JP2014509588A - 二特異性結合剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、二特異性抗スクレロスチン／抗ＤＫＫ１結合剤、および抗スクレロスチン結合剤と抗ＤＫＫ１結合剤との組み合わせ、ならびに関連する治療方法に関する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年３月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４４８，０８９号および２０１１年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／４８２，９７９号に基づく優先権の利益を主張するものであり、該出願はそれぞれ、参照により本明細書に援用される。

本出願は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１（ｃ）項および１．８２１（ｅ）項により規定されるコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）および書面の双方の役割を果たす、ＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」に準拠した配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０１２年２月２９日に作成されたこの「ｔｘｔ」ファイルの名称は、Ａ−１５９８−ＵＳ−ＮＰ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿０２２９１２＿ＳＴ２５＿ＡｄｄｅｄＳｅｑ４８５−４９６．ｔｘｔであり、サイズは４７１ＫＢである。
発明の背景

発明の分野
本発明は、二特異性抗スクレロスチン／抗ＤＫＫ１結合剤、および抗スクレロスチン結合剤と抗ＤＫＫ１結合剤との組み合わせ、ならびに関連する治療方法に関する。

個人の生涯にわたり、２段階または３段階の明らかな骨量の変化が起きる（Ｒｉｇｇｓ，Ｗｅｓｔ Ｊ．Ｍｅｄ．１５４：６３ ７７（１９９１）を参照）。第１段階は、男女双方で起こり、最大骨量に達するまで進行する。この第１段階は、軟骨内成長板の長さの成長および骨膜付加速度による径方向の成長によって達成される。第２段階は、海綿骨（椎骨および骨盤などの扁平骨）に関しては３０歳前後、皮質骨（例えば、四肢に見られる長骨）に関しては４０歳前後で開始し、老齢期まで継続する。この段階は、緩徐な骨量減少を特徴とし、男女双方で起きる。女性では、第３段階の骨量減少も起きるが、これは閉経後のエストロゲン欠乏による可能性が最も高い。この段階の間だけで、女性は、皮質骨および海綿骨部分からさらに骨量を失う恐れがある（Ｒｉｇｇｓ、上記参照）。

骨塩量の減少は、多様な状態によって引き起こされる可能性があり、重大な医学上の問題を引き起こす恐れがある。例えば、骨粗鬆症は、ヒトにおける衰弱性疾患であり、骨格骨量と骨塩密度の著しい低下、骨微細構造の劣化および付随する骨脆弱性の増加（すなわち、骨強度の低下）を含む骨の構造劣化、ならびに罹患者の骨折しやすさを特徴とする。ヒトにおける骨粗鬆症には、一般に、臨床的骨減少症（骨塩密度が、若年成人の骨の平均値よりも１標準偏差を超えるが２．５標準偏差未満下回る）が先行するが、これは米国でおよそ２５００万人に見られる状態である。米国ではさらに７８００万人の患者が臨床的骨粗鬆症（成熟した若年成人の骨の骨塩量を２．５標準偏差を超えて下回る骨塩量として定義される）と診断されている。ヒト集団における骨粗鬆症の頻度は、年齢に伴って増加する。白人では、骨粗鬆層は主に女性に発生し、米国では骨粗鬆症患者集団の８０％を占める。高齢者において増加した骨格骨の脆弱性および骨折しやすさは、この集団における転倒事故の危険性の増大によって悪化する。骨粗鬆症に付随する最も一般的な損傷には、股関節、手首、および椎骨の骨折がある。特に股関節骨折は、患者にとって極めて不快であり、費用がかかり、また女性とっては、高い死亡率および罹患率と相関している。

骨粗鬆症は、骨量低下による骨折の危険性の増加と考えられているが、現在利用できる骨障害の治療には成人の骨密度を増加させることができるものはほとんどなく、現在利用できる治療のほとんどは、主に、新たな骨の形成を刺激するよりもむしろ、さらなる骨吸収を阻害することによって作用する。現在、骨量減少を遅延させるためにエストロゲンが処方されている。しかしながら、患者が何らかの長期的利点を得るかどうか、またエストロゲンが７５歳を超える患者に対して何らかの効果を有するかどうかについては、いくつかの議論が展開されている。さらに、エストロゲンの使用は、乳癌および子宮内膜癌の危険性を高めると考えられている。カルシトニン、オステオカルシンをビタミンＫと共に、または高用量の食事カルシウムを場合によってビタミンＤと共に摂取することも、閉経後の女性に提案されている。しかしながら、高用量のカルシウムは望ましくない胃腸の副作用を有することが多く、血清中および尿中のカルシウムレベルを持続的にモニターしなければならない（例えば、Ｋｈｏｓｌａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７０：９７８９８２，１９９５）。

骨粗鬆症の現在の他の治療方法としては、ビスホスホネート（例えば、Ｆｏｓａｍａｘ（商標）、Ａｃｔｏｎｅｌ（商標）、Ｂｏｎｖｉｖａ（商標）、Ｚｏｍｅｔａ（商標）、オルパドロネート、ネリドロネート、スケリッド（ｓｋｅｌｉｄ）、ボネフォス）、副甲状腺ホルモン、カルシリティック（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ）、カルシミメティクス（例えば、シナカルセト）、スタチン、タンパク同化ステロイド、ランタン塩およびストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが挙げられる。しかしながら、このような治療薬は、望ましくない副作用を伴うことが多い（Ｋｈｏｓｌａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ、上記参照）。

ＳＯＳＴ遺伝子産物であるスクレロスチンは、骨の過成長と強い高密度の骨に示される骨疾患である硬結性骨化症では存在しない（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６８：５７７ ５８９，２００１、Ｂａｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０：５３７ ５４３，２００１）。スクレロスチン阻害剤は、骨ミネラル化の速度を向上させ、ひいては骨塩密度を増加させることが示されている（Ｐａｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｊｕｎ、印刷物に先立って電子公開される）。同様に、Ｄｋｋ−１は、骨形成の調節、特に骨折修復、および骨量減少に関連する他の様々な疾患（例えば、癌および糖尿病）におけるその作用に関与することが分かっている（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２０１０ Ｊｕｌ；２８（７）：９２８−３６、Ｇａｖｒｉａｔｏｌｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ．２００９ Ｊｕｌ；１３（７）：８３９−４８）。

Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）は、胚頭部誘導に関与し、Ｗｎｔに拮抗する、分泌タンパク質である（Ｇｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７−３６２（１９９８））。ヒトＤｋｋ−１のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチドが記載されている（米国特許第６，３４４，５４１号、第６８４４４２２号、第７，０５７，０１７号、米国公開特許出願第２００５００６９９１５号、Ｋｒｕｐｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２３８：３０１−３１３（１９９９））。ヒトにおけるＤｋｋ−１の発現は、胎盤に限定されると考えられ、胚発生にＤｋｋ−１が果たす役割を示唆している（Ｋｒｕｐｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、上記）。Ａｌｌｅｎらは（米国公開特許出願第２００４００３８８６０号）、ＬＲＰ５、ＨＢＭ、またはＬＲＰ６とＤｋｋ−１との間の相互作用に関するアッセイについて記載している。Ｄｋｋ−１に結合する抗体は、前述の特許および特許出願、ならびに米国公開特許出願第２００５００７９１７３号および第２００６０１２７３９３号に記載されている。

ヒトＤｋｋ−１は、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、およびＤｋｋ４を含むＤｉｃｋｋｏｐｆ遺伝子ファミリーのメンバーである（Ｋｒｕｐｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、上記）。Ｄｋｋ−１およびＤｋｋ−４はアフリカツメガエル胚におけるＷｎｔによる二次軸誘導を抑制することが示されているが、いずれもアフリカツメガエルのＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄまたはＦｒｉｚｚｌｅｄにより誘発される軸誘導を遮断せず、このことは、それらのＷｎｔ阻害活性がＷｎｔシグナル伝達経路におけるＦｒｉｚｚｌｅｄの上流に存在することを示唆している（Ｋｒｕｐｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、上記）。Ｄｋｋ−１は骨形成に対して阻害作用を有する可能性があり、それによりＤｋｋ−１が骨粗鬆症の予防または治療のための潜在的標的となることが示唆されている（Ｐａｔｅｌ ａｎｄ Ｋａｒｅｎｓｋｙ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５７２−１５７３（２００２）、Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５１３−１５２１（２００２））。

骨形成の増加を必要とする状態、例えば、骨折修復、または多発性骨髄腫などの病態に関連する骨量減少などの治療に有効な新規の阻害剤が本明細書において提供される。さらに、ＤＫＫ−１阻害剤およびスクレロスチン阻害剤の組み合わせを含む、骨の同化作用を増加させる多特異的薬剤も本明細書において提供される。これらの組み合わせは、例えば骨粗鬆症の治療、骨折の治癒の促進、および骨形成速度の向上を必要とする様々な状態に使用可能である。とりわけ、ＤＫＫ−１およびスクレロスチン阻害剤は、２つの別個の阻害剤、例えば、抗スクレロスチン抗体および抗ＤＫＫ−１抗体であってもよい。あるいは、ＤＫＫ−１およびスクレロスチン阻害剤は、単一の分子実体であってもよい。非限定的な例としては、ＤＶＤ−Ｉｇの二特異性抗体などの二特異性結合分子、および二特異性リンカーボディ（ｌｉｎｋｅｒｂｏｄｙ）が挙げられる。

本実施形態の一態様では、本発明の分子を用いた治療に好適な患者は、骨に転移する癌に罹患した患者であり、別の態様では、患者は、多発性骨髄腫に罹患した患者である。また別の態様では、患者は、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、歯周炎、関節リウマチ、および運動不足による骨量減少を有する患者から選択される。また他の実施形態では、患者は、例えば骨粗鬆症または癌（例えば、多発性骨髄腫）に関連する溶骨性病変によって引き起こされる、原因となる骨量の減少に起因する、またはこれに起因しない骨損傷を有する患者から選択される。そのような骨損傷の例としては、整形外科的処置、歯科処置、埋め込み手術、関節置換術（例えば、人工股関節置換術、人工膝関節置換術等）、骨移植、骨の美容整形、ならびに骨修復、例えば骨折治癒、偽関節治癒、癒合遅延治癒、および顔面再建術が挙げられるが、これらに限定されない。処置、置換術、移植、手術、または修復の前、最中、および／または後に１つ以上の組成物を投与してもよい。

一実施形態では、ポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記ポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に特異的に結合する結合分子が提供される。

別の実施形態では、ポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記ポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に特異的に結合する結合分子が提供される。

さらなる実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記第１のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは、存在するか、または不在であり、前記第２のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に特異的に結合する結合分子が提供される。

別の実施形態では、４つのポリペプチド鎖を含む、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に結合する結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、ＶＨ１およびＶＨ２重鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１およびＶＬ２軽鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、結合分子が提供される。

またさらなる実施形態では、４つのポリペプチド鎖を含む、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に結合する結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、配列番号１８および２０、２２および２４、２６および２８、３０および３２、３４および３６、３８および４０、４２および４４、４６および４８、５０および５２、５４および７６、５６および７２、５８および６０、６２および６４、６６および６８、７０および７２、７４および７６、７８および８０、８２および８４、８６および８８、９０および９２からなる群から選択されるＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合を含む結合分子が提供される。

別の実施形態では、４つのポリペプチド鎖を含む結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、前記結合分子が、３つのＶＨ１ ＣＤＲと、３つのＶＨ２ ＣＤＲと、３つのＶＬ１ ＣＤＲと、３つのＶＬ２ ＣＤＲとを含み、前記対合するＶＨ１とＶＬ１とのＣＤＲ、および対合するＶＨ２とＶＬ２とのＣＤＲが、配列番号：
９７〜１０２、１０５〜１１０、１１３〜１１８、１２１〜１２６、１２９〜１３４、１３７〜１４２、１４５〜１５０、１５３〜１５８、１６１〜１６６、１６９〜１７４、１７７〜１８２、１８５〜１９０、１９３〜１９８、２０１〜２０６、２０９〜２１４、２１７〜２２２，
または配列番号：
２２５〜２３０、２３３〜２３８、２４１〜２４６、２４９〜２５４、２５７〜２６２、２６５〜２７０、２７３〜２７８、２８１〜２８６、２８９〜２９４、２９７〜３０２、３０５〜３１０、３１３〜３１８、３２１〜３２６、３２９〜３３４、３３７〜３４２、３４５〜３５０、３５３〜３５８、３６１〜３６６、３６９〜３７４、３７７〜３８２、３８５〜３９０、３９３〜３９８、４０１〜４０６、４０９〜４１４からなる群から選択される結合分子が提供される。

別の実施形態では、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に結合する結合分子を生成するための方法であって、（ａ）スクレロスチンまたはＤＫＫ−１に結合可能な第１の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、（ｂ）スクレロスチンまたはＤＫＫ−１に結合可能な第２の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、（ｃ）ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む、第１および第３のポリペプチド鎖を構築するステップであって、式中、ＶＨ１は、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、ＣＨ１ではないという条件でリンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、ステップと、（ｄ）ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第２および第４のポリペプチド鎖を構築するステップであって、式中、ＶＬ１は、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、ステップと、（ｅ）スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に結合する結合分子が生成されるように、前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を発現させるステップと、を含む、方法が提供される。

別の実施形態では、本発明の結合分子を含む薬学的組成物が提供される。さらなる実施形態では、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体のうちの１つ以上と組み合わせた本発明の結合分子が提供される。

一実施形態では、骨障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の結合分子を投与することを含む、方法が提供される。別の実施形態では、骨折修復を促進する方法であって、それを必要とする患者に本発明の結合分子を投与することを含む、方法が提供される。別の実施形態では、骨密度を増加させる方法であって、それを必要とする患者に本発明の結合分子を投与することを含む、方法が提供される。さらなる実施形態では、骨強度を増加させる方法であって、それを必要とする患者に本発明の結合分子を投与することを含む、方法が提供される。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および図面を参照することで明らかになるであろう。

ｈｕＤＫＫ１またはｈｕＳｃｌに結合する二特異性ｈｕＡｂのＥＬＩＳＡ分析を要約している。 ｈｕＤＫＫ１またはｈｕＳｃｌに結合する二特異性ラットＡｂのＥＬＩＳＡ分析を要約している。 ｈｕＤＫＫ１およびｈｕＳｃｌに同時に結合する二特異性ＡｂのＥＬＩＳＡ分析を要約している。 同じモル比を用いたときに、ｒＡＢ−４−１１Ｈ１０が対照Ｍａｂと類似する中和活性を示す、インビトロバイオアッセイの結果を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、抗スクレロスチンｍＡｂと抗ＤＫＫ１ ｍＡｂとの組み合わせ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスを用いたインビボ試験からの腰椎および全脚のデータにおける、骨量密度（ＢＭＤ）および骨塩量（ＢＭＣ）の変化率を要約している。 抗スクレロスチン／抗ＤＫＫ−１併用療法での処置後の遺伝子発現データの分析を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、抗スクレロスチンｍＡｂと抗ＤＫＫ１ ｍＡｂとの組み合わせ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスにおける、腰椎および大腿骨−脛骨のＢＭＤ変化率を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、抗スクレロスチンｍＡｂと抗ＤＫＫ１ ｍＡｂとの組み合わせ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスにおける、腰椎および大腿骨−脛骨のＢＭＤ変化率を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、抗スクレロスチンｍＡｂと抗ＤＫＫ１ ｍＡｂとの組み合わせ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスからの骨強度の変化率を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、抗スクレロスチンｍＡｂと抗ＤＫＫ１ ｍＡｂとの組み合わせ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスからの骨強度の変化率を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、抗スクレロスチンｍＡｂと抗ＤＫＫ１ ｍＡｂとの組み合わせ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスからのマウス大腿骨の断面像を含む。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、およびＤＫＫ１ ｍＡｂ、ならびに１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したラットからのねじれモデルにおける、骨強度の変化率を要約している。 ビヒクル、６．１４７−２ｘ−Ａｂ５二特異体、６．３７−ＡｂＬ−Ａｂ２３二特異体、Ａｂ５Ｋ−ＡｂＳ−６．１４７二特異体、６．１４７−ＡｂＬ−２７Ｈ６二特異体、および８Ｇ２−ＡｂＬ−６．３７．５二特異体で処置したラットからの腰椎および大腿骨−脛骨における、ＢＭＤの変化率を要約している。 ビヒクル、６．１４７−２ｘ−Ａｂ５二特異体、６．３７−ＡｂＬ−Ａｂ２３二特異体、Ａｂ５Ｋ−ＡｂＳ−６．１４７二特異体、６．１４７−ＡｂＬ−２７Ｈ６二特異体、および８Ｇ２−ＡｂＬ−６．３７．５二特異体で処置したラットからの腰椎および大腿骨−脛骨における、ＢＭＤの変化率を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスからの骨強度の変化率を要約している。 ビヒクル、抗スクレロスチンｍＡｂ、抗ＤＫＫ１ ｍＡｂ、および１３Ｃ７−１１Ｈ１０二特異体で処置したマウスからの骨強度の変化率を要約している。 Ｗｎｔタンパク質で処理した骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞において、ラット１３Ｃ７−１１Ｈ１０が親抗体の中和活性を保持することを示す、骨芽細胞ｓｕｐｅｒｔｏｐｆｌａｓｈ競合アッセイの結果を要約している。 Ｗｎｔ１タンパク質で処理した骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３Ｅ１ＳＴＦ細胞において、ラットおよびヒトＤＶＤ−Ｉｇが、スクレロスチンおよびＤｋｋ１の双方に対する強力な中和活性を有することを示す、骨芽細胞ｓｕｐｅｒｔｏｐｆｌａｓｈ競合アッセイの結果を要約している。 ＤＶＤ−ＩｇによるスクレロスチンまたはＤｋｋ１へのＬｒｐ６の結合の阻害を示す、アルファスクリーン競合アッセイの結果を要約している。 ＤＶＤ−Ｉｇとして知られている代表的な二特異性結合分子の概略図である。

本明細書における節の見出しは編成目的に過ぎず、本明細書に記載される主題を制限するものと解釈されるべきではない。本出願において引用する全ての参照文献は、参照により本明細書に明示的に援用される。本明細書において別段の定めがない限り、本発明に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。

骨形成の増加を必要とする状態、例えば、骨折修復、または多発性骨髄腫などの病態に関連する骨量減少などの治療に有効な新規の二特異性分子が本明細書において提供される。さらに、ＤＫＫ−１阻害剤とスクレロスチン阻害剤との組み合わせを含む、骨の同化作用を増加させる薬剤の組み合わせも本明細書において提供される。これらの組み合わせは、例えば骨粗鬆症の治療、骨折治癒速度の向上、および骨形成速度の向上を必要とする様々な状態に使用可能である。この組み合わせ治療薬は、例えば抗スクレロスチン抗体と二特異性分子等、２つの別個の阻害剤の形態をとってもよく、または例えば二特異性結合分子等、単一の分子実体であってもよい。

報告により、偽関節の骨折モデルにおいてＤｋｋ−１発現が上昇することが示されている（Ｂａｊａｄａ，ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｏｎｅ；４５（４）：７２６−３５．）。同様に、健康な骨は、より低レベルのＤｋｋ−１を発現し、これは無傷の骨のＢＭＤに対するＤｋｋ−１抗体単独での限定された効果の説明を支持している。したがって、骨折を治療するためのスクレロスチン阻害剤とＤｋｋ−１阻害剤との組み合わせは、比較的短期間での最大負荷の顕著な増加を含む驚くほどに強い治癒応答を考慮すると、特に有用である。スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方の阻害剤を含む二特異性分子は、いずれの単剤療法のみの場合よりも高い生物学的応答を生じることが予想外に発見された。

本明細書で使用する際、二特異性分子は、その２つの結合領域のうちの１つで１つの抗原と結合し、その第２の結合領域で別の抗原と結合する。したがって、例えば、二特異性抗体は、２つの異なる抗原結合領域を有してもよく、それが結合するそれぞれの抗原に対して一価であってもよい。二特異性分子のさらなる非限定的な例は、２つの腕それぞれに２つの異なる抗原結合領域を有し、それにより異なる両抗原に対して二価であってもよいＤＶＤ−Ｉｇである。本明細書において提供される二特異性および二官能性のスクレロスチンおよびＤＫＫ−１結合分子は、本明細書に記載のように、１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変領域を含んでもよい。二特異性または二官能性抗体は、場合によっては、２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位とを有する人工ハイブリッド抗体である。これらの二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含むが、これらに限定されない種々の方法で生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。

二特異性分子は、本発明により、融合によって作成することもできる。一例では、これは、１つ以上の他の結合分子に連結させてもよい（例えば、融合タンパク質の発現、化学的連結、高親和性非共有結合等によって）。そのような結合分子の例としては、二特異性分子が生じるような、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣剤が挙げられるが、これらに限定されない。

二特異性分子はまた、２つの異なる抗原、例えばＤＫＫ−１およびスクレロスチンに特異的に結合する抗体を選択および／または設計することによって作成することもできる。例えば、Ｂｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０−１６１４を参照されたい。

二特異性分子はまた、スクレロスチンに対する第１の結合特異性および第２の標的に対する第２の結合特異性を含んでもよい。例えば、第２の標的は、第１のエピトープとは異なるスクレロスチンの別のエピトープであってもよい。別の例は、スクレロスチンに対する少なくとも１つの第１の結合特異性およびＤｋｋ−１内のエピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子である。別の例は、スクレロスチンに対する少なくとも１つの第１の結合特異性およびＬＲＰ４内のエピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子である。さらに、二特異性分子が多特異性である本発明については、分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。

二特異性結合剤のフォーマット
一態様では、本発明は、抗スクレロスチン結合剤および抗ＤＫＫ１結合剤を含む二特異性または多特異性分子、またはその断片を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合領域を別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体の別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子作製してもよい。本発明の抗体は、実際に、複数の他の機能分子に誘導体化または連結させて、２つを超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作製することもでき、そのような多特異性分子も本明細書で使用する「二特異性分子」または「二特異性結合分子」または「二特異性結合タンパク質」という用語に包含されるものとする。

本発明の二特異性分子を作成するために、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体などの１つ以上の他の結合分子に、二特異性分子が生じるように本発明の抗体を機能的に連結してもよい（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合、または別の方法によって）。

したがって、本発明は、スクレロスチンに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープとは異なるスクレロスチンの別のエピトープである。別の例は、スクレロスチンに対する少なくとも１つの第１の結合特異性およびＤｋｋ−１内のエピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子である。別の例は、スクレロスチンに対する少なくとも１つの第１の結合特異性およびＬＲＰ４内のエピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子である。さらに、二特異性分子が多特異性である本発明については、分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。

