JP2014511388A - Ｃｍｐまたはカゼイン種を含有する供給物を使用してオステオポンチンを単離する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、例えば乳清または甘性乳清ベースの供給物などのカゼイノマクロペプチドおよび／または遊離βカゼインを含有するミルク由来供給物から、オステオポンチンを単離する方法に関する。具体的には、本方法は、狭い範囲のｐＨと導電率のミルク由来供給物の使用を伴い、それは驚くことに、化学的に複雑な供給物からのオステオポンチンの非常に効率的な単離を提供することが、証明された。

Description

本発明は、例えば乳清または甘性乳清ベースの供給物などのミルク由来供給物から、オステオポンチンを単離する方法に関する。具体的には、本方法は、狭い範囲のｐＨと導電率のミルク由来供給物の使用を伴い、それは驚くことに、化学的に複雑な供給物からのオステオポンチンの非常に効率的な単離を提供することが、証明された。

オステオポンチンは、酸性で高度にリン酸化されたシアル酸に富む、カルシウム結合タンパク質である。オステオポンチンは、１モルのオステオポンチンあたり、およそ２８モルの結合リン酸塩を含有し、１モルのオステオポンチンあたり、およそ５０モルのＣａに結合する。

オステオポンチン（ＯＰＮ）は、骨再形成、異所性石灰化阻害、および細胞接着と移動、ならびにいくつかの免疫機能などの、多数の生物学的過程と関係があるとされる、多機能生理活性タンパク質である。オステオポンチンは、サイトカイン様特性を有し、Ｔヘルパー１免疫応答の開始における基本要因である。オステオポンチンは、ほとんどの組織と体液中に存在し、最大濃度はミルク中に見られる。

ＯＰＮの異所性石灰化阻害機能を裏付けて、ＯＰＮ欠損マウスを使用した生体内モデルは、タンパク質の外からの添加に際して、石灰化の減少を示した。これに加えて、ＯＰＮはシュウ酸カルシウム一水和物結晶の成長と凝集を抑制し得るので、ＯＰＮは、腎結石の形成に対する尿道の防御に関与する。

ミルク中のＯＰＮの生物学的役割は明らかでない；しかしいくつかの機能が仮定され得た。オステオポンチンは、乳腺の発達と分化に関与することが報告されており、初期乳汁分泌において乳腺中に高レベルのＯＰＮ発現が観察されている。さらに高度にアニオン性であるタンパク質の性質は、ＯＰＮがカルシウムイオンと可溶性複合体を形成できるようにして、それによってミルク中の意図されないカルシウムの結晶化と沈殿が抑制される。

学術文献中では、オステオポンチンは、典型的に骨またはミルクから精製され、典型的に２０ｍｇ／Ｌの濃度で牛乳中に存在する。ミルク中では、オステオポンチンは乳清タンパク質であるが、Ｃａ^２＋レベル次第では、カゼインミセルとある程度結びつくこともある。酸性乳清が、オステオポンチンの工業生産のための好ましい原料である。酸性乳清が成形される場合、Ｃａ^２＋が乳清相に漏出するにつれて、オステオポンチンはカゼインミセルから放出されると考えられる。この側面により、酸性乳清はオステオポンチンの直接的原料となる。同じ理由で、甘性乳清は、わずかにより低いオステオポンチン含量を有する。さらに甘性乳清は、κ−カゼインの酵素的切断からのカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含有する。ＣＭＰはオステオポンチンと多数の生化学的類似点を有し、どちらも小型で可撓性の酸性リン酸化糖タンパク質である。

上記の理由からＣＭＰとオステオポンチンは、イオン交換樹脂との結合においてかなり類似すると思われ、それはＣＭＰ含有原料からのオステオポンチンの精製において問題を引き起こす。別の側面は、チーズ製造のために使用されるタンパク質分解酵素によるオステオポンチン分解の恐れである。これらの３つの側面が、工業生産および科学的研究の双方において、オステオポンチン精製のためのこの原料の利用の回避につながることもあった。

国際公開第０２／２８４１３ Ａ１号パンフレットは、低ｐＨアニオン交換によって、ミルクおよび酸性乳清などの原材料から、オステオポンチン含有組成物を製造する方法を記載する。国際公開第０２／２８４１３ Ａ１号パンフレットでは、工程原材料も得られる製品もいずれも、アニオン交換体と結合して、オステオポンチンの結合を抑制することが知られているＣＭＰの一種であるｃＧＭＰを含有してはならないと、強調される。

国際公開第０１／１４９７４１ Ａ２号パンフレットは、ミルク材料を可溶性カルシウムと混合し、混合物のｐＨを調節して、オステオポンチンを溶液中に保ちながら、その他の乳清タンパク質成分を選択的に沈殿させることで、オステオポンチンをミルク材料から精製する方法を記載する。

本発明者らは、驚くことに、先行技術に見られる先入観に反して、供給物中の競合タンパク質の存在にもかかわらず、アニオン交換によって、複雑なミルク由来供給物から、高収率かつ高純度でオステオポンチンを単離し得ることを発見した。本発明者らは、オステオポンチンの収率と純度に、供給物の導電率が特に重要であることを見出し、ミルク由来供給物からのオステオポンチンの単離に最適な導電率の範囲を特定した。

したがって本発明の一態様は、
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、ミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法に関する。

本発明は、例えば
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、ミルク由来供給物であって、
−ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のカゼイノマクロペプチド、または
−遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン
をさらに含んでなるミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）前記ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法に関してもよい。

したがって本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法は、
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、ミルク由来供給物であって、
ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のカゼイノマクロペプチドをさらに含んでなる、ミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる。

本発明のその他の好ましい実施形態では、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法は、
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、ミルク由来供給物であって、遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼインをさらに含んでなる、ミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる。

本発明のさらに好ましい実施形態では、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法は、
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、ミルク由来供給物であって、
−ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のカゼイノマクロペプチド、および
−遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン
をさらに含んでなる、ミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる。

上述の利点に加えて、本方法は、より費用効率が高いアニオン交換媒体の使用と、アニオン交換媒体１ｋｇあたりのオステオポンチンのより高い収率を可能にする。

本方法の別の利点は、実施例５で実証されるようなアニオン交換サイクルあたりのステオポンチン収率の改善である。

水溶液の「導電率」（時に「比導電率」と称される）は、溶液が電気を伝導する能力の尺度である。導電率は、例えば２枚の電極間の溶液のＡＣ抵抗の測定によって判定されてもよく、結果は、典型的に１ｃｍあたりのミリジーメンス（ｍＳ／ｃｍ）単位で示される。導電率の測定値は、例えばＥＰＡ（ＵＳ米国環境保護庁）法１２０．１号に従って測定されてもよい。

