＢは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上で中断または終結されることがあり；
ＴＢおよびＴＢ’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
Ｒｘは、親油性物質（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、糖質（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ７は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ-、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ-Ｏ、
Figure 2023010881000011
 またはヘテロシクリルであり；
Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり；
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’、およびＺ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
ｐは、それぞれ存在ごとに独立して、０～２０である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ’）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000012
いくつかの実施形態では、式（Ｉ’）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000013
いくつかの実施形態では、式（Ｉ’）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000014
いくつかの実施形態では、式（Ｉ’）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000015
いくつかの実施形態では、式（Ｉ’）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000016
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000017
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000018
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000019
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000020
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000021
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000022
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000023
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000024
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000025
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000026
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000027
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000028
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000029
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000030
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000031
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000032
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000033
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000034
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000035
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000036
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000037
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000038
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000039
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000040
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000041
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000042
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000043
いくつかの実施形態では、Ｒは下記のものである。
Figure 2023010881000044
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000045
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000046
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000047
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000048
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000049
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000050
いくつかの好ましい実施形態では、Ｌ２ＡとＬ２Ｂは両方とも同じである。
いくつかの実施形態では、Ｌ２ＡとＬ２Ｂは両方とも異なっている。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｌ３ＡとＬ３Ｂは両方とも同じである。
いくつかの実施形態では、Ｌ３ＡとＬ３Ｂは両方とも異なっている。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｌ４ＡとＬ４Ｂは両方とも同じである。
いくつかの実施形態では、Ｌ４ＡとＬ４Ｂは両方とも異なっている。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５ＢとＬ５Ｃは全て同じである。
いくつかの実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５ＢとＬ５Ｃのうちの２つが同じである。
いくつかの実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５Ｂが同じである。
いくつかの実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５Ｃが同じである。
いくつかの実施形態では、Ｌ５ＢとＬ５Ｃが同じである。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの式（Ｉ）のモノマーを含むｉＲＮＡ剤を特色とする。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの式（Ｉ）のモノマー、より好ましくは１つ、２つ、または３つの式（Ｉ）のモノマー、より好ましくは１つまたは２つの式（Ｉ）のモノマー、一層より好ましくはわずか１つの式（Ｉ）のモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは全て、二本鎖ｉＲＮＡ剤の同じ鎖上にある。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、二本鎖ｉＲＮＡ剤の別々の鎖上にある。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤中の式（Ｉ）のモノマーは全て同じである。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤中の式（Ｉ）のモノマーは全て異なっている。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤中の式（Ｉ）の一部のモノマーだけが同じである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ剤中で互いに隣接している。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ剤中で互いに隣接していない。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ剤の５’末端、３’末端、内部位置、３’末端と５’末端の両方、５’末端と内部位置の両方、３’末端と内部位置の両方、および３つの位置の全て（５’末端と３’末端と内部位置）にある。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒｘはコレステロールである。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒｘはリトコール酸である。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒｘはオレイルリトコール酸である。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒｘは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000051
いくつかの好ましい実施形態では、ＢＬは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000052
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000053
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000054
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000055
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000056
 （式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６である）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000057
 （式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６である）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000058
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000059
 （式中、ＸはＯまたはＳである）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000060
 （式中、Ｒは、ＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000061
 （式中、Ｒは、ＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、下記式（ＶＩＩ）（式中、ＲはＯまたはＳである）のリンカーを介してｉＲＮＡ剤に結合している。
Figure 2023010881000062
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000063
 （式中、Ｒは、ＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000064
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000065
 （式中、Ｒは、ＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000066
 （式中、Ｒは、ＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000067
 （式中、Ｒは、ＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである）。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）は、下記構造を有する。
Figure 2023010881000068
 （式中、Ｒは、ＯＨまたはＮＨＣＯＯＨである）。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は式（Ｉ）のモノマーに加えて、次式（ＶＩ）に示す構造を有するモノマーを有する。
Figure 2023010881000069
 式中
Ｘ６およびＹ６は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-Ｒ１-Ｑ’-Ｒ２-ＯＰ（Ｚ’’’）（Ｚ’’’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-式（Ｉ）もしくは-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-であり；
Ｑ６は、存在しないか、または-（Ｐ６-Ｑ６-Ｒ６）ｖ-Ｔ６-であり；
Ｐ６およびＴ６は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ６はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上で中断または終結されることがあり；
Ｒ６はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ-、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ-Ｏ、
Figure 2023010881000070
 またはヘテロシクリルであり；
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’、およびＺ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
ｖは、それぞれ存在ごとに独立して、０～２０を表し；
ＲＬは、親油性物質（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、糖質（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質である。
いくつかの実施形態では、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の式（Ｉ）のモノマーに加えて、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の式（ＶＩ）のモノマーがｉＲＮＡ剤中に存在する。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）のモノマー１つと式（ＶＩ）のモノマー１つだけがｉＲＮＡ剤中に存在する。
いくつかの実施形態では、ＲLはコレステロールである。
いくつかの実施形態では、ＲLはリトコール酸である。
いくつかの実施形態では、ＲLはオレイルリトコール酸である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、式（ＶＩ）のモノマーと共有結合している。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、リン酸結合、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合を介して、式（ＶＩ）のモノマーと結合している。
いくつかの好ましい実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、式（ＶＩ）のモノマーを介してｉＲＮＡ剤に結合している。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーは、ｉＲＮＡ剤と式（ＶＩ）のモノマーの間に介在している。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーと式（ＩＩ）のモノマーは、互いに直接結合している。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーと式（ＩＩ）のモノマーは、互いに直接結合していない。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーと式（ＩＶ）のモノマーは、二本鎖ｉＲＮＡ剤の別々の鎖上にある。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーと式（ＩＶ）のモノマーは、ｉＲＮＡ剤の反対の末端にある。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーと式（ＩＶ）のモノマーは、ｉＲＮＡ剤の同じ末端にある。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーまたは式（ＩＶ）のモノマーの一方がｉＲＮＡ剤の内部位置にあると同時に、もう一方がｉＲＮＡ剤の末端位置にある。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のモノマーと式（ＩＶ）のモノマーは両方とも、ｉＲＮＡ剤の内部位置にある。
いくつかの好ましい実施形態では、式（ＩＶ）のモノマーは、下記構造を有する。
Figure 2023010881000071
いくつかの実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、
Figure 2023010881000072
Figure 2023010881000073
Figure 2023010881000074
Figure 2023010881000075
 からなる群から選択され、
式中、リガンドはＰＫ調節物質であり、Ｘ＝ＯまたはＳであり、Ｙ＝ＯまたはＳであり、ＰＥＧは、分子量（ＭＷ）２００～１００，０００の、ｗ-ＯＨ ＰＥＧ、ｗ-アミノＰＥＧ、ω-メトキシＰＥＧ、ω-ＳＨ ＰＥＧ、ω-プロパルギルＰＥＧ、ω-アジドＰＥＧ、およびω-リガンドＰＥＧである。
エンドソーム溶解成分
二重層膜を容易には横断することができない、巨大分子薬物および親水性薬物分子については、細胞のエンドソーム／リソソーム区画に閉じ込められることが、これらの薬物および薬物分子の作用部位に効果的に送達する上での最大の障害であると考えられる。近年、この問題に対処するために、多くの手法や戦略が工夫されてきた。リポソーム製剤については、融合性脂質を製剤中に使用することが最も一般的な手法となっている（Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｓ．，Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ｃ．ら（２００４）． Ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ ｏｆ ｐＨ-Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｖｉａ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ． Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ． Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１，７１３-７２３．）。プロトン化および／またはｐＨ誘導性の立体構造変化を通じてｐＨ感受性のエンドソーム溶解活性を示す他の成分には、荷電したポリマーおよびペプチドが含まれる。Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｓｔａｙｔｏｎ，Ｐ．Ｓ．ら（２００２）． Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ "ｓｍａｒｔ" ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ａｄｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３，９９２-９９９；Ｋａｋｕｄｏ，Ｃｈａｋｉ，Ｔ．，Ｓ．ら（２００４）． Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ-Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ-Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ-ｌｉｋｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３６，５６１８-５６２８；Ｙｅｓｓｉｎｅ，Ｍ．Ａ．およびＬｅｒｏｕｘ，Ｊ．Ｃ．（２００４）． Ｍｅｍｂｒａｎｅ-ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６，９９９-１０２１；Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｓ．，ｖａｎ Ｒｏｏｙ，Ｉ．ら（２００７）． Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｉＲＮＡ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ． Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３３１，２１１-４に例を見出すことができる。これらは、リポソームまたはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）などの、薬物送達系との関連で一般に使用されている。リポソーム製剤を用いる、葉酸受容体を介する送達については、例えば、ｐＨ感受性の融合性ペプチドがリポソームに組み入れられ、取込みの過程での薬物の放出を改善することによって活性を増強することが示されている（Ｔｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ａ．ら（２００２）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐＨ-ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｆｏｌａｔｅ-ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｔ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐＨｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５５９，５６-６８）。
ある実施形態では、本発明のエンドソーム溶解成分は、ｐＨ依存的な膜活性および／または融合性を示すポリカチオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は、ペプチドを模倣するよう設計された、タンパク質様の小さい鎖であり得る。ペプチド模倣体は、分子の特性を変化させるために既存のペプチドを修飾すること、または通常とは異なるアミノ酸もしくはその類似体を用いてペプチド様の分子を合成することによって生じ得る。ある実施形態では、これらは、ペプチドと比較して、安定性および／または生物学的活性が向上している。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は、エンドソームｐＨ（例えばｐＨ５～６）で活性のある立体構造をとる。「活性のある」立体構造とは、エンドソーム溶解成分が、エンドソームの溶解および／または本発明のモジュラー組成物、もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。
化合物のライブラリーについては、溶血アッセイを用いて、中性ｐＨと比べたエンドソームｐＨでのそれらの示差的な膜活性についてスクリーニングしてもよい。この方法で単離される見込みのある候補は、本発明のモジュラー組成物の成分として使用し得る。本発明の組成物および方法で使用されるエンドソーム溶解成分を同定するための方法は、化合物のライブラリーを提供する工程；血液細胞をライブラリーのメンバーと接触させる工程、ここで、接触が起こる培地のｐＨは制御される；これらの化合物が中性ｐＨ（例えば、約ｐＨ７～８）と比べて低いｐＨ（例えば、約ｐＨ５～６）で血液細胞の示差溶解を誘導するかどうかを決定する工程を含み得る。
例示的なエンドソーム溶解成分としては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４-２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１-１５８６）、およびこれらの誘導体（Ｔｕｒｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６-６８）が挙げられる。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して電荷またはプロトン化が変化する化学基（例えば、アミノ酸）を含有してもよい。エンドソーム溶解成分は、線状または分岐状であってもよい。エンドソーム溶解成分の例示的な一次配列としては、Ｈ２Ｎ-（ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡＧＧＣ）-ＣＯ２Ｈ；Ｈ２Ｎ-（ＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＡＡＡＧＧＣ）-ＣＯ２Ｈ；およびＨ２Ｎ-（ＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡ）-ＣＯＮＨ２が挙げられる。
ある実施形態では、２つ以上のエンドソーム溶解成分を本発明のｉＲＮＡ剤に組み入れてもよい。いくつかの実施形態では、これは、式（Ｉ）のモノマーに加えて、２つ以上の同じエンドソーム溶解成分をｉＲＮＡ剤に組み入れることを伴う。他の実施形態では、これは、式（Ｉ）のモノマーに加えて、２つ以上の異なるエンドソーム溶解成分をｉＲＮＡ剤に組み入れることを伴う。
これらのエンドソーム溶解成分は、例えば、エンドソームｐＨで立体構造を変化させることによって、エンドソームからの脱出を仲介し得る。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は、中性ｐＨでランダムコイル立体構造をとって存在し、エンドソームｐＨで両親媒性ヘリックスへと再編成し得る。この立体構造転移の結果として、これらのペプチドがエンドソームの脂質膜に挿入し、エンドソームの内容物を細胞質へと漏れ出させ得る。立体構造転移はｐＨ依存的であるので、エンドソーム溶解成分は、血液中（ｐＨ約７．４）を循環する間、ほとんどまたは全く融合活性を示すことができない。融合活性は、エンドソーム溶解成分による脂質膜の破壊を引き起こす活性と定義される。融合活性の一例は、エンドソーム溶解成分によるエンドソーム膜の破壊であり、これは、エンドソームの溶解、または本発明のモジュラー組成物(例えば核酸)の１つ以上の成分のエンドソームから細胞質への漏出および輸送をもたらす。
本明細書に記載される溶血アッセイに加えて、好適なエンドソーム溶解成分は、当業者により、他の方法を用いて試験および同定することができる。例えば、ｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境によって電荷を変化させる）化合物の能力を、常法によって（例えば、細胞アッセイで）試験することができる。ある実施形態では、試験化合物を、細胞と混合するかまたは細胞と接触させ、例えば、エンドサイトーシスによって、細胞に試験化合物を取り込ませる。その後、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製し、このエンドソーム調製物を対照細胞からのエンドソーム調製物と比較することができる。対照細胞と比べた、接触させた細胞由来のエンドソーム画分の変化（例えば、減少）は、試験化合物が融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触させた細胞と対照細胞を、例えば、顕微鏡法（例えば、光学顕微鏡法または電子顕微鏡法）で評価して、細胞内のエンドソーム集団の違いを決定することができる。試験化合物および／またはエンドソームを標識して、例えば、エンドソームの漏出を定量化することができる。
別のタイプのアッセイでは、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤を、１つ以上の試験融合剤または推定融合剤を用いて構築する。ｉＲＮＡ剤は、可視化しやすいように標識することができる。ひとたびｉＲＮＡ剤が細胞に取り込まれた際の、エンドソームからの脱出を促進するエンドソーム溶解成分の能力を、エンドソーム調製物の調製によって、または細胞の細胞質中の標識ｉＲＮＡ剤を可視化することができる顕微鏡技術によって評価することできる。ある他の実施形態では、遺伝子発現の阻害、または任意の他の生理的パラメータを、エンドソーム脱出の代用マーカーとして使用してもよい。
他の実施形態では、円偏光二色性分光法を用いて、ｐＨ依存的な構造転移を示す化合物を同定することができる。
２ステップアッセイを実施することもできる。この２ステップアッセイにおいては、第１のアッセイで、試験化合物だけでｐＨの変化に応答する能力を評価し、第２のアッセイで、試験化合物を含むモジュラー組成物がｐＨの変化に応答する能力を評価する。
ペプチド
本発明とともに使用するのに好適なペプチドは、天然ペプチド（例えば、ｔａｔペプチドまたはアンテナペディアペプチド）、合成ペプチド、またはペプチド模倣体であることができる。さらに、ペプチドは、修飾ペプチドであることができ、例えば、ペプチドは、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸を含むこともできる。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の明確な３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のオリゴヌクレオチドへの結合は、例えば、細胞による認識および吸収を高めることによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的分布に影響を及ぼし得る。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分の長さは、約５～５０アミノ酸、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸であることができる（例えば、表１参照）。
Figure 2023010881000076
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、もしくはＰｈｅからなる）疎水性ペプチドであることができる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチド、または架橋されたペプチドであることができる。別の代替において、ペプチド部分は、疎水性の膜転位配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）をも標的化部分であることができる。ペプチド部分は、細胞膜を横断して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶことができる、「送達」ペプチドであることができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）由来の配列は、送達ペプチドとして機能することができることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダムな配列によってコードされることができる（Ｌａｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２-８４，１９９１）。脂質に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約５アミノ酸～約３０アミノ酸の範囲であることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を増大させるための、構造的修飾を有することができる。下記のうちの任意の構造的修飾を利用することができる。
ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９-４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む、種々の組織の腫瘍への標的化を促進することができる（Ａｏｋｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３-７８７，２００１）。ＲＧＤペプチドは、脂質粒子の腎臓への標的化を促進することが好ましい。ＲＧＤペプチドは、線状または環状であることができ、かつ修飾する（例えば、特定の組織への標的化を促進するためにグリコシル化またはメチル化する）ことができる。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞を標的とすることができる（Ｈａｕｂｎｅｒら，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６-３３６，２００１）。
増殖細胞に濃縮されているマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特に、Ｉｖν３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。このように、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ－アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、Ｉｖ－ν３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞（例えば、細菌細胞または真菌細胞）、または哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－ヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ-３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－ディフェンシン、β－ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、またはわずか１種または２種のアミノ酸を主に含有するペプチド（例えば、ＰＲ-３９もしくはインドリシジン）であることができる。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの、２つの部分からなる両親媒性ペプチドであることができる（Ｓｉｍｅｏｎｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７-２７２４，２００３））。
ｉＲＮＡ剤
ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子と十分に相同な領域を含み、かつヌクレオチドに関して、ｉＲＮＡ剤またはその断片が標的遺伝子の下方調節を仲介することができるほどの十分な長さであるべきである。（説明しやすくするために、本明細書では、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語を、ＲＮＡ剤の１つ以上のモノマーサブユニットに関して使用する場合がある。本明細書での「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の用法は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代用物の場合、修飾ヌクレオチド、または１つ以上の位置での代用物置換部分も示すことができるということが理解されよう。）したがって、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に、およびいくつかの実施形態では、完全に、相補的な領域であるか、またはこのような領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的の間に完全な相補性がある必要はないが、対応性は、ｉＲＮＡ剤、またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断によって、配列特異的なサイレンシングを導くことが可能となる程度に十分でなければならない。相補性、すなわち、標的鎖との相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。多くの場合、特にアンチセンス鎖における完全な相補性が所望されるものの、いくつかの実施形態は、特にアンチセンス鎖において、（標的ＲＮＡに対して）１つ以上の、または例えば、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、もしくはそれより少ないミスマッチを含むことができる。特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域で最も許容され、かつ、存在する場合は、末端領域（単数または複数）において、例えば、５’末端および／または３’末端から６、５、４、または３ヌクレオチド以内であり得る。センス鎖に要求されるのは、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的であることのみである。
本明細書の他の箇所で論じられるように、およびその全体が参照により組み入れられる文献において、ｉＲＮＡ剤は、多くの場合、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含む。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、多くの場合、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含み、例えば、不対領域またはヘアピン構造の領域（例えば、２つの相補的な領域を繋ぐ領域）は、修飾またはヌクレオシド代用物を有することができる。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の３'末端または５'末端を安定化する修飾またはアンチセンスｓｉＲＮＡ剤がＲＩＳＣに入るように有利に働く修飾も想定される。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１２、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特別なビオチン試薬またはフルオレセイン試薬（これらは、ホスホロアミダイトとして生じ、ＲＮＡ合成の間に複数のカップリングが行なえるように、ＤＭＴ保護ヒドロキシル基を別に有する）を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤としては次のようなものが挙げられる：インターフェロン応答を誘発するのに十分な長さの分子（これらは、Ｄｉｃｅｒ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，２００１．Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３-３６６）によって切断され、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）内に入ることができる）；およびインターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子（これらの分子もＤｉｃｅｒによって切断され、かつ／またはＲＩＳＣ内に入ることができる）、例えば、ＲＩＳＣ内に入ることができる大きさの分子（例えば、Ｄｉｃｅｒ切断産物に類似した分子）。インターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子を、本明細書では、「ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ剤」と呼ぶ。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ剤」とは、例えば、ヒト細胞内で有害なインターフェロン応答を誘導しないぐらい十分に短い、例えば、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド対未満の二重鎖領域を有するＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖剤）を指す。ｓｉＲＮＡ剤、またはその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡに対してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子を下方調節することができ、この場合、標的は内在性の標的ＲＮＡまたは病原体の標的ＲＮＡを含み得る。
ｓｉＲＮＡ剤の各鎖の長さは、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド以下であることができる。鎖の長さは、少なくとも１９であってもよい。例えば、各鎖の長さは、２１～２５ヌクレオチドであることができる。ｓｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二重鎖領域、および１つ以上の突出、または１つもしくは２つの、２～３ヌクレオチドの３'突出を有してもよい。
標的ＲＮＡに対する相同性および標的遺伝子を下方調節する能力に加え、ｉＲＮＡ剤は、以下の特性のうちの１つ以上を有してもよい：
（１）ｉＲＮＡ剤は、下記のＲＮＡ剤の項で示される式ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、またはＸのものであり得る；
（２）一本鎖の場合、ｉＲＮＡ剤は、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基の類似体を含む５’修飾を有し得る；
（３）極めて多くの数の、または全ての、ヌクレオシドに対してさえ修飾がなされているにもかかわらず、ｉＲＮＡ剤は、正確な塩基対の形成、および例えば、標的ＲＮＡの切断によって、標的の下方調節を可能にするのに十分な、相同な標的ＲＮＡとの二重鎖構造の形成が可能であるように適切な３次元構造で塩基（または修飾塩基）を提示することができるアンチセンス鎖を有し得る；
（４）極めて多くの数の、または全ての、ヌクレオシドに対してさえ修飾がなされているにもかかわらず、ｉＲＮＡ剤は、「ＲＮＡ様」特性をなお有し得る。すなわち、ｉＲＮＡ剤は、リボヌクレオチドベースの内容物だけに限られないか、またはリボヌクレオチドベースの内容物が一部ですらあるとしても、ＲＮＡ分子の全体的な構造的特性、化学的特性、および物理的特性を有し得る。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば、全てのヌクレオチド糖が、例えば、２’ヒドロキシルの代わりに２’フルオロを含有するセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含有することができる。このデオキシリボヌクレオチド含有剤はなおＲＮＡ様特性を示すことが期待され得る。理論に束縛されることを望まないが、電気陰性のフッ素は、リボースのＣ２’位に結合する場合、軸配向を好む。フッ素のこの空間的優先傾向は、糖にＣ３’エンドパッカー（ｅｎｄｏ ｐｕｃｋｅｒ）を取ることを強制することできる。これは、ＲＮＡ分子に観察されるのと同じパッカリング様式であり、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じる。さらに、フッ素は、良好な水素結合受容体であるため、ＲＮＡ構造を安定化することが知られている水分子と同じ水素結合相互作用に参与することができる。２’糖位置の修飾部分は、デオキシリボヌクレオチドのＨ部分よりもリボヌクレオチドのＯＨ部分に特徴的であるＨ結合に入ることが可能である。特定のｉＲＮＡ剤は、糖の全部、または少なくとも５０、７５、８０、８５、９０、もしくは９５％にＣ３’エンドパッカーを示すか、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じることができるくらい十分な量の糖にＣ３’エンドパッカーを示すか、Ｃ３’エンドパッカー構造でない糖を約２０個、１０個、５個、４個、３個、２個、または１個しか持たない。修飾の性質にかかわらず、およびＲＮＡ剤が、特に、突出または他の一本鎖領域にデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含有し得るが、ＤＮＡ分子、または分子中のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％よりも多く、もしくは二重鎖領域中のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％よりも多くがデオキシリボヌクレオチドである任意の分子、または２’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドは、ＲＮＡ剤の定義から除外されることは確実である。
本明細書で使用される「一本鎖ｉＲＮＡ剤」とは、単一分子から構成されたｉＲＮＡ剤のことである。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、鎖内対形成によって形成される二重鎖領域を含んでもよく、例えば、一本鎖ｉＲＮＡ剤は、ヘアピン構造もしくはパンハンドル（ｐａｎ ｈａｎｄｌｅ）構造であるか、またはヘアピン構造もしくはパンハンドル構造を含み得る。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に関してアンチセンスであってもよい。ある実施形態では、一本鎖ｉＲＮＡ剤は、５’リン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’-リン酸修飾には、ＲＩＳＣを介した遺伝子サイレンシングと適合可能なものが含まれる。好適な修飾としては、５’モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化または非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）；酸素／硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ（例えば、５’－α－チオトリホスフェート、５’－γ－チオトリホスフェートなど）、５’－ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’）が挙げられる（これらの修飾は、二本鎖ｉＲＮＡのアンチセンス鎖に関しても使用することができる）。
一本鎖ｉＲＮＡ剤は、ＲＩＳＣ複合体に入り、ＲＩＳＣを介した標的ｍＲＮＡの切断に関与することができるぐらい十分に長くてもよい。一本鎖ｉＲＮＡ剤の長さは、少なくとも１４ヌクレオチド、および他の実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖ｉＲＮＡ剤の長さは、２００、１００、または６０ヌクレオチド未満である。
ヘアピンｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。二重鎖領域の長さは、２００、１００、または５０以下である。ある実施形態では、二重鎖領域の範囲の長さは、１５～３０、１７～２３、１９～２３、および１９～２１ヌクレオチド対である。ヘアピンは、いくつかの実施形態では、３’に、また、ある実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側に、一本鎖突出または末端不対領域を有してもよい。いくつかの実施形態では、突出の長さは、２～３ヌクレオチドである。
本明細書で使用される「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」とは、鎖間ハイブリダイゼーションによって二重鎖構造の領域が形成され得る、２つ以上の、場合によっては２つの、鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドであってもよい。二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、１７～２５、１９～２３、および１９～２１ヌクレオチドであってもよい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドであってもよい。二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、１７～２５、１９～２３、および１９～２１ヌクレオチドであってもよい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対に等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対であってもよい。二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対以下であってもよい。範囲の長さは、１５～３０、１７～２３、１９～２３、および１９～２１ヌクレオチド対であってもよい。
多くの実施形態では、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、内在性分子によって（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）切断されて、より小さいｄｓ ｉＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）を産生することができるくらいに十分大きい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖とセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい場合がある。センス鎖とアンチセンス鎖は、同じ修飾または同じ部類の修飾を有することもあれば、異なる修飾を有することもあり、例えば、場合によっては、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合がある。例えば、センス鎖を不活性化するために、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合があり、例えば、センス鎖を不活性化して、活性のあるｓｉＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を妨げるために、センス鎖を修飾することができる。これは、センス鎖の５’－リン酸化を妨げる修飾によって（例えば、５’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって）遂行することができる（Ｎｙｋａｎｅｎら（２００１） ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ １０７，３０９-３２１参照）。例えば、単に５'-ＯＨをＯ－ＭｅではなくＨによって置換することなどの、リン酸化を妨げる他の修飾も使用することもできる。あるいは、大きな嵩高い基を５’－ホスフェートに付加して、ホスホジエステル結合に変えてもよいが、ホスホジエステラーゼがこのような結合を切断して、機能的なｓｉＲＮＡの５’－末端を放出し得るので、これはあまり望ましくない可能性がある。アンチセンス鎖修飾には、５’リン酸化、および本明細書で論じられる任意の他の５’修飾、特に、一本鎖ｉＲＮＡ分子に関する節において上で論じられた５’修飾が含まれる。
