HU215434B - Eljárás interleukin-1 inhibitorok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, vektorok és gazdasejtek előállítására - Google Patents

Abstract

Interleűkin–1 alfa és interleűkin–1 béta közül legalább az egyik ellenhatásős interleűkin–1 inhibitőrt (IL–1i) állítanak elő. Az előállítástrekőmbináns DNS-eljárással végzik, eg , a fiziőlógiásan fűnkcióképesinterleűkin–1 inhibitőrt kódőló DNS-szekvenciát is elkülönítenek. ŕ

Description

A találmány tárgya interleukin- 1 inhibitorok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, a szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-vektorok, a vektort tartalmazó gazdasejtek, rekombináns GT10- ILIi— 2A DNS-molekula és rekombináns DNS-eljárás útján való előállításuk.

A. IL-1

Az interleukin- 1-ek a fehérjéknek számos sejttípus, köztük monociták és egyes makrofágok által előállított csoportja. Ez a csoport legalább két 17- 18 kilodalton molekulatömegű fehérjét foglal magában, amelyek interleukin- 1- a és interleukin- 1- β néven ismertek. Ezek a fehérjék számos, a gyulladásos folyamatokban és az immunválaszokban szerepet játszó különböző célsejtre fontos fiziológiás hatást fejtenek ki. Ezek a fehérjék a T-sejtekre ko-mitogének (fitohemaglutininnel), a kötőszöveti sejteket és a porcsejteket látens kollagenáz kiválasztására késztetik, továbbá növelik az endotheliális sejteknek a neutrofil sejtek iránti felületi tapadó erejét. Ezenkívül a hipotalamuszra pirogénként hatnak, fokozzák az izomfehérje katabolizmusát, és a hepatocitákat a fehérjék egy „akut fázis reaktáns” néven ismert csoportjának szintetizálására késztetik. így az interleukin- 1-ek (IL- 1) nyilvánvalóan fontos szerepet játszanak a szervezet fertőzéssel és sérüléssel szembeni válaszában.

B. Az IL-1 patológiás szerepe

Szokásosan jótékony hatása ellenére azonban ismeretessé váltak olyan körülmények, amelyek mellett az IL- 1 káros hatású. Például az IL- 1 növelheti a kollagenáz szintjét a gyulladásos ízületben, és a reumatoid arthritisz immunpatológiájának mind akut, mind krónikus szakaszában mediátorként vehet részt. Az IL- 1 felelős lehet az endotheliális sejtek működésének megváltozásáért, a leukociták és limfociták kemotaxisának irányításával és az ízületi szövetbe való vándorlásuk irányításával, hajszálérburjánzás kiváltásával, és a makrofágoknak az ízületi burokban való felgyűlésének fokozásával a betegség akut fázisa során. A szövetpusztulás fázisában az IL- 1 mediátorként vesz részt a kötöszöveti és porcsejtekböl felszabaduló enzimek stimulálása révén a szövetkárosodás kiváltásában.

Túlzott IL-1-termelést mutattak ki továbbá pszoriázisban szenvedő betegek bőrében, és magas IL- 1-szinteket találtak pszoriázisos arthritiszben szenvedő betegek ízületi folyadékában. A pszoriázisos arthritiszben szenvedő betegek gyulladt ízületében lévő sejtek által szabaddá tett IL- 1 szövetpusztulást közvetíthet azáltal, hogy fokozza enzim szabaddá válását más sejtekből. A Reiter-féle szindróma ízületi patológiája hasonló ahhoz, amit pszoriázisos arthritisz és reumatoid arthritisz esetén észlelünk. A gyulladásos arthritiszek e három különböző formájában az IL- 1 a szövetpusztulásban mediátorként vesz részt. IL- 1 található továbbá az oszteoarthritiszben szenvedő betegek ízületi folyadékában is. A porcsejtek által felszabadított IL- 1 ebben a betegségben részt vesz az ízületi porcok pusztításában.

Az IL- 1 növelheti az autoimmun betegségek súlyosságát is. Például szisztémás lupus erithemában szenvedő betegek perifériás vérsejtjeiben csökkent

IL- 1-termelést észleltek. Továbbá a B-limfocitafunkcióban bekövetkező bizonyos változások kapcsolatosak lehetnek az IL- 1-termelés vagy az IL- 1 hozzáférhetőségének rendellenességeivel.

Túlzott IL- 1-termelést észleltek börkeményedéses betegek perifériás monocitáiban, és az IL- 1-et a kötöszöveti sejtek kollagéntermelésének fokozása révén a fibrózis egy lehetséges okozójaként említették. A dermatomiozitiszben bekövetkező szövetkárosodás mechanizmusa ugyancsak kapcsolatos lehet sejt által közvetített immunitással, ezért az IL- 1 ebben a patofiziológiás folyamatban mediátorként vehet részt.

Az akut és krónikus szövetközi tüdőbetegségre a tüdő kötöszöveti sejtjeinek fokozott kollagén termelése jellemző, amit az IL- 1 fokozhat. Fokozott kisvérköri nyomás állatmodellen való legújabb vizsgálatai azt mutatják, hogy az IL- 1 felelős lehet az endotheliális sejtek változásának kiváltásáért, ami a tüdöartériák szűkülésével jár. Ez a szűkülés az oka a fokozott kisvérköri nyomás bekövetkezésének, és további másodlagos károsodásoknak. így az IL- 1 inhibitorok az ilyen tüdőbetegségek kezelésében hasznosak lehetnek.

A legújabb vizsgálatok alapján azt ismertették, hogy az IL- 1 képes az inzulintermelésben részt vevő Langerhans-szigetek β-sejtjeinek közvetlen károsítására. Feltételezések szerint az IL- 1 sejtkárosító hatása a fiatalkori diabetes mellitus akut fázisának elsődleges eseménye.

Az akut és krónikus glomerulonefritisz számos formájában a monociták és makrofágok vesékbe való beszűrödése jut érvényre. Ezen sejtek IL- 1-kibocsátása okozhatja az egyéb gyulladásos sejtek helyi felszaporodását, ami végül a vesékben fibrotikus reakciókhoz és gyulladásos károsodáshoz vezet.

Kimutatták, hogy köszvény és pszeudoköszvény esetén a szövetekben vagy folyadékokban található kristályok közvetlenül fokozzák a makrofágok IL-1felszabadítását. így ezekben a betegségekben az IL- 1 a gyulladásos ciklus fontos mediátora lehet.

Az IL- 1 képes a csontok kalciumvesztésének kiváltására, és gyulladásos ízületi betegségeknél előforduló oszteoporózisért felelős lehet.

A pszoriázisban szenvedő betegek keratinocitái nagy mennyiségű IL-l-et szabadítanak fel. Ez a mediátor lehet felelős azért a másodlagos sejtburjánzásért és felszaporodásért, ami az ebben a betegségben szenvedő betegek bőrén bekövetkezik.

Az IL- 1 a fontos endogén pirogének egyike, és felelős lehet bizonyos fertözéses betegségekben bekövetkező láz jelentős részének kiváltásában, például baktériumok vagy vírusok okozta akut lázas betegségek esetén.

A szarkoidózisra a test sok különböző szervében bekövetkező granulómás elváltozás jellemző. Az IL- 1 képesnek bizonyult arra, hogy in vitro granulómaképzödést váltson ki, és részt vehet ebben a folyamatban szarkoidózisban szenvedő betegek esetén.

A perifériás monociták fokozott IL- 1-termelését figyelték meg mind Crohn-féle kórban, mind fekélyes kolitiszben. Az IL- 1 bélben történő helyi felszabadulása ezen betegségek gyulladásos ciklusa fokozásában fontos mediátor lehet.

HU 215 434 Β

Egyes limfómákra láz, oszteoporózis, továbbá szekunder arthritisz is jellemző. Egyes limfóma sejtek esetén in vitro fokozott IL-1-kiválasztást észleltek, ezek felelősek lehetnek ezen rosszindulatú betegség egyes klinikai tüneteiért. Ugyancsak egyes malignans limfociták által termelt IL- 1 lehet felelős a leukémiák esetében jelentkező láz, akut fázisbeli válasz és leromlás bekövetkeztéért.

Az agyban lévő asztrociták IL- 1-kibocsátását tartják felelősnek a fibrózis kiváltásában, ami érelzáródás folytán az agy károsodását eredményezheti.

C. IL-1 inhibitor alkalmazása

A fenti és egyéb olyan körülmények esetén, amelyekben az IL- 1 káros hatást fejt ki, nyilvánvalóan klinikailag hasznosítható az IL-1 inhibitorhatás. Mivel az IL- 1 a T-sejtek ko-mitogénje, központi szerepe van az autoimmun és egyéb immunbetegségek kifejlődésében, így szisztémásán adagolva az IL- 1 inhibitorok hasznos immunszupresszív szerek lehetnek. Helyi alkalmazás esetén az ilyen IL- 1 inhibitorok a gyulladt ízület és más gyulladásos helyek szövetkárosodásainak megelőzésére szolgálhatnak. Valójában a szövetkárosodások megelőzésére egyes IL- 1 inhibitorok még hatékonyabban alkalmazhatók kollagenáz inhibitorokkal együttesen.

Az IL- 1 hatásába való terápiás beavatkozás lehetséges a szintézis, a kiválasztás, a célsejt kötődése vagy a fehérjére adott válasz szintjén. Az IL-l-et a monocita/makrofág és egyéb sejtek szintetizálják lipopoliszacharidokra, komplement fragmentumokra és vírusokra adott válaszként. Minden olyan molekula, amely megakadályozza ezeknek az indukáló szereknek a termelő sejtekhez való kötődését, vagy amelyik ezen sejtek fiziológiájára kifejtett hatásukba beleavatkozik, az IL- 1 hatásregulátoraként szolgálhat. Az IL- 1 nem egy hagyományos kiválasztórendszer révén választódik ki, mivel az izolált mRNS-ek, amelyek a fehérjéknek legalább két 30 kD-os prekurzorát kódolják, nem tartalmaznak hidrofób szignál szekvenciát. Az aktív fehérjének az inaktív prekurzorból való szabaddá válásához valószínűleg ennek a prekurzornak a proteolízise szükséges. Elméletileg egy olyan inhibitor, amely gátolja az IL- 1 vagy IL- 1ek prekurzoraikból való felszabadulását, szabályozhatná az IL- 1-hatást. Az IL- 1 feltehetően egy klasszikus, receptor által közvetített úton hat a célsejtekre, bár ezt a receptort még nem izolálták. így lehetséges, hogy egy olyan molekula, amely megakadályozza az IL- 1-nek a receptoraihoz való kötődését, szabályozhatja az IL- 1hatást is. Továbbá, bár még nem teljesen ismertek a receptorkötődést kővető intracelluláris események, lehetséges, hogy léteznek olyan szerek, amelyek megakadályozhatják a sejteknek más receptor által közvetített eseményekre való válaszát, és így gátolhatják az IL- 1hatást. A fentiek folytán feltételeztük, hogy fehérjék és más kis molekulák képesek lehetnek az IL- 1 egy vagy több ilyen módon való hatásának gátlására.

Nem várt módon legalább két ilyen IL- 1-gátló fehérjét találtunk, amelyek IL- 1-gátló tulajdonságokkal bírnak. Ezeket a molekulákat olyan tisztított formában nyertük ki, amelyek szakembert képessé tesznek arra, hogy meghatározza aminosavszekvenciájukat. Továbbá egy olyan sejtkészítményt jellemeztünk, amely ezeket a fehérjéket termeli, és egy olyan mRNS-t, amely ezeknek a szintéziséhez vezet. Végül antiszérumot fejlesztettünk ki, amely megkönnyíti a cDNS expressziós könyvtárak átvizsgálását olyan gének keresésére, amelyek ezeket az inhibitorokat kódolják. Ezek a reagensek együtt lehetővé teszik a klónozandó IL- 1 inhibitorokat kódoló cDNSek nyerését. Ezek a gének továbbá lehetővé teszik az IL- 1 által közvetített patofiziológiás állapotok kezelésére alkalmas gyógyászati készítményekben használható IL- 1 inhibitorok nagyléptékű termelését.

A találmány tárgya IL- 1 inhibitorok („IL- 1 i”) általában, és különösen monocita eredetű IL- 1 inhibitorok. A találmány tárgyát képezik még ezen inhibitorok biológiailag aktív analógjai is.

A találmány tárgya az IL- 1- a vagy IL- 1- β vagy ezek kombinációja ellen hatásos IL- 1 inhibitorok tisztított formában való előállítása. A találmány további célja ezen inhibitorok olyan tiszta formában való előállítása, amely lehetővé teszi aminosavszekvenciájuk megállapítását. A találmány célja továbbá bizonyos IL- 1 inhibitorok aminosavszekvenciájának meghatározása. A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen IL- 1 inhibitorok olyan biológiailag aktív analógjainak azonosítása, amelyek azonos vagy fokozott tulajdonságokkal bírnak.