本発明のさらなる態様は、本方法によって得られる、オステオポンチン含有組成物に関する。

本発明のさらなる態様は、オステオポンチン含有組成物それ自体に関する。

図１は、導電率５．５ｍＳ／ｃｍにおけるオステオポンチンの純度および収率に対する、甘性乳清由来供給物のｐＨの影響である。 図２は、ｐＨ４．３におけるオステオポンチンの純度と収率に対する、甘性乳清由来供給物の導電率の影響である。 図３は、ｐＨ４．３におけるＯＰＮの純度と収率に対する、酸性乳清由来供給物の導電率の影響である。

上述のとおり、本発明の一態様は、
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、ミルク由来供給物であって、
−ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のカゼイノマクロペプチド、または
−遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン
をさらに含んでなる、ミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法に関する。

方法のステップは、典型的に、例えばステップａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）の順序で実施される。しかし本発明のいくつかの実施形態では、方法のステップｃ）が省かれ、この場合、方法は、ステップａ）、ｂ）、およびｄ）を含んでなる。

本発明の文脈で「オステオポンチンの単離」という用語は、ステップｄ）において、アニオン交換媒体から回収されたタンパク質総重量に対して、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、なおもより好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｗ）の重量％へのオステオポンチンの濃縮に関する。オステオポンチンの単離は、ステップｄ）において、アニオン交換媒体から回収されたタンパク質総重量に対して、例えば少なくとも９７％（ｗ／ｗ）などの少なくとも９５％（ｗ／ｗ）の重量％へのオステオポンチンの濃縮を伴ってもよい。

本方法は、例えばＣＭＰ含有ミルク由来供給物など、５．０未満の等電点（ｐＩ）を有する追加的なタンパク質を含んでなるミルク由来供給物からのオステオポンチンの選択濃縮を改善するのに、特に有用である。「選択濃縮」という用語は、オステオポンチンと、ミルク由来供給物のその他のタンパク質総量との間のモル比を増大させることと、理解されるべきである。

タンパク質の等電点は、好ましくは２５℃での等電点電気泳動によって測定される。

本発明の文脈で「ミルク由来供給物」という用語は、アニオン交換媒体に接触する液体供給物に関する。

ミルク由来供給物は、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ラクダ、ラマ、ウマおよび／またはシカからのミルクなど、１つまたは複数の哺乳類起源からのミルクに由来する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は牛乳に由来する。

本発明の文脈で、「ミルク由来供給物」、「甘性乳清由来供給物」、「酸性乳清由来供給物」、および「乳清由来供給物」という用語は、総タンパク質量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）が、それぞれミルク、甘性乳清、酸性乳清または乳清に由来する供給物に関する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物の総タンパク質量の少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、好ましくは実質的に全てが、ミルク、甘性乳清、酸性乳清または乳清に由来する。

本発明の文脈で、「ミルク」という用語は、乳汁分泌中に哺乳類の乳腺から得られる液体に関する。「ミルク」という用語は、広義に解釈されるべきであり、生乳、すなわち乳腺から直接得られる液体と、例えば脱脂乳または全乳など、元の生乳と比較して乳脂肪濃度が低下している規格化乳製品の双方を包含する。

乳清は、ミルクからのチーズまたはカゼイン製造中に生じる水様副産物に言及する総称である。

本発明の文脈で、「甘性乳清」という用語は、例えば黄色チーズの製造中に起きる、レンネットベースのミルクの凝固中に得られる乳清に関する。

本発明の文脈で、「酸性乳清」という用語は、例えばカテージチーズまたはクワルク製造中、またはカゼイン／カゼイネートの製造中に起きる、ミルクの化学的または生物学的酸性化において得られる乳清に関する。

本発明の文脈で、「乳清（ｓｅｒｕｍ ｗｈｅｙ）」、「天然乳清」または「乳清（ｌａｃｔｏｓｅｒｕｍ）」としても知られている「乳清」という用語は、それから乳脂肪とカゼインミセルが除去されたミルクに関する。しかし乳清は、典型的に、ミセルが除去される前に、天然カゼインミセルから解離した、いくらかの遊離カゼイン種を含有する。乳清は、例えば孔径およそ０．１マイクロメートルのフィルターまたはメンブランを通過させて脱脂乳を精密濾過し、得られた透過液を乳清として収集することで、製造されてもよい。乳清は、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．に従って製造されてもよい。

理解されるであろうように、ミルク、甘性乳清、酸性乳清または乳清は、ミルク由来供給物を調製するためのいくつかの工程ステップを受けていてもよい。

ミルクまたはミルク関連製品の処理は、典型的に、低温殺菌（例えば７２℃で１５秒間）、または高温殺菌（例えば８５℃で２０秒間）などの１つまたは複数の加熱処理工程を伴う。

代案としては、または加えて、処理は、１つまたは複数の濾過ステップを伴ってもよい。精密濾過を使用して、微生物を除去し、または代案としてはカゼインを濃縮してもよい。例えば限外濾過またはナノ濾過を使用して、ホエータンパク質または乳清タンパク質を濃縮してもよい。

代案としては、または加えて、処理は、例えば脱脂乳から脂肪を分離し、および／またはミルクから微生物を分離するための１つまたは複数の遠心分離ステップ伴ってもよい。

代案としては、または加えて、処理は、水を除去し、したがってタンパク質および／またはミネラルなどの乾燥物質を濃縮するための１つまたは複数の蒸発ステップを伴ってもよい。

処理はまた、１つまたは複数のｐＨ調節を含んでなってもよい。例えば酸性化もまた使用して、カゼインを凝析してもよく、処理がイオン交換クロマトグラフィーを伴う場合は、ｐＨ調節がさらに重要なこともある。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、濾過加熱処理乳清、またはα−ラクトアルブミンおよび／またはβ−ラクトグロブリン枯渇乳清など、その他の乳タンパク質画分の製造からのもう１つのプロセス流を含んでなる。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、乳清由来供給物を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になる。ミルク由来供給物は、例えば乳清であってもよく、好ましくは、例えば乳清限外濾過して得られる残余分の形態の乳清タンパク質濃縮物である。

中ミルク由来供給物のオステオポンチンの含量は、特定の供給物タイプに依存する。本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．０１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のオステオポンチンを含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．０５〜５％（ｗ／ｗ）の範囲の量のオステオポンチンを含んでなってもよい。ミルク由来供給物は、例えば０．１〜２％（ｗ／ｗ）の範囲の量のオステオポンチンを含んでなってもよい。

代案としては、代案としてはミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．１〜１％（ｗ／ｗ）の範囲の量のオステオポンチンを含んでなってもよい。

本発明の文脈では、１つまたは複数の小成分または１つまたは複数の機能から「本質的になる」と記述される製品、成分、方法、または方法段階は、１つまたは複数の具体的に言及される小成分または１つまたは複数の具体的に言及される機能からなるが、本発明の基本的および新規特性に実質的に影響を及ぼさない、１つまたは複数の追加的な不特定の小成分成分または機能もまた含んでもよい。