ｄｓ ｉＲＮＡ剤が、分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択し得る。したがって、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、突出、例えば、１つもしくは２つの５’突出もしくは３’突出、または２～３ヌクレオチドの３’突出を含有するように対形成した、センス鎖とアンチセンス鎖を含有し得る。多くの実施形態は、３’突出を有する。あるｓｉＲＮＡ剤は、一本鎖突出を有し、いくつかの実施形態では、各末端に１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの長さの３’突出を有する。突出は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの２つの鎖がジグザグ状なっていることの結果として生じ得る。５’末端はリン酸化されていてもよい。
いくつかの実施形態では、二重鎖領域の長さは、例えば、上で論じられたｓｉＲＮＡ剤の範囲において、１５～３０ヌクレオチド長、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ剤は、天然のＤｉｃｅｒによって長いｄｓ ｉＲＮＡからプロセッシングされた産物と長さおよび構造が類似していることがあり得る。ｓｉＲＮＡ剤の２つの鎖が結合（例えば、共有結合）している実施形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および３’突出を与える他の一本鎖構造も本発明の範囲内にある。
ｄｓ ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載される単離されたｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物）のサイレンシングを仲介することができる。便宜上、このようなｍＲＮＡを、本明細書では、サイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ぶ。このような遺伝子を標的遺伝子とも呼ぶ。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡを標的とすることもできる。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉを仲介する」という語句は、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論に束縛されることを望まないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ（例えば、２１～２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤）が使用されると考えられている。
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子の間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合には、特異的結合が所望される条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合には、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが行なわれる条件下で、非標的配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が必要とされる。非標的配列は、典型的には、少なくとも５ヌクレオチド異なっている。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに「十分に相補的」である。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「厳密に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡとｉＲＮＡ剤は、例えば、厳密に相補的な領域でワトソン－クリック塩基対のみからできたハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含むことができる。さらに、いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に区別することができる。この場合、ｉＲＮＡ剤は、厳密な相補性が、単一ヌクレオチドの違いがある（例えば、７ヌクレオチド以内の）領域に見られる場合のみにＲＮＡｉを仲介する。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、１００、２００、３００、または４００ヌクレオチド未満の長さの核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。
本明細書で論じられるＲＮＡ剤は、未修飾のＲＮＡ、ならびに、例えば、効力を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含む。未修飾のＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在する、例えば、ヒトの体内に天然に存在するのと同じかまたは本質的に同じである分子を指す。当技術分野では、稀であるかまたは通常とは異なるが、天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと呼ぶことが多く、例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら （１９９４） Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ＲＮＡ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３－２１９６を参照されたい。（典型的には転写後修飾の結果であることが明白なので）修飾ＲＮＡと呼ばれることが多い、このような稀であるかまたは通常とは異なるＲＮＡは、本明細書で使用される「未修飾のＲＮＡ」という用語の範囲内にある。修飾ＲＮＡは、１つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在するものと異なる、例えば、ヒトの体内に存在するものと異なる分子を指す。これらは修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、当然、修飾されているのでＲＮＡではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物とは、リボリン酸骨格が非リボリン酸構築物で置換されている分子のことであり、この非リボリン酸構築物は、ハイブリダイゼーションが、リボリン酸骨格の場合に見られるのと実質的に同様（例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣物）であるように、塩基が正しい空間的関係性で提示されることを可能にする。上記の全ての例が本明細書で論じられる。
以下の考察の大部分は、一本鎖分子について言及するものである。本発明の多くの実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤（例えば、部分的二本鎖ｉＲＮＡ剤）が想定されている。したがって、以下に記載される一本鎖構造からできた二本鎖構造（例えば、２つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成している場合、または分子内対形成によって二本鎖領域が形成されている場合（例えば、ヘアピン構造））は、本発明の範囲内にある。長さについては、本明細書の他の箇所で記載されている。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多く（例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾）は、核酸内で繰り返される位置で生じる。修飾が核酸中のこれらの位置全てで生じる場合もあるが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’末端位置または５’末端位置でのみで生じ得、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域でのみ生じ得るか、またはＲＮＡの一本鎖領域でのみ生じ得る。例えば、非結合Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端で生じ得るか、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でもしくは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じ得るか、または二本鎖領域と一本鎖領域において、特に末端で生じ得る。５’末端（単数または複数）をリン酸化することができる。
いくつかの実施形態では、例えば、安定性を高めるために、突出に特定の塩基を含めるか、または一本鎖突出（例えば、５’突出もしくは３’突出、もしくはその両方）に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能である。例えば、突出にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがある。いくつかの実施形態では、３’突出または５’突出中の塩基の全てまたはいくつかを、例えば、本明細書に記載される修飾を用いて、修飾する。修飾には、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基での修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）が含まれることができる。突出が標的配列と相同である必要はない。
修飾およびヌクレオチド代用物を以下で論じる。
Figure 2023010881000077
上記の式ＶＩＩに示すスキャフォールドは、リボ核酸の一部を表す。塩基性成分は、リボース糖、塩基、末端リン酸、およびリン酸ヌクレオチド間リンカーである。塩基が、天然の塩基、例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシンである場合、糖は、（図示したように）未修飾の２’ヒドロキシルリボース糖であり、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは全てＯであり、式ＶＩＩは、天然の未修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
未修飾のオリゴリボヌクレオチドは、いくつかの用途では最適とは言えない場合があり、例えば、未修飾のオリゴリボヌクレオチドが、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、上記ＲＮＡ成分の１つ以上に対する化学修飾は、改善された特性を付与することができ、例えば、ヌクレアーゼに対してオリゴリボヌクレオチドをより安定にすることができる。
修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下のうちの１つ以上を含むことができる：
（ｉ）非結合（ＸおよびＹ）リン酸酸素の一方もしくは両方、ならびに／または結合（ＷおよびＺ）リン酸酸素の１つ以上の改変（例えば、置換）（リン酸が末端位置にある場合、位置ＷまたはＺのうちの１つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなる元素にリン酸を結合しない。しかしながら、用語を単純化するために、別途注記される場合を除き、核酸の５’末端のＷ位と核酸の３’末端の末端Ｚ位とは、本明細書で使用される「結合リン酸酸素」という用語の範囲内にある）；
（ｉｉ）リボース糖の構成成分（例えば、リボース糖の２’ヒドロキシル）の改変（例えば、置換）；
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の、「デホスホ（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによる大規模な置換；
（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース-リン酸骨格（括弧ＩＩ）の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、またはＲＮＡの３’末端もしくは５’末端のいずれかへの、部分（例えば、蛍光標識部分）のコンジュゲーション）。
この文脈で使用される、置換、修飾、改変などの用語は、プロセス限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、参照リボ核酸または天然に存在するリボ核酸から始めて、それを、修飾リボ核酸を産生するように修飾しなければならないことを意味ものではなく、修飾とは、単に、天然に存在する分子との違いを意味するものである。
いくつかの化学的実体の実際の電子構造は、ただ１つの標準的な型（すなわち、ルイス構造）によって十分に表すことはできないことが理解される。理論に束縛されることを望まないが、その代わりに、実際の構造は、集合的に共鳴型または共鳴構造として知られている、２つ以上の標準的な型のあるハイブリッドまたは加重平均であることができる。共鳴構造は、個別的な化学的実体ではなく、紙の上でのみ存在する。共鳴構造は、特定の化学的実体に対する結合電子および非結合電子の配置または「局在」という点においてのみ相互に異なる。１つの共鳴構造が他のものよりも高い程度でハイブリッドに寄与することが可能である。したがって、本発明の実施形態についての記載および図示される説明は、特定の種に対する主要な共鳴型として当技術分野で認識されているものに関してなされる。例えば、任意のホスホロアミデート（非結合酸素の窒素による置換）は、上記の図においてＸ＝ＯおよびＹ＝Ｎによって表されよう。
具体的な修飾を以下に詳細に論じる。
リン酸基
リン酸基は、負に荷電した種である。電荷は、２つの非結合酸素原子（すなわち、上記式１中のＸおよびＹ）に均等に分布している。しかしながら、リン酸基は、酸素原子の１つを異なる置換基で置換することによって修飾することができる。ＲＮＡリン酸骨格に対するこの修飾の１つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増大であり得る。したがって、理論に束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、非荷電リンカーかまたは非対称の電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかを生じさせる改変を導入することが望ましい可能性がある。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネートまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄に置換されている。ＸまたはＹのうちの１つだけが改変される状況とは異なり、ホスホロジチオエートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。ジアステレオマー形成により、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対するさまざまな耐性を示す調製物を生じさせることが可能である。さらに、キラルリン酸基を含有するＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾のＲＮＡ種と比べてより低い可能性がある。したがって、理論に束縛されることを望まないが、ジアステレオマー混合物を産生することができないという点で、キラル中心を排除するＸとＹの両方に対する修飾（例えば、ホスホロジチオエート形成）が望ましい可能性がある。したがって、Ｘは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルもしくはアリールである）のいずれか１つであることができる。したがって、Ｙは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルもしくはアリールである）のいずれか１つであることができる。Ｘおよび／またはＹを硫黄で置換することが可能である。
リン酸リンカーは、結合酸素（すなわち、上記式１中のＷまたはＺ）を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによって修飾することもできる。置換は、末端の酸素（位置Ｗ（３’）または位置Ｚ（５’））で生じることができる。Ｗを炭素で置換すること、またはＺを窒素で置換することが可能である。
候補となる薬剤を下記のような好適性について評価することができる。
糖基
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基の全てまたはいくつかの修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。理論によって束縛されるものではないが、ヒドロキシルが、２’アルコキシドイオンを形成するように脱プロトン化されることがもはやできないので、安定性の増強が予測される。２’アルコキシドは、リンカーのリン原子への分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。再び、理論によって束縛されることを望まないが、２’位でのアルコキシド形成が可能でない改変を導入することが、いくつかの実施形態に対して望ましい可能性がある。
「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に接続されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ－ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＰＥＧ誘導体である、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）のみを含有するオリゴヌクレオチドが堅固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目すべきことである。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的にｄｓのＲＮＡの突出部に特に関連する）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキル－チオ－アルキル；チオアルコキシ；ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは任意で、例えば、アミノ官能基で置換されていてもよい）が挙げられる。ある実施形態の他の置換基としては、２’－メトキシエチル、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、および２’－フルオロが挙げられる。
糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、修飾ＲＮＡは、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。
修飾ＲＮＡは、Ｃ－１’にヌクレオ塩基を欠く「無塩基」糖を含むこともできる。これらの無塩基糖は、１つ以上の構成成分の糖原子におけるさらなる修飾を含有することもできる。
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、２’修飾を、１つ以上のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含有するオリゴヌクレオチドである。
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
リン酸基の置換
リン酸基は、リン以外のものを含有する接続部（式１中の括弧Ｉ参照）に置換することができる。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、これを中性の構造模倣物で置換することは、ヌクレアーゼ安定性の増強を付与するはずであると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様では、荷電したリン酸基が中性部分に置換される改変を導入することが望ましい可能性がある。
リン酸基を置換することができる部分の例としては、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。ある実施形態では、置換には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれてもよい。
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
リン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物（式１中の括弧ＩＩ参照）に置換されているオリゴヌクレオチド模倣スキャフォールドを構築することもできる。理論によって束縛されることを望まないが、繰り返し荷電した骨格が存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様では、塩基が中性の代用骨格によって連結される改変を導入することが望ましい可能性がある。
例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）というヌクレオシド代用物が挙げられる。ある実施形態では、ＰＮＡ代用物を使用してもよい。
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端においてなされ得る。これらの修飾は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を、他の機能的分子実体、例えば、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルをベースにしたもの）にコンジュゲートすることができる。機能的分子実体は、リン酸基および／またはスペーサーを介して糖に付着させることが可能である。スペーサーの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ－３’もしくはＣ－５’のＯ基、Ｎ基、Ｓ基、もしくはＣ基に接続するかまたはこれらに置き換わることできる。あるいは、スペーサーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に接続するかまたはこれに置き換わることができる。これらのスペーサーまたはリンカーとしては、例えば、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＮ－、－（ＣＨ２）ｎＯ－、－（ＣＨ２）ｎＳ－、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を挙げることができる。「スペーサー／リン酸－機能的分子実体－スペーサーリン酸」という配列が、ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に介在するとき、この配列は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループの代わりになることが可能である。３’末端は－ＯＨ基とすることができる。理論に束縛されることを望まないが、特定の部分のコンジュゲーションは、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性特性を改善することができると考えられている。再び、理論に束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の改変を導入することが望ましい可能性がある。末端修飾の他の例としては、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ-４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）が挙げられる。
末端修飾は、本明細書の他の箇所で論じられるような理由を含む多くの理由のために、活性を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために加えることができる。活性を調節するために有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による５’末端の修飾が含まれる。例えば、ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤、とりわけアンチセンス鎖は、５’リン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣを介した遺伝子サイレンシングと適合可能なものが含まれる。好適な修飾には、５’モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化または非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）；酸素／硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ（例えば、５’－α－チオトリホスフェート、５’－γ－チオトリホスフェートなど）、５’－ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’）が含まれる。
末端修飾は、分解に対する耐性を増大させるのに有用であることもできる。
末端修飾は、分布をモニターするためにも有用であり得るが、このような場合、付加される基には、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）またはＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８）が含まれ得る。末端修飾は、取込みを増強するためにも有用であり得るが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾は、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するためにも有用であり得るが、このための有用な修飾にはマイトマイシンＣが含まれる。
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルはＲＮＡに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成もしくは天然のヌクレオ塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、またはツベルシジン）および上記の修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基および「汎用的な塩基」のいずれかの置換類似体または修飾類似体を利用することができる。例としては、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、および６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンならびに８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換グアニン、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニン、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３－デアザ－５－アザシトシン、２－アミノプリン、５－アルキルウラシル、７－アルキルグアニン、５－アルキルシトシン、７－デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、５－アミノ－アリル－ウラシル、Ｎ３－メチルウラシル、置換１，２，４－トリアゾール、２－ピリジノン、５－ニトロインドール、３－ニトロピロール、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６－イソペンチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、Ｎ－メチルグアニン、またはＯ－アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，８５８-８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されているものが挙げられる。
一般に、塩基の変化は、安定性を促進するためには使用されないが、他の理由のために有用である可能性があり、例えば、いくつかのもの（例えば、２，６－ジアミノプリンおよび２アミノプリン）は蛍光性である。修飾塩基は、標的特異性を低下させることがあり得る。このことは、ｉＲＮＡ剤の設計において考慮されてもよい。
候補となる修飾を下記のように評価することができる。
候補ＲＮＡの評価
候補ＲＮＡ剤（例えば、修飾ＲＮＡ）を、そのＲＮＡ剤または修飾分子および対照分子を適当な条件に曝露すること、ならびに選択された特性の存在について評価することによって、選択された特性について評価することができる。例えば、分解物質に対する耐性は、以下のように評価することができる。候補となる修飾ＲＮＡ（および対照分子、通常は未修飾形態）を、分解的な条件、例えば、分解作用物質（例えば、ヌクレアーゼ）を含む環境に曝露することができる。例えば、生物学的試料、例えば、治療的使用において直面し得る環境、例えば、血液または細胞画分（例えば、無細胞ホモジネートまたは破砕された細胞）と類似の生物学的試料を使用することができる。その後、候補および対照を、多数の手法のいずれかによって、分解に対する耐性について評価することができる。例えば、候補および対照を、例えば、放射性標識もしくは酵素標識、または蛍光標識（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５）を用いて、曝露の前に標識することができる。対照ＲＮＡおよび修飾ＲＮＡを、分解作用物質、および任意で、対照（例えば、不活化された（例えば、熱不活化された）分解作用物質）とともにインキュベートすることができる。その後、物理学的パラメータ（例えば、修飾分子および対照分子のサイズ）を決定する。これらのパラメータを、物理学的方法によって（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ分画カラムによって）、その分子がそのもとの長さを維持していたかどうかを評価するために決定するか、または機能的に評価することができる。あるいは、ノーザンブロット分析を用いて、未標識の修飾分子の長さをアッセイすることができる。
機能的アッセイを用いて、候補薬剤を評価することもできる。機能的アッセイは、修飾によって、遺伝子発現をサイレンシングする分子の能力が変化するかどうかを決定するために、最初に、または前の非機能的アッセイ（例えば、分解に対する耐性についてのアッセイ）の後で適用することができる。例えば、細胞（例えば、マウスまたはヒトの細胞などの哺乳類細胞）に、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現するプラスミドと、その蛍光タンパク質をコードする転写物に相同な候補ＲＮＡ剤を共トランスフェクトすることができる（例えば、国際公開第００／４４９１４号パンフレット参照）。例えば、ＧＦＰ ｍＲＮＡに相同な修飾ｄｓｉＲＮＡは、トランスフェクションに候補ｄｓｉＲＮＡを含めなかった対照細胞（例えば、ＲＮＡ剤が添加されなかった対照、および／または未修飾ＲＮＡが添加された対照）と比較して、細胞の蛍光の減少についてモニターすることによって、ＧＦＰ発現を阻害する能力についてアッセイすることができる。遺伝子発現に対する候補薬剤の効力は、修飾ｄｓ ｉＲＮＡ剤および未修飾ｄｓ ｉＲＮＡ剤の存在下での細胞の蛍光を比較することによって評価することができる。
代替的な機能的アッセイにおいて、内在性マウス遺伝子（例えば、ｃ－ｍｏｓなどの母性発現遺伝子）に相同な候補ｄｓ ｉＲＮＡ剤を未成熟のマウス卵母細胞に注入し、インビボで遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡ剤の能力を評価することができる（例えば、国際公開第０１／３６６４６号パンフレット参照）。卵母細胞の表現型（例えば、第ＩＩ中期での停止を維持する能力）を、ＲＮＡ剤が発現を阻害する指標としてモニターすることができる。例えば、ｄｓ ｉＲＮＡ剤によるｃ－ｍｏｓ ｍＲＮＡの切断は、卵母細胞に中期での停止を抜け出させ、単為生殖的発生を開始させるであろう（Ｃｏｌｌｅｄｇｅら Ｎａｔｕｒｅ ３７０：６５-６８，１９９４；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら Ｎａｔｕｒｅ，３７０：６８-７１，１９９４）。標的ＲＮＡレベルに対する修飾ＲＮＡ剤の効果は、陰性対照と比較して、標的ｍＲＮＡのレベルの減少についてアッセイするためのノーザンブロットによって、または標的タンパク質のレベルの減少についてアッセイするためのウエスタンブロットによって確認することができる。対照は、ＲＮＡ剤が添加されない細胞、および／または未修飾ＲＮＡが添加される細胞を含むことができる。
ＲＮＡ構造に関する参考文献
本明細書で列挙した刊行物、特許、および公開特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成によるものであってもよく、例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」エフ エックスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１（とりわけ、第１章「Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ－ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２章「Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３章「２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第４章「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、第５章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ」、第６章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ－２’－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ」、および第７章「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓ」）を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロッキング基、および反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６-５０４；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３-２３１１、ならびにＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３-６１９４、またはこれらの文献中で参照されている参考文献に記載されている。国際公開第００／４４８９５号パンフレット、国際公開第０１／７５１６４号パンフレット、または国際公開第０２／４４３２１号パンフレットに記載の修飾を本明細書で使用することができる。
リン酸基の参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号明細書に記載されている。アルキルホスホン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載されている。ホスホルアミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号明細書または米国特許第５，３６６，８７８号明細書に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号明細書に記載されている。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号明細書および米国特許第５，１７７，１９８号明細書に記載されている。３’－デオキシ－３’－アミノホスホルアミデートリボオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号明細書に記載されている。３’－デオキシ３’－メチレンホスホン酸オリゴリボヌクレオチドは、Ａｎ，Ｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９－２８０１に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Ｓｐｒｏａｔら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１、およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載されている。
糖基の参考文献
２’修飾に対する修飾は、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９～１３４および同文献中の全ての参考文献に見出すことができる。リボースに対する特異的修飾は、以下の参考文献に見出すことができる：２’－フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１～８４１，２’－ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ． Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０～１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１～３１０）。
リン酸基の置換に関する参考文献
メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書では、ＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書では、ＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（本明細書では、アミド－３結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（本明細書では、アミド－４結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、ならびに例えば、ＭＭＩとＰＯ結合またはＰＳ結合を交互に有する混合骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号の各明細書、ならびに公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号およびＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（それぞれ、国際公開第９２／２０８２２号および国際公開第９２／２０８２３号として公開されている）の各パンフレットに記載されているように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号明細書および同第５，２６４，５６４号明細書に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書に記載されているように調製することができる。シロキサン置換は、Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８８，１６，４５８３に記載されている。カルボネート置換は、Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ１９７１，１９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９７２，１９９１に記載されている。カルバメート置換は、Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，６１２９に記載されている。
リン酸－リボース骨格の置換に関する参考文献
シクロブチル糖代用物の化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号明細書に記載されているように調製することができる。ピロリジン糖代用物は、米国特許第５，５１９，１３４号明細書に記載されているように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第５，１４２，０４７号明細書および同第５，２３５，０３３号明細書、ならびに他の関連する特許の開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）はそれ自体公知であり、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５－２３で参照されているさまざまな手順のいずれかに従って調製することができる。これらは、米国特許第５，５３９，０８３号明細書に従って調製してもよい。
末端修飾の参考文献
末端修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３－１２８（２００２）および同文献中の参考文献に記載されている。
塩基の参考文献
Ｎ－２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号明細書に記載されているように調製することができる。３－デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号明細書に記載されているように調製することができる。５，６－置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号明細書に記載されているように調製することができる。５－プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号明細書に記載されているように調製することができる。さらなる参考文献は、塩基修飾についての上記の節に開示することができる。
さらなるＲＮＡ剤
特定のＲＮＡ剤は、以下の構造（式ＶＩＩＩ）を有する。
Figure 2023010881000078
 式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立してＨ（すなわち、無塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、および６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンならびに８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換グアニン、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニン、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３－デアザ－５－アザシトシン、２－アミノプリン、５－アルキルウラシル、７－アルキルグアニン、５－アルキルシトシン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、５－アミノ－アリル－ウラシル、Ｎ３－メチルウラシル、置換１，２，４－トリアゾール、２－ピリジノン、５－ニトロインドール、３－ニトロピロール、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６－イソペンチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、Ｎ－メチルグアニン、またはＯ－アルキル化塩基であり；
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、独立してＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；シアノ；メルカプト、ＳＲ８；アルキル-チオ-アルキル；アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらは各々、任意でハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、もしくはウレイドで置換されていてもよい）であるか；またはＲ４、Ｒ５、もしくはＲ６は、Ｒ７と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［-Ｏ-ＣＨ２-］共有結合架橋を形成し；
Ａ１は、
Figure 2023010881000079
 ；Ｈ；ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｗ１；無塩基ヌクレオチドであるか、または存在せず；
（いくつかの実施形態では、Ａ１は、特にアンチセンスに関して、５’モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’-グアノシンキャップ（７－メチル化または非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’-（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’-アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’-（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’一ジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’-ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）；酸素／硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ（例えば、５’-α－チオトリホスフェート、５’-γ－チオトリホスフェートなど）、５’-ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’-アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’-ＣＨ２）、５’-アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’）から選択される）；
Ａ２は下記のものであり：
Figure 2023010881000080
 Ａ３は下記のものであり：
Figure 2023010881000081
 Ａ４は、
Figure 2023010881000082
 ；Ｈ；Ｚ４；反転ヌクレオチドであるか；または存在せず；
Ｗ１は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ-Ｒ１０、Ｏ-Ｑ-Ｒ１０、Ｎ-Ｑ-Ｒ１０、Ｓ-Ｑ-Ｒ１０、または-Ｏ-であり；
Ｗ４は、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳであり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯＨ、Ｏ-、ＯＲ８、Ｓ、Ｓｅ、ＢＨ３ -、Ｈ、ＮＨＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリール（これらは各々、任意で置換されていてもよい）であり；
Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳであり；
Ｚ４は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ-Ｒ１０、Ｏ-Ｑ-Ｒ１０、Ｎ-Ｑ-Ｒ１０、Ｓ-Ｑ-Ｒ１０であり；
ｘは、５～１００であり、本明細書に記載されるＲＮＡ剤の長さに適合するように選択され；
Ｒ７は、Ｈであるか；またはＲ４、Ｒ５、もしくはＲ６と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［-Ｏ-ＣＨ２-］共有結合架橋を形成し；
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸、または糖であり；
Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり；
Ｒ１０は、Ｈ；フルオロフォア（ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）；硫黄保護基、ケイ素保護基、ホウ素保護基、もしくはエステル保護基；インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ-４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール；放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）；またはＲＮＡ剤であり；
ｍは、０～１，０００，０００であり；
ｎは、０～２０である。
Ｑは、無塩基糖、アミド、カルボキシ、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬もしくはフルオレセイン試薬からなる群から選択されるスペーサーである。
リン酸基全体が置換されている特定のＲＮＡ剤は、以下の構造（式ＩＸ）を有する：
Figure 2023010881000083
 式中、
Ａ１０～Ａ４０はＬ-Ｇ-Ｌであり；Ａ１０および／またはＡ４０は存在しなくてもよく（式中、Ｌはリンカーであり、一方または両方のＬは、存在してもまたは存在しなくてもよく、ＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇからなる群から選択される）
Ｇは、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノからなる群から選択される官能基であり；
Ｒ１０、Ｒ２０、およびＲ３０は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ（すなわち、無塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、および６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンならびに８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換グアニン、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニン、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３－デアザ－５－アザシトシン、２－アミノプリン、５－アルキルウラシル、７－アルキルグアニン、５－アルキルシトシン、７－デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、５－アミノ－アリル－ウラシル、Ｎ３－メチルウラシル、置換１，２，４－トリアゾール、２－ピリジノン、５－ニトロインドール、３－ニトロピロール、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６－イソペンチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、Ｎ－メチルグアニン、またはＯ－アルキル化塩基であり；
Ｒ４０、Ｒ５０、およびＲ６０は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；シアノ；メルカプト、ＳＲ８；アルキル-チオ-アルキル；アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらは各々、任意でハロ基、ヒドロキシ基、オキソ基、ニトロ基、ハロアルキル基、アルキル基、アルカリル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヘテロシクリル基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基、ヘテロアリールアミノ基、ジヘテロアリールアミノ基、アシルアミノ基、アルキルカルバモイル基、アリールカルバモイル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、ヒドロキシアルキル基、アルカンスルホニル基、アルカンスルホンアミド基、アレンスルホンアミド基、アラルキルスルホンアミド基、アルキルカルボニル基、アシルオキシ基、シアノ基、もしくはウレイド基で置換されてもよい）であるか；またはＲ４、Ｒ５、もしくはＲ６は、Ｒ７と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［-Ｏ-ＣＨ２-］共有結合架橋を形成し；
