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CN107406493B - 具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子 - Google Patents

具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子 Download PDF

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CN107406493B
CN107406493B CN201680014025.4A CN201680014025A CN107406493B CN 107406493 B CN107406493 B CN 107406493B CN 201680014025 A CN201680014025 A CN 201680014025A CN 107406493 B CN107406493 B CN 107406493B
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Abstract

本发明涉及用于治疗凝血疾病的经修饰的VWF分子。

Description

具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子
发明领域
本发明涉及用于改善凝血疾病治疗的产品和方法。
发明背景
存在由凝血因子缺陷引起的各种出血性疾病。最常见的疾病是血友 病A和B，分别由凝血因子VIII(FVIII)和IX的缺陷引起。另一种 已知的出血性疾病是血管性血友病(vonWillebrand's disease，VWD)。
在血浆中，FVIII主要作为血管性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)的非共价复合物存在，其凝血功能是加速因子Ⅸa依赖 性X因子转化为Xa。
经典血友病或血友病A是遗传性出血性疾病。它是由凝血FVIII 的染色体X连锁缺陷引起的，几乎完全影响每10,000人发生的1至2 个个体的男性。X染色体缺陷由本身不患血友病的女性携带者传播。血 友病A的临床表现是出血倾向增加。
在进行预防性治疗的严重血友病A患者中，FVIII必须每周静脉内 (i.v.)约3次施用，因为FVIII的血浆半衰期短，约12至14小时。每 次i.v.施用麻烦，与疼痛相关，并且具有感染的风险，特别是因为这主 要由患者自己或被诊断患有血友病的儿童的父母在家进行。
因此，非常希望增加FVIII的半衰期，使得含有FVIII的药物组合 物不必太过频繁地施用。
已经进行若干尝试以延长非活化的FVIII的半衰期：通过减少其与 细胞受体的相互作用(WO 03/093313 A2、WO 02/060951 A2)，通过 将聚合物共价连接到FVIII(WO 94/15625、WO 97/11957和US 4970300)，通过包封FVIII(WO 99/55306)，通过引入新的金属结合 位点(WO 97/03193)，通过肽键(WO 97/40145和WO 03/087355)或 二硫键(WO 02/103024A2)将A2结构域共价连接到A3结构域或通过 将A1结构域共价连接到A2结构域(WO2006/108590)。
增强FVIII或VWF的功能半衰期的另一方法是通过FVIII的聚乙 二醇化(WO 2007/126808、WO 2006/053299、WO 2004/075923)或通 过VWF的聚乙二醇化(WO 2006/071801)，其中聚乙二醇化的VWF 通过增加的半衰期将间接地也增加存在于血浆中FVIII的半衰期。还已 经描述了FVIII的融合蛋白(WO 2004/101740、WO2008/077616和WO 2009/156137)。
VWF(其在不同形式的血管性血友病(VWD)中缺失、功能缺陷 或仅以减少量可用)是存在于哺乳动物血浆中的具有多种生理功能的多 聚体粘附糖蛋白。在初期止血期间，VWF作为血小板表面上的特异性 受体和细胞外基质成分如胶原蛋白之间的介质。此外，VWF作为促凝 血因子FVIII的载体和稳定蛋白。VWF在内皮细胞和巨核细胞中合成 为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列和cDNA序 列公开于Collins et al.1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA 84:4393–4397 中。前体多肽pre-pro-VWF由22个残基的信号肽、741-残基的前肽 (pro-peptide)和成熟血浆VWF中发现的2050残基的多肽组成 (Fischer etal.,FEBS Lett.351:345-348,1994)。在内质网中的信号肽 切割后，在VWF的两个单体之间形成C末端二硫桥。在通过分泌途径 的进一步运输期间，添加了13个N-连接和10个O-连接的碳水化合物 侧链(Canis et al.(2010)Journal of Thrombosis and Haemostasis,8:137-145；Canis et al.(2012)The Biochemical Journal,447:217-228)。更 重要的是，VWF二聚体通过N-末端二硫桥多聚化，741个氨基酸长度 的前肽在晚期高尔基体中被酶PACE/弗林蛋白酶切割掉。前肽以及 VWF的高分子量多聚体(VWF-HMWM)存储在内皮细胞的怀布尔- 帕拉德小体内或血小板的α-颗粒中。
一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A1结构域内切 割VWF。因此，血浆VWF由从500kDa的单个二聚体到由多达20多 个分子量超过10,000kDa的二聚体组成的多聚体的全范围的多聚体组 成。据此VWF-HMWM具有最强的止血活性，其可以在瑞斯托菌素辅 因子活性(VWF：RCo)中测定。VWF：RCo/VWF抗原的比例越高， 高分子量多聚体的相对量越高。
VWF中的缺陷是血管性血友病(VWD)的原因，其特征在于具有 或多或少明显的出血表型。3型VWD是VWF完全缺失的最严重形式， 1型VWD涉及VWF的定量损失，其表型可能非常轻微。2型VWD涉 及VWF的定性缺陷，可能与3型VWD一样严重。2型VWD具有许 多子形式，其中一些与高分子量多聚体的损失或减少有关。2a型Von VWD的特征在于中间和大型多聚体的损失。2B型VWD的特征在于最 高分子量多聚体的损失。
VWD是人中最常见的遗传性出血性疾病，可以通过用含有血浆或 重组来源的VWF的浓缩物的替代疗法来治疗。
在血浆中，FVIII以高亲和力结合VWF，其保护其免于过早的分解 代谢，因此，除了其在初期止血中的作用外，起到调节FVIII血浆水平 的关键作用，因此也是控制第二期止血的核心因素。结合VWF的非活 化FVIII的半衰期在血浆中约为12至14小时。在3型血管性血友病中， 不存在或几乎不存在VWF，FVIII的半衰期仅为约6小时，由于FVIII 的浓度降低，导致这种患者的轻度至中度血友病A的症状。VWF对 FVIII的稳定作用也已经用于帮助在CHO细胞中重组表达FVIII (Kaufman et al.1989,Mol Cell Biol)。
存在增加VWF、FVIII或这两个因子的半衰期的产品和方法的需 要。
发明概述
在分开的发明中，已经发现VWF单体强烈结合到钙型凝集素结构 域家族10成员A(CLEC10A)(其为存在于巨噬细胞上的受体蛋白)。 特别是可以证明，CLEC10A在VWF清清除中起关键作用。在本发明 中，还发现存在于VWF上的O-连接的聚糖位点2298与CLEC10A相互作用。因此，本发明提供在位置2298缺乏O-连接糖基化的经修饰的 VWF分子，以延长体内VWF分子的半衰期。
因此，本发明涉及在项目[1]至[21]中定义的主题：
[1]能够结合因子VIII的血管性血友病因子(VWF)分子，其包含 在氨基酸位置2298缺少O-糖基化位点的C1结构域。优选地，VWF分 子不是鼠的。更优选地，VWF分子是人的。
[2]根据项目[1]的VWF分子，其中存在于天然VWF中位置2298 的O-糖基化位点已经通过缺失或置换VWF氨基酸序列的位置2292至 2303的一个或多个氨基酸而失活。
[3]根据项目[2]的VWF分子，其中位置2298的苏氨酸已被缺失或 被除苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸置换。
[4]根据项目[3]的VWF分子，其中所述除苏氨酸和丝氨酸之外的氨 基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、 谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[5]根据前述任一项的VWF分子，其包含SEQ ID NO：10或11所 示的氨基酸序列。
[6]根据项目[2]的VWF分子，其中位置2295、2297和2302之一的 脯氨酸已被缺失或被不同氨基酸置换。
[7]根据前述项目中任一项的VWF分子，其具有比天然血浆衍生的 VWF降低的体内清除。
[8]VWF的C1结构域，其包含氨基酸位置2298的O-糖基化位点， 连接至半衰期延长部分，优选与人白蛋白融合。
[9]根据上述项目中任一项的VWF分子，相比于与天然血浆衍生的 VWF共同施用的因子VIII的半衰期，所述VWF分子能够增加与所述 VWF分子共同施用的因子VIII的半衰期。
[10]根据上述任一项的VWF分子，其用于治疗凝血疾病。
[11]根据项目[10]的VWF分子，其中所述凝血疾病是血友病A或 血管性血友病。
[12]根据项目[10]或[11]的VWF分子，其中所述治疗还包括施用因 子VIII分子。
[13]根据项目[12]的VWF分子，其中所述VWF分子和所述因子 VIII分子分别施用。
[14]药物组合物，其包含项目[1]至[9]中任一项的VWF分子。
[15]药盒，其包含(i)项目[1]至[9]中任一项的VWF分子和(ii) 因子VIII分子。
[16]根据项目[15]的药盒，其中所述VWF分子和所述因子VIII分 子包含在分开的组合物中。
[17]药盒，其包含(i)项目[1]至[9]中任一项的VWF分子和(ii) 因子VIII分子，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血疾病。
[18]项目[1]至[9]中任一项的VWF分子用于增加体内VIII因子的半 衰期的用途。
[19]根据项目[1]至[9]中任一项的VWF分子，其用于延长治疗性治 疗中因子VIII的半衰期。
[20]体内增加半衰期因子VIII的方法，包括向受试者施用有效量的 项目[1]至[9]中任一项的VWF分子。
[21]治疗凝血疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效量的项目 [1]至[9]中任一项的VWF分子。
附图说明
图1：成熟VWF单体的结构域结构、功能结合位点和聚糖位置
VWF单体的蛋白质结构显示称为A、C和D结构域的内部同源区 域。VWF与具有一系列生物功能的大量配体相互作用。每个成熟VWF 单体包含如图所示分布的13个N-连接(向上箭头)和10个O-连接(向 下箭头)糖基化位点。给出参与糖苷键的氨基酸的序列号。对VWF成 熟亚单位结构的修订注释改编和修改自Zhou et al.(2012)Blood 120(2): 449-458。
图2：用可溶性CLEC10A孵育胰蛋白酶消化VWF片段后在洗脱 液级分中检测到的主要O-聚糖
(NeuGc＝N-羟乙酰神经氨酸；GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺；Gal＝半 乳糖；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺)
核心2聚糖(A)、携带一个NeuGc残基的核心1聚糖(B)和用 二糖GlcNAcβ1,3Gal延长的核心2聚糖(C)被鉴定为存在于洗脱液 级分中的主要O-聚糖结构。胰蛋白酶消化VWF片段与可溶性 CLEC10A孵育后，洗涤和洗脱结合的VWF肽，游离聚糖的 MALDI-TOF-MS分析显示，与CLEC10A孵育前的起始物质相比，聚 糖结构A(浓缩因子>40)、B(因子9)和C(因子7)的显著富集。 三种显示的O-聚糖占所有O-聚糖结构的约80％(与结构B相关的40％， 而A和C分别占20％)。
详述
在第一方面，本发明涉及能够结合因子VIII的经修饰的血管性血 友病因子(VWF)分子，其包含在氨基酸位置2298缺少O-糖基化位点 的C1结构域。
VWF
本文所用的术语“血管性血友病因子”(VWF)包括天然存在的(天 然的)VWF，还包括其变体，例如，片段，融合蛋白或缀合物，或其中 一个或多个残基已被插入、缺失或被置换但保留天然存在的VWF的生 物学活性的序列变体。如果VWF变体保留至少10％，优选至少25％， 更优选至少50％，最优选至少75％的野生型VWF的至少一种生物活性， 则生物活性在本发明的意义上得到保留。野生型VWF及其变体的生物 活性可由本领域技术人员使用瑞斯托菌素辅因子活性的方法(Federici A B et al.2004.Haematologica 89:77-85)，VWF与血小板中的糖蛋白 复合物Ib-V-IX的GP Ibα的结合(Sucker et al.2006.Clin ApplThromb Hemost.12:305-310)，胶原结合测定(Kallas&Talpsep.2001. Annals ofHematology 80:466-471)，或因子VIII结合测定(Veyradier et al.(2011)Haemophilia,vol.17,pp 944-951)来测定。
编码人天然VWF的基因被转录成9kb的mRNA，其被翻译成2813 个氨基酸的前原多肽(pre-propolypeptide)，估计分子量为310,000Da。 前原肽含有22个氨基酸的信号肽、741个氨基酸的前多肽 (pro-polypeptide)(SEQ ID NO：2的氨基酸23-763)和成熟亚单位(SEQ ID NO：2的氨基酸764-2813)。来自N末端的741个氨基酸的 前多肽切割导致由2050个氨基酸组成的成熟VWF。人天然VWF前原 多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2中。除非另有说明，否则本申请 中VWF残基的氨基酸编号参考SEQ ID NO：2，即便VWF分子不包 含SEQ IDNO：2的所有残基也是如此。除非另有说明，否则本文所用 的术语“VWF”是指VWF的成熟形式。
天然VWF的前多肽包含多个结构域。可以在文献中找到不同的结 构域注释(参见例如Zhou et al.(2012)Blood 120(2):449-458)。在本申 请中应用VWF的天然前多肽的以下结构域注释(参见图1)：
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
参考SEQ ID NO：2，D'结构域由氨基酸764-865组成；D3结构域 由氨基酸866-1242组成；并且C1结构域由氨基酸2255-2328组成。
“经修饰的”VWF分子具有与成熟人天然VWF(SEQ ID NO：2 所示氨基酸的氨基酸764-2813)的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
本发明的经修饰的VWF分子包含在氨基酸位置2298缺少O-糖基 化位点的VWF的C1结构域。包含在本发明的经修饰的VWF分子中 的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸2255-22328具有 至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的序列 同一性。
