HU222810B1 - Interleukin-1 inhibitorok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, a szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-vektorok, a vektort tartalmazó gazdasejtek és rekombináns GT-10-il-1i-2A DNS molekula - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát tisztított, az interleukin–1 alfa és interleukin–1béta közül legalább az egyikkel szemben aktív in- terleukin–1-inhibitorok (IL–1i) képezik, továbbá az ezeket kódoló DNS-szekvenciák,a DNS-szekvenciákat tartal- mazó vektorok és rekombináns gazdasejtek.A találmány szerinti megoldás az interleukin–1-gyel kapcsolatosrendellenességek kezelése és megelőzése területén alkalmazható. ŕ

Description

A találmány tárgya interleukin-l-inhibitorok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, a szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-vektorok, a vektort tartalmazó gazdasejtek és rekombináns GT-10-IL-li-2a DNS-molekula.

A) IL-1

Az interleukin-l-ek a fehérjéknek számos sejttípus, köztük monociták és egyes makrofágok által előállított csoportja. Ez a csoport legalább két 17-18 kilodalton molekulatömegű fehérjét foglal magában, amelyek interleukin-1 a és interleukin-1 β néven ismertek. Ezek a fehérjék számos, a gyulladásos folyamatokban és az immunválaszokban szerepet játszó különböző célsejtekre fontos fiziológiás hatást fejtenek ki. Ezek a fehérjék a T-sejtekre komitogének (fitohemagglutininnel), a kötőszöveti sejteket és a porcsejteket látens kollagenáz kiválasztására késztetik, továbbá növelik az endothelialis sejteknek a neutrofil sejtek iránti felületi tapadóerejét. Ezenkívül a hypothalamusra pirogénként hatnak, fokozzák az izomfehérje katabolizmusát, és a hepatocitákat a fehérjék-egy „akut fázis reaktáns” néven ismert csoportjának szintetizálására késztetik. így az interleukin-l-ek (IL-1) nyilvánvalóan fontos szerepet játszanak a szervezet fertőzéssel és sérüléssel szembeni válaszában.

B) Az IL-1 patológiás szerepe

Szokásosan jótékony hatása ellenére azonban ismeretessé váltak olyan körülmények, amelyek mellett az IL-1 káros hatású. Például az IL-1 növelheti a kollagenáz szintjét a gyulladásos ízületben, és a reumatoid arthritis immunpatológiájának mind akut, mind krónikus szakaszában mediátorként vehet részt. Az IL-1 felelős lehet az endothelialis sejtek működésének megváltozásáért, a leukociták és limfociták kemotaxisának irányításával és az ízületi szövetbe való vándorlásuk irányításával, hajszálérburjánzás kiváltásával, és a makrofágoknak az ízületi burokban való felgyűlésének fokozásával a betegség akut fázisa során. A szövetpusztulás fázisában az IL-1 mediátorként vesz részt a kötőszöveti és porcsejtekből felszabaduló enzimek stimulálása révén a szövetkárosodás kiváltásában.

Túlzott IL-1-termelést mutattak ki továbbá pszoriázisban szenvedő betegek bőrében, és magas IL—1szinteket találtak pszoriázisos arthritisben szenvedő betegek ízületi folyadékában. A pszoriázisos arthritisben szenvedő betegek gyulladt ízületében lévő sejtek által szabaddá tett IL-1 szövetpusztulást közvetíthet azáltal, hogy fokozza enzim szabaddá válását más sejtekből. A Reiter-féle szindróma ízületi patológiája hasonló ahhoz, amit pszoriázisos arthritis és reumatoid arthritis esetén észlelünk. A gyulladásos arthritisek e három különböző formájában az IL-1 a szövetpusztulásban mediátorként vesz részt. IL-1 található továbbá az osteoarthritisben szenvedő betegek ízületi folyadékában is. A porcsejtek által felszabadított IL-1 ebben a betegségben részt vesz az ízületi porcok pusztításában.

Az IL-1 növelheti az autoimmun betegségek súlyosságát is. Például szisztémás lupus erithemában szenvedő betegek perifériás vérsejtjeiben csökkent IL-1-termelést észleltek. Továbbá, a B-limfocita-fiinkcióban bekövetkező bizonyos változások kapcsolatosak lehetnek az IL-l-termelés vagy az IL-1 hozzáférhetőségének rendellenességeivel.

Túlzott IL-l-termelést észleltek bőrkeményedéses betegek perifériás monocitáiban, és az IL-l-et a kötőszöveti sejtek kollagéntermelésének fokozása révén a fibrózis egy lehetséges okozójaként említették. A dermatomyositisben bekövetkező szövetkárosodás mechanizmusa ugyancsak kapcsolatos lehet sejt által közvetített immunitással, ezért az IL-1 ebben a patofiziológiás folyamatban mediátorként vehet részt.

Az akut és krónikus szövetközi tüdőbetegségre a tüdő kötőszöveti sejtjeinek fokozott kollagéntermelése jellemző, amit az IL-1 fokozhat. Fokozott kisvérköri nyomás állatmodellen való legújabb vizsgálatai azt mutatják, hogy az IL-1 felelős lehet az endothelialis sejtek változásának kiváltásáért, ami a tüdőartériák szűkülésével jár. Ez a szűkülés az oka a fokozott kisvérköri nyomás bekövetkezésének, és további másodlagos károsodásoknak. így az IL-l-inhibitorok az ilyen tüdőbetegségek kezelésében hasznosak lehetnek.

A legújabb vizsgálatok alapján azt ismertették, hogy az IL-1 képes az inzulintermelésben részt vevő Langerhans-szigetek β-sejtjeinek közvetlen károsítására. Feltételezések szerint az IL-1 sejtkárosító hatása a fiatalkori diabetes mellitus akut fázisának elsődleges eseménye.

Az akut és krónikus glomerulonephrítis számos formájában a monociták és makrofágok vesékbe való beszűrődése jut érvényre. Ezen sejtek IL-1-kibocsátása okozhatja az egyéb gyulladásos sejtek helyi felszaporodását, ami végül a vesékben fibrotikus reakciókhoz és gyulladásos károsodáshoz vezet.

Kimutatták, hogy köszvény és pszeudoköszvény esetén a szövetekben vagy folyadékokban található kristályok közvetlenül fokozzák a makrofágok IL-1-felszabadítását. így ezekben a betegségekben az IL-1 a gyulladásos ciklus fontos mediátora lehet.

Az IL-1 képes a csontok kalciumvesztésének kiváltására, és gyulladásos ízületi betegségeknél előforduló oszteoporózisért felelős lehet.

A pszoriázisban szenvedő betegek keratinocitái nagy mennyiségű IL-l-et szabadítanak fel. Ez a mediátor lehet felelős azért a másodlagos sejtburjánzásért és -felszaporodásért, ami az ebben a betegségben szenvedő betegek bőrén bekövetkezik.

Az IL-1 a fontos endogén pirogének egyike, és felelős lehet bizonyos fertőzéses betegségekben bekövetkező láz jelentős részének kiváltásában, például baktériumok vagy vírusok okozta akut lázas betegségek esetén.

A szarkoidózisra a test sok különböző szervében bekövetkező granulomás elváltozás jellemző. Az IL-1 képesnek bizonyult arra, hogy in vitro granulomaképződést váltson ki, és részt vehet ebben a folyamatban szarkoidózisban szenvedő betegek esetén.

A perifériás monociták fokozott IL-l-termelését figyelték meg mind Crohn-féle kórban, mind fekélyes colitisben. Az IL-1 bélben történő helyi felszabadulása ezen betegségek gyulladásos ciklusa fokozásában fontos mediátor lehet.

HU 222 810 Bl

Egyes limfomákra láz, oszteoporózis, továbbá szekunder arthritis is jellemző. Egyes limfomasejtek esetén in vitro fokozott IL-l-kiválasztást észleltek, ezek felelősek lehetnek ezen rosszindulatú betegség egyes klinikai tüneteiért. Ugyancsak egyes malignans limfociták által termelt IL-1 lehet felelős a leukémiák esetében jelentkező láz, akut fázisbeli válasz és leromlás bekövetkeztéért.

Az agyban lévő asztrociták IL-1-kibocsátását tartják felelősnek a fibrózis kiváltásában, ami érelzáródás folytán az agy károsodását eredményezheti.

C) IL-1-inhibitor alkalmazása

A fenti és egyéb olyan körülmények esetén, amelyekben az IL-1 káros hatást fejt ki, nyilvánvalóan klinikáikig hasznosítható az IL-l-inhibitor hatás. Mivel az IL-1 a T-sejtek komitogénje, központi szerepe van az autoimmun és egyéb immunbetegségek kifejlődésében, így szisztémásán adagolva az IL-1-inhibitorok hasznos immunszupresszív szerek lehetnek. Helyi alkalmazás esetén az ilyen IL-1-inhibitorok a gyulladt ízület és más gyulladásos helyek szövetkárosodásainak megelőzésére szolgálhatnak. Valójában a szövetkárosodások megelőzésére egyes IL- 1-inhibitorok még hatékonyabban alkalmazhatók kollagenázinhibitorokkal együttesen.

Az IL-1 hatásába való terápiás beavatkozás lehetséges a szintézis, a kiválasztás, a célsejt kötődése vagy a fehérjére adott válasz szintjén. Az IL-l-et a monocita/makrofág és egyéb sejtek szintetizálják lipopoliszacharidokra, komplementfragmentumokra és vírusokra adott válaszként. Minden olyan molekula, amely megakadályozza ezeknek az indukálószereknek a termelősejtekhez való kötődését, vagy amelyik ezen sejtek fiziológiájára kifejtett hatásukba beleavatkozik, az IL-1-hatás regulátoraként szolgálhat. Az IL-1 nem egy hagyományos kiválasztórendszer révén választódik ki, mivel az izolált mRNS-ek, amelyek a fehérjéknek legalább két 30 kD-os prekurzorát kódolják, nem tartalmaznak hidrofób szignálszekvenciát. Az aktív feltétjének az inaktív prekurzorból való szabaddá válásához valószínűleg ennek a prekurzomak a proteolízise szükséges. Elméletileg egy olyan inhibitor, amely gátolja az IL-1 vagy IL-l-ek prekurzoraikból való felszabadulását, szabályozhatná az IL-1-hatást. Az IL-1 feltehetően egy klasszikus, receptor által közvetített úton hat a célsejtekre, bár ezt a receptort még nem izolálták. így lehetséges, hogy egy olyan molekula, amely megakadályozza az IL-1-nek a receptoraihoz való kötődését, szabályozhatja az IL-l-hatást is. Továbbá, bár még nem teljesen ismertek a receptorkötődést követő intracelluláris események, lehetséges, hogy léteznek olyan szerek, amelyek megakadályozhatják a sejteknek más receptor által közvetített eseményekre való válaszát, és így gátolhatják az IL-l-hatást. A fentiek folytán feltételeztük, hogy fehéqék és más kis molekulák képesek lehetnek az IL-1 egy vagy több ilyen módon való hatásának gátlására.

Nem várt módon legalább két ilyen IL- 1-gátló fehérjét találtunk, amelyek IL-1-gátló tulajdonságokkal bírnak. Ezeket a molekulákat olyan tisztított formában nyertük ki, amelyek szakembert képessé tesznek arra, hogy meghatározza aminosavszekvenciájukat. Továbbá, egy olyan sejtkészítményt jellemeztünk, amely ezeket a fehérjéket termeli, és egy olyan mRNS-t, amely ezeknek a szintéziséhez vezet. Végül, antiszérumot fejlesztettünk ki, amely megkönnyíti a cDNS expressziós könyvtárak átvizsgálását olyan gének keresésére, amelyek ezeket az inhibitorokat kódolják. Ezek a reagensek együtt lehetővé teszik a klónozandó IL-l-inhibitorokat kódoló cDNS-ek nyerését. Ezek a gének továbbá lehetővé teszik az IL-1 által közvetített patofiziológiás állapotok kezelésére alkalmas gyógyászati készítményekben használható IL-1-inhibitorok nagyléptékű termelését.

A találmány tárgya IL- 1-inhibitorok („IL- li”) általában, és különösen monocitaeredetű IL-1-inhibitorok. A találmány tárgyát képezik még ezen inhibitorok biológiailag aktív analógjai, valamint az inhibitorokat és analógjaikat kódoló DNS-szekvenciák.

A találmány tárgya az IL-Ία vagy IL-Ιβ vagy ezek kombinációja ellen hatásos IL-1-inhibitorok tisztított formában való előállítása. A találmány további célja ezen inhibitorok olyan tiszta formában való előállítása, amely lehetővé teszi aminosavszekvenciájuk megállapítását. A találmány célja továbbá bizonyos IL- 1-inhibitorok aminosavszekvenciájának meghatározása. A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen IL-1-inhibitorok olyan biológiailag aktív analógjainak azonosítása, amelyek azonos vagy fokozott tulajdonságokkal bírnak.

A találmány tárgya továbbá az ismertetett IL-1-inhibitorok termelésére szolgáló rekombináns DNS-rendszer. A találmány tárgya még olyan tisztított IL- 1-inhibitorok, amelyek IL-1 ellen hatásos gyógyászati készítmények hatóanyagaiként használhatók.

A találmány további tárgyai és előnyei a leírás további részében találhatók, vagy abból nyilvánvalóvá válnak, vagy a találmány gyakorlatából ismerhetők meg.

A találmány céljának elérése érdekében olyan IL-1inhibitorokat ismertetünk, amelyek IL-1 ellen gátló hatást fejtenek ki. Az előnyös inhibitorokat tisztított formában izoláltuk monocitakondicionált tápközegből, ahol a monocitákat IgG-bevonatú lemezeken tenyésztettük.

A találmány szerinti előnyös inhibitorok az 1, 2 és 3 inhibitorok. Az 1 és 2 inhibitorok olyan fehéijék, amelyek nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid-gélelektroforézis (SDS-PAGE) végzésekor a 22-23 kDa fehérjéknek jellemző helyzetig futnak, és Mono Q FPLC oszlopról megszabott körülmények között 52 mmol/l-es, illetve 60 mmol/l-es nátrium-kloriddal eluálhatók. A 3 inhibitor SDS-PAGE elvégzésekor egy 20 kDa fehérjének jellemző helyig fut, és Mono Q FPLC oszlopról megszabott körülmények között 48 mmol/l-es nátriumkloriddal eluálható. A találmány céljának elérésére a találmány magában foglal egy olyan gyógyászati készítményt is, amely legalább egy, a találmány szerinti IL-l-inhibitort vagy biológiailag aktív analógját tartalmazza.

A találmány céljával összhangban a találmány tárgyát képezi az IL-1-inhibitorok és analógjaik létrehozására alkalmas rekombináns DNS-rendszer. Ennek a rendszernek egy előnyös megvalósítási formája IL-13

HU 222 810 Bl inhibitor kódolására alkalmas legalább egy cDNS-klónt vagy szintetikus ekvivalensét és a fenti IL-l-inhibitorok kifejezésére alkalmas expressziós rendszert alkotó vektorokat és sejteket tartalmaz. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti cDNS-klónok azonosítására alkalmas antiszérumok. Az IL-1-inhibitorok termelésére alkalmas expressziós rendszerek, amelyek a fenti cDNSklónokat, analógjaikat vagy más, a fenti inhibitorokat kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazzák, ugyancsak a találmány tárgyát képezik.

Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetését adjuk. Az 1A. és IB. ábrákon két, metabolikusan ³⁵S-metioninnal jelzett monocita felülúszó Mono Q oszlopon való kromatografálásával kapott proteinprofilt ábrázoljuk. Az 1A. ábrán bemutatott profilt IgG-bevonatú Petri-csészén tenyésztett sejtek felülúszójából, az IB. ábrán szereplőt magzati borjúszérummal bevont Petri-csészéken tenyésztett sejtek felülúszójából nyertük.