A találmány tárgya továbbá az ismertetett IL- 1 inhibitorok termelésére szolgáló rekombináns DNS-rendszer előállítása. A találmány tárgya még olyan tisztított IL- 1 inhibitorok előállítása, amelyek IL- 1 ellen hatásos gyógyászati készítmények hatóanyagaiként használhatók.

A találmány további tárgyai és előnyei a leírás további részében találhatók, vagy abból nyilvánvalóvá válnak, vagy a találmány gyakorlatából ismerhetők meg.

A találmány céljának elérése érdekében olyan IL- 1 inhibitorokat ismertetünk, amelyek IL- 1 ellen gátló hatást fejtenek ki. Az előnyös inhibitorokat tisztított formában izoláltuk monocitakondicionált tápközegből, ahol a monocitákat IgG bevonatú lemezeken tenyésztettük.

A találmány szerinti előnyös inhibitorok az 1, 2 és 3 inhibitorok. Az 1 és 2 inhibitorok olyan fehérjék, amelyek nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid-gélelektroforézis (SDS-PAGE) végzésekor a 22- 23 kDa fehérjéknek jellemző helyzetig futnak, és Mono Q FPLC oszlopról megszabott körülmények között 52 mmol/l-es, illetve 60 mmol/l-es nátrium-kloriddal eluálhatók. A 3 inhibitor SDS-PAGE elvégzésekor egy 20 kDa fehérjének jellemző helyig fut, és Mono Q FPLC oszlopról megszabott körülmények között 48 mmol/l-es nátrium-kloriddal eluálható. A találmány céljának elérésére a találmány magában foglal egy olyan gyógyászati készítményt is, amely legalább egy, a találmány szerinti IL- 1 inhibitort vagy biológiailag aktív analógját tartalmazza.

A találmány céljával összhangban a találmány tárgyát képezi az IL- 1 inhibitorok és analógjaik létrehozására alkalmas rekombináns DNS-rendszer. Ennek a rendszernek egy előnyös megvalósítási formája IL- 1 inhibitor kódolására alkalmas legalább egy cDNS kiónt vagy szintetikus ekvivalensét, és a fenti IL-1 inhibito1

HU 215 434 Β rok kifejezésére alkalmas expressziós rendszert alkotó vektorokat és sejteket tartalmaz. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti cDNS kiónok azonosítására alkalmas antiszérumok. Az IL- 1 inhibitorok termelésére alkalmas expressziós rendszerek, amelyek a fenti cDNS kiónokat, analógjaikat vagy más, a fenti inhibitorokat kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazzák, ugyancsak a találmány tárgyát képezik.

Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetését adjuk.

Az l.A és l.B ábrákon két, metabolikusan ³⁵S-metioninnal jelzett monocita felülúszó Mono Q oszlopon való kromatografálásával kapott proteinprofilt ábrázoljuk. Az l.A ábrán bemutatott profilt IgG bevonatú Petri-csészén tenyésztett sejtek felülúszójából, az l.B ábrán szereplőt magzati borjúszérummal bevont Petri-csészéken tenyésztett sejtek felülúszójából nyertük.

A 2.A ábrán az l.A és l.B ábrákon bemutatott tartományokon lévő frakciókat tartalmazó gél ezüsttel festett képét mutatjuk be.

A 2.B ábra a 2.A ábrán látható gél autoradiogramja.

A 3.A, 3.B és 3.C ábrák az 1. példa szerint előállított tisztított IL- li adatait tartalmazzák. A 3.A ábra a kromatográfiás adatokat tartalmazza, ezekre ráillesztettük a radioaktivitásmintát. A 3.B ábra a 3.A ábrán megjelölt frakciókat mutatja a gélen futtatott minta ezüsttel festett formájában. A 3.C ábra a 3.B ábrán bemutatott gél autoradiogramja.

A 4.A ábrán a Mono Q oszlopon tisztított IL- la Superose 12 gélen gélszűréssel kapott frakcióit mutatjuk be, a 4.B ábra a 4. A ábra jelölt 37-38. frakcióinak azonos körülmények között ismételt gélszűrésével kapott frakciókat mutatja.

Az 5.A és 5.B ábrákon egér-antiszéramok Westernanalízisének eredményeit mutatjuk be. Az 5.A ábra az immunogén (Mono Q oszlopon tisztított LI- li) normál egér-antiszérum (NMS) és az 5 egér antiszéramának elegye alkalmazásával történő elemzésének eredményét mutatja. Az 5.B ábrán az 5 egér (A-E) vérének külön alkalmazásával történt elemzés eredménye látható.

A 6. ábrán a pSVXVPL2IL- li plazmid szerkezetét mutatjuk be.

A 7. ábrán apMK- SGE: IL- li plazmid szerkezetét mutatjuk be.

A 8.A-D. ábrákon az IL-li-a-ra vonatkozó jellemzőket mutatunk be. A 8. A és 8.B ábrákon kromatográfiás eredmények láthatók, a 8.C ábrán a 8.B ábrán látható frakcióknak megfelelő, gélen futtatott, ezüsttel színezett minta látható. A 8.D ábra az előbbi autoradiogramja.

A 9.A és 9.B ábrák az IL- li- β-ra vonatkozó eredményeket tartalmaznak. A 9.A ábrán kromatográfiás eredményeinket mutatjuk be, a 9.B ábrán az SDS-PAGE eredménye látható.

A 10. ábrán az IL- li- a peptid elválasztásának eredményét mutatjuk be.

All. ábrán az IL- li- β peptid elválasztásának eredményét mutatjuk be.

A 12.A ábrán a GT10-IL1Í-2A a 6. példa szerint EcoRI-val emésztett mintájának gélen való elektroforézisével kapott minta fényképét mutatjuk be.

A 12.B ábrán a 12.A ábrán bemutatott gél Southern biot módszerrel kapott autoradiogramját mutatjuk be.

A 13. ábrán a lambda GT10- ILII— 2A proteint kódoló tartománya DNS-szekvenciájának egy részét, valamint a várható aminosavszekvenciát mutatjuk be a 6. példa szerint.

A 14. ábrán a GT10-IL1Í-2A nukleotidszekvenciáját mutatjuk be.

A 15. ábrán egy peptidet mutatunk be, amely magában foglal többek között egy LI- li-szekvenciát és egy szekréciós vezető szekvenciát.

A következőkben a találmány előnyös megvalósítási módját írjuk le. Ez a leírás a példákkal együtt a találmány lényegének bemutatására szolgál.

A. Humán monocitákból származó inhibitor

Amint azt az előzőekben már ismertettük, a találmány tárgya tisztított formában elkülönített IL- 1 inhibitorok. Előnyösen az IL- 1 inhibitorok humán monocitákkal kondicionált tápközegből származóak, ahol a monocitákat IgG bevonatú edényeken tenyésztjük. Ezenkívül a találmány magában foglal bármilyen lényegében tisztított IL- 1 inhibitort, amely biológiailag ekvivalens a humánmonocita-tartalmú tápközegből származó inhibitorral.

A „biológiailag ekvivalens” megjelölésen a leírásban és az igénypontokban is azt értjük, hogy az IL- 1 inhibitorkompozíció hasonló módon képes meggátolni az IL- 1 hatását, mint a monocitákból izolált natív IL- 1 inhibitor, de a hatás mértéke nem szükségszerűen azonos. A „lényegében homológ” megjelölésen a leírásban és az igénypontokban a monocitákkal kondicionált tápközeg böl származó natív IL- 1 inhibitorhoz való olyan mértékű homológiát értünk, amely meghaladja bármely előzőekben ismertetett IL- 1 inhibitor homológiáját. Előnyösen a homológia mértéke 70% fölötti, még előnyösebben 80% fölötti, ennél is előnyösebben 90% fölötti. Különösen előnyös az inhibitoroknak az a köre, amely a 95%-ot meghaladó mértékben homológ a natív inhibitorral. A homológia százalékos értékét Dayhoff, M. D. módszerével számítjuk ki [Atlas of Protein Sequence and Stracture, 5,124 (1972), National Biochemical Research Foundation Washington, D. C.], amelyet leírásunkba referenciaként beépítünk, azaz azon két szekvencia közül a kisebb aminosav egységeinek számát adjuk meg, amely a szekvenciában azonos aminosavegységeket tartalmaz, ha az összehasonlítást olyan aminosavláncon végezzük, amely 100 aminosavegységre 4 megszakítással bír.

A találmány szerinti IL- 1 inhibitorok monocitakondicionált tápközegből származnak, és első ízben kerültek tisztított formában elkülönítésre. Az IL- 1 inhibitorok vonatkozásában „tiszta forma” vagy „tisztított forma” megjelölésen azt értjük, hogy a készítmény lényegében mentes más olyan fehérjéktől, amelyek nem IL- 1 inhibitor fehérjék. Előnyösen a találmány szerinti IL-1 inhibitorok legalább 90%-os tisztaságúak, még előnyösebben 95%-os tisztaságúak.

A példában leírt eljárásokkal legalább háromféle tisztított IL- 1 inhibitort izoláltunk. Ezek az 1 inhibitor, a 2 inhibitor és a 3 inhibitor. Az 1 inhibitor SDS-PAGE szerint 22-23 kDa molekulatömegű, izoelektromos

HU 215 434 Β pontja mintegy 4,8, és Mono Q FPLC oszlopról pH= 7,6os trisz pufferben mintegy 52 mmol/l-es nátrium-kloridoldattal eluálható. A 2 inhibitor 22- 23 kDa molekulatömegű fehérje, pl=4,8, Mono Q oszlopról 60 mmol/l-es nátrium-klorid-oldattal eluálható. A 3 inhibitor 20 kDa molekulatömegű fehérje, a Mono Q oszlopról 48 mmol/les nátrium-klorid-oldattal eluálható. Az 1, 2 és 3 inhibitorok immunológiai és funkcionális szempontból hasonlóak. Ezeket az inhibitorokat tisztított formában előállítottuk, és így aminosavszekvenciájukat is meg tudtuk határozni. A tisztított inhibitorokat az ABI fehérjeanalizátor (ABI Protein Sequencer) és az ehhez adott technikai módszertani leírás alkalmazásával vizsgálva az aminosavszekvencia lényeges részét meghatároztuk.

A 3. példában ismertetjük a három IL- 1 inhibitor, nevezetesen az IL- li-X, IL- li-a és IL- li-b aminosavszekvenciájára vonatkozó adatokat.

Felismertünk és előállítottunk legalább egy, egy IL- 1 inhibitor ellen termelődő antitestet is. Más, azonos vagy különböző IL- 1 inhibitorok ellen ható poliklonális és monoklonális antitestek is előállíthatok szakember számára ismert módon. Egy adott poliklonális antitest előállítását a 4. példában ismertetjük.

B. Rekombináns inhibitor

1. Általános ismertetés

Rekombináns DNS-eljárást ismertetünk IL- 1 inhibitor előállítására. A találmány egy megvalósítási formája szerint az aktív funkciós helyek biológiailag ekvivalensek az emberből izolált natív IL- 1 megfelelő funkciós helyeivel. Az IL- 1 inhibitorok előállításának irányítására természetes vagy szintetikus DNS-szek5 vencia használható. Az eljárás a következő műveleteket foglalja magában:

a) olyan DNS-szekvencia előállítása, amely képes a gazdasejtet úgy irányítani, hogy az IL- 1 inhibitor aktivitással bíró fehérjét termeljen;

b) a DNS-szekvenciának olyan vektorba való klónozása, amely bevihető egy gazdasejtbe, és ott szaporítható, a vektornak olyan operációs elemeket kell tartalmaznia, amelyek a DNS-szekvencia kifejezését lehetővé teszik;

c) a szintetikus DNS-szekvenciát és az operációs elemeket tartalmazó vektor bevitele olyan gazdasejtbe, amely képes az IL- 1 inhibitort kódoló DNS kifejezésére;

d) a gazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a vektor megsokszorozódását és az inhibitor kifejeződését;

e) az inhibitor elkülönítése és

f) annak lehetővé tétele, hogy az inhibitor aktív tercier szerkezetet vegyen fel, miáltal az IL- 1 inhibitor aktivitással fog rendelkezni.

A találmány oltalmi körébe tartozik az alábbi szekvenciájú fehérje is:

HU 215 434 Β ahol X jelentése cisztein, szerin vagy alanin, és Z jelentése arginin vagy prolin.

2. DNS-szekvenciák

A találmány szerinti eljárásban való használatra szánt DNS-szekvenciákat az 5. és 6. példákban ismertetjük. Ezek a szekvenciák szintetikus és természetes DNS-szekvenciákat tartalmaznak. A természetes szekvenciák továbbá tartalmaznak cDNS- vagy genomDNS-szegmenseket.

A 6. példa szerint olyan DNS molekuláris kiónját állítjuk elő, amely az 1- 3. példák szerint izolált fehérjével azonos fehérje kódolására képes. A 6. példa szerinti eljárásban egy GT10-IL1Í-2A plakkot izolálunk a GT- 10 könyvtárból. A plakkban lévő fágot tenyésztjük, a DNS-t elkülönítjük, és EcoRI-val emésztjük. Az 1850 bázispárból álló EcoRI-fragmens hordozza az IL- 1 inhibitor kódolására alkalmas szekvenciát. A 13. ábrán bemutatjuk az EcoRI-fragmens részleges DNSszekvenciáját.

