JP2014064590A - 卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示すズブチラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なズブチラーゼ変異体の提供。
【解決手段】洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、ズブチラーゼ変異体が、位置95〜103（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む使用。これらのズブチラーゼ変異体は、卵の染みに対する優れたまたは改良された洗浄性能を示す。本発明は、新規のズブチラーゼ変異体に、変異体をコードする単離DNA配列、発現ベクター、宿主細胞ならびに本発明の変異体を産生および使用するための方法にも関する。さらに本発明は、本発明の変異体を含む清浄用および洗剤組成物に関する。
【選択図】なし

Description

産業上の利用分野
本発明は、洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用に関する。特に本発明は、洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、ズブチラーゼ変異体が、位置95〜103（BASBPNナンバリング。下記参照）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む使用に関する。これらのズブチラーゼ変異体は、例えば清浄用または洗剤組成物、例えば洗濯用洗剤組成物および食器洗浄用組成物、例えば自動食器洗浄用組成物中に用いられる場合に卵の染みに及ぼす優れたまたは改良された洗浄性能を示すのに有用である。本発明は、新規のズブチラーゼ変異体に、変異体をコードする単離されたDNA配列、発現ベクター、宿主細胞ならびに本発明の変異体を産生および使用するための方法にも関する。さらに本発明は、本発明の変異体を含む清浄用および洗剤組成物に関する。

発明の背景
洗剤産業において、酵素は30年以上もの間洗浄用処方物中に必要な手段を供給してきた。このような処方物中に用いられる酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼならびにその他の酵素またはそれらの混合物を包含する。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。

多数の商業的に用いられるプロテアーゼ、例えばデュラザイム（登録商標）（Novo Nordisk A/S）、レラーゼ（登録商標）（Novo Nordisk A/S）、マキサペム（登録商標）（Gist-Brocades N.V.）、プラフェクト（登録商標）（Genencor International, Inc.）は、天然野生型プロテアーゼのタンパク質工学処理変異体である。

さらに多数のプロテアーゼ変異体が当業界で記載されている。従来技術のプロテアーゼ変異体の綿密なリストは、WO99/27082に示されている。
しかしながら、多数の有用なプロテアーゼ変異体が記載されてきてはいるが、多数の産業用途のための新規の改良型プロテアーゼまたはプロテアーゼ変異体の必要は依然として存在する。

特に例えば洗濯物または硬質表面からの卵の染みの除去の問題は、多数のプロテアーゼが卵白中に存在する物質により抑制されるという事実のために、顕著であった。このような物質の例としては、IV−０型トリプシン阻害剤（卵阻害剤）およびIII−０型トリプシン阻害剤（オボムコイド）が挙げられる。

したがって本発明の目的は、このような物質により抑制されないか、または限定程度にのみ抑制される改良型ズブチラーゼ変異体を提供することである。本発明のさらに別の目的は、例えば洗濯物および／または硬質表面からの卵の染みの除去に適している改良型ズブチラーゼ変異体を提供することである。

したがって第一の局面では、本発明は洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、ズブチラーゼ変異体が位置95〜103（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含む使用に関する。

第二の局面では、本発明は、以下の：
位置98と99の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そして少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、
位置99と100の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そして少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、
から成る群から選択されるズブチラーゼ変異体であって、本明細書中の実施例４に開示された「卵抑制検定」で試験された場合、少なくとも10％、の残留活性を有する変異体に関する。

第三の局面では、本発明は、以下の：
位置98と99の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置133および143における置換をさらに含む変異体、
位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置99における置換をさらに含む変異体、
位置98と99の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置167、170および194における置換をさらに含む変異体、
位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置216と217の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、

位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置217と218の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、
位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置42と43の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、ならびに
位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置129と130の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体
から成る群から選択されるズブチラーゼ変異体に関する。

第四の局面では、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体をコードする単離されたDNA配列に関する。
第五の局面では、本発明は、本発明の単離されたDNA配列を含む発現ベクターに関する。
第六の局面では、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換される微生物宿主細胞に関する。

第七の局面では、本発明は、本発明のズブチラーゼ変異体の製造方法であって、本発明の宿主が前記の変異体の発現および分泌を行なう条件下で培養され、変異体が回収される方法に関する。
第八の局面では、本発明は、本発明の変異体を含む清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物に関する。

第九の局面では、本発明は、硬質表面からまたは洗濯物からの卵の染みの除去方法であって、卵の染み含有硬質表面または卵の染み含有洗濯物を、位置95〜103（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物と接触させることを包含する方法に関する。

本発明のさらに他の局面は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
アラインメントおよびナンバリングに関しては、ズブチリシンＢＰＮ‘（ａ）（BASBPN）およびズブチリシン309（BLSABI）（ｂ）間のアラインメントを示す図１に対する参照がなされる。
これらのアラインメントは、本特許出願においては、残基のナンバリングのための参照として用いられる。

前記のGAPルーチンを用いたズブチリシンBPN'（ａ）およびサビナーゼ（登録商標）（ｂ）間のアラインメントを示す。

定義
本発明をさらに詳細に考察する前に、以下の用語および慣例を先ず定義する。
変異体の名称に関する命名法および慣例
本発明により製造または意図される種々のズブチラーゼ酵素変異体を説明する場合、参照を容易にするために以下の命名法および慣例が適応されてきた：
参照の枠は、単離または親酵素をズブチリシンＢＰＮ‘（BASBPN）と一列に並べることにより先ず定義される。

アラインメントは、以下のパラメーター：ギャップ作製ペナルティー＝８およびギャップ延長ペナルティー＝８ならびにそれらのデフォルト値に保持される全てのその他のパラメーターを用いて変異体をナンバリングするためにＧＣＧパッケージバージョン9.1のＧＡＰルーチンにより得られる。
別の方法は、ズブチラーゼ間の既知のアラインメント、例えばWO 91/00345に示されたアラインメントを使用することである。ほとんどの場合、差はいかなる重要性も有さない。

それにより多数の欠失および挿入がBASBPNに関連して定義される。図１において、ズブチリシン309（サビナーゼ（登録商標））は、BASBPNと比較して、位置36、58、158、162、163および164に６つの欠失を有する。これらの欠失は、図１において、星印（＊）で示されている。

親酵素において実施される種々の修飾は、概して、以下のような３つの素子を用いて示される：
もとのアミノ酸 位置 置換アミノ酸
したがって表示G195Eは、位置195におけるグリシンのグルタミン酸による置換を意味する。

もとのアミノ酸残基が任意のアミノ酸残基であり得る場合には、略記表示が用いられて、位置および置換アミノ酸のみを示す：
位置 置換アミノ酸
このような表示法は、同種ズブチラーゼにおける修飾（単数または複数）に関連して特に当てはまる（下記を参照）。

同様に置換中のアミノ酸残基（単数または複数）の同定が実体のない場合には：
もとのアミノ酸 位置
もとのアミノ酸（単数または複数）および置換アミノ酸（単数または複数）の両方が任意のアミノ酸を含み得る場合には、その位置は例えば：170と示される。
もとのアミノ酸（単数または複数）および／または置換アミノ酸（単数または複数）が１つより多いがしかし全てというわけではないアミノ酸（単数または複数）を含み得る場合には、選定アミノ酸は括弧の内側に示される：
もとのアミノ酸位置｛置換アミノ酸 ₁ 、・・・・・、置換アミノ酸 _n ｝

特定の変異体に関しては、任意のアミノ酸残基を示すために特定の三または一文字表記、例えば表記ＸａａおよびＸが用いられる。
置換：
位置195におけるグリシンに代わるグルタミン酸の置換は以下のように示され：
Gly195GluまたはG195E
あるいは位置195におけるグリシンに代わる任意のアミノ酸残基の置換は以下のように示される：
Gly195XaaまたはG195X
あるいは
Gly195またはG195。

したがって位置170における任意のアミノ酸残基に代わるセリンの置換は、以下のように示される：
Xaa170SerまたはX170S
あるいは
170Serまたは170S。

このような表示法は、同種ズブチラーゼにおける修飾（単数または複数）に関連して特に当てはまる（下記を参照）。したがって170Serは、例えばBASBPNにおけるLys170Ser修飾およびBLSAVIにおけるArg170Ser修飾の両方を含むことを意味する（図１を参照）。
もとのアミノ酸（単数または複数）および／または置換アミノ酸（単数または複数）が１つより多いがしかし全てではないアミノ酸（単数または複数）を含み得る修飾に関しては、位置170におけるアルギニンに代わるグリシン、アラニン、セリンまたはトレオニンの置換は、以下のように示されて：
Arg170｛Gly、Ala、Ser、Thr｝またはR170｛G、A、S、T｝、以下の変異体を示す：
R170G、R170A、R170SおよびR170T。

欠失：
位置195におけるグリシンの欠失は、以下により示される：
Gly195^*またはG195^*。
同様に、１つより多いアミノ酸残基の欠失、例えば位置195および196におけるグリシンおよびロイシンの欠失は、以下のように示される：
Gly195^*+Leu196^*またはG195^*+L196^*。

挿入：
G195後の追加のアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は、以下により示される：
Gly195GlyLysまたはG195GK、
あるいはG195後に１つより多いアミノ酸残基、例えばLys、AlaおよびSerが挿入される場合、これは以下のように示される：
Gly195GlyLysAlaSerまたはG195GKAS（配列番号１）。

このような場合、挿入アミノ酸残基（単数または複数）は、挿入アミノ酸残基（単数または複数）に先行するアミノ酸残基の位置番号への小文字の付加によりナンバリングされる。前記の例において、配列194〜196はしたがって以下のようである：
194 195 196
BLSAVI A - G - L
194 195 195a 195b 195c 196
変異体 A - G - K - A- S- L （配列番号16）

既存のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法における縮重が起こることは明らかである。例えば前記の例におけるグリシンの後にグリシンが挿入される場合、これはG195GGにより示される。同一の実際の変化は全く同様に、以下の：
194 195 196
BLSAVI A - G - L
から、
194 195 195a 196
変異体 A - G - G - L （配列番号27）
194 194a195 196
への変化に関してA194AGとして示され得る。
このような例は当業者には明らかであり、表示G195GGおよびこの型の挿入に関する対応する表示は、したがって、このような等価の縮退表示を含むことを意味する。

ギャップの埋め：
酵素における欠失が、ナンバリングのために用いられるズブチリシンBPN'配列との参照比較において存在する場合、このような位置での挿入は、位置36におけるアスパラギン酸の挿入に関しては以下のように示される：
^*36Aspまたは^*36D。

多重修飾：
多重修飾を含む変異体は、例えば以下のように＋により分離され：
Arg170Tyr+Gly195GluまたはR170Y+G195E
これは位置170および195においてそれぞれアルギニンおよびグリシンに代えてチロシンおよびグルタミン酸を置換する修飾を表す。

したがってTyr167｛Gly、Ala、Ser、Thr｝＋Arg170｛Gly、Ala、Ser、Thr｝は、以下の変異体を示す：

この命名法は、特定の共通特性を有するアミノ酸残基、例えば正荷電（K、R、H）、負荷電（D、E）の残基を置換、取替え、挿入または欠失するのを目指した修飾、あるいは小アミノ酸を別の小アミノ酸に置換することを意味する、例えばTy167｛Gly、Ala、Ser、Thr｝＋Arg170｛Gly、Ala"、Ser、Thr｝の保存的アミノ酸修飾（単数または複数）に関して特に当てはまる。さらなる詳細に関しては、「本発明の詳細な説明」の節を参照されたい。

プロテアーゼ
タンパク質基質におけるアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼまたは（互換可能的に）ペプチダーゼと分類される（Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Fransisco, Chapter 3参照）。

アミノ酸位置／残基のナンバリング
別記しない限り、本明細書中で用いられるアミノ酸ナンバリングはズブチラーゼBPN'（BASBPN）配列のナンバリングに対応する。ＢＰＮ’配列をさらなる説明のためには、図１またはSiezen et al., Protein Engng. 4(1991) 719-737を参照されたい。

セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、活性部位に必須セリン残基が存在する酵素である（White, Handler and Smith, 1973 “Principles of Biochemistry,” Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272）。