ｘは、５～１００であるか、または本明細書に記載されるＲＮＡ剤の長さに適合するように選択され；
Ｒ７０は、Ｈであるか；またはＲ４０、Ｒ５０、もしくはＲ６０と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［-Ｏ-ＣＨ２-］共有結合架橋を形成し；
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸、または糖であり；
Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり
ｍは、０～１，０００，０００であり；
ｎは、０～２０であり；
ｇは、０～２である。
特定のヌクレオシド代用物は、以下の構造（式Ｘ）を有する：
Figure 2023010881000084
 式中、
Ｓは、モフィリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸からなる群から選択されるヌクレオシド代用物であり；
Ｌはリンカーで、かつＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇ；-Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ-からなる群から選択されるか、または存在しなくてもよく；
Ｍは、アミド結合；スルホンアミド；スルフィネート；リン酸基；本明細書に記載される修飾リン酸基であるか、または存在しなくてもよく；
Ｒ１００、Ｒ２００、およびＲ３００は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ（すなわち、無塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、および６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンならびに８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換グアニン、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニン、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３－デアザ－５－アザシトシン、２－アミノプリン、５－アルキルウラシル、７－アルキルグアニン、５－アルキルシトシン、７－デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、５－アミノ－アリル－ウラシル、Ｎ３－メチルウラシル、置換１，２，４－トリアゾール、２－ピリジノン、５－ニトロインドール、３－ニトロピロール、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６－イソペンチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、Ｎ－メチルグアニン、またはＯ－アルキル化塩基であり；
ｘは、５～１００であるか、または本明細書に記載されるＲＮＡ剤の長さに適合するように選択され；
ｇは、０～２である。
定義
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素のうちの任意の基を指す。「アルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を含み、任意でＮ、Ｏ、またはＳが挿入され得る、直鎖または分岐鎖であり得る飽和非芳香族炭化水素鎖および不飽和非芳香族炭化水素鎖（これらは、プロピル、アリル、またはプロパルジルを含むが、これらに限定されない）を指す。例えば、Ｃ１-Ｃ１０は、この基がその中に１～１０個（１０個を含む）の炭素原子を有し得ることを意味する。「アルコキシ」という用語は、-Ｏ-アルキル基を指す。「アルキレン」という用語は、二価アルキル（すなわち、-Ｒ-）を指す。「アルキレンジオキソ」という用語は、-Ｏ-Ｒ-Ｏ-（式中、Ｒはアルキレンを表す）という構造の二価種を指す。「アミノアルキル」という用語は、アミノで置換されたアルキルを指す。「メルカプト」という用語は、-ＳＨ基を指す。「チオアルコキシ」という用語は、-Ｓ-アルキル基を指す。
「アリール基」という用語は、各環の０個、１個、２個、３個、または４個の原子が、置換基によって置換され得る、６炭素の単環式芳香環系または１０炭素の二環式芳香環系を指す。アリール基の例としては、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。「アリールアルキル」という用語または「アラルキル」という用語は、アリールで置換されたアルキルを指す。「アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されたアルコキシを指す。
本明細書で利用される「シクロアルキル」という用語は、３～１２個の炭素、例えば、３～８個の炭素、および例えば、３～６個の炭素を有する、飽和環式炭化水素基および部分不飽和環式炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、任意で置換されていてもよい。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合には１～３個のヘテロ原子を、二環式の場合には１～６個のヘテロ原子を、または三環式の場合には１～９個のヘテロ原子を有する、５～８員の芳香族単環式環系、８～１２員の芳香族二環式環系、または１１～１４員の芳香族三環式環系を指し、該ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環、二環、または三環の場合、炭素原子と、それぞれ、１～３個、１～６個、または１～９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、そこで、各環の０個、１個、２個、３個、または４個の原子は、置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどが挙げられる。「ヘテロアリールアルキル」という用語または「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合には１～３個のヘテロ原子を、二環式の場合には１～６個のヘテロ原子を、または三環式の場合には１～９個のヘテロ原子を有する、５～８員の非芳香族単環式環系、８～１２員の非芳香族二環式環系、または１１～１４員の非芳香族三環式環系を指し、該ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環、二環、または三環の場合、炭素原子と、それぞれ、１～３個、１～６個、または１～９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、そこで、各環の０個、１個、２個、または３個の原子は、置換基により置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホニル、テトラヒドロフラニルなどが挙げられる。
「オキソ」という用語は、炭素に結合した場合にはカルボニルを、窒素に結合した場合にはＮ－オキシドを、および硫黄に結合した場合にはスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル置換基、シクロアルキカルボニル置換基、アリールカルボニル置換基、ヘテロシクリルカルボニル置換基、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、これらはいずれも、置換基によってさらに置換されていてもよい。
「置換された」という用語は、所与の構造中の１つ以上の水素基と、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルフォニル、アルキルスルフォニルアルキル、アリールスルフォニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、ヘテロサイクリック、および脂肪族を含むが、これらに限定されない、特定の置換基の基との置換を指す。置換基をさらに置換することができることが理解される。
パリンドローム
本発明のｉＲＮＡ剤は、２つ以上のＲＮＡ領域を標的とすることができる。例えば、ｉＲＮＡ剤は、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第１の配列と第２の配列を含むことができる。第１の配列は第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができ、第２の配列は第２の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができる。ｉＲＮＡ剤の第１の配列と第２の配列が異なるＲＮＡ鎖上にあることができ、かつ第１の配列と第２の配列の間のミスマッチが、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満であることができる。ｉＲＮＡ剤の第１の配列と第２の配列が同じＲＮＡ鎖上にあることができ、かつ関連する実施形態では、ｉＲＮＡ剤の５０％よりも多く、６０％よりも多く、７０％よりも多く、８０％よりも多く、９０％よりも多く、９５％よりも多く、または１％よりも多くが、２分子の形態であることができる。ｉＲＮＡ剤の第１の配列と第２の配列は、互いに完全に相補的であることができる。
第１の標的ＲＮＡ領域が第１の遺伝子によってコードされることができ、かつ第２の標的ＲＮＡ領域が第２の遺伝子によってコードされることができるし、または第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域が単一遺伝子由来のＲＮＡの異なる領域であることができる。第１の配列と第２の配列は、少なくとも１ヌクレオチド異なり得る。
第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、遺伝子の第１の配列変異体と第２の配列変異体（例えば、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子）によってコードされる転写物上にあることができる。配列変異体は、例えば、突然変異、または多型であることができる。第１の標的ＲＮＡ領域は、第２の標的ＲＮＡ領域と比べて、ヌクレオチドの置換、挿入、もしくは欠失を含むことができるし、または第２の標的ＲＮＡ領域は、第１の標的領域の突然変異体または変異体であることができる。
第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、ウイルスＲＮＡ領域またはヒトＲＮＡ領域を含むことができる。第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、オンコジーンの変異転写物上にあることもできるし、または腫瘍抑制遺伝子転写物の異なる突然変異を含むこともできる。さらに、第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、遺伝子変異のホットスポットに対応することができる。
本発明の組成物は、ｉＲＮＡ剤分子の混合物を含むことができる。例えば、１つのｉＲＮＡ剤が、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第１の配列と第２の配列を含有することができ、さらに、第１の配列が第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができ、かつ第２の配列が第２の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができる。混合物は、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第３の配列と第４の配列を含む少なくとも１つの追加のｉＲＮＡ剤種を含むこともでき、この場合、第３の配列が第３の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができ、かつ第４の配列が第４の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができる。さらに、第１の配列または第２の配列が、第３の配列または第４の配列に対して、互いにハイブリダイズできるのに十分に相補的であることができる。第１の配列と第２の配列は同じまたは異なるＲＮＡ鎖上にあることができ、第３の配列と第４の配列は同じまたは異なるＲＮＡ鎖上にあることができる。
標的ＲＮＡ領域は、ウイルスＲＮＡまたはヒトＲＮＡの変異体配列であることができ、ある実施形態では、少なくとも２つの標的ＲＮＡ領域が、オンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子の変異体転写物であることができる。標的ＲＮＡ領域は、遺伝子変異のホットスポットに対応することができる。
ｉＲＮＡ剤組成物を作製する方法は、（例えば、ヒトにおける）高度の変動性または突然変異頻度を有する、標的遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子もしくはヒト遺伝子、またはオンコジーンもしくは腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３）のＲＮＡの領域に関する情報を入手または提供することを含むことができる。さらに、その領域内の複数のＲＮＡ標的に関する情報を入手または提供することを含むことができ、その場合、各々のＲＮＡ標的が、遺伝子の異なる変異体または突然変異体（例えば、ｐ５３ ２４８Ｑおよび／またはｐ５３ ２４９Ｓをコードするコドンを含む領域）に対応する。第１の配列が（例えば、２４９Ｑをコードする）複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第１の標的と相補的であり、第２の配列が（例えば、２４９Ｓをコードする）複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第２の標的と相補的であり、かつ第１の配列と第２の配列がハイブリダイズするのに十分に相補的であり得るように、ｉＲＮＡ剤を構築することができる。
例えば、標的遺伝子中の共通の突然変異体を同定するために、配列分析を使用して、高度の変動性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域を同定することができる。高度の変動性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域は、個体群由来の標的遺伝子についての遺伝子型情報を入手または提供することによって同定することができる。
互いにハイブリダイズするのに十分に相補的な第１の配列と第２の配列を有するｉＲＮＡ剤を提供することによって、標的遺伝子の発現を調節する（例えば、下方調節またはサイレンシング）することができる。さらに、第１の配列が第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができ、かつ第２の配列が第２の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができる。
ｉＲＮＡ剤は、第１の変異体ＲＮＡ標的領域に相補的な第１の配列と第２の変異体ＲＮＡ標的領域に相補的な第２の配列とを含むことができる。この第１の変異体ＲＮＡ標的領域と第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、またはオンコジーン）の第１の変異体と第２の変異体または第１の突然変異体と第２の突然変異体に対応することができる。第１の変異体標的ＲＮＡ領域と第２の変異体標的ＲＮＡ領域は、標的遺伝子の対立遺伝子変異体、突然変異（例えば、点突然変異）、または多型を含むことができる。第１の変異体ＲＮＡ標的領域と第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、遺伝子のホットスポットに対応することができる。
複数のｉＲＮＡ剤（例えば、パネルまたはバンク）を提供することができる。
他の実施形態
また別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、細胞に送達される外来のＤＮＡ鋳型から、インビボで細胞において産生される。例えば、ＤＮＡ鋳型をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号明細書）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４－３０５７参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができるし、または遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリックスを含むことができる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写ユニット、すなわち、ｉＲＮＡ剤の上部の鎖を含む転写物を産生するものと、ｉＲＮＡ剤の下部の鎖を含む転写物を産生するものとを含むことができる。鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ剤が産生され、プロセシングを受けて遺伝子サイレンシングを仲介するｓｉＲＮＡ剤断片となる。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、ＲＮアーゼからの保護および薬理学的特性（例えば、組織および細胞への取込みの増強）のためのさまざまな修飾を有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、例えば、糖の完全な２’－メチル化、ホスホロチオエート骨格、および例えば、３’－末端のコレステロール部分によって、普通のＲＮＡとは異なる。アンタゴｍｉｒは、内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングし、それによってｍｉＲＮＡ誘導性の遺伝子サイレンシングを妨害するために使用し得る。アンタゴｍｉｒ介在性のｍｉＲＮＡサイレンシングの例は、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５-６８９（これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる）に記載されているｍｉＲ－１２２のサイレンシングである。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周囲のゲノムＤＮＡがない場合でも、それらの比較的短い結合配列を認識することができるので、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を持つ短いオリゴヌクレオチドを、生きた細胞での遺伝子発現を操作するための道具として使用することができる。この戦略では、このような「デコイオリゴヌクレオチド」が細胞内に送達され、その後、標的因子によって認識および結合される。デコイによって転写因子のＤＮＡ結合部位が占められると、転写因子が後に標的遺伝子のプロモーター領域に結合することができなくなる。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を阻害するために、または転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方調節するために、治療剤として使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの利用例は、Ｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１-１０７５に見出すことができ、これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に少なくとも部分的に相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡの場合は、それらが相補的ＲＮＡ鎖に結合することによって相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を妨げる。アンチセンスＤＮＡは、特異的で、相補的な（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的とするために使用することもできる。結合が生じた場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮアーゼＨという酵素によって分解されることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用例は、Ｄｉａｓら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００２，１：３４７-３５５に見出すことができ、これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
アプタマー
アプタマーは、特異的な標的分子（単数または複数）に結合する核酸分子である。アプタマーは、ＲＮＡベースまたはＤＮＡベースであってもよく、かつリボスイッチを含んでもよい。リボスイッチとは、小さい標的分子に直接結合することができ、標的に結合することによって遺伝子活性に影響を及ぼすｍＲＮＡの一部のことである。したがって、リボスイッチを含有するｍＲＮＡは、その標的分子の有無によって、それ自体の活性の調節に直接関与する。
生理学的効果
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、治療上の毒性の決定が、ｉＲＮＡ剤と、ヒト配列および非ヒト動物配列の両方との相補性によってより容易になされるように設計することができる。これらの方法により、ｉＲＮＡ剤は、ヒト由来の核酸配列および少なくとも１種類の非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類（例えば、齧歯類、反芻類、または霊長類）由来の核酸配列に完全に相補的である配列からなることができる。例えば、非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）、ナミチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔｏ）、またはカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）であることができる。ｉＲＮＡ剤の配列は、非ヒト哺乳類およびヒトの相同遺伝子（例えば、オンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子）内の配列に相補的であることができる。非ヒト哺乳類におけるｉＲＮＡ剤の毒性を決定することによって、ヒトにおけるｉＲＮＡ剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、ｉＲＮＡ剤を、ヒトおよび２種類以上（例えば、２種類または３種類またはそれより多く）の非ヒト動物に対して相補的とすることができる。
本明細書に記載される方法は、ヒトに対するｉＲＮＡ剤の任意の生理学的効果、例えば、任意の望ましくない効果（例えば、毒性効果）、または任意の有益な、もしくは所望の効果と相関させるために使用することができる。
ｄｓ ｉＲＮＡの細胞取込みの増大
ｉＲＮＡ剤とｉＲＮＡ剤の細胞内への取込みに影響を及ぼす薬物とを投与する工程を含む本発明の方法。薬物は、ｉＲＮＡ剤が投与される前か、ｉＲＮＡ剤が投与された後か、またはｉＲＮＡ剤が投与されるのと同時に、投与することができる。薬物は、ｉＲＮＡ剤と共有結合させることができる。薬物は、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ－κＢの活性化因子であることができる。薬物は、細胞に対する一過性の効果を有することができる。
薬物は、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって（例えば、細胞の微小管、微小フィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって）、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取込みを増大させることができる。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであることができる。
薬物は、例えば、炎症性応答を活性化することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取込みを増大させることもできる。このような効果を有すると考えられる例示的な薬物としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン－１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
ｉＲＮＡコンジュゲート
ｉＲＮＡ剤は、第２の薬剤に結合（例えば、共有結合）させることができる。例えば、特定の障害を治療するために使用されるｉＲＮＡ剤は、第２の治療剤（例えば、ｉＲＮＡ剤以外の薬剤）に結合させることができる。第２の治療剤は、同じ障害の治療に対する治療剤であることができる。例えば、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害（例えば、癌）を治療するために使用されるｉＲＮＡの場合、ｉＲＮＡ剤は、抗癌作用がある第２の薬剤に結合させることができる。例えば、ｉＲＮＡ剤は、免疫系を刺激する薬剤（例えば、ＣｐＧモチーフ）、またはより一般的にはｔｏｌｌ様受容体を活性化し、かつ／またはγインターフェロンの産生を増大させる薬剤に結合させることができる。
ｉＲＮＡ産生
ｉＲＮＡは、例えば、種々の方法によって、大量に産生することができる。例示的な方法としては、有機合成およびＲＮＡ切断（例えば、インビトロでの切断）が挙げられる。
有機合成
ｉＲＮＡは、二本鎖のＲＮＡ分子の各々のそれぞれの鎖を別々に合成することによって作製することができる。その後、構成成分の鎖をアニーリングさせることができる。
大きなバイオリアクター（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ）製のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ ＩＩ）を用いて、所与のｉＲＮＡ用の特定のＲＮＡ鎖を大量に産生することができる。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ ＩＩリアクターは、１．５モル過剰のホスホロアミダイトヌクレオチドのみを使用して、効率的にヌクレオチドを結合させることができる。ＲＮＡ鎖を作製するためには、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標準的なモノマー添加サイクルを使用して、ｉＲＮＡ用の２１～２３ヌクレオチド鎖を合成することができる。典型的には、２つの相補的な鎖を別々に産生し、その後、例えば、固体担体からの放出および脱保護の後にアニーリングさせる。
有機合成を使用して、別個のｉＲＮＡ種を産生することができる。特定の標的遺伝子に対するｉＲＮＡ種の相補性を、正確に特定することができる。例えば、ｉＲＮＡ種は、多型（例えば、単一ヌクレオチド多型）を含む領域に相補的であり得る。さらに、多型の位置は、正確に規定することができる。いくつかの実施形態では、多型は、内部領域、例えば、末端の一方または両方から少なくとも４、５、７、または９ヌクレオチドの位置にある。
ｄｓ ｉＲＮＡ切断
ｉＲＮＡは、より大きなｄｓ ｉＲＮＡを切断することによって作製することもできる。切断は、インビトロまたはインビボで仲介され得る。例えば、インビトロでの切断によってｉＲＮＡを産生するために、以下の方法を使用することができる。
インビトロ転写。ｄｓ ｉＲＮＡは、両方向に核酸（ＤＮＡ）セグメントを転写することによって産生される。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、ベクターと、両側にＴ７プロモーターが隣接する位置でこのベクターにクローニングされた核酸セグメントについてのｄｓ ｉＲＮＡを産生する方法とを提供する。別々の鋳型が、ｄｓ ｉＲＮＡ用の２つの相補鎖のＴ７転写用に生成される。これらの鋳型は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの添加によってインビトロで転写され、ｄｓ ｉＲＮＡが産生される。ＰＣＲおよび／または他のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼ）を用いた同様の方法を使用することもできる。一実施形態では、この方法によって生成されるＲＮＡは、組換え酵素の調製物に混入し得るエンドトキシンを除去するように慎重に精製される。
インビトロでの切断。ｄｓ ｉＲＮＡは、例えば、Ｄｉｃｅｒまたは匹敵するＲＮアーゼＩＩＩベースの活性を用いて、インビトロで切断されてｉＲＮＡとなる。例えば、ｄｓ ｉＲＮＡは、ショウジョウバエ由来のインビトロ抽出物中で、または精製された成分（例えば、精製ＲＮアーゼもしくはＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体））を用いてインキュベートすることができる。例えば、Ｋｅｔｔｉｎｇら Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００１ Ｏｃｔ １５；１５（２０）：２６５４-９：およびＨａｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１ Ａｕｇ １０；２９３（５５３２）：１１４６-５０を参照されたい。
ｄｓ ｉＲＮＡの切断によって、通常、複数のｉＲＮＡ種が産生され、それぞれがもとのｄｓ ｉＲＮＡ分子の特定の２１～２３ｎｔ断片である。例えば、もとのｄｓ ｉＲＮＡ分子の重複領域および隣接領域に相補的な配列を含むｉＲＮＡが存在し得る。
合成方法を問わず、ｉＲＮＡ調製物は、製剤化に適した溶液（例えば、水溶液および／または有機溶液）中で調製することができる。例えば、ｉＲＮＡ調製物は、純粋な再蒸留水中で沈殿および再溶解させ、凍結乾燥させることができる。その後、乾燥させたｉＲＮＡは、意図される製剤化プロセスに適した溶液中に再懸濁させることができる。
製剤化
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、対象への投与用に製剤化することができる。
説明しやすくするために、本項での製剤、組成物、および方法は、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。
製剤化されたｉＲＮＡ組成物は、種々の状態をとることができる。いくつかの例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、均一に結晶性、および／または無水（例えば、水分が８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満、もしくは１０％未満）である。別の例では、ｉＲＮＡは、水相中に、例えば、水を含む溶液中にある。
水相組成物または結晶性組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に水相について）または粒子（例えば、結晶性組成物について適切であり得るような微粒子）に組み込むことができる。通常、ｉＲＮＡ組成物は、意図される投与方法と適合する様式で製剤化される（以下を参照）。
特定の実施形態では、組成物は、以下の方法、すなわち、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、もしくはこれらの手法の組合せ、または脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮、および他の自己集合のうちの少なくとも１つによって調製される。
ｉＲＮＡ調製物は、別の薬剤、例えば、別の治療剤またはｉＲＮＡを安定化する薬剤（例えば、ｉＲＮＡと複合体形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質）と組み合わせて製剤化することができる。さらに別の薬剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋のような二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎのような幅広い特異性のＲＮアーゼ阻害剤）などが挙げられる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、第２の遺伝子に関して、または同じ遺伝子に関して、ＲＮＡｉを仲介することができる第２のｉＲＮＡを含む。さらに他の調製物は、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個、もしくは１００個、またはそれより多くの異なるｉＲＮＡ種を含むことができる。このようなｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを仲介することができる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の薬剤）を含む。例えば、ウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ）の治療用のｉＲＮＡ組成物は、既知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）を含んでもよい。別の例では、癌の治療用のｉＲＮＡ組成物は、化学療法剤をさらに含んでもよい。
例示的な製剤を以下に論じる。
リポソーム
説明しやすくするために、本項での製剤、組成物、および方法は、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、膜状分子集合体（例えば、リポソームまたはミセル）中で送達されるように製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層（例えば、１つの二重層または複数の二重層）中に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームには、親油性材料と水性内部とから形成される膜を有する単層小胞および多重層小胞が含まれる。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性外部から水性内部を分離し、通常ｉＲＮＡ組成物を含まないが、いくつかの例では、ｉＲＮＡ組成物を含んでもよい。リポソームは、作用部位への活性成分の移動および送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜に類似しているため、リポソームが組織に適用されると、リポソーム二重層は、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物が細胞内に送達され、細胞内ではｉＲＮＡが、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ｉＲＮＡを特定の細胞型に導くように、特異的に標的される。
ｉＲＮＡを含有するリポソームは、種々の方法によって調製することができる。
一例では、リポソームの脂質成分を界面活性剤に溶解させて、脂質成分でミセルを形成させる。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであることができる。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な界面活性剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。ｉＲＮＡ調製物を、次に、脂質成分を含むミセルに添加する。脂質上のカチオン基は、ｉＲＮＡと相互作用し、ｉＲＮＡの周囲で凝縮して、リポソームを形成する。凝縮後、界面活性剤を、例えば、透析によって除去して、ｉＲＮＡのリポソーム調製物を得る。
必要であれば、凝縮を助長する担体化合物を、例えば、制御された添加によって、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であることができる。凝縮に有利に働くようにｐＨを調整することもできる。
送達ビヒクルの構造的成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み入れる安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを産生する方法のさらなる説明は、例えば、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。リポソーム形成はまた、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３-７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍら Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎら Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗら Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍら Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａら Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載されている例示的な方法の１つ以上の態様を含むことができる。送達ビヒクルとして使用されるのに適当なサイズの脂質凝集体を調製するための、一般的に使用される手法としては、超音波処理および凍結融解と押出し成形が挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒら Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６参照）。微小流動化は、一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）かつ比較的均一な凝集体が望ましい場合に使用することができる（Ｍａｙｈｅｗら Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、ｉＲＮＡ調製物をリポソームにパッケージングするように容易に適合される。
ｐＨ感受性であるかまたは負に荷電しているリポソームは、核酸分子と複合体形成するのではなく、核酸分子を閉じ込める。核酸分子と脂質の両方が同様に荷電しているため、複合体形成ではなく反発が起きる。それにもかからず、いくつかの核酸分子は、これらのリポソームの水性内部に閉じ込められる。ｐＨ感受性のリポソームは、培養中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するのに使用されている。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕら Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２） ２６９－２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要なタイプとして、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成させることができる。アニオン性リポソーム組成物は、通常、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対して、アニオン性融合性リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
リポソームをインビトロおよびインビボで細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット； Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、形質膜とは効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージにより取り込まれ、ｉＲＮＡをマクロファージに送達するのに使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては、天然リン脂質から得られるリポソームが、生体適合性かつ生体分解性であること、リポソームが広範囲の水溶性および脂溶性薬物を取り込むことができること、リポソームが、リポソーム内部のコンパートメント中に封入されたｉＲＮＡを代謝および分解から保護することが挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ、およびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，第１巻，ｐ２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
正に荷電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に荷電した脂質と融合し、その結果ｉＲＮＡの送達をもたらすことができる脂質－核酸複合体を形成する小さいリポソームを形成するのに使用することができる（例えば、ＤＯＴＭＡおよびＤＮＡとのその使用の説明に関して、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書参照）。
ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体形成する小胞を形成することができる。リポフェクチン（商標）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に荷電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する、正に荷電したＤＯＴＭＡリポソームを含む、高度にアニオン性の核酸を、生きた組織培養細胞内に送達するための有効な作用物質である。十分に正に荷電したリポソームが使用されると、得られた複合体上の正味の電荷もまた正である。このようにして調製される正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に自発的に結合して、形質膜と融合し、例えば、組織培養細胞内に機能的核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなくエステルによって結合されているという点でＤＯＴＭＡと異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物としては、例えば、２種類の脂質のうちの１つにコンジュゲートされており、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（トランスフェクタム（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミルアミド（「ＤＰＰＥＳ」）のような化合物を含むカルボキシスペルミンを含む種々の部分にコンジュゲートされているものが挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書参照）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートとしては、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に製剤化されているコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体化が挙げられる（Ｇａｏ，Ｘ．およびＨｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１参照）。ＤＯＰＥにポリリジンをコンジュゲートさせることによって作製されるリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株に関して、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを提供すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびリポフェクトアミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を提示する。このような利点としては、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増大、および皮膚にｉＲＮＡを投与する能力が挙げられる。いくつかの実施では、リポソームは、上皮細胞にｉＲＮＡを送達するために、また真皮組織（例えば、皮膚）へのｉＲＮＡの浸透を増強するためにも使用される。例えば、リポソームは、局所に適用することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所送達については、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，第２巻，４０５-４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８， １９９２，２５９-２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．およびＦｏｕｌｄ-Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２-６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ら Ｇｅｎｅ ５６：２６７-２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７-１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２-５２７，１９８３； Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．およびＨｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１-７８５５，１９８７参照）。
非イオン性リポソーム系もまた、特に非イオン性サーファクタントおよびコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達におけるこれらのリポソーム系の有用性を決定するために検討されている。ノバソーム（登録商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびノバソーム（登録商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤は、マウス皮膚の真皮に薬物を送達するのに使用された。ｉＲＮＡを含むこのような製剤は、皮膚の障害を治療するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能とすることができる。このような変形能は、リポソームが、リポソームの平均半径よりも小さな孔を通って浸透することを可能とすることができる。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソームは、表面縁活性化因子（通常、サーファクタント）を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ｉＲＮＡを含むトランスファーソームは、例えば、皮膚内のケラチノサイトにｉＲＮＡを送達するために皮下注射によって送達することができる。無傷の哺乳類皮膚を横断するためには、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、各々直径５０ｎｍ未満の一連の微細孔を通って通過しなければならない。さらに、脂質の特性のために、これらのトランスファーソームは、自己最適化性（例えば、皮膚内で、孔の形状に適応すること）、自己修復性であり得るとともに、多くの場合断片化することなく標的に到達することができ、自己装填性であり得ることが多い。
サーファクタント
説明しやすくするために、本項での製剤、組成物、および方法を、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。サーファクタントは、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム（上記を参照）のような製剤において幅広い用途を見出す。ｉＲＮＡ（または前駆体、例えば、ｉＲＮＡへプロセシングされ得るより大きなｄｓ ｉＲＮＡ、もしくはｉＲＮＡもしくは前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物が、サーファクタントを含むことができる。一実施形態では、ｉＲＮＡは、サーファクタントを含むエマルジョンとして製剤化される。多くの異なるタイプのサーファクタント（天然および合成の両方）の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤中で使用される異なるサーファクタントを類別するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
サーファクタント分子がイオン化されない場合は、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、薬学的製品において幅広い用途を見出しており、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて、２～約１８の範囲である。非イオン性サーファクタントとしては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル（例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマー）もまた、この部類に含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタント類のうち最も一般的なものである。
水に溶解または分散させたときに、負電荷を持つ場合、サーファクタント分子はアニオン性として分類される。アニオン性サーファクタントとしては、カルボキシレート（例えば、石鹸）、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル（例えば、アルキルサルフェートおよびエトキシル化アルキルサルフェート）、スルホネート（例えば、アルキルベンゼンスルホネート）、アシルイセチオネート、アシルタウレート、およびスルホスクシネート、ならびにホスフェートが挙げられる。アニオン性サーファクタント類のうち最も重要なものは、アルキルサルフェートおよび石鹸である。
水に溶解または分散させたときに、正電荷を持つ場合、サーファクタント分子はカチオン性として分類される。カチオン性サーファクタントとしては、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、この部類のうちで最もよく使用されるものである。
サーファクタント分子が正または負のいずれかの電荷を持つ能力を有する場合、このサーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントとしては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、およびホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤、およびエマルジョン中でのサーファクタントの使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
ミセルおよび他の膜状製剤
説明しやすくするために、本項でのミセルならびに他の製剤、組成物、および方法は、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらのミセルおよび他の製剤、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物は、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、本明細書では、両親媒性分子の疎水性部分の全てが内側に向き、親水性部分が周囲の水相と接触するように両親媒性分子が球状構造に配置される、特定の種類の分子集合体として定義される。反対の配置は、環境が疎水性である場合に存在する。
