[go: up one dir, main page]

CN119331827A - 一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用 - Google Patents

一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN119331827A
CN119331827A CN202411896739.5A CN202411896739A CN119331827A CN 119331827 A CN119331827 A CN 119331827A CN 202411896739 A CN202411896739 A CN 202411896739A CN 119331827 A CN119331827 A CN 119331827A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
til
tumor
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202411896739.5A
Other languages
English (en)
Inventor
赵振军
栗红建
张丹
赵圆
李朝晖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Puxin Biomedical Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Puxin Biomedical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Puxin Biomedical Co ltd filed Critical Jiangsu Puxin Biomedical Co ltd
Priority to CN202411896739.5A priority Critical patent/CN119331827A/zh
Publication of CN119331827A publication Critical patent/CN119331827A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请涉及细胞制备领域，特别涉及一种基因修饰的K562细胞及其在TIL扩增中的应用。本申请公开了一种基因修饰的K562细胞，所述K562细胞含有编码IL‑15、4‑1BBL和CD86的多核苷酸序列。本申请还公开一种基于饲养细胞的TIL细胞制备方法，此方法制备的TIL细胞冻存复苏后TIL细胞的关键质量属性（如细胞扩增和活率以及杀伤功能等）显著提高，对于提升TIL细胞治疗的临床疗效具有重要意义。

Description

一种基因修饰的K562细胞及其在TIL扩增中的应用
技术领域
本说明书涉及细胞制备领域，特别涉及一种基因修饰的K562细胞及其在TIL扩增中的应用。
背景技术
细胞与基因治疗（Cell and Gene Therapy，CGT）产品已成为全球医药发展的前沿和热点，其中TIL细胞免疫疗法(Tumor Infiltrating Lymphocytes, 肿瘤浸润淋巴细胞)已在实体肿瘤治疗方面显示出良好效果，目前已有TIL细胞药物获批上市，且有多款针对不同实体肿瘤的TIL细胞药物获批IND处于不同临床阶段。TIL细胞免疫疗法是将患者肿瘤组织中的T细胞分离出，在体外进行刺激扩增后回输到患者体内，从而扩大免疫应答，达到治疗原发或继发肿瘤的目的，其原理主要是肿瘤组织内浸润了大量T细胞，其中存在部分针对肿瘤特异性抗原的T细胞，其可以深入肿瘤组织内部特异性杀伤肿瘤。TIL细胞免疫疗法在实体肿瘤治疗方面显示出广阔的应用前景。
TIL细胞的活性原料主要为患者经手术切除的肿瘤组织或淋巴结，肿瘤组织或淋巴结经逐级转移后获得的肿瘤细胞悬液中含有部分处于“睡眠”状态且针对肿瘤特异性抗原的淋巴细胞，该部分细胞经体外活化和扩增为具有效应功能的T细胞后回输到患者体内，其可以深入肿瘤组织内部通过重启T细胞免疫应答信号通路从而特异性杀伤肿瘤，达到治疗原发或继发肿瘤的目的。
目前TIL细胞激活扩增工艺主要存在的缺点和不足之处如下：
（1）肿瘤组织处理阶段
传统的肿瘤组织处理方式是将肿瘤组织放置于添加无菌剪切液的一个培养皿中，通过无菌剪刀将所有肿瘤组织剪碎至无肉眼可见的组织小块获取淋巴细胞悬液，此处理方式可能不能将肿瘤组织中的淋巴细胞完全浸润释放出来，导致肿瘤组织中的淋巴细胞悬液获取得率下降。
（2）快速扩增阶段（REP）
传统的细胞激活主要是以3-6个不同健康供体来源混合且经辐照后的异源PBMC做为饲养细胞，然后按一定比例添加以激活和扩增TIL细胞，异源PBMC来源的饲养细胞主要缺点如下：
①异源供体来源的饲养细胞在激活TIL时会引入批次间异质性和可变性，从而可能影响TIL细胞在商业化生产时产品稳定性和临床治疗效果。
②多个异源供体来源辐照后PBMC做饲养细胞时一般用量较大（如TIL：饲养细胞=1：50-1：100），导致单批TIL生产时饲养细胞使用成本增加，且产品饲养细胞残留风险增加；