上述したように、本方法は、５．０未満のｐＩを有するタンパク質などの複雑な供給物、すなわちオステオポンチンの単離を妨げる分子実体を含有する供給物から、オステオポンチンを単離するのに特に効果的である。このようなタンパク質は、アニオン交換媒体の官能基について、オステオポンチンと競合することが分かっている。

５．０未満のｐＩを有するタンパク質の例は、α−ラクトアルブミン、プロテオースペプトン−３、プロテオースペプトン−５、およびプロテオースペプトン−８と、カゼイノマクロペプチドおよび／またはカゼイノリンペプチドなどのカゼイン由来ペプチドである。したがって追加的なタンパク質は、α−ラクトアルブミン、プロテオースペプトン−３、プロテオースペプトン−５、およびプロテオースペプトン−８、カゼイン由来ペプチド、カゼイノマクロペプチド、カゼイノリンペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群からの１つまたは複数のタンパク質を含んでなってもよい。遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼインは、５．０未満のｐＩ値を有するタンパク質の他の例である。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）の量の５．０未満のｐＩを有する追加的なタンパク質を含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。

代案としては、例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも２％（ｗ／ｗ）の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。理解されるであろうように、５．０未満のｐＩを有する追加的なタンパク質はオステオポンチンを含まないが、典型的に、指定範囲のｐＩを有する１つまたは複数のその他のタンパク質を含む。

本発明の別の実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．１〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する追加的なタンパク質を含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．５〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。代案としては、例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、２〜２５％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。

例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．３〜１５％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。代案としては、例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．５〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。

本発明本発明のさらなる実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する追加的なタンパク質を含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１０〜４５％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。代案としては、例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１５〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の５．０未満のｐＩを有する、追加的なタンパク質を含んでなってもよい。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、５．０未満のｐＩを有する追加的なタンパク質は４．５未満のｐＩ、好ましくは４．０未満のｐＩを有する。

本発明の文脈で「タンパク質」という用語は、ポリペプチドの大型凝集体と、単一ポリペプチド鎖およびジ−またはトリ−ペプチドなどのペプチドとの双方を包含する。化学的に、タンパク質は、いわゆるペプチド結合によって連結する、異なるおよび／または同一アミノ酸を含んでなるポリマーである。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）をさらに含んでなる。

本発明の文脈で、「ＣＭＰ」または「カゼイノマクロペプチド」という用語は、レンネット酵素への曝露時に、κ−カゼインから放出される小型タンパク質に関する。ＣＭＰは、タンパク質のグリコシル化変異体および非グリコシル化変異体の双方を包含する。タンパク質のグリコシル化変異体は、時にカゼイノグリコマクロペプチド（ｃＧＭＰ）と称される。

本発明のその他の好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、甘性乳清由来供給物を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になる。ミルク由来供給物は、例えば甘性乳清であってもよく、好ましくは、例えば甘性乳清の限外濾過によって得られる残余分の形態である、甘性乳清タンパク質濃縮物である。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、酸性乳清由来供給物を含んでなってもよく、またはさらにはそれから本質的になる。ミルク由来供給物は、例えば酸性乳清であってもよく、好ましくは、例えば酸性乳清の限外濾過によって得られる残余分の形態である、酸性乳清タンパク質濃縮物である。

本発明の文脈で、「乳清タンパク質濃縮物」、「甘性乳清タンパク質濃縮物」、または「酸性乳清タンパク質濃縮物」という用語は、それぞれ元の乳清、甘性乳清、または酸性乳清に中存在する総タンパク質量の少なくとも８０％（ｗ／ｗ）を含有して、水性組成物の乾燥重量に対して、少なくとも２５％（ｗ／ｗ）の総タンパク質含量を有する水性組成物に関する。

しかし本発明の別の実施形態では、ミルク由来供給物は、酸性乳清由来供給物でない。

本発明の好ましい実施形態では、例えば甘性乳清由来供給物などのミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のＣＭＰを含んでなる。例えば甘性乳清由来供給物などのミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも５％（ｗ／ｗ）、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、好ましくは少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、なおもより好ましくは少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の量のＣＭＰを含んでなってもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、例えば甘性乳清由来供給物などのミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のＣＭＰを含んでなる。例えば甘性乳清由来供給物などのミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、５〜３５％（ｗ／ｗ）の範囲、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、好ましくは１０〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲、なおもより好ましくは１５〜２５％（ｗ／ｗ）の範囲の量のＣＭＰを含んでなってもよい。

本発明者らは、驚くことに、本方法において、供給物が乳清またはその濃縮物をベースとする場合、沈殿が成形されることを観察した。沈殿は、アニオン交換処理中に問題を引き起こして、その堅牢性を低下させる。

本発明者らは沈殿を調査して、それが遊離β−カゼインまたは遊離α−カゼインなどの溶解形態で存在していた、沈殿カゼイン種を含有するという徴候を見出した。

本発明の文脈で、「遊離β−カゼイン」または「遊離α−カゼイン」という用語は、ミルク製品の天然カゼインミセルに結合していないβ−カゼイン分子またはα−カゼイン分子に関する。このような遊離β−カゼインまたは遊離α−カゼインとしては、β−カゼインまたはα−カゼインの溶解単一分子、またはα−カゼインおよび／またはβ−カゼインの小型凝集体が挙げられる。β−カゼインの単一分子は、例えばこれもまた遊離β−カゼインの一例である、小型β−カゼインミセルを形成することが知られている。

したがって本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、遊離α−カゼインと遊離β−カゼインをさらに含んでなる。遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼインは、典型的に乳清由来供給物中に存在する。

本発明者らは、アニオン交換に先だって、ミルク由来供給物から沈殿を除去することで、この沈殿問題を解決し得ることを見出した。したがって本発明のいくつかの好ましい実施形態では、方法のステップａ）は、ミルク由来供給物を形成するために酸性化された液体から、沈殿を除去することを伴う。このような除去は、例えば酸性化された液体の遠心分離または濾過を伴ってもよい。

別の沈殿問題解決策は、沈殿が限定的であり、または不在でさえある、例えばｐＨ５．０〜６．５の範囲の供給物ｐＨの使用である。

したがってミルク由来供給物は、５．０〜６．５の範囲のｐＨ、好ましくは５．０〜６．０の範囲のｐＨを有してもよい。

このｐＨ範囲でアニオン交換を実施する場合、２０〜４０℃などの１５℃を超える供給／処理温度を使用することが、さらに提言される。この温度範囲内では、溶解β−カゼインは、ミルクの天然カゼインミセルと混同すべきでない小型β−カゼインミセルを形成し、これらのβ−カゼインミセルは、単一β−カゼイン分子程にはアニオン交換工程を妨げないようである。