A leírásban adott kitanítás és az ismert eljárások alkalmazásával szakember más szintetikus polinukleotidszekvenciák előállítására is képes. A polinukleotid-szintézis jelenlegi állását bemutató munkákként említjük a következőket: Matteucci, M. D. és Caruthers, Μ. H.; J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981) és Beaucage S. L. és Caruthers, Μ. H.; Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981), valamint az ABI oligonukleotid-szintetizátorhoz adott használati utasításokat, amelyek mindegyikét leírásunkba referenciaként építjük be.

Ezek a szintetikus szekvenciák lehetnek a következőkben részletesebben ismertetésre kerülő természetes szekvenciákkal azonosak, vagy tartalmazhatnak az abban lévőtől eltérő nukleotidokat. A találmány egy olyan megvalósítási módjában, amelyben olyan szintetikus szekvenciákat alkalmazunk, amelyek a természetes DNSszekvenciában jelen lévőtől eltérő nukleotidokat tartalmaznak, úgy választjuk meg ezeket a különböző szekvenciákat, hogy azok még a monocitákból izolált IL- li primer szerkezetével egyező primer szerkezetű polipeptidet kódoljanak. Egy másik megvalósítási mód szerint a természetestől eltérő nukleotidokat tartalmazó szintetikus szekvencia olyan polipeptidet kódol, amelynek biológiai aktivitása azonos az IL- li itt leírt aktivitásával.

Továbbá a DNS-szekvencia lehet a természetes szekvenciának egy töredéke, azaz a természetben előforduló polinukleotid egy töredéke, az ilyen töredék elkülönítését és tisztítását sem valósították meg ez ideig. Egy megvalósítási mód szerint a DNS-szekvencia a cDNS-könyvtárból izolált restrikciós fragmens.

Egy további megvalósítási mód szerint a DNS-szekvenciát humán genomkönyvtárból izoláljuk. Ilyen, ebben a megvalósítási módban alkalmazható könyvtárat ismertetnek például Lawn és munkatársai [Cell, 15, 1157-1174 (1978)], munkájukat leírásunkba referenciaként építjük be.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a természetes DNS-szekvenciát az alábbi lépésekből álló eljárással állítjuk elő:

a) Humán cDNS-könyvtár készítése olyan sejtekből, előnyösen monocitákból, amelyek képesek az IL-1 inhibitornak egy vektorba, majd egy sejtbe való bevitelére, amely utóbbiban a cDNS sokszorozódásra, és részben vagy teljesen való kifejeződésre képes;

b) a humán DNS-könyvtár vizsgálata legalább egy olyan mintával, amely képes az IL- 1 inhibitorgénhez vagy -fehérjéhez kötődni;

c) legalább egy olyan klón azonosítása, amely az inhibitor kódolására képes gént tartalmaz, az azonosítás a kiónnak azon a képességén alapszik, hogy a génnek vagy fehérjetermékének legalább egy mintáját képes megkötni;

d) a kiválasztott klónból vagy klónokból az inhibitor kódolására képes gén vagy génrészlet elkülönítése;

e) a génnek vagy megfelelő részletének olyan operációs elemekhez való kötése, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a gén a gazdasejtbe bevihető legyen, és ott kifejeződjön.

Az eljárásban alkalmazható DNS-szekvencia is azonosítható és elkülöníthető az alábbi műveleti sor segítségével:

a) Humán genom-DNS-könyvtár készítése, előnyösen recArecBC E. coli gazdaszervezetben szaporítva;

b) a humán genom-DNS-könyvtár vizsgálata legalább egy olyan mintával, amely egy IL- 1 inhibitorgénhez vagy annak fehérjetermékéhez képes kötődni;

c) legalább egy olyan klón azonosítása, amely az inhibitor kódolására alkalmas gént tartalmazza, az azonosítás a kiónnak azon a képességén alapszik, hogy a gén vagy fehérjeterméke legalább egy mintájához kötődik;

d) az inhibitort kódoló gén izolálása az azonosított klónból (klónokból); és

e) a génnek vagy megfelelő fragmensének olyan operációs elemekhez való kötése, amelyek a génnek a gazdasejtbe való beviteléhez és kifejeződéséhez szükségesek.

A fenti eljáráshoz alkalmas természetes DNS-szekvencia izolálásánál előnyös a két restrikciós hely olyan meghatározása, hogy azok a megfelelő génen vagy génrészleten belül, annak végéhez legközelebbi részén helyezkedjenek el.

Ez után a megfelelő gént tartalmazó DNS-szegmenst megfelelő restrikciós endonukleázok alkalmazásával eltávolítjuk a maradék genomanyágtól. A kimetszést követően a DNS-szekvencia 3’ és 5’ végeit és minden exon kapcsolódást helyreállítunk, hogy olyan megfelelő DNS-szekvenciát nyerjünk, amely az IL- 1 inhibitorfehérje N- és C-terminálisát kódolni képes, és képes a DNS-szekvenciának operációs elemeihez való kapcsolására.

3. Vektorok

a) Mikroorganizmusok, különösen E. coli

A találmány szerinti eljárásban használható vektorok közé tartozik bármely olyan vektor, amelybe egy, az előzőekben ismertetett DNS-szekvencia és előnyös vagy kívánt operációs elemei beépíthetők, és amely vektor ezt követően egy gazdasejtbe bevihető, és ebben a sejtben szaporodik. Előnyösek azok a vektorok, amelyeknek restrikciós helyei jól dokumentáltak, és amelyek a DNS-szekvencia transzkripciójához előnyös

HU 215 434 Β vagy szükséges operációs elemeket tartalmazzák. Lehetnek a találmánynak azonban olyan megvalósítási módjai is, amelyekben jelenleg még nem ismert olyan vektorokat alkalmaznak, amelyek egy vagy több itt leírt cDNS-szekvenciát tartalmaznak. Különösen előnyös azonban, ha ezen vektorok mindegyike rendelkezik az alábbi jellemzők közül néhánnyal, vagy ezek mindegyikével:

(1) Rendelkezik a gazdaszervezet szekvenciáinak egy minimális számával; (2) képes a kívánt gazdaszervezetben való stabil fennmaradásra és szaporodásra; (3) képes arra, hogy a kívánt gazdaszervezetben nagy számban legyen jelen; (4) szabályozható promoterrel bír, amelyik úgy helyezkedik el, hogy elősegíti az érdeklődésre számot tartó gén transzkripcióját; (5) legalább egy olyan marker DNS-szekvenciája van, amely a plazmidnak egy, a DNS-szekvencia beiktatási helyétől eltérő részén egy megválasztható sajátosságot kódol; és (6) a transzkripció lezárására képes DNS-szekvencia.

A találmány szerinti, a DNS-szekvenciát tartalmazó és annak kifejezésére képes klónozó vektorok egy előnyös megvalósítási módban különböző operációs elemeket tartalmaznak. Ezek az „operációs elemek” legalább egy promotert, legalább egy Shine-Dalgarnoszekvenciát és iniciátor kodont, továbbá legalább egy terminátor kodont tartalmaznak. Előnyösen ezen „operációs elemek” magukban foglalnak még legalább egy operátort, legalább egy vezető szekvenciát a fehérjéknek az intracelluláris térből való kivitelére, legalább egy, egy regulátor proteinre vonatkozó gént, és bármely más olyan DNS-szekvenciát, amely a vektor DNS megfelelő transzkripciójához, és ezt követő transzlációjához szükséges vagy előnyös.

Ezen operációs elemek közül bizonyosak jelen lehetnek a találmány szerinti előnyös vektorok mindegyikében. Bármely további szükséges operációs elem hozzáadható ezekhez a vektorokhoz szakember számára ismert módon, különösen a leírásban adott kitanítás figyelembevételével .

A gyakorlatban ezen vektorok előállítása olyan módon lehetséges, ami lehetővé teszi, hogy könnyen elkülöníthetők, összeállíthatók és fele serélhet ők legyenek. Ez lehetővé teszi számos funkcionális gén összeállítását ezen elemek és a DNS-szekvenciák kódoló régióinak kombinálásával. Továbbá ezen elemek közül számos több, mint egy gazdaszervezetben alkalmazható. Továbbá ezen vektorok bizonyos előnyös megvalósítási mód mellett olyan DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik regulátorként („operátorként”) való működésüket, más DNS-szekvenciák regulátor fehérjék kódolására képesek.

i) Regulátorok

Ezen regulátorok az egyik megvalósítási mód szerint bizonyos környezeti feltételek mellett megakadályozzák a DNS-szekvencia kifejeződését, míg más környezeti körülmények mellett lehetővé teszik a DNS-szekvencia transzkripcióját, és az ezt követően a DNS által kódolt fehérje kifejeződését. Különösen előnyös, ha a regulátor szegmensek a vektorba úgy iktatódnak be, hogy a DNSszekvencia kifejeződése nem következik be, vagy rendkívül csökkent mértékben következik be akkor, ha például nincs jelen izopropil-tio-p-D-galaktozid. Ebben az esetben a DNS-szekvenciát tartalmazó transzformált mikroorganizmus kívánt sűrűségig szaporítható az IL- li kifejeződésének megkezdődését megelőzően. Ebben a megvalósítási módban a kívánt fehérje kifejeződését úgy indítjuk meg, hogy a kívánt sűrűség elérését követően olyan anyagot adunk a mikrobiális környezetbe, amely a DNS-szekvencia kifejeződését váltja ki.

ii) Promoterek

Az expressziós vektoroknak olyan promotereket kell tartalmazniuk, amelyeket a gazdaszervezet a saját fehérjéinek kifejezésére használhat. Bár általánosan használt a laktóz promoterrendszer, más mikrobiális promotereket is izoláltak és jellemeztek már, szakember ezeket is alkalmazhatja a rekombináns IL- li kifejezésére.

iii) Transzkripció terminátor

A transzkripció terminátorok a vektor stabilizálására szolgálnak. Különösen aRosenberg, M. és Court J. [Ann. Rév. Génét., 13, 319- 353 (1979)] által leírt szekvenciák alkalmasak a találmány szerinti eljárásban, ezeket leírásunkba referenciaként építjük be.

iv) Nem transziáit szekvencia

Megjegyezzük, hogy egy előnyös megvalósítási formában kívánatos lehet a kódoló régió 3’ vagy 5’ végének olyan helyreállítása, hogy nem átfordított 3’ vagy 5’ szekvenciák beépülése legyen lehetséges a géntranszkriptumba. Az ilyen nem átfordított szekvenciák közé tartoznak azok, amelyek az mRNS-t stabilizálják, ezeket Schmeissner, U„ McKenney, K„ Rosenberg, M. és Court, D. ismertetik a J. Mól. Bioi., 176, 39-53 (1984) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be.

v) Riboszóma kötőhelyek

Az idegen fehérjék mikrobiális kifejezéséhez néhány operációs elem szükséges, amelyek közé tartoznak - bár nem ezekre korlátozottak - a riboszóma kötőhelyek. Egy riboszóma kötőhely egy olyan szekvencia, amelyet egy riboszóma felismer, és a fehérjeszintézis kezdeteként ehhez kötődik; ezt Gold, L. és munkatársai (Ann. Rév. Microbio., 35, 557-580) és Marquis, D. M. és munkatársai [Gene, 42, 175- 183 (1986)] ismertetik, mindkét szakirodalmi helyet referenciaként építjük be leírásunkba. Egy előnyös riboszóma kötőhely a következő: GAGGCGCAAAAA (ATG).

vi) Vezető szekvencia és transzlációs kapcsoló

Előnyös továbbá, ha egy megfelelő kiválasztó vezető (szignál) szekvenciát kódoló DNS van jelen a DNSszekvencia 5’ végén, amint azt Watson, Μ. E. (Nucleic Acids Res„ 72, 5145-5163) ismerteti, ha a fehérjét a citoplazmából kell kiválasztani. Watson előbbi munkáját referenciaként beépítjük leírásunkba. A vezető szekvenciát kódoló DNS-nek olyan helyzetben kell lennie, amelyik lehetővé teszi egy olyan fúziós fehérje képződését, amelyben a vezető szekvencia közvetlenül szomszédos és kovalensen kötött az inhibitorhoz, azaz a két DNS-kódoló szekvencia között nem lehet semmiféle transzkripciós vagy transzlációs terminációs jel. A vezető szekvencia jelenléte az alábbi okok közül egy vagy több miatt kívánatos. Először is, a vezető szekvencia