在优选的实施方案中，存在于SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2328 中的一个、两个或三个(但不是更多个)氨基酸在本发明的经修饰的 VWF分子中包含的C1结构域中被缺失和/或置换。
在第一个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2328，除了三个氨基酸，其中所述三个氨基酸中 的每一个已被缺失或被在SEQ IDNO：2中的相应位置不存在的氨基酸 置换。也就是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸 序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于三个 (并且不是更多个)氨基酸。
在第二个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2328，除了两个氨基酸，其中所述两个氨基酸中 的每一个已被缺失或被在SEQ IDNO：2中的相应位置不存在的氨基酸 置换。也就是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸 序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于两个 (并且不是更多个)氨基酸。
在第三个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸2255-2333，除了一个氨基酸，其中所述一个氨基酸已 被缺失或被在SEQ ID NO：2中的相应位置不存在的氨基酸置换。也就 是说，本发明的经修饰的VWF分子的C1结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的C1结构域的氨基酸序列的不同之处在于一个(并且不是更 多个)氨基酸。
优选地，VWF氨基酸序列的位置2298的O-糖基化位点通过缺失 位置2298的苏氨酸或用不同的氨基酸、优选用除苏氨酸和丝氨酸之外 的氨基酸置换而失活。
因此，本发明在另一个实施方案中提供了包含SEQ ID NO：10所 示氨基酸序列的经修饰的VWF分子。在优选的方面，本发明的VWF 分子包括：
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa不存在；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是甘氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是丙氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是精氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬酰胺；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是半胱氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酰胺；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是组氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是异亮氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是亮氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是赖氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是甲硫氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是苯丙氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是脯氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是色氨酸；
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是酪氨酸；或者
-SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa是缬氨酸。
通常，本发明的经修饰的VWF分子还包含D'D3结构域。优选地， 经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸764至1242，或与由 SEQ ID NO：2的氨基酸764至1242组成的氨基酸序列具有至少90％， 优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列组成。 在优选的方面，本发明的VWF分子包含或由以下组成：
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa不存在；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是甘氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是丙氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是精氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬酰胺；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是天冬氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是半胱氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是谷氨酰胺；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是组氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是异亮氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是亮氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是赖氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是甲硫氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是苯丙氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是脯氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是色氨酸；
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是酪氨酸；或者
-SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa是缬氨酸。
或者，位置2298的O-糖基化位点通过缺失或置换参与由糖基转移 酶识别糖基化位点的一个或多个氨基酸而失活。推定的糖基化基序包含 VWF的氨基酸2292-2303。在一个实施方案中，位置2295、2297和/或 2302的至少一个脯氨酸被缺失或被不同的氨基酸置换。或者，位置2292、 2293和/或2303的至少一个苏氨酸缺失或被不同的氨基酸置换。
本发明的经修饰的VWF分子能够结合至因子VIII分子，和/或其 包含D'结构域和D3结构域(例如SEQ ID NO：3的D'结构域和D3结 构域)。优选地，经修饰的VWF分子能够结合人天然因子VIII的成熟 形式。在另一个实施方案中，经修饰的VWF分子能够结合由氨基酸序 列SEQ ID NO：12组成的单链因子VIII分子。
基于先前报道的方法描述(Veyradier et al.(2011)Haemophilia,vol. 17,pp944-951)，VWF与因子VIII的结合可以通过使用市售分布的即 用型ELISA试剂盒(Asserachrom VWF：FVIIIB，Diagnostica Stago， Asnieres，France)来测定。样品用测试试剂盒供应商分别定义的即用 型稀释缓冲液稀释。存在于待测试样品中的VWF被预先包被在微量滴 定板上的兔抗人VWF多克隆抗体捕获。随后，潜在的内源性FVIII与 VWF分离并消除。在加入与捕获的VWF相互作用的重组FVIII后， 与过氧化物酶偶联的小鼠单克隆抗人FVIII抗体与附着的FVIII结合， 并且在5分钟的反应时间后用1M硫酸停止随后的底物反应在450nm进 行光度测定定量。测试结果通过使用测试试剂盒相关标准进行计算。
或者，例如，如Bendetowicz et al.(1998)Blood,vol 92,No 2:pp 529-538所述，可以使用流式细胞计数/平衡结合测定。
因子VIII
术语“因子VIII”和“FVIII”在本文中同义使用。“FVIII”包括 FVIII的天然等位基因变异，可能存在并发生于从一个个体到另一个个 体。使用熟知的生产和纯化方法，FVIII可以是血浆衍生的或重组产生 的。糖基化、酪氨酸硫酸化和其他翻译后修饰的程度和位置可以变化， 这取决于所选择的宿主细胞及其生长条件。
术语FVIII包括FVIII类似物。本文所用的术语“FVIII类似物” 是指与FVIII的野生型氨基酸序列(即由UniProt标识P00451定义的 序列)相比，其中一个或多个氨基酸已被置换或缺失的FVIII分子(全 长或B结构域截短/缺失或单链FVIII)，或对于B结构域截短/缺失的 FVIII分子，该氨基酸序列的相应部分。FVIII类似物不是在自然界中 发生，而是通过人类操作获得的。根据本发明使用的因子VIII分子也 可以是B结构域截短/缺失的FVIII分子，其中剩余的结构域对应于 FVIII野生型氨基酸序列的氨基酸编号1-740和1649-2332所示的序列。 其他形式的B结构域缺失的FVIII分子在其a3结构域中另外具有部分 缺失，这得到单链FVIII分子。
因此，这些FVIII分子是在转化的宿主细胞(优选哺乳动物来源) 中产生的重组分子。然而，B结构域缺失的FVIII(即三个A-结构域， 两个C结构域以及a1，a2和a3区域)中的剩余结构域可能略有不同， 例如与各自野生型氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)有约1％， 2％，3％，4％或5％的氨基酸序列的不同。
根据本发明使用的FVIII分子可以是双链FVIII分子或单链FVIII 分子。包含在本发明组合物中的FVIII分子也可以是FVIII的生物活性 片段，即其中除了B结构域之外的一个或多个结构域已被缺失或截短的 FVIII，但其中缺失/截短形式的FVIII分子保留其支持血块形成的能力。 可以使用本领域熟知的技术在体外评估FVIII活性。根据本发明的用于测定FVIII活性的优选测试是显色底物测定或一步测定(参见下文)。 可以在其余的结构域中引入氨基酸修饰(置换，缺失等)，例如以修饰 因子VIII与如下的各种其它成分的结合能力：例如，VWF，低密度脂 蛋白受体相关蛋白(LPR)，各种受体，其他凝血因子，细胞表面等，或为了引入和/或消除糖基化位点等。不消除FVIII活性的其他突变也可 以适用于本发明组合物中使用的FVIII分子/类似物。
FVIII类似物还包括FVIII分子，其中亲本多肽的一个或多个氨基 酸残基已被缺失或被其它氨基酸残基置换，和/或其中另外的氨基酸残基 已添加到亲本FVIII多肽中。
此外，因子VIII分子/类似物可以在例如截短的B结构域中和/或在 分子(“FVIII衍生物”)的一个或多个其他结构域中包括其它修饰。 这些其它修饰可以是与因子VIII分子缀合的各种分子的形式，例如， 聚合物化合物，肽化合物，脂肪酸衍生化合物等。
术语FVIII包括糖基化的FVIII。在本发明的上下文中，术语“糖 基化的FVIII”旨在表示其中一个或多个PEG基团已通过多肽的多糖侧 链(聚糖)连接到FVIII多肽上的因子VIII分子(包括全长FVIII和B 结构域截短/缺失的FVIII)。
术语FVIII包括具有保护基或半衰期延长部分的FVIII分子。术语 “保护基”/“半衰期延长部分”在本文中被理解为指连接至一个或多个 氨基酸位点链功能度(例如-SH，-OH，-COOH，-CONH2，-NH2或 一种或多种N-和/或O-聚糖结构)的一个或多个化学基团，并且当与许 多治疗性蛋白质/肽缀合时可以增加这些蛋白质/肽的体内循环半衰期。 保护基/半衰期延长部分的实例包括：生物相容性脂肪酸及其衍生物，羟 烷基淀粉(HAS)，例如。羟基乙基淀粉(HES)，聚(Glyx-Sery)n(高 氨基酸聚合物(HAP))，透明质酸(HA)，肝素前体(Heparosan) 聚合物(HEP)，磷酰胆碱基聚合物(PC聚合物)，
Figure BDA0001399754850000121
聚合物(Mersana Therapeutics,MA,USA)，葡聚糖，聚唾液酸(PSA)，聚乙 二醇(PEG)，Fc结构域，转铁蛋白，白蛋白，弹性蛋白样肽，
Figure BDA0001399754850000122
聚合物(Amunix,CA,USA)，白蛋白结合肽，血管性血友病因子片段 (vWF片段)，羧基末端肽(CTP肽，Prolor Biotech,IL)及其任何 组合(参见例如McCormick,C.L.,A.B.Lowe,and N.Ayres, Water-Soluble Polymers,于Encyclopedia of Polymer Science and Technology.2002,John Wiley&Sons,Inc.)。衍生化的方式不是关键的， 可以从上面内容得到阐明。
可以根据本发明使用的FVIII分子包括融合蛋白，其包含与异源氨 基酸序列、优选半衰期延长的氨基酸序列融合的FVIII氨基酸序列。优 选的融合蛋白是Fc融合蛋白和白蛋白融合蛋白。术语“Fc融合蛋白” 在本文中旨在涵盖与可以衍生自任何抗体同种型的Fc结构域融合的 FVIII。由于IgG抗体的相对长的循环半衰期，IgG Fc结构域通常是优 选的。此外可以修饰Fc结构域以便调节某些效应子功能，例如，补体 结合和/或结合某些Fc受体。FVIII与具有结合FcRn受体能力的Fc结 构域的融合通常会导致与野生型FVIII的半衰期相比，融合蛋白的循环 半衰期延长。因此，用于本发明的FVIII分子也可以是FVIII类似物的衍生物，例如FVIII类似物的融合蛋白，聚乙二醇化或糖基化聚乙二醇 化FVIII类似物，或与肝素前体聚合物缀合的FVIII类似物。本文中术 语“白蛋白融合蛋白”意在涵盖与白蛋白氨基酸序列或其片段或衍生物 融合的FVIII。异源氨基酸序列可以融合到FVIII的N-或C-末端，或者 它可以内部插入FVIII氨基酸序列内。异源氨基酸序列可以是WO 2008/077616A1中描述的任何“半衰期延长多肽”，其公开内容通过引 用并入本文。
用于本发明组合物的FVIII分子的实例包括例如在WO 2010/045568、WO 2009/062100、WO 2010/014708、WO 2008/082669、 WO 2007/126808、US 2010/0173831、US 2010/0173830、US 2010/0168391、US 2010/0113365、US 2010/0113364、WO 2003/031464、 WO2009/108806、WO 2010/102886、WO 2010/115866、WO 2011/101242、WO 2011/101284、WO2011/101277、WO 2011/131510、 WO 2012/007324、WO 2011/101267、WO 2013/083858和WO2004/067566中描述的FVIII分子。
