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JP2019531744A - 腫瘍浸潤リンパ球拡大培養用の改変人工抗原提示細胞 - Google Patents

腫瘍浸潤リンパ球拡大培養用の改変人工抗原提示細胞 Download PDF

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Abstract

一部の実施形態において、ＭＯＬＭ−１４又はＥＭ−３骨髄系細胞など、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを含めた、単離された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関する組成物及び方法が開示され、骨髄系細胞はＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、及び１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬ及び／又はＯＸ４０Ｌをコードする核酸とを含み、ＣＤ８６及び４−１ＢＢＬ及び／又はＯＸ４０Ｌタンパク質を発現するように骨髄系細胞を形質導入する。一部の実施形態において、ａＡＰＣで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法及びａＡＰＣによる拡大培養後のＴＩＬを使用して癌を治療する方法もまた開示される。

Description

関連出願の相互参照
[001] 本国際出願は、２０１７年４月５日に出願された米国仮特許出願第６２／４８１，８３１号、２０１７年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４７５，０５３号、２０１６年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４３８，６００号、及び２０１６年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４１５，２７４号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらは全体として参照により本明細書に援用される。
発明の分野
[002] 腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養用の改変人工抗原提示細胞（artificial antigen presenting cell：ａＡＰＣ）が開示される。
発明の背景
[003] 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の自家養子移入を用いた大型難治性癌の治療は、予後不良の患者に対する強力な治療手法に相当する。Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393。免疫療法の成功には多量のＴＩＬが必要であり、商業化に向けてロバストで信頼性のある方法が求められている。これは、細胞拡大培養に関する技術上、物流上、及び規制上の問題に起因して、実現が課題となっている。ＩＬ−２ベースのＴＩＬ拡大培養と、それに続く「迅速拡大培養法」（ＲＥＰ）が、その速さ及び効率から、ＴＩＬ拡大培養に好ましい方法となりつつある。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。しかしながら、ＲＥＰは１４日の期間でＴＩＬの１，０００倍の拡大培養をもたらすことができるが、それにはフィーダー細胞として、多くの場合に複数のドナーからの、大過剰の（例えば２００倍の）照射した同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、並びに抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）及び高用量のＩＬ−２が必要である。Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42。その高い性能にも関わらず、ＰＢＭＣには、要求される同種異系ＰＢＭＣの数の多さ、複数の健常ドナーから白血球アフェレーシスによってＰＢＭＣを入手する必要性、結果として生じる凍結保存後のＰＢＭＣ生存能力のドナー間変動及び変動性のあるＴＩＬ拡大培養結果、未検出のウイルス性病原体が下流患者感染を引き起こすリスク、並びに各個別のドナー細胞産物の無菌性及び品質を確認し（ウイルス汚染検査を含む）及び拡大培養特性を試験するための大がかりで費用のかかる実験室検査を含め、欠点が数多くある。
[004] 残念ながら、ＴＩＬの拡大培養での使用向けに開発されたａＡＰＣは、ＰＢＭＣと比較すると、入力ＴＩＬの表現型特性の変化、並びに拡大培養性能の不足及び／又は拡大培養結果の変動性の大きさを含め、性能不足を被っている。ａＡＰＣとしての使用に適している可能性のある潜在的細胞は数多くあり、好適な候補を同定するのは予測不可能であるため、これまでポリクローナルＴＩＬ用のａＡＰＣ開発は、専ら十分に確立されたＫ５６２細胞株に焦点が置かれてきた。Butler and Hirano, Immunol. Rev. 2014, 257, 191-209。例えば、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）を発現するように修飾されたＫ５６２細胞がプレＲＥＰ培養下で（ＲＥＰ培養下ではない）試験され、腫瘍消化物からのＴＩＬ拡大培養の増強が決定されたが、しかしＴＩＬ拡大培養を達成するには、なおもＫ５６２細胞と併せてＰＢＭＣを使用する必要があった。Friedman, et al., J. Immunother. 2011, 34, 651-661。ＣＤ６４、ＣＤ８６、及び４−１ＢＢＬを発現するように修飾された他の改変Ｋ５６２細胞が試験されたが、実現したＴＩＬ拡大培養は、良くてもＰＢＭＣと同等の、十中八九はＰＢＭＣに満たないもので、また、好ましくないＣＤ８＋／ＣＤ４＋ Ｔ細胞比の方へのポリクローナルＴＩＬ表現型の偏りも被った。Ye, et al., J. Translat. Med. 2011, 9, 131。最近になって、ＣＤ８６、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、高親和性Ｆｃ受容体（ＣＤ６４）及び膜結合型ＩＬ−１５を発現するように修飾されたＫ５６２細胞もまた、ＴＩＬをＰＢＭＣフィーダーと比較して同等の数で増殖させる（ポストＲＥＰ）ことが示されているが、膜結合型ＩＬ−１５の更なる複雑性が伴う。Forget, et al., J. Immunother. 2014, 37, 448-60。開発された他のシステムは重要な共刺激分子を欠いているか、好ましくないＴ細胞表現型の偏りにつながっているか、又は追加のインターロイキン類（ＩＬ−２１など）が必要になっている。Butler and Hirano, Immunol. Rev. 2014, 257, 191-209。総じて、Ｋ５６２修飾ａＡＰＣが許容できる変動性で一貫したＴＩＬの拡大培養をもたらすとともに、全体的な拡大培養細胞数を含めた他の尺度でもまたＰＢＭＣより良好な性能であるとは明らかになっていない。Ｋ５６２細胞以外の別のａＡＰＣが他の細胞拡大培養方法で成功を収めているが、ＴＩＬを構成する細胞のユニークなポリクローナルサブセットでＰＢＭＣと同じ性能は実現していない。Maus, et al., Nat. Biotechnol. 2002, 20, 143-148；Suhoski, et al., Mol. Ther. 2007, 75, 981-988。
[005] ＭＯＬＭ−１４ヒト白血病細胞株は、再発性急性単球性白血病の患者の末梢血から樹立されたもので、初期の表現型の特徴付けから、少なくとも以下のマーカー：ＣＤ４、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ８７、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ１１６、ＣＤ１１８、及びＣＤ１５５の存在が示された。Matsuo, et al., Leukemia 1997, 11, 1469-77。ＭＯＬＭ−１４の更なる表現型の特徴付けから、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＣＤ５８のレベルがより高く、及びＣＤ８６のレベルがより低いことが見出された。これまで、ＭＯＬＭ−１４細胞及び近縁のＭＯＬＭ−１３細胞が腫瘍免疫療法適用のための細胞の拡大培養に有用なａＡＰＣであると報告されたことはない。
[006] ＥＭ−３ヒト細胞株は、フィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬの患者の骨髄から樹立された。Konopka, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 1985, 82, 1810-4。これまで、ＥＭ−３細胞及び近縁のＥＭ−２細胞株が腫瘍免疫療法適用のための細胞の拡大培養に有用なａＡＰＣであると報告されたことはない。ＥＭ−３細胞の表現型の特徴付けから、少なくとも以下のマーカー：ＣＤ１３、ＣＤ１５、及びＣＤ３３の存在が示される。
[007] 本発明は、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、及びＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）を含めた追加の共刺激分子が形質導入された、ＭＯＬＭ−１３、ＭＯＬＭ−１４、ＥＭ−３、及びＥＭ−２細胞を含めた改変骨髄系列細胞が、マスターセルバンクから効率的に産生することができるａＡＰＣを使用する利点を伴い、変動性が最小限で、コストが低い、且つＰＢＭＣ源としてヒト血液試料に頼らない、多数のＴＩＬの優れた極めて効率的な拡大培養をもたらすという予期せぬ発見を提供する。ＣＤ８６及び４−１ＢＢＬは、Ｔ細胞活性化のための共刺激シグナルを提供する共刺激分子である。追加の共刺激分子が形質導入されたＭＯＬＭ−１４、ＭＯＬＭ−１３、ＥＭ−３、及び／又はＥＭ−２細胞は、例えば、癌免疫療法及び他の療法に使用されるＴＩＬの拡大培養において有用である。
発明の概要
[008] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のベクターが形質導入された骨髄系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[009] ある実施形態において、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質の各々はヒトタンパク質である。
[0010] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと接触した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を刺激し、拡大することができる。
[0011] 本発明の特定の実施形態において、ＣＤ８６をコードする核酸分子が、４−１ＢＢＬをコードする核酸分子と異なるウイルスベクターに含まれても、又は同じウイルスベクターに含まれてもよいことは明らかであろう。
[0012] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、ａＡＰＣは約３０００ＩＵ／ｍＬの濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＯＫＴ−３抗体とを含む細胞培養培地において、ＴＩＬ集団を７日の期間で少なくとも５０倍に拡大する。
[0013] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、ａＡＰＣは、ａＡＰＣと接触したＴ細胞を刺激し、拡大することができる。
[0014] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、骨髄系細胞はＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現する。
[0015] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、骨髄系細胞は膜結合型ＩＬ−１５を本質的に欠いている。
[0016] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、骨髄系細胞はＭＯＬＭ−１４細胞である。
[0017] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、骨髄系細胞はＭＯＬＭ−１３細胞である。
[0018] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、骨髄系細胞はＥＭ−３細胞である。
[0019] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、骨髄系細胞はＥＭ−２細胞である。
[0020] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、ＣＤ８６タンパク質は配列番号８に記載のアミノ酸配列、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、４−１ＢＢＬタンパク質は配列番号９、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。
[0021] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣを提供し、ここで、は１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、ＣＤ８６をコードする核酸分子は配列番号１６に記載の核酸配列を含み、４−１ＢＢＬをコードする核酸分子は配列番号１９に記載の核酸配列を含む。
[0022] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、この方法は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含むａＡＰＣをＴＩＬ集団と接触させるステップを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現し、及びＴＩＬ集団は拡大培養される。ある実施形態において、本方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0023] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含む。
[0024] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0025] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む。
[0026] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0027] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＡＰＣ集団は、細胞培養培地においてＴＩＬ集団を７日の期間で少なくとも５０倍に拡大する。
[0028] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0029] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現する。
[0030] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0031] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＭＯＬＭ−１４細胞である。
[0032] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0033] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＭＯＬＭ−１３細胞である。
[0034] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0035] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＥＭ−３細胞である。
[0036] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0037] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＥＭ−２細胞である。
[0038] ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0039] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸分子と４−１ＢＢＬをコードする核酸分子とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むか、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、４−１ＢＢＬタンパク質は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むか、又はその１つ又は保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む。
[0040] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＣＤ８６をコードする核酸は配列番号１６に記載の核酸配列を含み、４−１ＢＢＬをコードする核酸は配列番号１９に記載の核酸配列を含む。
[0041] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[0042] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１：２００〜１：４００である。
[0043] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１：３００である。
[0044] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、この方法は、ＴＩＬ集団を含むＴＩＬ集団を骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることを含み、ここで、骨髄系ａＡＰＣは、ＴＩＬ上の少なくとも２つの共刺激分子に特異的に結合する少なくとも２つの共刺激リガンドを含み、共刺激分子が共刺激リガンドに結合するとＴＩＬの増殖が誘導され、それによりＴＩＬが特異的に拡大し、及び少なくとも２つの共刺激リガンドはＣＤ８６及び４−１ＢＢＬを含む。ある実施形態において、前述の方法はインビトロ又はエキソビボ方法である。
[0045] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、及び骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入される。
[0046] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬは第２のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、ＴＩＬが患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ
を含む方法から入手可能であり；及びここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、及び骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入される。
[0047] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0048] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手することであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いこと
を含む方法によって入手可能であり；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0049] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0050] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手することであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いこと
を含む方法によって入手可能であり；及びここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0051] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び迅速拡大培養は１４日以下の期間にわたって行われる。
[0052] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第２の集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップを含む方法によって入手可能であり、ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び迅速拡大培養は１４日以下の期間にわたって行われる。
[0053] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む。
[0054] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手することであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いことを含む方法によって入手可能であり；及びここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む。
[0055] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[0056] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手することであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いことを含む方法によって入手可能であり；及びここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[0057] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１：２００〜１：４００である。
[0058] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）集団を提供し、ＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ
を含む方法によって入手可能であり；及びここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１：２００〜１：４００である。特定の実施形態において、第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１：３００である。
[0059] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、及び第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１：３００である。
[0060] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[0061] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ＴＩＬ集団は第２のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び迅速拡大培養の開始から７日後に第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ
を含む方法によって入手可能であり；及びここで、骨髄系ａＡＰＣはＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し、骨髄系ａＡＰＣはＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入され、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[0062] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含む。
[0063] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0064] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0065] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｂ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ
を含む方法によって得られる。
[0066] ある実施形態において、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。ある実施形態において、骨髄系細胞は１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１３細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。特定の実施形態において、骨髄系細胞は１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。特定の実施形態において、骨髄系細胞は１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−２細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−２細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0067] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップであって、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含むステップ；
（ｅ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ；及び
（ｆ）高用量ＩＬ−２レジメンによって患者を処置するステップであって、高用量ＩＬ−２レジメンが、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキンを含み、これらが忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される、ステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0068] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって患者を処置するステップであって、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含むステップ；
（ｅ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ；及び
（ｆ）高用量ＩＬ−２レジメンによって患者を処置するステップであって、高用量ＩＬ−２レジメンが、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキンを含み、これらが忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される、ステップ
を含み；ここで、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0069] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）第１の細胞培養培地中での第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養により第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；及び
（ｂ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ
を含む方法によって入手可能であり；
及び更にここで、ＴＩＬ集団は骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンとの組み合わせで患者に投与するためのものであり、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するためのシクロホスファミドと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するためのフルダラビンを含み、更にここで、ＴＩＬ集団は高用量ＩＬ−２レジメンとの組み合わせで投与するためのものであり、高用量ＩＬ−２レジメンは、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与するための、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキンを含む。特定の実施形態において、ＴＩＬ集団は、高用量ＩＬ−２レジメンの前且つ骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンの後に投与するためのものである。
[0070] 特定の実施形態において、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１３細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。特定の実施形態において、骨髄系ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。
[0071] ある実施形態において、ＴＩＬ集団は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される癌の治療における使用のためのものである。
[0072] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；及び
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、第２の細胞培養培地中にＩＬ−２は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及びＯＫＴ−３抗体は約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。
[0073] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団は患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；及び
（ｂ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップを含む方法によって入手可能であり；ここで、第２の細胞培養培地中にＩＬ−２は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及びＯＫＴ−３抗体は約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する。
[0074] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；及び
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、迅速拡大培養は１４日以下の期間にわたって行われる。
[0075] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団は患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；及び
（ｂ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップを含む方法によって入手可能であり；ここで、迅速拡大培養は１４日以下の期間にわたって行われる。
[0076] 実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；及び
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、初期拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[0077] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；及び
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、迅速拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[0078] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団は患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｂ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップを含む方法によって入手可能であり；ここで、初期拡大培養及び／又は迅速拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[0079] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１：８０〜１：４００である。
[0080] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１：３００である。
[0081] ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は第３のＴＩＬ集団であり、及び
（ａ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第１のＴＩＬ集団は患者から切除された腫瘍から得られ／得られたものであり、及び第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｂ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップを含む方法によって入手可能であり、及びここで、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１：８０〜１：４００である。
[0082] ある実施形態において、迅速拡大培養における第２のＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１：３００である。
[0083] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を提供し、これは、
（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を入手するステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を入手するステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を入手するステップであって、迅速拡大培養の開始から７日後に第３のＴＩＬ集団が第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
を含み、ここで、癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。
[0084] ある実施形態において、本発明は、公知の共刺激分子を発現する腫瘍浸潤リンパ球の増殖を特異的に誘導するためのキットを提供し、このキットは有効量のａＡＰＣを含み、ここで、前記ａＡＰＣは、レンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞又はＥＭ−３細胞を含み、ＬＶは、前記公知の共刺激分子に特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドをコードする核酸を含み、公知の共刺激分子が前記共刺激リガンドに結合すると前記Ｔ細胞が刺激されて拡大し、キットは、アプリケーター及び前記キットの使用説明資料を更に含む。
[0085] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の効力を評価する方法を提供し、これは、
（ａ）内因性ＣＤ１６ Ｆｃ受容体を発現する複数のマウス肥満細胞腫Ｐ８１５細胞を提供するステップであって、Ｐ８１５細胞が高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びホタルルシフェラーゼをベースとするレンチウイルスベクターで形質導入されるステップ；