したがってステップｂ）におけるミルク由来供給物およびアニオン交換物質の温度は、１５〜４０℃の範囲、好ましくは２０〜３８℃の範囲であってもよい。

ミルク由来供給物は、例えばミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン総量を含んでなってもよい。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも２％（ｗ／ｗ）の遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン総量を含んでなってもよい。ミルク由来供給物は、例えばミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン総量を含んでなってもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、０．５〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン総量を含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、２〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲の量の遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン総量を含んでなってもよい。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、５〜１５％（ｗ／ｗ）の範囲の量の遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン総量を含んでなってもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のα−ラクトアルブミンを含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、好ましくは少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、なおもより好ましくは少なくとも３０％（ｗ／ｗ）の量のα−ラクトアルブミンを含んでなってもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のα−ラクトアルブミンを含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、５〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の量、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、好ましくは１０〜３５％（ｗ／ｗ）の範囲、なおもより好ましくは１２〜３０％（ｗ／ｗ）の範囲のα−ラクトアルブミンを含んでなってもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のβ−ラクトグロブリンを含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１５％（ｗ／ｗ）、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、好ましくは少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、なおもより好ましくは少なくとも４０％（ｗ／ｗ）の量のβ−ラクトグロブリンを含んでなってもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１〜７０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のβ−ラクトグロブリンを含んでなる。例えばミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１０〜６５％（ｗ／ｗ）の範囲の量、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、好ましくは２０〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲、なおもより好ましくは３５〜５５％（ｗ／ｗ）の範囲のβ−ラクトグロブリンを含んでなってもよい。

カゼインは、約４．６以下のｐＨ値で沈殿することが知られている。したがって本発明のいくつかの実施形態では、約３．６〜４．６の範囲のｐＨを有するミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、最大で１％（ｗ／ｗ）などの比較的低濃度のカゼインを有することが好ましい。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、最大で０．１％のカゼイン（ｗ／ｗ）を含んでなる。ミルク由来供給物が、さらには、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、最大で０．０１％のカゼイン（ｗ／ｗ）を含んでなることが好ましいこともある。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、６〜２５０ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなる。例えば、ミルク由来供給物は、５０〜１５０ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなってもよい。さらには、ミルク由来供給物が、７５〜１２５ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなることが、好ましいこともある。

代案としては、ミルク由来供給物は、５０〜２５０ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなってもよい。例えば、ミルク由来供給物は、５０〜１５０ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなってもよい。さらには、ミルク由来供給物が、７５〜１５０ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなることが、好ましいこともある。

ミルク由来供給物が、７５〜２５０ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなることが、好ましいこともある。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、少なくとも６ｇ／Ｌミルク由来供給物のタンパク質総量を含んでなる。例えばミルク由来供給物は、少なくとも５０ｇ／Ｌミルク由来供給物のタンパク質総量を含んでなってもよい。さらには、ミルク由来供給物が、少なくとも７５ｇ／Ｌミルク由来供給物のタンパク質総量を含んでなることが、好ましいこともある。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、２５℃でｐＨ３．８〜６．０の範囲のｐＨを有する。好ましくは、２５℃におけるミルク由来供給物のｐＨは、ｐＨ４．０〜５．５の範囲である。なおもより好ましくは、２５℃におけるミルク由来供給物のｐＨは、例えばｐＨ４．３〜４．５などのｐＨ４．２〜５．０の範囲である。

ミルク由来供給物の所望の導電率は、例えば以下によって得られてもよい：
−水の部分的除去によってミルク由来供給物を濃縮し、および／または塩の添加によって、導電率増大をもたらすこと、または
−塩の除去によってミルク由来供給物を脱塩し、および／または水の添加によって、導電率低下をもたらすこと。

水性液から水および／または塩を除去する技術は、当業者に良く知られている。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、２５℃で４．５〜９．０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有する。例えばミルク由来供給物の導電率は、２５℃で５．０〜８．０ｍＳ／ｃｍの範囲であってもよい。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物の導電率が、２５℃で５．５〜７．０ｍＳ／ｃｍの範囲であることが、なおもより好ましいこともある。

ミルク由来供給物は、例えば２５℃で４〜７ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有してもよい。代案としては、ミルク由来供給物は、２５℃で７〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有してもよい。代案としては、ミルク由来供給物は、２５℃で５〜８ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有してもよい。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、２５℃で４〜７ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、２５℃でｐＨ３．６〜５．０の範囲のｐＨを有する。

本発明のその他の好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、２５℃で７〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、２５℃でｐＨ５．０〜６．５の範囲のｐＨを有する。

本発明のさらに好ましい実施形態では、ミルク由来供給物は、２５℃で５〜８ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、２５℃でｐＨ４．０〜５．５の範囲のｐＨを有する。

例えばミルク由来供給物は、２５℃で５〜６ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、２５℃でｐＨ４．２〜５．０の範囲のｐＨを有してもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、ミルク由来供給物は、３．６〜６．５の範囲ｐＨを有し、
−ｐＨが３．６〜５．０の範囲の場合、導電率は少なくとも４ｍＳ／ｃｍで、最大でｃｏｎｄ．_ｍａｘ＝１．３８ｍＳ／ｃｍ^＊ｐＨ＋１．０３ｍＳ／ｃｍであり、
−ｐＨが５〜６．５の範囲の場合、導電率は、少なくともｃｏｎｄ．_ｍｉｎ＝１．３３ｍＳ／ｃｍ^＊ｐＨ−２．６７ｍＳ／ｃｍで、最大でｃｏｎｄ．_ｍａｘ＝１．３８ｍＳ／ｃｍ^＊ｐＨ＋１．０３ｍＳ／ｃｍである。

したがってこれらの実施形態の供給物のｐＨが例えばｐＨ６．０の場合、導電率は、少なくともｃｏｎｄ．_ｍｉｎ＝１．３３ｍＳ／ｃｍ^＊６．０−２．６７ｍＳ／ｃｍ＝５．３ｍＳ／ｃｍで、最大でｃｏｎｄ．_ｍａｘ＝１．３８ｍＳ／ｃｍ^＊６．０＋１．０３ｍＳ／ｃｍ＝９．３ｍＳ／ｃｍである。

例えばミルク由来供給物は、３．６〜５．０の範囲のｐＨと、少なくとも４ｍＳ／ｃｍの導電率、および最大でｃｏｎｄ．_ｍａｘ＝１．３８ｍＳ／ｃｍ^＊ｐＨ＋１．０３ｍＳ／ｃｍを有してもよい。

