JP2008163044A

JP2008163044A - 新規ペプチドおよびその医薬用途

Info

Publication number: JP2008163044A
Application number: JP2008067259A
Authority: JP
Inventors: Teruo Nishida; 輝夫西田; Makoto Inui; 誠乾; Masatane Nakamura; 雅胤中村
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Santen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-12-03
Filing date: 2008-03-17
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: SI1462455T1; US7232881B2; DK1462455T3; EP2172474A1; US8183343B2; EP1462455A4; US20090005317A1; CN1263770C; US7795222B2; CN1599748A; EP1462455B1; AU2002354188A1; WO2003048192A1; KR100967152B1; TW200302108A; CA2469134A1; EP2172474B1; CA2469134C; KR20100002291A; CY1114330T1

Abstract

【課題】インシュリン様成長因子−Ｉの最小活性発現単位を探求し、眼科および皮膚科領域における医薬用途を見出すこと。
【解決手段】インシュリン様成長因子−Ｉの最小活性発現単位であるSer−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列を含むペプチドとPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを併用すれば、角膜の障害治癒および皮膚の創傷治癒を著しく促進する。

【選択図】なし

Description

本発明は、Ser−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列を含む新規なペプチド、同ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物、およびSer−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列を含むペプチドとPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分として含有する角膜障害治療剤または皮膚創傷治癒促進剤に関する。

角膜は直径約１ｃｍ、厚さ約１ｍｍの透明な無血管の組織である。角膜の透明性は視機能に重要な影響を与えており、角膜における種々の生理生化学的現象は、主として角膜の透明性の維持ということを目的として機能している。

角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎またはドライアイ等の種々の疾患により引き起こされた角膜上皮欠損は、混合感染の併発がなければ自然に修復する。しかし、何らかの理由で修復が遅延したりあるいは修復が行われずに上皮欠損が遷延化すると、上皮の正常な構築に悪影響を与えるのみならず、実質や内皮の構造や機能まで害される。従来からの治療法の原理は、外界の刺激から角膜表面を保護することにより自然に上皮が伸展して欠損部の再被覆をはかるという受動的なものである。近年、細胞生物学の発展に伴い、細胞の分裂・移動・接着・伸展等に関与する因子が解明されており、角膜上皮欠損の修復には、角膜上皮の伸展を促進する化合物が重要な役割を担うことが報告されている（非特許文献１参照）。

ところで、インシュリン様成長因子は、表皮成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子等のように、正常ヒト細胞の成長を調節している成長因子の１つで、これにはインシュリン様成長因子−I（以下、「ＩＧＦ−I」とする）とインシュリン様成長因子−II（以下、「ＩＧＦ−II」とする）がある。最近、ＩＧＦ−Iが甲状腺細胞の増殖を刺激すること（非特許文献２参照）や、ＩＧＦ−IIが筋の成長や分化を調節すること（非特許文献３参照）等も報告されている。眼科領域においても、ＩＧＦ−I、ＩＧＦ−IIおよびそれらの機能的誘導体が網膜ニューロンの生存を促進させること（特許文献１参照）、ＩＧＦ−IIが角膜移植時の損傷を始めとする広範囲のあらゆる傷の治療に有効であること（特許文献２参照）、上記の成長因子を含む溶液を用いることによって移植に供される角膜等の眼組織を低温状態でも新鮮な組織状態で保存することが可能であること（特許文献３および４参照）が開示されている。さらに、一般的に成長因子を含むゲル配合物が前眼部を始めとする創傷の治癒に有効であることも開示されている（特許文献５参照）。