HU 215 434 Β jelenléte megkönnyítheti a gazdaszervezet számára az IL- li termelését. Közelebbről, a vezető szekvencia irányíthatja a kezdeti transzlációs terméknek egy vezető peptidázzal való lehasítását, hogy a vezető szekvenciát eltávolítsa, és visszamaradjon a potenciális proteinaktivitással bíró aminosavszekvencia. Másodszor a szignál szekvencia jelenléte megkönnyítheti az IL- li tisztítását azáltal, hogy a fehérjét hozzásegíti a sejtcitoplazma elhagyásához. Egyes gazdamikroorganizmus fajok esetén a megfelelő vezető szekvencia lehetővé teszi a teljes kész fehérjének a periplazmatikus térbe való kivitelét, ilyen eset áll fenn például az E. coli esetén. Bizonyos E. coli, Saccharomyces, Bacillus és Pseudomonas törzsek esetén a megfelelő vezető szekvencia lehetővé teszi a fehérjének a sejtmembránon át az extracelluláris közegbe való transzportját. Ebben az esetben a fehérje az extracelluláris proteintől megtisztítható. Harmadszor, egyes, a találmány szerint előállított fehérjék esetében a vezető szekvencia jelenléte szükséges lehet ahhoz, hogy a kész fehérjét egy olyan környezetben helyezzük el, ahol az hajtogatódhat aktív szerkezetének elnyerésére, amely szerkezet a megfelelő proteinaktivitással bír.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában egy további DNS-szekvenciát helyezünk el közvetlenül azt a DNS-szekvenciát megelőzően, amely az IL-1 inhibitort kódolja. Ez a további DNS-szekvencia transzlációs kapcsolóként való működésre képes, azaz ez egy olyan DNS-szekvencia, amely egy olyan RNS-t kódol, amely riboszómák elhelyezésére képes közvetlenül a vele határos RNS inhibitor riboszóma kötési helye mellett. A találmány egy megvalósítási módjában a transzlációs kapcsoló a TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAG ACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG DNS-szekvencia alkalmazásával, a transzlációs kapcsolók terén jártas szakember számára ismert eljárásokkal állítható elő.

vii) Transzlációs terminátor

A transzlációs terminátorok szerepe az mRNStranszláció megállítása. Ezek lehetnek természetesek, amint azt Kohli, J. (Mól. Gén. Génét., 182, 430- 439) ismerteti, vagy szintetikusak, amint azt Pettersson, R. F. [Gene, 24, 15-27 (1983)] leírja, mindkét hivatkozást referenciaként építjük be leírásunkba.

viii) Szelekciós markerek

Előnyös továbbá, ha a klónozó vektor egy szelekciós markert tartalmaz, például egy gyógyszer-rezisztencia markert vagy egyéb más markert, amelynek folytán a gazdamikroorganizmus egy szelektálható sajátosságot fejez ki. A találmány egyik megvalósítási módjában a vektorba ampicillinrezisztencia gént viszünk be, míg más plazmidokba tetraciklinrezisztencia vagy klo5 ramfenicol-rezisztencia gént viszünk be.

Az ilyen gyógyszer-rezisztencia vagy más kiválasztó marker részben arra szolgál, hogy megkönnyítse a transzformánsok szelekcióját. Továbbá az ilyen kiválasztó marker jelenléte a klónozó vektorban hasznos lehet a szennyező mikroorganizmusoknak a tápközegben való szaporodásának megakadályozására. Ebben a megvalósítási formában a transzformált gazdamikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyerjük a mikroorganizmusnak olyan körülmények között történő tény észtésé15 vei, amelyek az indukált fenotípus életben maradásához szükségesek.

Az előzőekben említett operációs elemeket szakember rutinszerűen választhatja ki az előzőekben ismertetett szakirodalom és a leírásban szereplő kitanítás alapján. Az ilyen operációs elemek általános példáit ismertetik a B. Lewin; Genes, Wiley & Sons, New York (1983) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Az előzőekben ismertetett vektorokon számos különbözőmegfelelő operációs elem található, ezek megismer25 hetők az előzőekben említett vektorok alapvető jellemzőivel foglalkozó szakirodalom áttekintése révén.

Úgy véljük, hogy az ilyen vektorok összeállítása a szakembertől elvárható kötelességek és feladatok körén belül esik, így szakember ennek megvalósítására túlzott kísérletek nélkül képes. Például megfelelő klónozó vektorokba hasonló DNS-szekvenciákat ligálunk, mint amilyeneket Maniatis és munkatársai [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984)] leírnak, közleményüket leírásunkba referenciaként építjük be.

A találmány szerint összeállított klónozó vektorok tekintetében megjegyezzük továbbá, hogy minden egyes vektorba a DNS-szekvenciának és az azt kísérő operációs elemeknek több másolata építhető be. Az egy vektorba beépíthető DNS-szekvencia több másolatának számát csak a kapott vektornak az a méretéből adódó képessége korlátozza, hogy a megfelelő gazdasejtbe bevihető legyen, és ott szaporodásra és transzkripcióra képes legyen.

b) Egyéb mikroorganizmusok

A találmány körébe tartoznak más, az E. colitól el45 térő mikroorganizmusokba bevihető vektorok is. Ilyen vektorokat ismertetünk az I. táblázatban. Az alábbiakban néhány előnyös vektort ismertetünk.

I. táblázat

Gazda- szervezetek	Szabályozott promoterek	Inducer	Transzkripció terminátor	mRNS- stabilizálás	Transzkripciós kezdő hely és szignál peptid	Marker	RS kötési hely
E. coli	Lac1, Tac2 Lambda pL Trp5	IPTG emelt hőmérséklet IAA-adagolás vagy tríptofánkiürítés	rmB6 rmC7	ompA8 Lambda int9 trp10	bla11 ompA12 phoS	ampicillin14 tetraciklin14’15 kloramfenicol16

o

HU 215 434 Β

I. táblázat (folytatás)

Gazda- szervezetek	Szabályozott promoterek	Inducer	Transzkripció terminátor	mRNS- stabilizálás	Transzkripciós kezdő hely és szignál peptid	Marker	RS kötési hely
Bacillus	*a-amiláz17 *szubtilizin18 *p-4319 spac-126	IPTG	E. coli rrn rm BT.T20		B. ami neutrális proteáz21 B. ami a-amiláz22 B. subt. szubtilizin23	Kanr 24 Camr25	B. ami neutrális proteáz B. ami a-amiláz22
Pseudomonas	Trp27 (E. coli) Lac (E. coli) Tac (E. coli)	IAA-adagolás vagy triptofán- kiürítés IPTG			foszfolipáz C28 exotoxin A29	szulfonamid30 sztreptomicin30	Trp (E. coli)
Élesztő	Gál l31, 1032 Adh I33 II34 Pho 5	Glükóz- kiürítés és galaktózglükózkiürítés, foszfátkiürítés	Cyc 1 Una a-faktor Sac 2		Invertáz36 Savas foszfatáz36 a-faktor	Ura 337 Leu 238 His 3 Táp 1

¹ Backman, K. Ptasnne, M. és Gilbert, W.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 73,4174- 4178 (1976).

² de Boer, H. A., Comstock, L. J. és Vasser, M.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 50,21-25(1983).

³ Shimatake, H. és Rosenberg, M.: Natúré, 292, 128- 132 (1981).

⁴ Derom, C„ Gheysen, D. és Fiers, W.: Gene, 17, 15-51 (1982).

⁵ Hallawell, R. A. és Entage, S.: Gene, 9, 27-47 (1980).

⁶ Grosius, J., Dűli, T. J., Sleeter, D. D. és Noller, H. F.: J. Mól. Bioi., 148, 107-127(1981).

⁷ Normanly, J., Ogden, R. C., Horváth, S. J. és Abelson, J.: Natúré, 327, 213-219 (1986).

⁸ Belasco, J. G., Nilsson, G., von Gabain, A. és Conen, S. N.: Cell, 46,245-251 (1986).

⁴ Schmelssner, W., McKenney, K., Rosenberg, M. és Court, D.: J. Mól. Bioi., 176, 39-53 (1984).

¹⁰ Mott, J. E„ Galloway, J. L. és Platt, T.: EMBO J„ 4, 1887-1891 (1985).

¹¹ Koshlés, D. és Botstein, D.: Cell, 20, 749-760 (1980).

¹² Movva, N. R., Kakamura, K. és Inouye, M.: J. Mól. Bioi., 143, 317-328 (1980).

¹³ Surin, Β. P„ Jans, D. A., Fimmel, A. L„ Shaw, D. C„ Cox, G. B. és Rosenberg, M.: J. Bacteriol., 157, 772-778 (1984).

¹⁴ Sutcliffe, J. G.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 3737-3741 (1978).

¹⁵ Peden, K.W.C.: Gene, 22, 277-280 (1983).

¹⁶ Alton, Ν. K. és Vapnek, D.: Natúré, 282, 864- 869 (1979).

¹⁷ Yang, M., Galizzi, A. és Henner, D.: Nuc. Acids. Rés., 11(2), 237-248 (1983).

¹⁸ Wong, S.L., Price, C. W„ Goldfarb, D. S. és Dói, R. M.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1184-1188 (1984).

¹⁴ Wang, P.-Z. és Dói, R. M.: J. Bioi. Chem., 259, 8619-8625 (1984).

²⁰ Lin, C.-K., Quinn, L. A., Rodriguez, R. L.: J. Cell Biochem. Suppl., (9B), p. 198 (1985).

²¹ Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J. és Filpula, D.: J. Bact., 159(3), 811-819 (1984).

²² Palva, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibazkov, M. és Kaariainen, L.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 5582- 5586 (1982).

²³ Wong, S.L., Pricee, C. W„ Goldfarb, D. S. és Dói, R. H.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1184-1188 (1984).

²⁴ Sullivan, M. A., Yasbin, R. E. és Young, F. E.: Gene, 29, 21-46(1984).

²⁵ Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J. és Filpula, D.: J. Bact., 759(3), 811-819 (1984).

²⁶ Yansura, D. G. és Henner, D. J.: PNAS, 81, 439-443 (1984).

²⁷ Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H. és Heyneker, H. L.: Biotechnology, 161- 165 (1984).

²⁸ Lory, S. és Tai, P. C.: Gene, 22, 95- 101 (1983).

_?£- ²⁹ Liu, P. V.: J. Infect. Dis., 730 (supl.), 594-599 (1974).

³⁰ Wood, D. G„ Hollinger, M. F. és Tindol, Μ. B.: J. Bact., 145, 1448- 1451 (1981).

³¹ St. John, T. P. és Davis, R. W.: J. Mól. Bioi., 752, 285-315 (1981).

³² Hopper, J. E. és Rowe, L. B.: J. Bioi. Chem., 253, 7566-7569(1978).

³³ Denis, C. L., Ferguson, J. és Young, E. T.: J. Bioi. Chem., 25S, 1165-1171 (1983).

³⁴ Lutsdorf, L. és Megnet, R.: Archs. Biochem. Biophys., 726, 933-944(1968).

³⁵ Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, M. és Hinnen, A.: EMBO, J. S„ 675-680 (1982).

³⁶ Watson, Μ. E.: Nucleic Acid Research, 72, 5145-5164 (1984).

³⁷ Gerband, C. és Guerineau, M.: Curr. Génét., 7,219-223 (1980).

³⁸ Hinnen, A., Hicks, J. B. és Fink, G. R.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929- 1933 (1978).

³⁹ Jabbar, M. A., Sivasubbramamian, N. és Nayak, D. P.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 2019- 2023 (1985).

i) Pseudomonas vektorok

Néhány, a Gram-negatív baktériumok széles tartományában autonóm replikációra képes vektor plazmid előnyösen használható a Pseudomonas nemzetségbe tartozó gazdaszervezetekben klónozó vektorként. Ezek közül néhányat a következő szakirodalmi helyeken ismertetnek: Tait, R. C., Close, T. J., Lundquist, R. C., Hagiya, M., Rodriguez, R. L. és Kado, C. I., Biotechnology, 1983. május, 269-275; Panopoulos, N. J.: Genetic Engineering in the Plánt Sciences, Praeger Pub50 lishers, New York, New York, 163- 185. oldal (1981); és Sakagucki, K.: Current Topic in Microbiology and Immunology, 96, 31-45 (1982); ezeket a szakirodalmi helyeket leírásunkba referenciaként építjük be.

Egy különösen előnyős konstrukció az

RSF1010 plazmidot és származékait tartalmazza, amelyeket a Bagdasarian, M., Bagdasarian, Μ. M., Coleman, S. és Timmis, K. N.: Plasmids ofMedical Environmental and Commercial Importance, szerkesztő: Timmis, K. N. és Puhler, A., Elsevier/North Hol60 land Biomedical Press (1979) szakirodalmi helyen is1

HU 215 434 Β mertetnek, ezt referenciaként leírásunkba beépítjük. Az RSF1010 előnye, hogy viszonylag kicsi, nagy másolati számú plazmid, amely könnyen transzformálható mind E. coli, mind Pseudomonas fajokba, és azokban stabilan fenntartható. Ebben a rendszerben előnyös az Escherichia esetére leírt Tac expressziós rendszer alkalmazása, mivel úgy tűnik, hogy az E. coli trp promoter könnyen felismerhető a Pseudomonas RNS-polimeráz számára, amint azt Sakagucki, K. [Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 31-45 (1982) és Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H. and Heyneker, H. L. (Biotechnology, 1984. február, 161- 165) ismertetik. Az előbbi szakirodalmakat leírásunkba referenciaként építjük be. A transzkripciós aktivitás tovább maximalizálható a promoter kicserélésével, például E. coli vagy P. aeruginosa trp promoterre. Továbbá az E. coli lacl génje is beépíthető a plazmidba, hogy szabályozó szerepet töltsön be.