特定の実施形態では、二特異性フォーマットは二重可変ドメイン（ＤＶＤ）Ｉｇである。特定の実施形態では、ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットは、免疫グロブリンのそれぞれの腕に２つの可変ドメインを含み、１分子当たり合計４つの可変ドメインとなる。一実施形態では、本発明の結合タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含む２つの抗原に結合可能なＤＶＤ−Ｉｇであり、第１および第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分から得られる第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分から得られる第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖は、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分から得られる第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分から得られる第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインである。企図される組み合わせの非限定的な例は、本明細書の表１に提示される配列番号１７〜９２であり、これはＤＶＤ−Ｉｇ重鎖および軽鎖の核酸およびアミノ酸配列を記載している。しかしながら、本明細書において提供される、抗体またはＣＤＲを含むその断片のあらゆる組み合わせが企図されている。

ＤＶＤ−Ｉｇの非限定的な例は、米国特許第７，６１２，１８１号、米国特許出願公開第２０１１０００８７６６Ａ１号、第２００９０３１１２５３Ａ１号、第２０１０００４７２３９Ａ１号、第２００９０２１５９９２Ａ１号、第２００７００８１９９６Ａ１号、第２００７００７１６７５Ａ１号、第２００７００４１９０５Ａ１号、第２０１００２６０６６８Ａ１号、第２０１０００７６１７８Ａ１号、第２００９０３０４６９３Ａ１号、第２００９０３１１２５３Ａ１号、および第２０１００２３３０７９Ａ１号に見出すことができる。ＤＶＤ−Ｉｇのさらなる非限定的な例は、国際特許出願公開第２００７０２４７１５Ａ２号、第２００８０２４１８８Ａ２号、第２００９１３４７７６Ａ２号、第２００９１４９１８５Ａ２号、第２００９１４９１８９Ａ２号、第２０１００６５８８２Ａ１号、第２０１０１２７２８４Ａ２号、および第２０１０１２７２９４Ａ２に見出すことができる。

「リンカー」という用語は、ペプチド結合によって結合された２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドを指して使用され、これは１つ以上の抗原結合部分を連結するために場合により使用される。そのようなリンカーポリペプチドは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照）。例えば、ＤＶＤ−ＩｇのＸ１は、本明細書において表１に記載するリンカー配列のいずれから選択されるリンカーであってよい。

具体的な実施形態では、リンカーを変異させて、アミノ酸置換がその特性を変化させるようにしてもよい。例えば、Ｏ−グリコシル化は、ＡｂＬリンカーを含むＤＶＤ−Ｉｇで観察され得る。この問題に取り組むために、ペプチドマッピングによって決定された各ＤＶＤ−ＩｇにおけるＯ−グリコシル化する特定の部位に応じて、１つ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基（下記の下線部分）をグリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）またはグルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）に変更してもよい。

部位は、重鎖リンカーおよび軽鎖リンカーのいずれかで、または双方で置換してもよい。

一実施形態では、結合タンパク質はＸ２を含まない。別の実施形態では、Ｘ１は、ＣＨ１ではないという条件で、リンカーである。

一実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖の双方が同じリンカーを含む。別の実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖は異なるリンカーを含む。別の実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖の双方が、短い（約６アミノ酸長以下）リンカーを含む。別の実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖の双方は、長い（６アミノ酸長を上回る）リンカーを含む。別の実施形態では、可変重鎖は短いリンカーを含み、可変軽鎖は長いリンカーを含む。別の実施形態では、可変重鎖は長いリンカーを含み、可変軽鎖は短いリンカーを含む。

特定の実施形態では、二特異性フォーマットは、スクレロスチンまたはＤＫＫ−１に結合するモノマードメインをさらに含む免疫グロブリンである。例えば、米国特許第７，５０３，９０７号および第７，８２０，７９０号、ならびに米国特許公開第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、および第２００６０２２３１１４号を参照されたい。一実施形態では、二特異性分子は、アビマーとしても知られる多重モノマードメインを含む。アビマーは、リンカーペプチドで結合された、それぞれアミノ酸３０〜３５個の２つ以上のペプチド配列を含む。特定の実施形態では、個々の配列は様々な膜受容体のＡドメインに由来し、ジスルフィド結合およびカルシウムによって安定化された強固な構造を有する。一部の実施形態では、それぞれのＡドメインは、標的タンパク質の特定のエピトープに結合することができる。同じタンパク質の異なるエピトープに結合するドメインの組み合わせは、結合活性として知られる作用である、このタンパク質に対する親和性を向上させる。一実施形態では、アビマーのモノマードメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域内に位置する。

特定の実施形態では、二特異性フォーマットは、リンカーボディである。「リンカーボディ」は、二価の二特異性抗体である。リンカーボディは、抗体のＶＬをリンカーを用いてそれぞれの重鎖と結合させることによって構築される。それぞれＤＫＫおよびスクレロスチンに対する特異性を表す２つの半分を各重鎖のＦｃに対立電荷対変異を導入することによって結び付けることができる。例えば、第１のＦｃは３９２Ｄおよび４０９Ｄを含有し、第２のＦｃは３５６Ｋおよび３５９Ｋを含有する（例えば、Ｋａｎｎａｎ Ｇｕｎａｓｅｋｈｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｊｕｎｅ ２０１０を参照）。

特定の実施形態では、二特異性フォーマットは、ペプチド結合領域を含む（例えば、ペプチド模倣体）。本明細書に記載の可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく模倣体（例えば、「ペプチド模倣体」または「ペプチドミメティック」）も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチド、またはペプチド領域と非ペプチド領域との組み合わせであってよい。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ ｐ．３９２、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（これらは参照によりあらゆる目的で本明細書に援用される）。治療上有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、同様の治療効果または予防効果を生じることができる。そのような化合物は、しばしばコンピュータによる分子モデリングを利用して開発される。一般に、本発明のペプチドミメティックは、本明細書ではＤｋｋ−１またはスクレロスチンに特異的に結合する能力等の所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当該技術分野で周知の方法により、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ．２−−、−−ＣＨ−−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−から選択される結合によって任意に置換された１つ以上のペプチド結合を有するタンパク質である。本発明の特定の実施形態では、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸による系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンをＤ−リジンに置換）を用いて、より安定なタンパク質を生成することができる。さらに、当該技術分野で既知の方法（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、参照により本明細書に援用される）により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束ペプチドを生成することができる。

特定の実施形態では、二特異性結合分子は二特異性ダイアボディである。二特異性ダイアボディ（Ｄｂ）は、発現にダイアボディフォーマットを使用する。ダイアボディは、ＶＨドメインとＶＬドメインとを連結するリンカーの長さをおよそ５残基まで減少させることによって、ｓｃＦｖ断片から作製される（Ｐｅｉｐｐ，Ｍ．ａｎｄ Ｔ．Ｖａｌｅｒｉｕｓ（２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：５０７−１１を参照）。このリンカーサイズの減少は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの交差対合による２つのポリペプチド鎖の二量化を容易にする。二特異性ダイアボディは、構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ配置）またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ配置）のいずれかを有する２つのポリペプチド鎖を同一細胞内で発現させることによって作製される。多種多様な二特異性ダイアボディが過去に作製されており、それらのほとんどは細菌中で可溶性形態で発現される。しかしながら、最近の比較研究は、可変ドメインの方向性が、活性な結合部位の発現および形成に影響を与え得ることを示している（Ｍａｃｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１５）：７０２１−５を参照）。それにもかかわらず、細菌中での可溶性発現は、タンデムｓｃＦｖ分子に優る重要な利点を示す。しかしながら、２つの異なるポリペプチド鎖が単一の細胞内で発現されることから、活性なヘテロ二量体と共に、不活性なホモ二量体が生成され得る。このため二特異性ダイアボディの均一な調製物を得るために、さらなる精製ステップの実施が必要となる。二特異性ダイアボディの生成を強制するための１つのアプローチは、ノブ・イントゥ・ホールダイアボディの作製である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，Ｔ．Ｐｒｏｓｐｅｒｏ，ａｎｄ Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１４）：６４４４−８．１８を参照）。このアプローチは、ＨＥＲ２およびＣＤ３に向けられた二特異性ダイアボディについて示された。Ｖａｌ３７をＰｈｅと交換し、Ｌｅｕ４５をＴｒｐと交換することによって、ＶＨドメインに大きなノブを導入し、抗ＨＥＲ２または抗ＣＤ３可変ドメインのいずれかにおいて、Ｐｈｅ９８をＭｅｔに変異させ、Ｔｒｙ８７をＡｌａに変異させることによって、ＶＬドメインに相補的ホールを作製した。このアプローチを使用することによって、二特異性ダイアボディの生成は、親ダイアボディによる７２％からノブ・イントゥ・ホールダイアボディによる９０％超にまで増加させることができる。ダイアボディは、よりＩｇ様の分子を作製するためにＦｃに融合され、ジ−ダイアボディと名付けられた（Ｌｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（４）：２８５６−６５を参照）。さらに、ＩｇＧの重鎖中に２つのＦａｂリピートを含み、４つの抗原分子に結合することができる多価の抗体構築物が記載されている（国際公開第０１７７３４２Ａ１号、およびＭｉｌｌｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（９）：４８５４−６１を参照）。

特定の実施形態では、二特異性結合分子が多特異性結合分子の背景に含まれてもよい。このフォーマットの非限定的な例は、国際特許出願公開第２００９０１８３８６Ａ１号および米国特許出願公開第ＵＳ２００９０１５５２７５号に見出すことができる。

特定の実施形態では、二特異性フォーマットはドメイン抗体である。「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫機能免疫グロブリン断片である。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合して、二価のドメイン抗体を作成する。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的にしてよい。例えば、米国特許公開第２０１００２３４５７０号および第２００４０２１９６４３Ａ１号を参照されたい。

一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異体として、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片、例えば、本明細書において提供される新規の二特異性分子配列由来のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖを含む。またこれは、軽鎖もしくは重鎖の二量体、または米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載されるように、Ｆｖまたは一本鎖構築物などの任意の最小断片であってもよい。

二特異性分子は、当該技術分野において既知の方法を用いて、結合部分を化学的に共役させることにより調製することができる。結合部分がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合的共役に様々なカップリング剤または架橋剤を使用することができる。例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル１ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロハキサン−１カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６、Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８を参照）。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１ ３２、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３、およびＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５に記載されている方法が挙げられる。共役剤としては、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣが挙げられ、双方ともにＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。結合部分が抗体である場合、２つの重鎖のヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって共役させることができる。一実施形態では、対応する重鎖または軽鎖の片方とジスルフィド結合を形成していない遊離スルフヒドリル基が存在するように、ヒンジ領域を改変して奇数のスルフヒドリル残基を含める。

二特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含んでもよい。二特異性分子を調製するための方法の非限定的な例は、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、米国特許第５，４８２，８５８号、および米国特許出願第２０１０／００７６１７８を含む様々な特許公報に記載されている。

あるいは、両結合部分を同じベクターにコードし、同じ宿主細胞で発現および構築してもよい。この方法は、二特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂｌ）：！、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二特異性分子は、１つの一本鎖抗体と１つの結合決定因子とを含む一本鎖分子、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二特異性分子であってよい。

スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に結合する抗体の非限定的な例は、本明細書において開示する。当業者は、本明細書に記載の抗体が、本発明の二特異性分子の背景で使用可能であることを理解するであろう。

二特異性分子のその特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウエスタンブロット法によって確認することができる。これらのアッセイはそれぞれ、一般に、特に対象とされるタンパク質−抗体複合体の存在をその対象複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を利用して検出する。

スクレロスチン結合分子
本発明は、本発明の二特異性分子に使用可能なスクレロスチン結合分子を提供する。特定の実施形態では、スクレロスチン結合分子は、抗体またはその断片である。特定の実施形態では、二特異性分子は、本明細書に記載の免疫グロブリンのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む。他の実施形態では、二特異性分子は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、および少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３を含む。スクレロスチン結合分子のＣＤＲ配列の非限定的な例は、本明細書の表１に提示する。

提供される二特異性分子のスクレロスチン結合成分は、表１に記載のＣＤＲのうち１個、２個、３個、４個、５個、または６個を含んでもよい。二特異性分子が、単一の抗体由来の２つ以上のＣＤＲ、または上記に挙げた抗体の任意の組み合わせ由来の２つ以上のＣＤＲを含んでもよいことが企図されている。一部のスクレロスチン結合成分は、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の双方を含む。特定のスクレロスチン結合成分は、表１に記載のＣＤＲの変異型を有し、それらのＣＤＲのうちの１つ以上（すなわち、２個、３個、４個、５個、または６個）はそれぞれ、表１に記載のＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。例えば、スクレロスチン結合成分は、それぞれ表１に記載の軽鎖ＣＤＲ３配列および重鎖ＣＤＲ３配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性をそれぞれ有する、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の双方を含んでもよい。提供されるスクレロスチン結合成分の一部のＣＤＲ配列はまた、任意の所与のＣＤＲのアミノ酸配列が、表１に記載の配列と１、２、３、４、または５アミノ酸残基以下で異なるように、表１に記載のＣＤＲ配列と異なってもよい。記載される配列との差は、典型的には保存的置換であるが、これに限定されない。

本明細書に記載の軽鎖のそれぞれを本明細書に記載の重鎖のいずれかと組み合わせて、二特異性分子のスクレロスチン結合成分を形成できることもさらに企図されている。本明細書において提供される特定のスクレロスチン結合成分は、本明細書において提供される軽鎖可変ドメインの配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸残基のみで異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、そのような配列差はそれぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、もしくは置換、またはそれらの組み合わせのいずれかである。特定のスクレロスチン結合成分の軽鎖可変領域は、本明細書において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本明細書において提供される特定のスクレロスチン結合成分は、本明細書において提供される重鎖可変ドメインの配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸残基のみで異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、そのような配列差はそれぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、もしくは置換、またはそれらの組み合わせである。特定のスクレロスチン結合成分の重鎖可変領域は、本明細書において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

他の実施形態では、スクレロスチンに結合する二特異性分子の部分は、米国特許第７，７４４，８７４号、米国特許第７，５９２，４２９号、および米国特許出願公開第２００９／０１３０１１３号で開示されるスクレロスチン結合分子から選択される。具体的な実施形態では、上記の特許および特許出願で開示される抗体由来のスクレロスチン結合ＶＨおよびＶＬを含むＤＶＤ−Ｉｇが企図されている。

ＤＫＫ−１結合剤
本発明は、本発明の二特異性分子に使用可能なＤＫＫ−１結合分子を提供する。特定の実施形態では、ＤＫＫ−１結合分子は、抗体またはその断片である。特定の実施形態では、二特異性分子は、本明細書に記載の免疫グロブリンのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む。他の実施形態では、二特異性分子は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。ＤＫＫ−１結合分子のＣＤＲ配列の非限定的な例は、表１に提示する。

提供される二特異性分子のＤＫＫ−１結合成分は、表１に記載のＣＤＲのうち１個、２個、３個、４個、５個、または６個を含んでもよい。二特異性分子が、単一の抗体由来の２つ以上のＣＤＲ、または表１に記載の抗体の任意の組み合わせ由来の２つ以上のＣＤＲを含んでもよいことが企図されている。一部のＤＫＫ−１結合成分は、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の双方を含む。特定のＤＫＫ−１結合成分は、表１に記載のＣＤＲの変異型を有し、それらのＣＤＲのうちの１つ以上（すなわち、２個、３個、４個、５個、または６個）はそれぞれ、表１に記載のＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。例えば、ＤＫＫ−１結合成分は、それぞれ表１に記載の軽鎖ＣＤＲ３配列および重鎖ＣＤＲ３配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性をそれぞれ有する、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の双方を含んでもよい。提供されるＤＫＫ−１結合成分の一部のＣＤＲ配列はまた、任意の所与のＣＤＲのアミノ酸配列が、表１に記載の配列と１、２、３、４、または５アミノ酸残基以下で異なるように、表１に記載のＣＤＲ配列と異なってもよい。記載される配列との差は、典型的には保存的置換であるが、これに限定されない。

本明細書に記載の軽鎖のそれぞれを本明細書に記載の重鎖のいずれかと組み合わせて、二特異性分子のＤＫＫ−１結合成分を形成できることもさらに企図されている。本明細書において提供される特定のＤＫＫ−１結合成分は、本明細書において提供される軽鎖可変ドメインの配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸残基のみで異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、そのような配列差はそれぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、もしくは置換、またはそれらの組み合わせのいずれかである。特定のＤＫＫ−１結合成分の軽鎖可変領域は、本明細書において提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本明細書において提供される特定のＤＫＫ−１結合成分は、本明細書において提供される重鎖可変ドメインの配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸残基のみで異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、そのような配列差はそれぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、もしくは置換、またはそれらの組み合わせのいずれかである。特定のＤＫＫ−１結合成分の重鎖可変領域は、本明細書において提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

他の実施形態では、ＤＫＫ−１に結合する二特異性分子の部分は、米国特許第７，７０９，６１１号、米国特許公開第２００８／０１９３４４９号、米国特許第７，６４２，２３８号、米国特許第７，７００，１０１号、国際公開第２００７／０８４３４４号で開示されるＤＫＫ−１結合分子から選択される。具体的な実施形態では、上記の特許および特許出願で開示される抗体由来のスクレロスチン結合ＶＨおよびＶＬを含むＤＶＤ−Ｉｇが企図されている。

抗体および結合エピトープ
本発明の二特異性結合分子は、本明細書において提供される抗スクレロスチンおよび抗ＤＫＫ−１抗体、ならびにその断片を含んでもよい。「抗体」という用語は、標的抗原に対する特異的結合に対して無傷の抗体と競合することができる、あらゆるアイソタイプの無傷の免疫グロブリンまたはその断片を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二特異性抗体を含む。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。無傷の抗体は、一般に、少なくとも２つの全長重鎖と２つの全長軽鎖とを含むことになるが、一部の例では、重鎖のみを含み得るラクダ類に天然に存在する抗体など、より少ない鎖を含んでもよい。抗体は、１つの起源のみに由来してもよく、または「キメラ」であってもよい（すなわち、下記でさらに説明するように、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来してもよい）。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、ハイブリドーマで、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の抗体の酵素切断もしくは化学切断によって作製することができる。特に指示がない限り、「抗体」という用語は、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体だけでなく、その誘導体、変異体、断片、および変異タンパク質も含む。さらに、明らかに除外されない限り、抗体は、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において「抗体模倣体」と称することもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書において「抗体複合体」と称することもある）、およびそられそれぞれの断片を含む。

天然に存在する抗体構造単位は、典型的には四量体を含む。そのような四量体はそれぞれ、典型的には、同一のポリペプチド鎖対２つからなり、それぞれの対は、１つの全長「軽鎖」（特定の実施形態では、約２５ｋＤａ）および１つの全長「重鎖」（特定の実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に関与する約１００〜１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与し得る定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、典型的には、κ軽鎖とλ軽鎖とに分類される。重鎖は、典型的には、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。ＩｇＧにはいつくかのサブクラスがあり、これにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれるが、これらに限定されない。ＩｇＭには、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスがある。ＩｇＡは、同様に、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスにさらに分類される。全長軽鎖および重鎖内では、典型的には、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって可変領域および定常領域が連結し、重鎖は、さらに約１０個のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照により、あらゆる目的で全体が援用される）を参照されたい。それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。

可変領域は、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。それぞれの対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的には、特異的エピトープへの結合を可能にし得るフレームワーク領域によって整列される。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の双方は、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。

特定の実施形態では、抗体重鎖は、抗体軽鎖の不在下で抗原に結合する。特定の実施形態では、抗体軽鎖は、抗体重鎖の不在下で抗原に結合する。特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体軽鎖の不在下で抗原に結合する。特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体重鎖の不在下で抗原に結合する。特定の実施形態では、個々の可変領域は、他の可変領域の不在下で抗原に特異的に結合する。

特定の実施形態では、ＣＤＲの明確な描写および抗体の結合部位を含む残基の特定は、抗体の構造を解明することによって、および／または抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。特定の実施形態では、これは、Ｘ線結晶解析など、当業者に既知の様々な手法のいずれかによって達成される。特定の実施形態では、種々の分析方法を利用して、ＣＤＲ領域を特定または近似することができる。そのような方法の例としては、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、および接触定義が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｋａｂａｔ定義は、抗体の残基に番号付けをするための基準であり、典型的には、ＣＤＲ領域を特定するために使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｗｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１４−８（２０００）を参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と類似しているが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、特定の構造的ループ領域の位置を考慮に入れる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−１７（１９８６）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８３（１９８９）を参照されたい。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデリングする、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐによって作製されたコンピュータプログラムの統合スイートを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：９２６８−９２７２（１９８９）、”ＡｂＭ（商標），Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．を参照されたい。ＡｂＭ定義は、知識データベースおよびＳａｍｕｄｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，”Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” ｉｎ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．，３：１９４−１９８（１９９９）に記載されているものなどのアブイニシオ法の組み合わせを用いて、一次配列から抗体の三次構造をモデリングする。接触定義は、利用可能な複合体結晶構造分析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：７３２−４５（１９９６）を参照されたい。

慣例により、重鎖のＣＤＲ領域は、典型的には、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で連番が付けられる。軽鎖のＣＤＲ領域は、典型的には、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で連番が付けられる。

「軽鎖」という用語は、全長軽鎖、および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインのＶＬおよび定常領域ドメインのＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端である。軽鎖は、κ鎖およびλ鎖を含む。

「重鎖」という用語は、全長重鎖、および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインのＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメインのＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインは、カルボキシル末端にあり、ＣＨ３が、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、およびＩｇＥを含む、いかなるアイソタイプであってもよい。

例えば、抗体が、Ｄｋｋ−１内などの規定の残基内のエピトープに結合していると考えられるとき、これはその抗体が規定の残基（例えば、Ｄｋｋ−１の規定のセグメント）からなるポリペプチドに特異的に結合していることを意味する。そのような抗体は、Ｄｋｋ−１内の全ての残基に必ずしも接触しない。また、Ｄｋｋ−１内の全ての単一アミノ酸置換または欠失は、結合親和性に必ずしも顕著な影響を与えるわけではない。抗体のエピトープ特異性は、様々な方法で測定することができる。例えば、１つのアプローチは、Ｄｋｋ−１の配列にわたり、少数のアミノ酸（例えば３個のアミノ酸）単位で異なる、約１５個のアミノ酸の重複するペプチド群を試験することを含む。ペプチドをマイクロタイターディッシュのウェル内で固定化する。固定化は、ペプチドの一方の末端をビオチン化することによって実施できる。あるいは、同じペプチドの異なる試料をＮ末端およびＣ末端でビオチン化し、比較目的で、別々のウェルで固体化してもよい。これは末端特異的抗体を特定するために有用である。あるいは、対象とする特定のアミノ酸で終結する付加的なペプチドを含めてもよい。このアプローチは、Ｄｋｋ−１の内部断片に対する末端特異的抗体を特定するために有用である。抗体または免疫機能断片を種々のペプチドそれぞれに対する特異的結合についてスクリーニングする。エピトープは、抗体が特異的結合を示す全てのペプチドに共通するアミノ酸セグメントを含んで存在するものと定義される。