（ｂ）複数のＰ８１５細胞とＴＩＬとを、ＯＫＴ−３とともに及びＯＫＴ−３なしで共培養するステップであって、それぞれ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化（特異的殺傷）又はリンホカイン活性化キラー性（ＬＡＫ、非特異的殺傷）を評価するステップ；
（ｃ）４時間インキュベートするステップ；
（ｄ）ルシフェリンを加えて５分間インキュベートするステップ；
（ｅ）ルミノメーターを使用して生物発光強度を読み取るステップ；及び
（ｆ）及びパーセント細胞傷害率及び生存率を計算するステップ
を含む。
図面の簡単な説明
[0086] 前述の概要、並びに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むときより良く理解されるであろう。
[0087]照射した同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞を使用したＴＩＬの迅速拡大培養の結果を示す。各ＴＩＬ株（Ｍ１０１５Ｔ及びＭ１０１６Ｔ）（１．３×１０５細胞）をＴ２５フラスコ内で４６個の異なる照射フィーダー（１．３×１０７細胞）、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）及びＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）と７日間共培養した。７日目にＴＩＬの拡大倍数値を計算した。この図は、４６個の異なるフィーダーロットを試験した、別個の刺激実験における２つのＴＩＬ株の拡大倍数の数字を示し、ＰＢＭＣフィーダー細胞を使用した拡大培養結果の変動性が明らかである。 [0088]ｐＬＶ４３０Ｇヒト４−１ＢＢＬベクターのベクター図を示す。 [0089]ｐＬＶ４３０Ｇヒト４−１ＢＢＬベクターの４−１ＢＢＬ ＰＣＲＰ（ポリメラーゼ連鎖反応産物）部分の図を示す。 [0090]ｐＬＶ４３０ＧヒトＣＤ８６ベクターのベクター図を示す。 [0091]ｐＬＶ４３０ＧヒトＣＤ８６ベクターのＣＤ８６ ＰＣＲＰ部分の図を示す。 [0092]ｐＤＯＮＲ２２１ヒトＣＤ８６ドナーベクターのベクター図を示す。 [0093]ｐＤＯＮＲ２２１ヒト４−１ＢＢＬドナーベクターのベクター図を示す。 [0094]ｐＬＶ４３０Ｇエンプティベクターのベクター図を示す。 [0095]ｐＤＯＮＲ２２１エンプティベクターのベクター図を示す。 [0096]レンチウイルス作製用のｐｓＰＡＸ２ヘルパープラスミドのベクター図を示す。 [0097]レンチウイルス作製用のｐＣＩＧＯ−ＶＳＶ．Ｇヘルパープラスミドのベクター図を示す。 [0098]レンチウイルストランスフェクション前（「非トランスフェクト」）及びトランスフェクション後（「トランスフェクト」）のＭＯＬＭ−１４細胞に対するフローサイトメトリー実験の結果を示し、改変ＭＯＬＭ−１４細胞上でのＣＤ１３７及びＣＤ８６の発現が確認される。 [0099]ＴＩＬロットＭ１０３２−Ｔ２についての照射した親非修飾ＭＯＬＭ−１４細胞（「親ＭＯＬＭ１４」）、改変ＭＯＬＭ−１４細胞（ＣＤ８６／４−１ＢＢＬ、「改変ＭＯＬＭ１４」）、又はＰＢＭＣフィーダー（「フィーダー」）を使用したＴＩＬの迅速拡大培養の結果を示す。ＴＩＬをＰＢＭＣフィーダー又は親若しくは改変ＭＯＬＭ１４細胞と１：１００の比で、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して共培養した。６及び１１日目に細胞をカウントして分割した。各点が、それぞれ０、６、１１及び１４日目に決定された細胞数を表す。対数目盛を用いる。 [00100]線形目盛を用いて図示した、図１３に記載の結果を示す。 [00101]対数目盛を用いたＴＩＬロットＭ１０３３−Ｔ６の結果を示し、他のパラメータは図１３に提供するとおりである。 [00102]線形目盛を用いて図示した、図１４に記載の結果を示す。 [00103]ＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現する改変ＭＯＬＭ−１４細胞（「ＴＩＬ＋改変ＭＯＬＭ１４（ＣＤ８６／４１ＢＢ）＋ＯＫＴ３」）又は照射ＰＢＭＣフィーダー（「ＴＩＬ＋フィーダー＋ＯＫＴ３」）を使用したＴＩＬの迅速拡大培養の結果を示す。ＴＩＬをＰＢＭＣフィーダー又は改変ＭＯＬＭ−１４細胞（ａＭＯＬＭ１４）と１：１００の比で、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を加えて共培養した。６及び１１日目に細胞をカウントして分割した。各点は、１４日目に決定された細胞数を表す。 [00104]２４ウェルG-Rexプレートのウェル内でＴＩＬ（２×１０４）を異なる比（１：１０、１：３０、及び１：１００、それぞれ「１０」、「３０」、及び「１００」と表示する）の親ＭＯＬＭ−１４（「ＭＯＬＭ１４」）細胞、ＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現するように形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞（「ａＭＯＬＭ１４」）、又はＰＢＭＣフィーダー（「ＰＢＭＣ＋」）と共に、各々ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して培養した実験の結果を示す。対照はＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）のみ（「ＰＢＭＣ−」）を使用して実施した。各条件につきトリプリケートで培養した。４及び７日目に培養物に新鮮培地及びＩＬ−２を供給した。７日目に生細胞をカウントした。ここに表す棒グラフは、１１日目にカウントされた生細胞数の平均値＋標準偏差（ＳＤ）を示す。ｐ値はスチューデント「ｔ」検定によって計算した。 [00105]シングル２４ウェルG-Rex培養プレートにおいて異なる比（１：３０、１：１００、及び１：３００、それぞれ「３０」、「１００」、及び「３００」と表示される）のＰＢＭＣフィーダー（「ＰＢＭＣ」）、親ＭＯＬＭ−１４細胞（「ＭＯＬＭ１４」）、又はＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現するように形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞（「ａＭＯＬＭ１４」）と共に、各々ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して培養したＴＩＬの結果を示す。１１日目に生細胞をカウントしてプロットした。他の条件は図１８にあるとおりである。 [00106]シングル２４ウェルG-Rex培養プレートにおいて異なる比（１：５０、１：１００、及び１：２００、それぞれ「５０」、「１００」、及び「２００」と表示される）のＰＢＭＣフィーダー（「ＰＢＭＣ」）、親ＭＯＬＭ−１４細胞（「ＭＯＬＭ１４」）、又はＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現するように形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞（「ａＭＯＬＭ１４」）と共に、各々ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して培養したＴＩＬの結果を示す。１４日目に細胞をカウントした。他の条件は図１８にあるとおりである。 [00107]シングル２４ウェルG-Rex培養プレートにおいて異なる比（１：１００、１：２００、１：４００、及び１：８００、それぞれ「１００」、「２００」、「４００」、及び「８００」と表示される）のＰＢＭＣフィーダー（「ＰＢＭＣ」）、親ＭＯＬＭ−１４細胞（「ＭＯＬＭ１４」）、又はＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現するように形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞（「ａＭＯＬＭ１４」）と共に、各々ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して培養したＴＩＬの結果を示す。１４日目に細胞をカウントした。他の条件は図１８にあるとおりである。 [00108]ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養した生細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α／β、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ５７ ＴＩＬの詳細な分布を示すサンバースト図による視覚化を示す。 [00109]ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣで拡大培養した生細胞、ＴＣＲα／β、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ５７ ＴＩＬの詳細な分布を示すサンバースト図による視覚化を示す。 [00110]生細胞、ＴＣＲα／β＋、ＣＤ４＋、又はＣＤ８＋ ＴＩＬにゲートをかけたメモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ＋／−、ＣＣＲ７＋／−）を示すフローサイトメトリー等高線プロットを図示する。 [00111]ＳＰＡＤＥツリーを使用してＣＤ３＋細胞にゲートをかけたＴ細胞サブセット、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ポストＲＥＰ ＴＩＬ（ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣで拡大培養した）の表現型の特徴付けを示す。色のグラデーションはＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＰＤ１、及びＣＤ１３７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に比例する。 [00112]ＳＰＡＤＥツリーを使用してＣＤ３＋細胞にゲートをかけたＴ細胞サブセット、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ポストＲＥＰ ＴＩＬ（ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣで拡大培養した）の表現型の特徴付けを示す。色のグラデーションはＭＦＩ ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＫＬＲＧ１、及びＴＩＧＩＴに比例する。 [00113]ミトコンドリアストレステスト中に測定された、フィーダー又はａＭＯＬＭ１４で拡大培養した後のＴＩＬの酸素消費速度（ＯＣＲ）を示す。各データ点は、トリプリケートで測定した平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。 [00114]ミトコンドリアストレステスト中に測定された、フィーダー又はａＭＯＬＭ１４で拡大培養した後のＴＩＬの細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を示す。各データ点は、トリプリケートで測定した平均値±ＳＥＭを表す。 [00115]デスティネーションベクターｐＬＶ４３０１Ｇのベクター図を示す。 [00116]ドナーベクター１、ｐＭＫ ７ｃ１２抗ｍＦＣ ｓｃＦｖ ＣｏＯｐ ＥＣＯＲＶ ＳａｃＩＩ Ｌ１Ｒ５のベクター図を示す。 [00117]ドナーベクター２、ｐＭＫ ｈＣＤ８ａ足場ＴＮ Ｌ５ Ｌ２のベクター図を示す。 [00118]レンチウイルス作製に使用される最終的なベクター、ｐＬＶ４３０１Ｇ ７Ｃ１２ ｓｃＦｖ ｍＩｇＧ ｈＣＤ８ ｆｌａｇのベクター図を示す。 [00119]デスティネーションベクターｐＬＶ４３０１Ｇのベクター図を示す。 [00120]ドナーベクター１、ｐＭＫ ８Ｂ３抗ｍＦＣ ｓｃＦｖ ＣｏＯｐ ＥＣＯＲＶ ＳａｃＩＩ Ｌ１Ｒ５のベクター図を示す。 [00121]ドナーベクター２、ｐＭＫ ｈＣＤ８ａ足場ＴＮ Ｌ５ Ｌ２のベクター図を示す。 [00122]レンチウイルス作製に使用される最終的なベクター、ｐＬＶ４３０１Ｇ ８Ｂ３ ｓｃＦｖ ｍＩｇＧ ｈＣＤ８ ｆｌａｇのベクター図を示す。 [00123]レンチウイルストランスフェクション前（「非トランスフェクト」）及びトランスフェクション後（「トランスフェクト」）のＥＭ−３細胞に対するフローサイトメトリー実験の結果を示し、改変ＥＭ−３細胞上でのＣＤ１３７及びＣＤ８６の発現が確認される。 [00124]ＴＩＬをａＥＭ３（７Ｃ１２又は８Ｂ３）と１：１００の比で、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を加えて共培養した実験の結果を示す。１１及び１４日目に細胞をカウントした。 [00125]ＴＩＬをａＥＭ３（７Ｃ１２又は８Ｂ３）と１：１００の比で、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を加えて共培養した実験の結果を示す。１１及び１４日目に細胞をカウントした。 [00126]ＴＩＬをａＥＭ３又はＰＢＭＣフィーダーと１：１００比で、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）を添加して又は添加せずに共培養した実験の結果を示す。棒グラフは、１１日目に決定された細胞数を示す。 [00127]種々のＴＩＬ：ａＡＰＣ比でのＥＭ−３ ａＡＰＣによるＴＩＬ拡大培養の結果を示す。 [00128]ＥＭ−３ ａＡＰＣによるＴＩＬ拡大培養の結果を示す。G-Rex 24ウェルプレートにおいてＴＩＬ（２×１０４）を５つの異なるＰＢＭＣフィーダーロット又はａＥＭ３（トリプリケート）と１：１００比で、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して共培養した。１４日目に生細胞をカウントした。グラフは、１４日目にカウントした生細胞数（平均値）を９５％信頼区間と共に示す。 [00129]ＥＭ−３ ａＡＰＣ及びＭＯＬＭ−１４ ａＡＰＣによるＴＩＬ拡大培養の結果を示す。G-Rex 24ウェルプレートにおいてＴＩＬ（２×１０４）を５つの異なるＰＢＭＣフィーダーロット又はａＭＯＬＭ１４（トリプリケート）又はａＥＭ３（同様にトリプリケート）と１：１００比で、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して共培養した。グラフは、１４日目にカウントした生細胞数（平均値）を９５％信頼区間と共に示す。 [00130]ａＥＭ３ ａＡＰＣ又はＰＢＭＣフィーダーで拡大培養した生細胞、ＴＣＲα／β、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋ ＴＩＬ（ＴＩＬバッチＭ１０５４）の詳細な分布を明らかにするためのサンバースト図による視覚化を示す。 [00131]ａＥＭ３ ａＡＰＣ又はＰＢＭＣフィーダーで拡大培養した生細胞、ＴＣＲα／β、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋ ＴＩＬ（ＴＩＬバッチＭ１０５５）の詳細な分布を明らかにするためのサンバースト図による視覚化を示す。 [00132]ＣＤ３＋細胞を使用してａＥＭ３ ａＡＰＣ又はＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ＳＰＡＤＥツリーを示す。色のグラデーションは、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１、及びＣＤ１３７のＭＦＩに比例する。 [00133]ＣＤ３＋細胞を使用してａＥＭ３ ａＡＰＣ又はＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ＳＰＡＤＥツリーを示す。色のグラデーションは、ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＫＬＲＧ１、及びＴＩＧＩＴのＭＦＩに比例する。 [00134]Seahorse XFミトストレステストによって測定した予備呼吸容量の概要を示す。 [00135]Seahorse XFミトストレステストによって測定した解糖予備能の概要を示す。 [00136]生細胞のミトコンドリアを染色する、且つその蓄積が膜電位に依存するMitoTracker色素を使用した、ＰＢＭＣ又はａＥＭ３に対して拡大培養した生細胞ＴＩＬのミトコンドリア染色を示す。ＰＢＭＣ又はａＥＭ３に対して拡大培養したＴＩＬをL/D Aquaと、続いてMitoTracker赤色色素で染色した。示されるデータは、生細胞集団にゲートをかけたMitoTracker陽性（ＭＦＩ）細胞である。 [00137]細胞傷害効力及び機能活性に関するＰ８１５ ＢＲＬＡの結果について、ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬとａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬとの比較を示す。 [00138]細胞傷害効力及び機能活性に関するＰ８１５ ＢＲＬＡの結果について、ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬとａＥＭ３ ａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬとの比較を示す。 [00139]非刺激（「ＵＳ」）ＴＩＬと比較した、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢでコートしたマイクロビーズで一晩刺激（「Ｓ」）した後のＴＩＬの２つのバッチのＩＦＮ−γ遊離について、ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬとａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬとの比較を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし。 [00140]非刺激（「ＵＳ」）ＴＩＬと比較した、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢでコートしたマイクロビーズで一晩刺激（「Ｓ」）した後のＴＩＬの３つのバッチのＩＦＮ−γ遊離について、ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬとａＥＭ３ ａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬとの比較を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし。 [00141]非刺激（「ＵＳ」）ＴＩＬと比較した、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢでコートしたマイクロビーズで一晩刺激（「Ｓ」）した後のＴＩＬの２つのバッチのグランザイムＢ遊離について、ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬとａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬとの比較を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし。 [00142]非刺激（「ＵＳ」）ＴＩＬと比較した、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢでコートしたマイクロビーズで一晩刺激（「Ｓ」）した後のＴＩＬの３つのバッチのグランザイムＢ遊離について、ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬとａＥＭ３ ａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬとの比較を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし。 [00143]ＴＩＬ拡大培養及び処理プロセスを示す。本発明のａＡＰＣはプレＲＥＰ段階（図の上半分）又はＲＥＰ段階（図の下半分）の両方で使用されてもよく、各細胞培養物にＩＬ−２を加えるときに加えてもよい。ステップ１は、４つの腫瘍断片を１０個のG-Rex 10フラスコに加えることを指す。ステップ２では、約４０×１０６個又はそれ以上のＴＩＬが得られる。ステップ３では、ＲＥＰのため３６個のG-Rex 100フラスコへの分割が行われる。ステップ４でＴＩＬを遠心によって回収する。約４３日の総処理時間の後にステップ５で新鮮なＴＩＬ産物が得られ、この時点でＴＩＬを患者に輸注することができる。 [00144]ａＡＰＣにより拡大培養したＴＩＬで用いられる治療プロトコルを示す。初めに手術（及び腫瘍切除）が行われ、及びリンパ球枯渇化学療法は、本明細書の他の部分に記載されるとおりの化学療法による骨髄非破壊的リンパ球枯渇を指す。 [00145]生物発光リダイレクト溶解アッセイ（Bioluminescent Redirected Lysis Assay：ＢＲＬＡ）の結果を示し、個別のエフェクター：標的比でＰ８１５クローンＧ６と共培養（抗ＣＤ３を添加して及び無しで）したときのＴＩＬバッチＭ１０３３Ｔ−１のパーセンテージ細胞傷害率が示される。 [00146]異なるエフェクター対標的細胞比に対するＩＦＮ−γ遊離量を示す酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）データを示す。 [00147]Ｐ８１５クローンＧ６と抗ＣＤ３の存在下において１：１のエフェクター対標的細胞比で共培養したときのＴＩＬバッチＭ１０３３Ｔ−１が発現したＬＡＭＰ１（％）を４時間及び２４時間共培養について示す。 [00148]ＴＩＬバッチＭ１０３０のＢＲＬＡ結果を示す。ＢＲＬＡによる細胞傷害性（ＬＵ５０／１×１０６ＴＩＬとして測定した）は２６±１６である。 [00149]ＴＩＬバッチＭ１０３０の標準クロム遊離アッセイを示す。クロム遊離アッセイによる細胞傷害性（ＬＵ５０／１×１０６ＴＩＬとして測定した）は２２である。 [00150]ＴＩＬバッチＭ１０５３のＢＲＬＡ結果を示し、ＢＲＬＡによるＴＩＬの溶解単位を７０±１７として示す。 [00151]ＴＩＬバッチＭ１０５３の標準クロム遊離アッセイ結果を示し、同様にクロムアッセイによるＴＩＬの溶解単位を１４±５として示す。この結果を図６４と比較すると、ＢＲＬＡ及びクロム遊離アッセイの性能が同等であることが示される。 [00152]ＩＦＮ−γ遊離とＴＩＬの細胞傷害能との間の直線関係を示す。 [00153]ＩＦＮ−γについてのELISpot結果を示す。 [00154]ＴＩＬバッチＭ１０５３の酵素ＩＦＮ−γ遊離を示す。 [00155]ＴＩＬバッチＭ１０３０の酵素ＩＦＮ−γ遊離を示す。 [00156]Ｍ１０５３Ｔ及びＭ１０３０ＴによるグランザイムＢ遊離を示すELISpotデータを示す。このデータから、ＢＲＬＡによって示されるＴＩＬの効力が確認される。 [00157]ＴＩＬバッチＭ１０５３の酵素グランザイムＢ遊離を示す。 [00158]ＴＩＬバッチＭ１０３０の酵素グランザイムＢ遊離を示す。 [00159]Ｍ１０５３Ｔ及びＭ１０３０ＴによるＴＮＦ−α遊離を示すELISpotデータを示す。このデータから、ＢＲＬＡによって示されるＴＩＬの効力が確認される。 [00160]ＴＩＬバッチＭ１０５３の酵素ＴＮＦ−α遊離を示す。 [00161]ＴＩＬバッチＭ１０３０の酵素ＴＮＦ−α遊離を示す。 [00162]かかる細胞集団をＦＢＳからｈＡＢ血清培地へとウィーニングしたときのａＥＭ３細胞（Ｃ７１２（Ａ）及び８Ｂ５（Ｂ））の細胞集団の変化を示す。 [00163]ａＥＭ３細胞集団を様々な凍結培地に懸濁した凍結−融解−回収サイクルの間の細胞集団の変化を示す。 [00164]８日間の時間経過にわたるガス透過性細胞培養フラスコ内でのａＥＭ３細胞の成長を示す。 [00165]ａＥＭ３細胞の純度を決定するフローパネル分析を示す。 [00166]ａＥＭ３細胞の純度の決定に用いられるフローパネル分析の結果を示す。 [00167]ＯＫＴ３によって刺激したａＥＭ３フィーダー細胞とＰＢＭＣフィーダーとの間のサイトカイン発現の差を示す。 [00168]ＴＩＬを有利には無血清培地（即ち、CTS Optmizer）で拡大培養（プレＲＥＰ）してもよく、ＣＭ１と比較したとき細胞数の増加がもたらされ得ることを示す。 [00169]ＴＩＬを有利には無血清培地（即ち、CTS Optmizer）で拡大培養してもよく、１１日目（プレＲＥＰ）にＣＭ１と比較したとき細胞数の増加がもたらされ得る（図８３）ことを示す。 [00169]ＴＩＬを有利には無血清培地（即ち、CTS Optmizer）で拡大培養してもよく、２２日目（プレ及びポストＲＥＰ）にＣＭ１と比較したとき細胞数の増加がもたらされ得る（図８４）ことを示す。 [00170]ａＡＰＣ細胞（即ち、ａＥＭ３細胞）を無血清培地を使用して成長させることができることを示す。具体的には、CTS OpTimizer及びPrime-TCDMが、ｃＤＭＥＭ（１０％hSerum）と比較したときａＥＭ３を成長させるのに有効であることが分かった。示されるデータは５つの別個の実験の平均値＋ＳＤであった。ｐ値はスチューデントｔ検定により計算した。＊Ｐ＜０．０５。 [00171]凍結保存後３日目におけるＴＩＬ−Ｒ３細胞株からのａＥＭ３細胞の急速回復を実証する実験の結果を示す。図８６は実験１の総細胞数を示す。 [00171]凍結保存後３日目におけるＴＩＬ−Ｒ３細胞株からのａＥＭ３細胞の急速回復を実証する実験の結果を示す。図８７は実験２の総細胞数を示す。 [00172]凍結保存後のＴＩＬ−Ｒ３細胞株からのａＥＭ３細胞の成長を示し、ここで、細胞はプレーティングして９日間成長させた。細胞数は解凍後３日毎に測定した。 [00173]凍結保存後のＴＩＬ−Ｒ３細胞株からのａＥＭ３細胞の成長を示し、ここで、細胞はGREX 10フラスコにプレーティングし、８日間成長させた。細胞数は解凍後４日毎に測定した。 [00174]ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫヒトＯＸ４０Ｌベクターのベクター図を示す。 [00175]ａＥＭ３細胞株及びＰＢＭＣフィーダーによりＲＥＰで拡大培養したＴＩＬのフローサイトメトリー分析の結果を示し、ａＥＭ３と共に培養したＴＩＬがＣＤ８＋ ＴＩＬの偏りを促進することが示される。 [00176]ａＥＭ３細胞株及びＰＢＭＣフィーダーによりＲＥＰでＴＩＬを拡大培養した実験から得られた生細胞の数を示す。 [00177]ａＥＭ３細胞株及びＰＢＭＣフィーダーによりＲＥＰでＴＩＬを拡大培養した実験から得られたＣＤ３＋細胞の数を示す。 [00178]ａＥＭ３細胞株及びＰＢＭＣフィーダーによりＲＥＰでＴＩＬを拡大培養した実験から得られたＣＤ３−細胞の数を示す。 [00179]ｑＰＣＲ方法を用いたテロメア長分析の結果を示す。 [00180]本発明のａＡＰＣの実施形態の概略図を示す。 [00181]本発明のａＡＰＣの実施形態の概略図を示す。 [00182]本発明のａＡＰＣの実施形態の概略図を示す。
配列表の簡単な説明
[00183] 配列番号１はムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
[00184] 配列番号２はムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
[00185] 配列番号３は組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列である。
[00186] 配列番号４はアルデスロイキンのアミノ酸配列である。
[00187] 配列番号５は組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列である。
[00188] 配列番号６は組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列である。
[00189] 配列番号７は組換えＩＬ−２１のアミノ酸配列である。
[00190] 配列番号８はヒトＣＤ８６のアミノ酸配列である。
[00191] 配列番号９はヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）のアミノ酸配列である。
[00192] 配列番号１０はヒトＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）のアミノ酸配列である。
[00193] 配列番号１１はヒトＣＤ２８のアミノ酸配列である。
[00194] 配列番号１２はヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列である。
[00195] 配列番号１３はヒト４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）のアミノ酸配列である。
[00196] 配列番号１４はヒトＯＸ４０（ＣＤ１３４）のアミノ酸配列である。
[00197] 配列番号１５はｐＬＶ４３０Ｇ ４−１ＢＢＬエンプティベクターのヌクレオチド配列である。
[00198] 配列番号１６はｐＬＶ４３０Ｇヒト４−１ＢＢＬベクターの４−１ＢＢＬ ＣｏＯＰ部分のヌクレオチド配列である。
[00199] 配列番号１７は４−１ＢＢＬ ＰＣＲＰのヌクレオチド配列である。
[00200] 配列番号１８はｐＬＶ４３０Ｇ ｈＣＤ８６エンプティベクターのヌクレオチド配列である。
[00201] 配列番号１９はｐＬＶ４３０ＧヒトｈＣＤ８６ベクターのｈＣＤ８６ ＣｏＯＰ部分のヌクレオチド配列である。
[00202] 配列番号２０はｐＬＶ４３０ＧヒトｈＣＤ８６ベクターのｈＣＤ８６ ＣｏＯＰ Ｂ１ Ｂ２ ＰＣＲＰ部分のヌクレオチド配列である。
[00203] 配列番号２１はｐＤＯＮＲ２２１ ｈＣＤ８６ベクターのヌクレオチド配列である。
[00204] 配列番号２２はｐＤＯＮＲ２２１ ４−１ＢＢＬベクターのヌクレオチド配列である。
[00205] 配列番号２３はｐＬＶ４３０Ｇベクターのヌクレオチド配列である。
[00206] 配列番号２４はｐＤＯＮＲ２２１ベクターのヌクレオチド配列である。
[00207] 配列番号２５はレンチウイルス作製用のｐｓＰＡＸ２ヘルパープラスミドのヌクレオチド配列である。
[00208] 配列番号２６はレンチウイルス作製用のｐＣＩＧＯ−ＶＳＶ．Ｇヘルパープラスミドのヌクレオチド配列である。
[00209] 配列番号２７はｍＦｃ−７Ｃ１２ ｓｃＦｖクローンのアミノ酸配列である。
[00210] 配列番号２８はｍＦｃ−８Ｂ３ ｓｃＦｖクローンのアミノ酸配列である。
[00211] 配列番号２９はｍＦＣ−７Ｃ１２ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列である。
[00212] 配列番号３０はｍＦＣ−８Ｂ３ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列である。
[00213] 配列番号３１はデスティネーションベクターｐＬＶ４３０１Ｇのヌクレオチド配列である。
[00214] 配列番号３２は、ドナーベクター１、ｐＭＫ ７ｃ１２抗ｍＦＣ ｓｃＦｖ ＣｏＯｐ ＥＣＯＲＶ ＳａｃＩＩ Ｌ１Ｒ５のヌクレオチド配列である。
[00215] 配列番号３３は、ドナーベクター２、ｐＭＫ ｈＣＤ８ａ足場ＴＮ Ｌ５ Ｌ２のヌクレオチド配列である。
[00216] 配列番号３４は、レンチウイルス作製に使用される最終的なベクター、ｐＬＶ４３０１Ｇ ７Ｃ１２ ｓｃＦｖ ｍＩｇＧ ｈＣＤ８ ｆｌａｇのヌクレオチド配列である。
[00217] 配列番号３５は、デスティネーションベクター、ｐＬＶ４３０１Ｇのヌクレオチド配列である。
[00218] 配列番号３６は、ドナーベクター１、ｐＭＫ ８Ｂ３抗ｍＦＣ ｓｃＦｖ ＣｏＯｐ ＥＣＯＲＶ ＳａｃＩＩ Ｌ１Ｒ５のヌクレオチド配列である。
[00219] 配列番号３７は、ドナーベクター２、ｐＭＫ ｈＣＤ８ａ足場ＴＮ Ｌ５ Ｌ２のヌクレオチド配列である。
[00220] 配列番号３８は、レンチウイルス作製に使用される最終的なベクター、ｐＬＶ４３０１Ｇ ８Ｂ３ ｓｃＦｖ ｍＩｇＧ ｈＣＤ８ ｆｌａｇのヌクレオチド配列である。
[00221] 配列番号３９はレンチウイルス作製用のｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ ＯＸ４０Ｌベクターのヌクレオチド配列である。
[00222] 配列番号４０は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるＴｅｌ−１ｂプライマーのヌクレオチド配列である。
[00223] 配列番号４１は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるＴｅｌ−２ｂプライマーのヌクレオチド配列である。
[00224] 配列番号４２は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるＴｅｌ−１ｂプライマーのヌクレオチド配列である。
[00225] 配列番号４３は、テロメア長の定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定に使用されるＴｅｌ−１ｂプライマーのヌクレオチド配列である。
発明の詳細な説明
[00226] 特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において言及される特許及び刊行物は全て、全体として参照により援用される。
定義
[00227] 用語「共投与」、「共投与する」、「〜との組み合わせで投与される」、「〜との組み合わせで投与する」、「同時の」、及び「並行した」は、本明細書で使用する場合、両方の医薬品有効成分及び／又はその代謝産物がヒト対象に同じ時点で存在するようなヒト対象への２つ以上の医薬品有効成分の投与を包含する。共投与には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時点における投与、又は２つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別個の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与もまた本発明の方法に包含される。
[00228] 用語「インビボ」は、対象の体内で起こる事象を指す。
[00229] 用語「インビトロ」は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞を利用した細胞ベースのアッセイを包含し、また、インタクトな細胞を利用しない無細胞アッセイも包含し得る。
[00230] 用語「エキソビボ」は、対象の体から取り出された細胞、組織及び／又は臓器を処理すること又はそれに手順を施すことを伴う事象を指す。適切には、細胞、組織及び／又は臓器は手術又は治療方法において対象の体に戻され得る。
[00231] 用語「抗原」は、免疫応答を誘導する物質を指す。一部の実施形態において、抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示された場合に抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による結合を受ける能力を有する分子である。用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞エピトープもまた包含する。抗原は、加えて、免疫系により認識される能力を有する。一部の実施形態において、抗原は、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球の活性化につながる体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を誘導する能力を有する。ある場合には、そのために抗原がＴｈ細胞エピトープを含むか又はそれに連結されている必要があることもある。抗原はまた、１又は複数のエピトープ（例えば、Ｂ−及びＴ−エピトープ）も有し得る。一部の実施形態において、抗原は、好ましくは、その対応する抗体又はＴＣＲと典型的には高度に特異的且つ選択的に反応し、他の抗原によって誘導され得る他の多数の抗体又はＴＣＲとは反応しないであろう。
[00232] 用語「有効量」又は「治療有効量」は、意図した適用、限定しないが、疾患治療を達成するのに十分な本明細書に記載されるとおりの化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図した適用（インビトロ又はインビボ）、又は治療下のヒト対象及び疾患病態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患病態の重症度、投与方法等に応じて異なってもよく、これは当業者が容易に判断することができる。この用語はまた、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板粘着及び／又は細胞遊走の低減）を生じさせるであろう用量にも適用される。具体的な用量は、選択した詳細な化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物との組み合わせで投与されるかどうか、投与タイミング、その投与先の組織、及び化合物を運ぶ物理的デリバリーシステムに応じて異なることになる。
[00233] 「治療効果」は、本明細書において当該の用語が使用されるとき、ヒト対象における治療利益及び／又は予防利益を包含する。予防効果としては、疾患又は病態の出現を遅延させる又は消失させること、疾患又は病態の症状の発生を遅延させる又は消失させること、疾患又は病態の進行を遅延させる、止める、又は好転させること、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