A transzláció bármely Pseudomonas fehérje esetén transzláció iniciáláshoz köthető, valamint bármely, az inhibitor intracelluláris kifejeződését kiváltó típusú, nagy expressziójú fehérje iniciációs helyéhez.

Azokban az esetekben, amikor nem hozzáférhető egy mínusz restrikciós Pseudomonas fajba tartozó gazdatörzs, az E. coliból izolált plazmidszerkezet transzformációs hatékonysága igen gyenge. Ezért szükséges a Pseudomonas klónozó vektornak a kívánt gazdaszervezetbe való transzformálását megelőzően egy másik faj r- m+ törzsén át való passzálása, amint azt Bagdasarian, M. és munkatársai [Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, 411-412. oldal, szerkesztők: Timmis és Puhler, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)] leírják, ezt a munkát leírásunkba referenciaként építjük be.

ii) Bacillus vektorok

Egy további előnyös expressziós rendszer a Bacillus fajba tartozó gazdaszervezetben pUBllO plazmid alkalmazása klónhordozóként. Mint más gazdavektorrendszerekben, a Bacillus gazdaszervezet esetén is lehetséges a találmány szerinti IL- li intracelluláris vagy kiválasztott fehérjeként való kifejezése. A találmány megvalósítási módja mindkét rendszert magában foglalja. Különböző gének létrehozására és vizsgálatára alkalmas, mind Bacillus, mind E. coli fajokban replikációra képes szállító vektorok hozzáférhetőek, ezek leírása a Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S. és Shivakumar,

A. G. [Genetic Engineering, 2. kötet, szerkesztők: Setlow és Hollander, Plenum Press, New York, New York, 115- 131. oldal (1980)] szakirodalmi helyen található, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Az IL- li-nak B. subtilisböl való kifejezése és kiválasztása céljából az cz-amiláz szignál szekvenciát előnyösen a fehérjét kódoló régióhoz kapcsoljuk. Intracelluláris inhibitor szintézisére a változtatható helyű DNS-szekvenciát az ez-ami láz vezető szekvencia riboszóma kötési helyéhez kapcsoljuk transzlációsán.

Ezen konstrukciók bármelyikének transzkripcióját előnyösen cz-amiláz promoterrel vagy származékával irányítjuk. Ez a származék tartalmazza a natív cz-amiláz promoter RNS-polimeráz-felismerő szekvenciáját, de tartalmazza a lac operátor régiót is. Hasonló hibrid promoterek konstruálhatok a penicillináz gén promoterből és a lac operátorból, ezek Bacillus gazdaszervezetben szabályozható módon működnek, amint azt Yansura, D. G. és Henner [Genetics and Biotechnology of Bacilli, szerkesztők: Ganesan, A. T. és Hoch, J. A., Academic Press, 249-263. oldal (1984)] ismerteti. Ezt a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. Az E. coli lacl génje ugyancsak bevihető a plazmidba, hogy szabályozó hatást fejtsen ki.

iii) Clostridium vektorok

Egy, a Clostridiumban való kifejeződésre alkalmas előnyös konstrukció a pJU12 plazmidban van, amelyet Squires, C. H. és munkatársai [J. Bacteriol., 759, 465-471 (1984)] ismertetnek, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be, ez a konstrukció C. perfringensbe transzformálható Heefner, D. L. és munkatársai [J. Bacteriol., 159, 460-464 (1984)] eljárásával, amely eljárást leírásunkba referenciaként építünk be. A transzkripciót a tetraciklinrezisztencia gén promoterje irányítja. A transzláció az azonos tet^r gén Shine- Dalgarno-szekvenciájához kötődik szorosan analóg módon azzal az eljárással, amelyet az előzőekben egyéb gazdaszervezetekben való alkalmazásra megfelelő vektorok esetén leírtunk.

iv) Élesztő vektorok

Élesztőbe bevitt idegen DNS fenntartása néhány különböző módon végezhető, amelyeket Botstein, D. és Davis, R. W. [The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones és Broach szerkesztők, 607-636. oldal (1982)] ismertetnek, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. Egy, a Saccharomyces nemzetségbe tartozó gazdaszervezetekben való alkalmazás esetén előnyös kifejeződési rendszer az IL- li gént a 2 mikron plazmidhoz köti. A 2 mikron kör előnye abban áll, hogy cir° törzsekbe bevíve viszonylag nagy másolati számú és stabilitású. Ezek a vektorok előnyösen magukban foglalják a replikációkezdést és a pBR322-ből legalább egy antibiotikumrezisztencia markert, hogy lehetővé tegyék az E. coliban való replikációt és szelekciót. Ezenkívül a plazmid előnyösen tartalmazza a két mikron szekvenciát és az élesztő LEU2 gént, amely azonos célt szolgál a LEU2 élesztő hiánymutánsban.

Ha a rekombináns IL- 1 inhibitort végül élesztőben kívánjuk kifejezni, előnyös, ha a klónozó vektort először Escherichia coliba visszük, ahol a vektor szaporodni képes, és ahonnan a vektort szaporodás után tisztított formában nyerjük ki. A vektort ez után az IL- 1 inhibitor végső kifejezése céljából az élesztőbe visszük.

c) Emlőssejtek

Az IL- 1 inhibitor cDNS szolgál génként az inhibitornak emlőssejtekben való kifejeződéséhez. Olyan szekvenciával kell bírnia, amely a riboszómákhoz való kötődésben hatékony, például olyannak, amint azt Kozák [Nucleic Acids Research, 75; 8125-8132 (1987)] ismerteti, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be; és vezető szekvencia kódolására alkalmas kapacitással kell bírnia [lásd a 3.a) vi) helyen], amely az érett fehérjét a sejtből kész formában eltávolít1

HU 215 434 Β ja. A teljes cDNS-szekvenciát hordozó DNS restrikciós fragmens beiktatható egy olyan expressziós vektorba, amely transzkripciós promoterrel és transzkripciófokozóval bír, amint azt Guarente, L. [Cell, 52: 303- 305 (1988)] és Kadonaga, J. T. és munkatársai [Cell, 51, 1079- 1090 (1987)] ismertetik, mindkét hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. A promoter szabályozható lehet, mint például a pMSG plazmidban (Pharmacia Cat. No. 27 450 601), ha az inhibitor konstitutív expressziója káros a sejtszaporodásra nézve. A vektornak egy teljes poliadenilezö szignállal kell bírnia, amint azt Ausubel, F. M. és munkatársai [Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987)] ismertetik - a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be -, ahhoz, hogy az mRNS transzkripciója ebből a vektorból rendesen történjen. Végül a vektor tartalmazni fogja a replikációkezdést, és legalább egy, a pBR322-ből származó antibiotikumrezisztencia markért, hogy E. coliban való replikációja és szelekciója megvalósuljon.

Az IL- 1 inhibitor termelésére alkalmas stabil sejtvonal kiválasztása érdekében az expressziós vektor tartalmazhatja egy kiválasztó marker génjét, például egy gyógyszer-rezisztencia markert, vagy hordozhatja egy hiányos sejtvonal komplementer génjét, például a dhfrsejtvonal transzformálására szolgáló dihidrofolátreduktáz (dhfr) gént, amint azt Ausubel és munkatársai az előzőekben idézett hivatkozási helyen leírják. Más megoldás szerint az expressziós vektorral együtt transzformálható egy külön plazmid, amely a kiválasztó markért hordozza.

4. Gazdasejtek/transzjörmáció

Az így kapott vektort egy megfelelő gazdasejtbe visszük be. A gazdasejtek lehetnek mikroorganizmusok vagy emlőssejtek.

a) Mikroorganizmusok

Úgy véljük, hogy bármely olyan mikroorganizmus alkalmazható, amely képes az exogén DNS felvételére, és annak génjei és kísérő operációs elemei kifejezésére. Ha a gazdaszervezetet megválasztottuk, a vektort a gazdaorganizmusba szakember számára ismert módon visszük be. Ilyen eljárásokat ismertetnek például az Advanced Bacterial Genetics, R. W. Davis és munkatársai, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980) szakirodalmi helyen, amely hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. A megvalósítási formák egyikében előnyös, ha a transzformáció alacsony hőmérsékleten történik, mivel a hőmérsékletszabályozás eszközül szolgál a regulációs géneknek az operációs elemek révén való kifejeződéséhez, amint azt az előzőekben ismertettük. Egy másik megvalósítási mód szerint, amennyiben ozmoláris regulátorokat építünk a vektorba, az idegen gének megfelelő szabályozásának biztosítására a transzformáció során a sókoncentráció szabályozása szükséges.

Előnyös, ha a gazdamikroorganizmus fakultatív anaerob vagy aerob mikroorganizmus. Ebben az eljárásban előnyösen használható gazdaszervezetek közé tartoznak az élesztők és baktériumok. Előnyösek a Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztők, különösen a Saccharomyces cerevisiae. Előnyösek a Bacillus, Escherichia és Pseudomonas nemzetségbe tartozó baktériumok, különösen a Bacillus subtilis és Escherichia coli. További gazdasejteket ismertettünk az előzőekben szereplő I. táblázatban.

b) Emlőssejtek

A vektor bevihető emlőssejt-tenyészetbe, erre néhány különféle eljárás alkalmas, például kalcium-foszfát/DNS koprecipitáció, elektroporációval vagy protoplaszt fúzióval. Előnyös eljárás a kalcium-foszfáttal való koprecipitáció, amint azt Ausubel és munkatársai az előzőekben hivatkozott irodalmi helyen ismertetik.

Számos olyan stabil sejttípus létezik, amely transzformálható, képes a cDNS-szekvencia transzkripciójára és transzlációjára, előállítja az IL- li prekurzort, és kiválasztja az érett fehérjét. A sejttípusok azonban különbözőek lehetnek a kiválasztott fehérje glükozilezését illetően, illetve az esetlegesen jelen lévő aminosavmaradékok transzlációt követő módosításában. így ideálisak azok a sejttípusok, amelyek a természetes molekulával azonos rekombináns IL- 1 inhibitort termelnek.

5. Génsebészeti úton előállított sejtek tenyésztése

A gazdasejteket az IL- 1 inhibitor kifejeződésének megfelelő körülmények között tenyésztjük. Ezek a körülmények általában a gazdasejtre fajlagosak, és szakember könnyen meghatározhatja ezeket az ilyen sejtek tenyésztési körülményeire vonatkozó szakirodalom és a leírásban adott kitanítás alapján. Ilyen ismereteket közölnek például baktériumok tenyésztési körülményeire vonatkozóan a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Hasonló információk találhatók élesztő- és emlőssejtek tenyésztésére vonatkozóan a Pollack, R.: Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be.

Minden olyan körülmény, amely a vektorban jelenlévő vagy abba beépített operációs elemektől függően a DNS-szekvencia expressziójának regulációjához szükséges, hatással van a transzformáció és a tenyésztési szakasz során. Egy megvalósítási mód szerint a sejteket olyan megfelelő regulációs körülmények között szaporítjuk nagy sűrűségig, amelyek gátolják a DNS-szekvencia kifejeződését. Az optimális sejtsűruség elérése után a környezeti körülményeket oly módon változtatjuk meg, hogy azok kedvezőek legyenek a DNS-szekvencia kifejeződésének. Ennek megfelelően az IL- 1 inhibitortermelés a gazdasejteknek közel optimális sűrűségig való szaporodása után következő időszakban következik be, és a kapott IL- 1 inhibitort a kifejeződéséhez szükséges regulációs körülmények megvalósítása után, némi idő elteltével nyerhetjük ki.

6. Tisztítás

a) Mikroorganizmusok által termelt IL- li

A találmány egy megvalósítási formája szerint a rekombináns IL- 1 inhibitort kinyerését követően, de aktív szerkezetének elnyerését megelőzően tisztítjuk. Ezt a megvalósítási módot azért tartjuk előnyösnek, mert úgy hisszük, hogy megkönnyíti az újrahajtogató1 1

HU 215 434 Β dott fehérje nagy hozamának elérését, ha a fehérjét először tisztítjuk. Azonban egy másik előnyös eljárás szerint az IL- 1 inhibitort először hagyjuk hajtogatódni, hogy megszerezze aktív szerkezetét a tisztítást megelőzően. Egy harmadik előnyös megoldás szerint az IL- 1 inhibitort újrahajtogatódott, aktív állapotában nyerjük ki a tápközegböl.