一方、サブスタンスＰは血管拡張、平滑筋収縮、唾液腺の分泌促進、利尿作用等を示す１１個のアミノ酸からなるポリペプチドである。サブスタンスＰについては眼科領域においても、眼障害における結膜杯細胞の異常分泌の改善が開示されていたり（特許文献６参照）、角膜炎等の炎症時におけるサブスタンスＰの動態が報告されている（非特許文献４および５等参照）、さまざまな研究がなされている。また、特許文献７にはサブスタンスＰのＣ末端側のテトラペプチドであるPhe−Gly−Leu−Met−NH₂（以下、「ＦＧＬＭ」とする）とＩＧＦ−Iとを併用すれば、角膜上皮の創傷治癒を促進し、かつ、ＦＧＬＭがこの作用を発現するサブスタンスＰの部分ペプチドの最小単位であることが記載されている。しかしながら、ＩＧＦ−Iは７０個ものアミノ酸が結合したポリペプチドであり、ＩＧＦ−Iのどのアミノ酸配列部位が効果発現に寄与しているかについては全く明らかにされていない。

皮膚創傷は、裂傷、擦過傷、外科的切開、皮膚潰瘍、火傷などの表面組織の損傷である。かかる皮膚創傷の治療は、受傷部位に応急処置を施した後、生体自身の回復力によって自然に治癒するのを待つのが一般であるが、このような自然治癒では回復までに長期間を要し、また、痛みも継続することから、受傷部位に創傷治療剤を投与するなどして積極的に創傷治癒を促進させることが望ましい。

創傷の治癒過程では、細胞の移動や増殖によって新らしい上皮組織や結合組織が形成されるので、創傷治癒に関与する細胞の移動・分化・増殖を促進若しくは刺激する薬剤が創傷治療剤となり得る。このような創傷治療剤として、塩化リゾチーム、ソルコセリンなどが知られている。

しかし、既存の創傷治療剤は、創傷治癒の促進作用が充分ではなく、短期間に創傷を完治できないという問題点がある。これらの創傷治療剤では、創傷の治癒過程で重要な要素となる表皮の再被覆、コラーゲンの合成、末梢循環の改善、肉芽形成、血管新生などへの寄与が小さいことに原因があると考えられている。

ところで、ＩＧＦ−Iの最小活性発現単位に関する報告はなく、Ser−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列からなるペプチドそのものについての報告もない。また、Ser−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列を含むペプチドとPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを併用した角膜障害に対する作用や皮膚疾患に対する作用も報告されていない。
臨眼，46, 738-743 (1992)、眼科手術，5, 719-727 (1992) J. Biol. Chem., 264, 18485-18488 (1989) Hum. Mol. Genet., 3, 1117-1121 (1994) 特表平７−５００８３９号公報特開昭６３−２３３９２５号公報特開平５−２５００１号公報特開平６−４８９０１号公報特開平２−１１２号公報国際公開第ＷＯ９５／１３０８７号パンフレット日本眼科学会雑誌，91, 982-987 (1987) 非特許文献参照日本眼科学会雑誌，92, 448-452 (1988) 特開平１０−１７４８９号公報。

一般に数多くのアミノ酸からなるペプチドは、生体内に投与すると代謝等によりペプチド結合が切断されやすく、また医薬として用いるために製剤化する段階で分解等を起こしやすい。そこで、ペプチド鎖はできるだけ短くすることが望まれるが、薬理活性は維持されなければならないので、長鎖ペプチドの最小活性発現単位を見つけ出すことは医薬品開発における重要な課題である。ＩＧＦ−Iは７０個ものアミノ酸からなる長鎖ペプチドであり、そのＩＧＦ−Iの最小活性発現単位を見つけ出すことは、より有用な医薬品を創製する上で非常に重要な課題である。また、その最小活性発現単位を用いて、具体的な薬理作用、即ち角膜障害に対する作用や皮膚創傷に対する作用について研究することは非常に興味のある課題である。

