JP2016518378A

JP2016518378A - 複合体

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Publication number: JP2016518378A
Application number: JP2016509427A
Authority: JP
Inventors: フーベルト・メッツナー; シュテファン・シュルテ; トーマス・ヴァイマー
Original assignee: シーエスエル、リミテッド
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2016-06-23
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: US20160200794A1; CN105163751A; HK1203409A1; EP2988772A1; US20180092966A1; SG11201508538SA; TW201534618A; AU2014257637B2; EP2796145A1; AU2014257637A1; MX2015014715A; US9878017B2; DK2796145T3; JP6474386B2; CA2909834A1; CN105163751B; KR20150144803A; WO2014173873A1; RU2015150040A; HK1219427A1

Abstract

本発明は、フォン・ビルブラント因子(VWF)及び第VIII因子の共有結合複合体に関し、ここで該複合体は、インビボで延長された半減期を有するように修飾されている。本発明はさらに、複合体を製造する方法、さらには出血事象を処置又は予防するための複合体の治療的又は予防的使用に関する。

Description

本発明は、フォン・ビルブラント（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子又はその変異体（ＶＷＦ）及び第ＶＩＩＩ因子又はその変異体（第ＶＩＩＩ因子）の共有結合複合体に関し、ここで該複合体は、インビボでの延長された半減期を有するように修飾されている。本発明はさらに、複合体を製造する方法、さらには出血事象を処置又は予防するための複合体の治療的又は予防的使用に関する。

血液凝固因子の欠乏により引き起こされる様々な出血障害がある。最も一般的な障害は血友病Ａ及びＢであり、これらはそれぞれ血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子の欠乏により生じる。別の公知の出血障害はフォン・ビルブラント病である。

血漿において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、大部分がフォン・ビルブラント因子との非共有結合複合体として存在する。プロペプチド切断後の２３３２までのアミノ酸のポリペプチドである成熟ＦＶＩＩＩは、図１に示されるいくつかのドメインから構成される。凝固におけるＦＶＩＩＩの機能は、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への第ＩＸａ因子依存性変換を加速することである。ＦＶＩＩＩとフォン・ビルブラント因子との複合体形成に起因して、ＦＶＩＩＩ及びフォン・ビルブラント因子は同じ分子の２つの機能であると長い間推測された。７０年代になってようやく、ＦＶＩＩＩ及びフォン・ビルブラント因子が生理的条件下で複合体を形成する別々の分子であることが明らかになった。８０年代には、約０．２ｎｍｏｌ／ＬというＦＶＩＩＩとフォン・ビルブラント因子との解離定数が決定され（非特許文献１）、そして両方の分子のＤＮＡ配列が決定された。

古典的血友病又は血友病Ａは遺伝性の出血性障害である。これは染色体Ｘ連鎖性血液凝固第ＶＩＩＩ因子欠損から生じ、そして１０，０００人あたり１人と２人との間の発生率でほとんど男性のみに影響を及ぼす。Ｘ染色体欠損は、それら自体血友病ではない女性キャリアにより伝達される。血友病Ａの臨床症状は増加した出血傾向である。第ＶＩＩＩ因子濃縮物での処置が導入される以前は、重篤な血友病を有する人物の平均寿命は２０年未満であった。血漿由来の第ＶＩＩＩ因子濃縮物の使用は、平均寿命を広く増加させて血友病患者の状況をかなり改善し、かれらの大部分に事実上通常の生活を送る可能性を与えてきた。しかし、血漿由来濃縮物及びそれらの使用に伴う特定の問題があり、それらのうち最も深刻なものはＢ型肝炎、非Ａ型非Ｂ型肝炎及びＨＩＶを引き起こすウイルスのようなウイルスの伝染であった。しかし、近年、様々なウイルス不活化方法及び新しい高度に精製された第ＶＩＩＩ因子濃縮物が開発され、それにより血漿由来第ＶＩＩＩ因子に関して非常に高い安全基準も確立されてきた。

予防的処置を受けている重篤な血友病Ａ患者において、ＦＶＩＩＩは、約１２時間というＦＶＩＩＩの短い血漿半減期のために週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与されなければならない。各ｉ．ｖ．投与は煩雑であり、痛みを伴い、そして特に大部分は過程で患者自身により、又は血友病Ａと診断された児童の両親により行われるので、感染のリスクを伴う。

従って、より少ない頻度で投与されなければならないＦＶＩＩＩを含有する医薬組成物の製造を可能にする、増加された機能的半減期を有するＦＶＩＩＩを生成することは非常に望ましいだろう。

細胞受容体との相互作用を減少させることにより（特許文献１、特許文献２）、ポリマーをＦＶＩＩＩに共有結合で結合することにより（特許文献３、特許文献４及び特許文献５）、ＦＶＩＩＩの封入により（特許文献６）、新しい結合部位の導入により（特許文献７）、ペプチド連結（特許文献８及び特許文献９）若しくはジスルフィド連結（特許文献１０）のいずれかによりＡ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合で結合することにより、又はＡ１ドメインとＡ２ドメインとの間のトロンビン切断を防止する変異を導入し、そしてそれ故トロンビン活性化後にＡ１ドメインをＡ２ドメインに共有結合で結合したままにすること（特許文献１１）のいずれかにより、ＦＶＩＩＩの機能的半減期を延長させるための幾つかの試みがなされた。

ＦＶＩＩＩ又はフォン・ビルブラント因子の機能的半減期を増強するための別のアプローチは、増加した半減期を有することにより、ペグ化フォン・ビルブラント因子が血漿中に存在するＦＶＩＩＩの半減期も間接的に増強するであろうということを念頭に置いた、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４）又はフォン・ビルブラント因子のＰＥＧ化（特許文献１５）によるもである。さらに、アルブミン又は免疫グロブリンの定常領域Ｆｃのような半減期増強ポリペプチドとのＦＶＩＩＩの融合タンパク質が記載されている（特許文献１６、特許文献１７及び特許文献１８）。

フォン・ビルブラント病（ＶＷＤ）の様々な形態において、欠失しているか、機能不全であるか又は減少した量でしか利用可能でないフォン・ビルブラント因子は、哺乳動物の血漿中に存在するマルチマーの接着性糖タンパク質であり、多数の生理学的機能を有する。一時止血の間、フォン・ビルブラント因子は、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンのような細胞外マトリックスの成分との間のメディエーターとして作用する。さらに、フォン・ビルブラント因子は、プロコアグラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）ＦＶＩＩＩのための担体及び安定化タンパク質として役立つ。フォン・ビルブラント因子は、内皮細胞及び巨核球において２８１３アミノ酸の前駆体分子として合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は、非特許文献２に開示される。前駆体ポリペプチドのプレ−プロ−フォン・ビルブラント因子は、２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチド及び成熟血漿フォン・ビルブラント因子において見出される２０５０残基のポリペプチドからなる（非特許文献３）、プロ−フォン・ビルブラント因子及び成熟フォン・ビルブラント因子モノマー単位については図２も参照のこと。小胞体におけるシグナルペプチドの切断後に、Ｃ末端ジスルフィド架橋が、フォン・ビルブラント因子の２つのモノマー間に形成される。分泌経路を通るさらなる輸送の間に、１２のＮ連結及び１０のＯ連結炭水化物側鎖が付加される。より重要なことには、フォン・ビルブラント因子ダイマーは、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、そして７４１アミノ酸長のプロペプチドは、後期（ｌａｔｅ）ゴルジ体において酵素ＰＡＣＥ／フューリンにより開裂される。プロペプチドに加えてフォン・ビルブラント因子の高分子量マルチマー（ＶＷＦ−ＨＭＷＭ）も、内皮細胞のバイベル・パラーデ小体（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌｌａｄｅｂｏｄｉｅｓ）又は血小板のα顆粒において貯蔵される。

血漿中に分泌されると、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、フォン・ビルブラント因子のＡ２ドメイン内で巨大フォン・ビルブラント因子マルチマーを切断する。血漿フォン・ビルブラント因子は、約５００ｋＤａの単一のダイマーから、１０，０００ｋＤａを超える分子量の２０まで又は２０より多くのダイマーからなるマルチマーまでの全範囲からなる。ＶＷＦ−ＨＭＷＭは最も強い止血活性を有し、これはリストセチン補因子活性アッセイ（ＶＷＦ：ＲＣｏ）により測定され得る。ＶＷＦ：ＲＣｏ／フォン・ビルブラント因子抗原の比が高くなるほど、高分子量マルチマーの相対的な量が高くなる。

フォン・ビルブラント因子の欠損がフォン・ビルブラント病（ＶＷＤ）の原因であり、これは、程度の差はあるが顕著な出血表現型により特徴づけられる。３型ＶＷＤは、フォン・ビルブラント因子が本質的に完全に失われている最も重症の形態であり、１型ＶＷＤは、フォン・ビルブラント因子の減少したレベルと関連しており、そしてその表現型は非常に穏やかであり得る。２型ＶＷＤは、フォン・ビルブラント因子の質的欠損に関連し、３型ＶＷＤと同程度に重症であり得る。２型ＶＷＤは多くのサブフォーム（ｓｕｂ−ｆｏｒｍｓ）を有し、それらのいくつかは、高分子量マルチマーの欠失又は減少を伴う。２Ａ型ＶＷＤは、中間及び大型マルチマーのの両方の欠失を特徴とし、従って血小板糖タンパク質１受容体に結合する能力が減少した質的に欠損したＶＷＦを特徴とする。２Ｂ型ＶＷＤは、最も高分子量のマルチマーの欠損を特徴とする。質的に欠損したＶＷＦの血小板膜上の糖タンパク質１受容体に結合する能力は異常に増強され、血小板への自発的な結合並びにその後の結合した血小板及び大きなフォン・ビルブラントマルチマーのクリアランスをもたらす。２Ｍ型ＶＷＤもまた、正常マルチマー分布以外はフォン・ビルブラント因子抗原レベルと同様に、血小板膜上の糖タンパク質１受容体に結合するその減少した能力を特徴とするフォン・ビルブラント因子の質的欠損である。２Ｎ型ＶＷＤ（Ｎｏｒｍａｎｄｙ）は、フォン・ビルブラント因子における質的欠損であり、この場合、凝固因子ＦＶＩＩＩへのフォン・ビルブラント因子の結合の欠損がある。フォン・ビルブラント因子及びフォン・ビルブラント因子マルチマーの量は正常であるが、患者はＦＶＩＩＩの減少したレベルを示し、血友病Ａと類似した表現型をもたらす。

ＶＷＤは、ヒトにおける最も多い遺伝性出血障害であり、ＶＷＦの型によって１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニン−バソプレシン（ＤＤＡＶＰ）を用いて細胞内貯蔵プールからフォン・ビルブラント因子を放出させる治療により、又は血漿起源若しくは組み換え起源のフォン・ビルブラント因子を含有する濃縮物を用いた置換治療により処置され得る。フォン・ビルブラント因子は、例えば特許文献１９に記載されるように、ヒト血漿から製造され得る。特許文献２０は、組み換えフォン・ビルブラント因子を単離する方法を記載する。

血漿において、ＦＶＩＩＩは高い親和性でフォン・ビルブラント因子に結合し、これにより早熟異化から保護され、従って一時止血におけるその役割に加えて、ＦＶＩＩＩの血漿レベルの調節における重大な役割を果たす。結果として、フォン・ビルブラント因子は、二次止血の制御における中枢因子でもある。血漿中でフォン・ビルブラント因子に結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は約１２時間である。フォン・ビルブラント因子が全く存在しないかほとんど存在しない３型ＶＷＤにおいて、ＦＶＩＩＩの半減期は約２時間しかなく、このような患者ではＦＶＩＩＩの減少した濃度に起因して軽度から中程度の血友病Ａの症状が生じる。

ＦＶＩＩＩに対するフォン・ビルブラント因子の安定化効果は、ＣＨＯ細胞におけるＦＶＩＩＩの組み換え発現を補助するためにも使用されている（非特許文献４）。ＦＶＩＩＩを安定化するためにフォン・ビルブラント因子を使用する他の最近の試みは、いくつかの近年の特許出願に開示されている（特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４）。

ＷＯ０３／０９３３１３Ａ２ＷＯ０２／０６０９５１Ａ２ＷＯ９４／１５６２５ＷＯ９７／１１９５７ＵＳ４９７０３００ＷＯ９９／５５３０６ＷＯ９７／０３１９３ＷＯ９７／４０１４５ＷＯ０３／０８７３５５ＷＯ０２／１０３０２４Ａ２ＷＯ２００６／１０８５９０ＷＯ２００７／１２６８０８ＷＯ２００６／０５３２９９ＷＯ２００４／０７５９２３ＷＯ２００６／０７１８０１ＷＯ２００４／１０１７４０ＷＯ２００８／０７７６１６ＷＯ２００９／１５６１３７ＥＰ０５０３９９１ＥＰ０７８４６３２ＷＯ２０１１０６０２４２ＷＯ２０１３０８３８５８ＷＯ２０１３１０６７８７ＷＯ２０１４０１１８１９

Ｌｅｙｔｅｅｔａｌ．、ＢｉｏｃｈｅｍＪ１９８９、２５７：６７９−６８３Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．１９８７、ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４３９３−４３９７Ｆｉｓｃｈｅｒｅｔａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５１：３４５−３４８、１９９４Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．１９８９、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ

ＦＶＩＩＩの半減期を増加させるためのさらにより良好なアプローチの必要性がまだなお存在する。半減期を延長したフォン・ビルブラント因子分子へのＦＶＩＩＩ分子の共有結合が、ＦＶＩＩＩ部分に半減期延長をもたらし、その結果、その半減期が融合していない半減期延長フォン・ビルブラント因子分子と同様になるということが、本出願の発明者らに見出された。この方法を用いて、ラットＰＫモデルにおいて遊離ＦＶＩＩＩの約３倍の半減期延長が見られた。本発明は、フォン・ビルブラント因子又はその変異体（ＶＷＦ）と第ＶＩＩＩ因子との共有結合複合体、特に複合体でのＶＷＦ成分の半減期を増強するために使用する方法を提供し、これは出血障害の治療及び予防において有利である長い半減期を有する安定な複合体の供給を可能にする。

発明の要旨
第一の局面において、本発明は、フォン・ビルブラント因子又はその変異体（ＶＷＦ）及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）又はその変異体（第ＶＩＩＩ因子）を含む共有結合複合体に関し、ここで該複合体は、インビボで延長された半減期を有するように修飾されている。好ましくは、それは、半減期延長部分を含むように修飾されている。ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子は共有結合複合体を形成し；この複合体のいずれかの部分、好ましくはＶＷＦ部分に半減期延長部分が結合されている。好ましくは、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子は、直接共有結合により、例えばＶＷＦの一部であるシステインの第ＶＩＩＩ因子の一部であるシステインとのジスルフィド架橋を介して、又はＶＷＦを第ＶＩＩＩ因子と、場合によりペプチドリンカーを介して融合させることにより連結されるが、ただし、共有結合複合体は、Ｆｃ鎖の一方がＶＷＦに融合され、そして他方のＦｃ鎖がＦＶＩＩＩ又はその変異体に融合されているＦｃ融合タンパク質ではない。好ましくは、共有結合連結は、半減期延長部分によりもたらされるものではない。

第一の実施態様において、第ＶＩＩＩ因子は、ＶＷＦとジスルフィド架橋を形成するように修飾される（ただし、ジスルフィド架橋は、それぞれＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子に融合されているＦｃ分子の２鎖の間にはない）。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、天然に存在するアミノ酸のシステイン残基での置換により、又はＶＷＦ中のシステイン残基とジスルフィド形成するシステイン残基の挿入により修飾されている。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子において置換される天然に存在するアミノ酸は、ａ３ドメイン中のアミノ酸から選択され、又はシステイン残基は、ａ３ドメイン中に挿入される（配列番号６の残基１６４９〜１６８９）。より好ましくは、天然に存在するアミノ酸は酸性残基であり、好ましくは保存された酸性残基、又は出血性表現型に関与する残基、又はＦＶＩＩＩａ３ドメインにおいて硫酸化され得るＴｙｒ残基である。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子において置換される天然に存在するアミノ酸は、第ＶＩＩＩ因子ａ３ドメインのアミノ酸１６５３〜１６６０内若しくはアミノ酸１６６７〜１６７４内若しくはアミノ酸１６７５〜１６８８内に位置し、又はシステインは、第ＶＩＩＩ因子ａ３ドメインのアミノ酸１６５３〜１６６０若しくはアミノ酸１６６７〜１６７４若しくはアミノ酸１６７５〜１６８８の配列中に導入される。なおより好ましくは、システインで置換される第ＶＩＩＩ因子ａ３ドメイン中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号６中のＴ１６５３、Ｌ１６５５、Ｄ１６５８、Ｅ１６６０、Ｓ１６６９、Ｖ１６７０、Ｎ１６７２、Ｋ１６７３、Ｋ１６７４、Ｅ１６７５、Ｄ１６７６及び／若しくはＮ１６８５、又は第ＶＩＩＩ因子の遺伝子操作された形態における等価な位置から選択される。最も好ましくは、システインで置換されるａ３ドメイン中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号６中のＴ１６５４、Ｑ１６５６、Ｆ１６７７、Ｄ１６７８、Ｉ１６７９、Ｙ１６８０、Ｄ１６８１、Ｅ１６８２、Ｄ１６８３、Ｅ１６８４、Ｑ１６８６、Ｓ１６８７及び／若しくはＰ１６８８又は第ＶＩＩＩ因子の遺伝子操作された形態の等価な位置から選択される。

別の実施態様において、システイン残基はＣ末端ドメインに挿入されるか、又はシステイン残基で置換される天然に存在するアミノ酸は、第ＶＩＩＩ因子のＣ末端ドメインにあり、好ましくはこの残基は、配列番号６中のＩ２０９８、Ｓ２１１９、Ｎ２１２９、Ｒ２１５０、Ｐ２１５３、Ｗ２２２９、Ｑ２２４６又は第ＶＩＩＩ因子の操作された形態中の等価な位置から選択される。