代案としては、ミルク由来供給物は、５．０〜６．５の範囲のｐＨと、少なくとも少なくともｃｏｎｄ．_ｍｉｎ＝１．３３ｍＳ／ｃｍ^＊ｐＨ−２．６７ｍＳ／ｃｍ、および最大でｃｏｎｄ．_ｍａｘ＝１．３８ｍＳ／ｃｍ^＊ｐＨ＋１．０３ｍＳ／ｃｍの導電率を有してもよい。

それが特に明記されない限り、導電率およびｐＨ値は、２５℃の温度を有する供給物中で測定される。

本発明のいくつかの実施形態では、アニオン交換媒体は、固相と、１つまたは複数のカチオン基とを含んでなる。

好ましくは、カチオン基の少なくともいくつかは、固相表面に付着し、および／または固相表面を通じて接近可能な孔表面に付着する。

本発明のいくつかの実施形態では、アニオン交換媒体の固相は、複数の粒子、フィルター、およびメンブランからなる群から選択される、１つまたは複数の構成要素を含んでなる。

固相は、例えば多糖類を含んでなってもよく、またはさらにはそれから本質的になる。架橋多糖類が、特に好ましい。有用な多糖類の例は、セルロース、アガロース、および／またはデキストランである。

代案としては、固相は、非炭水化物ポリマーを含んでなってもよく、またはさらにはそれから本質的になる。有用な非炭水化物ポリマーの例は、メタクリレート、ポリスチレン、および／またはスチレン−ジビニルベンゼンである。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、カチオン基はアミノ基を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になる。三級アミノ基が特に好ましく、適切なｐＨ条件下で四級アンモニウム基をもたらす。四級アンモニウム基は、アニオン交換媒体に強力なアニオン交換特性を提供する。

代案としては、または加えて、カチオン基は、１つまたは複数の一級または二級アミノ基を含んでなってもよい。かなりの量の一級または二級アミノ基が、典型的に、弱いアニオン交換特性をアニオン交換媒体に提供する。

サイクルあたりの最適タンパク質負荷は、アニオン交換クロマトグラフィーシステムのデザインと、アニオン交換媒体の特性に依存する。

圧力、流速などをはじめとする、アニオン交換クロマトグラフィー中の処理条件は、実際の工程実施、使用装置、および使用アニオン交換媒体に依存する。

ステップｂ）におけるミルク由来供給物の温度は、典型的に、微生物の増殖、およびタンパク質とアニオン交換媒体の熱損傷を回避するのに十分低いが、許容可能粘度を提供するのに十分高い。

本発明のいくつかの実施形態では、ステップｂ）におけるミルク由来供給物の温度は、２〜４０℃の範囲である。好ましくは、ステップｂ）におけるミルク由来供給物の温度は、４〜２０℃の範囲、なおもより好ましくは６〜１２℃の範囲である。

アニオン交換クロマトグラフィーと、その工業的実施に関するさらなる詳細は、あらゆる目的のために、参照によって本明細書に援用するＳｃｏｐｅｓに見ることができる。

本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本発明の方法は、ミルク由来供給物に接触させた後、アニオン交換媒体を洗浄溶液で洗浄するステップｃ）を含んでなる。有用な洗浄溶液は、アニオン交換媒体から、緩く結合する分子を除去できる、典型的に中性または弱酸性ｐＨの水性溶液である。洗浄液として、例えば脱ミネラル水、または例えば０．１ＭのＮａＣｌなどの中性ｐＨの塩化ナトリウム水溶液を使用してもよい。

本発明のその他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、ステップｃ）を含有しない。

本発明のステップｄ）は、アニオン交換媒体に結合するオステオポンチンの回収を伴う。回収は、典型的に、アニオン交換媒体を溶出剤に接触させて、得られた溶出液、すなわち溶出剤とアニオン交換媒体から放出された分子とを収集することで、実施される。

常態では溶出剤は、結合オステオポンチンをアニオン交換媒体から放出させるのに十分なイオン強度および／またはｐＨを有する、水溶液である。有用な溶出剤の例は、中性ｐＨの１．０ＭのＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、またはその組み合わせなどの塩水溶液である。

回収組成物は、例えば組成物を脱塩および濃縮し、引き続いてそれを粉末に転換するための追加的な工程ステップを受けてもよい。

したがって本発明のいくつかの好ましい実施形態では、回収組成物は、濃縮、透析濾過、溶媒蒸発、噴霧乾燥、およびタンパク質結合カチオン置換からなる群から選択される、１つまたは複数の工程ステップをさらに受ける。

例えば、回収組成物は、濃縮ステップを受けてもよい。

代案としては、または加えて、回収組成物は透析濾過ステップを受けてもよい。

代案としては、または加えて、回収組成物は蒸発ステップを受けてもよい。

代案としては、または加えて、回収組成物は噴霧乾燥ステップを受けてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、回収組成物は、以下のステップを受ける：
ｉ）例えば限外濾過による濃縮、
ｉｉ）例えば水中での透析濾過、
ｉｉｉ）任意選択的に、例えば蒸発による、別の濃縮ステップ、
ｉｖ）ステップｉｉ）またはｉｉｉ）の水性組成物を例えばＣａＣｌ_２などの水溶性カルシウム塩に接触させることによる、カチオン置換、
ｖ）低温殺菌、および
ｖｉ）低温殺菌組成物を粉末に変えるための噴霧乾燥。

本方法は、バッチプロセスまたは半バッチプロセスとして実施してもよい。半バッチプロセスは、例えば第１のおよび第２のアニオン交換カラムを稼働して、第２のアニオン交換カラム上でステップｃ）および／またはｄ）を実施しながら、第１のアニオン交換カラム上でステップｂ）を実施することで、またはその逆で、実施してもよい。

したがって本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法は、
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、甘性乳清タンパク質濃縮物である、ミルク由来供給物であって、ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のカゼイノマクロペプチドをさらに含んでなる、ミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる。

本発明のその他の好ましい実施形態では、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法は、
ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有する、乳清タンパク質濃縮物である、ミルク由来供給物であって、遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼインをさらに含んでなる、ミルク由来供給物を提供するステップと、
ｂ）ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
ｃ）任意選択的に、アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
ｄ）アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
を含んでなる。

さらに本発明の態様は、本明細書に記載される方法によって得られ得る、オステオポンチン含有組成物に関する。

本発明について、特定の実施形態を参照して上で説明した。しかし上述した以外のその他の実施形態も本発明の範囲内で等しく可能である。特に明記されない限り、本発明の異なる特徴および様々な実施形態および態様のステップは、本明細書に記載されるもの以外の方法で組み合わせられてもよい。