本発明の二特異性分子に使用するために、Ｄｋｋ−１のカルボキシ末端部分に位置する立体構造エピトープに結合する抗体およびその機能断片も提供される。Ｄｋｋ−１のカルボキシ末端は、複数のループを作成するジスルフィド結合のクラスターを形成する複数のシステイン残基を含有する。本発明は、これらのループのうちの２つと結合し、それによってＷｎｔ活性を抑制するＤｋｋ−１の能力を中和する、本発明の二特異性分子に使用するための抗体を提供する。前述の立体構造エピトープと結合することができる、本発明の二特異性分子に使用するための例示的な抗体は、モノクローナル抗体１１Ｈ１０および１Ｆ１１であり、これらはそれぞれ、軽鎖および重鎖を含む。本発明の二特異性分子に使用するためのさらなる例は、２０１０年１０月２７日出願の米国特許出願第６１／４０７，１２８号、および２０１１年１０月２７日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５８０２５号に見出すことができる。これら２つのループを含むエピトープは、配列番号１９０のシステイン残基２２０と２３７との間および配列番号１９０のシステイン残基２４５と２６３との間のジスルフィド結合によって形成される。したがって、エピトープを形成する２つのループの本体は、配列番号１９０のアミノ酸２２１〜２３６および２４６〜２６２を含む。結合に関与するこのループ内のセグメントは、配列番号１９０のアミノ酸２２１〜２２９および配列番号１９０のアミノ酸２４６〜２５３を含む。したがって、本発明の二特異性分子に使用するための本明細書において提供される特定の抗体および断片は、前述の領域（複数可）に特異的に結合する。例えば、抗体および断片の一部は、配列番号１９０のアミノ酸２２１〜２６２を含むか、またはそれらからなるペプチドに結合する。

競合抗体
Ｄｋｋ−１またはスクレロスチンに対する特異的結合に対して、例示される抗体または機能断片のうちの１つと競合する、本発明の二特異性結合分子の背景で有用な抗体およびその免疫機能断片も提供される。そのような抗体および断片は、例示される抗体のうちの１つと同じエピトープに結合してもよい。例示される抗体または断片と競合する、または例示される抗体または断片と同じエピトープに結合する抗体および断片は、類似する機能的特性を示すことが見込まれる。例示される抗体および断片は、本明細書に記載のものを含み、本明細書に記載の重鎖および軽鎖、可変領域ドメイン、ならびにＣＤＲを有するものをが含まれる。具体的な実施形態では、本発明は、提供される抗体のＶＨおよびＶＬを含む二特異性結合分子、例えば提供されるＤＶＤ−Ｉｇ（例えば、本発明の配列番号１７〜９２）、ならびにこれらの二特異性結合分子と結合について競合する結合分子を包含する。結合競合は、ＤＫＫ−１および／またはスクレロスチンに対するものであってもよい。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイなどの競合アッセイは当該技術分野で周知である。

それぞれの個々の免疫グロブリン鎖は、典型的には、それぞれがおおよそ９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴のある折り畳みパターンを有する、複数の「免疫グロブリンドメイン」からなる。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。ヒトでは、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは、４つの重鎖と４つの軽鎖とを含み、ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含み、ＩｇＭアイソタイプは、５つの重鎖と５つの軽鎖とを含む。重鎖のＣ領域は、典型的には、エフェクター機能に関与する１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存することになる。例えば、ＩｇＧ重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含む。本発明の二特異性分子における使用のために提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれを有してもよい。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、典型的には重鎖のおよそ１２０〜１３０個のアミノ末端アミノ酸と、軽鎖の約１００〜１１０個のアミノ末端アミノ酸とを含む、抗体の軽鎖および／または重鎖の部分を指す。特定の実施形態では、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間であってもアミノ酸配列が大きく異なる。抗体の可変領域は、典型的には、個々の抗体のその標的に対する特異性を決定する。

「中和抗原結合タンパク質」または「中和抗体］という用語は、リガンドに結合して、そのリガンドの生物学的作用を防止または低減する、本発明の二特異性分子に使用するための抗原結合タンパク質または抗体をそれぞれ指す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接遮断することによって、またはリガンドに結合して、間接的手段で結合するリガンドの能力を変化させること（リガンドの構造変化またはエネルギー変化）によって行うことが可能である。一部の実施形態では、この用語は、結合しているタンパク質が生物学的機能を果たすのを防ぐ抗原結合タンパク質も示し得る。抗原結合タンパク質の結合および／または特異性の判定において、例えば、抗体またはその免疫機能断片、抗体または断片は、過剰の抗体がリガンドに結合した結合パートナーの数を少なくとも約１〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、９７〜９８％、９８〜９９％、またはそれ以上減少させたとき（インビトロ競合結合アッセイで測定）、リガンドのその結合パートナーに対する結合を実質的に阻害することができる。一部の実施形態では、この中和能力は、競合アッセイによって特徴付けられる、および／または表現される。一部の実施形態では、中和能力は、ＩＣ_５０値またはＥＣ_５０値に関して表される。

特定の実施形態では、本発明の二特異性分子に使用するために提供される抗体のスクレロスチンまたはＤｋｋ−１に対する結合親和性（Ｋａ）は、当該技術分野で周知の手法（例えば、ＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ）により測定したとき、少なくとも１０^４または１０^５／Ｍ×秒である。他の抗体のＫａは、少なくとも１０^６、１０^７、１０^８、または１０^９／Ｍ×秒である。提供される特定の抗体は、低い解離速度を有する。例えば、一部の抗体のＫｏｆｆは、１×１０^−４秒−１、１×１０^−５秒−１、またはそれ以下である。

モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の任意の手法を用いて、例えば、免疫スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、作製することができる。脾臓細胞は、当該技術分野で既知の任意の手法を用いて、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、不死化することができる。ハイブリドーマ産生融合法に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生型であり、高い融合効率を有し、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地における成長を不可能させる酵素欠乏を有する。マウス融合体での使用に好適な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、およびＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合体で使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、および４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合体に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６である。

一部の例では、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＤｋｋ−１免疫原で免疫し、その免疫動物から脾臓細胞を採取し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定することによって作製される。そのようなハイブリドーマ細胞株、およびそれにより産生された抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体は、本発明に包含される。

ハイブリドーマ細胞株から分泌されたモノクローナル抗体は、抗体の分野で既知の有用な手法を用いて精製することができる。特定の特性、例えばＷｎｔ誘導活性を遮断する能力を有するｍＡｂを特定するために、ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングしてもよい。そのようなスクリーニングの例は、下記の実施例で示す。

前述の配列に基づくキメラ抗体およびヒト化抗体も提供される。治療薬として使用するためのモノクローナル抗体は、使用前に種々の方法で改変することができる。一例は「キメラ」抗体であり、これは共有結合して機能免疫グロブリンの軽鎖もしくは重鎖またはその免疫機能部分を作製する、異なる抗体由来のタンパク質セグメントからなる抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である。キメラ抗体に関連する方法については、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照されたい。ＣＤＲグラフティングは、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号に記載されている。

一般に、キメラ抗体の作製の目標は、目的の患者の種に由来するアミノ酸の数が最大化されたキメラを作成することである。一例は、抗体が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、一方その抗体鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「ＣＤＲグラフト」抗体である。ヒトにおける使用では、齧歯類抗体由来のＶ領域または選択されるＣＤＲをヒト抗体にグラフト化し、ヒト抗体の天然に存在するＶ領域またはＣＤＲと置き換えることが多い。

１つの有用な種類のキメラ抗体は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物で産生させたモノクローナル抗体から作製される。このモノクローナル抗体の特定のアミノ酸残基、典型的にはこの抗体の非抗原認識部分に由来するアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体において対応する残基と相同となるように改変される。ヒト化は、例えば、齧歯類の可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより、種々の方法を用いて実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−３６を参照されたい）。特定の実施形態では、ヒト以外の種に由来する定常領域（複数可）をヒト可変領域と共に使用して、ハイブリッド抗体を作製することができる。

また、完全ヒト抗体も提供される。ヒトを抗原に暴露することなく、所与の抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を作製するための方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の産生を実施する１つの手段は、マウスの体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子を不活化したマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することは、任意の所望の抗原で免疫することができる動物であるマウスにおいて、完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生する１つの手段である。完全ヒト抗体の使用により、マウスＭａｂまたはマウス由来Ｍａｂを治療薬としてヒトに投与することによって引き起こされることがある免疫原性およびアレルギー反応を最小限に抑えることができる。

完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫することによって作製可能である。この目的の抗原は、典型的には、６つ以上の連続アミノ酸を有し、場合によってはハプテン等の担体に共役させる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８、およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。そのような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を不能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大きい断片を、マウスゲノムに挿入することによって作製される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全な相補体は有さない部分改変動物を異種交配して、所望の免疫系の改変を全て有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、その免疫原に対して免疫特異的ではあるが、可変領域を含む、マウスではなくヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。そのような方法のさらなる詳細については、例えば、国際公開第９６／３３７３５号および第９４／０２６０２号を参照されたい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第６，７１３，６１０号、第６，６７３，９８６号、第６，１６２，９６３号、第５，５４５，８０７号、第６，３００，１２９号、第６，２５５，４５８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、および第５，５４５，８０６号、ＰＣＴ公開第９１／１０７４１号、第９０／０４０３６号、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および欧州特許第５４６０７３Ａ１号に記載されている。

本明細書において「ＨｕＭａｂ」マウスと称する上述のトランスジェニックマウスは、内因性μ鎖およびκ鎖の遺伝子座を不活化する標的変異と共に、再配列していないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９）。したがって、このマウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現減少を示し、免疫化に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、クラス転換および体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ．、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に詳述されている。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，７７０，４２９号、ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開第９３／１２２７号、第９２／２２６４６号、および第９２／０３９１８号を参照されたい。これらのトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の産生に利用される技術は、国際公開第９８／２４８９３号、およびＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６でも開示されている。例えば、ＨＣＯ７およびＨＣＯ１２トランスジェニックマウス系を用いて、本明細書における使用に好適な結合剤を生成することができる。

ハイブリドーマ技術を用いて、上述のもの等のトランスジェニックマウスから、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを産生および選択することができる。そのような抗体をクローン化し、好適なベクターおよび宿主細胞を用いて発現させてもよく、または培養ハイブリドーマ細胞から抗体を採取してもよい。

完全ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリーから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているように）。ファージ提示法は、糸状バクテリオファージの表面に抗体レパートリーを提示することによる免疫選択、およびその後の最適な抗原に対するそれらの結合によるファージの選択を模倣している。このような手法の１つは、ＰＣＴ公開第９９／１０４９４号に記載され、そのようなアプローチを用いてＭＰＬ受容体およびｍｓｋ受容体に対する高親和性かつ機能性のアゴニスト抗体の単離が説明されている。

本明細書において提供される二特異性分子はまた、スクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との間の結合を遮断または減少し、それによってＷｎｔシグナル伝達に関連する少なくとも１つの活性を刺激することもできる。

また、抗体および選択的結合剤の産生に有用な核酸分子、ベクター、および宿主細胞も提供される。特定の二特異性分子または断片は、表１に記載の抗スクレロスチン抗体または抗ＤＫＫ−１抗体のＣＤＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含み、特定の実施形態では、二特異性結合分子は、合計１２個（ＶＨ由来の６個およびＶＬ由来の６個）のＣＤＲを含むことになる。

また、前述の二特異性分子および断片のいずれかを含む薬学的組成物も提供される。そのような組成物は、典型的には、緩衝剤、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、または保存剤も含む。また、薬学的組成物または薬剤の調製における前述の抗体および断片の使用も提供される。

変異体
本発明の二特異性分子に使用するために提供される抗体または断片の一部は、上記で開示した抗体および断片（例えば表１に記載される配列を有するもの）の変異型である。例えば、抗体または断片の一部は、表１に記載される重鎖もしくは軽鎖、可変領域、またはＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するものである。

天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる：１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；２）中性親和性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；５）鎖の方向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、同じクラスの別のメンバーと交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチドミメティックおよびアミノ酸部分の他の逆転または反転形態が含まれる。

非保存的置換は、上記クラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを含み得る。このような置換残基は、ヒトの対応する配列と相同な領域、またはその分子の非相同領域に導入することができる。

このような変更を行う際、特定の実施形態によると、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい。タンパク質の疎水性親水性プロファイルは、それぞれのアミノ酸に数値（「疎水性親水性指標」）を割り当て、次いで、ペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均化することによって算出される。それぞれのアミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。

タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性プロファイルの重要性は、当該技術分野で理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照）。特定のアミノ酸は、類似する疎水性親水性指標またはスコアを有し、かつ類似する生物活性を保持している他のアミノ酸と置換できることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて交換を行う際、特定の実施形態では、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換が含まれる。本発明の一部の態様では、±１以内のものが含まれ、本発明の他の態様では、±０．５以内のものが含まれる。

また、特にそれによって作成される生物学的に機能性のタンパク質またはペプチドが、この場合のように免疫学的実施形態における使用が意図されている場合、類似するアミノ酸の置換を親水性に基づいて効率的に行うことができることも当該技術分野で理解されている。特定の実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるタンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性と抗原結合性または免疫原性と相関しており、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性と相関している。

これらのアミノ酸残基に、以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。類似する親水性値に基づいて交換を行う際、特定の実施形態では、親和性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内のものが含まれ、さらに他の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。一部の例では、親和性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。

当業者は、周知の技法を用いて、本明細書に記載のポリペプチドの好適な変異体を判定できるであろう。当業者は、活性にとって重要ではないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を損なうことなく交換できる分子の好適な範囲を特定することができる。当業者はまた、類似するポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を特定することもできるであろう。さらなる実施形態では、生物活性または構造にとって重要であり得る範囲であっても、生物活性を損なうことなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換を行うことができる。

さらに、当業者は、活性または構造にとって重要な類似するポリペプチド中の残基を特定する、構造−機能試験を検討することができる。そのような比較を考慮して、類似するポリペプチド中の活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応するタンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基による化学的に類似するアミノ酸の置換を選択することができる。

多くの科学刊行物が、二次構造の予測を扱っている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−２４５、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２２、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６、ａｎｄ Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照されたい。さらに、二次構造の予測を支援するためのコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、ホモロジーモデリングに基づいている。例えば、３０％を上回る配列同一性、または４０％を上回る類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似する構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の増大により、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の可能な折り畳み数を含み、二次構造の予測性が増強されている。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質中には限定された数の折り畳みが存在し、一旦重大な数の構造が解明されると、構造予測は飛躍的に正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。

二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７、Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４−１７０、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化的関連」（Ｈｏｌｍ，１９９９、上記参照、およびＢｒｅｎｎｅｒ，１９９７、上記参照）が挙げられる。

本発明の一部の実施形態では、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させる、（２）酸化に対する感受性を減少させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（４）リガンドまたは抗原結合親和性を変更する、および／または（４）このようなポリペプチドに他の物理化学的もしくは機能的特性を付与もしくは改変する、アミノ酸置換が行われる。例えば、天然に存在する配列において、単一のまたは複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では保存的アミノ酸置換）を行うことができる。ドメイン（複数可）の外側にあって分子間接触を形成する抗体の部分に置換を行うことができる。このような実施形態では、親配列の構造的特性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換（例えば、親抗体または天然抗体を特徴付けている二次構造を破壊しない１つ以上の置換アミノ酸）を用いることができる。当該技術分野で認知されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｔ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に援用される。

本発明はまた、グリコシル化部位（複数可）の数および／またはタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変更されている、本発明の二特異性分子のグリコシル化変異体も包含する。特定の実施形態では、抗体タンパク質変異体は、天然抗体よりも多いまたは少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、式中、Ｘと表されるアミノ酸残基は、プロリン以外のいかなるアミノ酸残基であってもよい。この配列を作成するためのアミノ酸残基の置換により、Ｎ結合炭水化物鎖の付加のための潜在的な新しい部位がもたらされる。あるいは、この配列を排除または変更する置換は、天然ポリペプチド中に存在するＮ結合炭水化物鎖の付加を防止する。例えば、Ａｓｎの欠失によって、またはＡｓｎを異なるアミノ酸で置換することによって、グリコシル化を減少させることができる。他の実施形態では、１つ以上の新しいＮ結合部位が作成される。抗体は、典型的には、Ｆｃ領域中に１つのＮ結合グリコシル化部位を有する。

さらなる変異体としては、親または天然アミノ酸配列中の１つ以上のシステイン残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（例えばセリン）で置換されている、システイン変異体が挙げられる。システイン変異体は、とりわけ、抗体が生物活性のある構造へと再折り畳みされなければならない場合に有用である。システイン変異体は、天然抗体よりも少ない数のシステイン残基を有してもよく、典型的には、対合していないシステインに起因する相互作用を最小限にするために、偶数を有する。

また、本明細書に記載の可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく模倣体（例えば、「ペプチド模倣体」または「ペプチドミメティック」）も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチド、またはペプチド領域と非ペプチド領域との組み合わせであってよい。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ ｐ．３９２、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（これらは参照により、あらゆる目的で本明細書に援用される）。治療上有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、同様の治療効果または予防効果を生じることができる。そのような化合物は、しばしばコンピュータによる分子モデリングを利用して開発される。一般に、本発明のペプチドミメティックは、本明細書ではＤｋｋ−１に特異的に結合する能力等の所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当該技術分野で周知の方法により、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ．２−−、−−ＣＨ−−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−から選択される結合によって任意に置換された１つ以上のペプチド結合を有するタンパク質である。本発明の特定の実施形態では、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸による系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンをＤ−リジンに置換）を用いて、より安定なタンパク質を生成することができる。さらに、当該技術分野で既知の方法（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、参照により本明細書に援用される）により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束ペプチドを生成することができる。

また、本明細書に記載の本発明の二特異性分子に使用するための抗体および断片の誘導体も提供される。誘導体化した抗体または断片は、抗体または断片に所望の特性、例えば特定の使用における半減期の増加等を与えるいかなる分子または物質を含んでもよい。誘導体化した抗体は、例えば、検出可能な部分（または標識部分）（例えば、放射性分子、比色分子、抗原分子、または酵素分子、検出可能なビーズ（磁気または高電子密度（例えば金）ビーズ等）、または別の分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）に結合する分子）、治療的または診断的部分（例えば、放射性部分、細胞毒性部分、または薬学的活性部分）、または特定の使用（例えば、ヒト対象等の対象への投与、または他のインビボもしくはインビトロの使用）における抗体の適合性を向上させる分子を含むことができる。抗体を誘導体化するために使用することができる分子の例としては、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗体のアルブミン結合誘導体およびＰＥＧ化誘導体は、当該技術分野で周知の技法を用いて調製することができる。一実施形態では、抗体は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体と共役または連結される。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質で化学修飾することができる。

他の誘導体としては、二特異性分子ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現等による、二特異性分子またはその断片と他のタンパク質またはポリペプチドとの共有複合体または凝集複合体が挙げられる。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグ等のペプチドであってもよい。二特異性分子含有融合タンパク質は、当該分子の精製または同定を容易にするために添加されるペプチド（例えばポリ−Ｈｉｓ）を含んでもよい。また、二特異性分子ポリペプチドは、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているように、ＦＬＡＧペプチドと連結させることもできる。ＦＬＡＧペプチドは、抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されたエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドを所与のポリペプチドと融合させた融合タンパク質の調製に有用な試薬が市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。

本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来する天然型および変異タンパク質型のポリペプチドが含まれる。二量化を促進するヒンジ領域を含有するそのような切断型のポリペプチドも含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上での親和性クロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。

ＰＣＴ出願第９３／１０１５１号および米国特許第５，４２６，０４８号および第５，２６２，５２２号（これらそれぞれは、参照によって本明細書に援用される）に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端まで延在する一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ変異タンパク質である。この変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化しており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化しており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していること以外は、ＰＣＴ出願第９３／１０１５１号に示されているネイティブＦｃ配列と同一である。変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対して低下した親和性を示す。

他の実施形態では、本明細書で開示されるような二特異性分子の重鎖および／または軽鎖の可変部分は、ある抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分で置換することができる。

あるいは、オリゴマーは、複数の二特異性分子ポリペプチドを含み、場合によってペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を有する融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されているものがある。

オリゴマー二特異性分子誘導体を調製するための別の方法には、ロイシンジッパーの使用がある。ロイシンジッパードメインは、それが認められるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、もともといくつかのＤＮＡ結合タンパク質において特定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、以来、様々な異なるタンパク質で発見されている。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するために好適なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願第９４／１０３０８号に記載されているもの、およびＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１（参照により本明細書に援用される）に記載されている肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。融合される異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、改変されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。あるアプローチでは、ロイシンジッパーペプチドと融合した二特異性分子断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を好適な宿主細胞中で発現させ、形成する可溶性オリゴマー二特異性分子断片または誘導体を培養上清から回収する。

別の態様では、本発明は、インビトロまたはインビボで（例えばヒト対象に投与したとき）、少なくとも１日の半減期を有する二特異性分子を提供する。一実施形態では、この抗体は、少なくとも３日の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその部分は、４日以上の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその部分は、８日以上の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化または改変されていない抗体と比較してより長い半減期を有するように、誘導体化または改変される。別の実施形態では、この抗体は、ＰＣＴ出願第００／０９５６０号に記載されるように、血清半減期を増加させる点変異を含有する。

また、本発明の二特異性分子のポリペプチド鎖、またはその断片、誘導体、変異タンパク質、または変異体をコードする核酸、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの同定、分析、変異、または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、または配列決定プライマーとして使用するために十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述のものの相補配列も提供される。核酸は、いかなる長さであってもよい。これらは例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよく、ならびに／または１つ以上の付加配列、例えば調節配列を含む、および／もしくはより大きな核酸、例えばベクターの一部であってもよい。核酸は、一本鎖または二本鎖であってよく、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工変異体（例えばペプチド核酸）を含み得る。

抗体ポリペプチド（例えば、重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または全長）をコードするＤＮＡは、Ｄｋｋ−１またはスクレロスチンまたはその免疫原性断片で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離することができる。ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の従来の手順により単離することができる。ファージ提示は、抗体の誘導体を調製することができる既知の技法の別の例である。あるアプローチでは、対象となる抗体の成分であるポリペプチドを任意の好適な組換え発現系で発現させ、発現したポリペプチドを会合させて抗体分子を形成する。

本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書で定義するように、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予洗溶液、約５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、およびハイブリダイゼーション温度５５℃（または約５０％のホルムアミドを含有するものなど、他の類似するハイブリダイゼーション溶液と、ハイブリダイゼーション温度４２℃）、ならびに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃の洗浄条件を用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、その後０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃で１回以上の洗浄を行う。さらに、当業者は、ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を操作して、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズした状態のままとなるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高めても、または低下させてもよい。

ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的パラメータおよび好適な条件を策定するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓにより記載されており（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３−６．４）、例えば、ＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。

変異によって核酸に変化をもたらすことにより、その核酸がコードするポリペプチドのアミノ酸配列の変化を導いてもよい。変異は、当該技術分野で既知のいかなる技法を用いて導入してもよい。一実施形態では、例えば部位特異的変異誘発プロトコルを用いて、１つ以上の特定のアミノ酸残基を変化させる。別の実施形態では、例えばランダム変異誘発プロトコルを用いて、１つ以上のランダムに選択された残基を変化させる。変異ポリペプチドは、どのように作製されていても、発現させて所望の特性についてスクリーニングすることができる。