[00234] 「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な賦形剤」は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び不活性成分を含むことが意図される。かかる薬学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な賦形剤の医薬品有効成分への使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な賦形剤が医薬品有効成分と適合しない場合を除き、本発明の治療用組成物中におけるその使用が企図される。他の薬物など、追加的な医薬品有効成分もまた、記載される組成物及び方法に取り入れることができる。
[00235] 用語「迅速拡大培養」は、１週間の期間で少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍）、より好ましくは１週間の期間で少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、又は９０倍）、又は最も好ましくは１週間の期間で少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬ数の増加を意味する。幾つもの迅速拡大培養プロトコルが本明細書に記載される。
[00236] 本明細書において「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍中に遊走した、当初白血球細胞として得られた細胞の集団が意味される。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬには、初代ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるとおり患者組織試料から得られるものであり（時に本明細書において「新鮮に回収された」又は「第１のＴＩＬ集団」と称される）、及び「二次ＴＩＬ」は、本明細書で考察するとおり拡大培養された又は増殖した任意のＴＩＬ細胞集団、限定しないが、例えばバルクＴＩＬ及び拡大培養されたＴＩＬ（適切な場合には「ＲＥＰ ＴＩＬ」又は「ポストＲＥＰ ＴＩＬ」、又は「第２のＴＩＬ集団」又は「第３のＴＩＬ集団」）、である。
[00237] ＴＩＬは、概して、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義することも、又は腫瘍に浸潤して治療を達成するその能力によって機能的に定義することもできる。ＴＩＬは、概して、以下のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１、及びＣＤ２５のうちの１又は複数の発現によって分類することができる。加えて、及び或いは、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するその能力によって機能的に定義することができる。
[00238] 本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」とは、ＴＩＬが約−１５０℃〜−６０℃の範囲で処理及び保存されることを意味する。一般的な凍結保存方法はまた、実施例を含め、本明細書の他の部分にも記載される。明確にするために言えば、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として用いられ得る凍結組織試料と区別可能なものである。
[00239] 本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」とは、かつて凍結保存されていたが、次に処理により、室温以上、限定しないが、例えば細胞培養温度又はＴＩＬを患者に投与し得る温度、に戻されたＴＩＬ集団を意味する。
[00240] 本明細書において「細胞集団」（ＴＩＬを含む）は、共通の形質を共有する多数の細胞を意味する。
[00241] 用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）、及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ−６、ＢＣＬ−６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞はＴＣＲ惹起後にエフェクター分子としてＩＬ−２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は血中のＣＤ４コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺に比例的に高濃度化する。
[00242] 用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型にはまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）、及びＩＬ−１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は抗原刺激後に、インターフェロン−γ、ＩＬ−４、及びＩＬ−５を含め、高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は血中のＣＤ８コンパートメントにおいて優勢であり、ヒトでは肺、肝臓、及び腸に比例的に高濃度化する。ＣＤ８＋ エフェクターメモリーＴ細胞は大量のパーフォリンを有する。
[00243] ２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈で用語「配列同一性」、「パーセント同一性」、及び「配列パーセント同一性」は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部として考慮せず、対応が最大となるように比較及びアラインメント（必要に応じてギャップを導入する）したときに同じである、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を特定の割合だけ有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いるか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを達成するために使用し得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野において公知である。パーセント配列同一性の決定に好適なプログラムとしては、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）BLASTウェブサイトから利用可能なBLASTプログラムスイートが挙げられる。２つの配列間の比較は、BLASTN又はBLASTPのいずれかのアルゴリズムを使用して行うことができる。BLASTNは核酸配列の比較に使用され、一方、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech、South San Francisco, California）又はDNASTARから利用可能なMegAlignが、配列のアラインメントに使用し得る更なる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによるアラインメントを最大化するための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
[00244] 用語「保存的アミノ酸置換」は、抗体の抗原への結合又はタンパク質のそのリガンドへの結合を無効にしないアミノ酸配列修飾を意味する。保存的アミノ酸置換としては、あるクラスのアミノ酸における同じクラスのアミノ酸による置換が挙げられ、ここで、クラスは、共通の物理化学的アミノ酸側鎖特性及び例えば標準的なデイホフ頻度交換行列又はBLOSUM行列によって決定されるとおりの、天然に見られる相同タンパク質における高い置換頻度によって定義される。６つの一般的なアミノ酸側鎖クラスが分類されており、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が含まれる。例えば、ＡｓｐをＡｓｎ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基に代える置換は保存的置換である。従って、４−１ＢＢＬ又はＣＤ８６タンパク質中の予測非必須アミノ酸残基が好ましくは同じクラスの別のアミノ酸残基に置き換えられる。抗原又はリガンド結合を消失させることのないアミノ酸保存的置換を同定する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187；Kobayashi, et al., Protein Eng. 1999, 12, 879-884 (1999)；及びBurks, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417を参照のこと）。
[00245] 用語「レトロウイルス」は、その複製サイクルの間に逆転写酵素を利用するＲＮＡウイルスを指し、ここで、レトロウイルスゲノムＲＮＡは逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換される。二本鎖ＤＮＡ形態は感染細胞の染色体に組み込まれる（「プロウイルス」）。プロウイルスはＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として働き、新規ウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を導く。プロウイルスの各末端には、「長末端反復配列」又は「ＬＴＲ」と呼ばれる構造がある。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル並びにウイルスゲノムの複製及び組込みに必要な配列を含め、数多くの調節シグナルを含む。レトロウイルス科（Retroviridae）の中には、Ａ型システルナウイルス属（Cisternavirus A）、Ａ型オンコウイルス属（Oncovirus A）、Ｂ型オンコウイルス属（Oncovirus B）、Ｃ型オンコウイルス属（Oncovirus C）、Ｄ型オンコウイルス属（Oncovirus D）、レンチウイルス属（Lentivirus）、ガンマレトロウイルス属（Gammaretrovirus）、及びスプーマウイルス属（Spumavirus）を含め、幾つかの属が含まれる。一部のレトロウイルスは発癌性（即ち腫瘍形成性）であるが、そうでないものもある。オンコウイルスは、感受性のある種において肉腫、白血病、リンパ腫、及び乳癌を誘導する。レトロウイルスは多種多様な種に感染し、水平にも垂直にも伝播し得る。レトロウイルスは宿主ＤＮＡに組み込まれるため、宿主ＤＮＡの配列を細胞から細胞へと伝播させる能力を有する。例示的なガンマレトロウイルスベクターには、細胞表面リン酸輸送体受容体を用いて侵入し、次に増殖細胞染色体に永久に組み込まれるアンホトロピックなモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ）に由来するものが含まれる。アンホトロピックＭＬＶベクター系は十分に確立されており、よく用いられる遺伝子デリバリーツールである（例えば、Gordon and Anderson, Curr. Op. Biotechnol., 1994, 5, 611-616及びMiller, et al., Meth. Enzymol., 1993, 217, 581-599（これらの開示は参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
[00246] 用語「レンチウイルス」は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型、及びＨＩＶ２型を含む）、ヒツジに脳炎（ビスナ）又は肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ・マエディ、ヤギに免疫不全、関節炎、及び脳症を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマに自己免疫性溶血性貧血、及び脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコに免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシにリンパ節症、リンパ球増加症、及び場合により中枢神経系感染症を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及び類人霊長類に免疫不全及び脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む属を指す。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長い潜伏期間及び経過の長期化を特徴とする。通常、これらのウイルスは単球及びマクロファージに潜伏感染し、そこから他の細胞に広がる。ＨＩＶ、ＦＩＶ、及びＳＩＶはまた、Ｔリンパ球（即ちＴ細胞）にも容易に感染する。
[00247] 用語「抗ＣＤ３抗体」は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体であって、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むものを指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ−３が含まれる。抗ＣＤ３抗体にはまた、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブが含まれる。
[00248] 用語「ＯＫＴ−３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対する、ヒト、ヒト化、キメラ、若しくはマウス抗体を含めたモノクローナル抗体又はその変異体を指し、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch Gladbach, Germany）及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、若しくはバイオシミラーなど、市販されている形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に提供する（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ−３の産生能を有するハイブリドーマが米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ８００１が付与されている。ＯＫＴ−３の産生能を有するハイブリドーマはまた、欧州認証細胞培養株保存機関（European Collection of Authenticated Cell Cultures：ＥＣＡＣＣ）にも寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が付与されている。
[00249] 用語「ＩＬ−２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）は、インターロイキン−２として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２が含まれる。ＩＬ−２については、例えば、Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載される。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号３）。例えば、用語ＩＬ−２には、ヒトの組換え形態のＩＬ−２、例えばアルデスロイキン（PROLEUKIN、使い捨てバイアル当たり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）、並びにCellGenix, Inc.、Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-209-b）によって商業的に供給されている組換えＩＬ−２の形態及び他の販売業者からの他の市販の均等物が包含される。アルデスロイキン（ｄｅｓ−アラニル−１，セリン−１２５ヒトＩＬ−２）は、分子量が約１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え形態のＩＬ−２である。本発明での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号４）。用語ＩＬ−２にはまた、Nektar Therapeutics、South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグNKTR-214を含め、本明細書に記載されるとおりの、ペグ化形態のＩＬ−２も包含される。本発明での使用に好適なNKTR-214及びペグ化ＩＬ−２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適な別の形態のコンジュゲート型ＩＬ−２が、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４９０２，５０２号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。本発明での使用に好適なＩＬ−２の製剤が米国特許第６，７０６，２８９号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
[00250] 用語「ＩＬ−７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは間質及び上皮細胞、並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ−７はＴ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ−７は、ＩＬ−７受容体αと共通γ鎖受容体とからなるヘテロ二量体のＩＬ−７受容体に結合し、それが胸腺内でのＴ細胞発達及び末梢内での生存にとって重要な一連のシグナルとなる。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-254）及びThermoFisher Scientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−７組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号５）。
[00251] 用語「ＩＬ−１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）は、インターロイキン−１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２が含まれる。ＩＬ−１５については、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ＩＬ−１５はβ及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ−２と共有している。組換えヒトＩＬ−１５は、分子質量が１２．８ｋＤａの、１１４アミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-230-b）及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号34-8159-82）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号６）。
[00252] 用語「ＩＬ−２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）は、インターロイキン−２１として知られるプレイオトロピックサイトカインタンパク質を指し、そのヒト及び哺乳類形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー、及び変異体を含め、あらゆる形態のＩＬ−２１が含まれる。ＩＬ−２１については、例えば、Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ＩＬ−２１は、主としてナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ−２１は、分子質量が１５．４ｋＤａの、１３２アミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-408-b）及びThermoFisherScientific, Inc.、Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−２１組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80）を含め、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を表２に提供する（配列番号７）。
[00253] 用語「骨髄系細胞」は、本明細書で使用する場合、骨髄系列の細胞又はそれに由来する細胞を指す。骨髄系列には、顆粒球（好中球、好酸球、及び好塩基球）、単球、マクロファージ、赤血球、巨核球、及びマスト細胞の種々のサブセットを含めた幾つもの形態学的、表現型的、及び機能的に異なる細胞型が含まれる。特定の実施形態において、骨髄系細胞は、骨髄系列の細胞株に由来する細胞である。
[00254] 「ＭＯＬＭ−１４」は、再発性急性単球性白血病の患者の末梢血から樹立されたヒト白血病細胞株を指し、初期の表現型の特徴付けから、少なくとも以下のマーカー：ＣＤ４、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ８７、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ１１６、ＣＤ１１８、及びＣＤ１５５の存在が示された。Matsuo, et al., Leukemia 1997, 11, 1469-77。ＭＯＬＭ−１４の更なる表現型の特徴付けから、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＣＤ５８のレベルがより高く、及びＣＤ８６のレベルがより低いことが見出された。ＭＯＬＭ−１４細胞株はＤＳＭＺに受託番号ＡＣＣ７７７で寄託されている。近縁のＭＯＬＭ−１３細胞株はＤＳＭＺに受託番号ＡＣＣ５５４で寄託されている。本明細書で使用する場合、用語「ＭＯＬＭ−１４細胞」は、ＭＯＬＭ−１４細胞及び／又は寄託されたＭＯＬＭ−１４親細胞株に由来する細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＭＯＬＭ−１３細胞」は、ＭＯＬＭ−１３細胞及び／又は寄託されたＭＯＬＭ−１３親細胞株に由来する細胞を指す。
[00255] 「ＥＭ−３」は、フィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬの患者の骨髄から樹立されたヒト細胞株を指す。Konopka, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 1985, 82, 1810-4。ＥＭ−３細胞の表現型の特徴付けから、少なくとも以下のマーカー：ＣＤ１３、ＣＤ１５、及びＣＤ３３の存在が示される。ＥＭ−３細胞株はＤＳＭＺに受託番号ＡＣＣ１３４で寄託されており、一方、近縁のＥＭ−２細胞株はＤＳＭＺに受託番号ＡＣＣ１３５で寄託されている。本明細書で使用する場合、用語「ＥＭ−３細胞」は、ＥＭ−３細胞及び／又は寄託されたＥＭ−３親細胞株に由来する細胞を指す。
[00256] 本明細書で使用する場合、用語「ＣＤ８６タンパク質」は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指し得る。
[00257] 本明細書で使用する場合、用語「４−１ＢＢＬ」又は「ＣＤ１３７Ｌ」は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指し得る。
[00258] 本明細書で使用する場合、用語「ＯＸ４０Ｌ」又は「ＣＤ１３７Ｌ」は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を指し得る。
[00259] 用語「バイオシミラー」は、臨床的に不活性な成分に軽微な違いがあるにも関わらず、米国で認可されている先発バイオ製剤と高度に類似した、且つそれに関して製剤の安全性、純度、及び効力の点でそのバイオ製剤と先発製剤との間に臨床的に有意味な違いがない、モノクローナル抗体又は融合タンパク質を含めたバイオ製剤を意味する。更に、後発バイオ医薬品又は「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁（European Medicines Agency）によって使用が既に許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。用語「バイオシミラー」はまた、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。バイオ製剤又はバイオ医薬品は、細菌又は酵母などの生物学的供給源によって作られる又はそれに由来する医薬品である。これはヒトインスリン又はエリスロポエチンなどの比較的小さい分子、又はモノクローナル抗体などの複合的な分子からなり得る。例えば、先発ＩＬ−２タンパク質がアルデスロイキン（PROLEUKIN）である場合、アルデスロイキンに準拠して医薬品規制当局により承認されたタンパク質は、アルデスロイキンと「バイオシミラー」であり、又はアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、後発バイオ医薬品又は「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁（European Medicines Agency：ＥＭＡ）によって使用が既に許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。欧州における後発バイオ適用についての関連する法的根拠は、規則（ＥＣ）第７２６／２００４号の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条（４）（その後の改正を含む）であり、従って欧州では、バイオシミラーは、規則（ＥＣ）第７２６／２００４号の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条（４）に基づき認可を受け、認可が承認され、又は認可申請の対象となり得る。既に認可を受けている元のバイオ医薬品製剤は、欧州では「先発医薬品製剤」と称され得る。ある製剤がバイオシミラーと見なされるための要件の一部が、後発バイオ医薬品製剤に関するＣＨＭＰガイドライン（CHMP Guideline on Similar Biological Medicinal Products）に概説されている。加えて、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインを含め、製剤固有のガイドラインがＥＭＡによって製剤毎に提供されており、そのウェブサイトに公開されている。本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機序、安全性プロファイル及び／又は有効性の点で先発医薬品製剤に類似したものであり得る。加えて、バイオシミラーは先発医薬品製剤と同じ病態の治療に使用される又はそれへの使用が意図されるものであり得る。従って、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した品質特性を有すると見なされ得る。或いは、又は加えて、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した生物学的活性を有すると見なされ得る。或いは、又は加えて、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した安全性プロファイルを有すると見なされ得る。或いは、又は加えて、本明細書に記載されるとおりのバイオシミラーは、先発医薬品製剤に類似した又は高度に類似した有効性を有すると見なされ得る。本明細書に記載されるとおり、欧州におけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可済みの先発医薬品製剤と比較される。しかしながら、一部の例では、バイオシミラーは、欧州経済地域外においてある種の試験で認可を受けたバイオ医薬品製剤（非ＥＥＡ認可「対照薬」）と比較されてもよい。かかる試験には、例えば、ある種の臨床試験及びインビボ非臨床試験が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「バイオシミラー」はまた、非ＥＥＡ認可対照薬と比較済みの又はそれと比較され得るバイオ医薬品製剤にも関する。ある種のバイオシミラーは、抗体、抗体断片（例えば抗原結合部分）及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさない軽微なアミノ酸構造の修飾（例えばアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その先発医薬品製剤のアミノ酸配列と９７％以上、例えば、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、先発医薬品製剤の翻訳後修飾と異なる１又は複数の翻訳後修飾、例えば、限定しないが、グリコシル化、酸化、アミド分解、及び／又はトランケーションを含んでもよく、但しその差異が医薬品製剤の安全性及び／又は有効性に変化をもたらさないものとする。バイオシミラーは先発医薬品製剤と同一の又は異なるグリコシル化パターンを有し得る。特に、限定的ではないが、バイオシミラーは、先発医薬品製剤に関連する安全性についての懸念がその差異によって対処される又は対処されるように意図される場合、異なるグリコシル化パターンを有し得る。加えて、バイオシミラーは、例えばその強度、医薬品形態、製剤化、賦形剤及び／又は体裁の点で先発医薬品製剤から逸脱してもよく、但し医薬品製剤の安全性及び有効性が損なわれないものとする。バイオシミラーは、例えば薬物動態学的（ＰＫ）及び／又は薬力学的（ＰＤ）プロファイルの点で先発医薬品製剤と比較して差異を含み得るが、なおも認可を受ける又は認可に好適であると考えるのに十分に先発医薬品製剤に類似していると見なされる。ある種の状況では、バイオシミラーは先発医薬品製剤と比較して異なる結合特性を呈し、ここで、この異なる結合特性は、ＥＭＡなどの規制当局により後発バイオ製剤としての認可を妨げるものではないと見なされる。用語「バイオシミラー」はまた、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。
[00260] 本明細書で使用する場合、用語「変異体」は、限定しないが、タンパク質、抗体又は融合タンパク質であって、参照タンパク質又は抗体のアミノ酸配列の範囲内の又はそれに隣接する特定の位置における１又は複数の置換、欠失及び／又は付加の点で参照タンパク質又は抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質、抗体又は融合タンパク質を包含する。変異体は、参照タンパク質又は抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１又は複数の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様の荷電又は非荷電アミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照タンパク質又は抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。用語「変異体」はまた、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
[00261] 「ペグ化」は、１又は複数のＰＥＧ基が抗体、抗体断片、又はタンパク質に結合するようになる条件下でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などと典型的に反応する修飾された抗体、又はその断片、又はタンパク質を指す。ペグ化により、例えば、抗体又はタンパク質の生物学的（例えば血清）半減期が増加し得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応で行われる。本明細書で使用する場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質の誘導体化に用いられている形態のＰＥＧのいずれかを包含することが意図される。ペグ化される抗体又はタンパク質は非グリコシル化抗体であってもよい。ペグ化方法は、例えば欧州特許第０１５４３１６号及び同第０４０１３８４号に記載されるとおり、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される抗体及びタンパク質に適用することができる。
[00262] 用語「約」及び「近似的に」は、ある値の統計的に意味のある範囲内であることを意味する。かかる範囲は、所与の値又は範囲のあるオーダー内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、より好ましくはなおも１０％以内、及び更により好ましくは５％以内であり得る。用語「約」又は「近似的に」に包含される許容可能な変動は研究下の詳細な系に依存し、当業者は容易に理解することができる。更に、本明細書で使用する場合、用語「約」及び「近似的に」は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状並びに他の数量及び特性が正確にそのものでなく、及び正確にそのものでなくてもよく、必要に応じて、公差、変換係数、丸め、測定誤差など、及び当業者に公知の他の要因を反映して、近似的であってもよく、及び／又はより大きくても若しくは小さくてもよいことを意味する。一般に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状又は他の数量若しくは特性は、そのように明示されるか否かに関わらず、「約」又は「近似的」である。極めて異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態は記載される構成を用い得ることが注記される。
[00263] 移行句「〜を含む（comprising）」、「〜から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「〜からなる（consisting of）」は、出願当初及び補正後の形態の添付の特許請求の範囲において使用されるとき、存在する場合に、どのような記載されていない追加的クレーム要素又はステップが特許請求の範囲から除外されるかに関して特許請求の範囲を定義する。用語「〜を含む」は包含的又はオープンエンドであることが意図され、いかなる記載されていない追加の要素、方法、ステップ又は材料も除外しない。用語「〜からなる」は、クレームに指定されるもの以外のいかなる要素、ステップ又は材料も除外し、後者の材料の例では、指定される材料に通常付随する不純物も除外する。用語「〜から本質的になる」は、指定される要素、ステップ又は材料及び特許請求される発明の基本的な新規の特徴に実質的に影響しないものに範囲を限定する。本発明を具現化する本明細書に記載される全ての組成物、方法、及びキットが、代替的実施形態では、移行句「〜を含む」、「〜から本質的になる」、及び「〜からなる」のいずれかによってより具体的に定義され得る。
人工抗原提示細胞
[00264] ある実施形態において、本発明は、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を発現し、且つ１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されている細胞を含む単離された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む。ある実施形態において、本発明は、１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00265] ある実施形態において、本発明は、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現するＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、細胞は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾され、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。
