MX2013010011A

MX2013010011A - Agentes de unión biespecífica.

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Publication number: MX2013010011A
Application number: MX2013010011A
Authority: MX
Inventors: Monica Florio; Taruna Arora; Christopher J R Paszty; William G Richards
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2014-10-24
Also published as: UY33931A; US9133272B2; CN103649118A; AU2012223358A1; CA2828000A1; AR085600A1; WO2012118903A3; EP2681242A2; JP2014509588A; EP2681242B1; TW201247708A; US20130164293A1; WO2012118903A2; EA201391248A1

Abstract

La invención se refiere a agentes de unión anti-esclerostina/anti- DKK1 biespecíficos y combinaciones de agentes de unión anti-esclerostina y anti-DKK1, y métodos de tratamiento relacionados.

Description

AGENTES DE UNIÓN BIESPECÍFICA Referencia cruzada a la solicitud relacionada Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente estadounidense provisoria 61 089 presentada el 1 o de marzo de 201 1 y a la solicitud de patente estadounidense provisoria 61 presentada el 5 de mayo de 201 1 Esta solicitud contiene una lista de secuencias en código ASCI I en archivo que se presenta tanto como copia de lectura en computadora así como copia en papel tal como lo requiere 37 Sección 1 y 1 la cual se incorpora por referencia en su totalidad en la presente El nombre del archivo creado el 29 de febrero de 2012 es y su tamaño es de 435 Antecedentes de la invención Campo de la invención La invención se refiere a los agentes de unión biespecífica y a las combinaciones de agentes de unión así como a los métodos de tratamiento Antecedentes de la invención Durante la vida de un sujeto se producen dos o tres etapas distintas de cambios en la masa ósea West 77 991 La primera etapa se produce tanto en hombres como en mujeres y continúa hasta llegar a un pico de masa Esta primera etapa se logra mediante el crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondrial y el crecimiento radial debido a una tasa de aposición La segunda etapa comienza alrededor de los 30 años en el caso del hueso trabecular planos tal como vértebras y y alrededor de los 40 años en el hueso cortical ejemplo los huesos largos que se encuentran en las y continúa hasta la Esta etapa se caracteriza por una lenta pérdida ósea y ocurre tanto en hombres como en En las también se produce una tercera etapa de pérdida muy probablemente debido a la deficiencia de estrógenos en la Solamente durante esta las mujeres pueden perder masa ósea adicional del hueso cortical y del compartimiento trabecular La pérdida del contenido mineral óseo puede deberse a una amplia variedad de afecciones y puede derivar en problemas médicos Por la osteoporosis es una enfermedad debilitante en los seres humanos y se caracteriza por marcadas disminuciones en la masa ósea del esqueleto y la densidad deterioro estructural del incluso deterioro de la microarquitectura ósea y aumentos correspondientes en la fragilidad de los huesos disminuciones en la fortaleza y susceptibilidad a fracturas en individuos con esta La osteoporosis en los seres humanos generalmente está precedida de osteopenia clínica mineral ósea mayor que una desviación estándar pero menor que desviaciones estándar por debajo del valor medio para el hueso de un adulto y afecta a aproximadamente 25 millones de personas en los Estados En los Estados Unidos otros 78 millones de pacientes han sido diagnosticados con osteoporosis clínica como contenido mineral óseo mayor que desviaciones estándar por debajo del que se encuentra en el hueso adulto joven La frecuencia de la osteoporosis en la población humana aumenta con la En la raza la osteoporosis predomina en las en los Estados comprenden un de los pacientes con En los la fragilidad aumentada y la susceptibilidad a fracturas del hueso esquelético se agrava por un mayor riesgo de caídas accidentales en esta Las fracturas de muñeca y vertebras se encuentran entre las lesiones más comunes asociadas a la En las fracturas de cadera son extremadamente incómodas y costosas para los y para las mujeres están correlacionadas con altas tasas de mortalidad y Si bien la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a la disminución de masa pocos de los tratamientos actualmente disponibles para trastornos esqueléticos pueden aumentar la densidad ósea de los y la mayoría de los tratamientos actualmente disponibles operan principalmente mediante la inhibición de una resorción ósea incrementada en lugar de estimular nueva formación Actualmente el estrógeno se indica para retrasar la pérdida Sin existe cierta controversia respecto de si los pacientes obtienen algún tipo de beneficio a largo plazo y si el estrógeno tiene algún tipo de efecto sobre pacientes mayores de 75 se cree que el uso de estrógenos aumenta el riesgo de cáncer de mama y Para las mujeres en la también se ha sugerido el uso de osteocalcina con vitamina K o altas dosis de calcio en la con o sin vitamina Sin las dosis altas de calcio frecuentemente tienen efectos colaterales gastrointestinales no y debe efectuarse un seguimiento continuo de los niveles de calcio en suero y urinario Khosla y Clínica Mayo Otros enfoques terapéuticos actuales de la osteoporosis incluyen bifosfonatos hormona calcimiméticos esteroides sales de lantano y estroncio y fluoruro de Sin esas terapias frecuentemente están asociadas a efectos colaterales Khosla y La producto del gen no se encuentra presente en la enfermedad ósea que presenta sobrecrecimiento de los huesos y huesos de alta densidad et 2001 Balemans et Hum 2001 Los inhibidores de esclerostina han demostrado que aumentan la tasa de y por tanto la densidad mineral ósea et J Bone Miner 201 0 publicado electrónicamente antes de su se ha demostrado que el está implicado en la regulación de la formación en particular en la reparación de fracturas y su rol en varias otras enfermedades asociadas a la pérdida ósea cáncer y et J 201 0 Gavriatolpoulou et Expert 2009 es una proteína secretada que participa en la inducción de la cabeza embrionaria y antagoniza Wnt et Nature 391 Se ha descrito la secuencia de aminoácidos de humana y los nucleótidos que la codifican de Solicitud de Patente Publicada 2005006991 Krupnick et Gene 301 Se consideraba que la expresión de en humanos estaba restringida a la sugiriendo un rol para en el desarrollo de los embriones et Alien y de Patente Publicada de describen ensayos relacionados con la interacción entre H o LRP6 con Los anticuerpos que unen fueron descritos en las patentes y solicitudes de patentes mencionadas anteriormente y en la Solicitud de Patentes Publicadas 200500791 73 y El humano es un miembro de una familia de genes Dickkopf que incluye y Dkk4 et Si bien y han demostrado suprimir la inducción del eje secundario inducido por Wnt en embriones de ninguno de los dos bloquea la inducción del eje generada por Xenopus Dishevelled o lo que sugiere que su actividad inhibidora de Wnt se encuentra en una posición anterior a Frizzled en la ruta de señalización de Wnt et Se ha sugerido que podría tener un efecto inhibitorio en la formación lo que los convierte en potenciales objetivos para la prevención o el tratamiento de la osteoporosis y Boyden et J Breve descripción de la invención En la presente memoria se dan a conocer nuevos inhibidores que son efectivos en el tratamiento de las condiciones que requieren una formación ósea por la reparación de fracturas o la pérdida ósea asociada con condiciones tales como el mieloma se dan a conocer en la presente memoria agentes multiespecíficos que aumentan el anabolismo óseo que incluyen combinaciones de inhibidores de y Estas combinaciones pueden ser utilizadas para el tratamiento por la acelerando la curación de y cualesquiera condiciones que requieran un aumento en la velocidad de formación En los inhibidores de y de la esclerostina pueden ser dos inhibidores por un anticuerpo y un anticuerpo De manera los inhibidores de y de esclerostina pueden ser una única entidad Algunos ejemplos no limitativos incluyen las uniones moleculares tales como las inmunoglobulinas anticuerpos y cuerpos de unión En un aspecto de esta realización el paciente adecuado para el tratamiento con las moléculas de la invención es uno que sufre cáncer con metástasis en el y en otro el paciente es uno que sufre de mieloma En un aspecto el paciente se selecciona de los pacientes que poseen osteopenia enfermedad de artritis reumatoidea y pérdida ósea debido a la En otras realizaciones ad el paciente se selecciona del grupo de pacientes que poseen daño óseo que puede o no derivar de una pérdida de masa ósea subyacente tal como la que es causada por la osteoporosis o las lesiones osteolíticas asociadas con el cáncer el mieloma Algunos ejem plos no limitativos de dicho daño óseo incluyen los tratamientos los tratamientos las cirug ías de el remplazo de articulaciones remplazo de remplazo de injertos cirug ía ósea cosmética y reparación ósea tal como cu ración de curación de fracturas no consol consolidación retardada de fracturas y reconstrucción Puede administrarse una o más com posiciones durante después del cirugía o reparación En una real se da a conocer una molécu la de unión que consiste de una cadena donde dicha cadena polipeptídica consiste de VH 1 VH 1 es un dom inio variable de cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o una porción de un ión al antígeno en VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o una porción de unión al antígeno en C es un dom inio constante de cadena pesada es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicho se encuentra ya sea presente como donde la molécula de u nión se une de manera específica tanto a la esclerostina como a En otra se da a conocer una molécula de unión que consiste de una cadena pol donde dicha cadena polipeptídica consiste de VL1 VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécu la de unión se une de manera específica tanto a la esclerostina como a En una realización adicional se da a conocer una molécula de unión que consiste de una primera y de u na segunda cadena polipeptídica donde dicha primera cadena polipeptídica consiste de VH 1 donde VH 1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena 1 es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde dicha segunda cadena polipeptídica consiste de VL1 donde VL1 es un primer dom inio variable de cadena ligera obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VL2 es u n segu ndo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de unión donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión se une de manera específica a la esclerostina y a 1 En otra realización se da a conocer u na molécula de u nión que se une tanto a la esclerostina como a 1 la cual consiste de cuatro cadenas donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH 1 VH 1 es un primer dominio variable de cadena VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de unión donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de donde VL1 es un primer dominio variable de cadena VL2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde los dominios variables de cadena pesada VH1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los agentes de unión a esclerostina SEC ID y o los agentes de unión a SEC ID y y donde los dominios variables de cadena ligera VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los agentes de unión a esclerostina SEC ID y o los agentes de unión a SEC ID y Aun en una realización se da a conocer una molécula de unión que se une tanto a la esclerostina como a la cual consiste de cuatro cadenas donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH1 es un primer dominio variable de cadena VH2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de VL1 donde VL1 es un primer dominio variable de cadena VL2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es ün cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión consiste de acoplamientos de VH 1 y VL1 seleccionados del conjunto que consiste SEC I D 18 y 22 y 26 y 30 y 34 y 38 y 42 y 46 y 50 y 54 y 56 y 58 y 62 y 66 y 70 y 74 y 78 y 82 y 86 y y 90 y En otra se da a conocer una molécula de unión que consiste de cuatro cadenas donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH 1 VH 1 es un primer dominio variable de cadena VH2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de VL1 donde VL1 es un primer dominio variable de cadena VL2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión consiste de 3 VH1 3 VH2 3 VL1 CDR y 3 VL2 donde los acoplamientos de VH1 y VL1 y los acoplamientos de VH2 y VL2 se seleccionan del conjunto que consiste de las SEC ID o SEC ID En otra se da a conocer un método para generar una molécula de unión que se une a esclerostina y a que consiste de los pasos obtener un primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en el cual puede unirse a la esclerostina o a obtener un segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en que puede unirse a la esclerostina o a construir las cadenas polipeptídicas primera y tercera las cuales consisten de VH1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de dicho primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VH2 es un seg undo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de dicho segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de unión con la condición de que no sea CH 1 donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como construir las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta las cuales consisten de VL1 VL 1 es un primer dom inio variable de cadena ligera obten ido a partir de dicho primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VL2 es un segundo dom inio variable de cadena ligera obtenido a partir de dicho segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y expresar dichas cadenas polipeptídicas primera segunda tercera y cuarta de forma tal que se genera una molécula de unión que se une a la esclerostina y a 1 En otra real ización se dan a conocer composiciones farmacéuticas que consisten de molécu las de unión de la invención En una realización se dan a conocer combinaciones de las moléculas de unión de la invención con uno o más de un un diluyente o un soporte farmacéuticamente En una realización se da a conocer un método para el tratamiento de un trastorno óseo que consiste en sum inistrar al paciente que lo necesite una molécula de unión de la invención En otra realización se da a conocer un método para acelerar la consol idación de fracturas óseas que consiste en suministrar al paciente q ue lo necesite una molécula de unión de la invención En otra realización se da a conocer un método para aumentar la densidad ósea que consiste en suministrar al paciente que lo necesite una molécula de unión de la invención En una realización se da a conocer un método para aumentar la resistencia ósea que consiste en suministrar al paciente que lo necesite una molécula de unión de la invención Estos y otros aspectos de la presente invención se clarifican mediante referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos Breve descripción de los d ibujos La Figu ra 1 resume los análisis ELISA de anticuerpos humanos biespecíficos unidos a huDK o La Fig u ra 2 resume los análisis E LISA de anticuerpos de rata biespecíficos u nidos a hu DKKI o huScl La Figu ra 3 resume los análisis ELISA de anticuerpos biespecíficos unidos a huDKKI y huScl al mismo La Fig ura 4 resume los resultados de bioensayos in vitro que muestran que 1 1 H 1 0 posee una actividad neutral izante similar a los Mabs de control cuando se utiliza la m isma relación La Fig ura 5 resume los datos de cambio porcentual en la densidad de masa ósea y el contenido mineral óseo en vértebras lumbares y en la pierna completa a partir de un estudio in vivo que utiliza ratones tratados con una combinación de mAb y DKK1 y La Figura 6 resume los datos de análisis de expresión génica luego del tratamiento con terapia de combinación con Las Figuras 7 y 8 resumen el cambio porcentual de la BMD en las vértebras lumbares y el en ratones tratados con una combinación de esclerostina mAb y DKK1 y Las Figuras 9 y 10 resumen el cambio porcentual en la resistencia ósea de ratones tratados con una combinación de mAb y DKK1 y 11H10 La Figura 11 contiene imágenes transversales de fémures de ratón obtenidas de ratones tratados con una combinación de mAb y DKK1 y La Figura 12 resume el cambio porcentual de la resistencia ósea para un modelo de torsión en ratas tratadas con esclerostina y DKK1 y Las Figuras resumen el cambio porcentual de la BMD en vértebras lumbares y de ratas tratadas con y Las Figuras resumen el cambio porcentual en la resistencia ósea de ratones tratados con y 1 H 10 La Figura 17 resume los resultados de un ensayo competitivo supertopflash el cual muestra que el 1 1 H 10 de rata conserva la actividad neutralizante de los anticuerpos parentales en células osteoblásticas C3T3E1 tratadas con proteínas La Figura 18 resume los resultados de un ensayo competitivo supertopflash el cual muestra que las de rata y humanas poseen una potente actividad neutralizante contra la escierostina y contra Dkk1 en células osteoblásticas MC3T3E1 STF tratadas con proteína Wnt1 La Figura 19 resume los resultados de un ensayo competitivo Alphascreen que muestra la inhibición de Lrp6 unido a escierostina o Dkk1 mediante La Figura 20 es un esquema de una molécula de unión biespecífica representativa conocida como Descripción detallada de la invención Los encabezados de las secciones de la presente memoria se proporcionan con el propósito de su organización y no han de entenderse como limitativos del tema que se describen bajo los Todas las referencias que se citan en esta solicitud se incorporan de manera expresa en la presente memoria por A menos que se defina lo contrario en la presente los términos científicos y técnicos que se utilizan en conexión con la presente invención estarán asociados a los significados comúnmente entendidos por un profesional en la Más a menos que el contexto requiera lo los términos en singular han de incluir pluralidades y los términos en plural han de incluir el En la presente memoria se dan a conocer nuevas moléculas biespecíficas que son efectivas para el tratamiento de condiciones que requieran una tasa de formación ósea por reparación de fracturas o pérdida ósea asociada con determinadas condiciones tales como el mieloma Por otra en la presente memoria se dan a conocer combinaciones de agentes que aumentan el anabolismo óseo incluyendo combinaciones de inhibidores de y Estas combinaciones pueden utilizarse para el tratamiento por aumentar la velocidad de curación de y cualesquiera condiciones que requieran un aumento de la tasa de formación La combinación terapéutica puede tomar la forma de dos inhibidores por un anticuerpo y una molécula o pueden ser una única entidad por una molécula de unión Los datos informados indican que la expresión de es elevada en los modelos de fractura no consolidada et 2009 De forma el hueso sano expresa niveles menores de lo cual ayuda a explicar el efecto limitado de los anticuerpos sobre BMD en el hueso intacto cuando se utilizan por Por las combinaciones de inhibidores de y esclerostina son particularmente útiles para el tratamiento de fracturas dada la sorprendentemente fuerte respuesta incluido un aumento significativo en la carga pico en un período de tiempo relativamente Se ha encontrado de manera inesperada que una molécula biespecífica que comprende inhibidores de tanto esclerostina como genera una respuesta biológica mayor que la de cualquiera de las dos monoterapias por Tal como se utiliza en esta una molécula biespecífica se une a un antígeno en una de sus dos regiones de y se une a un antígeno diferente en su segunda región de Por por un anticuerpo biespecífico puede poseer dos regiones de unión al antígeno diferenciadas y ser monovalente para cada antígeno al que se Un ejemplo adicional no limitativo de una molécula biespecífica es la cual puede poseer dos regiones de unión al antígeno diferenciadas en cada uno de sus siendo por tanto bivalente para ambos antígenos Las moléculas biespecíficas y bifuncionales de unión a la esclerostina y a que se dan a conocer en la presente memoria pueden incluir una o más CDR o una o más regiones variables tal como se describen en la presente Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos casos es un anticuerpo híbrido artificial que posee dos pares de cadenas diferentes y dos sitios de unión Estos anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos entre los que se incluyen a modo no limitativo la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos por Songsivilai I Kostelny et También pueden crearse moléculas biespecíficas de conformidad con la invención mediante En un puede unirse mediante la expresión de proteínas unión asociación no covalente de alta afinidad o a una o más moléculas de unión Entre los ejemplos de dichas moléculas de unión se encuentran a modo no limitativo otro fragmento de péptido o molécula de unión de forma tal que da lugar a una molécula Asimismo pueden crearse moléculas biespecíficas mediante la selección la ingeniería un anticuerpo que se une de manera específica a dos antígenos tales como y por Bostrom et Science Las moléculas biespecíficas también comprenden una primera especificidad de unión para esclerostina y una segunda especificidad de unión para una segunda Por la segunda diana puede ser otro epítopo de la esclerostina que difiera del primer Otro ejemplo es una molécula biespecífica que consiste en al menos una primera especificidad de unión para esclerostina y una segunda especificidad de unión para un epítopo comprendido en 1 Otro ejemplo es una molécula biespecífica que comprende al menos una primera especificidad de unión para esclerostina y u na segunda especificidad de u n ión para un epítopo comprendido en De forma para la invención en la cual la molécula biespecífica es multiespecífica la molécula puede incluir adicionalmente una tercera especificidad de unión además del primer y el segundo epítopo Formatos para los agentes de unión biespecífica En un la presente invención da a conocer moléculas biespecíficas o m ultiespecíficas que consisten en un agente de unión a y un agente de un ión a o un fragmento del Puede derivatizarse o unirse un anticuerpo de la invención o regiones de unión al antígeno del a otra molécula por otro péptido o proteína otro anticuerpo o l igando para un de manera de generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión o moléculas diana El anticuerpo de la invención puede de hecho derivatizarse o unirse a más de una molécu la funcional adicional a fin de general molécu las multiespecíficas que se u nen a más de dos sitios de unión moléculas diana d dichas moléculas multiespecíficas también se entienden dentro del alcance del término o de unión o de unión tal como se util iza en esta Para crear una molécula biespecífica de la un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente mediante acople qu fusión asociación no covalente u a una o más moléculas de unión tales como otro fragmento de péptido o molécula de unión mimética de forma tal que da lugar a una molécula De manera la presente invención incluye moléculas biespecíficas que consisten en al menos una primera especificidad de unión para esclerostina y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana Por el segundo epítopo diana es otro epítopo de la esclerostina que difiere del primer epítopo Otro ejemplo es una molécula biespecífica q ue consiste en al menos una primera especificidad de unión para esclerostina y u na segunda especificidad de unión para un epítopo comprendido en Otro ejemplo es una molécu la biespecífica q ue consiste en al menos una primera especificidad de un ión para esclerostina y una segunda especificidad de unión para un epítopo comprendido en De manera adicional para la invención en la cual la molécula biespecífica es la molécu la puede incluir una tercera especificidad de unión además de los epítopos diana primero y En ciertas el formato biespecífico es un dominio variable dual de Ig En ciertas el formato consiste en dos dominios variables en cada brazo de la dando lugar a un total de cuatro dom inios variables por molécula En una realización la proteína de unión de la invención es un capaz de unirse a dos antígenos que consiste en cuatro cadenas las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten en VH 1 VH1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten en VL1 donde VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena Algunos ejemplos no limitativos de las combinaciones contempladas en la presente memoria se proporcionan en la Tabla 1 SEC I D 1 las cuales describen las secuencias de los ácidos nucleicos y aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de Sin se contempla cualquier combinación de anticuerpos o fragmentos de incluidas las CDR que se describen en esta Entre algunos ejemplos no limitativos de pueden encontrarse en la Patente Estadounidense publicaciones de Solicitud de Patente Estadounidense US201 1 0008766A1 US2009031 1253A1 US201 00047239A1 US2009021 5992A1 US20070081996A1 US20070071 675A1 US20070041 905A1 US20100260668A1 US201 00076178A1 US20090304693A1 US2009031 1253A1 y US201 00233079A1 Otros ejemplos no limitativos de pueden encontrarse en las publ icaciones de Solicitud de Patente I nternacional WO2007024715A2 WO20080241 88A2 WO20091491 WO20091491 WO201 0065882A1 WO201 01 27284A2 y WO201 01 El térm ino de se utiliza para referirse a los polipéptidos que consisten en dos o más residuos aminoácidos un idos mediante enlaces peptídicos y opcionalmente se utilizan para unir una o más porciones de u nión al Dichos polipéptidos de unión son bien conocidos en la técnica por Hol et Nati Acad Sci USA J et al Structure 1 21 1 1 Por X1 del puede ser un cuerpo de unión seleccionado a partir de cualquiera de las secuencias de cuerpos de unión que se proporcionan en la Tabla 1 de esta En realizaciones los conectores pueden ser mutados para generar sustituciones de aminoácidos a fin de cambiar sus Por puede observarse con las que comprenden el conector Para abordar lo uno o más residuos Ser o Thr pueden ser cambiados a glicina o glutamina dependiendo de en cuáles sitios específicos sean en cada a determinar según el mapeo del ASTKGPSVFPLAP HC TVAAPSVFI FPP LC QPKAAPSVTLFPP LC Pueden sustituirse sitios en los conectores de cualquiera de los conectores de las cadenas pesada y o en En una la proteína de unión no consiste en En otra realización X1 es un cuerpo de unión con la condición de que no sea CH 1 En una tanto la cadena pesada variable como la cadena pesada ligera consisten en el mismo cuerpo de unión En otra realización la cadena pesada variable y la cadena pesada ligera consisten en diferentes cuerpos de En otra realización tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable consisten en un cuerpo de unión de poca