細菌セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ダルトン範囲の分子量を有する。それらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、真核生物キモトリプシン（これもセリンプロテアーゼの１つである）と活性が類似している。さらに範囲を狭めた用語であり、亜群を包含するアルカリ性プロテアーゼは、いくつかのセリンプロテアーゼの高ｐＨ最適条件を反映する（Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753参照）。

ズブチラーゼ
ズブチラーゼと仮に呼ばれるセリンプロテアーゼの一亜群が、Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737およびSiezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523により提唱されている。それらは、ズブチリシン様プロテアーゼと従来は呼ばれたセリンプロテアーゼの170より多いアミノ酸配列の相同性分析により限定される。ズブチリシンは、従来はしばしば、グラム陽性細菌または真菌により産生されるセリンプロテアーゼと定義され、そしてSiezen等によれば、現在は、ズブチラーゼの一亜群である。広範な種々のズブチラーゼが同定されており、多数のズブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。このようなズブチラーゼおよびそれらのアミノ酸配列のさらに詳細な説明に関しては、Siezen et al.（1997）を参照されたい。

ズブチラーゼの一亜群であるI-S1または「真の」ズブチリシンは、「古典的」ズブチリシン、例えばズブチリシン168（BSS168）、ズブチリシンBPN'（配列番号38）、ズブチリシンCarlsberg（アルカラーゼ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）およびズブチリシンDY（BSSDY）を含む。

ズブチラーゼのさらに別の亜群であるI-S2または高アルカリ性ズブチリシンは、Siezen等（上記）により認識されている。亜群I-S2プロテアーゼは高アルカリ性ズブチリシンとして記載されており、ズブチリシンPB92（BAALKP）（マキサカル（登録商標）、Gist-Brocades NV）、ズブチリシン309（配列番号49）（サビナーゼ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）、ズブチリシン１４７（BLS147）（エスペラーゼ（登録商標）、NOVO NORDISK A/S）およびアルカリ性エラスターゼＹａＢ（BSEYAB）のような酵素を含む。

「サビナーゼ（登録商標）」
サビナーゼ（登録商標）は、NOVO NORDISK A/Sにより市販されている。それはB. Lentusからのズブチリシン309であり、１つの位置においてのみBAALKPと異なる（N87S、本明細書中の図１参照）。サビナーゼ（登録商標）は、図１においてｂ)で示された、そして配列番号49で示されるようなアミノ酸配列を有する。

親ズブチラーゼ
「親ズブチラーゼ」という用語は、Siezen等（1991および1997）により定義されたズブチラーゼを意味する。さらなる詳細に関しては、すぐ上の「ズブチラーゼ」の説明を参照されたい。親ズブチラーゼは天然供給源から単離されたズブチラーゼでもあり得るが、この場合、ズブチラーゼの特徴を保持しながら、その後の修飾がなされてきた。さらに親ズブチラーゼは、J.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896(1999)に記載されているようなDNAシャッフリング技法により調製されてきた。あるいは「親ズブチラーゼ」という用語は、「野生型ズブチラーゼ」と呼ばれ得る。

ズブチラーゼ変異体の修飾（単数または複数）
本明細書中で用いられる「修飾（単数または複数）」という用語は、ズブチラーゼの化学的修飾、ならびにズブチラーゼをコードするDNAの遺伝子操作を含むよう定義される。修飾（単数または複数）は、アミノ酸側鎖（単数または複数）の取替え、当該アミノ酸（単数または複数）中のまたはそこでの置換（単数または複数）、欠失（単数または複数）および／または挿入であり得る。

ズブチラーゼ変異体
本発明の情況において、ズブチラーゼ変異体または突然変異化ズブチラーゼという用語は、もとのまたは親遺伝子を保有し、対応する親酵素を産生する親微生物由来の突然変異体遺伝子を発現中の生物体により産生されたズブチラーゼを意味し、親遺伝子は、前記の突然変異化ズブチラーゼプロテアーゼが適切な宿主中で発現される場合に産生される突然変異体遺伝子を産生するために、突然変異化されている。

相同ズブチラーゼ配列
特定の活性部位ループ領域およびサビナーゼ（登録商標）ズブチラーゼの前記のループ中のアミノ酸挿入は、本発明のズブチラーゼ変異体を得るために本明細書中の修飾に関して同定される。

しかしながら本発明はこの特定のズブチラーゼの修飾に限定されないが、しかしサビナーゼ（登録商標）との相同一次構造を有するその他の親（野生型）ズブチラーゼに及ぶ。２つのアミノ酸配列間の相同は、この情況においては、パラメーター「同一性」により説明される。

２つのズブチラーゼ間の同一性の程度を確定するために、ＧＣＧパッケージバージョン9.1のＧＡＰルーチンが、同一設定を用いて適用され得る（下記）。ルーチンからの出力は、アミノ酸アラインメントの他に、２つの配列間の「同一性パーセント」の算定である。
この説明に基づいて、当業者が適切な相同ズブチラーゼおよび本発明により修飾され得る対応する相同活性部位ループ領域を同定することはルーチンである。

単離されたDNA配列
「単離された」という用語は、DNA配列分子に適用される場合、DNA配列がその天然遺伝子環境から除去されており、したがってその他の外来のまたは望ましくないコード配列を含有せず、遺伝子工学処理タンパク質産生系内での使用に適した形態である。このような単離分子はそれらの天然環境から分離されたものであり、それらの例としては、cDNAおよびゲノムクローンが挙げられる。本発明の単離されたDNA分子は、それらが普通は会合されないその他の遺伝子を含有しないが、しかし天然５'および３'非翻訳化領域、例えばプロモーターおよびターミネーターを含み得る。会合領域の同定は、当業者には明らかである（例えば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985参照）。「単離されたDNA配列」という用語は、あるいは「クローン化されたDNA配列」と呼ばれ得る。

単離されたタンパク質
タンパク質に適用される場合、「単離された」という用語は、タンパク質がその生来の環境から除去されていることを示す。
好ましい形態では、単離タンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（即ち、「同種不純物」）を実質的に含有しない。

単離されたタンパク質は、SDS-PAGEにより確認した場合、純度が10％より高い、好ましくは20％より高い、さらに好ましくは30％より高い。さらに、高精製形態で、即ちSDS-PAGEにより確認した場合に、40％より高い純度で、60％より高い純度で、80％より高い純度で、さらに好ましくは95％より高い純度で、最も好ましくは99％より高い純度でタンパク質を提供するのが好ましい。
「単離されたタンパク質」という用語は、あるいは「精製されたタンパク質」と呼ばれ得る。

同種不純物
「同種不純物」という用語は、本発明のズブチラーゼが最初に得られる同種細胞から生じる任意の不純物（例えば本発明のズブチラーゼとは別のポリペプチド）を意味する。

〜から得られる
「〜から得られる」という用語は、特定の微生物供給源と結び付けて本明細書中で用いる場合、特定供給源により、または供給源からの遺伝子が挿入されていた細胞によりポリヌクレオチドおよび／またはズブチラーゼが産生されることを意味する。

基質
プロテアーゼに対する基質と結びつけて用いられる「基質」という用語は、その最も広い形態において、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受け易い少なくとも１つのペプチド結合を含有する化合物を含むと解釈されるべきである。

生成物
プロテアーゼ酵素反応から得られる生成物と結び付けて用いられる「生成物」という用語は、本発明の情況においては、ズブチラーゼプロテアーゼを包含する加水分解反応の生成物を含むと解釈されるべきである。生成物は、その後の加水分解反応における基質であり得る。

洗浄性能
本発明の情況においては、「洗浄性能」という用語は、例えば洗浄または硬質表面清浄化中に清浄にされる対象物上に存在する卵の染みを除去する酵素の能力として用いられる。本明細書中の実施例３中の「モデル洗剤洗浄性能試験」も参照されたい。

性能係数
「性能係数」という用語は、以下の式に関して定義される：
Ｐ＝Ｒ（変異体）−Ｒ（親）
（式中、Ｐは性能係数であり、Ｒ（変異体）は「モデル洗剤洗浄性能試験」に記載されたようなズブチラーゼ変異体で処理された後の被験物質の反射率（460 nmで測定）であり、そしてＲ（親）は「モデル洗剤洗浄性能試験」に記載されたような対応する親ズブチラーゼで処理された後の被験物質の反射率（460 nmで測定）である）。さらなる詳細に関しては、本明細書中の「モデル洗剤洗浄性能試験」を参照されたい。

残留活性
「残留活性」という用語は、本明細書中の「卵抑制検定」に記載されているように定義される(実施例４参照)。

本発明の詳細な説明
本発明は、活性部位ループ（ｂ）領域が現在知られているものより長いズブチリシン変異体が、卵の染み除去に関して洗浄性能改良を示す、ということが判明した。その同定は、親野生型酵素と比較してモデル洗剤組成物における洗浄性能特性(卵の染みの除去に関して)改良を示すズブチリシン変異体、特にズブチリシン３０９（BLSAVIまたはサビナーゼ（登録商標））の構築に際して成された。

いかなる特定の理論にも限定されずに考えると、現在、作用改良は、ズブチラーゼ変異体の活性部位ループ（ｂ）領域における卵白阻害剤の結合の妨害による。これは次に、恐らくは、酵素のこの特定の部位における１つまたはそれ以上の追加のアミノ酸残基の挿入のための活性部位ループ（ｂ）領域の構造変化のためである。

したがって本明細書中に記載された使用に適しているとして意図される変異体は、野生型ズブチラーゼと比較した場合、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が１つまたはそれ以上の以下の位置に挿入された変異体である：位置95と96の間、位置96と97の間、位置97と98の間、位置98と99の間、位置99と100の間、位置100と101の間、位置101と102の間、位置102と103の間、位置103と104の間およびそれらの組合せ。
好ましくは、挿入は、位置97と98の間、位置98と99の間、位置99と100の間および／または位置100と101の間、特に位置98と99の間および位置99と100の間で成される。

本発明の第一の局面のズブチラーゼ変異体は、天然物から同定され、単離された親または野生型ズブチラーゼであり得る。
このような親野生型ズブチラーゼは、当業界で既知の標準技法により特異的にスクリーニングされ得る。

これを実行する好ましい一方法は、多数の異なる微生物、好ましくは異なるバシラス属菌株からのズブチラーゼ中の活性部位ループをコードすることが既知のDNA領域を特異的にPCR増幅することにより得る。
ズブチラーゼは、それらのDNAおよびアミノ酸配列が相同であるという意味で、保存された酵素の一群である。したがって、活性部位ループにフランキングする相対的に特異的なプライマーを構築することができる。

これを実行する一方法は、異なるズブチラーゼのアラインメントを調べることによる(例えば、Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523参照)。それは、このルーチンの作業から、例えばBLSAVIからのような、I-S1またはI-S2群のいずれかにおけるアミノ酸残基95〜103間の活性部位ループ（ｂ）に対応する活性部位ループにフランキングするPCRプライマーを当業者が構築することである。多数の異なる微生物、好ましくは異なるバシラス属菌株からのDNAを増幅し、その後前記の増幅PCR断片をDNAシーケンシングするためにこのようなPCRプライマーを用いて、位置95〜103までの活性部位ループ領域に対応する、例えばBLSAVIと比較して長い活性部位領域を含むこれらの群のズブチラーゼを産生する菌株を同定することができる。菌株およびこのような注目のズブチラーゼの部分DNA配列が同定されれば、このようなズブチラーゼのクローニング、発現および精製を当業者が完了することはルーチン作業である。

しかしながら本発明のズブチラーゼ変異体は主に親ズブチラーゼの変異体であるということが意図される。
本明細書中に記載された使用に適したズブチラーゼ変異体は、当業界で既知の標準技法により、例えば部位特異的／無作為突然変異誘発により、または異なるズブチラーゼ配列のDNAシャッフリングにより構築され得る。さらなる詳細に関しては、本明細書中の「材料と方法」の節(下記参照)を参照されたい。

当業者により認められるように、本明細書中に記載された変異体は、位置９５〜１０３までの少なくとも１つの挿入のほかに、少なくとも１つのさらに別の修飾を含む。例えば変異体は、活性部位ループ（ｂ）領域に１つまたはそれ以上の置換を、ならびに前記の領域の外側に１つまたはそれ以上の置換を含み得る。さらに変異体は、活性部位ループ（ｂ）領域の外側に１つまたはそれ以上のさらなる挿入を含み得る。
さらに、本明細書中に記載された領域における挿入は、１つより多いアミノ酸残基の挿入を包含する。例えば本発明の変異体は、１つの挿入、２つの挿入または２つより多い挿入、例えば３、４または５つの挿入を含有し得る。