[00266] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現する。ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１３細胞はＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00267] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00268] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00269] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00270] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00271] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、ＯＸ４０Ｌをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６とＯＸ４０Ｌとを発現する。ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、ＯＸ４０Ｌをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１３細胞はＣＤ８６とＯＸ４０Ｌとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00272] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00273] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＭＯＬＭ−１４細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00274] 前述の実施形態のいずれにおいても、ＭＯＬＭ−１４又はＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣがＯＸ４０Ｌと４−１ＢＢＬとの両方を発現するように修飾され得ることは理解されるであろう。
[00275] ヒトＣＤ８６、ヒト４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、及びヒトＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）の配列を表３に提供する。
[00276] ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00277] ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00278] ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00279] ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00280] ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１４細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00281] ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＭＯＬＭ−１３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00282] ヒトＣＤ８６が結合するリガンド（ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４）、ヒト４−１ＢＢＬが結合するリガンド（４−１ＢＢ）、及びヒトＯＸ４０Ｌが結合するリガンド（ＯＸ４０）の配列を表４に提供する。
[00283] ある実施形態において、本発明は、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を発現し、且つ１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されている細胞を含む単離された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含み、ここで、ａＡＰＣはＥＭ−３親細胞株に由来する。ある実施形態において、本発明は、１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00284] ある実施形態において、本発明は、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を発現するＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、細胞は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾され、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。
[00285] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00286] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00287] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00288] ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00289] ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00290] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するＯＫＴ−３などのモノクローナル抗体のＦｃドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン７Ｃ１２及び８Ｂ３など、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00291] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00292] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00293] ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00294] ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00295] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するＯＫＴ−３などのモノクローナル抗体のＦｃドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン７Ｃ１２及び８Ｂ３など、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00296] ある実施形態において、本発明は、図９６に図示すとおり修飾されたＥＭ−３又はＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、図９７に図示すとおり修飾されたＥＭ−３又はＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、図９８に図示すとおり修飾されたＥＭ−３又はＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00297] ある実施形態において、本発明は、ＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を発現するＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、細胞は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾され、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。
[00298] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、ＯＸ４０Ｌをコードする核酸とを含み、ＥＭ−３細胞はＣＤ８６とＯＸ４０Ｌとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00299] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00300] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−３細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00301] ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00302] ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00303] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するＯＫＴ−３などのモノクローナル抗体のＦｃドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン７Ｃ１２及び８Ｂ３など、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように修飾されたＥＭ−３細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00304] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00305] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＯＸ４０Ｌタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及びＯＸ４０Ｌタンパク質はＥＭ−２細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00306] ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00307] ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１１又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00308] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するＯＫＴ−３などのモノクローナル抗体のＦｃドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン７Ｃ１２及び８Ｂ３など、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように修飾されたＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00309] ある実施形態において、本発明は、図９６に図示すとおり修飾されたＥＭ−３又はＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、図９７に図示すとおり修飾されたＥＭ−３又はＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、図９８に図示すとおり修飾されたＥＭ−３又はＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣを含む。
[00310] 前述の実施形態のいずれにおいても、ＥＭ−３又はＥＭ−２細胞を含むａＡＰＣがＯＸ４０Ｌと４−１ＢＢＬとの両方を発現するように修飾されてもよいことが理解される。
[00311] ある実施形態において、本発明は、ＣＤ５８を発現し、且つ１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されている細胞を含む単離された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含み、ここで、ａＡＰＣはＫ５６２系列親細胞株に由来する。ある実施形態において、本発明は、１又は複数の共刺激分子を発現するように修飾されているＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、Ｋ５６２系列親細胞株は受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３で寄託されており、また、欧州認証細胞培養株保存機関にも寄託されている（ＥＣＡＣＣＥＣＡＣＣ ８９１２１４０７）。
[00312] ある実施形態において、本発明は、ＣＤ５８を発現するＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、細胞は、配列番号８に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾され、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。
[00313] ある実施形態において、本発明は、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、Ｋ５６２系列細胞はＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00314] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00315] ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含むＣＤ８６タンパク質と、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質及び４−１ＢＢＬタンパク質はＫ５６２系列細胞の表面上に発現する。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00316] ある実施形態において、本発明は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00317] ある実施形態において、本発明は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９９％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９８％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９７％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９６％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９５％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第２のタンパク質に結合する第１のタンパク質と、配列番号１２又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％より高い同一性を有する配列を含む第４のタンパク質に結合する第３のタンパク質とを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。ある実施形態において、本発明は、前述のａＡＰＣの実施形態のいずれかを調製する方法を含む。
[00318] ある実施形態において、本発明は、更なる増殖シグナルを提供するＯＫＴ−３などのモノクローナル抗体のＦｃドメインに結合するため、本明細書に記載されるクローン７Ｃ１２及び８Ｂ３など、単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように修飾されたＫ５６２系列細胞を含むａＡＰＣを含む。
人工抗原提示細胞の調製方法
[00319] ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、ＣＤ８６及び４−１ＢＢＬの産生用遺伝子の安定取込みステップを含む。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、レトロウイルス形質導入ステップを含む。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、レンチウイルス形質導入ステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは当該技術分野において公知であり、例えば、Levine, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006,103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997,15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71、及び米国特許第６，６２７，４４２号（これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入ステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは当該技術分野において公知であり、例えば、Cepko and Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、トランスポゾン媒介性遺伝子導入ステップを含む。トランスポゾン媒介性遺伝子導入システムは当該技術分野において公知であり、トランスポザーゼがＤＮＡ発現ベクターとして提供されるか、又は発現可能ＲＮＡ若しくはタンパク質として提供されて、トランスジェニック細胞においてトランスポザーゼの長期発現が起こらないシステム、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、ｃａｐ及びポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポザーゼが含まれる。好適なトランスポゾン媒介性遺伝子導入システム、例えば、ＳＢ１０、ＳＢ１１、及びＳＢ１００ｘなどのサケ科型Ｔｅｌ様トランスポザーゼ（ＳＢ又はスリーピング・ビューティー（Sleeping Beauty）トランスポザーゼ）、及び酵素活性が増加した改変酵素について、例えば、Hackett, et al.,Mol. Therapy 2010,18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号（これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
[00320] ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、ＣＤ８６及び４−１ＢＢＬの一過性産生用遺伝子の安定取込みステップを含む。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、電気穿孔ステップを含む。電気穿孔方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Tsong, Biophys. J. 1991, 60, 297-306、及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７ Ａ１号（これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション方法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス）は当該技術分野において公知であり、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376；及びChen and Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号（これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、リポソームトランスフェクションステップを含む。リポソームトランスフェクション方法、例えば、ろ水中のカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（phophotidylethanolamine）（ＤＯＰＥ）との１：１（ｗ／ｗ）リポソーム配合物を用いる方法などは当該技術分野において公知であり、Rose, et al., Biotechniques 1991,10, 520-525及びFeigner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；同第５，９０８，６３５号；同第６，０５６，９３８号；同第６，１１０，４９０号；同第６，５３４，４８４号；及び同第７，６８７，０７０号（これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。ある実施形態において、ａＡＰＣを調製する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；同第６，０２５，３３７号；同第６，４１０，５１７号；同第６，４７５，９９４号；及び同第７，１８９，７０５号（これらの各々の開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いたトランスフェクションステップを含む。
[00321] ある実施形態において、ａＡＰＣの形質導入は、初めにGatewayクローニング方法（ThermoFisher, Inc.から市販されている）を用いてレンチウイルス形質導入用のベクターを調製し、続いてこのベクター及び本明細書の他の部分にもまた記載されるとおりの１又は複数の関連するヘルパープラスミドを使用してレンチウイルス形質導入することにより行われる。Gatewayクローニング方法では、ある遺伝子を選択し（ＣＤ８６など）、次にプライマーを提供し、ａｔｔＢタグ付加プライマー対の助けによりＰＣＲ技術を用いて増幅する。次にＢＰ反応を用いてこのＰＣＲ断片をａｔｔＰ部位を含むドナーベクター（ｐＤＯＮＲ２２１などのｐＤＯＮＲ）と組み合わせると、エントリークローンが提供される。ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組み込み反応によってＰＣＲ断片がドナーベクターと組み合わされる。得られるエントリークローンは、ａｔｔＬ部位に隣接した目的の遺伝子を含む。次にＬＲ反応を用いてエントリークローンをデスティネーションベクターと組み合わせると、発現ベクターが作製される。ＬＲ反応では、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位並びにクロナーゼ（clonase）酵素を使用した組換え反応を用いてエントリークローンがデスティネーションベクター（ｐＬＶ４３０Ｇなど）に連結される。ａｔｔＬ部位はエントリークローンに既に存在し、一方、デスティネーションベクターはａｔｔＲ部位を含む。ＬＲ反応を行うと、同時反応で目的の配列が１又は複数のデスティネーションベクターに移る。
[00322] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるａＡＰＣは血清ベースの培地下及び／又は無血清培地下で成長させ、維持してもよい。例示的方法によれば、ａＡＰＣは２４ウェルプレートにおいてウェル当たり約１×１０６細胞の細胞密度で３〜５日間培養してもよい。次に細胞を遠心によって単離及び／又は洗浄し、培地中に再懸濁するか、又は適切な凍結保存培地（例えば、CryoStor 10（BioLife Solutions））に凍結保存して−８０℃のフリーザーで保管してもよい。
[00323] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるａＡＰＣは血清ベースの培地の存在下で成長させてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載されるａＡＰＣは、ヒト血清（hSerum）含有培地（例えば、１０％hSerumのｃＤＭＥＭ）を含む血清ベースの培地の存在下で成長させてもよい。一部の実施形態において、血清ベースの培地の存在下で成長させるａＡＰＣは、ａＭＯＬＭ−１３細胞、ａＭＯＬＭ−１４細胞、及びａＥＭ３細胞からなる群から選択され得る。
[00324] 一部の実施形態において、本明細書に記載されるａＡＰＣは無血清培地の存在下で成長させてもよい。一部の実施形態において、無血清培地は、CTS Optmizer（ThermoFisher）、Xvivo-20（Lonza）、Prime T Cell CDM（Irvine）、XFSM（MesenCult）などからなる群から選択され得る。一部の実施形態において、無血清培地の存在下で成長させるａＡＰＣは、ａＭＯＬＭ−１３細胞、ａＭＯＬＭ−１４細胞、及びａＥＭ３細胞からなる群から選択され得る。
腫瘍浸潤リンパ球及びＴ細胞の拡大培養方法
[00325] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を含み、この方法は、少なくとも１つのＴＩＬを含むＴＩＬ集団を本明細書に記載されるａＡＰＣと接触させることを含み、ここで、前記ａＡＰＣは、ＴＩＬの細胞表面上に発現する共刺激分子に特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドを含み、前記共刺激分子が前記共刺激リガンドに結合するとＴＩＬの増殖が誘導され、それによりＴＩＬが特異的に拡大する。
[00326] ある実施形態において、本発明は、本開示のａＡＰＣのいずれかを使用して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりのステップを含む。例えば、腫瘍を酵素培地に置き、約１分間機械的に解離し得る。次に混合物を３７℃５％ＣＯ２で３０分間インキュベートし、次に再び約１分間機械的に破壊し得る。３７℃５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３度目に約１分間機械的に破壊し得る。３度目の機械的破壊後に大型の組織片が存在する場合、１回又は２回の更なる機械的解離が、３７℃５％ＣＯ２での更に３０分間のインキュベーションを伴い又は伴わず試料に適用されてもよい。最終回のインキュベーションの終了時、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、Ficollを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。ＴＩＬ培養は２４ウェルプレート（Costar２４ウェル細胞培養クラスター、平底；Corning Incorporated、Corning, NY）で開始したが、各ウェルには、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp.、Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は約１〜８ｍｍ３のサイズの１個の腫瘍断片を播種し得る。ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭヘペス、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補足したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ １６４０からなる。培養は、１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底を有する４０ｍＬ容量のガス透過性フラスコ（G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing、New Brightonで開始してもよく、各フラスコには、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片をロードし得る。G-Rex 10及び２４ウェルプレートを加湿インキュベーターにおいて３７℃５％ＣＯ２でインキュベートしてもよく、培養開始から５日後、培地の半分を取り出して新鮮なＣＭ及びＩＬ−２を補充してもよく、５日目以降、２〜３日毎に培地の半分を交換し得る。ＴＩＬの迅速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）は、本開示のａＡＰＣを使用して、本明細書の他の部分に記載されるとおり、Ｔ−１７５フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施し得る。Ｔ−１７５フラスコにおけるＲＥＰについては、各フラスコ内の１５０ｍＬの培地中に１×１０６個のＴＩＬを懸濁し得る。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）を補足したＣＭ及びAIM-V培地の１対１混合物（５０／５０培地）中において、ＴＩＬを本開示のａＡＰＣと本明細書に記載される比で培養し得る。Ｔ−１７５フラスコは３７℃５％ＣＯ２でインキュベートし得る。５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する５０／５０培地を使用して培地の半分を交換し得る。７日目、２つのＴ−１７５フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせてもよく、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する３００ｍＬのAIM-Vを加え得る。毎日又は２日毎に各バッグの細胞数をカウントしてもよく、新鮮培地を加えて細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。１００ｃｍ２ガス透過性シリコン底を有する５００ｍＬ容量フラスコ（例えば、G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing、本明細書の他の部分に記載されるとおり）におけるＲＥＰについては、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）を補足した４００ｍＬの５０／５０培地中において、５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをａＡＰＣと本明細書に記載される比（例えば１：１００）で培養し得る。G-Rex100フラスコは３７℃５％ＣＯ２でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心し得る。得られたＴＩＬペレットは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地に再懸濁し、G-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養する場合、７日目に各フラスコ中に存在する３００ｍＬの培地に各G-Rex 100のＴＩＬを懸濁してもよく、この細胞懸濁液は、３つのG-Rex100フラスコの播種に使用し得る３つの１００ｍＬアリコートに分割し得る。次に５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する約１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。次にG-Rex100フラスコを３７℃５％ＣＯ２でインキュベートしてもよく、４日後、各G-Rex100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。この後、培養１４日目に細胞を回収することによりＲＥＰを完了し得る。
[00327] 本明細書に記載されるとおり、ＴＩＬは有利には無血清培地の存在下で拡大培養し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＴＩＬ拡大培養方法は、血清ベースの培地（例えば、完全培地又はＣＭ１）よりむしろ、無血清培地の使用を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＴＩＬ拡大培養方法は、血清ベースの培地よりむしろ、無血清培地を使用し得る。一部の実施形態において、無血清培地は、CTS Optmizer（ThermoFisher）、Xvivo-20（Lonza）、Prime T Cell CDM（Irvine）などからなる群から選択され得る。
[00328] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含む。
[00329] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む。
[00330] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＡＰＣ集団は、細胞培養培地においてＴＩＬ集団を７日の期間で少なくとも５０倍に拡大する。
[00331] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現する。
[00332] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＭＯＬＭ−１４細胞である。
[00333] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＭＯＬＭ−１３細胞である。
[00334] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ｃ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｄ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、骨髄系細胞はＥＭ−３細胞である。
[00335] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＣＤ８６タンパク質は配列番号８に記載のアミノ酸配列、又はその保存的アミノ酸置換を含み、４−１ＢＢＬタンパク質は配列番号９に記載のアミノ酸配列、又はその保存的アミノ酸置換を含む。
[00336] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＣＤ８６をコードする核酸は配列番号１９に記載の核酸配列を含み、４−１ＢＢＬをコードする核酸は配列番号１６に記載の核酸配列を含む。
[00337] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップを含み、ここで、拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[00338] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は１：２００〜１：４００である。
[00339] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を入手するステップであって、１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するステップ、及び
（ｂ）細胞培養培地中でＴＩＬ集団をａＡＰＣ集団と接触させるステップ
を含み、ここで、ＴＩＬ集団とａＡＰＣ集団との比は約１：３００である。
[00340] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法を提供し、この方法は、ＴＩＬ集団を含むＴＩＬ集団を骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることを含み、ここで、骨髄系ａＡＰＣは、ＴＩＬ上の少なくとも２つの共刺激分子に特異的に結合する少なくとも２つの共刺激リガンドを含み、共刺激分子が共刺激リガンドに結合するとＴＩＬの増殖が誘導され、それによりＴＩＬが特異的に拡大し、及び少なくとも２つの共刺激リガンドはＣＤ８６及び４−１ＢＢＬを含む。
[00341] 前述の実施形態のいずれにおいても、ａＡＰＣは４−１ＢＢＬに加えてＯＸ４０Ｌを更に含んでもよく、又は４−１ＢＢＬの代わりにＯＸ４０Ｌを含んでもよい。
[00342] ある実施形態において、拡大培養する方法又は癌を治療する方法は、患者腫瘍試料からＴＩＬを入手するステップを含む。患者腫瘍試料は当該技術分野において公知の方法を用いて得てもよい。例えば、ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物及び鋭的剥離からの腫瘍断片（約１〜約８ｍｍ３のサイズ）から培養されてもよい。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、ロズウェルパーク記念研究所（Roswell Park Memorial Institute：ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタミン酸塩、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮアーゼ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーションと、それに続く機械的解離（例えば、組織解離装置を用いる）によって作製されてもよい。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍を約１分間機械的に解離した後、続いて３７℃５％ＣＯ２で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片しか存在しなくなるまで前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製されてもよい。この処理の終了時、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、FICOLL分枝状親水性多糖を使用した密度勾配分離を実施して、それらの細胞を除去し得る。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、当該技術分野において公知の代替的な方法を用いてもよい。前述の方法のいずれも、ＴＩＬの拡大培養方法又は癌の治療方法に関して本明細書に記載される任意の実施形態において用いることができる。