③大量异源健康供体PBMC需要从单采血分离获得，采购成本较高，而供体单采血需冷链运输，且一般要求48h内必须进行处理，因此对物流运输要求比较高。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种基于K562饲养细胞的TIL细胞制备方法及其应用。在快速扩增阶段（REP）采用单克隆化的基因改造K562细胞辐照后获得的饲养细胞进行TIL细胞的激活和扩增。
本申请提供一种基因修饰的K562细胞，所述K562细胞含有编码IL-15、4-1BBL和CD86的多核苷酸。
本申请提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，使用上述的K562细胞培养扩增肿瘤浸润淋巴细胞。
本申请提供上述的K562细胞或上述的方法在肿瘤浸润淋巴细胞制备中的应用。
本申请带来的有益效果包括但不限于：（1）经过将肿瘤组织逐级剪切浸润方式预扩增培养获取TIL细胞得率提高1.5倍，且细胞活率在90%以上。（2）由于单克隆化的基因改造K562饲养细胞批次均一稳定，可保证K562饲养细胞激活和扩增后TILs细胞产品的稳定性和功效。另外，基因改造K562可通过建立批量细胞库，随用随取，可大大降低单批TIL细胞生产时异体PBMC来源的饲养细胞使用成本，同时降低TIL产品中饲养细胞残留风险。此外，同样TIL:饲养细胞=1：25比例，基于基因改造K562 饲养细胞刺激扩增14天的TIL细胞扩增倍数达到1300倍以上（为PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞扩增倍数的2.14倍），细胞活率在90%以上，TIL细胞表型（CD3阳性率）达到95%以上，整个工艺阶段饲养细胞残留均为阴性，效靶比在1：1、1：3和1：10时细胞杀伤效率分别为25.4%、46.8%和55.9%（与PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞杀伤效率无明显区别），效靶比为1：10时IFN-γ分泌达689pg/ml（略高于PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞IFN-γ分泌）。该制备方法简单、高效、有利于TIL细胞规模化生产。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1为根据本申请一些实施例所示的冻存细胞时的降温程序。
图2为根据本申请一些实施例所示的TIL细胞制备工艺流程图。
图3为根据本申请一些实施例所示的Pre-REP阶段细胞活率柱状图。
图4为根据本申请一些实施例所示的Pre-REP阶段活细胞数柱状图。
图5为根据本申请一些实施例所示的TIL细胞扩增曲线图。
图6为根据本申请一些实施例所示的TIL细胞活率曲线图。
图7为根据本申请一些实施例所示的TIL细胞表型。
图8为根据本申请一些实施例所示的复苏后TIL细胞得率。
图9为根据本申请一些实施例所示的复苏后TIL细胞活率。
图10为根据本申请一些实施例所示的复苏后TIL细胞杀伤效率。
图11为根据本申请一些实施例所示的复苏后TIL细胞IFN-γ分泌量。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
本申请提供一种基因修饰的K562细胞，所述K562细胞含有编码IL-15、4-1BBL和CD86的多核苷酸。
在一些实施例中，所述K562细胞可以表达IL-15、4-1BBL和CD86。
在一些实施例中，所述K562细胞可以表达膜结合型IL-15、4-1BBL和CD86。
本申请还提供一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，使用上述的K562细胞培养扩增肿瘤浸润淋巴细胞。
在一些实施例中，所述方法具体可以包括以下步骤：1）从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，在含有IL-2的培养基中培养7～15天，得到第一细胞；2）将上述的K562细胞辐照，得到第二细胞；3）将第一细胞和第二细胞按（0.5～1.5）：（20～30）的数量比混合，培养，得到CD3阳性肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施例中，优选的，所述步骤3）中，第一细胞和第二细胞可以按1：25的数量比混合。
在一些实施例中，所述步骤1）中，从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，在含有IL-2的培养基中培养8～14天，得到第一细胞。在一些实施例中，所述步骤1）中，从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，在含有IL-2的培养基中培养9～13天，得到第一细胞。在一些实施例中，所述步骤1）中，从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，在含有IL-2的培养基中培养10～12天，得到第一细胞。在一些实施例中，所述步骤1）中，从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，在含有IL-2的培养基中培养11～12天，得到第一细胞。