可用于本发明组合物中的FVIII分子的实例包括
Figure BDA0001399754850000131
Figure BDA0001399754850000132
的活性成分以及WO 2008/135501、WO 2009/007451中所述的FVIII分子和WO 2004/067566的称为 “dBN(64-53)”的构建体(SEQ ID NO：12)。
治疗凝血疾病
本发明的经修饰的VWF分子可用于治疗凝血疾病，包括但不限于 血友病和血管性血友病。优选地，该疾病是血友病A或血管性血友病。
术语“血友病A”是指功能性凝血FVIII缺乏症，其通常是遗传的。
术语“血管性血友病”(VWD)是指与VWF的定性或定量缺乏有 关的凝血异常症。
疾病的治疗包括已经在任何临床阶段或症状时诊断为具有任何形 式的疾病的患者的治疗；疾病的症状或指征的发作或进展或加重或恶化 的延缓；和/或预防和/或降低疾病的严重性。
向其施用经修饰的VWF分子的“受试者”或“患者”可以是哺乳 动物，例如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类(例 如猴或人)。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。
本文描述了包含本发明的经修饰的VWF分子和任选的一种或多种 另外的治疗剂如下述第二治疗剂的组合物。组合物通常作为包括药学上 可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合 适的形式(取决于将其施用于患者的所需方法)。
本发明的经修饰的VWF分子可以通过各种途径施用于患者，例如 经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、鞘内、外用或局部。任何给 定情况下最合适的给药途径将取决于待施用的具体分子、受试者、疾病 的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，静脉内施用本发明的 经修饰的VWF分子。
在典型的实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子以足以允许以 0.5mg/kg至20mg/kg静脉内施用的浓度存在于药物组合物中。在一些实 施方案中，适用于本文所述的组合物和方法的抗体浓度包括但不限于 0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、 5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、 12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、 19mg/kg、20mg/kg，或者在任何上述值之间的范围，例如1mg/kg至 10mg/kg、5mg/kg至15mg/kg或10mg/kg至18mg/kg。
本发明的经修饰的VWF分子的有效剂量可以为每个单次(例如， 推注)施用、多次施用或连续施用约0.001至约750mg/kg，或达到血清 浓度为每个单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用0.01-5000μg/ml 血清浓度或其中根据所治疗的病症、施用途径和受试者的年龄、体重和 状况的任何有效范围或值。在某些实施方案中，每个剂量可以为每千克体重约0.5mg至约50mg或每千克体重约3mg至约30mg。本发明的经 修饰的VWF分子可以配制为水溶液。
药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的本发明的经修饰的 VWF分子的单位剂量形式存在。这样的单位可以含有0.5mg至5g，例 如但不限于1mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、100mg、200 mg、300mg、400mg、500mg、750mg、1000mg，或者在任何上述值 之间的范围，例如10mg至1000mg、20mg至50mg或30mg至300mg。 药学上可接受的载体可以取决于例如待治疗的病症或施用途径的多种 形式。
用本发明的经修饰的VWF分子确定有效剂量、总剂量数和治疗长 度完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研 究来确定。
可以通过将具有所需纯度的经修饰的VWF分子与任选的本领域通 常使用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称 为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子洗涤剂、 抗氧化剂和其它各种添加剂混合制备适用于本文所述方法的本发明的 经修饰的VWF分子的治疗剂型，作为冻干制剂或水溶液储存。参见 Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition(Osol,ed.1980)。这 样的添加剂所用的剂量和浓度必须对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH值保持在接近生理条件的范围内。它们可以以 约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及 其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物，柠 檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠柠檬酸盐混合物等)，琥 珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合 物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸缓冲剂(例如酒石酸-酒石 酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)， 富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠 混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲剂(例如 葡萄糖酸-葡糖酸钠混合物，葡萄糖酸-氢氧化钠混合物，葡萄糖酸-葡萄 糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢 氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳 酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐 缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外， 可以使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
可以加入防腐剂以延迟微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v) 的量加入防腐剂。合适的防腐剂包括苯酚，苄醇，间甲酚，对羟基苯甲 酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苄基卤化铵 (例如氯化物、溴化物和碘化物)，六氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯如 对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和 3-戊醇。可以加入有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等 渗性，并且等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高的糖醇，例如甘 油，赤藓醇，阿糖醇，木糖醇，山梨醇和甘露醇。稳定剂是指广泛类型 的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到添加剂，所述添加剂溶解治疗剂 或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇 (上面列举的)；氨基酸如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰 胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨 酸等，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木 糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括环多醇如肌醇；聚乙二醇； 氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫 代甘油，α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少 的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲 水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以 活性蛋白质重量的0.1至10,000重量/份存在。
可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助 溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂 暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂 包括聚山梨醇酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，普朗尼克 多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0001399754850000171
-20、
Figure BDA0001399754850000172
-80等)。 非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml 至约0.2mg/ml的范围存在。
附加的其它赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如EDTA)， 抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)和助溶剂。
除了本发明的经修饰的VWF分子之外，本文的制剂还可以含有第 二治疗剂。合适的第二治疗剂的实例提供如下。
给药方案可以根据许多临床因素(包括疾病的类型、疾病的严重程 度和患者对本发明的经修饰的VWF分子的敏感性)从每月一次到每天 发生变化。在具体实施方案中，本发明的经修饰的VWF分子以下面的 方式施用：每天，每周两次，每周三次，每5天，每10天，每两周， 每三周，每四周一次或每月一次，或在上述值中的任意两个值之间的任 何范围，例如从每四个星期到每个月，从每10天到每两周，或每周两 到三次等。
所施用的本发明的经修饰的VWF分子的剂量将根据具体的经修饰 的VWF分子、受试者以及疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、 治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)和所选择的施用途径；可以由 本领域技术人员容易地确定合适的剂量。
本领域技术人员将认识到，本发明的经修饰的VWF分子的单个剂 量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度、施用形式、途径和部 位以及受治疗的特定受试者的年龄和状况确定，以及医生将最终确定要 使用的合适的剂量。每当合适时，该剂量可以重复。如果发展出副作用， 剂量的量和/或频率可以根据正常的临床实践改变或减少。
联合治疗
优选地，用本发明的经修饰的VWF分子治疗的患者也用凝血疾病 的常规疗法进行治疗。例如，患有血友病的患者通常也用凝血因子VIII (因子VIII)进行治疗。
根据本发明使用的组合物中因子VIII的浓度通常在 10-10,000IU/mL的范围内。在不同的实施方案中，本发明组合物中FVIII 分子的浓度在10-8,000IU/mL、或10-5,000IU/mL、或20-3,000IU/mL、 或50-1,500IU/mL的范围内或者是3,000IU/mL、或2,500IU/mL、或 2,000IU/mL、或1,500IU/mL、或1,200IU/mL,1,000IU/mL、或800 IU/mL、或600IU/mL、或500IU/mL、或400IU/mL、或300IU/mL、 或250IU/mL、或200IU/mL、或150IU/mL、或100IU/mL。
“国际单位”或“IU”是通过FVIII活性测定测量的FVIII的凝血 活性(效力)的量度单位，所述FVIII活性测定例如使用针对在“IU” 中校准的国际标准制剂的标准校准的一步凝血测定或显色底物FVIII活 性测定。一步凝血测定是本领域已知的，例如在N Lee,Martin L,et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIIIConcentrates, Thrombosis Research(Pergamon Press Ltd.)30,511 519(1983)中描述的。一步测定的原理：测试作为激活的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT) -测定的修改版本进行：血浆与磷脂和表面活化剂的孵育导致内源性凝血 系统因子的激活。加入钙离子会引发凝血级联。测定形成可测量的纤维 蛋白凝块的时间。该测定在因子VIII缺乏血浆的存在下进行。缺乏血 浆的凝血能力由待测样品中包含的凝血因子VIII恢复。凝血时间的缩 短与样品中存在的因子VIII的量成正比。通过与国际单位中具有已知 因子VIII活性的标准制剂直接比较来定量凝血因子VIII的活性。
另一个标准测定是显色底物测定。显色底物测定可以商业购买，例 如coamaticFVIII测试试剂盒(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V.le Monza 338-20128Milano,Italy)。显色测定的原 理：在钙和磷脂存在下，因子X被因子IXa激活成因子Xa。因子VIIIa 作为辅因子刺激该反应。FVIIIa由反应混合物中的少量凝血酶从待测样 品中的FVIII形成。当使用最佳浓度的Ca2+、磷脂和因子IXa和过量 的因子X时，因子X的活化与因子VIII的效力成正比。活化的因子X 从显色底物S-2765中释放发色团pNA。因此，在405nm处测量的pNA 的释放与所形成的FXa的量成比例，因此也与样品的因子VIII活性成比例。
在一个实施方案中，治疗包括将本发明的经修饰的VWF分子和因 子VIII施用于患有血友病、优选血友病A的患者。
在另一个实施方案中，治疗包括将本发明的经修饰的VWF分子和 能够结合CLEC10A的化合物施用于患有血友病、优选血友病A的患者。