本発明の第一の局面のさらなる好ましい実施態様において、ＶＷＦはまた、天然に存在するアミノ酸のシステイン残基での置換により、又は第ＶＩＩＩ因子中に導入されたシステイン残基とのジスルフィド架橋を形成するシステイン残基の挿入により修飾される。好ましくは、システイン残基はＤ’若しくはＤ３ドメインに挿入されるか（図２を参照のこと）、又はシステイン残基で置換されるＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、Ｄ’若しくはＤ３ドメイン中の残基又はＤ’若しくはＤ３ドメイン中の塩基性若しくは高度に保存された残基若しくはＮ−ＶＷＤ型に含まれる残基若しくはＶＷＦ分子の表面上の露出されたアミノ酸である。本発明の好ましい実施態様において、システイン残基は、ＴＩＬ’ドメイン、Ｅ’ドメイン、ＶＷＤ３ドメイン、Ｃ８−３ドメイン、ＴＩＬ−３ドメイン若しくはＥ−３ドメイン中に挿入されるか、又はシステイン残基で置換されるＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、ＴＩＬ’ドメイン、Ｅ’ドメイン、ＶＷＤ３ドメイン、Ｃ８−３ドメイン、ＴＩＬ−３ドメイン若しくはＥ−３ドメイン中の残基である（全てＺｈｏｕｅｔａｌ（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１２０（２）、４４９−４５８により定義されるとおり）。例えば、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、Ｋ７７３、Ｇ７８５、Ｅ７８７、Ａ／Ｔ７８９、Ｋ７９０、Ｔ７９１、Ｑ７９３、Ｎ７９４、Ｍ８００、Ｒ８２０、Ｒ８２６、Ｆ８３０、Ｈ８３１、Ｋ８３４、Ｅ８３５、Ｐ８３８、Ｋ８４３、Ｒ８５２、Ｒ８５４、Ｋ８５５、Ｗ８５６、Ｈ８６１、Ｈ８７４、Ｋ８８２、Ｌ８８４、Ｒ９０６、Ｋ９１２、Ｈ９１６、Ｋ９２０、Ｋ９２３、Ｒ９２４、Ｋ９４０、Ｒ９４５、Ｋ９４８、Ｈ９５２、Ｒ９６０、Ｋ９６８、Ｒ９７６、Ｈ９７７、Ｋ９８５、Ｋ９９１、Ｋ１０２６、Ｒ１０３５、Ｋ１０３６、Ｋ１０５２、Ｑ１０５３、Ｋ１０７３又はＨ１０７４から選択される。好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号２中のＹ７９５、Ｒ８１６、Ｈ８１７、Ｐ８２８、Ｄ８５３、Ｄ８７９、Ｋ９２２、Ｄ９５１、Ｅ１０７８、Ｅ１１６１、及び／若しくはＲ１２０４又はＶＷＦの操作された形態中の等価な位置から選択される。より好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号２のＲ７６８、Ｒ７８２、Ｈ８１７、Ｄ８５３、Ｅ９３３、Ｌ９８４、Ｅ１０１５、Ｄ１０７６、Ｅ１０７８、Ｐ１０７９、Ｋ１１１６及び／若しくはＮ１１３４又は例えばＶＷＦの操作された形態中の等価な位置から選択される。

より好ましくは、ＶＷＦ及びＦＶＩＩＩ中の天然に存在するアミノ酸残基の置換の以下の組み合わせのうちの１つ又はそれ以上が導入される：
Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｍ８００Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｐ８２８Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｄ８５３Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｒ９２４Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｄ８５３Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｙ１６６４Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｄ１６６５Ｃ、Ｒ８１６Ｃ：Ｄ１６６６Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６６６Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｄ１６６６Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｎ７９４Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｐ８２８Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｄ８７９ＣＥ１６７５Ｃ、Ｒ９２４Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｎ７９４Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｄ１６７８Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６７８Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｄ１６７８Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｍ８００Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｒ８５４Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｙ７９５Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｍ８００Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｒ８１６Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｒ８５４Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｙ７９５Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｒ８１６Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｐ８２８Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｒ８５４Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｑ１０５３Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ。

なおより好ましくは、ＶＷＦ及びＦＶＩＩＩ中の天然に存在するアミノ酸残基の置換の以下の組み合わせのうちの１つ又はそれ以上が導入される：
Ｆ１６７７Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｔ１６５４Ｃ：Ｒ７８２Ｃ、Ｅ１６７５Ｃ：Ｒ７８２Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｒ７８２Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｅ１６７５Ｃ：Ｈ８１６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｅ１６８２Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｐ８２８Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｄ８５３Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｄ８５３Ｃ、Ｔ１６５４Ｃ：Ｄ８７９Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｅ９３３Ｃ、Ｐ１６８８：Ｔ９５１Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｔ１６５４Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｓ１６６９Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｄ１６８３Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｓ１６６９Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｖ１６７０Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｎ１６７２Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｄ１６７８Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｅ１６８４Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｆ１６７７Ｃ：Ｖ１０２７Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｖ１０２７Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｖ１０２７Ｃ、Ｓ１６５７Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｆ１６７７Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｅ１６８２Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｄ１６８３Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｅ１０７８Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｅ１０７８Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｅ１０７８Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｓ１６５７Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｄ１６５８Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｅ１６８２Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｖ１６７０Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｄ１６７８Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｄ１６８１Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｅ１６６０Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｄ１６７８Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｄ１６８３Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｅ１６８４Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｋ１６７４Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｅ１６８４Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｒ１２０４Ｃ。

最も好ましくは、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸残基の置換の以下の組み合わせのうちの１つ又はそれ以上が導入される：
Ｔ１６５４：Ｐ１０７９、Ｔ１６５４：Ｎ１１３４、Ｑ１６５６：Ｄ１０７６、Ｆ１６７７：Ｋ１１１６、Ｄ１６７８：Ｒ７８２、Ｉ１６７９：Ｋ１１１６、Ｙ１６８０：Ｈ８１７、Ｙ１６８０：Ｄ８５３、Ｙ１６８０：Ｅ１０７８、Ｄ１６８１：Ｒ７６８、Ｅ１６８２：Ｒ７６８、Ｄ１６８３：Ｒ７６８、Ｅ１６８４：Ｒ７６８、Ｑ１６８６：Ｒ７６８、Ｑ１６８６：Ｅ１０１５、Ｓ１６８７：Ｒ７６８、Ｓ１６８７：Ｎ１１３４、Ｐ１６８８：Ｒ７６８、Ｐ１６８８：Ｈ８１７、Ｐ１６８８：Ｅ９３３、Ｐ１６８８：Ｌ９８４、Ｐ１６８８：Ｅ１０１５、Ｐ１６８８：Ｄ１０７６及びＰ１６８８：Ｎ１１３４。

好ましくは、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子中の１つ又はそれ以上の挿入されたシステイン残基の組み合わせの天然に存在するアミノ酸は、実施例６において示され実験的に評価されるＶＷＦに対して共有結合で結合された第ＶＩＩＩ因子の０．５より高い相対比率、及び実施例９において示され実験的に評価される第ＶＩＩＩ因子の活性により選択される。最も好ましくは、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子中の１つ又はそれ以上の挿入されたシステイン残基の組み合わせの天然に存在するアミノ酸は、１．０より高い上記比率により選択される。

好ましくは、本発明の複合体中の第ＶＩＩＩ因子は、遺伝子操作された第ＶＩＩＩ因子である。操作された第ＶＩＩＩ因子は、部分的又は完全なＢドメイン欠失を有し得、これは１つ若しくはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失若しくはそれらの組み合わせを含む変異した第ＶＩＩＩ因子であってもよく、又は半減期延長部分を有する融合ポリペプチド若しくは化学的に修飾された、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）ポリマー若しくはヒアルロン酸のような半減期延長部分の結合により修飾された第ＶＩＩＩ因子であってもよい。

好ましい実施態様において、本発明の複合体中のＶＷＦは、ＶＷＦの半減期を延長された形態であり、好ましくはＶＷＦの遺伝子操作された形態である。より好ましくは、遺伝子操作されたＶＷＦは、半減期延長部分とのＶＷＦの融合タンパク質である。好ましくは、半減期延長部分は半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）であり、より好ましくは、ＨＬＥＰは、アルブミン又はそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及びその部分、例えばＦｃフラグメント、大きい流体力学的体積を有する溶媒和されたランダム鎖（例えばＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．２００９）、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）又はプロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ））、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される。別の好ましい実施態様において、複合体のＶＷＦはダイマーとして発現される。さらなる好ましい実施態様において、複合体のＶＷＦはマルチマーを形成する。

本発明の別の実施態様において、本発明の複合体の半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ））、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ））、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）ポリマー、又はヒアルロン酸の結合により延長される。

本発明の第二の実施態様は、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子を含む共有結合複合体であり、ここで該複合体は、インビボで延長された半減期を有するように修飾され、そしてここで第ＶＩＩＩ因子は、１つ又はそれ以上のＶＷＦドメインを含むように修飾されている。好ましくは、複合体の延長された半減期は、複合体においてＶＷＦの半減期延長形態を使用することにより得られる。

好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、ＶＷＦのＣの末端ドメインの１つ又はそれ以上と融合され（図４を参照のこと）、好ましくは、ＶＷＦの１つ又はそれ以上のＣ末端ドメインは第ＶＩＩＩ因子のＣの末端に融合されている。このようなＶＷＦのＣ末端ドメインは、ＶＷＦのＣ末端システインノット（ＣＫ）ドメインを含み、そしてさらに、Ｃ又はＣＫドメインに加えて、ＶＷＦの１つ又はそれ以上のさらなるドメイン、例えばＡ又はＤドメインを含んでいてもよい。より好ましくは、ＦＶＩＩＩは、好ましくはそのＣ末端に、配列番号２の残基２７２３−２８１３、２７２４−２８１３、２７２２−２８１３、２５７８−２８１３、２５８０−２８１３、２４９７−２８１３、２４２９−２８１３、２４００−２８１３、２３３４−２８１３、２２５５−２８１３、１８７３−２８１３、１６８３−２８１３、１２７７−２８１３、１２６４−２８１３若しくは７６４−２８１３又はその変異体を含むが、ただしシステイン残基２７７３（又はその等価物）は保存されている。

好ましくは、上に開示されるさらなるＶＷＦドメインを場合により含む、ＶＷＦのＣ末端ＣＫドメインは、切断可能なリンカーによりＦＶＩＩＩに結合される。より好ましくは、切断可能なリンカーは、血液凝固に関連するプロテアーゼにより切断可能な切断部位を含み、なおより好ましくは、切断可能なリンカーは、トロンビン切断部位、好ましくはＦＶＩＩＩのトロンビン切断部位のうちの１つを含む。好ましくは、リンカー配列はまた、さらなるアミノ酸残基も含み、好ましくは、さらなるアミノ酸残基は、ＶＷＦのＣ末端ドメインとリンカーの切断可能部分との間に挿入される。好ましくは、さらなるアミノ酸残基は、それぞれＦＶＩＩＩのａ３領域及びＶＷＦのＤ’Ｄ３領域を介してＦＶＩＩＩとＶＷＦとの相互作用を可能にするために十分な長さのペプチドを提供する。さらなるアミノ酸残基は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０または１５０アミノ酸より多くてもよい。好ましくは、さらなるアミノ酸残機は可動性の「非構造的」ペプチドを形成し、そしてより好ましくは、グリシン−セリン反復、プロリン−アラニン−セリン反復、ホモアミノ酸反復、又はＦＶＩＩＩＢドメインの配列を含むか、またはこれらからなる。

別の実施態様において、第ＶＩＩＩ因子は、ＶＷＦのＣ末端ドメインの１つ又はそれ以上とＮ末端で融合される。このようなＣ末端ドメインは、ＶＷＦのＣ末端システインノット（ＣＫ）ドメインから誘導され得、そしてＶＷＦの１つ又はそれ以上のさらなるドメインをさらに含み得る。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、好ましくはそのＮ末端に、配列番号２の残基２７２３−２８１３、２７２４−２８１３、２７２２−２８１３、２５８０−２８１３、２５７８−２８１３、２４９７−２８１３、２４２９−２８１３、２４００−２８１３、２３３４−２８１３、２２５５−２８１３、１８７３−２８１３、１６８３−２８１３、１２７７−２８１３、１２６４−２８１３若しくは７６４−２８１３又はその変異体を含むが、ただしシステイン残基２７７３（又はその等価物）は保存される。これらの実施態様について、発現産物は、Ｎ末端からＣ末端に、シグナルペプチド、ＶＷＦのＣＫドメインを、場合によりＶＷＦのさらなるドメインとともに、好ましくは切断可能な（場合により可動性の）リンカー、及び第ＶＩＩＩ因子を含む。

本発明の別の実施態様はＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子を含む共有結合複合体であり、ここでＶＷＦはＶＷＦの半減期延長形態であり、そしてここで第ＶＩＩＩ因子は、ＶＷＦのＤ’Ｄ３若しくはＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３領域、又は野生型フォン・ビルブラント因子のＦＶＩＩＩ結合活性の少なくとも１０％を維持するそのフラグメントを含むように修飾されている。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、その部分的又は完全なＢドメインがＶＷＦＤ’Ｄ３領域又はそのフラグメントで置き換えられるように修飾される（図５を参照のこと）。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、好ましくはその（又はその一部）のＢドメインの代わりに、それぞれ配列番号２の残基７６４〜１２４１、７６４〜１２４２、７６４〜１２４７、７６４〜１２７０若しくは７６４と１２４１〜１２７０との間のいずれかの配列、又はその変異体若しくはフラグメントを含む。

好ましい実施態様において、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、細胞培養培地中への分子の分泌の際に２鎖分子が生成され、そしてＤ’Ｄ３ドメインが第ＶＩＩＩ因子軽鎖のＮ末端に位置するように、第ＶＩＩＩ因子に結合される。これは、例えば、第ＶＩＩＩ因子ａ２ドメイン又はＢドメインの残りとＶＷＦＤ’Ｄ３ドメインとの間にＰＡＣＥ／フリンのための切断部位を含む切断可能なリンカーを導入することにより達成され得る（図５ｄ及びｅ）。好ましくは、リンカーは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインと第ＶＩＩＩ因子ａ３ドメインとの間にさらなる残基を含み、さらなる残基は、それぞれａ３及びＤ’Ｄ３ドメインを介して第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの分子内相互作用を可能にするために充分な長さのペプチドを含む（図５ｅ）。好ましくは、さらなる残基は、２００未満のアミノ酸、より好ましくは１００未満のアミノ酸、なおより好ましくは９０、８０、７０、６０、５０未満のアミノ酸、４０未満のアミノ酸、３０未満のアミノ酸、２０未満のアミノ酸、最も好ましくは１０未満のアミノ酸を含む。好ましくは、さらなる残基は、可動性の「非構造的」ペプチドを含み、より好ましくは、これらはグリシン−セリン反復、プロリン−アラニン−セリン反復又はホモアミノ酸反復を含むか、又はこれらからなる。記載されるような成熟形態得るために発現させようとするタンパク質は、さらなる配列、例えばＮ末端におけるシグナル配列を含むように構築され得る。

あるいは、第ＶＩＩＩ因子のＮ末端は、ＶＷＦＤ’Ｄ３ドメイン又はそのフラグメントのＣ末端に接続され、これは好ましくはＶＷＦのさらなるドメイン（例えば、Ｄ１及びＤ２ドメイン）によりＮ末端で延長される；これは、半減期延長ＶＷＦとの共有結合の発現及び細胞内形成を補助する。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、配列番号２の残基１〜１２４１若しくは残基７６４〜１２４１（プロペプチドの切断後）又はその変異体若しくはフラグメントをＮ末端に含む。

好ましくは、ＶＷＦのそれぞれＤ’Ｄ３又はＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインは、切断可能なリンカーにより第ＶＩＩＩ因子のＮ末端に結合される。より好ましくは、切断可能なリンカーは、血液凝固に関連するプロテアーゼにより切断可能な切断部位を含み、なおより好ましくは、切断可能なリンカーは、トロンビン切断部位、好ましくはＦＶＩＩＩのトロンビン切断部位のうちの１つを含む。好ましくは、リンカーは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３又はＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインと第ＶＩＩＩ因子分子との間にさらなる残基を含み、さらなる残基は、それぞれａ３及びＤ’Ｄ３領域を介して第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの相互作用を可能にするために十分な長さのペプチドを含む（図５ｅ）。好ましくは、２０、３０、５０、１００、又は１５０より多いさらなるアミノ酸が加えられる。好ましくは、さらなるアミノ酸は、可動性の非構造的ペプチドを含み、より好ましくは、それらはグリシン−セリン反復、プロリン−アラニン−セリン反復、ホモアミノ酸反復、又はＦＶＩＩＩＢドメインの配列を含むか又はこれらからなる。

さらに、上記のようなリンカーを介してＦＶＩＩＩのＮ末端に融合されたＶＷＦのＤ’Ｄ３又はＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインは、さらなるＶＷＦ関連官能基が構築物中に加入されるならば、ＶＷＦに由来するさらなるＶＷＦドメインによりＤ３と記載されるリンカーとの間で延長され得る。

本発明の第二の局面は、上記の第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦの共有結合複合体を製造する方法であり、該方法は、第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦ分子を真核生物細胞株において同時発現させること（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）を含む。好ましくは、真核生物細胞株は、効率的なプロセシングを確実にするためにＰＡＣＥ／フリンを発現するように修飾される。あるいは、タンパク質（第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦ）は、別々に製造され、次いで例えばジスルフィド架橋形成を可能にするための穏やかな酸化環境で、インビトロで混合され得るが、第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦの機能性はインタクトなままにする。

本発明のこの局面の別の実施態様において、（修飾された）第ＶＩＩＩ因子及び（修飾された）ＶＷＦは、化学的架橋により共有結合で接続される（図７を参照のこと）。

本発明の第三の局面は、薬剤における使用のため、好ましくは出血障害の処置又は予防における使用のための、上記共有結合複合体である。好ましくは、出血障害は血友病Ａ又はＶＷＤである。

本発明の第四の局面は、上記共有結合複合体を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる局面は、有効量の上記複合体を、それを必要とする被験体に投与することにより出血障害を処置又は予防する方法である。

発明の詳細な説明
上述のように、血友病、特に血友病Ａを有する患者の慢性処置のために、長い半減期を有するＦＶＩＩＩを有することは非常に有益だろう。本発明者らは、今や驚くべきことに、ＦＶＩＩＩにより長い半減期をもたらすフォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）及びＦＶＩＩＩの共有結合複合体が製造され得るということを見出した。特に複合体がその半減期をインビボで延長するように修飾される場合、例えばＶＷＦ又はＦＶＩＩＩの半減期延長形態が使用される場合、ＦＶＩＩＩの半減期は有意に増強され、これを、血友病Ａのような出血障害を有する患者の改善された予防及び処置のための魅力的なアプローチにする。好ましくは、インビボ回収もまたこのアプローチにより増加され得る。