A 2A. ábrán az 1A. és IB. ábrákon bemutatott tartományokon lévő frakciókat tartalmazó gél ezüsttel festett képét mutatjuk be.

A 2B. ábra a 2A. ábrán látható gél autoradiogramja.

A 3A., 3B. és 3C. ábrák az 1. példa szerint előállított tisztított IL-li adatait tartalmazzák. A 3A. ábra a kromatográfiás adatokat tartalmazza, ezekre ráillesztettük a radioaktivitásmintát. A 3B. ábra a 3A. ábrán megjelölt frakciókat mutatja a gélen futtatott minta ezüsttel festett formájában. A 3C. ábra a 3B. ábrán bemutatott gél autoradiogramja.

A 4A. ábrán a Mono Q oszlopon tisztított IL-la Superose 12 gélen gélszűréssel kapott frakcióit mutatjuk be, a 4B. ábra a 4A. ábra jelölt 37-38. frakcióinak azonos körülmények között ismételt gélszűrésével kapott frakciókat mutatja.

Az 5A. és 5B. ábrákon egérantiszérumok Westemanalízisének eredményeit mutatjuk be. Az 5A. ábra az immunogén (Mono Q oszlopon tisztított IL-li) normál egérantiszérum (NMS) és az 5 egér antiszérumának elegye alkalmazásával történő elemzésének eredményét mutatja. Az 5B. ábrán az 5 egér (A-E) vérének külön alkalmazásával történt elemzés eredménye látható.

A 6. ábrán a pSVXVPL2IL-li plazmidszerkezetét mutatjuk be.

A 7. ábrán a pMK-SGE:IL-li plazmidszerkezetét mutatjuk be.

A 8A-D. ábrákon az IL-li-a-ra vonatkozó jellemzőket mutatunk be. A 8A. és 8B. ábrákon kromatográfiás eredmények láthatók, a 8C. ábrán a 8B. ábrán látható frakcióknak megfelelő, gélen futtatott, ezüsttel színezett minta látható. A 8D. ábra az előbbi autoradiogramja.

A 9A. és 9B. ábrák az IL-Ιί-β-ra vonatkozó eredményeket tartalmaznak. A 9A. ábrán kromatográfiás eredményeinket mutatjuk be, a 9B. ábrán az SDS-PAGE eredménye látható.

A 10. ábrán az IL-li-α peptid elválasztásának eredményét mutatjuk be.

A 11. ábrán az IL—li—β peptid elválasztásának eredményét mutatjuk be.

A 12A. ábrán a GT10-IL1Í-2A a 6. példa szerint EcoRI-gyel emésztett mintájának gélen való elektroforézisével kapott minta fényképét mutatjuk be.

A 12B. ábrán a 12A. ábrán bemutatott gél Southem-blot-módszerrel kapott autoradiogramját mutatjuk be.

A 13. ábrán a lambda GT10-IL1Í-2A proteint kódoló tartománya DNS-szekvenciájának egy részét, valamint a várható aminosavszekvenciát mutatjuk be a 6. példa szerint.

A 14. ábrán a GT10-IL1Í-2A nukleotidszekvenciáját mutatjuk be.

A 15. ábrán egy peptidet mutatunk be, amely magában foglal többek között egy IL-li szekvenciát és egy szekréciós vezetőszekvenciát.

A következőkben a találmány előnyös megvalósítási módját írjuk le. Ez a leírás a példákkal együtt a találmány lényegének bemutatására szolgál.

A) Humán monocitákból származó inhibitor

Amint azt az előzőekben már ismertettük, a találmány tárgya tisztított formában elkülönített IL-1-inhibitorok. Előnyösen az IL-l-inhibitorok humán monocitákkal kondicionált tápközegből származóak, ahol a monocitákat IgG-bevonatú edényeken tenyésztjük. Ezenkívül a találmány magában foglal bármilyen lényegében tisztított IL-l-inhibitort, amely biológiailag ekvivalens a humánmonocita-tartalmú tápközegből származó inhibitorral.

A „biológiailag ekvivalens” megjelölésen a leírásban és az igénypontokban is azt értjük, hogy az IL-1inhibitor-kompozíció hasonló módon képes meggátolni az IL-1 hatását, mint a monocitákból izolált natív IL-l-inhibitor, de a hatás mértéke nem szükségszerűen azonos. A „lényegében homológ” megjelölésen a leírásban és az igénypontokban a monocitákkal kondicionált tápközegből származó natív IL-l-inhibitorhoz való olyan mértékű homológiát értünk, amely meghaladja bármely előzőekben ismertetett IL-1-inhibitor homológiáját. Előnyösen a homológia mértéke 70% fölötti, még előnyösebben 80% fölötti, ennél is előnyösebben 90% fölötti. Különösen előnyös az inhibitoroknak az a köre, amely a 95%-ot meghaladó mérték4

I

HU 222 810 Β1 ben homológ a natív inhibitorral. A homológia százalékos értékét Dayhoff, M. D. módszerével számítjuk ki [Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 124 (1972), National Biochemical Research Foundation Washington, D. C.], amelyet leírásunka referenciaként 5 beépítünk, azaz azon két szekvencia közül a kisebb aminosav egységeinek számát adjuk meg, amely a szekvenciában azonos aminosavegységeket tartalmaz, ha az összehasonlítást olyan aminosavláncon végezzük, amely 100 aminosavegységre 4 megszakítással 10 bír.

A találmány szerinti IL-1-inhibitorok monocitakondicionált tápközegből származnak, és első ízben kerültek tisztított formában elkülönítésre. Az IL-l-inhibitorok vonatkozásában „tiszta forma” vagy „tisztított fór- 15 ma” megjelölésen azt értjük, hogy a készítmény lényegében mentes más olyan fehéijéktől, amelyek nem IL- 1-inhibitor fehérjék. Előnyösen a találmány szerinti IL-l-inhibitorok legalább 90% tisztaságúak, még előnyösebben 95%-os tisztaságúak. 20

A példában leírt eljárásokkal legalább háromféle tisztított IL-l-inhibitort izoláltunk. Ezek az 1 inhibitor, a 2 inhibitor és a 3 inhibitor. Az 1 inhibitor SDS-PAGE szerint 22-23 kDa molekulatömegű, izoelektromos pontja mintegy 4,8, és Mono Q FPLC ősz- 25 lopról pH=7,6-os trisz-pufferben mintegy 52 mmol/1es nátrium-klorid-oldattal eluálható. A 2 inhibitor 22-23 kDa molekulatömegű fehérje, pl=4,8, Mono Q oszlopról 60 mmol/l-es nátrium-klorid-oldattal eluálható. A 3 inhibitor 20 kDa molekulatömegű fehérje, a 30 Mono Q oszlopról 48 mmol/l-es nátrium-klorid-oldattal eluálható. Az 1, 2 és 3 inhibitorok immunológiai és funkcionális szempontból hasonlóak. Ezeket az inhibitorokat tisztított formában előállítottuk, és így aminosavszekvenciájukat is meg tudtuk határozni. A tiszti- 35 tott inhibitorokat az ABI fehérjeanalizátor (ABI Protein Sequencer) és az ehhez adott technikai módszertani leírás alkalmazásával vizsgálva az aminosavszekvencia lényeges részét meghatároztuk.

A 3. példában ismertetjük a három IL-1-inhibitor, nevezetesen az IL-li-X, IL-li-α és IL-li-β aminosavszekvenciájára vonatkozó adatokat.

Felismertünk és előállítottunk legalább egy, egy IL-1-inhibitor ellen termelődő antitestet is. Más, azonos vagy különböző IL-1-inhibitorok ellen ható poliklonális és monoklonális antitestek is előállíthatók szakember számára ismert módon. Egy adott poliklonális antitest előállítását a 4. példában ismertetjük.

B) Rekombináns inhibitor

1. Általános ismertetés

Rekombináns DNS-eljárást ismertetünk IL-1-inhibitor előállítására. A találmány egy megvalósítási formája szerint az aktív funkciós helyek biológiailag ekvivalensek az emberből izolált natív IL-1 megfelelő funkciós helyeivel. Az IL-l-inhibitorok előállításának irányítására természetes vagy szintetikus DNS-szekvencia használható. Az eljárás a következő műveleteket foglalja magában:

a) olyan DNS-szekvencia előállítása, amely képes a gazdasejtet úgy irányítani, hogy az IL-1-inhibitor-aktivitással bíró fehérjét termeljen;

b) a DNS-szekvenciának olyan vektorba való klónozása, amely bevihető egy gazdasejtbe és ott szaporítható, a vektornak olyan operációs elemeket kell tartalmaznia, amelyek a DNS-szekvencia kifejezését lehetővé teszik;

c) a szintetikus DNS-szekvenciát és az operációs elemeket tartalmazó vektor bevitele olyan gazdasejtbe, amely képes az IL-l-inhibitort kódoló DNS kifejezésére;

d) a gazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a vektor megsokszorozódását és az inhibitor kifejeződését;

e) az inhibitor elkülönítése és

f) annak lehetővé tétele, hogy az inhibitor aktív tercier szerkezetet vegyen fel, miáltal IL-l-inhibitor-aktivitással fog rendelkezni.

A találmány oltalmi körébe tartozik az alábbi szekvenciájú fehérje is:

M

E

I

X

R

G

L

R

s

H L

I

T

L

L

L

F

L

F H

30

40

S

E

T

I

X

Z

P

S

G

R K

S

S

K

M

Q

A

F

R I

50

60

W

D

V

N

Q

K

T

F

Y

L R

N

N

Q

L

V

A

G

Y L

70

80

Q

G

P

N

V

N

L

E

E

K. I

D

V

V

P

I

E

P

H A

90

100

L

F

L

G

I

H

G

G

K

Μ X

L

S

X

V

K

S

G

D E

110

120

T

R

L

Q

L

E

A

V

N

I T

D

L

s

E

N

R

K.

Q D

130

140

K

R

F

A

F

I

R

S

D

S G

P

T

T

S

F

E

s

A A

150

160

X

P

G

W

F

L

X

T

A

Μ E

A

D

Q

P

V

S

L

T N

170

M

P

D

E

G

V

M

V

T

K F

Y

F

Q

E

D

E

ahol X jelentése risztéin, szerin vagy alanin, és Z jelentése arginin vagy prolin.

HU 222 810 Bl

2. DNS-szekvenciák

A találmány szerinti eljárásban való használatra szánt DNS-szekvenciákat az 5. és 6. példákban ismertetjük. Ezek a szekvenciák szintetikus és természetes DNS-szekvenciákat tartalmaznak. Természetes szekvenciák továbbá tartalmaznak cDNS- vagy genom-DNSszegmenseket.

A 6. példa szerint olyan DNS molekuláris kiónját állítjuk elő, amely az 1-3. példák szerint izolált fehérjével azonos fehérje kódolására képes. A 6. példa szerinti eljárásban egy GT10-IL1Í-2A plakkot izolálunk a GT-10 könyvtárból. A plakkban lévő fágot tenyésztjük, a DNS-t elkülönítjük és EcoRI-gyel emésztjük. Az 1850 bázispárból álló EcoRI-fragmens hordozza az IL—1 -inhibitor kódolására alkalmas szekvenciát. A 13. ábrán bemutatjuk az EcoRI-fragmens részleges DNS-szekvenciáját.

A leírásban adott kitanítás és az ismert eljárások alkalmazásával szakember más szintetikus polinukleotidszekvenciák előállítására is képes. A polinukleotidszintézis jelenlegi állását bemutató munkákként említjük a következőket:

Matteucci, M. D. és Caruthers, Μ. H.; J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981) és Beaucage S. L. és Caruthers, Μ. H.; Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981), valamint az ABI oligonukleotidszintetizátorhoz adott használati utasításokat, amelyek mindegyikét leírásunkba referenciaként építjük be.

Ezek a szintetikus szekvenciák lehetnek a következőkben részletesebben ismertetésre kerülő természetes szekvenciákkal azonosak, vagy tartalmazhatnak az abban lévőtől eltérő nukleotidokat. A találmány egy olyan megvalósítási módjában, amelyben olyan szintetikus szekvenciákat alkalmazunk, amelyek a természetes DNS-szekvenciában jelen lévőtől eltérő nukleotidokat tartalmaznak, úgy választjuk meg ezeket a különböző szekvenciákat, hogy azok még a monocitákból izolált IL— li primer szerkezetével egyező primer szerkezetű polipeptidet kódoljanak. Egy másik megvalósítási mód szerint a természetestől eltérő nukleotidokat tartalmazó szintetikus szekvencia olyan polipeptidet kódol, amelynek biológiai aktivitása azonos az IL— li itt leírt aktivitásával.

Továbbá a DNS-szekvencia lehet a természetes szekvenciának egy töredéke, azaz a természetben előforduló polinukleotid egy töredéke, az ilyen töredék elkülönítését és tisztítását sem valósították meg ez ideig. Egy megvalósítási mód szerint a DNS-szekvencia a cDNSkönyvtárból izolált restrikciós fragmens.

Egy további megvalósítási mód szerint a DNS-szekvenciát humán genomkönyvtárból izoláljuk. Ilyen, ebben a megvalósítási módban alkalmazható könyvtárat ismertetnek például Lawn és munkatársai [Cell 15, 1157-1174 (1978)], munkájukat leírásunkba referenciaként építjük be.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a természetes DNS-szekvenciát az alábbi lépésekből álló eljárással állítjuk elő:

a) humán cDNS-könyvtár készítése olyan sejtekből, előnyösen monocitákból, amelyek képesek az IL-1-inhibitornak egy vektorba, majd egy sejtbe való bevitelére, amely utóbbiban a cDNS sokszorozódásra és részben vagy teljesen való kifejeződésre képes;

b) a humán DNS-könyvtár vizsgálata legalább egy olyan mintával, amely képes az IL-1-inhibitor génhez vagy fehérjéjéhez kötődni;

c) legalább egy olyan klón azonosítása, amely az inhibitor kódolására képes gént tartalmaz, az azonosítás a kiónnak azon a képességén alapszik, hogy a génnek vagy fehéijetermékének legalább egy mintáját képes megkötni;

d) a kiválasztott kiónból vagy kiónokból az inhibitor kódolására képes gén vagy génrészlet elkülönítése;

e) a génnek vagy megfelelő részletének olyan operációs elemekhez való kötése, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a gén a gazdasejtbe bevihető legyen, és ott kifejeződjön.

Az eljárásban alkalmazható DNS-szekvencia is azonosítható és elkülöníthető az alábbi műveleti sor segítségével :

a) humán genom-DNS-könyvtár készítése, előnyösen recArecBC E. coli gazdaszervezetben szaporítva;

b) a humán genom-DNS-könyvtár vizsgálata legalább egy olyan mintával, amely egy IL-1-inhibitor génhez vagy annak fehérjetermékéhez képes kötődni;

c) legalább egy olyan klón azonosítása, amely az inhibitor kódolására alkalmas gént tartalmazza, az azonosítás a kiónnak azon a képességén alapszik, hogy a gén vagy fehéijeterméke legalább egy mintájához kötődik;

d) az inhibitort kódoló gén izolálása az azonosított kiónból (klónokból); és

e) a génnek vagy megfelelő fragmensének olyan operációs elemekhez való kötése, amelyek a génnek a gazdasejtbe való beviteléhez és kifejeződéséhez szükségesek.

A fenti eljáráshoz alkalmas természetes DNS-szekvencia izolálásánál előnyös a két restrikciós hely olyan meghatározása, hogy azok a megfelelő génen vagy génrészleten belül, annak végéhez legközelebbi részén helyezkedjenek el.