経皮膜を通した送達に好適な混合ミセル製剤は、ｉＲＮＡ組成物の水溶液と、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキルサルフェートと、ミセル形成化合物とを混合することにより調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびそれらの薬学的に許容される塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびそれらの類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコレート、デオキシコレート、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキルサルフェートの添加と同時か、または添加後に添加され得る。混合ミセルは、成分の実質的に全ての種類の混合によって形成するが、より小さなサイズのミセルを提供するためには激しい混合によって形成する。
一方法では、ｉＲＮＡ組成物および少なくともアルカリ金属アルキルサルフェートを含有する第１のミセル組成物を調製する。次に、この第１のミセル組成物を、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合して、混合ミセル組成物を形成させる。別の方法では、ミセル混合物を、ｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属アルキルサルフェートと少なくとも１つのミセル形成化合物とを混合し、次いで激しく混合しながら、残りのミセル形成化合物を添加することによって調製する。
フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定化し、かつ細菌増殖に対して保護してもよい。あるいは、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールをミセル形成成分とともに添加してもよい。グリセリンのような等張剤も、混合ミセル組成物の形成後に添加してもよい。
ミセル製剤を噴霧剤として送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーに噴射剤を充填する。加圧下にある噴射剤は、ディスペンサー中では液体形態である。水相と噴射剤相が１つになるように、すなわち、１つの相が存在するように、成分の比を合わせる。２つの相が存在する場合、例えば、定量弁を通して内容物の一部を投薬する前に、ディスペンサーを振盪させる必要がある。投薬用量の医薬品は、微細噴霧剤となって定量弁から噴射される。
噴射剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを挙げることができる。ある実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２－テトラフルオロエタン）が使用され得る。
必須成分の特定濃度は、比較的直接的な実験により決定することができる。口腔からの吸収のためには、投薬量を、注射による投与または消化管を介した投与についての投薬量の、例えば、少なくとも２倍または３倍に増大させることが望ましい場合が多い。
粒子
説明しやすくするために、本項での粒子、製剤、組成物、および方法は、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの粒子、製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、粒子（例えば、微粒子）に組み込まれ得る。微粒子は、噴霧乾燥によって産生することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技法の組合せを含む他の方法によって産生してもよい。さらなる説明については、以下を参照されたい。
持続放出性製剤。本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、制御放出（例えば、徐放）用に製剤化することができる。制御放出は、その放出を遅らせる構造または物質内にｉＲＮＡを配置することによって達成することができる。例えば、ｉＲＮＡは、多孔質マトリックス内に、または浸食性マトリックス中に配置することができ、これらのいずれも長期間にわたるｉＲＮＡの放出を可能にする。
ポリマー粒子（例えば、ポリマー微粒子）は、生分解によって微粒子から放出されたときのみ細胞によって取り込まれる、ｉＲＮＡの持続放出性リザーバとして使用することができる。したがって、この実施形態におけるポリマー粒子は、食作用を防止するほど十分大きく（例えば、１０μｍより大きく、または２０μｍより大きく）あるべきである。このような粒子は、より小さな粒子を作製するのと同じ方法であるが、第１のエマルジョンと第２のエマルジョンをあまり激しく混合しない方法によって産生することができる。すなわち、ホモジナイゼーション速度、ボルテックス混合速度、または超音波処理設定をより低く用いて、１０μｍではなく直径およそ１００μｍの粒子を得ることができる。混合の時間を変更することもできる。
より大きな微粒子は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、もしくは腹腔内注射によって、吸入（鼻内または肺内）によって、経口的に、または移植によって送達されるように、懸濁液、粉末、または植え込み可能な固体として製剤化することができる。これらの粒子は、比較的長期間にわたる徐放が望ましい場合に、任意のｉＲＮＡの送達に有用である。分解速度、したがって放出速度は、ポリマー製剤によって異なる。
微粒子は、液体懸濁媒体が微粒子境界を自由に浸透または灌流するのを可能にする孔、空隙、くぼみ、欠損部、または他の隙間空間を含み得る。例えば、有孔の微細構造を用いて、くぼみのある多孔質噴霧乾燥ミクロスフェアを形成することができる。
ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含有するポリマー粒子は、例えば、二重エマルジョン技法を用いて作製することができる。まず、ポリマーを有機溶媒に溶解させる。ポリマーは、乳酸／グリコール酸の重量比が６５：３５、５０：５０または７５：２５の乳酸／グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）であってもよい。次に、水溶液に懸濁させた核酸の試料をこのポリマー溶液に添加して２つの溶液を混合し、第１のエマルジョンを形成させる。これらの溶液は、ボルテックスまたは振盪によって混合することができ、混合物を超音波処理することができる。核酸が受けるニック形成、剪断、または分解という形態の損傷が最少量である一方、依然として適切なエマルジョンの形成を可能にする、任意の方法が可能である。例えば、許容される結果は、１／８インチのマイクロチッププローブを備えたＶｉｂｒａ－ｃｅｌｌモデルＶＣ－２５０ソニケーターにより、設定＃３で得ることができる。
噴霧乾燥
ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、噴霧乾燥によって調製することができる。噴霧乾燥したｉＲＮＡを、対象に投与するか、またはさらなる製剤化に供することができる。ｉＲＮＡの薬学的組成物は、分散可能な粉末状組成物（例えば、薬学的組成物）を提供するのに十分な条件下で、ｉＲＮＡを含む均質な水性混合物を噴霧乾燥することによって調製することができる。噴霧乾燥用の材料は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または分散性を増強する量の生理学的に許容される水溶性タンパク質を含むこともできる。噴霧乾燥した製品は、ｉＲＮＡを含む分散可能な粉末であることができる。
噴霧乾燥とは、液体材料またはスラリー材料を乾燥した微粒子形態に変換するプロセスのことである。噴霧乾燥は、吸入を含むさまざまな投与経路用の粉末材料を提供するのに使用することができる。例えば、Ｍ．ＳａｃｃｈｅｔｔｉおよびＭ．Ｍ．Ｖａｎ Ｏｏｒｔ：Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ａｅｒｏｓｏｌｓ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ編 Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋａｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６を参照されたい。
噴霧乾燥は、液滴の微細ミストを形成するために溶液、エマルジョン、または懸濁液を噴霧化することと、液滴を乾燥させることとを含むことができる。ミストを乾燥用チャンバ（例えば、容器、タンク、チューブまたはコイル）内へ発射することができ、このチャンバ内でミストが乾燥用ガスに接触する。ミストは、固体または液体の細孔形成剤を含むことができる。溶媒および細孔形成剤は、液滴から蒸発して乾燥用ガスになり、液滴を固化させ、同時に固体全体に細孔を形成させる。その後、この固体（典型的には粉末状粒子形態）を乾燥用ガスから分離し、回収する。
噴霧乾燥は、高度に分散された液体および十分な容量の空気（例えば、熱空気）を一緒にして、液体小滴の蒸発と乾燥をもたらすことを含む。噴霧乾燥されるべき調製物は、任意の溶液、当然、懸濁液、スラリー、コロイド分散液、または選択した噴霧乾燥装置を用いて噴霧化され得るペーストであることができる。典型的には、供給物は、溶媒を蒸発させて乾燥産物を回収器に運搬する温かい濾過気流中に噴霧される。次に、使用済み空気は溶媒とともに排出される。いくつかの異なるタイプの装置を用いて、所望の産物を提供することができる。例えば、Ｂｕｃｈｉ社またはＮｉｐｒｏ社により製造される市販の噴霧乾燥機は、所望のサイズの粒子を効率的に産生することができる。
噴霧乾燥した粉末状粒子は、形状がほぼ球状であり、サイズがほぼ均一であり、多くの場合くぼみがあり得る。組み込まれる医薬品および噴霧乾燥条件に応じて、ある程度の不規則性が存在し得る。多くの場合、噴霧乾燥したミクロスフェアの分散安定性は、これらのミクロスフェアの産生において膨張剤（または発泡剤）を使用するとより有効であるようである。ある実施形態は、分散相または連続相（他方の相は、水性の性質である）として膨張剤を有するエマルジョンを含み得る。膨張剤は、サーファクタント溶液を用いて、例えば、約５，０００～１５，０００ｐｓｉの圧力で市販の微小流動化装置を用いて分散させる。このプロセスによってエマルジョンが形成されるが、このエマルジョンは、典型的には、水性連続相に分散した水不混和性発泡剤のサブミクロンの液滴を含む、組み込まれたサーファクタントによって安定化され得る。この技法および他の技法を用いたこのような分散液の形成は一般的であり、当業者に周知である。発泡剤は、噴霧乾燥プロセスの間に気化して、通常くぼみのある多孔質の空気力学的に軽いミクロスフェアが残る、フッ素化化合物（例えば、パーフルオロヘキサン、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロデカリン、パーフルオロブチルエタン）であり得る。以下により詳細に論じるように、他の好適な発泡剤としては、クロロホルム、フレオン、および炭化水素が挙げられる。窒素ガスおよび二酸化炭素もまた、好適な発泡剤として企図される。
有孔の微細構造は、上記のように発泡剤を用いて形成され得るが、場合によっては、発泡剤を必要とせず、医薬品およびサーファクタントの水性分散液が直接噴霧乾燥されることが理解されよう。このような場合、製剤は、くぼみのある比較的多孔質の微粒子の形成を概して導くようなプロセス条件（例えば、温度の上昇）を受け入れる余地がある。さらに、医薬品は、このような技法で使用されるのに特に好適な特殊な物理化学的特性（例えば、高い結晶性、高い融解温度、界面活性等）を保有し得る。
有孔の微細構造は、任意で、１つ以上のサーファクタントと関連してもよいし、または１つ以上のサーファクタントを含んでもよい。さらに、混和性サーファクタントを、任意で懸濁媒体の液体相と組み合わせてもよい。サーファクタントの使用は、さらに分散安定性を増大させ得るか、製剤化の手順を簡素化し得るか、または投与時の生体利用性を増大させ得ることが当業者に理解されよう。当然、サーファクタントの組合せは、液体相中の１つ以上のサーファクタントと、有孔の微細構造と関連した１つ以上のサーファクタントの使用を含めて、本発明の範囲内であることが企図される。「～と関連する、または～を含む」とは、構造マトリックスまたは有孔の微細構造が、サーファクタントを組み込み得るか、サーファクタントを吸着し得るか、サーファクタントを吸収し得るか、サーファクタントでコーティングされ得るか、またはサーファクタントによって形成され得ることを意味する。
使用に好適なサーファクタントとしては、構造マトリックスと懸濁媒体との間の界面で層を形成することにより、安定化された呼吸用分散液の形成と維持を助長する任意の化合物または組成物が挙げられる。サーファクタントは、単一の化合物または（例えば、コサーファクタントの場合のように）化合物の任意の組合せを含んでもよい。特に、ある種のサーファクタントは、噴射剤中で実質的に不溶性であり、フッ素化されておらず、飽和脂質および不飽和脂質、非イオン性界面活性剤、非イオン性ブロックコポリマー、イオン性サーファクタント、ならびにこのような作用物質の組合せからなる群より選択される。上述のサーファクタントに加えて、好適な（すなわち、生体適合性の）フッ素化サーファクタントが、本明細書中の教示と適合し、所望の安定化された調製物を提供するのに使用され得ることが強調されてもよい。
天然と合成の両方の供給源に由来するリン脂質を含む脂質は、さまざまな濃度で使用されて、構造的マトリックスを形成し得る。通常、適合性の脂質は、ゲルから液晶への相転移が約４０℃より高いものを含む。ある実施形態では、組み込まれる脂質は、比較的長い鎖（すなわち、Ｃ６－Ｃ２２）の飽和脂質であり、リン脂質を含み得る。開示される安定化された調製物において有用な例示的なリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、短鎖ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、糖脂質、ガングリオシドＧＭ１、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ポリマー鎖（例えば、ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸、またはポリビニルピロリドン）を持つ脂質、スルホン化された単糖、二糖、および多糖を持つ脂質、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびオレイン酸）、コレステロール、コレステロールエステル、ならびにコレステロールヘミスクシネートを含む。それらの優れた生体適合性のために、リン脂質、およびリン脂質とポロキサマーの組合せは、本明細書に開示される安定化された分散液での使用に特に好適である。
適合性の非イオン性界面活性剤は、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎｓ（商標）８５）、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを含むソルビタンエステル、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル、グリセロールエステル、ならびにスクロースエステルを含む。他の好適な非イオン性界面活性剤は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ（ＭｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ）を用いて容易に特定することができる。特定のブロックコポリマーとしては、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのジブロックコポリマーおよびトリブロックコポリマー（ポロキサマー１８８（プルロニック（登録商標）Ｆ６８）、ポロキサマー４０７（プルロニック（登録商標）Ｆ－１２７）、およびポロキサマー３３８を含む）が挙げられる。イオン性サーファクタント（例えば、スルホコハク酸ナトリウム）および脂肪酸石鹸も利用し得る。ある実施形態では、微細構造は、オレイン酸またはそのアルカリ塩を含んでもよい。
上述のサーファクタントに加えて、カチオン性のサーファクタントまたは脂質は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の送達の場合に特に使用され得る。好適なカチオン性脂質の例としては、ＤＯＴＭＡ、すなわちＮ－［－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＴＡＰ、すなわち１，２－ジオレイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン、およびＤＯＴＢ（１，２－ジオレイル－３－（４’－トリメチルアンモニオ）ブタノイル－ｓｎ－グリセロール）が挙げられる。ポリカチオン性アミノ酸（例えば、ポリリジン）、およびポリアルギニンも企図される。
噴霧プロセスに関して、回転噴霧化、圧力噴霧化、および二液噴霧化のような噴霧方法を使用することができる。これらのプロセスで使用される装置の例としては、Ｙａｍａｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製の「Ｐａｒｕｂｉｓ[音声レンダリング]ミニスプレー ＧＡ－３２」および「Ｐａｒｕｂｉｓスプレードライヤー ＤＬ－４１」が挙げられ、またはＯｋａｗａｒａ Ｋａｋｏｋｉ社製の「スプレードライヤー ＣＬ－８」、「スプレードライヤー Ｌ－８」、「スプレードライヤー ＦＬ－１２」、「スプレードライヤー ＦＬ－１６」または「スプレードライヤー ＦＬ－２０」を、回転円板噴霧器を用いた噴霧方法に使用することができる。
噴霧された材料を乾燥させるのに使用するガスに関して、特に制限は課せられないが、空気、窒素ガスまたは不活性ガスを使用することが推奨される。噴霧された材料を乾燥させるのに使用するガスの入口の温度は、噴霧された材料の熱失活を引き起こさないような温度である。温度範囲は、約５０℃～約２００℃、例えば、約５０℃～１００℃で変動し得る。噴霧された材料を乾燥させるのに使用されるガスの出口の温度は、約０℃～約１５０℃、例えば、０℃～９０℃、例えば、０℃～６０℃で変動し得る。
噴霧乾燥は、呼吸に適した粒子サイズ、低水分含有量、およびすぐにエアロゾル化可能な流体特性を有する、均質な構成の実質的に非晶質の粉末を生じる条件下でなされる。場合によっては、得られる粉末の粒子サイズは、約９８％を上回る塊が約１０μｍ以下の直径を有する粒子となり、約９０％の塊が、５μｍ未満の直径を有する粒子となる。あるいは、約９５％の塊が直径１０μｍ未満の粒子を有し、約８０％の粒子塊が５μｍ未満の直径を有する。
ｉＲＮＡ調製物を含む医薬品ベースの分散性乾燥粉末は、呼吸器投与および肺投与に好適な薬学的担体または賦形剤と任意に組み合わせてもよい。このような担体は、患者に送達される粉末中のｉＲＮＡ濃度を低下させることが望ましい場合には単に増量剤としての役割を果たし得るが、ｉＲＮＡのより効率的かつ再現性のある送達を提供し、かつ製造および粉末充填を容易にするための流動性および粘稠度のようなｉＲＮＡの取扱い上の特性を改善するために、ｉＲＮＡ組成物の安定性を増強し、かつ粉末分散装置内の粉末の分散性を改善する役割も果たし得る。
このような担体材料は、噴霧乾燥前に、すなわち、精製バルク溶液に担体材料を添加することによって、薬物と組み合わせてもよい。そのようにして、担体粒子が薬物粒子とともに同時に形成されて、均質な粉末を生じる。あるいは、担体を別個に乾燥粉末形態に調製して、ブレンドすることにより乾燥粉末薬物と組み合わせてもよい。粉末担体は、通常結晶であるが（水吸収を回避するため）、場合によっては、非晶質または結晶と非晶質の混合物であってよい。担体粒子のサイズは、薬物粉末の流動性を改善するように選択してもよく、典型的には、２５μｍ～１００μｍの範囲である。担体材料は、上述の範囲のサイズを有する結晶性ラクトースであってもよい。
上述の方法のいずれかにより調製された粉末は、その後の使用のために従来の様式で噴霧乾燥機から回収される。医薬品および他の目的として使用するために、多くの場合、ふるい分けまたは他の従来の技法によって形成された全ての凝集物を崩壊させることが望ましい。薬学的用途に関しては、乾燥粉末製剤は、通常測り取って単回用量とされ、この単回用量がパッケージに密封される。このようなパッケージは、以下に詳述するように、乾燥粉末吸入器中での分散に特に有用である。あるいは、粉末は、多数回用量用の容器中にパッケージングされてもよい。
疎水性の薬物および成分ならびに他の薬物および成分を噴霧乾燥させる方法は、米国特許第５，０００，８８８号明細書、同第５，０２６，５５０号明細書、同第４，６７０，４１９号明細書、同第４，５４０，６０２号明細書および同第４，４８６，４３５号明細書に記載されている。ＢｌｏｃｈおよびＳｐｅｉｓｏｎ（１９８３）Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ．Ｈｅｌｖ ５８：１４－２２は、ジオキサン－水および２－エトキシエタノール－水の共沸溶媒中でのヒドロクロロチアジドとクロルタリドン（親油性薬物）と親水性アジュバント（ペンタエリスリトール）の噴霧乾燥を教示している。ＪＰ第８０６７６６号、特開平７－２４２５６８号、特開平７－１０１８８４号、特開平７－１０１８８３号、特開平７－１０１８９８２号、特開平７－１０１８８１号、および特開平４－０３６２３３号の各明細書を含む多数の日本国特許出願抄録は、親水性－疎水性産物の組合せの噴霧乾燥に関するものである。親水性－疎水性産物の組合せを噴霧乾燥させることに関連した他の外国特許出願としては、仏国特許出願公開第２５９４６９３号明細書、独国特許出願公開第２２０９４７７号明細書および国際公開第８８／０７８７０号パンフレットが挙げられる。
凍結乾燥
ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、凍結乾燥によって作製することができる。凍結乾燥とは、組成物を凍結させた後に組成物から水を昇華させるフリーズドライプロセスのことである。凍結乾燥プロセスに関連した特定の利点は、水溶液中で比較的不安定な生物製剤および医薬品を、温度上昇を伴わずに乾燥させ（それにより、有害な熱的影響を排除する）、その後、安定性の問題があまり見られない乾燥状態で保管することができることである。本発明に関して、このような技法は、生理活性を弱めることなく核酸を有孔の微細構造に組み込むことと特に適合する。凍結乾燥した微粒子を提供する方法は当技術分野で公知であり、本明細書中の教示に従って分散適合性の微細構造を提供するために過度の実験を必要としないことは明らかであろう。したがって、所望の多孔性およびサイズを有する微細構造を提供するように凍結乾燥プロセスが使用され得る限りは、凍結乾燥プロセスは本明細書中の教示と適合するものであり、本発明の範囲内であることが明示的に企図される。
遺伝子
一態様では、本発明は、本発明のｉＲＮＡ剤の投与の恩恵を受ける可能性がある疾患の危険性があるか、またはこのような疾患に罹患した対象を治療する方法を特色とする。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤を、それを必要とする対象に投与し、それによって、対象を治療する工程を含む。投与されるｉＲＮＡ剤は、治療される疾患によって決まる。
ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、増殖因子遺伝子または増殖因子受容体遺伝子、キナーゼ（例えば、タンパク質チロシンキナーゼ、タンパク質セリンキナーゼ、またはタンパク質スレオニンキナーゼ）遺伝子、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子をサイレンシングする。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＤＧＦβ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＤＧＦβ発現を特徴とする障害（例えば、精巣癌および肺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｅｒｂ－Ｂ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｂ－Ｂ発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｓｒｃ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳｒｃ発現を特徴とする障害（例えば、大腸癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＣＲＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＣＲＫ発現を特徴とする障害（例えば、大腸癌および肺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＧＲＢ２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＧＲＢ２発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＳ発現を特徴とする障害（例えば、膵癌、大腸癌、および肺癌、ならびに慢性白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＥＫＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＥＫＫ発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞癌、黒色腫、または白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＪＮＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＮＫ発現を特徴とする障害（例えば、膵癌または乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＦ発現を特徴とする障害（例えば、肺癌または白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｅｒｋ１／２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｋ１／２発現を特徴とする障害（例えば、肺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＣＮＡ発現を特徴とする障害（例えば、肺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＹＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＹＢ発現を特徴とする障害（例えば、大腸癌または慢性骨髄性白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｃ－ＭＹＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ－ＭＹＣ発現を特徴とする障害（例えば、バーキットリンパ腫または神経芽細胞腫）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＪＵＮ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＵＮ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣癌、前立腺癌、または乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＦＯＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＦＯＳ発現を特徴とする障害（例えば、皮膚癌または前立腺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＢＣＬ－２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＣＬ－２発現を特徴とする障害（例えば、肺癌、前立腺癌、または非ホジキンリンパ腫）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＤ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＤ発現を特徴とする障害（例えば、食道癌および大腸癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＶＥＧＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＶＥＧＦ発現を特徴とする障害（例えば、食道癌および大腸癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＥＧＦＲ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥＧＦＲ発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＡ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＡ発現を特徴とする障害（例えば、肺癌および子宮頸癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＥ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＥ発現を特徴とする障害（例えば、肺癌および乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＷＮＴ－１遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＷＮＴ－１発現を特徴とする障害（例えば、基底細胞癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、β－カテニン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないβ－カテニン発現を特徴とする障害（例えば、腺癌または肝細胞癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｃ－ＭＥＴ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ－ＭＥＴ発現を特徴とする障害（例えば、肝細胞癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＫＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＫＣ発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＮＦＫＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＮＦＫＢ発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＳＴＡＴ３遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳＴＡＴ３発現を特徴とする障害（例えば、前立腺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サバイビン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサバイビン発現を特徴とする障害（例えば、子宮頸癌または膵癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＨｅｒ２／Ｎｅｕ発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、トポイソメラーゼＩ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣癌および大腸癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩＩα発現を特徴とする障害（例えば、乳癌および大腸癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ７３遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ７３発現を特徴とする障害（例えば、結腸直腸腺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）発現を特徴とする障害（例えば、肝癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２７（ＫＩＰ１）発現を特徴とする障害（例えば、肝癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＰＭＩＤ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＰＭＩＤ発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＳ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＳ発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、カベオリンＩ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないカベオリンＩ発現を特徴とする障害（例えば、食道偏平上皮細胞癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＩＢ Ｉ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＩＢ Ｉ発現を特徴とする障害（例えば、男性の乳癌（ＭＢＣ））を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＴＡＩ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＴＡＩ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｍ６８遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭ６８発現を特徴とする障害（例えば、食道、胃、大腸および直腸のヒト腺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、化学療法薬と組み合わせて、アポトーシス活性を促進する方法として使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ５３発現を特徴とする障害（例えば、胆嚢癌、膵癌、および肺癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ５３ファミリーの一員であるＤＮ－ｐ６３における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＤＮ－ｐ６３発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐＲｂ発現を特徴とする障害（例えば、口腔偏平上皮細胞癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＡＰＣ１発現を特徴とする障害（例えば、大腸癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＲＣＡ１発現を特徴とする障害（例えば、乳癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＴＥＮ発現を特徴とする障害（例えば、過誤腫、神経膠腫、前立腺癌、および子宮内膜癌）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＬＬ融合遺伝子（例えば、ＭＬＬ－ＡＦ９）をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＬＬ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、急性白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、急性白血病および慢性白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、小児期急性白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、ユーイング肉腫）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、粘液脂肪肉腫）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、粘液脂肪肉腫）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、急性白血病）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
疾患
血管新生
別の態様では、本発明は、血管新生阻害によって恩恵を受ける可能性がある疾患もしくは障害（例えば、癌）の危険性があるか、またはこのような疾患もしくは障害に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特色とする。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤を、それを必要とする対象に投与し、それによって、対象を治療する工程を含む。投与されるｉＲＮＡ剤は、治療される血管新生関連遺伝子の種類によって決まることとなる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、αｖ－インテグリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないαｖ－インテグリン発現を特徴とする障害（例えば、脳腫瘍または上皮を起源とする腫瘍）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｆｌｔ－１受容体遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＦｌｔ－１受容体発現を特徴とする障害（例えば、癌および関節リウマチ）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、チューブリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないチューブリン発現を特徴とする障害（例えば、癌および網膜新血管形成）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、チューブリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないチューブリン発現を特徴とする障害（例えば、癌および網膜新血管形成）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
ウイルス疾患
また別の態様では、本発明は、ウイルスに感染した対象、またはウイルス感染に関連した障害もしくは疾患の危険性があるか、もしくはこのような障害もしくは疾患に罹患した対象を治療する方法を特色とする。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤を、それを必要とする対象に投与し、それによって、対象を治療する工程を含む。投与されるｉＲＮＡ剤は、治療されるウイルス疾患の種類によって決まる。いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルス遺伝子を標的とし得る。他の実施形態では、核酸は、宿主遺伝子を標的とし得る。
したがって、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した患者、またはＨＰＶによって媒介される障害（例えば、子宮頸癌）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。ＨＰＶは、子宮頸癌の９５％に関係し、したがって抗ウイルス療法は、これらの癌およびウイルス感染の他の症状を治療するための魅力的な方法である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、ＨＰＶ遺伝子は、Ｅ２、Ｅ６またはＥ７の群のうちの１つである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者、またはＨＩＶによって媒介される障害（例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ））の危険性があるか、もしくはこの障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、ＨＩＶ遺伝子は、ＣＣＲ５、ＧａｇまたはＲｅｖである。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、遺伝子はＣＤ４またはＴｓｇ１０１である。
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者、またはＨＢＶによって媒介される障害（例えば、肝硬変および肝細胞癌）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、標的とされるＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶコアタンパク質の尾部領域、プレ－ｃｒｅｇｉｏｕｓ（プレ－ｃ）領域、またはｃｒｅｇｉｏｕｓ（ｃ）領域の群のうちの１つをコードする。別の実施形態では、標的とされるＨＢＶ－ＲＮＡ配列は、ポリ（Ａ）尾部から構成される。ある実施形態では、ＨＢＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に感染した患者、またはＨＡＶによって媒介される障害の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＡＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者、またはＨＣＶによって媒介される障害（例えば、肝硬変）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、ＨＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｆ型肝炎、Ｇ型肝炎、もしくはＨ型肝炎を含む肝炎ウイルス株の群のいずれかに感染した患者、またはこれらの肝炎株のいずれかによって媒介される障害の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ型肝炎遺伝子、Ｅ型肝炎遺伝子、Ｆ型肝炎遺伝子、Ｇ型肝炎遺伝子、もしくはＨ型肝炎遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｆ型肝炎、Ｇ型肝炎、もしくはＨ型肝炎の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した患者、またはＲＳＶによって媒介される障害（例えば、乳児の下気道感染および小児喘息、例えば、高齢者の肺炎および他の合併症）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、標的とされるＨＢＶ遺伝子は、遺伝子Ｎ、ＬまたはＰの群のうちの１つをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に感染した患者、またはＨＳＶによって媒介される障害（例えば、陰部ヘルペスおよび単純疱疹ならびに主として免疫低下状態の患者における生命に関わる疾患もしくは視覚障害をもたらす疾患）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、標的とされるＨＳＶ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼまたはヘリカーゼ－プライマーゼをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、ヘルペスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染した患者、またはＣＭＶによって媒介される障害（例えば、先天性ウイルス感染および免疫不全状態の患者にの病的状態）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、ヘルペスエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に感染した患者、またはＥＢＶによって媒介される障害（例えば、ＮＫ／Ｔ－細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびホジキン病）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）（ヒトヘルペスウイルス８型とも呼ばれる）に感染した患者、またはＫＳＨＶによって媒介される障害（例えば、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、およびＡＩＤＳ関連原発性滲出液リンパ腫）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ＫＳＨＶ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＫＳＨＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）に感染した患者、またはこのウイルスに関連した疾患または障害（例えば、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ））を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＪＣＶ遺伝子の発現を低下させる。ある実施形態では、ＪＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、ミクソウイルスに感染した患者、またはミクソウイルスによって媒介される障害（例えば、インフルエンザ）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ミクソウイルス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ミクソウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、ライノウイルスに感染した患者、またはライノウイルスによって媒介される障害（例えば、風邪）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ライノウイルス遺伝子の発現を低下させる。ある実施形態では、ライノウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、コロナウイルスに感染した患者、またはコロナウイルスによって媒介される障害（例えば、風邪）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、コロナウイルス遺伝子の発現を低下させる。ある実施形態では、コロナウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、フラビウイルスである西ナイルウイルスに感染した患者、または西ナイルウイルスによって媒介される障害の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、西ナイルウイルス遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、西ナイルウイルス遺伝子は、Ｅ、ＮＳ３、またはＮＳ５を含む群のうちの１つである。いくつかの実施形態では、西ナイルウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、セントルイス脳炎フラビウイルスに感染した患者、またはこのウイルスに関連した障害もしくは疾患（例えば、ウイルス性出血熱または神経学的疾患）の危険性があるか、もしくはこのような障害もしくは疾患に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、セントルイス脳炎遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、セントルイス脳炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、ダニ媒介性脳炎フラビウイルスにより感染した患者、またはダニ媒介性脳炎ウイルスによって媒介される障害（例えば、ウイルス性出血熱および神経学的疾患）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ダニ媒介性脳炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、ウイルス性出血熱および神経学的疾患を一般に引き起こすマレー渓谷脳炎フラビウイルスに感染した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、マレー渓谷脳炎ウイルス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、マレー渓谷脳炎ウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、デング熱フラビウイルスに感染した患者、またはこのウイルスに関連した疾患もしくは障害（例えば、デング出血熱）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、デング熱ウイルス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、デング熱ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に感染した患者、またはＳＶ４０によって媒介される障害（例えば、腫瘍形成）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、ヒトＴ細胞白血球ウイルス（ＨＴＬＶ）に感染した患者、またはこのウイルスに関連した疾患または障害（例えば、白血病およびミエロパシー）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＨＴＬＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、ＨＴＶＬ１遺伝子は、Ｔａｘ転写活性化因子である。いくつかの実施形態では、ＨＴＬＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭｕＬＶ）に感染した患者、またはＭｏ－ＭｕＬＶによって媒介される障害（例えば、Ｔ細胞白血病）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、Ｍｏ－ＭｕＬＶ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、Ｍｏ－ＭｕＬＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に感染した患者、またはＥＭＣＶによって媒介される障害（例えば、心筋炎）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。ＥＭＣＶは、マウスおよびブタにおいて心筋炎を引き起こし、ヒト心筋細胞に感染することができる。したがって、このウイルスは、異種移植を受けた患者に関する心配事である。いくつかの実施形態では、ＥＭＣＶ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＥＭＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、麻疹ウイルス（ＭＶ）に感染した患者、ＭＶによって媒介される障害（例えば、麻疹）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＭＶ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＭＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に感染した患者、またはＶＺＶによって媒介される障害（例えば、水疱瘡または帯状ヘルペス（帯状疱疹とも呼ばれる））の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＶＺＶ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＶＺＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、アデノウイルスに感染した患者、またはアデノウイルスによって媒介される障害（例えば、気道感染）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、アデノウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に感染した患者、またはＹＦＶによって媒介される障害（例えば、気道感染）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＹＦＶ遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、遺伝子は、Ｅ、ＮＳ２Ａ、またはＮＳ３遺伝子を含む群のうちの１つであってもよい。いくつかの実施形態では、ＹＦＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、ポリオウイルスに感染した患者、またはポリオウイルスによって媒介される障害（例えば、ポリオ）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ポリオウイルス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ポリオウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明の方法はまた、ポックスウイルスに感染した患者、またはポックスウイルスによって媒介される障害（例えば、天然痘）の危険性があるか、もしくはこのような障害に罹患した患者を治療することを提供する。いくつかの実施形態では、ポックスウイルス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ポックスウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