従って、第一の局面において、本発明は、フォン・ビルブラント因子又はその変異体（ＶＷＦ）及び第ＶＩＩＩ因子又はその変異体（第ＶＩＩＩ因子）を含む共有結合複合体に関し、ここで複合体は、インビボで延長された半減期を有するように修飾されている。例えば、ＶＷＦは、ＶＷＦの半減期延長形態であり得；あるいは（又はさらに）、第ＶＩＩＩ因子はＶＩＩＩの半減期延長形態であり得、又は半減期延長部分が、リンカーを介して共有結合複合体に結合され得る。好ましくは、複合体中のＶＷＦは半減期延長部分を含む。好ましくは、共有結合複合体は、一方のＦｃモノマーがＶＷＦに連結され、かつ他方のＦｃモノマーが第ＶＩＩＩ因子に連結されたヘテロダイマーＦｃ融合物ではない。より好ましくは、共有結合連結は半減期延長部分によりもたらされるものではない。

本明細書で使用される用語「フォン・ビルブラント（ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子」又は「ＶＷＦ」は、フォン・ビルブラント因子の少なくとも一部の活性が保持されている限り、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、少数若しくは多数の欠失（例えば、１つ又はそれ以上のドメインの欠失）を含むＶＷＦ、又は別のペプチド若しくはタンパク質部分、例えば半減期を増加するポリペプチド、もしくは非タンパク質部分とのその融合タンパク質のような変異体を含む、野生型ＶＷＦの生物学的活性を有するいずれかのポリペプチドを指す。ＶＷＦ活性はコラーゲン結合活性、及び／又は血小板結合活性、及び／又はＦＶＩＩＩ結合活性であり得る。ＦＶＩＩＩ結合活性は、ＶＷＦ上の結合部位を介して共有結合で結合されたＦＶＩＩＩを用いずにＶＷＦについて決定されるだろう。ＶＷＦ活性を測定するためにアッセイは十分に確立されており、例えばコラーゲン結合アッセイ、リストセチン（Ｒｉｓｔｏｃｅｔｉｎ）補因子活性アッセイ、又はＦＶＩＩＩ結合アッセイである。生物学的活性は、欠失及び／又は他の修飾を含むＶＷＦが野生型ＶＷＦについて測定されたいずれかの活性の少なくとも１０％、好ましくは１５％、２０％、２５％、又は３０％、より好ましくは少なくとも４０％又は５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、７０％又は７５％を保持する場合に、本発明の意味では保持されている。用語「第ＶＩＩＩ因子結合ドメイン」は、野生型フォン・ビルブラント因子の第ＶＩＩＩ因子結合活性の少なくとも１０％、好ましくは１５％、２０％、２５％、又は３０％、より好ましくは少なくとも４０％又は５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、７０％又は７５％を保持するＶＷＦのフラグメント又は部分を指す。第ＶＩＩＩ因子結合ドメインは、成熟ＶＷＦのＮ末端、例えばＤ’Ｄ３ドメイン又はそのフラグメントに位置する。

野生型フォン・ビルブラント因子をコードする遺伝子は９ｋｂｍＲＮＡに転写され、これが３１０，０００Ｄａの推定分子量を有する２８１３アミノ酸のプレプロポリペプチドに翻訳される。プレプロポリペプチドは、２２アミノ酸長のシグナルペプチド、７４１アミノ酸のプロポリペプチド及び成熟サブユニットを含む。Ｎ末端からの７４１アミノ酸長のプロポリペプチドの切断は、２０５０アミノ酸からなる成熟ＶＷＦを生じる。ＶＷＦプレプロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示し、そしていくつかの変異体が公開されている（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５４３．２）。ＶＷＦ分子が配列番号２の全ての残基を含む必要はないが、別の指示がなければ、本出願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸番号付けは配列番号２を参照する。成熟野生型ＶＷＦのアミノ酸配列は、配列番号２の残基７６４〜２８１３に対応する。本明細書で使用される用語「ＶＷＦ」は、上述のいずれか１つのＶＷＦ機能のうちの少なくとも部分的なＶＷＦ活性を示すＶＷＦのいずれかの形態又はその変異体を指す。

野生型ＶＷＦのプロポリペプチドは、以下の順序で配置された多数のドメインを含む（ＳｃｈｎｅｐｐｅｎｈｅｉｍａｎｄＢｕｄｄｅ（２０１１）ＪＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ９（Ｓｕｐｐｌ．１）２０９−２１５に従うプロ−ＶＷＦドメインＤ１〜Ｄ４のドメイン構造、Ｚｈｏｕｅｔａｌ（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１２０、４４９−４５８に従うＣドメインのドメイン構造及び命名法）：
Ｄ１−Ｄ２−Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４− Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ
Ｄ１及びＤ２ドメインは、切除されて成熟ＶＷＦを生じるプロペプチドに相当する。、Ｄ’ドメインは配列番号２のアミノ酸７６４〜８６５を包含し；Ｄ’Ｄ３ドメインは、配列番号の２それぞれアミノ酸７６４〜１２４１、７６４〜１２４２、７６４〜１２４７、若しくは７６４〜１２７０、又は７６４と１２４１〜１２７０との間のいずれかの配列を包含する。カルボキシ末端の９０残基は、タンパク質の「シスチンノット」スーパーファミリーに相同な「ＣＫ」ドメインを含む。これらのファミリーメンバーは、ジスルフィド結合を通して二量体化する傾向を有する。Ｚｈｏｕらにより定義されるＣ末端ドメインＣ１〜Ｃ６は、配列番号２における残基２２５５〜２３３３（Ｃ１）、２３３４〜約２４０２（Ｃ２）、２４２９〜２４９６（Ｃ３）、２４９７〜２５７７（Ｃ４）、２５７８〜２６４６（Ｃ５）、及び２６４７〜２７２２（Ｃ６）に対応する。

野生型フォン・ビルブラント因子は、配列番号２に示される成熟フォン・ビルブラント因子のアミノ酸配列、残基７６４〜２８１３を含む。ＶＷＦの生物学的活性が保持される限り、ＶＷＦの付加、挿入、Ｎ末端、ＣＫ末端又は内部欠失も包含される。欠失及び／又は他の修飾を含むＶＷＦが、野生型ＶＷＦについて測定されたいずれかの活性の少なくとも１０％、好ましくは１５％、２０％、２５％、又は３０％、より好ましくは少なくとも４０％又は５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、７０％又は７５％を保持する場合、本発明の意味で生物学的活性は保持される。野生型ＶＷＦの生物学的活性は、例えば、リストセチン補因子活性を測定するための方法（ＦｅｄｅｒｉｃｉＡＢｅｔａｌ．２００４．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ８９：７７−８５）、血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰＩｂαへのＶＷＦの結合（Ｓｕｃｋｅｒｅｔａｌ．２００６．ＣｌｉｎＡｐｐｌＴｈｒｏｍｂＨｅｍｏｓｔ．１２：３０５−３１０）、又はコラーゲン結合アッセイ（Ｋａｌｌａｓ＆Ｔａｌｐｓｅｐ．２００１．ＡｎｎａｌｓｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ８０：４６６−４７１）、又は例えば表面プラズモン共鳴によるコラーゲン結合の測定を使用して、当業者により決定され得る。使用され得るＶＷＦの生物学的活性を決定する他の方法は、ＦＶＩＩＩ結合能の決定を含む（Ｖｅｙｒａｄｉｅｒｅｔａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ２０１１）。

用語「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」は本明細書において交換可能に使用される。「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」又は「第ＶＩＩＩ因子」は、野生型血液凝固ＦＶＩＩＩに加えて、野生型血液凝固ＦＶＩＩＩのプロコアグラント活性が少なくとも部分的に保持されている野生型血液凝固ＦＶＩＩＩの誘導体又は変異体も含む。誘導体は、野生型ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列と比較して、Ｂドメイン若しくはＢドメインの一部の欠失のような欠失、挿入及び／又は付加を有し得る。用語第ＶＩＩＩ因子は、重鎖及び軽鎖を含むＦＶＩＩＩのタンパク質分解でプロセシングした形態、例えば、活性化前の２鎖形態、さらには未切断の単鎖第ＶＩＩＩ因子を含む。

用語「第ＶＩＩＩ因子」は、野生型ＦＶＩＩＩの生物学的活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％又は２５％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％又は５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、７０％又は７５％を保持するいずれかのＦＶＩＩＩの変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）又は変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）を含む。

ＦＶＩＩＩを、約２８０ｋＤａの分子量を有する単一ポリペプチド鎖として合成する。アミノ末端シグナルペプチドは、小胞体中へのＦＶＩＩＩの転位の際に除去され、次いで、成熟（すなわち、シグナルペプチドの切断後）ネイティブＦＶＩＩＩ分子が、Ｂドメインとａ３ドメインとの間又はＢドメイン内でその分泌の過程でタンパク質分解的に切断される。これは、約９０〜２００ｋＤａのＮ末端重鎖フラグメントと金属イオン依存性結合した約８０ｋＤａのＣ末端軽鎖からなるヘテロダイマーの放出を生じる（Ｋａｕｆｍａｎ、ＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎＭｅｄ．Ｒｅｖｓ．６：２３５（１９９２）による概説も参照のこと）。

ヘテロダイマーの生理的活性化は、トロンビンによるタンパク質鎖のタンパク質分解切断により起こる。トロンビンは、重鎖を切断して９０ｋＤａタンパク質にし、次いで５４ｋＤａ及び４４ｋＤａのフラグメントにする。トロンビンはまた、８０ｋＤａ軽鎖を切断して７２ｋＤａのタンパク質にする。活性ＦＶＩＩＩを構成するのは、カルシウムイオンにより結び付けられた、後者のタンパク質及び重鎖フラグメント（上の５４ｋＤａ及び４４ｋＤａ）である。４４ｋＤａＡ２重鎖フラグメントが分子から解離する場合、又は７２ｋＤａ及び５４ｋＤａのタンパク質がトロンビン、活性化タンパク質Ｃ若しくはＦＸａによりさらに切断される場合に、不活化が起こる。血漿において、ＦＶＩＩＩは、約５０倍モル過剰のフォン・ビルブラント因子タンパク質（「ＶＷＦ」）との結合により安定化され、これが上記のようなＦＶＩＩＩのタンパク質分解を阻害するようである。

ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、３つの構造的ドメインに体系付けられる：それぞれ３３０アミノ酸の三重のＡドメイン、９８０アミノ酸の単一のＢドメイン、及びそれぞれ１５０アミノ酸の二重のＣドメイン。Ｂドメインは、他のタンパク質に対して相同性を有しておらず、そしてこのタンパク質の２５の潜在的なアスパラギン（Ｎ）連結グリコシル化部位のうちの１８を提供する。Ｂドメインは凝固において機能を有していないようであり、Ｂドメインを除去されたＦＶＩＩＩ分子がなお凝固促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒｙ）活性を有したまま除去され得る。

非限定的な例として、本明細書において使用される第ＶＩＩＩ因子は、減少若しくは妨げられたＡＰＣ切断をもたらすＦＶＩＩＩ変異体（Ａｍａｎｏ１９９８．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：５５７−５６３）、さらに安定化されたＡ２ドメインを有するＦＶＩＩＩ変異体（ＷＯ９７／４０１４５）、増加した発現を生じるＦＶＩＩＩ変異体（Ｓｗａｒｏｏｐｅｔａｌ．１９９７．ＪＢＣ２７２：２４１２１−２４１２４）、減少した免疫原性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｌｏｌｌａｒ１９９９．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５０５−５０８）、独立して発現された重鎖及び軽鎖から再構成されたＦＶＩＩＩ（Ｏｈｅｔａｌ．１９９９．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３１：９５−１００）、ＨＳＰＧのようなＦＶＩＩＩの異化を生じる受容体への減少した結合を有するＦＶＩＩＩ変異体（ｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）及び／又はＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）（Ａｎａｎｙｅｖａｅｔａｌ．２００１．ＴＣＭ、１１：２５１−２５７）、ジスルフィド結合を安定化されたＦＶＩＩＩ変異体（Ｇａｌｅｅｔａｌ．、２００６．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．４：１３１５−１３２２）、改善された分泌特性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｍｉａｏｅｔａｌ．、２００４．Ｂｌｏｏｄ１０３：３４１２−３４１９）、増加した補因子特異的活性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉｅｔａｌ．、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４４：１０２９８−３０４）、改善された生合成及び分泌、減少したＥＲシャペロン相互作用、改善されたＥＲ−ゴルジ輸送、不活化に対する増加した活性化又は抵抗性及び改善された半減期を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｐｉｐｅ２００４．Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３０：２２７−２３７により要約される）、並びにフリンにより切断不可能な１本鎖ＦＶＩＩＩ変異体を含む。これらのＦＶＩＩＩ変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）及び変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）は全てそれら全体で参照により本明細書に加入される。

好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、配列番号６に示されるＦＶＩＩＩの全長配列を含み、より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、Ｂドメインの部分的又は完全な欠失を有するＦＶＩＩＩの変異体である。ＦＶＩＩＩの生物学的活性が少なくとも部分的に保持されている限り、ＦＶＩＩＩの付加、挿入、置換、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部の欠失も包含される。生物学的活性は、修飾を含むＦＶＩＩＩが野生型ＦＶＩＩＩの生物学的活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％又は２５％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％又は５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、７０％又は７５％も保持する場合に、本発明の意味で保持されている。第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性は以下に記載される熟練工（ａｒｔｉｓａｎ）により決定され得る。

第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を決定するための適切な試験は、例えば、段階凝固アッセイ（Ｒｉｚｚａｅｔａｌ．１９８２．ＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎａｓｓａｙｏｆＦＶＩＩＩ：ＣａｎｄＦＩＸａｉｎＢｌｏｏｍｅｄ．ＴｈｅＨｅｍｏｐｈｉｌｉａｓ．ＮＹＣｈｕｒｃｈｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ１９９２）又は発色性（２段階）基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイ（Ｓ．Ｒｏｓｅｎ、１９８４．ＳｃａｎｄＪＨａｅｍａｔｏｌ３３：１３９−１４５、ｓｕｐｐｌ．）である。これらの参考文献の内容は、参照により本明細書に加入される。

ヒト血液凝固ＦＶＩＩＩの成熟野生型形態のアミノ酸配列を配列番号６に示す。特定の配列のアミノ酸位置の言及は、ＦＶＩＩＩ野生型タンパク質におけるそのアミノ酸の位置を意味し、かつ言及される配列における他の位置での変異、例えば欠失、挿入及び／又は置換の存在を排除するものではない。例えば、配列番号６を参照して残基２００４の変異は、修飾されたホモログにおいて配列番号６の位置１〜２３３２における１つ又はそれ以上のアミノ酸が欠けているということを除外しない。

上記定義内の「第ＶＩＩＩ因子」及び／又は「ＶＷＦ」はまた、個体ごとに存在及び発生し得る天然の対立遺伝子変異及び他の哺乳動物種由来のＦＶＩＩＩ、例えばブタＦＶＩＩＩも含む。上記定義内の「第ＶＩＩＩ因子」及び／又は「ＶＷＦ」はさらに、ＦＶＩＩＩ及び又はＶＷＦの変異体を含む。このような変異体は、野生型配列と１つ又はそれ以上のアミノ酸残基において異なる。このような差異の例としては、保存的アミノ酸置換、すなわち、類似した特徴を有するアミノ酸、例えば（１）小さいアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、及び（６）芳香族アミノ酸のグループ内での置換が挙げられ得る。このような保存的置換の例を以下の表１に示す。

ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦにおける用語「保存された残基」は、進化的に保存された残基に関連し、すなわち、ここでそれぞれの位置において、同一の残基又は保存的置換が少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの哺乳動物配列において見出される。

ＦＶＩＩＩ、ＶＷＦ又はそのドメインの用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、それぞれ配列番号６又は２において示される配列又は配列の関連する部分に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８２％、８４％、８５％、８６％、又は８８％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％の配列同一性を有するタンパク質又はドメインを指すが、ただし変異体は、それぞれタンパク質又はそのドメインの生物学的活性の、少なくとも１０％、好ましくは１５％、２０％、２５％、又は３０％、より好ましくは少なくとも４０％又は５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、７０％又は７５％を保持する。特定の位置は、その他の位置よりも変異に適しているかもしれないということが認識される。例えば、ＶＷＦのＣＫドメインの変異体は、位置２７７３（又はその等価物）においてシステインを保持している必要があり、これはダイマーの形成に必須であるようである。ＣＫドメイン中の他のシステイン残基（Ｚｈｏｕｅｔａｌ（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１２０、４４９−４５８）、及びＶＷＦの他のドメインそしてまたＦＶＩＩＩもまた必須であり得る。

配列同一性％を決定するために、適切な配列整列プログラム、例えばＧＣＧスイートのＧＡＰプログラムを使用して、デフォルトパラメーターを使用して配列を整列させる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ（１９８４）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ１２、３８７）。配列を整列させるために使用され得る他のプログラムとしては、ＦＡＳＴＡ（Ｌｉｐｍａｎ＆Ｐｅａｒｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７、１４３６−１４４１）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ（１９９０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５、４０３−４１０）、及びＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ（１９９４）ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ２２、４６７３−４６８０）が挙げられる。

本発明の一実施態様において、共有結合連結は、遺伝子操作によりＦＶＩＩＩに導入されるＦＶＩＩＩ中のシステイン残基と、野生型ＶＷＦ配列中に見出されるシステイン、又は遺伝子操作によりＶＷＦ配列中の適切な位置にも導入され得るシステイン残基との間のジスルフィド架橋により達成される。

本発明の１つの好ましい実施態様は、半減期を延長されたＶＷＦと第ＶＩＩＩ因子とを含む共有結合複合体に関し、ここで第ＶＩＩＩ因子は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸のシステイン残基での置換、又はＶＷＦ中のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成するＦＶＩＩＩ中の適切な位置における少なくとも１つのシステイン残基の挿入により修飾される（図３）。

従って、本発明によれば、複合体の第ＶＩＩＩ因子成分のアミノ酸配列は、配列番号６に示される野生型ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列と異なる。修飾された第ＶＩＩＩ因子は、少なくとも１つの変異、例えば天然に存在するアミノ酸のシステインでの置換、又は例えばＣ３ドメイン若しくはＣ末端ドメイン中の適切な位置でのシステイン残基の挿入を有する。従って、本発明の複合体の第ＶＩＩＩ因子において１つ又はそれ以上、例えば２、３、４、５、又はそれ以上のさらなるシステイン残基が存在し得；より好ましくは、１つ又は２つだけのさらなるシステイン残基が導入され、最も好ましくは、１つのさらなるシステイン残基が導入される。