Ezután a megfelelő gént tartalmazó DNS-szegmenst megfelelő restrikciós endonukleázok alkalmazásával eltávolítjuk a maradék genomanyágtól. A kimetszést követően a DNS-szekvencia 3’ és 5’ végeit és minden exonkapcsolódást helyreállítunk, hogy olyan megfelelő DNS-szekvenciát nyerjünk, amely az IL-1-inhibitor fehérje N- és C-terminálisát kódolni képes, és képes a DNS-szekvenciának operációs elemeihez való kapcsolására.

3. Vektorok

a) Mikroorganizmusok, különösen E. coli

A találmány szerinti eljárásban használható vektorok közé tartozik bármely olyan vektor, amelybe egy, az előzőekben ismertetett DNS-szekvencia és előnyös vagy kívánt operációs elemei beépíthetők, és amely vektor ezt követően egy gazdasejtbe bevihető, és ebben a sejtben szaporodik. Előnyösek azok a vektorok, amelyeknek restrikciós helyei jól dokumentáltak, és amelyek a DNS-szekvencia transzkripciójához előnyös vagy szükséges operációs elemeket tartalmazzák. Le6

HU 222 810 Β1 hetnek a találmánynak azonban olyan megvalósítási módjai is, amelyekben jelenleg még nem ismert olyan vektorokat alkalmaznak, amelyek egy vagy több itt leírt cDNS-szekvenciát tartalmaznak. Különösen előnyös azonban, ha ezen vektorok mindegyike rendelkezik az alábbi jellemzők közül néhánnyal, vagy ezek mindegyikével:

(1) rendelkezik a gazdaszervezet szekvenciáinak egy minimális számával; (2) képes a kívánt gazdaszervezetben való stabil fennmaradásra és szaporodásra; (3) képes arra, hogy a kívánt gazdaszervezetben nagy számban legyen jelen; (4) szabályozható promoterrel bír, amelyik úgy helyezkedik el, hogy elősegíti az érdeklődésre számot tartó gén transzkripcióját; (5) legalább egy olyan marker DNS-szekvenciája van, amely a plazmádnak egy, a DNS-szekvencia beiktatási helyétől eltérő részén egy megválasztható sajátosságot kódol; és (6) a transzkripció lezárására képes DNS-szekvencia.

A találmány szerinti, a DNS-szekvenciát tartalmazó és annak kifejezésére képes klónozóvektorok egy előnyös megvalósítási módban különböző operációs elemeket tartalmaznak. Ezek az „operációs elemek” legalább egy promotert, legalább egy Shine-Dalgamo-szekvenciát és iniciátorkodont, továbbá legalább egy terminátorkodont tartalmaznak. Előnyösen ezen „operációs elemek” magukban foglalnak még legalább egy operátort, legalább egy vezetőszekvenciát a fehérjéknek az intracelluláris térből való kivitelére, legalább egy, egy regulátorproteinre vonatkozó gént, és bármely más olyan DNS-szekvenciát, amely a vektor-DNS megfelelő transzkripciójához és ezt követő transzlációjához szükséges vagy előnyös.

Ezen operációs elemek közül bizonyosak jelen lehetnek a találmány szerinti előnyös vektorok mindegyikében. Bármely további szükséges operációs elem hozzáadható ezekhez a vektorokhoz szakember számára ismert módon, különösen a leírásban adott kitanítás figyelembevételével.

A gyakorlatban ezen vektorok előállítása olyan módon lehetséges, ami lehetővé teszi, hogy könnyen elkülöníthetők, összeállíthatók és felcserélhetők legyenek. Ez lehetővé teszi számos funkcionális gén összeállítását ezen elemek és a DNS-szekvenciák kódolórégióinak kombinálásával. Továbbá, ezen elemek közül számos több mint egy gazdaszervezetben alkalmazható. Továbbá, ezen vektorok bizonyos előnyös megvalósítási mód mellett olyan DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik regulátorként („operátorként”) való működésüket, más DNS-szekvenciák regulátorfehétjék kódolására képesek.

i) Regulatorok

Ezen regulátorok az egyik megvalósítási mód szerint bizonyos környezeti feltételek mellett megakadályozzák a DNS-szekvencia kifejeződését, míg más környezeti körülmények mellett lehetővé teszik a DNSszekvencia transzkripcióját, és az ezt követően a DNS által kódolt fehérje kifejeződését. Különösen előnyös, ha a regulátorszegmensek a vektorba úgy iktatódnak be, hogy a DNS-szekvencia kifejeződése nem következik be, vagy rendkívül csökkent mértékben következik be akkor, ha például nincs jelen izopropil-tio-P-Dgalaktozid. Ebben az esetben a DNS-szekvenciát tartalmazó transzformált mikroorganizmus kívánt sűrűségig szaporítható az IL-li kifejeződésének megkezdődését megelőzően. Ebben a megvalósítási módban a kívánt fehérje kifejeződését úgy indítjuk meg, hogy a kívánt sűrűség elérését követően olyan anyagot adunk a mikrobiális környezetbe, amely a DNS-szekvencia kifejeződését váltja ki.

ii) Promoterek

Az expressziós vektoroknak olyan promotereket kell tartalmazniuk, amelyeket a gazdaszervezet a saját fehérjéinek kifejezésére használhat. Bár általánosan használt a laktózpromoter-rendszer, más mikrobiális promotereket is izoláltak és jellemeztek már, szakember ezeket is alkalmazhatja a rekombináns IL-li kifejezésére.

iii) Transzkripcióterminátor

A transzkripcióterminátorok a vektor stabilizálására szolgálnak. Különösen a Rosenberg, M. és Court J. [Ann. Rév. Génét. 13, 319-353 (1979)] által leírt szekvenciák alkalmasak a találmány szerinti eljárásban, ezeket leírásunkba referenciaként építjük be.

iv) Nem transzlatált szekvencia

Megjegyezzük, hogy egy előnyös megvalósítási formában kívánatos lehet a kódolórégió 3’ vagy 5’ végének olyan helyreállítása, hogy nem átfordított 3’ vagy 5’ szekvenciák beépülése legyen lehetséges a géntranszkriptumba. Az ilyen nem átfordított szekvenciák közé tartoznak azok, amelyek az mRNS-t stabilizálják, ezeket Schmeissner, U., McKenney, K. Rosenberg, M. és Court, D. ismertetik a J. Mól. Bioi. 176, 39-53 (1984) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be.

v) Riboszómakötö helyek

Az idegen fehérjék mikrobiális kifejezéséhez néhány operációs elem szükséges, amelyek közé tartoznak - bár nem ezekre korlátozottak - a riboszómakötö helyek. Egy riboszómakötö hely egy olyan szekvencia, amelyet egy riboszóma felismer, és a fehérjeszintézis kezdeteként ehhez kötődik; ezt Gold, L. és munkatársai [Ann. Rév. Microbio. 35, 557-580] és Marquis, D. M. és munkatársai [Gene 42, 175-183 (1986)] ismertetik, mindkét szakirodalmi helyet referenciaként építjük be leírásunkba. Egy előnyös riboszómakötö hely a következő: GAGGCGCAAAAA (ATG).

vi) Vezetőszekvencia és transzlációkapcsoló

Előnyös továbbá, ha egy megfelelő kiválasztó vezető (szignál)-szekvenciát kódoló DNS van jelen a DNSszekvencia 5’ végén, amint azt Watson, Μ. E.; [Nucleic Acids Rés. 12, 5145-5163] ismerteti, ha a fehérjét a citoplazmából kell kiválasztani. Watson előbbi munkáját referenciaként beépítjük leírásunkba. A vezetőszekvenciát kódoló DNS-nek olyan helyzetben kell lennie, amelyik lehetővé teszi egy olyan fúziós fehérje képződését, amelyben a vezetőszekvencia közvetlenül szomszédos és kovalensen kötött az inhibitorhoz, azaz a két DNS kódolószekvencia között nem lehet semmiféle transzkripciós vagy transzlációs terminációs jel. A vezetőszekvencia jelenléte az alábbi okok közül egy vagy több miatt

HU 222 810 Bl kívánatos. Először is, a vezetőszekvencia jelenléte megkönnyítheti a gazdaszervezet számára az IL- li termelését. Közelebbről, a vezetőszekvencia irányíthatja a kezdeti transzlációs terméknek egy vezetőpeptidázzal való lehasítását, hogy a vezetőszekvenciát eltávolítsa, és visszamaradjon a potenciális proteinaktivitással bíró aminosavszekvencia. Másodszor, a szignálszekvencia jelenléte megkönnyítheti az IL—li tisztítását azáltal, hogy a fehérjét hozzásegíti a sejtcitoplazma elhagyásához. Egyes gazda-mikroorganizmusfajok esetén a megfelelő vezetőszekvencia lehetővé teszi a teljes kész fehérjének a periplazmatikus térbe való kivitelét, ilyen eset áll fenn például az E. coli esetén. Bizonyos E. coli, Saccharomyces, Bacillus és Pseudomonas törzsek esetén a megfelelő vezetőszekvencia lehetővé teszi a fehérjének a sejtmembránon át az extracelluláris közegbe való transzportját. Ebben az esetben a fehérje az extracelluláris proteintől megtisztítható. Harmadszor, egyes, a találmány szerint előállított fehérjék esetében a vezetőszekvencia jelenléte szükséges lehet ahhoz, hogy a kész fehéijét egy olyan környezetben helyezzük el, ahol az hajtogatódhat aktív szerkezetének elnyerésére, amely szerkezet a megfelelő proteinaktivitással bír.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában egy további DNS-szekvenciát helyezünk el közvetlenül azt a DNS-szekvenciát megelőzően, amely az IL-l-inhibitort kódolja. Ez a további DNS-szekvencia transzlációs kapcsolóként való működésre képes, azaz ez egy olyan DNS-szekvencia, amely egy olyan RNS-t kódol, amely riboszómák elhelyezésére képes közvetlenül a vele határos RNS-inhibitor riboszómakötési helye mellett. A találmány egy megvalósítási módjában a transzlációs kapcsoló a TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG DNS-szekvencia alkalmazásával, a transzlációs kapcsolók terén jártas szakember számára ismert eljárásokkal állítható elő.

vii) Transzlációs terminátor

A transzlációs terminátorok szerepe az mRNStranszláció megállítása. Ezek lehetnek természetesek, amint azt Kohli, J. [Mól. Gén. Génét.; 182, 430-439] ismerteti, vagy szintetikusak, amint azt Pettersson, R. F.; [Gene 24, 15-27 (1983)] leírja, mindkét hivatkozást referenciaként építjük be leírásunkba.

viii) Szelekciós markerek

Előnyös továbbá, ha a klónozóvektor egy szelekciós markert tartalmaz, például egy gyógyszerrezisztencia-markert, vagy egyéb más markert, amelynek folytán a gazdamikroorganizmus egy szelektálható sajátosságot fejez ki. A találmány egyik megvalósítási módjában a vektorba ampicillinrezisztencia-gént viszünk be, míg más plazmidokba tetraciklinrezisztencia- vagy kloramfenicolrezisztencia-gént viszünk be.

Az ilyen gyógyszerrezisztencia- vagy más kiválasztó marker részben arra szolgál, hogy megkönnyítse a transzformánsok szelekcióját. Továbbá, az ilyen kiválasztó marker jelenléte a klónozóvektorban hasznos lehet a szennyező mikroorganizmusoknak a tápközegben való szaporodásának megakadályozására. Ebben a megvalósítási formában a transzformált gazdamikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyeljük a mikroorganizmusnak olyan körülmények között történő tenyésztésével, amelyek az indukált fenotípus életben maradásához szükségesek.

Az előzőekben említett operációs elemeket szakember rutinszerűen választhatja ki az előzőekben ismertetett szakirodalom és a leírásban szereplő kitanítás alapján. Az ilyen operációs elemek általános példáit ismertetik a B. Lewin; Genes, Wiley & Sons, New York (1983) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Az előzőekben ismertetett vektorokon számos különböző megfelelő operációs elem található, ezek megismerhetők az előzőekben említett vektorok alapvető jellemzőivel foglalkozó szakirodalom áttekintése révén.

Úgy véljük, hogy az ilyen vektorok összeállítása a szakembertől elvárható kötelességek és feladatok körén belül esik, így szakember ennek megvalósítására túlzott kísérletek nélkül képes. Például, megfelelő klónozóvektorokba hasonló DNS-szekvenciákat ligálunk, mint amilyeneket Maniatis és munkatársai [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984)] leírnak, közleményüket leírásunkba referenciaként építjük be.

A találmány szerint összeállított klónozóvektorok tekintetében megjegyezzük továbbá, hogy minden egyes vektorba a DNS-szekvenciának és az azt kísérő operációs elemeknek több másolata építhető be. Az egy vektorba beépíthető DNS-szekvencia több másolatának számát csak a kapott vektornak a méretéből adódó az a képessége korlátozza, hogy a megfelelő gazdasejtbe bevihető legyen, és ott szaporodásra és transzkripcióra képes legyen.

ó) Egyéb mikroorganizmusok

A találmány körébe tartoznak más, az E. colitól eltérő mikroorganizmusokba bevihető vektorok is. Ilyen vektorokat ismertetünk az I. táblázatban. Az alábbiakban néhány előnyös vektort ismertetünk.

1. táblázat

Gazda- szervezetek	Szabályozott promoterek	Inducer	Transzkripció- terminátor	MRNS- stabilizálás	Transzkripciós kezdőhely és szignálpcptid	Marker	RS- kötési hely
E. coli	Lac1, Tac2 lambda pL Trp5	IPTG emelt hőmérséklet IAA- adagolás vagy tripto- fánkiürítés	rmB6 rmC7	ompA8 lambda int9 trp10	bla ompA12 phoS	ampicillin14 tetraciklin14·15 kloram- fenicol16

HU 222 810 Bl

I. táblázat (folytatás)

Gazda- szervezetek	Szabályozott promoterek	Inducer	Transzkripció- terminátor	MRNS- stabilizálás	Transzkripciós kezdőhely és szignálpeptid	Marker	RS- kötési hely
Bacillus	*a-amiláz17 *szubtilizin18 *p-4319 spac-I26	IPTG	E. coli rm rmBT.T20		B. ami neutrális proteáz21 B. ami a-amiláz22 B. subt. szubtilizin23	Kan'24 Camr25	B. ami neutrális proteáz B. ami aamiláz22
Pseudomonas	Trp27 (E. coli) Lac (E. coli) Tac (E. coli)	IAAadagolás vagy triptofánkiürítés IPTG			foszfolipáz C28 exotoxin A29	szulfonamid30 sztrepto- micin30	Ttp (E. coli)
	Gál l3', 1032 Adh I33 II34 Pho5	Glükózkiürítés és galaktóz-glükóz kiürítés foszfátkiürítés	Cyc 1 Una a-faktor Sac 2		Invertáz36 Savas foszfatáz36 a-faktor	Ura 337 Leu 238 His 3 Táp 1

1. Backman, K. Ptasnne, M. és Gilbert, W.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4178 (1976).

2. de Boer, H. A., Comstock, L. J., és Vasser, M.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983).

3. Shimatake, H. és Rosenberg, M.; Natúré 292, 128-132 (1981).

4. Derom. C., Gheysen, D. és Fiers, W.; Gene 17, 15-51 (1982).

5. Hallawell R. A. és Entage, S.; Gene 9, 27-47 (1980).

6. Grosius, J., Dűli. T. J., Sleeter, D. D., és Noller, H. F.; J. Mól. Bioi. 148 107-127 (1981).

7. Normanly, J., Ogden, R. C., Horváth, S. J. és Abelson, J.; Natúré 321, 213-219 (1986).

8. Belasco, J. G., Nilsson, G., von Gabain, A. és Conen, S. N.; Cell 46, 245-251 (1986).

9. Schmelssner, W., McKenney, K., Rosenberg M. és Court, D.; J. Mól. Bioi. 176, 39-53 (1984).

10. Mott. J. E., Galloway, J. L. és Platt, T.; EMBO J. 4 1887-1891 (1985).

11. Koshlés, D. és Botstein, D.; Cell 20, 749-760 (1980).

12. Movva. N. R., Kakamura, K. és Inouye, M.; J. Mól. Bioi. 143, 317-328 (1980).

13. Surin, Β. P., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Shaw, D. C., Cox, G. B. és Rosenberg, M.; J. Bacteriol. 157, 772-778 (1984).