longitud de 6 aminoácidos o de menor En otra realización tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable consisten en un cuerpo de unión de gran longitud que 6 am En otra la cadena pesada variable consiste de un cuerpo de unión de poca longitud y la cadena ligera variable consiste de un cuerpo de unión de gran longitud En otra realización la cadena pesada variable consiste de un cuerpo de unión de gran longitud y la cadena ligera variable consiste de un cuerpo de unión de poca En ciertas el formato biespecífico es una inmunoglobulina que asimismo consiste de un dominio monomérico que se une a la esclerostina o por Patente Estadounidense y y publicaciones de Patente 200401 2005004851 y 200602231 En una la molécula biespecífica consiste de múltiples dominios monoméricos Las proteínas Avimer consisten de una o más secuencias de 30 a 35 aminoácidos cada conectadas mediante péptidos de En ciertas las secuencias individuales se derivan de dominios A de varios receptores de membrana y poseen una estructura estabilizada mediante enlaces disulfuro y En algunas cada dominio A puede unirse a cierto epítopo de la proteína La combinación de dominios unidos a diferentes epítopos de la misma proteína aumenta la afinidad de esta efecto que se conoce como En una el dominio monomérico o proteína Avimer se ubica dentro de la región Fe de la En ciertas el formato biespecífico es un cuerpo de Un de es un anticuerpo biespecífico El cuerpo de unión se construye mediante la unión de un VL de un anticuerpo a su respectiva cadena pesada utilizando el cuerpo de Pueden unirse dos mitades que representa la especificidad para DKK y esclerostina respectivamente mediante la introducción de mutaciones de pares de carga opuestos en la Fe de cada cadena Por la primera Fe contiene 392D y 409D mientras que la segunda Fe contiene 356K y 359K por Kannan Gunasekhran et Biol Junio 201 En ciertas el formato biespecífico consiste de una región de unión al péptido ejemplo un péptido se dan a conocer las moléculas miméticas o basadas en los dominios de región variable y las CDR que se describen en la presente Estos análogos pueden ser no peptídicos o combinaciones de regiones peptídicas y no Drug Veber y TINS y Evans et 1 los cuales se incorporan en la presente memoria por referencia y para cualquier Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden ser utilizados para producir un efecto terapéutico o profiláctico Dichos compuestos a menudo se desarrollan con la ayuda de un modelado molecular las moléculas peptidomiméticas de la invención son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo que exhibe una actividad biológica tal en este la capacidad de unirse de manera especifica a o la pero poseen una o más uniones peptídicas opcionalmente remplazadas por una unión seleccionada y y mediante la utilización de métodos bien conocidos en la La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un aminoácido del mismo tipo en lugar de puede utilizarse en ciertas realizaciones de la invención para generar proteínas más pueden generarse mediante métodos conocidos en ia técnica péptidos restringidos que consisten de una secuencia de consenso o una variación sustancialmente idéntica a la secuencia de consenso y 61 los cuales se incorporan en la presente memoria mediante por mediante la adición de residuos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el En ciertas la molécula de unión biespecíflca es un diacuerpo Los diacuerpos biespecíficos utilizan el formato de diacuerpo para la Los diacuerpos se producen a partir de fragmentos scFv mediante la reducción de la longitud del cuerpo de unión que conecta los dominios VH y VL a aproximadamente 5 residuos y Valerius 1 Esta reducción del tamaño del cuerpo de unión facilita la dimerización de dos cadenas polipeptídicas mediante el acoplamiento cruzado de los dominios VH y Los diacuerpos biespecíficos se producen mediante la expresión de dos cadenas polipeptídicas con ya sea la estructura y o y dentro de la misma En la actualidad se ha producido una variedad de diacuerpos biespecíficos diferentes y la mayoría de ellos se expresan en forma soluble en las Sin un estudio comparativo reciente demuestra que la orientación de los dominios variables puede influir en la expresión y formación de los sitios de unión activos M et al 1 Nati Acad USA 1 7021 De todas la expresión soluble en las bacterias representa una ventaja importante respecto a las moléculas scFv en tándem Sin dado que dos cadenas polipeptídicas diferentes se expresan dentro de una única célula pueden producirse homod ímeros inactivos junto con los heterodímeros Para ello es necesaria la implementación de pasos de purificación adicionales a fin de obtener preparaciones homogéneas de diacuerpos U n enfoque para forzar la generación de diacuerpos biespecíficos es la producción de diacuerpos del tipo descrito en inglés como Hol y Winter Nati Acad Sci USA Este enfoque fue demostrado para un diacuerpo biespecífico dirigido contra HER2 y Se introdujo una porción con forma de bola en el dominio VH mediante el intercambio de Va 1 37 con Phe y Leu45 con Trp y se produjo un hoyo complementario en el domin io VL mediante la mutación de Phe98 a Met y Tyr87 a Ala ya sea en el dominio variable ER2 o en el Utilizando este enfoque puede aumentarse la producción de diacuerpos biespecíficos desde a partir el diacuerpo parental hasta más de mediante el diacuerpo se han fusionado diacuerpos a Fe a fin de generar más moléculas similares a llamadas et J Biol Chem Por otra se ha publicado información acerca del constructo m ultivalente para el anticuerpo el cual consiste de dos repeticiones de Fab en la cadena pesada de un IgG y es capaz de unirse a cuatro moléculas de antígeno WO 0 77342?1 y et al J I mm 1 En ciertas la molécu la de unión biespecífica puede encontrarse en el contexto de una molécula de unión Puede encontrarse un ejemplo no l im itativo de este formato en la publicación de Solicitud de Patente Internacional WO2009018386A1 y en la publicación de Solicitud de Patente Estadounidense US200901 En ciertas el formato biespecífico es un anticuerpo de dom U n de domin es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que consiste de sólo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena En algu nos dos o más regiones VH se unen de manera covalente a un péptido de unión a fin de crear un anticuerpo de dominio Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos Ver por ejemplo las publicaciones de Patente Estadounidense 20100234570 y 2004021 9643A1 En una las moléculas biespecíficas de la invención consisten como especificidad de u nión al menos un anticuerpo o un fragmento de i por ejem un o una cadena simple Fv a partir de una secuencia de molécula biespecífica que se da a conocer en la presente Asim puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena o cualquier fragmento mínimo tal como un Fv o una estructura de cadena simple tal como se escribe en Ladner et Patente Estadounidense Pueden prepararse moléculas biespecíficas mediante la conjugación química de las porciones de unión utilizando métodos conocidos en la Cuando las porciones de unión son proteínas o pueden utilizarse una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugación Entre algunos ejemplos se incluye la proteína ácido fenilendimaleimida propionato y por Karpovsky et 1984 MA et 1985 USA Entre otros métodos se incluyen aquellos que se describen en 1985 Behring Brennan et 1985 Science y Glennie et 1987 La conjugación de agentes incluye SATA y ambos suministrados por Pierce Chemical Cuando las porciones de unión son pueden conjugarse mediante enlace sulfhirilo en las regiones bisagra de las dos cadenas En una realización la región bisagra se modifica de manera que contenga un número impar de residuos de forma tal que existe un grupo sulfhidrilo libre que no ha formado una unión disulfuro con la correspondiente contraparte de cadena pesada o Las moléculas biespecíficas pueden consistir de al menos dos moléculas de cadena Algunos ejemplos no limitativos de métodos para la preparación de moléculas biespecífica se describen en varias publicaciones de patente en Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número Patente Estadounidense Número y Solicitud de Patente Estadounidense De manera ambas contrapartes a unir pueden ser codificadas en el mismo vector y expresadas y construidas en la misma célula Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es un mAb x mAb x Fab x o una proteína de fusión ligando x Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena simple que consiste de un anticuerpo de cadena simple y un determinante de o una molécula biespecífica de cadena simple que consiste de dos determinantes de En la presente memoria se dan a conocer ejemplos no limitativos de anticuerpos que se unen a la esclerostina y a Un experto en la técnica ha de apreciar que los anticuerpos que se describen en la presente memoria pueden emplearse en el contexto de las moléculas biespecíficas de la La unión de las moléculas biespecíficas a sus correspondientes dianas específicas puede confirmarse por ejemplo un ensayo de inm u noabsorción enzimática radioi nm unoensayo análisis bioensayo inhibición del o Western Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de com plejos de particular interés mediante el empleo de un reactivo marcado un específico para el complejo de Moléculas de unión a la esclerostina La invención da a conocer moléculas de unión a la esclerostina que pueden ser utilizadas en las moléculas biespecíficas de la En ciertas la molécula biespecífica consiste en el dominio VH VL de una inmunoglobul ina tal como se describe en la presente En otras la molécula biespecífica consiste de al menos una CDR 1 CDR2 CDR3 de cadena ligera y al menos una CDR1 o CDR3 de cadena Alg unos ejemplos no limitativos de secuencias CDR de molécu las de unión a la esclerostina se dan a conocer en la Tabla 1 de la presente El componente de un ión a la esclerostina de las moléculas biespecíficas que se dan a conocer puede incluir cuatro cinco o seis de las CDR que se muestran en la Tabla 1 Se contempla que la molécula biespecífica puede incluir dos o más CDR de un único o dos o más CDR de cualquiera de las combinaciones de los anticuerpos que se muestran Alg unos componentes de unión a la esclerostina incluyen tanto la CDR3 de cadena ligera como la CDR3 de cadena Ciertos componentes de unión a ia esclerostina poseen formas variantes de las CDR que se muestran en la Tabla 1 donde una o más 5 o de las CDR poseen cada una al menos o identidad de secuencia a la secuencia que se muestra en la Tabla 1 Por los componentes de unión a la esclerostina pueden incluir tanto una CDR3 de cadena ligera como una CDR3 de cadena pesada de las cuales cada una posee una identidad de secuencia de al menos o con la secuencia de CDR3 de cadena ligera y CDR3 de cadena que se muestra en la Tabla 1 Las secuencias CDR de algunos componente de unión a la esclerostina que se dan a conocer pueden asimismo diferir de las secuencias CDR que se muestran en la Tabla 1 de forma tal que la secuencia de aminoácidos para una CDR dada difiere de la secuencia que se muestra en la Tabla 1 en no más que 1 4 o 5 residuos pero sin limitarse a las diferencias con las secuencias mostradas son sustituciones se contempla que cada una de las cadenas ligeras que se describen en la presente memoria pueda combinarse con cualquiera de las cadenas pesadas que se describen en esta memoria para formar el componente de unión a la esclerostina de la molécula Algunos componentes de unión a la esclerostina que se dan a conocer en esta memoria consisten de un dominio variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera de los que se dan a conocer en esta memoria en sólo 1 7 1 1 1 2 1 14 o 1 5 residuos donde cada una de dichas diferencias en secuencia es de manera independiente ya sea una una inserción o una sustitución de un o una combinación de La región variable de cadena ligera en ciertos componentes de unión a la esclerostina consisten en una secuencia de aminoácidos que posee al menos o de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera que se dan a conocer en la presente Algunos componentes de unión a la esclerostina que se dan a conocer en esta memoria consisten de un dominio variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada de los que se dan a conocer en esta memoria en sólo 1 7 1 0 1 1 1 2 1 14 o 15 residuos donde cada una de dichas diferencias en secuencia es de manera independiente ya sea una una inserción o una sustitución de un o una combinación de La región variable de cadena pesada en ciertos componentes de unión a la esclerostina consisten en una secuencia de aminoácidos que posee al menos o de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada que se dan a conocer en la presente En otras la porción de la molécula biespecífica que se une a esclerostina se selecciona de aquellas moléculas de unión a la esclerostina que se divulgan en la Patente Estadounidense Patente Estadounidense y publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 1 En una realización se contempla una que consiste de un VH y un VL de unión a la esclerostina a partir de los anticuerpos que se divulgan en las antemencionadas patentes y solicitudes de Agentes de unión a La invención da a conocer moléculas de unión a que pueden ser utilizadas en las moléculas biespecíficas de la En ciertas las moléculas de unión a son o fragmentos de En ciertas la molécula biespecífica consiste del dominio VH VL de una inmunoglobulina tal como se describe en la presente En otras la molécula biespecífica consiste de al menos uno de CDR1 CDR3 de cadena ligera y CDR1 o CDR3 de cadena Algunos ejemplos no limitativos de secuencias CDR de moléculas de unión a se muestran en la Tabla 1 El componente de unión a de las moléculas biespecíficas que se dan a conocer puede incluir cinco o seis de las CDR que se muestran en la Tabla 1 Se contempla que la molécula biespecífica puede incluir dos o más CDR de un único o dos o más CDR de cualquier combinación de los anticuerpos que se muestran en la Tabla 1 Algunos componentes de unión a incluyen tanto la CDR3 de cadena ligera y la CDR3 de cadena Algunos componentes de unión a poseen formas variantes de las CDR que se muestran en la Tabla 1 donde cada una de una o más 5 o de las CDR posee al menos o de identidad de secuencia con una secuencia de CDR de las que se muestran en la Tabla 1 Por los componentes de unión a pueden incluir tanto una CDR3 de cadena ligera como una CDR3 de cadena pesada donde cada una posee una identidad de secuencia de o con la secuencia CDR3 de cadena ligera y CDR3 de cadena que se muestra en la Tabla 1 Las secuencias CDR de algunos de los componentes de unión a que se dan a conocer también pueden diferir de las secuencias CDR que se muestran en la Tabla 1 de forma tal que la secuencia de aminoácidos para cualquier CDR dada difiere de la secuencia que se muestra en la Tabla 1 en no más que 1 4 o 5 residuos pero sin limitarse a las diferencias con las secuencias que se muestran son sustituciones Se contempla asimismo que cada una de las cadenas ligeras que se describen en la presente memoria puede combinarse con cualquiera de las cadenas pesadas que se describen en la presente memoria para formar el componente de unión a de la molécula Ciertos componentes de unión a que se dan a conocer en la presente memoria consisten de un dominio variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera que se da a conocer en la presente memoria sólo en 1 1 1 1 14 o 15 residuos donde cada una de dichas diferencias en secuencia es de manera independiente ya sea una una inserción o una sustitución de un o una combinación de La región variable de cadena ligera en ciertos componentes de unión a consiste de una secuencia de aminoácidos que posee al menos o de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera que se dan a conocer en la presente Ciertos componentes de unión a que se dan a conocer en la presente memoria consisten de un dominio variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada de los que se dan a conocer en la presente memoria en sólo 1 1 14 o 1 5 residuos donde cada una de dichas diferencias en secuencia es de manera independiente ya sea una una inserción o una sustitución de un o una combinación de La región variable de cadena pesada en ciertos componentes de unión a consiste de una secuencia de aminoácidos que posee al menos o de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada que se dan a conocer en la presente En otras la porción de la molécula biespecífica que se une a se selecciona a partir de aquellas moléculas de unión a que se divulgan en la Patente Estadounidense 1 publicación de Patente Estadounidense Patente Estadounidense Patente Estadounidense 101 y WO En una realización se contempla una que consiste de un VH y un VL de unión a la esclerostina a partir de los anticuerpos que se divulgan en las antemencionadas patentes y solicitudes de Anticuerpos y Epítopos de Unión Las moléculas de unión biespecífica de la invención pueden consistir de los anticuerpos y y los fragmentos de los mismos que se dan a conocer en esta El término se refiere a una intacta de cualquier o un fragmento de ésta que pueda competir con el anticuerpo intacto por la unión específica al antígeno e por anticuerpos completamente humanos y Un es una especie de una proteína de unión al Un anticuerpo intacto generalmente consistirá de al menos dos cadenas pesadas de longitud total y dos cadenas ligeras de longitud pero en algunos casos puede incluir menos cadenas tales como los anticuerpos naturales que se encuentran en los camélidos los cuales pueden consistir de sólo cadenas Los anticuerpos pueden derivarse exclusivamente de una fuente o pueden ser es pueden derivarse porciones diferentes del anticuerpo a partir de dos anticuerpos diferentes tal como se describe en mayor detalle a continuación Las proteínas de unión al o fragmentos de unión pueden prod ucirse en los mediante técn icas de ADN o mediante la lisis enzimática o quím ica de anticuerpos A menos que se indique lo el término además de anticuerpos que consisten de dos cadenas pesadas de long itud completa y dos cadenas ligeras de longitud fragmentos y muteínas de Más aun a menos que se excluyan los anticuerpos incluyen anticuerpos anticuerpos anticuerpos de domi anticuerpos sintéticos los que a menudo se les refiere en la presente memoria como anticuerpos anticuerpos anticuerpos fusiones de anticuerpos los que a menudo se les refiere en la presente memoria como de y fragmentos de las unidades estructurales de los anticuerpos naturales constituyen un Cada uno de dichos tetrámeros típicamente está compuesto de dos pares idénticos de cadenas donde cada par posee una cadena ciertas alrededor de 25 de longitud completa y una cadena ciertas alrededor de de longitud La porción terminal ino de cada cadena típicamente incluye una región variable de alrededor de 1 00 a 1 0 o más aminoácidos la cual típicamente es responsable del reconocim iento del La porción terminal carboxi de cada cadena típicamente define una región constante que puede ser responsable de la función Las cadenas ligeras humanas típicamente se clasifican como cadenas ligeras kapa y Las cadenas pesadas típicamente se clasifican como alfa o y definen el isotipo del anticuerpo como IgA e IgG posee varias entre las que se incluyen en carácter no limitativo IgG lgG3 e IgM posee entre las cuales se sin limitarse lgM 1 e IgA se subdivide de manera similar en entre las cuales se incluyen en carácter no limitativo lgA1 e Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud típicamente las regiones variable y constante se encuentran unidas mediante una región de alrededor de 12 o más a la vez que la cadena pesada también incluye una región de alrededor de 10 aminoácidos por Fundamental Capítulo 7 2nd Raven por referencia en su totalidad para todo Las regiones variables de cada par de cadenas típicamente conforman el sitio de unión al Las regiones variables típicamente exhiben la misma estructura general que las regiones relativamente conservadas unidas mediante tres regiones también llamadas regiones determinantes de complementariedad o Las CDR de las dos cadenas de cada par típicamente son alineadas por las regiones las cuales pueden permitir la unión a un epítopo Del terminal N al terminal tanto las regiones variables de cadena ligera como las de cadena pesada típicamente conforman los dominios FR1 CDR1 CDR3 y La asignación de aminoácidos a cada dominio típicamente está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological I nterest Institutes of y 1991 o Chothia J Chothia et 883 En ciertas una cadena pesada de un anticuerpo se une a un antígeno en la ausencia de una cadena ligera de un En ciertas una cadena ligera de un anticuerpo se une a un antígeno en la ausencia de una cadena pesada de un En ciertas una región de unión al anticuerpo se une a un antígeno en la ausencia de una cadena ligera de un En ciertas una región de unión al anticuerpo se une a un antígeno en la ausencia de una cadena pesada de un En ciertas una región variable individual se une de manera específica a un antígeno en la ausencia de otras regiones En ciertas el delineamiento definitivo de una CDR y la identificación de los residuos que conforman el sitio de unión de un anticuerpo se logra mediante la resolución de la estructura del anticuerpo la resolución de la estructura del complejo En ciertas realizaciones que pueden ser realizadas mediante cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por un experto en la tales como cristalografía de rayos En ciertas pueden emplearse varios métodos de análisis para identificar o aproximarse a las regiones Entre algunos ejemplos de dichos métodos se sin limitarse la definición de la definición de la definición AbM y la definición de La definición de Kabat es una norma para la numeración de los residuos en un anticuerpo y típicamente es utilizada para identificar las regiones por Johnson Nucleic Acids La definición de Chothia es similar a la definición de pero la definición de Chothia toma en cuenta las posiciones de ciertas regiones de bucles por Chothia et Chothia et La definición AbM utiliza un conjunto integrado de programas de computadora producidos por Oxford Molecular Group que modelan la estructura de un por Martin et Proc Nati Acad Sci A Computer Program for Modeling Variable Regions of Oxford La definición AbM modela la estructura terciaria de un anticuerpo a partir de la secuencia primaria utilizando una combinación de bases de datos de información y métodos ab tales como los descritos por Samudrala et Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical en Function y Genetics La definición de contacto se basa en el análisis de las estructuras cristalinas complejas por MacCallum et Por a las regiones CDR en la cadena pesada se les refiere típicamente como y H3 y las mismas se enumeran de forma secuencial en la dirección desde el terminal amino al terminal A las regiones CDR en la cadena ligera típicamente se les refiere como L1 L2 y L3 y las m ismas se enumeran de forma secuencial en la dirección desde el term inal ami no hasta el terminal carboxi El término incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de ésta que posean una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión Una cadena ligera de longitud completa incl uye un domin io de región y un dom inio de región El domin io de región variable de la cadena ligera se encuentra en el terminal amino del Las cadenas l igeras incluyen cadenas kapa y cadenas El término incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de ésta que poseen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión Una cadena pesada de longitud completa incluye u n dominio de región VH y tres dominios de región CH 1 C y El dominio VH se encuentra en el terminal amino del y los dominios CH se encuentran en el terminal siendo que CH3 es el que se encuentra más cercano al terminal carboxi del La cadenas pesadas pueden ser de cualquier incluyendo IgG los subtipos IgG lgG2 lgG3 e IgA los subtipos lgA1 e l IgM e Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epítopo en el entorno de los residuos tal como en el entorno de por lo que sign ifica es que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que consiste de los residuos especificados ejem un segmento especificado de Dicho anticue3rpo no necesariamente está en contacto con cada residuo dentro de 1 Tampoco cada sustitución o elim inación de un aminoácido dentro de necesariamente afecta la afinidad de manera La especificidad de un anticuerpo por un epítopo puede determinarse en una variedad de Un por involucra la prueba de un conjunto de péptidos solapados de alrededor de 15 aminoácidos que abarcan la secuencia de y difieren en incrementos de un peq ueño número de aminoácidos 3 Los péptidos se encuentran inmovilizados dentro de los pocilios de una placa de microtitulación La in movilización se torna efectiva mediante la biotinilación de un term inal de los pueden biotinilarse muestras diferentes del mismo péptido en el terminal N y C e inmovilizarse en pocilios separados para propósitos de Esto es útil para la identificación de anticuerpos específicos para un tipo de terminal pueden incluirse péptidos adicionales que poseen en un extremo un aminoácido de interés en particu Este enfoque es útil para la identificación de anticuerpos específicos para un tipo de terminal contra los fragmentos internos de 1 Se determina mediante screening la unión específica de un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional a cada uno de los varios El epítopo se define como la porción q ue se encuentra en un segmento de aminoácidos que es común a todos lo péptidos para los cuales el anticuerpo muestra especificidad de Los anticuerpos y los fragmentos funcionales de éstos que se unen a un epítopo conformacional que se ubica en la porción del terminal carboxi de Se dan a para su utilización en las moléculas biespecíficas de ia El terminal carboxi de contiene varios residuos cisteína que forman un conglomerado de enlaces disulfuro el cual crea varios La invención da a conocer para su utilización en las moléculas biespecíficas de la que se unen a dos de estos neutralizando así la capacidad de para suprimir la actividad de Algunos ejemplos de para su utilización en las moléculas biespecíficas de la capaces de unirse al epítopo antes mencionado son los anticuerpos monoclonales 1 1 H 10 y 1 F1 1 cada uno de los cuales consiste de una cadena ligera y una cadena Pueden encontrarse ejemplos adicionales para su utilización en las moléculas biespecíficas de la invención en la Solicitud de Patente Estadounidense 61 presentada el 27 de octubre de y Solicitud de Patente Internacional 1 presentada el 27 de octubre de 201 1 El epítopo que comprende estos dos bucles se forma mediante enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína 220 y 237 de SEC I D 190 y entre los residuos de cisteína 245 y 263 de SEC I D El cuerpo de los dos bucles que conforman el epítopo por tanto incluye los aminoácidos 221 y de SEC I D 1 Entre los segmentos dentro de este bucle que se encuentran involucrados en ia unión se incluyen los aminoácidos 221 de SEC ID 190 y los aminoácidos de SEC I D Por ciertos anticuerpos y fragmentos que se dan a conocer en la presente para su utilización en las moléculas biespecíficas de la se unen de manera específica a antes Algunos de los anticuerpos y por se unen a un péptido comprendido por o que consiste de los aminoácidos 221 a 262 de SEC I D Anticuerpos competidores Se dan a y fragmentos inmunológicamente funcionales de que son de utilidad en el contexto de las moléculas biespecíficas de la invención que compiten con uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales ejemplificados por la unión específica a o a Dichos anticuerpos y fragmentos también pueden unirse al mismo epítopo que uno de los anticuerpos Es de esperar que los anticuerpos y fragmentos que compiten con o se unen al mismo epítopo que el anticuerpo o fragmento ejemplificado posean propiedades funcionales Entre los anticuerpos y fragmentos ejemplificados se incluyen aquellos que se describen en la presente incluidos aquellos con los dominios de región variable de cadena pesada y ligera y las CDR que se muestran en la presente En algunas realizaciones el alcance de la invención incluye las moléculas de unión tales como las que se dan a conocer SEC I D NOs 1 de la presente que comprenden el VH el VL de los anticuerpos que se dan a y moléculas de unión que compiten con estas moléculas de unión biespecífica por la unión La competencia por la unión puede ser por 1 por la Los ensayos de tal como el ensayo son bien conocidos en la técn ica Cada cadena ind ividual de la inmunoglobulina está típicamente compuesta de varios de la inm cada uno de los cuales consiste en aproximadamente 90 a 1 1 0 aminoácidos y posee un patrón de plegamiento Estos domin ios son las unidades básicas de las que están com puestos los poli péptidos de un En los los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas los isotipos IgG e Ig E contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas y el isoti po IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas l La región C de la cadena pesada típicamente consiste en uno o más dom inios que pueden ser responsables de la función El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del Las cadenas pesadas de por contienen tres dom inios de región C conocidos como CH 1 CH2 y Los anticuerpos que se dan a conocer par su utilización en las moléculas biespecíficas de la invención pueden poseer cualq uiera de estos isotipos y El término o se refiere a una porción de las cadenas ligera pesada de u n típicamente incluyendo aproximadamente los am inoácidos 1 20 a 130 desde el terminal amino en la cadena pesada y alrededor de 1 00 a 1 10 aminoácidos desde el terminal am ino en la cadena En ciertas las regiones variables de anticuerpos diferentes difieren en forma extensiva en la secuencia de aminoácidos aun entre anticuerpos de la misma La región variable de un anticuerpo típicamente determ ina la especificidad de un anticuerpo en particu lar por su molécula El térm ino na neutralizante de unión al o se refiere a una proteína de un ión al antígeno o para su utilización en las moléculas biespecíficas de la invención que se une a un ligando e impide o disminuye el efecto biológico de ese Esto puede por mediante el bloqueo directo de un sitio de unión en el ligando o mediante la unión al ligando y la alteración de la capacidad del ligando para unirse por medios indirectos como alteraciones estructurales o energéticas en el En algunas el término también puede denotar una proteína de unión al antígeno que impide que la proteína a la que está unida realice una función Al evaluar la capacidad de unión especificidad de una proteína de unión al por un anticuerpo o un fragmento inmunológicamente funcional de un anticuerpo o fragmento puede sustancialmente inhibir la unión de un ligando a su contraparte cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de la contraparte unida al ligando en al menos alrededor de 1 o más en un ensayo de unión competitiva in En algunas la capacidad neutralizante se caracteriza describe mediante un ensayo de En algunas la capacidad neutralizante se describe en términos de un valor IC50 o En ciertas los anticuerpos que se dan a conocer para su utilización en las moléculas biespecíficas de la invención poseen una afinidad de unión por la esclerostina o de al menos 104 o x medida mediante técnicas bien conocidas en la técnica ejemplo Biacore o Otros anticuerpos poseen un valor de Ka de al menos 108 o x Ciertos anticuerpos que se dan a conocer poseen una baja velocidad de Algunos por poseen una Koff de o Los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando cualquier procedimiento conocido en la por mediante la inmortalización de células de bazo recolectadas del animal transgénico habiendo completado el programa de Las células de bazo pueden inmortalizarse utilizando cualquier procedimiento conocido en la por mediante su fusión con células de mieloma para producir Las células de mieloma para su utilización en los procedimientos de fusión que dan lugar al hibridoma preferentemente no son productoras de poseen una alta eficiencia de y deficiencias enzimáticas que las tornan incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que sustentan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas Entre algunos ejemplos de líneas de células apropiadas para su utilización en las fusiones de ratón se incluyen NS1 4 1 1 y entre algunos ejemplos de líneas de células apropiadas para su utilización en las fusiones de rata se incluyen R21 1 I R983F y Entre otras líneas de células útiles para las fusiones celulares se encuentran GM y En algunos una línea de células de hibridoma se produce mediante la inmunización de un animal un animal transgénico que posee secuencias de inmunoglobulina con un inmunógeno contra la recolección de células de bazo del animal fusionando las células de bazo recolectadas con una línea de células de generando de esa forma células de estableciendo líneas de células de hibridoma a partir de las células de y la identificación de una línea de células de hibridoma que produce un anticuerpo que se una a un polipéptido de Dichas líneas de células de y los anticuerpos monoclonales 1 que éstas están comprendidas dentro del alcance de la presente Los hibridomas o mAb pueden adicionalmente someterse a un ensayo que permita identificar con propiedades tales como la habilidad de bloquear una actividad inducida por A continuación se proporcionan ejemplos de dichos ensayos Se dan a anticuerpos quiméricos y humanizados basados en las secuencias Los anticuerpos monoclonales que se utilizan como agentes terapéuticos pueden ser modificados en diversas maneras antes de su Un ejemplo es un anticuerpo el cual es un anticuerpo compuesto por segmentos de proteína de diferentes anticuerpos que se unen de forma covalente para producir cadenas funcionales de inmunoglobulina ligeras o pesadas o porciones inmunológicamente funcionales de una porción de la cadena pesada ligera es idéntica u homologa a la secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados a partir de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo mientras que el resto de idénticas u homologas a la secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados a partir de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de Por mayor información acerca métodos que se relacionan con anticuerpos por Patente Estadounidense y Morrison et USA 81 El injerto de CDR se por en las Patentes Estadounidenses y 1 01 el objetivo de construir un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la cual se maximiza el número de aminoácidos a partir de la especie Un ejemplo lo constituye el anticuerpo con de en la cual el anticuerpo consiste de una o más regiones determinantes de complementariedad de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de mientras que el resto de de anticuerpos u a otra clase o subclase de Para la utilización en a menudo se injerta la región V o ciertas CDR seleccionadas a partir de un anticuerpo de roedor en un anticuerpo remplazando las regiones V o CDR que naturalmente se encuentran en el anticuerpo Un tipo útil de anticuerpos quiméricos es un anticuerpo un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal desarrollado inicialmente en un animal no Ciertos residuos aminoácidos en este anticuerpo típicamente de las porciones que no reconocen al antígeno del se modifican de forma tal que son homólogos a los correspondientes residuos en un anticuerpo humano del isotipo La humanización puede llevarse a por mediante varios métodos introduciendo al menos una porción de una región variable de un roedor en sustitución de las regiones correspondientes de un anticuerpo humano por las Patentes Estadounidenses y Jones et Nature 321 Riechmann et 1 Nature Verhoeyen et Science En ciertas pueden utilizarse regiones constantes de una especie diferente de la humana junto con humanas para producir anticuerpos se dan a conocer anticuerpos completamente Existen métodos para construir anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer a los seres humanos al antígeno com pletamente Una forma de implementar la prod ucción de anticuerpos completamente humanos es la del sistema inm u ne humoral de La introducción de loci de inmunoglobuMna humana en ratones en los cuales los genes Ig endógenos han sido inactivados constituye una forma de producción de anticuerpos monoclonales com pletamente humanos en el un an imal que puede ser inmunizado con cualqu ier antígeno La uti lización de anticuerpos completamente humanos puede minim izar las respuestas inmunogénicas y alérgicas que a menudo pueden resultar de la adm inistración de Mab de ratón o derivatizados de ratón a humanos como agentes Pueden producirse anticuerpos com pletamente humanos mediante la inmunización de animales transgénicos que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de una producción de inmunoglobuMna Los antígenos adecuados para este propósito típicamente poseen seis o más aminoácidos contig y opcionalmente están conjugados a un tal como un por Jakobovits et 1 Nati Acad USA 2551 Jakobovits et Nature y Bruggermann et al 1 Year in I 7 En un ejemplo de dicho se producen animales transgénicos mediante la incapacitación de los loci de inmunoglobu Mna de ratón endógena que codifican las cadenas de inmunoglobuMna pesada y ligera de ratón y la inserción en el genoma de ratón de grandes fragmentos de ADN del genoma humano que contienen loci que codifican las proteínas de cadena pesada y ligera se hibridan animales parcialmente los cuales poseen menos que el complemento completo de las loci de inmunoglobulina a fin de obtener un animal que posee todas las modificaciones del sistema inmune Al administrárseles un estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno pero poseen secuencias de aminoácidos humanas en lugar de incluyendo las regiones Por mayor detalle acerca de dichos por y Algunos métodos adicionales referentes a ratones transgénicos para la construcción de anticuerpos humanos se describen en las Patentes Estadounidenses y en las publicaciones PCT WO91 y en EP 546073B1 y EP 546073A1 Los ratones transgénicos que se describen a los que se les refiere como ratones contienen un minilocus de gen de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina humana de cadena pesada y y de cadena ligera kapa no junto con las mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadena µ y et Nature De manera los ratones exhiben una expresión disminuida de IgM o de ratón y en respuesta a la y los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos sufren un cambio de clase y una mutación somática a fin de generar anticuerpos monoclonales humanos IgG de alta afinidad et Lonberg y Harding y Sci La preparación de ratones HuMab se describe en detalle en Taylor et Nucleic Acids Chen et International Immunology Tuaillon et J I 1 Lonberg et Nature 1 Handbook of Pharmacology 1 1 Taylor et 1 International Immunology Lonberg y 1 Harding y N Fishwild et Nature Biotechnology Ver asimismo las Patentes Estadounidenses y así como la Patente Estadounidense las Publicaciones Internacionales WO WO y WO las tecnologías utilizadas para la producción de anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se divulgan en WO y Méndez et Nature Genetics 1 Por pueden utilizarse las cepas de ratones transgénicos HC07 y HC012 para generar agentes de unión apropiados para el uso especificado en la presente Utilizando tecnología de pueden producirse MAb humanos específicos para el antígeno con la especificidad deseada y seleccionarse a partir de ratones transgénicos tales como los descritos Dichos anticuerpos pueden ser clonados y expresados utilizando un vector y una célula huésped o pueden recolectarse los anticuerpos a partir de células de hibridoma También pueden derivarse anticuerpos completamente humanos a partir de bibliotecas de como se divulga en Hoogenboom et 1991 y Marks et 1991 Las técnicas de imitan la selección inmune a partir de la aparición de repertorios de anticuerpos en la superficie de bacteriófagos Una de dichas técnicas se describe en la publicación PCT la cual describe el aislamiento de anticuerpos agonistas de alta afinidad y funcionales para receptores de MPL y utilizando un enfoque como Las moléculas biespecíficas que se dan a conocer en la presente memoria también pueden bloquear o disminuir la unión entre la esclerostina y LRP5 estimulando así al menos una actividad asociada con la señalación se dan a conocer moléculas de ácidos vectores y células huésped que son útiles en la producción de los anticuerpos y agentes de unión Ciertas moléculas o fragmentos biespecíficos incluyen cinco o las seis CDR de anticuerpos o que se muestran en la Tabla 1 y en ciertas realizaciones una molécula de unión biespecífica comprenderá un total de doce CDR de un VH y 6 de un se dan a conocer composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de las moléculas y fragmentos biespecíficos Dichas composiciones típicamente incluyen asimismo un un diluyente farmacéuticamente un vehículo un un emulsificante o un Se da a conocer asimismo la utilización de los anticuerpos y fragmentos anteriores en la preparación de una composición farmacéutica o Variantes Algunos de los anticuerpos o fragmentos que se dan a conocer para su utilización en las moléculas biespecíficas de la invención son formas variantes de los anticuerpos y fragmentos que se divulgan arriba aquellos que poseen las secuencias que se muestran en la Tabla 1 Por algunos de los anticuerpos o fragmentos poseen una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras en una o más de las cadenas pesadas o regiones variables o CDR que se muestran en la Tabla 1 Los aminoácidos naturales pueden dividirse en dos clases basándose en las propiedades comunes de sus cadenas 1 hidrofílicos residuos que influyen en la orientación de la y Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden comprender los residuos aminoácidos que no se encuentran en la los cuales típicamente se incorporan mediante síntesis química de péptidos en lugar de su síntesis en sistemas Entre ellos se encuentran las moléculas peptidomiméticas y otras formas revertidas o invertidas de grupos Las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de las clases anteriores por un miembro de otra Tales residuos de sustitución pueden introducirse en regiones que son homologas a las secuencias correspondientes o en las regiones no homologas de la Al realizar dichos de acuerdo con ciertas puede considerarse el índice hidropático de los El perfil hidropático de una proteína se calcula asignando un valor numérico de a cada aminoácido y luego promediando estos valores de manera repetitiva a lo largo de la cadena Se ha asignado a cada aminoácido un índice de hidropatía basándose en sus características de hidrofobicidad y valina leucina fenilalanina metionina alanina glicina treonina serina triptófano tirosina prolina histidina glutamato glutamina aspartato asparragina lisina y arginina La importancia del perfil hidropático al conferir a la proteína una función biológica interactiva es conocida en la técnica por Kyte et 1 1 31 Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos que poseen un índice o nivel hidropático similar y aún conservan una actividad biológica Para efectuar cambios basados en el índice en ciertas se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos se encuentran en el entorno de En algunos aspectos de la se incluyen aquellos que se encuentran en el entorno de 1 y en otros aspectos de la se incluyen aquellos que se encuentran en el entorno de es conocido en la técnica que puede llevarse a cabo la sustitución por aminoácidos similares de manera efectiva en base a la particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcional así creado está destinado para su utilización en realizaciones como en el caso En ciertas la mayor hidrofilicidad local promedio de una gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos se correlaciona con la unión al antígeno o es con una propiedad biológica de la Se han asignado a estos residuos aminoácidos los siguientes valores de arginina lisina aspartato 1 glutamato 1 serina asparragina glutamina glicina treonina 1 alanina histidina cisteína metionina valina leucina isoleucina tirosina fenilalanina y triptófano Para efectuar cambios basándose en la semejanza de valores de en ciertas se incluye la sustitución por aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad se encuentran en el entorno de m ientras que en otras se incluyen aquellos que se encuentran en el entorno de 1 y en otras se incluyen aquellos que se encuentran en el entorno de En algunos pueden identificarse epítopos a partir de las secuencias de aminoácidos primarias en base a la A estas regiones también se les refiere como centrales del Un experto en la técnica asimismo podrá determinar variantes de polipéptidos apropiadas tal como se las describe en la presente memoria utilizando proced im ientos bien Un experto en la técnica podrá identificar áreas apropiadas de la molécula que pueden ser cambiadas sin destruir la actividad mediante métodos dirigidos a ciertas regiones que no se creen importantes en cuanto a la El experto en la técnica asimismo podrá identificar residuos y porciones de las moléculas conservadas entre pol ipéptidos En realizaciones incluso las áreas que puedan ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden ser sujetas a sustituciones de aminoácidos conservadoras sin destruir la actividad biológica o sin afectar de manera adversa la estructura del De manera ad icional un experto en la técnica puede revisar los estud ios sobre estructura y función e identificar residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o la A la luz de tal comparación puede predecirse la importancia de los residuos aminoácidos en una proteína que corresponden a los residuos aminoácidos que son importantes para la actividad o la estructura en proteínas Un experto en la técnica puede optar por realizar sustituciones de aminoácidos químicamente similares para aquellos residuos aminoácidos que se habían considerado Varias publicaciones científicas se han enfocado en la predicción de la estructura 1 in Chou et 1 Biochemistry 1 Chou et Biochemistry 1 1 Chou et Areas Chou et y Chou et J Más actualmente se encuentran disponibles programas de computación para facilitar la predicción de la estructura Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado por Por dos polipéptidos o proteínas que poseen una identidad de secuencia mayor al o una similitud de a menudo poseen topologías estructurales El reciente crecimiento de la base de datos estructurales de proteínas ha hecho disponible una predictibilidad aumentada para la estructura incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o de una Ver Holm et Se ha sugerido et que existe un número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dada y que una vez que se haya resuelto un número crítico de la predicción estructural se tornará dramáticamente más Otros métodos para predecir la estructura secundaria incluye el reconocimiento del plegamiento Sippl et 1 Structure 1 el del et 1991 Science Gribskov et Gribskov et 1 y la Holm y 1 En algunas realizaciones de la invención se realizan sustituciones de aminoácidos las 1 disminuyen la susceptibilidad a la disminuyen la susceptibilidad a la alteran la afinidad de unión para la formación de complejos alteran la afinidad de unión al ligando o al confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos Por pueden realizarse sustituciones de un aminoácido o de múltiples a aminoácidos ciertas sustituciones de aminoácidos en la secuencia que se encuentra en la Pueden realizarse sustituciones en la porción del anticuerpo que se encuentra fuera los formando contactos En dichas pueden utilizarse sustituciones de aminoácidos conservadoras que no cambian las características estructurales de la secuencia parental de manera sustancial uno o más aminoácidos de remplazo que no perturban la estructura secundaria que caracteriza al anticuerpo parental o Algunos ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Structures y Molecular Principies New Freeman y Introduction to Protein Structure y 1991 New Garland y Thornton et 1991 Nature cada uno de los cuales se incorpora por referencia en la presente La invención asimismo comprende variantes de glicosilación de las moléculas biespecíficas de la invención donde el número el tipo de sitios de glicosilación han sido alterados en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido En ciertas las variantes de las proteínas de un anticuerpo consisten de un número mayor o menor de sitios de glicosilación unidos a N que el anticuerpo Un sitio de glicosilación unido a N se caracteriza por la o donde el residuo aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo aminoácido excepto La sustitución de residuos aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial par la adicción de una cadena de carbohidrato unida a De forma las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia impedirán la adición de una cadena de carbohidrato unida a N que se encuentre presente en el polipéptido Por puede disminuirse la glicosilación mediante la eliminación de una Asn o mediante la sustitución de Asn por un aminoácido En otras realizaciones se crean uno o más nuevos sitios unidos a N Los anticuerpos típicamente poseen un sitio de glicosilación unido a N en la región Entre algunas variantes adicionales se incluyen las variantes de cisteína donde uno o más residuos de cisterna en la secuencia del aminoácido parental o nativo es eliminada o sustituida por otro aminoácido Las variantes de cisteína son entre cuando los anticuerpos deben volver a plegarse en una conformación biológicamente Las variantes de cisteína poseen menos residuos cisteína que el anticuerpo y típicamente poseen un número impar a fin de minimizar las interacciones que resultan de las cisteínas no se dan a conocer moléculas miméticas o basadas en los dominios de región variable y CDR que se describen en la presente Estos análogos pueden ser no péptidos o combinaciones de regiones peptídicas y no Ver Drug 1 Veber y TI NS y Evans et 1 los cuales se incorporan por referencia en la presente memoria y para cualquier Pueden utilizarse péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico las moléculas peptidomiméticas de la invención son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo que exhibe una actividad biológica tal como lo es en la presente la habilidad para unirse específicamente a pero poseen una o más uniones peptídicas opcionalmente remplazadas por una unión seleccionada y y mediante métodos bien conocidos en la Puede utilizarse en ciertas realizaciones de la invención la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un del mismo tipo en lugar de para generar proteínas más estables y 61 incorporados por referencia en la presente por mediante la adición de residuos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el se dan a conocer derivados de los anticuerpos y fragmentos para su utilización en las moléculas biespecíficas de la invención que se describen en la presente El anticuerpo o fragmento derivatizado puede comprender cualquier molécula o sustancia que imparte una propiedad deseada al anticuerpo o tal como una vida media aumentada en una aplicación El anticuerpo derivatizado puede consistir por una entidad detectable una molécula antigénica o una cuenta detectable como una cuenta magnética o electrodensa o una molécula que se une a otra molécula biotina o una entidad terapéutica o diagnóstica una entidad citotóxica o farmacéuticamente o una molécula que aumenta la adecuación de un anticuerpo para un uso particular la administración a un tal como un sujeto u otros usos in vivo o in Entre algunos ejemplos de moléculas que pueden ser utilizadas para derivatizar un anticuerpo se incluyen la albúmina la albúmina de suero y el polietilenglicol Pueden prepararse derivados de anticuerpos unidos a albúmina y PEGados utilizando procedimientos bien conocidos en la En una el anticuerpo se encuentra conjugado o de lo contrario unido a transtiretina o una variante de La TTR o variante de TTR puede modificarse químicamente por una entidad química seleccionada a partir del conjunto que consiste de homopolímeros de copolímeros de óxido de de polioles polioxietilados y polivinil Entre otros derivados se incluyen los conjugados covalentes o agregados de moléculas o fragmentos de las con otras proteínas o tales como mediante la expresión de proteínas de fusión recombinantes que consisten de polipéptidos heterologos fusionados al terminal N o el terminal C de un polipéptido de una molécula Por el péptido conjugado puede ser un péptido heterólogo señal por el líder factor alfa de o un péptido tal como una cola de un Las proteínas de fusión que contienen las moléculas biespecíficas pueden consistir de péptidos añadidos para facilitar la purificación o la identificación de la molécula Asimismo puede unirse un polipéptido de la molécula biespecífica al péptido FLAG tal como se escribe en Hopp et y 1 El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo enlazado de manera reversible a un anticuerpo monoclonal específico permitiendo el rápido ensayo y la fácil purificación de la proteína recombinante expresada Se encuentran disponibles reactivos útiles para la preparación de proteínas de fusión en las cuales el péptido FLAG se fusiona a un polipéptido El término tal como se utiliza en la presente memoria incluye las formas nativa y muteína de los