Bizonyos körülmények mellett az IL- 1 inhibitor elnyeri rendes, aktív szerkezetét a gazdamikroorganizmusban való kifejeződéskor, és aktív állapotban jut át a sejtfalon vagy membránon, vagy kerül a periplazmatikus térbe. Ez általában akkor következik be, ha a rekombináns fehérjét kódoló DNS-hez a megfelelő vezető szekvenciát kötjük. Ha az IL- 1 inhibitor nem nyeri el rendes aktív szerkezetét, a képződött diszulfidkötéseket és/vagy az előforduló nemkovalens kölcsönhatásokat kell először szétroncsolni denaturáló- vagy redukálószerekkel, például guanidin-kloriddal és βmerkapto-etanollal, majd hígítás, és ezen szerek szabályozott körülmények között történő oxidálása után az IL- 1 inhibitor elnyeri aktív szerkezetét. Az újrahajtogatást megelőző és követő tisztítás során előnyösen az alábbi lépések néhány kombinációját alkalmazzuk: anioncserélö kromatográfia (Mono Q vagy DEAESepharose), gélszűréses kromatográfia (Superose), kromatofókuszálás (Mono P) és hidrofób kromatográfiás interakció (oktil- vagy fenil-sepharose). Különösen értékes művelet az antitestaffinitás kromatográfia, amelyet IL- li specifikus monoklonális antitestekkel végzünk (ezt a 3. példában írjuk le).

b) Emlőssejtekből származó IL-1 i

Az emlőssejtek által termelt IL- 1 inhibitort kondicionált tápközegböl tisztítjuk az alábbi lépések alkalmazásával: ioncserélő kromatográfia és immunaffinitás kromatográfia a 3. példában leírt monoklonális antitestek alkalmazásával. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás és termékek számos módosítása és variációja képzelhető el. így a találmány magában foglalja mindazokat a módosításokat és variációkat, amelyek az oltalmi körön belül esnek, valamint ezek ekvivalenseit.

Megjegyezzük, hogy a leírásban adott kitanítás alkalmazása egy adott problémára vagy környezetre szakember köteles tudásához tartozik. A következőkben a találmány szerinti termékekre, és elkülönítésük és feldolgozásuk módjára vonatkozóan adunk példákat.

A példák a találmány különféle, előnyösnek tartott megvalósítási módjait ismertetik. A példákban szereplő közleményeket leírásunkba referenciaként építjük be.

1. példa

Fehérje készítése

A. Anyagok

A Hank-féle kiegyenlített sóoldatot [Hank’s

Balanced Salt Solution (HBSS)j és az RPMI-t a Mediatech, Washington, D. C. cégtől szereztük be.

A Lymphoprep az Accurate Chemical and Scientific

Corp., Westbury, N. Y. cégtől származik. A humán IgG, MTT, a nyúl anti-prosztaglandin E₂ antiszérum, az ammónium-hidrogén-karbonát, a ditiotreitol, a komplett és inkomplett Freund adjuváns, a hipoxantin, az aminopterin és a timidin a Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri) terméke. A C3H/HeJ egereket a Jakcson Labs, Bar Harbor, Maine laboratóriumból szereztük be. A BALB/c egereket és a P3 mieloma sejteket John Kappler és Philippa Marrack doktoroktól [The National Jewish Center fór Immunology and Respiratory Medicine (NJC/IRM), Denver, Colorado] kaptuk [Natúré, 256, 495-497 (1975)]. A rekombináns humán IL-1 a Cistron Biotechnology, Pine Brook, N. J. cégtől származik. A tisztított fitohemagglutinin a Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, N. C. terméke. A humán fityma fibroblasztokat primer tenyészetből, dr. Richard Clarktól (NJC/IRM, Denver, Colorado) kaptuk. A monoklonális egér anti-nyúl IgG antitesteket az AIA reagensgyártó cégtől (Aurora, Colorado) szereztük be. Az alacsony metionintartalmú RPMI-t Select-Amine kit (GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y.) alkalmazásával készítettük. A [³⁵S]-metionint, a difenil-oxazolt és a [¹⁴C]-jód-ecetsavat a DuPont-NEN, Chicago, Illinois cégtől szereztük be. A magzati borjúszérum származási helye a HyClone Laboratories, Logan, Utah. A Mono Q és Superose 12 oszlopok a Pharmacia, Inc. Piscataway, N. J. cégtől származnak. A C4 fordított fázisú oszlopokat a Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana cégtől kaptuk. A C8 fordított fázisú oszlopokat az Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornia cégtől kaptuk. Az acetonitrilt és a polietilénglikol 8000-et a J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N. J. cégtől szereztük be. A triíluor-ecetsav és a guanidin-hidrogén-klorid a Pierce Chemicals, Rockford, Illinois cégtől származik. Az endoproteináz Lys C-t a Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana cégtől kaptuk. A PGE₂ ELISA-hoz alkalmazott Nunc-Immuno Plate I mikrotiter lemezeket az Intermountain Scientific Corporation, Bountiful, Utah cégtől kaptuk. A hidridoma-termelésre alkalmazott lemezek származási helye Costar, Cambridge, Massachusetts.

B. Monocita IL-1 inhibitor létrehozása

Humán leukocitákat nyerünk normál donoroktól leukoforézissel, a leukocitákat Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS) 1 rész sejt: 1 rész HBSS arányban szuszpendáljuk, Lymphoprepet rétegezünk alá, és 30 percig szobahőmérsékleten 400x g értéken centrifugáljuk. A mononukleáris frakciót elkülönítjük (egy donortól jellemzően 4-5x 10⁹ sejtet nyerünk), Ca⁺⁺ vagy Mg++ nélküli HBSS-sel mossuk, szérummentes RPMIben szuszpendáljuk, és Sephadex G200 kromatográfiás eljárással LPS-mentessé tett normál humán IgG-nal bevont Petri-csészékre szélesztjük (6x 10^{1 * * * * * 7} sejt 10 ml oldatban/100 mm-es csésze). Minden reagens 10 pg/ml alatti mennyiségű LPS-tartalmú. A sejteket 24-48 órán át tenyésztjük, a kapott kondicionált tápközeg tartalmazza a nyers IL- 1 inhibitor (IL- li) felülúszót. Jellemzően egy donortól származó sejtek 700-900 ml nyers IL- li felülúszót eredményeznek.

C. Az IL-1 inhibitor vizsgálata

Az IL- li kimutatására rutinszerűen két IL- 1 vizsgálati eljárást alkalmazunk. Timociták szaporodása

HU 215 434 Β (4-6 hetes, C3H/HeJ egerekből származó lx 10⁶ sejt) 1,0 egység/ml rekombináns humán IL- 1 és 1 pg/ml fitohemagglutinin hatására adott válaszként a 3 napos stimulálással elért maximális érték felére csökken, ezt ³H-timidin-beépüléssel vagy MTT tetrazóliumsó-felvétellel [Mosmann, T. J.: Immunoi. Method, 65, 55-61 (1983)] mérjük. A nyers IL- li felülúszó 10-szeres hígításban teljes mértékben gátolja ezt a szaporodási választ. Humán dermális fibroblasztok (lx 10⁵ sejt lyukanként egy 96 lyukú lemezen) jellemzően válaszolnak 0,5 egység/ml rekombináns humán IL- 1 hatására úgy, hogy 6 órás stimulálás után mintegy 50000pg/ml PGE₂-t választanak ki, amely ELISA-val mérhető. Ez a vizsgálat éppoly érzékeny IL- li hatására, mint a fenti timocitavizsgálat.

D. Az IL-1 inhibitor metabolikus jelzése

Az IL- 1 inhibitort metabolikusan jelezzük oly módon, hogy mononukleáris leukocitákat 48 órán át (a B. lépésben leírt) IgG bevonatú lemezeken szérummentes, csak 0,75 pg/ml hideg metionint tartalmazó (a normál érték 15 pg/ml) RPMI-ben, amelyhez 10⁷ sejtenként 0,5 mCi ³⁵S-metionint (1151 Ci/mmol) adtunk, tenyésztünk. Kontrolljelzést végzünk a fentivel azonos módon, azzal az eltéréssel, hogy a lemezeket IgG helyett magzati borjúszérummal vonjuk be. Az ilyen kontroll felülúszókkal végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy igen kevés IL- li választódik ki, ha a sejteket magzati borjúszérummal bevont lemezeken tenyésztjük.

E. Az IL-1 inhibitorfehérje tisztítása

A nyers IL- li felülúszót nátrium-kloriddal 1,0 mol/l-es oldattá alakítjuk, jégen 1 órán át inkubáljuk, majd 10000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáljuk. A teljes inhibitoraktivitást, de a kiindulási fehérjének csak 20%-át tartalmazó felülúszót 4 °C hőmérsékleten 0,025 mol/l-es, pH=7,6-os, 0,1% szacharózt tartalmazó trisz-pufferrel (A puffer) szemben kimerítően dializáljuk, a fehérjék gradiens frakcionálását egy Mono Q anioncserélö oszlopon végezzük. Az inhibitortartalmú oldat dialízisét folytatjuk, majd 10000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáljuk. Ez után az oldatot 0,22 μ-os nylonszűrökön visszük át. A felülúszókat 10 ml, metabolikus jelzéssel készült, hasonlóan feldolgozott felülúszóval egyesítjük, és 1,0 ml vagy 8,0 ml ágytérfogatú Mono Q-Superose (Pharmacia FPLC) oszlopokra visszük, és A pufferrel mossuk mindaddig, amíg az elfolyó OD₂₈₀ értéke az alapvonalra visszatér, ez után az A pufferben készült 0,025 mol/1 és 0,10 mol/1 közötti lineáris koncentráció gradiensű oldattal eluáljuk az oszlopot. Az oszlopról vett frakciókat gyűjtjük, és elemezzük radioaktivitásukat és bioaktivitásukat. Az egyes frakciókból vett mintákat redukált 12,5%-os SDS-PAGE alkalmazásával futtatjuk, ezüsttel színezzük, difenil-oxazollal átitatjuk, szárítjuk, majd filmre helyezve autoradiográfiás adatokat nyerünk. Az l.A ábrán 40 ml nyers IL- li felülúszó és 3 ml metabolikusan jelzett IL- li felülúszó elegyének Mono Q kromatográfiával nyert proteinprofilját mutatjuk be. Erre az ábrára ráhelyezve láthatók az egyenként 50 μΐ-es frakciók radioaktivitás adatai, valamint az IL- li PGE₂-termelés révén mért bioaktivitása. Két nagyobb és egy kisebb radioaktív csúcs látható, amely teljes korrelációban van a három bioaktivitás csúccsal. Az l.B ábrán hasonló kromatogramot látunk, amely 15 ml nyers IL- li felülúszónak 3 ml olyan metabolikusan jelzett monocita felülúszóval való el egyéböl származik, amelyet IgG helyett magzati borjúszérummal (FCS) bevont lemezen tenyésztettünk. Az előzőekben tárgyalt három radioaktív csúcs jelentősen kisebbé vált. A 2.A ábrán az l.A és l.B ábrán látható kromatogram alapján érdeklődésre számot tartó tartomány frakcióinak ezüsttel festett gélkromatogramját mutatjuk be. Megjegyezzük, hogy az l.A ábrán radioaktív és bioaktív csúcsot adó frakciók (52. és 59. frakció) mindegyike egy nagy sávot ad 22 kD-nál (nyíllal jelölve) SDS-PAGE-ben. A harmadik csúcs (az l.A ábra 48. frakciója) SDS-PAGE-ben 20 kD-nál sávot ad. A nyers IL- li gélszűréses vizsgálata az aktív molekula 18- 25 kD-os molekulatömegére utal. A 2.B ábra a 2.A ábrán bemutatott gél autoradiogramja. Jól látható, hogy a 20 és 22 kD-os fehérjesávok a legnagyobb radioaktivitással bíróak a frakciók közül.

Az eredményeket összegezve megállapítjuk, hogy az IgG-nal bevont Petri-csészén szélesztett monociták metabolikus jelzésével radioaktív mintát kapunk, ilyen minta alig képződik, ha a sejteket magzati borjúszérummal (FCS) bevont lemezeken szélesztjük. Ezek az indukált radioaktivitással bíró minták tökéletesen együtt kromatografálhatók néhány bioaktivitással bíró IL- 1 inhibitorral Mono Q oszlopon, géleken, és olyan autoradiogramot adnak, amelyről megállapítható, hogy a három legnagyobb indukált molekula az IL- li molekulára előzetesen várt molekulatömegnek megfelelő.