本発明者等は、ＩＧＦ−Iの種々の部分ペプチドを合成し、その部分ペプチドとサブスタンスＰ若しくはＦＧＬＭを併用した角膜上皮伸展に関する薬理試験を実施することにより、ＩＧＦ−Iの最小活性発現単位がSer−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列（以下、「ＳＳＳＲ」とする）であることを見い出した。また、ＳＳＳＲで表されるアミノ酸配列を含んでいるペプチドとサブスタンスＰ若しくはＦＧＬＭを併用すれば、角膜の障害治癒および皮膚の創傷治癒を促進することを見い出した。すなわち、（１）アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類と（２）アミノ酸配列がPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類を含有する組成物は、種々の要因により角膜が損傷を受けた状態にある角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎またはドライアイ等の角膜障害の治療剤又は裂傷、擦過傷、外科的切開、皮膚潰瘍、火傷などの皮膚創傷やそれに起因する壊疽などの疾患に対する治癒剤として有用であることが見い出された。なお、本発明の角膜障害治療剤及び皮膚創傷治癒促進剤には、既に創傷治癒効果の認められているアスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸の塩、パントテン酸、パントテン酸の塩などを配合して使用することができる。

ＩＧＦ−IはＡ、Ｂ、ＣおよびＤの各ドメインから構成されるが、ＡドメインおよびＢドメインはインシュリンやＩＧＦ−IIと類似の構造をもつので、本発明者等は、ＩＧＦ−IのＣドメインおよびＤドメインに注目して角膜上皮伸展作用を検討した。そして、Ｃドメインを構成するペプチドまたはＤドメインを構成するペプチドとサブスタンスＰを併用して角膜上皮伸展試験を実施したところ、Ｃドメインを構成するペプチドであるGly−Tyr−Gly−Ser−Ser−Ser−Arg−Arg−Ala−Pro−Gln−Thr（以下、「ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ」とする）に活性が認められた。つぎに、ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴの両末端からそれぞれ２アミノ酸を除去しても活性が維持されたので、アラニンスキャニング手法を用いてGly−Ser−Ser−Ser−Arg−Arg−Ala−Pro（以下、「ＧＳＳＳＲＲＡＰ」とする）のアミノ酸を順次アラニンに変換したものを合成してサブスタンスＰ若しくはＦＧＬＭとの共存下で角膜上皮伸展試験を実施したところ、ＳＳＳＲで表されるアミノ酸配列を含んでいるペプチドはすべて活性を発現したので、ＳＳＳＲが角膜上皮伸展作用を発現するのに必須で最小のＩＧＦ−Iの部分ペプチドであることが判明した。

後述する薬理試験の結果より、ＩＧＦ−Iの最小活性発現単位であるSer−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列を含むＳＳＳＲ類似体とPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるアミノ酸配列を含むＦＧＬＭ類似体を併用すれば、角膜上皮の伸展および皮膚の創傷治癒を著しく促進する。したがって、ＳＳＳＲ類似体とＦＧＬＭ類似体を組合せて投与すれば、これらの薬剤が相乗的に作用して角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎、ドライアイ等の角膜障害の治療剤または裂傷、擦過傷、外科的切開、皮膚潰瘍、火傷等の皮膚創傷やそれに起因する壊疽などの疾患の治癒剤としての効果を発揮する。

本発明者らは、主として下記の４つの発明を完成した。

第一の発明は、アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表される新規ペプチド若しくはその誘導体またはそれらの医薬として許容される塩類に関する発明である。