polipéptidos derivados de la región Fe de un se incluyen formas truncadas de dichos polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la Las proteínas de fusión q ue contienen entidades Fe los ol igómeros formados a partir de ofrecen la ventaja de u na fácil purificación mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína U n poli péptido Fe descrito en la Solicitud PCT WO 0151 y en las Patentes Estadounidenses 048 y 522 una de las cuales se incorpora por referencia en la presente es un pol ipéptido de cadena simple que se extiende desde la región bisagra N term inal hasta el terminal C de la región Fe de un anticuerpo humano lgG 1 Otro polipéptido Fe útil es la muteína Fe descrita en la Patente Estadounidense y en Baum et 1 EM BO J 1 La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la secuencia de Fe nativo presentada en WO 01 51 excepto en que el aminoácido 1 9 fue cambiado de Leu a el aminoácido 20 fue cam biado de Leu a Glu y el am inoácido 22 fue cam biado de Gly a La muteína exhibe una afinidad disminuida por los receptores de En otras la porción variable de las cadenas pesada ligera de una molécula biespecífica tal como se divulga en la presente memoria puede utilizarse en sustitución de la porción variable de una cadena pesada De forma el oligómero es una proteína de fusión que consiste de múltiples polipéptidos de la molécula con o sin cuerpos de unión de péptidos Entre los cuerpos de unión de péptidos apropiados se encuentran los que se describen en las Patentes Estadounidenses U 180 y Otro método para la preparación de derivados oligoméricos de las moléculas biespecíficas involucra el uso de una cremallera de Los dominios de la cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se Las cremalleras de leucina fueron originalmente identificadas en varias proteínas de unión al ADN et Science y desde entonces han sido halladas en una variedad de proteínas De entre las cremalleras de leucina conocidas algunas son péptidos que se encuentran en la naturaleza y derivados de éstos que se dimerizan o Algunos ejemplos de dominios de cremalleras de leucina apropiados para la producción de proteínas oligoméricas solubles se describen en la Solicitud PCT WO y la cremallera de leucina derivada a partir de la proteína surfactante D de pulmón descrita en Hoppe et FEBS Letters 191 lo cual se incorpora por referencia en la presente La utilización de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heterologa fusionada a la misma se describe en Fanslow et En un las proteínas de fusión recombinantes que consisten de un fragmento de una molécula biespecífica o de un derivado fusionado a un péptido de una cremallera de leucina se expresan células huésped y los fragmentos o derivados de las moléculas biespecíficas oligoméricas solubles que se forman se recuperan a partir del sobrenadante del En otro la presente invención da a conocer una molécula biespecífica que posee una vida media de al menos un día in vitro o in vivo al ser administrada a un En una el anticuerpo posee una vida media de al menos tres En otra el anticuerpo o porción de éste posee una vida media de cuatro días o En otra el anticuerpo o porción de unión al antígeno de éste se derivatiza o modifica de forma tal que posea una vida media mayor en comparación al anticuerpo no derivatizado o no En otra el anticuerpo contiene mutaciones de punto para aumentar la vida media en el tal como se describe en WO se dan a conocer los ácidos nucleicos que codifican las cadenas polipeptídicas de una molécula biespecífica de la o un muteína o variante de la los polinucleótidos necesarios para la realización de sondas de cebadores de PCR o cebadores de secuencia para la el la mutación o la amplificación de un polinucleótido que codifica un ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un y las secuencias complementarias de las anteriores Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier Pueden ser por 1 1 1 o más nucleótidos de pueden contener una o más secuencias por secuencias ser parte de un ácido nucleico de mayor por un Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra simple o de hebra doble y pueden constituir nucleótidos de ARN y variantes de los mismos ácidos nucleicos Puede aislarse el ADN que codifica los polipéptidos de un anticuerpo cadena pesada o dominio variable sólo o longitud a partir de células B de ratones que han sido inmunizados con o esclerostina o un fragmento inmunogénico de cualquiera de Puede aislarse el ADN utilizando técnicas convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa Otro ejemplo de técnica conocida es mediante la cual pueden prepararse derivados de En un los polipéptidos que son componentes de un anticuerpo de interés se expresan en cualquier sistema de expresión recombinante y a los polipéptidos expresados se les permite ensamblarse para formar moléculas de La invención asimismo da a conocer ácidos nucleicos que se hibridan para formar otros ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación Los métodos para la hi bridación de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica por Current Protocols in Molecular John Wiley N 1 1 Tal como se define en la presente una condición de hibridación moderadamente fuerte utiliza una solución de prelavado que contiene 5 x cloruro de de sodio 1 mM EDTA buffer de hibridación de alrededor de de 6x y una temperatura de hibridación de C otras soluciones de hibridación similares tales como una que contenga alrededor de de con una temperatura de hibridación de C y condiciones de lavado a en Una condición de hibridación fuerte híbrida en 6x SSC a seguida de uno o más lavados en 1 x SDS at Más aun un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación lavado para incrementar o dism inuir la fuerza de la hibridación de forma tal que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son idénticas u nas con otras en al menos 98 o típicamente permanecen hibrídadas unas con Los parámetros básicos que afectan la elección de condiciones de hibridación así como las directrices para el diseño de condiciones apropiadas se describen por Fritsch y Maniatis 1 Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring N capítu los 9 y 1 1 y Current Protocols in Molecular 1 Ausubel et al John Wiley I secciones 0 y y pueden ser determinados por cualquiera que posea experiencia en la técnica basándose por la longitud composición en bases del ADN Pueden introducirse cambios en un ácido nucleico mediante mutación lo cual genera cam bios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que el primero Pueden introducirse mutaciones utilizando cualquier procedimiento conocido en la En una realización se cambian uno o más residuos aminoácidos en particular por ejem un protocolo de mutagénesis dirigida a un En otra real ización se cam bian uno o más residuos seleccionados aleatoriamente util por un protocolo de mutagénesis De cualquier forma que se puede expresarse un polipéptido mutante y luego detectarse una propiedad especial med iante métodos de Pueden introducirse mutaciones en un ácido nucleico sin alterar de manera significativa la actividad biológica de un polipéptido que el primero codifica Por pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que dan lugar a sustituciones de am inoácidos en residuos aminoácidos no De forma alternativa pueden introducirse una o más m utaciones en un ácido nucleico que cambian la actividad biológica de un polipéptido que el primero Por la mutación puede cambiar la actividad biológica de manera cuantitativa o Entre algunos ejemplos de cambios cuantitativos se incluyen el la disminución o la eliminación de la Entre algunos ejem plos de cambios cualitativos se i ncluye el cam bio de la especificidad de un anticuerpo por el Pueden realizarse modificaciones conservadoras en las cadenas pesada y ligera que se describen en la presente memoria las modificaciones correspondientes en los ácidos nucleicos que las para producir una molécula biespecífica que posea las características funcionales y bioquímicas Los métodos para lograr dichas modificaciones son los descritos Los anticuerpos de cadena simple que se contemplan para su utilización con las moléculas biespecíficas de la invención pueden formarse mediante la unión de fragmentos del dominio variable de las cadenas pesada y la cual se contempla en esta memoria mediante un puente de aminoácidos peptídico dando lugar a una única cadena Dichos Fv de cadena única mediante la fusión de ADN que codifica al conector peptídico entre los ADN que codifican los dos polipéptidos de dominio variable y Los polipéptidos resultantes pueden replegarse en sí mismos para formar monómeros de unión al o pueden formar multímeros trímeros o dependiendo de la longitud de un conector flexible entre los dos dominios variables et 1 Kortt et 2001 Pueden formarse scFv multiméricas que se unen a epítopos diferentes mediante la combinación de diferentes polipéptidos que comprenden VL y VH et 2001 Entre los procedimientos desarrollados para la producción de anticuerpos de cadena simple se incluyen las descritas en la Patente Estadounidense 1 Science Huston et USA Ward et 1 Nature de Graaf et Methods Mol Las proteínas y fragmentos funcionales de éstas contempladas en la invención pueden modificarse en mayor grado de varias Por si están destinados para su utilización para usos pueden conjugarse con polietilenglicol a fin de prolongar la vida media en suero o aumentar la disponibilidad in situ de la De manera la región V de los anticuerpos o fragmentos contemplados puede fusionarse con la región Fe de una molécula diferente del La región Fe que se utiliza para este propósito puede modificarse de forma tal que no se une a un disminuyendo de esa manera la probabilidad de inducir la lisis celular en el paciente cuando la proteína de fusión se utiliza como agente Por otra los anticuerpos o fragmentos de éstos contemplados en la presente memoria pueden conjugarse con albúmina de suero humano par aumentar la vida media del anticuerpo o fragmentos de éste en Otra contraparte de fusión para los anticuerpos o fragmentos de éstos contemplados por la invención es la transtiretina TTR posee la capacidad de formar un por lo que una proteína de fusión puede formar un anticuerpo lo cual puede aumentar su avidez de De manera pueden lograrse modificaciones sustanciales en las características funcionales bioquímicas de los anticuerpos y fragmentos que se describen en la presente memoria mediante la creación de sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de la estructura del esqueleto molecular en el área de la por en forma de sábana o en formación la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio o la voluminosidad de la cadena Una de aminoácidos puede involucrar una sustitución de un residuo aminoácido con un residuo no nativo que posee poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo aminoácido en esa Más cualquier residuo nativo en el polipéptido con tal como se describió antes para la mutagénesis por escaneo de Un experto en la técnica puede implementar sustituciones de aminoácidos conservadoras como no en los anticuerpos contemplados en la presente memoria mediante la aplicación de técnicas de Pueden utilizarse sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de los anticuerpos o moléculas biespecíficas de la invención que se dan a conocer en esta o para aumentar o disminuir la afinidad de estos anticuerpos o moléculas biespecíficas de la invención por o esclerostina humanos o para modificar la afinidad de unión de otras moléculas biespecíficas que se describen en la presente Expresión Las moléculas biespecíficas y los fragmentos funcionales pueden prepararse mediante varias técnicas convencionales de manera de expresar las secuencias de ácido n ucleico que se muestran en la tabla 1 o para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la tabla 1 Por es posible producir moléculas biespecíficas mediante sistemas de expresión utilizando cualquiera de las técnicas conocidas por Monoclonal A New Dimensión in Biological Kennet et al Plenum Nueva York 1 y A Laboratory Harlow y Lañe Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring 1 Las molécu las biespecíficas de la presente invención pueden expresarse en las l íneas celulares de los hibridomas o en las líneas celulares que no correspondan a los Es posible utilizar los constructos de expresión q ue codifican los anticuerpos para transformar una célula anfitriona de mam de insecto o m icrobiana Es posible realizar la transformación utilizando cualquiera de los métodos conocidos para introducir polinucleótidos en una célula por ejemplo mediante el empaque del polinucleótido en un virus o en un bacteriófago y luego transduciendo una célu la anfitriona con el constructo mediante procedimientos de transinfección conocidos en la tales como los que se ejemplifican en las publicaciones estadounidenses 21 y El procedimiento de transformación óptimo a uti lizar dependerá del tipo de célula anfitriona a Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mam íferos son bien conocidos en la técnica e i ncluyen sin limitarse transinfección mediada con precipitación de fosfato de transinfección mediada con fusión de encapsulado de los polinucleótidos en los mezcla de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente y m icroinyección directa de ADN a los Los constructos de la expresión recombinante de la invención típicamente consisten de una molécula de ácido n ucleico que codifica a un polipéptido que incluye uno o más de los una región constante de cadena pesada ejem CH 1 CH2 una región variable de cadena pesada y al menos dos o más regiones variables de cadena pesada una región constante de cadena una región variable de cadena ligera y al menos dos o más regiones variables de cadena una o más regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera o pesada de la molécula y opcionalmente una secuencia conectora entre mú ltiples regiones Estas secuencias de ácido nucleico se insertan dentro de un vector de expresión adecuado utilizando técnicas de ligadura En algunas se utilizan vectores que emplean ensayos de complementación de fragmentos de proteínas utilizando indicadores tales como dihidrofolato reductasa por la publicación estadounidense Es posible adquirir vectores de expresión de por ejem I nvitrogen Life Technologies o de BD Biosciences Otros vectores útiles para la clonación y expresión de los anticuerpos y fragmentos de la invención incluyen aquellos descritos en Bianchi y Biotech Biotechnol Bioeng Se analizan vectores de expresión adecuados por en Methods Enzymol vol 1 85 Goeddel 1 Nueva Academic el cual se incorpora a la presente memoria a modo de los vectores de expresión util izados en cualquiera de las células anfitrionas contienen secuencias para el mantenimiento del plásmido o virus y para la clonación y la expresión de secuencias de nucleótidos Dichas llamadas de manera colectiva por lo general incluyen una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos operativamente un una o más secuencias un origen de replicación una secuencia de term inación de transcripción una secuencia de intrones completa con un sitio de empalme para un donante o un una secuencia que codifique para una secuencia líder de secreción de un sitio de unión de una secuencia de poliadeni lación una región policonectora para insertar el ácido nucleico que codifica para el polipéptido a y un elemento de marcado el vector podrá contener una secuencia de codificación de que es una molécula oligonucleotídica situada en el extremo o de la secuencia la secuencia oligonucleotídica que codifica para m u is por ejemplo u otra para la cual existan anticuerpos disponibles a nivel tales como HA del virus de la o La cola se encuentra típicamente fusionada a la proteína del anticuerpo luego de la y puede utilizarse para lograr la purificación por afinidad del anticuerpo en la célula Es posible lograr la purificación por por ejemplo mediante utilizando anticuerpos contra la cola como matriz de es posible a retirar la cola del polipéptido del anticuerpo purificado mediante varias como por ejemplo la utilización de algunas peptidasas para la Las secuencias flanqueantes en el vector de expresión pueden ser homólogas a partir de la misma especie cepa que la célula heterólogas a partir de una especie diferente de la célula o cepa de la célula híbrida una combinación de la secuencias flanqueantes obtenidas a partir de más de una sintéticas o Como la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o cualquier organismo vertebrado o o cualquier con la condición de que la secuencia flanqueante sea funcional y pueda ser activada la maquinaria de la célula Pueden obtenerse secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la las secuencias flanqueantes útiles para los propósitos de la presente memoria habrán sido previamente identificadas mediante mapeo digestión de endonucleasas de restricción y por tanto habrán sido aisladas a partir de la fuente de tejido apropiada utilizando las endonucleasas de restricción En algunos puede conocerse la secuencia completa de un nucleótido de una secuencia En la presente la secuencia flanqueante puede ser sintetizada utilizando los métodos descritos en la presente memoria para la síntesis o clonación de ácidos Cuando se conoce la totalidad o sólo una porción de la secuencia puede obtenerse utilizando PCER mediante el screening de una biblioteca genómica con un fragmento de oligonucleótido secuencia flanqueante obtenido a partir de la misma u otra Cuando la secuencia flanqueante no se puede aislarse un fragmento de ADN que contienen una secuencia flanqueante a partir de una porción mayor de ADN que puede por una secuencia de codificación o incluso otro gen o El aislamiento puede lograrse mediante la digestión de endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN adecuado seguida del aislamiento mediante purificación en gel de cromatografía en columna RTM Calif u otros métodos conocidos por el experto en la La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será de fácil comprensión para un experto en la Un origen de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión particularmente aquellos que se obtienen y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula Si el vector de elección no contiene un sitio origen de puede sintetizarse uno químicamente basándose en una secuencia y ligarse dentro del Por el origen de replicación obtenido a partir del plásmido pBR322 England es apropiado para la mayoría de las bacterias y varios orígenes virus de estomatitis vesicular o virus de papiloma tales como HPV o son útiles para la clonación de vectores en células no se requiere un origen de replicación mamífero para los vectores de expresión mamíferos a menudo se utiliza el origen SV40 sólo porque contiene el promotor Los vectores de expresión y clonación de la presente invención típicamente contendrán un promotor que es reconocido por el organismo huésped y se encuentra funcionalmente unido al ácido nucleico que codifica la molécula biespecífica o un fragmento inmunológicamente funcional de la Los promotores son secuencias no transcriptas ubicadas antes del codón de inicio de un gen estructural en el entorno de 100 a 1000 que controlan la transcripción del gen Los promotores se agrupan convencionalmente en una o dos los promotores inducibles y los promotores Los promotores inducibles inician el aumento de los niveles de transcripción a partir del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de En los promotores constitutivos inician la producción continua de genes es existe poco o ningún control experimental sobre la expresión del Se conoce un gran número de reconocidos por una variedad de células huésped Un promotor adecuado se encuentra funcionalmente unido al ADN que codifica la molécula biespecífica mediante la eliminación del promotor del ADN fuente mediante la digestión de enzimas de restricción o la amplificación del promotor mediante reacción de polimerasa en cadena y la inserción del promotor deseado en el También son bien conocidos en la técnica algunos promotores adecuados para su utilización con huéspedes de Los mejoradores de levadura se utilizan ventajosamente con promotores de También son bien conocidos algunos promotores adecuados para su utilización con células huésped mamíferas entre los que se sin limitarse aquellos obtenidos a partir de genomas de virus tales como el virus virus de viruela de aves de adenovirus como Adenovirus virus de papiloma virus de sarcoma virus de hepatitis B y más preferiblemente virus simiano 40 Entre otros promotores mamíferos adecuados se incluyen los promotores mamíferos por los promotores de choque térmico y el promotor de Entre algunos promotores particulares útiles en la práctica de los vectores de expresión recombinante de la invención se sin limitarse la región del promotor temprano de SV40 y 1981 Nature el promotor el promotor contenido en la terminación terminal larga del virus del sarcoma de Rous et Cell el promotor de timidina quinasa de herpes et las secuencias regulatorias del gen de metalotionina et Nature los vectores de expresión procariotas tales como el promotor de beta lactamasa et o el promotor tac et También se encuentran disponibles para su utilización las siguientes regiones de control transcripcional las cuales exhiben especificidad por el tejido y han sido utilizadas en animales la región de control del gen de elastasa I que es activa en células pancreáticas acinares et Ornitz et Cold Spring Harbor Hepatology la región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancráticas Nature la región de control del virud de tumor de mamas de ratón que es activa en células linfoides y mastoides en testículos y mamas et Cell la región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado et Genes y la región de control del gen de la alfa fetoproteína que es activa en el hígado et Hammer et Science la región de control del gen de alfa antitripsina que es activa en el hígado et Genes y la región de control del gen de beta globina que es activa en las células mieloides et Nature Kollias et Cell la región de control del gen de la proteína básica de mielina que es activa en oligodendrocitos en el cerebro et 1 Cell la región de control del gen de la cadena de miosina que es activa en el músculo esquelético 1 Nature la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina et Science y más particularmente la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides et Cell Adames et Nature Alexander et Cell Puede insertarse una secuencia mejoradora en el vector para aumenta la transcripción en eucariotas superiores de un ácido nucleico que codifica una molécula biespecífica o un fragmento inmunológicamente funcional de ésta de la presente Los mejoradores son elementos de actividad cis del usualmente alrededor de bp de que actúan sobre los promotores para aumentar la Los mejoradores son relativamente independientes de la orientación y la Han sido encontrados a y de la unidad de Se conocen varias secuencias mejoradoras disponibles a partir de genes mamíferos alfa fetoproteína e Asimismo puede utilizarse una secuencia mejoradora a partir de un El mejorador el mejorador del promotor temprano del el mejorador de polioma y los mejoradores de adenovirus son elementos mejoradores ejemplificativos de la activación de promotores en Mientras que puede empalmarse un promotor en el vector en una posición a o de una molécula de ácido típicamente se coloca en una posición a del En los vectores de una secuencia de terminación de la transcripción típicamente se ubica a del extremo de una región codificadora de un polipéptido y cumple la función de finalizar la una secuencia de terminación de la transcripción utilizada para la expresión en células procariotas es un fragmento rico en seguido de una secuencia Mientras que la secuencia puede clonarse fácilmente a partir de una biblioteca o aun obtenidas comercialmente como parte de un también puede fácilmente sintetizarse utilizando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos tales como los que se describen en la presente Un elemento de gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo Los genes marcadores típicos utilizados en vectores de expresión codifican proteínas que otorgan resistencia a los antibióticos u otras por la la o la kanamicina en células huésped complementan las deficiencias auxotróficas de la o suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de un medio Entre algunos ejemplos de marcadores seleccionabas se incluyen el gen de resistencia a la el gen de resistencia a la y el gen de resistencia a la También puede utilizarse para la selección tanto en células huésped procariotas como eucariotas un gen bacteriano de resistencia a la Pueden utilizarse otros genes de selección para amplificar el gen que será La amplificación es un proceso mediante el cual los genes que no pueden ser expresados en una única copia a niveles suficientemente altos para permitir la supervivencia y el crecimiento de células bajo ciertas condiciones de selección se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células Entre algunos ejemplos de marcadores seleccionabas amplificables para células mamíferas se incluyen la dinhidrofolato reductasa y timidina quinasa carente de Al usar estos marcadores las células mamíferas transformantes se adaptan exitosamente a sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el Se impone presión de selección mediante el cultivo de las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio se aumenta permitiendo así la supervivencia de sólo aquellas células en las cuales el gen de selección has sido Bajo estas el ADN adyacente al gen de tal como el ADN que codifica una molécula biespecífica de la es con el gen de Usualmente se necesita un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de la traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia de o una secuencia de Kozak El elemento típicamente se ubica a del promotor y a de la secuencia de codificación del polipéptido a En algunos por ejemplo cuando se desea la glicosilación en sistema de expresión en células huésped pueden manipularse varias para mejorar la glicosilación o el Por puede alterarse el sitio de lisis de una peptidasa para un péptido señal en o pueden añadirse las cuales también pueden afectar la El producto proteico final puede poseen en la posición al primer aminoácido de la proteína uno o más aminoácidos adicionales que inciden en la los cuales pueden no haber sido totalmente Por el producto proteico final puede poseer uno o dos residuos aminoácidos que se encuentran en el sitio de lisis de la añadidos al terminal De manera la utilización de algunos sitios de lisis enzimática pueden derivar en una forma levemente truncada pero activa del polipéptido si la enzima corta en dicha área dentro del polipéptido Cuando un vector de expresión comercialmente