14. Sutcliffe, J. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737-3741 (1978).

15. Peden, K. W. C.; Gene 22, 277-280 (1983).

16. Alton, N. K. és Vapnek, D.; Natúré 282, 864-869 (1979).

17. Yang, M., Galizzi, A., és Henner, D.; Nuc. Acids Rés. 11(2), 237-248 (1983).

18. Wong. S.-L., Price, C. W., Goldfarb, D. S., és Dói, R. M.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).

19. Wang. P.-Z., és Dói, R. M.; J. Bioi. Chem. 259, 8619-8625 (1984).

20. Lin. C.-K., Quinn, L. A. Rodriquez, R. L.; J. Cell Biochem. Suppl. (9B), p. 198 (1985).

21. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J., és Filpula, D.; J. Bact. 159(3), 811-819(1984).

22. Palva, I., Sarvas, m., Lehtovaara, P., Sibazkov, M., és Kaariainen, L.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5582-5586 (1982).

23. Wong. S.-L., Pricee, C. W., Goldfarb, D. S„ és Dói, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).

24. Sullivan, M. A., Yasbin, R. E., és Young, F. E.; Gene 29, 21-46(1984).

25. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J., és Filpula, D.; J. Bact. 159(3), 811-819(1984).

26. Yansura, D. G. és Henner, D. J.; PNAS 81, 439-443 (1984).

27. Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H. és Heyneker, H. L.; Biotechnology, 161-165(1984).

28. Lory, S„ és Tai, P. C.; Gene 22, 95-101 (1983).

29. Liu, P. V.; J. Infect. Dis. 130 (supl), 594-599 (1974).

30. Wood, D. G., Hollinger, M. F. és Tindol, Μ. B.; J. Bact. 145, 1448-1451 (1981).

31. St. John, T. P. és Davis, R. W.; J. Mól. Bioi. 152, 285-315 (1981).

32. Hopper, J. E. és Rowe, L. B.; J. Bioi. Chem. 253, 7566-7569 (1978).

HU 222 810 Bl

33. Denis, C. L., Ferguson, J. és Young, E. T.; J. Bioi.

Chem. 258, 1165-1171 (1983).

34. Lutsdorf. L. és Megnet, R.; Archs. Biochem. Biophys. 126, 933-944(1968).

35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, M. és Hinnen,

A.; EMBO. J. S. 675-680 (1982).

36. Watson, Μ. E.; Nucleic Acid Research 12,

5145-5164(1984).

37. Gerband, C. és Guerineau, M.; Curr. Génét. 1,

219-223 (1980).

38. Hinnen, A., Hicks, J. B. és Fink, G. R.; Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978).

39. Jabbar, M. A., Sivasubbramamian, N. és Nayak, D.

P.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023 (1985).

i) Pseudomonas-vektorok

Néhány, a Gram-negatív baktériumok széles tartományában autonóm replikációra képes vektorplazmid előnyösen használható a Pseudomonas nemzetségbe tartozó gazdaszervezetekben klónozóvektorként. Ezek közül néhányat a következő szakirodalmi helyeken ismertetnek: Tait, R. C., Close, T. J., Lundquist, R. C., Hagiya, M. Rodriguez, R. L. és Kado, C. I., Biotechnology, 1983. május, 269-275; Panopoulos, N. J.: Genetic Engineering in the Plánt Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, 163-185. oldal (1981); és Sakagucki, K. : Current Topic in Microbiology and Immunology 96, 31-45 (1982); ezeket a szakirodalmi helyeket leírásunkba referenciaként építjük be.

Egy különösen előnyös konstrukció az RSF1010 plazmidot és származékait tartalmazza, amelyeket a Bagdasarian, M., Bagdasarian, Μ. M., Coleman, S., és Timmis, K. N.; Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance, szerk: Timmis, K. N. és Puhler, A., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979) szakirodalmi helyen ismertetnek, ezt referenciaként leírásunkba beépítjük. Az RSF1010 előnye, hogy viszonylag kicsi, nagy másolati számú plazmid, amely könnyen transzformálható mind E. coli, mind Pseudomonas fajokba, és azokban stabilan fenntartható. Ebben a rendszerben előnyös az Escherichia esetére leírt Tac expressziós rendszer alkalmazása, mivel úgy tűnik, hogy az E. coli trp promoter könnyen felismerhető a Pseudomonas RNS-polimeráz számára, amint azt Sakagucki, K. [Current Topics in Microbiology and Immunology 96; 31-45 (1982)] és Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H., and Heyneker, H. L. [Biotechnology, 1984. febr., 161-165.] ismertetik. Az előbbi szakirodalmakat leírásunkba referenciaként építjük be. A transzkripciós aktivitás tovább maximalizálható a promoter kicserélésével, például E. coli vagy P. aeruginosa trp promoterre. Továbbá, az E. coli lacl-génje is beépíthető a plazmidba, hogy szabályozó szerepet töltsön be.

A transzláció bármely Pseudomonas fehérje esetén transzlációiniciáláshoz köthető, valamint bármely, az inhibitor intracelluláris kifejeződését kiváltó típusú, nagy expressziójú fehérje iniciációs helyéhez.

Azokban az esetekben, amikor nem hozzáférhető egy mínusz restrikciós Pseudomonas fajba tartozó gazdatörzs, az E. coliból izolált plazmidszerkezet transzformációs hatékonysága igen gyenge. Ezért szükséges a Pseudomonas klónozóvektomak a kívánt gazdaszervezetbe való transzformálását megelőzően egy másik faj r- m+ törzsén át való passzálása, amint azt Bagdasarian, M., és munkatársai [Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, 411-422. oldal, szerkesztők: Timmis és Puhler, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)] leírják, ezt a munkát leírásunkba referenciaként építjük be.

ii) Bacillus-vektorok

Egy további előnyös expressziós rendszer a Bacillus fajba tartozó gazdaszervezetben pUBl 10 plazmid alkalmazása klónhordozóként. Mint más gazdavektorrendszerekben, a Bacillus gazdaszervezet esetén is lehetséges a találmány szerinti IL— li intracelluláris vagy kiválasztott fehérjeként való kifejezése. A találmány megvalósítási módja mindkét rendszert magában foglalja. Különböző gének létrehozására és vizsgálatára alkalmas, mind Bacillus, mind E. coli fajokban replikációra képes szállítóvektorok hozzáférhetőek, ezek leírása a Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., és Shivakumar, A. G. [Genetic Engineering, 2. kötet, szerkesztők: Setlow és Hollander, Plenum Press, New York, New York, 115-131. oldal (1980)] szakirodalmi helyen található, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Az IL-li-nek B. subtilisből való kifejezése és kiválasztása céljából az α-amiláz szignálszekvenciát előnyösen a fehérjét kódoló régióhoz kapcsoljuk. Intracelluláris inhibitor szintézisére a változtatható helyű DNS-szekvenciát az α-amiláz vezetőszekvencia riboszómakötési helyéhez kapcsoljuk transzlációsán.

Ezen konstrukciók bármelyikének transzkripcióját előnyösen α-amiláz-promoterrel vagy származékával irányítjuk. Ez a származék tartalmazza a natív a-amiláz-promoter RNS-polimeráz-felismerő szekvenciáját, de tartalmazza a lac operátorrégiót is. Hasonló hibrid promoterek konstruálhatok a penicillinázgén-promoterből és a lac operátorból, ezek Bacillus gazdaszervezetben szabályozható módon működnek, amint azt Yansura, D. G. és Henner [Genetics and Biotechnology of Bacilli, szerkesztők: Ganesan, A. T. és Hoch, J. A., Academic Press, 249-263. oldal (1984)] ismerteti. Ezt a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. Az E. coli lacl-génje ugyancsak bevihető a plazmidba, hogy szabályozó hatást fejtsen ki.

iii) Clostridium-vektorok

Egy, a Clostridiumban való kifejeződésre alkalmas előnyös konstrukció a pJU12 plazmidban van, amelyet Squires, C. H. és munkatársai [J. Bacteriol. 159, 465-471 (1984)] ismertetnek, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be, ez a konstrukció C. perfringensbe transzformálható Heefher, D. L. és munkatársai [J. Bacteriol. 159, 460-464 (1984)] eljárásával, amely eljárást leírásunkba referenciaként építünk be. A transzkripciót a tetraciklinrezisztencia-gén promoterje irányítja. A transzláció az azonos tet^r gén Shine-Dalgamoszekvenciájához kötődik szorosan analóg módon azzal az eljárással, amelyet az előzőekben egyéb gazdaszervezetekben való alkalmazásra megfelelő vektorok esetén leírtunk.

HU 222 810 Bl iv) Élesztővektorok

Élesztőbe bevitt idegen DNS fenntartása néhány különböző módon végezhető, amelyeket Botstein, D. és Davis, R. W.: [The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathem, Jones és Broach szerkesztők, 607-636. oldal (1982)] ismertetnek, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. Egy, a Saccharomyces nemzetségbe tartozó gazdaszervezetekben való alkalmazás esetén előnyös kifejeződési rendszer az IL-li gént a 2 mikron plazmidhoz köti. A 2 mikron kör előnye abban áll, hogy cir° törzsekbe bevive viszonylag nagy másolati számú és stabilitású. Ezek a vektorok előnyösen magukban foglalják a replikációkezdést és a pBR322-ből legalább egy antibiotikumrezisztencia-markert, hogy lehetővé tegyék az E. coliban való replikációt és szelekciót. Ezenkívül a plazmid előnyösen tartalmazza a két mikron szekvenciát és az élesztő-LEU2 gént, amely azonos célt szolgál a LEU2 élesztő hiánymutánsban.

Ha a rekombináns IL-1-inhibitort végül élesztőben kívánjuk kifejezni, előnyös, ha a klónozóvektort először Escherichia coliba visszük, ahol a vektor szaporodni képes, és ahonnan a vektort szaporodás után tisztított formában nyerjük ki. A vektort ezután az IL-l-inhibitor végső kifejezése céljából az élesztőbe visszük.

c) Emlőssejtek

Az IL-1-inhibitor cDNS szolgál génként az inhibitornak emlőssejtekben való kifejeződéséhez. Olyan szekvenciával kell bírnia, amely a riboszómákhoz való kötődésben hatékony, például olyannak, amint azt Kozák: [Nucleic Acids Research 75: 8125-8132 (1987)] ismerteti, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be; és vezetőszekvencia kódolására alkalmas kapacitással kell bírnia [lásd a 3. a) vi) helyen], amely az érett fehérjét a sejtből kész formában eltávolítja. A teljes cDNS-szekvenciát hordozó DNS restrikciós fragmens beiktatható egy olyan expressziós vektorba, amely transzkripciós promoterrel és transzkripciófokozóval bír, amint azt Guarente, L. [Cell 52: 303-305 (1988)] és Kadonaga, J. T. és munkatársai [Cell 57, 1079-1090 (1987)] ismertetik, mindkét hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. A promoter szabályozható lehet, mint például a pMSG-plazmidban (Pharmacia Cat. No. 27450601), ha az inhibitor konstitutív expressziója káros a sejtszaporodásra nézve. A vektornak egy teljes poliadenilezőszignállal kell bírnia, amint azt Ausubel, F. M. és munkatársai [Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987)] ismertetik - a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be -, ahhoz, hogy az mRNS transzkripciója ebből a vektorból rendesen történjen. Végül, a vektor tartalmazni fogja a replikációkezdést és legalább egy, a pBR322-ből származó antibiotikumrezisztencia-markert, hogy E. coliban való replikációja és szelekciója megvalósuljon.

Az IL-l-inhibitor termelésére alkalmas stabil sejtvonal kiválasztása érdekében az expressziós vektor tartalmazhatja egy kiválasztó marker génjét, például egy gyógyszerrezisztencia-markert, vagy hordozhatja egy hiányos sejtvonal komplementer génjét, például a dhffsejtvonal transzformálására szolgáló dihidrofolát-reduktáz (dhfir)-gént, amint azt Ausubel és munkatársai az előzőekben idézett hivatkozási helyen leírják. Más megoldás szerint az expressziós vektorral együtt transzformálható egy külön plazmid, amely a kiválasztó markert hordozza.

4. Gazdasejtek/transzformáció

Az így kapott vektort egy megfelelő gazdasejtbe visszük be. A gazdasejtek lehetnek mikroorganizmusok vagy emlőssejtek.

a) Mikroorganizmusok

Úgy véljük, hogy bármely olyan mikroorganizmus alkalmazható, amely képes az exogén DNS felvételére, és annak génjei és kísérő operációs elemei kifejezésére. Ha a gazdaszervezetet megválasztottuk, a vektort a gazdaorganizmusba szakember számára ismert módon visszük be. Ilyen eljárásokat ismertetnek például az Advanced Bacterial Genetics, R. W. Davis és munkatársai, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980) szakirodalmi helyen, amely hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. A megvalósítási formák egyikében előnyös, ha a transzformáció alacsony hőmérsékleten történik, mivel a hőmérsékletszabályozás eszközül szolgál a regulációs géneknek az operációs elemek révén való kifejeződéséhez, amint azt az előzőekben ismertettük. Egy másik megvalósítási mód szerint, amennyiben ozmoláris regulátorokat építünk a vektorba, az idegen gének megfelelő szabályozásának biztosítására a transzformáció során a sókoncentráció szabályozása szükséges.

Előnyös, ha a gazdamikroorganizmus fakultatív anaerob vagy aerob mikroorganizmus. Ebben az eljárásban előnyösen használható gazdaszervezetek közé tartoznak az élesztők és baktériumok. Előnyösek a Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztők, különösen a Saccharomyces cerevisiae. Előnyösek a Bacillus, Escherichia és Pseudomonas nemzetségbe tartozó baktériumok, különösen a Bacillus subtilis és Escherichia coli. További gazdasejteket ismertettünk az előzőekben szereplő I. táblázatban.

b) Emlőssejtek

A vektor bevihető emlőssejttenyészetbe, erre néhány különféle eljárás alkalmas, például kalcium-foszfát/DNS koprecipitáció, elektroporációval vagy protoplasztfuzióval. Előnyös eljárás a kalcium-foszfáttal való koprecipitáció, amint azt Ausubel és munkatársai az előzőekben hivatkozott irodalmi helyen ismertetik.

Számos olyan stabil sejttípus létezik, amely transzformálható, képes a cDNS-szekvencia transzkripciójára és transzlációjára, előállítja az IL-li prekurzort, és kiválasztja az érett fehéijét. A sejttípusok azonban különbözőek lehetnek a kiválasztott fehéije glükozilezését illetően, illetve az esetlegesen jelen lévő aminosavmaradékok transzlációt követő módosításában. így ideálisak azok a sejttípusok, amelyek a természetes molekulával azonos rekombináns IL-1-inhibitort termelnek.

5. Génsebészeti úton előállított sejtek tenyésztése

A gazdasejteket az IL-1-inhibitor kifejeződésének megfelelő körülmények között tenyésztjük. Ezek a körülmények általában a gazdasejtre fajlagosak, és szakem11

HU 222 810 ΒΙ bér könnyen meghatározhatja ezeket az ilyen sejtek tenyésztési körülményeire vonatkozó szakirodalom és a leírásban adott kitanítás alapján. Ilyen ismereteket közölnek például baktériumok tenyésztési körülményeire vonatkozóan a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Hasonló információk találhatók élesztő és emlőssejtek tenyésztésére vonatkozóan a Pollack, R.: Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be.