本発明の好ましい実施態様では、以下の：位置99における置換、位置133における置換、位置143における置換、位置167における置換、位置170における置換、位置194における置換、位置42および43間における挿入、位置129および130間における挿入、位置216および217間における挿入、位置217および218間における挿入ならびにそれらの組合せから成る群から選択される位置において、さらなる修飾が実施される。

本発明の興味深い実施態様において、追加のアミノ酸残基は位置９８および９９間に挿入される（BASBPNナンバリング）。
位置98および99間の挿入は、好ましくは以下の群から選択される（BASBPNナンバリングで）：

あるいはより特定的なズブチリシン309および密接に関連したズブチラーゼ、例えばBAALKP、BLSUBLおよびBSKSMK：

さらに、位置98および99間の挿入がさらなる修飾と、即ち位置133〜143におけるアミノ酸残基の置換、ならびに位置167、170および194におけるアミノ酸残基の置換と併有される、というのが目下好ましい。
それぞれ位置133および134における（位置98および99間の挿入に加えての）置換は、好ましくは以下のものから成る群から選択される：

好ましい実施態様では、位置133における置換は、X133｛D、E、K、R｝、好ましくはX133DまたはX133E、特にX133Eからなる群から選択される。
別の好ましい実施態様では、位置143における置換は、X143｛D、E、K、R｝、好ましくはX143KまたはX143R、特にX143Kから成る群から選択される。

好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換を含むズブチラーゼ変異体である：X98XS+X133E+X143K。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換を含むサビナーゼ（登録商標）変異体である：A98AS+A133E+T143K。
さらに、それぞれ位置167、170および134における（位置98および99間の挿入のほかの）置換は、好ましくは以下のものから成る群から選択される：

好ましい実施態様では、
位置167における置換は、X167｛A、T、G、S｝から成る群から選択され、特にX167A；
位置170における置換は、X170｛A、T、G、S｝から成る群から選択され、特にX170S；そして
位置194における置換は、X194｛F、I、L、M、P、W、Y｝から成る群から選択され、特にX194P；
である。

好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換：X98XT+X167A+X170S+X194Pを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：A98AT+Y167A+R170S+A194Pを含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。
本発明のさらに興味深い実施態様では、追加のアミノ酸残基は位置99および100間に挿入される（BASBPNナンバリング）。
位置99および100間の挿入は、好ましくは以下のものから成る群から選択される（BASBPNナンバリングで）：

あるいはより特定的なズブチリシン309および密接に関連したズブチラーゼ、例えばBAALKP、BLSUBLおよびBSKSMK：

位置99および100間の挿入に関しては、本発明の興味深い一実施態様においては、挿入は位置99における置換と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置99における以下の置換が関連すると考えられる：

好ましい実施態様では、位置99における置換は、X99｛A、T、G、S｝、特にX99AまたはX99Tから成る群から選択される。
好ましい変異体の一例は、以下の挿入および置換：X99XD+X99AまたはX99XR+X99Tを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：S99SD+S99AまたはS99SR+S99Tを含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。

位置99および100間の挿入に関しては、本発明の別の興味深い実施態様においては、挿入は位置216および217間の少なくとも１つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前期の挿入のほかに、位置216および217間の以下の挿入が関連すると考えられる：

好ましい実施態様では、位置216および217間の挿入は、X216X｛F、I、L、M、P、W、Y｝から成る群から選択され、特にX216XPである。
好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：X99XD+X99A+X216XPならびにX99XD+X99A+X216XDPを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：S99SD+S99A+S216SPならびにS99SD+S99A+S216SDPを含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。

位置99および100間の挿入に関しては、本発明のさらに別の興味深い実施態様では、挿入は、位置217および218間の少なくとも１つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置217および218間の以下の挿入が関連すると考えられる：

好ましい実施態様では、位置217および218間の挿入は、X217X｛F、I、L、M、P、W、Y｝から成る群から選択され、特にX217XPである。
好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：X99XD+X99A+X217XPならびにX99XD+X217XPを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：S99SD+S99A+L217LPならびにS99SD+L217Pを含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。
位置99および100間の挿入に関しては、本発明のさらに興味深い実施態様においては、挿入は、位置42および43間の少なくとも１つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置42および43間の以下の挿入が関連すると考えられる：

好ましい実施態様では、位置42および43間の挿入は、X42X｛H、V、C、N、Q｝から成る群から選択され、特にX42XNである。
好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：X99XD+X42XNならびにX99XD+X99A+X42XNを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：S99SD+D42DNならびにS99SD+S99A+D42DNを含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。
位置99および100間の挿入に関しては、本発明のさらに興味深い実施態様においては、挿入は、位置129および130間の少なくとも１つのアミノ酸残基のさらなる挿入と併有されるのが好ましい。したがって、意図された前記の挿入のほかに、位置129および130間の以下の挿入が関連すると考えられる：

好ましい実施態様では、位置129および130間の挿入は、X129X｛D、E、K、R｝から成る群から選択される。
好ましい変異体の例は、以下の挿入および置換：X99XD+X129XDならびにX99XD+X99A+X129XDを含むズブチラーゼ変異体である。特に好ましい変異体は、以下の挿入および置換：S99SD+P129PDならびにS99SD+S99A+P129PDを含むサビナーゼ（登録商標）変異体である。
あるアミノ酸残基の類似のアミノ酸残基へのいわゆる保存的置換は、酵素の特徴の小変化のみを生じると予測されることは、当業者には周知である。
以下の表Ｉは、保存的アミノ酸置換の群を列挙する。

表Ｉ
保存的アミノ酸置換
一般特性 アミノ酸
塩基性（正荷電） Ｋ＝リシン
Ｈ＝ヒスチジン
酸性（負荷電） Ｅ＝グルタミン酸
Ｄ＝アスパラギン酸
極性 Ｑ＝グルタミン
Ｎ＝アスパラギン
疎水性 Ｌ＝ロイシン
Ｉ＝イソロイシン
Ｖ＝バリン
Ｍ＝メチオニン
芳香族 Ｆ＝フェニルアラニン
Ｗ＝トリプトファン
Ｙ＝チロシン
小 Ｇ＝グリシン
Ａ＝アラニン
Ｓ＝セリン
Ｔ＝トレオニン
この原則によれば、保存的置換を含むズブチラーゼ変異体は、互いに徹底的には異ならない特徴を示すと予測される。

本明細書中に開示されたおよび／または例示されたズブチラーゼ変異体を基礎にして、同様に改良された洗浄性能を示す他のズブチラーゼ変異体を得るために、これらの変異体に対する適切な保存的修飾（単数または複数）を当業者が同定するのは、ルーチン作業である。

構造分散性の天然または人工的作製から酵素を単離するために、そして親ズブチラーゼから変異体を設計および産生するためにも、親ズブチラーゼは亜群I-S1およびI-S2、特に亜群I-S2に属するのが好ましい。
亜群I-S1からの変異体に関しては、BSS168（BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP）、BASBPN、BSSDY、BLSCAR（BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3）、BSSPRCおよびBSSPRDまたは亜群I-S1の特徴を保有しているその機能的変異体からなる群から親ズブチラーゼを選択するのが好ましい。
亜群I-S2からの変異体に関しては、BSAPRQ、BLS147（BSAPRM、BAH101）、BLSAVI（BSKSMK、BAALKP、BLSUBL）、BYSYAB、BAPB92、TVTHERおよびBSAPRSまたは亜群I-S2の特徴を保有しているその機能的変異体からなる群から親ズブチラーゼを選択するのが好ましい。

特に親ズブチラーゼはBLSAVI（サビナーゼ（登録商標）、Novo Nordisk A/S）であり、本発明の好ましいズブチラーゼ変異体はしたがって、サビナーゼ（登録商標）の変異体である。したがって特に興味深い変異体は、サビナーゼ（登録商標）変異体、即ちBLSAVI変異体であって、この場合、

１．SeRが位置98および99間に挿入されており、位置133のAlaがGluで置換されており、そして位置143のThrがLysで置換されている（BASBPNナンバリング）か、あるいは
２．Aspが位置99および100間に挿入されており、そして位置99のSerがAlaで置換されているか（BASBPNナンバリング）、あるいは
３．Thrが位置98および99間に挿入されており、位置167のTyrがAlaで置換されており、位置170のArgがSerで置換されており、そして位置194のAlaがProで置換されているか（BASBPNナンバリング）、あるいは

４．Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてProが位置217および218間に挿入されている（BASBPNナンバリング）。
５．Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてProが位置216および217間に挿入されている（BASBPNナンバリング）。
６．Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてAsp-Proが位置216および217間に挿入されている（BASBPNナンバリング）。

７．Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてAspが位置129および130間に挿入されている（BASBPNナンバリング）。
８．Aspが位置99および100間に挿入されており、そしてAsnが位置42および43間に挿入されている（BASBPNナンバリング）。
９．Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そしてAsnが位置42および43間に挿入されている（BASBPNナンバリング）。

１０．Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがThrで置換されている。
１１．Aspが位置99および100間に挿入されており、位置99のSerがAlaで置換されており、そして位置131のProがThrで置換されている。

本発明は、前記のズブチラーゼ変異体のいずれかの、そのアミノ酸配列に対する任意のその他の修飾と組合せた使用も包含する。特に、改良された特性を酵素に提供するための当業界で既知のその他の修飾との組合せが意図される。当業界は異なる改良特性を有する多数のズブチラーゼ変異体を記載し、そしてそれらの多くが本明細書中の「発明の背景」の節に記載されている（上記参照）。それらの参考文献は、本明細書中に記載されたズブチラーゼ変異体と有益に併有され得るズブチラーゼ変異体を同定するための参考文献として、本明細書に開示される。

このような組合せは、位置：222（酸化安定性を改良する）、218（熱安定性を改良する）、酵素を安定化するCa結合部位、例えば位置76における置換、ならびに従来技術から明らかな多数のその他のものを含む。
さらに別の実施態様では、本明細書中に記載されたズブチラーゼ変異体は、以下の位置のいずれかにおける１つまたはそれ以上の修飾（単数または複数）と併有され得る：

特に以下のBLSAVI、BLSUBL、BSKSMKおよびBAALKP変異体は、組合せのために適切であると考えられる：

さらに、変異体S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104IまたはN76D+V104Aのいずれかあるいはこれらの突然変異（V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A）のその他の組合せ、あるいは前記の修飾（単数または複数）のうちのいずれかひとつまたはそれ以上と組合せたS101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252Kを含む変異体は、改良された特性を示す。

さらに本発明の主局面（単数または複数）のズブチラーゼ変異体は、好ましくは位置129、131および194のいずれかにおける１つまたはそれ以上の修飾（単数または複数）と、好ましくは129K、131Hおよび194P修飾として、最も好ましくはP129K、P131HおよびA194P修飾として併有される。任意のそれらの修飾（単数または複数）は、それらの産生においてより高い発現レベルのズブチラーゼ変異体を提供すると予測される。

前記のように、本明細書中に開示された変異体は、限定程度に、IV-0型トリプシン阻害剤により抑制されるだけであり、その結果、それらは卵の染みに及ぼす優れた洗浄性能を示す。したがって、当業者に、開発作業の初期段階で、この目的のための有効且つ好ましい変異体を選定させるために、本発明者は、問題の変異体の性能を最初に査定するために、当業者により容易に実行され得る適切な予備試験を提供した。

したがって、本明細書中の実施例４に開示された「卵抑制検定」は、選定の変異体の能力を最初に査定するために用いられ得る。言い換えれば、「卵抑制検定」は、IV-0型トリプシン阻害剤により、選定変異体が抑制され得るか否かならびにその程度を査定するために用いられ得る。この試験を用いて、卵の染みを除去するための選定変異体の適格性が査定され得る。その論理的根拠は、選定変異体がＩＶ−０型トリプシン阻害剤により強く抑制される場合には、それは、普通はさらなる試験的実験を実行する必要がないということである。