在一些实施例中，可以将第一细胞和第二细胞按（0.75～1.25）：（22～28）的数量比混合。在一些实施例中，可以将第一细胞和第二细胞按（1～1.25）：（24～26）的数量比混合。
在一些实施例中，所述步骤1）中，培养基中IL-2的浓度可以为2000～4000IU/ml。例如，培养基中IL-2的浓度可以为2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900或4000IU/ml。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。
在一些实施例中，所述步骤1）中，肿瘤可以为黑色素瘤。
在一些实施例中，所述步骤3）中，培养时使用的培养基中可以含有IL-2和CD3抗体，在一些实施例中，优选的，所述步骤3）中，培养基中IL-2的浓度可以为2000～4000IU/ml。例如，培养基中IL-2的浓度可以为2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900或4000IU/ml。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。
在一些实施例中，优选的，所述步骤3）中，培养基中CD3抗体的浓度可以为20～40ng/ml。例如，培养基中CD3抗体的浓度可以为20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40ng/ml。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。
在一些实施例中，所述步骤3）中，培养的时间可以为7～15天。例如，培养的时间可以为7、8、9、10、11、12、13、14或15天。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。
在一些实施例中，优选的，所述步骤3）中，培养的时间可以为14天。
在一些实施例中，所述步骤3）中，第一活细胞密度可以为1～1.5x106/ml。例如，第一活细胞密度可以为1 x106/ml、1.1 x106/ml、1.2 x106/ml、1.3 x106/ml、1.4 x106/ml或1.5x106/ml。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。
在一些实施例中，所述步骤3）中，混合培养后，可以每隔2～4天补液。在一些实施例中，所述步骤3）中，第一活细胞培养密度可以为5～10x105/ml。
在一些实施例中，所述步骤1）和3）中，培养时使用的培养基可以为无血清培养基。在一些实施例中，所述步骤1）和3）中，优选的，所述无血清培养基可以为AIM V无血清培养基。
本申请还提供上述的K562细胞或上述的方法在肿瘤浸润淋巴细胞制备中的应用。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
基于TIL细胞的独特特性，对K562细胞进行了精准基因改造，主要通过引入膜结合白介素因子、优选免疫刺激分子，并对抗原特异性基因进行了改造。具体改造如下：
1）诱导活化功能：选择能维持记忆性T细胞且不会引起T细胞凋亡的白介素因子，并通过设计膜结合型白介素因子，以克服分泌型因子血清半衰期短的缺点，从而更有效地诱导和维持T细胞的增殖与分化。
2）共刺激信号选择：优选与活化的CD4+和CD8+T细胞高表达受体相结合的免疫刺激分子，通过提供共刺激信号，显著促进T细胞的体外扩增，为细胞药物的制备提供高质量的细胞源。
3）抗原特异性改造：针对K562细胞表面可能引起免疫细胞优势生长的Marker进行基因改造，避免了对细胞一致性的影响，从而提高了细胞药物CMC部分的质量可控性，并在临床阶段保证了稳定的疗效。这一改造也凸显了K562细胞作为饲养细胞相较于PBMC的优势。
成功构建的IL-15、4-1BBL和CD86基因改造K562细胞已经过单克隆筛选、建库检定、功能验证和安全性评价方法的开发与验证，其经辐照后获得的K562饲养细胞能够特异性提升T细胞的增殖能力、细胞杀伤功能及体内持续存活能力，显著增强了其在抗肿瘤治疗中的疗效。
基因改造K562单克隆细胞系构建步骤如下：
（1）将IL-15、4-1BBL和CD86基因序列构建至 Pre-Lenti-EF1-CAR-V2-WPmut 载体上，将构建后的表达载体通过慢病毒转导的方式对K562野生型细胞系（购至ATCC）进行IL-15、4-1BBL和CD86基因改造，得到IL-15、4-1BBL和CD86基因改造K562多克隆细胞，然后对K562多克隆细胞通过流式细胞仪分选出多个IL-15、4-1BBL和CD86三阳性单克隆，并对每个单克隆细胞进行源性拍照溯源和扩增培养，最后经流式细胞仪检测并成功筛选出10个IL-15、4-1BBL和CD86三阳性率均在99%以上的IL-15、4-1BBL和CD86基因改造K562单克隆细胞系。
实施例2
本专利实施方式采用黑色素瘤患者的黑色素瘤组织进行TIL细胞的制备，具体涉及肿瘤组织接受和处理、TIL细胞快速扩增准备、TIL细胞激活和快速扩增培养以及TIL细胞收获、制剂和冻存等几个步骤，具体如下：