disponible carece alguna de las secuencias flanqueantes deseadas que se describen el vector puede modificarse mediante la ligazón individual de estas secuencias en el Después del que el vector ha sido seleccionado y modificado de la manera se inserta una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula biespecífica o un fragmento inmunológicamente funcional de la misma en el sitio adecuado del El vector completado que contiene secuencias que codifican el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional de éste de la invención se inserta en una célula huésped adecuada para la amplificación la expresión de La transformación de un vector de expresión para una molécula biespecífica o fragmento inmunológicamente funcional de la m isma en una célula huésped seleccionada puede lograrse mediante métodos bien conocidos incluyendo métodos tales como la tranfección la el cloruro de la electoporación la microinyección la lipofección el método u otra técnica conocida El método seleccionado será en parte u na función del tipo de célula huésped a Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica La célula huésped transformada cuando se cultiva bajo las condiciones sintetiza una molécula biespecífica o un fragmento funcional de ésta q ue puede subsiguientemente ser recolectada a partir del medio de cultivo la célula huésped la secreta en el o directamente a partir de la célula huésped que la produce no es La selección de una célula huésped apropiada dependerá de varios tales como los niveles de expresión las modificaciones en polipéptidos que son deseables o necesarias para la actividad como la glicosilación o la y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa Son bien conocidas en la técn ica ciertas líneas de célu las íferas que se encuentran d isponibles como huéspedes para la entre las que se incluyen sin limitarse muchas líneas de células inmortalizadas que se encuentran disponibles a partir de American Type Culture Collection tales como las células de ovario de hámster chino células células de riñon de cría de hámster células de riñón de mono células de carcinoma hepatocelular humano Hep y un número adicional de líneas de En ciertas la mejor línea de células para expresar un constructo de ADN en particular puede seleccionarse mediante el ensayo de varias líneas de células para determinar cuáles poseen los más altos niveles de niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a Formulación En ciertas la invención también se refiere a composiciones que comprenden las moléculas biespecíficas que constituyen el objeto de la invención o sus fragmentos junto con uno o más de lo un diluyente farmacéuticamente un un un un un Dichas composiciones pueden contener una cantidad efectiva de la molécula bioespecífica o fragmentos inmunológicamente funcionales de la Por lo también se incluye el uso de los anticuerpos y fragmentos que se proporcionan en la presente en la preparación de una composición farmacéutica o un Dichas composiciones pueden ser utilizadas en el tratamiento de una serie de enfermedades tal como las que se indican más adelante en la sección de ejemplos de Los componentes aceptables de formulación para preparaciones farmacéuticas no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones em Además de las moléculas los y los fragmentos que se proporcionan las composiciones de acuerdo con la invención pueden contener componentes para mantener o por el pH la viscosidad isotonicidad esterilidad estabilidad velocidad de disolución o liberación adsorción o penetración de la composición Los materiales apropiados para la formulación de composiciones farmacéuticas pero no se limitan aminoácidos como g glutamina arginina o antioxidantes como ácido sulfito de sodio o sulfito de h idrógeno soluciones amortig uadoras como fosfatos u otros ácidos agentes de relleno como man itol o glici agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético agentes complejantes como polivin ciclodextri na o d y otros carbohidratos como mañosa o proteínas como albúmina sérica gelatina o agentes saborizantes y agentes polímeros hidrófilos como pol ipéptidos de bajo peso contraiones formadores de sales como conservantes como cloruro de ácido ácido timerosal alcohol clorhexid ácido sórbico o peróxido de solventes como propilenglicol o o alcoholes de azúcar como manitol o agentes de agentes tensoactivos o humectantes ésteres de polisorbatos tal como polisorbato polisorbato agentes potenciadores de la estabilidad sacarosa o agentes potenciadores de la tonicidad como haluros de metales preferentemente cloruro de sodio o manitol vehículos de excipientes y o adyuvantes Pharmaceutical 18a Publishing que se incorporan aquí por El vehículo primario o soporte en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no Los vehículos o soportes adecuados para tales composiciones incluyen agua para solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal posiblemente complementado con otros materiales con composiciones comunes para administración Otros ejemplos de vehículos incluyen solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de Las composiciones que comprenden moléculas biespecíficas o sus fragmentos se pueden preparar para su almacenamiento mediante la mezcla de la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales en forma de torta liofilizada o solución las moléculas biespecíficas o sus fragmentos se pueden formular como un liofilizado utilizando excipientes tal como sacarosa Los componentes de la formulación están presentes en concentraciones aceptables para el sitio de Las soluciones amortiguadoras se utilizan ventajosamente para mantener la composición a un pH fisiológico o en un pH ligeramente más típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente a aproximadamente entre aproximadamente y Las composiciones farmacéuticas pueden comprender solución amortiguadora TRIS de aproximadamente pH o solución amortiguadora de acetato de aproximadamente pH que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado Una composición farmacéutica puede incluir una cantidad efectiva de moléculas biespecíficas o sus fragmentos en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de Mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril u otro vehículo las soluciones pueden prepararse en forma de dosis Los excipientes adecuados pero no se limitan materiales tal como carbonato de carbonato de sodio o o fosfato de o agentes tal como gelatina o goma o agentes lubricantes tal como estearato de ácido esteárico o Las composiciones farmacéuticas adicionales se ecuentran en forma de formulaciones de liberación sostenida o Pueden utilizarse técnicas para la formulación de una variedad de otros medios de liberación sostenida o tal como soportes de micropartículas o grageas porosas e inyecciones depot por que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones Los preparados de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma por películas o poliláctidos de U U y EP copolímeros de ácido y gama et 1 Biopolímeros poli et 1981 J Biomed Mater 1 y de vinilo et o ácido 1 Las composiciones de liberación sostenida pueden incluir también que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la Véase por Eppstein et EP EP 088046 y EP La composición farmacéutica a ser utilizada para la administración in vivo normalmente es La esterilización puede llevarse a cabo por filtración a través de membranas de filtración Si la composición es la esterilización puede llevarse a cabo ya sea antes o después de la liofilización y La composición para administración parenteral puede ser almacenada en forma liofilizada o en una En ciertas las composiciones parenterales se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso por una bolsa o vial de solución intravenosa con un tapón perforable mediante una aguja de inyección h ipodérm o una jeringa estéril precargada lista para uso i U na vez formulada la composición farmacéutica de la se puede almacenar en viales estériles como gel o como polvo deshidratado o Tales form ulaciones pueden ser almacenadas en una forma lista para usar o en una forma liofil que se reconstituye antes de su administración Los com ponentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferentemente de alta pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente dañinos al menos de grado Nacional de Alimentos generalmente al menos de grado y más típicamente por lo menos de calidad las com posiciones destinadas para uso in vivo son generalmente En la medida en que un com puesto dado debe ser sintetizado antes de su el producto resultante se encuentra típicamente sustancialmente l ibre de cualquier agente potencialmente particularmente que pueden estar presentes durante el proceso de síntesis o purificación Las composiciones para adm inistración parenteral son también sustancialmente isotónicas y en cond iciones GMP Prácticas de La presente invención proporciona kits para producir dosis múltiples o unidades de dosis únicas de admi nistración Por cada uno de los kits de acuerdo con la invención puede contener un primer recipiente con una proteína seca y un segundo recipiente con un diluyente incluyendo por ejemplo jeringas precargadas con una o múltiples cámaras jeringas para liojeringas o jeringas sin Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía típicamente por La inyección pueden ser intracerebral intralesional o Pueden utilizarse gotas oculares para administración En algunos las inyecciones pueden ubicarse en las cercanías de un hueso en particular o de los huesos a los que se dirige el Para la administración los anticuerpos pueden ser administrados en una solución acuosa libre de parenteralmente aceptable que comprende las moléculas biespecíficas deseadas o fragmentos de las mismas en un vehículo farmacéuticamente Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que las moléculas biespecíficas o fragmentos de las mismas se formulan como una solución conservada en forma Las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas biespecíficas que constituyen el objeto de la invención y sus fragmentos se pueden administrar por inyección en bolo o continuamente por por dispositivo de sistemas de liberación sostenida u otros medios para lograr una liberación La composición farmacéutica tam bién puede ser adm inistrada localmente a través de la implantación de una una esponja u otro material adecuado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula Cuando se emplea un d ispositivo de el dispositivo puede ser implantado en cualquier tej ido u órgano y la liberación de la molécula deseada puede ser a través de difusión bolo de liberación o liberación La preparación puede formularse con un tal como microesferas partículas compuestos poliméricos ejem ácido ácido o ácido copoli grageas o que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que luego puede ser administrado a través de una inyección La formulación con ácido hialurónico tiene el efecto de promover duración sostenida en la Las composiciones de la invención que comprenden una molécula biespecífica o su fragmento funcional se pueden formular para En estas una molécula biespecífica se formula como un polvo seco para inhalación o también se pueden formular soluciones para inhalación de molécula biespecífica con un propeiente para suministro en aerosol tal como por nebulización La administración pulmonar se describe adicionalmente en que describe la administración pulmonar de las proteínas modificadas y que se incorpora aquí por Ciertas composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar a través del tracto como ser por vía Las moléculas biespecíficas que constituyen el objeto de la invención o sus fragmentos que se administran de esta manera se pueden formular con o sin los soportes habitualmente utilizados en la composición de formas de dosificación sólidas tal como comprimidos y Una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y la degradación se reduce al Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción de la molécula biespecífica o sus fragmentos Para la administración se pueden utilizar aminoácidos modificados para conferir resistencia a las enzimas También pueden emplearse ceras de bajo punto de aceites agentes de agentes disgregantes de comprimidos y Las composiciones que constituyen el objeto de la invención que comprenden moléculas biespecíficas o sus fragmentos también se pueden utilizar ex En tales las tejidos u órganos obtenidos del paciente se exponen a la molécula biespecífica o se realiza un cultivo con la Las células cultivadas pueden luego implantarse nuevamente en el paciente o en un paciente diferente o utilizarse para otros En ciertas las moléculas biespecíficas o sus fragmentos se pueden administrar mediante la implantación de ciertas células que han sido genéticamente utilizando métodos tales como los descritos para expresar y secretar el Dichas células pueden ser células animales o y pueden ser o o pueden ser A fin de disminuir la posibilidad de una respuesta las células se pueden encapsular para evitar la infiltración de los tejidos Los materiales de encapsulación son típicamente membranas o recintos poliméricos que permiten la liberación del de los de la pero impiden la destrucción de las células por el sistema inmunológico del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos Posología Las composiciones farmacéuticas proporcionadas pueden ser administradas para tratamientos profilácticos Una se en a una cantidad que es una cantidad pero no del ingrediente activo una molécula biespecífica o su fragmento inmunologicamente para lograr el efecto que es una reducción o eliminación de la gravedad frecuencia de los síntomas mejora o reparación de los Una terapéuticamente se refiere a una cantidad que es suficiente para corregir una afección o los o para retardar o revertir el avance de una enfermedad o cualquier otro síntoma Una profilácticamente se refiere a una cantidad que es eficaz para obstaculizar o retardar la aparición de una afección o En la toxicidad y eficacia terapéutica del anticuerpo o fragmento se puede determinar de acuerdo con procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares animales por la determinación de la DL50 letal para el de la y ED50 terapéuticamente eficaz en el de la La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación Las composiciones preferidas son aquellas que exhiben grandes índices Los datos obtenidos a partir de cultivo celulares estudios con animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosis para seres La dosificación del ingrediente activo típicamente se alinea dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen ED50 con poca o ninguna La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración La cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende moléculas biespecíficas o sus fragmentos a emplear terapéutica o profilácticamente por del contexto terapéutico y los Los expertos en la técnica apreciarán que los niveles de dosificación adecuados para el de acuerdo con ciertas variarán por tanto en de la molécula la indicación para la cual se está utilizando la molécula la vía de y el tamaño la superficie del cuerpo o tamaño de los condición edad y salud del Un médico puede titular la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico Las dosificaciones típicas varían desde aproximadamente 1 pg kg hasta aproximadamente 100 pg kg o dependiendo de los factores mencionados En ciertas la dosis puede variar de 1 pg kg hasta aproximadamente 150 pg o 1 pg kg hasta aproximadamente 100 o 5 pg kg hasta aproximadamente 50 mg En ciertas la dosis es de al menos 1 pg En ciertas la dosis es por lo menos 1 pg En ciertas la dosis es por lo menos 5 pg En ciertas la dosis es por lo menos 5 pg En ciertas la dosis es por lo menos 10 pg En ciertas la dosis es por lo menos 50 pg En ciertas la dosis es por lo menos 100 mg La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula biespecífica o su fragmento inmunológicamente funcional en la Por un médico administrará la composición hasta alcanzar una dosis que logra el efecto La composición por lo se puede administrar en una sola o en dos o más dosis pueden o no contener la misma cantidad de la molécula en el o como una infusión continua a través de un dispositivo de implantación o El tratamiento puede ser continuo o Habitualmente los expertos en la técnica efectúan un ajuste adicional de la dosis adecuada y ello se encuentra dentro del ámbito de las tareas que habitualmente Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante el uso de datos adecuadas de Para tratar un trastorno médico utilizando un método dirigido a esclerostina y o 1 puede administrarse al paciente una composición que comprende las moléculas biespecíficas que constituyen el objeto de la invención o sus fragmentos en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sosten ida en al menos un indicador que refleje la gravedad del Una mejora se considera si el paciente presenta una mejora en al menos dos ocasiones separadas por al menos uno a siete d o en algunos de una a seis El intervalo apropiado dependerá en cierta medida de la afección que se esté el médico experto será quien determi ne el intervalo adecuado para determinar si la mejora es El grado de mejoría se determ ina en function de signos o y también puede emplear cuestionarios realizados al tal como cuestionarios de calidad de vida Pueden evaluarse varios indicadores que reflejan el alcance de la enfermedad del paciente para determ ina r si la cantidad y el tiempo del tratamiento es El valor de referencia para el indicador o indicadores elegidos se establece mediante un examen del paciente antes de la admi nistración de la primera dosis de el examen de referencia se realiza dentro de aproximadamente 60 d ías de administrar la primera Si el anticuerpo se adm inistra para tratar síntomas tal por para tratar una la primera dosis se administra tan pronto como sea posible luego de ocurrida la La mejora se induce mediante la administración de las moléculas biespecíficas que constituyen el objeto de la invención o sus fragmentos hasta que el paciente manifiesta una mejoría respecto de la situación inicial para el indicador o los indicadores En el tratamiento de enfermedades este grado de mejora se obtiene mediante la administración de este medicamento repetidamente durante un período de al menos un mes o por durante o tres meses o o de forma es suficiente un período de una a seis o incluso una sola para el tratamiento de afecciones Para lesiones o afecciones una sola dosis puede ser Aunque el grado de enfermedad del paciente después del tratamiento puede parecer que ha mejorado de acuerdo con uno o más se puede continuar el tratamiento indefinidamente en el mismo nivel o con una dosis o frecuencia Una vez reducido o interrumpido el podrá continuarse luego en el nivel inicial en caso de que los síntomas vuelvan a Las moléculas biespecíficas que constituyen el objeto de la invención y sus fragmentos se pueden utilizar para detectar esclerostina y o en muestras Tales usos permiten la identificación de células o tejidos que producen la proteína o sirven como diagnóstico para detectar condiciones patológicas en las que la esclerostina se produce en exceso o por debajo del nivel Los anticuerpos y fragmentos que se proporcionan también se pueden utilizar en métodos para la detección de una molécula que se une a esclerostina Por puede utilizarse una variedad de métodos de detección En alg unos se pone en contacto una molécula de esclerostina o su fragmento a la que se une una molécula biespecífica con un anticuerpo o fragmento descrito en la junto con otra molécula una molécula Una red ucción en la unión entre la molécula biespecífica o fragmento y esclerostina y o indica que la molécula se une al La unión de la molécula biespecífica o fragmento puede detectarse mediante una variedad de por La detección de la unión entre la molécula biespecífica o fragmento al objetivo se puede simplificar marcando el anticuerpo de manera En algunos una molécula que dem uestra unirse en el análisis in icial se continúa analizando para determinar si inhibe una actividad de esclerostina ejem si la molécula activa la señalización de Métodos de tratam iento y usos En otro se divulga la utilización de los anticuerpos o fragmentos mencionados anteriormente para el tratam iento de varias Algunos por implican la administración a un paciente que lo de una cantidad efectiva de moléculas biespecíficas o fragmentos de la tales como se describen en la presente para el tratamiento de enfermedades sensibles a la renovación de los enfermedades enfermedades neurológ enfermedades enfermedades enfermedades pulmonares y enfermedades de la piel Algunos métodos de tratamiento implican el tratamiento de artritis artropatía psoriásica o Algunos anticuerpos y fragmentos se utilizan para el tratamiento de una enfermedad es sensible a la renovación de los citoblastos y se selecciona del conjunto q ue consiste de insuficiencia cardíaca crónica y enfermedades es una enfermedad inflamatoria seleccionada del conjunto que consiste de enfermedad de Crohn colitis y enfermedad inflamatoria intestinal es una enfermedad neurológica seleccionada del conjunto que consiste de enfermedad de enfermedad de Parkinson y corea de es una enfermedad ocular seleccionada del conjunto que consiste de degeneración macular y es una enfermedad renal seleccionada del conjunto que consiste de nefropatía terminal nefropatía nefritis túbulointersticial y nefropatía es una enfermedad pulmonar seleccionada del conjunto que consiste de enfermedad pulmonar obstructiva fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis qu ística o es una enfermedad de la piel generada como resultado de los daños al epitel io intestinal provocados por quim Adicionalmente se dan a conocer en la presente memoria métodos para tratar o prevenir la pérd ida de masa ósea q ue consisten en admin istrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula biespecífica de la En una la molécula biespecífica de la invención consiste de una reg ión variable seleccionada de uno de los anticuerpos descritos en cualquiera de las publicaciones estadounidenses US US 301 US US US 7 y US 1 01 o de un fragmento inmunológicamente funcional del mismo tal como se describe en la presente En un aspecto de la presente realización el paciente es una persona con cáncer con metástasis en los y en otro el paciente es u na persona con mieloma Entre las afecciones particulares que pueden tratarse con las composiciones de la presente invención se incluyen las en los casos de crecimiento o desarrollo óseo anormal Entre los ejemplos representativos de dichas afecciones se incluyen la la disostosis cleidocraneal la la d isplasia la enfermedad de el raquitismo el síndrome de Marfan la exostosis múltiple hereditaria la osteogénesis im la la osteopoiq las lesiones pseudoartrosis y la osteomielitis piogénica Entre otras afecciones que pueden tratarse o prevenirse se incluyen una am plia variedad de causas de osteoporosis y disminución de la masa Entre los ejemplos representativos de dichas afecciones se incluyen la enfermedad periodontal la dism inución de la masa ósea ind ucida por el consumo de fármacos el hiperparatiroidismo primario o el síndrome de hiperparatiroidismo la d ism inución de la masa ósea inducida por osteoporosis en la disminución de la masa ósea postmenopáusica la osteodistrofia renal los trastornos óseos la disminución de la masa ósea osteonecrosis la enfermedad de Paget la la enfermedades del metabol ismo la la anemia la enfermedad ósea isquém ica como la enfermedad de la osteoporosis regional m los estados las afecciones causadas por la dism inución de la masa ósea inducida por el uso de la disminución de la masa ósea inducida por el uso de heparina los trastornos de la médula el la desnutrición la deficiencia de la osteopenia u osteoporosis idiopática la osteopenia u osteoporosis el la hepatopatía el estado las afecciones inflamatorias crón la artritis la enfermedad inflamatoria la colitis la colitis inflamatoria la enfermedad de Crohn la el la diabetes mell el los trastornos de la los trastornos de la glándula el síndrome de la acromegal el h la inmovilización o falta de util ización el síndrome de distrofia simpática la osteoporosis regional la la disminución de la masa ósea asociada a la sustitución de articu la d isminución de la masa ósea asociada al VI H la dism inución de la masa ósea asociada a la pérdida de la hormona de crecim la dism inución de la masa ósea asociada a la fibrosis q uística la displasia la disminución de la masa ósea asociada a la quimioterapia la disminución de la masa ósea inducida por la dismi nución de la masa ósea relacionada con el la d isminución de la masa ósea por supresión el m ieloma la dism inución de la masa ósea i nducida por la anorexia la d ism inución de la masa ósea facial asociada a la disminución de la masa ósea craneal asociada a la disminución de la masa ósea maxilar asociada a la disminución de la masa ósea del cráneo asociada a enfermedades y la dism inución de la masa ósea asociada a los viajes espaciales Otras afecciones se relacionan con la dism inución de la masa ósea con la incluida la dism inución de hueso facial asociada a la la dism inución de hueso craneal asociada a la la d ismin ución de hueso maxilar asociada a la vejez y la dism inución de hueso del cráneo asociada a la Las composiciones de la presente invención también podrían ser útiles para mejorar los resultados de los procedim ientos los procedimientos los implantes los transplantes de articulaciones ejemplo de la cadera o de la rodi los injertos las cirugías estéticas óseas y las reparaciones óseas tales como la consolidación de una fractura de una una consolidación retardada y la reconstrucción facial Una o más composiciones podrán adm inistrarse durante posteriormente al proced im cirug ía o cirug ía En ciertas real izaciones se prevé la liberación local de las moléculas de unión de la invención para indicaciones sin l imitarse sitios de espondilodesis u En una la molécula de unión se libera a través de una inyección local en el sitio del En otra realización se agrega una secuencia de unión adicional a las moléculas de unión de la invención para dirigir a las moléculas de unión contra las proteínas que se encuentran restring idas dentro la matriz extracelular del lo cual puede mejorar el tiempo de retención en el sitio del tratamiento y la farmacocinética de la molécula de un ión con lo que se mejora la Entre algunos ejemplos de dichas proteínas se incluyen sin l imitarse colágeno tipo 1 sialoproteína ósea y proteína de la matriz En ciertas la secuencia de unión adicional es un péptido de unión o una secuencia de u na proteína Avimer que se une a las proteínas que se encuentran restringidas dentro la matriz extracelular del La siguiente es una lista no limitativa de las realizaciones específicas