Minden olyan körülmény, amely a vektorban jelen lévő vagy abba beépített operációs elemektől függően a DNS-szekvencia expressziójának regulációjához szükséges, hatással van a transzformáció és a tenyésztési szakasz során. Egy megvalósítási mód szerint a sejteket olyan megfelelő regulációs körülmények között szaporítjuk nagy sűrűségig, amelyek gátolják a DNS-szekvencia kifejeződését. Az optimális sejtsűrűség elérése után a környezeti körülményeket oly módon változtatjuk meg, hogy azok kedvezőek legyenek a DNS-szekvencia kifejeződésének. Ennek megfelelően az IL- 1-inhibitor-termelés a gazdasejteknek közel optimális sűrűségig való szaporodása után következő időszakaszban következik be, és a kapott IL-1-inhibitort a kifejeződéséhez szükséges regulációs körülmények megvalósítása után némi idő elteltével nyerhetjük ki.

6. Tisztítás

a) Mikroorganizmusok által termelt IL-li

A találmány egy megvalósítási formája szerint a rekombináns IL-1 -inhibitort kinyerését követően, de aktív szerkezetének elnyerését megelőzően tisztítjuk. Ezt a megvalósítási módot azért tartjuk előnyösnek, mert úgy hisszük, hogy megkönnyíti az újrahajtogatódott fehérje nagy hozamának elérését, ha a fehérjét először tisztítjuk. Azonban egy másik előnyös eljárás szerint az IL-1-inhibitort először hagyjuk hajtogatódni, hogy megszerezze aktív szerkezetét a tisztítást megelőzően. Egy harmadik előnyös megoldás szerint az IL-1 -inhibitort újrahajtogatódott, aktív állapotában nyerjük ki a tápközegből.

Bizonyos körülmények mellett az IL-1-inhibitor elnyeri rendes, aktiv szerkezetét a gazdamikroorganizmusban való kifejeződéskor, és aktív állapotban jut át a sejtfalon vagy membránon, vagy kerül a periplazmatikus térbe. Ez általában akkor következik be, ha a rekombináns fehérjét kódoló DNS-hez a megfelelő vezetőszekvenciát kötjük. Ha az IL-l-inhibitor nem nyeri el rendes aktív szerkezetét, a képződött diszulfrdkötéseket és/vagy az előforduló nem kovalens kölcsönhatásokat kell először szétroncsolni, denaturáló- vagy redukálószerekkel, például guanidin-kloriddal és β-merkapto-etanollal, majd hígítás és ezen szerek szabályozott körülmények között történő oxidálása után az IL-1-inhibitor elnyeri aktív szerkezetét. Az újrahajtogatást megelőző és követő tisztítás során előnyösen az alábbi lépések néhány kombinációját alkalmazzuk: anioncserélő kromatográfia (MonoQ vagy DEAE-Sepharose), gélszűréses kromatográfia (Superose), kromatofokuszálás (MonoP) és hidrofób kromatográfiás interakció (oktil- vagy fenil-sepharose). Különösen értékes művelet az antitestaffinitás-kromatográfia, amelyet IL—lispecifikus monoklonális antitestekkel végzünk (ezt a 3. példában írjuk le).

b) Emlőssejtekből származó IL-li

Az emlőssejtek által termelt IL-l-inhibitort kondicionált tápközegből tisztítjuk az alábbi lépések alkalmazásával: ioncserélő kromatográfia és immunaffinitáskromatográfia a 3. példában leírt monoklonális antitestek alkalmazásával. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás és termékek számos módosítása és variációja képzelhető el. így a találmány magában foglalja mindazokat a módosításokat és variációkat, amelyek az oltalmi körön belül esnek, valamint ezek ekvivalenseit.

Megjegyezzük, hogy a leírásban adott kitanítás alkalmazása egy adott problémára vagy környezetre szakember köteles tudásához tartozik. A következőkben a találmány szerinti termékekre és elkülönítésük és feldolgozásuk módjára vonatkozóan adunk példákat.

A példák a találmány különféle, előnyösnek tartott megvalósítási módjait ismertetik. A példákban szereplő közleményeket leírásunkba referenciaként építjük be.

1. példa

Fehérje készítése

A) Anyagok

A Hank-féle kiegyenlített sóoldatot [Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)] és az RPMI-t a Mediatech, Washington, D. C. cégtől szereztük be. A Lymphoprep az Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N. Y. cégtől származik. A humán IgG, MTT, a nyúl-antiprosztaglandin E₂ antiszérum, az ammónium-hidrogén-karbonát, a ditiotreitol, a komplett és inkomplett Freund-adjuváns, a hipoxantin, az aminopterin és a timidin a Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri) terméke. A C3H/HeJ egereket a Jakcson Labs, Bar Harbor, Maine laboratóriumból szereztük be. BALB/c egereket és a P3 mielomasejteket John Kappler és Philippa Marrack doktoroktól [the National Jewish Center fór Immunology and Respiratory Medicine (NJC/IRM), Denver, Colorado] kaptuk [Natúré 256, 495-497 (1975)]. A rekombináns humán IL-1 a Cistron Biotechnology, Pine Brook, N. J. cégtől származik. A tisztított fitohemagglutinin a Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, N. C. terméke. A humán fitymafibroblasztokat primer tenyészetből dr. Richard Clarktól (NJC/IRM, Denver, Colorado) kaptuk. A monoklonális egér antinyúl-IgG antitesteket az AIA reagensgyártó cégtől (Aurora, Colorado) szereztük be. Az alacsony metionintartalmú RPMI-t Select-Amine kit (GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y.) alkalmazásával készítettük. A [³⁵S]-metionint, a difenil-oxazolt és a [¹⁴C]-jódecetsavat a DuPont-NEN, Chicago, Illinois cégtől szereztük be. A magzati borjúszérum származási helye a HyClone Laboratories, Logan, Utah. A Mono Q és Superose 12 oszlopok a Pharmacia, Inc., Piscataway, N. J. cégtől származnak. A C4-fordított fázisú oszlopokat a Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana cégtől kaptuk.

HU 222 810 Β1

A C-8-fordított fázisú oszlopokat az Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornia cégtől kaptuk. Az acetonitrilt és a polietilénglikol 8000-et a J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N. J. cégtől szereztük be. A trifluor-ecetsav és a guanidin-hidrogén-klorid a Pierce Chemicals, Rockford, Illinois cégtől származik. Az endoproteináz Lys C-t a Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana cégtől kaptuk. A PGE₂ ELISA-hoz alkalmazott Nunc-Immuno Plate I mikrotiterlemezeket az Intermountain Scientific Corporation, Bountiful, Utah cégtől kaptuk. A hibridómatermelésre alkalmazott lemezek származási helye Costar, Cambridge, Massachusetts.

B) Monocita IL-1-inhibitor létrehozása

Humán leukocitákat nyerünk normál donoroktól leukoforézissel, a leukocitákat Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS) 1 rész sejt: 1 rész HBSS arányban szuszpendáljuk, Lymphoprepet rétegezünk alá, és 30 percig szobahőmérsékleten 400xg értéken centrifugáljuk. A mononukleáris frakciót elkülönítjük (egy donortól jellemzően 4-5 xlO⁹ sejtet nyerünk), Ca⁺⁺ vagy Mg⁺⁺ nélküli HBSS-sel mossuk, szérummentes RPMI-ben szuszpendáljuk, és Sephadex G200 kromatográfiás eljárással LPS-mentessé tett normál humán IgG-vel bevont Petri-csészékre szélesztjük (6xl0⁷ sejt 10 ml oldatban/100 mm-es csésze). Minden reagens 10 pg/ml alatti mennyiségű LPS-tartalmú. A sejteket 24-48 órán át tenyésztjük, a kapott kondicionált tápközeg tartalmazza a nyers IL-1-inhibitor (IL-li) felülúszót. Jellemzően egy donortól származó sejtek 700-900 ml nyers IL- li felülúszót eredményeznek.

C) Az IL-1-inhibitor vizsgálata

Az IL-li kimutatására rutinszerűen két IL-1 vizsgálati eljárást alkalmazunk. Timociták szaporodása (4-6 hetes, C3H/HeJ egerekből származó 1 χ 10⁶ sejt) 1,0 egység/ml rekombináns humán IL-1 és 1 pg/ml fitohemagglutinin hatására adott válaszként a 3 napos stimulálással elért maximális érték felére csökken, ezt ³H-timidin-beépüléssel vagy MTT tetrazóliumsófelvétellel [Mosmann, T. J., Immunoi. Method, 65, 55-61 (1983)] méljük. A nyers IL-li felülúszó 10szeres hígításban teljes mértékben gátolja ezt a szaporodási választ. Humán dermális fibroblasztok (1 χ 10⁵ sejt lyukanként egy 96 lyukú lemezen) jellemzően válaszolnak 0,5 egység/ml rekombináns humán IL-1 hatására úgy, hogy 6 órás stimulálás után mintegy 50 000 pg/ml PGE₂-t választanak ki, amely ELISA-val mérhető. Ez a vizsgálat éppoly érzékeny IL-li hatására, mint a fenti timocitavizsgálat.

D) Az IL-1-inhibitor metabolikus jelzése

Az IL-l-inhibitort metabolikusan jelezzük oly módon, hogy mononukleáris leukocitákat 48 órán át [a B) lépésben leírt] IgG-bevonatú lemezeken szérummentes, csak 0,75 pg/ml hideg metionint tartalmazó (a normál érték 15 pg/ml) RPMI-ben, amelyhez 10⁷ sejtenként 0,5 mCi ³⁵S-metionint (1151 Ci/mmol) adtunk, tenyésztünk. Kontrolljelzést végzünk a fentivel azonos módon, azzal az eltéréssel, hogy a lemezeket IgG helyett magzati borjúszérummal vonjuk be. Az ilyen kontrollfelülúszókkal végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy igen kevés IL-li választódik ki, ha a sejteket magzati boíjúszérummal bevont lemezeken tenyésztjük.

E) Az IL-1-inhibitor fehérje tisztítása

A nyers IL-li felülúszót nátrium-kloriddal 1,0 mol/l-es oldattá alakítjuk, jégen 1 órán át inkubáljuk, majd 10 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáljuk. A teljes inhibitoraktivitást, de a kiindulási fehérjének csak 20%-át tartalmazó felülúszót 4 °C hőmérsékleten 0,025 mol/l-es, pH=7,6-os, 0,1% szacharózt tartalmazó trisz-pufferrel (A puffer) szemben kimerítően dializáljuk, a fehérjék gradiensffakcionálását egy Mono Q anioncserélő oszlopon végezzük. Az inhibitortartalmú oldat dialízisét folytatjuk, majd 10 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáljuk. Ezután az oldatot 0,22 μ-os nejlonszűrőkön visszük át. A felülúszókat 10 ml, metabolikus jelzéssel készült, hasonlóan feldolgozott felülúszóval egyesítjük, és 1,0 ml vagy 8,0 ml ágytérfogatú Mono Q-Superose (Pharmacia FPLC) oszlopokra visszük, és A pufferrel mossuk mindaddig, amíg az elfolyó OD₂₈₀ értéke az alapvonalra visszatér, ezután az A pufferben készült 0,025 mol/1 és 0,10 mol/1 közötti lineáris koncentrációgradiensű oldattal eluáljuk az oszlopot. Az oszlopról vett frakciókat gyűjtjük, és elemezzük radioaktivitásukat és bioaktivitásukat. Az egyes frakciókból vett mintákat redukált 12,5%-os SDS-PAGE alkalmazásával futtatjuk, ezüsttel színezzük, difenil-oxazollal átitatjuk, szárítjuk, majd filmre helyezve autoradiográfrás adatokat nyerünk. Az 1A. ábrán 40 ml nyers IL-li felülúszó és 3 ml metabolikusan jelzett IL-li felülúszó elegyének Mono Q kromatográfiával nyert proteinprofilját mutatjuk be. Erre az ábrára ráhelyezve láthatók az egyenként 50 pl-es frakciók radioaktivitásadatai, valamint az IL-1 i PGE₂-termelés révén mért bioaktivitása. Két nagyobb és egy kisebb radioaktív csúcs látható, amely teljes korrelációban van a három bioaktivitáscsúccsal. Az 1B. ábrán hasonló kromatogramot látunk, amely 15 ml nyers IL-li felülúszónak 3 ml olyan metabolikusan jelzett monocita felülúszóval való elegyéből származik, amelyet IgG helyett magzati boíjúszérummal (FCS) bevont lemezen tenyésztettünk. Az előzőekben tárgyalt három radioaktív csúcs jelentősen kisebbé vált. A 2A. ábrán az 1A. és 1B. ábrán látható kromatogram alapján érdeklődésre számot tartó tartomány frakcióinak ezüsttel festett gélkromatogramját mutatjuk be. Megjegyezzük, hogy az 1A. ábrán radioaktív és bioaktív csúcsot adó frakciók (52. és 59. frakció) mindegyike egy nagy sávot ad 22 kD-nál (nyíllal jelölve) SDS-PAGE-ben. A harmadik csúcs (az 1A. ábra 48. frakciója) SDS-PAGE-ben 20 kD-nál sávot ad. A nyers IL-li gélszűréses vizsgálata az aktív molekula 18-25 kD-os molekulatömegére utal. A 2B. ábra a 2A. ábrán bemutatott gél autoradiogramja. Jól látható, hogy a 20 és 22 kD-os fehéijesávok a legnagyobb radioaktivitással bíróak a frakciók közül.

Az eredményeket összegezve megállapítjuk, hogy az IgG-vel bevont Petri-csészén szélesztett monociták metabolikus jelzésével radioaktív mintát kapunk, ilyen minta alig képződik, ha a sejteket magzati borjúszérummal (FCS) bevont lemezeken szélesztjük. Ezek az indu13

HU 222 810 Bl kált radioaktivitással bíró minták tökéletesen együtt kromatografálhatók néhány bioaktivitással bíró IL-1-inhibitorral Mono Q oszlopon, géleken, és olyan autoradiogramot adnak, amelyről megállapítható, hogy a három legnagyobb indukált molekula az IL-li molekulá- 5 ra előzetesen várt molekulatömegnek megfelelő.

A szekvenciameghatározáshoz az IL-li molekulákat tovább tisztítjuk. Ezt két módon végezzük. Elsőként a bioaktivitás és radioaktivitás terén csúcsot adó Mono Q frakciókat C4-fordított fázisú oszlopra visszük, és 10 eluensként 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó víz és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril közötti gradienst alkalmazunk. Mivel az IL-li molekula izotóppal jelzett, az egyes frakciókból vett minták radioaktivitását számlálón közvetlenül mérjük, ezenkívül a 15 mintákat SDS-PAGE-vel elemezzük, majd autoradiográfiás értékelést végzünk. A 3A. ábra egy ilyen kromatogramot mutat, amelyre ráhelyeztük a radioaktivitásmintát is. Az egyes frakciókból vett mintákat gélen hittatjuk, majd ezüsttel festjük (3B. ábra), ezt köve- 20 tőén a gélek autoradiogramját készítjük el (3C. ábra), ezek azt mutatják, hogy az IL-li molekula a 32-36. frakciókban található. Ezeket a frakciókat beszárítjuk és szekvenáljuk. Más megoldás szerint a fő Mono Q frakciókat szárítjuk be Speed-Vac alkalmazásával, a be- 25 szárított anyagot 0,4 ml 0,05 mol/l-es ammónium-hidrogén-karbonátban újra szuszpendáljuk, majd előzetesen azonos pufferrel egyensúlyba hozott 10x300 mm-es, Superose 12 géllel töltött oszlopon (Pharmacia FPLC) gélszűréssel kétszer közvetlenül kromatografáljuk. En- 30 nek eredményét mutatjuk be a 4A. és 4B. ábrákon.