他の病原体
別の態様では、本発明は、病原体（例えば、細菌性、アメーバ性、寄生性、または真菌性の病原体）に感染した対象を治療する方法を特色とする。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤を、それを必要とする対象に投与し、それによって、対象を治療する工程を含む。投与されるｉＲＮＡ剤は、治療される病原体の種類によって決まる。いくつかの実施形態では、核酸は、病原体遺伝子を標的とし得る。他の実施形態では、核酸は、宿主遺伝子を標的とし得る。
標的遺伝子は、増殖、細胞壁合成、タンパク質合成、転写、エネルギー代謝（例えば、クレブス回路）、または毒素産生に関与するものであることができる。
したがって、本発明は、マラリアを引き起こすマラリア原虫に感染した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、マラリア原虫遺伝子の発現を低下させる。別の実施形態では、遺伝子は、頂端膜抗原１（ＡＭＡ１）である。いくつかの実施形態では、マラリア原虫の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、ブルーリ潰瘍）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランス遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、結核）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ヒト結核菌遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ヒト結核菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、癩病）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、癩菌遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、癩菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、細菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、皮膚および粘膜の感染）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、細菌である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、肺炎または小児期下気道感染）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、細菌である化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、連鎖球菌性咽頭炎または猩紅熱）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、化膿連鎖球菌遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、化膿連鎖球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、細菌である肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、肺炎または小児期下気道感染）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、肺炎クラミジア遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、肺炎クラミジアの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
本発明はまた、細菌である肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、またはこの病原体に関連した疾患もしくは障害（例えば、肺炎または小児期下気道感染）を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、肺炎マイコプラズマ遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、肺炎マイコプラズマの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現を低下させる。
免疫障害
一態様では、本発明は、望ましくない免疫応答を特徴とする疾患もしくは障害（例えば、炎症性の疾患もしくは障害、もしくは自己免疫性の疾患もしくは障害）の危険性があるか、またはこのような疾患もしくは障害に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特色とする。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤を、それを必要とする対象に投与し、それによって、対象を治療する工程を含む。投与されるｉＲＮＡ剤は、治療される免疫障害の種類によって決まる。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、虚血または再灌流傷害、例えば、急性心筋梗塞、不安定狭心症、心肺バイパス、外科的介入（例えば、血管形成術（例えば、経皮的経管的冠状動脈形成術））、移植された臓器もしくは組織（例えば、移植された心臓組織または血管組織）に対する応答、または血栓溶解に伴う虚血または再灌流傷害である。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、再狭窄、例えば、外科的介入（例えば、血管形成術（例えば、経皮的経管的冠状動脈形成術））に伴う再狭窄である。
ある実施形態では、疾患または障害は、炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
ある実施形態では、疾患または障害は、感染または傷害に伴う炎症である。
ある実施形態では、疾患または障害は、喘息、狼瘡、多発性硬化症、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、関節炎（例えば、関節リウマチまたは乾癬性関節炎）である。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、インテグリンまたはその共リガンド、例えば、ＶＬＡ４、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭをサイレンシングする。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、セレクチンまたはその共リガンド、例えば、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン（ＥＬＡＭ）、Ｉ－セレクチン、Ｐ－セレクチン糖タンパク質－１（ＰＳＧＬ－１）をサイレンシングする。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、補体系の構成成分、例えば、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ３ａＲ、Ｃ５ａＲ、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ５コンバターゼをサイレンシングする。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ケモカインまたはその受容体、例えば、ＴＮＦＩ、ＴＮＦＪ、ＩＬ－１Ｉ、ＩＬ－１Ｊ、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＩｇＥ、ＳＣＹＡ１１、ＣＣＲ３をサイレンシングする。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＧＣＳＦ、Ｇｒｏ１、Ｇｒｏ２、Ｇｒｏ３、ＰＦ４、ＭＩＧ、プロ血小板塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）、ＭＩＰ－１Ｉ、ＭＩＰ－１Ｊ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＣＭＢＫＲ１、ＣＭＢＫＲ２、ＣＭＢＫＲ３、ＣＭＢＫＲ５、ＡＩＦ－１、Ｉ－３０９をサイレンシングする。
疼痛
一態様では、本発明は、急性疼痛もしくは慢性疼痛の危険性があるか、または急性疼痛または慢性疼痛に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特色とする。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤を、それを必要とする対象に投与し、それによって、対象を治療する工程を含む。投与されるｉＲＮＡ剤は、治療される疼痛の種類によって決まる。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、イオンチャネルの構成成分をサイレンシングする。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、神経伝達物質の受容体またはリガンドをサイレンシングする。
一態様では、本発明は、神経学的な疾患もしくは障害の危険性があるか、または神経学的な疾患もしくは障害に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特色とする。本方法は、ｉＲＮＡが神経学的な疾患または障害を媒介する遺伝子に相同であり、かつこの遺伝子を、例えば、切断によってサイレンシングすることができるｉＲＮＡ剤を提供する工程と、それを対象に投与し、それによって対象を治療する工程とを含む。
神経学的障害
ある実施形態では、疾患または障害は、アルツハイマー病またはパーキンソン病を含む、神経学的障害である。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤を、それを必要とする対象に投与し、それによって、対象を治療する工程を含む。投与されるｉＲＮＡ剤は、治療される神経学的障害の種類によって決まる。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アミロイドファミリー遺伝子（例えば、ＡＰＰ）、プレセニリン遺伝子（例えば、ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２）、またはＩ－シヌクレインをサイレンシングする。
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、神経変性トリヌクレオチドリピート障害（例えば、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、または脊髄小脳失調（例えば、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３（マシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ７、もしくはＳＣＡ８））である。
ある他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＨＤ、ＤＲＰＬＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＭＪＤ１、ＣＡＣＮＬ１Ａ４、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８をサイレンシングする。
ヘテロ接合性の喪失
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）は、ＬＯＨ領域における配列（例えば、遺伝子）にヘミ接合性をもたらし得る。これは、正常細胞と疾患状態の細胞（例えば、癌細胞）との間に重大な遺伝的差異をもたらすことができ、正常細胞と疾患状態の細胞（例えば、癌細胞）との間の有用な差異を提供する。この差異は、遺伝子または他の配列が正倍数体細胞ではヘテロ接合体であるが、ＬＯＨを有する細胞ではヘミ接合体であるために生じ得る。ＬＯＨの領域は、多くの場合、喪失すると望ましくない増殖を促進する遺伝子、例えば、腫瘍抑制遺伝子、および例えば、他の遺伝子（場合によっては、正常に機能（例えば、増殖）するのに必須の遺伝子）を含む他の配列を含む。本発明の方法は、一部には、必須遺伝子の１つの対立遺伝子を本発明のｉＲＮＡ剤で特異的に切断またはサイレンシングすることによる。ｉＲＮＡ剤は、ＬＯＨを有する細胞に見出される必須遺伝子の単一の対立遺伝子を標的にするが、ＬＯＨを示さない細胞に存在する他の対立遺伝子はサイレンシングしないように選択される。実質的に、ｉＲＮＡ剤は２つの対立遺伝子を区別し、選択された対立遺伝子を優先的にサイレンシングする。実質的には、多型（例えば、ＬＯＨによって影響を受ける必須遺伝子のＳＮＰ）は、ＬＯＨを有する細胞（例えば、ＬＯＨを有する癌細胞）を特徴とする障害の標的として使用される。
当業者は、腫瘍抑制遺伝子に近接し、かつ腫瘍抑制遺伝子を含むＬＯＨ領域内にある必須遺伝子を同定することができる。腫瘍抑制遺伝子ｐ５３に近接して位置する遺伝子である、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰＯＬＲ２Ａ）の大サブユニットをコードする遺伝子は、このような遺伝子である。このような遺伝子は、癌細胞でＬＯＨの領域内に存在することが多い。ＬＯＨ領域内に存在し、かつ多くの癌細胞種では失われている他の遺伝子としては、複製タンパク質Ａ７０ｋＤａサブユニット、複製タンパク質Ａ３２－ｋＤａ、リボヌクレオチドレダクターゼ、チミジル酸合成酵素、ＴＡＴＡ関連因子２Ｈ、リボソームタンパク質Ｓ１４、真核生物の開始因子５Ａ、アラニルｔＲＮＡシンセターゼ、システイニルｔＲＮＡシンセターゼ、ＮａＫ ＡＴＰアーゼ、α－１サブユニットおよびトランスフェリン受容体を含む群が挙げられる。
したがって、本発明は、ＬＯＨを特徴とする障害（例えば、癌）を治療する方法を特色とする。本方法は、任意で、ＬＯＨ領域の遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型を決定する工程、正常細胞におけるこの遺伝子の両対立遺伝子の遺伝子型を決定する工程、ＬＯＨ細胞に見出される対立遺伝子を優先的に切断またはサイレンシングするｉＲＮＡ剤を提供する工程、および対象にｉＲＮＡを投与し、それによって、障害を治療する工程を含む。
本発明はまた、本明細書に開示されるｉＲＮＡ剤、例えば、多型遺伝子の１つの対立遺伝子を優先的にサイレンシング（例えば、切断）することができるｉＲＮＡ剤を含む。
別の態様では、本発明は、２つ以上の遺伝子をｉＲＮＡ剤で切断またはサイレンシングする方法を提供する。これらの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２つ以上の遺伝子に見出される配列に十分な相同性を有するように選択される。例えば、配列ＡＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴは、マウスのラミンＢ１、ラミンＢ２、ケラチン複合体２－遺伝子１、およびラミンＡ／Ｃ間で保存されている。したがって、この配列を標的とするｉＲＮＡ剤は、これらの遺伝子集団全体を効率的にサイレンシングするであろう。
本発明はまた、２つ以上の遺伝子をサイレンシングすることができる、本明細書に開示されるｉＲＮＡ剤を含む。
送達経路
説明しやすくするために、本項の製剤、組成物、および方法を、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施することができ、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。ｉＲＮＡを含む組成物は種々の経路で対象に送達され得る。例示的な経路としては、静脈内経路、局所経路、経直腸経路、経肛門経路、経膣経路、経鼻経路、経肺経路、および経眼経路が挙げられる。
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に好適な薬学的組成物中に組み込むことができる。このような組成物は、典型的には、１つ以上のｉＲＮＡと薬学的に許容される担体とを包む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品の投与と適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張な吸収遅延剤などを包むことを意図する。薬学的活性のある物質としてこのような媒体および薬剤を使用することは、当技術分野で周知である。従来の媒体および薬剤がいずれも活性化合物と適合しない場合を除き、組成物に従来の媒体および薬剤を使用することが企図される。また、補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる
本発明の薬学的組成物は、局所治療または全身治療のどちらが所望されるかによって、かつ治療されるべき領域によって、多くの方法で投与され得る。投与は、局所（経眼、経膣、経直腸、経鼻、経皮を含む）、経口、または非経口であってよい。非経口投与としては、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉内注射、または髄腔内投与もしくは脳室内投与が挙げられる。
投与の経路および部位は標的化を増大させるように選択してもよい。例えば、筋細胞を標的とする場合、対象となる筋肉に筋肉内注射することは、論理的な選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形態のｉＲＮＡを投与することによって標的とし得る。血管内皮細胞は、バルーン・カテーテルをｉＲＮＡでコーティングすること、および機械的にＤＮＡを導入することによって標的とすることができる。
局所投与用の製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および粉末剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水溶性基剤、粉末基剤、または油状基剤、増粘剤などが、必要または望ましいものであり得る。コーティングされたコンドーム、グローブなどもまた有用であり得る。
経口投与用の組成物としては、粉末剤または顆粒剤、水中懸濁液または水中溶液、シロップ、エリキシルもしくは非水溶性媒体、錠剤、カプセル、薬用キャンディ、またはトローチが挙げられる。錠剤の場合、使用可能な担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリム、およびリン酸塩が挙げられる。さまざまな崩壊剤（例えば、デンプン）ならびに潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク）が、一般に錠剤に使用される。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水溶性懸濁液が経口使用に必要とされる場合、核酸組成物を乳化剤および懸濁剤と組み合わせることができる。所望される場合、ある種の甘味剤および／または香味剤を添加することができる。
髄腔内投与または脳室内投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。
非経口投与のための製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えば、リザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にされ得る。静脈内使用のために、溶質の総濃度を、調製物が等張となるように制御し得る。
経眼投与については、軟膏または滴下可能な液剤を、アプリケータまたは目薬用容器などの当業者に公知の眼球送達系によって送達してもよい。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリ（ビニルアルコール）などのムコミメティックス（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ソルビン酸、ＥＤＴＡ、または塩化ベンジルクロニウムなどの防腐剤、ならびに通常の分量の希釈剤および／または担体を含むことができる。
局所送達
説明しやすくするために、本項の製剤、組成物、および方法を、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、局所投与を介して対象に送達される。「局所投与」とは、対象の表面に直接製剤を接触させることによって、対象に送達することを指す。局所送達の最も一般的な形態は皮膚に対するものであるが、本明細書に開示される組成物は、体の他の表面（例えば、目、粘膜、体腔の表面、または内部の表面）に対して、直接適用することもできる。
上述のように、最も一般的な局所送達は皮膚に対するものである。この用語は、局所および経皮を含むいくつかの投与経路を包含するが、これらに限定されない。これらの投与の様式は、典型的には、皮膚の透過障壁への浸透および標的組織または標的層への効率的な送達を含む。局所投与は、組成物が表皮および真皮に浸透し、最終的に全身への送達を達成する手段として使用することができる。局所投与は、対象の表皮もしくは真皮に、またはその特定の層に、または下層の組織に、オリゴヌクレオチドを選択的に送達する手段として使用することもできる。
本明細書で使用される場合、「皮膚」という用語は、動物の表皮および／または真皮を指す。哺乳類の皮膚は、２つの主な別個の層からなる。皮膚の外側の層は、表皮と呼ばれる。表皮は、角質層、顆粒層、有棘層、および基底層から構成され、角質層は皮膚の表面にあり、基底層は表皮の最も深い部分にある。表皮は、体の場所に応じて５０μｍ～０．２ｍｍの厚さである。
表皮の下に真皮があり、真皮は表皮よりも著しく厚い。真皮は、主として繊維束形態のコラーゲンから構成されている。このコラーゲン束は、とりわけ、血管、毛細リンパ管、腺、神経終末、および免疫学的に活性のある細胞に対する支えを提供する。
器官としての皮膚の主な機能の１つは、体内への物質の侵入を調節することである。皮膚の主たる透過障壁は、さまざまな分化状態の細胞の多くの層から形成される角質層によって提供される。角質層での細胞間の隙間は、皮膚透過障壁をさらに増強するための密閉を提供する、格子状に配置されたさまざまな脂質で満たされている。
皮膚によって提供される透過障壁は、約７５０Ｄａよりも大きい分子量を有する分子に対しては主として非透過性である。大きい分子が皮膚の透過障壁を通過するためには、通常の浸透以外の機構が使用されなければならない。
いくつかの要因が、投与される薬剤に対する皮膚の透過性を決定付ける。これらの要因としては、治療を受けた皮膚の特性、送達剤の特性、薬物と送達剤および薬物と皮膚の両方の間の相互作用、適用された薬物の投薬量、治療の形態、治療後の投与計画が挙げられる。選択的に表皮および真皮を標的とするために、薬物があらかじめ選択された層へと浸透することを可能にする、１つ以上の浸透促進剤を含む組成物を処方することが可能なこともある。
経皮送達は、脂溶性治療薬の投与に有用な経路である。真皮は、表皮よりも透過性が高く、それゆえに、擦過した皮膚、火傷した皮膚、または剥離した皮膚からの吸収は遥かにより速やかになる。皮膚への血流を増大させる炎症および他の生理条件も、経皮吸収を増強する。この経路からの吸収は、油状ビヒクル（塗油）の使用によって、または１つ以上の浸透促進剤の使用によって増強し得る。経皮経路を介して本明細書に開示される組成物を送達する他の効率的な方法としては、皮膚の水分補給および制御放出型の局所パッチの使用が挙げられる。経皮経路は、全身治療および／または局所治療のための、本明細書中に開示される組成物を送達する潜在的に効率的な手段を提供する。
さらに、イオントフォレーシス（電場の影響下で生体膜を通してイオン性溶質を移動させること）（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６３）、フォノフォレーシス、またはソノフォレーシス（さまざまな治療剤が、生体膜、特に、皮膚および角膜を越えて吸収されるのを増強するために超音波を使用すること）（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６６）、ならびに投薬位置および投与部位での保持に対してビヒクル特性を最適化すること（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６８）は、局所投与される組成物が皮膚および粘膜部位を越えて輸送されるのを増強するための有用な方法であり得る。
提供された組成物および方法は、さまざまなタンパク質および遺伝子の機能を、培養または保存された真皮組織においてインビトロで、および動物において調べるために使用し得る。したがって、本発明は、任意の遺伝子の機能を調べるために適用することができる。本発明の方法は、治療的にまたは予防的に使用することもできる。例えば、乾癬、扁平苔癬、中毒性表皮壊死症、多形性紅斑、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫、パジェット病、カポジ肉腫、肺線維症、ライム病、ならびにウイルス、真菌、および細菌の皮膚感染などの疾患に罹患していることが分かっている動物またはこのような疾患への罹患が疑われる動物の治療のために。
肺送達
説明しやすくするために、本項の製剤、組成物、および方法を、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施することができ、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物は、肺送達によって対象に投与することができる。肺送達組成物は、患者が分散剤を吸入することによって、分散剤中の組成物（例えば、ｉＲＮＡ）が肺に到達し、肺で肺胞領域を通して直接血液循環に容易に吸収され得るように、送達することができる。肺送達は、肺の疾患を治療するために、全身送達と局所送達の両方に効果的であり得る。
肺送達は、噴霧製剤、エアロゾル製剤、ミセル製剤、および乾燥粉末ベースの製剤の使用を含む、さまざまな手法で達成することができる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器、および乾燥粉末分散装置を用いて達成することができる。定量式の装置を使用してもよい。噴霧器または吸入器を使用する利点の１つは、これらの装置が内蔵型であるために汚染の可能性が最小限となることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、容易に乾燥粉末として製剤化され得る薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物は、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末として、単独でまたは好適な粉末担体と組み合わせて安定に保存し得る。吸入用の組成物の送達は、装置内に組み込まれた場合に、エアロゾル医薬品の投与中の、服用量の追跡、服用順守の監視、および／または患者に対する服用の喚起を可能にする、タイマー、用量計測器、時間測定器、または時間表示器などの服用時間計測要素によって仲介されてもよい。
「粉末」という用語は、自由に流動し、かつ吸入装置内で容易に分散することができるとともに、後に対象によって吸入されて肺に到達し、肺胞内に浸透することが可能となる微細分散固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、この粉末は、「呼吸用に適して」いると言える。例えば、平均粒子サイズは、直径約１０μｍ未満で、比較的均一な球状の形に分布している。いくつかの実施形態では、直径約７．５μｍ未満であり、いくつかの実施形態では、約５．０μｍ未満である。通常、粒子サイズ分布は、直径約０．１μｍ～約５μｍであり、約０．３μｍ～約５μｍである場合もある。
「乾燥」という用語は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水分含有量、通常は、約５％ｗ未満、場合によっては、約３％ｗ未満の水分含有量を有することを意味する。乾燥組成物は、エアロゾルを形成するように、粒子が吸入装置内で容易に分散可能なものであり得る。
「治療的有効量」という用語は、期待される生理学的応答を得るために治療すべき対象に所望のレベルの薬物を提供するのに必要とされる、組成物中に存在する量である。
「生理学的に有効な量」という用語は、所望の症状緩和効果または治療効果を得るために対象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、肺に対する重大で有害な毒物学的効果を伴わずに、担体を肺に摂取させることを意味する。
担体として有用な薬学的賦形剤の種類としては、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、充填剤（例えば、糖質、アミノ酸、およびポリペプチド）、ｐＨ調整剤またはｐＨ緩衝剤、塩（例えば、塩化ナトリウム）が挙げられる。これらの担体は、結晶形態でも非晶質形態でもよく、またはこの２つの形態の混合物であってもよい。
特に有用な充填剤としては、適合性の糖質、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適な糖質としては、単糖（例えば、ガラクトース、Ｄ－マンノース、ソルボース）、二糖（例えば、ラクトース、トレハロース）、シクロデキストリン（例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）、および多糖（例えば、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン）、アルジトール（例えば、マンニトール、キシリトール）などが挙げられる。糖質の群としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、およびマンニトールが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニンおよびグリシンが挙げられ、いくつかの実施形態では、グリシンが使用される。
本発明の組成物の微量成分である添加剤は、噴霧乾燥中の立体構造の安定性および粉末の分散性の向上のために含めてもよい。これらの添加剤としては、トリプトファン、チロシン、ロイシン、およびフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸が挙げられる。
好適なｐＨ調整剤またはｐＨ緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの、有機酸および有機塩基から調製される有機塩が挙げられ、いくつかの実施形態では、クエン酸ナトリウムが使用される。
ミセルｉＲＮＡ製剤の経肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル、ならびに他の非ＣＦＣ噴射剤およびＣＦＣ噴射剤などの噴射剤を用いて、定量噴霧装置で達成し得る。
経口または経鼻送達
説明しやすくするために、本項の製剤、組成物、および方法を、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施することができ、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。口腔および鼻腔の膜は両方とも、他の投与経路に優る利点を与える。例えば、これらの膜を通して投与された薬物は、速やかに作用を開始し、治療的血漿レベルを提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、厳しい胃腸（ＧＩ）環境への薬物の曝露を回避する。さらなる利点としては、これらの膜部位に容易に接近することができるので、薬物を簡単に適用し、局在させ、かつ除去することができることが挙げられる。
経口送達では、組成物を、口腔の表面に、例えば、舌下粘膜（舌の腹側表面の膜および口腔底部を含む）または頬の内膜を構成する頬粘膜に対して標的とすることができる。舌下粘膜は比較的透過性が高いため、多くの薬物の速やかな吸収と許容可能な生体利用性を与える。さらに、舌下粘膜は、便利で、許容可能で、かつ容易に接近可能である。
分子が口腔粘膜を通して透過する能力は、分子サイズ、脂溶性、およびペプチドタンパク質のイオン化に関連すると思われる。１，０００ダルトン未満の小さい分子は、速やかに粘膜を横断すると思われる。分子サイズが増加するのにつれて、透過性は急速に減少する。脂溶性の化合物は、脂溶性でない分子よりも透過性が高い。分子がイオン化されていない、または電荷において中性である場合に、最大吸収が生じる。したがって、荷電分子は、口腔粘膜からの吸収にとって最も大きな課題となる。
また、ｉＲＮＡの薬学的組成物は、上記のような混合ミセルの薬学的製剤および噴射剤を、吸入ではなく、定量噴霧ディスペンサーからヒトの口腔内に噴霧することによって、口腔に投与し得る。一実施形態では、薬学的製剤および噴射剤を口腔内に噴霧する前に、ディスペンサーをまず振盪する。
装置
説明しやすくするために、本項の装置、製剤、組成物、および方法は、主として未修飾のｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの装置、製剤、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、かつこのような実施は本発明の範囲内にあることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、例えば、対象に植え込むかまたは別の方法で対象に設置される装置などの装置上または装置内に配置することができる。例示的な装置としては、血管系に導入される装置（例えば、血管組織の内腔に挿入される装置）、またはステント、カテーテル、心臓弁、および他の血管用装置を含む、装置自体が血管の一部を形成する装置が挙げられる。これらの装置（例えば、カテーテルまたはステント）は、肺、心臓、または足の血管に配置することができる。
他の装置としては、血管用装置以外の装置、例えば、腹膜、または臓器もしくは腺組織に植え込まれる装置（例えば、人工臓器）が挙げられる。この装置は、ｉＲＮＡに加えて治療物質を放出することができ、例えば、装置は、インスリンを放出することができる。
他の装置としては、人工関節（例えば、股関節）および他の整形外科用移植片が挙げられる。
一実施形態では、ｉＲＮＡを含む組成物の単位用量または一定用量は、移植装置によって分配される。この装置は、対象内のパラメータをモニターするセンサーを含むことができる。例えば、この装置は、ポンプおよび任意で関連電子機器を含んでもよい。
組織（例えば、細胞または器官）は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を用いてエクスビボで処理し、その後、対象に投与または植え込むことができる。
組織は、自己、同種、または異種の組織であり得る。例えば、組織は、移植片対宿主病を低下させるように処理することができる。他の実施形態では、組織は同種組織であり、その組織における望ましくない遺伝子発現を特徴とする障害を治療するために処理される。例えば、組織、例えば、造血細胞（例えば、骨髄造血細胞）は、望ましくない細胞増殖を阻害するように処理することができる。
自己組織であれ移植組織であれ、処理された組織の導入は、他の治療と組み合わせることができる。
いくつかの実施では、ｉＲＮＡで処理された細胞は、例えば、この細胞が移植片から離れるのを阻止するが、体内の分子がこの細胞に到達するのを可能にし、かつこの細胞によって産生された分子が体内に侵入するのを可能にする半透過性多孔質障壁により、他の細胞から隔離される。一実施形態では、多孔質障壁は、アルギン酸から形成される。
一実施形態では、避妊用具が、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）でコーティングされるか、またはこれらを含有する。例示的な用具としては、コンドーム、ペッサリー、ＩＵＤ（移植可能な子宮内用具）、スポンジ、膣コンドーム、および産児制限用具が挙げられる。一実施形態では、ｉＲＮＡは、精子または卵を不活性化するように選択される。別の実施形態では、ｉＲＮＡは、ウイルスまたは病原体のＲＮＡ（例えば、ＳＴＤ）のＲＮＡに相補的であるように選択される。いくつかの例では、ｉＲＮＡ組成物は、殺精子剤を含むことができる。
投薬量
一態様では、本発明は、対象（例えばヒト対象）に、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤を投与する方法を特色とする。本方法は、単位用量のｉＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ剤であって、（ａ）二本鎖部分が１９～２５ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば、２１～２３ｎｔであり、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内在性標的ＲＮＡまたは病原体標的ＲＮＡ）に相補的であり、かつ任意で（ｃ）少なくとも１つの１～５ヌクレオチド長の３’突出を含むものを投与することを含む。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり１．４ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１ｍｇ未満、および体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば約４．４×１０１６コピー）、または体重１ｋｇ当たり１，５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤である。
規定量は、疾患または障害、例えば、標的ＲＮＡに関連する疾患または障害を、治療または予防するのに有効な量であり得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内または筋肉内）、吸入投与、または局所適用によって投与することができる。いくつかの実施形態では、投薬量は、体重１ｋｇあたり２、１、または０．１ｍｇ未満であってもよい。
いくつかの実施形態では、単位用量は、１日に１回未満の頻度、例えば、２，４，８または３０日毎よりも低い頻度で投与される。別の実施形態では、単位用量は、頻繁には投与されない（例えば、規則正しい頻度では投与されない）。例えば、単位用量は、単回で投与されてもよい。
一実施形態では、有効用量が他の従来の治療モダリティで投与される。一実施形態では、対象はウイルス感染症であり、モダリティは、ｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤）以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、対象はアテローム性動脈硬化症であり、有効用量のｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤）が、組み合わせて、例えば、外科的介入（例えば、血管形成術）の後に投与される。
一実施形態では、対象に、初回用量および１回以上の維持用量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を投与する。維持用量は、通常、初回用量よりも少ない（例えば、初回用量より１／２少ない）。維持投与計画は、対象を、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１．４ｍｇの範囲、例えば、１日に体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇの用量で治療することを含む。維持用量は、例えば、５、１０、または３０日毎に１回しか投与されない。さらに、治療投与計画は、しばらく持続されるが、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態によって変わる。ある実施形態では、投薬は、１日に１回、例えば、２４、３６、４８時間、またはそれを上回る時間に１回、例えば、５または８日毎に１回しか送達されなくてもよい。治療後、患者の状態の変化および疾患状態の症状の緩和について、患者をモニターすることができる。患者が現在の投薬量レベルに対してそれほど応答しない場合、化合物の投薬量を増大させてもよいし、または疾患状態の症状の緩和が認められる場合、疾患状態が除去されている場合、もしくは望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。
有効用量は、特定の状況の下で所望されるか、または適切と考えられるように、単回投与でまたは２回以上の投与で投与することができる。繰り返しの注入または頻繁な注入を容易にすることが望ましい場合には、送達装置（例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、もしくは関節内））またはリザーバを植え込むことが望ましいことがある。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤の薬学的組成物は、複数のｉＲＮＡ剤種を含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤種が、天然に存在する標的配列に関して別のｉＲＮＡ剤種と重複せずかつ隣接しない配列を有する。別の実施形態では、複数のｉＲＮＡ剤種は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は対立遺伝子特異的である。
場合によっては、患者は、ｉＲＮＡ剤を用いて、別の治療モダリティと併せて治療される。例えば、ウイルス疾患、例えば、ＨＩＶ関連疾患（例えば、ＡＩＤＳ）の治療を受けている患者に、ウイルスにとって必須の標的遺伝子に特異的なｉＲＮＡ剤を、公知のウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）と併せて投与し得る。別の例では、他の実施形態では、癌の治療を受けている患者に、腫瘍細胞の増殖に必須の標的に特異的なｉＲＮＡ剤を、化学療法と併せて投与し得る。
治療が成功した後、疾患状態の再発を予防するための維持療法を患者に施すことが望ましく、その場合、本発明の化合物は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇの維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号参照）。
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害を治療もしくは予防するのに、またはヒトにおける生理学的状態を調節するのに十分効果的な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度または量は、このｉＲＮＡ剤および投与方法（例えば、経鼻、口腔内、経肺）に対して決定されたパラメータによって決まる。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激または灼熱感を回避するために、いくつかの成分を遥かに低い濃度にする必要がある傾向にある。好適な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を最大１０～１００倍まで希釈することが望ましい場合もある。
疾患または障害の重症度、過去の治療、対象の全般的な健康状態および／または年齢、ならびに他の疾患の存在を含むが、これらに限定されない、ある種の要因が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投薬量に影響を及ぼす場合がある。さらに、治療的有効量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を用いた対象の治療は、単回治療を包含することができるし、または例えば、一連の治療を含むことができる。また、治療に使用されるｉＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）の有効投薬量を、特定の治療の間に増大させても減少させてもよいことが理解されよう。投薬量の変更は可能であり、本明細書に記載されるような診断アッセイの結果から明らかになり得る。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後に、対象をモニタリングすることができる。モニタリングからの情報に基づいて、追加量ｉＲＮＡ剤組成物を投与することができる。
投薬は、治療されるべき疾患状態の重症度および応答性によって決まり、治療コースは、数日間～数ヶ月間、または治癒がもたらされるかもしくは疾患状態の減少が達成されるまで続けられる。最適な投与スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積量の測定から算出することができる。当業者は、最適な投薬量、投与の方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適の投薬量は、個々の化合物の相対的な効能によって変化し得るものであり、通常、インビトロおよびインビボの動物モデルで有効であることが分かっているＥＣ５０を基に推定することができる。いくつかの実施形態では、動物モデルとして、ヒト遺伝子（例えば、標的ＲＮＡを産生する遺伝子）を発現するトランスジェニック動物が挙げられる。トランスジェニック動物は、対応する内在性ＲＮＡを欠損しているものであることができる。別の実施形態では、試験用の組成物は、少なくとも内部領域においては、動物モデルの標的ＲＮＡとヒトの標的ＲＮＡとの間で保存されている配列と相補的であるｉＲＮＡ剤を含む。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤を、多くの方法で、哺乳類、特に大型哺乳類（例えば、ヒト以外の霊長類またはヒト）に投与することができることを、本発明者らは発見している。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤）組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとしてまたは拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔内、舌下、経内視鏡、経直腸、経口、経膣、局所、経肺、鼻腔内、尿道、または経眼で行われる。投与は、対象者によって、または別の人（例えば、医療提供者）によって行われ得る。医薬品は、一定用量で、または定量を送達するディスペンサー中に提供され得る。選択される送達様式については、以下により詳細に論じる。
本発明は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤を直腸投与または直腸送達するための方法、組成物およびキットを提供する。
したがって、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば、本明細書に記載される治療的有効量のｉＲＮＡ剤、例えば、４０ヌクレオチド未満、例えば、ヌクレオチド３０未満の二本鎖領域を有し、１つまたは２つの１～３ヌクレオチドの一本鎖３’突出を有するｉＲＮＡ剤は、直腸投与（例えば、直腸から下部大腸または上部大腸に導入）することができる。この手法は、炎症性障害、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害、例えば、ポリープまたは大腸癌を治療する際に、特に有用である。
医薬品は、分配装置、例えば、大腸の検査またはポリープの除去に使用される装置と類似した、柔軟性のある、カメラガイド付き装置であって、薬剤を送達する手段を含む装置を導入することによって、大腸内の部位に送達することができる。
ｉＲＮＡ剤の直腸投与には、浣腸剤を用いる。浣腸剤のｉＲＮＡ剤は、食塩水または緩衝溶液に溶解することができる。また、直腸投与には坐剤を用いることもでき、坐剤は、他の成分、例えば、賦形剤（例えば、ココアバターまたはヒドロプロピルメチルセルロース）を含むことができる。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤はいずれも、例えば、錠剤、カプセル、ジェルカプセル、薬用キャンディ、トローチ、または液状シロップの形態で経口投与することができる。さらに、組成物は、口腔の表面に局所適用することができる。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤はいずれも、口腔内に投与することができる。例えば、医薬品は口腔内に噴霧するか、または例えば、液体、固体、もしくはゲルの形態で、口腔内の表面に直接適用することができる。こうした投与は、口腔内（例えば、歯茎または舌）の炎症の治療に特に望ましく、例えば、一実施形態では、口腔内投与は、例えば、吸入を伴わずに、ディスペンサー、例えば、薬学的組成物および噴射剤を分配する定量噴霧ディスペンサーから口腔内に噴霧することによって行われる。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤はいずれも、眼球組織に投与することができる。例えば、医薬品は、眼または隣接する組織（例えば、瞼の内側）に適用することができる。医薬品は、例えば、噴霧することによって、滴剤として、洗眼液として、または軟膏として局所適用することができる。投与は、対象者によって、または別の人（例えば、医療提供者）によって行われ得る。医薬品は、一定用量で、または定量を送達するディスペンサー中で提供され得る。医薬品は、眼の内側に投与することもでき、選択された領域または構造に対してこの医薬品を導入することができる針または他の送達装置によって導入することができる。眼球治療は、眼または隣接する組織の炎症を治療するのに特に望ましい。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤はいずれも、皮膚に直接投与することができる。例えば、医薬品は、例えば、皮膚に貫通するが、例えば、その下にある筋組織には貫通しない極微針または一連の極微針を使用することによって、皮膚層に局所適用または送達することができる。ｉＲＮＡ剤組成物の投与は、局所的であることができる。局所適用は、組成物を、例えば、対象の真皮または表皮に送達することができる。局所投与は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および粉末剤の形態であることができる。局所投与用の組成物は、リポソーム、ミセル、エマルジョン、または他の脂溶性分子集合体として製剤化することができる。経皮投与は、イオントフォレーシス、フォノフォレーシスまたはソノフォレーシスなどの少なくとも１つの浸透促進法を用いて適用することができる。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤はいずれも、肺系統に投与することができる。経肺投与は、吸入によって、または肺系統内に送達装置を導入することによって、例えば、医薬品を分配することができる送達装置を導入することによって達成することができる。ある実施形態は、吸入による肺送達の方法を使用し得る。医薬品は、この医薬品（例えば、吸入できるぐらい十分に小さい形態の湿ったまたは乾燥した医薬品）を送達するディスペンサー中で提供することができる。この装置は、定量の医薬品を送達することができる。対象、または別の人が、医薬品を投与することができる。
肺送達は、肺組織に直接影響を及ぼす障害だけでなく、他の組織に影響を及ぼす障害にも有効である。