したがって、本明細書中に記載された使用のために特別に興味深い変異体は、本明細書中の実施例４に記載された「卵抑制検定」で試験した場合に、少なくとも10％、例えば少なくとも15％、例えば少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、例えば少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも35％の残留活性を有する変異体である。本発明の特に興味深い実施態様では、変異体は、本明細書中の実施例４に記載された「卵抑制検定」で試験した場合に、少なくとも40％、例えば少なくとも45％、例えば少なくとも50％、好ましくは少なくとも55％、例えば少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも65％、例えば少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも75％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも90％の残留活性を有する。

明らかに、本発明の変異体は、少なくとも記述された最低レベルに関して、さらに好ましくは記述された中間レベルで、最も好ましくは記述された最高レベルに関して、前記の判定基準を満たすのが好ましい。

あるいは、または前記の検定に加えて、選定変異体の適格性は、本明細書中の実施例３に開示された「モデル洗剤洗浄性能試験」で試験され得る。「モデル洗剤洗浄性能試験」は、標準洗剤組成物中に混入された場合に、参照系、即ち親ズブチラーゼ（同一モデル洗剤系に混入され、同一条件下で試験される）と比較して、標準テキスタイルから卵の染みを除去する変異体の能力を査定するために用いられ得る。この試験を用いて、卵の染みを除去するための選定変異体の適格性が最初に検査され得る。その論理的根拠は、選定変異体が親ズブチラーゼと比較される試験において有意の改良を示さない場合、それは普通はさらなる試験的実験を実行する必要がないということである。

したがって本明細書中に記載された使用のために特別に興味深い変異体は、本明細書中の実施例３に開示された「モデル洗剤洗浄性能試験」に記載されたような以下の：
6.2％ LAS（ナンサ80S）
2％ C₁₆〜C₁₈の脂肪酸のナトリウム塩
4％ 非イオン性界面活性剤（プルラファックスLF404）
22％ ゼオライトＰ
10.5％ Na₂CO₃
4％ Na₂Si₂O₅
2％ カルボキシメチルセルロース（CMC）
6.8％ アクリレート液CP5 40％
20％ 過ホウ酸ナトリウム（実験式NaBO₂・H₂O₂）
0.2％ EDTA
21％ Na₂SO₄
水（残余量）
を含むモデル洗剤組成物で試験した場合に、同一条件下で試験された親ズブチラーゼと比較して、卵の染みに及ぼす洗浄性能の改良を示すような変異体である。

洗浄性能における改良は、本明細書中の実施例３で定義されたいわゆる「性能係数」を用いることにより定量され得る。
本発明の非常に興味深い実施態様では、本発明の変異体は、「洗浄性能試験」で試験した場合、少なくとも１、例えば少なくとも1.5、例えば少なくとも２、好ましくは少なくとも2.5、例えば少なくとも３、例えば少なくとも3.5、特に少なくとも４、例えば少なくとも4.5、例えば少なくとも５つの性能係数を有する。

明らかに、本発明の変異体は、少なくとも記述された最低レベルに関して、さらに好ましくは記述された中間レベルで、最も好ましくは記述された最高レベルに関して、前記の判定基準を満たすのが好ましい。

前記のように、本発明は新規のズブチラーゼ変異体も提供する。本発明の新規のズブチラーゼ変異体局面に関する詳細および明細は、本発明の使用局面と結びつけて前記された変異体の詳細および明細と同一であるかまたは類似する。これは、適切な場合はいつでも、本明細書中で詳細に考察された使用（例えば好ましい挿入および置換等）に関する記述は、必要な変更を加えて、本発明の新規のズブチラーゼ変異体に、ならびに本発明の方法局面に、そして清浄用および洗剤組成物局面に適用する。

ズブチラーゼ変異体の産生
ズブチラーゼをクローニングするための、ならびに遺伝子（例えばズブチラーゼ遺伝子）中への挿入を導入するための多数の方法は、当業界で周知である（「発明の背景」の節で引用された参考文献を比較されたい）。

概して、遺伝子のクローニングおよび前記遺伝子中への挿入（無作為および／または部位特異的）の導入のための標準手法は、本発明のズブチラーゼ変異体を生成するために用いられ得る。適切な技法のさらなる説明に関しては、本明細書中の実施例（下記参照）、ならびにSambrook et al.(1989) Molecular cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al.(eds.) “Current protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990およびWO 96/34946を参照されたい。

さらにズブチラーゼ変異体は、多彩性の人工的作製のための標準技法により、例えば異なるズブチラーゼ遺伝子のDNAシャッフリングにより構築され得る（WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370: 389-91 (1994)）。例えばサビナーゼ（登録商標）の活性部位（ｂ）ループより長い活性部位（ｂ）ループ領域を含むことが天然で同定された１つまたはそれ以上の部分ズブチラーゼ配列を有するサビナーゼ（登録商標）をコードする遺伝子のDNAシャッフリングは、改良型洗浄性能変異体に関するその後のスクリーニング後に、本明細書中に記載された目的に適したズブチラーゼ変異体を提供する。

発現ベクター
本発明の酵素をコードするDNA構築物を含む組換え発現ベクターは、組換えDNA法を便利に施され得る任意のベクターであり得る。ベクターの選択はしばしば、それが導入される宿主細胞に依存する。したがってベクターは、自律的複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター、例えばプラスミドであり得る。

あるいはベクターは、宿主細胞中への導入時に、一部分またはその全体を宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数または複数）と一緒に複製されるものであり得る。

ベクターは、好ましくはその中で本発明の酵素をコードするDNA配列が、DNAの転写に必要とされる追加のセグメントと操作可能的に連結される発現ベクターである。概して発現ベクターはプラスミドまたはウイルスDNAに由来し、あるいは両方の素子を含有し得る。「操作可能的に連結される」という用語は、セグメントが、それらの意図された目的と共同して機能するよう、例えば転写がプロモーターで開始して、酵素をコードするDNA配列を介して進行するよう整列されることを示す。

プロモーターは、選定宿主細胞中で転写活性を示す任意のDNA配列であり得るし、そして宿主細胞と同種または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。
細菌宿主細胞中での使用のための適切なプロモーターの例としては、バシラス属のBacillus stearothermophilusマルトゲン性アミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformisα−アミラーゼ遺伝子、デンプン液化バシラスBacillus amyloliquefaciensα−アミラーゼ遺伝子、枯草菌Bacillus subtilusアルカリ性プロテアーゼ遺伝子またはBacillus pumilusキシロシダーゼ遺伝子、あるいはラムダファージＰ_RまたはＰ_Lプロモーター、あるいは大腸菌lac、trpまたはtacプロモーターが挙げられる。

本発明の酵素をコードするDNA配列は、必要な場合、適切なターミネーターとも操作可能的に連結され得る。
本発明の組換えベクターは、当該宿主細胞中でベクターを複製させるＤＮＡ配列をさらに含み得る。

ベクターは、選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞中の欠陥を補足する遺伝子、または例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン等のような抗生物質に対する耐性、あるいは重金属または除草剤に対する耐性をコードする遺伝子も含み得る。

宿主細胞の分泌経路に本発明の酵素を向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られている）が組換えベクター中に提供される。分泌シグナル配列は、的確なリーディングフレーム中で酵素をコードするDNA配列と接合される。分泌シグナル配列は一般に、酵素をコードするDNA配列に対して５‘に置かれる。分泌シグナル配列は、普通は酵素と会合するものであり得るし、あるいは別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からであり得る。

それぞれ本発明の酵素、プロモーターおよび任意にターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をコードするDNA配列を結繋するために、あるいは適切なＰＣＲ増幅計画によりこれらの配列を集合するために、そして複製または組込みに必要な情報を含有する適切なベクター中にそれらを挿入するために用いられる手法は、当業者には周知である（例えば、Sambrook et al.前記引用を比較されたい）。

宿主細胞
宿主細胞中に導入される本発明の酵素をコードするDNA配列は、当該宿主に対して同種または異種であり得る。宿主細胞に対して同種である、即ち、天然に宿主細胞により産生される場合、それは典型的には別のプロモーター配列と操作可能的に連結され、あるいは適切な場合には、その天然環境におけるのとは違う別の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列と操作可能的に連結される。「同種の」という用語は、当該宿主生物体にとって天然である酵素をコードするDNA配列を含むよう意図される。「異種の」という用語は、天然で宿主により発現されないDNA配列を含むよう意図される。したがってDNA配列は別の生物体からであり得るし、あるいはそれは合成配列であり得る。

その中に本発明のDNA構築物または組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の酵素を産生し得る任意の細胞であり、その例としては、細菌、酵母、真菌および高等真核生物細胞、例えば植物が挙げられる。

培養時に本発明の酵素を産生し得る細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバシラス属の菌株、例えば枯草菌B. subtilus、B. licheniformis、B. lentus、短バシラスB. brevis、B. stearothermophilus、B. alkalophilus、デンプン液化バシラスB. amyloliquefaciens、B. coagulans、B. circulans、B. lautus、巨大菌B. megatheriumまたはB. thuringiensis、あるいはストレプトミセス属の菌株、例えばS. lividansまたはS. murinus、あるいはグラム陰性細菌、例えば大腸菌である。

細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔、接合により、あるいはそれ自体既知の方法でコンピテント細胞を用いることにより実行され得る（Sambrook et al.上記を比較されたい）。

細菌、例えば大腸菌中で酵素を発現する場合、酵素は典型的には不溶性顆粒（封入体として既知である）として細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒は回収されて、変性され、その後、変性剤を希釈することにより酵素は構造復元される。後者の場合には、細胞を粉砕することにより、例えば音波処理または浸透圧ショックにより酵素を細胞周辺腔から回収して、細胞周辺腔の内容物を放出し、酵素を回収し得る。

グラム陽性細菌、例えばバシラス属またはストレプトミセス属菌株中で酵素を発現する場合、酵素は細胞質中に保持され得るし、あるいは細菌分泌配列により細胞外培地に向けられる。後者の場合、酵素は下記のように培地から回収され得る。

ズブチラーゼ変異体の産生方法
本発明は、本発明の単離酵素の産生方法であって、酵素をコードするDNA配列で形質転換された適切な宿主細胞が酵素の産生を可能にする条件下で培養され、その結果生じた酵素が培養から回収される方法を提供する。
酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターが異種宿主中で形質転換される場合、本発明の酵素の異種組換え体産生を可能にし得る。

それにより、同種不純物を含有しないことを特徴とする高度精製ズブチラーゼ組成物を製造することができる。
この情況では、同種不純物は、本発明の酵素が本来得られる同種細胞から生じるあらゆる不純物（例えば本発明の酵素以外の他のポリペプチド）を意味する。

形質転換化宿主細胞を培養するために用いられる培地は、当該宿主細胞を増殖するのに適した任意の慣用的培地であり得る。発現ズブチラーゼは、培地中に分泌されるのが便利であり、周知の手法により、例えば遠心分離または濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質様構成成分を沈殿し、その後、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー処理することにより、そこから回収される。

清浄用および洗剤組成物
概して、清浄用および洗剤組成物は当業界で十分記載されており、適切な清浄用および洗剤組成物のさらなる説明に関しては、WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011を参照されたい。
さらに本明細書中の実施例は、多数のズブチラーゼ変異体に関する卵の染みに及ぼす洗浄性能における改良を立証する。

洗剤組成物
ズブチラーゼ変異体は、付加され、したがって洗剤組成物の一構成成分になり得る。
本発明の洗剤組成物は、例えば手洗いまたは機械洗い洗濯用洗剤組成物、例えば汚れた布帛の前処理に適した洗濯用添加剤組成物およびリンス付加布帛柔軟剤組成物として処方され得るし、あるいは一般家庭硬質表面清浄作業における使用のための洗剤組成物として処方され、あるいは手洗いまたは機械食器洗浄作業のために処方され得る。

特定の局面において、本発明は、本発明のズブチラーゼ酵素を含む洗剤添加剤を提供する。洗剤添加剤ならびに洗剤組成物は、１つまたはそれ以上の他の酵素、例えば別のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼを含み得る。