より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子において置換される天然に存在するアミノ酸は、ａ３ドメイン中のアミノ酸である。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子中の置換される天然に存在するアミノ酸は、ＦＶＩＩＩａ３ドメインのアミノ酸１６５３〜１６６０内又はアミノ酸１６６７〜１６７４内又はアミノ酸１６７５〜１６８８内に位置する。より好ましくは、ａ３ドメイン中の天然に存在するアミノ酸は、酸性残基、好ましくは保存された酸性アミノ酸残基、又は出血性表現型に関与する残基、又はＦＶＩＩＩａ３ドメイン中の硫酸化され得るＴｙｒ残基である。なおより好ましくは、システインで置換されるａ３ドメイン中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号６中のＥ１６４９、Ｄ１６５８、Ｅ１６６０、Ｄ１６６３、Ｙ１６６４、Ｄ１６６５、Ｄ１６６６、Ｅ１６７１、Ｅ１６７５、Ｄ１６７６、Ｄ１６７８、Ｉ１６７９、Ｙ１６８０、Ｅ１６８２、Ｄ１６８３、Ｅ１６８４から、なおより好ましくはＴ１６５３、Ｌ１６５５、Ｄ１６５８、Ｅ１６６０、Ｓ１６６９、Ｖ１６７０、Ｎ１６７２、Ｋ１６７３、Ｋ１６７４、Ｅ１６７５、Ｄ１６７６及び／若しくはＮ１６８５又は例えば第ＶＩＩＩ因子の遺伝子操作された形態における等価な位置から選択される。最も好ましくは、システインで置換されるａ３ドメイン中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号６中のＴ１６５４、Ｑ１６５６、Ｆ１６７７、Ｄ１６７８、Ｉ１６７９、Ｙ１６８０、Ｄ１６８１、Ｅ１６８２、Ｄ１６８３、Ｅ１６８４、Ｑ１６８６、Ｓ１６８７及び／若しくはＰ１６８８又は例えばＦＶＩＩＩの遺伝子操作された形態中の等価な位置から選択される。

好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、実施例６に示される実験的に評価された共有結合で結合された第ＶＩＩＩ因子対ＶＷＦの０．５より高い相対比及び実施例９に示された実験的に評価された第ＶＩＩＩ因子の活性により選択される。最も好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、１．０より高い上記相対比で選択される。

本発明の第一の局面の別の好ましい実施態様において、システインで置換される天然に存在するアミノ酸は、ＦＶＩＩＩのＣ末端ドメインにあり、好ましくはアミノ酸２０５１と２２７０との間のＦＶＩＩＩ領域中のアミノ酸であり、より好ましくは残基は配列番号６中のＩ２０９８、Ｓ２１１９、Ｎ２１２９、Ｒ２１５０、Ｐ２１５３、Ｗ２２２９、Ｑ２２４６又は例えばＦＶＩＩＩの操作された形態中の等価な位置から選択される。

本発明の第一の局面のさらなる好ましい実施態様において、ＶＷＦは、システイン残基での天然に存在するアミノ酸の置換、又はシステイン残基の挿入によっても修飾され、これが第ＶＩＩＩ因子中に導入されたシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する。ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、Ｄ’若しくはＤ３領域内の残基、好ましくはＤ’若しくはＤ３領域中の塩基性残基、又はＤ’若しくはＤ３領域中の高度に保存された残基、又はＮ−ＶＷＤ型に関与する残基又はＶＷＦ分子の表面上に露出されたアミノ酸である。本発明の好ましい実施態様において、システイン残基は、ＴＩＬ’ドメイン、Ｅ’ドメイン、ＶＷＤ３ドメイン、Ｃ８−３ドメイン、ＴＩＬ−３ドメイン若しくはＥ−３ドメイン中に挿入され、又はシステイン残基で置換されるＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、ＴＩＬ’ドメイン、Ｅ’ドメイン、ＶＷＤ３ドメイン、Ｃ８−３ドメイン、ＴＩＬ−３ドメイン若しくはＥ−３ドメイン（Ｚｈｏｕｅｔａｌ（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１２０（２）４４９−４５８により定義されるドメイン）中の残基である。例えば、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、Ｒ７６８、Ｒ７８２、Ｒ８１６、Ｒ８２０、Ｒ８２６、Ｒ８５２、Ｒ８５４、Ｒ９０６、Ｒ９２４、Ｒ９４５、Ｒ９６０、Ｒ９７６、Ｒ１０３５、Ｈ８１７、Ｈ８３１、Ｈ８６１、Ｈ８７４、Ｈ９１６、Ｈ９５２、Ｈ９７７、Ｈ１０４７、Ｋ７７３、Ｋ７９０、Ｋ８３４、Ｋ８４３、Ｋ８５５、Ｋ８８２、Ｋ９１２、Ｋ９２０、Ｋ９２２、Ｋ９２３、Ｋ９４０、Ｋ９４８、Ｋ９６８、Ｋ９８５、Ｋ９９１、Ｋ１０２６、Ｋ１０３６、Ｋ１０５２、Ｋ１０７３、Ｇ７８５、Ｍ８００、Ｄ８７９、Ｑ１０５３、Ｅ１０７８、Ｅ７８７、Ａ７８９、Ｔ７８９、Ｔ７９１、Ｑ７９３、Ｎ７９４、Ｙ７９５、Ｐ８２８、Ｆ８３０、Ｅ８３５、Ｐ８３８、Ｄ８５３、Ｗ８５６、Ｌ８８４から選択される。好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号２中のＴ７９５、Ｒ８１６、Ｄ８７９、Ｄ９５１、Ｅ１１６１、及び／若しくはＲ１２０４又は例えばＶＷＦの操作された形態中の等価な位置から選択される。より好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、配列番号２中のＲ７６８、Ｒ７８２、Ｈ８１７、Ｄ８５３、Ｅ９３３、Ｌ９８４、Ｅ１０１５、Ｄ１０７６、Ｅ１０７８、Ｐ１０７９、Ｋ１１１６及び／若しくはＮ１１３４又は例えばＶＷＦの操作された形態中の等価な位置から選択される。

好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、実施例６に示される実験的に評価された共有結合で結合されたＦＶＩＩＩ対ＶＷＦの０．５より高い相対比、及び実施例９に示される実験的に評価された第ＶＩＩＩ因子の活性により選択される。最も好ましくは、ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸は、１．０より高い上記比率により選択される。

好ましくは、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸残基の置換の以下の組み合わせの１つ又はそれ以上が導入される：
Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｍ８００Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｐ８２８Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｄ８５３Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｒ９２４Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｄ１６５８Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｄ８５３Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｄ１６６３Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｙ１６６４Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｄ１６６５Ｃ、Ｒ８１６Ｃ：Ｄ１６６６Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６６６Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｄ１６６６Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｅ１６７１Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｎ７９４Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｐ８２８Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｄ８７９ＣＥ１６７５Ｃ、Ｒ９２４Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ｅ１０７８Ｃ：Ｅ１６７５Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｎ７９４Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｄ１６７６Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｄ１６７８Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｄ１６７８Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｄ１６７８Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｍ８００Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｒ８５４Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｉ１６７９Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｔ７９１Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｙ７９５Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｍ８００Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｒ８１６Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｆ８３０Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｒ８５４Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｙ１６８０Ｃ、Ａ／Ｔ７８９Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｙ７９５Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｒ８１６Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｐ８２８Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｅ８３５Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｐ８３８Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｒ８５４Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｄ８７９Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ、Ｑ１０５３Ｃ：Ｅ１６８２Ｃ。

ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸残基の置換の以下の組わせのうちの１つ又はそれ以上が導入される：
Ｆ１６７７Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｒ７６８Ｃ、Ｔ１６５４Ｃ：Ｒ７８２Ｃ、Ｅ１６７５Ｃ：Ｒ７８２Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｒ７８２Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｙ７９５Ｃ、Ｅ１６７５Ｃ：Ｈ８１６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｅ１６８２Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｒ８１６Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｈ８１７Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｐ８２８Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｄ８５３Ｃ、Ｎ１６８５Ｃ：Ｄ８５３Ｃ、Ｔ１６５４Ｃ：Ｄ８７９Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｅ９３３Ｃ、Ｐ１６８８：Ｔ９５１Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｔ１６５４Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｓ１６６９Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｄ１６８３Ｃ：Ｌ９８４Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｓ１６６９Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｖ１６７０Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｎ１６７２Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｄ１６７８Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｅ１６８４Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｅ１０１５Ｃ、Ｆ１６７７Ｃ：Ｖ１０２７Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｖ１０２７Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｖ１０２７Ｃ、Ｓ１６５７Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｆ１６７７Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｅ１６８２Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｄ１６８３Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｄ１０７６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｅ１０７８Ｃ、Ｉ１６７９Ｃ：Ｅ１０７８Ｃ、Ｙ１６８０Ｃ：Ｅ１０７８Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｓ１６５７Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｄ１６５８Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｅ１６８２Ｃ：Ｐ１０７９Ｃ、Ｖ１６７０Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｋ１６７３Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｄ１６７８Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｄ１６８１Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｋ１１１６Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｅ１６６０Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｄ１６７８Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｄ１６８３Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｅ１６８４Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｑ１６８６Ｃ：Ｎ１１３４Ｃ、Ｔ１６５３Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｌ１６５５Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｋ１６７４Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｄ１６７６Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｅ１６８４Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｓ１６８７Ｃ：Ｅ１１６１Ｃ、Ｐ１６８８Ｃ：Ｒ１２０４Ｃ。

最も好ましくは、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸残基の置換の以下の組み合わせの１つ又はそれ以上が導入される：
Ｔ１６５４：Ｐ１０７９、Ｔ１６５４：Ｎ１１３４、Ｑ１６５６：Ｄ１０７６、Ｆ１６７７：Ｋ１１１６、Ｄ１６７８：Ｒ７８２、Ｉ１６７９：Ｋ１１１６、Ｙ１６８０：Ｈ８１７、Ｙ１６８０：Ｄ８５３、Ｙ１６８０：Ｅ１０７８、Ｄ１６８１：Ｒ７６８、Ｅ１６８２：Ｒ７６８、Ｄ１６８３：Ｒ７６８、Ｅ１６８４：Ｒ７６８、Ｑ１６８６：Ｒ７６８、Ｑ１６８６：Ｅ１０１５、Ｓ１６８７：Ｒ７６８、Ｓ１６８７：Ｎ１１３４、Ｐ１６８８：Ｒ７６８、Ｐ１６８８：Ｈ８１７、Ｐ１６８８：Ｅ９３３、Ｐ１６８８：Ｌ９８４、Ｐ１６８８：Ｅ１０１５、Ｐ１６８８：Ｄ１０７６及びＰ１６８８：Ｎ１１３４。

好ましくは、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子中の１つ又はそれ以上の挿入されたシステイン残基の組み合わせの天然に存在するアミノ酸は、実施例６に示される実験的に評価された共有結合で結合された第ＶＩＩＩ因子対ＶＷＦの０．５より高い相対比及び実施例９に示される実験的に評価された第ＶＩＩＩ因子の活性により選択される。最も好ましくは、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子中の１つ又はそれ以上の挿入されたシステイン残基の組み合わせの天然に存在するアミノ酸は１．０より高い上記比により選択される。

好ましくは、本発明の複合体中の第ＶＩＩＩ因子は、遺伝子操作された第ＶＩＩＩ因子である。操作された第ＶＩＩＩ因子は、部分的又は完全なＢドメイン欠失を含み得、これは１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失又はそれらの組み合わせを含む変異した第ＶＩＩＩ因子であっても、第ＶＩＩＩ因子の１本鎖バージョンであっても、半減期延長部分、例えば半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）との融合ポリペプチドであってもよい。また、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）ポリマー又はヒアルロン酸のような半減期延長部分の結合により、化学的に修飾された第ＶＩＩＩ因子であってもよい。これはまた、別の種、例えば別の哺乳動物種由来の第ＶＩＩＩ因子、例えばブタ第ＶＩＩＩ因子であってもよい。

好ましくは、本発明の複合体中のＶＷＦは、ＶＷＦの半減期延長形態である。

本明細書で使用される用語「半減期」は、それぞれのタンパク質の機能的半減期、すなわちインビボで、すなわち血中で活性の半分が失われるのにかかる時間を示す。

好ましい実施態様において、本発明の複合体中のＶＷＦの半減期延長形態は、ＶＷＦの遺伝子操作された形態である。より好ましくは、遺伝子操作されたＶＷＦは、半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）のような半減期延長部分とのＶＷＦの融合タンパク質である。

本明細書で使用される「半減期増強ポリペプチド」又は「半減期延長ポリペプチド」（ＨＬＥＰ）は、その半減期を延長するために、目的のタンパク質、特にＶＷＦに融合される部分である。好ましいＨＬＥＰは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンＧの定常領域及びそのフラグメント、生理的条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、さらには免疫グロブリン定常領域の一部に結合することができるポリペプチド若しくは脂質からなる群より選択される。凝固因子の治療活性又は生物学的活性を安定化又は延長することができるのは、本明細書に記載される全長半減期延長タンパク質（例えば、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、若しくは免疫グロブリンＧの定常領域）又はその１つ若しくはそれ以上のドメイン若しくはフラグメントであり得る。このようなフラグメントは、ＨＬＥＰフラグメントが野生型ＶＷＦ又は第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも２５％の機能的半減期延長を生じる限り、１０若しくはそれ以上のアミノ酸長から構成され得、又はＨＬＥＰ配列からの少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得、又はそれぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部若しくは全てを含み得る。

ＨＬＥＰはＨＬＥＰの変異体であり得る。用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」は、挿入、欠失及び保存的又は非保存的のいずれかの置換を含み、ここでこのような変化は、ＨＬＥＰの半減期延長特性が少なくとも部分的に維持されることを可能にする。

特に、本発明の提案されるＶＷＦＨＬＥＰ融合構築物は、ＨＬＥＰ及びＨＬＥＰのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含み得る。ＨＬＥＰは、いずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物ＨＬＥＰとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケが挙げられる。

好ましくは、半減期延長部分は、アルブミン又はその変異体若しくはフラグメント、免疫グロブリン定常領域又はその変異体及び部分、例えばＦｃフラグメント、大きい流体力学的体積を有する溶媒和されたランダム鎖（例えばＸＴＥＮ、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）又はプロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ））、アファミン又はその変異体、アルファ−フェトプロテイン又はその変異体、ビタミンＤ結合タンパク質又はその変異体、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される。最も好ましくは、ＨＬＥＰはヒト血清アルブミンである。

用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）及び「ヒトアルブミン」（ＨＡ）は、本出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広義であり、ヒト血清アルブミン（並びにそのフラグメント及び変異体）に加えて他の種由来のアルブミン（並びにそのフラグメント及び変異体）も包含する。

本明細書で使用される「アルブミン」は、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ又はそれ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）、例えばＣａ²⁺、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｚｎ²⁺イオン、脂肪酸、ホルモン、ビリルビンの結合又はＦｃＲｎへの結合を有するアルブミンフラグメント若しくは変異体を集合的に指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミン若しくはそのフラグメント、特に本明細書で配列番号７に示されるヒトアルブミンの成熟形態、又は他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはそのフラグメント、又はこれらの分子のアナログ若しくは変異体若しくはそのフラグメントを指す。

特に、本発明の提案されるＶＷＦ融合構築物は、ヒトアルブミンの天然に存在する多型変異体及びヒトアルブミンのフラグメントを含み得る。一般的に言えば、アルブミンフラグメント又は変異体は、少なくとも３０、最も好ましくは７０より多いアミノ酸長である。アルブミン変異体は、アルブミンの少なくとも１つのドメイン全体若しくは該ドメインのフラグメント、例えばドメイン１（配列番号７のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号７のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号７のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号７の１〜３８７）、２＋３（配列番号７の１９５〜５８５）又は１＋３（配列番号３のアミノ酸１〜１９４＋配列番号７のアミノ酸３８８〜５８５）から優先的に成るものであっても、あるいはこれらを含んでいてもよい。各ドメインは、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５及びＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含む可動性サブドメイン間リンカー領域と共に、それ自体２つの相同なサブドメイン、すなわち１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１及び５１２〜５８５から構成される。

本発明の複合体内のＶＷＦ融合構築物のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン又はそれらの保存的修飾を含み得る。

好ましい実施態様において、アルブミンのＮ末端は修飾されたＶＷＦのアミノ酸配列のＣ末端に融合される。すなわち、本発明の複合体は構造：
ｍＶＷＦ−Ｌ−Ａ
［ここでｍＶＷＦは本明細書上記の修飾されたＶＷＦであり、Ｌは任意のペプチドリンカー配列であり、そしてＡは本明細書の上で定義されるアルブミンである］
を含み得る。

本発明の修飾されたＶＷＦ又は修飾されたＶＷＦとのＦＶＩＩＩの複合体は、１つより多くのＨＬＥＰ配列、例えば２または３つのＨＬＥＰ配列を含み得る。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、縦一列に、例えば連続した反復として、ＶＷＦのＣ末端部分に融合され得る。

ＨＬＥＰはまた、ペプチドリンカーによりＶＷＦにカップリングされ得る。リンカーは非免疫原性であるべきであり、そして切断不可能なリンカーでも切断可能なリンカーでもよい。切断不可能なリンカーは、例えば、ＷＯ２００７／０９０５８４において例示されるように交互のグリシン及びセリン残基から構成され得る。

ＶＷＦ部分とＨＬＥＰ部分との間の可能なペプチドリンカーはまた、ペプチド配列から成るものであり得、これはヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然環境におけるこのようなペプチド配列はタンパク質表面の近くに位置し、そしてこの配列に対する自己寛容（ｎａｔｕｒａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ）が想定され得るように免疫系にアクセス可能である。例がＷＯ２００７／０９０５８４に示される。好ましくは、リンカー領域はＶＷＦの配列を含み、これは発現された融合タンパク質の新抗原特性の減少した危険性を生じるはずである。

切断可能なリンカーは、プロテアーゼによる切断を可能にするために十分可動性であるべきである。リンカーペプチドは、好ましくは凝固系のプロテアーゼ、例えばＦＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ及び／又はＦＶＩＩａにより切断可能である。