ｉＲＮＡ剤は、液体または液体以外のもの（例えば、粉末、結晶）、または肺送達用のエアロゾルとして製剤化することができる。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤はいずれも、経鼻投与することができる。経鼻投与は、送達装置を鼻内に導入することによって、例えば、医薬品を分配することができる送達装置を導入することによって達成することができる。経鼻送達の方法は、噴霧剤、エアロゾル、液体（例えば、点鼻による）、または鼻腔の表面への局所投与によるものを含む。医薬品は、例えば、吸入できるぐらい十分に小さい形態の湿ったまたは乾燥した医薬品を送達するディスペンサー中で提供することができる。この装置は、定量の医薬品を送達することができる。対象、または別の人が、医薬品を投与することができる。
経鼻送達は、鼻組織に直接影響を及ぼす障害だけでなく、他の組織に影響を及ぼす障害にも有効である。
ｉＲＮＡ剤は、液体または液体以外のもの（例えば、粉末、結晶）として、または経鼻送達用に製剤化することができる。
ｉＲＮＡ剤は、天然のウイルスキャプシド中に、化学的もしくは酵素的に産生された人工キャプシドもしくはそれに由来する構造体中にパッケージングすることができる。
ｉＲＮＡ剤を含む薬学的組成物の投薬量は、疾患状態（例えば癌、または心血管疾患）の症状を緩和するために投与することができる。対象は、上述の方法のいずれかによって、薬学的組成物を用いて治療することができる。
対象における遺伝子発現は、ｉＲＮＡ剤を含む薬学的組成物を投与することによって調節することができる。
対象は、粉末形態、例えば、結晶性粒子などの微粒子の集合体である規定量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へとプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤）の組成物を投与することによって治療することができる。組成物は、例えば、１つ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的な、複数のｉＲＮＡ剤を含むことができる。本方法は、本明細書に記載される他の特色を含むことができる。
対象は、噴霧乾燥を含む方法（すなわち、液体溶液、エマルジョン、または懸濁液を噴霧化し、その液滴をすぐに乾燥ガスに曝露させ、得られた多孔質粉末粒子を回収すること）によって調製された規定量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することによって治療することができる。組成物は、例えば、１つ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的な、複数のｉＲＮＡ剤を含むことができる。本方法は、本明細書に記載される他の特色を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、粉末形態、結晶形態、または他の微細分割形態で、担体（例えば、吸入または他の経肺送達に好適なマイクロ粒子もしくはナノ粒子）とともに、または担体を伴わずに、提供することができる。このことは、エアロゾル調製物、例えば、エアロゾル化した噴霧乾燥組成物を提供することを含み得る。エアロゾル組成物は、定量送達装置中に提供されるか、または定量送達装置装置によって分配されることができる。
吸引によって、例えば、噴霧乾燥したｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物を、エアロゾル化し、このエアロゾル化組成物を吸引することによって、治療可能な状態について、対象を治療することができる。ｉＲＮＡ剤は、ｓｉＲＮＡであることができる。組成物は、例えば、１つ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的な、複数のｉＲＮＡ剤を含むことができる。本方法は、本明細書に記載される他の特色を含むことができる。
対象は、有効量／規定量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物を投与することによって治療することができ、組成物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、またはこれらの技法の組合せを含む方法によって調製される。
別の態様では、本発明は、対象の細胞における転写物の存在量に関連したパラメータを評価する工程、参照値に対して評価されたパラメータを比較する工程、および評価されたパラメータが参照値に対してあらかじめ選択された関係性を有する（例えば、値が大きい）場合に、ｉＲＮＡ剤（または、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、もしくはｉＲＮＡ剤もしくはその前駆体をコードするＤＮＡ）を対象に投与する工程を含む方法を特色とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、評価される転写物に相補的な配列を含む。例えば、パラメータは、転写レベルの直接的な測定、タンパク質レベルの測定、疾患または障害の症状または特徴（例えば、細胞増殖速度および／または腫瘍質量、ウイルス量）の測定であり得る。
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む第１の量の組成物であって、ｉＲＮＡ剤が標的核酸と実質的に相補的である鎖を含む組成物を対象に投与する工程、および標的核酸によりコードされるタンパク質と関連する活性を評価し、この評価を、第２の量を投与し得るかどうかを決定するために使用する工程を含む方法を特色とする。いくつかの実施形態では、本方法は、第２の量の組成物を投与する工程を含み、第２の量についての投与時機または投薬量は、評価の関数である。本方法は、本明細書に記載される他の特色を含むことができる。
別の態様では、本発明は、二本鎖ｉＲＮＡ剤（ｄｓ ｉＲＮＡ剤）の供給源を対象に投与する方法を特色とする。本方法は、（ａ）１９～２５ヌクレオチド長、例えば、２１～２３ヌクレオチドの二本鎖領域を含み、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内在性ＲＮＡまたは病原体ＲＮＡ）に相補的であり、かつ任意で（ｃ）少なくとも１つの１～５ｎｔ長の３’突出を含むｄｓ ｉＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤の供給源を投与または植え込む工程を含む。一実施形態では、供給源は、長期にわたりｄｓ ｉＲＮＡ剤を放出し、例えば、供給源は、制御放出または遅延放出型の供給源（例えば、ｄｓ ｉＲＮＡ剤を徐々に放出する微粒子）である。他の実施形態では、供給源は、ポンプ、例えば、センサーを含むポンプ、または１つ以上の単位用量を放出することができるポンプである。
一態様では、本発明は、標的ＲＮＡに相補的な（例えば、実質的および／または正確に相補的な）ヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む薬学的組成物を特色とする。標的ＲＮＡは、内在性のヒト遺伝子の転写物であることができる。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９～２５ヌクレオチド長、例えば、２１～２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、かつ任意で（ｃ）少なくとも１つの１～５ｎｔ長の３’突出を含む。一実施形態では、薬学的組成物は、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、またはリポソームであることができる。
一例では、薬学的組成物は、局所送達剤と混合されたｉＲＮＡ剤を含む。局所送達剤は、複数の微視的小胞であることができる。微視的小胞は、リポソームであることができる。いくつかの実施形態では、リポソームはカチオン性リポソームである。
別の態様では、薬学的組成物は、局所浸透促進剤と混和されたｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む。一実施形態では、局所浸透促進剤は、脂肪酸である。脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプリン酸、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはＣ１－１０アルキルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容されるそれらの塩であることができる。
別の実施形態では、局所浸透促進剤は、胆汁酸塩である。胆汁酸塩は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、または薬学的に許容されるそれらの塩であることができる。
別の実施形態では、浸透促進剤は、キレート剤である。キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチル酸、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、β－ジケトンのＮ－アミノアシル誘導体、またはそれらの混合物であることができる。
別の実施形態では、浸透促進剤は、サーファクタント、例えば、イオン性または非イオン性のサーファクタントである。サーファクタントは、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル、パーフルオロ化合物のエマルジョン、またはそれらの混合物であることができる。
別の実施形態では、浸透促進剤は、不飽和環状尿素、１－アルキル－アルコン、１－アルケニルアザシクロ－アラカノン、ステロイド性の抗炎症剤、およびそれらの混合物からなる群から選択されることができる。さらに別の実施形態では、浸透促進剤は、グリコール、ピロール、アゾン、またはテルペンであることができる。
一態様では、本発明は、経口送達に好適な形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む薬学的組成物を特色とする。一実施形態では、経口送達は、消化管の細胞または領域、例えば、小腸、大腸（例えば、大腸癌を治療するため）などにｉＲＮＡ剤組成物を送達するのに使用することができる。経口送達の形態は、錠剤、カプセル、またはジェルカプセルであることができる。一実施形態では、薬学的組成物のｉＲＮＡ剤は、細胞接着タンパク質の発現を調節するか、細胞の増殖速度を調節するか、または真核生物の病原体またはレトロウイルスに対する生物活性を有する。別の実施形態では、薬学的組成物は、哺乳類の胃で、錠剤、カプセル、またはジェルカプセルが溶解するのを実質的に妨げる腸溶性材料を包含する。いくつかの実施形態では、腸溶性材料はコーティング剤である。コーティング剤は、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、または酢酸フタル酸セルロースであることができる。
別の実施形態では、経口投薬形態の薬学的組成物は、浸透促進剤を含む。浸透促進剤は、胆汁酸塩または脂肪酸であることができる。胆汁酸塩は、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの塩であることができる。脂肪酸は、カプリン酸、ラウリン酸、またはそれらの塩であることができる。
別の実施形態では、経口投薬形態の薬学的組成物は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤はポリエチレングリコールである。別の例では、賦形剤はプレシロールである。
別の実施形態では、経口投薬形態の薬学的組成物は、可塑剤を含む。可塑剤は、ジエチルフタル酸、トリアセチンセバシン酸ジブチル、フタル酸ジブチル、またはクエン酸トリエチルであることができる。
一態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤および送達ビヒクルを含む薬学的組成物を特色とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９～２５ヌクレオチド長、例えば、２１～２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、かつ任意で（ｃ）少なくとも１つの１～５ヌクレオチド長の３’突出を含む。
一実施形態では、送達ビヒクルは、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を、局所の投与経路によって細胞に送達することができる。送達ビヒクルは、微視的小胞であることができる。一例では、微視的小胞はリポソームである。いくつかの実施形態では、リポソームはカチオン性リポソームである。別の例では、微小ビヒクルはミセルである。一態様では、本発明は、注射可能な投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖のｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む薬学的組成物を特色とする。一実施形態では、注射可能な投薬形態の薬学的組成物として、滅菌水性溶液または滅菌水性分散液および滅菌粉末が挙げられる。いくつかの実施形態では、滅菌溶液は、水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、またはプロピレングリコールなどの希釈剤を含むことができる。
一態様では、本発明は、経口投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む薬学的組成物を特色とする。一実施形態では、経口投薬形態は、錠剤、カプセル、およびジェルカプセルからなる群から選択される。別の実施形態では、薬学的組成物は、哺乳類の胃で、錠剤、カプセル、またはジェルカプセルが溶解するのを実質的に妨げる腸溶性材料を含む。いくつかの実施形態では、腸溶性材料はコーティング剤である。コーティング剤は、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、または酢酸フタル酸セルロースであることができる。一実施形態では、経口投薬形態の薬学的組成物は、浸透促進剤、例えば、本明細書に記載される浸透促進剤を含む。
別の実施形態では、薬学的組成物の経口投薬形態は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤は、ポリエチレングリコールである。別の例では、賦形剤は、プレシロールである。
別の実施形態では、薬学的組成物の経口投薬形態は、可塑剤を含む。可塑剤は、フタル酸ジエチル、セバシン酸トリアセチンジブチル、フタル酸ジブチル、またはクエン酸トリエチルであることができる。
一態様では、本発明は、経直腸投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む薬学的組成物を特色とする。一実施形態では、経直腸投薬形態は浣腸剤である。別の実施形態では、経直腸投薬形態は坐剤である。
一態様では、本発明は、経膣投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む薬学的組成物を特色とする。一実施形態では、経膣投薬形態は坐剤である。別の実施形態では、経膣投薬形態は、フォーム、クリーム、またはジェルである。
一態様では、本発明は、経肺または経鼻投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む薬学的組成物を特色とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、粒子、例えば、マクロ粒子（例えば、ミクロスフェア）に組み込まれている。粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技法の組合せによって産生することができる。ミクロスフェアは、懸濁液、粉末、または移植可能な固体として製剤化することができる。
一態様では、本発明は、対象が吸入するのに好適な、噴霧乾燥されるｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物であって、（ａ）吸入によって対象の状態を治療するのに好適な治療的有効量のｉＲＮＡ剤、（ｂ）糖質およびアミノ酸からなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤、ならびに（ｃ）任意で、分散性を促進する量の生理学的に許容される水溶性ポリペプチドを含む組成物を特色とする。
一実施形態では、賦形剤は糖質である。糖質は、単糖、二糖、三糖および多糖からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、糖質は、デキストロース、ガラクトース、マンニトール、Ｄ－マンノース、ソルビトールおよびソルボースからなる群から選択される単糖である。別の実施形態では、糖質は、ラクトース、マルトース、スクロース、およびトレハロースからなる群から選択される二糖である。
別の実施形態では、賦形剤はアミノ酸である。一実施形態では、アミノ酸は疎水性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンからなる群から選択される。また別の実施形態では、アミノ酸は極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、システイン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される。
一実施形態では、分散性を促進するポリペプチドは、ヒト血清アルブミン、α－ラクトアルブミン、トリプシノーゲンおよびポリアラニンからなる群から選択される。
一実施形態では、噴霧乾燥されるｉＲＮＡ剤組成物は、１０ミクロン未満の質量中央径（ＭＭＤ）を有する粒子を含む。別の実施形態では、噴霧乾燥されるｉＲＮＡ剤組成物は、５ミクロン未満の質量中央径を有する粒子を含む。また別の実施形態では、噴霧乾燥されるｉＲＮＡ剤組成物は、５ミクロン未満の空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する粒子を含む。
ある他の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の薬学的製剤を収納する好適な容器を含むキットを提供する。ある実施形態では、薬学的製剤の個々の成分は、１つの容器内に提供され得る。あるいは、薬学的製剤の成分を別個に２つ以上の容器、例えば、ｉＲＮＡ剤調製物用の１つの容器と担体化合物用の少なくとももう１つの容器を提供するのが望ましい場合がある。キットは、単一の箱の中の１つ以上の容器のような、多くの異なる構成で包装されてもよい。異なる成分は、例えば、キットに付属の取扱説明書に従って組み合わせることができる。これらの成分は、例えば、薬学的組成物を調製して投与するために、本明細書に記載される方法に従って組み合わせることができる。キットは送達装置を含むこともできる。
別の態様では、本発明は、装置、例えば、植え込み可能な装置を特色とし、この装置は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、もしくはｓｉＲＮＡ剤、もしくはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば、内在性転写物をサイレンシングするｉＲＮＡ剤を含む組成物を分配または投与することができる。一実施形態では、装置は、組成物でコーティングされる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤が装置内に配置される。別の実施形態では、装置は、単位用量の組成物を分配するための機構を含む。別の実施形態では、装置は、例えば、拡散によって連続的に組成物を放出する。例示的な装置としては、ステント、カテーテル、ポンプ、人工臓器または人工臓器の部品（例えば、人工心臓、心臓弁など）、および縫合糸が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「結晶性」という用語は、結晶の構造または特性を有する固体、すなわち、一定の角度で平坦な面が交差し、かつ規則的な内部構造を有する三次元構造の粒子を指す。本発明の組成物は、さまざまな結晶形態を有し得る。結晶形態は、例えば、噴霧乾燥を含む種々の方法によって調製することができる。
一態様では、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、該細胞に本発明のｉＲＮＡ剤を提供する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ-Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ-２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ-１遺伝子、β-カテニン遺伝子、ｃ-ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子の突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異、およびｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異からなる群から選択される。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例はさらに制限するものとみなされるべきではない。本明細書の全体を通じて引用される、参考文献、係属特許出願、および公開特許は全て、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
実施例１．糖質コンジュゲートビルディングブロック１１０および１１２の合成
Figure 2023010881000085
１０１の調製：
ガラクトサミンペンタアセテート１００(５２．００ｇ、１３３．６３ｍｍｏｌ)を、周囲温度でジクロロエタン（３００ｍＬ）中に入れた。そこに、ＴＭＳＯＴｆ（４４．５５ｇ、２００．４４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で９０分間、水浴で撹拌し、加熱を停止し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷重炭酸ナトリウム溶液中に入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を暗色の粘性物質（４４．５０ｇ、定量的）として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。１Ｈ ＮＭＲとＭＡＬＤＩで生成物の生成を確認した。ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８の計算値３２９．１１；実測値３５２．１（Ｍ＋Ｎａ）。
１０２の調製：
化合物１０１（４３．７０ｇ、１３３．５６ｍｍｏｌ）とそのベンジルエステル（４１．７１ｇ、２００．３４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解させ、そこに分子ふるい（５０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。そこにＴＭＳＯＴｆ（１４．５０ｇ、６６．７８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出：２０～１００％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体（６０．５０ｇ、８６％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ ＭＳ：Ｃ２６Ｈ３５ＮＯ１１の計算値５３７．２２；実測値５６０．２１（Ｍ＋Ｎａ）。
１０３の調製：
化合物１０２（６０．００ｇ、１１１．６８ｍｍｏｌ）を、メタノール／酢酸エチルの混合物に溶解させ、アルゴンで脱気した。Ｐｄ／Ｃ（６．００ｇ、１０重量％、Ｄｅｇｕｓｓａ、ウェットタイプ）を添加し、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄し、高真空下で一晩乾燥して、生成物（４８．８５ｇ、９８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ ＭＳ：Ｃ１９Ｈ２９ＮＯ１１の計算値４４７．１７；実測値４６９．９（Ｍ＋Ｎａ）。
１０４の調製：
化合物１０１（４２．３０ｇ、１２８．４３ｍｍｏｌ）とそのアジドエタノール（２６ｇ、１９２．４５ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（３００ｍＬ）で溶解させ、そこに分子ふるい（５０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。そこにＴＭＳＯＴｆ（１４．２９ｇ、６４．２１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷した重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出：２０％－１００％の酢酸エチル／ヘキサン、次いで５％－１０％のメタノール／酢酸エチル）で精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体（５９．２３ｇ、９１．００％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ ＭＳ：Ｃ２０Ｈ３２Ｎ４Ｏ１１の計算値５０４．２１；実測値５２７．１（Ｍ＋Ｎａ）。
１０５の調製：
化合物１０４（９．３３ｇ、１８．５０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、そこにＰＰｈ３（５．９７ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４８時間撹拌した。出発材料が完全に消失したことをＴＬＣで確認した。水（１ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２４時間撹拌した。ＴＦＡ（２．８５ｍＬ、２３．１２ｍｍｏｌ）とトルエン（４０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと２回共蒸発させ（２×４０ｍＬ）、高真空下で乾燥させた。これを同日中に次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ２０Ｈ３４Ｎ２Ｏ１１の計算値４７８．２２；実測値５００．８（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2023010881000086
１０７の調製：
化合物１０６（ＪＯＣ ２００２）（６．９４ｇ、１４．７３ｍｍｏｌ）とモノｂｏｃプロピルアミン（１０．２６ｇ、５８．８９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、そこにＨＢＴＵ（１７．２６ｇ、４５．５０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１５．３６ｍＬ、８８．１４ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌した。反応混合物を氷と水の混合物中に入れ、ジクロロメタンで抽出し、重炭酸ナトリウム溶液、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで２％－１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物を白色の綿毛状の固体（１０．４９ｇ、７６％）として得た。ＭＳ：Ｃ４５Ｈ７７Ｎ７Ｏ１４の計算値９３９．５５；実測値９４０．５３（Ｍ＋Ｈ）。
１０８の調製：
化合物１０７（２．４０ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、そこにＴＦＡ／ＤＣＭ（１：４、１０ｍＬ）の混合物を添加し、３０分間撹拌した。反応を質量スペクトルでモニターした。１００ｍＬのトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと２回共蒸発させ（２×１００ｍＬ）、高真空下で乾燥させて、化合物をそのＴＦＡ塩（白色の粘着性物質、２．４７ｇ、９９％）として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ３０Ｈ５３Ｎ７Ｏ８の計算値６３９．４０；実測値６４０．４５（Ｍ＋Ｈ）。
１０９の調製：
ＧａｌＮＡｃ酸１０３（４．００ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、そこにＨＢＴＵ（３．７５ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．３４ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（５ｍＬ、３．２当量）を添加し、３～４分間撹拌した。そこに１０８（２．４７ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍＬ）、水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで勾配溶出５％－１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物１０９を白色の固体（４．２０ｇ、８７％）として得た。ＭＳ：Ｃ８７Ｈ１３４Ｎ１０Ｏ３８の計算値１９２６．８９；実測値１９４９．５（Ｍ＋Ｎａ）。
１１０の調製：
ＧａｌＮＡｃ誘導体１０９（７．５０ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）を、アルゴンで脱気したメタノール（５０ｍＬ）中に入れた。Ｐｄ／Ｃ（０．８００ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａタイプ、ウェット）と数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で一晩水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。ＴＦＡ（０．４６５ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと共蒸発させ（２回）、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をＴＦＡ塩（淡黄色の固体、７．３０ｇ、９９％）として得た。ＭＳ：Ｃ７９Ｈ１２８Ｎ１０Ｏ３６の計算値１７９２．８５；実測値１８１５．９（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2023010881000087
１１１の調製：
トリカルボン酸１０６（２．１７ｇ、４．６２５ｍｍｏｌ）とアミン（１８．５０ｍｍｏｌ、先の反応からの粗製物）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＴＢＴＵ（５．３４ｇ、１６．６３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２．２４ｇ、１６．５９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（５．６４ｍＬ、３２．３６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。２４時間撹拌した後、追加量のＤＩＥＡ（４ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。４８時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、１Ｍリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで３％－１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物１１１を白色の固体（５．８０ｇ、６８％）として得た。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１２５Ｎ７Ｏ４１の計算値１８５１．７９；実測値１８７４．２０（Ｍ＋Ｎａ）。
１１２の調製：
ＧａｌＮＡｃ誘導体１１１（５．７５ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）を、アルゴンで脱気したメタノール（１００ｍＬ）中に入れた。Ｐｄ／Ｃ（０．６００ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、含水型）と数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で３６時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。ＴＦＡ（０．３５４ｍＬ、１．２５当量）とトルエン（３０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと共蒸発させ（２回）、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をＴＦＡ塩（５．７０ｇ、粗製物）として得た。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１２５Ｎ７Ｏ４１の計算値１７１７．７５；実測値１７４０．５（Ｍ＋Ｎａ）。
実施例２．糖質コンジュゲート１１８の合成
Figure 2023010881000088
１１５の調製：
ヒドロキシプロリンアミン（３．００ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）とドデカンジオン酸モノメチルエステル（１．７４８ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）中に一緒に入れた。そこにＨＢＴＵ（３．２５ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．７ｍＬ、２１．２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を一晩撹拌した。反応混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、ＤＣＭで抽出した。重炭酸溶液、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル／ヘキサン、酢酸エチル、次いで５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、所要の化合物１１５を白色の固体（４．３０ｇ、９３％）として得た。ＭＳ：Ｃ３９Ｈ５１ＮＯ７の計算値６４５．３７；実測値６４６．３５（Ｍ＋Ｈ）。
１１６の調製：
化合物１１５（４．２５ｇ、６．５８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＤＣＭ／水（５０ｍＬ、２：１：１）の混合物に溶解させた。ＬｉＯＨ（１．９０ｇ、４５．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、酢酸を添加して、反応混合物を中和した。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭで抽出した。このＤＣＭ溶液にＴＥＡ（過剰）を添加し、溶液を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、所要の生成物１１６をそのＴＥＡ塩（４．１５ｇ、８６％）として得た。ＭＳ：Ｃ３８Ｈ４９ＮＯ７の計算値６３１．３５；実測値６３０．３４（Ｍ-Ｈ）。
１１７の調製：
化合物１１６（１．３０ｇ、２．０６ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．８２１ｇ、１．０５当量）をＤＭＦ（３０ｍＬ）中に一緒に入れた。そこにＤＩＥＡ（１．０７ｍｌ、３当量）を添加し、混合物を３～４分間撹拌した。アミン１１０（３．００ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）の溶液、次いで１当量のＤＩＥＡを添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭに溶解させ、重炭酸と水で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。残渣をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで５％-２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、生成物１１７を白色の固体（３．３５ｇ、８８％）として得た。ＭＳ：Ｃ１１７Ｈ１７５Ｎ１１Ｏ４２の計算値２４０６．１９；実測値２４２９．１０（Ｍ＋Ｎａ）。
固体担体１１８の調製：
化合物１１７（３．３０ｇ、１．３７ｍｏｌ）、コハク酸無水物 （０．２７４ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．５０１ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体（３．８１ｇ）として得た。ＭＳ：Ｃ１２１Ｈ１７９Ｎ１１Ｏ４５の計算値２５０６．２１；実測値２５２９．２０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（２．２０ｇ、０．８７７ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．３３４ｇ、０．８７７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．４５７ｍＬ、２．６２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を３～４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（１２．３０ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％ Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１１８（１３．１０ｇ、５０．５μｍｏｌ／ｇローディング）を得た。
実施例３．糖質コンジュゲート１２２の合成
Figure 2023010881000089
１１９の調製：
Ｚ-アミノカプロン酸（２．１９ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（３．１３ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．１９ｍＬ、５．００当量）を添加し、混合物を数分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン１１２（１０．１０ｇ、５．５２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＤＭＦに溶解させ、前記混合物に添加し、４８時間撹拌した。生成物の生成についてＴＬＣとＭＡＬＤＩを確認した。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、ＮａＨＣＯ３溶液と水で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチルによる溶出、次いで５％－１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出）で精製して、所要の化合物１１３をオフホワイトの固体（６．２０ｇ、５７％）として得た。ＭＳ：Ｃ８７Ｈ１３６Ｎ８Ｏ４２の計算値１９６４．８８；実測値１９８７．７５（Ｍ＋Ｎａ）。
１２０の調製：
化合物１１９（６．１０ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、そこに１ｍＬの酢酸を添加した。反応混合物を脱気し、そこにＰｄ／Ｃ（０．７００ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、含水型）を添加し、バルーン圧下で３６時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。そこに１．２５当量のＴＦＡとトルエン（５０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと２回共蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させて、所要の化合物をオフホワイトの固体（６．１０ｇ、定量的）として得た。この化合物を、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ７９Ｈ１３０Ｎ８Ｏ４０の計算値１８３０．８４；実測値１８５３．８１（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2023010881000090
１２１の調製：
化合物１１６（５．０６ｇ、６．９０ｍｍｏｌ）、ＧａｌＮＡｃアミン１１２（１０．５５ｇ、５．７５６ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（２．４４ｇ、１．１当量）、およびＨＯＢｔ（１．０２５ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に一緒に入れた。そこにＤＩＥＡ（６ｍＬ、３４．５１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４８時間撹拌した。反応をＴＣＬとＭＡＬＤＩでモニターした。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭに溶解させ、重炭酸と水で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。残渣をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで３％-１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、生成物１２１をオフホワイトの固体（１０．５０ｇ、７９％）として得た。ＭＳ：Ｃ１１１Ｈ１６６Ｎ８Ｏ４５の計算値２３３１．０９；実測値 ２３５４．０３（Ｍ＋Ｎａ）。
１２２の調製：
化合物１２１（２．００ｇ、０．８５７ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１８６ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．３１４ｇ、３当量）をＤＣＭ中に一緒に取り、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩として得る。コハク酸塩（２．００ｇ、０．８５７ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．３２５ｇ、０．８５７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させる。そこにＤＩＥＡ（０．４５０ｍＬ、２．５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をを３～４分間旋回させる。そこにポリスチレン担体（１０．００ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させる。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄し、これを酢酸無水物でキャッピングして、固体担体１２２を得る。
実施例４．糖質コンジュゲート１２８の合成
Figure 2023010881000091
１２５の調製：
アミン１２３（２．７５ｇ、４．６１ｍｍｏｌ）とモノエチルヘキサンジオン酸（０．８８６ｇ、５．０９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（２．０９ｇ、５．５１ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（２．８８ｍＬ、１６．５３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を氷水混合物中に入れ、ＤＣＭで抽出し、重炭酸溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（５０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＥｔＯＡｃ、次いで５％-１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製して、所要の生成物を綿毛状の白色の固体（２．２５ｇ、６５％）として得た。ＭＳ：Ｃ４０Ｈ５２Ｎ２Ｏ８Ｓ２の計算値７５２．３２；実測値７５３．３１（Ｍ＋Ｎａ）。
１２６の調製：
化合物１２５（２．２０ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／水（２０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させた。ＬｉＯＨ（０．１８７ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、４時間後に冷却し、クエン酸を添加して、反応混合物をクエンチした。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭで抽出し、水で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。残渣をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、３％－２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物１２６（０．７５０ｇ、３５％）をそのＴＥＡ塩として得た。ＭＳ：Ｃ３８Ｈ４８Ｎ２Ｏ８Ｓ２の計算値７２４．２９；実測値７２３．２８（Ｍ-Ｈ）。
１２７の調製：
化合物１２６（１．００８ｇ、１．３９０ｍｍｏｌ）、１１０（１．９０４ｇ、１．００７ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（０．４００ｇ、１．０５４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．５２５ｍＬ、３当量）を添加し、反応物を２日間撹拌した。反応混合物をＴＬＣとＭＡＬＤＩでモニターした。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで３％-１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を綿毛状のオフホワイトの固体（１．９０ｇ、７６％）として得た。ＭＳ：Ｃ１１７Ｈ１７４Ｎ１２Ｏ４３Ｓ２の計算値２４９９．１２；実測値２５２２．１２（Ｍ＋Ｎａ）。
固体担体１２８の調製：
化合物１２７（２．００ｇ、０．８００ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１６０ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．３００ｇ、３当量）をＤＣＭ中に一緒に入れ、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩として得る。化合物１２７（２．００ｇ、０．７６９ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．２９０ｇ、０．７６９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させる。そこにＤＩＥＡ（０．５００ｍＬ、３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をを３～４分間旋回させる。そこにポリスチレン担体（１０．００ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させる。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄し、これを酢酸無水物でキャッピングして、固体担体１２８を得る。
実施例５．糖質コンジュゲート１３６の合成
Figure 2023010881000092
１３１の調製：
マンノーストリクロロアセトイミデート１２９（１５．００ｇ、２０．２４ｍｍｏｌ）とアジドアルコール（４．２５ｇ、１．２当量）をトルエンに溶解させ、２回共沸騰させた。残渣を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）と分子ふるい（１０ｇ）を添加した。反応混合物を氷水浴で冷却した。そこにＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１当量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、ＴＥＡでクエンチした。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をクロマトグラフィー（２０％－５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を無色の液体（８．３６ｇ、５５％）として得た。ＭＳ：Ｃ４０Ｈ３９Ｎ３Ｏ１２の計算値７５３．２５；実測値７７６．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
１３２の調製：
化合物１３１（８．３０ｇ、１１．０１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（７０ｍＬ）に溶解させ、そこにＰＰｈ３（３．４６ｇ、１．２当量）を添加し、混合物を周囲温度で２日間撹拌した。そこに水（１ｍＬ）を添加し、混合物をさらに２４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。そこにトリフルロ酢酸（１．０６ｍＬ、１．２５当量）とトルエン（５０ｍＬ）を添加した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をトルエンと２回共蒸発させ、高真空下で乾燥させた。これを、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ４０Ｈ４１ＮＯ１２の計算値７２７．２６；実測値７５０．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
１３３の調製：
トリカルボン酸（１１．０５ｇ、２３．４５ｍｍｏｌ）とアミン（６８．１９ｇ、９４ｍｍｏｌ、先の反応からの粗製物）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。そこにＴＢＴＵ（２７．０９ｇ、８４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１．３４ｇ、８４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２８ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。２４時間撹拌した後、追加量のＤＩＥＡ（２８ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。４８時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、１Ｍリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、および水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで３％－１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物１３３を白色の固体（４１．９５ｇ、６７％）として得た。ＭＳ：Ｃ１４１Ｈ１４６Ｎ４Ｏ４４の計算値２５９８．９３；実測値２６２１．８９（Ｍ＋Ｎａ）。
１３４の調製：
化合物１３３（３．０５ｇ、１．１７６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物に溶解させた。そこに５０当量のギ酸アンモニウム、次いでの５％Ｐｄ／Ｃ（１．５ｇ、５０ｗｔ％）を添加し、周囲温度で８時間撹拌した。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、ＭｅＯＨ／ＤＣＭで洗浄し、溶媒を除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を白色の固体（２．６５ｇ、９２％）として得た。ＭＳ：Ｃ１３３Ｈ１４０Ｎ４Ｏ４２の計算値２４６４．８９；実測値２４８７．９２（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2023010881000093
１３５の調製：
マンノースアミン（２．０７６ｇ、０．８４２ｍｍｏｌ）、１１６（０．７４０ｇ、１．００ｍｍｏｌ）、およびＴＢＴＵ（０．０．３５３ｇ、１．１当量）、およびＨＯＢｔ（０．１４９ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．０．８６９ｍＬ、５当量）を添加し、反応物を２日間撹拌した。反応混合物をＴＬＣとＭＡＬＤＩでモニターした。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで２％-４％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を綿毛状のオフホワイトの固体（１．４８ｇ、５７％）．ＭＳ：Ｃ７１Ｈ１８７Ｎ５Ｏ４８の計算値３０７８．２３；実測値３１０１．２５（Ｍ＋Ｎａ）。