A frakciókat gyűjtjük, minden frakcióból mintát veszünk, és radioaktivitás és bioaktivitás szempontjából elemezzük, SDS-PAGE-t végzünk, a gélt ezüsttel festjük, és autoradiogramot készítünk róla. A megfelelő 35 frakciókat Speed-Vac berendezésen szárítjuk, majd szekvenáljuk.

2. példa

Az IL-l-inhibitor tervezett szekvenálása 40

A szekvenálást megelőzően a mintákat 6 mol/l-es, pH=8,6-os guanidin-hidrogén-kloridban oldjuk, 4 órán át 37 °C hőmérsékleten nitrogéngáz-atmoszférában a feltétjéhez viszonyított 100-szoros moláris ditiotreitolfeleslegben redukáljuk, majd 400-szoros ¹⁴C-jód-ecet- 45 sav-felesleggel 1 órán át alkilezzük. A reakcióelegyet C8-fordított fázisú oszlopon sómentesítjük, eluáljuk, majd részlegesen beszárítjuk. Az N-terminális szekven1 5 10

RPSGRKSSKMQ majd ezt követően C4 RP-HPLC eljárással hasonlóan tisztított IL-li-X preparátum elemzésével az alábbi szekvenciát kaptuk: 55

5

PrepKxF24 ______ és

PrepKxF23 R P__ R K ciát szekvenciaanalizátorral (Applied Biosystems Protein Sequencer) határozzuk meg. A belső szekvenciák meghatározására az előzetesen adott esetben redukált és alkilezett mintákat cianogén-bromiddal vagy proteolitikus enzimmel emésztjük, az emésztési eljárást szakember számára ismert módon végezzük. A reakcióelegyet beszárítjuk, 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben oldjuk, és a peptideket C8-fordított fázisú oszlopon elkülönítjük.

3. példa

Az IL-1-inhibitorokfajtáinak tisztítása és szekvenálása

A) IL-li-X, IL-li-a és IL-li-b fajták

Az IL-li Mono Q oszlopon való tisztításával a biológiai aktivitás három nagy részre válik szét, ezt az 1 A. ábrán mutatjuk be, és az 1. példában írjuk le, az aktivitással bíró csúcsok az előbbiek szerinti 48., 52. és 59. csúcsok. Ezen frakciók SDS-PAGE útján való elemzése - amely a 2A. ábrán látható - 20, 22, illetve egy további 22 kD-os inhibitorfajta jelenlétét mutatják. Az ilyen gélek Westem-elemzésekor - amelyet egérantiszérum alkalmazásával az alábbi 4. példában ismertetünk - mindhárom fajta inhibitor festődik. Ha az IL-li-t metabolikusan ³⁵S-metioninnal jelzett sejtekből készítjük, a jelzést a sejteknek IgG-vel bevont lemezen való szaporítása során végezzük, ezen frakciók mindegyike radioaktív lesz (ezt a 2B. ábrán az előzőekben említett gél autoradiogramján mutatjuk be). Az 1. példa szerinti logikát követve, azaz azt, hogy a fentivel párhuzamosan, de nem indukáló körülmények között tenyésztett sejtek nem hoznak létre IL-li bioaktivitást, és nem jelentkeznek a radioaktív sávok, arra a következtetésre juthatunk, hogy ez a három fajta adja a biológiai aktivitást. Ezt a három inhibitorfajtát a következő módon neveztük el: IL-li-X, IL-li-a és IL-li-b.

B) IL-li-X tisztítása és szekvenálása

Az IL-li-X- és/vagy IL-li-a-tartalmú Mono Q frakciókat fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) Synchropak RP-4 (C4) oszlopon tisztítjuk, és a radioaktív mintákat szekvenciaanalízisnek tesszük ki. Az RP-HPLC eljárással tisztított IL-li-a és IL-li-b közvetlen szekvenálására irányuló számos kísérlet kudarca azt a feltételezést alapozta meg, hogy ezek az inhibitorok N-terminálisukon kémiailag blokkoltak. Azonban egy IL-li-a (IL-li-aB2p2) preparátum elemzésekor az alábbi szekvenciát kaptuk:

20

AFISDVNQ,

15 20 __M Q A F _ I D _ VN K _ F

L K M Q A F I

HU 222 810 Β1

Ezek a szekvenciák nyilvánvalóan részei az IL-li-a szekvenálására irányuló kezdeti kísérletekor kapott szekvenciának. Feltételezésünk szerint ezek a szekvenciaadatok az IL-li-X elnevezésű 20 kD-os fajta N-terminálisának felelnek meg.

A fenti és minden ezt követó szekvencia esetén az aláhúzással jelölt helyzet vagy azt jelenti, hogy az adott egységet nem tudtuk azonosítani, vagy hogy az azonosítást illetően kétségeink vannak. Ha egy helyzetben két vagy több egység megjelölése szerepel, ez azt jelzi, 10 hogy a szekvenálási lépésben egynél több aminosavat észleltünk, a több jelölés közül a legfelső jelenti a legvalószínűbbnek tartott egységet.

C) Az IL-li-a és IL-li-bpeptidjeinek létrehozása, tisztítása és szekvenálása Minthogy az IL-li-a és IL—li—b N-terminálisukon nyilvánvalóan kémiailag blokkoltak, ezek peptidjeit endoproteinázos emésztéssel hozzuk létre. Közelebbről, az IL-li-a vagy IL— li—b mintákat tartalmazó Mono Q frakciókat egy 4,6x250 mm-es C3-RPHPLC 20 oszlopon (Zorbax Protein Plus) engedjük át, minden megelőző kísérletben a C-4 oszlopok megfelelő alternatíváit alkalmaztuk. Az IL-li-a-t (8A. és B. ábrák), vagy az IL—li—b-t (9A. ábra) igen fokozatos gradiens alkalmazása mellett (0,2% acetonitril/perc 0,5 ml/perc 25 áramlási sebesség mellett) választjuk el a legnagyobb szennyező radioaktív kísérőjétől, a humán lizozimtól.

A tisztított minták azonosítását SDS-PAGE alkalmazásával, majd ezt követően autoradiogramok készítésével (8C. és D., valamint 9B. ábrák) ellenőrizzük, a megfe- 30 lelő tisztaságú minta a gélen egyetlen, 22 kD-os radioaktív fehérjeként jelentkezik. A fehérjéket manuálisan szilikonnal bevont üvegcsövekbe gyűjtjük, és 25 ml 0,2%-os Tween-20 oldatot adunk hozzájuk. Az IL-litartalmú frakciókat Speed-Vac készüléken 50 ml-re pá5 roljuk be, majd 1%-os ammónium-hidrogén-karbonát hozzáadásával 300 ml-re egészítjük ki, ezután 1 mg endoproteinázt adunk az elegyhez. IL-li-a esetén enzimként endoproteináz Lys C-t (Boehringer-Mannheim) alkalmazunk, míg IL-li-b esetén a hasítást endoproteináz Asp N-nel (Boehringer-Mannheim) végezzük. A hasítást 37 °C hőmérsékleten végezzük 16 órán át, majd a reakcióelegy térfogatát Speed-Vac készüléken 50 ml-re pároljuk be.

Az II—li—a mintát közvetlenül kromatografáljuk, 15 míg az IL-li-b mintát először 5 ml, 2 mol/l-es, pH=8,0 -as trisz-pufferben készült 50 mmol/l-es ditiotreitol adagolásával redukáljuk, a reagáltatást 30 percig végezzük 37 °C hőmérsékleten, majd 10 ml, 1,1 pmol/les etanolos ³H-jód-ecetsav adagolásával karboxi-metilezzük, a reagáltatást 30 percig, 37 °C hőmérsékleten, sötétben végezzük. A peptidek elválasztását 2,1 χ 250 mmes, Brownlee Aquaporee RP-300 (C8) szűkfúratú oszlopon végezzük, 100 ml/perc áramlási sebesség mellett, mikrofuratú hardverrel, és mikrofúrattal kompatibilis szivattyúkkal felszerelt Beckman nagynyomású folyadékkromatográf alkalmazásával. Eluensként 0,1% trifluorecetsavat tartalmazó víz és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril közötti 0- 100%-os lineáris gradienst alkalmazunk, az eluálást 200 perc alatt végezzük el. A peptidek elválasztását a 10. és 11. ábrákon mutatjuk be. A szekvenciákra kapott információk a következők:

RaLysC-41

5 10

M Q A F _ I D V N Q K

RaLysC-53

10 15 20 K 25 P

FYL NNQLVA YLQGPNVNLEEQ I D N _ N

RaLysC-61

5

I Y

FATJRHVH

RaLysC-31

5

F Y F Q E D

RaLysC-37

1 5 G E

10

V S

I

15 T

N S

20

_ Q D F T RaLysC-35

—

L

Q

L

E A

N

R

Q

s Q

L

G

E

Q

1 5

10

15

20

E T

R

L

Q

L

E A

V

I

T D

L

L

E

N

RpAspN-51 1 5

10

15

20 25

Q K

T

F

L

G

D V N P I

E

P

Y

A

R N

N

Q

L

V A

S

Y

L

Q G P N V N L

RPAspN-43

5 10

DEGVMVTKFYFQ

HU 222 810 Β1

RPAspN-39

5 K 10 15 _PSGRKSSFMQAFRTQ

RpAspN-25

5

D K R F A F I R

RpAspN-30

115 10

S L Q

D EVNHLKKIS

A kapott peptidszekvenciák közül kettő nyilvánvalóan rokon azzal, amit a korábbiakban az IL- li-X esetén nyertünk. Ezek egyike, az RaLysC-41 egy Il-li-a szekvencia, a másik, az RpAspN-51 egy IL-li-b szekvencia, ami érvként szolgál amellett, hogy a háromféle IL- li legalábbis közel rokon fehérjék, hacsak nem egyetlen eredeti IL—li molekulának a kémiailag és/vagy fizikailag módosított formái. Ha a felsorolt szekvenciákat kombináljuk, az alábbi szekvenciakompozíciót kapjuk (ld. alább).

Úgy tűnik, hogy ez a szekvenciakompozíció nincs jelen egyetlen olyan ismert polipeptidben sem, amelyet a legújabb gyűjteményben, a „Protein Identification Resource Database” (PÍR 16.0) szakirodalmi helyen ismertetnek. Úgy véljük, hogy ezek a szekvenciák vagy ettől kevéssé eltérő variánsok a molekuláknak egy IL-1-inhibitorként hatni képes új csoportját képviselik.

/.......RaLysC-41.......1 |.....................RaLysC-53..............

).........RBAsp N-39........4 _t....................REAspnN-51.....................|

(..............IL-Kp 2ρΛ2 ..............₄

EPSGRKSSKMQAFRISDVNQKTFYLRNNQLVaÍyLQGPNVNLEE^ID

ξ.

(,. .RaLysC-31{

|.......RBAspnM-43..........1

DEGVMVTKFYFQED

(..............ReLysC-35,37..............i

N

S

G IGG

HSDETBLOLEAVRfiTDLLEjj

... .RaLysC-61......|

|.. .R8AepN-25. . .4

V

DKRFAFIRHYH

4. példa

Az IL-1-inhibitorral szemben fajlagos antitestek ké- 45 szítése hetes BALB/c egerekbe [Exp. Cell. Rés. 60, 61-77 (1970)] szubkután olyan IL-1-inhibitort injektálunk, amelyet előzetesen nyers felülúszóból Mono Q kromatográfiás úton részlegesen (négyszázszorosan) 50 tisztítottunk, PBS-sel szemben dializáltunk, és komplett Freund-adjuvánsban emulgeáltunk. Egy-egy egérnek 5 ml nyers felülúszóból származó tisztított IL-1-inhibitort adunk be. Az egereknek kéthetenként a fentivel azonos mennyiségű, nem komplett Freund-adjuváns- 55 bán emulgeált IL-1-inhibitort adunk, és a beadagolás után minden alkalommal 7 nap múlva farkukból szérummintákat veszünk. Az antiszérumok anti-IL-liaktivitását az SDS-PAGE alkalmazásával végzett immunogén futtatás keresztreakcióinak Westem-analí- 60 zisével vizsgáljuk. Az 5A. és 5B. ábrákon látható, hogy három IL-li-beinjektálást követően az egerek mindegyike termelt anti-IL-li antitesteket.

Minthogy a monoklonális antitestek igen nagy jelentőséggel bírnak az IL— li génnek az expressziós könyvtárból való klónozásánál, a rekombináns IL— li protein tisztításánál és a molekula biológiai hatásának vizsgálatánál, hozzáláttunk az IL-li-re fajlagos monoklonális antitestek sorozatának gyártásához. A B-sejt-hibridómák előállítására a fenti egereknek intravénásán a fentivel azonos mennyiségű IL-1-inhibitort adunk be sóoldatban 24 órával lépük eltávolítása előtt. A lépből a splenocitákat hideg kiegyensúlyozott sóoldatba (BSS) vonjuk ki, BSS-sel kétszer mossuk, P3 mielomasejtekkel 2χ10⁷ P3 sejt/10⁸ lép B-sejt arányban elegyítjük, majd lecentrifúgáljuk. A száraz csapadékhoz cseppenként 1 ml meleg, 5% szén-dioxid-gázt tartalmazó PEG

HU 222 810 Bl

6000-et (40% polietilénglikol 6000:60% minimális eszenciális tápközeg) adunk, ezzel a sejteket összeolvasztjuk. Az összeolvadt sejteket BSS-sel mossuk, mlenként 2 χ 10⁵ peritoneális sejtet tartalmazó 10 ml gazdag tápközegben (10% FBS) újra szuszpendáljuk, és a csapadékot 10 ml-es pipetta alkalmazásával finoman feltöijük. Az elegy térfogatát peritoneális sejteket tartalmazó tápközeg további hozzáadásával 20 ml-re egészítjük ki, majd a sejteket 96 lyukú, egyenként 0,1 ml-es lyukakat tartalmazó lemezre visszük fel. A lemezeket gázinkubátorba visszük, és a következő módon kezeljük:

1. nap - dús tápközegben lévő 3 xHAT (hipoxantin, aminopterin, timidin) adagolása 1 χ végkoncentrációig,

5. nap - a tápközeg kicserélése dús tápközegben lévő 1 χ HAT 200 μΐ-ével helyettesítve,

10. nap - a hibrid szaporodás ellenőrzése, a tápközeg kicserélése, ml-enként 1,5 χ 10⁶ peritoneális sejtet tartalmazó dús tápközegben lévő 1 χ HAT 200 μΐ-ével helyettesítve.

Ha a hibrid sejtek már közel összefolyóak, a lyukban lévő felülúszókat vizsgálatra visszük, a sejteket pipetta hegyével finoman lekaparjuk, és átvisszük egy olyan 1 ml-es tenyésztőlyukba, amely dús tápközegben 1 χ HAT-t és ml-enként 3 χ 10⁶ peritoneális sejtet tartalmaz.

Az összenőtt sejtekkel fedett lyukakból származó felülúszó anti-IL-li-aktivitását ELISA alkalmazásával vizsgáljuk, amely vizsgálatban a mikrotitrálólyukakhoz részlegesen tisztított IL-1-inhibitort kötünk (az IL—li azonos az egereknek beinjektált Mono Q oszlopon tisztított anyaggal). Negatív és pozitív kontrollként normál egérszérumot és hiperimmun antiszérumot alkalmazunk. A pozitív felülúszókon az ELISA-t ismételten elvégezzük homogénen tisztított IL-1 -inhibitorral bevont lemezeken, és vizsgáljuk tisztított, metabolikusan jelzett IL—li immunprecipitációjával. A pozitív sejteket a hígítás limitálásával klónozzuk, és prisztánnal kezelt egereknek injektáljuk be ascites létrehozása céljából. Nagy mennyiségű IL—li fajlagos antitest termelhető az egérascites fluidumának szövettenyésztésével vagy masszív fejlesztésével és összegyűjtésével. Az antitestek tisztítása és oldhatatlan ágyhoz való kapcsolása révén a rekombináns IL—li fehérje tisztítására alkalmas affmitásadszorbenst nyerünk.