A szekvenciameghatározáshoz az IL- li molekulákat tovább tisztítjuk. Ezt két módon végezzük. Elsőként a bioaktivitás és radioaktivitás terén csúcsot adó Mono Q frakciókat C4 fordított fázisú oszlopra visszük, és eluensként 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó víz és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril közötti gradienst alkalmazunk. Mivel az IL- li molekula izotóppal jelzett, az egyes frakciókból vett minták radioaktivitását számlálón közvetlenül mérjük, ezenkívül a mintákat SDS-PAGE-dzsel elemezzük, majd autoradiográfiás értékelést végzünk. A 3.A ábra egy ilyen kromatogramot mutat, amelyre ráhelyeztük a radioaktivitásmintát is. Az egyes frakciókból vett mintákat gélen futtatjuk, majd ezüsttel festjük (3.B ábra), ezt kővetően a gélek autoradiogramját készítjük el (3.C ábra), ezek azt mutatják, hogy az IL- li molekula a 32- 36. frakciókban található. Ezeket a frakciókat beszárítjuk, és szekvenáljuk. Más megoldás szerint a fö Mono Q frakciókat szárítjuk be Speed Vác alkalmazásával, a beszárított anyagot 0,4 ml 0,05 mol/l-es ammónium-hidrogén-karbonátban újra szuszpendáljuk, majd előzetesen azonos pufferrel egyensúlyba hozott lOx 300 mm-es, Superose 12 géllel töltött oszlopon (Pharmacia FPLC) gélszűréssel kétszer közvetlenül kromatografáljuk. Ennek eredményét mutatjuk be a 4.A és 4.B ábrákon. A frakciókat gyűjtjük, minden frakcióból mintát veszünk, és radioaktivitás és bioaktivitás

HU 215 434 Β szempontjából elemezzük, SDS-PAGE-t végzünk, a gélt ezüsttel festjük, és autoradiogramot készítünk róla. A megfelelő frakciókat Speed Vác berendezésen szárítjuk, majd szekvenáljuk.

2. példa

Az IL- 1 inhibitor tervezett szekvenálása A szekvenálást megelőzően a mintákat 6 mol/l-es, pH= 8,6-os guanidin-hidrogén-kloridban oldjuk, 4 órán át 37 °C hőmérsékleten nitrogéngáz atmoszférában a fehérjéhez viszonyított 100-szoros moláris ditiotreitolfeleslegben redukáljuk, majd 400-szoros ¹⁴C-jód-ecetsav-felesleggel 1 órán át alkilezzük. A reakcióelegyet C8 fordított fázisú oszlopon sómentesítjük, eluáljuk, majd részlegesen beszárítjuk. Az N-terminális szekvenciát szekvenciaanalizátorral (Applied Biosystems Protein Sequencer) határozzuk meg. A belső szekvenciák meghatározására az előzetesen adott esetben redukált és alkilezett mintákat cianogén-bromiddal vagy proteolitikus enzimmel emésztjük, az emésztési eljárást szakember számára ismert módon végezzük. A reakcióelegyet beszárítjuk, 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben oldjuk, és a peptideket C8 fordított fázisú oszlopon elkülönítjük.

3. példa

Az IL-1 inhibitorok fajtáinak tisztítása és szekvenálása

A. IL-1 i- X, IL-1 i- a és IL- 1 i- b fajták

Az IL- li Mono Q oszlopon való tisztításával a biológiai aktivitás három nagy részre válik szét, ezt az 1 .A ábrán mutatjuk be, és az 1. példában írjuk le, az aktivitással bíró csúcsok az előbbiek szerinti 48., 52. és 59. csúcsok. Ezen frakciók SDS-PAGE útján való elemzése - amely a 2.A ábrán látható - 20, 22, illetve egy további 22 kD-os inhibitorfajta jelenlétét mutatják. Az ilyen gélek Western-elemzésekor - amelyet egér antiszérum alkalmazásával az alábbi 4. példában ismertetünk mindhárom fajta inhibitor festődik. Ha az IL- li-t metabolikusan ³⁵S-metioninnal jelzett sejtekből készítjük, a jelzést a sejteknek IgG-nal bevont lemezen való szaporítása során végezzük, ezen frakciók mindegyike radioaktív lesz (ezt a 2.B ábrán az előzőekben említett gélautoradiogramján mutatjuk be). Az 1. példa szerinti logikát követve, azaz abból, hogy a fentivel párhuzamosan, de nem indukáló körülmények között tenyésztett sejtek nem hoznak létre IL- li-bioaktivitást, és nem jelentkeznek a radioaktív sávok, arra a következtetésre juthatunk, hogy ez a három fajta adja a biológiai aktivitást. Ezt a három inhibitorfajtát a következő módon neveztük el: IL- li-X, IL- li-a és IL- li-b.

B. IL-li-X tisztítása és szekvenálása Az IL-li-X és/vagy IL-li-a tartalmú Mono Q frakciókat fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC), Synchropak RP-4 (C4) oszlopon tisztítjuk, és a radioaktív mintákat szekvenciaanalízisnek tesszük ki. Az RP- HPLC eljárással tisztított IL- li- a és IL- li-b közvetlen szekvenálására irányuló számos kísérlet kudarca azt a feltételezést alapozta meg, hogy ezek az inhibitorok N-terminálisukon kémiailag blokkoltak. Azonban egy IL- li- a (IL- li- aB2p2) preparátum elemzésekor az alábbi szekvenciát kaptuk:

majd ezt követően C4 RP-HPLC eljárással hasonlóan tisztított IL-li-X preparátum elemzésével az alábbi szekvenciát kaptuk:

Ezek a szekvenciák nyilvánvalóan részei az IL-li-a szekvenálására irányuló kezdeti kísérletekkor kapott szekvenciának. Feltételezésünk szerint ezek a szekvenciaadatok az IL-li-X elnevezésű 20 kD-os fajta N-terminálisának felelnek meg.

A fenti, és minden ezt követő szekvencia esetén az aláhúzással jelölt helyzet vagy azt jelenti, hogy az adott egységet nem tudtuk azonosítani, vagy hogy az azonosítást illetően kétségeink vannak. Ha egy helyzetben két vagy több egység megjelölése szerepel, ez azt jelzi, hogy a szekvenálási lépésben egynél több aminosavat észleltünk, a több jelölés közül a legfelső jelenti a legvalószínűbbnek tartott egységet.

C. Az IL- 1 i— a és IL-1 i- b peptidjeinek létrehozása, tisztítása és szekvenálása Minthogy az IL-li-a és IL-li-b N-terminálisukon nyilvánvalóan kémiailag blokkoltak, ezek peptidjeit endoproteinázos emésztéssel hozzuk létre. Közelebbről, az IL- li-a vagy IL- li-b mintákat tartalmazó Mono Q frakciókat egy 4,6x 250 mm-es C3- RPHPLC oszlopon (Zorbax Protein Plus) engedjük át, minden megelőző kísérletben a C4 oszlopok megfelelő alternatíváit alkalmaztuk. Az IL-li-a-t (8.A és 8.B ábrák) vagy az IL- li-b-t (9.A ábra) igen fokozatos gradiens alkalmazása mellett (0,2% acetonitril/perc 0,5 ml/perc áramlási sebesség mellett) választjuk el a legnagyobb

Λ

HU 215 434 Β szennyező radioaktív kísérőjétől, a humán lizozimtól. A tisztított minták azonosítását SDS-PAGE alkalmazásával, majd ezt követően autoradiogramok készítésével (8.C és 8.D, valamint 9.B ábrák) ellenőrizzük, a megfelelő tisztaságú minta a gélen egyetlen, 22 kD-os radioaktív fehérjeként jelentkezik. A fehérjéket manuálisan szilikonnal bevont üvegcsövekbe gyűjtjük, és 25 ml 0,2%-os Tween- 20-oldatot adunk hozzájuk. Az IL- litartalmú frakciókat Speed Vác készüléken 50 ml-re pároljuk be, majd 1%-os ammónium-hidrogén-karbonát hozzáadásával 300 ml-re egészítjük ki, ez után 1 mg endoproteinázt adunk az elegyhez. IL- li- a esetén enzimként endoproteináz Lys C-t (BoehringerMannheim) alkalmazunk, míg IL- li-b esetén a hasítást endoproteináz Asp N-val (Boehringer-Mannheim) végezzük. A hasítást 37 °C hőmérsékleten végezzük 16 órán át, majd a reakcióelegy térfogatát Speed Vác készüléken 50 ml-re pároljuk be.

Az IL- li- a mintát közvetlenül kromatografáljuk, míg az IL- li-b mintát először 5 ml 2 mol/l-es, pH= 8,0as trisz-pufferben készült 50 mmol/l-es ditiotreitol adagolásával redukáljuk, a reagáltatást 30 percig végezzük

37 °C hőmérsékleten, majd 10 ml, 1,1 μιηοΙ/Ι-es etanolos ³H-jód-ecetsav adagolásával karboxi-metilezzük, a reagáltatást 30 percig, 37 ‘C hőmérsékleten, sötétben végezzük. A peptidek elválasztását 2,lx 250 mm-es, Brownlee Aquaporee RP- 300 (C8) szűkfuratú oszlopon végezzük,

100 ml/perc áramlási sebesség mellett, mikrofuratú hardware-rel, és mikrofurattal kompatíbilis szivattyúkkal felszerelt Beckman nagynyomású folyadékkromatográf alkalmazásával. Eluensként 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó víz és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril közötti 0-100%-os lineáris gradienst alkalmazunk, az eluálást 200 perc alatt végezzük el. A peptidek elválasztását a 10. és 11. ábrákon mutatjuk be. A szekvenciákra kapott információk a következők:

«

HU 215 434 Β

A kapott peptidszekvenciák közül kettő nyilvánvalóan rokon azzal, amit a korábbiakban az IL- li-X esetén nyertünk. Ezek egyike, az RaLysC-41 egy IL-li-a szekvencia, a másik, az R(iAspN-51 egy IL-li-b szekvencia, ami érvként szolgál amellett, hogy a háromféle IL- li legalábbis közel rokon fehérjék, hacsak nem egyetlen eredeti IL- li-molekulának a kémiailag és/vagy fizikailag módosított formái. Ha a felsorolt szekvenciákat kombináljuk, az alábbi szekvenciakompozíciót kapjuk.

Úgy tűnik, hogy ez a szekvenciakompozíció nincs jelen egyetlen olyan ismert polipeptidben sem, amelyet a legújabb gyűjteményben, a „Protein Identification Resource Database” (PÍR 16.0) szakirodalmi helyen ismertetnek. Úgy véljük, hogy ezek a szekvenciák vagy ettől kevéssé eltérő variánsok, a molekuláknak egy IL- 1 inhibitorként hatni képes új csoportját képviselik.

4. példa

Az IL-1 inhibitorral szemben fajlagos antitestek készítése hetes BALB/c egerekbe [Exp. Cell. Rés., 60, 61- 77 (1970)] szubkután olyan IL- 1 inhibitort injektálunk, amelyet előzetesen nyers felülúszóból Mono Q kromatográfiás úton részlegesen (négyszázszorosan) tisztítottunk, PBS-tal szemben dializáltunk, és komplett

Freund-adjuvánsban emulgeáltunk. Egy-egy egérnek 5 ml nyers felülúszóból származó tisztított IL- 1 inhibitort adunk be. Az egereknek kéthetenként a fentivel azonos mennyiségű, nemkomplett Freund-adjuvánsban emulgeált IL- 1 inhibitort adunk, és a beadagolás után minden alkalommal 7 nap múlva farkukból szérummintákat veszünk. Az antiszérumok anti-IL- li aktivitását az SDS-PAGE alkalmazásával végzett immunogén futtatás keresztreakcióinak Western-analízisével vizsgáljuk. Az 5.A és 5.B ábrákon látható, hogy három IL- li55 beinjektálást követően az egerek mindegyike termelt anti-IL- li antitesteket.

Minthogy a monoklonális antitestek igen nagy jelentőséggel bírnak az IL- li génnek az expressziós könyvtárból való klónozásánál, a rekombináns IL- li protein tisztításánál, és a molekula biológiai hatásának vizsgála1 A

HU 215 434 Β tánál, hozzáláttunk az IL- li-ra fajlagos monoklonális antitestek sorozatának gyártásához. A B-sejt hibridómák előállítására a fenti egereknek intravénásán a fentivel azonos mennyiségű IL- 1 inhibitort adunk be sóoldatban, 24 órával lépük eltávolítása előtt. A lépből a splenociákat hideg kiegyensúlyozott sóoldatba (BSS) vonjuk ki, BSS-tal kétszer mossuk, P3 mieloma sejtekkel 2x ΙΟ⁷ P3 sejt/10⁸ lép B-sejt arányban elegyítjük, majd lecentrifugáljuk. A száraz csapadékhoz cseppenként 1 ml meleg, 5% szén-dioxid gázt tartalmazó PEG 6000et (40% polietilénglikol 6000:60% minimális eszenciális tápközeg) adunk, ezzel a sejteket összeolvasztjuk. Az összeolvadt sejteket BSS-tal mossuk, mlenként 2x 10⁵ peritoneális sejtet tartalmazó 10 ml gazdag tápközegben (10% FBS) újra szuszpendáljuk, és a csapadékot 10 ml-es pipetta alkalmazásával finoman feltörjük. Az elegy térfogatát peritoneális sejteket tartalmazó tápközeg további hozzáadásával 20 ml-re egészítjük ki, majd a sejteket 96 lyukú, egyenként 0,1 ml-es lyukakat tartalmazó lemezre visszük fel. A lemezeket gázinkubátorba visszük, és a következő módon kezeljük:

1. nap - Dús tápközegben lévő 3x HAT (hipoxantin, aminopterin, timidin) adagolása lx végkoncentrációig.