contem pladas por la presente Se contempla que cuando un VH 1 o CDR de un VH 1 se selecciona de los cuerpos de unión a la el VH2 o CDR de un se selecciona de los cuerpos de unión a De manera cuando un VH I o CDR de un VH 1 se selecciona de los cuerpos de unión a the VH2 o CDR de un VH2 se selecciona de los cuerpos de unión a la Se contempla asimismo que cuando un VL 1 o CDR de un VL 1 se selecciona de los cuerpos de unión a la esclerostina the o CDR de u n VL2 se selecciona de los cuerpos de unión a De forma inversa cuando un VL 1 o CDR de un VL1 se selecciona de los cuerpos de unión a the o CDR de un se selecciona de los cuerpos de unión a la 1 Una molécula de unión que consiste de una cadena donde dicha cadena polipeptídica consiste de VH1 VH 1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión se une de manera específica tanto a la esclerostina como a La molécula de unión de la realización 1 donde VH 1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID 1 1 1 1 y o cuerpos de unión a SEC ID y Una molécula de unión que consiste de una cadena donde dicha cadena polipeptídica consiste de VL1 VL 1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión se une de manera específica tanto a la esclerostina como a La molécula de unión de la realización donde VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID y o cuerpos de unión a SEC ID y La molécula de unión de la realización 1 o donde se encuentra Una molécula de unión que consiste de una primera y una segunda cadena donde dicha primera cadena polipeptídica consiste de donde VH1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde dicha segunda cadena polipeptídica consiste de a VL1 donde VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión se une de manera específica a la esclerostina y a La molécula de unión de la realización donde los dominios variables de cadena pesada VH 1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC I D 1 1 1 y o cuerpos de unión a SEC I D 31 y y donde los dominios variables de cadena ligera VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC I D 1 1 1 1 1 51 1 1 91 1 y o cuerpos de unión a SEC ID 231 271 31 1 351 391 y La molécula de unión de la realización 1 o donde es una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del conjunto que consiste de las SEC I D 41 La molécula de unión de las realizaciones donde la molécula de unión consiste de dos primeras cadenas polipeptídicas y dos segundas cadenas 1 La molécula de unión de la realización 1 o donde la región Fe se selecciona del conjunto que consiste de una región Fe de secuencia nativa y una región Fe de secuencia 1 1 La molécula de unión de la realización 1 donde la región Fe se selecciona del conjunto que consiste de una región Fe de un lgG2 IgM y 1 La molécu la de unión de la real ización 1 o donde dicho VH 1 de la primera cadena polipeptidica y dicho VL1 de la segunda cadena polipeptidica se obtienen del mismo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en 1 La molécu la de unión de la realización 1 o donde dicho VH 1 de la primera cadena polipeptidica y d icho VL1 de la segunda cadena polipeptidica se obtienen de diferente anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en La molécu la de unión de la realización 1 o donde dicho VH2 de la primera cadena polipeptidica y dicho VL2 de la segunda cadena polipeptidica se obtienen del mismo anticuerpo parental o porción de un ión al antígeno en La molécula de unión de la realización 1 o donde dicho VH2 de la primera cadena polipeptídica y dicho VL2 de la segunda cadena polipeptídica se obtienen de diferente anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en La molécula de unión de la realización 1 o 6 con la condición de que dicho cuerpo de unión no es CH1 La molécula de unión de la realización 1 o donde dicho primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en se une a dicho primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual dicho segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en se une a dicho segundo La molécula de unión de la realización 1 o donde dicho primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en se une a dicho primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la que dicho segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en se une a dicho segundo La molécula de unión de la realización 1 o donde dicho primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en y dicho segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en se seleccionan del conjunto que consiste de un anticuerpo un anticuerpo con injerto de y un anticuerpo La molécula de unión de la realización 1 o donde dicho primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en y dicho segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en se seleccionan del conjunto que consiste de un fragmento un fragmento un fragmento bivalente q ue consiste de dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en una región un fragmento Fd que consiste de los dom inios VH y CH 1 un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo de de un un fragmento una región determinante de complementariedad un anticuerpo de cadena y un 21 La molécula de unión de la realización 1 o donde dicha molécula de unión posee al menos una propiedad deseada exhibida por dicho primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en o dicho seg undo anticuerpo o porción de unión al antígeno en La molécula de un ión de la realización 21 donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros del La molécula de unión de la realización 21 donde dichos parámetros del anticuerpo se seleccionan del conj unto que consiste de especificidad por el afinidad por el función biológica reconocimiento del solubi eficiencia de i nm rectividad cruzada con el y u nión a un anticuerpo Una molécula de unión que se une tanto a la esclerostina como a que consiste de cuatro cadenas donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH 1 VH 1 es un primer dominio variable de cadena pesada VH2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de donde VL1 es un primer dominio variable de cadena VL2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde los dominios variables de cadena pesada VH1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID y o cuerpos de unión a SEC ID y y donde los dominios variables de cadena ligera VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID y o cuerpos de unión a SEC ID y La molécula de unión de la realización 24 con la condición de que dicho cuerpo de unión no es Una molécula de unión que se une tanto a la esclerostina como a que consiste de cuatro cadenas donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH 1 VH 1 es un primer dominio variable de cadena VH2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de VL1 donde VL1 es un primer dominio variable de cadena VL2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión consiste de acoplamientos de VH 1 y VL1 selecionados a partir del conjunto que consiste SEC I D 18 y 22 y 26 y 30 y 34 y 38 y 42 y 46 y 50 y 54 y 56 y 58 y 62 y 66 y 70 y 74 y 78 y 82 y 86 y 90 y 486 y 490 y y 494 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre VH 1 y VL1 son las SEC I D 18 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 22 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 26 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 30 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 34 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 38 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 42 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 46 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 50 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 54 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y VL1 son las SEC ID 56 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 58 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y VL1 son las SEC ID 62 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y VL1 son las SEC ID 66 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y VL1 son las SEC ID 70 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 74 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y VL1 son las SEC ID 78 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 82 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y son las SEC ID 86 y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento entre y VL1 son las SEC ID 90 y La molécula de unión de las realizaciones 3 y donde el VH del conector a la esclerostina consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y y donde el VH del conector a DKK1 consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID NOs donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y La molécula de unión de las realizaciones 3 y donde el VL del conector a la esclerostina consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID NOs donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y y donde el VL del conector a DKK1 consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID NOs donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y La molécula de unión de las realizaciones y donde el VH del conector a la esclerostina consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID NOs donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y y donde el VH del conector a DKK1 consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID NOs donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y y donde el VL del conector a la esclerostina consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID NOs donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y y donde el VL del conector a DKK1 consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de SEC ID NOs donde cada miembro del grupo posee 3 CDR y Una molécula de unión que consiste de cuatro cadenas donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH1 es un primer dominio variable de cadena VH2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de donde VL1 es un primer dominio variable de cadena VL2 es un segundo dominio variable de cadena C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como donde la molécula de unión consiste de 3 VH1 3 VH2 3 VL1 CDR y 3 VL2 donde the paired VH1 y VL1 y paired VH2 y VL2 se seleccionan del conjunto que consiste de las SEC ID or SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de la realización donde dichas CDR de VH1 son SEC ID dichas CDR de VH1 son las SEC ID dichas CDR de VL2 son las SEC ID y dichas CDR de VH2 son las SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho se selecciona del conjunto que consiste de las SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho se selecciona del conjunto que consiste de las SEC ID y La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de la cadena es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de la cadena es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de la cadena es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de la cadena VH1 es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones donde dicho de es la SEC ID La molécula de unión de las realizaciones 26 y donde dicho es diferente en las cadenas y Un método para generar una molécula de unión que se une a la esclerostina y a que consiste de los la obtención de un primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en que puede acoplarse a la esclerostina o la obtención de un segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en que puede acoplarse a la esclerostina o la construcción de las cadenas polipeptidicas primera y tercera que consisten de VH1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de dicho primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de dicho segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de unión con la condición de que no sea donde dicho se encuentra ya sea presente como y es una región donde dicha se encuentra ya sea presente como la construcción de las cadenas segunda y cuarta que consisten de VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de dicho primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de dicho segundo anticuerpo parental o cuerpo de unión al antígeno de C es un dominio constante de cadena es un cuerpo de donde dicho se encuentra ya sea presente como y no comprende una región donde dicha se encuentra ya sea presente como y la expresión de dichas tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de forma tal que se genera una molécula de unión que se une a esclerostina y El método de la realización donde los dominios variables de cadena pesada VH1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID y o cuerpos de unión a SEC ID y y donde los dominios variables de cadena ligera VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID y o cuerpos de unión a SEC ID 391 y El método de la realización donde cada uno de dichos primeros anticuerpos o porciones de unión al antígeno en y cada uno de dichos segundos anticuerpos o porciones de unión al antígeno en se seleccionan separadamente a partir del conjunto que consiste de un anticuerpo un anticuerpo con injerto de y un anticuerpo 81 El método de la realización donde cada uno de dichos primeros anticuerpos o porciones de unión al antígeno en y cada uno de dichos segundos anticuerpos o porciones de unión al antígeno en se seleccionan separadamente a partir del conjunto que consiste de un fragmento un fragmento un fragmento bivalente que consiste de dos fragmentos Fab acoplados por un puente disulfuro en la región bisagra un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 un fragmento Fv que consiste de los dominios VH y CH 1 un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo de un un fragmento una región determinante de complementariedad un anticuerpo de cadena y El método de la realización donde dicho primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en posee al menos una propiedad deseada exhibida por la molécula de El método de la realización donde dicho segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en posee al menos una propiedad deseada exhibida por la molécula de El método de la realización donde la región Fe se selecciona del conj unto que consiste de una región Fe de secuencia nativa y una región Fe de secuencia El método de la realización donde la región Fe se selecciona del conjunto que consiste de una región Fe de una lgG 1 IgM Ig E y El método de la realización donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros del El método de la realización donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros del El método de la realización donde dichos parámetros del anticuerpo se seleccionan del conjunto q ue consiste de especificidad por el afinidad por el potencia función reconocim iento del estabil idad eficiencia de inmunogenicidad farmacocinética biodisponibilidad rectividad cruzada con el y unión a un anticuerpo El método de la realización donde dichos parámetros del anticuerpo se seleccionan del conjunto que consiste de especificidad por el afinidad por el potencia función reconocim iento del estabilidad solubil idad eficiencia de inmunogenicidad farmacoci nética biodisponibilidad rectividad cruzada con el y u nión a un anticuerpo El método de la real ización donde dicho primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en se une a dicho primer antígeno con una afinidad diferente a la afinidad con la que dicho segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en se une a dicho segundo 91 El método de la realización donde dicho primer anticuerpo o porción de unión al antígeno en se une a dicho primer antígeno con una potencia diferente a la potencia con la que dicho segundo anticuerpo o porción de unión al antígeno en se une a dicho segundo El método de la realización con la condición de que dicho cuerpo de unión no es CH 1 Una composición farmacéutica que consiste de la molécula de unión de cualquiera de las realizaciones 1 La molécula de unión de cualquiera de las realizaciones 1 en combinación con uno o más de un diluyente o soporte farmacéuticamente Un método para el tratamiento de un trastorno óseo que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las realizaciones 1 Un método para acelerar la consolidación de fracturas óseas que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las realizaciones 1 Un método para aumentar la densidad ósea que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las realizaciones 1 Un método para aumentar la resistencia ósea que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las realizaciones El método de las realizaciones donde BMC se aumenta en al menos o 200 por ciento en comparación al paciente que no recibe el El método de las realizaciones donde BMD se aumenta en al menos o 200 por ciento en comparación con el paciente que no recibe el Un polinucleótido que codifica la molécula de unión de cualquiera de las realizaciones La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento y VL1 son las SEC ID y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento y son las SEC ID y La molécula de unión de la realización donde el acoplamiento y son las SEC ID y La molécula de unión de la realización donde dichas VL1 CDR son las SEC ID dichas VH1 CDR son las SEC ID dichas VL2 CDR son las SEC ID y dichas VH2 CDR son las SEC ID Tal como se permite en ciertas j urisdicciones todas las referencias que se divulgan en la presente memoria se incorporan por referencia en sus respectivas totalidades tal como si cada una fuese incorporada de manera para cualq uier porpósito incluida la habilitación y la descripción de la Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito exclusive de ilustrar ciertos aspectos de los fragmentos y composiciones que se dan a conocer en la presente memoria y por tanto no han de entenderse como limitativos del alcance de la invención q ue se reivindica TABLA 1 o o ? o O o o o o O o o O o o o O o O o o t o o o I ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCG G2 NA CTGTCAGGTGCAGCTTGTCGAGAGCGGTGGAGGGGTGGTACAACCCGGAAGATCACTCCGGC TTTCATGCGCAGCATCCGGTTTTACATTTTCGCGGTATGACATGCACTGGGTGAGACAGGCAC CAGGAAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCATCATCTTCTATGATGGGTCCAATAAGTACTACGCCG ACCCGGTAAAAGGGAGGTTCACTATTAGCCGCGACAACTCGAAGAATACGCTGTACCTGCAGA TGAACTCGTTGCGAGCCGAAGATACCGCGGTCTACTATTGTGCGACGCTCGCGGCTGCGTTCG ATTACTGGGGCCAAGGAACATTGGTCACGGTCTCCTCAGCGTCAACGAAAGGACCGTCGGTGT TCCCCTTGGCCCCTGAGGTGCAGCTCGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCA TCCGTCAAAGTCTCGTGCAAGGCGTCAGGGTACACATTCACCGACTATAACATGCATTGGGTC CGGCAGGCTCCCGGTCAGGGGCTGGAGTGGATGGGGGAAATCAATCCGAACTCCGGAGGGG CAGGATACAATCAAAAGTTTAAGGGACGCGTAACGATGACCACTGACACGTCAACCTCCACGG CGTATATGGAGCTCAGAAGCCTCCGAAGCGACGACACTGCTGTCTATTACTGTGCGAGACTGG GATATGATGATATCTACGACGATTGGTACTTCGATGTATGGGGACAAGGGACGACGGTCACCG TCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCT CCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG TCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTAC ACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGT TGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGA CGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA ATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCA 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AAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA t o O o o 493 I 1 1 H 1 ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCG G2 NA CTGTGAAGTGCAGTTGGTACAGTCGGGTGGGGGACTGGTGCAGCCAGGGGGTTCGCTTAGGT TGTCGTGCACAGCGTCGGGGTTTACATTCTCAAACCACTGGATTCACTGGGTGAGACAAGCCC CTGGTAAAGGGCTGGAATGGGTCAGCGGGATCAATTGGAATTCAGGCAGCCGGGGATATTCG GATTCCGTAAAAGGAAGGTTCACTATCTCGAGGGATAACGCAAAGAACTCCCTCTATTTGCAGA TGAACAGCCTTCGGGCGGAGGACACGGCAGTCTACTACTGTGCCCGAGAAAGACCCGTGGCC ACAGGCGCGTTTGACATTTGGGGTCAGGGCACGACAGTAACGGTCTCCTCAGCGTCAACGAAA GGACCGTCGGTGTTCCCCTTGGCCCCTGAGGTGCAGCTCGTACAGTCGGGTGCGGAAGTAAA GAAACCCGGCTCATCCGTGAAAGTCTCGTGTAAAGCCTCCGGGTTCACCTTCACAGACTACATT ATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGGCAGGGCCTTGAATGGATGGGGTATATCAACCCCTA CAATGATGACACGGAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGAAGGGTGACAATCACGGCGGATAAGAG CACCAGCACTGCATACATGGAGCTCTCGTCATTGCGCTCGGAGGACACTGCAGTCTACTATTG CGCGAGATCCATCTACTATTACGATGCGCCGTTTGCTTATTGGGGACAAGGAACGCTGGTCAC CGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCA CCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCC TCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACC TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAA TGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCC TCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG GCCTCCCAG CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA CDR se muestran en y la región constante de la cadena pesada se muestra en para las SEC I D 1 y Ejemplos Ejemplo 1 I ngeniería de moléculas de Ig con dominio variable dual y 1 Se uti lizaron anticuerpos dirigidos contra Esclerostina y DKK1 humanos para la construcción de varios conjuntos de moléculas de Ig con dominio variable dual Los ADNs para los genes de cadena ligera y cadena pesada se obtuvieron a partir de hibridomas de rata o ratones Para construir la cadena ligera del dominio el domin io VL del anticuerpo humana se fusionó en tándem mediante un cuerpo de unión primeros 1 2 aminoácidos del domin io CL1 de cadenas con el terminal N del dom inio variable de cadena l igera de DKK1 de un anticuerpo seguido de CL para formar la cadena ligera de de longitud completa De modo el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo humana se fusionó en tándem mediante un cuerpo de unión primeros 1 3 o 1 2 aminoácidos de CH 1 en cadena con el term inal N de VH del anticuerpo u DKK1 segu ido de una región constante completa de cadena pesada La otra versión de DVD es de en el terminal N de cadena de con los respectivos cuerpos de unión El cuerpo de unión entre dos dominios variables de cadena ligera se derivó de la reg ión CL 1 m ientras que el cuerpo de unión entre dos dominios de cadena pesada se derivó de la región CH 1 de la reg ión constante de cadena Todos los constructos de ADN se clonaron en vector pTT5 a través de sitios de restricción Un ejemplo de las moléculas de generadas es el DVD quimérico de 1 H donde de un anticuerpo humana de ratón se unieron al terminal N de la cadena del anticuerpo 1 H 10 humano de rata y contiene la región constante lgG2a de También se obtuvieron con orientación inversa de los dominios donde los dominios variables de humano de 1 1 H se fusionaron con el terminal N de la cadena de de Se seleccionaron cuerpos de unión derivados de dominios constantes de rata para proporcionar estabilidad así como también para obtener un constructo más similar al de Este tipo de anticuerpo biespecífico asimilado al de rata debería poseer menor riesgo de inmunogenecidad potencial al ser utilizado en modelos de rata de corto y largo Ejemplo 2 Expresión de La producción a gran escala de la se llevó a cabo en un biorreactor Wave del modo Se inocularon matraces de 3 L con 1 L cada uno de células a razón de 3E5 células viables por mi Se utilizó medio de expresión F17 y se complementó con 1 6 mM Glutamina y 25 Luego de 48 horas se realizaron recuentos observándose valores de viabilidad entre y Se obtuvo una dilución 1 del cultivo mezclando en una bolsa Wave de 50 1 1 litros de cultivo de con 1 1 litros de medio F 1 7 Un nuevo recuento celular realizado 24 horas más tarde arrojó una viabilidad de Luego se llevó a cabo una dilución 1 10 en medio F1 7 y se agregó mg de ADN plasmídico de cultivo 1 con 3 mi PEI Se agregaron cantidades iguales de ADN para cada una de las cadenas de anticuerpo A las 24 horas post transfección se agregó al cultivo 625 mi de de alimentación en Triptona N 1 en F1 7 con seguido de una incubación de cinco se realizaron recuentos observándose una viabilidad celular de Luego el medio acondicionado se cosechó por centrifugación a 4000 rpm durante 45 minutos y el CM se filtró utilizando un filtro de Se analizó una alícuota del anticuerpo mediante bajo condiciones reductoras y no Ejemplo 3 Purificación y Formulación de la para Estudios In Vivo La se purificó a partir de un cultivo El protocolo de purificación se basó en el uso de la cromatografía de seguida de una cromatografía de de interacción hidrofóbica Concentración del Sobrenadante de los Cultivos Celulares La concentración del sobrenadante de los cultivos celulares se llevó a cabo a mediante el uso de un equipo de TTF de Flujo Se emplearon membranas PES 1 0kD MWCO x 1 pie para concentrar el producto 10 veces El flujo cruzado fue y la presión a través de la membrana fue Cromatografía de Afinidad con Proteína G Se realizó la cromatografía de afinidad con Proteína G a temperatura sin embargo el sobrenadante del cultivo celular se permaneció frío durante la Se mantuvo constante la velocidad del a volúmenes de columna por Se concentraron 20 litros de sobrenadante diez luego se diluyó el resultante con medio volumen de una solución buffer mM de Tris pH 9 y 1 M de citrato de posteriormente se cargó en una columna de Proteína Fast Flow cm2 x equilibrada con M citrato de 25 mM de pH Después de cargar el sobrenadante del cultivo se lavó la columna con una solución M citrato de 25 de pH 9 hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó los valores de la línea de Con posterioridad al se eluyó el anticuerpo con una solución de ácido acético M pH 3 y se colectó la totalidad del pico de La totalidad de la muestra eluida contenía gramos del Después de la se llevó el pool obtenido de la columna de Proteína G inmediatamente a pH 7 con Tris Base 1 Cromatografía en columna de HP Se realizó la cromatografía a temperatura utilizando una columna de con una capacidad de unión de 7 mg de proteína por de Se mantuvo la velocidad del flujo a volúmenes de columna por Se preparó el pool obtenido de la columna de Proteína G para la unión a la HP mediante el agregado de una solución 20 mM de fosfato de 3 M de sulfato de amonio pH7 hasta alcanzar una concentración final de M de sulfato de Se cargaron 1 15 del pool obtenido de la columna de Proteína G en una columna de 35 mL de HP cm2 x equilibrada con una solución 20 mM de fosfato de M de sulfato de pH Después del se lavó la columna con una solución 20 mM de fosfato de M de sulfato de pH 7 hasta que la absorbancia del eluato alcanzara nuevamente los valores de la línea de Se eluyó el producto de la columna de HP con 20 volúmenes de columna con un gradiente lineal decreciente de sulfato de amonio en 20 mM de fosfato de sodio a pH Se colectaron fracciones de volúmenes de columna y se analizaron por HPLC de exclusión molecular para determinar la Se reunieron las fracciones en función del porcentaje del pico mayor para formar un pool de Se recuperó un del obteniéndose un rendimiento de 210 I ntecambio de Buffers y Concentración Se realizó el intercambio de buffers a mediante el uso de cassettes de diálisis de celulosa 10 kD MWCO Se realizó la concentración a mediante el uso del dispositivo para centrifugación PES 10kD Se logró una recuperación del Se sustituyó el buffer de 80 mL del pool obtenido de la columna de HP a 10 mM de 250 mM de pH El volumen del pool de producto después de realizada la diálisis fue de 1 13 con una concentración de proteínas de Después de realizada la el pool de producto se concentró a mediante el uso de un dispositivo de concentración para Se esterilizó el pool de producto mediante filtración La concentración del producto puro filtrado fue de La recuperación total fue del o Se determinó la concentración de endotoxinas en el producto puro esta fue menor a El producto puro filtrado se almacenó a Ejemplo 4 ELISA para Esclerostina y DKK1 Se analizó la capacidad de varios anticuerpos biespecíficos para unirse específicamente a Esclerostina y DKK1 mediante un ensayo de ELISA de Se recubrieron placas con 20 de una solución de 1 de anticuerpo murino MAb 56H2 en buffer de recubrimiento Se emplearon placas de ELISA de mitad de superficie de 96 pocilios y la incubación se realizó durante una hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a Las placas se lavaron una vez con 100 de solución de lavado conteniendo de y luego incubaron con 100 de solución bloqueante conteniendo de suero de cabra y de durante una Se agregó la proteína Esclerostina humana de una solución madre de 10 diluida en solución y se incubó a temperatura ambiente por una seguido de lavados como se describió Se agregaron 20 de diversos anticuerpos biesepecíficos diluidos 625 anticuerpos parentales e IgG relacionadas pero sin relación con humanas o de control en solución bloqueante y se incubaron las placas a temperatura ambiente por una Después de una incubación en solución de se agregaron a las placas 20 de diluida en solución bloqueante y éstas se incubaron durante una hora a temperatura y a continuación se incubaron en solución de Se agregó a los pocilios diluida en solución bloqueante hasta una dilución de y a continuación se incubaron las placas a tem peratura ambiente por un se lavaron tres veces con 1 00 de la solución de lavado En la etapa se agregaron a las placas 20 de solución de trabajo del sistema SuperSignal ELI SA Femto y se midió la señal con un luminómetro a 425 Los resum idos en las Figuras 1 indican que todos los anticuerpos biespecíficos estudiados son capaces de unir ambos ligandos de forma simultánea y por lo tanto ni las secuencias que conectan las reg iones variables de los anticuerpos ni los sitios de unión al ligando de cada dominio variable provocan un limitaciones esféricas significativas para la un ión del segundo Ejemplo 5 Ensayo Biacore para Esclerostina y DKK1 Para profundizar en la demostración de que los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos se evaluó la actividad de unión específica tetravalente dual mediante el análisis Ei anticuerpo de cabra anticuerpo específico del fragmento se inmovi lizó a las cuatro células de flujo del ch CM5 a una densidad de superficie alta 3500 RU inmovi Los anticuerpos se diluyeron a 20 Nm en 25 m pH 250mM de de 1 L de anticuerpo albúmina bovina y se capturaron en células de flujo individual Los ligandos 1 humano y la Esclerosti na se diluyeron a 1 00nM en la misma solución buffer y se inyectaron en forma secuencial sobre los Ig Los sensogramas muestran que cuando el anticuerpo biespecífico se satura con el primer antígeno DKK1 humano como Esclerostina y se inyecta el segundo antígeno se observa una segunda Se observó una respuesta similar al revertir la secuencia de inyección de La observación de dos uniones independientes demuestra que los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a ambos ligandos de forma Ejemplo 6 Bioensayo de activación de Wnt en osteoblastos Los anticuerpos biespecíficos diseñados son capaces de neutralizar la capacidad de los dos antígenos de bloquear la señalización canónica del gen tal como se ha demostrado en el ensayo de activación del gen Wnt en los Las células 1 sufrieron el proceso de transfección con gen reportero TOP Flash y las células más estables fueron seleccionadas y El clon C1 0 fue identificado como el mejor mostró un buen comportamiento en diferentes condiciones y evidenció una disminución de su actividad luego de la incubación ya sea con Esclerostina purificada o con proteínas DKK1 debido a la inhibición de la activación de la transduccion de la señal del gen Las células fueron cultivadas en medio de expansión Alfa conteniendo de suero fetal bovino 1 X de penicilina y estreptomicina y 1 de Cuando las células alcanzaron el de coincidencias el medio se cambió por un medio diferenciado de 50 de ácido ascórbico y 10 mM de durante 4 Luego de la esta linea de células produce proteínas endógenas que desencadenan la activación canónica de los genes Wnt de manera Se aspiró el medio de cultivo y se agregó a la placa de cultivo una nueva muestra de 100uLs con concentraciones de anticuerpos mono y biespecíficos preincubados durante 4hs con DKK1 Esclerostina durante a durante La actividad de las Luciferasas fue medida siguiendo las instrucciones del fabricante Luciferase Assay Cat Varios anticuerpos biespecíficos de humanos y ratas ensayados fueron capaces de activar la transducción canónica del gen Wnt en los osteoblastos de forma proporcional a la dosis tanto en presencia de Esclerostina como de Dkk1 demostrando en mayor grado la capacidad de los anticuerpos para neutralizar simultáneamente la función inhibitoria del gen Wnt sobre ambas proteínas Ejemplo 7 Bioensayo de Luciferasa inducida por Wnt Los anticuerpos biespecíficos diseñados fueron capaces de neutralizar a Dkk1 y bloquear la actividad luciferasa inducida por Wnt1 tal como se determinó mediante ensayo utilizando La línea de osteoblastos MC3T3E 1 fue diseñada mediante transducción lentiviral con un constructo de luciferasa con responsividad al Factor de Célula T un constructo represor de Tet y un constructo de Wnt1 inducible por En este la adición de doxiciclina 1 al medio de cultivo durante indujo la expresión de Wnt1 y la transduccion de la señal mediante la unión de Wnt1 a los receptores y Frizzled en la superficie de la derivando en la expresión del gen indicador de Se incubaron célu las MC3T3E 1 Wnt 1 en la presencia de esclerostina Dkk1 y la señalización Wnt fue in hibida debido a la unión competitiva de la esclerostina y Dkk1 a I nicialmente se mezcló la proteína Dkk1 humana a 1 o proteína de Esclerostina humana 1 con PBS de control o con una di lución en serie de los anticuerpos 24 horas más tarde se determinó la señal de luciferasa como se describe más arriba y se graficaron los datos usa ndo el software PRISM Como se resume en las Figuras 4 y 1 los anticuerpos biespecíficos inhibieron a la esclerostina y a Dkk1 en forma y restauraron la señalización Wnt inducida por la proteína Wnt 1 Ejem plo 8 Método de detección de cuerpos de unión a la Esclerosti na y lo DKK1 Se estableció un método para explorar la capacidad de los cuerpos peptídicos y proteínas Avimer biespecíficas para bloquear la unión de Esclerostina o Dkk1 a Lrp6 usando proteínas purificadas de Dkk1 marcadas con biotina y Esclerostina y Lrp6 o Lrp5 con cola de histid ina Se determinó la capacidad de los Avimer para bloquear Sel o Dkk 1 unidas a mediante un ensayo Se incubaron 5µ? de o biotina y 5µ? de Lrp6 durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se agregaron 5µ? de agente biespecífico durante una hora seguido por otra agregado de 10ul de mezcla de esferas Se incubó la reacción durante 1 hora previo a la lectura de la señal AlphaScreen en un aparato EnVision a La pérdida de señal en los pocilios tratados con el agente biespecífico indicó que los anticuerpos biespecíficos bloquean la unión de Dkk1 y Esclerostina a y podrían de esa forma permitir que varias proteínas Wnt disparen una señalización La Figura 1 9 resume los datos de uno de dichos experimentos de Ejemplo 9 Modelo in vivo de masa ósea y dureza ósea en ratón Estos estudios y sus resultados se muestran en la Figura Diseño del Se utilizaron un total de 45 ratones B6D2F1 machos de 10 En un los animales se dividieron en 5 grupos considerando tanto el peso del cuerpo como la densidad ósea de la región medida por DXA in Los ratones fueron inyectados subcutáneamente ya sea con vehículo o anticuerpos esclerostina o anticuerpos DKK1 o la combinación de anticuerpos Esclerostina y anticuerpos DKK1 o anticuerpo biespecífico dos veces por semana durante 3 Debido a la diferencia en el peso los anticuerpos fueron suministrados a igual molaridad X 1 con dkk1 dkk1 en el grupo Combinación y Los animales fueron escaneados in vivo semanalmente por DXA para monitorear los efectos anabólicos de los huesos como respuesta a las drogas en la regiones vertebral lumbar y luego fueron eutanasiados al finalizar el Se recolectaron los fémures para realizar densitometrías ex vivo y analizar la resistencia de los Densitometría in Los animales fueron escaneados mediante DXA GE Lunar PIXmus I desde la zona de unión de la tibia y la fíbula hasta el cuello del fémur y en la región de las vértebras lumbares a fin de determinar la densidad mineral ósea en área en estos Densitometría ex Los fémures fueron escaneados usando un sistema de computada de mesa Locus G E y reconstruidos a una resolución de 1 3 Se examinaron las regiones que abarcaban el de la altura del fémur a nivel de porción media de la diáfisis cortical 800 para el hueso cortical y el 1 del fémur distal para el hueso trabecular 500 para el vehículo y el anticuerpo DKK1 550 para el anticuerpo Sel y 600 para la Combinación y el anticuerpo Se midió el área de hueso cortical y el momento de inercia del corte transversal a nivel de la diáfisis La fracción de volumen óseo trabecular el número de trabéculas el espesor trabecular y la BMD trabecular fueron evaluadas a nivel del fémur Los fémures fueron evaluados en ensayos de flexión de tres puntos hasta la falla a n ivel de la porción media de la Así se evaluaron los parámetros de fortaleza ósea carga máxima y rigidez 858 Mini Bionix I I longitud 6 tasa de desplazamiento 6 Análisis estad Los análisis estad ísticos se real izaron con el paquete informático GraphPad Prism La comparación se llevó a cabo realizando un estudio de Anova u nidireccional con una prueba de Tukey Kramer Los resultados se expresan como medias error estándar de la media y se considera sig n BM D in vivo Aumentos significativos en BMC y BM D fueron observados tanto a nivel de las vertebras lumbares como de las regiones en los grupos de la Combinación y de los anticuerpos a partir de la primera semana de tratam La respuesta continuó aumentando en mayores n iveles que cuando se emplearon los anticuerpos y DKK1 por separado en el período del tratam Los datos reportados en la Figura X representan el porcentaje de cam bio en BMC desde los niveles básales a nivel de la ur hacia el final del estudio Todos los tratamientos resu ltaron en un aumento significativo de BMC en comparación con el grupo tratado con el que disminuyó sólo en respecto a la l ínea de El BMC en los animales tratados con aumentó en los tratados con un en los tratados con la el BMC aumentó y en los tratados con aumentó respecto a la línea Los aumentos en BMC y BMD tanto a nivel de las vertebras lumbares y las regiones inducidas por los tratamientos con la Combinación o fueron significativamente mayores los de o por Masa Ósea y Fortaleza En comparación con el el anticuerpo produjo un aumento significativo de y de pero no de la En comparación con el no produjo un aumento significativo del diafisaria y del CSMI El nivel de flexibilidad de la diáfisis femoral no se vio afectado por el tratamiento con En comparación con el produjo el aumento significativo del del del y del En comparación con el produjo el aumento significativo del pero no del CSMI En comparación con el produjo el aumento de la carga máxima de la diáfisis del fémur y de su rigidez En comparación con el la Combinación produjo un aumento significativo en el fémur distal del y En comparación con el la Combinación produjo un aumento significativo del y del CSMI En comparación con el la Combinación produjo un aumento significativo de la carga máxima y la rigidez de la diáfisis femoral Los valores medios de todos esos parámetros en la Combinación fueron significativamente mayores a los observados en los grupos tratados sólo con pare el y sólo con DKK1 De forma similar a lo observado con la Combinación en comparación con el veh ículo el produjo un aumento significativo del del N del 1 y de la a nivel del fémur distal En comparación con el el tratamiento con produjo un aumento significativo del y del CSM I En comparación con el produjo un aumento significativo de la carga máxima y rigidez Los valores med ios de todos estos parámetros en el tratamiento con fueron significativamente mayores a los observados en los grupos tratados sólo con pare el CSM y sólo con DKK1 Los tratamientos con la Combinación tanto como aquellos con produjeron mayores aumentos en la masa y la fortaleza óseas que los tratamientos con cualquiera de las Estos resultados indican claramente que tanto el tratamiento con la Com binación como el tratamiento con tienen un efecto sinérgico inesperado en el aumento de la masa y fortaleza óseas en este modelo Conclusión una molécula con efecto inhibidor de la esclerostina y Dkk1 parece tener una mayor actividad terapéutica que o DKK1 aislados en las afecciones asociadas con bajos niveles de masa y reparación Ejemplo 10 La terapia combinada con los anticuerpos y Dkk1 provoca un aumento de la expresión de PTHR1 Con el fin de comprender mejor el mecanismo molecular subyacente al impacto sinérgico del tratamiento con la combinación de anticuerpos Sost y Dkk1 sobre la formación de tejido se estudió la expresión de los de los miembros de las vías anabólicas Se trataron ratas Sprague Dewey de meses de con vehículo Dkk1 2 2 combinación 5 o 1 0 2 durante dos Se sacrificaron los animales en el día 14 y se extrajeron los fémures de las eliminándose todo el tejido Se eliminaron las epífisis y los cartílagos y se enjuagó el fémur con PBS enfriado sobre hielo con el fin de eliminar la médula los huesos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se Se purificó el ARN del tejido óseo usando el kit de purificación de ARN total Pro 96 Se analizó la expresión génica mediante el uso del sistema Affymetrix Panel 331 140 Santa El tratamiento con la terapia combinada produjo un mucho mayor aumento de la expresión de gran número de genes asociados al anabolismo óseo que el producido por cada terapia de forma Estos genes incluyen marcadores de osteocitos de la vía de señalización canónica de Wnt osteogénicos 1 A1 y de la biología transcripcional de osteoblastos I se observó también un aumento sinérgico del receptor 1 de la hormona paratiroidea componente de la vía de señalización de la hormona paratiroidea más Como se resume en la Figura estos datos sugieren que la acción sinérgica del tratamiento con la combinación de y Dkk1 Ab sobre el anabolismo óseo podría deberse a un aumento en la señalización de la PTH resultante del tratamiento Ejemplo 1 1 Expresión de moléculas de unión en gran escala Se generaron los siguientes acoples de Se probaron dos orientaciones y 5 conectores diferentes los primeros 6 aminoácidos de los primeros 13 aminoácidos de 1 se probaron para cada Se expresaron las moléculas de unión de forma en células 296 6E adaptadas a la en placas de 96 Las células 293 6E fueron sembradas en placas de cultivo de tejidos de 96 tratadas con a una densidad de 5E4 células por en el medio de expresión para células 293 Freestyle suplementado con de Pluronic 25 G418 y de suero fetal bovino 24 horas antes de la transfección e incubadas durante toda la noche a 37 en presencia de de En el día de la 1 00 ng se mezclaron las moléculas de ADN correspondientes a las HC y LC de las moléculas de Se agregó a las mezclas de ADN 25 de una mezcla 1 de medio Freestyle FugeneHD Después de una incubación a temperatura ambiente por se agregó la totalidad de las mezclas de transfección a las placas de cultivo sembradas el día anterior y se agitaron con movimiento oscilante Se volvieron a colocar las placas de cultivo a en un incubador a 37 de C02 durante la Al día el medio de cultivo y las mezclas de transfección fueron eliminadas por aspiración y reemplazadas por 1 30 µ? de medio de cultivo libre de suero con de Se cultivaron las placas por 6 días Los medios condicionados fueron recogidos el séptimo día posterior a la Las placas fueron centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos para precipitar cualquier resto Se transfirieron cuidadosamente los sobrenadantes a bloques de polipropileno Se determinaron las concentraciones de las moléculas de unión de los CM mediante el sistema ForteBio QK usando biosensores de Proteína A 1 Se remojaron los biosensores de Proteína A en buffer de muestra durante 10 minutos antes del Al comienzo del los biosensores previamente remojados se sumergieron en una dilución 1 de las muestras de CM durante 2 minutos y se registraron las moléculas Se calculó la concentración de las muestras con el software Data Analysis usando la curva estándar de IgG 1 Se realizó el screening mediante ensayos de ELISA como se describe en el Ejemplo 4 de esta Los ensayos de WNT se realizaron como se describe en los Ejemplos 6 y 7 de este El screening a gran escala condujo a la identificación de moléculas candidatas a totalmente con una potente actividad neutralizante dual contra la Esclerostina y Dkk1 El de los 1 57 de las moléculas candidatas analizadas mostró una buena expresión transitoria en el ensayo de expresión transitoria alcanzando varias de éstas niveles de expresión mayores a 10 Ejemplo 12 Estimulación de la formación de hueso y aumento de la resistencia ósea para el modelo de ratones jóvenes intactos en Diseño del En este estudio se utilizó un total de 45 ratones machos B6D2F1 de 1 0 semanas de Al inicio del los animales se dividieron en 5 grupos en relación al peso corporal y la BMD en la región mediante DXA in Los ratones se inyectaron subcutáneamente ya sea con vehículo o o DKK1 o una combinación de y DK 1 o 1 1 H 1 0 dos veces por semana durante tres Debido a las diferencias en el peso los anticuerpos se dosificaron a igual molaridad X con 1 1 DKK1 1 DKK1 para el grupo y 25 1 1 H 1 Los animales se escanearon semanalmente mediante DXA in vivo para observar los efectos anabólicos óseos de los tratamientos con el fármaco en las regiones vertebrolumbar y luego se sacrificaron al final del Los fémures se recuperaron para densitometría ex vivo mediante y análisis de la resistencia Densitometría in los animales se escanearon mediante DXA Lunar PIXImus I en las regiones de la unión de tibia y peroné con el cuello de fémur y de las vértebras lumbares para determinar la por unidad de área en estas Densitometría ex los fémures se escanearon utilizando un sistema de escritorio Locus GE y se reconstruyeron a una resolución de 1 3 Se examinaron las regiones que abarcan el de la altura del fémur a nivel cortical en la diáfisis media 800 y a nivel trabecular del fémur distal 500 para el vehículo y DKK1 550 para y 600 para la Combinación y El área de hueso cortical y el momento de inercia transversal se midieron en la región central de la La fracción de volumen trabecular el número de trabéculas el espesor trabecular y la BMD trabecular se evaluaron en el fémur Se examinaron los fémures en flexión de 3 puntos hasta el fallo del centro de la diáfisis y se evaluaron los parámetros de resistencia carga máxima y rigidez 858 Mini Bionix I I extensión 6 velocidad de desplazamiento 6 Análisis Para realizar los análisis estadísticos se utilizó GraphPad Prism La comparación se llevó a cabo mediante ANOVA de una con un test de Tukey Los datos se informan como Media y se consideran significativos para BMD in Tan sólo una semana después del tratamiento se registraron incrementos significativos del BMC y la BMD para los grupos Combinación y tanto en la región de las vértebras lumbares como en la y la respuesta continuó aumentando durante el período de tratamiento a un nivel mayor que para y por Los datos mostrados representan el cambio porcentual del BMC relativo a la línea de base en la al final del estudio Todos los tratamientos derivaron en un incremento significativo del BMC en comparación con el grupo tratado con el cual disminuyó sólo comparado con la línea de Los animales tratados con aumentaron el BMC en un con aumentaron el BMC en un con Combinación aumentaron el BMC en un y con aumentaron el BMC en un comparado con la linea de Los incrementos del BMC y la BMD tanto en las vértebras lumbares como en el inducidos por los tratamientos con Combinación o fueron significativamente mayores que para o por Masa ósea y resistencia derivó en un aumento significativo de y en el fémur pero no de en comparación con el DKK1 no afectó significativamente el y el CS I diafisarios en comparación con el La resistencia a la flexión de la diáfisis femoral no fue afectada por el tratamiento con DKK1 aumentó significativamente el valor de y en el fémur distal en comparación con el aumentó significativamente el diafisaria pero no el CSMI en comparación con el aumentó significativamente la carga máxima y la rigidez del eje femoral en comparación con el La Combinación aumentó significativamente el valor de N y en el fémur distal en comparación con el La Combinación aumentó significativamente el y el CSMI diafisarios en comparación con el La Combinación aumentó significativamente la carga máxima y la rigidez de la diáfisis femoral en comparación con el Los valores medios de todos estos parámetros fueron significativamente mayores para la Combinación que para los grupos y DKK1 por De modo similar que la 1 1 H 10 aumentó significativamente N y en el fémur distal en comparación con el 1 H 1 0 aumentó significativamente el y el CSMI diafisarios en comparación con el 1 1 H 10 aumentó significativamente la carga máxima y la rigidez de la diáfisis femoral en comparación con el Los valores medios de todos estos parámetros fueron significativamente mayores para 1 1 H 1 0 que para los grupos y DKK1 por Los resultados de este Ejemplo se resumen en las Figuras 1 Los tratamientos con Combinación y con 1 1 H 1 0 condujeron ambos a mayores incrementos de la masa ósea y la resistencia ósea en comparación con cualquiera de las Estos resultados indicaron claramente que los tratamientos con Combinación y con 1 1 H 10 ambos tienen un efecto sinérgico en el incremento de la masa ósea y de la resistencia ósea para un modelo de ratón Ejemplo 13 Estimulación de la formación de hueso y aumento de la resistencia ósea del fémur fracturado para un modelo de fractura femoral cerrada en Diseño del Se sometieron ratas macho de 12 semanas de edad corporal medio 428 a una fractura diafisaria media femoral cerrada tal como se reportara anteriormente et J Orthop Res se insertó una aguja de jeringa calibre 18 en el canal medular a través de los cóndilos la cual sirvió de fijación El fémur luego se sometió a fractura transversa a través de un impacto contuso mediante la aplicación de una carga en el lado anterior del Un día después de la los animales se inyectaron subcutáneamente ya sea con vehículo DKK1 o las 1 1 H o en cada dos veces por A las 5 semanas los animales se los fémures contralaterales fracturados y no fracturados se recuperaron para densitometría y Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Densitometría por Los clavos intramedulares se retiraron de los fémures fracturados antes del análisis Los fémures se escanearon ex vivo por absorciometría de rayos x de energía dual GE Lunar PIXImus I los análisis se realizaron en el central del fémur fracturado o el fémur contralateral intacto entero para determinar el contenido mineral óseo por unidad de Densitometría por Ambos fémures también se escanearon por tomografía computada cuantitativa periférica Stratec XCT research a una resolución de 100 Se efectuaron análisis para tres cortes de en el centro del callo del fémur fracturado y el punto medio del fémur contralateral Los extremos proximal y distal de cada fémur se fijaron en Yeso de Laboratorio de Fraguado Lento para aislar una región central de mm de Estos fémures fracturados y CL fueron examinados en torsión hasta el fallo a una velocidad de desplazamiento angular de 858 Mini Bionix MTS Se evaluaron parámetros de resistencia ósea entre los que se encuentran el torque máximo la energía hasta el fallo y la rigidez torsional Análisis Se utilizó GraphPad Prism para determinar las diferencias estadísticas entre grupos mediante test t bilaterales de datos no con considerado como Fémures y mostraron ambos mejoras similares en la masa ósea y la resistencia ósea en el callo como lo demuestran los incrementos significativos del BMC mediante DXA a y mediante pQCT a en comparación con los controles con Estos incrementos de la masa ósea se asociaron con un torque máximo mayor en el fémur en comparación con los controles con Las aumentaron significativamente la masa ósea y la resistencia ósea en el callo fracturado hasta niveles mayores que o por Comparado con el el BMC del callo fracturado fue mayor mediante DXA y mayor mediante pQCT para el grupo Este aumento de la masa ósea se asoció con un de incremento en el torque máximo para el grupo comparado con el el BMC por DXA fue significativamente mayor para el grupo en comparación con los grupos por separado o por Fémures contralaterales no no afectó significativamente la masa ósea y la resistencia ósea diafisarias en los fémures contralaterales no Sin aumentó significativamente el espesor cortical medio diafisario y el torque máximo en un 1 y un en comparación con el Las aumentaron significativamente el espesor del hueso cortical femoral contralateral y el torque máximo en un 1 y un en comparación con el cambios similares a los observados para el grupo Datos expresados como Media S Los resultados de este Ejemplo se resumen en las figuras 1 1 Ejemplo 14 Ensayos alpha screen para y 1 El ensayo com petitivo AlphaScreen se realizó básicamente como se describe en Si lverman al 2005 Nature Biotech 1 1 Se generaron curvas de respuesta a la dosis di luyendo en serie proteínas parentales y en buffer de ensayo m H EPES pH 100 mM NaCI 1 en una placa de microtitulacion Greiner de 384 pocil Se agregó a la placa de microtitulacion una cantidad de marcador de Esclerostina recombinante humana o de purificada y qu í micamente biotini lada en el laboratorio 1 seguida de la adición de una mezcla de ya sea de ratón o y perlas AlphaScreen de estreptavidina y proteína A 0 de cada u Luego la placa de m icrotitulacion se selló y se incubó durante la noche a temperatura La inhibición de la formación de complejo se midió como reducción de la señal quimioluminiscente medida en el Lector Fusión Píate utilizando una excitación a 680 nm y emisión a 620 nm Los resultados se resumen en la Figura insufficientOCRQuality

Claims

REIVI NDICACIONES

1 . Una molécula de unión que consiste de una cadena polipeptídica, donde dicha cadena polipeptídica consiste de VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n, donde: VH 1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1 )n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1 )n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n es una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente, donde la molécula de unión se une de manera específica tanto a la esclerostina como a DKK-1 .

2. La molécula de unión de la reivindicación 1 , donde VH 1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 95, 96, 1 04, 1 1 2, 120, 128, 1 36, 144, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, y 216, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336, 344, 352, 360, 368, 376, 384, 392, 400, y 408.

3. Una molécula de unión que consiste de una cadena polipeptídica, donde dicha cadena polipeptídica consiste de VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n, donde: VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n es una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente, donde la molécula de unión se une de manera específica tanto a la esclerostina como a DKK-1.

4. La molécula de unión de la reivindicación 3, donde VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 94, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, y 215, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 223, 231, 239, 247, 255, 263, 271, 279, 287, 295, 303, 311, 319, 327, 335, 343, 351, 359, 367, 375, 383, 391, 399, y 407.

5. La molécula de unión de la reivindicación 1 o 3, donde (X2)n se encuentra ausente.

6. Una molécula de unión que consiste de una primera y una segunda cadena polipeptídica, donde dicha primera cadena polipeptídica consiste de VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n, donde VH1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n es una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente; y donde dicha segunda cadena polipeptídica consiste de VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n, donde VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de un segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente, donde la molécula de unión se une de manera específica a esclerostina y DKK-1.

7. La molécula de unión de la reivindicación 6, donde los dominios variables de cadena pesada VH1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 95, 96, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, y 216, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336, 344, 352, 360, 368, 376, 384, 392, 400, y 408, y donde los dominios variables de cadena ligera VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 94, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, y 215, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 223, 231, 239, 247, 255, 263, 271, 279, 287, 295, 303, 311, 319, 327, 335, 343, 351, 359, 367, 375, 383, 391 , 399, y 407.

8. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde (X1 )n es una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. 415-482.

9. La molécula de unión de las reivindicaciones 6, donde la molécula de unión consiste de dos primeras cadenas polipeptídicas y dos segundas cadenas polipeptídicas.

10. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde la región Fe se selecciona del conjunto que consiste de una región Fe de secuencia nativa y una región Fe de secuencia variante.

1 1 . La molécula de unión de la reivindicación 10, donde la región Fe se selecciona del conjunto que consiste de una región Fe de una lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, Ig , IgE, y IgD.

1 2. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho VH 1 de la primera cadena polipeptídica y dicho VL1 de la segunda cadena polipeptídica se obtienen del mismo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste.

1 3. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho VH 1 de la primera cadena polipeptídica y dicho VL1 de la segunda cadena polipeptídica se obtienen de diferente anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste.

14. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho VH2 de la primera cadena polipeptídica y dicho VL2 de la segunda cadena polipeptídica se obtienen del mismo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste.

15. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho VH2 de la primera cadena polipeptídica y dicho VL2 de la segunda cadena polipeptídica se obtienen de diferente anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste.

16. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6 con la condición de que dicho cuerpo de unión no es CH 1 .

17. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho primer antígeno con una potencia diferente de la potencia con la cual dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho segundo antígeno.

18. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho primer antígeno con una afinidad diferente de la afinidad con la que dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho segundo antígeno.

19. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, y dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se seleccionan del conjunto que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo con injerto de CDR, y un anticuerpo humanizado.

20. La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, y dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se seleccionan del conjunto que consiste de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que consiste de dos fragmentos Fab acoplados por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH 1 ; un fragmento Fv que consiste de los dominios; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, un anticuerpo de cadena simple, y diacuerpos.

21 . La molécula de unión de la reivindicación 1 , 3, o 6, donde dicho molécula de unión posee al menos una propiedad deseada exhibida por dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antigeno en éste, o dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste.

22. La molécula de unión de la reivindicación 21 , donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros del anticuerpo.

23. La molécula de unión de la reivindicación 21 , donde dichos parámetros del anticuerpo se seleccionan del conjunto que consiste de especificidad por el antígeno, afinidad por el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento del epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada con el tejido, y unión a un anticuerpo ortólogo.

24. Una molécula de unión que se une tanto a la esclerostina como a DKK-1 que consiste de cuatro cadenas polipeptídicas, donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n, donde: VH 1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n es una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente; y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n, donde VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente, donde los dominios variables de cadena pesada VH1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 95, 96, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, y 216, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336, 344, 352, 360, 368, 376, 384, 392, 400, y 408, y donde los dominios variables de cadena ligera VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 94, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, y 215, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 223, 231, 239, 247, 255, 263, 271, 279, 287, 295, 303, 311, 319, 327, 335, 343, 351, 359, 367, 375, 383, 391, 399, y 407.

25. La molécula de unión de la reivindicación 24 con la condición de que dicho cuerpo de unión no es CH1.

26. una molécula de unión que se une tanto a la esclerostina como a DKK-1 que consiste de cuatro cadenas polipeptídicas, donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n, donde: VH 1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1 )n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1 )n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n es una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente; y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n, donde VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1 )n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1 )n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente, donde la molécula de unión consiste de acoplamientos de VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n seleccionados a partir del conjunto que consiste de: SEC I D Nos. 1 8 y 20; 22 y 24; 26 y 28; 30 y 32; 34 y 36; 38 y 40; 42 y 44; 46 y 48; 50 y 52; 54 y 76; 56 y 72; 58 y 60; 62 y 64; 66 y 68; 70 y 72; 74 y 76; 78 y 80; 82 y 84; 86 y 88; y 90 y 92.

27. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC I D Nos. 18 y 20.

28. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 22 y 24.

29. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 26 y 28.

30. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 30 y 32.

31. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 34 y 36.

32. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 38 y 40.

33. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 42 y 44.

34. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 46 y 48.

35. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 50 y 52.

36. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 54 y 76.

37. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 56 y 72.

38. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 58 y 60.

39. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 62 y 64.

40. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 66 y 68.

41. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 70 y 72.

42. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 74 y 76.

43. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 78 y 80.

44. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 82 y 84.

45. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 86 y 88.

46. La molécula de unión de la reivindicación 26, donde el acoplamiento entre VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n son las SEC ID Nos. 90 y 92.

47. La molécula de unión de las reivindicaciones 1, 3, y 6, donde el cuerpo de unión al VH de la esclerostina consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 100, 101, 102; b) 108, 109, 110; C) 116, 117, 118; d) 124, 125, 126; e) 132, 133, 134; f) 140, 141, 142; g) 148, 149, 150; h) 156, 157, 158; ·) 164, 165, 166; j) 172, 173, 174; k) 180, 181, 182; 1) 188, 189, 190; m) 196, 197, 198; n) 204, 205, 206; o) 212, 213, 214; y P) 220, 221, 222, y donde el VH del conector a partir del conjunto que consiste de las SEC I D Nos. a) 228, 229, 230; b) 236, 237, 238; c) 244, 245, 246; d) 252, 253, 254; e) 260, 261 , 262; f) 268, 269, 270; 9) 276, 277, 278; h) 284, 285, 286; i) 292, 293, 294; j) 300, 301 , 302; k) 308, 309, 31 0; 1) 316, 31 7, 318; m) 324, 325, 326; n) 332, 333, 334; o) 340, 341 , 342; P) 348, 349, 350; q) 356, 357, 358; r) 364, 365, 366; s) 372, 373, 374; t) 380, 381 , 382; u) 388, 389, 390; v) 396, 397, 398; w) 404, 405, 406; y x) 412, 413, 414.

48. La molécula de unión de las reivindicaciones 1, 3 y 6, donde el cuerpo de unión a la esclerostinaVL consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 97, 98, 99; b) 105, 106, 107; c) 113, 114, 115; d) 121, 122, 123; e) 129, 130, 131; f) 137, 138, 139; g) 145, 146, 147; h) 153, 154, 155; i) 161, 162, 163; j) 169, 170, 171; k) 177, 178, 179; 1) 185, 186, 187; m) 193, 194, 195; n) 201, 202, 203; o) 209, 210, 211; y P) 217, 218, 219, y donde el VL del conector a DKK1 consiste de 3 CDR seleccionadas partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 225, 226, 227; b) 233, 234, 235; c) 241, 242, 243; d) 249, 250, 251; e) 257, 258, 259; f) 265, 266, 267; g) 273, 274, 275; h) 281, 282, 283; i) 289, 290, 291; j) 297, 298, 299; k) 305, 306, 307; I) 313, 314, 315; m) 321, 322, 323; n) 329, 330, 331; o) 337, 338, 339; p) 345, 346, 347; q) 353, 354, 355; r) 361, 362, 363; s) 369, 370, 371; t) 377, 378, 379; u) 385, 386, 387; v) 393, 394, 395, w) 401, 402, 403; and x) 409, 410, 411.

49. La molécula de unión de las reivindicaciones 1, 3, y 6, donde el cuerpo de unión al VH de la esclerostina consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 100, 101, 102; b) 108, 109, 110; c) 116, 117, 118; d) 124, 125, 126; e) 132, 133, 134; f) 140, 141, 142; g) 148, 149, 150; h) 156, 157, 158; i) 164, 165, 166; j) 172, 173, 174; k) 180, 181, 182; 1) 188, 189, 190; m) 196, 197, 198; n) 204, 205, 206; o) 212, 213, 214; y P) 220, 221, 222, y donde el VH del conector a DKK1 consiste de 3 CDR seleccionadas partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 228, 229, 230; b) 236, 237, 238; c) 244, 245, 246; d) 252, 253, 254; e) 260, 261, 262; f) 268, 269, 270; 9) 276, 277, 278; h) 284, 285, 286; i) 292, 293, 294; j) 300, 301, 302; k) 308, 309, 310; l) 316, 317, 318; m) 324, 325, 326; n) 332, 333, 334; 0) 340, 341, 342; P) 348, 349, 350; q) 356, 357, 358; r) 364, 365, 366; s) 372, 373, 374; t) 380, 381, 382; u) 388, 389, 390; v) 396, 397, 398; w) 404, 405, 406; y x) 412, 413, 414. y donde the cuerpo de unión a la esclerostinaVL consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 97, 98, 99; b) 105, 106, 107; c) 113, 114, 115; d) 121, 122, 123; e) 129, 130, 131; f) 137, 138, 139; g) 145, 146, 147; h) 153, 154, 155; i) 161, 162, 163; j) 169, 170, 171; k) 177, 178, 179; I) 185, 186, 187; m) 193, 194, 195; n) 201, 202, 203; o) 209, 210, 211; y p) 217, 218, 219, y donde el VL del conector a DKK1 consiste de 3 CDR seleccionadas a partir del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 225, 226, 227; b) 233, 234, 235; c) 241, 242, 243; d) 249, 250, 251; e) 257, 258, 259; f) 265, 266, 267; g) 273, 274, 275; h) 281, 282, 283; i) 289, 290, 291; j) 297, 298, 299; k) 305, 306, 307; 1) 313, 314, 315; m) 321, 322, 323; n) 329, 330, 331; o) 337, 338, 339; P) 345, 346, 347; q) 353, 354, 355; r) 361, 362, 363; s) 369, 370, 371 t) 377, 378, 379; u) 385, 386, 387; v) 393, 394, 395; w) 401, 402, 403; and x) 409, 410, 411.

50. Una molécula de unión que consiste de cuatro cadenas polipeptídicas, donde las cadenas polipeptídicas primera y tercera consisten de VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n, donde: VH1 es un primer dominio variable de cadena pesada; VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n es una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente; y donde las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta consisten de VL1-(X1 )n-VL2-C-(X2)n, donde VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera; VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n no comprende una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente, donde la molécula de unión consiste de 3 VH1 CDR, 3 VH2 CDR, 3 VL1 CDR y 3 VL2 CDR, donde los VH1 y VL1 CDR acoplados, y los VH2 y VL2 CDR acoplados, se seleccionan del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. a) 97-102; b) 105-110; c) 113-118; d) 121-126; e) 129-134; f) 137-142; g) 145-150; h) 153-158; i) 161-166; j) 169-174; k) 177-182; 1) 185-190; m) 193-198; n) 201-206; o) 209-214; P) 217-222, o SEC ID 1 Mos. a) 225-230; b) 233-238; c) 241-246; d) 249-254; e) 257-262; f) 265-270; g) 273-278; h) 281-286; ¡) 289-294; j) 297-302; k) 305-310; l) 313-318; m) 321-326; n) 329-334; o) 337-342; P) 345-350; q) 353-358; r) 361-366; s) 369-374; t) 377-382; u) 385-390; v) 393-398; w) 401-406; x) 409-414.

51. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 161-163, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 164-166, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 385-387, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 388-390.

52. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 385-387, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 388-390, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 161-163, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 164-166.

53. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 153-155, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 156-158, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 385-387, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 388-390.

54. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 385-387, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 388-390, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 153-155, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 156-158.

55. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 409-411, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos.412-414, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 121-123, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 124-126.

56. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 409-411, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos.412-414, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 177-179, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 180-182.

57. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 409-411, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 412-414, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 97-99, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 100-102.

58. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 385-387, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 388-390, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 105-107, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 108-110.

59. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 97-99, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 100-102, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 409-411, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 412-414.

60. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 385-387, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 388-390, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 105-107, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 108-110.

61. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 409-411, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos.412-414, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 105-107, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 108-110.

62. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VH1 son SEC ID Nos. 105-107, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 108-110, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 385-387, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 388-390.

63. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VL1 son las SEC ID Nos. 105-107, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 108-110, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 409-411, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 412-414.

64. La molécula de unión de la reivindicación 50, donde dichas CDR de VL1 son las SEC ID Nos. 369-371, dichas CDR de VH1 son las SEC ID Nos. 372-374, dichas CDR de VL2 son las SEC ID Nos. 105-107, y dichas CDR de VH2 son las SEC ID Nos. 108-110.

65. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n se selecciona del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. 415-484.

66. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n se selecciona del conjunto que consiste de las SEC ID Nos. 440, 441, 437, 438, 431, 432, 483, y 484.

67. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la cadena VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 440.

68. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la cadena VH1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 441.

69. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la cadena VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 437.

70. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la cadena VH1-(X1)n-VH2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 438.

71. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 440.

72. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n la VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 441.

73. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 483.

74. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la VL1-(X1)n-VL2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 484.

75. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 431.

76. La molécula de unión de las reivindicaciones 50-64, donde dicho (X1)n de la VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n es la SEC ID NO: 432.

77. La molécula de unión de las reivindicaciones 1 , 3, 6, 24, 26 y 50, donde dicho (X1 )n es el diferente en las cadenas VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n y VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n.

78. Un método para generar una molécula de unión que se une a esclerostina y DKK-1 que consiste de los pasos: (a) la obtención de un primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, que puede acoplarse a la esclerostina o DKK- 1 ; (b) la obtención de un segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, que puede acoplarse a la esclerostina o DKK-1 ; (c) la construcción de la cadenas polipeptídicas primera y tercera que consisten de VH 1 -(X1 )n-VH2-C-(X2)n, donde: VH 1 es un primer dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de dichos primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; VH2 es un segundo dominio variable de cadena pesada obtenido a partir de dicho segundo anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; C es un dominio constante de cadena pesada; (X1 )n es un cuerpo de unión con la condición de que no es CH1 , donde dicho (X1 )n se encuentra ya sea presente como ausente; y (X2)n es una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente; (d) la construcción de las cadenas polipeptídicas segunda y cuarta que consisten de VL1 -(X1 )n-VL2-C-(X2)n, donde: VL1 es un primer dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de dicho primer anticuerpo parental o porción de unión al antígeno en éste; VL2 es un segundo dominio variable de cadena ligera obtenido a partir de dicho segundo anticuerpo parental o cuerpo de unión al antígeno de éste; C es un dominio constante de cadena ligera; (X1)n es un cuerpo de unión, donde dicho (X1)n se encuentra ya sea presente como ausente; and(X2)n no comprende una región Fe, donde dicha (X2)n se encuentra ya sea presente como ausente; y (e) la expresión de dichas primera, segunda, tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de forma tal que se genera una molécula de unión que se une a esclerostina y DKK-1.

79. El método de la reivindicación 78, donde los dominios variables de cadena pesada VH1 y VH2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 95, 96, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 152, 160, 168, 176, 184, 192, 200, 208, y 216, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 224, 232, 240, 248, 256, 264, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336, 344, 352, 360, 368, 376, 384, 392, 400, y 408, y donde los dominios variables de cadena ligera VL1 y VL2 consisten de una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste de los cuerpos de unión a la esclerostina SEC ID Nos. 94, 103, 111, 119, 127, 135, 143, 151, 159, 167, 175, 183, 191, 199, 207, y 215, o cuerpos de unión a DKK-1 SEC ID Nos. 223, 231, 239, 247, 255, 263, 271, 279, 287, 295, 303, 311, 319, 327, 335, 343, 351, 359, 367, 375, 383, 391, 399, y 407.

80. El método de la reivindicación 78, donde cada uno de dichos primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, y cada uno de dichos segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se seleccionan separadamente a partir del conjunto que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo con injerto de CDR, y un anticuerpo humanizado.

81 . El método de la reivindicación 78, donde cada uno de dichos primer anticuerpo parental , o porción de un ión al antígeno en éste, y cada uno de dichos segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se seleccionan separadamente a partir del conj unto que consiste de un fragmento Fab, un fragmento F(ab' )2 , un fragmento bivalente que consiste de dos fragmentos Fab acoplados por un puente disulfuro en la región bisagra ; un fragmento Fd que consiste de los domin ios VH y CH 1 ; un fragmento Fv que consiste de los dominios VH y CH 1 ; un fragmento Fv que consiste de los domin ios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, un anticuerpo de cadena simple, y diacuerpos.

82. El método de la reivindicación 78, donde dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, posee al menos una propiedad deseada exhibida por la molécula de unión .

83. El método de la reivindicación 78, donde dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, posee al menos una propiedad deseada exhibida por la molécula de unión .

84. El método de la reivindicación 78, donde la región Fe se selecciona del conj unto que consiste de una región Fe de secuencia nativa y una región Fe de secuencia variante.

85. El método de la reivind icación 78, donde la región Fe se selecciona del conj unto que consiste de una región Fe de una IgG 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, IgA, IgM , Ig E, y IgD.

86. El método de la reivindicación 78, donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros del anticuerpo.

87. El método de la reivindicación 78, donde dicha propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros del anticuerpo.

88. El método de la reivindicación 78, donde dichos parámetros del anticuerpo se seleccionan del conjunto que consiste de especificidad por el antígeno, afinidad por el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento del epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, rectividad cruzada con el tejido, y unión a un anticuerpo ortólogo.

89. El método de la reivindicación 78, donde dichos parámetros del anticuerpo se seleccionan del conjunto que consiste de especificidad por el antígeno, afinidad por el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento del epítopo, estabilidad, solubilidad, eficiencia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, rectividad cruzada con el tejido, y unión a un anticuerpo ortólogo.

90. El método de la reivindicación 78, donde dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho primer antígeno con una afinidad diferente a la afinidad con la que dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho segundo antígeno.

91 . El método de la reivindicación 78, donde dicho primer anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho primer antígeno con una potencia diferente a la potencia con la que dicho segundo anticuerpo parental, o porción de unión al antígeno en éste, se une a dicho segundo antígeno.

92. El método de la reivindicación 78, con la condición de que dicho cuerpo de unión no es CH 1 .

93. Una composición farmacéutica que consiste de la molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -77.

94. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -77 en combinación con una o más of a farmacéuticamente aceptable excipiente, diluyente o soporte.

95. Un método para el tratamiento de un trastorno óseo que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -77.

96. Un método para acelerar la consolidación de fracturas óseas que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -77.

97. Un método para aumentar la densidad ósea que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -77.

98. Un método para aumentar la resistencia ósea que consiste en administrar al paciente que lo necesite la molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -77.