5. példa

Az IL—li cDNS klónozása

Kimutattuk, hogy IgG-bevonatú Petri-csészén szélesztett és 24 órán át [³⁵S]-metionin jelenlétében tenyésztett monociták [³⁵S]—IL—li-t termelnek, amely Mono Q oszlopon mutatott kromatográfiás sajátságai alapján azonosítható.

Annak meghatározására, hogy az IL-1 i mikor termelődik maximális sebességgel (a 24 órás időszak alatt), a szélesztett monocitákat [³⁵S]-metionin hatásának tesszük ki impulzusszerű módon, rövid, 2 órás időtartamon át, amely idő elteltével nagy feleslegben lévő jelzetlen metionint adagolunk, és az inkubálást további 2 órán át folytatjuk. Ezután a tápközeget összegyűjtjük, és meghatározzuk az izotóppal jelzett IL-li-t. Ezt az eljárást alkalmazzuk monocitákon az IgG-bevonatú lemezen való szélesztést követő különböző időpontokban, azt találjuk, hogy a monociták [³⁵S]-metionin jelenlétének való kitevése a szélesztés után 15 órával hozza létre a maximális [³⁵S]—IL— li-t, jelezve ezzel azt, hogy a monocitákban az IL—li mRNS az IgG-bevonatú lemezen való szélesztést követően 15 óra múlva van a maximális szinten.

Az IB. példa szerint előállított friss monocitákat szélesztünk LPS-mentes IgG-η. RPMI tápközegben 15 órán át, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálást követően a sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd 4 mol/l-es guanidin-tiocianáttal, 25 mmol/l-es pH=7-es nátrium-citráttal, 0,5% szarkozillal és 0,1 mol/l-es 2-merkaptoetanollal lizáljuk. A lizátum össz-RNS-tartalmát P. Chomczynski és N. Sacchi AGPC eljárásával [Analytical Biochemistry, 162, 156-159. o. (1987)] elkülönítjük.

A poli A+ RNS-t oligo dT cellulóz kromatográfiás eljárással {Aviv, H. és Leder, P. [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 1408-1412 (1972)]} elkülönítjük, etanollal kicsapjuk, majd 0,36 pg/μΐ koncentrációra oldjuk. A cDNS Gubler, U. és Hoffman, B. J. [Gene 25, 263-269 (1983)] eljárásával való előállításához 1 pg poli A⁺ RNS-t használunk fel.

A cDNS-t lambda gtll expressziós könyvtárba visszük be EcoRI linkerek alkalmazásával, amelyek a Boehringer Mannheim 988 488 katalógusszámának vagy a New England Bio Láb 1070 katalógusszámának megfelelőek, az eljárás során a fenti gyártók utasításait követjük.

A kapott, 10⁶ független kiónt tartalmazó könyvtárat E. coli Y1090 rk~-on (Promega Biotec) szkríneljük, az IL-li-nek megfelelő poliklonális antitesttel, amint azt az előzőekben leírtuk, az R. A. Young és R. W. Davis [PNAS 80, 1194-1198 (1983)] által leírt szkrínelési körülményeket alkalmazzuk. A pozitív mintákat egy második, biotinilezett antitest (például kecske antiegér-IgG, Bethesda Research Labs), majd egy strepavidin-lúgos foszfatáz konjugát (Bethesda Research Labs) alkalmazásával azonosítjuk Bayer, E. A. és Wilchek, M.: [Methods in Biochemical Analysis (1979)] és Guesdon, J. L. Temynch, T. és Avrameas, S. [J. Histochem. Cytochem. 27, 1131-1138 (1979)] által leírt, és a gyártó utasításai szerinti módon.

6. példa

Az IL-1-inhibitort kódoló gén elkészítése és szekvenálása

Az 5. példában leírt módon előállított cDNS-t lambda GT10 klónozóvektorba építjük be. Ezt a cDNS-t először EcoRI metilázzal, S-adenozil-metionin szubsztrát alkalmazásával metilezzük, EcoRI linkereket kapcsolunk hozzá ligációs reakcióban, majd a linkerek feleslegét EcoRI endonukleázzal való emésztéssel és CL6B szpin oszlopon végzett kromatografálással eltávolítjuk. 0,124 pg kapcsolt, méret szerint szelektált cDNS-t és

HU 222 810 Bl pg EcoRI-gyel hasított és foszfatázzal kezelt lambda GTlO-et tartalmazó reakcióelegyet készítünk, és a ligációs reakció termékeit GIGAPACK GOLD burkolóextraktum (Stratagene) alkalmazásával burkoljuk. így egy 1 χ 10⁷ tagból álló könyvtárat kapunk. í #ILlil—3 minta

TTA

TTCTACGTCCGNAAG5’

Lys Met Gin Ala Phe #ILlil - 4 minta

T A A A T

TTCAAGATGAAGGTCGT

Lys Phe Tyr Phe Gin Glu #ILlil - 5 minta

T A

TACCANTGNTTCAAGAT

Me t Val Thr Lys Phe Tyr #ILlil - 6 minta

A ATT

CTGCANTTGGTCTTCTG

Asp Val Asn Gin Lys Thr #ILlil — 7 minta

ATT A

TTGGTCTTCTGNAAGAT

Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Megjegyzés: N=A, G, C és T

Az #ILlil—3 mintát 5’ végén ³²P-foszforilezzük, és a könyvtár 3 χ 10⁵ plakkjának szkrínelésére használjuk.

A mintát reprodukálhatóan a három plakkhoz hibridizál- 35 juk, ezen plakkok egyike az #ILli-4 mintával is hibridizálódik. Ezt a plakkot, a GT10 ILli-2A-t tenyésztjük, és a DNS-t Lambdasorb (Promega) alkalmazásával izoláljuk a gyártó utasításainak követésével.

A GT10-ILli-2A-t az ATCC 40488 letéti számon 40 letétbe helyeztük [American Type Culture Collection (ATCC)]. A DNS-t EcoRI-gyel emésztjük, öt egyforma aliquot részre osztjuk, és 1%-os agarózgélen elektroforetizáljuk.

Az elektroforézist követően a géleket etidium-bro- 45 middal festjük. Ennek a gélnek egy fényképét mutatjuk be a 12A. ábrán. A 6., 8., 10., 12. és 14. sávok tartalmazzák az EcoRI-emésztés öt aliquotját. Az ötödik sáv HindlII-mal hasított vad típusú lambda DNS és HaelIImal (New England Biolabs) hasított φΧ174 RF DNS 50 elegyét tartalmazza, amelyek hasznos molekulatömegmarkerek. A 12A. ábrán azt mutatjuk be, hogy a GT10-IL1Í-2A olyan EcoRI-fragmenst tartalmaz, amely 1850 bázispár hosszúságú.

Annak még meggyőzőbb bizonyítására, hogy ez az 55 1850 bázispárból álló fragmens az IL-l-inhibitort kódoló szekvenciát hordozza, a következők szerint Southem-blot-módszert alkalmazunk. A 12A. ábrán bemutatott gélen lévő DNS-fragmenst szokásos eljárással nitro-cellulózra visszük. A nitro-cellulózt ezután hosszá- 60

Ennek a GT10 könyvtárnak a szkrínelésére a 3. példában bemutatott protein- és peptidszekvencia alapján antiszensz oligonukleotidmintákat szintetizálunk. Ezeknek a mintáknak a szekvenciája és a nekik megfelelő peptidszekvenciák a következők:

T

C C T 5 ’ As p

A

A A 5’ Phe bán 5 csíkra vágjuk, hogy az egyes csíkok tartalmazzák a 6., 8., 10., 12. és 14. sávok DNS-ét. A csíkokat ezután egyenként hibridizáljuk a fenti, az 5’ végükön ³²P-foszfáttal jelölt oligonukleotidmintákkal. Az oligonukleotidkoncentráció 1 pmol/ml, a hibridizálás hőmérséklete az alábbi:

Sáv	Minta	Hőmérséklet
6	#ILlil-3	35 °C
8	#ILlil—4	42 °C
10	#ILlil-5	42 °C
12	#ILlil-6	40 °C
14	#ILlil-7	35 °C

Mosást követően a sávokat sorba rendezzük és egymáshoz erősítjük, hogy az eredeti nitro-cellulóz-lemezt helyreállítsuk. Ezt a lemezt erősítőemyő jelenlétében -70 °C hőmérsékleten 14 órán át autoradiografáljuk. A kapott autoradiogram fényképét a 12B. ábrán mutatjuk be. Ez bizonyítja, hogy a minták mindegyike fajlagosan hibridizálódik az 1850 bázispárt tartalmazó fragmenshez, igazolva ezzel azt, hogy ez a fragmens jelentős, az IL-1inhibitor szekvenciáját kódoló részt hordoz.

DNS-szekvenciájának meghatározására a GT10-IL1Í-2A DNS-t EcoRI-gyel emésztjük, 1%-os agarózgélen elektroforézist végzünk, és az 1850 bázispárt tartalmazó fragmenst elkülönítjük. Ezt a fragmenst

HU 222 810 Bl

EcoRI-gyel emésztett M13 mpl9-cel Egáljuk, és E. coli JM109 törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokat a béta-galaktozidáz-aktivitás hiánya szerint szkrineljük. Öt ilyen béta-galaktozidáz-hiányos transzformánst izoláltunk, ezekből egy szálú DNS-t készítünk, és Sanger és munkatársai eljárása szerint szekvenáljuk. A három transzformáns DNS-szekvenciája megfelel az mRNS 3’ végének, míg két transzformáns a proteint kódoló szekvenciát adja. A 13. ábrán azt a DNS-szekvenciát mutatjuk be, amelyet a cDNS proteint kódoló részére kaptunk.

A 13. ábrán az előre jelzett aminosavszekvenciát is bemutatjuk. Az első aminosavtól, az alanintól a 29. aminosavig, a prolinig, valamint a 79. aminosavtól, az izoleucintól a lánc végéig az aminosavszekvencia feltételezett. A 30. aminosavtól, a prolintól, a 78. aminosavig, a prolinig terjedő előre jelzett aminosavszekvencia megegyezik a 3. példában leírt peptidszekvenciával.

7. példa

A GT10-11-2A és azlL-li szekvenálása

A GT10-IL1Í-2A egy részét szekvenáltuk, ennek eredményét a 14. ábrán mutatjuk be. A DNS (99-557. nukleotidok) egy olyan fehérjét kódol, amely az IL-1inhibitorra jellemző aminosavszekvenciát tartalmazza. Úgy véljük azonban, hogy ezen a fehérjén néhány módosulásnak kell végbemennie, mielőtt a sejten kívüli környezetbe kiválasztódna. Ezek a módosulások a fehérje IL-li-akivitását tekintve lehetnek lényegesek vagy lényegtelenek.

A GT10-IL1Í-2A az X jelöléssel illetett IL-li amino terminusának legalább 32 aminosav N-terminálisát kódolja (3-98. nukleotidok). Úgy véljük, hogy ebben a 32 aminosavban szerepel egy kiválasztó vezetőszekvencia, amely a 24-26. nukleotidok által kódolt M-nél kezdődik, a naszcens IL-li-t a sejt közötti környezetbe irányítja, majd a vezetőpeptidáz és feltehetőleg egyéb peptidázok eltávolítják. Ennek a szekvenciának az eltávolítási mértéke az alfa- és béta-IL-l-inhibitorok esetén jelenleg még ismeretlen, de feltehető, hogy ezeknek a formáknak az N-terminálisa közel van az X forma N-terminálisához. Valószínű, hogy a kiválasztó leader (vezető)szekvencia eltávolítása szükséges ahhoz, hogy a fehérje hatékony IL- li-aktivitásúvá váljon.

A GT10-IL1Í-2A 349-351. nukleotidjai egy olyan N-egységet kódolnak, amely egy konszenzus Nglikozilezési hely része. N-glikanázzal való emésztésre való érzékenységük alapján feltételezzük, hogy az alfaés béta-IL- li glikozilezettek. Mivel az X forma nem érzékeny ezzel az enzimmel való emésztésre, feltehetőleg ez nem glikozilezett, bár ez a lehetőség is fennáll, ez a proteinszekvenálásban jártas szakember számára a leírásban adott információk birtokában könnyen kimutatható. Feltételezzük, hogy ennek az N-egységnek a glikozilezése nem szükséges ahhoz, hogy a protein hatásos IL-li-aktivitást mutasson.

A GT10-IL1Í-2A 99-101. nukleotidjai egy P egységet kódolnak (lásd a 15. ábrán), de ez a P egység nem mutatható ki ebben a helyzetben (az N-terminálison) az IL-li X formájában. Lehetséges, hogy ez az egység az érett fehérjében módosul. Úgy véljük, hogy ennek az egységnek a módosulása nem lényeges az IL—liaktivitás hatékonysága szempontjából.

Az alfa- és béta-formák jelenleg ismeretlen N-terminális egységei az Edman-lebontással nem teljesen mutathatók ki, feltehetőleg a GT10-IL1Í-2A által kódolt fehérje bizonyos N-terminális egységeinek eltávolítását követően módosulnak. Feltételezzük, hogy ez a módosulás nem lényeges az IL-li-aktivitás hatékonysága szempontjából.

8. példa

Az IL-li-t kódoló gének expressziója állati sejtekben

Az IL-li állati sejtekben való expressziójához a következő lépések szükségesek:

a) Expressziós vektor létrehozása

b) A gazdasejtvonal megválasztása

c) Az expressziós vektor bevitele a gazdasejtbe

d) A rekombináns gazdasejt manipulálása az IL-li expressziós szintjének növelésére.

1. Az állati sejtekben való felhasználásra szánt IL-li expressziós vektorok különféle típusúak lehetnek, köztük erősen konstitutív expressziós szerkezetek, indukálható génszerkezetek, valamint olyanok, amelyek bizonyos sejttípusokban való expresszióra megfelelőek. Minden esetben promotereket és más génszabályozó szakaszokat, például indukálható vagy nem indukálható erősítőket (enhancer) és poliadenilációs jeleket helyezünk el a plazmidalapú vektorban lévő cDNSszekvenciához megfelelő helyzetben. A következőkben két ilyen szerkezetet ismertetünk:

(1) Egy erős konstitutív promoterszakaszt tartalmazó szerkezetet készítünk majomvírus 40 (SV40) gén kontrollszignálok olyan elrendezésben való alkalmazásával (pSV2CAT), ami plazmidra Gorman és munkatársai [Mól. Cél. Bioi.; 2, 1044-1051 (1982)] által leírtaknak (amit leírásunkba referenciaként építünk be) megfelel. Ezt a plazmidot úgy manipuláljuk, hogy az IL-li cDNS-t helyettesítjük be a kloramfenikol-acetil-transzferázt (CAT) kódoló szekvencia helyére a molekuláris biológiai technikában ismert módon (lásd Maniatis és munkatársai fentiekben hivatkozott munkája), amint azt a 6. ábrán bemutatjuk· (2) Indukálható génszerkezetet készítünk olyan PMK-plazmid alkalmazásával, amely egér-metallotionein (MT-1) promoterszakaszát [Brinster és munkatársai; Cell 27. 228-231 (1981)] tartalmazza. Ezt a plazmidot alkalmazhatjuk kiindulási anyagként, és manipulálhatjuk a 7. ábrán bemutatott módon egy fémmel indukálható génszerkezet előállítására.