変異は、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を顕著に変更せずに、核酸に導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基のアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行ってもよい。あるいは、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を選択的に変化させる１つ以上の変異を核酸に導入してもよい。例えば、変異は、生物活性を量的または質的に変化させ得る。量的変化の例としては、活性の増加、減少、または排除が挙げられる。質的変化の例としては、抗体の抗原特異性の変化が挙げられる。

記載される重鎖および軽鎖への保存的改変（およびコード化核酸への対応する改変）を行って、機能特性および生化学的特性を有する二特異性分子を作成してもよい。そのような改変を達成するための方法は上記に記載されている。

本発明の二特異性分子との使用が企図されている一本鎖抗体は、本明細書で提供される重鎖と軽鎖との可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片をアミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）によって連結させ、単一のポリペプチド鎖をもたらすことによって形成することができる。そのような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することによって調製することができる。得られたポリペプチドは、それ自体に折り重なって抗原結合モノマーを形成してもよく、またはこれらは、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成してもよい（Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体の作製のために開発された技法としては、米国特許第４，９４６，７７８号、、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４、ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に記載されているものが挙げられる。

本発明によるタンパク質およびその機能断片は、様々な方法でさらに改変してもよい。例えば、これらを治療目的で使用する場合、血清半減期を延長するため、またはタンパク質の送達を増強するために、これらをポリエチレングリコールと共役（ペグ化）させてもよい。あるいは、対象抗体またはその断片のＶ領域を異なる抗体分子のＦｃ領域と融合させてもよい。この目的で使用するＦｃ領域は、相補体と結合しないように改変してもよく、したがって融合タンパク質を治療剤として使用するときに患者において細胞溶解が誘導される可能性を低下させることができる。さらに、対象抗体またはその機能断片は、抗体またはその断片の血清半減期を向上させるためにヒト血清アルブミンと共役させてもよい。本発明の抗体またはその断片の別の有用な融合パートナーはトランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは四量体を形成する能力を有し、したがって、抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、結合力を増加させ得る多価抗体を形成することができる。

あるいは、本明細書に記載される抗体および断片の機能特性および／または生化学的特性の実質的な改変は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列中に、（ａ）例えばシート構造もしくはヘリカル構造としての置換の範囲内の分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さの維持に対するその効果が著しく異なる置換を作成することによって達成することができる。「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に与える効果がわずかまたは存在しない非天然残基での天然アミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、アラニン走査変異誘発について以前に記載されているように、ポリペプチド中の任意の天然残基をアラニンで置換してもよい。

対象抗体のアミノ酸置換（保存的または非保存的に関わらず）は、当業者によってルーチン的な技法を使用して実施することができる。本明細書において提供される本発明の抗体もしくは二特異性分子の重要な残基を特定するために、あるいはヒトＤｋｋ−１またはスクレロスチンに対するこれら本発明の抗体もしくは二特異性分子の親和性を増加または減少させるために、あるいは本明細書に記載される他の二特異性分子の結合親和性を改変するために、アミノ酸置換を用いることができる。

発現
二特異性分子および機能断片は、表１に提示する核酸配列を発現するため、または表１に提示するアミノ酸配列のうちのいずれかをコードする核酸配列を発現するために、多数の従来の手法のうちのいずれによって調製してもよい。

例えば、二特異性分子は、当該技術分野で既知の任意の技法を用いて組換え発現系により産生することができる。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照されたい。

本発明の二特異性分子は、ハイブリドーマ細胞株またはハイブリドーマ以外の細胞株で発現させることができる。抗体をコードする発現構築物を用いて、哺乳動物、昆虫、または微生物の宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号によって例示されているように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージにパッケージングし、当該技術分野で既知のトランスフェクション法によって、その構築物を宿主細胞に形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法を用いて行うことができる。使用される最適な形質転換法は、形質転換される宿主細胞型に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は、当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中へのポリヌクレオチド（複数可）のカプセル化、核酸と正荷電脂質との混合、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の組換え発現構築物は、典型的には、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３）、重鎖可変領域および場合によっては少なくとも２つ以上の重鎖可変領域、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域および場合によっては少なくとも２つ以上の軽鎖可変領域、二特異性分子の軽鎖または重鎖の１つ以上のＣＤＲ、ならびに場合によっては複数の可変領域間のリンカー配列のうちの１つ以上を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。これらの核酸配列は、標準的なライゲーション技法を用いて適切な発現ベクターに挿入される。一部の実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素等のタンパク質レポーターを用いたタンパク質断片相補性アッセイを使用するベクターが用いられる（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（旧名「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入可能である。本発明の抗体および断片をクローニングおよび発現するための他の有用なベクターとしては、Ｂｉａｎｃｈｉ ａｎｄ ＭｃＧｒｅｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８４（４）：４３９−４４（２００３）に記載されているものが挙げられる。さらなる好適な発現ベクターは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓで考察されており、これは参照によって本明細書に援用される。

典型的には、宿主細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスを維持するため、ならびに外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび発現させるための配列を含有する。「フランキング配列」と総称されるそのような配列には、典型的には、以下の作動可能に連結したヌクレオチド配列のうちの１つ以上が含まれる：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位およびアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカー要素。

場合により、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわちそのコード配列の５’もしくは３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ等）をコードするオリゴヌクレオチド配列、またはＦＬＡＧ（著作権）、ＨＡ（インフルエンザウイルスからの赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ））、もしくはｍｙｃ等の市販の抗体が存在する別の「タグ」を含有してもよい。タグは、典型的には、発現時に抗体タンパク質と融合され、宿主細胞から抗体を親和性精製する手段として役割を果たし得る。親和性精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって達成することができる。場合により、タグは、続いて切断のための特定のペプチダーゼを用いること等の様々な手段によって、精製した抗体ポリペプチドから除去することができる。

発現ベクター中のフランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種に由来）、ハイブリッド（すなわち、１種を超える起源のフランキング配列の組み合わせ）、合成、または天然であってよい。したがって、フランキング配列の起源は、そのフランキング配列が、宿主細胞機構において機能的であり、宿主細胞機構によって活性化できる限りは、いかなる原核生物もしくは真核生物、いかなる脊椎生物もしくは無脊椎生物、またいかなる植物であってもよい。

本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当該技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって得ることができる。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってすでに特定されているはずであり、したがって適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離することができる。場合によっては、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知のこともある。ここでは、フランキング配列は、核酸の合成またはクローニングのための本明細書に記載の方法を用いて合成可能である。

フランキング配列の全体または一部のみが既知である場合、これは、ＰＣＲを用いて、および／または同じ種もしくは別の種に由来する好適なオリゴヌクレオチドおよび／またフランキング配列断片を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。フランキング配列が未知である場合は、例えば、コード配列またはさらには別の遺伝子（複数可）を含有してもよいより大きなＤＮＡ片から、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片を単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を生成し、次いでアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）、または当業者に既知の他の方法を用いて単離することによって達成することができる。この目的を達成するための好適な酵素の選択は、当業者に容易に明らかになるであろう。

複製起点は、典型的には、原核細胞発現ベクター、特に商品として購入したものの一部であり、この起点は、宿主細胞中でのベクターの増幅を促進する。最適なベクターが複製部位の起点を含有しない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクター中に連結させてもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、様々な起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶ等のパピローマウイルス）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、哺乳動物複製起点は、哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有することのみが理由で使用される場合が多い）。

本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、かつ二特異性分子またはその免疫機能断片をコードする核酸と作動可能に連結したプロモーターを含有する。プロモーターとは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置する非転写配列（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）である。プロモーターは、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの２つのクラスのうちの１つへと慣習的に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の存在もしくは不在または温度変化等の培養条件の何らかの変化に応答して、その制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始させる。その一方で、構成的プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始し、すなわち遺伝子発現の実験的制御はわずかしか存在しないか、または存在しない。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを取り出し、またはプロモーターをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、二特異性分子をコードするＤＮＡと作動可能に連結させる。

また、酵母宿主で使用するための好適なプロモーターも当該技術分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞での使用に好適なプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られたものが含まれるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。

本発明の組換え発現ベクターの実施に有用な特定のプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｍｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’末端の長い反復配列に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、ベータ−ラクタマーゼプロモーター等の原核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が含まれるが、これらに限定されない。また、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている、以下の動物転写制御領域も使用できる：膵臓腺房細胞中で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９４６、Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）、膵臓ベータ細胞中で活性のあるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）、精巣、乳房、リンパ系、および肥満細胞中で活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）、肝臓中で活性のあるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）、肝臓中で活性のあるアルファ−胎児タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）、肝臓中で活性のあるアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）、骨髄性細胞中で活性のあるベータ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０、Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、脳中のオリゴデンドロサイト細胞中で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）、骨格筋中で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）、視床下部中で活性のある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）、特にリンパ球細胞中で活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８、Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）。

本発明の二特異性分子またはその免疫学機能断片をコードする核酸の高等真核生物における転写を増加させるために、エンハンサー配列をベクターに挿入してもよい。エンハンサーとは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐの長さであり、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、方向性および位置に比較的依存しない。これらは、転写単位の５’側および３’側で発見されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−胎児タンパク質、およびインスリン）。また、ウイルス由来のエンハンサー配列も使用可能である。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが、真核生物プロモーターを活性化させるための例示的な促進要素である。エンハンサーは、核酸分子の５’側または３’側の位置でベクター内にスプライシングしてもよいが、これは典型的にはプロモーターの５’側の部位に配置される。

発現ベクターにおいて、転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域末端の３’側に位置し、転写を終結させる役割を果たす。原核生物細胞における発現に用いられる転写終結配列は、典型的にはＧ−Ｃリッチ断片であり、ポリ−Ｔ配列が続く。配列は、ライブラリーから容易にクローン化されるか、またはさらにベクターの一部として商品として購入されるが、本明細書に記載される方法等の核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。

選択可能なマーカー遺伝子要素は、選択的培養培地中で増殖させる宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。発現ベクターに用いられる典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞では、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない必須栄養素を供給する、タンパク質をコードする。選択可能なマーカーの例としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。細菌ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物および真核生物宿主細胞の両方における選択のために使用することができる。

他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅させることができる。増幅とは、単一のコピーでは、特定の選択条件下で細胞の生存および増殖を可能にするのに十分な高いレベルで発現できない遺伝子を後続世代の組換え細胞の染色体内でタンデム反復させるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な増幅可能な選択可能なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターを有さないチミジンキナーゼが挙げられる。これらのマーカーの使用において、哺乳動物細胞形質転換体を、その形質転換体のみがベクター中に存在する選択遺伝子のおかげで生存するように特異的に適応した選択圧下に置く。培地中の選択剤の濃度が逐次増加する条件下で形質転換細胞を培養することよって選択圧が課され、それによって選択遺伝子が増幅された細胞のみの生存を可能にする。これらの状況下で、本発明の二特異性分子をコードするＤＮＡ等、選択遺伝子に隣接するＤＮＡが選択遺伝子と共増幅される。

リボソーム結合部位がｍＲＮＡの翻訳開始に通常必要であり、これはシャイン・ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。この要素は、典型的にはプロモーターの３’側および発現させるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。

一部の例では、例えば、真核宿主細胞発現系中にグリコシル化が所望される場合は、様々なプレ配列を操作してグリコシル化または収率を向上させることができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更するか、または同様にグリコシル化に影響を与え得るプロ配列を付加してもよい。最終タンパク質産物は、発現に伴う１つ以上の付加アミノ酸を１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に有することがあり、これらは完全に除去されていない場合がある。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に付着した、ペプチダーゼ切断部位中に見られる１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用により、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような範囲で切断する場合に、わずかに切断されているが活性な形態の所望のポリペプチドが生じ得る。

市販の発現ベクターが上述の所望のフランキング配列の一部を欠く場合は、これらの配列をベクター内に個々に連結させることによってベクターを改変することができる。ベクターを選択し、所望に応じて改変した後、二特異性分子またはその免疫学機能断片をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入する。

本発明の抗体またはその免疫機能断片をコードする配列を含有する完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入する。その二特異性分子その免疫機能断片のための発現ベクターの選択した宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の知られている技法等の方法を含む、周知の方法によって達成可能である。選択される方法は、使用する宿主細胞の種類に部分的に依存することになる。これらの方法および他の好適な方法は当業者に周知である。

形質転換宿主細胞は、適切な条件下で培養した際に、二特異性分子またはその機能断片を合成し、続いてこれを培養培地から収集するか（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）、またはこれを産生する宿主細胞から直接収集することができる（それが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化等）、および生物活性分子への折り畳みの容易さ等の様々な要因に依存することになる。

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、および多くの他の細胞株等のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、特定のＤＮＡ構築物を発現させるための最良の細胞株は、様々な細胞株を試験して、どの細胞株が最高レベルの発現レベルを有し、構成的なＤｋｋ−１結合特性を有する抗体を産生するかを決定することによって選択することができる。

製剤
特定の実施形態では、本発明はまた、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントのうちの１つ以上と共に対象の二特異性分子またはその断片を含む組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の二特異性分子またはその免疫機能断片を含有してもよい。したがって、薬学的組成物または薬剤の調製における本明細書において提供される抗体および断片の使用も含まれる。そのような組成物は、下記の代表的な有用性の項に記載するような種々の疾患の治療に使用することができる。

薬学的調製物に許容される製剤成分は、使用される投与量および濃度で受容者に非毒性である。提供される二特異性分子、抗体、および断片に加えて、本発明による組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変、維持、または保存するための成分を含有してもよい。薬学的組成物を製剤化するための好適な材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝剤（酢酸塩、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸類等）；増量剤（マンニトールまたはグリシン等）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等）；充填剤；単糖類、二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン類等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）；着色剤、香味剤、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー類（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド類；塩形成対イオン類（ナトリウム等）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素等）；溶媒類（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）；糖アルコール類（マンニトールまたはソルビトール等）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル類、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベート類、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール）；安定性増強剤（ショ糖またはソルビトール等）；等張性増強剤（ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール等）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、および／または薬学的アジュバント類が挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（参照により本明細書に援用される）を参照）。

薬学的組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本来は水性または非水性のいずれでもよい。そのような組成物に好適なビヒクルまたは担体としては、注射用水、生理的食塩水、または人工脳脊髄液が挙げられ、場合によっては、非経口投与用組成物で一般的な他の材料が追加される。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらなる代表的なビヒクルである。二特異性分子またはその断片を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液形態の任意の製剤化剤と混合することにより、保存用に調製することができる。さらに、二特異性分子またはその断片は、ショ糖等の適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化することができる。

製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。緩衝剤は、生理的ｐＨあるいはそれよりわずかに低いｐＨで、典型的には約４．０〜約８．５、あるいは約５．０〜８．０のｐＨ範囲で組成物を維持するために有利に使用される。薬学的組成物は、ｐＨ約６．５〜８．５のトリス緩衝液、またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含んでもよく、さらにソルビトールまたはその好適な代替物を含んでもよい。

薬学的組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物として、有効量の二特異性分子またはその断片を含んでもよい。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することにより、液剤を単位用量形態で調製することができる。好適な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、乳糖、またはリン酸カルシウム等の不活性材料、あるいはデンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム等の結合剤、あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる薬学的組成物は、持続または制御送達製剤の形態である。リポソーム担体、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズ、およびデポー注射剤等の種々の他の持続または制御送達手段を製剤化するための技法を用いることができる（例えば、薬学的組成物の送達用多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載している、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照）。持続放出調製物としては、成型品の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、薄膜、またはマイクロカプセル、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ １５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ １２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、同書）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）を挙げることができる。持続放出組成物としてはまた、当該技術分野で既知の複数の方法のうちのいずれかによって調製することができるリポソーム類を挙げることもできる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２、欧州特許第０３６，６７６号、欧州特許第０８８，０４６号、および欧州特許第１４３，９４９号を参照されたい。

インビボ投与に用いられる薬学的組成物は、一般的に滅菌されている。滅菌は、滅菌ろ過膜を通すろ過により達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、滅菌は、凍結乾燥および再構成の前後いずれかに実施してよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液として保存することができる。特定の実施形態では、非経口用組成物は、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能な密栓を有する静脈注射溶液用バッグまたはバイアル、または注射に即時使用できるプレフィルド滅菌シリンジに入れる。

本発明の薬学的組成物が一旦製剤化されると、これを溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または乾燥もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存することができる。そのような製剤は、即時使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。

薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、好ましくは高純度であり、潜在的有害混入物を実質的に含まない（例えば、少なくとも米国食品（ＮＦ）グレード、一般に少なくとも分析グレード、またより典型的には少なくとも薬学的グレード）。さらに、インビボ使用が意図された組成物は、通常は滅菌されている。所与の化合物を使用前に合成しなければならない限りは、得られる生成物は、典型的には、合成または精製工程中に存在し得る潜在的毒物、特にいかなるエンドトキシンもが実質的に含まない。親投与用組成物はまた、滅菌されており、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。

本発明は、複数回用量または単回用量投与単位を製造するためのキットを提供する。例えば、本発明によるキットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性希釈剤を有する第２の容器の両方を含んでもよく、これには例えば、単一および複数のチャンバーを有するプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ、溶解液シリンジ、または無針シリンジ）がある。

本発明の薬学的組成物は、典型的には注射により非経口的に送達することができる。注射は、眼内、腹腔内、門脈内、筋肉内、静脈内、髄腔内、脳内（実質内）、脳室内、動脈内、病巣内、病巣周囲、または皮下であってよい。点眼剤を眼内投与のために使用してもよい。場合によっては、処置の対象とされる特定の１本または複数の骨の近傍に局所注射してもよい。非経口投与のために、抗体は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の二特異性分子またはその断片を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液として投与することができる。非経口注射に特に好適なビヒクルは滅菌蒸留水であり、二特異性分子またはその断片が、適切に保存された滅菌等張液として製剤化される。

対象の二特異性分子およびその機能断片を含む薬学的組成物は、ボーラス注射によって投与しても、または点滴によって連続投与しても、埋め込みデバイス、持続放出システム、あるいは持効性放出を達成するための他の手段によって投与してもよい。薬学的組成物はまた、所望の分子が吸収もしくはカプセル化されている膜、スポンジ、または別の適切な材料を介して局所投与することができる。埋め込みデバイスを使用する場合、このデバイスは、任意の好適な組織または器官に埋め込んでよく、所望の分子を拡散、徐放ボーラス、または連続放出によって送達してもよい。この調製物は、生成物の制御放出または持続放出をもたらすことが可能な注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはコポリ（乳／グリコール）酸（ＰＬＧＡ）等）、ビーズ、またはリポソーム等の薬剤を用いて製剤化してもよく、これはその後デポー注射によって送達することができる。ヒアルロン酸を用いた製剤化は、循環血中の持続時間を助長する効果を有する。

二特異性分子またはその機能断片を含む対象組成物は、吸入用に製剤化してもよい。これらの実施形態では、二特異性分子を吸入用の乾燥粉末として製剤化してもよく、または噴霧化等により、エアロゾル送達用の推進剤を用いて二特異性分子吸入溶液を製剤化してもよい。肺投与は、参照により本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されており、これは化学的修飾タンパク質の肺送達を記載している。

本発明の特定の薬学的組成物は、経口等、消化管を介して送達することができる。この様式で投与される対象の二特異性分子またはその断片は、錠剤およびカプセル剤等の固形剤形の配合に慣例的に使用される担体を用いて、または担体を用いずに製剤化することができる。カプセル剤は、生物学的利用能が最大化され、全身前分解が最小化される時点で、胃腸管内の地点に製剤の活性部分を放出するように設計することができる。二特異性分子またはその機能断片の吸収を容易にするために、付加的な薬剤を含めてもよい。経口投与の場合、修飾アミノ酸を使用して、消化酵素に対する耐性を付与してもよい。また、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用可能である。

二特異性分子またはその断片を含む対象組成物は、エクスビボで使用してもよい。そのような場合には、患者から取り出した細胞、組織、または器官を二特異性分子に暴露させるか、または二特異性分子と共に培養する。この培養細胞は、その後その患者または別の患者に戻して移植しても、または他の目的で使用してもよい。

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法等の方法を用いて遺伝子操作された特定の細胞を移植して、ポリペプチドを発現および分泌させることによって、二特異性分子またはその断片を送達することができる。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であってよく、また自己細胞、異種細胞、または異種間細胞、あるいは不死化細胞であってもよい。免疫応答の機会を減少させるために、細胞をカプセル化して周囲組織の浸潤を避けることもできる。カプセル化材料は、典型的には、タンパク質産物（複数可）の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲組織からの他の有害な因子による細胞破壊を防ぐ、生体適合性のある半透過性ポリマー封入物または膜である。

投与量
提供される薬学的組成物は、予防処置および／または治療処置のために投与することができる。「有効量」とは、一般に、症状の重症度および／または頻度の軽減または除去および／または損傷の改善または治療である所望の効果を達成するために、活性成分（すなわち、二特異性分子またはその免疫機能断片）の十分な量であるが、非毒性である量を指す。「治療的有効量」とは、疾患状態または症状を治療するために十分な量、あるいは疾患または任意の他の望ましくない症状の進行を防ぐか、妨げるか、遅らせるか、または逆転させるのに十分な量を指す。「予防的有効量」とは、疾患状態または症状の発生を防ぐか、妨げるか、または遅らせるのに有効な量を指す。

一般に、抗体または断片の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）の測定を含む、細胞培養物および／または実験動物における標準的薬学的手順に従って判定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。

細胞培養および／または動物実験から得られたデータは、ヒトへの投与量範囲を策定する際に使用することができる。活性成分の投与量は、典型的には、毒性がほとんどないか、全くないＥＤ５０を含む濃度を循環させる範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で異なってもよい。

治療的または予防的に使用される、二特異性分子またはその断片を含む薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の背景および目的に応じて異なることになる。したがって、特定の実施形態による治療のための適切な投与量レベルは、部分的に、送達される分子、二特異性分子が用いられる適応症、投与経路、および患者の大きさ（体重、体表面、または臓器の大きさ）および／または状態（年齢および全体的な健康）に応じて異なり得ることを当業者は認識するであろう。臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を滴定し、投与経路を変更してもよい。典型的な投与量は、上記の因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上の範囲である。特定の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。特定の実施形態では、用量は少なくとも０．１μｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は少なくとも１μｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は少なくとも５μｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は少なくとも５ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は少なくとも１０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は少なくとも５０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、用量は少なくとも１００ｍｇ／ｋｇである。

投与頻度は、製剤中の二特異性分子またはその免疫機能的断片の薬物動態パラメータに応じて異なることになる。例えば、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで、この組成物を投与することになる。したがって、この組成物は、単回用量として、または経時的に２回以上の用量として（同じ量の所望の分子を含有しても、そうでなくてもよい）、あるいは埋め込みデバイスもしくはカテーテルを介した持続点滴として投与してもよい。治療は、経時的に連続的であっても、または断続的であってもよい。適切な投与量のさらなる改良は、当業者が日常的に行っており、当業者が日常的に行う業務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量応答データの使用により確認することができる。

スクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１を標的とすることによって医学的障害を治療するために、対象の二特異性分子またはその断片を含む組成物は、その障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標の持続的改善を誘導するのに十分な量および時間で患者に投与することができる。患者が、少なくとも１〜７日、または場合によっては１〜６週間の間隔がある少なくとも２つの機会に改善を示す場合に、改善が「持続されている」と考えられる。適切な間隔は、ある程度、治療されている病状に依存し、改善が持続されているかどうかを判定するための適切な間隔の決定は、熟練した医師の権限内である。改善の程度は、兆候または症状に基づいて判定され、また生活の質のアンケート等、患者に渡されるアンケートを使用することもできる。

患者の病気の程度を反映する種々の指標を評価して、治療の量および時間が十分であるかどうかを判定してもよい。選択された１つまたは複数の指標のベースライン値は、抗体の初回用量投与前の患者の検査により設定される。好ましくは、ベースライン検査は、初回用量の投与の約６０日前までに行う。例えば骨折の治療等、急性症状の治療のために抗体が投与される場合、傷害発生後、できる限り速やかに初回用量を投与する。

患者が選択された１つまたは複数の指標のベースラインに対する改善を示すまで二特異性分子またはその断片を投与することによって、改善が誘導される。慢性状態の治療では、この改善度は、少なくとも１ヵ月以上の期間、例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月以上にわたり、または無期限でこの薬剤を反復投与することにより得られる。１〜６週間の期間、または単回用量でさえ、急性病態の治療に十分であることが多い。傷害または急性状態の場合は、単回用量でも十分であり得る。

治療後の患者の病気の程度が１つ以上の指標により改善したと考えられたとしても、治療を同じレベルでまたは用量もしくは頻度を減じて無期限に継続してもよい。一旦治療を減少または中断した後、症状が再出現した場合は治療を元のレベルで再開してもよい。

対象の二特異性分子およびその断片は、生体試料中のスクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１を検出するために使用することができる。このような使用は、このタンパク質を産生する細胞または組織の特定を可能にするか、あるいはスクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１が過剰産生もしくは過少産生される病態を検出するための診断として役立つ。提供される抗体および断片はまた、スクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１に結合する分子をスクリーニングするための方法に使用することもできる。例えば、種々の競合スクリーニング法が使用可能である。一部の方法では、二特異性分子が結合するスクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１分子またはその断片を別の分子（すなわち、候補分子）と共に、本明細書に開示の抗体または断片に接触される。二特異性分子または断片とスクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１との間の結合の減少は、分子の標的への結合の指標である。二特異性分子または断片の結合は、種々の方法、例えばＥＬＩＳＡを用いて検出可能である。二特異性分子または断片と標的との間の結合の検出は、抗体を検出可能に標識することによって簡便化することができる。一部の方法では、初期スクリーニングで結合を示す分子は、それがスクレロスチンおよび／またはＤｋｋ−１活性を阻害するかどうか（例えば、分子がＷｎｔシグナル伝達を活性化するかどうか）を判定するためにさらに分析する。

治療法および使用法
別の態様では、種々の疾患の治療における前述の抗体または断片の使用が開示される。例えば、特定の方法は、関節炎、幹細胞の再生に応答する疾患、炎症性疾患、神経系疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、および皮膚疾患を治療するために、本明細書に記載される有効量の本発明の二特異性分子または断片をそれを必要とする患者に投与することを含む。一部の治療法は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、または変形性関節炎の治療を含む。一部の抗体および断片は、（ａ）幹細胞の再生に応答する、糖尿病、慢性心不全、および筋肉疾患からなる群から選択される疾患、（ｂ）クローン病、大腸炎、および炎症性腸疾患からなる群から選択される炎症性疾患である疾患、（ｃ）アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病からなる群から選択される神経系疾患である疾患、（ｄ）黄斑変性症および網膜症からなる群から選択される眼疾患である疾患、（ｅ）末期腎疾患、慢性腎疾患、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、およびＩｇＡネフロパシーからなる群から選択される腎疾患である疾患、（ｆ）慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、および嚢胞性線維症からなる群から選択される肺疾患である疾患、または（ｇ）化学療法で誘発された腸上皮の損傷に起因する皮膚疾患である疾患を治療するために使用される。

本明細書において、骨量の減少を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の二特異性分子を投与することを含む、方法がさらに提供される。一実施形態では、本発明の二特異性分子は、米国特許第７，７４４，８７４号、第２００９／０１３０１１３号、第７，５９２，４２９号、第２００８／０１９３４４９号、第７，６４２，２３８号、および第７，７００，１０１に記載の抗体、または本明細書に記載する免疫機能断片から選択される可変領域を含む。本実施形態の一態様では、患者は骨に転移する癌に罹患した患者であり、別の態様では、患者は多発性骨髄腫に罹患した患者である。

本発明の組成物によって治療可能な特定の状態には、骨の成長または発達が異常である異形成症が含まれる。そのような状態の代表的な例としては、軟骨形成不全症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性骨異形成症、ゴーシェ病、低リン血症性くる病、マルファン症候群、遺伝性多発性外骨腫（ｅｘｏｔｏｓｅｓ）、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、偽関節、および化膿性骨髄炎が挙げられる。

治療または予防することができる他の状態としては、骨減少症、骨粗鬆症、および骨量減少の多種多様な原因が挙げられる。そのような状態の代表的な例としては、歯周病、抗てんかん薬誘発性骨量減少、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、家族性副甲状腺機能亢進症候群、無重力誘発性骨量減少、男性の骨粗鬆症、閉経後骨量減少、骨関節炎、腎性骨異栄養症、骨の浸潤性障害、口腔骨量減少、顎の骨壊死、若年性パジェット病、メロレオストーシス、代謝性骨疾患、肥満細胞症、鎌状赤血球症、虚血性骨疾患（レッグ・カルベ・ペルテス病、局所性移動性骨粗鬆症等）、貧血状態、ステロイドに起因する症状、糖質コルチコイド誘発性骨量減少、ヘパリン誘発性骨量減少、骨髄障害、壊血病、栄養不良、カルシウム欠乏症、特発性骨減少症または骨粗鬆症、先天性骨減少症または骨粗鬆症、アルコール依存症、慢性肝疾患、閉経後状態、慢性炎症性症状、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、クローン病、希発月経、無月経、妊娠、真性糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、副甲状腺障害、クッシング病、先端肥大症、性腺機能低下症、運動不足または廃用、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、局所骨粗鬆症、骨軟化症、関節置換に関連する骨量減少、ＨＩＶ関連骨量減少、成長ホルモンの欠損に関連する骨量減少、嚢胞性線維症に関連する骨量減少、線維性異形成、化学療法関連骨量減少、腫瘍誘発性骨量減少、癌関連骨量減少、ホルモン除去による骨量減少、多発性骨髄腫、薬物誘発性骨量減少、神経性無食欲症、疾患関連顔面骨量減少、疾患関連頭部骨量減少、疾患関連顎骨量減少、疾患関連頭蓋骨量減少、および宇宙旅行に関連する骨量減少が挙げられる。さらなる状態は、加齢に関連する顔面骨量減少、加齢に関連する頭部骨量減少、加齢に関連する顎骨量減少、および加齢に関連する頭蓋骨量減少を含む、加齢に関連する骨量減少に関する。

本発明の組成物は、整形外科的処置、歯科処置、埋め込み手術、関節置換術（例えば、股関節および膝関節）、骨移植、骨の美容整形、および骨修復、例えば骨折治癒、偽関節治癒、癒合遅延治癒、および顔面再建術の予後を改善するためにも使用可能である。処置、置換術、移植、手術、または修復の前、最中、および／または後に１つ以上の組成物を投与してもよい。

特定の実施形態では、骨折部位、脊椎固定、または歯科関連の適応症を含むが、これらに限定されない、本発明の結合分子の局所送達が想定されている。一実施形態では、結合分子は、治療部位への局所注射によって送達される。別の実施形態では、本発明の結合分子に付加的な結合配列を追加して、結合分子を骨細胞外基質に限定されるタンパク質に向かわせるが、これは治療部位における滞留時間および結合分子のＰＫを改善し、それにより有効性を改善することができる。これらのタンパク質の非限定的な例としては、１型コラーゲン、骨シアロタンパク質、および象牙質基質タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、この付加的な結合配列は、骨細胞外基質に限定されるタンパク質に結合する結合ペプチドまたはアビマー配列である。

以下は、本発明により企図される具体的な実施形態の非限定的羅列である。

ＶＨ１またはＶＨ１由来のＣＤＲがスクレロスチンバインダーから選択される場合、ＶＨ２またはＶＨ２由来のＣＤＲはＤＫＫ−１バインダーから選択されることが企図される。反対に、ＶＨ１またはＶＨ１由来のＣＤＲがＤＫＫ−１バインダーから選択される場合、ＶＨ２またはＶＨ２由来のＣＤＲはスクレロスチンバインダーから選択される。ＶＬ１またはＶＬ１由来のＣＤＲがスクレロスチンバインダーから選択される場合、ＶＬ２またはＶＬ２由来のＣＤＲはＤＫＫ−１バインダーから選択されることがさらに企図される。反対に、ＶＬ１またはＶＬ１由来のＣＤＲがＤＫＫ−１バインダーから選択される場合、ＶＬ２またはＶＬ２由来のＣＤＲはスクレロスチンバインダーから選択される。

１．ポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記ポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に特異的に結合する、結合分子。

２．ＶＨ１およびＶＨ２が、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１の結合分子。

３．ポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記ポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に特異的に結合する、結合分子。

４．ＶＬ１およびＶＬ２が、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３の結合分子。

５．（Ｘ２）ｎが不在である、実施形態１または３の結合分子。

６．第１および第２のポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記第１のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは、存在するか、または不在であり、前記第２のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に特異的に結合する、結合分子。

７．前記ＶＨ１およびＶＨ２重鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１およびＶＬ２軽鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６の結合分子。

８．（Ｘ１）ｎが、配列番号４１５〜４８２からなる群から選択されるアミノ酸配列である、実施形態１、３、または６の結合分子。

９．結合分子が２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む、実施形態６の結合分子。

１０．Ｆｃ領域が、天然配列Ｆｃ領域および変異配列Ｆｃ領域からなる群から選択される、実施形態１、３、または６の結合分子。

１１．Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ由来のＦｃ領域からなる群から選択される、実施形態１０の結合分子。

１２．第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ１と第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ１とが、同じ親抗体またはその抗原結合部分に由来する、実施形態１、３、または６の結合分子。

１３．第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ１と第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ１とが、異なる親抗体またはその抗原結合部分に由来する、実施形態１、３、または６の結合分子。

１４．第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ２と第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ２とが、同じ親抗体またはその抗原結合部分に由来する、実施形態１、３、または６の結合分子。

１５．前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ２と前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ２とが、異なる親抗体またはその抗原結合部分に由来する、実施形態１、３、または６の結合分子。

１６．前記リンカー（Ｘ１）ｎがＣＨ１でないことを条件とする、実施形態１、３。または６の結合分子。

１７．前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する力価とは異なる力価で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、実施形態１、３、または６の結合分子。

１８．前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する親和性とは異なる親和性で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、請求項１、３、または６の結合分子。

１９．前記第１の親抗体またはその抗原結合部分、および前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト抗体、およびヒト化抗体からなる群から選択される、実施形態１、３、または６の結合分子。

２０．前記第１の親抗体またはその抗原結合部分、および前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結する２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖抗体、およびダイアボディからなる群から選択される、実施形態１、３、または６の結合分子。

２１．前記結合分子が、前記第１の親抗体もしくはその抗原結合部分、または前記第２の親抗体もしくはその抗原結合部分によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する、実施形態１、３、または６の結合分子。

２２．前記所望の特性が１つ以上の抗体パラメータから選択される、実施形態２１の結合分子。

２３．前記抗体パラメータが、抗原特異性、抗原に対する親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、およびオーソロガス抗原結合からなる群から選択される、実施形態２１の結合分子。

２４．４つのポリペプチド鎖を含む、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に結合する結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、ＶＨ１およびＶＨ２重鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１およびＶＬ２軽鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、結合分子。

２５．前記リンカー（Ｘ１）ｎがＣＨ１でないことを前提とする、実施形態２４の結合分子。

２６．４つのポリペプチド鎖を含む、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に結合する結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、配列番号１８および２０、２２および２４、２６および２８、３０および３２、３４および３６、３８および４０、４２および４４、４６および４８、５０および５２、５４および７６、５６および７２、５８および６０、６２および６４、６６および６８、７０および７２、７４および７６、７８および８０、８２および８４、８６および８８、９０および９２、４８６および４８８、４９０および４９２、ならびに４９４および４９６からなる群から選択されるＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合を含む結合分子。

２７．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号１８および２０である、実施形態２６の結合分子。

２８．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号２２および２４である、実施形態２６の結合分子。

２９．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号２６および２８である、実施形態２６の結合分子。

３０．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号３０および３２である、実施形態２６の結合分子。

３１．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号３４および３６である、実施形態２６の結合分子。

３２．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号３８および４０である、実施形態２６の結合分子。

３３．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号４２および４４である、実施形態２６の結合分子。

３４．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号４６および４８である、実施形態２６の結合分子。

３５．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５０および５２である、実施形態２６の結合分子。

３６．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５４および７６である、実施形態２６の結合分子。

３７．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５６および７２である、実施形態２６の結合分子。

３８．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５８および６０である、実施形態２６の結合分子。

３９．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号６２および６４である、実施形態２６の結合分子。

４０．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号６６および６８である、実施形態２６の結合分子。

４１．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号７０および７２である、実施形態２６の結合分子。

４２．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号７４および７６である、実施形態２６の結合分子。

４３．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号７８および８０である、実施形態２６の結合分子。

４４．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号８２および８４である、実施形態２６の結合分子。

４５．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号８６および８８である、実施形態２６の結合分子。

４６．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号９０および９２である、実施形態２６の結合分子。

４７．スクレロスチンバインダーＶＨが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
１００、１０１、１０２；１０８、１０９、１１０；１１６、１１７、１１８；１２４、１２５、１２６；１３２、１３３、１３４；１４０、１４１、１４２；１４８、１４９、１５０；１５６、１５７、１５８；１６４、１６５、１６６；１７２、１７３、１７４；１８０、１８１、１８２；１８８、１８９、１９０；１９６、１９７、１９８；２０４、２０５、２０６；２１２、２１３、２１４；および２２０、２２１、２２２からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
ＤＫＫ１バインダーＶＨが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
２２８、２２９、２３０；２３６、２３７、２３８；２４４、２４５、２４６；２５２、２５３、２５４；２６０、２６１、２６２；２６８、２６９、２７０；２７６、２７７、２７８；２８４、２８５、２８６；２９２、２９３、２９４；３００、３０１、３０２；３０８、３０９、３１０；３１６、３１７、３１８；３２４、３２５、３２６；３３２、３３３、３３４；３４０、３４１、３４２；３４８、３４９、３５０；３５６、３５７、３５８；３６４、３６５、３６６；３７２、３７３、３７４；３８０、３８１、３８２；３８８、３８９、３９０；３９６、３９７、３９８；４０４、４０５、４０６；および４１２、４１３、４１４からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む、実施形態１、３、および６の結合分子。

４８．スクレロスチンバインダーＶＬが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
９７、９８、９９；１０５、１０６、１０７；１１３、１１４、１１５；１２１、１２２、１２３；１２９、１３０、１３１；１３７、１３８、１３９；１４５、１４６、１４７；１５３、１５４、１５５；１６１、１６２、１６３；１６９、１７０、１７１；１７７、１７８、１７９；１８５、１８６、１８７；１９３、１９４、１９５；２０１、２０２、２０３；２０９、２１０、２１１；および２１７、２１８、２１９からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
ＤＫＫ１バインダーＶＬが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
ａ）２２５、２２６、２２７；２３３、２３４、２３５；２４１、２４２、２４３；２４９、２５０、２５１；２５７、２５８、２５９；２６５、２６６、２６７；２７３、２７４、２７５；２８１、２８２、２８３；２８９、２９０、２９１；２９７、２９８、２９９；３０５、３０６、３０７；３１３、３１４、３１５；３２１、３２２、３２３；３２９、３３０、３３１；３３７、３３８、３３９；３４５、３４６、３４７；３５３、３５４、３５５；３６１、３６２、３６３；３６９、３７０、３７１；３７７、３７８、３７９；３８５、３８６、３８７；３９３、３９４、３９５；４０１、４０２、４０３；および４０９、４１０、４１１からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む、実施形態１、３、および６の結合分子。

４９．スクレロスチンバインダーＶＨが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
１００、１０１、１０２；１０８、１０９、１１０；１１６、１１７、１１８；１２４、１２５、１２６；１３２、１３３、１３４；１４０、１４１、１４２；１４８、１４９、１５０；１５６、１５７、１５８；１６４、１６５、１６６；１７２、１７３、１７４；１８０、１８１、１８２；１８８、１８９、１９０；１９６、１９７、１９８；２０４、２０５、２０６；２１２、２１３、２１４；および２２０、２２１、２２２からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
ＤＫＫ１バインダーＶＨが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
２２８、２２９、２３０；２３６、２３７、２３８；２４４、２４５、２４６；２５２、２５３、２５４；２６０、２６１、２６２；２６８、２６９、２７０；２７６、２７７、２７８；２８４、２８５、２８６；２９２、２９３、２９４；３００、３０１、３０２；３０８、３０９、３１０；３１６、３１７、３１８；３２４、３２５、３２６；３３２、３３３、３３４；３４０、３４１、３４２；３４８、３４９、３５０；３５６、３５７、３５８；３６４、３６５、３６６；３７２、３７３、３７４；３８０、３８１、３８２；３８８、３８９、３９０；３９６、３９７、３９８；４０４、４０５、４０６；および４１２、４１３、４１４からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
スクレロスチンバインダーＶＬが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
９７、９８、９９；１０５、１０６、１０７；１１３、１１４、１１５；１２１、１２２、１２３；１２９、１３０、１３１；１３７、１３８、１３９；１４５、１４６、１４７；１５３、１５４、１５５；１６１、１６２、１６３；１６９、１７０、１７１；１７７、１７８、１７９；１８５、１８６、１８７；１９３、１９４、１９５；２０１、２０２、２０３；２０９、２１０、２１１；および２１７、２１８、２１９からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
ＤＫＫ１バインダーＶＬが、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有する、配列番号：
２２５、２２６、２２７；２３３、２３４、２３５；２４１、２４２、２４３；２４９、２５０、２５１；２５７、２５８、２５９；２６５、２６６、２６７；２７３、２７４、２７５；２８１、２８２、２８３；２８９、２９０、２９１；２９７、２９８、２９９；３０５、３０６、３０７；３１３、３１４、３１５；３２１、３２２、３２３；３２９、３３０、３３１；３３７、３３８、３３９；３４５、３４６、３４７；３５３、３５４、３５５；３６１、３６２、３６３；３６９、３７０、３７１；３７７、３７８、３７９；３８５、３８６、３８７；３９３、３９４、３９５；４０１、４０２、４０３；および４０９、４１０、４１１からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む、実施形態１、３、および６の結合分子。

５０．４つのポリペプチド鎖を含む結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、前記結合分子が、３つのＶＨ１ ＣＤＲと、３つのＶＨ２ ＣＤＲと、３つのＶＬ１ ＣＤＲと、３つのＶＬ２ ＣＤＲとを含み、前記対合するＶＨ１とＶＬ１とのＣＤＲ、および対合するＶＨ２とＶＬ２とのＣＤＲが、配列番号：
９７〜１０２；１０５〜１１０；１１３〜１１８；１２１〜１２６；１２９〜１３４；１３７〜１４２；１４５〜１５０；１５３〜１５８；１６１〜１６６；１６９〜１７４；１７７〜１８２；１８５〜１９０；１９３〜１９８；２０１〜２０６；２０９〜２１４；２１７〜２２２、
または配列番号：
ａ）２２５〜２３０；２３３〜２３８；２４１〜２４６；２４９〜２５４；２５７〜２６２；２６５〜２７０；２７３〜２７８；２８１〜２８６；２８９〜２９４；２９７〜３０２；３０５〜３１０；３１３〜３１８；３２１〜３２６；３２９〜３３４；３３７〜３４２；３４５〜３５０；３５３〜３５８；３６１〜３６６；３６９〜３７４；３７７〜３８２；３８５〜３９０；３９３〜３９８；４０１〜４０６；４０９〜４１４からなる群から選択される、結合分子。

５１．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１６１〜１６３であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１６４〜１６６であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０である、実施形態５０の結合分子。

５２．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１６１〜１６３であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１６４〜１６６である、実施形態５０の結合分子。

５３．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１５３〜１５５であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１５６〜１５８であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０である、実施形態５０の結合分子。

５４．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１５３〜１５５であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１５６〜１５８である、実施形態５０の結合分子。

５５．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１２１〜１２３であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１２４〜１２６である、実施形態５０の結合分子。

５６．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１７７〜１７９であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１８０〜１８２である、実施形態５０の結合分子。

５７．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号９７〜９９であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１００〜１０２である、実施形態５０の結合分子。

５８．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、実施形態５０の結合分子。

５９．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号９７〜９９であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１００〜１０２であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４である、実施形態５０の結合分子。

６０．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、実施形態５０の結合分子。

６１．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、実施形態５０の結合分子。

６２．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０である、実施形態５０の結合分子。

６３．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４である、実施形態５０の結合分子。

６４．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３６９〜３７１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３７２〜３７４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、実施形態５０の結合分子。

６５．前記（Ｘ１）ｎが配列番号４１５〜４８４からなる群から選択される、実施形態５０〜６４の結合分子。

６６．前記（Ｘ１）ｎが、配列番号４４０、４４１、４３７、４３８、４３１、４３２、４８３、および４８４からなる群から選択される、実施形態５０〜６４の結合分子。

６７．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４０である、実施形態５０〜６４の結合分子。

６８．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４１である、実施形態５０〜６４の結合分子。

６９．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３７である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７０．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３８である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７１．ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４０である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７２．ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４１である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７３．ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４８３である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７４．ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４８４である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７５．ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３１である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７６．ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３２である、実施形態５０〜６４の結合分子。

７７．前記（Ｘ１）ｎがＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖とＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖とで異なる、実施形態１、３、６、２４、２６、および５０の結合分子。

７８．スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に結合する結合分子を生成するための方法であって、（ａ）スクレロスチンまたはＤＫＫ−１に結合可能な第１の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、（ｂ）スクレロスチンまたはＤＫＫ−１に結合可能な第２の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、（ｃ）ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む、第１および第３のポリペプチド鎖を構築するステップであって、式中、ＶＨ１は、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、ＣＨ１ではないという条件でリンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、ステップと、（ｄ）ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第２および第４のポリペプチド鎖を構築するステップであって、式中、ＶＬ１は、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、ステップと、（ｅ）スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に結合する結合分子が生成されるように、前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を発現させるステップと、を含む、方法。