在另一个实施方案中，治疗包括将本发明的经修饰的VWF分子和 因子VIII分子和能够结合CLEC10A的化合物施用于患有VWD或血友 病、优选血友病A的患者。
在一个具体实施方案中，同时施用本发明的经修饰的VWF分子和 第二治疗剂(例如因子VIII和/或能结合CLEC10A的化合物)。在另 一个实施方案中，分别施用本发明的经修饰的VWF分子和第二治疗剂 (例如因子VIII和/或能结合CLEC10A的化合物)。施用本发明的经 修饰的VWF分子和第二治疗剂(例如因子VIII和/或能够结合 CLEC10A的化合物)之间的时间没有特别限制。优选本发明的经修饰 的VWF分子在能够结合CLEC10A的化合物之前施用。
CLEC10A
CLEC10A(也称为巨噬细胞Gal型凝集素)是CLEC家族的人II 型跨膜受体蛋白。其他同义词是C型凝集素超家族成员14，巨噬细胞 凝集素2和CD301。CLEC10A与肝脏ASGPR蛋白密切相关，但由中 等单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达。如本文所用，术语“CLEC10A”是指具有或由在标识Q8IUN9-1、Q8IUN9-2和Q8IUN9-3 之一下的UniProt数据库中显示的氨基酸序列组成的人蛋白质。最优选 地，CLEC10A包含在标识Q8IUN9-1下的UniProt数据库中显示的氨 基酸序列或由其组成。
能够结合CLEC10A的化合物
能够结合CLEC10A的化合物(以下称为“该化合物”)的类型或 类别没有特别限定。然而，优选地，该化合物是肽或多肽，最优选地， 该化合物是抗体或其片段。
本文所用的术语“抗体”是指与特定抗原结合或具有免疫反应性的 免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、遗传工程化和其他修饰形 式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、异源缀合抗 体(例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)、抗体的单域抗 体(纳米抗体)和抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、 rIgG和scFv片段。此外，除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mAb) 意在包括完整分子以及抗体片段(例如Fab和F(ab')2片段)，其能够 结合蛋白质。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的Fc片段，从动物或植 物的循环中更快地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(Wahl et al,1983,J.Nucl.Med.24:316)。
在本发明使用的抗体能够结合CLEC10A的至少一种变体。在其它 实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的细胞外结构域，例如结合 CLEC10A的氨基酸序列的氨基酸61-316内的表位。优选地，本发明的 抗体与CLEC10A的凝集素结合位点结合。
还优选抗体特异性结合CLEC10A。在一个实施方案中，抗体能够 结合CLEC10A，但不能结合以下所有受体：ASGPR1、COLEC12、 CLEC4F、CLEC4M、SCARA5和MMR。在另一个实施方案中，抗体 能够结合CLEC10A，但不能结合ASGPR1(UniProt标识：P07306)。 在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合COLEC12 (UniProt标识：Q5KU26)。在另一个实施方案中，抗体能够结合 CLEC10A，但不能结合CLEC4F(UniProt标识：Q8N1N0)。在另一 个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合CLEC4M (UniProt标识：Q9H2X3)。在另一个实施方案中，抗体能够结合 CLEC10A，但不能结合SCARA5(UniProt标识：Q6ZMJ2)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但不能结合MMR(UniProt 标识：P22897)。在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A，但 不能结合以下受体中任何一种：ASGPR1、COLEC12、CLEC4F、 CLEC4M、SCARA5和MMR。
在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的至少一种鼠直系 同源物。在该实施方案中，抗体可能能够结合MGL1、MGL2或MGL1 和MGL2两者。抗体可能能够结合具有或由UniProt标识P49300中定 义的氨基酸序列组成的蛋白质。抗体可能能够结合具有或由UniProt标 识F8WHB7中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。抗体可能能够结合具 有或由UniProt标识Q8JZN1中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。
在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的大鼠直系同源物。 在另一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的兔直系同源物。在另 一个实施方案中，抗体能够结合CLEC10A的食蟹猴(macaca fascicularis)直系同源物和/或普通猕猴(macaca mulatta)直系同源物。
由CLEC10A和抗体形成的复合物的解离常数KD优选小于100nM， 更优选小于10nM，最优选小于5nM。通常，KD范围为约10pM至约 100nM，或约100pM至约10nM，或约500pM至约5nM。
优选地，在本发明中使用的抗体是单克隆抗体。本文所用的术语“单 克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是 指衍生自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，并且 不是产生其的方法。单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备， 包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。(Harlow and Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual"CSH Press 1988,Cold Spring Harbor N.Y.)。
在其他实施方案中，包括在人中体内使用抗CLEC10A抗体，可以 使用嵌合、灵长类、人源化或人抗体。在优选的实施方案中，抗体是人 抗体或人源化抗体，更优选单克隆人抗体或单克隆人源化抗体。
本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有衍生自非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体的制备方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi etal,1986, BioTechniques 4:214-221；Gillies et al.,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816397，其全部内容通过 引用并入本文。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球 蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他目标结合子 序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体 将包含基本上全部的至少一个、通常为两个可变结构域，其中所有或基 本上所有的对应于非人免疫球蛋白的CDR区域和全部或基本上所有的 FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫 球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是所选择的人免疫球蛋白模板 的一部分。人源化是制备嵌合抗体的技术，其中人可变结构域的一个或 多个氨基酸或部分已经被来自非人物种的相应序列所置换。人源化抗体 是在非人物种中产生的结合期望的抗原的抗体分子，其具有来自非人物 种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架 (FR)区域。通常，人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的 相应残基置换，以改变(优选改善)抗原结合。这些框架置换通过本领 域熟知的方法来鉴定，例如，通过CDR和框架残基的相互作用的建模 来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较来鉴定在特定 位置处的异常框架残基。参见例如Riechmann et al.,1988,Nature 332:323-7和Queen et al.的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、 5,693,762和6,180,370(其各自的全部内容通过引用并入本文)。抗体 可以使用本领域已知的各种技术进行人源化，包括例如CDR移植(EP239400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539、5,530,101 和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP592106； EP519596；Padlan,1991,MoI.Immunol,28:489-498；Studnicka et al, 1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska et al,1994,Proc.Natl.Acad.Sci. 91:969-973)和链置换(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)，所 有这些的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，如Queen et al的美国专利号5,530,101、 5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370(其各自的全部内容通过 引用并入本文)中所述制备人源化抗体。
在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是人抗体。完全“人”抗 CLEC10A抗体对于人类患者的治疗性治疗可能是期望的。如本文所用， “人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人 免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因并且不表达内源 性免疫球蛋白的动物分离的抗体。可以通过本领域已知的多种方法制备 人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上文所述噬菌体 展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、 WO 96/33735和WO 91/10741，其各自的全部内容通过引用并入本文。也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白 基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如PCT公开WO 98/24893、 WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；美国专利号5,413,923、 5,625,126；5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、 5,885,793、5,916,771和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。可 以使用称为“指导的选择(guided selection)”的技术来产生识别所选 表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗 体)用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers et al,1988, Biotechnology 12:899-903)。
在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是灵长类化抗体。术语“灵 长类化抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。产生灵长类化抗体 的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,658,570、5,681,722和 5,693,780，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是衍生化抗体。例如但不限 于，已经通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知的 保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连 接进行了修饰的衍生化抗体(参见下文关于抗体缀合物的讨论)等。许 多化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特异性 化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以 含有一种或多种非经典氨基酸。
在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体或其片段可以是这样的抗体 或抗体片段，其序列已被修饰以相对于相应的野生型序列减少至少一个 恒定区介导的生物效应子功能。为了修饰抗CLEC10A抗体，使得其表 现出与Fc受体的结合降低，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在Fc受 体(FcR)相互作用所需的特定区域突变(参见例如，Canfield andMorrison,1991,J.Exp.Med.173:1483-1491；和Lund et al,1991,J. Immunol.147:2657-2662)。抗体的FcR结合能力的降低还可以降低依 赖于FcR相互作用的其它效应子功能，例如调理作用和吞噬作用以及抗 原依赖性细胞毒性。