概して、選択される酵素（単数または複数）の特性は、選定洗剤と相溶性であり（即ち、pH−最適条件、他の酵素および非酵素成分との相溶性等）、そして酵素（単数または複数）は有効量で存在すべきである。

プロテアーゼ：適切なプロテアーゼとしては、動物、植物または微生物起源のものが挙げられる。微生物起源が好ましい。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバシラス属から得られるもの、例えばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシン309、ズブチリシン147およびズブチリシン168である(WO 89/06279に記載）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えばブタまたはウシ起源の）およびWO 89/06270およびWO 94/25583に記載されたフザリウム属プロテアーゼである。

有用なプロテアーゼの例は、WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116およびWO 98/34946に記載された変異体、特に以下の位置：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235および274のうちの1つまたはそれ以上における置換を有する変異体である。

好ましい市販プロテアーゼ酵素としては、アルカラーゼ^TM、サビナーゼ^TM、プリマーゼ^TM、デュラナーゼ^TM、エスペラーゼ^TMおよびカンナーゼ^TM（Novo Nordisk A/S）、マキサターゼ^TM、マキサカル^TM、マキサペム^TM、プロペラーゼ^TM、プラフェクト^TM、プラフェクトＯｘＰ^TM、ＦＮ２^TMおよびＦＮ３^TM（Genencor International Inc.）が挙げられる。

リパーゼ：適切なリパーゼとしては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。有用なリパーゼの例としては、フミコラ属（サーモミセス属と同義語）からの、例えば欧州特許第258 068号および欧州特許第305 216号に記載されているようなH. lanuginosa（T. lanuginosus）からの、またはWO 96/13580に記載されているようなH. insolensからのリパーゼ、シュードモナス属リパーゼ、例えばP. alcaligenesまたはP. pseudoalcaligenes（欧州特許第218 272号）、P. cepacia（欧州特許第331 376号）、P. stutzeri（英国特許第1,372,034号）、P. fluorescens、シュードモナス種菌株SD705（WO 95/06720およびWO 96/27002）、P. wisconsinensis（WO 96/12012）からのリパーゼ、バシラス属リパーゼ、例えば枯草菌B. subtilus（Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、B. stearothermophilus（JP 64/744992）またはB. Pumilus（WO 91/16422）からのリパーゼが挙げられる。

その他の例は、例えば、WO 92/05249WO 94/01541、欧州特許第407225号、欧州特許第260 105号、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079およびWO 97/07202に記載されているもののようなリパーゼ変異体である。
好ましい市販リパーゼ酵素としては、リポラーゼ^TMおよびリポラーゼウルトラ^TM（Novo Nordisk A/S）が挙げられる。

アミラーゼ：適切なアミラーゼ（αおよび／またはβ）としては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。アミラーゼとしては、例えばバシラス属Bacillus、例えば英国特許第号により詳細に記載されているB. licheniformisの特定菌株から得られるα−アミラーゼが挙げられる。

有用なアミラーゼの例は、WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873およびWO97/43424に記載されている変異体、特に以下の位置：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408および444のうちの１つまたはそれ以上に置換を伴う変異体である。
市販アミラーゼは、デュラミル^TM、テルマミル^TM、フンガミル^TMおよびＢＡＮ^TM（Novo Nordisk A/S）、ラピダーゼ^TMおよびプラスター^TM（Genencor International Inc.）である。

セルラーゼ：適切なセルラーゼとしては、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。適切なセルラーゼとしては、米国特許第4,435,307号、米国特許第5,648,263号、米国特許第5,691,178号、米国特許第5,776,757号およびWO 89/09259に開示されているバシラス属、シュードモナス属、フミコラ続、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属、からのセルラーゼ、例えばHumicola insolens、Myceliophthora thermophilaおよびFusarium oxysporumから産生される真菌セルラーゼが挙げられる。

特に適切なセルラーゼは、色保護利点を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第0 495 257号、欧州特許第0 531 372号、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940に記載されたセルラーゼである。その他の例は、例えばWO 94/07998、欧州特許第0 531 315号、米国特許第5,457,046号、米国特許第5,686,593号、米国特許第5,763,254号、WO 95/24471WO 98/12307PCT/DK98/00299に記載されたもののようなセルラーゼ変異体である。

市販セルラーゼとしては、セルザイム^TMおよびカレザイム^TM（Novo Nordisk A/S）、クラジナーゼ^TMおよびプラダックスＨＡ^TM（Genencor International Inc.）ならびにＫＡC-500（Ｂ）^TM（Kao Corporation）が挙げられる。

ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。化学的修飾化またはタンパク質工学処理突然変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例としては、WO 93/24618、WO 95/10602およびWO 98/15257に記載されているもののような、ヒトヨタケ属Coprinusからの、例えばC. cinereusからのペルオキシダーゼおよびそれらの変異体が挙げられる。
市販ペルオキシダーゼとしては、ガードザイム^TM（Novo Nordisk A/S）が挙げられる。

洗剤酵素（単数または複数）は、１つまたはそれ以上の酵素を含有する別個の添加剤を付加することにより、あるいはこれらの酵素の全てを含む併合添加剤を付加することにより、洗剤組成物中に含入され得る。本発明の洗剤添加剤、即ち別個の添加剤または併合添加剤は、例えば顆粒、液体、スラリー等として処方され得る。好ましい洗剤添加剤処方物は、顆粒、特に無粉塵性顆粒、液体、特に安定化液、あるいはスラリーである。

無粉塵性顆粒は、例えば米国特許第4,106,991号および第4,661,452号に開示されているように生成され、そして任意に、当業界で既知の方法により被覆され得る。蝋質コーティング物質の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を有し、15〜80エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；ならびに脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。

流動床技術による適用に適した皮膜形成コーティング物質の例は、英国特許第1483591号に示されている。液体酵素調製物は、確立された方法にしたがって、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を付加することにより安定化され得る。保護酵素は、欧州特許第238,216号に開示された方法により調製され得る。

本発明の洗剤組成物は、任意の便利な形態で、例えば棒、錠剤、粉末、顆粒、ペーストまたは液体であり得る。液体洗剤は、水性で典型的には70％までの水および0〜30％の有機溶媒を含有するか、または非水性あり得る。

洗剤組成物は、典型的には１つまたはそれ以上の界面活性剤を含み、それらは非イオン性、例えば半極性および／または陰イオン性および／または陽イオン性および／または両イオン性であり得る。界面活性剤は、典型的には0.1重量％〜60重量％のレベルで存在する。その中に含入される場合、洗剤は通常は約1％〜約40％の陰イオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二級アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−またはアルケニルコハク酸または石鹸を含有する。

その中に含入される場合、洗剤は普通は、約0.2％〜40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドまたはグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」）を含有する。

洗剤は、0〜65％の洗剤ビルダーまたは錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カルボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキルまたはアルケニルコハク酸、可溶性シリケートまたは層化シリケート（例えば、ＳＫＳ−６（Hoechst））を含有し得る。

洗剤は、１つまたはそれ以上のポリマーを含み得る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ならびにラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーがある。

洗剤は、過酸生成漂白活性剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネートと併合され得るH₂O₂供給源、例えばペルボレートまたはペルカルボネートを含み得る漂白系を含有し得る。択一的に、漂白系は、例えばアミド、イミドまたはスルホン型のペルオキシ酸を含み得る。

本発明の洗剤組成物の酵素（単数または複数）は、慣用的安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸またはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステルまたはフェニルホウ素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルホウ素酸を付加することにより安定化され、そして組成物は、例えばWO 92/19709およびWO 92/19708に記載されたように処方され得る。

洗剤は、その他の慣用的洗剤成分、例えば布帛コンディショナー、例えば粘土、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ沈殿防止剤、汚れ再沈着防止剤、染料、殺細菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇り抑制剤または香料も含有し得る。
洗剤組成物中に、任意の酵素、特に本発明の酵素が、0.01〜100 mgの酵素タンパク質／洗浄液１リットル、好ましくは0.05〜5 mgの酵素タンパク質／洗浄液１リットル、特に0.1〜1 mgの酵素タンパク質／洗浄液１リットルに対応する量で付加され得る、ということが目下意図される。

本発明の酵素は、WO 97/07202（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示された洗剤処方物中に追加のに混入され得る。
本発明は、以下の実施例でさらに詳細に記載されるが、それらの実施例は、いかなる点においても、特許請求されるような本発明の範囲を限定するよう意図されない。

洗剤組成物において、省略構成成分表記は、以下の意味を有する：
LAS： 線状Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム
TAS： 獣脂アルキル硫酸ナトリウム
XYAS： C_1X〜C_1Yのアルキル硫酸ナトリウム
SS： 式２−ブチルオクタン酸の第二級石鹸界面活性剤
25EY： 平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合されるＣ₁₂〜Ｃ₁₅の主に線状の第一級アルコール
45EY： 平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合されるＣ₁₄〜Ｃ₁₅の主に線状の第一級アルコール

XYEZS： 平均Ｚモルのエチレンオキシド／モルと縮合されるＣ_1X〜Ｃ_1Yのアルキル硫酸ナトリウム
非イオン性：平均エトキシル化度3.8および平均プロポキシル化度4.5のＣ〜Ｃの混合エトキシル化／プロポキシル化脂肪アルコール。プルラファックスＬＦ４０４の商品名でBASF GmbHから販売されている
CFAA： C₁₂〜C₁₄のアルキルＮ−メチルグルカミド
TFAA： C₁₆〜C₁₈のアルキルＮ−メチルグルカミド
シリケート： 非晶質ケイ酸ナトリウム（SiO₂：Na₂O比＝2.0）
NaSKS-6： 式δ-Na₂Si₂O₅の結晶層化シリケート

カルボネート： 無水炭酸ナトリウム
ホスフェート： トリポリ燐酸ナトリウム
MA／AA： 平均分子量約80,000の1:4マレイン酸／アクリル酸のコポリマー
ポリアクリレート： 平均分子量8,000のポリアクリレートホモポリマー。ＰＡ３０の商品名でBASF GmbHから販売されている
ゼオライトＡ： 1〜10μmの範囲の一次粒子サイズを有する式Na₁₂（AlO₂SiO₂）₁₂・27H₂Oの水和アルミノケイ酸ナトリウム
シトレート： クエン酸三ナトリウム二水和物
シトリック： クエン酸

ペルボレート： 無水過ホウ酸ナトリウム一水和物漂白剤。実験式ＮａＢＯ₂・Ｈ₂Ｏ₂
PB4： 無水過ホウ酸ナトリウム四水和物
ペルカルボネート： 実験式２Ｎａ₂ＣＯ₃・３Ｈ₂Ｏ₂の無水過炭酸ナトリウム漂白剤
TAED： テトラアセチルエチレンジアミン
CMC： ナトリウムカルボキシメチルセルロース
DETPMP： ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）。デクエスト2060の商品名でMonsantoにより販売されている
PVP： ポリビニルピロリドンポリマー

EDDS： エチレンジアミン−N,N'−二コハク酸。ナトリウム塩の形態の［S,S］異性体
石鹸泡抑制剤： 25％パラフィン蝋、融点50℃、17％疎水性シリカ、58％パラフィン油
粒状石鹸泡抑制剤： 12％シリコーン／シリカ、18％ステアリルアルコール、70％粒状形態のデンプン
スルフェート： 無水硫酸ナトリウム
HMWPEO： 高分子量ポリエチレンオキシド
TAE25： 獣脂アルコールエトキシレート

洗剤実施例Ｉ
本発明の粒状布帛清浄用組成物は、以下のように調製され得る：
線状C₁₂アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム 6.5
硫酸ナトリウム 15.0
ゼオライトＡ 26.0
ニトリロ三酢酸ナトリウム 5.0
酵素 0.1
PVP 0.5
TAED 3.0
ホウ酸 4.0
ペルボレート 18.0
フェノールスルホネート 0.1
少量成分 全量で100％まで

洗剤実施例II
圧縮粒状布帛清浄用組成物（密度800 g/l）は、本発明にしたがって以下のように調製し得る：
45AS 8.0
25E3S 2.0
25E5 3.0
25E3 3.0
TFAA 2.5
ゼオライトＡ 17.0
NaSKS-6 12.0
クエン酸 3.0