実施例１ 電導度制御甘性乳清濃縮物からのオステオポンチン濃縮
プロトコル
以下の精製実験は、１３．３ｍＬ（１７０ｍｍ×１０ｍｍ）カラムに充填された、強力なアニオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇｂｅａｄｓを装着した、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）装置上で実施された。流速は、全ての実験において、装入、洗浄、および溶出全体を通じて、３．３３ｍｌ／分に維持した。原料は甘性乳清タンパク質単離物であり、各実験において７０ｇの総タンパク質量をカラムに装入した。原料中のＣＭＰ含量を分析した。原料サンプルを最終タンパク質濃度１０％ｗ／ｖに希釈し、これ以降ｐＨ（４．７ｍＳ／ｃｍでｐＨ３．０〜５．７）および導電率（ｐＨ４．３で２．３〜１０．３ｍＳ／ｃｍ）は、それぞれＨＣｌおよびＮａＣｌの添加によって調節した。床体積の３倍の１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０溶液によって、非結合タンパク質をカラムから洗い流した。引き続いて、溶出液中にタンパク質が検出されなくなるまで、カラムに１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０溶液を通過させて、結合タンパク質を溶出した。

以下の技術を使用して、各溶出液サンプルについて、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＣＭＰ、および総タンパク質の含有量を分析した。

総タンパク質量の測定
溶出液の総タンパク質含量は、Ｃｏｈｅｎで記載されるように、標準ケルダール消化によって測定した。

ＨＰＬＣ法によるＯＰＮ定量化
分析原理：
０．２２μｍフィルターを通してサンプルを濾過し、ＰｈａｒｍａｃｉａからのカラムＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５（１ｍｌ）によるＨＰＬＣを実施して、２８０ｎｍで検出した。外部標準法（既知のＯＰＮ含量の標準物質のピーク面積との比較）によって、サンプル濃度を計算した。方法の特異性が低いため、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）で、サンプルが比較的純粋なＯＰＮを含んでなることが、この分析手順の必要条件である。

試薬：ＯＰＮ標準物質；ミリＱ水、ＨＰＬＣ等級；ＮａＣｌ、Ｍｅｒｃｋ；トリスＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ
緩衝液Ａ：１０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスＨＣＬ、ｐＨ８．０
緩衝液Ｂ：０．８ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０

標準検量線は、緩衝液Ａ中のＯＰＮ標準の濃度範囲が１〜１０ｍｇ／ｍｌである、５つの標準物質から作成した。全ての標準物質は、カラムへの装入前に、０．２２μｍフィルターによって濾過した。

試料採取および前処理：
分析のためのサンプルが標準検量線の範囲外にある場合は、それらをＨＰＬＣ等級のミリＱ水で希釈した。溶出剤からの多量のＮａＣｌが存在する場合にも、ＯＰＮのアニオン交換樹脂への結合を可能にするために、希釈が必要なことがあった。２５μＬの１〜１０ｍｇ／ｍＬのＯＰＮに相当する量を分析のために注入した。サンプルは、ＨＰＬＣへの注入前に、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。

ＨＰＬＣ条件：流速１ｍｌ／分、注入量２５μＬ、勾配：０％Ｂで０〜３分間、０〜６０％Ｂで３〜１７分間、６０〜１００％Ｂで１７〜３０分間、１００％Ｂで３０〜３３分間、１００〜０％Ｂで３３〜３４分間、０％Ｂで３４〜４０分間。

結果の計算および表示：
標準曲線を参照して、用いられた希釈を観察することで、各サンプル中のＯＰＮの濃度を計算した。

現文脈でケルダール消化によって判定される大部分または全てのタンパク質はＯＰＮであったため、ＯＰＮ特異的Ｊｏｎｅｓ係数７．１７を使用して、ＯＰＮと総タンパク質量間の比率によって、純度を計算した。

ＨＰＬＣによる主要乳清タンパク質の定量化
ゲル透過クロマトグラフィーによる、主要乳清タンパク質、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、およびＣＭＰ（カゼイノグリコマクロペプチド）の分離および定量化。

付属プレカラムＰＷｘｌ（６ｍｍ４ｃｍ）と直列に連結されたＴＳＫｇｅｌ３０００ＰＷｘｌ（７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）の２本のカラム（Ｔｏｓｏｈａｓｓ，日本）を使用して、ゲル透過クロマトグラフィーを実施した。

システムの較正のための標準溶液は、以下からなった：５００．０ｍｌの０．０２Ｍのリン酸緩衝液７．５に溶解された、２２５ｍｇのＣＭＰ、２２５ｍｇのα−ラクトアルブミン、および５０ｍｇのβ−ラクトグロブリン。

サンプルの前処理：粉末サンプルを１ｍｇ／ｍｌでリン酸緩衝液に溶解し、可溶化のために一晩置いた。代案としては、液体サンプルをリン酸緩衝液で希釈して、およそ０．１％のタンパク質含量を得た。タンパク質含量が０．１％未満であった場合は、サンプルを希釈せずに測定した。カラムへの注入前に、０．２２μｍのフィルターを通過させて、全てのサンプルを濾過した。

結果の計算および表現：
以下に従って、サンプル中の個々のタンパク質の百分率を計算した：
Ａ×０．１×Ｆ、式中、
Ｂ
Ａ＝サンプル中で測定された面積
０．１＝０．１％溶液のための換算係数
Ｆ＝希釈係数（１００，０００／ｍｇサンプル重量）
Ｂ＝０．１％標準溶液中の個々のタンパク質の計算された面積

結果
ＣＭＰ含量
甘性乳清原料中のＣＭＰ含量は２０．１％であったが、驚くことに、実施例１の濃縮ＯＰＮ組成物中では、ＣＭＰは不検出であった。

オステオポンチンの純度と収率に対する供給物ｐＨの影響：
図１に示される、装入供給物のｐＨ価を変動させる第１の一連の実験は、ｐＨ３からおよそｐＨ４．３へのｐＨ増大と共に、ＯＰＮ収率（供給物中の７０ｇの総タンパク質量からのＯＰＮのｍｇ）が増大することを示す。ｐＨ４．３を超えるｐＨの増大時に、高収率は維持される。得られたＯＰＮ調製品中のＯＰＮの純度は、低ｐＨ価では非常に高いが、ｐＨがおよそｐＨ４．５を超えて増大すると純度は緩慢に低下するが、およそｐＨ６．５まではなおも許容可能である。しかし高純度ＯＰＮの最良の収率は、ｐＨ３．８〜５．５のｐＨ範囲、特にｐＨ４．３〜４．５の範囲で得られる。

オステオポンチンの純度と収率に対する供給物の導電率の影響：
導電率を変動させる一連の実験からの結果は、図２に示される。低導電率では収率が高い一方、純度は低い。導電率を増大させると純度は増大し、およそ５．５ｍＳ／ｃｍで１００％に達する。導電率をさらに増大させると純度は高いままである一方、導電率がおよそ１０ｍＳ／ｃｍを超えると、ＯＰＮの収率は低下し始める。しかし高純度ＯＰＮの最良の収率は、４．５〜９．０ｍＳ／ｃｍの範囲、特に５〜８ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率で得られるようである。