この第一の発明の特徴は、ＩＧＦ−Iの最小活性発現単位である新規ペプチド、すなわちアミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表される新規ペプチドを見いだしたところにある。従って、アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその誘導体（以下、該ペプチドとその誘導体を「ＳＳＳＲ誘導体」と総称する）とは、Ser−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列を含む新規なペプチドであれば、特に制限されることはない。該ペプチドの誘導体とは、Ser−Ser−Ser−Argで表されるペプチドに活性発現に影響しない１個または複数のアミノ酸が結合したもの、Ｎ末端がアシル基等のペプチドに汎用される保護基で保護されているもの、Ｃ末端がエステル、アミド等のペプチドに汎用される保護基で保護されているものなどを意味し、また、Ser残基のヒドロキシ基が汎用される保護基で保護されたものや、Arg残基のアミノ基が汎用される保護基で保護されたものも含む。より具体的に示すと、ＳＳＳＲ誘導体としては、例えばＳＳＳＲ、ＧＳＳＳＲＲＡＰをはじめ、Ser−Ser−Ser−Arg−Arg（以下、「ＳＳＳＲＲ」と略記する）、Gly−Ser−Ser−Ser−Arg（以下、「ＧＳＳＳＲ」と略記する）、Gly−Ser−Ser−Ser−Arg−Arg（以下、「ＧＳＳＳＲＲ」と略記する）、Ala−Ser−Ser−Ser−Arg−Arg−Ala−Pro（以下、「ＡＳＳＳＲＲＡＰ」と略記する）、Gly−Ser−Ser−Ser−Arg−Ala−Ala−Pro（以下、「ＧＳＳＳＲＡＡＰ」と略記する）、Gly−Ser−Ser−Ser−Arg−Ala−Ala−Ala−Pro（以下、「ＧＳＳＳＲＡＡＡＰ」と略記する）などが挙げられる。これらのペプチドを構成するアミノ酸には、L−体、D−体、DL−体が存在するが、それらはすべて本発明に含まれる。薬理試験の項で具体的に示されているように、ペプチド鎖中にＳＳＳＲで表されるアミノ酸配列を含んでいるＳＳＳＲ誘導体はすべて、サブスタンスＰ若しくはＦＧＬＭとの併用により角膜上皮伸展効果および皮膚創傷治癒促進効果を発現する。

本発明のＳＳＳＲ誘導体は、ペプチド自動合成機を用いて公知な方法で製造することができ、その詳細は実施例で述べる。

第二の発明は、アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表される新規ペプチド若しくはその誘導体またはそれらの医薬として許容される塩類を有効成分として含有し、医薬として許容される添加物を配合してなる医薬組成物に関する発明である。

第三の発明は、
（１）アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類と
（２）アミノ酸配列がPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類
とを有効成分として含有する角膜障害治療剤に関する発明である。

第四の発明は、上記成分(1)と上記成分(2)を有効成分として含有する皮膚創傷治癒促進剤に関する発明である。

第三および第四の発明の特徴は、最小活性発現単位がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチドと、最小活性発現単位がPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるペプチドとを併用することにより、優れた角膜上皮伸展効果および皮膚創傷治癒促進効果が発現することを見いだしたところにある。

第三および第四発明において、アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその類似体（以下、該ペプチドとその類似体を「ＳＳＳＲ類似体」と総称する）とは、Ser−Ser−Ser−Argで表されるアミノ酸配列を含むペプチドであれば、特に制限されることはない。該ペプチドの類似体とは、Ser−Ser−Ser−Argで表されるペプチドにその活性発現に影響を及ぼさない１個または複数のアミノ酸が結合したもの、Ｎ末端がアシル基等のペプチドに汎用される保護基で保護されているもの、Ｃ末端がエステル、アミド等のペプチドに汎用される保護基で保護されているものなどを意味し、また、Ser残基のヒドロキシ基が汎用される保護基で保護されたものや、Arg残基のアミノ基が汎用される保護基で保護されたものも含む。より具体的に示すと、ＳＳＳＲ類似体として、例えば前述したＳＳＳＲ誘導体の他、ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴなどが挙げられる。ＳＳＳＲ類似体のペプチドを構成するアミノ酸には、L−体、D−体、DL−体が存在するが、それらはすべて本発明に含まれる。より好ましい形態はすべてL−体のアミノ酸からなるペプチドである。