７９．前記ＶＨ１およびＶＨ２重鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１およびＶＬ２軽鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７８の方法。

８０．前記第１の親抗体またはその抗原結合部分それぞれと、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分それぞれとが、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト抗体、およびヒト化抗体からなる群から別個に選択される、実施形態７８の方法。

８１．前記第１の親抗体またはその抗原結合部分それぞれと、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分それぞれとが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結する２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖抗体、およびダイアボディからなる群から別個に選択される、実施形態７８の方法。

８２．前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が、結合分子によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する、実施形態７８の方法。

８３．前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が、結合分子によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する、実施形態７８の方法。

８４．Ｆｃ領域が、天然配列Ｆｃ領域および変異配列Ｆｃ領域からなる群から選択される、実施形態７８の方法。

８５．Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ由来のＦｃ領域からなる群から選択される、実施形態７８の方法。

８６．前記所望の特性が１つ以上の抗体パラメータから選択される、実施形態７８の方法。

８７．前記所望の特性が１つ以上の抗体パラメータから選択される、実施形態７８の方法。

８８．前記抗体パラメータが、抗原特異性、抗原に対する親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、およびオーソロガス抗原結合からなる群から選択される、実施形態７８の方法。

８９．前記抗体パラメータが、抗原特異性、抗原に対する親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、およびオーソロガス抗原結合からなる群から選択される、実施形態７８の方法。

９０．前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する親和性とは異なる親和性で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、実施形態７８の方法。

９１．前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する力価とは異なる力価で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、実施形態７８の方法。

９２．前記リンカーがＣＨ１でないことを条件とする、実施形態７８の方法。

９３．実施形態１〜７７のうちのいずれかの結合分子を含む、薬学的組成物。

９４．薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体のうちの１つ以上と組み合わせた、実施形態１〜７７のうちのいずれかの結合分子。

９５．骨障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に実施形態１〜７７のうちのいずれかの結合分子を投与することを含む、方法。

９６．骨折修復を促進する方法であって、それを必要とする患者に実施形態１〜７７のうちのいずれかの結合分子を投与することを含む、方法。

９７．骨密度を増加させる方法であって、それを必要とする患者に実施形態１〜７７のうちのいずれかの結合分子を投与することを含む、方法。

９８．骨強度を増加させる方法であって、それを必要とする患者に実施形態１〜７７のうちのいずれかの結合分子を投与することを含む、方法。

９９．ＢＭＣが、未治療患者と比較して、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００パーセント増加する、実施形態９６〜９８の方法。

１００．ＢＭＤが、未治療患者と比較して、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ーセント増加する、実施形態９６〜９８の方法。

１０１．実施形態１〜７７のうちのいずれかの結合分子をコードするポリヌクレオチド。

１０２．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号４８６および４８８である、実施形態２６の結合分子。

１０３．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号４９０および４９２である、実施形態２６の結合分子。

１０４．ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号４９４および４９６である、実施形態２６の結合分子。

１０５．前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号２２５〜２２７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号２２８〜２３０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、実施形態５０の結合分子。

特定の国の管轄で許可されているように、本明細書に開示される全ての参考文献は、それぞれが個別に援用されるかのように、本発明の権限を付与し、説明することを含むあらゆる目的で、参照によりその全体が本明細書に援用される。以下の実施例は、本明細書において提供される抗体、断片、および組成物の特定の態様を単に説明するために提供されており、したがって特許請求された発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

実施例１
二特異性二重可変ドメインＩｇ分子の操作：抗スクレロスチンおよび抗ＤＫＫ１
数組の二重可変ドメイン（ＤＶＤ）Ｉｇ分子の構築に、ヒトスクレロスチンおよびＤＫＫ１に対する抗体を使用した。マウス、ラット、またはゼノマウスハイブリドーマから、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子のＤＮＡを取得した。二重ドメイン軽鎖軽を構築するために、抗ヒトスクレロスチン抗体のＶＬドメインをリンカー（軽鎖のＣＬ１ドメインの最初の１２個のアミノ酸）により抗ｈｕ ＤＫＫ１抗体軽鎖の可変ドメインのＮ末端、続いてＣＬにタンデム融合させて、全長ＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖を形成した。

同様に、抗ｈｕスクレロスチン抗体の重鎖（ＶＨ）の可変ドメインをリンカー（重鎖のＣＬ１の最初の１３または１２個のアミノ酸）により抗ｈｕ ＤＫＫ１抗体のＶＨのＮ末端に、続いて重鎖の完全定常領域にタンデム融合させた。もう１つのＤＶＤの変形形態は、抗ＤＫＫ１のＶＨ／ＶＬが、それぞれのリンカーにより、抗スクレロスチンの重鎖／軽鎖のＮ末端上に連結したものである。

軽鎖の２つの可変ドメイン間のリンカーはＣＬ１領域から得、重鎖の２つの可変ドメイン間のリンカーは重鎖の定常領域のＣＨ１領域から得た。全てのＤＮＡ構築物を固有の制限部位によってｐＴＴ５ベクターにクローニングした。

生成されるＤＶＤ−Ｉｇ分子の一例は、マウス抗ｈｕスクレロスチン抗体ＡＢ−４のＶＬ／ＶＨがラット抗ｈｕ ＤＫＫ１ １１Ｈ１０抗体の軽鎖／重鎖のＮ末端に結合され、ラットＩｇＧ２ａ定常領域を含む、ラットキメラＤＶＤ ＡＢ−４−１１Ｈ１０である。ラット抗ｈｕ ＤＫＫ１ １１Ｈ１０の可変ドメイン（ＶＬ／ＶＨ）がマウス抗スクレロスチンＡＢ−４の軽鎖／重鎖のＮ末端に融合された、逆の方向性の可変ドメインを有するＤＶＤも作成された。

構造安定性をもたらし、また構築体をよりラット様にするために、ラット定常ドメイン由来のリンカーを選択した。この種のラット化二特異性抗体は、短期および長期ラットモデルで使用したとき、潜在的免疫原性の危険性がより低いはずである。

実施例２
スクレロスチン−ＤＫＫ１ ＤＶＤ−Ｉｇの発現
Ｗａｖｅバイオリアクター（２５Ｌ）でのスクレロスチン−ＤＫＫ１ ＤＶＤ−Ｉｇの大規模生産を以下のように実施した。
３Ｌフラスコにそれぞれ１Ｌの２９３−６Ｅ細胞を１ｍＬ当たり３Ｅ５生存細胞（ＶＣ／ｍＬ）で接種した。Ｆ１７発現培地を使用し、プルロニック１．１ｍｇ／ｍＬ、Ｌ−グルタミン６ｍＭ、およびジェネテシン２５ｕｇ／ｍＬを補充した。４８時間後、細胞計数を実施し、９９．１％〜９９．９％の生存率が観察された。５０Ｌ Ｗａｖｅバッグ中の１１．２５リットルの２９３−６Ｅ培養物を１１．２５リットルの新鮮Ｆ１７培地と混合することにより、１：２希釈の培養物を得た。２４時間後にもう１度細胞計数を実施し、生存率９８．５％が確認された。次にＦ１７培地で１：１０希釈を行い、全プラスミドＤＮＡ０．５ｍｇ／Ｌ（培養物）（つまり１２．５ｍｇ）をＰＥＩ Ｍａｘ ３ｍＬ／ｍｇ（ＤＮＡ）と共に添加した。抗体鎖それぞれに等量のＤＮＡを添加した（６．２５ｍｇ）。トランスフェクションの２４時間後、６２５ｍＬ（培養物２５ｍＬ／Ｌ）のフィード（０．１％プルロニックを含むＦ１７中の２０％トリプトンＮ１からなる）をこの培養物に添加し、次いで５日間インキュベートした。続いて、細胞計数を実施し、細胞生存率８２．９％が観察された。次に、４０００ｒｐｍで４５分間の遠心分離により馴化培地（ＣＭ）を採取し、０．２ｕｍフィルターでこのＣＭをろ過した。還元条件下および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、一定分量の抗体を分析した。

実施例３
インビボ試験用のスクレロスチン−ＤＫＫ１ ＤＶＤ−Ｉｇの精製および製剤化
一時的な細胞培養物から、スクレロスチン−ＤＫＫ１ ＤＶＤ−Ｉｇを精製した。この精製スキームには、親和性クロマトグラフィーと、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）とを用いた。

細胞培養液の濃縮
細胞培養液の濃縮は、ＴＦＦ（タンジェンシャルフローろ過）装置を用いて４℃で実施した。ＰＥＳ １０ｋＤ ＭＷＣＯ（５×１平方フィート）膜を使用して、生成物をおよそ１０倍に濃縮した。直交流は０．７Ｌ／平方フィート／分、ＴＭＰは２５〜３０ｐｓｉとした。

プロテインＧクロマトグラフィー
プロテインＧクロマトグラフィーは室温で実施したが、添加時は細胞培養液の冷却を保った。流量は、１分当たり０．２カラム容量で一定に保った。
２０リットルの清澄化細胞培養液を１０倍濃縮し、半分の容量の１．２Ｍクエン酸ナトリウム、７５ｍＭトリス（ｐＨ９）で希釈し、次いで０．４Ｍクエン酸ナトリウム、２５ｍＭトリス（ｐＨ９）で平衡化した２３０ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＸＫ５０、１９．６ｃｍ２×１２．５ｃｍ）に添加した。細胞培養液の添加後、２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに復帰するまで０．４Ｍクエン酸ナトリウム、２５ｍＭトリス（ｐＨ９）でカラムを洗浄した。洗浄後、０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３）でカラムから抗体を溶出させ、溶出ピーク全体を収集した。この溶出プールは、２．１９７グラムの生成物を含有していた。溶出後、１Ｍトリス塩基プロテインＧプールをｐＨ７に即座に調整した。

Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰクロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰクロマトグラフィーを室温で実施し、樹脂１ｍＬ当たりおよそ７ｍｇのタンパク質を結合した。流量は、０．２カラム容量／分で一定に保った。

２０ｍＭリン酸ナトリウム、３Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７）を最終濃度０．６Ｍ硫酸アンモニウムとなるまで添加することにより、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰへの結合のためにプロテインＧプールを調整した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．６Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７）で平衡化した３５ｍＬ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰカラム（ＸＫ ２６、５．３ｃｍ２×６．６ｃｍ）に、調整したプロテインＧプール１１５ｍＬ（２４５ｍｇ）を添加した。添加後、通過画分の２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに復帰するまで、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．６Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ７）でカラムを洗浄した。２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中の漸減する硫酸アンモニウム（０．６〜０Ｍ）の２０カラム容量直線勾配を用いて、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰカラムから生成物を溶出させた。０．５カラム容量の画分を回収し、サイズ排除ＨＰＬＣによってアッセイを行って純度を判定した。主ピーク％に基づいて画分をプールして、生成物プールを作成した。生成物の８６％が回収され、２１０ｍｇを得た。

製剤化：緩衝液交換および濃縮
再生セルロース１０ｋＤ ＭＷＣＯ透析カセットを用いて、４℃で緩衝液交換を実施した。濃縮は、ＰＥＳ １０ｋＤ ＭＷＣＯ 遠心装置を用いて４℃で実施した。回収率は８５％であった。

８０ｍＬ（８０ｍｇ）のＰｈｅｎｙｌ ＨＰプールを１０ｍＭトリス、２５０ｍＭ Ｌ−プロリン（ｐＨ７．５）に緩衝液交換した。透析は、３リットルの１０ｍＭトリス、２５０ｍＭ Ｌ−プロリン（ｐＨ７．５）に対して３回透析することによって実施した。透析後生成物プールの容積は、タンパク質濃度０．６７４ｍｇ／ｍＬで１１３ｍＬであった。透析後、遠心濃縮装置を用いて生成物プールを１８．５ｍＬまで濃縮した。次いで、生成物プールを滅菌ろ過した（０．２２ミクロン）。ろ過された純粋バルクの濃度は、３．６５ｍｇ／ｍＬであった。総回収率は７３％、つまり６７．６ｍｇであった。ろ過された純粋バルクのエンドトキシンレベルは、０．０７ＥＵ／ｍｇ未満であった。ろ過された純粋バルク生成物を４℃で保存した。

実施例４
スクレロスチンおよびＤＫＫ１ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ捕捉アッセイによって、スクレロスチンとＤｋｋ１とに同時に特異的に結合する各種二特異性抗体の能力を判定した。９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ、製品番号３６９４）中、１ｍｇ／ｍＬのマウス抗ｈｕＳｃｌ ＭＡｂ ５６Ｈ２を含むコーティング緩衝液（０．０１５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、０．０３５Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）２０ｍＬ／ウェルでプレートをコーティングし、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。プレートを１００ｍＬ／ウェルの洗浄溶液（０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）で一度洗浄し、続いて１００ｍＬ／ウェルのブロッキング溶液（１％ ＢＳＡ、１％ヤギ血清、および０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を室温で１時間添加した。ヒトスクレロスチンタンパク質を添加し（１０ｎｇ／ｍＬの原液をブロッキング溶液で希釈したもの２０ｍＬ／ウェル）、室温で１時間インキュベートし、その後上記と同様に洗浄した。各種希釈二特異性Ａｂ（０、０．００８、０．０４、０．２、１、５、２５、１２５、６２５ｎＭ）、親Ａｂ（陽性対照）、および非ＤＫＫ１／Ｓｃｌ（スクレロスチン）関連ＩｇＧ（ヒトまたはラットＩｇＧ、陰性対照）２０ｍＬ／ウェルをブロッキング溶液に添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄溶液でのインキュベーション後、ブロッキング溶液で希釈したｈｕＤＫＫ１−ビオチン（１０ｎｇ／ｍＬ）２０ｍＬ／ウェルを室温で１時間プレートに添加した後、洗浄溶液に入れた。ブロッキング溶液で希釈したＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ希釈物（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号３１００１）を１：５０，０００希釈でウェルに添加し（２０ｍＬ／ウェル）、次いで室温で１時間インキュベーションし、続いて洗浄溶液１００ｍＬ／ウェルで３回洗浄した。最終ステップとして、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ、製品番号３７０７４）希釈標準溶液２０ｍＬ／ウェルをプレートに添加し、ルミノメーターを用いて４２５ｎｍでシグナルを読み取った。図１〜３にまとめたデータは、試験した全ての二特異体が両標的に同時に結合可能であり、したがって抗体の可変領域を連結するリンカー配列も、各可変ドメインの１つのリガンドとの結合も、第２のリガンドの結合に顕著な立体障害をもたらさないことを示している。

実施例５
スクレロスチンおよびＤＫＫ１ Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
二特異性抗体が両標的に結合可能であることをさらに立証するために、四価二重特異性結合活性をＢｉａｃｏｒｅ分析によって評価した。簡潔に述べると、４つ全てのＣＭ５チップのフローセルに、高表面密度（＞３，５００ＲＵ固定化）でヤギ抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ断片特異的抗体を固定化した。二特異性抗体を２５ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｐ−２０、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡで２０ｎＭに希釈し、個々のフローセルに捕捉した。リガンド（ヒトＤｋｋ−１およびヒトスクレロスチン）を同じ緩衝液で１００ｎＭに希釈し、順次捕捉した二特異性Ｉｇ上に注入した。

センソグラムは、二特異性抗体を第１の抗原（ヒトＤｋｋ１またはヒトスクレロスチンのいずれか）で飽和させて第２の抗原を注入したときに、第２の結合シグナルが観察されたことを示している。この観察結果は、抗原注入の順序を逆にした場合も同様であった。これら２つの別個の結合事象の観察結果は、二特異性抗体が両リガンドに同時に結合可能であることを示している。

実施例６
骨芽細胞Ｗｎｔ活性化バイオアッセイ
操作された二特異性抗体は、骨芽細胞Ｗｎｔ活性化アッセイで示されるように、カノニカルＷｎｔシグナル伝達を遮断する両標的の能力を中和することができる。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＳｕｐｅｒ−ＴＯＰＦｌａｓｈレポーター構築物でトランスフェクトし、安定な細胞株を選択および評価した。クローンＣ１０を最良のクローンとして特定し、これを様々な条件下で十分に特徴付けて、これが精製したスクレロスチンタンパク質またはＤｋｋ１タンパク質のいずれかとのインキュベーション後に、Ｗｎｔ経路活性化の阻害により減少したレポーター活性を有することが示された。細胞を増殖培地（１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、および１．０ｕｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有するα−ＭＥＭ培地）で培養した。細胞が８０％コンフルエントに達したとき、培地を分化培地（増殖培地、５０ｕｇ／ｍＬのアスコルビン酸、および１０ｍＭ β−グリセロリン酸）に交換して４日間培養した。分化後、この細胞株は、オートクライン的にカノニカルＷｎｔ活性化を誘導する内因性タンパク質（複数可）を産生する。培地を吸引し、１００ｕＬの各種濃度の単一特異性または二特異性抗体を含有する新鮮ＤＭ（Ｄｋｋ１とともに４時間および／またはスクレロスチンとともに４５〜６０分間、３７Cであらかじめインキュベートした）をウェルに２４時間添加した。製造業者の使用説明に従ってルシフェラーゼ活性を測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ’ｓ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、製品番号Ｅ４５３０）。

試験した様々なラットおよびヒト二特異性抗体は、スクレロスチンおよびＤｋｋ１の双方の存在下で、骨芽細胞カノニカルＷｎｔ経路を用量依存的に活性化することができ、これらの抗体が、両可溶性タンパク質のＷｎｔ阻害機能を同時に中和できることをさらに示した。

実施例７
Ｗｎｔ誘導ルシフェラーゼバイオアッセイ
操作された二特異性抗体は、骨芽細胞に基づくアッセイで判定したとき、Ｄｋｋ１を中和し、Ｗｎｔ１誘導ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼ活性を遮断することができた。Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）応答性ルシフェラーゼ構築物、Ｔｅｔリプレッサー構築物、およびドキシサイクリン誘導性Ｗｎｔ１構築物のレンチウイルス形質導入によって、骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３Ｅ１／ＴｅｔＯＮ−Ｗｎｔ１／ＳＴＦ−Ｌｕｃ＃５細胞株を操作した。このアッセイでは、ドキシサイクリン（１０ｎｇ／ｍＬ）を培養培地に２２〜２６時間添加することにより、Ｗｎｔ１の発現、ならびにＷｎｔ１の細胞表面ＬＲＰ５／６およびＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との結合を介したシグナル伝達が誘導され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現をもたらした。ＭＣ３Ｔ３Ｅ１／ＴｅｔＯＮ−Ｗｎｔ１／ＳＴＦ−ｌｕｃ＃５細胞をスクレロスチンおよび／またはＤｋｋ１の存在下でインキュベートし、スクレロスチンおよびＤｋｋ１のＬＲＰ５／６との競合的結合によりＷｎｔシグナル伝達が阻害された。ヒトＤｋｋ１タンパク質（０．１ｕｇ／ｍＬ）またはヒトスクレロスチンタンパク質（１ｇ／ｍＬ）を対照ＰＢＳまたは二特異性抗体の連続希釈物と予備混合した。２４時間後、ルシフェラーゼシグナルを上述のように測定し、ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いてデータをグラフに示した。図４および１８にまとめるように、二特異性抗体は、用量依存的にスクレロスチンおよびＤｋｋ１を阻害し、Ｗｎｔ１によって誘導されるＷｎｔシグナル伝達を回復させた。

実施例８
スクレロスチンおよび／またはＤｋｋ１のバインダーのスクリーニング方法
精製したビオチン標識Ｄｋｋ１およびスクレロスチンタンパク質、ならびに精製したＨｉｓタグＬｒｐ６またはＬｒｐ５を用いた、スクレロスチンまたはＤｋｋ１のＬｒｐ６との結合を遮断する二特異性抗体、ペプチボディ、およびアビマーの能力をスクリーニングするための方法が確立された。スクレロスチンまたはＤｋｋ１のＬｒｐ６／Ｌｒｐ５との結合を遮断する二特異性／ペプチド／アビマーの能力を、アルファスクリーンアッセイを用いて判定した。５μＬのビオチン−Ｓｃｌ（またはビオチン−Ｄｋｋ１）および５μＬのＬｒｐ６−Ｈｉｓをまず室温で１時間インキュベートし、次いで５μＬの二特異剤をさらに１時間添加し、その後１０ｕＬのドナー／アクセプタービーズ混合物を添加した。この反応物をさらに１時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置でアルファスクリーンシグナルを５２０〜６２０ｎＭで読み取った。二特異剤で処理したウェルにおけるシグナルの喪失は、二特異体がＤｋｋ１およびスクレロスチンのＬｒｐ５／Ｌｒｐ６との結合を遮断し、それによってカノニカルシグナル伝達が各種Ｗｎｔタンパク質によって誘発されることを可能にし得ることを示している。図１９は、そのようなスクリーニングの一実験のデータをまとめている。

実施例９
インビボマウス骨量および骨強度モデル
これらの試験および結果を図５にまとめる。試験計画：生後１０週間の雄Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス合計４５匹を本試験に使用した。試験開始時に、体重およびインビボＤＸＡによる大腿骨−脛骨領域のＢＭＤの双方で平均化して、動物を５群（ｎ＝９／群）に分割した。マウスに、ビヒクル（プロリン）、またはスクレロスチン−Ａｂ（Ｓｃｌ−Ａｂ）、またはＤＫＫ１−Ａｂ、またはＳｃｌ−ＡｂとＤＫＫ１−Ａｂとの組み合わせ（組み合わせ）、または二特異性抗体（Ｂｉｓｐ−Ａｂ）のいずれかを週２回３週間にわたり皮下注射した。分子量の差により、抗体を等モル濃度（１．８２×１０−５Ｍ）で投与し、１８．２ｍｇ／ｋｇのＳｃｌ−Ａｂ、１８．０７ｍｇ／ｋｇのＤＫＫ１−Ａｂ、組み合わせ群では１８．２ｍｇ／ｋｇのＳｃｌ−Ａｂ＋１８．０７ｍｇ／ｋｇのＤＫＫ１−Ａｂ、および２５ｍｇ／ｋｇのＢｉｓｐ−Ａｂとした。動物をインビボＤＸＡで週１回スキャンして、腰椎領域および大腿骨−脛骨領域における薬物処置の骨同化作用をモニターし、その後試験終了時に安楽死させた。μＣＴによるエクスビボ密度計測および骨強度分析のために大腿骨を採取した。

インビボ密度計測：動物の脛骨−腓骨接合部から大腿骨頸（大腿骨−脛骨）および腰椎（ＬＶ１−５）の領域をＤＸＡ（ＧＥ Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ ＩＩ）でスキャンして、これらの部位の面積ＢＭＤを測定した。