考察／結論
ｐＨの影響：
図１から、およそｐＨ３．６未満のｐＨ価では、ＯＰＮはその電荷が低下するようであり、したがって樹脂のカチオン基への結合が低下する。およそｐＨ４．５を超えるｐＨ価では、供給物のその他のタンパク質が負に帯電して樹脂に結合し始めるようになるので、ＯＰＮの純度は低下し始める。したがって本発明者らは、供給物が大量のＣＭＰを含有するのにもかかわらず、高収率で高純度のＯＰＮが単離される最適ｐＨ価の範囲をｐＨ３．６〜６．５の範囲と特定した。得られるＯＰＮ調製品中で、ＣＭＰは不検出である。

導電率の影響：
図２から、およそ４ｍＳ／ｃｍ未満の導電率では、その他のタンパク質が樹脂に結合し得るので、ＯＰＮ純度は低下するようである。導電率がおよそ６ｍＳ／ｃｍを超えると、ＯＰＮの樹脂への結合がさらに弱くなり、収率は緩慢に低下するが、およそ１０ｍＳ／ｃｍの導電率までは許容可能である。したがって本発明者らは、ＯＰＮ生産のために、およそ４〜１０ｍＳ／ｃｍの狭い範囲が最適であると特定した。この狭い範囲内では、およそ２０％のＣＭＰを含有する原料からでさえも、高収率かつ高純度でＯＰＮを単離し得る。

いくつかの追加的な実験を実施して、甘性乳清ベース供給物中の特許請求されるｐＨ／導電率範囲を探索したが、追加的な実験は上述の結論を裏付ける。

実施例２ 電導度制御酸性乳清濃縮物からのオステオポンチンの濃縮
以下の精製実験は、実施例１と同様のＦＰＬＣ装置上で実施した。しかし原料は、１０％（ｗ／ｗ）の総タンパク質含量を有する酸性乳清濃縮物であり、およそ７０ｇの総タンパク質量がカラムに装入された。

濃縮酸性乳清を異なる程度に希釈して、２．５〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を生じさせた。実施例１に記載される方法によって、供給物および溶出液中のＯＰＮおよび総タンパク質量を測定した。

ＨＣｌの添加によってｐＨを４．３に調節し、原料をアニオン交換カラムに装入した。床体積の３倍の０．１ＭのＮａＣｌによって非結合タンパク質をカラムから洗い流し、引き続いて、溶出液中にタンパク質が検出されなくなるまで、カラムに１ＭのＮａＣｌ溶液を通過させて、結合タンパク質を溶出した。

濃縮酸性乳清からのＯＰＮの濃縮における、ＯＰＮの純度と収率に対する導電率の影響は図３に示される。

図３のデータは、記載される手順による、酸性乳清からのＯＰＮの濃縮を示す。甘性乳清が原料として使用された実施例１と同様に、供給物の低導電率が、生成物の純度を犠牲にして収率を増大させることが、再度観察された。しかし酸性乳清由来供給物は、大量のＣＭＰを含有しないので、影響は、供給物が甘性乳清に由来する場合程には、ＯＰＮの濃縮に有害でない。酸性乳清由来供給物は、微量成分を含有し、その結合は、ＣＭＰの結合回避で用いられるのと同じパラメータ設定によって、最小化し得る。したがって実施例１で特定されたＯＰＮ単離の狭い最適範囲は、酸性乳清からのＯＰＮ単離にも同様に適用されることが観察され得る。

本発明者らはいくつかの追加的な実験を実施して、酸性乳清ベースの供給物中の特許請求されるｐＨ／導電率範囲を探索したが、追加的な実験は上述の知見を裏付ける。

実施例３ 電導度制御乳清濃縮物からのオステオポンチンの濃縮
先の実施例に従って、開示される方法によるＯＰＮ生産のための原料として、乳清を使用し得る。乳清は、カゼインミセルを除去するように、２４℃の脱脂乳の精密濾過（フィルター孔径およそ０．１ミクロン）によって製造される。その後、ＨＣｌによって乳清サンプルをｐＨ４．３またはｐＨ４．７に調節し、ダイアフィルター処理して、４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率と、およそ５％または１０％（ｗ／ｗ）の総タンパク質含量を得た。引き続いて、実施例１に記載されるように、およそ５℃でのアニオン交換によって、変性乳清サンプルからＯＰＮを濃縮した。

結果と観察
実施された試行は、乳清に由来する供給物もまた、本方法で使用してもよいことを実証した。

驚くことに、処理中に未確認の沈殿が観察され、数サイクルのアニオン交換後に、アニオン交換物質の目詰まりまたは汚染が生じた。沈殿の問題は、アニオン交換に先だって、濾紙を通して酸性化乳清を濾過することで解決された。本発明者らは、沈殿が、天然カゼインミセルが除去された際に乳清中に留まる、遊離α−および遊離β−カゼインなどの溶解カゼイン種と関連している徴候を見た。

考察／結論
乳清が、カゼインを除去するように脱脂乳を精密濾過して製造されるのに対し、甘性および酸性乳清は、それぞれレンネットまたは酸の作用によるカゼインの沈殿によって、カゼインが枯渇される。その結果、全ての３つのカテゴリーのミルク由来供給物は、カゼインの沈殿および軟凝集のためにアニオン交換クロマトグラフィー手順を妨げ得る、カゼインミセルを本質的に含まない。

本発明者らは、溶解カゼインがアニオン交換中に問題を引き起こす徴候を見た。この問題は、例えばマイクロフィルターを使用して、アニオン交換に先だってミルク由来供給物を濾過することで、解決し得る。

代案としては、アニオン交換ステップは、例えばｐＨ５．０〜６．５の範囲など、沈殿が限定的であり、または不在でさえあるｐＨで実施してもよい。このｐＨ範囲でアニオン交換を実施する場合、２０〜４０℃などの１５℃を超える供給／処理温度を使用することが、さらに提言される。この温度範囲内では、溶解β−カゼインは、ミルクの天然カゼインミセルと混同すべきでない小型β−カゼインミセルを形成し、これらのβ−カゼインミセルは、単一β−カゼイン分子程にはアニオン交換工程を妨げないようである。

実施例４ 電導度制御なしの甘性乳清濃縮物からのオステオポンチンの濃縮
以下の精製実験は、実施例１と同様のＦＰＬＣ装置上で実施した。原料は甘性乳清単離物であり、およそ１ｇの総タンパク質量をカラムに装入した。限外濾過によって、甘性乳清をカラム装入前に濃縮し、等容積の水の添加後にダイアフィルター処理して、最後に等容積の水で再度希釈した。得られた導電率は、２．１ｍＳ／ｃｍであった。実施例１に記載される方法によって、供給物および溶出液中のＣＭＰおよび総タンパク質量を測定した。ＯＰＮの量は、供給物および溶出液の双方の中の干渉タンパク質のために、測定され得なかった。表１のＯＰＮデータは、実施例１からの実験中の既知の収率から推定される。