ＨＬＥＰはまた、非共有結合で半減期延長部分、例えばヒト血漿中に天然に存在するタンパク質（例えば、アルブミン、免疫グロブリン）に結合することができるペプチドであり得る。この場合、ＶＷＦは、好ましくはＤ’Ｄ３ドメインに対してＣ末端又はＮ末端に、半減期延長部分を結合するペプチドを保有するやり方で修飾されるだろう。

本発明の別の実施態様において、ＶＷＦの半減期は、化学的修飾、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー又はヒアルロン酸のような半減期延長部分の結合により延長される。

本発明の別の実施態様は、第ＶＩＩＩ因子と半減期を延長されたＶＷＦとの共有結合複合体であり、ここで第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子に付加されたさらなるペプチド又はポリペプチド配列を介してＶＷＦに接続される。好ましくは、付加された配列は１つ又はそれ以上のＶＷＦドメインを含む。

上述のように、小胞体での生合成の間、ＶＷＦプロペプチドモノマーは、Ｃ末端シスチンノットドメイン（ＣＫ）の間に形成されたＣ末端ジスルフィド架橋を介してダイマーへと組み立てられる。本発明者らは、驚くべきことに、このＣＫドメインが、第ＶＩＩＩ因子に融合された場合に、第ＶＩＩＩ因子中に導入されたＣＫドメインと、ＶＷＦ中に天然に存在するものとの間にジスルフィド共有結合連結をもたらすということを今や見出した。従ってこのことは、本発明の第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの間の共有結合複合体を達成する別の新しい方法を提示する。共有結合連結が形成される効率は、第ＶＩＩＩ因子に融合されたＶＷＦの部分にさらなるＣドメインが含まれる場合に増強され得る。これらは、例えば、場合によりさらなるＶＷＦドメインにより延長された、Ｚｈｏｕら（２０１２、Ｂｌｏｏｄ１２０、４４９−４５８）により定義された、Ｃ５〜Ｃ６ドメイン、Ｃ３〜Ｃ６ドメイン又はＣ１〜Ｃ６ドメインであり得る。

従って、本発明の別の実施態様は、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子を含む共有結合複合体であり、ここでＶＷＦはＶＷＦの半減期延長形態であり、ここで第ＶＩＩＩは、ＶＷＦのＣ末端ドメインＣＫを含み、場合によりさらなるＶＷＦドメインを含有するように修飾されている。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、そのＣＫ末端でそのように修飾されている。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、システイン残基２７７３（又はその等価物が）が保存されるならば、好ましくはそのＣ末端に、配列番号２の残基２７２３〜２８１３、２７２２〜２８１３、２７２４〜２８１３、２５８０〜２８１３、２５７８〜２８１３、２４９７〜２８１３、２４２９〜２８１３、２４００〜２８１３、２３３４〜２８１３、２２５５〜２８１３、１８７３〜２８１３、１６８３〜２８１３、１２７７〜２８１３、１２６４〜２８１３若しくは７６４〜２８１３又はその変異体を含む。好ましくは、修飾された第ＶＩＩＩ因子は、ＣＫドメインに加えて、Ｚｈｏｕら（２０１２、Ｂｌｏｏｄ１２０、４４９−４５８）により定義されるＶＷＦのＣ６、Ｃ５〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ２〜Ｃ６、若しくはＣ１〜Ｃ６ドメイン又はその変異体を含む。場合により、ＣＫ及びＣドメインはＶＷＦのさらなるドメインにより延長され得る。

本発明の別の実施態様において、第ＶＩＩＩ因子はＶＷＦのＣ末端ドメインの１つ又はそれ以上とＮ末端で融合される（図６を参照のこと）。このようなＣ末端ドメインは、ＶＷＦのＣ末端シスチンノット（ＣＫ）ドメインから誘導され得、そしてＶＷＦのＶＷＦ配列全体までＣドメイン、Ｄドメイン、又はＡドメインのうちの１つ又はそれ以上をさらに含み得る（ＶＷＦの構造については図２を参照のこと）。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、好ましくはそのＮ末端に、配列番号２の残基２７２３〜２８１３、２７２２〜２８１３２７２４〜２８１３、２５８０〜２８１３、２５７８〜２８１３、２４９７〜２８１３、２４２９〜２８１３、２４００〜２８１３、２３３４〜２８１３、２２５５〜２８１３、１８７３〜２８１３、１６８３〜２８１３、１２７７〜２８１３若しくは１２６４〜２８１３若しくは７６４〜２８１３又はその変異体を含むが、ただしシステイン残基２７７３（又はその等価物）は保存される。この実施態様において、シグナルペプチドをＶＷＦドメインのＮ末端に付加し、そしてＶＷＦドメインを成熟第ＶＩＩＩ因子（シグナルペプチド無し）のＮ末端に直接又はポリペプチドリンカーを介して融合する。

好ましくは、ＶＷＦの、場合によりさらなるドメインにより延長されたＣ末端ＣＫドメインは、切断可能なリンカーにより第ＶＩＩＩ因子に結合される。リンカー配列は、１つ又はそれ以上のアミノ酸、例えば１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５又は１〜３つ（例えば１、２又は３）のアミノ酸から成るものであり得、そしてこれらは互いに等しくても異なっていてもよい。通常は、リンカー配列は野生型凝固因子中の対応する位置に存在しない。好ましくは、リンカーは切断可能なリンカーであり、すなわち、これはプロテアーゼの切断部位を含み、好ましくは、血液凝固に関連するプロテアーゼにより切断可能な切断部位を含み、より好ましくは、切断可能なリンカーはトロンビン切断部位を含み、なおより好ましくはＦＶＩＩＩのトロンビン切断部位のうちの１つを含む。

切断可能リンカーの例は
ＥＤＦＤＩＹＤＥＤＥＮＱＳＰＲＳＦＱＫＫＴＲＨＹＦＩＡＡＶＥＲＬＷＤＹＧＭＳＳＳＰＨＶＬＲＮ（配列番号６（ＦＶＩＩＩ）のａａ１６７５〜１７２０）又は
ＮＴＧＤＹＹＥＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲＳＦＳＱＮＳＲＨＲＳＴＲＱＫＱＦＮＡＴＴＩＰＥＮ（配列番号６のａａ７１４〜７６４）又は
ＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶＡＫＫＨＰＫＴＷＶＨＹＩＡＡＥＥＥＤＷＤＹＡＰＬＶ（配列番号６のａａ３５７〜３９９）又は
ＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶＡＫＫＨＰＫＴＷＶＨＹＩＡＡＥＥＥＤＷＤＹＡ（配列番号６のａａ３５７〜３９６）又は
ＶＶＲＦＤＤＤＮＳＰＳＦＩＱＩＲＳＶＡＫＫＨＰＫＴＷＶＨＹＩＡＡＥＥＥＤＷＤ（配列番号６のａａ３５７〜３９４）
であり、切断性が保持されるならば、その欠失、挿入及び／又は置換を含む。

場合により、リンカーはさらなるアミノ酸残基を含み、これらは好ましくはＶＷＦ由来のドメインとリンカーの切断可能な部分との間に導入される。好ましくは、さらなる残基は、第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの、特にそれぞれａ３及びＤ’Ｄ３領域を介した相互作用を可能にするために十分な長さのペプチドを提供する。さらなるアミノ酸残基は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０又は１５０アミノ酸よりも多くてもよい。好ましくは、さらなるアミノ酸残基は、可動性「非構造的」ペプチドを形成し、そしてより好ましくは、グリシン−セリン反復、プロリン−アラニン−セリン反復、ホモアミノ酸反復、又はＦＶＩＩＩＢドメインの配列を含むか、又はこれらから成る。

本発明の別の実施態様は、ＶＷＦ及び第ＶＩＩＩ因子を含む共有結合複合体であり、ここでＶＷＦはＶＷＦの半減期延長形態であり、かつ第ＶＩＩＩ因子はＶＷＦのＤ’Ｄ３領域、及び場合によりＶＷＦのさらなるドメインを含むように修飾されている（図５）。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、その部分的又は完全なＢドメインがＶＷＦＤ’Ｄ３領域又はそのフラグメントで置き換えられるように修飾される（図５ｄ及びｅ）。より好ましくは、第ＶＩＩＩ因子は、好ましくはそのＢドメイン（又はその一部）の代わりに、それぞれ配列番号２の残基７６４〜１２４１、７６４〜１２４２、７６４〜１２４７若しくは７６４〜１２７０又は７６４と１２４１〜１２７０との間のいずれかの配列、又はその変異体若しくはフラグメントを含む。

好ましくは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、細胞培養培地中への分子の分泌の際に２鎖分子が生成されるように、かつＤ’Ｄ３ドメインが第ＶＩＩＩ因子軽鎖のＮ末端に位置するように、第ＶＩＩＩ因子に結合される。これは、例えばＰＡＣＥ／フリンの切断部位を含む切断可能なリンカーを、第ＶＩＩＩ因子ａ２ドメインとＶＷＦＤ’Ｄ３ドメインとの間に導入することにより達成され得る（図５ｄ及びｅ）。場合により、リンカーは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインと第ＶＩＩＩ因子ａ３ドメインとの間のさらなる残基を含む（図５ｅ）。さらなる残基は、それぞれａ３及びＤ’Ｄ３領域を介する第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの分子内相互作用を可能にするために十分な長さのペプチドを含む。好ましくは、さらなる残基は、３００、２５０、２００、１５０、１２０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、又は１０アミノ酸未満である。さらなるアミノ酸残基は、可動性の「非構造的」ペプチドを含み得、好ましくはそれらはグリシン−セリン反復、プロリン−アラニン−セリン反復又はホモアミノ酸反復、又はＦＶＩＩＩＢドメイン由来の配列を含むか又はこれらから成りさえする。

上記の実施態様は成熟形態であり；当業者は、例えば、さらなる配列、例えばＮ末端のシグナル配列を含めることにより、成熟形態を得るために発現されるべきタンパク質を構築することができる。

あるいは、第ＶＩＩＩ因子のＮ末端は、場合によりＶＷＦのさらなるドメイン（例えば、Ｄ１及びＤ２ドメイン）を含有する、ＶＷＦＤ’Ｄ３ドメイン又はそのフラグメントのＣドメイン末端に接続され、これは好ましくはシグナルペプチドによりＮ末端で伸長されている。これは、半減期を延長されたＶＷＦとの共有結合の発現及び細胞内形成において助けとなる。より好ましくは、ＶＷＦ部分は、配列番号２のＮ末端残基１〜１２４１若しくは残基７６４〜１２４１（プロペプチドの切断後）又はその変異体若しくはフラグメントを含む。

好ましくは、それぞれＶＷＦのＤ’Ｄ３又はＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインは、切断可能なリンカーにより第ＶＩＩＩ因子のＮ末端に結合される。より好ましくは、切断可能なリンカーは、プロテアーゼ切断部位、より好ましくは凝固系のプロテアーゼのうちの１つについての切断部位、なおより好ましくは、トロンビン切断部位、好ましくはＦＶＩＩＩのトロンビン切断部位のうちの１つを含む。場合により、リンカーは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３又はＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメインと第ＶＩＩＩ因子分子との間にさらなる残基を含み、さらなる残基は、それぞれａ３及びＤ’Ｄ３領域を介した第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの分子内相互作用を可能にするために十分な長さのペプチドを含む。好ましくは、２０、３０、４０、５０、７０、１００又は１５０より多いさらなるアミノ酸が加えられる。好ましくは、さらなるアミノ酸は、可動性の非構造的ペプチドを含み、より好ましくは、それらはグリシン−セリン反復、プロリン−アラニン−セリン反復、ホモアミノ酸反復、又はＦＶＩＩＩＢドメインの配列を含むか又はそれらから成りさえする。

さらなる代替として、第ＶＩＩＩ因子のＣ末端は、ＶＷＦＤ’Ｄ３ドメイン又はそのフラグメントのＮ末端に接続される。これは、同時発現される半減期を延長されたＶＷＦとの共有結合の発現及び細胞内形成において役立つ。より好ましくは、ＶＷＦは、それぞれ配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４１、７６４〜１２４２、７６４〜１２４７若しくは７６４〜１２７０若しくは７６４と１２４１〜１２７０との間のいずれか配列又はその変異体もしくはフラグメントを含む。

好ましくは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン（又はＤ１Ｄ２Ｄ’Ｄ３ドメイン）は、切断可能なリンカーにより第ＶＩＩＩ因子のＮ末端に結合され；ＶＷＦドメインに対してＮ末端側にシグナルペプチドを含めることは、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現の際の分泌をもたらす。より好ましくは、切断可能なリンカーは、トロンビン切断部位、好ましくはそれぞれ配列番号６のアミノ酸位置３７２、７４０及び／又は１６８９におけるトロンビン切断部位を含む配列から構成されるＦＶＩＩＩのトロンビン切断部位のうちの１つを含む。

場合により、リンカーは、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインと第ＶＩＩＩ因子分子との間にさらなる残基を含み、さらなる残基は、それぞれａ３及びＤ’Ｄ３領域を介して第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの相互作用を可能にするために十分な長さのペプチドを含む。好ましくは、２０、３０、４０、５０、７０、１００、１２０又は１５０より多いさらなるアミノ酸が加えられる。好ましくは、さらなるアミノ酸は、可動性の非構造的ペプチドを含み、より好ましくは、それらはグリシン−セリン反復、プロリン−アラニン−セリン反復、ホモアミノ酸反復、又はＦＶＩＩＩＢドメインの配列を含むか又はこれから成りさえする。

様々なリンカーを含むこのような融合タンパク質の例を配列番号１４４〜１７７に示す；示される各配列、すなわちＤＮＡ及びその翻訳産物（融合タンパク質）、さらには遺伝コードの冗長性のために同じ翻訳産物をコードするＤＮＡ配列（例えば、それらのＤＮＡ配列のコドン最適化バージョン）は、本発明の特定の実施態様である。しかし、当業者は、また本発明の範囲内でもあるこのような融合タンパク質の多くのさらなる例を設計することができるだろう。

好ましくは、本発明の複合体のＶＷＦ部分は、天然で形成するようにマルチマーを形成する。特定の理由のためには、複合体のＶＷＦ部分がダイマーより多くを形成しないことが望ましいかもしれない。これは、ＶＷＦのプロペプチド配列を除去し、そしてＶＷＦシグナルペプチドを直接Ｄ’のＮ末端に融合し、それによりプロペプチドを除去されたＶＷＦ分子の発現を可能にすることにより達成され得る。プロペプチドが存在しないことに起因して、Ｄ’Ｄ３ドメインを介した多量体化がブロックされる。他の特定の理由のためには、複合体のＶＷＦ部分がモノマーより多くを形成しないことが望ましいかもしれない。これは、ＶＷＦのプロペプチド配列を除去し、そしてＶＷＦシグナルペプチドを直接Ｄ’に融合し、プロペプチドを除去されたＶＷＦ分子の発現を可能にすることにより、そしてさらにＣｙｓ２７７３の別の適切なアミノ酸、例えばアラニンへの変異を導入することにより、達成され得る。

本発明の別の実施態様は、１つ又はそれ以上の共有結合が第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦ結合部位との間に直接存在する（好ましくはジスルフィド結合）第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体、及び別の共有結合が分子の第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦ部分との間に存在する第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体、及び１つ又はそれ以上のＨＬＥＰが第ＶＩＩＩ因子に、ＶＷＦに、又は両方に接続されている第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体を形成する上記の実施態様のいずれかの組み合わせである（図１２）。このような第ＶＩＩＩ因子／ＶＷＦ複合体は、第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦ部分との間にジスルフィド結合のみを含む複合体よりも高い収率で生成可能であり得るので、有利であり得る。

本発明の第二の局面は、上記の第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの共有結合複合体を製造する方法であり、該方法は、真核生物細胞株において第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦを同時発現させることを含む。従って、本発明はまた、本発明の複合体を形成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。

用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、未修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでも修飾されたＲＮＡ若しくはＤＮＡでもよいいずれかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、１本鎖ＤＮＡでも２本鎖ＤＮＡでも、１本鎖ＲＮＡでも２本鎖ＲＮＡでもよい。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、１つ又はそれ以上の修飾塩基及び／又は異常な塩基、例えばイノシンを含むＤＮＡ又はＲＮＡも含む。当然のことながら、当業者に公知の多くの有用な目的に役立つ様々な修飾がＤＮＡ及びＲＮＡに対して成され得る。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的または代謝的な修飾された形態、さらにはウイルス並びに単細胞及び複雑な細胞を含めた細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態も包含する。

当業者には当然のことながら、遺伝子コードの縮重に金して、所定のポリペプチドは異なるポリヌクレオチドによりコードされ得る。これらの「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）は本発明により包含される。

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは単離されたポリヌクレオチドである。用語「単離された」ポリヌクレオチドは、限定されないが他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡのような他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを指す。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製され得る。当業者に公知の従来の核酸精製法が単離されたポリヌクレオチドを得るために使用され得る。この用語はまた、組み換えポリヌクレオチド及び化学的に合成されたポリヌクレオチドも含む。

本発明はさらに、本発明の修飾されたＶＷＦ及び／若しくは修飾された第ＶＩＩＩ因子、又は修飾されたＶＷＦ及び／若しくは修飾された第ＶＩＩＩ因子を含む本発明のポリペプチドを一緒にコードする一群のポリヌクレオチドに関する。例えば、群中の第一のポリヌクレオチドは、修飾された第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードし得、そして第二のポリヌクレオチドは修飾された第ＶＩＩＩ因子の軽鎖をコードし得、そして第三のポリヌクレオチドは修飾されたＶＷＦをコードし得る。

本発明のさらに別の局面は、本発明に従うポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクターである。好ましくは、このプラスミド又はベクターは発現ベクターである。特定の実施態様において、ベクターはヒト遺伝子治療における使用のための転移ベクターである。

本発明はまた、上記の一群のポリヌクレオチドを含む一群のプラスミド又はベクターに関する。第一のプラスミド又はベクターは、上記第一のポリヌクレオチドを含み得、そして第二のプラスミド又はベクターは上記第二のポリヌクレオチドを含み得る。あるいは、２つ又はそれ以上のコード配列が、本発明の複合体の一部である１つより多くのタンパク質の発現を方向づけるために、別々のプローター配列又は１つのプロモーター及び内部リボソーム移行部位（ＩＲＥＳ）エレメントのいずれかを使用して１つの発現ベクターにクローンされる。

本発明のさらに別の局面は、本発明のポリヌクレオチド、プラスミド若しくはベクター、又は本明細書に記載される一群のポリヌクレオチド、若しくは一群のプラスミド若しくはベクターを含む宿主細胞である。