エクスビボ密度計測：デスクトップマイクロＣＴシステム（ｅＸｐｌｏｒｅ Ｌｏｃｕｓ ＳＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて大腿骨をスキャンし、分解能１３μｍに再構成した。皮質骨については中央骨幹皮質骨において大腿骨の高さの１０％にわたる領域（閾値８００ｍｇ／ｃｃ）、および遠位大腿骨梁の１０％にわたる領域（閾値は、ビヒクルおよびＤＫＫ１−Ａｂについては５００ｍｇ／ｃｃ、Ｓｃｌ−Ａｂについては５５０ｍｇ／ｃｃ、組み合わせおよびＢｉｓｐ−Ａｂについては６００ｍｇ／ｃｃ）を検査した。皮質骨面積（Ｃｔ．Ａｒ）および断面慣性モーメント（ＣＳＭＩ）を中央骨幹領域で測定した。海綿骨体積率（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、および骨梁ＢＭＤ（Ｔｂ．ＢＭＤ）を遠位大腿骨で評価した。

生体力学：中央骨幹における破断までの３点曲げで大腿骨を試験し、骨強度パラメータの最大負荷および剛性を評価した（ＭＴＳ ８５８ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏｎｉｘ ＩＩ、スパン長＝６ｍｍ、変位速度＝６ｍｍ／分）。

統計分析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．５．０１）を使用して、統計分析を実施した。一方向Ａｎｏｖａをテューキー・クレーマー事後試験と共に用いて比較を行った。データは平均＋ＳＥＭ（標準誤差）として報告され、ｐ＜０．０５が有意とみなされた。

結果：
インビボＢＭＤ：治療１週間後に早くも組み合わせ群およびＢｉｓｐ−Ａｂ群の腰椎（ＬＶ１−５）および大腿骨−脛骨の両領域でＢＭＣおよびＢＭＤの有意な増加が認められ、この応答は、処置期間にわたり、Ｓｃｌ−Ａｂ単独およびＤＫＫ１−Ａｂ単独よりも高いレベルで増加し続けた。図Ｘに示すデータは、試験終了時（３週間）の脛骨−大腿骨におけるベースラインからのＢＭＣの変化率を表す。全ての処置は、ベースラインと比較してわずか−３．５％しか減少しなかったビヒクル処置群と比較して、ＢＭＣの有意な増加をもたらした。ベースラインと比較して、Ｓｃｌ−Ａｂで処置した動物はＢＭＣが２７％増加し、Ｄｋｋ１−ＡｂではＢＭＣが１３％増加し、組み合わせではＢＭＣが５１％増加し、Ｂｉｓｐ−ＡｂではＢＭＣが４８％増加した。組み合わせ処置またはＢｉｓｐ−Ａｂ処置によって誘導された腰椎および大腿骨−脛骨の双方におけるＢＭＣおよびＢＭＤの増加は、Ｓｃｌ−Ａｂ単独またはＤｋｋ１−Ａｂ単独よりも有意に大きかった。

骨量および骨強度：ＤＫＫ１−Ａｂは、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋４７％）、Ｔｂ．Ｎ（＋３０％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋２３％）を有意に増加させたが、Ｔｂ．Ｔｈ（＋１３％）は有意に増加させなかった。ＤＫＫ１−Ａｂは、ビヒクルと比較して、骨幹Ｃｔ．Ａｒ（＋３％）およびＣＳＭＩ（＋１％）に有意な影響を与えなかった。大腿骨骨幹軸の曲げ強度は、ＤＫＫ１−Ａｂ処置による影響を受けなかった。

Ｓｃｌ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋７６％）、Ｔｂ．Ｎ（＋２１％）、Ｔｂ．Ｔｈ（＋７１％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋４７％）を有意に増加させた。Ｓｃｌ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、骨幹Ｃｔ．Ａｒ（＋２４％）を有意に増加させたが、ＣＳＭＩ（＋２２％）は有意に増加させなかった。Ｓｃｌ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、大腿骨骨幹軸最大負荷（＋２９％）および剛性（＋２４％）を有意に増加させた。

組み合わせは、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋２７８％）、Ｔｂ．Ｎ（＋６４％）、Ｔｂ．Ｔｈ（＋１７５％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋１４９％）を有意に増加させた。組み合わせは、ビヒクルと比較して、骨幹Ｃｔ．Ａｒ（＋３７％）およびＣＳＭＩ（＋４４％）を有意に増加させた。組み合わせは、ビヒクルと比較して、大腿骨骨幹軸最大負荷（＋４７％）および剛性（＋４６％）を有意に増加させた。組み合わせ群におけるこれら全てのパラメータの平均値は、Ｓｃｌ−Ａｂ（ＣＳＭＩを除く）単独群およびＤＫＫ１−Ａｂ単独群で観察されたものよりも有意に高かった。

組み合わせと同様に、Ｂｉｓｐ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋２２８％）、Ｔｂ．Ｎ（＋５７％）、Ｔｂ．Ｔｈ（＋１５２％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋１２９％）を有意に増加させた。Ｂｉｓｐ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、骨幹Ｃｔ．Ａｒ（＋３５％）およびＣＳＭＩ（＋３９％）を有意に増加させた。Ｂｉｓｐ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、大腿骨骨幹最大負荷（＋４５％）および剛性（＋４４％）を有意に増加させた。Ｂｉｓｐ−Ａｂ群におけるこれら全てのパラメータの平均値は、Ｓｃｌ−Ａｂ（ＣＳＭＩを除く）単独群およびＤＫＫ１−Ａｂ単独群で観察されたものよりも有意に高かった。

要約：組み合わせおよびＢｉｓｐ−Ａｂの両処置は、いずれかの単剤療法と比較して、骨量および骨強度のより大きい増加をもたらした。これらの結果は、組み合わせおよびＢｉｓｐ−Ａｂの両処置が、このマウスモデルの骨量および骨強度の向上に予想外の相乗効果を与えることを明確に示した。

結論：スクレロスチンおよびＤｋｋ１の双方に対する阻害作用を含む分子である二特異性Ａｂは、低い骨量および骨修復に関連する状態で、Ｓｃｌ−Ａｂ単独またはＤＫＫ１−Ａｂ単独よりも強い治療活性を有すると思われる。

実施例１０
Ｓｏｓｔ−ＡｂおよびＤｋｋ１−Ａｂ併用療法はＰＴＨＲ１発現を増加させる
骨形成に対するＳｏｓｔおよびＤｋｋ１抗体併用治療の相乗的影響の根底にある分子機序をより理解するために、骨同化経路要素の発現を試験した。生後７〜９ヶ月の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットをビヒクル（Ｖｅｈ）、Ｄｋｋ１−Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）、Ｓｏｓｔ−Ａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）、組み合わせ（コンボ５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）で２週間処置した。動物を１４日目に致死させ、ラット大腿骨を摘出し、全ての筋肉を除去した。骨端および軟骨を除去し、骨髄を除去するために大腿骨を氷冷ＰＢＳで洗い流した。この骨を液体窒素中で瞬間凍結させて粉砕した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏ ９６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて骨ＲＮＡを精製した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ−Ｐｌｅｘ ２．０ Ｐａｎｅｌ ３３１１４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて遺伝子発現を分析した。

併用療法による治療は、骨の同化作用に関連する複数の遺伝子の発現をいずれか単独での療法よりもはるかに高い程度まで増加させた。これらの遺伝子には、骨細胞（ＤＭＰ１）、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路（Ａｘｉｎ２）、骨形成（Ｃｏｌ１Ａ１）、および骨芽細胞転写（Ｏｓｔｅｒｉｘ）の生物学マーカーが含まれた。予想外に、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）シグナル経路成分ＰＴＨ受容体１（ＰＴＨＲ１）の相乗的増加も観察された（下記の図ＸＸ）。図６にまとめたこれらのデータは、Ｓｏｓｔ−ＡｂとＤｋｋ１−Ａｂとの併用治療の骨の同化作用に対する相乗作用が、併用治療によって生じたＰＴＨシグナル伝達の予想外の増加に一部起因し得ることを示唆している。

実施例１１
結合分子のハイスループット（ＨＴ）発現
以下のスクレロスチン／ＤＫＫ１対合が生成された。

２つの異なる方向性、および１つの方向性につき５つの異なるリンカー（ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＣＬ／ＣＨ１の最初の６個のアミノ酸、ＣＬ／ＣＨ１の最初の１３個のアミノ酸）をそれぞれの対について試験した。９６ウェルプレート中、接着適応２９３ ６Ｅ細胞で結合分子を一時的に発現した。ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェル組織培養プレート中、０．０１％プルロニックＦ６８、２５μｇ／ｍＬのＧ４１８、および５％ ＦＢＳを補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｇｉｂｃｏ ＃１２３３８）に、トランスフェクションの２４時間前に１ウェル当たり５Ｅ４細胞で接着２９３ ６Ｅ細胞を播種し、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。

トランスフェクション当日、結合分子の相当するＨＣおよびＬＣ ＤＮＡそれぞれ１００ｎｇ（４０ｎｇ／μＬ）を混合した。２５μＬ／ウェルの予備混合したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍｅｄｉａ：ＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｒｏｃｈｅ、製品番号０４−７０９−７１３−００１）（２４：１）をこのＤＮＡ混合物に添加した。室温で１５〜３０分間のインキュベーション後、このトランスフェクション混合物全体を前日に播種した培養プレートに添加し、穏やかな揺動で混合した。この培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに戻して一晩置いた。翌日、培地とトランスフェクション混合物を吸引して取り出し、０．５％トリプトンを含有する無血清培地１３０μＬと交換した。これらのプレートをさらに６時間インキュベートした。トランスフェクション後７日目に馴化培地（ＣＭ）を採取した。プレートを１０００ｒｐｍで５分間回転させて、全ての細胞残屑をペレット化した。上清を慎重に滅菌ポリプロピレンブロックに移動させた。

Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサーを用いたＦｏｒｔｅＢｉｏ ＱＫ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、製品番号１８−５０１０）でＣＭ中の結合分子の濃度を測定した。測定前にＰｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサーを試料緩衝液に１０分間浸漬した。測定開始時に、あらかじめ濡らしたバイオセンサーを２倍希釈ＣＭ試料に２分間浸漬し、捕捉された分子を記録した。プレインストールされたＩｇＧ１濃度標準曲線を用いて、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ６．３ソフトウェアで試料濃度を算出した。

本明細書の実施例４に記載したように、ＥＬＩＳＡスクリーニングを実施した。本明細書の実施例６および７に記載したように、ＷＮＴアッセイを実施した。

結論：ＨＴスクリーニングにより、スクレロスチンおよびＤｋｋ１に対する強力な二重中和活性を有するいくつかの完全ヒトＤＶＤ−Ｉｇ候補の特定に至った。スクリーニングした１５７の候補のうち、３５％がＨＴ発現スクリーニングで良好な一時的発現を示し、いくつかの候補は、１０ｕｇ／ｍＬを上回る発現レベルを生じた。

実施例１２
無処置の成長期の幼若マウスモデルにおける骨形成の刺激および骨強度の増加。
試験計画：生後１０週間の雄Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス合計４５匹を本試験に使用した。試験開始時に、体重およびインビボＤＸＡによる大腿骨−脛骨領域のＢＭＤの双方で平均化して、動物を５群（ｎ＝９／群）に分割した。ビヒクル（プロリン）、またはスクレロスチン−Ａｂ（Ｓｃｌ−Ａｂ）、またはＤＫＫ１−Ａｂ、またはＳｃｌ−ＡｂとＤＫＫ１−Ａｂとの組み合わせ（組み合わせ）、または１３Ｃ７−１１Ｈ１０のいずれかをマウスの皮下に週２回３週間にわたり注射した。分子量の差により、抗体を等モル濃度（１．８２×１０^−５Ｍ）で投与し、１８．２ｍｇ／ｋｇのＳｃｌ−Ａｂ、１８．０７ｍｇ／ｋｇのＤＫＫ１−Ａｂ、組み合わせ群では１８．２ｍｇ／ｋｇのＳｃｌ−Ａｂ＋１８．０７ｍｇ／ｋｇのＤＫＫ１−Ａｂ、および２５ｍｇ／ｋｇの１３Ｃ７−１１Ｈ１０とした。動物をインビボＤＸＡで週１回スキャンして、腰椎領域および大腿骨−脛骨領域における薬物処置の骨同化作用をモニターし、その後試験終了時に安楽死させた。μＣＴによるエクスビボ密度計測および骨強度分析のために大腿骨を採取した。

インビボ密度計測：動物の脛骨−腓骨接合部から大腿骨頸（大腿骨−脛骨）および腰椎（ＬＶ１−５）の範囲をＤＸＡ（ＧＥ Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ ＩＩ）でスキャンして、これらの部位の面積ＢＭＤを測定した。

エクスビボ密度計測：デスクトップマイクロＣＴシステム（ｅＸｐｌｏｒｅ Ｌｏｃｕｓ ＳＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて大腿骨をスキャンし、分解能１３μｍに再構成した。皮質骨については中央骨幹皮質骨において大腿骨の高さの１０％にわたる領域（閾値８００ｍｇ／ｃｃ）、および遠位大腿骨梁の１０％にわたる領域（閾値は、ビヒクルおよびＤＫＫ１−Ａｂについては５００ｍｇ／ｃｃ、Ｓｃｌ−Ａｂについては５５０ｍｇ／ｃｃ、組み合わせおよびＢｉｓｐ−Ａｂについては６００ｍｇ／ｃｃ）を検査した。皮質骨面積（Ｃｔ．Ａｒ）および断面慣性モーメント（ＣＳＭＩ）を中央骨幹領域で測定した。海綿骨体積率（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）、および骨梁ＢＭＤ（Ｔｂ．ＢＭＤ）を遠位大腿骨で評価した。

生体力学：中央骨幹における破断までの３点曲げで大腿骨を試験し、骨強度パラメータの最大負荷および剛性を評価した（ＭＴＳ ８５８ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏｎｉｘ ＩＩ、スパン長＝６ｍｍ、変位速度＝６ｍｍ／分）。

統計分析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．５．０１）を使用して、統計分析を実施した。一方向Ａｎｏｖａをテューキー・クレーマー事後試験と共に用いて比較を行った。データは平均＋ＳＥＭ（標準誤差）として報告され、ｐ＜０．０５が有意とみなされた。

結果：
インビボＢＭＤ：治療１週間後に早くも組み合わせ群および１３Ｃ７−１１Ｈ１０群の腰椎（ＬＶ１−５）および大腿骨−脛骨の両領域でＢＭＣおよびＢＭＤの有意な増加が認められ、この応答は、処置期間にわたり、Ｓｃｌ−Ａｂ単独およびＤＫＫ１−Ａｂ単独よりも高いレベルで増加し続けた。示されるデータは、試験終了時（３週間）の脛骨−大腿骨におけるベースラインからのＢＭＣの変化率を表す。全ての処置は、ベースラインと比較してわずか−３．５％しか減少しなかったビヒクル処置群と比較して、ＢＭＣの有意な増加をもたらした。ベースラインと比較して、Ｓｃｌ−Ａｂで処置した動物はＢＭＣが２７％増加し、Ｄｋｋ１−ＡｂではＢＭＣが１３％増加し、組み合わせではＢＭＣが５１％増加し、１３Ｃ７−１１Ｈ１０ではＢＭＣが４８％増加した。組み合わせ処置またはＢｉｓｐ−Ａｂ処置によって誘導された腰椎および大腿骨−脛骨の双方におけるＢＭＣおよびＢＭＤの増加は、Ｓｃｌ−Ａｂ単独またはＤｋｋ１−Ａｂ単独よりも有意に大きかった。

骨量および骨強度：
ＤＫＫ１−Ａｂは、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋４７％）、Ｔｂ．Ｎ（＋３０％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋２３％）を有意に増加させたが、Ｔｂ．Ｔｈ（＋１３％）は有意に増加させなかった。ＤＫＫ１−Ａｂは、ビヒクルと比較して、骨幹Ｃｔ．Ａｒ（＋３％）およびＣＳＭＩ（＋１％）に有意な影響を与えなかった。大腿骨骨幹の曲げ強度は、ＤＫＫ１−Ａｂ処置による影響を受けなかった。

Ｓｃｌ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋７６％）、Ｔｂ．Ｎ（＋２１％）、Ｔｂ．Ｔｈ（＋７１％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋４７％）を有意に増加させた。Ｓｃｌ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、Ｃｔ．Ａｒ（＋２４％）を有意に増加させたが、ＣＳＭＩ（＋２２％）は有意に増加させなかった。Ｓｃｌ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、大腿骨骨幹最大負荷（＋２９％）および剛性（＋２４％）を有意に増加させた。

組み合わせは、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋２７８％）、Ｔｂ．Ｎ（＋６４％）、Ｔｂ．Ｔｈ（＋１７５％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋１４９％）を有意に増加させた。組み合わせは、ビヒクルと比較して、骨幹Ｃｔ．Ａｒ（＋３７％）およびＣＳＭＩ（＋４４％）を有意に増加させた。組み合わせは、ビヒクルと比較して、大腿骨骨幹軸最大負荷（＋４７％）および剛性（＋４６％）を有意に増加させた。組み合わせ群におけるこれら全てのパラメータの平均値は、Ｓｃｌ−Ａｂ（ＣＳＭＩを除く）単独群およびＤＫＫ１−Ａｂ単独群で観察されたものよりも有意に高かった。

組み合わせと同様に、１３Ｃ７−１１Ｈ１０は、ビヒクルと比較して、遠位大腿骨ＢＶ／ＴＶ（＋２２８％）、Ｔｂ．Ｎ（＋５７％）、Ｔｂ．Ｔｈ（＋１５２％）、およびＴｂ．ｖＢＭＤ（＋１２９％）を有意に増加させた。１３Ｃ７−１１Ｈ１０は、ビヒクルと比較して、骨幹Ｃｔ．Ａｒ（＋３５％）およびＣＳＭＩ（＋３９％）を有意に増加させた。１３Ｃ７−１１Ｈ１０は、ビヒクルと比較して、大腿骨骨幹最大負荷（＋４５％）および剛性（＋４４％）を有意に増加させた。１３Ｃ７−１１Ｈ１０群におけるこれら全てのパラメータの平均値は、Ｓｃｌ−Ａｂ（ＣＳＭＩを除く）単独群およびＤＫＫ１−Ａｂ単独群で観察されたものよりも有意に高かった。

この実施例による結果は、図７〜１１にまとめる。組み合わせおよび１３Ｃ７−１１Ｈ１０の両処置は、いずれかの単剤療法と比較して、骨量および骨強度のより大きい増加をもたらした。これらの結果は、組み合わせおよび１３Ｃ７−１１Ｈ１０の両処置が、この無処置のマウスモデルの骨量および骨強度の向上に相乗効果を与えることを明確に示した。

実施例１３
ラット大腿骨閉鎖骨折モデルにおける骨折した大腿骨の骨形成の刺激および骨強度の増加。
試験計画：生後１２週間の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（平均体重４２８ｇ）に、以前に報告されているように片側大腿骨骨幹中央部閉鎖骨折を起こした（Ｂｏｎｎａｒｅｎｓ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ １９８４；２：９７−１０１）。簡潔に述べると、１８ゲージの注射針を大腿顆を通して髄管内に挿入し、これを内固定とした。次に、大腿部の前（外側）面にかかる鈍的衝撃によって大腿骨に横骨折を起こした。骨折１日後、動物（ｎ＝１８／群）に、生理食塩水ビヒクル、Ｓｃｌ−Ａｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＫＫ１−Ａｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）、またはＤＶＤ−Ｉｇ １３Ｃ７−１１Ｈ１０、６．１４７−２ｘ−Ａｂ５、６．３７−ＡｂＬ−Ａｂ２３、Ａｂ５Ｋ−ＡｂＳ−６．１４７、６．１４７−ＡｂＬ−２７Ｈ６、もしくは８Ｇ２−ＡｂＬ−６．３７．５（各図に示す）（３４．３７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを週２回皮下注射した。骨折５週間後、動物を安楽死させ、骨折および非骨折対側（ＣＬ）大腿骨を密度計測および生体力学のために採取した。本試験は、Ａｍｇｅｎ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。

ＤＸＡによる密度計測：密度計測分析前に骨折大腿部から髄内ピンを取り出した。二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ；ＧＥ Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ ＩＩ）により大腿骨をエクスビボでスキャンし、骨折大腿骨の中央３０％または対側無傷大腿骨全体で分析を実施して、面積骨塩量（ＢＭＣ）を測定した。

ｐＱＣＴによる密度計測：両大腿骨は、分解能１００μｍでの末梢定量的コンピュータ断層撮影（ｐＱＣＴ；Ｓｔｒａｔｅｃ ＸＣＴ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＡ＋；Ｇｅｒｍａｎｙ）でもスキャンした。骨折大腿骨仮骨の中央、および対側大腿骨（ＢＭＣ）の中間点の３つの０．５ｍｍ切片に分析を実施した（ＢＭＣ）。

生体力学：各大腿骨の近位端および遠位端をＳｌｏｗ Ｓｅｔ Ｌａｂ Ｐｌａｓｔｅｒ（Ｈｅｒａｅｕｓ−Ｋｕｌｚｅｒ）に埋め込んで、１４〜１６ｍｍの長さの中央領域を分離した。これらの骨折大腿骨およびＣＬ大腿骨の角変位速度２．０度／秒での破断ねじりを試験した（ＭＴＳ ８５８ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏｎｉｘ ＩＩ，ＭＴＳ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）。最大トルク（Ｎ−ｍｍ）、破断エネルギー（Ｎ−ｍｍ．ｄｅｇ）、およびねじり剛性（Ｎ／ｍｍ）を含む骨強度パラメータを評価した。

統計分析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．５．０１）を使用して、対応のない両側ｔ検定により、ｐ＜０．０５を有意とみなし、群間の統計的相違を判定した。

結果：骨折大腿骨：Ｓｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂは、ビヒクル対照と比較したＤＸＡ（＋１７〜２１％）およびｐＱＣＴ（＋１３〜２２％）によるＢＭＣの有意な増加によって示されるように、骨折仮骨の骨量および骨強度で同様の改善を示した。これらの骨量の増加は、ビヒクル対照と比較して４２〜４４％高い骨折大腿骨の最大トルクに関連付けられた。

ＤＶＤ−Ｉｇは、骨折仮骨の骨量および骨強度をＳｃｌ−Ａｂ単独またはＤＫＫ１−Ａｂ単独よりも高いレベルまで大きく向上させた。ビヒクルと比較して、ＤＶＤ−Ｉｇ群では骨折仮骨ＢＭＣがＤＸＡで４４％高く、ｐＱＣＴで３２％高かった。この骨量の向上は、ビヒクルと比較したＤＶＤ−Ｉｇにおける最大トルクの８５％の増加に関連付けられた。さらに、ＤＸＡ ＢＭＣは、Ｓｃｌ−Ａｂ単独群またはＤＫＫ１−Ａｂ単独群と比較して、ＤＶＤ−Ｉｇ群で有意に高かった。