[00343] ある実施形態において、ＲＥＰは、任意の好適な方法によって本開示のａＡＰＣを使用してガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて迅速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体、例えば、モノクローナル抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ−３（Ortho-McNeil、Raritan, NJ, USA又はMiltenyi Biotech、Auburn, CA, USAから市販されている）又はＵＨＣＴ−１（BioLegend、San Diego, CA, USAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２又はＩＬ−１５などのＴ細胞成長因子の存在下で、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μＭ ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐ１００：２０９−２１７（２１０Ｍ）など、任意選択でベクターから発現させることのできる、１つ又は複数のエピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１又は複数の抗原によってインビトロでＴＩＬを更に刺激することにより、迅速に拡大培養することができる。他の好適な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２、及びＶＥＧＦＲ２、又はその抗原性部分を挙げることができる。ＴＩＬはまた、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ１つ又は複数の抗原による再刺激によっても迅速に拡大培養し得る。或いは、ＴＩＬは、例えば照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２によって更に再刺激することができる。
[00344] ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約５０００ｍＬ〜約２５０００ｍＬの細胞培養培地、約５０００ｍＬ〜約１００００ｍＬの細胞培養培地、又は約５８００ｍＬ〜約８７００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、ＴＩＬの拡大培養方法は、約１０００ｍＬ〜約２０００ｍＬの細胞培地、約２０００ｍＬ〜約３０００ｍＬの細胞培養培地、約３０００ｍＬ〜約４０００ｍＬの細胞培養培地、約４０００ｍＬ〜約５０００ｍＬの細胞培養培地、約５０００ｍＬ〜約６０００ｍＬの細胞培養培地、約６０００ｍＬ〜約７０００ｍＬの細胞培養培地、約７０００ｍＬ〜約８０００ｍＬの細胞培養培地、約８０００ｍＬ〜約９０００ｍＬの細胞培養培地、約９０００ｍＬ〜約１００００ｍＬの細胞培養培地、約１００００ｍＬ〜約１５０００ｍＬの細胞培養培地、約１５０００ｍＬ〜約２００００ｍＬの細胞培養培地、又は約２００００ｍＬ〜約２５０００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大には１種類以下の細胞培養培地が使用される。任意の好適な細胞培養培地、例えば、AIM-V細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Invitrogen、Carlsbad, CA, USA）を使用し得る。この点に関して、本発明の方法では有利には、ＴＩＬ数の拡大に必要な培地の量及び培地の種類の数が減少する。ある実施形態において、ＴＩＬ数の拡大は、２日又は３日おき以下の頻度で細胞をフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡大すると、細胞の拡大培養に必要なフィーディング頻度が減少することにより細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になる。
[00345] ある実施形態において、迅速拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。かかる実施形態は、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６細胞／ｃｍ２へと拡大培養することを可能にする。ある実施形態において、この拡大培養はフィーディングなしに行われる。ある実施形態において、この拡大培養は、培地がガス透過性フラスコ内に約１０ｃｍの高さで存在する限りフィーディングなしに行われる。ある実施形態において、これにはフィーディングはないが、１又は複数のサイトカインの添加はある。ある実施形態において、サイトカインは、サイトカインを培地と混合する必要は一切ななしにボーラスとして添加することができる。かかる容器、装置、及び方法は当該技術分野において公知で、ＴＩＬの拡大培養に用いられており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９ Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７ Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８ Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０号、国際公開第２０１１／０７２０８８ Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３ Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１ Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５ Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０号、国際公開第２０１３／１７３８３５ Ａ１号、及び米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６ Ａ１号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが含まれる。かかるプロセスはまた、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292（この開示は参照により本明細書に援用される）にも記載されている。
[00346] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 10フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA）である。ある実施形態において、ガス透過性容器は１０ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は４０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は２回の培地交換後に１〜３億個のＴＩＬを提供する。
[00347] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 100フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA）である。ある実施形態において、ガス透過性容器は１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は４５０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は２回の培地交換後に１０〜３０億個のＴＩＬを提供する。
[00348] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 100Mフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA）である。ある実施形態において、ガス透過性容器は１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は１０００ｍＬの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は培地交換なしに１０〜３０億個のＴＩＬを提供する。
[00349] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 100Lフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA）である。ある実施形態において、ガス透過性容器は１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は２０００ｍＬの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は培地交換なしに１０〜３０億個のＴＩＬを提供する。
[00350] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 24ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA）である。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは２ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは８ｍＬの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は２回の培地交換後にウェル当たり２０００〜６０００万個の細胞を提供する。
[00351] ある実施形態において、ガス透過性容器はG-Rex 6ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USA）である。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは１０ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器はウェルを備えたプレートを含み、ここで、各ウェルは４０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。ある実施形態において、ガス透過性容器は２回の培地交換後にウェル当たり１〜３億個の細胞を提供する。
[00352] ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はろ過されていない。ろ過されていない細胞培地を使用すると、細胞の数の拡大に必要な手順が簡便になり得る。ある実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含まない。
[00353] ある実施形態において、哺乳類から腫瘍組織試料を得ること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養すること；腫瘍組織試料からＴＩＬを得ること；ａＡＰＣを使用して細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を約１４〜約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む本方法の所要期間。
[00354] ある実施形態において、迅速拡大培養には約１×１０９〜約１×１０１１個のａＡＰＣが使用される。ある実施形態において、迅速拡大培養には約１×１０９個のａＡＰＣが使用される。ある実施形態において、迅速拡大培養には約１×１０１０個のａＡＰＣが使用される。ある実施形態において、迅速拡大培養には約１×１０１１個のａＡＰＣが使用される。
[00355] ある実施形態において、ＴＩＬ対ａＡＰＣ比（ＴＩＬ：ａＡＰＣ）は、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１０５、１：１１０、１：１１５、１：１２０、１：１２５、１：１３０、１：１３５、１：１４０、１：１４５、１：１５０、１：１５５、１：１６０、１：１６５、１：１７０、１：１７５、１：１８０、１：１８５、１：１９０、１：１９５、１：２００、１：２２５、１：２５０、１：２７５、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、及び１：５００からなる群から選択される。好ましい実施形態において、ＴＩＬ対ａＡＰＣ比（ＴＩＬ：ａＡＰＣ）は約１：９０である。好ましい実施形態において、ＴＩＬ対ａＡＰＣ比（ＴＩＬ：ａＡＰＣ）は約１：９５である。好ましい実施形態において、ＴＩＬ対ａＡＰＣ比（ＴＩＬ：ａＡＰＣ）は約１：１００である。好ましい実施形態において、ＴＩＬ対ａＡＰＣ比（ＴＩＬ：ａＡＰＣ）は約１：１０５である。好ましい実施形態において、ＴＩＬ対ａＡＰＣ比（ＴＩＬ：ａＡＰＣ）は約１：１１０である。
[00356] ある実施形態において、迅速拡大培養におけるＴＩＬ対ａＡＰＣ比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、又は約１：５００である。ある実施形態において、迅速拡大培養におけるＴＩＬ対ａＡＰＣ比は１：５０〜１：３００である。ある実施形態において、迅速拡大培養におけるＴＩＬ対ａＡＰＣ比は１：１００〜１：２００である。
[00357] ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。好ましい実施形態において、細胞培養培地は約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ、又は８０００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ−２を含む。
[00358] ある実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ−３抗体を含む。好ましい実施形態において、細胞培養培地は約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。
[00359] ある実施形態において、ＴＩＬの迅速拡大培養プロセスは、先述のとおりＴ−１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42）又はガス透過性培養ウェア（G-Rexフラスコ、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）を使用して実施し得る。Ｔ−１７５フラスコ内でのＴＩＬ迅速拡大培養については、１５０ｍＬの培地に懸濁された１×１０６個のＴＩＬを各Ｔ−１７５フラスコに加え得る。ＴＩＬはａＡＰＣと１ ＴＩＬ対１００ ａＡＰＣの比で培養してもよく、及び細胞は、３０００ＩＵ（国際単位）／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（例えばＯＫＴ−３）を補足したＣＭとAIM-V培地との１対１混合物中で培養した。Ｔ−１７５フラスコは３７℃５％ＣＯ２でインキュベートし得る。５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して培地の半分を交換し得る。７日目に２つのＴ−１７５フラスコからの細胞を３リットルバッグに合わせ、その３００ｍｌのＴＩＬ懸濁液に５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する３００ｍＬのAIM Vを加えた。各バッグの細胞数を毎日又は２日毎にカウントし、新鮮培地を加えて細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
[00360] ある実施形態において、１００ｃｍガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量ガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation、New Brighton, MN, USAから市販されている）におけるＴＩＬ迅速拡大培養については、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）を補足した４００ｍＬの５０／５０培地中で５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬをａＡＰＣと１：１００の比で培養し得る。G-Rex 100フラスコは３７℃５％ＣＯ２でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（毎分回転数；４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。ＴＩＬペレットは、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する１５０ｍＬの新鮮培地に再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し加え得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養する場合、７日目に各フラスコ中に存在する３００ｍＬの培地に各G-Rex 100のＴＩＬを懸濁してもよく、この細胞懸濁液は、３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る３つの１００ｍＬアリコートに分割し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する１５０ｍＬのAIM-Vを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコは３７℃５％ＣＯ２でインキュベートしてもよく、４日後、各G-Rex 100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含有する１５０ｍＬのAIM-Vを加え得る。培養１４日目に細胞を回収し得る。
[00361] ある実施形態において、ＴＩＬは以下のとおり調製し得る。２ｍＭグルタミン（Mediatech, Inc. Manassas, VA）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen Life Technologies）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen Life Technologies）、５％熱失活ヒトＡＢ血清（Valley Biomedical, Inc. Winchester, VA）及び６００ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ−２（Chiron、Emeryville, CA）を補足したAIM-V培地（Invitrogen Life Technologies、Carlsbad, CA）を含む完全培地（ＣＭ）中で２ｍｍ３腫瘍断片を培養する。固形腫瘍の酵素消化のため、腫瘍標本をＲＰＭＩ−１６４０中にダイシングし、洗浄し、１５〜２２℃において８００ｒｐｍで５分間遠心し、酵素消化緩衝液（ＲＰＭＩ−１６４０中０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ及び３０単位／ｍｌのＤＮアーゼ）に再懸濁した後、続いて室温で一晩回転させた。断片から樹立したＴＩＬはＣＭ中で３〜４週間成長させて、新鮮に拡大培養してもよく、又は１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する熱失活ＨＡＢ血清中に凍結保存して、試験時まで−１８０℃で保管してもよい。採取腹水から得られた腫瘍関連リンパ球（tumor associated lymphocyte：ＴＡＬ）を３×１０６細胞／ウェルで２４ウェルプレートのＣＭ中に播種した。ほぼ隔日で、低倍率倒立顕微鏡を使用してＴＩＬ成長を調べた。
[00362] ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の方法、組成物、及び装置を用いたＰＢＭＣを使用したＴＩＬの拡大培養に用いられている。ある実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１１Ｌ、約１２Ｌ、約１３Ｌ、約１４Ｌ、約１５Ｌ、約１６Ｌ、約１７Ｌ、約１８Ｌ、約１９Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ、及び約３０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、５０〜１５０ｍＬ、１５０〜２５０ｍＬ、２５０〜３５０ｍＬ、３５０〜４５０ｍＬ、４５０〜５５０ｍＬ、５５０〜６５０ｍＬ、６５０〜７５０ｍＬ、７５０〜８５０ｍＬ、８５０〜９５０ｍＬ、及び９５０〜１０５０ｍＬからなる群から選択される容積範囲を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、１Ｌ〜２Ｌ、２Ｌ〜３Ｌ、３Ｌ〜４Ｌ、４Ｌ〜５Ｌ、５Ｌ〜６Ｌ、６Ｌ〜７Ｌ、７Ｌ〜８Ｌ、８Ｌ〜９Ｌ、９Ｌ〜１０Ｌ、１０Ｌ〜１１Ｌ、１１Ｌ〜１２Ｌ、１２Ｌ〜１３Ｌ、１３Ｌ〜１４Ｌ、１４Ｌ〜１５Ｌ、１５Ｌ〜１６Ｌ、１６Ｌ〜１７Ｌ、１７Ｌ〜１８Ｌ、１８Ｌ〜１９Ｌ、及び１９Ｌ〜２０Ｌからなる群から選択される容積範囲を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、０．５Ｌ〜５Ｌ、５Ｌ〜１０Ｌ、１０Ｌ〜１５Ｌ、１５Ｌ〜２０Ｌ、２０Ｌ〜２５Ｌ、及び２５Ｌ〜３０Ｌからなる群から選択される容積範囲を有するガス透過性細胞バッグを含む。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、及び約２８日の揺動時間を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、３０分〜１時間、１時間〜１２時間、１２時間〜１日、１日〜７日、７日〜１４日、１４日〜２１日、及び２１日〜２８日の揺動時間を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約２回揺動／分、約５回揺動／分、約１０回揺動／分、約２０回揺動／分、約３０回揺動／分、及び約４０回揺動／分の揺動速度を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、２回揺動／分〜５回揺動／分、５回揺動／分〜１０回揺動／分、１０回揺動／分〜２０回揺動／分、２０回揺動／分〜３０回揺動／分、及び３０回揺動／分〜４０回揺動／分の揺動速度を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、約２°、約３°、約４°、約５°、約６°、約７°、約８°、約９°、約１０°、約１１°、及び約１２°の揺動角度を利用する。ある実施形態において、細胞拡大培養システムは、２°〜３°、３°〜４°、４°〜５°、５°〜６°、６°〜７°、７°〜８°、８°〜９°、９°〜１０°、１０°〜１１°、及び１１°〜１２°の揺動角度を利用する。
[00363] ある実施形態において、ａＡＰＣを使用してＴＩＬを拡大培養する方法は、優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当該技術分野において公知の任意の選択方法を用いることができる。例えば、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択には、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載される方法が用いられてもよい。
[00364] ある実施形態において、本発明のａＡＰＣはＴ細胞の拡大培養に使用され得る。ＴＩＬの拡大培養について記載している本発明の前述の任意の実施形態もまた、Ｔ細胞の拡大培養に適用し得る。ある実施形態において、本発明のａＡＰＣを使用してＣＤ８＋ Ｔ細胞が拡大培養されてもよい。ある実施形態において、本発明のａＡＰＣを使用してＣＤ４＋ Ｔ細胞が拡大培養されてもよい。ある実施形態において、本発明のａＡＰＣを使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ）が形質導入されたＴ細胞が拡大培養されてもよい。ある実施形態において、本発明のａＡＰＣを使用して、修飾Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞が拡大培養されてもよい。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、当該技術分野において、例えば米国特許第７，０７０，９９５号；同第７，４４６，１９０号；同第８，３９９，６４５号；同第８，９１６，３８１号；及び同第９，３２８，１５６号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、ＣＤ１９を含めた任意の好適な抗原に対して標的化し得る。修飾ＴＣＲ細胞は、当該技術分野において、例えば米国特許第８，３６７，８０４号及び同第７，５６９，６６４号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２、及びＶＥＧＦＲ２を含めた任意の好適な抗原、又はその抗原性部分に対して標的化し得る。
癌及び他の疾患を治療する方法
[00365] 本明細書に記載される組成物及び方法は、疾患の治療方法において使用することができる。ある実施形態において、本組成物及び方法は、過剰増殖性障害の治療における使用のためのものである。本組成物及び方法はまた、本明細書及び以下の段落に記載されるとおりの他の障害の治療においても使用され得る。本明細書に記載されるＴＩＬ、その集団及び組成物は、疾患の治療における使用のためのものであり得る。ある実施形態において、本明細書に記載されるＴＩＬ、集団及び組成物は、過剰増殖性障害の治療における使用のためのものである。
[00366] 一部の実施形態において、過剰増殖性障害は癌である。一部の実施形態において、過剰増殖性障害は固形腫瘍癌である。一部の実施形態において、固形腫瘍癌は、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、及び腎細胞癌、膵癌、及び膠芽腫からなる群から選択される。一部の実施形態において、過剰増殖性障害は血液学的悪性腫瘍である。一部の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。
[00367] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を含み、これは、（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；（ｂ）細胞培養培地中で人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び（ｃ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第２のＴＩＬ集団を投与するステップを含む。ある実施形態において、ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。ある実施形態において、迅速拡大培養は１４日以下の期間にわたって行われる。
[00368] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を含み、これは、（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも１０倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で第２のａＡＰＣ集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を得るステップであって、第３のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む。ある実施形態において、ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。ある実施形態において、迅速拡大培養は１４日以下の期間にわたって行われる。ある実施形態において、初期拡大培養はガス透過性容器を使用して行われる。
[00369] ある実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法を含み、これは、（ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；（ｂ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、第２のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも１０倍数が多く、及び第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；（ｃ）第２の細胞培養培地中で人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を使用して第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を得るステップであって、第３のＴＩＬ集団が第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；（ｄ）癌を有する患者に治療上有効な分量の第３のＴＩＬ集団を投与するステップを含む。ある実施形態において、ａＡＰＣは１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、ここで、１又は複数のウイルスベクターは、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、ＭＯＬＭ−１４細胞はＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する。ある実施形態において、迅速拡大培養は１４日以下の期間にわたって行われる。
[00370] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を治療する方法を含み、ここで、患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法はシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日を２日（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）、及びフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日を５日（ＴＩＬ注入前２７〜２３日目）である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
[00371] 適応される疾患又は障害の治療、予防及び／又は管理における本明細書に記載される化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の治療指針を提供する当該技術分野において公知の様々なモデルを用いて試験することができる。例えば、卵巣癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92；及びFong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12に記載されている。膵癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、Herreros- Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294に記載されている。乳癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212に記載されている。黒色腫治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859に記載されている。肺癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664に記載されている。肺癌治療の有効性を決定するためのモデルについては、例えば、Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60；及びSano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32に記載されている。
化学療法による骨髄非破壊的リンパ球枯渇
[00372] ある実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を治療する方法を含み、ここで、患者は本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。ある実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための、本明細書に記載される方法によって入手可能なＴＩＬ集団を提供し、ここで、ＴＩＬ集団は、骨髄非破壊的化学療法で前処置される患者を治療するためのものである。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法はシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日を２日（ＴＩＬ注入前２７日目及び２６日目）、及びフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日を５日（ＴＩＬ注入前２７〜２３日目）である。ある実施形態において、骨髄非破壊的化学療法及び本開示に係るＴＩＬ注入（０日目）の後、患者は生理学的忍容量まで８時間毎に静脈内に７２０，０００ＩＵ／ｋｇのＩＬ−２（アルデスロイキン、PROLEUKINとして市販されている）の静脈内注入を受ける。
[00373] 実験的知見から、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合エレメント（「サイトカインシンク」）の除去により、治療有効性の増強において重要な役割を果たすことが指摘される。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬを導入する前に患者に対してリンパ球枯渇ステップ（時に「免疫抑制コンディショニング」とも称される）を利用する。
[00374] 一般に、リンパ球枯渇は、フルダラビン又はシクロホスファミド（その活性型はマホスファミドと称される）及びこれらの組み合わせの投与を用いて実現される。かかる方法については、Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85、Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681、Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239、及びDudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357（これらは全て、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。
[00375] 一部の実施形態において、フルダラビンは０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は３５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間投与される。一部の実施形態において、フルダラビン治療は２５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間投与される。
[00376] 一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与によって０．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度で達成される。一部の実施形態において、活性型のシクロホスファミドであるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与によって１μｇ／ｍＬの濃度で達成される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は１日、２日、３日、４日、５日、６日、又は７日間又はそれ以上投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日、又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投薬量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内に（ｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は２５０ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で４〜５日間投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド治療は２５０ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で４日間投与される。
[00377] 一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを一緒に患者に投与することにより実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは２５０ｍｇ／ｍ２／日ｉ．ｖ．で４日間にわたって投与される。