カルボネート 7.0
MA/AA 5.0
CMC 0.4
酵素 0.1
TAED 6.0
ペルカルボネート 22.0
EDDS 0.3
粒状石鹸泡抑制剤 3.5
水／少量成分 全量で100％まで

洗剤実施例III
着色布帛の洗濯に際して特に有用である本発明の粒状布帛清浄用組成物を、以下のように調製した：
LAS 10.7 −
TAS 2.4 −
TFAA − 4.0
45AS 3.1 10.0
45E7 4.0 −
25E3S − 3.0
68E11 1.8 −

25E5 − 8.0
シトレート 15.0 7.0
カルボネート − 10.0
クエン酸 2.5 3.0
ゼオライトＡ 32.1 25.0
Na-SKS-6 − 9.0
MA/AA 5.0 5.0
DETPMP 0.2 0.8
酵素 0.10 0.05
シリケート 2.5 −

スルフェート 5.2 3.0
PVP 0.5 −
ポリ（４−ビニルピリジン）−Ｎ−オキシド／ビニルイミダゾールとビニルピロリドンのコポリマー − 0.2
ペルボレート 1.0 −
フェノールスルホネート 0.2 −
水／少量成分 全量で100％まで

洗剤実施例IV
「洗浄による柔軟化」能力を提供する本発明の粒状布帛清浄用組成物は、以下のように調製し得る：
45AS − 10.0
LAS 7.6 −
68AS 1.3 −
25E3 − 5.0
ココアルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
1.4 1.0
シトレート 5.0 3.0
Na-SKS-6 − 11.0

ゼオライトＡ 15.0 15.0
MA/AA 4.0 4.0
DETPMP 0.4 0.4
ペルボレート 15.0 −
ペルカルボネート − 15.0
TAED 5.0 5.0
緑粘土 10.0 10.0
HMWPEO − 0.1
酵素 0.10 0.05
シリケート 3.0 5.0
カルボネート 10.0 10.0
粒状石鹸泡抑制剤 1.0 4.0
CMC 0.2 0.1
水／少量成分 全量で100％まで

洗剤実施例V
本発明のヘビーデューティー液体布帛清浄用組成物は、以下のように調製し得る：
LAS酸形態 − 25.0
クエン酸 5.0 2.0
25AS酸形態 8.0 −
25AE2S酸形態 3.0 −
25AE7 8.0 −
CFAA 5 −
DETPMP 1.0 1.0
脂肪酸 8 −

オレイン酸 − 1.0
エタノール 4.0 6.0
プロパンジオール 2.0 6.0
酵素 0.10 0.05
ココアルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
− 3.0
緑粘土 − 5.0
PVP 2.0 −
水／少量成分 全量で100％まで

粉末自動食器洗浄用組成物Ｉ
非イオン性界面活性剤 0.4〜2.5％
メタケイ酸ナトリウム 0 〜 20％
二ケイ酸ナトリウム 3 〜 20％
三リン酸ナトリウム 20 〜40％
炭酸ナトリウム 0 〜 20％
過ホウ酸ナトリウム 2 〜 9％
テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）1 〜 4％
硫酸ナトリウム 5 〜 33％
酵素 0.0001〜0.1％

粉末自動食器洗浄用組成物II
非イオン性界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート）
1 〜 2％
二ケイ酸ナトリウム 2 〜 30％
炭酸ナトリウム 10 〜 50％
ホスホン酸ナトリウム 0 〜 5％
クエン酸三ナトリウム二水和物 9 〜30％
ニトリロ三ナトリウム酢酸（NTA） 0 〜20％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 5 〜10％
テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）1 〜 2％
ポリアクリレートポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー）
6 〜 25％
酵素 0.0001〜0.1％
香料 0.1〜0.5％
水 5 〜10

粉末自動食器洗浄用組成物III
非イオン性界面活性剤 0.5〜2.0％
二ケイ酸ナトリウム 25 〜 40％
クエン酸ナトリウム 30 〜 55％
炭酸ナトリウム 0 〜 29％
重炭酸ナトリウム 0 〜 20％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 0 〜 15％
テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）0 〜 6％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 5％
粘土 1 〜 3％
ポリアミノ酸 0 〜 20％
ポリアクリル酸ナトリウム 0 〜 8％
酵素 0.0001〜0.1％

粉末自動食器洗浄用組成物IV
非イオン性界面活性剤 1 〜 2％
ゼオライトMAP 15 〜42％
二ケイ酸ナトリウム 30 〜 34％
クエン酸ナトリウム 0 〜 12％
炭酸ナトリウム 0 〜 20％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 7 〜 15％
テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）0 〜 3％

ポリマー 0 〜 4％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 5％
有機ホスホネート 0 〜 4％
粘土 1 〜 2％
酵素 0.0001〜0.1％
硫酸ナトリウム 残余量

粉末自動食器洗浄用組成物V
非イオン性界面活性剤 1 〜 7％
二ケイ酸ナトリウム 18 〜 30％
クエン酸三ナトリウム 10 〜 24％
炭酸ナトリウム 12 〜 20％
モノペルスルフェート（2KHSO₅、KHSO₄、K₂SO₄）
15 〜 21％
漂白安定剤 0.1〜 2％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 6％
ジエチレントリアミンペンタアセテート、五ナトリウム塩
0 〜 2.5％
酵素 0.0001〜0.1％
硫酸ナトリウム、水 残余量

清浄界面活性剤系を有する粉末および液体食器洗浄用組成物VI
非イオン性界面活性剤 0 〜 1.5％
オクタデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物 0 〜 5％
オクタデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物およびヘキサデシルジメチルアミンＮ−オキシド二水和物の80:20重量C18／C16配合物 0 〜 4％
オクタデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ−オキシド無水物およびヘキサデシルビス（ヒドロキシエチル）アミンＮ−オキシド無水物の70:30重量C18／C16配合物
0 〜 5％
平均エトキシル化度３のC₁₃〜C₁₅のアルキルエトキシスルフェート 0 〜 10％
平均エトキシル化度３のC₁₂〜C₁₅のアルキルエトキシスルフェート 0 〜 5％

平均エトキシル化度12のC₁₃〜C₁₅のエトキシル化アルコール 0 〜 5％
平均エトキシル化度９のC₁₂〜C₁₅のエトキシル化アルコール 0 〜 6.5％
平均エトキシル化度30のC₁₃〜C₁₅のエトキシル化アルコールの配合物0 〜 4％
二ケイ酸ナトリウム 0 〜 33％
トリポリ燐酸ナトリウム 0 〜 46％
クエン酸ナトリウム 0 〜 28％
クエン酸 0 〜 29％
炭酸ナトリウム 0 〜 20％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 0 〜11.5％
テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ） 0 〜 4％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 0 〜 7.5％
硫酸ナトリウム 0 〜12.5％
酵素 0.0001〜0.1％

非水性液体自動食器洗浄用組成物VII
液体非イオン性界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート）2.0〜10.0％
アルカリ金属ケイ酸塩 3.0〜15.0％
アルカリ金属リン酸塩 20.0〜40.0％
高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液体担体
25.0〜45.0％
安定剤（例えばリン酸およびＣ₁₆〜Ｃ₁₈のアルカノールの部分エステル）
0.5〜7.0％
発泡抑制剤（例えばシリコーン） 0 〜1.5％
酵素 0.0001〜0.1％

非水性液体食器洗浄用組成物VIII
液体非イオン性界面活性剤（例えばアルコールエトキシレート） 2.0〜10.0％
ケイ酸ナトリウム 3.0〜15.0％
アルカリ金属炭酸塩 7.0〜20.0％
クエン酸ナトリウム 0.0〜1.5％
安定剤（例えば微粉砕シリコーンおよび低分子量ジアるきるポリグリコールエーテルの混合物） 0.5〜7.0％
低分子量ポリアクリレートポリマー 5.0〜15.0％
粘土ゲル増粘剤(ベントナイト) 0.0〜10.0％
ヒドロキシプロピルセルロースポリマー 0.0〜0.6％
酵素 0.0001〜0.1％
高級グリコール、ポリグリコール、ポリオキシド、グリコールエーテルから選択される液体担体 残余量

チキソトロピック液体自動食器洗浄用組成物IX
C₁₂〜C₁₄の脂肪酸 0 〜0.5％
ブロックコポリマー界面活性剤 1.5％〜15.0％
クエン酸ナトリウム 0 〜 12％
トリポリ燐酸ナトリウム 0 〜 15％
炭酸ナトリウム 0 〜 8％
三ステアリン酸アルミニウム 0 〜0.1％
スルホン酸クメンナトリウム 0 〜1.7％
ポリアクリレート増粘剤 1.32〜2.5％
ポリアクリル酸ナトリウム 2.4〜6.0％
ホウ酸 〜4.0％

ギ酸ナトリウム 0 〜0.45％
ギ酸カルシウム 0 〜0.2％
ナトリウムｎ−デシジフェニルオキシドジスルフォネート 0〜4.0％
モノエタノールアミン(MEA) 〜1.86％
水酸化ナトリウム（50％） .9〜9.3％
１,２−プロパンジオール 0 〜9.4％
酵素 0.0001〜0.1％
石鹸泡抑制剤、染料、香料、水 残余量

液体自動食器洗浄用組成物X

アルコールエトキシレート 0 〜20％
脂肪酸エステルスルホネート 0 〜30％
ドデシル硫酸ナトリウム 0 〜20％
アルキルポリグリコシド 0 〜21％
オレイン酸 0 〜10％
二ケイ酸ナトリウム一水和物 18 〜 33％
クエン酸ナトリウム二水和物 18 〜 33％
ステアリン酸ナトリウム 0 〜 2.5％
過ホウ酸ナトリウム一水和物 0 〜 13％
テトラアセチルエチレンジアミン（TAED） 0 〜 8％
マレイン酸／アクリル酸コポリマー 4 〜 8％
酵素 0.0001〜0.1％

保護化漂白剤粒子を含有する液体自動食器洗浄用組成物XI
ケイ酸ナトリウム 5 〜 10％
ピロリン酸四カリウム 15 〜 25％
三リン酸ナトリウム 0 〜 2％
炭酸カリウム 4 〜 8％
保護化漂白剤粒子、例えば塩素 5 〜 10％
高分子増粘剤 .7〜1.5％
水酸化カリウム 0 〜 2％
酵素 0.0001〜0.1％
水 残余量

XII：I、II、III、IV、VIおよびXに記載されたような自動食器洗浄用組成物。この場合、ペルボレートはペルカルボネートに置換される。

XIII：マンガン触媒を追加のに含有するＩ〜VIに記載されたような自動食器洗浄用組成物。マンガン触媒は、例えば、”Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching”, Nature, (1994), 369, 637-639に記載された化合物の１つであり得る。

方法および材料
テキスタイル：
WFK10N標準テキスタイル片（卵の染み）は、WFK Testgewebe GmbH, Christenfeld 10, D-41379 Bruggen-Bracht, Germanyから入手した。

菌株：
枯草菌B. subtilus DN1885（Diderichsen et al., 1990）。
B. lentus 309および147は、NCIBに保管され、寄託番号NCIB10309および10147を与えられた、そして米国特許第3,723,250号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているバシラス属のBacillus lentusの特定菌株である。
大腸菌ＭＣ1000（M.J. Casadaban and S.N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179-207）は、慣用的方法によりｒ^-、ｍ⁺を作製されたものであって、米国特許出願第039,298号に記載されている。

プラスミド：
pJS3（配列番号60）：ズブチラーゼ３０９をコードする合成遺伝子を含有する大腸菌−枯草菌シャトルベクター（Jacob Schiodt et al. in Protein and Peptide letters 3:39-44 (1996)により記載されている）。
pSX222：枯草菌発現ベクター（WO 96/34946に記載）

一般分子生物学的方法：
別記しない限り、ＤＮＡ操作および形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて実施した（Sambrook et al.(1989) Molecular cloning:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al.(eds.) “Current protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990）。
DNA操作のための酵素は、供給元の使用説明書にしたがって用いた。

DNA操作のための酵素
別記しない限り、DNA操作用の酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等は全て、New England Biolabs, Inc.から入手する。