固体担体１３６の調製：
化合物１１７（２．１０ｇ、０．６８１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１３６ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．２４９ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体（１．５６ｇ）として得た。ＭＳ：Ｃ１７５Ｈ１９１Ｎ５Ｏ５１の計算値２５０６．２１；３１７８．２５；実測値３２０１．２０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（１．００ｇ、０．３０５ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．１３８ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．５０ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３～４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（６．０５ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％ Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１３６（６．７０ｇ、４２μｍｏｌ／ｇローディング）を得た。
実施例６．糖質コンジュゲート１４３の合成
Figure 2023010881000094
１３８の調製：
マンノーストリクロロアセトイミデート１２９（１５．２３ｇ、２０．５５ｍｍｏｌ）とＡ（４．３６ｇ、１．０２当量）をトルエンに溶解させ、２回共沸騰させた。残渣を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）と分子ふるい（１０ｇ）を添加した。反応混合物を氷水浴で冷却した。そこにＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１当量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、ＴＥＡでクエンチした。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン、１５％－２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を無色の液体（１４．５２ｇ、９０％）として得た。ＭＳ：Ｃ４６Ｈ４２Ｏ１２の計算値７８６．２７；実測値８０９．２５（Ｍ＋Ｎａ）。
１３９の調製：
マンノースベンジルエステル（１４．３０ｇ、１８．１７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、そこに２滴の酢酸を添加した。脱気し、Ｐｄ／Ｃ（１．５０ｇ、１０ｗｔ％ Ｄｅｇｕｓｓａウェットタイプ）を添加し、バルーン圧下で２４時間水素化した。反応をＴＬＣとＭＡＬＤＩでモニターした。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶媒を除去し、残渣を高真空下で乾燥させて、化合物を無色のオイル（１１．２０ｇ、９０％）として得た。ＭＳ：Ｃ３９Ｈ３６Ｏ１２の計算値６９６．２２；実測値７１９．１８（Ｍ＋Ｎａ）。
１４１の調製：
ヒドロキシプロリンアミン１４０（３．８２ｇ、７．１８ｍｍｏｌ）、１４１（５．００ｇ、７．１８ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（２．６５ｇ、７．１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（３．６５ｍＬ、５当量）を添加し、反応物を３時間撹拌した。反応混合物をＴＬＣでモニターした。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィー（まず、酢酸エチル、次いで５％-１０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製して、所要の生成物を白色の固体（４．０８ｇ、４６％）として得た。ＭＳ：Ｃ７１Ｈ７４Ｎ２Ｏ１６の計算値１２１０．５０；実測値１２３３．４０（Ｍ＋Ｎａ）。
固体担体１４３の調製：
化合物１４１（２．００ｇ、１．６５２ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．３３０ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．６０４ｇ、３当量）をＤＣＭ中に一緒に入れ、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩１４２として得る。コハク酸塩（２．００ｇ、１．５２６ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．５７８ｇ、１．５２６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させる。そこにＤＩＥＡ（１．３２ｍＬ、５当量）を添加し、反応物を３～４分間旋回させる。そこにポリスチレン担体（１０．００ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させる。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄し、これを酢酸無水物でキャッピングして、固体担体１４３を得る。
実施例７．糖質コンジュゲート１５２の合成
Figure 2023010881000095
１４６の調製：
化合物１４４（２６．５５ｇ、６４．０６ｍｍｏｌ）と１４５（１０．００ｇ、５３．４３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（２４．１２ｇ、６４ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（４６ｍＬ、５当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（２０％－５０％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（２３．２０ｇ、７４％）として得た。ＭＳ．Ｃ３２Ｈ４５Ｎ３Ｏ７のＭＷ計算値：５８３．７２、実測値５８４．７３（Ｍ＋Ｈ）。
１４７の調製：
化合物１４６（３．３０ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル／ＭｅＯＨの混合物に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）を触媒として用いて、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ．Ｃ１６Ｈ３３Ｎ３Ｏ３のＭＷ計算値：３１５．２５、実測値３１６．２６（Ｍ＋Ｈ）。
１４８の調製：
化合物１４７（５．６５ｍｍｏｌ）とＧａｌＮＡｃ酸１０３（５．８１ｇ、１２．９９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（４．９７ｇ、１３．１０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．００ｍＬ，３当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、水とブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで３％－１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（５．２５ｇ、７９％）として得た。ＭＳ．Ｃ５４Ｈ８７Ｎ５Ｏ２３のＭＷ計算値：１１７３．５８、実測値１１９６．６０（Ｍ＋Ｎａ）。
１４９の調製：
二分岐のＧａｌＮＡｃ誘導体１４８（５．１５ｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水ＤＣＭに溶解させ、そこに３ｍＬのアニソールと３０ｍＬのＴＦＡを添加し、この反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。ＴＬＣで確認し、反応混合物にトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。トルエンと２回共蒸発させ、残渣をＤＣＭに溶解させ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物を濾過カラム（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を薄茶色の固体（４．４０ｇ、９１％）として得た。ＭＳ．Ｃ５０Ｈ７９Ｎ５Ｏ２３のＭＷ計算値：１１１７．５２、実測値１１４０．６２（Ｍ＋Ｎａ）。
１５０の調製：
二分岐のＧａｌＮＡｃ酸１４９（４．３０ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）とヒドロキシプロリンアミン１５３（２．２５ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（１．４６ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．３ｍＬ）を添加し、反応混合物を３時間撹拌した。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、水と重炭酸で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（３％-１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を白色の固体（３．２５ｇ、５２％）として得た。ＭＳ．Ｃ８２Ｈ１１７Ｎ７Ｏ２７のＭＷ計算値：１６３１．８０、実測値１６５４．４５（Ｍ＋Ｎａ）。
１５１の調製：
化合物１５０（３．３０ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．４０４ｇ、２当量）、ＤＭＡＰ（０．７４０ｇ、３当量）をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に一緒に入れ、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのＴＥＡ塩１５１として得る。ＭＳ．Ｃ８６Ｈ１２１Ｎ７Ｏ３０のＭＷ計算値：１７３１．８２、実測値１７５３．８７（Ｍ＋Ｎａ）。
固体担体１５２の調製：
コハク酸塩１５１（２．０２ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．８４２ｇ、１．１当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（１．５０ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３～４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（２８ｇ）を添加し、混合物を一晩振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％ Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して固体担体１５２（３０．１０ｇ、３０μｍｏｌ／ｇローディング）を得た。
実施例８．糖質コンジュゲート１６１の合成
Figure 2023010881000096
１５５の調製：
ヒドロキシプロリンアミン１５３（１０．００ｇ、１８．７６ｍｍｏｌ）と１５４（４．９８ｇ、１８．７６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（７．８３ｇ、２０．６４ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（９．８１ｍＬ、５６．２９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２時間撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（０％-１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（１３．２０ｇ、９０％）として得た。ＭＳ．Ｃ４６Ｈ５７Ｎ３Ｏ８のＭＷ計算値：７７９．４１、実測値７８０．４２（Ｍ＋Ｈ）。
１５６の調製：
化合物１５５（１３．００ｇ、１６．６６ｍｍｏｌ）を酢酸エチル／ＭｅＯＨの混合物に溶解させ、少量のトリエチルアミンの存在下、Ｐｄ／Ｃ（１．５０ｇ）を触媒として用いて、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した（９．９３ｇ、９２％）。ＭＳ．Ｃ３８Ｈ５１Ｎ３Ｏ６のＭＷ計算値：６４５．３８、実測値６４６．４０（Ｍ＋Ｈ）。
１５７の調製：
化合物１５６（９．９０ｇ、１５．３３ｍｍｏｌ）とジＣｂｚリジン（６．３６ｇ、１５．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（６．１１ｇ、１５．３３ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（８ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を２時間撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（０％-１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（１３．１０ｇ、８３％）として得た。ＭＳ．Ｃ６０Ｈ７５Ｎ５Ｏ１１のＭＷ計算値：１０４１．５５、実測値１０４２．５７（Ｍ＋Ｈ）。
１５８の調製：
化合物１５７（１２．９０ｇ、１２．３７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル／ＭｅＯＨの混合物に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１．３０ｇ）を触媒として用いて、バルーン圧下で水素化した。３時間後にＴＬＣで確認し、小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ．Ｃ４４Ｈ６３Ｎ５Ｏ７のＭＷ計算値：７７３．４７、実測値７７４．５０（Ｍ＋Ｈ）。
１６０の調製：
化合物１５８（２．３２ｇ、３ｍｍｏｌ）とグルコース酸１５９（４．５０ｇ６．４５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（２．４４ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（３．３６ｍＬ、３当量）を添加し、反応物を２時間撹拌し、反応混合物を氷冷水中に入れ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで０％-１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（５．４０ｇ、８５％）として得た。ＭＳ．Ｃ１２２Ｈ１３１Ｎ５Ｏ２９のＭＷ計算値：２１２９．８９、実測値２１５２．９０（Ｍ＋Ｎａ）。
固体担体１６１の調製：
化合物１６０（５．２０ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．４８８ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．８９４ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体として得た。ＭＳ：Ｃ１２６Ｈ１３５Ｎ５Ｏ３２のＭＷ計算値：２２２９．９１、実測値２２５２．５０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（２．４４ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．９２５ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（１．２７ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３～４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（２４ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％ Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１６１（２７ｇ、３１ｕｍｏｌ／ｇローディング）を得た。
実施例９．糖質コンジュゲート１６５および１６６の合成
Figure 2023010881000097
１６３の調製：
化合物１５８（５．４０ｇ、６．９７ｍｍｏｌ）とマンノース酸１３９（９．９６ｇ １４．３０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（５．４２ｇ、１４．３０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．４５ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を２時間撹拌し、反応混合物を氷冷水に注ぎ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで２％-１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（９．２０ｇ、６２％）として得た。ＭＳ．Ｃ１２２Ｈ１３１Ｎ５Ｏ２９のＭＷ計算値：２１２９．８９、実測値２１５２．６５（Ｍ＋Ｎａ）。
固体担体１６５の調製：
化合物１６３（３．２０ｇ、１．４０８ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．２８３５ｇ、２当量）、およびＤＭＡＰ（０．５１６ｇ、３当量）をＤＣＭに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのＴＥＡ塩としてのオフホワイトの固体として得た。ＭＳ：Ｃ１２６Ｈ１３５Ｎ５Ｏ３２のＭＷ計算値：２２２９．９１、実測値２２５２．９０（Ｍ＋Ｎａ）。コハク酸塩（１．４０８ｍｍｏｌとＨＢＴＵ（０．６４０ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（１．２２ｍＬ、過剰）を添加し、反応物を３～４分間旋回させた。そこにポリスチレン担体（２０ｇ）を添加し、混合物を２４時間振盪させた。フリットに通して濾過し、ＤＣＭ、１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で２時間乾燥させた。これを２５％ Ａｃ２Ｏ／Ｐｙ混合物で３０分間キャッピングした。同じ洗浄／乾燥手順を繰り返して、固体担体１６１（２３．２ｇ、５４．７ｕｍｏｌ／ｇローディング）を得た。
１６６の調製：
化合物１６３（４．０１ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（０．６５ｍＬ、３．７５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物にアミダイト試薬（０．６２９ｍＬ、２．８２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１５分間撹拌した。ＴＬＣで確認し、反応混合物を分液漏斗に移し、水と重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を除去した。粗生成物をクロマトグラフィー（３０％-８０％のアセトン／ＤＣＭ）で精製して、生成物（４．２０ｇ、９６％）を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝１４８．１９、１４７．７９、１４７．３３。ＭＳ．Ｃ１３１Ｈ１４８Ｎ７Ｏ３０ＰのＭＷ計算値：２３３０．００、実測値２３５３．２０（Ｍ＋Ｎａ）。
実施例１０．糖質コンジュゲートビルディングブロックの合成
１７１、１７２、１７３、および１７４の合成：
ビルディングブロック１７１と１７２は、１０３の合成手順と同様の手順を用いて合成する。ビルディングブロック１７３と１７４は、１０５の合成手順と同様の手順を用いて合成する。
Figure 2023010881000098
１８０の合成：
ビルディングブロック１８０は、１１０の合成手順と同様の手順を用いて合成する。
Figure 2023010881000099
ビルディングブロック１８８の合成：
Figure 2023010881000100
実施例１１．糖質コンジュゲートの合成
Figure 2023010881000101
ビルディングブロック１８０をアミン１８３、１８５、および１８８と共役させ、それぞれ、糖質コンジュゲート１８９、１９０、および１９１を提供する。
Figure 2023010881000102
２０１の調製：
マンノース（１０．００ｇ、５５．５３ｍｍｏｌ）とデシノール（１００ｇ、溶媒）とＣＳＡ（５００ｍｇ）を１１０℃で、油浴で一晩撹拌した。デシノールの色は一晩で濃い茶色になった。デシノールの大部分を減圧下で完全蒸留した。残渣をＤＣＭに溶解させ、ＴＥＡで中和した。この溶液を水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドによる濾過（初めに酢酸エチル、次に１０％－１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物（７．５２ｇ、４２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ ＭＨｚ）δ＝５．９０-５．７５（ｍ，１Ｈ），５．０２-４．８５（ｍ，２Ｈ），４．００-３．３０（ｍ，７Ｈ），２．１０-１．９４（ｍ，２Ｈ），１．６０-１．４９（ｍ，２Ｈ），１．４１-１．２０（ｍ，１２Ｈ）。
２０３の調製：
化合物２０１（０．１７２ｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（１０μ（１０２ｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。ＭＳを添加し、５ｍＬのＤＣＭ中の１３８（１．００ｇ．１．３５ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下して添加した。反応をＴＬＣでモニターし、アクセプターがなくなった時点で、反応物をＴＥＡでクエンチし、ＤＣＭで希釈し、ＭＳを濾過で除去し、乾燥させた。残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出１０％－４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の綿毛状の固体（０．５５０ｇ、６９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝７．９５-７．２０（ｍ，４０Ｈ），５．９０-５．５０（ｍ，７Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ，１Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝８．０６Ｈｚ，１Ｈ），４．９８-４．８１（ｍ，３Ｈ），４．６５-４．０９（ｍ，９Ｈ），３．８１-３．４２（ｍ，５Ｈ），３．２０（ｂｓ，１Ｈ），２．７９（ｂｓ，１Ｈ），２．０１-１．８８（ｍ，２Ｈ），１．３０-０．９２（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ＝１６６．２８，１６６．２０，１６５．８８，１６５．７６，１６５．６６，１６５．６４，１６５．４０，１３９．３４，１３４．０４，１３３．８２，１３３．７１，１３３．６６，１３３．４２，１３３．３０，１３０．２１，１２９．９９，１２９．８６，１２９．７０，１２９．５９，１２９．２８，１２９．０３，１２９．００，１２８．９４，１２８．７７，１２８．７３，１２８．６３，１２８．６１，１２８．５４，１２８．４７，１２８．４４，１１４．３７，１０２．７４，１０２．６８，９８．８１，８５．２７，７２．４３，７１．９６，７１．３７，７１．３１，７１．０１，７０．３０，７０．２６，７０．０５，６８．３１，６８．２３，６７．４１，６６．１１，６２．６３，６２．０８，３３．９６，２９．６５，２９．５８，２９．５３，２９．５８，２９．０８，２６．２０。ＭＳ．Ｃ８４Ｈ８２Ｏ２４について計算された分子量、計算値１４７４．５２、実測値１４９７．６０（Ｍ＋Ｎａ）。
２０４の調製：
化合物２０３（０．１０４ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／Ｐｙ（１０ｍＬ、１：１）とＡｃ２Ｏ（０．５ｍＬ、過剰）とＤＭＡＰ（０．０５０ｇ）の混合物に溶解させ、反応物を一晩撹拌した。反応物をＭｅＯＨでクエンチし、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出１０％－３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の綿毛状の固体（０．１０８ｇ、９９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝８．１０-７．２０（ｍ，４０Ｈ），５．９９（ｄｄ，Ｊ＝３．１，７．８Ｈｚ，２Ｈ），５．８８-５．７５（ｍ，２Ｈ），５．７０（ｄｄ，Ｊ＝７．８２，１０．４３Ｈｚ，１Ｈ），５．６５-５．４７（ｍ，２Ｈ），５．１０-４．０７（ｍ，１３Ｈ），３．９０-３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６９-３．６１（ｍ，１Ｈ），３．３６-３．２８（ｍ，１Ｈ），２．９８-２．８１（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．１０-２．０１（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｓ，３Ｈ），１．４２-１．２０（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ＝１７０．１２，１７０．０８，１６６．１６，１６５．６７，１６５．６４，１６５．４８，１６５．４６，１６４．７８，１３９．２９，１３３．８０，１３３．７０，１３３．７０，１３３．５４，１３３．４４，１３３．４１，１３３．３５，１３０．１３，１３０．０２，１２９．９２，１２９．６９，１２９．５８，１２９．４９，１２９．４０，１２９．１５，１２９．１０，１２８．８８，１２８．８３，１２８．７９，１２８．７３，１２８．６６，１２８．４７，１２８．４０，１１４．３５，１０２．３２，９９．５８，９６．６４，７４．５１，７２．１１，７１．９１，７１．４６，７１．２１，６９．７８，６９．７２，６９．５１，６９．２８，６８．１９，６８．０３，６７．８２，６７．１２，６１．９７，６１．８３，３３．９４，２９．６３，２９．６１，２９．５５，２９．４９，２９．２７，２９．２０，２９．０５，２６．１１，２１．０６，２０．０２。ＭＳ：Ｃ８８Ｈ８６Ｏ２６について計算された分子量、計算値１５５８．５４、実測値１５８１．８（Ｍ＋Ｎａ）。
２０５の調製：
化合物２０５（１．３６ｇ、０．８７３ｍｍｏｌ）をジオキサン：水（４０ｍＬ、３：１）の混合物に溶解させた。反応混合物に、ルチジン（０．２０３ｍＬ、２当量）、次いでＯｓＯ４溶液（１ｍＬ。０．０５Ｍのｔブタノール溶液）を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム（０．７７４ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、ＤＣＭ（３回）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を全て除去し、残渣を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残渣をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、そこにオキソン（０．５９０ｇ、１．０５当量）を添加し、周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、２ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配抽出０％－４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の固体（１．０８ｇ、７９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝１１．９６（ｓ，１Ｈ），８．００-７．２３（ｍ，４０Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝３．４１Ｈｚ，１Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝３．１７Ｈｚ，１Ｈ），５．７９-５．６３（ｍ，２Ｈ），５．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９０-４．３５（ｍ，７Ｈ），４．１０-３．５５（ｍ，４Ｈ），３．３０-３．２０（ｍ，１Ｈ），２．９６-２．８７（ｍ，１Ｈ），２．１８-２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），２．０１-１．９５（ｍ，１Ｈ），１．５１-１．３９（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ），１．２０-１．０１（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ＝１７８．６８，１７８．４８，１７０．２６，１７０．１６，１６６．２５，１６５．７８，１６５．７３，１６５．７０，１６５．５４，１６５．５３，１６４．８３，１３３．８５，１３３．７５，１３３．６０，１３３．４９，１３０．１８，１３０．０８，１２８．８５，１２９．６１，１２９．５２，１２９．４４，１２９．２０，１２９．１３，１２８．９１，１２８．８９，１２８．８１．１２８．７８，１２８．７１，１２８．５１，１２８．４５，１０２．３４，９９．６７，９６．６５，７４．６０，７２．１７，７１．９４，７１．４９，７１．２１，６９．８２，６９．７９，６９．５９，６９．３７，６８．２２，６８．１１，６７．８１，６７．２０，６４．５５，６１．９９，６１．８５，６０．５９，４４．０６，３３．９６，３０．７９，２９．３９，２９．３１，２９．２４，２９．２０，２９．１７，２９．０８，２６．０８，２４．８５，２４．７９，２２．２０，２１．２４，２１．１１，２０．０７。ＭＳ：Ｃ８７Ｈ８４Ｏ２８について計算された分子量、計算値１５７６．５１、実測値１５９９．５０（Ｍ＋Ｎａ）。
２０６の調製：
化合物２０５（０．８５０ｇ、０．５３９ｍｍｏｌ）、ヒドロキシプロリンアミン（０．３００ｇ、０．５６３ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（０．２６５ｇ、０．６９８ｍｍｏｌ）をアルゴン下でＤＭＦに溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．２８１ｍＬ、３当量）を添加し、周囲温度で３時間撹拌した。反応ををＴＬＣでモニターし、出発材料が消費された時点で、混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで勾配溶出３％-１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物を淡黄色の固体（１．０９ｇ、９６％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝８．００-７．１０（ｍ，５３Ｈ），６．９０-６．８０（ｍ，４Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝３．４１Ｈｚ，１Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝３．１７Ｈｚ，１Ｈ），５．７９-５．６３（ｍ，２Ｈ），５．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．４１（ｄｄ，Ｊ＝８．００，１０．０１Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９７（ｄ，Ｊ＝４．１５Ｈｚ，１Ｈ），４．９０-４．８０（ｍ，３Ｈ），４．７０-４．３０（ｍ，７Ｈ），４．２０-４．００（ｍ，２Ｈ），３．９５-３．８５（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．６９-３．５０（ｍ，１Ｈ），３．３０-３．２０（ｍ，２Ｈ），２．９６-２．８７（ｍ，１Ｈ），２．１８-２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），２．０１-１．９５（ｍ，１Ｈ），１．５１-１．３９（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ），１．２０-１．０１（ｍ，２０Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ＝１７１．８７，１７０．８５，１６９．４６，１６９．０４，１６５．２５，１６５．２１，１６５．０９，１６４．９５，１６４．４８，１６４．５３，１６２．２９，１５８．０９，１５７．９７，１４５．０８，１３５．８７，１３５．７３，１３４．０４，１３３．７４，１３３．５６，１２９．６０，１２９．１８，１２９．０６，１２８．９１，１２８．８４，１２８．８１，１２８．７５，１２８．６７，１２８．６３，１２８．５２，１２８．４１，１２７．７７，１２７．５８，１１３．１９，１１３．０９，１０２．３０，９９．６０，９６．６０，８５．１０，７５．６８，７１．４８，７０．０２，６９．８１，６８．９９，６８．５８，６６．５５，６１．８６，６＝５４．９６，４５．７４，３８．２７，３６．３２，３５．７６，３５．４６，３４．１５，３０．７４，２８．６９，２６．２０，２５．３４，２６．２０，２５．３４，２４．１５，２０．４８，１９．５４。ＭＳ：Ｃ１１９Ｈ１２２Ｎ２Ｏ３２について計算された分子量、計算値２０９０．８０、実測値２０１３．９０（Ｍ＋Ｎａ）。
長いアルキル鎖ＣＰＧ２０７の調製：
ヒドロキシ誘導体２０６（０．５５０ｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させ、そこにコハク酸無水物（０．０７８ｇ、３当量）とＤＭＡＰ（０．１２８ｇ、４当量）を添加し、一晩撹拌した。ＴＬＣによって反応が完了したことが示された。反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、冷えた希釈クエン酸溶液と水で連続的に洗浄し（２回）、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、高真空下で乾燥させて、コハク酸塩を得た。ＰＰｈ３（０．９０ｇ、１．３当量）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、１．５当量）、および前工程からのコハク酸塩を、アセトニトリルとＤＣＭ（６ｍＬ）の混合物に溶解させた。上記の溶液にＤＴＮＰ（０．０８６ｇ、１．０５当量）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液を添加した。混合物を３～４分間ゆっくりと振盪させた。長鎖アルキルアミン-ＣＰＧ（ｌｃａａ ＣＰＧ、１．４０ｇ、１３３ｍｍｏｌ／ｇ）を混合物に添加し、２時間穏やかに振盪させた。ＣＰＧを濾過し、濾液が無色の状態であるまでＤＣＭ、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：９）の混合物、およびＤＣＭで連続的に洗浄し、乾燥させた。乾燥したＣＰＧを別のフラスコに移し、穏やかに振盪させながら、ＴＥＡ（１ｍＬ）の存在下、ピリジン（２５％）中のＡｃ２Ｏで１５分間処理した。最後に、ＣＰＧを濾過し、ＤＣＭ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１）、次いでＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。ＣＰＧ２０７を真空下で一晩乾燥させ、報告されている通りにローディングを測定した（１．４８ｇ、ローディング３６μｍｏｌ／ｇ）。
Figure 2023010881000103
化合物２１７は、報告されている手順に従って合成した（Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．；Ｋａｒｅｎ，Ｐ．；Ｌａｕｒｅｎｃｅ，Ｖ．Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００４，５２，９６５-９７１．）。
２１８の調製：
１-デシノール（０．３００ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）とトリクロロアセトイミデート２１７２．３３ｇ、１．２当量）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（３０μ（３０ｇ、１．２当量）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ１３０．０８，１２８．８５，１２９．６１，１２９．５２，１２９．４４，１２９．２０，１２９．１３，１２８．９１，１２８．８９，１２８．８１．１２８．７８，１２８．７１，１２８．５１，１２８．４５，１０２．３４，９９．６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、化合物を白色の綿毛状の固体（２．０１ｇ、８６％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝７．８０-８．１２（ｍ，１０Ｈ），７．６０-７．７８（ｍ，４Ｈ），７．１８-７．６０（ｍ，２１Ｈ），６．２０-６．０５（ｍ，２Ｈ），５．６０-５．９１（ｍ，５Ｈ），５．１０-５．４３（ｍ，３Ｈ），３．８０-５．０２（ｍ，７Ｈ），３．４０-３．５６（ｍ，１Ｈ），１．９５-２．１０（ｍ，４Ｈ），１．００-１．６０（ｍ，１１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ＝１６９．８９，１６６．５１，１６６．４０，１６６．３５，１６６．３２，１６６．２４，１６６．１０，１６６．０３，１６５．９９，１６５．９６，１６５．８６，１６５．６１，１６５．４６，１６６．３８，１６５．３４，１６５．２７，１６５．２３，１６３．６８，１３９．３６，１３３．７１，１３３．６７，１３３．５６，１３３．４０，１３３．２７，１３３．２１，１３０．１２，１３０．０５，１２９．９８，１２９．９５，１２９．９２，１２９．８８，１２９．８０，１２９．７７，１２９．７３，１２９．６８，１２９．６２，１２９．５５，１２９．５０，１２９．４７，１２９．４１，１２９．４０，１２９．２９，１２９．１４，１２９．１１，１２９．０３，１２８．９６，１２８．８７，１２８．８４，１２８．８３，１２８．７８，１２８．７６，１２８．６３，１２８．５６，１２８．５４，１２８．４８，１２８．３７，１２８．２６，１１４．３３，１１４．２６，１００．９２，１００．８４，９７．０４，９６．５２，７５．３６，７５．１７，７４．８４，７３．３７，７２．９５，７２．９０，７２．８１，７２．５７，７２．５０７，７１．９４，７１．５８，７１．０５，７０．３７，７０．２７，７０．１９，７０．０６，６９．８６，６９．２４，６９．１９，６９．０２，６３．７１，６３．５６，６３．２０，６２．９３，６２．６９，３３．９６，３３．９１，３２．９３，２９．６０，２９．５３，２９．５０，２９．４６，２９．４２，２９．３３，２９．３０，２９．２２，２９．１４，２９．０６，２９．００。ＭＳ．Ｃ７１Ｈ６８Ｏ１８について計算された分子量、計算値１２０８．４４、実測値１２３１．４（Ｍ＋Ｎａ）。
２１９の調製：
化合物２１８（７．２６ｇ、６ｍｍｏｌ）をジオキサン：水の混合物（１００ｍＬ、３：１）に溶解させた。反応混合物に、ルチジン（０．７ｍＬ、２当量）、次いでＯｓＯ４溶液（５ｍＬ．０．０５Ｍのｔブタノール溶液）を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム（５．１１ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出し（３回）、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を全て除去し、残渣を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残渣をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解させ、そこにオキソン（３．８６ｇ、１．０５当量）、そして周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、１０ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出２０％－４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物１５０を白色の固体（５．５０ｇ、７５％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝１２．００（ｂｓ，１Ｈ），８．４２-７．１０（ｍ，３５Ｈ），６．１０-４．５（ｍ，１３Ｈ），４．２０-３．３０（ｍ，３Ｈ），２．２０-２．０３（ｍ，３Ｈ），１．５０-０．８（１１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６、１００ＭＨｚ）δ＝１７４．５５，１７４．５１，１６９．１３，１６５．５９，１６５．５２，１６５．３９，１６５．２７，１６５．２４，１６５．１４，１６４．９９，１６４．８８，１６４．７５，１６４．７０，１６４．６６，１６４．６０，１６４．５４，１６４．５０，１６２．９２，１６５．５９，１６５．５１，１６５．３９，１６５．２７，１６５．２４，１６５．１４，１６４．９９，１６４．８８，１６４．７５，１６４．７０，１６４．６０，１６４．５４，１６４．５０，１３３．８０，１３３．７１，１３３．５８，１３３．４２，１３３．２９，１３３．１５，１２９．８８，１２９．４２，１２９．３６，１２９．２９，１２９．２３，１２９．２０，１２９．１２，１２９．０７，１２９．０５，１２９．０３，１２８．９１，１２８．８８，１２８．７２，１２８．５９，１２８．４８，１２８．３８，９９．９６，９９．２９，９９．２２，９５．９６，９５．６４，９５．２２，９３．１０，７５．６１，７４．８６，７４．５７，７４．３７，７４．１５，７３．５９，７３．１４，７２．５８，７１．４６，７１．１５，７０．４８，７０．３１，７０．０９，６９．９７，６９．００，６８．８７，６８．２２，６７．８１，６３．６５，６２．４９，６０．７３，５９．７６，４３．０１，３３．６８，３３．６２，３２．５４，２８．８４，２８．８２，２８．６１，２８．５５，２８．４７，２８．４０，２５．４７，２５．２１，２４．５２，２４．４３，２０．４５。ＭＳ．Ｃ７０Ｈ６６Ｏ２０について計算された分子量、計算値１２２６．４１、実測値１２４９．４（Ｍ＋Ｎａ）。
２２０の調製：
化合物２１９（１．６５ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）、ヒドロキシプロリンアミン（０．９４５ｇ、１．３当量）、およびＨＢＴＵ（０．６２３ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）をアルゴン下でＤＭＦに溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．７１ｍＬ、３当量）を添加し、周囲温度で３時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、出発材料が消費された時点で、混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（まず酢酸エチル、次いで勾配溶出３％-１０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製して、生成物２２０を淡黄色の固体（１．５５ｇ、６５％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝８．２０-７．３２（ｍ，３５Ｈ），７．３２-７．１０（ｍ，９Ｈ），６．９０-６．８２（ｍ，４Ｈ），６．００-５．６３（ｍ，４Ｈ），５．４１-５．３７（ｍ，１Ｈ），５．２０-５．０３（ｍ，２Ｈ），４．９８（ｄ，Ｊ＝４．１５Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝４．１５Ｈｚ，１Ｈ），４．８８-４．０５（ｍ，９Ｈ），３．７０（ｓ，６Ｈ），３．６５-２．９３（ｍ，１０Ｈ），２．２０-０．８０（ｍ，２２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６、１００ＭＨｚ）δ＝１７１．８１，１７０．９４，１７０．９０，１７０．８４，１６５．５６，１６５．５３，１６５．４９，１６５．１９，１６５．１２，１６４．８７，１６４．７２，１６４．６３，１６４．５８，１６４．４６，１５８．０９，１５８．０３，１５７．９６，１４５．０８，１４４．７４，１３５．８７，１３５．７３，１３５．４８，１３５．４２，１３３．８０，１３３．５７，１３３．４２，１３３．２９，１２９．６０，１２９．５５，１２９．２６，１２９．２０，１２９．０４，１２９．００，１２８．８７，１２８．７４，１２８．６９，１２８．５９，１２８．３６，１２８．３４，１２８．２７，１２８．０２，１２７．８６，１２７．７７，１２７．５７，１２６．７４，１２６．５６，１１３．１９，１１３．０９，９９．２６，９５．９４，８５．７７，８５．１０，７４．８３，７３．５８，７２．５５，７１．４３，７０．４４，７０．０７，６９．０１，６８．８７，６８．５８，６８．１９，６７．４５，６５．１９，６３．２９，６３．４８，６３．３３，６２．４７，５９．７５，５５．５９，５４．９９，５４．９６，５３．４４，４４．５６，３８．２１，３６．３０，３５．７６，３５．４１，３４．１５，３２．５２，３０．７４，３０．１５，２９．０９，２８．８４，２８．６６，２８．５６，２８．５２，２６．１８，２５．２７，２５．２２，２４．５４，２４．１４．２１．２２，２０．７５，２０．７１，１８．５９，１４．０７，１３．５４。ＭＳ．Ｃ１０２Ｈ１０４Ｎ２Ｏ２４について計算された分子量、計算値１７４０．７０、実測値１２６３．７（Ｍ＋Ｎａ）。
長いアルキル鎖ＣＰＧ２２１の調製：
ヒドロキシ誘導体２２０（１．５０ｇ、０．８６２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解させ、そこにコハク酸無水物（０．１７４ｇ、２当量）とＤＭＡＰ（０．３１６ｇ、３当量）を添加し、一晩撹拌した。ＴＬＣによって反応が完了したことが示された。反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、冷えた希釈クエン酸溶液と水で連続的に洗浄し（２回）、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、高真空下で乾燥させて、コハク酸塩を得た。前工程からのコハク酸塩とＨＢＴＵ（０．３９２ｇ、１．２当量）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解させた。そこにＤＩＥＡ（０．４５０ｍＬ）を添加し、混合物をアルゴン下で５分間撹拌した。長鎖アルキルアミン-ＣＰＧ（ｌｃａａ ＣＰＧ、５．３０ｇ、１３３ｍｍｏｌ／ｇ）を混合物に添加し、２時間穏やかに振盪させた。ＣＰＧを濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物、およびＤＣＭで連続的に洗浄し、乾燥させた。乾燥したＣＰＧを別のフラスコに移し、穏やかに振盪させながら、ＴＥＡ（１ｍＬ）の存在下、ピリジン（２５％）中のＡｃ２Ｏで１５分間処理した。最後に、ＣＰＧを濾過し、ＤＣＭ、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（９：１）、次いでＤＣＭ、およびエーテルで洗浄した。ＣＰＧ２２１を真空下で一晩乾燥させ、報告されている通りにローディングを測定した（５．６２ｇ、ローディング：４２μｍｏｌ／ｇ）。
Figure 2023010881000104
ヒドロキシ誘導体２２０（０．２００ｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．８０ｍＬ）とクロロアミダイト試薬（０．０６８ｍＬ）を添加し、一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、溶媒を減圧下で除去し、（ＴＥＡで中和した）シリカゲルカラムに直接充填した。まず２：１（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、次いでＥｔＯＡｃで溶出して、生成物（０．１５０ｇ、６７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝７．１０-８．１２（ｍ，４８Ｈ），６．８５-６．７５（ｍ，４Ｈ）６．１０（ｔ，Ｊ＝１０．１９Ｈｚ，１Ｈ），５．８０-５．６０（ｍ，３Ｈ），５．３３-５．２０（ｍ，２Ｈ），５．００-４．０６（ｍ，１２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．９０-３．０５（ｍ，１６Ｈ），２．８０-１．０１（２７Ｈ）。３１Ｐ（ＣＤＣｌ３、１６１ＭＨｚ）δ＝１４５．８３，１４５．４１，１４４．９５。ＭＳ．Ｃ１１１Ｈ１２１Ｎ４Ｏ２５について計算された分子量、計算値１９４０．８１、実測値１９６３．８０（Ｍ＋Ｎａ）。
実施例１２．ＲＮＡ合成および二重鎖アニーリング
１．オリゴヌクレオチド合成：
オリゴヌクレオチドは全て、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機またはＡＢＩ ３９４合成機で合成された。別途明記されない限り、市販の制御多孔質ガラス固体担体（ｄＴ-ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社製）と、標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイト、すなわち、５’-Ｏ-ジメトキシトリチルＮ６-ベンゾイル-２’-ｔ-ブチルジメチルシリル-アデノシン-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピル-２-シアノエチルホスホロアミダイト、５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ４-アセチル-２’-ｔ-ブチルジメチルシリル-シチジン-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピル-２-シアノエチルホスホロアミダイト、５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ２-イソブチリル-２’-ｔ-ブチルジメチルシリル-グアノシン-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピル-２-シアノエチルホスホロアミダイト、および５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-２’-ｔ-ブチルジメチルシリル-ウリジン-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピル-２-シアノエチルホスホロアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。２’-Ｆホスホロアミダイト、５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ４-アセチル-２’-フルオロ-シチジン-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピル-２-シアノエチル-ホスホロアミダイト、および５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-２’-フルオロ-ウリジン-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピル-２-シアノエチル-ホスホロアミダイトは、Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入した。１０％ ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中、０．２Ｍの濃度で使用したグアノシンを除いて、ホスホロアミダイトは全て、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中、０．２Ｍの濃度で使用した。１６分の連結／再利用時間を使用した。活性剤は、５-エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）であり、ＰＯ-酸化については、ヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ-酸化については、２，６-ルチジン／ＡＣＮ（１：１ ｖ／ｖ）中のＰＡＤＳ（２％）を使用した。