ＨＣｌの添加によってｐＨを４．３に調節し、原料をアニオン交換カラムに装入した。床体積の３倍の水によって非結合タンパク質をカラムから洗い流し、以下、溶出液中にタンパク質が検出されなくなるまで、カラムに１ＭのＮａＣｌ溶液を通過させて、結合タンパク質を溶出した。

考察／結論：
表１のデータは、記載される処置による酸性乳清タンパク質の濃縮を示す。しかしＯＰＮは、供給物中の酸性乳清タンパク質の微量画分を構成するために、わずかな程度にのみ濃縮される。例えばＣＭＰもまた樹脂に結合し、供給物中に高濃度で存在するので、このタンパク質は、樹脂の結合能力を大量に消費する。したがってこの手順は、ＯＰＮ生産のために十分でない。

実施例５ 比較および結論（実施例１と実施例４の比較）
実施例１および４の処理のいくつかの特性が、下の表２で比較される。

結論
表２で要約されるように、実施例１の方法は、ＯＰＮの濃縮について、実施例４の方法よりもはるかにより特異的である。したがって実施例１の処理では、サイクルあたりカラムにより多くのタンパク質を装入し得て、サイクルあたりのＯＰＮの収率がはるかにより高い。この方法が事実上純粋なＯＰＮをもたらすのに対し、実施例４の生成物ではＣＭＰが優勢である。

参考文献
Ｃｏｈｅｎ：Ｊｕｌｉｕｓ Ｂ．Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９１０年
Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．：Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｓｅｎｓｏｒｙ，ａｎｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｉｒｔｙ−ｆｏｕｒ ｐｅｒｃｅｎｔ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ”，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．９２：４７７３−４７９１，２００９年
Ｓｃｏｐｅｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ；第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，ＩＳＢＮ ０−３８７−９４０７２−３
国際公開第０２／２８４１３ Ａ１号パンフレット
国際公開第０１／１４９７４１ Ａ２号パンフレット
国際公開第９９／３３４１５ Ａ１号パンフレット

Claims (30)

1. ａ）オステオポンチンを含んでなり、２５℃でｐＨ３．６〜６．５の範囲のｐＨと、２５℃で４〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率とを有する、ミルク由来供給物であって、
   −前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のカゼイノマクロペプチド、または
   −遊離α−カゼインおよび遊離β−カゼイン
   をさらに含んでなる、ミルク由来供給物を提供するステップと、
   ｂ）前記ミルク由来供給物をアニオン交換媒体に接触させることを含む、前記ミルク由来供給物にアニオン交換クロマトグラフィーを実施するステップと、
   ｃ）任意選択的に、前記アニオン交換媒体を洗浄するステップと、
   ｄ）前記アニオン交換媒体に結合するタンパク質を回収し、それによって単離オステオポンチンを含んでなる組成物を得るステップと
   を含んでなることを特徴とする、ミルク由来供給物からオステオポンチンを単離する方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、５．０未満の等電点（ｐＩ）を有する追加的タンパク質をさらに含んでなることを特徴とする方法。
3. 請求項２に記載の方法において、前記１つまたは複数の追加的なタンパク質が、α−ラクトアルブミン、カゼイノマクロペプチド、カゼイノリンペプチド、プロテオースペプトン−３、プロテオースペプトン−５、プロテオースペプトン−８、およびその混合物からなる群から選択される、１つまたは複数のタンパク質を含んでなることを特徴とする方法。
4. 請求項３または４に記載の方法において、前記１つまたは複数の追加的なタンパク質が、カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を含んでなることを特徴とする方法。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、乳清由来供給物を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になることを特徴とする方法。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、甘性乳清由来供給物を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になることを特徴とする方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のＣＭＰを含んでなることを特徴とする方法。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のＣＭＰを含んでなることを特徴とする方法。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の遊離α−カゼインと遊離β−カゼインの総量を含んでなることを特徴とする方法。
10. 請求項９に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、ｐＨ５．０〜６．０の範囲などの５．０〜６．５の範囲のｐＨを有することを特徴とする方法。
11. 請求項９に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、温度２０〜３８℃の範囲などの１５〜４０℃の範囲の温度を有することを特徴とする方法。
12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物を提供するステップａ）が、前記ミルク由来供給物を形成するために酸性化された液体から、沈殿を除去することを伴うことを特徴とする方法。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のα−ラクトアルブミンを含んでなることを特徴とする方法。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のα−ラクトアルブミンを含んでなることを特徴とする方法。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、少なくとも１％（ｗ／ｗ）の量のβ−ラクトグロブリンを含んでなることを特徴とする方法。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、前記ミルク由来供給物のタンパク質総量に対して、１〜７０％（ｗ／ｗ）の範囲の量のβ−ラクトグロブリンを含んでなることを特徴とする方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、６〜２５０ｇ／Ｌミルク由来供給物の範囲のタンパク質総量を含んでなることを特徴とする方法。
18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、２５℃でｐＨ３．８〜５．５の範囲のｐＨを有することを特徴とする方法。
19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、２５℃で導電率４．５〜９．０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有することを特徴とする方法。
20. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、２５℃で導電率４〜７ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有することを特徴とする方法。
21. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、２５℃で導電率５〜８ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有することを特徴とする方法。
22. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法において、前記ミルク由来供給物が、２５℃で導電率７〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有することを特徴とする方法。
23. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法において、前記アニオン交換媒体が、固相と、１つまたは複数のカチオン基とを含んでなることを特徴とする方法。
24. 請求項２３に記載の方法において、前記アニオン交換媒体の前記固相が、複数の粒子、フィルター、およびメンブランからなる群から選択される、１つまたは複数の構成要素を含んでなることを特徴とする方法。
25. 請求項２３または２４に記載の方法において、前記固相が、多糖類を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になることを特徴とする方法。
26. 請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法において、前記固相が、架橋多糖類を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になることを特徴とする方法。
27. 請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法において、前記固相が、セファロースを含んでなり、またはさらにはそれから本質的になることを特徴とする方法。
28. 請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法において、前記カチオン基が、アミノ基を含んでなり、またはさらにはそれから本質的になることを特徴とする方法。
29. 請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法において、回収された前記組成物が、濃縮、透析濾過、溶媒蒸発、噴霧乾燥、およびタンパク質結合カチオン置換からなる群から選択される、１つまたは複数の工程ステップをさらに受けることを特徴とする方法。
30. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって得られることを特徴とする、オステオポンチン含有組成物。

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