[00378] ある実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与と、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与によって実施される。
医薬組成物、投薬量、及び投与レジメン
[00379] ある実施形態において、本開示のａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、患者に医薬組成物として投与される。ある実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のａＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当該技術分野において公知のとおりの任意の好適な経路によって投与されてもよい。好ましくは、ＴＩＬは、動脈内注入又は静脈内注入など、単回注入として投与され、これは好ましくは約３０〜６０分続く。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が挙げられる。
[00380] 任意の好適な用量のＴＩＬを投与することができる。好ましくは、約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０ ＴＩＬが投与され、特に癌が黒色腫である場合、平均約７．８×１０１０ ＴＩＬである。ある実施形態において、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。
[00381] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。ある実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２、及び５×１０１２〜１×１０１３の範囲である。
[00382] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖ未満である。
[00383] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％ １９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％ １８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％ １７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％ １６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％ １５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％ １４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％ １３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％ １２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％ １１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％ １０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％ ９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％ ８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％ ７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％ ６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％ ５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、又はｖ／ｖ超である。
[00384] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％〜約５０％、約０．００１％〜約４０％、約０．０１％〜約３０％、約０．０２％〜約２９％、約０．０３％〜約２８％、約０．０４％〜約２７％、約０．０５％〜約２６％、約０．０６％〜約２５％、約０．０７％〜約２４％、約０．０８％〜約２３％、約０．０９％〜約２２％、約０．１％〜約２１％、約０．２％〜約２０％、約０．３％〜約１９％、約０．４％〜約１８％、約０．５％〜約１７％、約０．６％〜約１６％、約０．７％〜約１５％、約０．８％〜約１４％、約０．９％〜約１２％又は約１％〜約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
[00385] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、約０．０２％〜約４．５％、約０．０３％〜約４％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０５％〜約３％、約０．０６％〜約２．５％、約０．０７％〜約２％、約０．０８％〜約１．５％、約０．０９％〜約１％、約０．１％〜約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲である。
[00386] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、又は０．０００１ｇ以下である。
[00387] 一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、又は１０ｇ超である。
[00388] 本発明の実施形態の医薬組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投薬量範囲にわたって有効である。正確な投薬量は、投与経路、化合物の投与形態、治療対象の性別及び年齢、治療対象の体重、並びに主治医の優先的選択及び経験に依存することになる。臨床的に確立されたＴＩＬの投薬量もまた、適宜用いられ得る。ＴＩＬの投薬量など、本明細書の方法を用いて投与される医薬組成物の量は、治療下のヒト又は哺乳類、障害又は病態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質及び処方医師の裁量に依存することになる。
[00389] 一部の実施形態において、ＴＩＬは単回用量で投与されてもよい。かかる投与は、注射、例えば静脈内注射によってもよい。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回用量で投与されてもよい。投与は、年１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は６回超であってもよい。投与は、月１回、２週間に１回、週１回、又は隔日１回であってもよい。ＴＩＬの投与は必要な限り継続されてもよい。
[00390] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２、及び５×１０１２〜１×１０１３の範囲である。
[00391] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ ｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ〜約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ〜約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
[00392] 一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投薬量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２３ｍｇ〜約２８ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ〜約１１０ｍｇ、又は約９５ｍｇ〜約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ〜約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ〜約２０５ｍｇ、又は約１９８〜約２０７ｍｇの範囲である。
[00393] 有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射によること、静脈内、腹腔内、非経口的、筋肉内、皮下、局所、移植によること、又は吸入によることを含め、同様の有用性を有する薬剤について一般に認められている任意の投与方式により、単回用量又は複数回用量のいずれで投与されてもよい。
実施例
[00394] ここで、以下の実施例を参照して、本明細書に包含される実施形態を説明する。これらの実施例はあくまでも例示を目的として提供されるものであり、本明細書に包含される開示がこれらの実施例に限定されると解釈されることがあっては決してならず、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形例を包含すると解釈されなければならない。
実施例１ − ＰＢＭＣフィーダー細胞を使用した腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養の変動性
[00395] ＰＢＭＣフィーダー細胞を使用して達成されるＴＩＬ拡大培養の変動性は、患者から得られた同じＴＩＬ株に関する複数のＴＩＬ拡大培養の結果を比較することにより実証し得る。図１は、照射した同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞（ＰＢＭＣフィーダー）を使用したＴＩＬの迅速拡大培養の典型的な結果を示す。Ｍ１０１５Ｔ及びＭ１０１６Ｔとの名称の２つのＴＩＬ株（１．３×１０５細胞）を４６個の異なる照射フィーダー細胞ロット（１．３×１０７）、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ、組換えヒトＩＬ−２（例えば、アルデスロイキン又は等価物）、CellGenix, Inc.、Portsmouth, NH, USA）及びＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotec GmbH、Bergisch Gladbach, Germany）とＴ２５フラスコ内で７日間共培養した。７日目にＴＩＬの拡大倍数値を計算した。この図は、別個の刺激実験における２つのＴＩＬ株の拡大倍数の数字を示す。各ＴＩＬ株につき、４６個の異なるＰＢＭＣフィーダーロットを試験した。結果は各ＴＩＬ株について１００倍超に及び、ＰＢＭＣフィーダー細胞を使用した拡大培養結果の変動性が強調される。本発明のａＡＰＣは、以下の実施例に示すとおり、ＰＢＭＣフィーダーと比較して拡大培養性能の変動性の低下、並びに他の利点をもたらす。
実施例２ − ａＡＰＣ開発用の骨髄系細胞の選択
[00396] 様々な骨髄系列細胞株に関して表現型の特徴付けを行い、ＴＩＬ拡大培養用のａＡＰＣへの更なる修飾に可能性のある候補を同定した。結果を表５に要約する。ＭＯＬＭ−１４細胞株はＣＤ６４の内因性発現を呈し、更なる開発に選択した。ＥＭ−３細胞株は、ＩＣＯＳ−Ｌの内因性発現の観察に基づき選択した（これはＥＭ−２細胞株については、同じ患者から採取したにも関わらず観察されなかった）。
実施例３ − ＭＯＬＭ−１４人工抗原提示細胞（ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣ）の調製
[00397] Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHからＭＯＬＭ−１４細胞を入手した。ＭＯＬＭ−１４ベースのａＡＰＣを開発するため、ＭＯＬＭ−１４細胞を共刺激分子ＣＤ８６及び４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）で改変した。ヒトＣＤ８６（ｈＣＤ８６）及びヒト４−１ＢＢＬ（ｈ４−１ＢＢＬ）遺伝子を市販のＰＬＶ４３０Ｇにクローニングし、レンチウイルス形質導入方法を用いてＰＤＯＮＲ２２１ベクター（Invitrogen／Thermo Fisher Scientific、Carlsbad, CA, USA）とコトランスフェクトした。Katzen, Expert Opin. Drug Disc. 2007, 4, 571-589に記載されるとおりゲートウェイクローニング法を用いてｈＣＤ８６及びｈＣＤ１３７Ｌ遺伝子をＰＬＶ４３０Ｇ及びＰＤＯＮＲ２２１ベクターにクローニングした。２９３Ｔ細胞株（ラージＴ抗原で形質転換したヒト胎児腎細胞）をレンチウイルス作製に使用し、ＭＯＬＭ−１４細胞に形質導入した。ＡＰＣコンジュゲートＣＤ８６及びＰＥコンジュゲートＣＤ１３７Ｌを使用してトランスフェクト細胞を選別することにより（S3eセルソーター、Bio-Rad、Hercules, CA, USA）、細胞を単離し、エンリッチした。エンリッチ細胞の純度をフローサイトメトリーによって調べた。
[00398] クローニングに使用したベクター及びその一部分を図２〜図１１に図示し、各ベクターのヌクレオチド配列を表６に提供する。ｐＬＶ４３０Ｇヒト４−１ＢＢＬベクターを図２に示し、そのポリメラーゼ連鎖反応産物（ＰＣＲＰ）部分を図３に示す。ｐＬＶ４３０ＧヒトＣＤ８６ベクターを図４に示し、そのＰＣＲＰ部分を図５に示す。ｐＤＯＮＲ２２１ヒトＣＤ８６ドナー及びヒト４−１ＢＢＬドナーベクターを、それぞれ図６及び図７に示す。Gatewayクローニング法用のエンプティーｐＬＶ４３０Ｇデスティネーションベクター及びエンプティーｐＤＯＮＲ２２１ドナーベクターの図を、それぞれ図８及び図９に示す。図１０及び図１１は、レンチウイルス作製に使用されるｐｓＰＡＸ２及びｐＣＩＧＯ−ＶＳＶ．Ｇヘルパープラスミドのベクター図を示す。
[00399] フローサイトメトリー（Canto IIフローサイトメーター、Becton, Dickinson, and Co.、Franklin Lakes, NJ, USA）を用いて改変ＭＯＬＭ−１４ ａＡＰＣ（本明細書ではａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣとも称される）のＣＤ８６及び４−１ＢＢＬ発現を確認した。結果は図１２に示す。ａＭＯＬＭ−１４ ａＡＰＣを１００Ｇｙでγ線照射し、凍結した。
実施例４ − ＭＯＬＭ−１４人工抗原提示細胞を使用した腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養
[00400] 改変ＭＯＬＭ−１４細胞を１００Ｇｙでγ線照射した後、ＴＩＬと共培養した。ＲＥＰは、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を含有するＣＭ２培地においてＴＩＬを照射済み改変ＭＯＬＭ−１４細胞と１：１００の比で１４日間培養することによって開始した。ＲＥＰ回収時に、ＴＩＬ拡大培養速度、活性化及び分化段階マーカーの表現型、代謝速度、細胞傷害性及び再迅速拡大培養プロトコル（ｒｅ−ＲＥＰ）アッセイを測定した。
[00401] 結果は図１３、図１４、図１５、及び図１６に示し、ここで、は２組の患者ＴＩＬについての２つの拡大培養を比較している。ＣＤ８６／４−１ＢＢＬ修飾ＭＯＬＭ−１４細胞（「ＴＩＬ＋改変ＭＯＬＭ１４＋ＯＫＴ３」と表示される）の結果はＰＢＭＣフィーダー（「ＴＩＬ＋フィーダー＋ＯＫＴ３」と表示される）と同等である。
[00402] 図１７において１４日目の結果を比較し、ここで、は２つの更なる患者ＴＩＬの結果が示される。この結果から、ＣＤ８６及び４−１ＢＢＬで改変したＭＯＬＭ−１４細胞が、同種異系フィーダー細胞と比較したとき、迅速拡大培養プロトコルにおいて同様のＴＩＬ拡大培養を示したことが指摘される。しかしながら、親ＭＯＬＭ−１４と培養したＴＩＬは拡大しなかった。
[00403] 加えて、ＭＯＬＭ−１４に対して拡大培養したＴＩＬはＴＩＬ表現型を維持し、ＢＲＬＡを用いて測定したときＰ８１５細胞の殺傷効力を示した（これについては実施例９に詳細に記載する）。簡潔に言えば、ルシフェリン形質導入Ｐ８１５標的細胞及び目的のＴＩＬを抗ＣＤ３有り及び無しで共培養して、ＴＩＬの腫瘍応答性がＴＣＲ活性化を通じたものか（特異的殺傷）、それとも非特異的殺傷かを決定した。４時間のインキュベーション後、ウェルにルシフェリンを加えて５分間インキュベートした。インキュベーション後、ルミノメーターを使用して生物発光強度を読み取った。パーセンテージ細胞傷害率及びパーセンテージ生存率は以下の式を用いて計算した：％生存率＝（実験的生存率−最小値）／（最大シグナル−最小シグナル）×１００又は％細胞傷害率＝１００−（％生存率）。
[00404] 図１８には、低いＴＩＬ対ＭＯＬＭ−１４ ａＡＰＣ比で実施した拡大培養の結果をＰＢＭＣフィーダーによる拡大培養の結果と比較して示す。２４ウェルG-RexプレートにおいてＴＩＬ（２×１０４）を異なるＴＩＬ対ａＡＰＣ又はＰＢＭＣ比（１：１０、１：３０、及び１：１００、それぞれ「１０」、「３０」、及び「１００」と表示する）で親ＭＯＬＭ−１４（「ＭＯＬＭ１４」）細胞、ＣＤ８６と４−１ＢＢＬとを発現するように形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞（「ａＭＯＬＭ１４」）、又はＰＢＭＣフィーダー（「ＰＢＭＣ＋」）と共に、各々ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して培養した。対照はＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）のみを使用して実施した（「ＰＢＭＣ−」）。各条件につきトリプリケートで培養した。４及び７日目に培養物に新鮮培地及びＩＬ−２を供給した。７日目に生細胞をカウントした。図１８は、１１日目にカウントされた生細胞数の平均値＋標準偏差（ＳＤ）を示し、ｐ値はスチューデントｔ検定によって計算している。ＴＩＬ単独、ＰＢＭＣ単独、及びａＭＯＬＭ−１４細胞単独を使用して更なる対照実験を実施し、これらは全て、細胞数が検出不能の結果となった（データは示さず）。これらの結果は、ＯＫＴ−３及びＩＬ−２添加のＰＢＭＣフィーダーと比較したとき（ｐ＝０．０５９８）、ＯＫＴ−３及びＩＬ−２添加の１：１００の比（ＴＩＬ：ａＭＯＬＭ１４）が同様の拡大培養をもたらすことを示している。
[00405] 図１９には、より高いＴＩＬ対ＭＯＬＭ−１４ ａＡＰＣ比で実施し、他の点では図１８について上記に記載したとおり実施した拡大培養の結果をＰＢＭＣフィーダーによる拡大培養の結果と比較して示す。１：３００の比では、ＯＫＴ−３及びＩＬ−２添加のＣＤ８６／４−１ＢＢＬ修飾ＭＯＬＭ−１４ ａＡＰＣはＯＫＴ−３及びＩＬ−２添加のＰＢＭＣフィーダーよりも有意に優れている。これらの結果は、図２０及び図２１に示す反復実験で異なるＴＩＬバッチを使用して確認された。詳細には、図２１に見られるとおり、１：２００のＴＩＬ対ａＭＯＬＭ１４比が、同じ条件下でのＰＢＭＣフィーダーと比較してＴＩＬ拡大培養の増強を示す。これらの結果から、ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣが、特に１：２００〜１：３００のＴＩＬ：ａＭＯＬＭ１４比を使用したとき、ＴＩＬ数の拡大の点でＰＢＭＣよりも予想外に優れていることが確認される。
[00406] 図２２及び図２３において、ａＭＯＬＭ１４又はＰＢＭＣで拡大培養したＴＩＬをフローサイトメトリー分析によって比較して、ＴＩＬが同様の表現型を呈したことが確認され、これは患者への再注入時に同様の性能を示すものと予想し得る。簡潔に言えば、初めにＴＩＬをL/D Aquaで染色して生存能力を決定した。次に、細胞をＴＣＲ α／β ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４ ＦＩＴＣ、ＣＤ８ ＰＢ、ＣＤ５６ ＡＰＣ、ＣＤ２８ＰＥ、ＣＤ２７ ＡＰＣ−Ｃ７、及びＣＤ５７−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で表面染色した。Canto IIフローサイトメーター（Becton, Dickinson, and Co.、Franklin Lakes, NJ, USA）を使用して前方光散乱（ＦＳＣ）／側方光散乱（ＳＳＣ）に基づき１０，０００〜１００，０００細胞をゲーティングすることにより、表現型分析を行った。データをCytobankソフトウェアによって分析して、サンバースト図及びＳＰＡＤＥ（Spanning Tree Progression of Density Normalized Event（密度正規化事象のスパニングツリープログレッション））解析を作成した。ゲートは蛍光マイナス１（ＦＭＯ）コントロールに基づき設定した。ａＭＯＬＭ１４に対して拡大培養したＴＩＬは、ＰＢＭＣフィーダーと比較したときＣＤ８＋ ＴＩＬが増加する。理論によって拘束されないが、このＣＤ８＋ ＴＩＬ割合の増強は、ＭＯＬＭ１４に改変された４−１ＢＢＬの存在に起因し得る。ＣＤ２８、ＣＤ５７、及びＣＤ２７分化マーカーの発現に差はない。更なるフローサイトメトリーデータが図２４に示され、これは、生細胞、ＴＣＲα／β＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ ＴＩＬにゲートをかけたメモリーサブセット（ＣＤ４５ＲＡ＋／−、ＣＣＲ７＋／−）を示すフローサイトメトリー等高線プロットを図示し、ＰＢＭＣフィーダーで得られたメモリーサブセットがａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣによって再現されることを示している。
[00407] ＣＤ３＋細胞を使用してａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣ又はＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬのＣＤ４及びＣＤ８ ＳＰＡＤＥツリーを図２５及び図２６に示す。色のグラデーションは、ＬＡＧ３、ＴＩＬ３、ＰＤ１及びＣＤ１３７又はＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＫＬＲＧ１及びＴＩＧＩＴの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に比例する。理論によって拘束されないが、これらの結果は、ａＭＯＬＭ１４に対して拡大培養したＴＩＬの２つのバッチが活性化を受けていたが、ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣとＰＢＭＣフィーダーとの間にＭＦＩの差はなかったことを示しており、ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣが、ＰＢＭＣフィーダーで得られるＴＩＬ表現型結果を有効に再現することが指摘される。
[00408] ａＭＯＬＭ１４又はＰＢＭＣに対して拡大培養したＴＩＬの代謝プロファイルについてもまた分析した。デュアルミトコンドリア−解糖ストレステストを用いて、照射ＰＢＭＣフィーダー又はａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣで拡大培養した後のＴＩＬの酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定した。簡潔に言えば、１０ｍＭグルコース、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補足したアッセイ培地、ｐＨ７．４で細胞を洗浄し（XF Assay Medium、Agilent Technologies、Santa Clara, CA, USA）、次に、接着剤でコーティングした（Cell-Tak（商標）、Corning）XFp細胞培養マイクロプレートに１×１０５生細胞をプレーティングした。プレートをスピンして細胞をプレートに接着させ、次に加湿された非ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で平衡化した後、細胞代謝を分析した。ミトコンドリア及び解糖ストレステスト実験は、Seahorse XFpアナライザー（Agilent Technologies、Santa Clara, CA, USA）を使用して、細胞のミトコンドリア呼吸及び解糖呼吸を同時に分析するため以下の化合物：１μＭオリゴマイシン；０．５μＭ ＦＣＣＰ；５０ｍＭ ２−デオキシグルコース；及び各０．５μＭのロテノン及びアンチマイシンＡを特定の間隔で連続的に注入して実施した。結果はWAVE v2.3.0ソフトウェア（Agilent Technologies、Santa Clara, CA, USA）及びGraphPad Prism v6.07グラフィックソフトウェアを使用して分析したもので、図２７及び図２８に示し、ここで、点は、トリプリケートで測定した平均値±ＳＥＭを表す。ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣ及びＰＢＭＣフィーダーで成長させた両方のＴＩＬが、同様の酸化的リン酸化及び解糖挙動を示す。このデータは、ａＭＯＬＭ１４がＰＢＭＣフィーダーと比較したときＴＩＬの代謝プログラミングを変化させないことを示唆している。
実施例５ − ＥＭ−３人工抗原提示細胞（ａＥＭ３ ａＡＰＣ）の調製
[00409] Creative Bioarray, Inc.（Shirley, NY, USA）からＥＭ−３細胞を入手した。ＥＭ−３ベースの人工ＡＰＣを開発するため、ＥＭ−３細胞株をＣＤ８６、４−１ＢＢＬ、及びＩｇＧ Ｆｃ領域に対する抗体（クローン７Ｃ１２又はクローン８Ｂ３）で改変した。ヒトＣＤ８６及びヒト４−１ＢＢＬ／ＣＤ１３７遺伝子を市販のＰＬＶ４３０Ｇにクローニングし、レンチウイルス形質導入方法を用いてＰＤＯＮＲ２２１ベクター（Invitrogen）とコトランスフェクトした。Katzen, Expert Opin. Drug Disc. 2007, 4, 571-589に記載されるとおりゲートウェイクローニング法を用いてｈＣＤ８６及びｈＣＤ１３７Ｌ遺伝子をＰＬＶ４３０Ｇ及びＰＤＯＮＲ２２１ベクターにクローニングした。２９３Ｔ細胞株をレンチウイルス作製に使用し、ＥＭ−３細胞株に形質導入した。ＡＰＣコンジュゲートＣＤ８６及びＰＥコンジュゲートＣＤ１３７Ｌを使用してトランスフェクト細胞を選別することにより（S3eセルソーター、BioRad、Hercules, CA, USA）、細胞を単離し、エンリッチした。エンリッチ細胞の純度をフローサイトメトリーによって調べた。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ（Viva Biotech Ltd.、Chicago, IL, USA）のＦｃに対する７Ｃ１２及び８Ｂ３と称される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体クローンを作成した。これらのｓｃＦｖクローンのアミノ酸配列は表７に提供する（配列番号２７及び配列番号２８）。作成したｓｃＦｖクローンをＯＫＴ−３に対するＦｃ結合効率に関してスクリーニングし、コレポーターとしてｅＧＦＰを含有するｐＬＶ４３０１Ｇに向けて改変してレンチウイルスを作製した。パッケージング及びレンチウイルス作製には２９３Ｔ細胞株を使用した。レンチウイルス系を使用して改変ＥＭ−３（ＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ）細胞を形質導入し、ｅＧＦＰを用いて選別した。
ＥＭ３７Ｃ１２ＣＤ８６ＣＤ１３７Ｌ及びＥＭ３８Ｂ３ＣＤ８６ＣＤ１３７Ｌは、各形質導入分子の一貫した発現に関してフローサイトメトリーによって定期的に評価した。
[00410] ａＥＭ３ ａＡＰＣの非限定的調製プロトコル（これはまた、ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣでの使用にも適合させることができる）について、以下の段落に記載する。
[00411] 目的のプラスミドの分子クローニングは以下のとおり実施し得る。ＤＯＮＲベクターの作成には、以下のカクテルを使用し得る：Ｂ部位フランキングＰＣＲ産物又はデスティネーションベクター（例えば、Gateway適合レンチベクター）５０〜１００μｇ；ＤＯＮＲベクター（例えば、ｐＤＯＮＲ２２２）５０〜１００μｇ；BR Clonase II（Life Technologies）１μＬ；及びＴＥ緩衝液（（１ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、容積を５μＬにするのに十分な量）。室温で少なくとも１時間インキュベートする。インキュベーション後、熱ショック法又は電気穿孔のいずれかによって細菌形質転換を実施する。デスティネーションベクターの作成には、以下のカクテルを使用し得る：組換えｐＤＯＮＲベクター（例えば、ｐＤＯＮ２２２−ｇｅｎｅＸ）５０〜１００μｇ、デスティネーションベクター（例えば、Gateway適合レンチベクター）５０〜１００μｇ、LR Clonase II（Life Technologies）１μＬ、及びＴＥ緩衝液（（１ｍＭトリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５μＬにするのに十分な量）。室温で少なくとも１時間インキュベートする。インキュベーション後、化学的にコンピテントな形質転換／熱ショック法のいずれかによって細菌形質転換を実施する。
[00412] クローニングしたプラスミドの形質転換及び選択は、以下のとおり実施し得る。化学的にコンピテントな形質転換方法は以下のとおり実施し得る。選択用の抗生物質を含有する栄養寒天プレート（ＬＢ-Lennox又はＹＴ）を調製する。回復培地（Lucigen、Middleton, WI, USAを補足）を室温ですぐに利用できるように確実にする。任意選択で、滅菌培養管を氷上で冷却してもよい（例えば、１７ｍｍ×１００ｍｍ管（１４ｍＬ管））、各形質転換反応につき１本の管）。−８０℃のフリーザーからE. cloni細胞（Lucigen）を取り出し、濡れた氷上で完全に解凍する（５〜１５分）。任意選択で、冷却した培養管に４０μＬのE. cloni細胞を加える。４０μＬの細胞に１〜４μＬのＤＮＡ試料を加える。指で軽く打つ（上下にピペッティングすることにより混合しないこと、これにより気泡が取り込まれて細胞が温まり得る）。細胞／ＤＮＡ混合物を氷上で３０分間インキュベートする。培養管を４２℃の水浴中に４５秒間置くことにより、細胞に熱ショックを与える。１．７ｍＬ管又は培養管を氷に２分間戻す。細胞に３５０μＬの室温の回復培地を加えるか、又は培養管中の細胞に９６０μＬの室温の回復培地を加える。管を振盪インキュベーターに３７℃において２５０ｒｐｍで１時間置く。適切な抗生物質を含有するＬＢ-Lennox又はＹＴ寒天プレートに最大１００％の形質転換混合物をプレーティングする。プレーティング容積はＤＮＡに応じて最適化する必要があり得る。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。形質転換クローンは任意のリッチ培養培地（例えばＬＢ又はＴＢ）において更に成長させることができる。
[00413] Miniprep（Qiagen, Inc.、Valencia, CA, USA）用のコロニーは、以下のとおり成長させてもよい。ＤＮＡ操作のプレーティング回復形質転換反応（例えばＬＲ反応）からコロニーが形成された後、所望の本数の穴開きキャップ付き２ｍＬ Eppendorfマイクロチューブの中に１ｍＬの所望のＴＢ／抗生物質を加える。ART LTS ２０μＬソフトピペットティップ（VWR 89031-352）又は１０μＬ Denvilleティップを使用して所望の数のコロニーをピックする。穴開きキャップ付き２ｍＬ Eppendorfマイクロチューブにティップを置く。管に適合するようにティップを切断し、キャップを閉め、それらの管を振盪機に置く（VWRブランド１５ｍＬ管を伴う紫色の１５ｍＬ管保持具）。２２５ｒｐｍ／３７℃で一晩（１６時間以下）振盪する。一晩インキュベートした後、各ティップを滅菌水が中に入ったDenvilleからのClavePak 96プレート内の１ｍＬ管に置く（プラスミドのスクリーニング及び選択後の細菌ストック産物の作製用にティップを確保しておく）。Qiagen Miniプレップキットプロトコル（Qiagen, Inc.、Valencia, CA, USA）に従いMiniprepを実施する。プラスミドが溶出したところで、制限消化を実施して正しいクローンを選択する。プラスミドの選択後、同じプラスミドクローンから確保しておいたティップを使用することにより、プラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させて細菌ストックを作製する。
[00414] レンチウイルス作製は以下のとおり実施されてもよい。以下の培地組成物を調製する：５００ｍＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma）；２５ｍＬ ＦＢＳ熱失活（ＨＩ）（Hyclone）；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Life Technologies）；１×Primocin（Invivogen）；１×Plasmocin（Invivogen）；及び１×２−メルマクトエタノール（mermactoethanol）（Life Technologies）。９０％コンフルエントの２９３Ｔ細胞が入ったＴ７５フラスコ（Thermo Fisher Scientific）を回収する。培地を吸引する。１０ｍｌ ＰＢＳを加え、穏やかにリンスし、吸引して取り除く。２ｍＬのTrypLE Express（Life Technologies）を加え、それを細胞層全面に均等に分布させて、３７℃（細胞培養インキュベーター）で３〜５分間静置する。１０ｍＬ培地を加え、上下にピペッティングすることにより細胞を分散させる。複数のフラスコがある場合には合わせる。細胞をカウントする。血球計を使用して濃度を決定する場合、細胞／ｍＬ＝（カウントされた細胞数×希釈係数×１０４）。再び分割してＴ７５フラスコに戻すため、細胞が完全にコンフルエントになるまでに必要な時間を決定し、それに従い希釈する。（細胞は１６〜１８時間毎に倍加するため、３日＝１／２７希釈）。概して、コンフルエンスが２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、１日２．５の増殖係数が用いられてもよい。容積が２５ｍＬの培地となるようにする。ストックのタイトレーション用にプレーティングするには、アッセイの各ウェルは０．４ｍＬの培地中５×１０４細胞が必要である。２９３Ｔ細胞を培地中２×１０４／ｍＬに調整する。２４ウェルプレートにおいてウェル当たり１ｍＬをプレーティングする。例えば、月曜日にプレーティングした細胞は火曜日に感染させて、金曜日にフローサイトメーターにかけてもよく、木曜日にプレーティングした細胞は金曜日に感染させて、月曜日にフローサイトメーターにかける。パッケージングトランスフェクション用にプレーティングするため、Ｔ７５フラスコに、トランスフェクションの前日には６．８×１０６細胞又はトランスフェクションのモニタリング時には１．７×１０６細胞をプレーティングする。（トランスフェクション当日に播種すると、トランスフェクション効率の変動が減少し得る）。培地でフラスコ内の容積を２５ｍＬにする。例えば、月曜日にセットアップしたフラスコは火曜日にトランスフェクトし、木曜日及び金曜日にウイルスを収集する。ある場合には（例えば、高いタイトレーションコンストラクト）、２回目の収集は省略されてもよい。レンチウイルスベクターをパッケージングするには、各Ｔ７５フラスコトランスフェクションにつき２μｇ Ｂａｃｕｌｏ ｐ３５プラスミド（任意選択；死滅遺伝子をパッケージングする場合に限り必要である）、２μｇ ＶＳＶ．Ｇ ｅｎｖプラスミド（例えば、ｐＭＤ２．Ｇ又はＰＣＩＧＯ ＶＳＶ−Ｇ）；４．７μｇ Ｇａｇ／ポリメラーゼプラスミド（例えば、ｐｓＰＡＸ２又はｐＣＭＶ−ΔＲ８．９１）、及び２．３μｇの上記に記載されるレンチウイルスベクターが必要である。全ての試料について必要なＶＳＶ及びＲ８．２／９．１（＋／−Ｂａｃｕｌｏ）プラスミドの量を決定する（多数の試料を調製する場合、これらのＤＮＡの混合物を作る）。各Ｔ７５トランスフェクションにつき２ｍＬのOpti-MEM培地（Thermo Fisher Scientific）中９０μＬのLipofectAmine 2000（Thermo Fisher Scientific）が必要である。全ての試料について、十分なOpti-Mem及びLipofectAmine 2000を含有する混合物を作る。穏やかに混合し、室温で５分間静置し、管Ａのラベルを付す。各トランスフェクションについて、マイクロチューブに対して５００μＬ室温Opti-MEM培地にパッケージングＤＮＡ及び特異的レンチウイルスベクターＤＮＡを加え、管Ｂのラベルを付す。管Ａ内の２ｍＬのLipofectAmine 2000混合物に管Ｂからの５００μＬのＤＮＡを加え、穏やかに混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートする。パッケージングフラスコから培地を吸引する。５ｍＬのOpti-MEM培地に２．５ｍＬのＤＮＡ／Lipofectamine複合体を加え、細胞に加える（２９３Ｔ細胞は半接着しているに過ぎないため、細胞上で直接ピペッティングしないこと）。乾燥を防ぐため、プレートは少数の一群で処理する。一晩インキュベートし、翌日朝に培地を交換する。培地交換後２４時間で上清を収集する。上清はトランスフェクション後４８時間で単一の収集物で回収してもよく、又はトランスフェクション後４８及び７２時間で２つの収集物として回収してもよい（その場合、回収物はプールする）。二重の収集が望ましい場合、上清は初日にピペッティングにより収集し、２０ｍＬの新鮮培地を補充する。フラスコの乾燥を防ぐため、一度に５つのフラスコのみで作業する。収集した上清は、翌日にプールするまで４℃に保つ。翌日、上清を再び冷却し、適宜プールする。上清を２０００ｒｐｍで５分間スピンして任意の夾雑２９３Ｔ細胞を沈降させる。回収した上清は、プレフィルターディスクを含む０．４５μｍ又は０．８μｍフィルタユニットでろ過する。ろ過速度が比較的速くなるように、十分に大きいろ過ユニットを使用する。濃縮の準備が整うまで４℃で保管する。