(1)肿瘤组织接受
手术切除获取的黑色素瘤患者的两份黑色素瘤组织存储在等渗且添加抗生素的营养组织接受液【AIM V 无血清培养基（Gibco，货号：A3021002）+100mg/ml链霉素、青霉素（hyclone，货号:SV30010）+50mg/ml庆大霉素（上海上药中西制药有限公司，货号：国药准字H31022243）】，通过2-8℃冷链运输至细胞制备间。同时取样组织接收液进行无菌检测，无菌检测为阴性。
（2）肿瘤组织处理
黑色素瘤组织按照称重分为两等份，分别做如下处理：
①生物安全柜中向5个培养皿中依次分别添加5-8ml无菌剪切液【AIM V 无血清培养基（Gibco，货号：A3021002）+3000IU/ml IL-2（北京双鹭药业股份有限公司，货号：S19991007）】，分别标记为A、B、C、D、E。将组织接收液中其中一份黑色素瘤组织放置A培养皿，并将单个肿瘤组织剪为3-5块。使用新的无菌镊子将A培养皿中所有组织转移至B培养皿，静置2-3分钟。使用新的无菌镊子将B培养皿中所有组织转移至C培养皿，并将所有肿瘤组织剪切为2块。使用新的无菌镊子将C培养皿中所有组织转移至D培养皿，静置2-3分钟。使用新的无菌镊子将D培养皿中所有组织转移至E培养皿，并将所有肿瘤组织剪碎至约27立方毫米大小（3×3×3mm的块状）。将E培养皿中组织与获取的淋巴细胞悬液均转移至含有15-25ml无菌剪切液的T75细胞培养瓶中，吹打6-12次后静置4-6分钟，如发现脂肪类漂浮组织，吸取废弃。取样细胞悬液进行无菌检测，无菌检测为阴性。
②生物安全柜中向1个培养皿中添加5-8ml无菌剪切液【AIM V 无血清培养基（Gibco，货号：A3021002）+3000IU/ml IL-2（北京双鹭药业股份有限公司，货号：S19991007）】。将组织接收液中另一份黑色素瘤组织放置培养皿，并将所有肿瘤组织剪碎至约27立方毫米大小（3×3×3mm的块状）。然后将培养皿中组织与获取的淋巴细胞悬液均转移至含有15-25ml无菌剪切液的T75细胞培养瓶中，吹打6-12次后静置4-6分钟，如发现脂肪类漂浮组织，吸取废弃。取样细胞悬液进行无菌检测，无菌检测为阴性。
（3）TIL细胞快速扩增准备（Pre-REP）
分别将配置好的1000ml Pre-REP完全培养基【AIM V 无血清培养基（Gibco，货号：A3021002）+3000IU/ml IL-2（北京双鹭药业股份有限公司，货号：S19991007）】转移至两个对应G-Rex 100M中，然后将细胞培养瓶中获取的上述①和②的所有细胞悬液与组织分别对应转移到G-Rex 100M中，于37℃、5% CO2培养箱中进行TIL细胞预扩增培养，当天即为D1，扩增不超过15天，D12开始取样计数，活细胞总数≥2E7时进行Pre-REP细胞收获，当天进入REP阶段，如活细胞总数不足2E7，继续培养并依次D13、D14计数，如D14计数的活细胞总数仍不足2E7，则在D15直接收获。分别通过70 µm细胞滤筛对收获的两种细胞悬液过滤至50ml离心管，除去大的细胞团块和组织，过滤后的两种细胞悬液收集后进入下一步的快速扩增培养。另外分别取D7培养上清和Pre-REP最后一天的收集的细胞悬液进行无菌检测，无菌检测为阴性。
（4）TIL细胞快速扩增（REP）
①激活培养（D1）
Pre-REP阶段收获的两种细胞悬液合并后混合均匀，取样计数，根据计数结果均分两份，均400g、10min离心后弃上清，然后分别以REP扩增培养基【AIM V 无血清培养基（Gibco，货号：A3021002）+3000IU/ml IL-2（北京双鹭药业股份有限公司，货号：S19991007）】重悬均匀并调整活细胞密度1-1.5E6/ml，同时分别添加30ng/ml终浓度的CD3单抗（Takara，货号：T210），然后均按1：25比例分别依次加入经37℃水浴复苏且清洗换液的IL-15、CD86和4-1BBL基因改造、辐照后的K562饲养细胞（谱新生物改造）和3种异体供体（合佑生，批号：EZ4016/EZ4131/013k058）混合PBMC辐照后的饲养细胞，最后将两种细胞悬液分别转至对应细胞培养袋（OriGen Biomedical Inc.，货号：PL30-2G），于37℃、5% CO2培养箱中激活培养3d。
②补液培养（D4）
两种细胞激活培养3d后取样计数，根据计数结果分别补充REP扩增培养基【AIM V无血清培养基（Gibco，货号：A3021002）+3000IU/ml IL-2（北京双鹭药业股份有限公司，货号：S19991007）】调整活细胞密度5-10E5 /ml，同时取样检测TIL表型和饲养细胞残留，培养袋中两组剩余细胞于37℃、5% CO2培养箱种培养3d。
③Xuri培养（D7）
两种细胞培养3d后取样计数，两种细胞悬液通过400g、10min离心洗涤后弃上清，分别补加REP扩增培养基【AIM V 无血清培养基（Gibco，货号：A3021002）+3000IU/ml IL-2（北京双鹭药业股份有限公司，货号：S19991007）】调至相同的活细胞密度5-10E5 /ml，同时取样检测TIL表型和饲养细胞残留，剩余两组细胞分别转移至Cellbag 10 L培养袋（Cytiva，货号：29-1054-99），分别将Cellbag 10 L培养袋对应组装至两台Xuri-W25反应器（Cytiva，型号：29064568）中，均调整Xuri反应器相同的转速（4-6rpm）和角度（2-4°），启动Xuri动态培养。此后每隔2天取样计数，并分别通过无菌焊接方式并泵进REP扩增培养基调至相同活细胞密度5-10E5/ml，培养体积到达5000mL后每天取样计数，并根据细胞生长密度调至相同的灌流速率和Xuri反应器转速、角度，于37℃、5% CO2条件进行动态培养。
④TIL细胞收获、制剂和冻存
根据TIL细胞制剂回输剂量确定需要的活细胞总数，一般培养14天内细胞总数可达到收获标准。D14时两组TIL细胞分别取样计数，并根据计数结果进行TIL表型、饲养细胞残留、无菌及支原体检测，然后对Xuri动态培养的两组细胞分别进行LOVO全自动细胞处理纯化系统（费森尤斯卡比，型号：6R4900）收获和洗涤浓缩，最终分别置换为100ml细胞悬液，然后根据平台制剂配方【20%HSA：复方电解质：CS10=2:2:6（V/V）】调整活细胞密度1E7/ml-1E8/ml，并分别按照一定体积分装至若干冻存袋（Miltenyi，货号：200-074-400），分别经排气、抽真空和真空塑封，最后采用程序降温仪（Thermo Fisher，型号：7453）以预设冻存程序（附图1）进行TIL细胞制剂程序降温，结束后将TIL细胞制剂转移至气相液氮罐长期存储。冻存2-7d后分别取出两冻存的两组TIL细胞复苏后进行细胞计数、TIL表型、饲养细胞残留、细胞杀伤和γ-IFN分泌检测。
数据显示：（1）经过将肿瘤组织逐级剪切浸润方式预扩增培养获取TIL细胞得率提高1.5倍（见图4），且细胞活率在90%以上（见图3）。
（2）同样TIL:饲养细胞=1：25比例，基于基因改造K562饲养细胞刺激扩增14天的TIL细胞扩增倍数达到1300倍以上（为PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞扩增倍数的2.14倍）（见图5），细胞活率在90%以上（见图6），REP培养阶段收获冻存的成品冻存复苏后TIL细胞表型（CD3阳性率）达到95%以上（见图7），整个REP阶段以及成品冻存复苏后饲养细胞残留均为阴性（详见表1），成品冻存复苏后TIL细胞得率达104%（略高于PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞成品冻存复苏后得率）（见图8），成品冻存复苏后TIL细胞活率达92.5%（略高于PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞成品冻存复苏后活率）（见图9），效靶比在1：1、1：3和1：10时对患者原代肿瘤细胞的杀伤效率分别为25.4%、46.8%和55.9%（与PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞杀伤效率无明显区别）（见图10），效靶比为1：10时IFN-γ分泌达689pg/ml（略高于PBMC饲养细胞刺激培养的TIL细胞IFN-γ分泌）（见图11）。
表1
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20%的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims (10)

1.一种基因修饰的K562细胞，其特征在于，所述K562细胞含有编码IL-15、4-1BBL和CD86的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的K562细胞，其特征在于，所述K562细胞表达IL-15、4-1BBL和CD86。
3.如权利要求1所述的K562细胞，其特征在于，所述K562细胞表达膜结合型IL-15、4-1BBL和CD86。
4.一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，使用如权利要求1～3任一项所述的K562细胞培养扩增肿瘤浸润淋巴细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞，在含有IL-2的培养基中培养7～15天，得到第一细胞；
2）将权利要求1～3任一项所述的K562细胞辐照，得到第二细胞；
3）将第一细胞和第二细胞按（0.5～1.5）：（20～30）的数量比混合，培养，得到CD3阳性肿瘤浸润淋巴细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，培养基中IL-2的浓度为2000～4000IU/ml；
和/或，所述步骤1）中，肿瘤为黑色素瘤。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，培养时使用的培养基中含有IL-2和CD3抗体；
和/或，所述步骤3）中，培养的时间为7～15天；
和/或，所述步骤3）中，第一活细胞密度为1～1.5x106/ml；
和/或，所述步骤3）中，第一细胞和第二细胞按1：25的数量比混合；
和/或，所述步骤3）中，混合培养后，每隔2～4天补液；
和/或，所述步骤1）和3）中，培养时使用的培养基为无血清培养基。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于， 所述培养基中IL-2的浓度为2000～4000IU/ml，CD3抗体的浓度为20～40ng/ml。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基为AIM V无血清培养基。
10.如权利要求1～3任一项所述的K562细胞或权利要求4～9任一项所述的方法在肿瘤浸润淋巴细胞制备中的应用。
CN202411896739.5A 2024-12-23 2024-12-23 一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用 Pending CN119331827A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411896739.5A CN119331827A (zh) 2024-12-23 2024-12-23 一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202411896739.5A CN119331827A (zh) 2024-12-23 2024-12-23 一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN119331827A true CN119331827A (zh) 2025-01-21

Family

ID=94263955

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202411896739.5A Pending CN119331827A (zh) 2024-12-23 2024-12-23 一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN119331827A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180127715A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Engineered Artificial Antigen Presenting Cells for Tumor Infiltrating Lymphocyte Expansion
CN109666639A (zh) * 2018-12-24 2019-04-23 浙江大学 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法
CN110358736A (zh) * 2016-05-20 2019-10-22 杭州优善生物科技有限公司 一种修饰的k562细胞、其制备方法及nk细胞培养组合物
CN112391349A (zh) * 2019-08-19 2021-02-23 刘韬 滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增nk细胞的方法
CN117467605A (zh) * 2023-10-16 2024-01-30 西安交通大学医学院第一附属医院 饲养细胞及利用饲养细胞体外扩增nk细胞的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110358736A (zh) * 2016-05-20 2019-10-22 杭州优善生物科技有限公司 一种修饰的k562细胞、其制备方法及nk细胞培养组合物
US20180127715A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Engineered Artificial Antigen Presenting Cells for Tumor Infiltrating Lymphocyte Expansion
CN109666639A (zh) * 2018-12-24 2019-04-23 浙江大学 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法
CN112391349A (zh) * 2019-08-19 2021-02-23 刘韬 滋养层细胞株及其制备方法和体外诱导扩增nk细胞的方法
CN117467605A (zh) * 2023-10-16 2024-01-30 西安交通大学医学院第一附属医院 饲养细胞及利用饲养细胞体外扩增nk细胞的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARCUS O. BUTLER 等: "Human cell-based artificial antigen-presenting cells for cancer immunotherapy", IMMUNOL REV., vol. 257, no. 1, 31 January 2014 (2014-01-31), pages 1 - 28 *
MARIE-ANDRÉE FORGET 等: "Activation and propagation of tumor infiltrating lymphocytes on clinical-grade designer artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy of melanoma", J IMMUNOTHER., vol. 37, no. 9, 1 November 2015 (2015-11-01), pages 3 *
QUNRUI YE 等: "Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes", JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 9, no. 131, 9 August 2011 (2011-08-09), pages 1 - 13, XP021105653, DOI: 10.1186/1479-5876-9-131 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110713978A (zh) 一种肿瘤抗原特异性肿瘤浸润性t细胞的分离方法
CN103756964A (zh) 一种高效扩增cd3-cd56+的自然杀伤细胞培养系统的方法
CN111690615B (zh) 一种鼻咽癌类器官专用培养基及无支架培养方法
CN106591363A (zh) 一种通用型异体car‑t细胞制备方法及应用
CN108379569B (zh) 高效荷载肿瘤抗原的dc疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性ctl的方法
CN111902533A (zh) 产生自然杀伤细胞的方法
Wickström et al. Expansion of tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma tumors
WO2015014291A1 (zh) 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法
CN109609451B (zh) 体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法
CN117025530B (zh) 用肿瘤坏死因子受体超家族激动剂扩增肿瘤浸润淋巴细胞（til）的方法
CN116179486B (zh) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法
CN112430573A (zh) 一种nk细胞的培养体系及培养方法
US20230295566A1 (en) Method for producing tumor-infiltrating t-lymphocytes (til) and their use as cellular therapeutics for the treatment of human tumors
CN114672457A (zh) 来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂
CN119331827A (zh) 一种基因修饰的k562细胞及其在til扩增中的应用
CN111787929A (zh) 细胞重编程疗法
Maleckar et al. Tumor-derived activated cells: culture conditions and characterization
CN109957543A (zh) 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法
CN112608903A (zh) 一种淋巴细胞及其培养体系和培养方法
CN118853565A (zh) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的培养工艺
CN117771273A (zh) 一种增强对肿瘤微环境适应性的新型肿瘤浸润淋巴细胞疗法
WO2023092155A1 (en) Organoid and tumor-infiltrating lymphocyte co-culture for optimization of patient-specific immunotherapy response
CN113005085A (zh) 一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法
US12440565B1 (en) Dendritic cell preparation and preparation method thereof
US20240200030A1 (en) Tumor proximal cell collection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20250121