另一方面，抗CLEC10A抗体或其片段可以是已被修饰以增加或降 低其与胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的抗体或抗体片段。为了改变 对FcRn的结合亲和力，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在FcRn相 互作用所必需的特定区域突变(参见例如WO 2005/123780)。增加对 FcRn的结合亲和力应该增加抗体的血清半衰期，降低对FcRn的结合 亲和力应相反地降低抗体的血清半衰期。在具体实施方案中，抗 CLEC10A抗体是IgG类的抗体，其中重链恒定区的氨基酸残基250、 314和428中的至少一个被用未修饰抗体中存在的氨基酸残基不同的氨 基酸残基置换。IgG类抗体包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的抗体。 置换可以在单独的位置250、314或428或其任何组合中进行，例如在 位置250和428，或在位置250和314，或在位置314和428，或在位置 250、314和428，其中在位置250和428作为优选组合。对于每个位置， 置换氨基酸可以是与未修饰抗体的该位置中存在的氨基酸残基不同的 任何氨基酸残基。对于位置250，置换氨基酸残基可以是除苏氨酸以外 的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨 酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨 酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，缬氨酸，色氨酸 或酪氨酸。对于位置314，置换氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任何 氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯 丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺， 脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨 酸。对于位置428，置换氨基酸残基可以是除甲硫氨酸以外的任何氨基 酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨 酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，脯氨酸， 谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。WO 2005/123780的表1中鉴定了合适的氨基酸置换的具体组合，该表全部 内容通过引用并入本文。另见Hinton et al的美国专利号7,217,797、 7,361,740、7,365,168和7,217,798，其全部内容通过引用并入本文。
在另一方面，抗CLEC10A抗体具有插入一个或多个其高变区的一 个或多个氨基酸，例如US 2007/0280931中所述。
抗体缀合物
在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体是通过例如任何类型的分子 共价连接到抗体而被修饰的抗体缀合物，使得共价连接不干扰与 CLEC10A的结合。将效应子部分与抗体缀合的技术在本领域中是熟知 的(参见例如Hellstrom等人,Controlled Drag Delivery,2nd Ed.,于pp. 623-53(Robinson等人,eds.,1987))；Thorpe et al,1982,Immunol.Rev.62:119-58和Dubowchik等人,1999,Pharmacology and Therapeutics 83:67-123)。
在一个实例中，抗体或其片段通过共价键(例如，肽键)在任选地 N末端或C末端融合到另一种蛋白质(或其部分；优选在蛋白质的至少 10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列。优选地，抗体(或其片段) 在抗体恒定结构域的N末端与另一个蛋白质连接。可以使用重组DNA 程序来产生这样的融合物(例如如WO 86/01533和EP0392745中所述)。 在另一个实例中，效应子分子可以增加体内的半衰期。这种类型的合适 的效应子分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结 合化合物(例如在WO 2005/117984中描述的那些)。
在一些实施方案中，抗CLEC10A抗体可以连接到聚(乙二醇) (PEG)部分上。例如，如果抗体是抗体片段，PEG部分可以通过位于 抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游 离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基基团)连接。这样的氨基酸可以天 然存在于抗体片段中，或者可以使用重组DNA方法工程改造到片段中。 参见例如美国专利5,219,996。可以使用多个位点来连接两个或更多个 PEG分子。优选地，PEG部分通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨 酸残基的巯基共价连接。当巯基用作连接点时，可以使用适当活化的效 应子部分，例如巯基选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。
在另一个实例中，抗CLEC10A抗体缀合物是经修饰的Fab'片段， 其是PEG化的，即具有共价连接到其上的PEG(聚(乙二醇))(例 如根据EP0948544中公开的方法)。另见Poly(ethyleneglycol)Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications,(J.MiltonHarris(ed.), Plenum Press,New York,1992)；Poly(ethyleneglycol)Chemistry andBiological Applications,(J.Milton Harris and S.Zalipsky,eds., AmericanChemical Society,Washington D.C,1997)；和Bioconjugation Protein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences,(M.Aslam and A.Dent,eds.,GrovePublishers,New York,1998)；和Chapman, 2002,Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545。
可用于阻断CLEC10A受体的另一个实施方案是VWF-C1结构域， 其包含位置2298的O-糖基化位点，其连接到半衰期延长部分例如与白 蛋白融合，优选通过接头连接。优选的实施方案是具有如SEQ ID NO： 9所示的氨基酸序列的融合蛋白。
试剂盒
本发明的另一方面是药盒，其包含(i)如上文所定义的经修饰的 VWF分子和(ii)选自因子VIII、能够结合CLEC10A的化合物(优选 抗体)及其组合的多肽。优选地，经修饰的VWF分子和多肽包含在分 开的组合物中。
本发明的另一方面是药盒，其包含(i)如上文所定义的经修饰的 VWF分子和(ii)选自因子VIII、能够结合CLEC10A的化合物(优选 抗体)及其组合的多肽，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血疾病。
本发明的另一方面是如上所定义的修饰的VWF分子用于增加半衰 期或降低因子VIII的清除的用途。
术语“半衰期”是指从体内循环中消除一半的蛋白质所需的时间。 可以测定曲线下面积(AUC)以评估清除效果。清除的减少导致较高的 AUC值和半衰期的增加。
本发明的另一方面是上文定义的化合物(优选抗体)用于增加因子 VIII的半衰期、优选在治疗性治疗中的用途。
本发明还涉及在体内增加因子VIII的半衰期或降低因子VIII的清 除的方法，包括向受试者施用有效量的如上文所定义的经修饰的VWF 分子。
本发明的另一方面是治疗凝血疾病的方法，其包括向有需要的患者 施用有效量的如上文所定义的经修饰的VWF分子。
另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子在血友病A治疗中降低 施用FVIII的频率的用途。静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少到 每周两次。或者，静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少到每周一次。
另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子在VWD治疗中降低施 用VWF的频率的用途。静脉内或皮下施用VWF的频率可以减少到每 周两次。或者，静脉内或皮下施用VWF的频率可以减少到每周一次。 即，本发明的经修饰的VWF分子每周施用一次或两次。
另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子用于降低在血友病A的 治疗中待施用的剂量FVIII的用途。
另一方面是如上定义的经修饰的VWF分子用于降低在VWD治疗 中待施用的剂量VWF的用途。
下表总结了序列表中显示的核苷酸和氨基酸序列：
SEQ ID NO: 备注
1 编码人天然VWF前原肽的DNA序列
2 人天然VWF前原肽的氨基酸序列引物
3 引物
4 引物
5 引物
6 引物
7 引物
8 引物
9 通过Gly-Ser接头与人白蛋白融合的人VWF的C1结构域的氨基酸序列
10 具有T2298突变的经修饰的VWF的C1结构域
11 具有T2298突变的经修饰VWF的成熟形式
12 单链因子VIII分子
实施例
实施例1：存在于VWF上的特异性糖基化结构被鉴定为与 CLEC10A进行相互作用，以及存在于VWF上O-连接的糖基位点2298
为了鉴定CLEC10A在人VWF上的结合位点，VWF的胰蛋白酶 消化片段与可溶性CLEC10A一起温育。洗涤后，结合的蛋白质片段分 别在pH 11和使用含有100mM GalNAc的溶液洗脱。基于SPR预实验 选择洗脱条件，所述SPR预实验指示所有与CLEC10A结合的组分在规定的条件下完全洗脱。随后，对各洗脱液级分进行MS分析。
游离的N-和O-聚糖被全甲基化并通过MALDI-TOF-MS分析表征。 得到的数据表明，CLEC10A在识别N-和O-聚糖时显著不同。与用作 起始物质的VWF片段(聚糖分析观察到18％非唾液酸化O-聚糖的存 在)相比，两种洗脱液级分均显示非唾液酸化O-聚糖的强烈富集，而 含有一个或多个NeuAc残基的唾液酸化O-聚糖以及不管唾液酸化状态 如何的N-聚糖都极度降低。不同的洗脱条件(碱性对GalNAc)导致仅 略微不同的聚糖模式。可以在洗脱液级分中鉴定出三种主要的O-糖基 化结构，其代表检测到的所有O-聚糖结构的约80％。各自的结构如图 2所示。通过MALDI-TOF-MS分析鉴定了核心2聚糖(浓缩因子大于 40)、携带一个NeuGc残基的核心1聚糖(浓缩因子约9)和用二糖 GlcNAcβ1,3Gal延长的核心2聚糖(浓缩因子约为7)的富集。括号中 提及的浓缩因子定量描述了与CLEC10A孵育前的起始物质相比，各自 聚糖的富集。
除了前述的研究之外，在VWF片段去糖基化后，通过纳米液相色 谱电喷雾离子化MS/MS进行分析。在两种不同洗脱液级分中的每一种 中检测到的肽模式是可比的，因此与所用的洗脱条件无关。结果，洗脱 后清楚地鉴定了含有苏氨酸2298的VWF肽。基于获得的分析数据，可 以排除其他糖基化VWF片段参与CLEC10A结合。因此，O-连接的聚 糖位点T2298最有可能含有未被唾液酸化的聚糖结构，因此与 CLEC10A相互作用。此外，存在于VWF上的该糖基化位点被专门鉴 定为CLEC10A的主要相互作用配偶体，因此被认为是完全负责受体相 互作用。所有其他VWF聚糖位点似乎不参与CLEC10A结合。
总之，在从可溶性CLEC10A中洗脱胰蛋白酶消化的VWF片段后， MS分析表明，发现非唾液酸化O-聚糖结合CLEC10A，而唾液酸化O- 聚糖以及无论唾液酸化状态如何的N-聚糖不与CLEC10A发生显著相 互作用。存在于VWF上的三个主要O-糖基化结构(核心2聚糖、携带一个NeuGc残基的核心1聚糖和用二糖GlcNAcβ1,3Gal延长的核心2 聚糖)被鉴定为负责相互作用。由于与两种其他结构相比，核心2聚糖 检测到非常高的浓缩因子，VWF上存在的该聚糖似乎对CLEC10A具 有很强的亲和力。另外，仅含有O-连接的聚糖位点2298的VWF肽被鉴定为与CLEC10A结合，因此含有未被唾液酸化的聚糖结构。最终， 这些结果是出乎意料的，并表明聚糖位点T2298完全负责 VWF-CLEC10A的相互作用。此外，观察到的糖基化模式似乎只存在 于T2298。基于这些结果和CLEC10A介导的VWF清除的观察，可以 认为CLEC10A对天然糖基化VWF的清除仅受O-连接的糖基化位点 2298的影响。因此，为了防止CLEC10A结合，在操作相应的O-糖基 化位点和/或鉴定存在于该聚糖位点的各自的碳水化合物结构之后，可以 假设VWF突变体的清除降低。
方法
1)VWF的还原和羧甲基化
在+4℃下，依照前面部分描述的方法纯化的体积30mL的VWF溶 液进一步在1升还原缓冲液(50mM Tris，100mM NaCl，pH8.5)中透 析过夜。再次重复该步骤，除了第二次透析在室温下进行4小时。随后， 通过在轻轻搅拌(IKA，Staufen，Germany)下加入1M DTT的储备溶液将溶液调节至15mM DTT。通过在+37℃温育60分钟进行VWF的 还原。然后通过加入1M储备溶液用40mM碘乙酰胺烷基化VWF，并 将溶液在室温下孵育60分钟。
2)从人血浆中纯化的单体VWF的酶消化
在基于前述方法还原和烷基化后，通过Membra-Cel MD25-14透析 管路(Serva，Heidelberg，Germany)在+4℃下将60mL单体VWF(蛋 白质浓度为1mg/mL)针对20L的50mMNH4HCO3(pH 7.8)透析过 夜。透析步骤重复2次。将固定的胰蛋白酶树脂(Promega，Mannheim， Germany)用50mM NH4HCO3(pH 7.8)洗涤，并加入到蛋白质溶液 中，导致浓度为每8mg蛋白质1mL胰蛋白酶树脂。随后，将悬浮液在 旋转混合器(Glaswarenfabrik KarlHecht，Sondheim，Germany)上 于+37℃孵育24小时。反应后，通过离心(Multifuge 3SR，Heraeus， Osterode，Germany)以2,000×g在+20℃离心15分钟来分离固定的 胰蛋白酶。在另外的过滤步骤(孔径为0.45μm，Sterivex-HV，Millipore， Cork，Ireland)后，将反应混合物转移到Centricon Plus-70装置(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)并在室温下以3,000xg离心15分钟 (Multifuge 3SR，Heraeus，Osterode，Germany)。通过SDS-PAGE 证明了成功的切割反应(数据未显示)。通过施加显色底物证实胰蛋白 酶的消耗(数据未显示)。将胰蛋白酶消化片段(约0.5mg/mL的蛋白 质浓度)在SpeedVac真空浓缩器系统(ThermoScientific， Langenselbold，Germany)中浓缩至终浓度约40mg/mL。最终，通过 MS分析研究浓缩的VWF片段的肽谱，并与在第一离心步骤之前获得 的中间体级分比较，从而提供两个样品具有相同组成的VWF片段的证 据。
3)与CLEC10A相互作用的胰蛋白酶消化VWF片段的鉴定