本発明の宿主細胞は、本発明の共有結合複合体を製造する方法において使用され得る。該方法は：
（ａ）所望のタンパク質複合体が発現されるような条件下で本発明の細胞を培養すること；及び
（ｂ）場合により、宿主細胞から、または培地から所望のタンパク質複合体を回収すること
を含む。

適切な宿主細胞において高レベルで組み換え変異体タンパク質を産生することは、当業者に公知の方法に従って様々な発現系において増殖され得る組み換え発現ベクターにおいて適切な調節エレメントと一緒に有効な転写単位へと上述の修飾されたｃＤＮＡを組み立てることを必要とする。有効な転写調節エレメントは、それらの天然宿主として動物細胞を有するウイルスから、又は動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導され得る。好ましくは、サルウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、若しくはラウス肉腫ウイルスの長い末端反復由来のプロモーター−エンハンサーの組み合わせ、又はベータ−アクチン若しくはＧＲＰ７８のような動物細胞における強く恒常的に転写される遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせが使用され得る。ｃＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの安定な高いレベルを達成するために、転写単位はその３’近位部分において転写終結ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含有するべきである。好ましくは、この配列は、サルウイルス４０初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子由来である。

次いでｃＤＮＡを、修飾された第ＶＩＩＩ因子及び／又はＶＷＦタンパク質の発現のために適した宿主細胞株のゲノムに組み込み得、次いでこれを本発明の共有結合複合体へと組み立て得る。あるいは、細胞中で安定な染色体外エレメントとして残る安定なエピソームベクターもまた使用され得る。好ましくは、この細胞株は、正確な折り畳み、ジスルフィド結合形成、アスパラギン連結グリコシル化及び他の翻訳後修飾、さらには培地への分泌を確実にするために、脊椎動物起源の動物細胞株であるべきである。他の翻訳後修飾の例は、新生ポリペプチド鎖のチロシンＯ−硫酸化及びタンパク質分解性プロセシングである。使用され得る細胞株の例は、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、及びハムスターＣＨＯ細胞である。

対応するｃＤＮＡをコードする組み換え発現ベクターを、いくつかの異なる方法で動物又はヒトの細胞株中に導入し得る。例えば、組み換え発現ベクターは、異なる動物ウイルスに基づくベクターから作製することができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及び好ましくはウシパピローマウイルスに基づくベクターである。

対応するＤＮＡをコードする転写単位もまた、組み換えＤＮＡをそれらのゲノムに組み込まれている特定の細胞クローンの単離を容易にするために、これらの細胞において優性選択可能マーカーとして機能し得る別の組み換え遺伝子と一緒に動物細胞中に導入され得る。この種の優性選択可能マーカー遺伝子の例は、ジェネティシン（Ｇ４１８）に対する抵抗性を与えるＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びピューロマイシンに対する抵抗性を与えるピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択可能なマーカーをコードする組み換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするベクターと同じベクター上に存在していても、又は宿主細胞のゲノムに同時に導入され組み込まれる別のベクターにコードされていてもよく、頻繁に、強い物理的連結を異なる転写単位間に生じる。

所望のタンパク質のｃＤＮＡと一緒に使用され得る他の種類の選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位に基づく。この種の遺伝子を、内因性ｄｈｆｒ活性を欠いた細胞、優先的にＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）中に導入した後、これらがヌクレオシドを含まない培地で増殖することが可能となる。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、及びグリシンを含まないＨａｍのＦ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子は、同じベクター又は異なるベクターのいずれかに連結されて、ｃＤＮＡ転写単位と一緒に上記の種類のＣＨＯ細胞中に導入され得、そのようにして組み換えタンパク質を産生するｄｈｆｒ陽性細胞株を作製する。

細胞傷害性ｄｈｆｒ阻害剤メトトレキサートの存在下で上記細胞株が増殖する場合、メトトレキサートに抵抗性の新しい細胞株が出現する。これらの細胞株は、増幅された数の連結されたｄｈｆｒ及び所望のタンパク質の転写単位に起因して増加した速度で組み換えタンパク質を産生し得る。これらの細胞株を、増加する濃度のメトトレキサート（１〜１００００ｎＭ）で増殖させる場合、非常に高い速度で所望のタンパク質を産生する新しい細胞株を得ることができる。

所望のタンパク質を産生する上記細胞株を、懸濁培養液中又は様々な固体支持体上のいずれかで大規模で増殖させることができる。これらの支持体の例は、デキストラン若しくはコラーゲンマトリックスに基づくマイクロキャリア、又は中空繊維若しくは様々なセラミック材料の形態の固体支持体である。細胞懸濁培養液又はマイクロキャリアで増殖する場合、上記細胞株の培養は、バッチ培養として、又は長期間にわたって馴化培地の連続的製造を用いる灌流培養のいずれかとして行われ得る。従って、本発明によれば、上記細胞株は所望の組み換え変異体タンパク質の製造のための工業プロセスの開発のために十分適している。

本発明の複合体を≧８０％の純度まで、より好ましくは≧９５％の純度まで精製することが好ましく、そして細胞培養由来の混入した高分子、特に他のタンパク質及び核酸に関して９９．９％より高い純度で、かつ感染性及び発熱性の因子を含まない薬学的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、単離された又は精製された本発明の修飾共有結合複合体は、他の無関係なポリペプチドを実質的に含まない。

本発明の共有結合複合体は、上記の種類の分泌細胞の培地中に蓄積し、所望のタンパク質と細胞培養媒体中の他の物質の間のサイズ、電荷、疎水性、溶解度、特異的親和性などの差異を利用する方法を含む様々な生化学的及びクロマトグラフィー法により濃縮及び精製され得る。

このような精製の例は、例えば、ＨＬＥＰ、好ましくはヒトアルブミンに特異的な、又はそれぞれの凝固因子に特異的な、固体支持体上に固定されたモノクローム抗体への組み換え変異体タンパク質の吸着である。複合体の支持体への吸着、洗浄及び脱着後に、タンパク質を、上記の特性に基づいて様々なクロマトグラフィー技術によりさらに精製することができる。精製工程の順序は、例えば工程の容量及び選択性、支持体の安定性又は他の局面に従って選択される。例えば、好ましい精製工程は、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー工程、免疫親和性クロマトグラフィー工程、親和性クロマトグラフィー工程、疎水性クロマトグラフィー工程、色素クロマトグラフィー工程、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程、マルチモーダルクロマトグラフィー工程、及びサイズ排除クロマトグラフィー工程である。

ウイルス混入の理論的危険性を最小にするために、ウイルスの効果的な不活化及び／又は除去を可能にするプロセスにおいてさらなる工程が含まれ得る。このような工程は、例えば、液体若しくは固体状態での熱処理、溶媒及び／若しくは界面活性剤での処理、可視若しくはＵＶスペクトルでの照射、ガンマ線照射又はナノろ過である。

本発明の修飾されたポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）はまた、ヒト遺伝子治療における使用のために導入ベクターに組み込まれ得る。

本発明のこの局面の別の実施態様において、（修飾された）第ＶＩＩＩ因子及び（修飾された）ＶＷＦは、化学的架橋により共有結合で接続される。

本発明の様々な生成物は薬剤として有用である。従って、本発明の第三の局面は、薬剤、好ましくは出血障害の処置又は予防における使用のための上記の共有結合複合体である。好ましくは、出血障害は血友病Ａ又はＶＷＤである。

本発明の第四の局面は、上記の共有結合複合体を含む医薬組成物である。本発明において記載される共有結合複合体は、治療的使用のために医薬製剤へと製剤化され得る。精製されたタンパク質は、従来の生理学的に適合性の水性緩衝溶液に溶解され、これには場合により、医薬製剤を提供するための医薬添加剤が添加され得る。

このような医薬担体及び添加剤、さらには適切な医薬製剤は、当該分野で周知である（例えば、「ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｆｒｏｋｊａｅｒｅｔａｌ．、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）又は「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、３^rd ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｋｉｂｂｅｅｔａｌ．、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。標準的な医薬製剤化技術は当業者に周知である（例えば、２００５Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ ＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ^(R)、ＴｈｏｍｓｏｎＨｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、２０ｔｈｅｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏｅｔａｌ．、Ｅｄｓ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００を参照のこと）。特に、本発明の共有結合複合体を含む医薬組成物は、凍結乾燥形態又は安定な液体形態で製剤化され得る。ポリペプチド変異体は、当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水のような１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤の添加により使用前に再構成される。

組成物の製剤は、いずれかの薬学的に適した投与手段により個体に送達される。様々な送達系が公知であり、そしていずれかの都合の良い経路により組成物を投与するために使用され得る。好ましくは、本発明の組成物は全身投与される。全身使用のために、本発明の複合体は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内又は経皮）送達又は経腸的（例えば、経口、膣又は直腸）送達のために従来の方法に従って製剤化される。最も優先的な投与経路は、静脈内及び皮下投与である。製剤は、注入により又はボーラス注射により持続的に投与され得る。いくつかの製剤は遅い放出系を包含する。

本発明の共有結合複合体は、治療有効用量で患者に投与され、これは、耐えられない有害な副作用を生じる用量に達することなく、処置される状態又は適応症の重症度又は拡散を予防するか又は低減する、所望の効果を生じるために十分である用量を意味する。正確な用量は、例えば適応症、製剤、投与様式のような多くの因子に依存し、そして各々の適応症について前臨床及び臨床試験において決定されなければならない。

本発明の医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と併用して投与され得る。これらの薬剤は、同じ医薬製剤の一部として組み込まれ得る。

本発明のさらなる局面は、有効量の上記の複合体を、それを必要とする被験体に投与することにより出血障害を処置又は予防する方法である。別の実施態様において、該方法は、有効量の、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のプラスミド若しくはベクターを個体に投与することを含む。あるいは、該方法は、有効量の本明細書に記載される本発明の宿主細胞を個体に投与することを含み得る。

本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載される。本発明の特定の実施態様の記載は、添付の図面と合わせてなされ得る。

図１：ａ）、成熟ＦＶＩＩＩタンパク質のドメイン構造；ｂ）Ｂドメイン欠失成熟ＦＶＩＩＩタンパク質のドメイン構造；ｃ）Ｂドメイン欠失１本鎖成熟ＦＶＩＩＩタンパク質のドメイン構造。矢印はＰＡＣＥ／フリン切断部位を示し、三角は活性化のためのトロンビン切断部位を示す。図２：Ｚｈｏｕら、２０１２に従う、プロ−ＶＷＦ（Ａ）及び成熟ＶＷＦ（Ｂ）のドメイン構造。ＶＷＦ−二量体化及び多量体化は示していない。図３：第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦがジスルフィド架橋を介して連結された共有結合複合体の例。ＶＷＦドメインを灰色で示し、第ＶＩＩＩ因子を白色で示す。図４：ＶＷＦＣＫドメインを含むＶＷＦドメインを伴う修飾ＦＶＩＩＩの例。ＦＶＩＩＩドメインを白色で示し、ＶＷＦドメインを灰色で示す。黒三角はトロンビン切断部位を示し、白三角はリンカーに導入されたプロテアーゼ切断部位を示す。図４−１の続き。図５：Ｄ’Ｄ３ドメインを含むＶＷＦドメインを伴う修飾ＦＶＩＩＩの例。矢印はＰＡＣＥ／フリン切断部位を示し、黒三角はトロンビン切断部位を示し、白三角はリンカーに導入されたプロテアーゼ切断部位を示す。図５−１の続き。図６：さらなるＶＷＦドメインで修飾されたＦＶＩＩＩ。記号は上で説明されたとおりである。図６−１の続き。図６−２の続き。図７：化学的架橋により連結された共有結合複合体の例。図８：共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ−ＳＣ／ＶＷＦ−ＦＰ分子のウェスタンブロット。Ｍ、分子サイズマーカー。Ａ、抗ＦＶＩＩＩ、Ｂ、抗ＶＷＦ抗体ブロット。図９：精製後（レーン１）及びその後のトロンビン切断後（レーン２）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ−ＳＣ／ＶＷＦ−ＦＰ分子の分離。図１０：抗ＶＷＦ抗体（Ａ）及び抗ＦＶＩＩＩ抗体（Ｂ）による共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ−ＳＣ／ＶＷＦ−ＦＰマルチマー分子のマルチマーゲル分析。レーン１、血漿由来ＶＷＦ；レーン２及び３、共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ−ＳＣ／ＶＷＦ−ＦＰマルチマーを発現する２つのクローンの上清；レーン４、ｒＶＷＦ−ＦＰ。図１１：ラットにおける共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ−ＳＣ／ＶＷＦ−ＦＰマルチマー（丸）の薬物動態解析。Ａ、ＦＶＩＩＩデータ、Ｂ、ＶＷＦデータ。図１２：場合によりペプチドリンカーを介した、ジスルフィド架橋及びＶＷＦの第ＶＩＩＩ因子への融合の両方を用いた構築物の例。図１２−１の続き。図１２−２の続き。図１２−３の続き。

配列表：
配列番号１：ヒトＶＷＦのｃＤＮＡ配列
配列番号２：ヒトＶＷＦのタンパク質配列
配列番号３：ＰＣＲプライマーＶＷＦ＋
配列番号４：ＰＣＲプライマーＶＷＦ−
配列番号５：ヒトＦＶＩＩＩのｃＤＮＡ配列
配列番号６：成熟ヒトＦＶＩＩＩのタンパク質配列
配列番号７：成熟ヒト血清アルブミンのタンパク質配列
配列番号：８〜１４３：実施例に列挙される変異誘発のための様々なプライマー及びオリゴヌクレオチド。
配列番号：１４４〜１７７：様々なリンカーを通して接続された、様々なＶＷＦ−ＣＫ含有配列とのヒト１本鎖ＦＶＩＩＩの融合タンパク質配列（ＤＮＡ及びタンパク質）。

実施例１：Ｄ’Ｄ３領域中にシステイン残基を含むＶＷＦ変異体の生成
その多重クローニング部位に全長ＶＷＦｃＤＮＡ配列を含有する発現プラスミド（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を予め生成した（ｐＶＷＦ−２４４８）。このベクター中に含まれるＶＷＦｃＤＮＡ配列は配列番号１と示され、その対応するタンパク質配列は配列番号２と示される。

このような発現ベクターを生成するために、ＶＷＦｃＤＮＡを、当業者に公知の標準的な条件下で（そして例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｏｍ／ＷｉｌｅｙＣＤＡ／に記載されるように）、ＶＷＦｃＤＮＡ（市販される、例えばＡＴＣＣ、Ｎｏ．６７１２２からのｐＭＴ２−ＶＷＦから入手可能）を含有するプラスミドから、プライマーセットＶＷＦ＋及びＶＷＦ−（配列番号３及び４）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し得る。得られたＰＣＲフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより消化され得、そしてＥｃｏＲＩにより直線化された発現ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３に連結され得る。挿入断片の正確な起源についてスクリーニングした得られた発現プラスミドは、ＶＷＦ発現に適したＣＭＶプロモーターの下流にＶＷＦの野生型ｃＤＮＡを含有する。

ＶＷＦ配列に変異を導入するために、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＸＬＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、キット製造者により勧められる以下のプロトコルに従ってプラスミドｐＶＷＦ−２４４８に適用した。変異誘発反応ごとに、１０ｘ反応緩衝液５μｌ、プラスミドＤＮＡｐＶＷＦ−２４４８１μｌ（５０ｎｇ）、１μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）それぞれの２つの変異誘発オリゴヌクレオチドの各々、１μｌｄＮＴＰミックス、３μｌＱｕｉｃｋ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１μｌＴｕｒｂｏポリメラーゼ（２，５Ｕ／μｌ）及び３７μｌＨ₂Ｏを混合し、そして２分間９５℃で初期変性、ａ）５０秒間９５℃で変性、ｂ）５０秒間６０℃でアニーリング、そしてｃ）１４分間６８℃で伸長を１８サイクル、続いて単回の７分間６８℃の終結伸長期を用いるポリメラーゼ連鎖反応にかけた。続いて、このキットからのＤｐｎＩ酵素１μｌを加え、そして反応混合物をさらに６０分間３７℃でインキュベートした。その後、変異誘発反応混合物３μｌをＥ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（例えば、ＸＬ１０Ｇｏｌｄ、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。クローンを単離し、プラスミドＤＮＡを抽出し、そしてＶＷＦ配列中の変異をＤＮＡ配列決定により確認した。

以下の表は、ＶＷＦｃＤＮＡ配列の変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド及び導入されたそれぞれの変異を記載する。

上記のプロトコル及びプラスミドを使用して、そして当業者に公知の（そして例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、（同書）に記載されるような）分子生物学的技術を適用することにより、他の構築物は、配列番号２内のいずれかのアミノ酸残基の変異のために当業者により製造され得る。

これらの実施例における半減延長方式として、ＶＷＦへのアルブミン融合を選択した。これは接尾辞−ＦＰにより示される。

ＶＷＦ及びＶＷＦ変異体のアルブミン融合物を生成するために、リンカー及びアルブミンｃＤＮＡ配列の挿入を、ＷＯ２００９／１５６１３７に記載される実施例と同様にして行った。

プロペプチド配列を含有しないＶＷＦ変異体を含有する発現カセットの生成のために、上記の変異誘発を、配列番号５４及び５５を有するプライマーを使用して行った。

これにより、シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜２２）が直接Ｄ’領域（配列番号２のアミノ酸７６４）に融合されているＶＷＦ配列を生じる。

以下の表は、散在（ｓｃａｔｔｅｒｅｄ）アプローチでＶＷＦＤ’Ｄ３ドメイン中のシステインと交換された残基を記載する：

実施例２：ａ３ドメイン中にシステイン残基を含むＦＶＩＩＩ変異体の生成
発現プラスミドにおいてクローンされたいずれかのＦＶＩＩＩｃＤＮＡ配列を使用して、Ｃｙｓ変異をａ３ドメインに導入することができる。好ましくは、部分的Ｂドメイン欠失を有する１本鎖ＦＶＩＩＩ構築物が使用される（例えば、ＷＯ２００４／０６７５６６を参照のこと）。

ＦＶＩＩＩ発現ベクターを生成するために、ＦＶＩＩＩｃＤＮＡを、配列番号５６及び５７のプライマーセットを使用して、当業者に公知の（そして例えばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｏｍ／ＷｉｌｅｙＣＤＡ／に記載されるような）標準的条件下で、ＦＶＩＩＩｃＤＮＡを含有するプラスミドからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し得る。得られたＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより消化し、そしてＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより直線化された発現ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に連結した。得られた発現プラスミドは、ＣＭＶプロモーターの下流にＦＶＩＩＩのｃＤＮＡを含有し、そして動物細胞培養におけるＦＶＩＩＩ発現に適する。