また、アミノ酸配列がPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるペプチド若しくはその類似体（以下、該ペプチドとその類似体を「ＦＧＬＭ類似体」と総称する）とは、Phe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであれば、特に制限されることはない。該ペプチドの類似体とは、Phe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるペプチドにその活性発現に影響を及ぼさない１個または複数のアミノ酸が結合したものや、Ｎ末端がアシル基等のペプチドに汎用される保護基で保護されているものを意味する。より具体的に示すと、ＦＧＬＭ類似体としては、例えばサブスタンスＰ、ＦＧＬＭをはじめ、米国特許３８６２１１４号に具体的開示されている４〜１２個のアミノ酸で構成されるポリペプチドであるＴｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２などが挙げられる。より好ましい例としては、サブスタンスＰ、ＦＧＬＭがある。これらを構成するアミノ酸にも、L-体、D-体、DL-体が存在するが、それらはすべて本発明に含まれる。本発明におけるより好ましい形態はすべてL-体のアミノ酸からなるペプチドである。

本発明において、医薬として許容される塩類としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられる。

本発明において、ＳＳＳＲ類似体とＦＧＬＭ類似体の併用は、角膜上皮の伸展および皮膚の創傷治癒を促進する作用を発現する。これらの作用を発現するＳＳＳＲ類似体の種類およびＦＧＬＭ類似体の種類は特に制限されないが、より好ましい実施の形態としては、ＩＧＦ−１の最小活性発現単位であるＳＳＳＲとサブスタンスＰの最小活性発現単位であるＦＧＬＭを組み合わせて使用することが挙げられる。

本発明の角膜障害治療剤及び皮膚創傷治癒促進剤は、汎用されている技術を用いて調製することができ、ＳＳＳＲ類似体またはそれらの医薬として許容される塩類と、ＦＧＬＭ類似体またはそれらの医薬として許容される塩類とをそれぞれの単独製剤としてまたは配合製剤として、非経口でも、経口でも投与することができるが、非経口投与がより好ましい。

角膜障害治療剤の好ましい投与剤型としては、点眼剤、眼軟膏等が挙げられる。これらは汎用されている技術を用いて調製することができる。例えば、点眼剤は、塩化ナトリウム等の等張化剤、リン酸ナトリウム等の緩衝化剤、塩化ベンザルコニウム等の防腐剤等を用いて調製することができる。ｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、４〜８の範囲が好ましい。

角膜障害治療剤としての投与量は症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、点眼剤であれば、ＳＳＳＲ類似体またはそれらの医薬として許容される塩類の量は、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）のものを１日１〜数回点眼すればよい。また、ＦＧＬＭ類似体またはそれらの医薬として許容される塩類の量は、０．００００１〜０．１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００１〜０．０１％（ｗ／ｖ）のものを１日１〜数回点眼すればよい。

無論、上記の両成分を同時に配合して点眼剤等の製剤とすることができる。

また、皮膚創傷治癒促進剤の好ましい製剤形態としては、軟膏剤、ゼリー剤、パップ剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤、スプレー剤、エアゾール剤、硬膏剤、懸濁剤、乳剤などを例示でき、また、適当な溶剤を選定して液剤を調製することもできる。また、皮膚創傷治癒促進剤を調製するために、その剤形に応じて充填剤、賦形剤、基剤、増量剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、界面活性剤、抗酸化剤、分散剤、乳化剤、溶解剤、溶解補助剤などを添加できる。

上記製剤用の担体としては、例えば、白色ワセリン、流動パラフィン、ゲル化炭化水素、セチルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プラスティベースハイドロフィリック、ゼラチン、デキストリン、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ビニルピロリドンを構成成分とする重合体・共重合体、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、塩化ベンザルコニウム、オリーブ油、ツバキ油、ダイズ油等の油脂類、乳糖、水などが挙げられる。

本発明の皮膚創傷治癒促進剤は、創傷部位や創傷の程度に応じて各種の形態で投与できる。例えば外用剤として使用する場合は、本剤を皮膚などの所要部位（患部）に直接塗布、噴霧または貼付することが望ましい。

本発明の皮膚創傷治癒促進剤の投与量は、症状、年令、剤型等を考慮して適宜選択できる。ＳＳＳＲ類似体またはそれらの医薬として許容される塩類の投与量は通常１日当たり０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜５００ｍｇであって、１回または数回に分けて投与する。また、ＦＧＬＭ類似体またはそれらの医薬として許容される塩類の投与量は、通常１日当たり０．０１〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇであって、１回または数回に分けて投与する。