[00415] ウイルスは、−８０℃での長期貯蔵のためPEG-it法（System Biosciences, Inc.、Palo Alto, CA 94303）を用いて濃縮し得る。トランスフェクションプレートから上清を収集する。上清中の細胞デブリをスピンダウンする。上清はまた、いかなるパッケージング細胞も完全に除去するため、ろ過してもよい。上清の容積の４分の１に等しい量のPEG-it溶液を上清に加える。懸濁液を４℃で一晩インキュベートする。４℃において３５００ｒｐｍ（１５００ｇ）で３０分間遠心する。上清を取り出し、４℃において３５００ｒｐｍで５分間遠心する。残りの上清を除去する。ウイルスを所望量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、アリコートを−８０℃で凍結する。
[00416] レンチウイルスを使用した細胞株の形質導入は、以下のとおり実施されてもよい。形質導入しようとする細胞を、２４ウェルプレートのウェル当たり１×１０６個の浮遊細胞（１回の形質導入につき１ウェル）又は２４ウェルプレート内の接着細胞について５０％コンフルエンス（１回の形質導入につき１ウェル）のいずれかとなるように調整する。浮遊細胞については、細胞の濃度を１×１０７／ｍＬに調整し、２４ウェルプレートのウェル当たり１００μＬをプレーティングする（１回の形質導入につき１ウェル）。接着細胞については、形質導入日に細胞／ｃｍ２に基づき５０％コンフルエンスが実現するようにプレーティングする（例えば、２９３Ｔ細胞について、コンフルエンス＝２×１０５／ｃｍ２）。ウェル当たりの総形質導入容積は、３〜１０μｇ／ｍＬポリブレン（臭化ヘキサジメトリン、Sigma-Aldrich Co.、St. Louis, MO, USA）を含む約５００μＬでなければならない。濃縮ウイルスの添加量は、所望のＭＯＩ（感染多重度）に依存することになる。典型的なＭＯＩは１０：１であるが、これは細胞型に応じて変わり得る。トランスフェクションウェルは、１×１０６個の浮遊細胞又は５０％コンフルエントの細胞のいずれかを含有する１００μＬの標準培地を含まなければならない。１０：１のＭＯＩについては（例えば、ウイルス活性が１×１０８ＩＵ／ｍＬであり、目標が１×１０６細胞を感染させることであり、このとき１×１０７個のビリオン又は１００μＬのウイルスが必要になる）。５００μＬとなるように標準培地を加える。３μｇ／ｍＬ（初代細胞）〜１０μｇ／ｍＬ（腫瘍細胞株）となるようにポリブレンを加える。１つ又は複数のプレートを３０℃において１８００ｒｐｍで１．５〜２時間スピンする。組織培養インキュベーターを使用して１つ又は複数のプレートを３７℃／５％ＣＯ２で５時間〜一晩インキュベートする。培地を交換する。７２時間の形質導入後、十分な細胞が利用可能な場合、フローサイトメトリー分析を実施して形質導入効率を試験する。
[00417] ａＡＰＣの選別は以下のとおり実施されてもよい。上記に記載される培地において、細胞数が最低でも１０００〜２０００万個に達するまで細胞を培養する。各条件につき１×１０６細胞を取り、形質導入するタンパク質に対する抗体で染色する。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析して形質導入の安定性を試験する。目的のタンパク質の発現を分析して確認した後、残りの細胞を選別用に調製する。S3ソーターにおいて目的のマーカーにゲートをかけることにより細胞を選別する。上述の培地を使用して、選別された細胞を培養する。バイアルを凍結する前に、目的のタンパク質発現の安定性を試験する。Recovery細胞培養フリージング培地（Invitrogen）を使用して同じ細胞のセルバンクを作製する。細胞は、形質導入及び選別手順を終える毎にバンク化し得る。
[00418] ７Ｃ１２及び８Ｂ３ ｓｃＦｖクローンのヌクレオチド配列情報（配列番号２９及び配列番号３０）及びそのレンチウイルスベクターを表８に提供する。ｐＬＶ４３０１Ｇ ７Ｃ１２ ｓｃＦｖ ｍＩｇＧ ｈＣＤ８ ｆｌａｇベクターの作成に使用した配列は配列番号３１〜配列番号３４として提供され、図２９〜図３２に図示される。ｐＬＶ４３０１Ｇ ８Ｂ３ ｓｃＦｖ ｍＩｇＧ ｈＣＤ８ ｆｌａｇベクターの作成に使用した配列は配列番号３５〜配列番号３８として提供され、図３３〜図３６に図示される。
[00419] 本明細書に記載される実験に使用した改変ＥＭ−３ ａＡＰＣ（本明細書ではａＥＭ３ ａＡＰＣとも称される）の調製においては、ＣＤ８６及び４−１ＢＢＬの発現はフローサイトメトリー（Canto IIフローサイトメーター、Becton, Dickinson, and Co.、Franklin Lakes, NJ, USA）を用いて確認した。結果は図３７に示す。ａＥＭ３ ａＡＰＣを１００Ｇｙでγ線照射し、凍結した。
[00420] 上記に記載したとおり、ＣＤ８６、ＩｇＧ Ｆｃ領域に対する抗体、及び４−１ＢＢＬ（又は任意選択で４−１ＢＢＬなし）を発現するように予め形質導入したａＥＭ−３細胞を、同様のレンチウイルス形質導入手法を用いて共刺激ヒトＯＸ−４０Ｌで遺伝子操作した。ヒトＯＸ−４０Ｌを含有するレンチウイルスを作成するため、ｐＬｅｎｔｉ−Ｃ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ ＯＸ４０Ｌ（ＰＳ１０００６４、Origene、配列番号３９、図９０）ベクターをＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミド（ｐＣＩＧＯ−ＶＳＶ．Ｇ）と共に、PolyJet（Signagen Laboratories、Rockville, MD, USA）を使用してPhoenix-GP（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−３２１５）細胞株にコトランスフェクトした。６０時間後に上清を回収し、Ultracel-100メンブレンを備えたAmicon Ultra-15遠心フィルタユニットを使用して濃縮した。次にａＥＭ−３細胞を濃縮レンチウイルスに感染させて、更に５日間拡大培養した。細胞をＰＥコンジュゲート抗ヒトＯＸ４０Ｌ、ブリリアントバイオレット４２１コンジュゲート抗ヒトＣＤ１３７Ｌ（先行するａＥＭ−３細胞に４−１ＢＢＬが含まれる場合）、及びＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ８６で染色し、S3eセルソーター（Bio-Rad, Inc.、Hercules, CA, USA）を使用してＧＦＰ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ（含まれる場合）、ＣＤ８６の発現に基づき選別した。選別した細胞の純度をフローサイトメトリーを用いて更に検証した。エンリッチ細胞の純度をフローサイトメトリーによって調べた。
実施例６ − ＥＭ−３人工抗原提示細胞を使用した腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養
[00421] ＥＭ−３ ａＡＰＣ（ａＥＭ３）がＴＩＬを拡大させる能力を試験する実験を実施した。ＴＩＬをａＥＭ３（７Ｃ１２又は８Ｂ３）と１：１００比の比で、ＯＫＴ−３（３０ｍｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を加えて共培養した。１１及び１４日目に細胞をカウントした。結果はＴＩＬの２つのバッチについて図３８及び図３９にプロットする。加えて、ＴＩＬをａＥＭ３又はＰＢＭＣフィーダーと１：１００比で、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して、ＯＫＴ−３（３０ｍｇ／ｍＬ）を添加して又は添加せずに共培養した。結果は図４０にプロットし、ここで、棒グラフは、１１日目に決定された細胞数を示す。
[00422] 図４１は、異なるＴＩＬ：ａＡＰＣ比でのＥＭ−３ ａＡＰＣ（ａＥＭ３）によるＴＩＬ拡大培養の結果を示す。これらの結果は、ａＥＭ３ ａＡＰＣが、特に１：２００の比で培養時間が長いとき（１４日）、ＰＢＭＣと同等の、場合によってはより良好な性能であることを示している。
[00423] 図４２は、ＥＭ−３ ａＡＰＣ（ａＥＭ３）によるＴＩＬ拡大培養からの細胞数の変動性がＰＢＭＣフィーダーと比較して低いことを示している。G-Rex 24ウェルプレートにおいてＴＩＬ（２×１０４）を５つの異なるＰＢＭＣフィーダーロット又はａＥＭ３（トリプリケート）と１：１００比で、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して共培養した。グラフは、１４日目にカウントした生細胞数（平均値）を９５％信頼区間と共に示す。図４３は、ＥＭ−３ ａＡＰＣ及びＭＯＬＭ−１４ ａＡＰＣによるＴＩＬ拡大培養結果を比較することにより、G-Rex 24ウェルプレートにおいて５つの異なるＰＢＭＣフィーダーロット又はａＭＯＬＭ１４（トリプリケート）又はａＥＭ３（同様にトリプリケート）と１：１００比で、ＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を添加して共培養したＴＩＬ（２×１０４）と比較したａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４の両方についての細胞数の変動性を示す。１４日目に生細胞をカウントした。グラフは生細胞数（平均値）を９５％信頼区間と共に示す。ａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４の結果は、先行技術において好ましいＰＢＭＣフィーダー手法と比較して、両方のａＡＰＣでより高い一貫性を達成し得ることを示している。
[00424] ａＥＭ３又はＰＢＭＣフィーダーに対して拡大培養したＴＩＬを使用して、４つの異なるパネル（分化パネル１及び２、Ｔ細胞活性化パネル１及び２）を使用したフローサイトメトリー分析を行った。簡潔に言えば、初めにＴＩＬをL/D Aquaで染色して生存能力を決定した。次に、分化パネル１についてＴＣＲα／β ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４ ＦＩＴＣ、ＣＤ８ ＰＢ、ＣＤ５６ ＡＰＣ、ＣＤ２８ ＰＥ、ＣＤ２７ ＡＰＣ−Ｃｙ７、及びＣＤ５７−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；分化パネル２についてＣＤ４５ＲＡ ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８ａ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５、ＣＣＲ７ ＰＥ、ＣＤ４ ＦＩＴＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ３８ ＡＰＣ、及びＨＬＡ−ＤＲ ＰＢ；Ｔ細胞活性化パネル１についてＣＤ１３７ ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８ａ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、Ｌａｇ３ ＰＥ、ＣＤ４ ＦＩＴＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＰＤ１ ＡＰＣ、及びＴｉｍ−３ ＢＶ４２１；又はＴ細胞活性化パネル２についてＣＤ６９ ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８ａ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＴＩＧＩＴ ＰＥ、ＣＤ４ ＦＩＴＣ、ＣＤ３ ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＫＬＲＧ１ ＡＬＥＸＡ ６４７、及びＣＤ１５４ ＢＶ４２１で細胞を表面染色した。Canto IIフローサイトメーターを使用してＦＳＣ／ＳＳＣに基づき１０，０００〜１００，０００細胞をゲーティングすることにより表現型分析を行った。Cytobankソフトウェア（Cytobank, Inc.、Santa Clara. CA. USA）を使用してデータを分析し、サンバースト図及びＳＰＡＤＥ（Scanning-tree Progression Analvsis of Density-normalized Events（密度正規化事象のスパニングツリープログレッション））プロットを作成した。ゲートは蛍光マイナス１（ＦＭＯ）コントロールに基づき設定した。ＳＰＡＤＥプロットは、表面マーカーの発現レベルに基づき関連ノードの形態で特徴付けられる細胞群で作成した。ＣＤ３＋ゲーティングに基づきＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ＴＩＬサブセットを決定し、ツリーを作成した。サンバースト図による視覚化は図４４及び図４５に示される。図４４は、ａＥＭ３ ａＡＰＣに対して拡大培養したＴＩＬが、ＰＢＭＣフィーダーに対して拡大培養した同じＴＩＬと比較したとき、ＣＤ８＋表現型を維持していたことを示す。図４５は、ａＥＭ３ ａＡＰＣに対して拡大培養した異なる患者からの第２のＴＩＬバッチの結果を示し、ここで、はＰＢＭＣフィーダーを使用した拡大培養の結果（２５％）と比較してＣＤ８＋細胞の明らかな増加（６５．６％）が見られる。
[00425] ＣＤ３＋細胞を使用してａＥＭ３ ａＡＰＣ又はＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したＴＩＬのＣＤ４及びＣＤ８ ＳＰＡＤＥツリーを図４６及び図４７に示す。色のグラデーションは、ＬＡＧ３、ＴＩＬ３、ＰＤ１及びＣＤ１３７又はＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＫＬＲＧ１及びＴＩＧＩＴの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に比例する。理論によって拘束されないが、これらの結果は、ａＥＭ３ ａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬが活性化を起こしていたことを示しており、しかしａＥＭ３ ａＡＰＣとＰＢＭＣフィーダーとの間でＭＦＩに差はなかったことから、ａＥＭ３ ａＡＰＣがＰＢＭＣフィーダーで達成される表現型結果を有効に再現することが指摘される。
[00426] ＰＢＭＣフィーダーと比較したａＥＭ３ ａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬについて、予備呼吸容量（ＳＲＣ）及び解糖予備能もまた評価した。結果は図４８及び図４９に示す。Seahorse XF細胞ミトストレステストは、ミトコンドリアにおける電子伝達鎖の成分を標的にする呼吸調節因子を用いて細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を直接測定することによりミトコンドリア機能を測定する。試験化合物（オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、及びロテノンとアンチマイシンＡとの混合物、以下に記載する）を連続的に注入して、それぞれ、ＡＴＰ産生、最大呼吸、及び非ミトコンドリア呼吸を測定する。次にこれらのパラメータ及び基礎呼吸を使用してプロトンリーク及び予備呼吸容量を計算する。各調節因子が電子伝達鎖の特異的成分を標的にする。オリゴマイシンはＡＴＰシンターゼ（複合体Ｖ）を阻害し、オリゴマイシン注射後のＯＣＲの低下は、細胞性ＡＴＰ産生に関連するミトコンドリア呼吸と相関する。カルボニルシアニド−４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）は、プロトン勾配を破綻させてミトコンドリア膜電位を破壊する脱共役剤である。結果として、電子伝達鎖を通じた電子流が抑制されず、複合体ＩＶによって酸素が最大限に消費される。ひいてはＦＣＣＰの刺激を受けたＯＣＲを使用して、最大呼吸と基礎呼吸との差として定義される予備呼吸容量を計算することができる。予備呼吸容量（ＳＲＣ）は、細胞がエネルギー要求の増加に応答する能力の尺度である。第３の注射は、複合体Ｉ阻害薬であるロテノンと、複合体ＩＩＩ阻害薬であるアンチマイシンＡとの混合物である。この組み合わせはミトコンドリア呼吸を遮断し、ミトコンドリア外部の過程によってドライブされる非ミトコンドリア呼吸の計算を可能にする。
[00427] 図５０は、ＰＢＭＣフィーダー又はａＥＭ３ ａＡＰＣに対して拡大培養した生細胞ＴＩＬのミトコンドリア染色を示す。MitoTracker色素が生細胞のミトコンドリアを染色し、その蓄積は膜電位に依存する。ＰＢＭＣフィーダー又はａＥＭ３に対して拡大培養したＴＩＬをL/D Aquaと、続いてMitoTracker赤色色素で染色した。データは、生細胞集団にゲートをかけたMitoTracker陽性（ＭＦＩ）細胞を示す。
実施例７ − 改変ＭＯＬＭ−１４（ａＭＯＬＭ１４）及びＥＭ−３（ａＥＭ３） ａＡＰＣの比較
[00428] 前出の例に記載されるとおり、ＰＢＭＣフィーダー並びにａＭＯＬＭ１４及びａＥＭ３ ａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬについて、細胞傷害効力に関してＢＲＬＡを用いて機能活性を評価した。Ｐ８１５ ＢＲＬＡについては実施例９に詳細に記載される。結果は図５１及び図５２に示し、ａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬがＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したものと同様の機能特性（及び予想された臨床的有効性）を有することが示される。
[00429] 上記に記載したとおりＰＢＭＣフィーダー並びにａＭＯＬＭ１４及びａＥＭ３ ａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬからのＩＦＮ−γ遊離及びグランザイムＢ遊離もまた、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢでコートしたマイクロビーズで一晩刺激した後に評価した。ＩＦＮ−γ遊離結果は図５３及び図５４に示し、グランザイムＢ遊離結果は図５５及び図５６に示す。ａＥＭ３ ａＡＰＣで拡大培養したＴＩＬについて、ＰＢＭＣフィーダーで拡大培養したものと比べてＩＦＮ−γ遊離及びグランザイムＢ遊離の有意且つ意外な増加が観察されたが、ａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣによって拡大培養したＴＩＬについては観察されなかった。理論によって拘束されないが、これは、ａＥＭ３ ａＡＰＣと培養したＴＩＬがインビボで癌療法としての活性がより高いものであり得ることを示唆している。観察された他の差の多くは統計的に有意でなかった。
[00430] ａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣによるＴＩＬ拡大培養の結果は表９に要約される。
実施例８ − ａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣマスターセルバンクの調製
[00431] ａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣを以下の培地組成物で成長させてマスターセルバンクを作製してもよく、これはａＡＰＣ供給のためこの培地で更に成長させてもよい：５００ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA）、５０ｍＬウシ胎仔血清（ＦＢＳ）熱失活（ＨＩ）（Hyclone）；１０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ緩衝液）（Life Technologies）；１×Primocin（Invivogen）；１×Plasmocin（Invivogen）、及び１×２−メルカプトエタノール（Life Technologies）。
[00432] 本明細書に記載されるａＡＰＣはまた、ａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣを含め、細胞の成長のための当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いてマスターセルバンクから成長させてもよい。ある実施形態では、ａＡＰＣを解凍し、次に８０〜９０％ＲＰＭＩ １６４０＋１０〜２０％熱失活ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）の培地において、２〜３日毎に飽和培養物を１：２〜１：３分割し、２４ウェルプレートに約０．５〜１×１０６細胞／ｍＬで播種し、３７℃及び５％ＣＯ２でのインキュベーションで約０．５〜１．５×１０６細胞／ｍＬに維持することにより拡大培養する。
[00433] ヒト治療薬の作製における本発明の特定の実施形態のａＡＰＣの使用に利用し得る更なるステップは当該技術分野において公知であり、細胞株の特徴付け（ＨＬＡ高分解能タイピング）；サイトカイン遊離試験；ａＡＰＣを成長させるのにＦＢＳに代えるヒト血清の試験；ａＡＰＣを凍結するための凍結培地の試験；マスターセルバンク化（原材料試験及び安定性試験を含む）；照射の標準化（照射線量（１０００、３０００、５０００、１００００、１５０００ｒａｄ）、新鮮ａＡＰＣと凍結ａＡＰＣの比較、及びＴＩＬ有り／無しを含む）；ａＡＰＣの安定性；ａＡＰＣの汚染を判定するためのパネルの開発；分子生物学的アッセイの開発（ｑＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング）；黒色腫、子宮頸癌、及び頭頸部癌を含めた異なる腫瘍型からのＴＩＬ拡大培養の試験（G-Rex 5Mを使用）；効力、純度、及び同一性試験；マイコプラズマ及び無菌性アッセイ；微生物学的試験（ＵＳＰ／ＥＰ無菌性、バイオバーデン及びエンドトキシンアッセイ）；及び外来ウイルス因子試験が含まれる。
実施例９ − ＴＩＬの拡大培養方法及び拡大培養したＴＩＬによる癌の治療方法
[00434] ＴＩＬは、本明細書に記載される任意の拡大培養方法を用いて、ａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣなどの本発明の特定の実施形態のａＡＰＣを使用して拡大培養し得る。例えば、ＴＩＬの拡大培養方法を図５７に図示する。ａＡＰＣを使用したＴＩＬの拡大培養は、更に、本明細書に記載される患者の癌を治療する任意の方法と組み合わせてもよい。ＴＩＬを拡大培養し、及び拡大培養したＴＩＬで患者を治療する方法を図５８に示し、ここで、拡大培養はａＡＰＣ（ａＥＭ３及びａＭＯＬＭ１４ ａＡＰＣを含む）を利用する。
実施例１０ − Ｐ８１５生物発光リダイレクト溶解アッセイ
[00435] この例では、生物発光リダイレクト溶解アッセイ（Bioluminescent Redirected Lysis Assay：ＢＲＬＡ）においてＴＩＬの溶解能を判定するための代理標的細胞株の開発について記載する。ＢＲＬＡは、自己腫瘍細胞の非存在下におけるＴ細胞媒介性死滅の評価を可能にする。細胞溶解活性は１〜４時間でＴ細胞受容体の関与有り及び無しで評価することができ、Ｔ細胞受容体が関与するＴ細胞死滅及び関与のない、いわゆるリンホカイン活性化キラー活性（ＬＡＫ）が評価される。
[00436] 内因性ＣＤ１６ Ｆｃ受容体を発現するマウス肥満細胞腫Ｐ８１５細胞は抗ＣＤ３ε（ＯＫＴ−３）に結合することができ、標的細胞株として効力のあるＴＣＲ活性化シグナルをもたらす。Ｐ８１５クローンＧ６をｅＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼをベースとするレンチウイルスベクターで形質導入し、選別し、BD FACSAria IIを用いてクローニングした。Intellicyt iQue Screenerを使用して分析したｅＧＦＰ強度に基づきクローンＧ６を選択した。標的細胞と目的のＴＩＬとを＋／−ＯＫＴ−３で共培養して、それぞれ、ＴＣＲ活性化（特異的殺傷）又は非特異的（リンホカイン活性化キラー性、ＬＡＫ）を評価した。４時間のインキュベーション後、ウェルにホタルルシフェリン（（４Ｓ）−２−（６−ヒドロキシ−１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、複数の供給元から市販されている）を加え、５分間インキュベートした。ルミノメーターを使用して生物発光強度を読み取った。パーセント細胞傷害率及び生存率は以下の式を用いて計算した：％生存率＝（実験的生存率−最小値）／（最大シグナル−最小シグナル）×１００；％細胞傷害率＝１００−（％生存率）。共培養したＴＩＬの培地上清中におけるインターフェロンγ遊離をＥＬＩＳＡによって分析し、ＴＩＬ上でのＬＡＭＰ１（ＣＤ１０７ａ、クローンｅＢｉｏＨ４Ａ３）発現をフローサイトメーターで分析してＴＩＬの細胞傷害効力を判定した。
[00437] 結果は図５９〜図７５に示す。図５９は、個々のエフェクター：標的比でＰ８１５クローンＧ６と（抗ＣＤ３を添加して及び無しで）共培養したＴＩＬバッチＭ１０３３Ｔ−１のＢＲＬＡによるパーセント毒性を示す。図６０は、異なるエフェクター対標的細胞比に対するＩＦＮ−γ遊離量を示す酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）データを示す。図６１は、Ｐ８１５クローンＧ６と抗ＣＤ３の存在下において１：１のエフェクター対標的細胞比で共培養したときのＴＩＬバッチＭ１０３３Ｔ−１が発現するＬＡＭＰ１（％）を４時間及び２４時間共培養について示す。
[00438] これらの結果は、図６２（ＴＩＬバッチＭ１０３０のＢＲＬＡを示す）に記載の第２のＴＩＬバッチを使用して確認された。ＢＲＬＡによる細胞傷害性（ＬＵ５０／１×１０６ ＴＩＬとして測定した）は２６±１６である。図６３はＴＩＬバッチＭ１０３０の標準クロム遊離アッセイの結果を示す。クロム遊離アッセイによる細胞傷害性（ＬＵ５０／Ｉ×１０６ ＴＩＬとして測定した）は２２である。
[00439] 第３のＴＩＬバッチを使用して結果を更に確認した。図６４は、ＴＩＬバッチＭ１０５３についてのＢＲＬＡ結果を示し、ＢＲＬＡによるＴＩＬの溶解単位は７０±１７と示される。図６５は、ＴＩＬバッチＭ１０５３の標準クロム遊離アッセイの結果を示し、クロムアッセイによるＴＩＬの溶解単位は１４±５と示される。２つのアッセイ結果の比較から、ＢＲＬＡ結果がクロム遊離アッセイ結果と同等の性能であることが示される。
[00440] 図６６は、ＩＦＮ−γ遊離とＴＩＬの細胞傷害能との間の直線関係を示す。図６７は、ＩＦＮ−γについてのELISpot結果を示す。図６８は、ＴＩＬバッチＭ１０５３についての酵素ＩＦＮ−γ遊離を示す。図６９は、ＴＩＬバッチＭ１０３０についての酵素ＩＦＮ−γ遊離を示す。図７０は、Ｍ１０５３Ｔ及びＭ１０３０ＴによるグランザイムＢ遊離を明らかにするELISpotデータを示す。図７１は、ＴＩＬバッチＭｌ０５３についての酵素グランザイムＢ遊離を示す。図７２は、ＴＩＬバッチＭ１０３０についての酵素グランザイムＢ遊離を示す。図７３は、Ｍ１０５３Ｔ及びＭ１０３０ＴによるＴＮＦ−α遊離を示すELISpotデータを示す。図７４は、ＴＩＬバッチＭ１０５３についての酵素ＴＮＦ−α遊離を示す。図７５は、ＴＩＬバッチＭ１０３０についての酵素ＴＮＦ−α遊離を示す。図６６〜図７６のデータから、ＢＲＬＡによってもまた示すとおりのこれらのＴＩＬバッチの効力が確認される。
[00441] 結論として、ＢＲＬＡは放射性核種が不要であり、従来の細胞傷害性アッセイと同程度に高効率且つ高感受性である。個々の時点におけるＴＩＬ上のＬａｍｐ１発現のフローサイトメトリーによる評価は、ＢＲＬＡによって示される効力と比べて細胞傷害性Ｔ細胞の脱顆粒を実証する。ＢＲＬＡは標準クロム遊離アッセイと同程度乃至それより良好な効力を実証する。ＢＲＬＡはまた、ＴＩＬ溶解活性の効力の判定も可能にする。ＢＲＬＡをクロム遊離アッセイと比較すると、ＢＲＬＡの効率性及び信頼性が明らかになる。ＢＲＬＡはＴＩＬによるＩＦＮγ遊離と直線関係を有する。ELISpotによるＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及びグランザイムＢの遊離アッセイは、ＢＲＬＡによって判定したＴＩＬの細胞傷害効率と整合している。
実施例１１ − Ｍ３細胞をＦＢＳからｈＡＢ血清へとウィーニングする方法
[00442] 反応性を回避するため、一部の細胞株をある培地から別の培地へとウィーニングする必要があり得る。ここで、は、反応性を回避するためＥＭ３細胞がＦＢＳからｈＡＢ血清へとウィーニングされる。図７６に示すとおり、ａＥＭ３細胞をＦＢＳからｈＡＢ血清へとウィーニングすることに成功した。
実施例１２ − 凍結培地配合の最適化
[00443] 本明細書に記載されるとおり培養したＥＭ３細胞をクライオバンク化するため、方法は凍結培地配合であり、最適化した。図７７に示すとおり、３つの凍結培地を使用して、それが細胞数に及ぼす効果をカウントした。利用した細胞培地には、CryStor 10（Biolife Solutions（ＣＳ１０））（Ａ）、ｈＡＢ［９０％］及びＤＭＳＯ［１０％］（Ｂ）、並びにＤＭＳＯ［１０％］及びｃＤＭＥＭ２［７０％］含有ｈＡＢ［２０％］（Ｃ）が含まれた。図７７は、ヒトＡＢ血清（９０％）及びＤＭＳＯ（１０％）の配合が予想外にも３日間の回復後にＭ３細胞数の増加をもたらしたことを実証している。
実施例１３ − GREXフラスコ内でのａＥＭ３細胞の成長
[00444] ａＥＭ３細胞をガス透過性細胞培養フラスコ（即ち、GREXフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing））において培養し、８日間の時間経過にわたって細胞倍加時間への効果を観察した。図７８に示すとおり、GREXフラスコはａＥＭ３細胞の急速な成長をもたらした。
実施例１４ − フローパネル分析によるａＥＭ３細胞純度の決定
[00445] 本明細書に記載される方法により培養した細胞の純度を決定するため、フローパネル分析を用いてａＥＭ３ ａＡＰＣの純度を決定した。かかる分析の結果を図７９及び図８０に示す。図８０に示すとおり、選別前、ａＥＭ３細胞集団はａＥＭ３ ７Ｃ１２及びａＥＭ３ ８Ｂ５細胞についてそれぞれ５３．５％及び４３．２％ｅＧＦＰ＋であった。選別後、細胞集団はａＥＭ３ ７Ｃ１２及びａＥＭ３ ８Ｂ５細胞についてそれぞれ９６．８％及び９６．３％ｅＧＦＰ＋に改善された（図８０）。
実施例１５ − ＰＢＭＣフィーダーの代替としてのａＥＭ３フィーダー細胞
[00446] 本明細書に記載されるとおり、ａＥＭ３細胞はＰＢＭＣフィーダーの代替として使用されてもよく、ＴＩＬ拡大培養過程及び得られるＴＩＬの両方について予想外に異なる特徴をもたらし得る。サイトカイン発現の差を比較するため、ＯＫＴ−３による処理によってＰＢＭＣ及びａＥＭ３細胞を刺激した。図８１に示すとおり、ａＥＭ３細胞はＰＢＭＣと比較すると比較的異なるサイトカイン発現プロファイルを呈した。意外にも、本発明のａＥＭ３細胞は、従来のＰＢＭＣで拡大培養したＴＩＬの同じサイトカイン分泌特性を再現することなく有効なＴＩＬ（本明細書に示すとおり）を提供する。
実施例１６ − 完全培地と無血清培地とのＴＩＬ拡大培養比較
[00447] ＴＩＬ拡大培養プロトコルを最適化するため、幾つかのＴＩＬ拡大培養実験（expirement）を本明細書に記載されるとおり、但し完全培地（ＣＭ１）でなく、むしろ無血清培地で実施した。
[00448] 一つの実験では、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加したＣＭ１又は様々な無血清培地が入った単一のウェルにおいて組織断片を培養した。次に１１日目のＲＥＰの開始前に細胞をカウントした。使用した様々な無血清培地には、Prime CDM（Irvine）、CTS Optimizer（ThermoFisher）、及びXvivo-20（Lonza）が含まれた。図８２に示すとおり、CTSによるＴＩＬ拡大培養（プレＲＥＰ）が、ＣＭ１と比較したとき細胞数の増加をもたらした。
[00449] 加えて、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加したＣＭ１又は様々な無血清培地で組織断片を１１日目まで培養した。次に１１日目にＰＢＭＣフィーダー、ＯＫＴ−３、及びＩＬ−２を使用してＲＥＰを開始し、１６日目に培養を分割した。次に２２日目の終わりに培養を終了した。使用した様々な無血清培地には、Prime CDM（Irvine）、CTS Optimizer（ThermoFisher）、及びXvivo-20（Lonza）が含まれた。図８３及び図８４に示すとおり、それぞれ１１日目及び２２日目に細胞をカウントすると、Prime CDMによるＴＩＬ拡大培養（プレＲＥＰ）が、ＣＭ１と比較したとき細胞数の増加をもたらした。
実施例１７ − 血清ベースの培地と比較したときの無血清培地におけるａＡＰＣの成長
[00450] 血清の非存在下でのａＡＰＣ成長及び維持プロトコルを最適化するため、様々な無血清培地を使用してａＥＭ３細胞を培養した。
[00451] ある群の細胞には血清ベースの培地（ｃＤＭＥＭ（１０％hSerum）を提供し、他の群の細胞には無血清培地を提供したことを除けば、本明細書に記載されるとおりの一般的な細胞培養プロトコルを用いて、ａＥＭ３細胞を２４ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０６細胞で３日間培養した。本試験に利用した無血清培地には、CTS OpTmizer（ThermoFisher）、Xvivo 20（Lonza）、Prime-TCDM（Irvine）、及びXFSM（MesenCult）培地が含まれた。次に３日目に細胞をカウントした。
[00452] 図８５に示すとおり、CTS OpTmizer及びPrime-TCDM無血清培地は、血清ベースの培地（即ちｃＤＭＥＭ（１０％hSerum）と同等の細胞成長をもたらした。従って、無血清培地は、血清ベースの培地と比較したとき、ａＡＰＣの成長及び維持に有効な代替的選択肢である。
実施例１８ − ａＡＰＣの増殖、維持、及び凍結保存
[00453] この例では、ａＡＰＣの調製及び保存手順を提供する。具体的には、ＴＩＬ−Ｒｓ３と称される細胞株からのａＥＭ３細胞を増殖させて凍結保存した。
[00454] ａＥＭ３細胞の解凍及び回復は、以下の非限定的な手順を用いて達成し得る。CTS OpTmizer基本培地（Thermo Fisher）、CTS OpTmizer細胞添加剤（Thermo Fisher）、ゲンタマイシン（Lonza）、及びGlutamax（Life Technologies）から調製される予め温めた培地中で（３７℃）、凍結保存された（cyropreserved）ａＥＭ３細胞を徐々に温める。次に浮遊細胞を４℃において１５００ｒｐｍで５分間遠心する。得られた上清を破棄し、残りのａＥＭ３細胞を前述の培地に再懸濁し、プレーティングする（６ウェルプレートのウェル当たり５×１０６細胞／１０ｍＬ）。
[00455] ａＥＭ３細胞の増殖は、以下の非限定的な手順を用いて達成し得る。ガス透過性細胞培養フラスコ（即ち、GREX 10フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing））に前述の培地のアリコートを調製する。プレーティングしたａＥＭ３細胞を遠心（即ち、４℃において１５００ｒｐｍで５分間）によって洗浄し、培地に再懸濁し、１〜２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度でGREXフラスコに加える。ａＥＭ３細胞懸濁液を３０ｍＬの培地で希釈し、次にGREXフラスコをＣＯ２下３７℃で３〜４日間インキュベートした。３〜４日後、インキュベーターからGREXフラスコを取り出し、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内に置いた。培養したａＥＭ３細胞をGREXフラスコからピペットで慎重に抜き取り、抜き取りにより得られたものを遠心すると、増加した数のａＥＭ３細胞がもたらされ、これをGREX 10フラスコ当たり１０〜２０×１０６細胞の細胞密度で再懸濁し得る。
[00456] ａＥＭ３細胞の代替的な凍結保存は、以下の非限定的な手順を用いて達成し得る。ａＥＭ３細胞が入った前述のGREX 10フラスコをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣ内に置く。培養したａＥＭ３細胞をGREXフラスコからピペットで慎重に抜き取り、抜き取りにより得られたものを遠心すると、増加した数のａＥＭ３細胞がもたらされ、これをある容積のCryStor 10（Biolife Solutions）に再懸濁すると、クリオバイアル内において１０〜１００×１０６細胞／バイアルの濃度がもたらされる。ａＥＭ３細胞懸濁液は、凍結容器に入れて−８０℃フリーザーに移してもよい。
実施例１９ − 凍結保存後のａＥＭ３細胞の急速回復の実証
[00457] CS-10凍結保存培地を使用してＴＩＬ−Ｒ３細胞株からのａＥＭ３細胞（１〜２×１０６細胞）を実施例１８に記載する手順に従い凍結保存した。次にかかる細胞のバイアルを解凍し、細胞をカウントした。細胞数は、凍結前、解凍後、及び解凍３日後（即ち、解凍回復後）に取った。図８６及び図８７に示すとおり、２つの別個の実験において総生細胞数は解凍後急速に回復した。
[00458] ＴＩＬ−Ｒ３細胞（１×１０６細胞）を解凍し（解凍後３日目）、２４ウェルプレートの各ウェルに０．５×１０６／ｃｍ２の密度でプレーティングした。０及び３日目、生細胞をカウントして記録した。初回継代時（６日目）、細胞を２×１０６細胞／ｃｍ２又は０．５×１０６細胞／ｃｍ２の密度で分割した。初回継代の終了時に細胞カウントを実施した。得られた細胞数を図８８に示し、これは解凍後回復段階及び成長段階の両方を実証している。