ＦＶＩＩＩ配列中に変異を導入するために、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＸＬ部位特異的変異誘発キット、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）をキット製造者により勧められるようにＦＶＩＩＩ発現プラスミドに対して適用した。

以下の表は、ＦＶＩＩＩｃＤＮＡ配列の変異誘発に使用されたオリゴヌクレオチド及び導入されたそれぞれの変異を記載する。

上記及びＷＯ２００４／０６７５６６に記載されるプロトコル及びプラスミドを使用して、当業者に公知の（そして例えばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、同書に記載されるような）分子生物学的技術を適用することにより、いずれかの他の構築物が、ＦＶＩＩＩのａ３ドメイン内のいずれかの他のアミノ酸残基の変異のために当業者により作製され得る。

以下の表は、第ＶＩＩＩ因子ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメインにおいてシステインと交換される残基を記載する。

実施例３：ＶＷＦ由来Ｃ末端伸長を有するＦＶＩＩＩ分子のための発現ベクターの生成
そのカルボキシ末端に加えられたＶＷＦドメイン又はフラグメントを有するＦＶＩＩＩ分子を、当業者に公知の分子生物学的方法により生成した。これらを使用してＶＷＦ−ＦＰと同時トランスフェクトし（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ）、両方のタンパク質のＣ末端でＣＫドメインを介して共有結合により連結された修飾されたＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ−ＦＰを含有するヘテロダイマーを生成した。

そのためにＦＶＩＩＩｃＤＮＡをプライマー
Ｗｅ４３２３ＧＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣ
（配列番号８２）
Ｗｅ４３２４ＣＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＧＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧＣ（配列番号８３）
により増幅し、そして得られたＰＣＲフラグメントを適切な発現ベクター、例えばＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより開かれたｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（同書）に挿入した。得られたＡｇｅＩ及びＮｏｔＩ部位を通して、それぞれプライマー対
Ｗｅ４２６４ＧＴＧＡＣＣＧＧＴＡＡＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＧＴＣＣＣ（配列番号８４）
Ｗｅ４２６７ＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＧ（配列番号８５）及び
Ｗｅ４２６５ＧＴＧＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣ（配列番号１４２）
Ｗｅ４２６７ＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＧ（配列番号８５）及び
Ｗｅ４２６６ＧＴＧＡＣＣＧＧＴＴＧＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡＧ（配列番号８６）
Ｗｅ４２６７ＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＧ（配列番号８５）を使用してＰＣＲにより増幅された、ＶＷＦ由来Ｃ末端ドメインＣ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ（ＶＷＦアミノ酸２４００〜２８１３）、Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ（ＶＷＦアミノ酸２５４４〜２８１３）又はＣＫドメイン単独（ＶＷＦアミノ酸２７２４〜２８１３）のコード配列を挿入した。これにより、それぞれＶＷＦＣ末端ドメインＣ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ、Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ又はＣＫによりＣ末端を伸長されたＦＶＩＩＩｃＤＮＡを含有する発現ベクターが得られた。

ＡｇｅＩ制限部位に、ＦＶＩＩＩ活性化の間にＶＷＦ−ＦＰからＦＶＩＩＩを放出する切断可能なリンカー配列を導入した。リンカー配列をＦＶＩＩＩのトロンビン切断部位の１つを囲む配列から選択したが、いずれの他のトロンビン切断部位も同様に使用され得る（例えば、ＷＯ０３／０３５８６１に記載されるとおり）。例として、トロンビン切断部位３７２及び１６８９は、以下のｃＤＮＡ配列により表される：
ＣＳ３７２（配列番号８７）： ^5'ＡＣＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＧＧＴ^3'
ＣＳ１６８９（配列番号８８）： ^5'ＡＣＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＧＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＣＣＧＧＴ^3'
これらの配列は、それらの末端にＡｇｅＩ制限部位を含む適切なＰＣＲプライマーにより増幅され得る。次いでＰＣＲフラグメントはＡｇｅＩにより切断されて上記のＡｇｅＩにより開かれた発現ベクター中に挿入される。

同様のアプローチが、そのＢドメイン若しくはその一部がＶＷＦＤ’Ｄ３領域で置き換えられているＦＶＩＩＩｃＤＮＡ分子又はＶＷＦＤ’Ｄ３領域がＦＶＩＩＩのＮ末端若しくはＣ末端へ直接もしくはリンカーを介して接続されているＦＶＩＩＩｃＤＮＡ分子を含有する発現プラスミドを構築するために当業者により使用され得る。

実施例４：ＣＨＯ細胞におけるＶＷＦ変異体の安定な発現のためのプラスミドのトランスフェクション
ｐＩＲＥＳｎｅｏ３に基づく発現プラスミドを、ＸＬ１０Ｇｏｌｄ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させ、そして標準のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。

ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１を、標準的な方法、例えばｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ又はリポフェクションを使用してトランスフェクトし、そして所望のＶＷＦ−ＦＰ変異体を発現している単一クローンを選択した。

正確なＶＷＦプロペプチド切断のために、プロテアーゼフリン（ＮＭ００２５６９．２）をコードする発現プラスミドを、ＶＷＦプラスミドと一緒に１：４のモル比（フリン：ＶＷＦ変異体）で同時トランスフェクトした。

実施例５：ＶＷＦ−ＦＰ変異体を発現するＣＨＯ細胞のトランスフェクション及びＦＶＩＩＩ変異体の一過性発現
ＦＶＩＩＩ変異体発現プラスミドを上記のように精製した。安定なＶＷＦ−ＦＰ変異体ＣＨＯクローン（実施例４）への一過性トランスフェクションを標準的な方法に従って行った。

一過性トランスフェクションの収穫を、遠心分離により行って上清から細胞を分離した。上清のアリコートを生成し、そして組み換え産物を特徴づけした。

以下の表は、ＦＶＩＩＩ変異体発現プラスミド（カラム１）のＶＷＦ−ＦＰ変異体を安定に発現するＣＨＯ細胞（カラム２）への一過性トランスフェクションからの代表的結果を記載する。総ＦＶＩＩＩ活性に対する共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ抗原の比率（カラム７）又は総ＦＶＩＩＩ抗原に対する共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ抗原の比率（カラム８）が１．０に等しいか又はそれより大きくなるように選択され、これを最も好ましい変異体の組み合わせの選択基準として使用した。

共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ抗原の量を、実施例６に記載されるアッセイにより決定し、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ活性並びに抗原を実施例９及び１０に記載されるアッセイにより決定した。

実施例６：ＶＷＦ変異体に共有結合で結合されたＦＶＩＩＩ変異体のＥｌｉｓａによる検出
一過性トランスフェクションからの細胞培養上清サンプル（１０ｍｌ）を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａｃｅｌｌ−３０Ｋ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＵＦＣ９０３０２４；３０００ｇ遠心分離）を用いて濃縮した。培養上清（濃縮物）中のＶＷＦ−ＦＰに共有結合で結合されたＦＶＩＩＩを、標準的ＥＬＩＳＡにより測定した。手短には、マイクロプレートを、捕捉抗体１ウェルあたり１００μＬ（ウサギ抗ヒトＶＷＦ−ＩｇＧ、ＤａｋｏＡ００８２［Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ］、緩衝液Ａで１：２０００希釈［ＳｉｇｍａＣ３０４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ］）とともに終夜周囲温度でインキュベートした。プレートを緩衝液Ｂ（ＳｉｇｍａＴ９０３９）で３回洗浄した後、各ウェルを２００μＬ緩衝液Ｃ（ＳｉｇｍａＴ６７８９）とともに１．５時間周囲温度でインキュベートした（ブロッキング）。さらに３回の緩衝液Ｂでの洗浄工程の後、緩衝液Ｂでの試験サンプルの段階希釈、さらには共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ−ＦＰの対照製剤の段階希釈、（緩衝液Ｂ中２．０〜０．０３任意Ｕ／ｍｌ（これらは標準ヒト血漿を使用して決定された標準ＦＶＩＩＩ単位に対応しないかもしれないので、我々はこれらを「任意単位」と呼ぶ）；１ウェルあたりの体積：１００μＬ）を、周囲温度で１．５時間インキュベートした。緩衝液Ｂでの３回の洗浄工程の後、３５０ｍＭＣａＣｌ₂ ２００μＬを各ウェルに加え、そして１時間周囲温度でインキュベートした。ＣａＣｌ₂を（洗浄することなく）除去し、そしてさらに２００μｌを各ウェルに加え、そしてさらに１時間インキュベートした。緩衝液Ｂでの３回の洗浄工程の後、検出抗体（に対する検出抗体ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ペルオキシダーゼ標識、ＣｅｄａｒｌａｎｅＣＬ２００３５Ｋ−Ｄ）の緩衝液Ｂ中の１：２希釈１００μＬを各ウェルに加え、そして１時間周囲温度でインキュベートした。緩衝液Ｂでの３回の洗浄工程の後、基質溶液（ＯＵＶＦ、ＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１００μＬを各ウェルに加え、そして１５分間周囲温度で暗所にてインキュベートした。１００μＬ未希釈停止希釈（ｕｎｄｉｌｕｔｅｄｓｔｏｐｄｉｌｕｔｉｏｎ）（ＯＳＦＡ、ＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を加えて、波長４５０ｎｍでの適切なマイクロプレートリーダーでの読み取りのためのサンプルを準備した。次いで、試験サンプルの濃度を、対照製剤を用いた標準曲線を使用して計算した。

実施例７：ウェスタンブロット及びクーマシー染色による、ＶＷＦ変異体に共有結合で結合されたＦＶＩＩＩ変異体の検出
あるいは、共有結合複合体を染色又はウェスタンブロット法により検出した。サンプルを、還元又は非還元条件下で変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、そしてその後のウェスタンブロットを用いて試験した。ＦＶＩＩＩの検出のために、社内の（ｉｎｈｏｕｓｅ）マウス抗ＦＶＩＩＩモノクローム抗体混合物、続いてアルカリホスファターゼ結合二次抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＶＷＦ検出のためにＨＲＰ標識ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ（Ｆａ．ＤａｋｏＰ０２２６）抗体を使用した。

図８は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの上記の２つの方式による、ｒＶＷＦ−ＦＰダイマーに共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ−ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ）のウェスタンブロット分析を示す。Ａは抗ＦＶＩＩＩ抗体を使用して検出され、Ｂは抗ＶＷＦ抗体を使用して検出された。レーン１は、そのＣ末端に加えられたＶＷＦ由来Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ配列及びＦＶＩＩＩとＣ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ配列との間のさらなるトロンビン切断部位によりＦＶＩＩＩ部分がＶＷＦ−ＦＰダイマーに連結されている連結された物質を表す。これは、実施例８に記載される特異的Ｅｌｉｓａにより測定した共有結合ＦＶＩＩＩの、総ＦＶＩＩＩ活性に対する比５．７８及び総ＦＶＩＩＩ抗原に対する比７．４７を有していた。４６０ｋＤａより上の高分子量帯を、抗ＦＶＩＩＩ抗体及び抗ＶＷＦ抗体の両方により可視化し、そして共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ−ＦＰ複合体の存在を実証した。Ｍは分子サイズマーカーを示す。レーン２及び３は、それぞれＦＶＩＩＩ−ＳＣ及びＶＷＦ−ＦＰの対照製剤を表す。

レーン４及び５は、それぞれＣｙｓ変異によりＦＶＩＩＩａ３ドメインとＶＷＦ−ＦＰＤ３ドメインとの間のジスルフィド架橋により連結された共有結合複合体を表す。レーン４は、ＶＷＦ−ＦＰＥ１０７８Ｃ変異体上のＦＶＩＩＩ−ＳＣＩ１６７９Ｃ変異体を表す。レーン５はＶＷＦ−ＦＰＥ１０７８Ｃ変異体上のＦＶＩＩＩ−ＳＣＩ１６７５Ｃ変異体を表す。レーン６は、ＶＷＦ−ＦＰ変異体Ｅ１０７８Ｃのみを含有する対照製剤である。ブロットは、遊離ＦＶＩＩＩ分子のほかに互いに共有結合で連結された高分子量ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ−ＦＰ複合体の存在を実証する。

図９は、ＧｅｌｃｏｄｅＢｌｕｅＳｔａｉｎ試薬で染色された還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１はｒＶＷＦ−ＦＰダイマーに共有結合で連結された精製ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ−一本鎖）を含有し、レーン２は、平行してＦＶＩＩＩを活性化しながらリンカー配列において共有結合で連結したＦＶＩＩＩ部分を放出するトロンビン消化後の同じ製剤を示す。レーン１の帯は共有結合複合体及びＦＶＩＩＩダイマーを表し、２６８と４６０ｋＤａのマーカーの間のレーン２における顕著なバンドはＶＷＦ−ＦＰ部分を表すが、７１ＫＤａの下の範囲におけるバンドはＦＶＩＩＩフラグメントを表す。

実施例８：ＦＶＩＩＩのＶＷＦへの化学的架橋
ＦＶＩＩＩを、好ましくは生理的ＮａＣｌ及びＣａＣｌ₂濃度を含有する緩衝水溶液中で好ましくは４℃と３７℃との間の一定の温度で、５００Ｄａと１００ｋＤａとの間の分子量を有する二重特異的ビス−スクシンイミドエステル（ＰＥＧ）ｎと、２：１〜１：１０００（好ましくは約１：１）のＦＶＩＩＩと架橋剤とのモル比で反応させる。ＦＶＩＩＩ濃度は、好ましくはそれ自身とのＦＶＩＩＩの架橋を最少にするために低い。１分から６０分の期間の後、半減期延長ＶＷＦを、ＶＷＦの単量体ビルディング単位に基づいて２：１〜２００：１のモル過剰でＦＶＩＩＩ溶液に加えた。上に示した温度で１〜３００分の期間インキュベートした後、残留試薬を、好ましくは第一級アミノ基を含有する低分子量化合物を使用してクエンチし、そしてＦＶＩＩＩ及びＶＷＦの共有結合複合体を、この分野の専門家に公知の方法により精製し、未反応のＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩのオリゴマー及び未反応のＶＷＦを除去した。所望の共有結合複合体の含有量を最大にし、かつ副生成物の含有量を最少にすることを目的として、異なるインキュベーション工程についての反応時間及び温度を、この分野の専門家に公知の方法により、例えば抗ＦＶＩＩＩ抗体又は抗ＶＷＦ抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析を使用することにより最適化した。

修飾されたＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ分子の化学的架橋のために様々な試薬が使用され得る。これらは、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦの異なる反応性基の架橋に基づく：
ａ）アミン−アミン架橋剤（例えば、ビス−イミドエステル（ＰＥＧ）ｎ又はビス−スクシンイミドエステル（ＰＥＧ）ｎ）
ｂ）カルボキシル−カルボキシル架橋剤
ｃ）スルフヒドリル−スルフヒドリル架橋剤（例えば、ビス−マレイミド（ＰＥＧ）ｎ）
ｄ）炭水化物−炭水化物架橋剤
ｅ）アミン−スルフヒドリル架橋剤
ｆ）スルフヒドリル−炭水化物架橋剤
ｇ）スルフヒドリル−ヒドロキシル架橋剤
ｈ）カルボキシル−アミン架橋剤

実施例９：第ＶＩＩＩ因子活性及び抗原の分析
インビトロでのＦＶＩＩＩ：Ｃの活性測定のために、凝固アッセイ（例えば、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙにより供給されるＰａｔｈｒｏｍｔｉｎＳＬ試薬及びＦＶＩＩＩ欠乏血漿）又は発色アッセイ（例えば、Ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍにより供給されるＣｏａｍａｔｉｃＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ）のいずれかを使用した。これらのアッセイを製造者の指示に従って行った。

ＦＶＩＩＩ抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）を標準的ＥＬＩＳＡにより測定した。手短には、マイクロプレートを、１ウェルあたり１００μＬの捕捉抗体（ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩＩｇＧ、ＣｅｄａｒｌａｎｅＣＬ２００３５Ｋ−Ｃ、緩衝液Ａ［ＳｉｇｍａＣ３０４１］中１：２００希釈）とともに２時間周囲温度でインキュベートした。プレートを緩衝液Ｂ（ＳｉｇｍａＰ３５６３）で３回洗浄した後、サンプル希釈緩衝液（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）中の試験サンプルの段階希釈、さらにはサンプル希釈緩衝液中のＦＶＩＩＩ製剤の段階希釈（ＣＳＬＢｅｈｒｉｎｇ；２００〜２ｍＵ／ｍＬ）（１ウェルあたりの体積：１００μＬ）を２時間周囲温度でインキュベートした。緩衝液Ｂを用いた３回の洗浄工程の後、検出抗体（ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩＩｇＧ、ＣｅｄａｒｌａｎｅＣＬ２００３５Ｋ−Ｄ、ペルオキシダーゼ標識）の緩衝液Ｂ中の１：２希釈１００μＬを各ウェルに加え、そしてさらに１時間周囲温度でインキュベートした。緩衝液Ｂを用いた３回の洗浄工程の後、基質溶液（１：１０（体積／体積）ＴＭＢＯＵＶＦ：ＴＭＢ緩衝液ＯＵＶＧ、ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ）１００μＬをウェルごとに加え、そして３０分間周囲温度で暗所にてインキュベートした。停止溶液（ＤａｄｅＢｅｈｒｉｎｇ、ＯＳＦＡ）１００μＬを加えて、波長４５０ｎｍにて適切なマイクロプレートリーダーでの読み取りのためのサンプルを調製した。次いで、試験サンプルの濃度を、参照としてＦＶＩＩＩ製剤を用いた標準曲線を使用して計算した。

実施例１０：ＶＷＦ活性及び抗原の分析
サンプルを、ＶＷＦ：Ａｇの免疫比濁（ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ）測定（ＯＰＡＢ０３、ＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、そしてコラーゲン結合（ＴｅｃｈｎｏｚｙｍＶＷＦ：ＣＢＡＥＬＩＳＡ、Ｒｅｆ．５４５０３０１、較正セット５４５０３１０及び対照セット５４５０３１２、Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａを用いて）について製造者により記載されるように分析した。

ＶＷＦ：ＲＣｏ試験を、製造者の記載に従ってＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｒｂｕｒｇ、ＧｅｒｍａｎｙのＢＣＶＷＦ試薬を使用して行った。国際濃縮標準（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅＳｔａｎｄａｒｄ）を一次標準製剤として使用して日常的な使用のための社内標準製剤を較正した。