タンパク質分解活性
本発明の情況において、タンパク質分解活性は、Kilo NOVOプロテアーゼ単位（KNPU）中で発現される。活性は酵素標準（サビナーゼ（登録商標））に対して相対的に確定され、確定は、標準条件、即ち50℃、ｐＨ8.3、反応時間9分、測定時間3分でのタンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン（DMC）溶液の消化を基礎にしている。フォルダーAF220／1は、Novo Nordisk A/S, Denmarkに要請して入手可能である（このフォールダーは参照により本明細書中に含まれる）。

GUは、標準条件下で、基質としてＮ−アセチルカゼインを用いた40℃で15分のインキュベーション中に、1 mmoleのグリシンと等価の量のＮＨ₂基を産生するタンパク質分解酵素活性と定義されるグリシン単位である。
酵素活性は、可溶性基質であるスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−パラ−ニトロ−フェノールとの反応により、PNA検定を用いても測定し得る。これは、Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith, L.A., (1988)に記載されている。

発酵：
ズブチラーゼ酵素の製造のための発酵は、5日間、100 ml BPX培地を含入する500 mlバッフルドエーレンマイヤーフラスコ中で、回転振盪台（300 r.p.m.）上で、30℃で実施した。
その結果として、例えば２リットルのブロスを製造するためには、20個のエーレンマイヤーフラスコを同時に発酵させた。

培地：
BPX培地組成（１リットル当たり）
ジャガイモデンプン 100 g
大麦ground barley 50 g
ダイズ粉 20 g
Na₂HPO₄x12H₂O 9 g
プルロニック 0.1 g
ナトリウムカゼイネート 10 g
培地中のデンプンをα−アミラーゼで液化し、120℃で45分間加熱することにより培地を滅菌する。滅菌後、NaHCO₃の付加（0.1 M）により、pHを９に調整する。

実施例１．
酵素変異体の構築および発現：
部位特異的突然変異誘発：
所望の挿入物を含有するオリゴ体を用いたPCRにより産生されるDNA断片の伝統的クローニング（Sambrook et al.(1989) Molecular cloning:A laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989）により、特定の挿入を含み、そして特定の置換を含む本発明のズブチラーゼ309（サビナーゼ（登録商標））部位特異的変異体を作製した（下記参照）。

鋳型プラスミドDNAはpJS3（下記参照）またはズブチラーゼ309の変異体を含有するこの類似体であった。
オリゴ特異的突然変異誘発により、挿入および置換を変異体の構築に導入した。
ズブチラーゼ309変異体を大腸菌中で形質転換させた。これらの形質転換体の一夜培養から精製されたDNAを、制限エンドヌクレアーゼ消化、DNA断片の精製、結繋、枯草菌の形質転換により枯草菌中で形質転換させた。枯草菌の形質転換は、Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221により記載されているように実施した。

特定領域において挿入および置換を導入するための部位特異的突然変異誘発：
部位特異的突然変異誘発を実施するために用いるための全体的戦略：
挿入および置換の部位にフランキングするDNA配列に対応し、挿入および置換を限定するDNA塩基対により分離される突然変異原性プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成した。

その後、結果的に生じた突然変異原性プライマーを、修飾化プラスミドpJS3とのPCR反応に用いた（前記参照）。その結果生じたPCR断片を精製し、二次PCR反応で伸長させて、その結果生じたPCR産物を精製し、大腸菌−枯草菌シャトルベクター中でクローン化する（下記参照）か、または三次PCR反応で伸長させた後、エンドヌクレアーゼにより消化させて、大腸菌−枯草菌シャトルベクター中でクローン化した（下記参照）。PCR反応は、通常条件下で実施する。

この戦略後、サビナーゼ（登録商標）において挿入および置換を構築したが、この場合、挿入および置換は、下記の表にしたがって導入した。各PCR過程に用いたプライマーが、用いたクローニング部位と同様に示されている。
前記の戦略にしたがって、詳細な例を以下に示す：
２つの挿入および１つの置換をサビナーゼ（登録商標）で構築したが、この場合、挿入は位置99（^*99aD）および217（^*217aP）にそれぞれ導入し、置換は位置S99Aに導入した（下記参照）。

位置99での挿入および置換は、対立プライマー（5’ GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG 3’（アンチセンス））（配列番号83）とのPCR反応に用いられた突然変異原プライマー（5’ CCG AAC CTG AAC CAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3’（センス））（配列番号７１）により導入した。
プライマー；5’ CAT CGA TGT ACC GTT TGG TAA GCT GGC ATA TGTTG3’（配列番号94）を用いて位置217で挿入を導入する２回目のPCRにより、生成されたPCR断片をサビナーゼのＣ末端に向けて延長させた。pJS3中のMlu I部位の下流に位置するプライマー；5’ AAC CGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC 3’（配列番号105）を用いた３回目のPCRにより、２回目のPCR産物を、サビナーゼのＣ末端に向けて延長させた。PCR反応は全て、鋳型としてプラスミドpJS3を用いた。３回目のPCRから生じた延長DNA断片を、修飾化プラスミドpJS3のSal I-およびMlu I−部位中でクローン化した（前記参照）。
周知の技法によりプラスミドDNAを大腸菌中で形質転換させ、一大腸菌コロニーをシーケンシングして、意図した突然変異を確証した。

他の変異体は全て、同様の方法で構築した。
本発明のズブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含む枯草菌ｐＪＳ３発現プラスミドを、コンピテント枯草菌菌株中で形質転換させ、10μg/mlクロラムフェニコールを含有する培地（CAM）中で前記と同様に発酵させた。
プライマーおよびクローニング部位：

実施例２
酵素変異体の精製：
本手法は、枯草菌宿主細胞における本発明のズブチラーゼの産生のための2リットル規模発酵の精製に関する。
約1.6リットルの発酵ブロスを、1リットルビーカー中で5000 rpmで35分間遠心分離した。10％酢酸を用いて上清をｐＨ6.5に調整し、Seitz Supra S100フィルタープレートで濾過した。

濾液を、Amicon S1Y10 UFカートリッジを装備したAmicon CH2A UFユニットを用いて、濾液を約400 mlに濃縮した。UF濃縮物を遠心分離し、濾過した後、pH7でバシトラシン親和性カラムで室温で吸収させた。pH7に調整した0.01ジメチルグルタル酸、0.1 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウムを含有する緩衝溶液中の25％２−プロパノールおよび1 M塩化ナトリウムを用いて、バシトラシンカラムから、室温でプロテアーゼを溶離した。

バシトラシン精製過程からのプロテアーゼ活性を有する分画を併合し、ｐＨ6.5に調整した0.01ジメチルグルタル酸、0.2 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡させた750 mlのセファデックスＧ２５カラム（直径5 cm）に適用した。
セファデックスG25カラムからのタンパク質分解活性を有する分画を併合し、ｐＨ6.5に調整した0.01 Mジメチルグルタル酸、0.2 Mホウ酸および0.002 M塩化カルシウムを含有する緩衝液で平衡させた150 mlのCMセファロースCL 6B陽イオン交換カラム（直径5 cm）に適用した。

２リットルの同一緩衝液中の0〜0.1 M塩化ナトリウム（ズブチリシン147の場合は0〜0.2 M塩化ナトリウム）の線状勾配を用いて、プロテアーゼを溶離した。
最終精製過程において、CMセファロースカラムからのプロテアーゼ含有分画を併合し、GR81PP膜（Danish Sugar Factories Inc.）を装備したAmicon限外濾過セル中で濃縮した。
構築および発酵のための実施例１の技法を、そして前記の単離手法を用いて、以下のズブチリシン309変異体を生成し、単離した：
位置96挿入変異体：
L96LA
L96LA+A98T+A108C+A138C
位置97挿入変異体：
G97GI+S99T
位置98挿入変異体：

位置99挿入変異体：

実施例３．
「モデル洗剤洗浄性能試験」：
標準洗剤組成物中の選定ズブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、以下の実験条件を用いて標準洗浄実験を実施し得る：
洗剤： モデル洗剤
洗剤用量： 4.0 g/l
pH： 10.1
洗浄時間 20分
温度 30℃
水硬度： 15°dH
酵素濃度： 10 nm（洗剤溶液中）
試験系： 10 mlビーカー（撹拌棒付）
テキスタイル／容積： ５テキスタイル片（直径2.5 cm）/50 ml洗剤溶液
被験物質： WFK10N（卵の染み）

モデル洗剤の組成を以下に示す：
6.2％ LAS（Nansa 80S）
2％ C₁₆〜C₁₈脂肪酸のナトリウム塩
4％ 非イオン性界面活性剤（プルラファックスＬＦ４０４）
22％ ゼオライトＰ
10.5％ Na₂CO₃
4％ Na₂Si₂O₅
2％ カルボキシメチルセルロース（CMC）
6.8％ アクリレート液CP5 40％
20％ 過ホウ酸ナトリウム（実験式NaBO₂・H₂O₂）
0.2％ EDTA
21％ Na₂SO₄
水

HClまたはNaOHの付加により、洗剤溶液のpHを10.1に調整する。試験系へのCaCl₂およびMgCl₂（Ca²⁺：Mg²⁺＝4:1）の付加により、水硬度を15°dHに調整する。洗浄後、テキスタイル片を水道水で洗い流して、風乾した。
Macbeth ColorEye 7000光度計（Macbeth, Division of Kollmorgen Instruments Corporation, Germany）を用いて460 nmで、被験物質上での反射率（Ｒ（変異体））の測定を実施する。測定は、メーカーのプロトコールにしたがって実施する。

ブランク値を決定するために、酵素を付加せずに同様の洗浄実験を実施する。反射率（Ｒ（ブランク））のその後の測定は、直ぐ上で記載したように実施する。
次に前記と同様に参照実験を実施するが、この場合、親酵素の洗浄性能を試験する。その後の反射率（Ｒ（親））測定は、直ぐ上で記載したように実施する。

以下の式にしたがって限定される性能係数（Ｐ）によって、洗浄性能を評価する：
Ｐ＝（Ｒ（変異体）−Ｒ（ブランク））−（Ｒ（親）−Ｒ（ブランク））
＝Ｒ（変異体）−Ｒ（親）
前記の試験方法を用いて、以下の結果を得た：

明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、親ズブチラーゼ、即ちサビナーゼ（登録商標）との比較において、卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示す。

実施例４．
「卵抑制検定」
以下の抑制検定は、試験されるズブチラーゼ変異体がペプチド−pNA結合の加水分解を触媒し、それにより黄色pNAを放出するという原理に基づいており、これは405 nmで追跡調査し得る。所定時間後の放出pNAの量は、ズブチラーゼ活性の直接測定値である。それぞれ阻害剤を用いておよび用いずにこのような加水分解実験を実行することにより、ある種のズブチラーゼ変異体が抑制される程度に関する定量的測定値を得ることができる。

反応条件：
酵素濃度： 0.0003 mg/ml
IV-0型トリプシン阻害剤の濃度： 0.0015 mg/ml
初期基質濃度： 0.81 mM
反応時間： 11分
検定温度： 25℃
検定pH： 8.6
吸光度測定： 405 nm

検定溶液：
基質溶液（2 mM）：500 mgのSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAを4 ml DMSO（200 mM）中に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍に希釈する。その結果生じる基質溶液中の基質の濃度は、２mMである。

阻害剤溶液（0.005 mg/ml）：５mgのIV-0型トリプシン阻害剤（SigmaＴ−1886）を10 mlの水に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍に溶解する。その結果生じる阻害剤溶液中の阻害剤の濃度は、0.005 mg/mlである。
酵素溶液（0.001 mg/ml）：酵素1 mgを水10 ml中に溶解する。この溶液を下記の緩衝溶液で100倍に溶解する。その結果生じる酵素溶液中の酵素の濃度は、0.001 mg/mlである。

緩衝溶液（pH 8.6）：トリス15.7 mgを適量の水に溶解し、0.75 mlの30％（w/v）BRIJ（BRIJ 35ポリオキシエチレンラウリルエーテル、30％（w/v）、Sigmaカタログ番号430AG-6）を付加する。4 M NaOHを用いてｐＨを8.6に調整し、溶液を水で1リットルに希釈する。

阻害剤を用いた検定
1容積単位（例えば80 μl）の阻害剤溶液を適切な反応容器（例えば分光光度計セルまたは微小滴定プレート）中で1容積単位（例えば80 μl）の酵素溶液と混合し、25℃で15分間平衡させる。1.375容積単位（例えば110 μl）の基質溶液を反応容器に付加し、その後、405 nmでの吸光度を11分間追跡調査する（例えば10秒毎または30秒毎に測定することにより）。線状回帰分析を用いて吸光度曲線の勾配を算定する。吸光度曲線の勾配は、α_inhibitorで示される。

阻害剤を用いない検定
1容積単位（例えば80 μl）の緩衝溶液を適切な反応容器（例えば分光光度計セルまたは微小滴定プレート）中で1容積単位（例えば80 μl）の酵素溶液と混合し、25℃で15分間平衡させる。1.375容積単位（例えば110 μl）の基質溶液を反応容器に付加し、その後、405 nmでの吸光度を11分間追跡調査する（例えば10秒毎または30秒毎に測定することにより）。線状回帰分析を用いて吸光度曲線の勾配を算定する。吸光度曲線の勾配は、αで示される。

ブランク
1容積単位（例えば80 μl）の阻害剤溶液を適切な反応容器（例えば分光光度計セルまたは微小滴定プレート）中で1容積単位（例えば80 μl）の緩衝溶液と混合し、25℃で15分間平衡させる。1.375容積単位（例えば110 μl）の基質溶液を反応容器に付加し、その後、405 nmでの吸光度を11分間追跡調査する。これらの測定値は計算に用いられないが、しかし単に、緩衝溶液および／または基質溶液に酵素が付加されなかった対照として役立つ。

残留活性（RA）の算定
以下の式にしたがって、残留酵素活性（RA）を算定する：
ＲＡ＝（α_inhibitor／α）ｘ100％
前記の試験を用いて、以下の結果を得た：

明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、親ズブチラーゼ、即ちサビナーゼ（登録商標）よりはるかに小程度に阻害された。

実施例５．
自動食器洗浄（ADW）における本発明のズブチラーゼ変異体の性能
標準条件を用いて、市販家庭用食器洗浄用組成物（ソマットターボ、Henkel Washmittel GmbH）中で、ADWにおける本発明の変異体の性能を試験した。用いた汚れは、スチールプレート上に被覆された卵／ミルク混合物であった。さらに種々の食品を含有するバラスト汚れを付加した。

洗剤： ソマットターボ
洗剤用量： 4.0 g/l
ｐＨ： 10.7
水硬度： 3°dH（機械イオン交換）
温度 55℃
酵素濃度： 機械中の洗浄水の総容積を基礎にして、20 nMおよび40 nM
試験方法： 下記のようなスチールプレート上を卵／ミルク汚染する
機械： シリンダコンパクトCylinda Compact
洗浄プログラム： 予洗なしでプログラム４

材料
220 ml非脱脂乳
卵15個、中サイズ
スチールプレート、直径18 cm
組成物中の酵素活性を不活性化するために、ソマットターボ食器洗浄用組成物を電子レンジで5分間、85℃で加熱した。

スチールプレートの汚染
220 mlの非脱脂乳をBraun UK20調理機中で2分間、15個の卵と混合した。篩に掛けた後、浸漬により混合物中でステンレススチールプレートを汚染した。
プレートを、直立位置で室温で一夜乾燥させた。次に、表面のタンパク質を変性するために、乾燥プレートを120℃で45分間加熱した。

ADW実験
各実験に関しては、10枚の汚れたプレートを、シリンダコンパクト機中で、予洗なしで洗浄した（プログラム４）。汚れたプレートのほかに、機械には10枚の磁器プレート、4個のガラス、4個のカップおよび16片の刃物類を充填した。
さらに50 gのバラストスラリーを機械に付加した。スラリーの組成を以下に示す：
ジャガイモデンプン（5.43％）、小麦粉（4.38％）、植物油（4.32％）、マーガリン（4.32％）、ラード（4.32％）、クリーム（8.76％）、非脱脂乳（8.76％）、卵（8.76％）、トマトケチャップ（3.00％）、バーベキューソース（2.19％）、マスタード（4.00％）、安息香酸（0.73％）、水（３mM Ca²⁺＋Mg²⁺）（36.7％）。

測定および計算
ミノルタ彩度計（CR-300型）を用いて、プレート上の6つの異なる位置で、光反射値（Ｒ値）を測定した。測定は、清浄プレート上（Ｒ（清浄））、加熱後の汚損プレート上（Ｒ（汚染））および洗浄後のプレート上（Ｒ（洗浄後））で成された。
以下の式にしたがって、除去タンパク質皮膜（RPF％）を算定した：
RPF（％）＝100％ｘ（Ｒ（洗浄後）−Ｒ（汚染））／（Ｒ（清浄）−Ｒ（汚染）
前記の試験方法を用いて、以下の結果を得た（±は標準偏差を示す）：

明らかなように、本発明の変異体は、サビナーゼ（登録商標）と比較した場合、優れた性能を有する。

実施例６．
市販粉末洗剤中の本発明のズブチラーゼ変異体の洗浄性能
市販洗剤組成物中の選定ズブチラーゼ変異体の洗浄性能を査定するために、以下の実験条件を用いて標準洗浄実験を実施した：
洗剤用量： 4.0 g/l
洗浄温度： 30℃
洗浄時間 20分
水硬度： 15°dH（Ｃａ²⁺：Ｍｇ²⁺＝4:1）
pH： 調整せず
酵素濃度： １、２、５、10、30 nM
試験系： 150 mlガラスビーカー（撹拌棒付）
テキスタイル／容積： ５テキスタイル片（直径2.5 cm）、50 ml洗剤中
被験物質： WFK10N（卵の染み）

使用した洗剤は、ドイツのスーパーマーケット（Persil Megapearls）から入手した。使用前に、電子レンジ処理（85℃で5分間）により、洗剤中の全酵素活性を不活性化した。

反射率測定は、本明細書中の実施例３に記載したように実施した。
データ（Ｒ値）は、以下のように評価した：
サビナーゼ（登録商標）より高いＲ値を有する変異体は、値１とした。
サビナーゼ（登録商標）より低いＲ値を有する変異体は、値−１とした。
サビナーゼ（登録商標）と同様のＲ値を有する変異体は、値０とした。

結果：
変異体 値
サビナーゼ（登録商標） ０
L96LA １
L96LA+A98T+A108C+A138C １
G97GI+S99T １
明らかなように、ズブチラーゼ変異体は、サビナーゼ（登録商標）と比較した場合、市販洗剤中での洗浄性能改良を示す。

Claims (43)

1. 洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のためのズブチラーゼ変異体の使用であって、位置95〜103（BASBPNナンバリング）の活性部位ループ（ｂ）領域に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体の使用。
2. 追加のアミノ酸残基が、位置95と96、位置96と97、位置97と98、位置98と99、位置99と100、位置100と101、位置101と102、位置102と103、位置103と104の間およびそれらの組合せから成る群から選択される位置に挿入されている請求項１記載の使用。
3. 追加のアミノ酸残基が、位置98と99の間および99と100の間から成る群から選択される位置に挿入されている請求項２記載の使用。
4. 変異体が、本明細書中の実施例４に開示された「卵抑制検定」で試験された場合、少なくとも10％、例えば少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも25％の残留活性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
5. 位置98と99の間の挿入がX98XA、X98XT、X98XGおよびX98XSから成る群から選択される請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
6. 位置99と100の間の挿入がX99XD、X99XE、X99XKおよびX99XRから成る群から選択される請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
7. 変異体が少なくとも１つのさらなる修飾を含む前記請求項のいずれかに記載の使用。
8. さらなる修飾が、位置99における置換、位置133における置換、位置143における置換、位置167における置換、位置170における置換、位置194における置換、位置42と43の間の挿入、位置129と130の間の挿入、位置216と217の間の挿入、位置217と218の間の挿入およびそれらの組合せから成る群から選択される位置において実施される請求項７記載の使用。
9. 変異体が以下の：
   位置98と99の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置133および143における置換をさらに含む変異体、
   位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置99における置換をさらに含む変異体、
   位置98と99の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置167、170および194における置換をさらに含む変異体、
   位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置216と217の間に少なくとも1つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、
   位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置217と218の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、
   位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置42と43の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体、ならびに
   位置99と100の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含み、そして位置129と130の間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入をさらに含む変異体
   から成る群から選択される請求項８記載の使用。
10. 親ズブチラーゼがI-S1亜群に属する前記請求項のいずれかに記載の使用。
11. 親ズブチラーゼがBSS168、BASBPN、BSSDYおよびBLSCARまたはI-S1亜群の特徴を保有しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求項10記載の使用。
12. 親ズブチラーゼがI-S2亜群に属する請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
13. 親ズブチラーゼがBLS147、BLSAVI、BAPB92、TVTHERおよびBYSYABまたはI-S2亜群の特徴を保有している機能的変異体から成る群から選択される請求項12記載の使用。
14. 親ズブチラーゼがBLSAVI（配列番号１）である請求項13記載の使用。
15. 変異体がS99SD+S99Aである請求項14記載の使用。
16. 変異体がS99SR+S99Tである請求項14記載の使用。
17. 変異体がA98AS+A133E+T143Kである請求項14記載の使用。
18. 変異体がA98AT+Y167A+R170S+A194Pである請求項14記載の使用。
19. 変異体がS99SD+S99A+P129PDである請求項14記載の使用。
20. 変異体がS99SD+S99A+S216SPである請求項14記載の使用。
21. 変異体がS99SD+S99A+S216SDPである請求項14記載の使用。
22. 変異体がS99SD+S99SA+L217LPである請求項14記載の使用。
23. 変異体がS99SD+D42DNである請求項14記載の使用。
24. 変異体がS99SD+S99A+D42DNである請求項14記載の使用。
25. 以下の：
    位置98と99の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そして少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、
    位置99と100の間の少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入に対応する活性部位（ｂ）ループ中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含み、そして少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む変異体（BASBPNナンバリング）、
    から成る群から選択されるズブチラーゼ変異体であって、本明細書中の実施例４に開示された「卵抑制検定」で試験された場合、少なくとも10％、の残留活性を有する変異体。
26. 変異体が少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも25％の残留活性を有する請求項25記載の変異体。
27. 請求項９〜24のいずれかに記載されているような特徴を有する請求項25〜26記載の変異体。
28. 請求項９〜24のいずれかで限定されるようなズブチラーゼ変異体。
29. 請求項25〜28のいずれかで限定されるようなズブチラーゼ変異体をコードする単離されたDNA配列。
30. 請求項29の単離されたDNA配列を含む発現ベクター。
31. 請求項30の発現ベクターで形質転換される微生物宿主細胞。
32. 細菌、好ましくはバシラス属、特にB. lentusである請求項31記載の微生物宿主細胞。
33. 真菌または酵母、好ましくは糸状真菌、特にアスペルギルス属である請求項31記載の微生物宿主細胞。
34. 請求項31〜33のいずれかに記載の宿主が前記変異体の発現および分泌を行なう条件下で培養され、変異体が回収される請求項25〜27のいずれかに記載のズブチラーゼ変異体の製造方法。
35. 請求項25〜28のいずれかに記載の変異体を含む清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物。
36. セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項35記載の組成物。
37. 清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯および／または食器洗浄用組成物中の請求項25〜28のいずれかで限定されるような変異体の使用。
38. 硬質表面または洗濯物からの卵の染みの除去方法であって、卵の染み含有硬質表面または卵の染み含有洗濯物を、位置95〜103（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物と接触させることを包含する方法。
39. 変異体が請求項２〜24のいずれかで限定されるような特徴を有する請求項38記載の方法。
40. 組成物がセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項38〜39のいずれかに記載の方法。
41. 洗濯物からまたは硬質表面からの卵の染みの除去のための、位置95〜103（BASBPNナンバリング）からの活性部位ループ（ｂ）領域中に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含むズブチラーゼ変異体を含有する清浄用または洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄用組成物の使用。
42. 変異体が請求項２〜24のいずれかで限定されるような特徴を有する請求項41記載の使用。
43. 組成物がセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、別のプロテアーゼ、アミラーゼまたはそれらの混合物をさらに含む請求項41〜42のいずれかに記載の使用。

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