無論、上記の両成分を同時に配合して軟膏等の製剤とすることができる。

以下に、製造例、製剤例および薬理試験の結果を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

［製造例］
本発明に用いられるＳＳＳＲ類似体の代表的な製造例を以下に示す。

１．ＳＳＳＲの製造
ペプチド自動合成機４３０A（Applied Biosystems社製）を用い、既設ソフトに従って第３ブチルオキシカルボニル（BOC）法により保護ペプチド樹脂を合成した。出発原料として4-(オキシメチル)フェニルアセトアミドメチル［Boc-Arg(Tos) PAM］樹脂担体 (０．５mmolスケール)を使用した。本合成法では、Ｎa-アミノ保護基であるBoc基の除去には３０％トリフルオロ酢酸(TFA)/ジクロロメタン、７０％TFA/ジクロロメタンを使用し、その洗浄にはN-メチル-2-ピロリドン(NMP)/ジクロロメタンを用いた。縮合剤のN,N’-ジシクロへキシルカルボジイミド（DCC）及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）とN-保護アミノ酸のBoc-Ser(OBzl)誘導体はそれぞれアミノ基に対し４当量用い、反応溶媒としてジメチルスルホキシド(DMSO)−NMP （８：２）を使用した。縮合反応終了後、残存するアミノ基を完全に塞ぐ操作として無水酢酸／N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)にて欠陥ペプチドの生成を防いだ。Boc基の除去と、Boc-Ser(OBzl)の縮合を繰り返し最終保護ペプチドの構築を行った。得られた保護ペプチド樹脂からのペプチドの切り出しと全ての保護基の脱離は無水フッ化水素(HF)処理（ＨＦ：ｐークレゾール、８：２（Ｖ／Ｖ）、−２〜−５℃、６０分）によって行った。反応後、ＨＦを留去し、０．１％トリフルオロ酢酸水にてペプチドを抽出し、粗生成物を凍結乾燥粉末として得たのち、分取精製に供した。分取精製は島津製作所製ＨＰＬＣＬＣ８A（カラム：ＹＭＣ製ODS 30 X 240mm）を使用し、アセトニトリル/水系（０．１％TFA含有）で０．５−２％のグラジエント(８０分)で行った。得られた目的物の高純度画分を集め、アセトニトリル留去後、凍結乾燥して標的化合物のＴＦＡ塩７０ｍｇ（収率３２％）を得た。

アミノ酸分析（加水分解条件：6N HCl, 110℃,22時間）
Ser(3)2.74, Arg(1)1.00
ＨＰＬＣ分析[Column:YMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent:1-60% CH₃CN/5mM CF₃CF₂COOH(25min)，Temp.: 25℃，Flow rate:1.0ml/min，Detector:220nm]
純度（HPLC）：98.5％
質量分析（ESI-MS）
MH⁺＝436.2（Theor.=436.2,mono isotopic）

２．ＳＳＳＲ類似体の製造
ＳＳＳＲと同様の操作を行い、ＧＳＳＳＲ、ＳＳＳＲＲ、ＧＳＳＳＲＲ、ＧＳＳＳＲＲＡＰ、ＡＳＳＳＲＲＡＰ、ＧＳＳＳＲＡＡＰ、ＧＳＳＳＲＡＡＡＰを製造した。以下に代表的なペプチドについての物性を示す。

（１）ＧＳＳＳＲ
アミノ酸分析（加水分解条件：6N HCl, 110℃,22時間）
Ser(3)2.76, Gly(1)1.00, Arg(1)1.00
ＨＰＬＣ分析[Column:YMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent:1-60% CH₃CN/5mM CF₃CF₂COOH(25min)，Temp.: 25℃，Flow rate:1.0ml/min，Detector:220nm]
純度（HPLC）：98.5％
質量分析（ESI-MS）
MW＝492.3（Theor.=492.5）