非骨折対側大腿骨：ＤＫＫ１−Ａｂは、非骨折対側大腿骨における骨幹の骨量および骨強度に有意な影響を与えなかった。しかしながら、Ｓｃｌ−Ａｂは、ビヒクルと比較して、骨幹中央部皮質厚を１３％、最大トルクを２２％有意に増加させた。ＤＶＤ−Ｉｇは、ビヒクルと比較して、対側大腿骨皮質骨厚を１３％、最大トルクを２０％有意に増加させ、この変化は、Ｓｃｌ−Ａｂ群の変化と類似していた。データは、平均±標準偏差として表し、＊はビヒクルに対してｐ＜０．０５とする。

本実施例の結果は、図１２〜１６にまとめる。

実施例１４
Ｌｒｐ６／スクレロスチンおよびＬｒｐ６／Ｄｋｋ１アルファスクリーンアッセイ
アルファスクリーン競合アッセイを原則的にＳｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ．ａｌ ２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（１２）：１５５６−１５６１に記載されている通りに実施した。３８４ウェルＧｒｅｉｎｅｒマイクロタイタープレート中で親およびＤＶＤ−Ｉｇタンパク質をアッセイ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で連続希釈することにより、用量反応曲線を生成した。トレーサー量の社内で精製した化学的にビオチン化された組換えヒトまたはラットスクレロスチン（最大１．５ｎＭ）をこのマイクロタイタープレートに添加した後、マウスＬＲＰ６−ｈｉｓまたはｒｈＬＲＰ６−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（最大６〜１２ｎＭ）のいずれかと、アルファスクリーン「ドナー」ストレプトアビジンおよび「アクセプター」プロテインＡビーズ（各１０ｍｇ／ｍＬ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）とを含む混合物を添加した。次にこのマイクロタイタープレートを密封し、室温で一晩インキュベートした。Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、６８０ｎｍでの励起および５２０〜６２０ｎｍでの放射を用いて、化学発光シグナルの減少として複合体形成の阻害を測定した。結果を図１９にまとめる。

Claims (98)

1. ポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記ポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に特異的に結合する、結合分子。
2. ＶＨ１およびＶＨ２が、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合分子。
3. ポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記ポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に特異的に結合する結合分子。
4. ＶＬ１およびＶＬ２が、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の結合分子。
5. （Ｘ２）ｎが不在である、請求項１または３に記載の結合分子。
6. 第１および第２のポリペプチド鎖を含む結合分子であって、前記第１のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは、存在するか、または不在であり、前記第２のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に特異的に結合する結合分子。
7. 前記ＶＨ１およびＶＨ２重鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１およびＶＬ２軽鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の結合分子。
8. （Ｘ１）ｎが、配列番号４１５〜４８２からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
9. 前記結合分子が、２つの第１のポリペプチド鎖および２つの第２のポリペプチド鎖を含む、請求項６に記載の結合分子。
10. 前記Ｆｃ領域が、天然配列Ｆｃ領域および変異配列Ｆｃ領域からなる群から選択される、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
11. 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ由来のＦｃ領域からなる群から選択される、請求項１０に記載の結合分子。
12. 前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ１と前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ１とが、同じ親抗体またはその抗原結合部分に由来する、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
13. 前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ１と前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ１とが、異なる親抗体またはその抗原結合部分に由来する、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
14. 前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ２と前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ２とが、同じ親抗体またはその抗原結合部分に由来する、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
15. 前記第１のポリペプチド鎖の前記ＶＨ２と前記第２のポリペプチド鎖の前記ＶＬ２とが、異なる親抗体またはその抗原結合部分に由来する、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
16. 前記リンカーがＣＨ１でないことを条件とする、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
17. 前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する力価とは異なる力価で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
18. 前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する親和性とは異なる親和性で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
19. 前記第１の親抗体またはその抗原結合部分、および前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト抗体、およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
20. 前記第１の親抗体またはその抗原結合部分、および前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結する２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖抗体、およびダイアボディからなる群から選択される、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
21. 前記結合分子が、前記第１の親抗体もしくはその抗原結合部分、または前記第２の親抗体もしくはその抗原結合部分によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する、請求項１、３、または６に記載の結合分子。
22. 前記所望の特性が１つ以上の抗体パラメータから選択される、請求項２１に記載の結合分子。
23. 前記抗体パラメータが、抗原特異性、抗原に対する親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、およびオーソロガス抗原結合からなる群から選択される、請求項２１に記載の結合分子。
24. ４つのポリペプチド鎖を含む、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に結合する結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、ＶＨ１およびＶＨ２重鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１およびＶＬ２軽鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、結合分子。
25. 前記リンカーがＣＨ１でないことを条件とする、請求項２４に記載の結合分子。
26. ４つのポリペプチド鎖を含む、スクレロスチンおよびＤＫＫ−１の双方に結合する結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、
    配列番号１８および２０、２２および２４、２６および２８、３０および３２、３４および３６、３８および４０、４２および４４、４６および４８、５０および５２、５４および７６、５６および７２、５８および６０、６２および６４、６６および６８、７０および７２、７４および７６、７８および８０、８２および８４、８６および８８、９０および９２、４８６および４８８、４９０および４９２、ならびに４９４および４９６からなる群から選択されるＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合を含む、結合分子。
27. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号１８および２０である、請求項２６に記載の結合分子。
28. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号２２および２４である、請求項２６に記載の結合分子。
29. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号２６および２８である、請求項２６に記載の結合分子。
30. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号３０および３２である、請求項２６に記載の結合分子。
31. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号３４および３６である、請求項２６に記載の結合分子。
32. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号３８および４０である、請求項２６に記載の結合分子。
33. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号４２および４４である、請求項２６に記載の結合分子。
34. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号４６および４８である、請求項２６に記載の結合分子。
35. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５０および５２である、請求項２６に記載の結合分子。
36. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５４および７６である、請求項２６に記載の結合分子。
37. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５６および７２である、請求項２６に記載の結合分子。
38. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号５８および６０である、請求項２６に記載の結合分子。
39. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号６２および６４である、請求項２６に記載の結合分子。
40. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号６６および６８である、請求項２６に記載の結合分子。
41. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号７０および７２である、請求項２６に記載の結合分子。
42. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号７４および７６である、請求項２６に記載の結合分子。
43. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号７８および８０である、請求項２６に記載の結合分子。
44. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号８２および８４である、請求項２６に記載の結合分子。
45. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号８６および８８である、請求項２６に記載の結合分子。
46. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎとの対合が、配列番号９０および９２である、請求項２６に記載の結合分子。
47. 前記スクレロスチンバインダーＶＨが、配列番号：
    ａ）１００、１０１、１０２、
    ｂ）１０８、１０９、１１０、
    ｃ）１１６、１１７、１１８、
    ｄ）１２４、１２５、１２６、
    ｅ）１３２、１３３、１３４、
    ｆ）１４０、１４１、１４２、
    ｇ）１４８、１４９、１５０、
    ｈ）１５６、１５７、１５８、
    ｉ）１６４、１６５、１６６、
    ｊ）１７２、１７３、１７４、
    ｋ）１８０、１８１、１８２、
    ｌ）１８８、１８９、１９０、
    ｍ）１９６、１９７、１９８、
    ｎ）２０４、２０５、２０６、
    ｏ）２１２、２１３、２１４、および
    ｐ）２２０、２２１、２２２、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
    前記ＤＫＫ１バインダーＶＨが、配列番号：
    ａ）２２８、２２９、２３０、
    ｂ）２３６、２３７、２３８、
    ｃ）２４４、２４５、２４６、
    ｄ）２５２、２５３、２５４、
    ｅ）２６０、２６１、２６２、
    ｆ）２６８、２６９、２７０、
    ｇ）２７６、２７７、２７８、
    ｈ）２８４、２８５、２８６、
    ｉ）２９２、２９３、２９４、
    ｊ）３００、３０１、３０２、
    ｋ）３０８、３０９、３１０、
    ｌ）３１６、３１７、３１８、
    ｍ）３２４、３２５、３２６、
    ｎ）３３２、３３３、３３４、
    ｏ）３４０、３４１、３４２、
    ｐ）３４８、３４９、３５０、
    ｑ）３５６、３５７、３５８、
    ｒ）３６４、３６５、３６６、
    ｓ）３７２、３７３、３７４、
    ｔ）３８０、３８１、３８２、
    ｕ）３８８、３８９、３９０、
    ｖ）３９６、３９７、３９８、
    ｗ）４０４、４０５、４０６、および
    ｘ）４１２、４１３、４１４、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む、請求項１、３、および６に記載の結合分子。
48. 前記スクレロスチンバインダーＶＬが、配列番号：
    ａ）９７、９８、９９、
    ｂ）１０５、１０６、１０７、
    ｃ）１１３、１１４、１１５、
    ｄ）１２１、１２２、１２３、
    ｅ）１２９、１３０、１３１、
    ｆ）１３７、１３８、１３９、
    ｇ）１４５、１４６、１４７、
    ｈ）１５３、１５４、１５５、
    ｉ）１６１、１６２、１６３、
    ｊ）１６９、１７０、１７１、
    ｋ）１７７、１７８、１７９、
    ｌ）１８５、１８６、１８７、
    ｍ）１９３、１９４、１９５、
    ｎ）２０１、２０２、２０３、
    ｏ）２０９、２１０、２１１、および
    ｐ）２１７、２１８、２１９、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
    前記ＤＫＫ１バインダーＶＬが、配列番号：
    ｂ）２２５、２２６、２２７、
    ｃ）２３３、２３４、２３５、
    ｄ）２４１、２４２、２４３、
    ｅ）２４９、２５０、２５１、
    ｆ）２５７、２５８、２５９、
    ｇ）２６５、２６６、２６７、
    ｈ）２７３、２７４、２７５、
    ｉ）２８１、２８２、２８３、
    ｊ）２８９、２９０、２９１、
    ｋ）２９７、２９８、２９９、
    ｌ）３０５、３０６、３０７、
    ｍ）３１３、３１４、３１５、
    ｎ）３２１、３２２、３２３、
    ｏ）３２９、３３０、３３１、
    ｐ）３３７、３３８、３３９、
    ｑ）３４５、３４６、３４７、
    ｒ）３５３、３５４、３５５、
    ｓ）３６１、３６２、３６３、
    ｔ）３６９、３７０、３７１、
    ｕ）３７７、３７８、３７９、
    ｖ）３８５、３８６、３８７、
    ｗ）３９３、３９４、３９５、
    ｘ）４０１、４０２、４０３、および
    ｙ）４０９、４１０、４１１、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む、請求項１、３、および６に記載の結合分子。
49. 前記スクレロスチンバインダーＶＨが、配列番号：
    ａ）１００、１０１、１０２、
    ｂ）１０８、１０９、１１０、
    ｃ）１１６、１１７、１１８、
    ｄ）１２４、１２５、１２６、
    ｅ）１３２、１３３、１３４、
    ｆ）１４０、１４１、１４２、
    ｇ）１４８、１４９、１５０、
    ｈ）１５６、１５７、１５８、
    ｉ）１６４、１６５、１６６、
    ｊ）１７２、１７３、１７４、
    ｋ）１８０、１８１、１８２、
    ｌ）１８８、１８９、１９０、
    ｍ）１９６、１９７、１９８、
    ｎ）２０４、２０５、２０６、
    ｏ）２１２、２１３、２１４、および
    ｐ）２２０、２２１、２２２、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
    前記ＤＫＫ１バインダーＶＨが、配列番号：
    ａ）２２８、２２９、２３０、
    ｂ）２３６、２３７、２３８、
    ｃ）２４４、２４５、２４６、
    ｄ）２５２、２５３、２５４、
    ｅ）２６０、２６１、２６２、
    ｆ）２６８、２６９、２７０、
    ｇ）２７６、２７７、２７８、
    ｈ）２８４、２８５、２８６、
    ｉ）２９２、２９３、２９４、
    ｊ）３００、３０１、３０２、
    ｋ）３０８、３０９、３１０、
    ｌ）３１６、３１７、３１８、
    ｍ）３２４、３２５、３２６、
    ｎ）３３２、３３３、３３４、
    ｏ）３４０、３４１、３４２、
    ｐ）３４８、３４９、３５０、
    ｑ）３５６、３５７、３５８、
    ｒ）３６４、３６５、３６６、
    ｓ）３７２、３７３、３７４、
    ｔ）３８０、３８１、３８２、
    ｕ）３８８、３８９、３９０、
    ｖ）３９６、３９７、３９８、
    ｗ）４０４、４０５、４０６、および
    ｘ）４１２、４１３、４１４、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
    前記スクレロスチンバインダーＶＬが、配列番号：
    ａ）９７、９８、９９、
    ｂ）１０５、１０６、１０７、
    ｃ）１１３、１１４、１１５、
    ｄ）１２１、１２２、１２３、
    ｅ）１２９、１３０、１３１、
    ｆ）１３７、１３８、１３９、
    ｇ）１４５、１４６、１４７、
    ｈ）１５３、１５４、１５５、
    ｉ）１６１、１６２、１６３、
    ｊ）１６９、１７０、１７１、
    ｋ）１７７、１７８、１７９、
    ｌ）１８５、１８６、１８７、
    ｍ）１９３、１９４、１９５、
    ｎ）２０１、２０２、２０３、
    ｏ）２０９、２１０、２１１、および
    ｐ）２１７、２１８、２１９、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含み、
    前記ＤＫＫ１バインダーＶＬが、配列番号：
    ａ）２２５、２２６、２２７、
    ｂ）２３３、２３４、２３５、
    ｃ）２４１、２４２、２４３、
    ｄ）２４９、２５０、２５１、
    ｅ）２５７、２５８、２５９、
    ｆ）２６５、２６６、２６７、
    ｇ）２７３、２７４、２７５、
    ｈ）２８１、２８２、２８３、
    ｉ）２８９、２９０、２９１、
    ｊ）２９７、２９８、２９９、
    ｋ）３０５、３０６、３０７、
    ｌ）３１３、３１４、３１５、
    ｍ）３２１、３２２、３２３、
    ｎ）３２９、３３０、３３１、
    ｏ）３３７、３３８、３３９、
    ｐ）３４５、３４６、３４７、
    ｑ）３５３、３５４、３５５、
    ｒ）３６１、３６２、３６３、
    ｓ）３６９、３７０、３７１、
    ｔ）３７７、３７８、３７９、
    ｕ）３８５、３８６、３８７、
    ｖ）３９３、３９４、３９５、
    ｗ）４０１、４０２、４０３、および
    ｘ）４０９、４１０、４１１、からなる群から選択される３つのＣＤＲを含む、請求項１、３、および６に記載の結合分子。
50. ４つのポリペプチド鎖を含む結合分子であって、第１および第３のポリペプチド鎖が、ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＨ１は、第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、第２および第４のポリペプチド鎖が、ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、式中、ＶＬ１は、第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在であり、前記結合分子が、３つのＶＨ１ ＣＤＲと、３つのＶＨ２ ＣＤＲと、３つのＶＬ１ ＣＤＲと、３つのＶＬ２ ＣＤＲとを含み、前記対合するＶＨ１とＶＬ１とのＣＤＲ、および対合するＶＨ２とＶＬ２とのＣＤＲが、配列番号：
    ａ）９７〜１０２、
    ｂ）１０５〜１１０、
    ｃ）１１３〜１１８、
    ｄ）１２１〜１２６、
    ｅ）１２９〜１３４、
    ｆ）１３７〜１４２、
    ｇ）１４５〜１５０、
    ｈ）１５３〜１５８、
    ｉ）１６１〜１６６、
    ｊ）１６９〜１７４、
    ｋ）１７７〜１８２、
    ｌ）１８５〜１９０、
    ｍ）１９３〜１９８、
    ｎ）２０１〜２０６、
    ｏ）２０９〜２１４、
    ｐ）２１７〜２２２、
    または配列番号：
    ｂ）２２５〜２３０、
    ｃ）２３３〜２３８、
    ｄ）２４１〜２４６、
    ｅ）２４９〜２５４、
    ｆ）２５７〜２６２、
    ｇ）２６５〜２７０、
    ｈ）２７３〜２７８、
    ｉ）２８１〜２８６、
    ｊ）２８９〜２９４、
    ｋ）２９７〜３０２、
    ｌ）３０５〜３１０、
    ｍ）３１３〜３１８、
    ｎ）３２１〜３２６、
    ｏ）３２９〜３３４、
    ｐ）３３７〜３４２、
    ｑ）３４５〜３５０、
    ｒ）３５３〜３５８、
    ｓ）３６１〜３６６、
    ｔ）３６９〜３７４、
    ｕ）３７７〜３８２、
    ｖ）３８５〜３９０、
    ｗ）３９３〜３９８、
    ｘ）４０１〜４０６、
    ｙ）４０９〜４１４からなる群から選択される、結合分子。
51. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１６１〜１６３であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１６４〜１６６であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０である、請求項５０に記載の結合分子。
52. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１６１〜１６３であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１６４〜１６６である、請求項５０に記載の結合分子。
53. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１５３〜１５５であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１５６〜１５８であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０である、請求項５０に記載の結合分子。
54. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１５３〜１５５であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１５６〜１５８である、請求項５０に記載の結合分子。
55. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１２１〜１２３であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１２４〜１２６である、請求項５０に記載の結合分子。
56. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１７７〜１７９であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１８０〜１８２である、請求項５０に記載の結合分子。
57. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号９７〜９９であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１００〜１０２である、請求項５０に記載の結合分子。
58. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、請求項５０に記載の結合分子。
59. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号９７〜９９であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１００〜１０２であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４である、請求項５０に記載の結合分子。
60. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、請求項５０に記載の結合分子。
61. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、請求項５０に記載の結合分子。
62. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号３８５〜３８７であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号３８８〜３９０である、請求項５０に記載の結合分子。
63. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号４０９〜４１１であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号４１２〜４１４である、請求項５０に記載の結合分子。
64. 前記ＶＬ１ ＣＤＲが配列番号３６９〜３７１であり、前記ＶＨ１ ＣＤＲが配列番号３７２〜３７４であり、前記ＶＬ２ ＣＤＲが配列番号１０５〜１０７であり、ＶＨ２ ＣＤＲが配列番号１０８〜１１０である、請求項５０に記載の結合分子。
65. 前記（Ｘ１）ｎが、配列番号４１５〜４８４からなる群から選択される、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
66. 前記（Ｘ１）ｎが、配列番号４４０、４４１、４３７、４３８、４３１、４３２、４８３、および４８４からなる群から選択される、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
67. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４０である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
68. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４１である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
69. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３７である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
70. 前記ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖の前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３８である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
71. 前記ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４０である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
72. 前記ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４４１である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
73. 前記ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４８３である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
74. 前記ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４８４である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
75. 前記ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３１である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
76. 前記ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎの前記（Ｘ１）ｎが配列番号４３２である、請求項５０〜６４に記載の結合分子。
77. 前記（Ｘ１）ｎがＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖とＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎ鎖とで異なる、請求項１、３、６、２４、２６、および５０に記載の結合分子。
78. スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に結合する結合分子を生成するための方法であって、（ａ）スクレロスチンまたはＤＫＫ−１に結合可能な第１の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、（ｂ）スクレロスチンまたはＤＫＫ−１に結合可能な第２の親抗体またはその抗原結合部分を得るステップと、（ｃ）ＶＨ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＨ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む、第１および第３のポリペプチド鎖を構築するステップであって、式中、ＶＨ１は、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の重鎖可変ドメインであり、ＶＨ２は、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第２の重鎖可変ドメインであり、Ｃは、重鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、ＣＨ１ではないという条件でリンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域であり、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、ステップと、（ｄ）ＶＬ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＬ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含む第２および第４のポリペプチド鎖を構築するステップであって、式中、ＶＬ１は、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分に由来する第１の軽鎖可変ドメインであり、ＶＬ２は、前記第２の親抗体またはその抗原結合に由来する第２の軽鎖可変ドメインであり、Ｃは、軽鎖定常ドメインであり、（Ｘ１）ｎは、リンカーであり、前記（Ｘ１）ｎは存在するか、または不在であり、（Ｘ２）ｎは、Ｆｃ領域を含まず、前記（Ｘ２）ｎは存在するか、または不在である、ステップと、（ｅ）スクレロスチンおよびＤＫＫ−１に結合する結合分子が生成されるように、前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を発現させるステップと、を含む、方法。
79. 前記ＶＨ１およびＶＨ２重鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９５、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、１６０、１６８、１７６、１８４、１９２、２００、２０８、および２１６、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、３４４、３５２、３６０、３６８、３７６、３８４、３９２、４００、および４０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１およびＶＬ２軽鎖可変ドメインが、スクレロスチンバインダー配列番号９４、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、１５９、１６７、１７５、１８３、１９１、１９９、２０７、および２１５、またはＤＫＫ−１バインダー配列番号２２３、２３１、２３９、２４７、２５５、２６３、２７１、２７９、２８７、２９５、３０３、３１１、３１９、３２７、３３５、３４３、３５１、３５９、３６７、３７５、３８３、３９１、３９９、および４０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載の方法。
80. 前記第１の親抗体またはその抗原結合部分それぞれと、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分それぞれとが、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト抗体、およびヒト化抗体からなる群から別個に選択される、請求項７８に記載の方法。
81. 前記第１の親抗体またはその抗原結合部分それぞれと、前記第２の親抗体またはその抗原結合部分それぞれとが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結する２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖抗体、およびダイアボディからなる群から別個に選択される、請求項７８に記載の方法。
82. 前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が、結合分子によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する、請求項７８に記載の方法。
83. 前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が、結合分子によって示される少なくとも１つの所望の特性を有する、請求項７８に記載の方法。
84. Ｆｃ領域が、天然配列Ｆｃ領域および変異配列Ｆｃ領域からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
85. Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ由来のＦｃ領域からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
86. 前記所望の特性が１つ以上の抗体パラメータから選択される、請求項７８に記載の方法。
87. 前記所望の特性が１つ以上の抗体パラメータから選択される、請求項７８に記載の方法。
88. 前記抗体パラメータが、抗原特異性、抗原に対する親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、およびオーソロガス抗原結合からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
89. 前記抗体パラメータが、抗原特異性、抗原に対する親和性、力価、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解性、生産効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、およびオーソロガス抗原結合からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
90. 前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する親和性とは異なる親和性で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、請求項７８に記載の方法。
91. 前記第２の親抗体またはその抗原結合部分が前記第２の抗原に結合する力価とは異なる力価で、前記第１の親抗体またはその抗原結合部分が前記第１の抗原に結合する、請求項７８に記載の方法。
92. 前記リンカーがＣＨ１でないことを条件とする、請求項７８に記載の方法。
93. 請求項１〜７７のいずれかに記載の結合分子を含む、薬学的組成物。
94. 薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体のうちの１つ以上と組み合わせた、請求項１〜７７のいずれかに記載の結合分子。
95. 骨障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜７７のいずれかに記載の結合分子を投与することを含む、方法。
96. 骨折修復を促進する方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜７７のいずれかに記載の結合分子を投与することを含む、方法。
97. 骨密度を増加させる方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜７７のいずれかに記載の結合分子を投与することを含む、方法。
98. 骨強度を増加させる方法であって、それを必要とする患者に請求項１〜７７のいずれかに記載の結合分子を投与することを含む、方法。

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