[00459] 更に、ＴＩＬ−Ｒ３細胞（２０×１０６細胞）をGREX 10フラスコにおいて２×１０６／ｃｍ２の密度で実施例１８に記載する手順に従い培養した。４日目及び８日目、生細胞をカウントして記録した。得られた細胞数を図８９に示し、これは４日目〜８日目に細胞が１３．９×１０６細胞／ｃｍ２の密度に達したときプラトーに達する凍結保存後の細胞の成長段階を実証する。
実施例２０ − ａＥＭ３ ａＡＰＣと培養したＴＩＬのＣＤ８の偏り、拡大培養性能、及びＣＤ３汚染
[00460] １５個の異なるプレＲＥＰ ＴＩＬ株（０．４×１０５細胞）をａＥＭ３ ａＡＰＣ（本明細書に記載されるとおり）又はＰＢＭＣフィーダー（１０×１０６）のいずれか、ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）と共培養し、５日目に６ウェルGrexプレートを使用して培養物を分割した。１１日目の時点で培養物をサンプリングし、フローサイトメトリーによって分析した。式（ＣＤ８％ ａＥＭ３）／（ＣＤ８％ ＰＢＭＣ）によってＣＤ８＋細胞の相対比を計算した。図９１に示す結果は、ａＥＭ３細胞と培養したＴＩＬが意外にもＣＤ８＋の偏り及びＴＩＬ産物の改善を促進することを示している。これらの実験の更なる結果を図９２、図９３、及び図９４に示し、これらの結果は、ＰＢＭＣフィーダーと共に培養したＴＩＬと比較して、ａＥＭ３ ａＡＰＣと共に培養したＴＩＬが同等の拡大培養を呈し、非ＣＤ３＋細胞汚染が低かったことを示している。
実施例２１ − テロメア長測定
[00461] テロメア長を測定するｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）アッセイのため、プレＲＥＰ又はポストＲＥＰ（ＣＤ３＋に関して磁気ビーズ選別した）ＴＩＬからゲノムＤＮＡを単離した。リアルタイムｑＰＣＲ方法については、Cawthon, Nucleic Acids Res. 2002, 30(10), e47；及びYang, et al., Leukemia, 2013, 27, 897-906に記載される。簡潔に言えば、９６ウェルフォーマットでＰＣＲサーマルサイクラー（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を使用してテロメア反復コピー数と単一遺伝子コピー数（Ｔ／Ｓ）との比を決定した。テロメア又はヘモグロビン（ｈｇｂ）のいずれかのＰＣＲ反応に１０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用し、及び使用したプライマーは以下のとおりであった：
Ｔｅｌ−１ｂプライマー（CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT）（配列番号４０）；
Ｔｅｌ−２ｂプライマー（GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT）（配列番号４１）；
ｈｇｂ１プライマー（GCT TCT GAC ACA ACT GTG TTC ACT AGC）（配列番号４２）；及び
ｈｇｂ２プライマー（CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC）（配列番号４３）。
[00462] 試料は全てテロメア及びヘモグロビンの両方の反応によって分析し、分析は同じプレート上でトリプリケートで実施した。試験試料に加えて、各９６ウェルプレートには、１３０１ヒトＴ細胞白血病細胞株（Sigma及びＡＴＣＣから入手可能）から単離したゲノムＤＮＡを用いた０．０８ｎｇ〜２５０ｎｇの５ポイント標準曲線が含まれた。各試料のＴ／Ｓ比（−ｄＣｔ）はテロメア閾値サイクル（Ｃｔ）中央値からヘモグロビンＣｔ中央値を差し引くことにより計算した。相対的Ｔ／Ｓ比（−ｄｄＣｔ）は、各未知の試料のＴ／Ｓ比から１０．０ｎｇ標準曲線ポイントのＴ／Ｓ比を差し引くことにより決定した。
[00463] 結果は図９５に示す。示される各データ点が、相対Ｔ／Ｓ比の測定中央値である。これらの結果は、ａＥＭ３と培養したＴＩＬがそのテロメア長を維持することを示している。

Claims (99)

  1. １又は複数のウイルスベクターが形質導入された骨髄系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であって、前記１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、共刺激分子をコードする１又は複数の核酸とを含み、前記骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と１又は複数の共刺激分子とを発現する、ａＡＰＣ。
  2. 前記ａＡＰＣと接触した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を刺激し、拡大することができる、請求項１に記載のａＡＰＣ。
  3. 約３０００ＩＵ／ｍＬの濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＯＫＴ−３抗体とを含む細胞培養培地において、ＴＩＬ集団を７日の期間で少なくとも５０倍に拡大する、請求項１又は２に記載のａＡＰＣ。
  4. 前記ａＡＰＣと接触したＴ細胞を刺激し、拡大することができる、請求項１又は２に記載のａＡＰＣ。
  5. 前記骨髄系細胞がＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  6. 前記骨髄系細胞がＭＯＬＭ−１４細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  7. 前記骨髄系細胞がＥＭ−３細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  8. 前記ＥＭ−３細胞が、ＯＫＴ−３抗体のＦｃドメインへの結合能を有する単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように更に形質導入される、請求項７に記載のａＡＰＣ。
  9. 前記ｓｃＦｖ結合ドメインが、クローン７Ｃ１２（配列番号２７）、クローン８Ｂ３（配列番号２８）、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項８に記載のａＡＰＣ。
  10. 前記ＣＤ８６タンパク質が、配列番号８に記載の配列、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  11. ＣＤ８６をコードする前記核酸が配列番号１９を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  12. 前記１又は複数の共刺激分子が４−１ＢＢＬタンパク質を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  13. 前記４−１ＢＢＬタンパク質が、配列番号９に記載の配列、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項１２に記載のａＡＰＣ。
  14. 前記４−１ＢＢＬタンパク質をコードする前記１又は複数の核酸が配列番号１６を含む、請求項１２に記載のａＡＰＣ。
  15. 前記１又は複数の共刺激分子がＯＸ４０Ｌタンパク質を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  16. 前記ＯＸ４０Ｌタンパク質が、配列番号１０に記載の配列、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項１５に記載のａＡＰＣ。
  17. 前記ａＡＰＣが無血清培地において成長させたものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。
  18. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法であって、ＴＩＬ集団を請求項１〜１７のいずれか一項に記載のａＡＰＣと接触させるステップを含み、前記ＴＩＬ集団が拡大培養される、方法。
  19. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団を拡大培養する方法であって、
    （ａ）骨髄系細胞を１又は複数のウイルスベクターで形質導入して人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）集団を得るステップであって、前記１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、１又は複数の共刺激分子をコードする１又は複数の核酸とを含み、前記骨髄系細胞がＣＤ８６タンパク質と１又は複数の共刺激分子とを発現するステップ、及び
    （ｂ）細胞培養培地中で前記ＴＩＬ集団を前記ａＡＰＣ集団と接触させるステップ
    を含む方法。
  20. 前記細胞培養培地が、約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＡＰＣ集団が、細胞培養培地において前記ＴＩＬ集団を７日の期間で少なくとも５０倍に拡大する、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 前記骨髄系細胞がＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記骨髄系細胞がＭＯＬＭ−１４細胞である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記骨髄系細胞がＥＭ−３細胞である、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＥＭ−３細胞が、ＯＫＴ−３抗体のＦｃドメインへの結合能を有する単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように更に形質導入される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ｓｃＦｖ結合ドメインがクローン７Ｃ１２（配列番号２７）、クローン８Ｂ３（配列番号２８）、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＣＤ８６タンパク質が、配列番号８、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. ＣＤ８６をコードする前記核酸が配列番号１９を含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記１又は複数の共刺激分子が４−１ＢＢＬタンパク質を含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記４−１ＢＢＬタンパク質が、配列番号９に記載の配列、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記４−１ＢＢＬタンパク質をコードする前記１又は複数の核酸が配列番号１６を含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記１又は複数の共刺激分子がＯＸ４０Ｌタンパク質を含む、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＯＸ４０Ｌタンパク質が、配列番号１０に記載の配列、あるいはその１又は複数の保存的アミノ酸置換を含む配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記拡大培養がガス透過性容器を使用して行われる、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が１：２００〜１：４００である、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が約１：３００である、請求項３５に記載の方法。
  37. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法であって、前記方法が、ＴＩＬ集団を含むＴＩＬ集団を骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることを含み、前記骨髄系ａＡＰＣが、ＣＤ８６と、前記ＴＩＬ上の少なくとも１つの共刺激分子に特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドとを含み、前記共刺激分子が前記共刺激リガンドに結合すると前記ＴＩＬの増殖が誘導され、それによりＴＩＬが特異的に拡大し、そして前記少なくとも１つの共刺激リガンドが４−１ＢＢＬを含む、方法。
  38. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法であって、前記方法が、ＴＩＬ集団を含むＴＩＬ集団を骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることを含み、前記骨髄系ａＡＰＣが、ＣＤ８６と、前記ＴＩＬ上の少なくとも１つの共刺激分子に特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドとを含み、前記共刺激分子が前記共刺激リガンドに結合すると前記ＴＩＬの増殖が誘導され、それによりＴＩＬが特異的に拡大し、そして前記少なくとも１つの共刺激リガンドがＯＸ４０Ｌを含む、方法。
  39. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法であって、前記方法が、ＴＩＬ集団を含むＴＩＬ集団を骨髄系人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることを含み、前記骨髄系ａＡＰＣが、ＣＤ８６と、前記ＴＩＬ上の少なくとも２つの共刺激分子に特異的に結合する少なくとも２つの共刺激リガンドとを含み、前記共刺激分子が前記共刺激リガンドに結合すると前記ＴＩＬの増殖が誘導され、それによりＴＩＬが特異的に拡大し、そして前記少なくとも２つの共刺激リガンドが４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌを含む、方法。
  40. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法であって、
    （ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；
    （ｂ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して前記第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、前記迅速拡大培養の開始から７日後に前記第２のＴＩＬ集団が前記第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ；及び
    （ｃ）前記癌を有する患者に治療上有効な分量の前記第２のＴＩＬ集団を投与するステップ
    を含み；
    前記骨髄系ａＡＰＣがＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し；そして
    前記骨髄系ａＡＰＣがＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現するように形質導入される、方法。
  41. 前記骨髄系ａＡＰＣが１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、前記１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、前記ＭＯＬＭ−１４細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記骨髄系ａＡＰＣが１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、前記１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、前記ＥＭ−３細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記ＥＭ−３細胞が、ＯＫＴ−３抗体のＦｃドメインへの結合能を有する単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように更に形質導入される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ｓｃＦｖ結合ドメインが、クローン７Ｃ１２（配列番号２７）、クローン８Ｂ３（配列番号２８）、又はその保存的アミノ酸置換を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記迅速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記細胞培養培地が約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記拡大培養がガス透過性容器を使用して行われる、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記第２のＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が１：２００〜１：４００である、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記第２のＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が約１：３００である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記癌が、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、及び膠芽腫からなる群から選択される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記第２のＴＩＬ集団を前記患者に投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって前記患者を処置するステップを更に含む、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記第２のＴＩＬ集団の前記患者への投与の翌日に開始する高用量ＩＬ−２レジメンによって前記患者を治療するステップを更に含む、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記高用量ＩＬ−２レジメンが、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含み、これらが忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される、請求項５３に記載の方法。
  55. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団によって癌を治療する方法であって、
    （ａ）患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を得るステップ；
    （ｂ）第１の細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、前記第２のＴＩＬ集団が前記第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、そして前記第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
    （ｃ）第２の細胞培養培地において骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して前記第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第３のＴＩＬ集団を得るステップであって、前記迅速拡大培養の開始から７日後に前記第３のＴＩＬ集団が前記第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；そして前記第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ；
    （ｄ）前記癌を有する患者に治療上有効な分量の前記第３のＴＩＬ集団を投与するステップ
    を含む方法。
  56. 前記骨髄系ａＡＰＣが、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞を含み、前記１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、前記ＭＯＬＭ−１４細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記骨髄系ａＡＰＣが、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＥＭ−３細胞を含み、前記１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬをコードする核酸とを含み、前記ＥＭ−３細胞がＣＤ８６タンパク質と４−１ＢＢＬタンパク質とを発現する、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記ＥＭ−３細胞が、ＯＫＴ−３抗体のＦｃドメインへの結合能を有する単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように更に形質導入される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ｓｃＦｖ結合ドメインが、クローン７Ｃ１２（配列番号２７）、クローン８Ｂ３（配列番号２８）、又はその保存的アミノ酸置換を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記第２の細胞培養培地中にＩＬ−２が約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、そしてＯＫＴ−３抗体が約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記迅速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記初期拡大培養がガス透過性容器を使用して行われる、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記迅速拡大培養がガス透過性容器を使用して行われる、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記迅速拡大培養における前記第２のＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が１：８０〜１：４００である、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記迅速拡大培養における前記第２のＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が約１：３００である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記癌が、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、及び膠芽腫からなる群から選択される、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記第３のＴＩＬ集団を前記患者に投与する前に骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンによって前記患者を処置するステップを更に含む、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与ステップと、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与ステップを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記第３のＴＩＬ集団を前記患者に投与した翌日に開始する高用量ＩＬ−２レジメンによって前記患者を治療するステップを更に含む、請求項５５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記高用量ＩＬ−２レジメンが、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含み、これらが忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記第１の細胞培養培地が第２の骨髄系ａＡＰＣ集団を更に含み、前記第２の骨髄系ａＡＰＣ集団が、１又は複数のウイルスベクターが形質導入されたＭＯＬＭ−１４又はＥＭ−３細胞を含み、前記１又は複数のウイルスベクターが、ＣＤ８６をコードする核酸と、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子をコードする１又は複数の核酸とを含み、前記骨髄系ａＡＰＣがＣＤ８６タンパク質と共刺激分子とを発現する、請求項５５〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 公知の共刺激分子を発現する腫瘍浸潤リンパ球の増殖を特異的に誘導するためのキットであって、前記キットが有効量のａＡＰＣを含み、前記ａＡＰＣが、レンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入されたＭＯＬＭ−１４細胞又はＥＭ−３細胞を含み、前記ＬＶが、前記公知の共刺激分子に特異的に結合する少なくとも１つの共刺激リガンドをコードする核酸を含み、前記公知の共刺激分子が前記共刺激リガンドに結合すると前記Ｔ細胞が刺激されて拡大し、前記キットがアプリケーター及び前記キットの使用説明資料を更に含む、キット。
  73. 癌細胞に対する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の効力を評価する方法であって、
    （ａ）内因性ＣＤ１６ Ｆｃ受容体を発現する複数のマウス肥満細胞腫Ｐ８１５細胞を提供するステップであって、前記Ｐ８１５細胞が高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びホタルルシフェラーゼをベースとするレンチウイルスベクターで形質導入されるステップ；
    （ｂ）前記複数のＰ８１５細胞とＴＩＬとを、ＯＫＴ−３とともに共培養することにより特異的殺傷に関してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化を評価し、そして、ＯＫＴ−３なしで共培養することにより非特異的殺傷に関してリンホカイン活性化キラー性（ＬＡＫ）を評価するステップ；
    （ｃ）前記共培養物を４時間インキュベートするステップ；
    （ｄ）ルシフェリンを加えて５分間インキュベートするステップ；
    （ｅ）ルミノメーターを使用して前記共培養物から生物発光強度を読み取るステップ；及び
    （ｆ）パーセント細胞傷害率及び生存率を計算するステップ
    を含む方法。
  74. 癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、前記腫瘍浸潤リンパ球集団が第１のＴＩＬ集団であり、且つ
    （ａ）細胞培養培地中で骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して第１のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、前記第１のＴＩＬ集団が予め患者から切除された腫瘍から得られ、及び更に前記迅速拡大培養の開始から７日後に前記第２のＴＩＬ集団が前記第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多いステップ
    を含む方法によって入手可能であり；及び
    前記骨髄系ａＡＰＣがＨＬＡ−Ａ／Ｂ／Ｃ、ＩＣＯＳ−Ｌ、及びＣＤ５８を内因的に発現し；
    及び前記骨髄系ａＡＰＣが、ＣＤ８６タンパク質と、４−１ＢＢＬタンパク質、ＯＸ４０Ｌタンパク質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子とを発現するように形質導入される、使用のためのＴＩＬ集団。
  75. 前記迅速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、請求項７４に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  76. 前記細胞培養培地が約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む、請求項７４又は７５に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  77. 前記拡大培養がガス透過性容器を使用して行われる、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  78. 前記第２のＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が１：２００〜１：４００である、請求項７４〜７７のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  79. 前記第２のＴＩＬ集団と前記ａＡＰＣ集団との比が約１：３００である、請求項７８に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  80. 患者の癌の治療における使用のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団であって、前記腫瘍浸潤リンパ球集団が第３のＴＩＬ集団であり、且つ
    （ａ）第１の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団の初期拡大培養を行うことにより第２のＴＩＬ集団を得るステップであって、前記第１のＴＩＬ集団が患者から切除された腫瘍から入手可能であり、及び更に前記第２のＴＩＬ集団が前記第１のＴＩＬ集団よりも少なくとも５倍数が多く、及び前記第１の細胞培養培地がＩＬ−２を含むステップ；
    （ｂ）第２の細胞培養培地において骨髄系人工抗原提示細胞（骨髄系ａＡＰＣ）集団を使用して前記第２のＴＩＬ集団の迅速拡大培養を行うことにより前記第３のＴＩＬ集団を得るステップであって、前記迅速拡大培養の開始から７日後に前記第３のＴＩＬ集団が前記第２のＴＩＬ集団よりも少なくとも５０倍数が多く；及び前記第２の細胞培養培地がＩＬ−２及びＯＫＴ−３を含むステップ
    を含む方法によって得られる、ＴＩＬ集団。
  81. 前記迅速拡大培養が１４日以下の期間にわたって行われる、請求項８０に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  82. 前記細胞培養培地が約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度のＩＬ−２と、約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度のＯＫＴ−３抗体とを更に含む、請求項８０又は８１に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  83. 前記第２の細胞培養培地中にＩＬ−２が約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で存在し、及びＯＫＴ−３抗体が約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度で存在する、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  84. 前記初期拡大培養が１４日以下の期間にわたって実施される、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  85. 前記初期拡大培養及び／又は迅速拡大培養がガス透過性容器を使用して行われる、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  86. 前記骨髄系ａＡＰＣが、ＣＤ８６タンパク質と、４−１ＢＢＬタンパク質、ＯＸ４０Ｌタンパク質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子とを発現するように形質導入されるＭＯＬＭ−１４細胞を含む、請求項８０〜８５のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  87. 前記骨髄系ａＡＰＣが、ＣＤ８６タンパク質と、４−１ＢＢＬタンパク質、ＯＸ４０Ｌタンパク質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子とを発現するように形質導入されるＥＭ−３細胞を含む、請求項８０〜８６のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  88. 前記ＥＭ−３細胞が、ＯＫＴ−３抗体のＦｃドメインへの結合能を有する単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように更に形質導入される、請求項８７に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  89. 前記ｓｃＦｖ結合ドメインが、クローン７Ｃ１２（配列番号２７）、クローン８Ｂ３（配列番号２８）、又はその保存的アミノ酸置換を含む、請求項８７に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  90. 前記癌が、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる癌、頭頸部癌、腎癌、腎細胞癌、膵癌、及び膠芽腫からなる群から選択される、請求項８０〜８９のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  91. 患者が骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを受けた後に前記患者に投与するための、請求項８０〜９０のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  92. ６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与と、それに続く２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間のフルダラビンの投与の後に投与するための、請求項９１に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  93. 高用量ＩＬ−２レジメンの前日に投与するための、請求項８０〜９２のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  94. 前記高用量ＩＬ−２レジメンが、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含み、これらが忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与される、請求項９３に記載の使用のためのＴＩＬ集団。
  95. （１）請求項８０〜９４のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団と、（２）シクロホスファミドと（３）フルダラビンとの組み合わせであって、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間投与するためのシクロホスファミドと、それに２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間投与するためのものであるフルダラビンが続く、組み合わせ。
  96. 請求項８０〜９２のいずれか一項に記載の使用のためのＴＩＬ集団と高用量のＩＬ−２レジームとの組み合わせであって、前記高用量ＩＬ−２レジメンが、忍容量まで８時間毎に１５分ボーラス静脈内注入として投与するために、６００，０００又は７２０，０００ＩＵ／ｋｇのアルデスロイキン、又はそのバイオシミラー若しくは変異体を含む、組み合わせ。
  97. ＣＤ８６と、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１又は複数の共刺激分子とを発現するように遺伝子操作された骨髄系細胞を含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
  98. 前記骨髄系細胞がＥＭ−３細胞であり、前記骨髄系細胞が、ＯＫＴ−３抗体のＦｃドメインへの結合能を有する単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）結合ドメインを発現するように更に遺伝子操作される、請求項９７に記載のａＡＰＣ。
  99. 前記ＥＭ−３細胞が、４−１ＢＢＬとＯＸ４０Ｌとを発現するように遺伝子操作される、請求項９８に記載のａＡＰＣ。
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