为了鉴定VWF中存在的哪个聚糖链与CLEC10A相互作用，胰蛋 白酶消化VWF片段与可溶性CLEC10A(R&D Systems，Wiesbaden， Germany)一起孵育。将1mg冻干的受体蛋白溶于2mL含有10mM HEPES、150mM NaCl和5mM CaCl2(pH 7.4)的反应缓冲液中。通过 加入20倍浓缩的缓冲液储备溶液将蛋白质含量为0.5mg/mL的胰蛋白酶 消化后20mL浓缩的VWF片段调节至相同的缓冲液条件，然后与含有 受体蛋白的溶液混合。在+37℃，在轻轻混合下进行孵育过夜 (Glaswarenfabrik Karl Hecht，Sondheim，Germany)。然后，以3,000 ×g(Multifuge 3SR，Heraeus，Osterode，Germany)离心(Amicon Ultra-15离心过滤器单元，NMWL 10kDa，Merck Millipore，Darmstadt， Germany)分离未结合的VWF片段并弃去。在室温下进行离心，直至 达到0.5mL的剩余体积。然后将含有与VWF片段相互作用的受体蛋白的浓缩反应混合物用反应缓冲液洗涤并再次浓缩。在重复该浓缩溶液的 洗涤步骤2次后，将反应混合物分成两等份，然后用两种不同的洗脱缓 冲液处理。一方面，在pH 11(100mM甘氨酸/NaOH缓冲液，pH 11.0) 下洗脱结合的蛋白质片段，另一方面，通过使用含有GalNAc(100mM GalNAc，pH 4.3)的溶液洗脱结合的蛋白质片段。将相应的洗脱缓冲液 加入洗涤和浓缩的溶液中，并在轻轻混合下在室温下孵育过夜。通过离 心分离后，收集含有洗脱的VWF片段的所得滤液并通过MS分析。
4)胰蛋白酶消化VWF片段与清除受体相互作用的分析
分离的胰蛋白酶片段通过PNGase F处理和β-消除进行去糖基化， 然后通过应用纳米液相色谱电喷雾离子化MS/MS进行分析。此外，游 离的N-和O-聚糖被全甲基化并通过MALDI-TOF-MS分析表征。基于 发表的方法(Canis et al.(2010)Journal of Thrombosisand Haemostasis, 8:137-145；Canis et al.(2012)The Biochemical Journal,447:217-228) 进行分析。
实施例2：生成VWF突变体T2298的表达载体
先前已经产生了在其多克隆位点中含有全长VWF cDNA序列的表 达质粒。该载体中包含的VWF cDNA序列显示为SEQ ID NO：1，其 对应的蛋白质序列为SEQ ID NO：2。
为了产生这样的表达载体，在本领域技术人员已知的标准条件下， 使用引物组VWF+和VWF-(SEQ ID NO.3和4)，通过聚合酶链反应 (PCR)从含有VWF cDNA的质粒(商业上可获得，例如来自ATCC， No.67122的pMT2-VWF)扩增VWF cDNA(并且如Current Protocolsin Molecular Biology,Ausubel FM et al.(eds.)John Wiley&Sons,Inc.； http:// www.currentprotocols.com/WileyCDA/中所述)。将得到的PCR 片段用限制性内切核酸酶EcoRI消化，并连接到已经通过EcoRI线性 化的表达载体pIRESneo3(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA) 中。得到的插入片段正确取向的表达质粒含有CMV启动子下游的VWF 的野生型cDNA。
为了将突变引入VWF序列中，定点诱变(QuickChange XL Site DirectedMutagenesis Kit，Stratagene，La Jolla，CA，USA)按照试 剂盒制造商的建议，按照以下操作方案应用于上述质粒。每个诱变反应 5μl的10×反应缓冲液、1μl质粒DNA(50ng)、各自1μl(10pmol/μl) 的两种诱变寡核苷酸We4781和We4782(SEQ ID NO.5和6)、1μl 的dNTP Mix、3μl的Quick-溶液，1μl的Turbo聚合酶(2,.5U/μl) 和37μl的H2O混合并进行聚合酶链式反应，初始变性在95℃下进行2 分钟，18个循环a)在95℃下变性50秒，b)在60℃退火50秒，c)在68℃下延伸17分钟，然后在68℃下进行7分钟的单末端延伸阶段。 随后加入1μl来自该试剂盒的DpnI酶，反应物在37℃下再孵育60分 钟。然后将3μl的诱变反应物转化到大肠杆菌中。分离克隆，提取质粒 DNA，并通过DNA测序验证VWF序列中的突变。
使用上述操作方案和质粒，并且通过应用本领域技术人员已知的分 子生物学技术(并且如例如在Current Protocols in Molecular Biology， 同上中所述)，可由本领域技术人员制备其他构建体用于突变其它氨基 酸残基。
实施例3：生成含有T2298残基的白蛋白融合的VWF片段的表达 载体
为了产生含有氨基酸残基2276至2326的VWF片段与人白蛋白融 合的表达载体，包含N-末端信号肽和C-末端28氨基酸甘氨酸/丝氨酸 接头的VWF片段的编码序列是通过基因合成(Eurofins MWG Synthesis，Ebersberg，Germany)制备的，其中在5'端具有NheI限制性位点和在3'端具有BamH1位点。将该片段从由NheI和BamH1消化 提供的克隆载体中切下，纯化并克隆到NheI/BamH1消化的表达载体 pIRESneo3(同上)中。
白蛋白编码序列通过PCR扩增。对于该PCR扩增，1μl的含有野 生型白蛋白cDNA的质粒DNA(50ng)、5μl的10×反应缓冲液、各 自1μl(10pmol/μl)的两个PCR引物HA+和HA-(SEQ ID NO：7 和8)、1μl的dNTP Mix、1μl的Turbo聚合酶(2,5U/μl)和40μl 的H2O混合，并进行聚合酶链式反应，初始变性在95℃下进行2分钟， 25个循环：a)在95℃下变性20秒，b)在61℃退火20秒，c)在68℃ 下延伸7分钟，然后在68℃下进行7分钟的单末端延伸阶段。将该片段 纯化，用BamH1和NotI消化，并连接到含有VWF片段的上述载体的 BamH1和NotI位点。将连接混合物转化大肠杆菌。分离克隆，提取质 粒DNA，并通过DNA测序验证序列。表达构建体的氨基酸序列示于 SEQ ID NO：9中。
实施例4：质粒转染和VWF突变体在CHO细胞中的表达
将表达质粒在大肠杆菌TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA) 中生长并使用标准操作方案(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。使用 Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用表达质粒转染CHO K1细 胞。分离单克隆，并在无血清培养基(CD-CHO，Life Technologies) 中在750μg/ml的Geniticin存在下生长。将克隆通过T培养瓶传到摇瓶和生物反应器中，从其中收获上清液以纯化相应的重组VWF蛋白。
实施例5：VWF抗原的定量
培养上清液中的VWF抗原通过ELISA测定，其性能是本领域技术 人员已知的。简言之，将微孔板与100μL每孔的以1:2000稀释于缓冲 液A(Sigma C3041，Sigma-Aldrich，Munich，Germany)中捕获抗体 (兔抗人vWF-IgG，Dako A0082[Dako，Hamburg，Germany])在环 境温度下过夜。用缓冲液B(Sigma P3563)洗涤板三次后，将各孔与 200μL缓冲液C(Sigma P3688)在环境温度下一起温育1.5小时(封 闭)。在用缓冲液B进行另外三个洗涤步骤之后，将测试样品在缓冲液 B中的连续稀释液以及标准人血浆(ORKL21；20-0.2mU/mL；Siemens Healthcare Diagnostics，Marburg，Germany)在缓冲液B中的连续稀 释液(每孔体积：100μL)在环境温度下孵育1.5小时。在用缓冲液B 进行三个洗涤步骤之后，向每个孔中加入100μL在缓冲液B中1:16000 稀释的检测抗体(兔抗人vWF-IgG，Dako P0226，过氧化物酶标记的)， 并在环境温度下孵育1小时。在用缓冲液B进行三个洗涤步骤后，每孔 加入100μL底物溶液(OUVF，Siemens Healthcare Diagnostics)，并 在黑暗中在环境温度下孵育30分钟。加入100μL未稀释的终止稀释液 (OSFA，Siemens Healthcare Diagnostics)制备样品，以在合适的酶标 仪上在450nm波长进行读数。然后用标准人血浆作为参考的标准曲线， 计算测试样品的浓度。
实施例6：VWF T2298Q突变体的药代动力学分析
实施例4的VWF-T2298Q和重组VWF(野生型)分别静脉内施 用于总共4只CD大鼠的每一只。剂量为100U(VWF:Ag)/kg体重， 注射体积为4mL/kg。
使用交替取样方案，在应用测试物质后5分钟开始以适当的时间 间隔眶后抽取血液样品，得到2只动物/时间点的样品(对于子集Nr.1， t＝0、5、30、90分钟、4小时、1天和对于子集Nr.2，t＝0、15分钟、 1、2、8小时和2天)。该方案旨在最大限度地减少血液采样对待定 量血浆浓度的潜在影响。将血液加工成血浆并进行深冻储存直到分析。 血浆中的VWF：Ag水平随后通过如实施例5所述的ELISA进行定量。 平均血浆浓度用于计算药代动力学参数。
序列表
<110> 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司
<120> 具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子
<130> A241
<150> EP2015158065.1
<151> 2015-03-06
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 8442
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(8442)
<400> 1
atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
agg aag tgc agc aag tga 8442
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 2
<211> 2813
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
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785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
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1145 1150 1155
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1160 1165 1170
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1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
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Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物VWF+
<400> 3
ttcgaattcc cgcagccctc atttgcaggg 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR引物VWF-
<400> 4
tccgaattcc ggcagcagca ggcacccatg c 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物 VWFT2298Q+
<400> 5
gcagccctgc ccccaggcca aagctcccac 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物VWFT2298Q-
<400> 6
gtgggagctt tggcctgggg gcagggctgc 30
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物HA+
<400> 7
ggatccgatg cacacaagag tgaggttg 28
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物HA-
<400> 8
gcggccgcct ataagcctaa ggcagcttga c 31
<210> 9
<211> 686
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽(1-22); VWF片段aa 2276至2326 (23 - 73); 甘氨酸/丝氨酸接头(74 - 101); 白蛋白(102 - 686)
<400> 9
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys Leu Ser
20 25 30
Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr Ala Lys Ala
35 40 45
Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn Ala Asp
50 55 60
Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe
100 105 110
Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe
115 120 125
Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val
130 135 140
Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala
145 150 155 160
Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys
165 170 175
Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys
180 185 190
Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp
195 200 205
Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met
210 215 220
Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu
225 230 235 240
Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala
260 265 270
Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp
275 280 285
Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu
290 295 300
Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu
305 310 315 320
Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val
325 330 335
Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu
340 345 350
Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn
355 360 365
Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu
370 375 380
Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro
385 390 395 400
Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val
405 410 415
Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu
420 425 430
Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu
435 440 445
Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala
450 455 460
Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro
465 470 475 480
Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe
485 490 495
Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr
500 505 510
Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser
515 520 525
Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala
530 535 540
Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln
545 550 555 560
Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys
565 570 575
Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu
580 585 590
Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe
595 600 605
Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile
610 615 620
Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala
625 630 635 640
Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val
645 650 655
Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu
660 665 670
Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
675 680 685
<210> 10
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在T2298具有突变的经修饰的VWF的C1结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa不存在或是除了苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸
<400> 10
Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu Glu Ala
1 5 10 15
Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys Leu Ser Gly
20 25 30
Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Xaa Ala Lys Ala Pro
35 40 45
Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln
50 55 60
Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
65 70
<210> 11
<211> 2050
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在T2298具有突变的经修饰的VWF的成熟形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1535)..(1535)
<223> Xaa不存在或是除了苏氨酸和丝氨酸之外的氨基酸
<400> 11
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu
465 470 475 480
Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val
485 490 495
Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu
500 505 510
Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala
515 520 525
Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu
530 535 540
Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
545 550 555 560
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu
565 570 575
Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala
580 585 590
Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys
595 600 605
Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser
610 615 620
Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly
625 630 635 640
Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His
645 650 655
Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn
660 665 670
Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp
675 680 685
Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro
690 695 700
Thr Leu Pro Pro His Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu
705 710 715 720
Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val
725 730 735
Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn
740 745 750
Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly
755 760 765
Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr
770 775 780
Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
785 790 795 800
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly
805 810 815
Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly
820 825 830
Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro
835 840 845
Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro
850 855 860
Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly
865 870 875 880
Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg
885 890 895
Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu
900 905 910
Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp
915 920 925
Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe
930 935 940
Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile
945 950 955 960
Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr
965 970 975
Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu
980 985 990
Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly
995 1000 1005
Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His
1010 1015 1020
Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr
1025 1030 1035
Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg
1040 1045 1050
Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr
1055 1060 1065
Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser
1070 1075 1080
Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val
1085 1090 1095
Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val
1100 1105 1110
Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp
1115 1120 1125
Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg
1145 1150 1155
Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val
1160 1165 1170
Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr
1175 1180 1185
Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe
1190 1195 1200
Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu
1205 1210 1215
Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly
1220 1225 1230
Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala
1235 1240 1245
Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly
1250 1255 1260
Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn
1265 1270 1275
Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly
1280 1285 1290
His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln
1295 1300 1305
Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly
1310 1315 1320
Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly
1325 1330 1335
Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val
1340 1345 1350
Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys
1355 1360 1365
Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu
1370 1375 1380
Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala
1385 1390 1395
Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val
1400 1405 1410
Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val
1415 1420 1425
Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser
1430 1435 1440
Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp
1445 1450 1455
Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe
1460 1465 1470
Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu
1475 1480 1485
Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln
1490 1495 1500
Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys
1505 1510 1515
Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys
1520 1525 1530
Pro Xaa Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg
1535 1540 1545
Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val
1550 1555 1560
Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu
1565 1570 1575
Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro
1580 1585 1590
Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser
1595 1600 1605
Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr
1610 1615 1620
Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser
1625 1630 1635
Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn
1640 1645 1650
Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys
1655 1660 1665
Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu
1670 1675 1680
Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met
1685 1690 1695
Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser
1700 1705 1710
Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys
1715 1720 1725
Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro
1730 1735 1740
Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp
1745 1750 1755
Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val
1760 1765 1770
Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln
1775 1780 1785
Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys
1790 1795 1800
Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala
1805 1810 1815
Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met
1820 1825 1830
Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val
1835 1840 1845
Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro
1850 1855 1860
Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys
1865 1870 1875
Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly
1880 1885 1890
Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys
1895 1900 1905
Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp
1910 1915 1920
Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys
1925 1930 1935
Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys
1940 1945 1950
Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu
1955 1960 1965
Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp
1970 1975 1980
Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser
1985 1990 1995
Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro
2000 2005 2010
Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly
2015 2020 2025
Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys
2030 2035 2040
Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys
2045 2050
<210> 12
<211> 1444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链FVIII
<400> 12
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln
755 760 765
Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met
770 775 780
Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
785 790 795 800
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu
805 810 815
Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn
820 825 830
Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
835 840 845
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu
850 855 860
Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu
865 870 875 880
Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
885 890 895
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala
900 905 910
Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe
915 920 925
Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys
930 935 940
Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
945 950 955 960
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn
965 970 975
Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe
980 985 990
Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu
995 1000 1005
Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr
1010 1015 1020
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met
1025 1030 1035
Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg
1040 1045 1050
Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile
1055 1060 1065
His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr
1070 1075 1080
Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val
1085 1090 1095
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1100 1105 1110
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
1115 1120 1125
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1130 1135 1140
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1145 1150 1155
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1160 1165 1170
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu
1175 1180 1185
Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
1190 1195 1200
Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser
1205 1210 1215
Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly
1220 1225 1230
Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys
1235 1240 1245
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
1250 1255 1260
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu
1265 1270 1275
Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu
1280 1285 1290
Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe
1295 1300 1305
Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His
1310 1315 1320
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
1325 1330 1335
Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr
1340 1345 1350
Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
1355 1360 1365
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp
1370 1375 1380
Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn
1385 1390 1395
Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
1400 1405 1410
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln
1415 1420 1425
Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1430 1435 1440
Tyr

Claims (12)

1.能够结合因子VIII的人血管性血友病因子即VWF分子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗凝血疾病，其中所述凝血疾病是血友病A或血管性血友病，其中所述VWF分子包含在氨基酸位置2298缺少O-糖基化位点的C1结构域且具有相比于天然血浆衍生的VWF而言降低的体内清除，并且其中存在于天然VWF中的位置2298的O-糖基化位点已经通过用选自下列的氨基酸置换VWF氨基酸序列的位置2298的氨基酸苏氨酸而失活：甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
2.权利要求1的用途，其中位置2298的苏氨酸已被氨基酸谷氨酰胺置换。
3.权利要求2的用途，其中所述VWF分子包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，其中Xaa为谷氨酰胺。
4.权利要求2的用途，其中所述VWF分子包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中Xaa为谷氨酰胺。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中相比于与天然血浆衍生的VWF共同施用的因子VIII的半衰期，所述VWF分子能够增加与所述VWF分子共同施用的因子VIII的半衰期。
6.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述治疗还包括施用因子VIII分子。
7.权利要求6的用途，其中所述VWF分子和所述因子VIII分子分开施用。
8.药盒，其包含(i)权利要求1至5中任一项之中所定义的VWF分子和(ii)因子VIII分子。
9.权利要求8的药盒，其中所述VWF分子和所述因子VIII分子包含在分开的组合物中。
10.药盒，其包含(i)权利要求1至5中任一项之中所定义的VWF分子和(ii)因子VIII分子，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血疾病。
11.权利要求1至5中任一项之中所定义的VWF分子在制备用于体内增加因子VIII的半衰期的药物中的用途。
12.权利要求1至5中任一项之中所定义的VWF分子在制备药物中的用途，所述药物用于在治疗性治疗中延长因子VIII的半衰期。
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