（２）ＳＳＳＲＲ
アミノ酸分析（加水分解条件：6N HCl, 110℃,22時間）
Ser(3)2.76, Arg(2)2.00
ＨＰＬＣ分析[Column:YMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent:1-60% CH₃CN/0.1% CF₃COOH(25min)，Temp.: 25℃，Flow rate:1.0ml/min，Detector:220nm]
純度（HPLC）：99.7％
質量分析（ESI-MS）
MW＝591.5（Theor.=591.6）

（３）ＧＳＳＳＲＲ
アミノ酸分析（加水分解条件：6N HCl, 110℃,22時間）
Ser(3)2.73, Gly(1)0.98, Arg(2)2.00
ＨＰＬＣ分析[Column:YMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent:1-60% CH₃CN/0.1% CF₃COOH(25min)，Temp.: 25℃，Flow rate:1.0ml/min，Detector:220nm]
純度（HPLC）：99.3％
質量分析（ESI-MS）
MW＝648.5（Theor.=648.7）

（４）ＧＳＳＳＲＲＡＰ
アミノ酸分析（加水分解条件：6N HCl, 110℃,22時間）
Ser(3)2.68, Gly(1)0.99, Ala(1)1.01, Arg(2)2.00
ＨＰＬＣ分析[Column:YMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent:1-60% CH₃CN/0.1% CF₃COOH(25min)，Temp.: 25℃，Flow rate:1.0ml/min，Detector:220nm]
純度（HPLC）：98.6％
質量分析（ESI-MS）
MW＝816.7（Theor.=816.9）

［製剤例］
本発明に用いられる代表的な製剤例を以下に示す。

１．点眼剤
以下の処方の点眼剤を汎用される方法を用いて調製した。

処方例１
１００ｍｌ中
ＳＳＳＲ１ｍｇ
塩化ナトリウム９００ｍｇ
水酸化ナトリウム適量
塩酸適量
滅菌精製水適量

処方例１と同様にして、ＳＳＳＲを１００ｍｌ中に０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ含有する点眼液を調製することができる。

処方例２
１００ｍｌ中
ＧＳＳＳＲ１ｍｇ
ＦＧＬＭ１００ｍｇ
塩化ナトリウム９００ｍｇ
水酸化ナトリウム適量
塩酸適量
滅菌精製水適量

処方例２と同様にして、ＦＧＬＭを１００ｍｌ中に１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、５００ｍｇ、１０００ｍｇ含有する点眼液を調製することができる。

処方例３
１００ｍｌ中
ＳＳＳＲ１ｍｇ
ＦＧＬＭ１００ｍｇ
塩化ナトリウム９００ｍｇ
水酸化ナトリウム適量
塩酸適量
滅菌精製水適量

処方例３と同様にして、ＳＳＳＲを０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、およびＦＧＬＭを１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、５００ｍｇ、１０００ｍｇ任意に組み合わせた点眼液を調製することができる。

２．軟膏剤
処方例４
１００ｇ中
ＳＳＳＲ１０ｍｇ
ＦＧＬＭ１００ｍｇ
流動パラフィン１０ｇ
白色ワセリン適量

ＳＳＳＲの添加量およびＦＧＬＭの添加量を適宜変えることにより、種々の濃度の軟膏を調製できる。

処方例５
１００ｇ中
ＧＳＳＳＲ１ｍｇ
サブスタンスＰ１００ｍｇ
流動パラフィン１０ｇ
白色ワセリン適量

処方例５と同様にして、ＧＳＳＳＲの添加量およびサブスタンスＰの添加量を適宜変えることにより、種々の濃度の軟膏を調製できる。

処方例６
１００ｇ中
ＳＳＳＲＲ５ｍｇＦＧＬＭ１００ｍｇ
流動パラフィン１０ｇ
白色ワセリン適量

ＳＳＳＲＲの添加量およびＦＧＬＭの添加量を適宜変えることにより、種々の濃度の軟膏を調製できる。

処方例７
１００ｇ中
ＧＳＳＳＲＲ５０ｍｇ
サブスタンスＰ１０ｍｇ
アスコルビン酸３ｍｇ
流動パラフィン１０ｇ
プラスティベースハイドロフィリック適量

ＧＳＳＳＲＲの添加量およびサブスタンスＰの添加量を適宜変えることにより、種々の濃度の軟膏を調製できる。

［薬理試験］
（１）角膜上皮伸展に対する作用（in vitro）
雄性日本白色ウサギの角膜を用い、Nishida らの方法（J. Cell Biol., 97, 1653-1657 (1983)）に準じ、角膜片の組織培養系での角膜上皮伸展長を指標にして角膜上皮伸展に対する影響を検討した。

（実験方法）
ウサギ角膜片より切り出した角膜ブロック（１群６個）を、被験化合物を含む培養液（ＴＣ−１９９）中、３７℃・５％ＣＯ_２の条件下で２４時間培養した。培養後、角膜ブロックをエタノール−氷酢酸（容積比９５：５）混合液中で固定し、パラフィンで包埋して切片を作製した。切片を脱パラフィンした後、ヘマトキシリン−エオジン染色し、顕微鏡下で上皮細胞層の伸展長を測定した。

コントロールとしては被験化合物を含まない培養液で同様に培養したものを用いた。

（被験化合物）
実験に用いたペプチドの代表例を表１に示す。

（結果）
実験結果を表１に示す。なお、表中の伸展率は、コントロール群の伸展長を基準（１００％）として算出した各６例の平均値である。

表１に示すように、ＳＳＳＲ類似体単独、サブスタンスＰ単独およびＦＧＬＭ単独では角膜上皮の伸展に対する影響は認められなかったが、ＳＳＳＲ類似体とサブスタンスＰ（若しくはＦＧＬＭ）の両方を含む培養液で培養をすると、角膜上皮の著しい伸展促進が認められた。

（２）皮膚創傷治癒に対する作用
皮膚創傷治癒効果は以下に示す方法で試験することができる。

ラットをジエチルエーテル吸入で麻酔させ背部の体毛をバリカンで剃毛し，脱毛用クリームで除毛する。２４時間後に５ｍｍ径の皮膚生検用トレパンを用いて背部皮膚に表皮・真皮の全層性の創傷を等間隔で５箇所作成し、止血の確認後にＳＳＳＲを含有する軟膏、ＦＧＬＭを含有する軟膏およびＳＳＳＲとＦＧＬＭを含有する軟膏をそれぞれ１日１回塗布する。各軟膏塗布前にラットの背部創傷を写真撮影しその面積を測定する。ＳＳＳＲを含有する軟膏、ＦＧＬＭを含有する軟膏およびＳＳＳＲとＦＧＬＭを含有する軟膏を塗布後の各創傷面積を比較することにより皮膚創傷治癒効果を検討できる。

Claims

アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその誘導体またはそれらの医薬として許容される塩類。
アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその誘導体またはそれらの医薬として許容される塩類を有効成分として含有し、医薬として許容される添加物を配合してなる医薬組成物。
下記成分；
１）アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類
２）アミノ酸配列がPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類
を含有する角膜障害治療剤。
角膜障害が角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎またはドライアイである請求項３記載の角膜障害治療剤。
剤型が点眼剤である請求項３記載の角膜障害治療剤。
下記成分；
１）アミノ酸配列がSer−Ser−Ser−Argで表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類
２）アミノ酸配列がPhe−Gly−Leu−Met−NH₂で表されるペプチド若しくはその類似体またはそれらの医薬として許容される塩類を含有する皮膚創傷治癒促進剤。
皮膚創傷が裂傷、擦過傷、外科的切開、皮膚潰瘍または火傷である請求項６記載の皮膚創傷治癒促進剤。
剤型が軟膏剤または貼付剤である請求項６記載の皮膚創傷治癒促進剤。