薬物動態分析のために、ＶＷＦ抗原を標準的ＥＬＩＳＡにより測定した。手短には、マイクロプレートを、１ウェルあたり１００μＬの捕捉抗体（ウサギ抗ヒトｖＷＦ−ＩｇＧ、ＤａｋｏＡ００８２［Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ］、緩衝液Ａ［ＳｉｇｍａＣ３０４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ］中で１：２０００希釈）とともに周囲温度で終夜インキュベートした。プレートを緩衝液Ｂ（ＳｉｇｍａＰ３５６３）で３回洗浄した後、各ウェルを、２００μＬ緩衝液Ｃ（ＳｉｇｍａＰ３６８８）とともに１．５時間周囲温度でインキュベートした（ブロッキング）。緩衝液Ｂを用いたさらに３回の洗浄工程の後、緩衝液Ｂ中の試験サンプルの段階希釈、さらには緩衝液Ｂ中の標準ヒト血漿の段階希釈（ＯＲＫＬ２１；２０〜０．２ｍＵ／ｍＬ；ＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（１ウェルあたりの体積：１００μＬ）を１．５時間周囲温度でインキュベートした。緩衝液Ｂを用いた３回の洗浄工程の後、検出抗体（ウサギ抗ヒトｖＷＦ−ＩｇＧ、ＤａｋｏＰ０２２６、ペルオキシダーゼ標識）の緩衝液Ｂ中の１：１６０００希釈１００μＬを各ウェルに加え、そして１時間周囲温度でインキュベートした。緩衝液Ｂでの３回の洗浄工程の後、基質溶液（ＯＵＶＦ、ＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１００μＬをウェルごとに加え、そして３０分間周囲温度で暗所にてインキュベートした。未希釈の停止希釈（ＯＳＦＡ、ＳｉｅｍｅｎｓＨｅａｌｔｈｃａｒｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１００μＬを加えて、波長４５０ｎｍでの適切なマイクロプレートリーダーにおける読み取りのためのサンプルを調製した。次いで試験サンプルの濃度を、参照として標準ヒト血漿を用いて標準曲線を使用して計算した。

実施例１１：ＶＷＦマルチマー分析
ＶＷＦマルチマー分析を、近年記載されたように（Ｔａｔｅｗａｋｉｅｔａｌ．，．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５２：２３−３２（１９８８）、及びＭｅｔｚｎｅｒｅｔａｌ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ４（Ｓｕｐｐｌ．３）：２５−３２（１９９８））少し改変してＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動により行った。手短には、ランニングバッファーで平衡化した後、使用準備のできた１％アガロースミニゲル（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、可能な限りこの方法を標準化した。同程度の量のＶＷＦ抗原をＳＤＳ−アガロースゲルでの電気泳動にかけた。ウェスタンブロット後に、タンパク質のバンドを、抗ＶＷＦ抗体、抗ＦＶＩＩＩ抗体又は抗アルブミン抗体、続いてアルカリホスファターゼ標識抗ＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ、製品番号１３０５）を使用して検出し、そして色反応を濃度測定により定量した。

共有結合ＦＶＩＩＩ−ＳＣ／ＶＷＦ−ＦＰマルチマー複合体の２つの製剤を、マルチマーゲル分析により分析した。図１０のレーン２及び３は、ＦＶＩＩＩ部分が、ＦＶＩＩＩとＣ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ配列との間にさらなるトロンビン切断部位を含むそのＣ末端に加えられたＶＷＦ由来Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ配列によりＶＷＦ−ＦＰマルチマーに連結されている物質を表す（実施例３）。レーン１は血漿由来ＶＷＦ、レーン４はＶＷＦ−ＦＰを表す。結果は、共有結合ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰ複合体が、ＷＦ−ＦＰ又は天然ＶＷＦと同様の程度まで確かに多量体化するということを実証する。さらなるバンドは、１つ又はそれ以上の共有結合ＦＶＩＩＩ分子の付加を表す。抗ＶＷＦ抗体により検出された大部分のマルチマーバンド（Ａ）はまた抗ＦＶＩＩＩでも染色することができ（Ｂ）、共有結合ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰマルチマーを実証する。

実施例１２：共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰ複合体の精製
共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰダイマー複合体を含有する細胞培養上清を、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過し、そして３０ｋＤａＵＦユニット（Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ^TM、Ｐａｌｌ）で２０倍まで濃縮した。共有結合で連結したＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰマルチマー複合体を含有する細胞培養上清を、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過し、そしてＣａｄｅｎｃｅ^TM使い捨てインライン濃縮器（３０ｋＤａカットオフ、Ｐａｌｌ）を用いて濃縮した。次いでこの物質を、平衡緩衝液（ＥＢ、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．０）で平衡化したヒトアルブミン捕捉選択カラム（ＢＡＣ）にアプライした。カラムをＥＢで洗浄し、そしてＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰ複合体をＥＢ中２ＭＭｇＣｌ₂で溶出した。溶出ピークをプールし、そして少し改変してＭｃＣｕｅｅｔａｌ．、２００９；Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ、１２１６（４５）：７８２４−３０に記載されるように、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、４００ｍＭＣａＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７を含有するＳＥＣＨｉＰｒｅｐＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００高分解能（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）のランニングバッファーに対して透析した。次いでこの物質を予め平衡化したＳＥＣＨｉＰｒｅｐＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００高分解能（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、そしてサイズにより分離した後、共有結合により連結されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰを含有するフラクションのみをプールし、そしてＳＥＣＨｉＰｒｅｐＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００高分解能（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。このプールを１．７ｍＭＣａＣｌ₂、１０ｍＭＬ−Ｈｉｓ、３０８ｍＭＮａＣｌ、８．７６ｍＭショ糖、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７に対して透析した。最後にこの物質をアリコートで凍結した。

あるいは、特定の構築物については、ＶＩＩＩ選択カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ヒトアルブミン捕捉選択カラムよりも良好な精製結果が得られ得る。このような場合、細胞培養上清濃縮物を予め平衡化されたＶＩＩＩ選択カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、そして平衡化緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５ｍＭＣａＣｌ₂、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０ｐＨ７）で洗浄した後、高塩濃度（１ＭＮａＣｌ）の平衡化緩衝液で洗浄し、次いで再び平衡化緩衝液で洗浄する。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰ複合体を、２０ｍＭＬ−Ｈｉｓ、５ｍＭＣａＣｌ₂、１５０ｍＭＮａＣｌ、６０％エチレングリコール、０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７で溶出した。溶出ピークをプールし、そして５０ｍＭＨＥＰＥＳ、４００ｍＭＣａＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７を含有するその後のＳＥＣカラムのランニングバッファに対して透析した。次いでこの物質を、予め平衡化したＳＥＣＨｉＰｒｅｐＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５００高解像度（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにアプライした。共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰを含有するフラクションをプールした。このプールを、１．７ｍＭＣａＣｌ₂、１０ｍＭＬ−Ｈｉｓ、３０８ｍＭＮａＣｌ、８．７６ｍＭショ糖、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７に対して透析した。最後に、この物質をアリコートで凍結した。

実施例１３：ＦＶＩＩＩ欠損マウス及びラットにおける共有結合で連結されたＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体の薬物動態分析。
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を、ＦＶＩＩＩ欠損マウス（１物質あたり１２匹のマウス）に１００ＩＵ（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）／体重１ｋｇの用量で静脈内投与した。血液サンプルを、交互サンプリングスキームを使用して適切な間隔で採取し、３動物／時点（サブセット１番についてｔ＝０分及び１６時間、サブセット２番について５分及び２４時間、サブセット３番について２時間及び４時間、そしてサブセット４番について８時間及び３２時間）からサンプルを得た。このスキームは、定量しようとする血漿濃度に対する血液サンプリングの潜在的効果を最少にするよう設計されている。血液を処理して血漿にし、そして分析まで急速冷凍した。その後、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ抗原含有量を特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（実施例７、９及び１０を参照のこと）により定量した。処置群の平均値を使用して、５分後のインビボ回収を計算した。式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋに従って排出のベータ期の時点を使用して半減期を計算したが、ｋは回帰線の傾きである。通常、抗原を薬物動態研究における基準として使用した。抗原及び機能的活性は相関すると予測される。

ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を、麻酔をかけたＣＤ／Ｌｅｗｉｓラット（物質あたり６匹のラット）に１００ＩＵ（ＶＷＦ：Ａｇ）／体重ｋｇの用量で静脈投与した。交互サンプリングスキームを使用して試験物質の適用の５分後に開始して適切な間隔で血液サンプルを採取し、３動物／時点からサンプルを得た（サブセット番号１についてｔ＝０、５、３０、９０分、４時間、１日、そしてサブセット番号２について０、１５分、１、２、８時間及び２日）。このスキームは、定量しようとする血漿濃度に対する血液サンプリングの潜在的影響を最少にするように設計される。血液を処理して血漿にし、そして分析まで急速冷凍して貯蔵した。その後、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ抗原含有量を特異的ＥＬＩＳＡ（上記参照）により定量した。処置群の平均値を使用して、５分後のインビボ回収を計算した。。式ｔ_1/2＝ｌｎ２／ｋに従って排出のベータ期の時点を使用して半減期を計算したが、ｋは回帰線の傾きである。通常、測定からの動物における固有のＦＶＩＩＩ活性のバックグラウンドを排除するために、抗原を正常動物における薬物動態研究における基準として使用した。抗原及び機能的活性は相関すると予測される。

ＶＷＦＣ３〜Ｃ６及びＣＫドメインが切断可能なリンカーを介してそのカルボキシ末端へと結合された１本鎖ＦＶＩＩＩ配列及びアルブミン融合ＶＷＦからなる共有結合ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＦＰ製剤（実施例３に記載されるとおり）を、ラットＰＫモデルにおけるそれらの半減期について試験した。図１１は、組み換えＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ、Ａにおける四角）、ＶＷＦ−ＦＰ（Ｂにおける四角）及び血漿由来ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ複合体（Ｈａｅｍａｔｅ、三角）と比較した、共有結合複合体（丸、図説明文においてＦＶＩＩＩ−ＣＫ＋ＶＷＦ−ＦＰと称される）の排出動態を示す。ＡはＦＶＩＩＩデータを示し（共有結合複合体は、実施例６に記載されるような特異的Ｅｌｉｓａにより測定される；全ての他の化合物はＦＶＩＩＩＥｌｉｓａにより測定した）、ＢはＶＷＦＥｌｉｓａのデータを示す。共有結合構築物の排出動態は、両方の部分が共有結合で結合されている場合に期待されるように、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ抗原が測定された場合に同様であった。ＦＶＩＩＩ抗原についての終末相半減期を７．９時間と計算し、ＶＷＦの終末相半減期を７．８時間と計算した。驚くべきことに、ＶＷＦ−ＦＰ対照（ＶＷＦ抗原）について計算された終末相半減期は非常に類似して８．１時間であった。クリアランス速度もまた共有結合複合体について９．８ＩＵ／ｍＬ／時間、そしてＶＷＦ−ＦＰについて１０．１ＩＵ／ｍＬ／時間と類似していた。ｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ）の半減期を２．５時間と計算し、これは遊離ＦＶＩＩＩの約３倍の共有結合複合体の半減期延長を生じるだろう。

これらの結果は、半減期を延長されたＶＷＦ分子へのＦＶＩＩＩ配列の共有結合が、ＦＶＩＩＩ分子の半減期を有意に、かつ非融合半減期延長ＶＷＦ分子の半減期と似た程度まで実際に延長するということを示す。

Claims

フォン・ビルブラント因子又はその変異体（ＶＷＦ）及び第ＶＩＩＩ因子又はその変異体（第ＶＩＩＩ因子）を含む共有結合で連結された複合体であって、該複合体は半減期延長部分を含み、ただし、これは一方のＦｃモノマーがＶＷＦに連結され、かつ他方のＦｃモノマーが第ＶＩＩＩ因子に連結されているヘテロダイマーＦｃ融合物ではない、上記共有結合で連結された複合体。
共有結合連結が、半減期延長部分によりもたらされるものではない、請求項１に記載の共有結合で連結された複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、ＶＷＦとジスルフィド架橋を形成するように修飾されている、請求項１又は請求項２に記載の共有結合で連結された複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、システイン残基での天然に存在するアミノ酸の置換又はシステイン残基の挿入により修飾されており、該システイン残基がＶＷＦ中のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する、請求項３に記載の共有結合複合体。
第ＶＩＩＩ因子中の置換される天然に存在するアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子ａ３ドメイン中のアミノ酸から選択される、請求項４に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子中の置換される天然に存在するアミノ酸が、ＦＶＩＩＩａ３ドメインのアミノ酸１６５３〜１６６０内若しくはアミノ酸１６６７〜１６７４内若しくはアミノ酸１６７５〜１６８８内に位置するか、又はシステインがＦＶＩＩＩａ３ドメインのアミノ酸１６５３〜１６６０若しくはアミノ酸１６６７〜１６７４若しくはアミノ酸１６７５〜１６８８の配列中に導入される、請求項４又は請求項５に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子中の置換される天然に存在するアミノ酸がＣ末端ドメイン中にある、請求項３に記載の複合体。
ＶＷＦは、システイン残基での天然に存在するアミノ酸の置換又はシステイン残基の挿入により修飾されており、該システイン残基が第ＶＩＩＩ因子中に導入されたシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
ＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸がＤ’若しくはＤ３ドメイン中のアミノ酸であり、又はシステイン残基の挿入がＤ’若しくはＤ３ドメイン中にある、請求項８に記載の複合体。
システイン残基が、ＴＩＬ’ドメイン、Ｅ’ドメイン、Ｄ３ドメイン、Ｃ８−３ドメイン、ＴＩＬ−３ドメイン若しくはＥ−３ドメイン中に挿入されているか、又はシステイン残基で置換されたＶＷＦ中の天然に存在するアミノ酸が、ＴＩＬ’ドメイン、Ｅ’ドメイン、Ｄ３ドメイン、Ｃ８−３ドメイン、ＴＩＬ−３ドメイン若しくはＥ−３ドメイン中の残基である、請求項８又は請求項９に記載の複合体。
ＶＷＦが、ＦＶＩＩＩ結合ドメインを含むか、又はＦＶＩＩＩ結合ドメインからなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子がＶＷＦの１つ又はそれ以上のドメインを含むように修飾されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子がＶＷＦのＣ末端ドメインＣＫを含むように修飾されている、請求項１２に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、ＶＷＦドメインＣ６、若しくはＣ５及びＣ６、Ｃ３〜Ｃ６、又はドメインＣ１〜Ｃ６のうちの１つ若しくはそれ以上、又はその変異体も含むように修飾されている、請求項１３に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、配列番号２の残基２７２４〜２８１２又はその変異体を含むが、ただし、システイン残基２７７３（又はその等価物）は保存されている、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の複合体。
Ｃ末端ＶＷＦドメインが、切断可能なリンカーによって第ＶＩＩＩ因子に結合されている、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合体。
切断可能なリンカーが、第ＶＩＩＩ因子のトロンビン切断部位のうちの１つを含む、請求項１６に記載の複合体。
リンカー配列が、それぞれａ３ドメイン及びＤ’Ｄ３ドメインを介して第ＶＩＩＩ因子とＶＷＦとの分子間相互作用を可能にするために十分な長さのペプチドを生じるさらなるアミノ酸残基を含む、請求項１６又は請求項１７に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、そのＣ末端若しくはＮ末端で、若しくは第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン内で修飾されているか、又は第ＶＩＩＩ因子のＢドメインを部分的若しくは完全に置き換えて修飾されている、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメイン又はそのフラグメントを含むように修飾されている、請求項１２又は請求項１９に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、そのＢドメインを部分的又は完全にＶＷＦＤ’Ｄ３ドメイン又はそのフラグメント若しくは変異体で置き換えることにより修飾されている、請求項２０に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、そのＢドメイン内に、又はそのＢドメインの代わりに、又はそのＢドメインの一部の代わりに、配列番号２の残基７４６〜１２４１若しくはその変異体若しくはフラグメントを含む、請求項２１に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が、第ＶＩＩＩ因子軽鎖のアミノ末端に相当するＶＷＦＤ’Ｄ３ドメインを有する２鎖分子として発現される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の複合体。
さらなるリンカー配列が、ＶＷＦのＤ’Ｄ３領域と第ＶＩＩＩ因子軽鎖ドメインとの間に導入される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子が遺伝子操作された第ＶＩＩＩ因子である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の複合体。
操作された第ＶＩＩＩ因子が、完全若しくは部分的なＢドメイン欠失を有するか、変異された第ＶＩＩＩであるか、又は半減期延長部分を有する融合ポリペプチドである、請求項２５に記載の複合体。
ＶＷＦがＶＷＦの半減期延長形態である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の複合体。
ＶＷＦの半減期延長形態が、半減期延長部分を有するＶＷＦの遺伝子操作された融合タンパク質である、請求項２６に記載の複合体。
半減期延長部分が、アルブミン又はその変異体若しくはフラグメント、免疫グロブリン定常領域並びにその部分及び変異体、例えばＦｃフラグメント又はその変異体、大きい流体力学的体積を有する溶媒和されたランダム鎖（例えばＸＴＥＮ又はＰＡＳ）、アファミン又はその変異体、アルファ−フェトプロテイン又はその変異体、ビタミンＤ結合タンパク質又はその変異体、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複合体。
ＶＷＦの血漿半減期が、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、ヘパロサンポリマー、エラスチン様ポリペプチド又はヒアルロン酸の結合により延長される、請求項１、２又は２７のいずれか１項に記載の複合体。
ＶＷＦがモノマーとして発現されるか、又はＶＷＦがダイマーとして発現される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の複合体。
ＶＷＦがマルチマーを形成する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の複合体。
共有結合連結が、１つ又はそれ以上の化学的に合成された架橋剤の使用により得られる、請求項１又は請求項３０のいずれか１項に記載の複合体。
第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦが、１つより多くの共有ジスルフィド結合又はペプチド若しくはタンパク質性リンカーにより接続される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の複合体。
真核生物細胞株において第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦを同時発現させることを含む、請求項１〜３２又は請求項３４のいずれか１項に記載の第ＶＩＩＩ因子及びＶＷＦの共有結合複合体を製造する方法。
出血障害の処置又は予防における使用のための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の共有結合複合体。
出血障害が血友病Ａ又はフォン・ビルブラント病である、請求項３６に記載の複合体。
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。