リガンドがコンジュゲートされした鎖を、対応するリガンドを含有する固体担体を用いて合成した。例えば、配列の３’-末端での糖質部分／リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃについて）の導入は、対応する糖質固体担体を用いて合成を開始することによって達成した。同様に、３’-末端のコレステロール部分は、コレステロール担体上で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分を、先の実施例に記載されたような選択したテザーを介してｔｒａｎｓ-４-ヒドロキシプロリノールに連結させて、ヒドロキシプロリノール-リガンド部分を得た。その後、スクシネートリンカーを介してヒドロキシプロリノール-リガンド部分を固体担体と連結させるか、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホロアミダイトに変換し、所望の糖質コンジュゲートビルディングブロックを得た。詳細については実施例１～１１を参照されたい。フルオロフォア標識ｓｉＲＮＡを、対応するホスホロアミダイトまたは固体担体（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入）から合成した。オレイルリトコール酸（ＧａｌＮＡｃ）３ポリマー担体は、３８．６μｍｏｌ／グラムのローディングで自家生産した。マンノース（Ｍａｎ）３ポリマー担体も、４２．０μｍｏｌ／グラムのローディングで自家生産した。
所望の位置での、例えば、配列の５’-末端での、選択されたリガンドのコンジュゲーションは、別途明記されない限り、標準的なホスホロアミダイト連結条件下で、対応するホスホロアミダイトを、成長中の鎖に連結させることによって達成した。固体に結合したオリゴヌクレオチドに対する、５-（エチルチオ）-１Ｈ-テトラゾール活性剤の存在下でのホスホロアミダイトの０．１Ｍ無水ＣＨ３ＣＮ溶液の延長１５分の連結。報告されている通りに（１）標準的なヨウ素水を用いて、またはコンジュゲートオリゴヌクレオチドの１０分の酸化待ち時間を伴う、ｔｅｒｔ-ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いた処理によって、ヌクレオチド間ホスファイトからホスフェートへの酸化を行なった。ホスホロチオエートは、ＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入）、ＰＡＤＳ、およびまたはボーケージ試薬などの硫黄転移試薬を用いて、ホスファイトからホスフェートへの酸化によって導入した。コレステロールホスホロアミダイトは、自家合成し、ジクロロメタン中、０．１Ｍの濃度で使用した。コレステロールホスホロアミダイトの連結時間は、１６分であった。
３’-コレステロール-３’-糖質を含有するオリゴヌクレオチドの合成を、コレステロールホスホロアミダイトの、所望の糖質を持つ固体担体への連結と、それに続くヌクレオシドホスホロアミダイトへの連結によって達成した。第２のリガンドを含むまたは含まないＰＥＧ化オリゴヌクレオチドを、対応するＰＥＧ-ＮＨＳエステルのアミノ結合配列への合成後コンジュゲーションによって得た。アミノリンカーを、対応するｔｒａｎｓ-４-ヒドロキシプロリノールベースのアミノリンカーまたは市販のアミノリンカーを用いて、配列中の所望の位置に導入した。例えば、３’-ＰＥＧ-３’-ＧａｌＮＡｃ含有オリゴヌクレオチドの合成を、ｔｒａｎｓ-４-ヒドロキシプロリノールアミノリンカーホスホロアミダイトの、所望のＧａｌＮＡｃを持つ固体担体への連結と、それに続くヌクレオシドホスホロアミダイトへの連結によって遂行した。こうして得られたオリゴヌクレオチドを、配列の性質に応じて、重炭酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ７．５～９での、ＰＥＧ-ＮＨＳエステルとの合成後コンジュゲーションに供した。
２．脱保護Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成が完了した後、担体を１００ｍｌガラスボトル（ＶＷＲ）に移した。オリゴヌクレオチドを、８０ｍＬのエタノールアンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の混合物を用いて、５５℃で６．５時間、塩基とリン酸基を同時に脱保護しながら担体から切断した。ボトルを氷上で短時間冷却し、その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０ｍＬのボトルに入れた。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部のエタノール／水（１：１ ｖ／ｖ）で洗浄した。その後、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ-ｖａｐ）で混合物の容量を約３０ｍＬにまで減らした。その後、混合物をドライアイス上で凍結させ、真空下、スピードバックで乾燥させた。
３．脱保護ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍｌのトリエチルアミンとトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）またはピリジン－ＨＦとＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。その後、反応物を５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に合わせ、精製するまでフリーザーで保存した。
４．分析
精製する前に、オリゴヌクレオチドを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析したが、緩衝液とカラムの選択は、配列とコンジュゲートされるリガンドの性質によって決まる。
５．糖がコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＥＧ化
アミノリンカーで官能化されたオリゴヌクレオチドを、ｐＨ７．５～９．０の重炭酸ナトリウム緩衝液中で、所望の分子量のＰＥＧ-ＮＨＳエステルで処理した。反応の進行は、ＨＰＬＣでモニターした。反応が完了した後、ＰＥＧ化オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで精製し、ＭＳで分析した。
６．ＨＰＬＣ精製
リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを調製的な逆相ＨＰＬＣで精製した。コンジュゲートされていないオリゴヌクレオチドを、自家で詰めたＴＳＫゲルカラムでの陰イオン交換ＨＰＬＣで精製した。緩衝液は、１０％ ＣＨ３ＣＮ（緩衝液Ａ）中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）と１０％ ＣＨ３ＣＮ、１Ｍ ＮａＢｒ（緩衝液Ｂ）中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）であった。全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させた。約０．１５ ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを水で１５０μｌに希釈し、その後、ＣＧＥとＬＣ／ＭＳ分析用の特殊なバイアルにピペッティングした。化合物は、最終的に、ＬＣ-ＥＳＭＳとＣＧＥで分析した。
７．ｓｉＲＮＡ調製
ｓｉＲＮＡの調製のために、等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、ゆっくりと室温まで冷却した。二重鎖の完全性は、ＨＰＬＣ分析で確認した。
Figure 2023010881000105
Figure 2023010881000106
Figure 2023010881000107
Figure 2023010881000108
実施例１３：マウスにおける動物試験
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５匹／群、８～１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製（米国マサチューセッツ州所在））における製剤化されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた少量の尾静脈注射によって行なった。ＡＤ-３６２９、ＡＤ-３６７１、ＡＤ-３６７２、ＡＤ-３６７３、およびＡＤ-３６７４について、１００ｍｇ／ｋｇで３日連続投与を行なった。注射しやすくするために、マウスを約３分間赤外線ランプの下に置いた。最後の投与から４８時間後に、ＣＯ２による窒息によってマウスを屠殺した。０．２ｍｌの血液を後眼窩採血により採取し、肝臓を摘出し、液体窒素中で凍結させた。血清、肝臓、および回腸は、－８０℃で保存した。マウス血清中の総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、ＷａｋｏのコレステロールＥ酵素比色法（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．社製(米国バージニア州リッチモンド所在)）を用いて測定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いて、ＶＥＲＳＡ Ｍａｘ Ｔｕｎａｂｌｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ社製（米国カリフォルニア州所在））で測定した。標的遺伝子ＡｐｏＢのメッセージレベルは、以下のようなｂＤＮＡ解析によって測定した。
ｂＤＮＡ解析：
６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ社製）を用いて、凍結した肝臓および回腸をすり潰し、解析するまで粉末を－８０℃で保存した。プロトコルに従って、分岐ＤＮＡ技術をベースとしたＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製（米国カリフォルニア州フレモント所在））を用いて、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベルを検出した。１０～２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、６００ｕｌの０．３ｕｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製の＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製の＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で一晩溶解させた。その後、１０ｕｌのライセートを９０ｕｌの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、マウスＰＣＳＫ９およびマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットを含むＰａｎｏｍｉｃｓ捕捉プレート（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製(米国所在)）上で、５５℃で一晩インキュベートした。その後、プロトコルに従って、捕捉プレートにシグナルの増幅と検出のための処理を施し、化学発光を、マイクロプレートルミノメーターＶｉｃｔｏｒ２-Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で相対光単位（ＲＬＵ）として読み取った。肝臓と回腸のライセートにおけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群と比較した。
結果：
表４に示すように、ＰＢＳ対照と比較して、化合物ＡＤ-３６７３、およびＡＤ-３６７４による処置は、マウスの肝臓と回腸におけるＰＣＳＫ９転写物レベルの顕著な（約５０％）および（約７６％）の低下（ＰＢＳ対照群に対して正規化したときに、より小さいＰＣＳＫ９対ＧＡＰＤＨ転写物比で示される）をもたらし、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡ分子がインビボで活性があることを示した。表４に示すように、サイレンシング活性は、それらの動物でそれぞれ３２％および４６％の総コレステロールの低下となって現れた。
Figure 2023010881000109
実施例１４：コレステロールのみがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡと比べたコレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡのサイレンシング活性
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（３匹／群、８～１０週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）における製剤化されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、２７Ｇ針を用いた少量の尾静脈注射によって行なった。１００ｍｇ／ｋｇで３日連続投与を行なった。最後の投与から２４時間後にマウスを衰弱死させ、臓器を摘出し、液体窒素中で凍結させ、血液は、最後の投与から１、２、５、８、１１、および１５日目に採取した。採取した血清、肝臓、および回腸は、－８０℃で保存した。総血清コレステロールを、製造元の指示書に従って、Ｓｔａｎｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国テキサス州ベルネ所在）のＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｉｎｄｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｔｅｓｔを用いて測定した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを用いて、ＶＥＲＳＡ Ｍａｘ Ｔｕｎａｂｌｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製（米国カリフォルニア州サニーバレー所在））で測定した。
ｂＤＮＡ解析：
６８５０ Ｆｒｅｅｚｅｒ／Ｍｉｌｌ Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ社製）を用いて、凍結した肝臓をすり潰し、解析するまで粉末を－８０℃で保存した。プロトコルに従って、分岐ＤＮＡ技術をベースとしたＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＡｐｏＢとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを検出した。１０～２０ｍｇの凍結した肝臓の粉末を、１０００ｕｌの０．３ｕｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＰＲＫ０９２）を含む組織／細胞溶解溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，＃ＭＴＣ０９６Ｈ）中、６５℃で４０分間溶解させた。その後、１０ｕｌのライセートを９０ｕｌの溶解ワーキング試薬（２容量の水に１容量のストック溶解混合液）に添加し、マウスＡｐｏＢおよびマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットを含むＰａｎｏｍｉｃｓ捕捉プレート（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製(米国所在)）上で、５５℃で一晩インキュベートした。その後、プロトコルに従って、捕捉プレートにシグナルの増幅と検出のための処理を施し、化学発光を、マイクロプレートルミノメーターＶｉｃｔｏｒ２-Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）で相対光単位（ＲＬＵ）として読み取った。肝臓ライセートにおけるＡｐｏＢ ｍＲＮＡ対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比を各々の処置群に対して平均化し、ＰＢＳで処置した対照群と比較した。
結果：
図３１に示すように、コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡと比較して、コレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによる処置は、マウスの肝臓と回腸におけるＡｐｏＢ転写物レベルの顕著な低下（ＰＢＳ対照群に対して正規化したときに、より小さいＡｐｏＢ対ＧＡＰＤＨ転写物比で示される、約６５％対約１０％）をもたらし、コレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡが、コレステロールがコンジュゲートされただけのｓｉＲＮＡと比較して、優れたノックダウンを有することを示した。サイレンシング活性は、ＰＢＳ対照と比較して、コレステロールのみがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡおよびコレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡについて、それぞれ約５０％および約９０％の総コレステロールの低下となって現れた。
図３２に示すように、コレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ（ＡＤ-３６９８）は、コレステロールのみがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ（ＡＤ-５５４４）よりも、改善されて、長くなった総コレステロール低下の持続時間（約１５日対約１０日）を示した。
Figure 2023010881000110
実施例１５．コレステロールがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡとコレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの取込みの比較
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（３匹／群、１６～１９グラム体重、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製(米国マサチューセッツ州所在））におけるＣｙ３標識されたｓｉＲＮＡのボーラス投与を、尾静脈注射によって行なった。注射しやすくするために、マウスを約３分間赤外線ランプの下に置いた。ＡＤ-１８１１７、ＡＤ-１８１１８、ＡＤ-１８１１９、およびＰＢＳの投与を、１００ｍｇ／ｋｇの１回の単一ボーラス注射によって行なった。投与から１５分または３時間後、アベルチン（２４０ｍｇ／ｋｇ）でマウスに麻酔をかけ、その後、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝食塩水で灌流した。マウスの肝臓を４％パラホルムアルデヒドで一晩、その後、２０％スクロース／リン酸緩衝食塩水で一晩固定した。その後、組織をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｔｉｓｓｕｅ-Ｔｅｋ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ； Ｓａｈｕｒａ(米国カリフォルニア州トーランス所在））に包埋し、切片を、－２０℃に保持したクライオスタットを用いて６μｍに切った。これらのスライドをＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎによる顕微鏡検査を用いて解析した。図３２に示すように、コレステロール-（ＧａｌＮＡｃ）３がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ（ＡＤ-１８１１９）は、コレステロールのみ（ＡＤ-１８１１７）または（ＧａｌＮＡｃ）３のみ（ＡＤ-１８１１８）がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡと比べて、優れた細胞への取込みを有していた。
実施例１６．糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるＦＶＩＩのインビボサイレンシング
実験デザイン
Figure 2023010881000111
図３９および図４０は、糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡを用いたＦＶＩＩのインビボサイレンシングの結果を示している。
実施例１７．糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるインビボサイレンシングに対するスペーサー、結合、価数、およびコレステロール位置の効果
実験デザイン
－ １日に１回、３日連続で、１００ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ中）、ｉ．ｖ．（ボーラス）
－ 最後の投与の２４時間後に屠殺
－ 肝臓と空腸の試料でＡｐｏＢ（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のｂＤＮＡアッセイ
－ 肝臓における総コレステロールも測定した。
結果を図４１に示す。ジスルフィド結合のあるコンジュゲートは、コレステロールコンジュゲートのみを用いた場合と同様のＡｐｏＢレベルの阻害を示した。これは、ジスルフィド結合のないコンジュゲートで見られた阻害よりも低かった。この効果は、ジスルフィド結合がどこに配置されるかを問わず見られた。コレステロールがセンス鎖の５’末端に配置された場合には、阻害が、コレステロールコンジュゲートのみのレベルに低下するのが見られたので、センス鎖の３’末端にコレステロールを配置させることが明らかに好まれた。二価のコンジュゲートは三価のコンジュゲートと同じぐらい効果的であった。
実施例１８．インビボでの遺伝子サイレンシングに対するリガンドの役割（ＧａｌＮＡｃ対グルコース）
二価のＧａｌＮＡｃコンジュゲートおよびグルコースコンジュゲート（以下に図示）を用いて、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートによる受容体標的化の関与を確認した。
Figure 2023010881000112
実験デザイン：
－ １日に１回、３日連続で、１００ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ中）、ｉ．ｖ．（ボーラス）
－ 最後の投与の２４時間後に屠殺
－ 肝臓と空腸の試料でＡｐｏＢのｂＤＮＡ（ＧＡＰＤＨに対して正規化）
－ 肝臓の総コレステロールも測定した。
図４２に結果を示す。肝臓において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、グルコースコンジュゲートまたはコレステロールのみのコンジュゲートよりも高いＡｐｏＢの阻害を示した。しかしながら、空腸では、３つのコンジュゲートは全て、同様の活性を示した。空腸にはＡＳＧＰ-Ｒ１がないので、見られた活性は、３つのデザイン全てにコレステロールが存在したからであった可能性がある。
実施例１９．インビトロでの糖質コンジュゲートのサイレンシング活性
ＡＳＧＰＲを下方調節するために、初代マウス肝細胞を、コラーゲンコーティングした６ウェルディッシュに１日間または６日間播種した。５ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて、ＡＳＧＲを活性化させた。ＡｐｏＢまたはＬｕｃのｓｉＲＮＡを無血清培地中に２ｕＭで添加し、２４時間取込みを進行させた。細胞を溶解し、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをｂＤＮＡアッセイで評価した。６日目でのＡＳＧＲの下方調節を確認するために、ウェスタンブロットを行なった。図４３は、３つ全てのコンジュゲート（コレステロールのみ、ＧａｌＮＡｃのみ、およびコレステロール-ＧａｌＮａｃ併用）が、１日目でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡサイレンシングを示したことを示している。培養数日後、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのサイレンシング能力が損なわれるが、これは、初代細胞の培養時間の延長に伴って起こることが知られているＡＳＧＲなどの受容体の下方調節と一致している。コレステロールコンジュゲートについても、６日目でのサイレンシング能力が若干低下することが示された。以下のｓｉＲＮＡを用いた：
ＡＤ-１９５５（対照、-／-）
ＡＤ-６４９０（対照、-／Ｃｙ３）
ＡＤ-５５４６（Ｃｈｏｌ／Ｃｙ３）
ＡＤ-３６９７（ＧａｌＮＡｃ／Ｃｙ３）
ＡＤ-３６９８（ＧａｌＮＡｃ＋Ｃｈｏｌ／Ｃｙ３）。
実施例２０．インビトロでの取込みの間の、糖質がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡのＡＳＧＲリガンドアシアロフェツイン（ＡＳＦ）との競合
初代マウス肝細胞を、コラーゲンコーティングした６ウェルディッシュに１日間播種した。５ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて、ＡＳＧＲを活性化させた。ｓｉＲＮＡとのインキュベーションの前と、ｓｉＲＮＡとのインキュベーションの間に、増加量のアシアロフェツインを用いて、ＧａｌＮＡｃがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの結合を競合させた。ＡｐｏＢまたはＬｕｃのｓｉＲＮＡを無血清培地中に４ｕＭで添加し、２４時間取込みを進行させた。細胞を溶解し、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンをｂＤＮＡアッセイで評価した。図４４は、アシアロフェツインの存在によって、ＧａｌＮＡｃがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡとコレステロール－ＧａｌＮＡｃがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの取込みが競合することを示している。アシアロフェツインがＡｐｏＢのサイレンシングに打ち勝つ能力は、ＧａｌＮＡｃとＡＳＧＲの相互作用が取込みと活性の仲介に重要であるということを示唆している。以下のｓｉＲＮＡを用いた：
ＡＤ-１９５５（対照、-／-）
ＡＤ-６４９０（対照、-／Ｃｙ３）
ＡＤ-３６９７（ＧａｌＮＡｃ／Ｃｙ３）
ＡＤ-３６９８（ＧａｌＮＡｃ＋Ｃｈｏｌ／Ｃｙ３）。
実施例２１．糖質コンジュゲートのインビトロでの受容体結合と取込み
ＡＳＧＰＲを下方調節するために、初代マウス肝細胞を、コラーゲンコーティングした６ウェルディッシュに１日間または６日間播種した。５ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて、ＡＳＧＲを活性化させた。ＡｐｏＢの二重鎖を無血清培地中に１ｕＭで添加し、６時間取込みを進行させた。取込みが完了した後、細胞を３．７％ＰＦＡで固定し、ＤＡＰＩで対比染色した。図４５に見られるように、コレステロールコンジュゲート（ＡＤ-１８１１７）またはコレステロール＋ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（ＡＤ-１８１１９）のいずれかを含むＣｙ３標識ｓｉＲＮＡは、コンジュゲートのないＣｙ３標識ｓｉＲＮＡ（ＡＤ-１８５６０）またはＧａｌＮＡｃコンジュゲートのみのＣｙ３標識ｓｉＲＮＡ（ＡＤ-１８１１８）よりも遥かに効率的に取り込まれた。
実施例２２．ガラクトースがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡによるインビボでのＡｐｏＢ遺伝子サイレンシング
マウスに５０ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラスで注射した。図４６Ａに示す、ガラクトースがコンジュゲートされたｓｉＲＮＡは、化合物２０７から合成した。図４６Ｂは、コレステロールとガラクトースの両方のコンジュゲートを含むｓｉＲＮＡが、ガラクトースコンジュゲートのみを含むｓｉＲＮＡと比較して、遺伝子サイレンシングを生じさせたことを示している。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
次式（Ｉ）に示す構造を有する化合物を含むｉＲＮＡ剤：
Figure 2023010881000113
 式中、
ＡおよびＢは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、またはＳであり；
ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、ＨまたはＣ１-Ｃ６アルキルであり；
ＸおよびＹは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-リンカー-ＯＰ（Ｚ’’’）（Ｚ’’’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-式（Ｉ）、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-、または-リンカー-Ｒであり；
Ｒは、ＬＧであるかまたは以下に示す構造：
Figure 2023010881000114
 を有し；
ＬＧは、それぞれ存在ごとに独立して、リガンドであり；かつ
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’、およびＺ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳである。
［実施態様２］
次式（Ｉ’）に示す構造を有する化合物を含むｉＲＮＡ剤：
Figure 2023010881000115
 式中、
ＡおよびＢは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、またはＳであり；
ＸおよびＹは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-Ｒ１-Ｑ’-Ｒ２-ＯＰ（Ｚ’’’）（Ｚ’’’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-式（Ｉ）、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-、または-Ｑ-Ｒであり；
Ｒは、Ｌ１であるか、または次式（ＩＩ）～（Ｖ）：
Figure 2023010881000116
 に示す構造を有し；
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０～２０であり、ここで、繰り返し単位は、同一であっても異なっていてもよく；
ＱおよびＱ’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、-（Ｐ７-Ｑ７-Ｒ７）ｐ-Ｔ７-、または-Ｔ７-Ｑ７-Ｔ７’-Ｂ-Ｔ８’-Ｑ８-Ｔ８であり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｐ７、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃ、Ｔ７、Ｔ７’、Ｔ８、およびＴ８’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
Ｂは、-ＣＨ２-Ｎ（ＢＬ）-ＣＨ２-であり；
ＢＬは、-ＴＢ-ＱＢ-ＴＢ’-ＲＸであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃ、Ｑ７、Ｑ８、およびＱＢは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上で中断または終結されることがあり；
ＴＢおよびＴＢ’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
ＲＸは、親油性物質、ビタミン、ペプチド、糖質、エンドソーム溶解成分、ステロイド、テルペン、またはカチオン性脂質であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ７は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ-、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ-Ｏ、
Figure 2023010881000117
 またはヘテロシクリルであり；
Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質であり；
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’、およびＺ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
ｐはそれぞれ存在ごとに独立して、０～２０である。
［実施態様３］
前記ｉＲＮＡ剤が二本鎖である、実施態様１に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様４］
前記化合物が前記鎖の１つの３’末端にある、実施態様３に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様５］
前記化合物がセンス鎖の３’末端にある、実施態様４に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様６］
前記ｉＲＮＡ剤が、少なくとも１つの次式（ＶＩ）の構造をさらに含む、実施態様１に記載のｉＲＮＡ剤：
Figure 2023010881000118
 式中、
Ｘ６およびＹ６は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-ヌクレオシド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）Ｏ-Ｒ１-Ｑ’-Ｒ２-ＯＰ（Ｚ’’’）（Ｚ’’’’）Ｏ-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-式（Ｉ）もしくは-Ｐ（Ｚ’）（Ｚ’’）-であり；
Ｑ６は、存在しないか、または-（Ｐ６-Ｑ６-Ｒ６）ｖ-Ｔ６-であり；
Ｐ６およびＴ６は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ６は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上で中断または終結されることがあり；
Ｒ６は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ-、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ-Ｏ、
Figure 2023010881000119
 またはヘテロシクリルであり；
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ’’、Ｚ’’’、およびＺ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、ＯまたはＳであり；
ｖはそれぞれ存在ごとに独立して、０～２０を表し；
ＲＬは、親油性物質またはカチオン性脂質である。
［実施態様７］
ＲＬが親油性物質である、実施態様６に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様８］
ＲＬがコレステロールである、実施態様６に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様９］
ＲＬが
Figure 2023010881000120
 である、実施態様６に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１０］
Ｒが、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、または式（Ｖ）である、実施態様２に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１１］
Ｒが、次式（Ｖ）：
Figure 2023010881000121
 の構造を有する、実施態様１０に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１２］
Ｒが
Figure 2023010881000122
 である、実施態様１１に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１３］
Ｒが
Figure 2023010881000123
 である、実施態様１１に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１４］
前記化合物が、構造
Figure 2023010881000124
 を有する、実施態様２に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１５］
前記化合物が、構造
Figure 2023010881000125
 を有する、実施態様２に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１６］
前記化合物が、構造
Figure 2023010881000126
 を有する、実施態様２に記載のｉＲＮＡ剤。
［実施態様１７］
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞に実施態様１に記載のｉＲＮＡ剤を提供する工程を含む方法。
［実施態様１８］
前記標的遺伝子が、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ-Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ-２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ-１遺伝子、β-カテニン遺伝子、ｃ-ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子の突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異、およびｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異からなる群から選択される、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
単独でまたは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と組み合わせて実施態様１に記載のｉＲＮＡ剤を含む薬学的組成物。
［実施態様１９］
単独でまたは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と組み合わせて実施態様１に記載のｉＲＮＡ剤を含む薬学的組成物。
配列表
Figure 2023010881000226
Figure 2023010881000227
Figure 2023010881000228
Figure 2023010881000229
Figure 2023010881000230
Figure 2023010881000231
Figure 2023010881000232
Figure 2023010881000233
Figure 2023010881000234
Figure 2023010881000235
Figure 2023010881000236
Figure 2023010881000237
Figure 2023010881000238
Figure 2023010881000239
Figure 2023010881000240
Figure 2023010881000241
Figure 2023010881000242
Figure 2023010881000243
Figure 2023010881000244
Figure 2023010881000245
Figure 2023010881000246
Figure 2023010881000247
Figure 2023010881000248
Figure 2023010881000249
Figure 2023010881000250
Figure 2023010881000251
Figure 2023010881000252
Figure 2023010881000253
Figure 2023010881000254
Figure 2023010881000255
Figure 2023010881000256
Figure 2023010881000257
Figure 2023010881000258
Figure 2023010881000259
Figure 2023010881000260
Figure 2023010881000261
Figure 2023010881000262
Figure 2023010881000263
Figure 2023010881000264

Claims (29)

  1. 次式（Ｉ’）に示す構造を有する化合物：
    Figure 2023010881000127
     ［式中、
    ＡおよびＢは、それぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、またはＳであり；
    ＸおよびＹの一方は、Ｈ、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、またはホスホロアミダイトであり、かつＸおよびＹのもう一方は保護基であり；
    Ｒは、Ｌ１であるか、または次式（ＩＩ）～（Ｖ）：
    Figure 2023010881000128
     に示す構造を有し；
    ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０～２０であり、ここで、繰り返し単位は、同一であっても異なっていてもよく；
    Ｑは、存在しないか、-（Ｐ７-Ｑ７-Ｒ７）ｐ-Ｔ７-、または-Ｔ７-Ｑ７-Ｔ７’-Ｂ’-Ｔ８’-Ｑ８-Ｔ８－であり；
    Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｐ７、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃ、Ｔ７、Ｔ７’、Ｔ８、およびＴ８’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
    Ｂ’は、-ＣＨ２-Ｎ（ＢＬ）-ＣＨ２-であり；
    ＢＬは、-ＴＢ-ＱＢ-ＴＢ’-ＲＸであり；
    Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃ、Ｑ７、Ｑ８、およびＱＢは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、または置換アルキレンであり、ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上で中断または終結されてよく；
    ＴＢおよびＴＢ’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
    ＲＸは、親油性物質、またはカチオン性脂質であり；
    Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、およびＲ７は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ-Ｏ、
    Figure 2023010881000129
     またはヘテロシクリルであり；
    Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、またはヒドロキシル保護基を有するその誘導体であり；
    Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＮ）２であり；
    ＲＮは、それぞれ存在ごとに独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり；
    Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
    ｐはそれぞれ存在ごとに独立して、０～２０を表す］。
  2. ＡおよびＢはそれぞれＯであり；
    ＸおよびＹの一方はＨであり、かつＸおよびＹのもう一方は保護基であり；
    Ｒは式（Ｖ）に示す構造を有し；
    Ｑは、－Ｐ７-Ｑ７-Ｔ７－であり；
    Ｑ７はアルキレンであり；
    Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、ヒドロキシル保護基を有する、糖質の誘導体である
    請求項１に記載の化合物。
  3. ＸはＨであり、かつＹは保護基であり；
    Ｑは、－Ｐ７-Ｑ７-Ｔ７－であり、Ｐ７はＣ（Ｏ）であり、Ｑ７はアルキレンであり、かつＴ７はＣ（Ｏ）ＮＨである；
    請求項２に記載の化合物。
  4. 前記糖質は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ－ガラクトサミニトール、マンノース、マンノサミン、マンノース－６－リン酸、グルコース、グルコサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、グルコース－６－リン酸、グルコサミニトール、グルコースグリセルアルデヒド、フコース、フコサミン、フクロース、ラクトース、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ－フシトール、Ｌ－フシトール、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノス－ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムノース、ラムニトール、ラムノサミン、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロースからなる群より選択される、請求項２または３に記載の化合物。
  5. 前記糖質は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、請求項４に記載の化合物。
  6. Figure 2023010881000130
     からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
  7. Figure 2023010881000131
     である、請求項２に記載の化合物。
  8. Figure 2023010881000132
     である、請求項２に記載の化合物。
  9. Figure 2023010881000133
     である、請求項２に記載の化合物。
  10. Figure 2023010881000134
     である、請求項１に記載の化合物。
  11. Figure 2023010881000135
     である、請求項１に記載の化合物。
  12. Figure 2023010881000136
     である、請求項１に記載の化合物。
  13. Figure 2023010881000137
     である、請求項１に記載の化合物。
  14. Figure 2023010881000138
     である、請求項１に記載の化合物。
  15. Figure 2023010881000139
     である、請求項１に記載の化合物。
  16. Figure 2023010881000140
     である、請求項１に記載の化合物。
  17. Figure 2023010881000141
     である、請求項１に記載の化合物。
  18. 次式により表される化合物。
    Figure 2023010881000142
  19. 化合物１１７を作製する方法であって、
    Figure 2023010881000143
     ヒドロキシプロリン化合物１１５：
    Figure 2023010881000144
     を加水分解して、ヒドロキシプロリン化合物１１６：
    Figure 2023010881000145
     を形成するステップ；および
    ヒドロキシプロリン化合物１１６を、リガンド部分化合物１１０：
    Figure 2023010881000146
     またはその塩と、化合物１１７を作製するのに有効な条件下で反応させるステップ
    を含む、方法。
  20. 前記加水分解するステップが、ＴＨＦ／ＤＣＭ／水の中のＬｉＯＨの存在下で行われ、次いで酢酸で中和することを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. ヒドロキシプロリン化合物１１６をリガンド部分化合物１１０と反応させるステップが、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ、またはＤＭＦ中のＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの存在下で行われる、請求項１９に記載の方法。
  22. ＧａｌＮＡｃ酸１０３：
    Figure 2023010881000147
     を、分岐リンカー化合物１０８：
    Figure 2023010881000148
     またはその塩と、リガンド部分化合物１０９：
    Figure 2023010881000149
     を形成するのに有効な条件下で反応させるステップ；および
    前記リガンド部分化合物１０９を、リガンド部分化合物１１０を形成するのに有効な条件下で水素化するステップ
    をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  23. ＧａｌＮＡｃ酸１０３を分岐リンカー化合物１０８と反応させるステップが、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ／ＨＯＢｔの存在下で行われる、請求項２２に記載の方法。
  24. リガンド部分化合物１０９を水素化するステップが、Ｐｄ／Ｃ、メタノール、および酢酸の存在下でＨ２を用いて行われる、請求項２２に記載の方法。
  25. ＧａｌＮＡｃ誘導体化合物１０２：
    Figure 2023010881000150
     を、ＧａｌＮＡｃ酸化合物１０３を形成するのに有効な条件下で水素化するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  26. ＧａｌＮＡｃ誘導体化合物１０２を水素化するステップが、Ｐｄ／Ｃ、メタノール、および酢酸の存在下でＨ２を用いて行われる、請求項２５に記載の方法。
  27. 分岐リンカー化合物１０６：
    Figure 2023010881000151
     を、リンカー化合物：
    Figure 2023010881000152
     と反応させて、分岐リンカー化合物１０７：
    Figure 2023010881000153
     を形成するステップ；および
    分岐リンカー化合物１０７のＮ保護基を、分岐リンカー化合物１０８を形成するのに有効な条件下で脱保護するステップ
    をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  28. 分岐リンカー化合物１０６を前記リンカー化合物と反応させるステップが、ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＤＩＥＡの存在下で行われる、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記脱保護するステップが、ＴＦＡ／ＤＣＭの存在下で行われる、請求項２７に記載の方法。
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