2. Számos különféle állati sejtvonal alkalmazható az IL-li kifejezésére az előzőekben leírt vektorok alkalmazásával, így aktív fehérjék állíthatók elő. Két olyan lehetséges sejtvonal, amelyeknek idegen gének expresszióját elősegítő képességét jól jellemezték, az egér-Ltk- és a kínaihörcsög-petefészek (CHO) dhfrsejtek, bár az IL-li expressziója nem korlátozódik ezekre a sejtvonalakra.

3. A DNS-vektor ezekbe a sejtvonalakba számos génátviteli eljárással vihető be. Az itt alkalmazott eljá19

HU 222 810 Bl rás a kalcium-foszfát-DNS precipitációs eljárás, amelyet S. L. Graham és A. S. van dér Eb [Virology 52, 456-467 (1973)] írnak le. Ebben az eljárásban az IL—li expressziós vektorát egy másik, egy kiválasztó markert kódoló expressziós vektorral együtt csapják ki. Ltk~-sejttranszfekció esetén a kiválasztó marker egy timidin-kináz-gén, és a kiválasztást (szelekció) Wigler és munkatársai [Cell 76;777-785 (1979)] eljárásával végezzük, CHO dhfr- sejtek esetén a kiválasztó marker dihidrofolát-reduktáz (DHFR), és a szelekciót Ringold és munkatársai; [J. Mól. Appl. Génét. 7, 165-175 (1981)] eljárásával végezzük.

4. Ezt követően az IL— li génszerkezetet kifejező sejteket olyan körülmények között szaporítjuk, amelyek mellett az IL-li-termelés szintje nő. A metallotionein promoterszerkezetet hordozó sejteket már nehézfémek, például kadmium jelenlétében szaporíthatjuk, amely az MT-1 promoter hasznosítását ötszörösére növeli [Mayo és munkatársai, Cell 29 99-108] ez az IL—li fehéijeszint jelentékeny növekedéséhez vezet. Azokat a sejteket, amelyek IL— li expressziós vektorokat (SV40- vagy MT-1-alapú) DHFR expressziós vektorokkal együtt tartalmaznak, a Ringold és munkatársai [J. Mól. Appl. Génét. 1, 165-175 (1981)] által leírt génszaporítási eljárás szerint kezelhetjük methotrexate alkalmazásával, ami a DHFR-nek kompetitív antagonistája. Ez a sejtben a DHFR-gén több másolatának jelenlétéhez vezet, ennek folytán az IL— li gének megnövekedett kópiaszámához, ami több IL— li fehérje termelődéséhez vezet a sejtben.

9. példa

IL-li tisztítása rekombináns állati sejtekből

Tekintettel arra, hogy az IL-li-t természetes anyagok sejtjeiből kívánjuk kiválasztani, feltételezzük, hogy az előzőekben a természetes fehérjék tisztítására leírt eljárások hasonló tisztítást és jellemzőket eredményeznek rekombináns fehéijék esetén.

10. példa

Az IL-li szekvenciája

Az IL-li aminoterminális egységét néhányszor közvetlen fehéijeszekvencia-meghatározással argininként (R) azonosítottuk. Az ilyen szekvenálás eredményét a 3. példában mutatjuk be. Ezzel ellentétben az IL-li cDNS-szekvenálás alapján előrelátható aminoterminális egysége egy prolin (P). Ez az aminoterminális egység felel meg a 13. ábrán látható 85-87. nukleotidoknak, és ez van körrel megjelölve a 14. és 15. ábrákon. Ez a látszólagos eltérés a cDNS-szekvencia és a közvetlen proteinszekvencia között feloldható azzal a feltételezéssel, hogy a cDNS-szekvenciába egy hiba épült be, miközben az mRNS-ből reverz transzkriptáz által katalizált módon szintetizálódott. Azaz, az mRNSen az aminoterminális egység kódolására alkalmas módon elhelyezkedő CGA (arginin) kodon változhatott a reverz transzkriptázreakció során CCA (prolin) kodonná a cDNS-ben. Ilyen típusú reverz transzkriptázproblémát ismertettek már korábban a szakirodalomban [B. D. Clark és munkatársai; Nucleic Acids Research 14, 7897 (1986)].

Feltételezzük, hogy a protein helyes aminosavszekvenciája a cDNS által előre láthatónak megfelelő, kivéve azt, hogy az aminoterminális aminosav prolin helyett arginin, amint az a 13-15. ábrákon jelölve van. Mind a DNS-szekvenciák, mind a nekik megfelelő peptidszekvenciák a találmány oltalmi körén belül esnek, azzal a megjegyzéssel, hogy előnyös az aminoterminálison az argininszekvencia.

Claims (41)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Legalább 90%-os tisztaságú interleukin-l-inhibitor (IL-li), amely az interleukin-1 alfa és interleukin-1 béta közül legalább az egyikkel szemben aktív.
2. 2. Fiziológiásán funkcióképes interleukin-1-inhibitort (IL-li) kódoló izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi szekvenciarészletet:

   GCG TCA CAG AAT GGA AAT CTG CAG 27 AGG CCT CCG CAG TCA CCT AAT CAC TCT 54 CCT CCT CTT CTG ATC ATT CAG AGA CCG 81 ATC TGC CCA CCC TCT GGG AGA AAA TCC 108 AGC AAG ATG CAA GCC TTC AGA ATC TGG 135 GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG 162 AGG AAC AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC 189 TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA 216 GAA AAG ATA GAT GTG GTA CCC ATT GAG 243 CCT CAT GCT CTG TCT TGG GAA TCC ATG 270 GAG

   HU 222 810 Β1
3. 3. A 2. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi DNS-szekvencia 99. és 554. közötti nukleotidjait:

   70 80 90 100 110 120

   CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCCACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET 1CPPSGRKS

   130 140 150 160 170 180

   GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN

   190 200 210 220 230 240

   ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I D

   250 260 270 280 290 300

   TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLGIHGGKMCL

   310 320 330 340 350 360

   CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD

   370 380 390 400 410 420

   TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP

   430 440 450 460 470 480

   CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA

   490 500 510 520 530 540

   ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVS LTNMPDEGVMVTKFY

   550 4-560 570 580 590 600

   TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E *
4. 4. A 2. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi DNS-szekvencia 99. és 554. közötti nukleotidjait:

   70 80 90 100 110 120

   CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCGACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICRPSGRKS

   130 140 150 160 170 180

   GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN

   190 200 210 220 230 240

   ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKID

   250 260 270 280 290 300

   TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG IHGGKMCL

   HU 222 810 Bl

   310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD

   370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF ÍRSDSGP

   430 440 450 460 470 480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA

   490 500 510 520 530 540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVS LTNMPDEGVMVTKFY

   550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E *
5. 5. Interleukin-l-et (IL-1) gátolni képes interleukin-l-inhibitor (IL—li) polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza: 25 (A)

   10 20 30 40 50 60

   GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA

   MEICRGLRSHLI

   70 80 90 100 110 120

   CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICXPSGRKS

   130 140 150 160 170 180

   GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN

   190 200 210 220 230 240

   ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I D

   250 260 270 280 290 300

   TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG I HGGKMCL

   310 320 330 340 350 360

   CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD

   370 380 390 400 410 420

   TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF ÍRSDSGP

   430 440 450 460 470 480

   CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG

   TTSFESAACPGWFLCTAMEA

   HU 222 810 Bl

   490 500 510 520 530 540

   ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT

   DQPVSLTNMPDEGVMVTKFY

   550 560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * ahol S nukleotid jelentése C vagy G és X aminosav jelentése R vagy P;

   (B) az (A) szekvencia IL-l-et gátló IL-li-szekvenciát tartalmazó részlete;

   (C) az (A) szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;

   (D) az (A) szekvencia kódolórégiójának 99-554. 10 pozíciói közötti szekvenciája által kódolt szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;

   (E) az alábbi aminosavszekvencia vagy annak egy IL-l-et gátló fragmense:

   (U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L CTA Μ E A D Q P V S L T N M P D E G V M V Τ K F Y F Q EDE

   ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (F) az (E) aminosavszekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy (C), (D) vagy (F) szekvenciaként legalább 80%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy (C), (D) vagy (F) szekvenciaként legalább

   25 90%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.
8. 8. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy (C), (D) vagy (F) szekvenciaként legalább 95%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.
9. 9. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jelle30 mezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:

   (a) az alábbi aminosavszekvencia vagy annak egy IL-l-et gátló fragmense:

   (U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWDVNQKT FYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVP IEPHA LFLG IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAF IRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVS LTNMPDE GVMVTKFYFQEDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 5%-ban különböző aminosavszekvencia.
10. 10. A 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez45 ve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:

    (a) az alábbi aminosavszekvencia vagy annak egy IL-l-et gátló fragmense:

    (U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L C T A Μ E A D Q P V S L T N M P D E G V M V T K F Y F Q EDE

    ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és 60 (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 1%-ban különböző aminosavszekvencia.

    HU 222 810 Β1
11. 11. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazza:

    M R N Q P L S V G A R K S L s Q K G M P Q A F R L I E W E D V N Q K T F Y L P R N H A G Y N V N K I D V V P I E L F L G I H G G K M C L s c V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L c T A M E A D Q P V S L T N M P D E G V M V T K F Y F Q E D E
12. 12. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak részletét tartalmazó N-terminális szekréciós szignálpeptidet tartalmaz:

    MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC
13. 13. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy glikozilációs mintázata a humán urináris IL— li-étől eltérő, vagy glikozilálatlan.
14. 14. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtben lett előállítva, 20 és legalább 90%-os tisztaságú.
15. 15. A 14. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként prokarióta sejtben lett előállítva.
16. 16. A 15. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként E. co/í-sejtben lett előállítva.
17. 17. A 14. igénypont szerinti polipeptid, azzal jelle15 mezve, hogy rekombináns gazdasejtként emlőssejtben lett előállítva.
18. 18. A 17. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként CHO-sejtben lett előállítva.
19. 19. Interleukin-l-et (IL-l-et) gátolni képes IL-li-t kódoló rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:

    (A)

    10 20 30 40 50 60

    GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA

    MEICRGLRSHLI

    70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICXPSGRKS

    130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN

    190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I D

    250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG IHGGKMCL

    310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVN I TD

    370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP

    430 440 450 460 470 480

    CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG

    TTSFESAACPGWFLCTAMEA

    HU 222 810 Bl

    490 500 510 520 530 540

    ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT

    DQPVS LTNMPDEGVMVTKFY

    550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * ahol S nukleotid jelentése C vagy G, és az X aminosav jelentése R vagy P;

    (B) az (A) szekvenciában található kódolórégió vagy az (A) szekvencia IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részlete;

    (C) az (A) szekvenciában található kódolórégiónak vagy IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részletének degenerált szekvenciája;

    (U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWD

    NQLVAGYLQGPNVNLEEK

    LFLG IHGGKMCLSCVKSG

    NI TDLSENRKQDKRFAF I

    ESAACPGWFLCTAMEADQ

    GVMVTKFYFQEDE ahol 25 (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az

    IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; 30 vagy (G) az (F) aminosavszekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.
20. 20. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 80%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.

    (D) az (A) szekvenciával legalább 70%-ban homo10 lóg szekvencia;

    (E) az (A) szekvencia kódolórégiójának 99-554. pozíciói közötti szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;

    (F) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló szekvencia:

    VNQKTFYLRN IDVVPIEPHA DETRLQLEAV RSDSGPTTSF PVSLTNMPDE
21. 21. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 90%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.
22. 22. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 95%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.
23. 23. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza :

    (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:

    (U) (X) P S G R K S s K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E G V M V T K F Y F Q E D E

    ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; 50 vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 5%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.

    (U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWD NQLVAGYLQGPNVNLEEK LFLG IHGGKMCLSCVKSG NITDLSENRKQDKRFAF I ESAACPGWFLCTAMEADQ GVMVTKFYFQEDE
24. 24. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza :

    (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:

    VNQKTFYLRN

    IDVVPIEPHA

    DETRLQLEAV

    RSDSGPTTSF

    PVSLTNMPDE

    HU 222 810 Bl ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és 5 (X) jelentése R vagy P;

    vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 1%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.
25. 25. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciájú polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazza:

    M R P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L c T A M E A D Q P V S L T N M P D E G V M V T K F Y F Q E D E

    (Uniós elsőbbsége: 1988. 11. 03.; módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
26. 26. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak részletét tartalmazó N-terminális szekréciós szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz:

    MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC
27. 27. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a natív IL-l-inhibitorétól eltérő promotert tartalmaz, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva a kódolószekvenciához.
28. 28. Vektor, amely 17-27. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmaz.
29. 29. Rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy 20 interleukin-l-et (IL-l-et) gátló aktivitású IL—li polipeptidet kódoló DNS-molekulát tartalmaz, amely DNS-molekula az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:

    (A)

    10 20 30 40 50 60

    GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA

    MEICRGLRSHLI

    70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSETICXPSGRKS

    130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN

    190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKI D

    250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG I HGGKMCL

    310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD

    370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP

    430 440 450 460 470 480

    CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG

    TTSFESAACPGWFLCTAMEA

    HU 222 810 Bl

    490 500 510 520 530 540

    ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT

    DQPVSLTNMPDEGVMVTKFY

    550 4560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * ahol S nukleotid jelentése C vagy G és X aminosav jelentése R vagy P;

    (B) az (A) szekvenciában található kódolórégió vagy az (A) szekvencia IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részlete;

    (C) az (A) szekvenciában található kódolórégiónak vagy IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részletének degenerált szekvenciája;

    (D) az (A) szekvenciával legalább 70%-ban homo10 lóg szekvencia;

    (E) az (A) szekvencia kódolórégiójának 99-554. pozíciói közötti szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;

    (F) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy 15 IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló szekvencia:

    (U) (X) P S G R K S s K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N N Q L V AGY L Q G P N V N L E E K 1 D V V P I E P H A L F L G I H G G K M c L S C V K S G D E T R L Q L E A V N 1 T D LSE N R K Q D K R F A F 1 R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L c T A M E A D Q P V S L T N M P D E G V M V T K F Y F Q E D E

    ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (G) az (F) aminosavszekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.
30. 30. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 80%-ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNS-molekulát tartalmaz.
31. 31. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 90%-ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNS-molekulát tartalmaz.
32. 32. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 95%-ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNS-molekulát tartalmaz.
33. 33. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz:

    (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:

    (U) (X) P S G R K S s K. M Q A F R I W D V N Q K. T F Y L R N N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L C T A Μ E A D Q P V S L T N M P D E G V M V T K F Y F Q EDE

    ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 5%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.
34. 34. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazó DNS-molekulát

    50 tartalmaz:

    (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:

    (U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q κ T F Y L R N N Q L VÁG Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

    HU 222 810 Bl

    ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE

    GVMVTKFYFQEDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekré- 5 ciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy

    MRPSGRKSSKMQAFR IW NQLVAGYLQGPNVNLEE LFLG 1HGGKMCLSCVKS NI TDLSENRKQDKRFAF ESAACPGWFLCTAMEAD GVMVTKFYFQEDE (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 1%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.
35. 35. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi aminosavszekvenciájú polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz:

    DVNQKTFYLRN

    KIDVVPIEPHA

    GDETRLQLEAV

    IRSDSGPTTSF

    QPVSLTNMPDE
36. 36. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak részletét tartalmazó 20 N-terminális szekréciós szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz:

    MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC
37. 37. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy prokarióta sejt.
38. 38. A 37. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy E. coli-sejt.
39. 39. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy emlőssejt.
40. 40. A 39. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy CHO-sejt.
41. 41. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként a natív IL-li-inhibitor promoterétől eltérő promotert funkcio25 nálisan a kódolószekvenciához kapcsoltan tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz.