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WO2017110922A1 - 高分子凝集体の製造方法 - Google Patents

高分子凝集体の製造方法 Download PDF

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WO2017110922A1
WO2017110922A1 PCT/JP2016/088205 JP2016088205W WO2017110922A1 WO 2017110922 A1 WO2017110922 A1 WO 2017110922A1 JP 2016088205 W JP2016088205 W JP 2016088205W WO 2017110922 A1 WO2017110922 A1 WO 2017110922A1
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WO
WIPO (PCT)
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gel
polymer
solution
protein
anion
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2016/088205
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
吉則 太田
寛昭 鈴村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kojima Industries Corp
Spiber Inc
Original Assignee
Kojima Industries Corp
Spiber Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Kojima Industries Corp, Spiber Inc filed Critical Kojima Industries Corp
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Priority to CN201680075774.8A priority patent/CN108431094A/zh
Priority to JP2017558210A priority patent/JPWO2017110922A1/ja
Priority to US16/065,391 priority patent/US20190002644A1/en
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
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    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
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    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
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    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D—TEXTILES; PAPER
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    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin
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    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a polymer aggregate.
  • Spider silk is also known as spider silk, and is known to be produced using biosynthetic technology using natural spider silk as a starting material.
  • Polymer aggregates obtained by forming spider silk proteins into various shapes are known.
  • Patent Document 1 discloses a film using a spider silk protein.
  • Patent Document 2 discloses polypeptide particles derived from spider silk proteins.
  • proteins are easily dissolved in water or other solvents, and even if they are extruded into a coagulating liquid in a predetermined shape, they are dissolved in the coagulating liquid, and it is difficult to obtain a molded product such as a fiber shape or a film shape with a high yield. It was.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing polymer aggregates, which can easily obtain polymer aggregates having various shapes.
  • the present invention includes a step of bringing a polymer solution containing a polymer substance and a gel-forming cation into contact with an anion solution containing a gel-forming anion to form a gel at the interface between the polymer solution and the anion solution. And a method of aggregating the polymer substance inside the gel, and a method for producing a polymer aggregate.
  • a gel is formed at the interface between the polymer solution and the anion solution by the gel-forming cation and the gel-forming anion.
  • a solution containing the polymer substance is sealed inside the formed gel.
  • the gel functions like a dialysis membrane, and small molecules (eg, solvent, salt, etc.) in the polymer solution and anion solution move through the gel, while the polymer substance stays inside the gel, Aggregates to form polymer aggregates.
  • the shape of the polymer aggregate obtained depends on the shape of the gel formed.
  • the gel is formed by contact between the polymer solution and the anion solution, it can be formed into various shapes such as fibers, films, hollow pipes, beads and the like by a simple operation. Therefore, according to the production method of the present invention, polymer aggregates having various shapes can be easily obtained.
  • the gel-forming cation may be at least one selected from multivalent cations or hydrogen ions.
  • the gel-forming anion may be an alginate ion.
  • the anion solution preferably further contains a polymer substance aggregation promoter. Thereby, a polymer aggregate can be manufactured in a shorter time.
  • the polymer solution may further contain a polymer substance dissolution accelerator.
  • the production method of the present invention can produce a polymer aggregate in an aqueous system because there is no movement of the polymer substance through the gel. Therefore, the polymer solution and the anion solution may be water. Since polymer aggregates can be produced in aqueous systems, processes such as waste liquid treatment can be simplified, and there is no risk of mixing non-aqueous solvents into the resulting polymer aggregates, making it easy to use polymer aggregates. There is also an advantage that it can be expanded.
  • the type of polymer material is not particularly limited. It is preferred that the molecular substance is a protein.
  • the type of protein is not particularly limited, and may be a polypeptide derived from a spider silk protein, for example.
  • the shape of the polymer aggregate obtained depends on the shape of the gel to be formed. Since the gel is formed by contact between the polymer solution and the anion solution, it can be formed into various shapes such as fibers, films, hollow pipes, beads and the like by a simple operation.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing a coagulating liquid-gel-dope liquid interface in the manufacturing method according to one embodiment. It is a manufacturing process figure concerning one embodiment. It is the photograph which shows the polymer aggregate (what spider silk protein aggregates and is fibrous) obtained in Example 1, and the trace figure which traced the said photograph. (A) It is a photograph which shows the polymer aggregate formed in the gel. (B) It is a photograph which shows the polymer aggregate from which the gel was removed. (C) It is the trace figure which traced the photograph of (A). (D) It is the trace figure which traced the photograph of (B).
  • the method for producing a polymer aggregate according to the present invention comprises contacting a polymer solution containing a polymer substance and a gel-forming cation with an anion solution containing a gel-forming anion, and the polymer solution and the anion solution.
  • a step of forming a gel at the interface hereinafter also referred to as “gel forming step”
  • aggregation step a step of aggregating the polymer substance inside the gel
  • the polymer material used as a raw material is not particularly limited, and any polymer material can be used.
  • the polymer substance include, for example, biopolymers such as proteins, nucleic acids, lipids, and polysaccharides (eg, cellulose, starch, etc.), synthetic resins (eg, polyvinyl chloride, polyethylene, phenol resins, etc.), Synthetic polymers such as silicon resin (for example, silicon rubber), synthetic fiber (for example, nylon, vinylon, polyester, polyethylene terephthalate, etc.), and synthetic rubber (for example, butadiene rubber, isoprene rubber, etc.) can be mentioned.
  • the production method according to the present invention is preferably applied to biopolymers such as proteins.
  • biopolymers such as proteins.
  • the protein used as a raw material may be produced by a microorganism or the like by a gene recombination technique, may be produced by synthesis, or may be a product obtained by purifying a naturally derived protein.
  • the protein is preferably a structural protein.
  • the structural protein is a protein having a role of constructing a biological structure, and is different from functional proteins such as enzymes, hormones, and antibodies.
  • Examples of the structural protein include naturally occurring structural proteins such as fibroin, collagen, resilin, elastin and keratin. Fibroin produced by insects and spiders is known as a naturally occurring fibroin.
  • the structural protein preferably includes a spider silk protein.
  • at least one selected from polypeptides derived from spider silk proteins (spider silk fibroin), silk proteins (silk yarn, silk fibroin, etc.), gelatin, collagen, and elastin is preferable. These proteins are easy to be formed into various shapes including fibers.
  • fibroin produced by insects include, for example, Bombyx mori, Kwako (Bombyx mandaraina), Tengea (Antheraea yamanai), ⁇ ⁇ (Antereaperanii), ⁇ ⁇ (Eriothyraminey) ), Silkworms (Samia cythia), chestnut worms (Caligula japonica), Chussa moth (Anthereaea mylitta), silkworms produced by silkworms such as Antheraea assamata, vespasam worms Examples include silk proteins.
  • fibroin produced by insects include silkworm fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • the silk thread is a fiber (a silk thread) obtained from a silkworm made by a silkworm, Bombyx mori larva.
  • the silk thread is composed of two fibroins covered with glue (sericin). Fibroin is composed of a large number of fibrils, and the outer side of fibroin is covered with four layers of sericin to form a single string.
  • Silk fibroin is made from natural or domestic silkworms, or used or discarded silk fabric as a raw material, and purified by removing sericin covering fibroin and other fats.
  • the silk fibroin is preferably a lyophilized powder of purified fibroin.
  • Spider silk fibroin is a fibroin produced by spiders. Spiders have up to seven types of silk glands, each producing fibroin (spider silk protein) with different properties. Spider silk protein is a large toughened spider protein (MaSp) having a high toughness, a small toroidal spider protein (minor ampule spider protein, MiSp), and a whip according to the source organ. Flagellform (Flag), tubular, aggregate, aggregate, aciform and piriform spider silk proteins are named.
  • Fibroin produced by spiders includes, for example, spiders belonging to the genus spider (Araneus spp.) Such as the spider spider, the spider spider, the red spider spider, and the bean spider, the genus spiders of the genus Araneus, the spider spider spider, the spider spider genus e Spiders, spiders such as spiders, spiders belonging to the genus Spider, spiders belonging to the genus Pronos, spiders belonging to the genus Trinofunda, such as Torinofundamas (genus Cyrtarachne) Spiders belonging to the genus (Gasteracantha), spiders belonging to the genus Spider (Ordgarius genus), such as the spiders, the spiders, and the spiders belonging to the genus Ordgarius Spiders belonging to the genus Argiope, such as the genus Argiope, spiders belonging to the genus Arachnura, such as the white-tailed spider, spiders belonging to the
  • Spiders belonging to the genus Azumigumi (Menosira), spiders belonging to the genus Dyschiriognatha (genus Dyschiriognatha) such as the common spider spider, the black spider spider, the genus Spider genus belonging to the genus Spider belonging to the genus (L) and the genus Spider belonging to the genus (L) Produced by spiders belonging to the family Tetragnathidae such as spiders belonging to the genus Prostenops
  • Examples include spider silk protein.
  • the spider silk protein include dragline proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.
  • fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin- 4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidolin 1 [derived from Nephila clavipes (GenBank accession number AAC4, amino acid sequence A04) U37520 (base sequence)), major sample spidroin 1 [La rodectus hesperus origin] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 2 [Nephila clavata origin] (GenBank accession number AAL32447, amino acid sequence 45, amino acid sequence) major amploidate
  • Naturally derived fibroin include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidin, sample, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” is described as a keyword in DEFINITION from sequences including INV as DIVISION among the sequence information registered in NCBI GenBank. It can be confirmed by extracting a character string of a specific product from the sequence, CDS, and a sequence in which the specific character string is described from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • the protein may be a polypeptide derived from the natural protein, that is, a recombinant polypeptide.
  • recombinant fibroin is produced in several heterologous protein production systems, and as a production method thereof, a transgenic goat, a transgenic silkworm, or a recombinant plant or mammalian cell is used.
  • Recombinant fibroin has, for example, the amino acid sequence of fibrin derived from nature or the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues to the amino acid sequence of fibrin derived from nature. It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to the modification and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • Recombinant polypeptide of a large sputum dragline protein is, for example, a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m (where, in Formula 1, (A) n The motif represents an amino acid sequence composed of 4 to 20 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues with respect to the total number of amino acid residues in the n motif is 70% or more. M represents an integer of 5 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences. It may be the same amino acid sequence or a different amino acid sequence. Specific examples include proteins containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 and SEQ ID NOs: 8 and 9.
  • a protein comprising a domain sequence represented by Formula 2: [REP2] o (where, in Formula 2, o represents an integer of 5 to 300.
  • REP2 represents Gly 1X
  • An amino acid sequence composed of one Y, and X and Y represent any amino acid residue other than Gly, and a plurality of REP2s may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 corresponds to the repeat part and motif of the partial sequence of human collagen type 4 (NCBI Genbank accession number: CAA56335.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 301st residue to the 540th residue.
  • a protein comprising a domain sequence represented by Formula 3: [REP3] p (wherein, in Formula 3, p represents an integer of 4 to 300.
  • REP3 represents Ser 1 J 1 J represents an amino acid sequence composed of one Tyr, one Gly, one U-Pro, J represents an arbitrary amino acid residue, particularly preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser, and Thr.
  • Plural REP3s may have the same or different amino acid sequences. Good).
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 can be exemplified.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of resilin (NCBI Genbank accession number NP 61157, Gl: 24654243), in which Thr at the 87th residue is replaced with Ser, and the Asn at the 95th residue.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is added to the N-terminus of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence in which is replaced with Asp.
  • Examples of recombinant polypeptides of elastin include proteins having amino acid sequences such as NCBI Genbank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine). Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is added with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 at the N-terminus of the amino acid sequence of residues 121 to 390 of the amino acid sequence of NCBI Genbank accession number AAC98395. It is a thing.
  • Examples of the keratin recombinant polypeptide include Capra hircus type I keratin. Specifically, a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 (amino acid sequence of NCBI Genbank accession number ACY30466) can be mentioned.
  • the recombinant polypeptide may be a recombinant fibroin containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the fibroin amino acid sequence.
  • the above-mentioned recombinant fibroin may contain a tag sequence at one or both of the N-terminal and C-terminal. This makes it possible to isolate, immobilize, detect and visualize recombinant fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that use specific affinity (binding property, affinity) with other molecules.
  • affinity tag include a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are arranged, and has a property of specifically binding to a metal ion such as nickel. Therefore, a single tag of recombinant fibroin by metal chelating chromatography (chelating metal chromatography) is used. It can be used for separation.
  • Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • an “epitope tag” using an antigen-antibody reaction can also be used.
  • a peptide (epitope) exhibiting antigenicity as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like can be mentioned.
  • recombinant fibroin can be easily purified with high specificity.
  • a tag sequence that can be separated with a specific protease can also be used.
  • Recombinant fibroin from which the tag sequence has been cleaved can also be recovered by treating the protein adsorbed via the tag sequence with a protease.
  • Such a protein can be expressed, for example, by a host transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding the protein and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Can be produced.
  • the method for producing a gene encoding a protein is not particularly limited.
  • a gene encoding a natural structural protein can be used to produce the gene by a method of amplification and cloning by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or chemical synthesis.
  • the method of chemical synthesis of the gene is not particularly limited.
  • AKTA oligopilot plus 10/100 GE Healthcare Japan Co., Ltd.
  • a gene can be chemically synthesized by a method of linking oligonucleotides automatically synthesized in step 1 by PCR or the like.
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N terminus of the above amino acid sequence may be synthesized.
  • Regulatory sequences are sequences that control the expression of recombinant proteins in the host (for example, promoters, enhancers, ribosome binding sequences, transcription termination sequences, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • an inducible promoter that functions in a host cell and can induce expression of a target protein may be used.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, virus vector, cosmid vector, fosmid vector, artificial chromosome vector, and the like.
  • An expression vector that can replicate autonomously in a host cell or can be integrated into a host chromosome and contains a promoter at a position where a nucleic acid encoding a target protein can be transcribed is preferably used. .
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used.
  • prokaryotes include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas and the like.
  • vectors for introducing a nucleic acid encoding a protein include pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, pUB110, and pNCO2 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-238869). And the like.
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast and filamentous fungi (molds, etc.).
  • yeast examples include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like.
  • filamentous fungi examples include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma and the like.
  • vectors examples include YEP13 (ATCC 37115) and YEp24 (ATCC 37051).
  • Any method can be used for introducing an expression vector into the host cell as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, competent method, and the like.
  • a method for expressing a nucleic acid by a host transformed with an expression vector in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition, etc. .
  • the protein can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium.
  • the method for culturing a host in a culture medium can be performed according to a method usually used for culturing a host.
  • the host culture medium contains a carbon source, nitrogen source and inorganic salts that can be assimilated by the host, and the host can be cultured efficiently.
  • a medium either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be anything that can be assimilated by the host, such as glucose, fructose, sucrose, and molasses containing them, carbohydrates such as starch and starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, In addition, alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Cultivation of prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • Protein isolation and purification can be carried out by a commonly used method. For example, when the protein is expressed in a dissolved state in the cell, the host cell is recovered by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer. Then, the host cells are disrupted with dynomill or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a method usually used for protein isolation and purification, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent, etc.
  • a method usually used for protein isolation and purification that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic solvent, etc.
  • Precipitation method anion exchange chromatography method using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), positive using resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia)
  • Electrophoresis methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Using methods such as these alone or in combination, purification It is possible to obtain the goods.
  • the host cell is similarly recovered, crushed, and centrifuged to recover the insoluble substance of the modified fibroin as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble form of modified fibroin can be solubilized with a protein denaturant.
  • a purified preparation of modified fibroin can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein When the protein is secreted outside the cell, the protein can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture with a technique such as centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • the gel-forming cation is a cation that forms a gel by binding to the gel-forming anion.
  • the gel-forming cation is typically a multivalent cation and a hydrogen ion (proton).
  • the polyvalent cation is a compound having a positive charge of 2 or more, for example, a compound having a metal cation of 2 or more and one or more cationic groups in one molecule. Examples of the compound having two or more cationic groups in one molecule include polyamine ions having two or more amino groups in one molecule.
  • Examples of the metal cation having a valence of 2 or more include alkaline earth metal ions such as Ca 2+ and Mg 2+ , transition metal ions such as Mn 2+ , Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+ and Cu 2+ , Zn 2+ and Al 3+. Is mentioned.
  • the gel-forming anion is an anion that forms a gel by combining with the gel-forming cation.
  • the anion for gel formation include ions of polysaccharides having an anionic group such as carrageenan, pectin (for example, LM pectin), gum arabic, xanthan gum, gellan gum, soybean polysaccharide and alginic acid (for example, sodium alginate), Examples include ions of acids such as polylactic acid and polyphosphoric acid.
  • the gel-forming cation and the gel-forming anion can be used in any combination.
  • the gel-forming cation is a divalent or higher valent metal cation, and the gel-forming anion.
  • the polymer solution can be obtained, for example, by adding a polymer substance to a solvent in which a cation for gel formation is dissolved, and dissolving the solution by a known method such as stirring, heating, and electric field application.
  • the gel-forming cation may be added to the solvent as a compound (multivalent cation compound) that generates the gel-forming cation when dissolved in the solvent.
  • the polyvalent cation compound include, for example, metal halides (for example, CaCl 2 , MgCl 2 ), metal nitrates (for example, Ca (NO 3 ) 2 , Mg (NO 3 ) 2 ), metal thiocyanate ( For example, Ca (SCN) 2 , Mg (SCN) 2 ), diamine compounds (eg, ethylenediamine, p-phenylenediamine), and polyvalent complex salts (eg, [Co 4 (OH) 6 ⁇ en 6 ] (NO 3 ) 6 ).
  • the solvent of the polymer solution may be water or an aqueous solvent such as a buffer solution, such as dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), hexafluoroisopropanol (HFIP) and hexafluoroacetone (HFAc). ) And other organic solvents.
  • a buffer solution such as dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), hexafluoroisopropanol (HFIP) and hexafluoroacetone (HFAc).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • HFAc hexafluoroacetone
  • the solvent of the polymer solution may be a mixed solvent in which two or more solvents are mixed.
  • the mixed solvent also includes a mixed solvent of an aqueous solvent and an organic
  • the polymer solution may further contain a dissolution accelerator that promotes dissolution of the polymer substance. This facilitates the preparation of the polymer solution.
  • a dissolution accelerator that promotes dissolution of the polymer substance.
  • the dissolution promoter include, for example, inorganic salts composed of a Lewis acid and a Lewis base shown below when the polymer substance is a protein.
  • the Lewis base include oxo acid ions (nitrate ions, perchlorate ions, etc.), metal oxo acid ions (permanganate ions, etc.), halide ions, thiocyanate ions, cyanate ions, and the like.
  • Lewis acid examples include metal ions such as alkali metal ions and alkaline earth metal ions, polyatomic ions such as ammonium ions, complex ions, and the like.
  • inorganic salts composed of a Lewis acid and a Lewis base include lithium salts such as lithium chloride, lithium bromide, lithium iodide, lithium nitrate, lithium perchlorate, and lithium thiocyanate, calcium chloride, calcium bromide.
  • Calcium salts such as calcium iodide, calcium nitrate, calcium perchlorate and calcium thiocyanate
  • iron salts such as iron chloride, iron bromide, iron iodide, iron nitrate, iron perchlorate and iron thiocyanate
  • Aluminum salts such as aluminum chloride, aluminum bromide, aluminum iodide, aluminum nitrate, aluminum perchlorate, and aluminum thiocyanate
  • Sodium salts such as sodium uride, sodium nitrate, sodium perchlorate and sodium thiocyanate
  • zinc salts such as zinc chloride, zinc bromide, zinc iodide, zinc nitrate, zinc perchlorate and zinc thiocyanate
  • chloride Magnesium salts such as magnesium, magnesium bromide, magnesium iodide, magnesium nitrate, magnesium perchlorate, and magnesium thiocyanate, barium chloride, barium bromide, barium iodide, barium nitrate, barium perchlorate, and barium thiocyanate
  • strontium salts such as strontium chloride, strontium bromide, strontium iodide, strontium nitrate, strontium perchlorate, and strontium thiocyanate.
  • specific examples of the dissolution accelerator include thiol and amine.
  • specific examples of the dissolution accelerator include carbon disulfide and sodium hydroxide.
  • the polymer substance is a synthetic resin, such as acrylic
  • a specific example of the dissolution accelerator is sodium thiocyanate
  • sulfuric acid is mentioned.
  • polyvinyl chloride acetone and cyclohexane are mentioned as specific examples of the dissolution accelerator.
  • the gel-forming cation may act as a dissolution accelerator that promotes the dissolution of the polymer substance.
  • the content of the gel-forming cation in the polymer solution is appropriately set according to the type of polymer substance, gel-forming cation, gel-forming anion, solvent, and other additives.
  • the polymer substance is protein
  • the gel-forming cation is Ca 2+
  • the gel-forming anion is an alginate ion
  • the content of the gel-forming cation is 0.1 to 5.0 mol /
  • a concentration range of L is preferable, and a concentration range of 0.4 to 3.0 mol / L is more preferable.
  • the content of the polymer substance in the polymer solution is appropriately set according to the type of polymer substance.
  • the content of the polymer substance is preferably 10 to 50% by mass, more preferably 15 to 30% by mass based on the total amount of the polymer solution.
  • the viscosity of the polymer solution is not particularly limited, but is preferably 50 to 20000 cP at 25 ° C., more preferably 200 to 8000 cP, for example, from the viewpoint of easy molding.
  • the viscosity of the polymer solution is measured by, for example, an EMS viscometer.
  • the anion solution (coagulating liquid) can be obtained, for example, by adding the above-described gel-forming anion to a solvent and dissolving it by a known method such as stirring, heating, and electric field application.
  • the anion for gel formation may be added to the solvent as a compound (anion compound) that generates the anion for gel formation when dissolved in the solvent.
  • anionic compound include polysaccharides having an anionic group and salts thereof.
  • polysaccharide having an anionic group and a salt thereof include sodium alginate.
  • Sodium alginate is represented by (NaC 6 H 7 O 6 ) n (n is 1 to 5000) and may be abbreviated as Na-ALG.
  • the solvent of the anion solution may be water or an aqueous solvent such as a buffer solution, such as dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), hexafluoroisopropanol (HFIP), and hexafluoroacetone (HFac).
  • a buffer solution such as dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), hexafluoroisopropanol (HFIP), and hexafluoroacetone (HFac).
  • An organic solvent such as The solvent of the anion solution may be a mixed solvent in which two or more solvents are mixed.
  • the mixed solvent also includes a mixed solvent of an aqueous solvent and an organic solvent.
  • the solvent of the anion solution may be the same as the solvent of the polymer solution. Further, both solvents may be aqueous solvents.
  • a polymer solution dope solution
  • an anion solution coagulation solution
  • a polymer aggregate can be formed in an aqueous system. Thereby, the obtained polymer aggregate can be applied to a living body. For example, it can be used in place of a silk thread that is currently used as a surgical sewing thread, as well as an artificial blood vessel, an artificial skin, an artificial bone, etc. Application to is possible.
  • the anion solution may further contain an aggregation accelerator for the polymer substance.
  • an aggregation accelerator for the polymer substance for the polymer substance.
  • the polymer substance aggregation promoter include alkali metal ions such as Na + , Li + and K + when the polymer substance is a protein.
  • the polymer material is cellulose
  • a specific example of the polymer material aggregation promoter is ethanol.
  • a specific example of the aggregation accelerator for the polymer substance is a disulfide compound.
  • the content of the gel-forming anion in the anion solution is appropriately set according to the type of polymer substance, gel-forming cation, gel-forming anion, solvent, and other additives.
  • the polymer substance is protein
  • the gel forming cation is Ca 2+
  • the gel forming anion is an alginate ion
  • the content of the gel forming anion is 0.1 to 6.0% by weight.
  • the concentration range is preferably 1.0 to 2.0% by weight.
  • the polymer solution is brought into contact with the anion solution to form a gel at the interface between the polymer solution and the anion solution.
  • a gel having an arbitrary shape such as a fiber shape, a film shape, a hollow pipe shape, or a bead shape can be formed by controlling the shape of the contact surface.
  • a fiber shape for example, it can be formed by continuously extruding a polymer solution from a spinning nozzle into an anion solution.
  • a film shape for example, it can be formed by continuously extruding a polymer solution from a slit hole into an anion solution.
  • the polymer solution can be formed by continuously extruding the polymer solution from the hollow slit hole or through the double tube into the anion solution and also injecting the polymer solution into the polymer solution.
  • the polymer solution can be formed by intermittently extruding from a nozzle into an anion solution.
  • the polymer substance is aggregated inside the gel.
  • the gel functions like a dialysis membrane.
  • an excessive gel-forming cation or dissolution accelerator contained in the polymer solution escapes into the anion solution through the gel.
  • Aggregation proceeds.
  • the aggregation of the polymer substance proceeds when the aggregation accelerator contained in the anion solution enters the polymer solution through the gel.
  • the anion solution may be stirred. Thereby, the efficiency of mass transfer through the gel is improved, so that the production efficiency is improved.
  • the time for performing the aggregation step may be appropriately set according to the shape and use of the polymer aggregate, such as the type of polymer substance, gel-forming cation, gel-forming anion, solvent and other additives. Usually, it is 3 minutes to 3 hours, and preferably 3 minutes to 2 hours.
  • the manufacturing method according to the present embodiment may further include a step of immersing the polymer aggregate in which the gel is bound in a sheath shape in a solvent such as water (also referred to as “aggregation step 2”) after the aggregation step. Good. Thereby, the movement of the cation for gel formation or the dissolution accelerator from the inside of the gel to the solvent is promoted, and the polymer aggregate can be further aggregated.
  • a solvent such as water
  • the time which implements the aggregation process 2 is usually from 3 minutes to 3 hours, preferably from 3 minutes to 2 hours, more preferably from 3 minutes to 1 hour.
  • the production method according to the present embodiment may further include a step of removing the gel from the polymer aggregate (also referred to as “gel removal step”) after the aggregation step or the aggregation step 2.
  • the polymer aggregate may be provided as a polymer aggregate in which the gel is bound in a sheath form. When the gel is unnecessary, the polymer aggregate is obtained by removing the gel by a gel removal step.
  • a removal method using mechanical means such as crushing the gel with a roller, a chemical method such as immersing in a solution that dissolves only the gel without dissolving the polymer aggregate, or
  • the method of removing a gel with an ultrasonic wave or heat is mentioned.
  • FIG. 1A is an explanatory diagram showing a process of extruding a polymer solution (dope solution) into an anion solution (coagulation solution).
  • the dope liquid 1 is put into the syringe 9a, and the dope liquid 1 is continuously pushed out from the nozzle to the coagulation liquid 4.
  • the dope solution 1 is obtained by dissolving a polymer substance (for example, a polypeptide derived from spider silk protein) in an aqueous solution containing a cation for gel formation (for example, Ca 2+ ).
  • the coagulation liquid 4 is an aqueous solution containing an anion for gel formation (for example, alginate ion).
  • the coagulating liquid 4 is put in the container 3 and is slowly stirred.
  • the extruded dope liquid 2 forms a gel 5 at the interface in the coagulation liquid 4.
  • polymer substances for example, polypeptides derived from spider silk proteins
  • aggregate to form polymer aggregates 8. Since the fiber-shaped gel 5 is formed by extrusion, the resulting polymer aggregate 8 also has a fiber shape.
  • FIG. 1 (B) is an explanatory view showing a process of immersing the polymer aggregate coated with the gel in water and further aggregating it.
  • Water 7 is placed in a container 6 and is slowly stirred.
  • the polymer aggregate 8 coated with the gel 5 is immersed in the water 7 together with the gel 5. Thereby, the polymer aggregate 8 further aggregates. By drying this, it becomes a high-strength yarn.
  • FIG. 2 is an explanatory view showing a manufacturing method according to another embodiment.
  • a polymer aggregate having a particle shape (bead shape) is obtained.
  • the dope solution 1 is put into the syringe 9a, and the dope solution 1 is intermittently pushed out from the nozzle to the coagulation solution 4.
  • the extruded dope liquid 2 forms a gel 5 at the interface in the coagulation liquid 4.
  • the polymer substance aggregates to form a polymer aggregate 8. Since the gel 5 having a particle shape is formed by intermittent extrusion, the resulting polymer aggregate 8 also has a particle shape.
  • FIG. 3 is an explanatory view showing a manufacturing method according to another embodiment.
  • a polymer aggregate in the form of a film is obtained.
  • the dope solution 1 is continuously extruded from the slit hole 9b into the coagulation solution 4.
  • the extruded dope liquid 2 forms a gel 5 in the coagulation liquid 4.
  • the polymer substance aggregates to form a polymer aggregate 8. Since the film-shaped gel 5 is formed by extrusion, the resulting polymer aggregate 8 also has a film shape.
  • FIG. 4A is an explanatory view showing a manufacturing method according to another embodiment.
  • FIG. 4B is an enlarged view of a portion surrounded by A in FIG.
  • a hollow pipe-shaped or tube-shaped polymer aggregate is obtained.
  • the dope solution 1 is continuously pushed out from the syringe 9a to the coagulation solution 4 through an annular slit hole 9b provided at the tip of the nozzle so as to form a tube.
  • the extruded dope liquid 2 forms a tubular gel 5 in the coagulation liquid 4.
  • the polymer substance aggregates to form a polymer aggregate 8. Since the tube-shaped gel 5 is formed by extrusion, the resulting polymer aggregate 8 also has a hollow pipe shape or tube shape with a small diameter.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view showing the coagulating liquid-gel-dope liquid interface in the manufacturing method according to an embodiment.
  • the mechanism by which polymer aggregates are formed by the production method according to the present invention will be described using the schematic cross-sectional view 10 showing the coagulating liquid-gel-dope liquid interface shown in FIG.
  • a polymer solution containing Ca (SCN) 2 and fibroin is used as the dope solution
  • an anion solution containing sodium alginate is used as the coagulation solution.
  • the gel layer 12 is formed from Ca 2+ (gel forming cations) contained in the dope solution and alginate ions (ALG n ⁇ : gel forming anions) contained in the coagulation solution.
  • the gel layer 12 is considered to function like a dialysis membrane.
  • low molecular weight SCN ⁇ , H 2 O, and Na + move through the gel layer 12, while the fibroin that is a polymer remains inside the gel.
  • the outflow of SCN ⁇ through the gel layer 12 decreases the solubility of fibroin inside the gel and the aggregation proceeds.
  • FIG. 6 is a manufacturing process diagram according to one embodiment.
  • the dope liquid 22 is extruded in the P direction from the nozzle 23 of the extruder 21, the extruded dope liquid 24 is immersed in the coagulation liquid 26 in the coagulation tank 25, the generated gel 27 is peeled off, and the aggregated fibroin 28 is added to the water tank 29. It is immersed in pure water 30 and further agglomerated, and then solidified through a dryer 31 to obtain a wound yarn 32.
  • a fibroin yarn can be manufactured in a series of steps.
  • the fibroin yarn has practically sufficient strength even if it is an undrawn yarn, but may be further drawn.
  • Example 1 Preparation of polypeptide derived from spider silk protein ⁇ Gene synthesis> (1) Synthesis of ADF3Kai gene A partial amino acid sequence of ADF3 (GI number: 1263287), one of the two main worm-coiled silkworm spider silkworm proteins, was obtained from the NCBI web database and placed at the N-terminus of the same sequence. A gene encoding an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) to which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) consisting of a start codon, a His10 tag and an HRV 3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site was added was commissioned to GenScript.
  • a pUC57 vector (with an Nde I site immediately upstream of the 5 ′ end and an Xba I site immediately downstream of the 5 ′ end) into which the ADF3Kai gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 had been introduced was obtained. Thereafter, the gene was treated with restriction enzymes with Nde I and EcoR I and recombined into a pET22b (+) expression vector.
  • a PCR reaction was carried out using ADF3Kai as a template using a T7 promoter primer (SEQ ID NO: 14) and Rep Xba I primer (SEQ ID NO: 15), and the 5 ′ half of the ADF3Kai gene sequence
  • sequence A The sequence (hereinafter referred to as “sequence A”) was amplified, and the fragment was subjected to restriction enzyme treatment with Nde I and Xba I in advance using a Mighty Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Recombined.
  • sequence B and sequence B 3 ′ half sequence of the gene sequence of ADF3Kai.
  • the fragment was recombined into a pUC118 vector previously treated with Xba I and EcoR I using a Mighty Cloning Kit (Takara Bio Inc.).
  • the pUC118 vector into which the sequence A was introduced was treated with Nde I and Xba I
  • the pUC118 vector into which the sequence B was introduced was treated with restriction enzymes with Xba I and EcoR I, respectively, and the target DNA fragments of the sequences A and B were obtained by cutting out the gel.
  • the DNA fragments A and B and pET22b (+) previously treated with Nde I and EcoR I were subjected to a ligation reaction and transformed into E. coli DH5 ⁇ .
  • ADF3Kai-Large gene shown in SEQ ID NO: 6 was confirmed.
  • the amino acid sequence of ADF3Kai-Large is as shown in SEQ ID NO: 3.
  • NRSH1 ADF3Kai-Large-NRSH1
  • pET22b (+) expression vector containing the gene sequence of NRSH1 obtained above was transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3). After culturing the obtained single colony in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours, 1.4 mL of the same culture solution was added to 140 mL of LB medium containing ampicillin, and cultured at 37 ° C. and 200 rpm. The culture was continued until the OD 600 was 3.5. Then, OD 600 of the culture broth of 3.5, added with 50% glucose 140mL in 2 ⁇ YT medium 7L containing ampicillin, and further cultured until an OD 600 of 4.0.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the dissolved protein solution is centrifuged (11,000 ⁇ g, 10 minutes, room temperature) with the above-mentioned Tommy Seiko centrifuge, and the supernatant is used with a dialysis tube (Sanko Junyaku Co., Ltd. cellulose tube 36/32). And dialyzed against water.
  • the white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation, the water was removed with a freeze dryer, and the lyophilized powder was recovered.
  • the degree of purification of the target protein NRSH1 (about 101.1 kDa) in the obtained lyophilized powder was determined by image analysis of the results of polyacrylamide gel electrophoresis (CBB staining) of the powder using Totallab (nonlinear dynamics ltd.). confirmed. As a result, the purity of NRSH1 was about 85%.
  • the dope solution was extruded into a coagulation solution using a syringe.
  • the diameter of the extrusion nozzle was 0.5 mm, and the extrusion speed was 50 mL / Hr.
  • the dope was immersed in the coagulation liquid for 90 minutes (gel bath time) to obtain a polymer aggregate formed in the gel. Thereafter, the gel covering the polymer aggregate was removed to obtain a fibroin of the yarn.
  • FIG. 7 is a photograph showing the polymer aggregate obtained in Example 1 (in which spider silk proteins are aggregated into a fibrous form) and a trace diagram obtained by tracing the photograph.
  • FIG. 7 (A) is a photograph showing polymer aggregates formed in the gel.
  • FIG. 7B is a photograph showing the polymer aggregate from which the gel has been removed.
  • FIG. 7C is a trace diagram obtained by tracing the photograph of FIG.
  • FIG. 7D is a trace diagram obtained by tracing the photograph of FIG.
  • Example 2 Except that the dope solution was prepared by adding spider silk protein (NRSH1) to a DMSO solution of 1M CaCl 2 to a concentration of 20% by mass, and that the gelling bath immersion time was changed to 30 minutes. In the same manner as in No. 1, a polymer aggregate was produced.
  • NRSH1 spider silk protein
  • FIG. 8 is a photograph showing the polymer aggregate obtained in Example 2 (in which spider silk proteins are aggregated into a fibrous form), and a trace diagram obtained by tracing the photograph.
  • FIG. 8 (A) is a photograph showing polymer aggregates formed in the gel.
  • FIG. 8B is a photograph showing the polymer aggregate from which the gel has been removed.
  • FIG. 8C is a trace diagram obtained by tracing the photograph of FIG.
  • FIG. 8D is a trace diagram obtained by tracing the photograph of FIG.
  • Example 3 The use of silk thread (sericin unremoved) instead of spider silk protein (NRSH1), the concentration of Ca (SCN) 2 contained in the dope solution being 5M, and the gelling bath immersion time being changed to 180 minutes
  • the polymer aggregate was produced in the same manner as in Example 1 except that it was immersed in the coagulating liquid and then immersed in RO water for 60 minutes (RO water immersion time).
  • the silk thread (sericin unremoved) was obtained by taking a cocoon cocoon from the cocoon and cutting the rice husk.
  • FIG. 9 is a photograph showing the polymer aggregate (silk protein aggregated into a fibrous form) obtained in Example 3, and a trace figure obtained by tracing the photograph.
  • FIG. 9 (A) is a photograph showing polymer aggregates formed in the gel.
  • FIG. 9B is a trace diagram obtained by tracing the photograph of FIG. The polymer aggregate of Example 3 was integrated with the gel.
  • Example 4 The use of fibron fibron from which sericin has been removed from silk thread instead of silk thread (without sericin removal), the change in sodium alginate concentration in the coagulation solution to 2.0% by mass, and the gelling bath immersion time have been changed to 30 minutes A polymer aggregate was produced in the same manner as in Example 3 except that the RO water immersion time was changed to 30 minutes.
  • Filamentous fibroin from which sericin was removed from silk thread was prepared as follows. (1) Silk thread was put into a boiled 0.5% by weight Marcel soap water (use Marcel soap finely divided with grater) so that the bath ratio was 1: 100, and boiled for 30 minutes with occasional stirring. (2) Throw away soap water and rinse with lukewarm water. (3) The silk thread rinsed with lukewarm water in (2) was boiled in boiling water so that the bath ratio was 1: 100. (4) The hot water was thrown away. (5) Procedures (1) to (4) were repeated two more times (3 times in total). (6) Finally dehydrated and dried at 60 ° C. or lower.
  • FIG. 10 is a photograph showing the polymer aggregate obtained in Example 4 (silk protein aggregated into a fibrous form) and a trace diagram obtained by tracing the photograph.
  • FIG. 10A is a photograph showing polymer aggregates formed in the gel.
  • FIG. 10B is a trace diagram obtained by tracing the photograph of FIG. The polymer aggregate of Example 4 was integrated with the gel.
  • Example 5 A polymer aggregate was produced in the same manner as in Example 4 except that a regenerated silk thread was used instead of the filamentous fibroin from which sericin was removed from the silk thread.
  • the regenerated silk thread was prepared as follows. (1) The silk thread was boiled for 30 minutes with boiling 0.5 mass% Marcel soap water (use Marcel soap finely made with grater). (2) Then, it boiled for 30 minutes with boiling hot water. (3) Procedures (1) and (2) were repeated twice more (total 3 times). (4) Finally boiled in boiling water for 30 minutes. (5) It was dried overnight at a temperature of 37 ° C. (6) The dried silk was weighed and 10 times its volume of 9M lithium bromide aqueous solution was added and dissolved in a 40 ° C. environment.
  • the lysate obtained in (6) was placed in a cellulose dialysis membrane (Seamless Cellulose Tubing, 36/32 manufactured by VISKASESELES COAP) and dialyzed against pure water for 3 to 4 days.
  • the collected liquid after dialysis was filtered with a filter (pore diameters of 197 ⁇ m and 560 ⁇ m) to remove dust.
  • the protein concentration was measured by the BCA method, and diluted with MilliQ so that the protein concentration was 2% by mass or less.
  • the regenerated silk yarn solution was freeze-dried in an environment of ⁇ 80 ° C. The thickness was 1-2 cm. (11) After lyophilization, it was stored at 4 ° C.
  • Table 1 shows the manufacturing conditions and results.
  • the polymer aggregate of Example 5 was integrated with the gel.
  • Example 6 Example 1 except that a commercially available gelatin (Catalog Number 170-6537 manufactured by BIORAD) was used in place of the spider silk protein (NRSH1) and that the gelling bath immersion time was changed to 30 minutes. A polymer aggregate was produced.
  • a commercially available gelatin Catalog Number 170-6537 manufactured by BIORAD
  • NRSH1 spider silk protein
  • FIG. 11 is a photograph showing the polymer aggregate obtained in Example 6 (in which gelatin proteins are aggregated into a fibrous form) and a trace diagram obtained by tracing the photograph.
  • FIG. 11 (A) is a photograph showing polymer aggregates formed in the gel.
  • FIG. 11B is a trace diagram obtained by tracing the photograph of FIG. The polymer aggregate of Example 6 was integrated with the gel.

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Abstract

本発明は、高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、上記高分子溶液と上記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程と、上記ゲルの内部で上記高分子物質を凝集させる工程と、を備える、高分子凝集体の製造方法に関する。

Description

高分子凝集体の製造方法
　本発明は、高分子凝集体の製造方法に関する。
　クモ糸はスパイダーシルクとも言われ、天然クモ糸を出発物質とし、バイオ合成技術を用いて産生されることが知られている。クモ糸タンパク質を種々の形状に成形した高分子凝集体が知られている。例えば、特許文献１には、クモ糸タンパク質を使用したフィルムが開示されている。また、特許文献２には、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドパーティクルが開示されている。
特表２００８－５０７２６０号公報 国際公開第２０１４／６１０４３号
　しかし、タンパク質は、水又はその他の溶媒に溶解しやすく、所定形状で凝固液に押し出しても凝固液に溶解してしまい、歩留まりよく繊維形状、フィルム形状等の成形物を得ることが困難であった。
　そこで、本発明は、様々な形状の高分子凝集体を容易に得ることができる、高分子凝集体の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明は、高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、上記高分子溶液と上記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程と、上記ゲルの内部で上記高分子物質を凝集させる工程と、を備える、高分子凝集体の製造方法を提供する。
　本発明の製造方法では、ゲル形成用カチオンとゲル形成用アニオンにより、高分子溶液とアニオン溶液の界面にゲルを形成させる。これにより、形成されたゲルの内部に高分子物質を含む溶液が封入される。このとき、ゲルは透析膜のように機能し、高分子溶液及びアニオン溶液中の小分子（例えば、溶媒、塩等）はゲルを介して移動する一方で、高分子物質はゲル内部に留まり、凝集して高分子凝集体が形成される。当該製造方法では、得られる高分子凝集体の形状は、形成されるゲルの形状に依存する。ゲルは、高分子溶液とアニオン溶液の接触により形成されるため、簡便な操作で、例えば、繊維、フィルム、中空パイプ、ビーズ等の様々な形状に成形することができる。したがって、本発明の製造方法によれば、様々な形状の高分子凝集体を容易に得ることができる。
　上記ゲル形成用カチオンは、多価カチオン又は水素イオンから選択される少なくとも１種であってよい。また、上記ゲル形成用アニオンは、アルギン酸イオンであってよい。
　上記アニオン溶液は、高分子物質の凝集促進剤を更に含有することが好ましい。これにより、より短時間で、高分子凝集体を製造することができる。
　上記高分子溶液は、高分子物質の溶解促進剤を更に含有していてもよい。
　本発明の製造方法は、ゲルを介した高分子物質の移動がないことから、水系で高分子凝集体を製造することができる。したがって、上記高分子溶液及びアニオン溶液の溶媒が水であってもよい。高分子凝集体を水系で製造できることから、廃液処理等の工程を簡素化でき、また得られる高分子凝集体への非水系溶媒の混入のリスクがないため、高分子凝集体の用途を容易に広げることができるという利点もある。
　本発明の製造方法は、ゲルを透析膜のように機能させ、ゲルの内部で高分子物質を凝集させるという作用に基づくことから、高分子物質の種類は特に制限されないが、典型的には高分子物質がタンパク質であることが好適である。また、タンパク質の種類は特に制限されないが、例えば、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドであってよい。
　本発明によれば、様々な形状の高分子凝集体を容易に得ることができる、高分子凝集体の製造方法の提供が可能となる。本発明の製造方法では、得られる高分子凝集体の形状は、形成されるゲルの形状に依存する。ゲルは、高分子溶液とアニオン溶液の接触により形成されるため、簡便な操作で、例えば、繊維、フィルム、中空パイプ、ビーズ等の様々な形状に成形することができる。
一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。（Ａ）高分子溶液（ドープ液）をアニオン溶液（凝固液）中に押し出す工程を示す説明図である。（Ｂ）ゲルに被覆された高分子凝集体を水に浸漬し、更に凝集させる工程を示す説明図である。 一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。 一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。 （Ａ）一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。（Ｂ）図４（Ａ）においてＡで囲った部分の拡大図である。 一実施形態に係る製造方法における凝固液－ゲル－ドープ液の界面を示す模式断面図である。 一実施形態に係る製造工程図である。 実施例１で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。（Ｃ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。（Ｄ）（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。 実施例２で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。（Ｃ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。（Ｄ）（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。 実施例３で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。 実施例４で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。 実施例６で得られた高分子凝集体（ゼラチンタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
　本発明に係る高分子凝集体の製造方法は、高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、上記高分子溶液と上記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程（以下、「ゲル形成工程」ともいう。）と、上記ゲルの内部で上記高分子物質を凝集させる工程（以下、「凝集工程」ともいう。）と、を備える。
（高分子溶液）
　原料となる高分子物質は、特に制限されることなく任意の高分子物質を用いることができる。高分子物質の具体例としては、例えば、タンパク質、核酸、脂質、及び多糖類（例えば、セルロース、デンプン等）等の生体高分子、合成樹脂（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、フェノール樹脂等）、シリコン樹脂（例えば、シリコンゴム等）、合成繊維（例えば、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート等）、及び合成ゴム（例えば、ブタジエンゴム、イソプレンゴム等）等の合成高分子が挙げられる。
　タンパク質等の生体高分子は、特に高分子凝集体の製造工程に改良の余地があることから、本発明に係る製造方法は、タンパク質等の生体高分子に適用するのが好適である。タンパク質の種類に制限はなく、任意のタンパク質に適用できる。原料となるタンパク質は、遺伝子組換え技術により微生物等で製造したものであってもよく、合成により製造されたものであってもよく、また天然由来のタンパク質を精製したものであってもよい。
　タンパク質としては、構造タンパク質が好ましい。構造タンパク質は、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラ－ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質はスパイダーシルクタンパク質を含むことが好ましい。なお、構造タンパク質の中でも、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（クモ糸フィブロイン）、シルクタンパク質（絹糸、絹フィブロイン等）、ゼラチン、コラーゲン及びエラスチンから選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。これらのタンパク質は、繊維をはじめとして様々な形状に成形しやすい。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　絹糸は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維（繭糸）である。繭糸は２本のフィブロインがニカワ質（セリシン）で覆われる形で１本になっている。フィブロインは多数のフィブリルで構成され、フィブロインの外側は４層のセリシンで覆われ、１本の繭糸が構成されている。
　絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料とし、フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分等を除去して精製したものである。絹フィブロインは、精製したフィブロインを凍結乾燥粉末としたものが好ましい。
　クモ糸フィブロインはクモ類が産生するフィブロインである。クモには最大７種類の絹糸腺があり、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　タンパク質は、上記天然型タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。例えば、組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。
　組換えフィブロインは、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列、あるいは天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変に相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
　大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４～２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が７０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは５～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）として表すことができる。具体的には配列番号１～３及び配列番号８、９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。
　コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたものである。
　レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１１で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ　６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたものである。
　エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたものである。
　ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号１３で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
　組換えポリペプチドは、上記フィブロインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
　上述の組換えフィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
　遺伝子組み換え技術によってタンパク質を製造する方法について以下に詳述する。かかるタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
　タンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
　発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
　原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
　タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
　ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
　上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
　発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、宿主の培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　タンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
　また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。
　タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　ゲル形成用カチオンは、ゲル形成用アニオンと結合してゲルを形成するカチオンである。ゲル形成用カチオンは、典型的には、多価カチオン、及び水素イオン（プロトン）である。多価カチオンは、２価以上の正電荷を持つ化合物であり、例えば、２価以上の金属陽イオン、１分子中に２以上のカチオン性基を有する化合物が挙げられる。１分子中に２以上のカチオン性基を有する化合物としては、例えば、１分子中に２以上のアミノ基を有するポリアミンのイオンが挙げられる。２価以上の金属陽イオンとしては、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋等のアルカリ土類金属イオン、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋等の遷移金属イオン、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋が挙げられる。
　ゲル形成用アニオンは、ゲル形成用カチオンと結合してゲルを形成するアニオンである。ゲル形成用アニオンとしては、例えば、カラギナン、ペクチン（例えば、ＬＭペクチン等）、アラビアガム、キサンタンガム、ジェランガム、大豆多糖類及びアルギン酸（例えば、アルギン酸ナトリウム）等のアニオン性基を有する多糖類のイオン、ポリ乳酸、ポリリン酸等の酸のイオンが挙げられる。
　ゲル形成用カチオンとゲル形成用アニオンは、任意に組み合わせて用いることができるが、ゲル形成効率に優れるという観点から、ゲル形成用カチオンが２価以上の金属陽イオンであり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンであることが好ましく、ゲル形成用カチオンがＣａ２＋であり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンであることがより好ましい。
　高分子溶液（ドープ液）は、例えば、ゲル形成用カチオンを溶解させた溶媒に高分子物質を添加し、撹拌、加熱及び電場印加等の公知の方法により溶解させることで得ることができる。
　ゲル形成用カチオンは、溶媒に溶解した際に当該ゲル形成用カチオンを生成する化合物（多価カチオン化合物）として溶媒に添加してもよい。多価カチオン化合物の具体例としては、例えば、金属ハロゲン化物（例えば、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２）、金属硝酸塩（例えば、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＮＯ３）２）、金属チオシアン酸塩（例えば、Ｃａ（ＳＣＮ）２，Ｍｇ（ＳＣＮ）２）、ジアミン化合物（例えば、エチレンジアミン、ｐ－フェニレンジアミン）、及び多価錯塩（例えば、［Ｃｏ４（ＯＨ）６・ｅｎ６］（ＮＯ３）６）が挙げられる。
　高分子溶液の溶媒は、水、及び緩衝液等の水系溶媒であってもよく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）及びヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）等の有機溶媒であってもよい。高分子溶液の溶媒は、２種以上の溶媒を混合した混合溶媒であってもよい。混合溶媒は、水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒も含む。
　高分子溶液は、高分子物質の溶解を促進させる溶解促進剤を更に含有していてもよい。これにより、高分子溶液の調製が容易になる。溶解促進剤の具体例としては、例えば、高分子物質がタンパク質の場合、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。高分子物質が加硫ゴムの場合、溶解促進剤の具体例として、チオール及びアミンが挙げられる。高分子物質がセルロースの場合、溶解促進剤の具体例として、二硫化炭素及び水酸化ナトリウムが挙げられる。高分子物質が合成樹脂、例えばアクリルの場合、溶解促進剤の具体例として、チオシアン酸ナトリウムが挙げられ、ポリアミド及びポリパラフェニレンテレフタルアミドの場合、溶解促進剤の具体例として、硫酸が挙げられ、ポリ塩化ビニルの場合、溶解促進剤の具体例として、アセトン及びシクロヘキサンが挙げられる。なお、高分子物質とゲル形成用カチオンとの組み合わせによっては、ゲル形成用カチオンが高分子物質の溶解を促進させる溶解促進剤として作用することもある。
　高分子溶液中のゲル形成用カチオンの含有量は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等に応じて適宜設定される。例えば、高分子物質がタンパク質であり、ゲル形成用カチオンがＣａ２＋であり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンである場合、ゲル形成用カチオンの含有量は、０．１～５．０モル／Ｌの濃度範囲であることが好ましく、０．４～３．０モル／Ｌの濃度範囲であることがより好ましい。
　高分子溶液中の高分子物質の含有量は、高分子物質の種類等に応じて適宜設定される。例えば、高分子物質がタンパク質である場合、高分子物質の含有量は、高分子溶液全量を基準として、１０～５０質量％であることが好ましく、１５～３０質量％であることがより好ましい。
　高分子溶液の粘度は、特に制限されないが、例えば、成形が容易になるという観点から、２５℃において５０～２００００ｃＰであることが好ましく、２００～８０００ｃＰであることがより好ましい。高分子溶液の粘度は、例えばＥＭＳ粘度計により測定される。
（アニオン溶液）
　アニオン溶液（凝固液）は、例えば、上述したゲル形成用アニオンを溶媒に添加し、撹拌、加熱及び電場印加等の公知の方法により溶解させることで得ることができる。
　ゲル形成用アニオンは、溶媒に溶解した際に当該ゲル形成用アニオンを生成する化合物（アニオン化合物）として溶媒に添加してもよい。アニオン化合物の具体例としては、例えば、アニオン性基を有する多糖類、及びその塩が挙げられる。アニオン性基を有する多糖類、及びその塩の好適な具体例としては、アルギン酸ナトリウムが挙げられる。アルギン酸ナトリウムは（ＮａＣ６Ｈ７Ｏ６）ｎ（ｎは１～５０００）で表され、Ｎａ－ＡＬＧと略記することもある。
　アニオン溶液の溶媒は、水、及び緩衝液等の水系溶媒であってもよく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）及びヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）等の有機溶媒であってもよい。アニオン溶液の溶媒は、２種以上の溶媒を混合した混合溶媒であってもよい。混合溶媒は、水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒も含む。
　アニオン溶液の溶媒は、高分子溶液の溶媒と同じであってもよい。また、両溶媒とも水系溶媒であってもよい。高分子溶液（ドープ液）もアニオン溶液（凝固液）も水系溶媒とすることにより、高分子凝集体を水系で成形できる。これにより、得られた高分子凝集体は、生体への適用が可能となり、例えば、現在、手術縫製糸として使用されているシルク糸に換えて使用できるほか、人工血管、人工皮膚、人工骨等への適用が可能となる。
　アニオン溶液は、高分子物質の凝集促進剤を更に含有していてもよい。これにより、高分子凝集体の製造効率を向上させることができる。高分子物質の凝集促進剤の具体例としては、例えば、高分子物質がタンパク質の場合、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋等のアルカリ金属イオンが挙げられる。高分子物質がセルロースの場合、高分子物質の凝集促進剤の具体例として、エタノールが挙げられる。高分子物質が未加硫ゴムの場合、高分子物質の凝集促進剤の具体例として、ジスルフィド化合物が挙げられる。
　アニオン溶液中のゲル形成用アニオンの含有量は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等に応じて適宜設定される。例えば、高分子物質がタンパク質であり、ゲル形成用カチオンがＣａ２＋であり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンである場合、ゲル形成用アニオンの含有量は、０．１～６．０重量％の濃度範囲であることが好ましく、１．０～２．０重量％の濃度範囲であることがより好ましい。
（ゲル形成工程）
　ゲル形成工程では、高分子溶液をアニオン溶液と接触させ、高分子溶液とアニオン溶液との界面にゲルを形成する。高分子溶液とアニオン溶液とを接触させる際、接触面の形状を制御することにより、繊維形状、フィルム形状、中空パイプ形状、及びビーズ形状等の任意の形状のゲルを形成させることができる。
　繊維形状の場合、例えば、高分子溶液を紡糸ノズルからアニオン溶液に連続的に押し出すことで成形できる。フィルム形状の場合、例えば、高分子溶液をスリット孔から連続的にアニオン溶液に押し出すことで成形できる。中空パイプ形状の場合、例えば、高分子溶液を中空スリット孔から、又は二重管を通じて連続的にアニオン溶液に押し出すと共に高分子溶液の内部にも高分子溶液を注入することで成形できる。ビーズ形状の場合、例えば、高分子溶液をノズルから間欠的にアニオン溶液に押し出すことで成形できる。
（凝集工程）
　凝集工程では、ゲルの内部で高分子物質を凝集させる。凝集工程では、ゲルが透析膜のように機能し、例えば、高分子溶液に含まれる余剰のゲル形成用カチオン又は溶解促進剤がゲルを介してアニオン溶液中に抜けていくことによって、高分子物質の凝集が進むことになる。また、例えば、アニオン溶液に含まれる凝集促進剤がゲルを介して高分子溶液中に侵入することによって、高分子物質の凝集が進むことになる。凝集工程では、例えば、アニオン溶液を攪拌してもよい。これによりゲルを介した物質移動の効率が向上するため、製造効率が向上する。
　凝集工程を実施する時間は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等、高分子凝集体の形状及び用途等に応じて適宜設定すればよいが、通常、３分～３時間であり、３分～２時間であることが好ましい。
　凝集工程の実施により、ゲルが鞘状に結合した高分子凝集体が得られる。
（凝集工程２）
　本実施形態に係る製造方法は、凝集工程の後、ゲルが鞘状に結合した高分子凝集体を水等の溶媒に浸漬する工程（「凝集工程２」ともいう。）を更に備えていてもよい。これにより、ゲル内部から溶媒へのゲル形成用カチオン又は溶解促進剤の移動が促進され、より一層高分子凝集体を凝集させることができる。
　凝集工程２を実施する時間は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等、高分子凝集体の形状及び用途等に応じて適宜設定すればよいが、通常、３分～３時間であり、３分～２時間であることが好ましく、３分～１時間であることがより好ましい。
（ゲル除去工程）
　本実施形態に係る製造方法は、凝集工程又は凝集工程２の後、高分子凝集体からゲルを除去する工程（「ゲル除去工程」ともいう。）を更に備えていてもよい。高分子凝集体は、用途に応じて、ゲルが鞘状に結合した高分子凝集体のまま提供されてもよいし、ゲルが不要な場合は、ゲル除去工程によってゲルを除去した高分子凝集体として提供されてもよい。ゲルを除去する方法としては、例えば、ローラーでゲルをつぶす等の機械的手段を用いた除去方法、高分子凝集体は溶解させずゲルだけを溶解する溶液に浸漬する等の化学的方法、又は超音波若しくは熱によりゲルを除去する方法が挙げられる。
　本実施形態に係る製造方法を図１～図６を参照しながら更に説明する。
　図１は、一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図１に示す製造方法では、繊維形状の高分子凝集体が得られる。図１（Ａ）は、高分子溶液（ドープ液）をアニオン溶液（凝固液）中に押し出す工程を示す説明図である。シリンジ９ａにドープ液１を入れ、ドープ液１をノズルから凝固液４に連続的に押し出す。ドープ液１は、ゲル形成用カチオン（例えば、Ｃａ２＋）を含む水溶液に高分子物質（例えば、クモ糸タンパク質由来のポリペプチド）を溶解したものである。凝固液４は、ゲル形成用アニオン（例えば、アルギン酸イオン）を含む水溶液である。凝固液４は容器３に入れられており、ゆっくり撹拌されている。押し出されたドープ液２は凝固液４の中で界面にゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質（例えば、クモ糸タンパク質由来のポリペプチド）が凝集し、高分子凝集体８が形成される。押し出しにより、繊維形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８も繊維形状となる。
　図１（Ｂ）は、ゲルに被覆された高分子凝集体を水に浸漬し、更に凝集させる工程を示す説明図である。水７は容器６に入れられており、ゆっくり攪拌されている。ゲル５に被覆された高分子凝集体８をゲル５ごと水７に浸漬させる。これにより高分子凝集体８は更に凝集する。これを乾燥することで強度の高い糸となる。
　図２は、他の実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図２に示す製造方法では、粒子形状（ビーズ形状）の高分子凝集体が得られる。シリンジ９ａにドープ液１を入れ、ドープ液１をノズルから間欠的に凝固液４に押し出す。押し出されたドープ液２は凝固液４の中で界面にゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質が凝集し、高分子凝集体８が形成される。間欠的な押し出しにより粒子形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８も粒子形状となる。
　図３は、他の実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図３に示す製造方法では、フィルム形状の高分子凝集体が得られる。ドープ液１をスリット孔９ｂから連続的に凝固液４に押し出す。押し出されたドープ液２は、凝固液４の中でゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質が凝集し、高分子凝集体８が形成される。押し出しによりフィルム形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８もフィルム形状となる。
　図４（Ａ）は、他の実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図４（Ｂ）は、図４（Ａ）においてＡで囲った部分の拡大図である。図４（Ａ）に示す製造方法では、中空パイプ形状又は管形状の高分子凝集体が得られる。シリンジ９ａからドープ液１をノズル先端に設けられた環状のスリット孔９ｂを通じて、管状を呈するように連続的に凝固液４に押し出す。押し出されたドープ液２は、凝固液４の中で管状のゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質が凝集し、高分子凝集体８が形成される。押し出しにより管形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８も細径の中空パイプ形状又は管形状となる。
　図５は、一実施形態に係る製造方法における凝固液－ゲル－ドープ液の界面を示す模式断面図である。図５に示す凝固液－ゲル－ドープ液の界面を示す模式断面図１０を使用し、本発明に係る製造方法により高分子凝集体が形成するメカニズムを説明する。図５では、ドープ液としてＣａ（ＳＣＮ）２及びフィブロインを含む高分子溶液を使用し、凝固液としてアルギン酸ナトリウムを含むアニオン溶液を使用している。ゲル層１２は、ドープ液に含まれるＣａ２＋（ゲル形成用カチオン）と凝固液に含まれるアルギン酸イオン（ＡＬＧｎ－：ゲル形成用アニオン）から形成される。すなわち、ドープ液層１１のＣａ２＋－フィブロインと、凝固液層１３のアルギン酸ナトリウム（Ｎａ＋－ＡＬＧｎ－）との間でイオン交換反応が起こり、Ｃａ２＋－ＡＬＧｎ－が生成することでゲル化し、ゲル層１２が形成される。ゲル層１２は、透析膜のように機能すると考えられる。この結果、低分子量のＳＣＮ－、Ｈ２Ｏ及びＮａ＋は、ゲル層１２を介して移動する一方で、高分子であるフィブロインは、ゲル内部に留まることになる。また、ゲル層１２を介したＳＣＮ－の流出により、ゲル内部でのフィブロインの溶解度が低下し、凝集が進むと考えられる。
　図６は、一実施形態に係る製造工程図である。押し出し機２１のノズル２３からＰ方向にドープ液２２を押し出し、押し出されたドープ液２４は凝固槽２５の凝固液２６に浸漬し、生成するゲル２７を剥ぎ落とし、凝集したフィブロイン２８を水槽２９の純水３０に浸漬させてさらに凝集させ、次いで乾燥機３１を通して固化し、巻糸３２とする。このようにして一連の工程でフィブロイン糸を製造できる。フィブロイン糸は未延伸糸のままでも実用的には十分な強度を有するが、さらに延伸してもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドの調製
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
　ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ番号：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成委託した。その結果、配列番号５で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ　Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ　Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
　ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号１４）とＲｅｐ　Ｘｂａ　Ｉプライマー（配列番号１５）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ　Ｉ　Ｒｅｐプライマー（配列番号１６）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１７）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６　ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号６に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号３で示すとおりである。
（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
　上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号３）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号７に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１（以下、単に「ＮＲＳＨ１」ともいう。）のアミノ酸配列は配列番号１で示すとおりである。
＜タンパク質の発現＞
　上記で得られたＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍＬを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。
＜ポリペプチドの調製＞
（Ｉ）遠沈管（５０ｍＬ）にＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍＬを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ－０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ－３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（ＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍＬと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍＬ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ、ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。
（ＩＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物に緩衝液ＡＩを３０ｍＬ加え、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック　ウルトラタラックス」、レベル２）で３分間分散させた後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を除去した。
（ＩＶ）上清を捨てた遠沈管に７．５Ｍの尿素緩衝液Ｉ（７．５Ｍ　尿素、１０ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を加え、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ、ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）（レベル７）で沈殿をよく分散させた。その後、シェイカー（タイテック社製「ＢＲ－４３ＦＬ/ＭＲ」）（２００ｒｐｍ、６０℃）で１２０分間溶解させた。溶解後のタンパク質溶液を上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＮＲＳＨ１（約１０１．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。
２．高分子溶液（ドープ液）の調製
　１Ｍ　Ｃａ（ＳＣＮ）２の純水溶液にクモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）を濃度２０質量％となるよう添加し、シェーカーを使用して３時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は２５℃において２０８８ｃＰ（センチポアズ）であった。
３．アニオン溶液（凝固液）の調製
　アルギン酸ナトリウム（Ｎａ－ＡＬＧ）を１．０質量％含む純水を凝固液とした。
４．高分子凝集体の製造
　図１（Ａ）に示すように、シリンジを使用してドープ液を凝固液に押し出した。押し出しノズルの直径は０．５ｍｍ、押し出し速度は５０ｍＬ／Ｈｒとした。押し出し後、ドープを凝固液に９０分間（ゲル化浴浸漬時間）浸漬し、ゲル内に形成された高分子凝集体を得た。その後、高分子凝集体を被覆するゲルを除去し、糸条のフィブロインを得た。
　製造条件と結果を表１及び図７に示す。図７は、実施例１で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図７（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図７（Ｂ）は、ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。図７（Ｃ）は、図７（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。図７（Ｄ）は、図７（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。
〔実施例２〕
　ドープ液を、１Ｍ　ＣａＣｌ２のＤＭＳＯ溶液にクモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）を濃度２０質量％となるよう添加して調製したこと、及びゲル化浴浸漬時間を３０分間に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、高分子凝集体を製造した。
　製造条件と結果を表１及び図８に示す。図８は、実施例２で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図８（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図８（Ｂ）は、ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。図８（Ｃ）は、図８（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。図８（Ｄ）は、図８（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。
〔実施例３〕
　クモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）に代えて絹糸（セリシン未除去）を使用したこと、ドープ液に含まれるＣａ（ＳＣＮ）２の濃度を５Ｍとしたこと、ゲル化浴浸漬時間を１８０分間に変更したこと、及び凝固液に浸漬した後、ＲＯ水に６０分間（ＲＯ水浸漬時間）浸漬したこと以外は、実施例１と同様にして、高分子凝集体を製造した。
　絹糸（セリシン未除去）は、繭から蚕の蛹を取り出し、繭殻を裁断したものを用いた。
　製造条件と結果を表１及び図９に示す。図９は、実施例３で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図９（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図９（Ｂ）は、図９（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。なお、実施例３の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。
〔実施例４〕
　絹糸（セリシン未除去）に代えて絹糸からセリシンを除去した糸状フィブロンを使用したこと、凝固液中のアルギン酸ナトリウム濃度を２．０質量％に変更したこと、ゲル化浴浸漬時間を３０分間に変更したこと、及びＲＯ水浸漬時間を３０分間に変更したこと以外は、実施例３と同様にして、高分子凝集体を製造した。
　絹糸からセリシンを除去した糸状フィブロインは、以下のようにして調製した。
（１）沸騰した０．５質量％マルセル石鹸水（マルセル石鹸はおろし金で細かくしたものを使用）に、浴比１：１００となるように絹糸を入れ、時々かき混ぜながら３０分間煮た。
（２）石鹸水を捨て、一度ぬるま湯ですすいだ。
（３）沸騰したお湯に、浴比１：１００となるように、（２）においてぬるま湯ですすいだ絹糸を入れ煮た。
（４）お湯を捨てた。
（５）手順（１）～（４）をさらに２回繰り返した（計３回）。
（６）最後に脱水し、６０℃以下で乾燥させた。
　製造条件と結果を表１及び図１０に示す。図１０は、実施例４で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図１０（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。なお、実施例４の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。
〔実施例５〕
　絹糸からセリシンを除去した糸状フィブロインに代えて、再生絹糸を使用したこと以外は、実施例４と同様にして、高分子凝集体を製造した。
　再生絹糸は、以下のようにして調製した。
（１）沸騰した０．５質量％マルセル石鹸水（マルセル石鹸はおろし金で細かくしたものを使用）で絹糸を３０分間煮た。
（２）その後、沸騰したお湯で３０分間煮た。
（３）手順（１）と（２）をさらに２回繰り返した（計３回）。
（４）最後に沸騰したお湯で３０分間煮た。
（５）温度３７℃環境で一晩乾燥させた。
（６）乾燥後の絹の重さを測り、その１０倍量の９Ｍ臭化リチウム水溶液を入れ、４０℃環境で溶解させた。
（７）（６）で得られた溶解液をセルロース透析膜（ＶＩＳＫＡＳＥＳＥＬＥＳ　ＣＯＡＰ製のＳｅａｍｌｅｓｓ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｔｕｂｉｎｇ、３６／３２）に入れ、純水で３～４日間透析した。
（８）透析後の回収液を、フィルター（孔径１９７μｍと５６０μｍ）でろ過し、ゴミを取り除いた。
（９）ＢＣＡ法によりタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度が２質量％以下になるようにＭｉｌｌｉＱで希釈した。
（１０）再生絹糸溶液を、－８０℃環境で凍結乾燥させた。厚さは１～２ｃｍであった。
（１１）凍結乾燥後は４℃で保存した。
　製造条件と結果を表１に示す。なお、実施例５の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。
〔実施例６〕
　クモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）に代えて市販のゼラチン（ＢＩＯＲＡＤ社製　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｕｍｂｅｒ　１７０－６５３７）を使用したこと、及びゲル化浴浸漬時間を３０分間に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、高分子凝集体を製造した。
　製造条件と結果を表１及び図１１に示す。図１１は、実施例６で得られた高分子凝集体（ゼラチンタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図１１（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図１１（Ｂ）は、図１１（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。なお、実施例６の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１及び図７～１１に示すとおり、タンパク質の種類に依存せず、ゲルの内部にタンパク質の凝集体が得られた。また、凝固液へのタンパク質の溶出はほとんど確認されず、凝集体を歩留まりよく得ることができた。
　１…高分子溶液（ドープ液）、２…押し出されたドープ液、３，６…容器、４…アニオン溶液（凝固液）、５…ゲル、７…水、８…高分子凝集体、９ａ…シリンジ、９ｂ…スリット孔、１０…凝固液－ゲル－ドープ液の界面を示す模式断面図、１１…ドープ液層、１２…ゲル層、１３…凝固液層、２１…押し出し機、２２…ドープ液、２３…ノズル、２４…押し出されたドープ液、２５…凝固槽、２６…凝固液、２７…ゲル、２８…凝集したフィブロイン、２９…水槽、３０…純水、３１…乾燥機、３２…巻糸。

Claims (8)

  1. 　高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、前記高分子溶液と前記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程と、
    　前記ゲルの内部で前記高分子物質を凝集させる工程と、を備える、高分子凝集体の製造方法。
  2. 　前記ゲル形成用カチオンが、多価カチオン又は水素イオンから選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記ゲル形成用アニオンが、アルギン酸イオンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記アニオン溶液が、高分子物質の凝集促進剤を更に含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記高分子溶液が、高分子物質の溶解促進剤を更に含有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記高分子溶液及び前記アニオン溶液の溶媒が水である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記高分子物質が、タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　前記タンパク質が、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである、請求項７に記載の製造方法。
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