5. nap - A tápközeg kicserélése dús tápközegben lévő 1 x HAT 200 μΐ-ével helyettesítve.

10. nap - A hibridszaporodás ellenőrzése, a tápközeg kicserélése, ml-enként l,5x 10⁶ peritoneális sejtet tartalmazó dús tápközegben lévő lx HAT 200 μΐ-ével helyettesítve.

Ha a hibrid sejtek már közel összefolyóak, a lyukban lévő felülúszókat vizsgálatra visszük, a sejteket pipetta hegyével finoman lekaparjuk, és átvisszük egy olyan 1 ml-es tenyésztő lyukba, amely dús tápközegben lx HAT-ot és ml-enként 3x 10⁶ peritoneális sejtet tartalmaz.

Az összenőtt sejtekkel fedett lyukakból származó felülúszó anti-IL- li aktivitását ELISA alkalmazásával vizsgáljuk, amely vizsgálatban a mikrotitráló lyukakhoz részlegesen tisztított IL- 1 inhibitort kötünk (az IL- li azonos az egereknek beinjektált, Mono Q oszlopon tisztított anyaggal). Negatív és pozitív kontrollként normál egérszérumot és hiperimmun antiszérumot alkalmazunk. A pozitív felülúszókon az ELISA-t ismételten elvégezzük homogénen tisztított IL-1 inhibitorral bevont lemezeken, és vizsgáljuk tisztított, metabolikusan jelzett IL- li immunprecipitációjával. A pozitív sejteket a hígítás limitálásával klónozzuk, és prisztánnal kezelt egereknek injektáljuk be ascites létrehozása céljából. Nagy mennyiségű IL- li fajlagos antitest termelhető az egér ascites fluidumának szövettenyésztésével, vagy masszív fejlesztésével és összegyűjtésével. Az antitestek tisztítása és oldhatatlan ágyhoz való kapcsolása révén a rekombináns IL- li fehérje tisztítására alkalmas affinitás adszorbenst nyerünk.

5. példa

Az IL- 1 i cDNS klónozása

Kimutattuk, hogy IgG bevonatú Petri-csészén szélesztett és 24 órán át [³⁵S]-metionin jelenlétében tenyésztett monociták [³⁵S]-IL— li-t termelnek, amely Mono Q oszlopon mutatott kromatográfiás sajátságai alapján azonosítható.

Annak meghatározására, hogy az IL- li mikor termelődik maximális sebességgel (a 24 órás időszak alatt), a szélesztett monocitákat [³⁵S]-metionin hatásának tesszük ki impulzusszerü módon, rövid, 2 órás időtartamon át, amely idő elteltével nagy feleslegben lévő jelzetlen metionint adagolunk, és az inkubálást további 2 órán át folytatjuk. Ez után a tápközeget összegyűjtjük, és meghatározzuk az izotóppal jelzett IL- li-t. Ezt az eljárást alkalmazzuk monocitákon az IgG bevonatú lemezen való szélesztést követő különböző időpontokban, azt találjuk, hogy a monociták [³⁵S]-metionin jelenlétének való kitevése a szélesztés után 15 órával hozza létre a maximális [³⁵S]-IL— li-t, jelezve ezzel azt, hogy a monocitákban az IL- li mRNS az IgG bevonatú lemezen való szélesztést követően 15 óra múlva van a maximális szinten.

Az 1 .B példa szerint előállított friss monocitákat szélesztünk LPS-mentes IgG-on. RPMI tápközegben 15 órán át, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálást követően a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk, majd 4 mol/l-es guanidin-tiocianáttal, 25 mmol/l-es pH= 7-es nátrium-citráttal, 0,5% szarkozillal és 0,1 mol/les 2-merkapto-etanollal lizáljuk. A lizátum össz-RNStartalmát P. Chomczynski és N. Sacchi AGPC-eljárásával [Analytical Biochemistry, 162, 156-159. oldal (1987)] elkülönítjük.

A poli A+ RNS-t oligo-dT cellulóz kromatográfiás eljárással [Avív, H. ésLeder, P.; Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69,1408-1412 (1972)] elkülönítjük, etanollal kicsapjuk, majd 0,36 μ g/μ 1 koncentrációra oldjuk. A cDNS Gubler, U. és Hoffman, B. J. [Gene, 25, 263-269 (1983)] eljárásával való előállításához 1 pg poli A+ RNS-t használunk fel.

A cDNS-t lambda gtll expressziós könyvtárba visszük be EcoRI linkerek alkalmazásával, amelyek a Boehringer Mannheim 988488 katalógusszámának vagy a New England Bio Láb 1070 katalógusszámának megfelelőek, az eljárás során a fenti gyártók utasításait követjük.

A kapott, 10⁶ független kiónt tartalmazó könyvtárat E. coli Y1090rk -on (Promega Biotec) szkríneljük, az IL- li-nek megfelelő poliklonális antitesttel, amint azt az előzőekben leírtuk, az R. A. Young és R. W. Davis [PNAS, 80,1194- 1198 (1983)] által leírt szkrínelési körülményeket alkalmazzuk. A pozitív mintákat egy második, biotinilezett antitest (például kecske anti-egér IgG, Bethesda Research Labs), majd egy strepavidin-lúgos foszfatáz konjugát (Bethesda Research Labs) alkalmazásával azonosítjuk Bayer, E. A. és Wilchek, M. [Methods in Biochemical Analysis (1979)] és Guesdon, J. L., Ternynch, T. és Avrameas, S. [J. Histochem. Cytochem., 27, 1131-1138 (1979)] által leírt, és a gyártó utasításai szerinti módon.

6. példa

Az IL-1 inhibitort kódoló gén elkészítése és szekvenálása

Az 5. példában leírt módon előállított cDNS-t lambda GT10 klónozó vektorba építjük be. Ezt a

HU 215 434 Β cDNS-t először EcoRI metilázzal, S-adenozil-metionin szubsztrát alkalmazásával metilezzük, EcoRI linkereket kapcsolunk hozzá ligációs reakcióban, majd a linkerek feleslegét EcoRI endonukleázzal való emésztéssel és CL6B szpin oszlopon végzett kromatografálással eltávolítjuk. 0,124 pg kapcsolt, méret szerint szelektált cDNS-t és 1 pg EcoRI-vei hasított és foszfatázzal kezelt lambda GTlO-et tartalmazó reakcióelegyet készítünk, és a ligációs reakció termékeit GIGAPACK GOLD burkoló extraktum (Stratagene) alkalmazásával burkoljuk. így egy lx 10⁷ tagból álló könyvtárat kapunk.

Ennek a GT10 könyvtárnak a szkrínelésére a 3. példában bemutatott protein- és peptidszekvencia alapján antiszensz oligonukleotid mintákat szintetizálunk. Ezeknek a mintáknak a szekvenciája, és a nekik megfelelő peptidszekvenciák a következők:

Az#ILlil-3 mintát 5’ végén ³²P-foszforilezzük, és a könyvtár 3x 10⁵ plakkjának szkrínelésére használjuk. A mintát reprodukálhatóan a három plakkhoz hibridizáljuk, ezen plakkok egyike az ILlil-4 mintával is hibridizálódik. Ezt a plakkot, a GT ILli- 2A-t tenyésztjük, és a DNS-t Lambdasorb (Promega) alkalmazásával izoláljuk a gyártó utasításainak követésével.

A GT10- ILli-2A-t az ATCC 40488 letéti számon letétbe helyeztük [American Type Culture Collection (ATCC)]. A DNS-t EcoRI-vel emésztjük, öt egyforma alikvot részre osztjuk, és 1%-os agarózgélen elektroforetizáljuk.

Az elektroforézist követően a géleket etidium-bromiddal festjük. Ennek a gélnek egy fényképét mutatjuk be a 12.A ábrán. A 6., 8., 10., 12. és 14. sávok tartalmazzák az EcoRI emésztés öt alikvotját. Az ötödik sáv HindlII-mal hasított vad típusú lambda DNS és HaelIImal (New England Biolabs) hasított 0X174 RF DNS elegyét tartalmazza, amelyek hasznos molekulatömegmarkerek. A 12.A ábrán azt mutatjuk be, hogy a GT10-IL1Í-2A olyan EcoRI-fragmenst tartalmaz, amely 1850 bázispár hosszúságú.

Annak még meggyőzőbb bizonyítására, hogy ez az 1850 bázispárból álló fragmens az IL- 1 inhibitort kódoló szekvenciát hordozza, a következők szerint Southern biot módszert alkalmazunk. A 12.A ábrán bemutatott gélen lévő DNS-fragmenst szokásos eljárással nitro-cellulózra visszük. A nitro-cellulózt ez után o

HU 215 434 Β hosszában 5 csíkra vágjuk, hogy az egyes csíkok tartalmazzák a 6., 8., 10., 12. és 14. sávok DNS-ét. A csíkokat ez után egyenként hibridizáljuk a fenti, az 5’ végükön ³²P-foszfáttal jelölt oligonukleotid mintákkal. Az oligonukleotid-koncentráció 1 pmol/ml, a hibridizálás hőmérséklete az alábbi:

Sáv	Minta	Hőmérséklet
6.	#ILlil-3	35 °C
8.	#ILlil-4	42 °C
10.	#ILlil-5	42 °C
12.	#ILlil-6	40 °C
14.	#ILlil-7	35 °C

Mosást követően a sávokat sorba rendezzük, és egymáshoz erősítjük, hogy az eredeti nitro-cellulóz lemezt helyreállítsuk. Ezt a lemezt erősítő ernyő jelenlétében -70 °C hőmérsékleten 14 órán át autoradiografáljuk. A kapott autoradiogram fényképét a 12.B ábrán mutatjuk be. Ez bizonyítja, hogy a minták mindegyike fajlagosan hibridizálódik az 1850 bázispárt tartalmazó fragmenshez, igazolva ezzel azt, hogy ez a fragmens jelentős, az IL- 1 inhibitor szekvenciáját kódoló részt hordoz.

DNS-szekvenciájának meghatározására a GT10-IL1Í-2A DNS-t EcoRI-vel emésztjük, 1%-os agarózgélen elektroforézist végzünk, és az 1850 bázispárt tartalmazó fragmenst elkülönítjük. Ezt a fragmenst EcoRI-vel emésztett M13 mpl9-cel ligáljuk, és E. coli JM109 törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokat a béta-galaktozidázaktivitás hiánya szerint szkríneljük. Öt ilyen béta-galaktozidázhiányos transzformánst izoláltunk, ezekből egyszálú DNS-t készítünk, és Sanger és munkatársai eljárása szerint szekvenáljuk. A három transzformáns DNS szekvenciája megfelel az mRNS 3’ végének, míg két transzformáns a proteint kódoló szekvenciát adja. A 13. ábrán azt a DNS-szekvenciát mutatjuk be, amelyet a cDNS proteint kódoló részére kaptunk.

A 13. ábrán az előre jelzett aminosavszekvenciát is bemutatjuk. Az első aminosavtól, az alanintól a 29. aminosavig, a prolinig, valamint a 79. aminosavtól, az izoleucintól a lánc végéig az aminosavszekvencia feltételezett. A 30. aminosavtól, aprolintól a 78. aminosavig, a prolinig terjedő előre jelzett aminosavszekvencia megegyezik a 3. példában leírt peptidszekvenciával.

7. példa

A GT10-Lilli-2A és az IL- li szekvenálása

A GT10-IL1Í-2A egy részét szekvenáltuk, ennek eredményét a 14. ábrán mutatjuk be. A DNS (99-557. nukleotidok) egy olyan fehérjét kódol, amely az IL- 1 inhibitorra jellemző aminosavszekvenciát tartalmazza. Úgy véljük azonban, hogy ezen a fehérjén néhány módosulásnak kell végbemennie, mielőtt a sejten kívüli környezetbe kiválasztódna. Ezek a módosulások a fehérje IL- li-aktivitását tekintve lehetnek lényegesek vagy lényegtelenek.

A GT10-IL1Í-2A az X jelöléssel illetett IL-li aminoterminusának legalább 32 aminosav N-terminálisát kódolja (3-98. nukleotidok). Úgy véljük, hogy ebben a 32 aminosavban szerepel egy kiválasztó vezető szekvencia, amely a 24-26. nukleotidok által kódolt M-nél kezdődik, a naszcens IL- li-t a sejt közötti környezetbe irányítja, majd a vezető peptidáz és feltehetőleg egyéb peptidázok eltávolítják. Ennek a szekvenciának az eltávolítási mértéke az alfa- és béta-IL- 1 inhibitorok esetén jelenleg még ismeretlen, de feltehető, hogy ezeknek a formáknak az N-terminálisa közel van az X forma N-terminálisához. Valószínű, hogy a kiválasztó leader (vezető) szekvencia eltávolítása szükséges ahhoz, hogy a fehérje hatékony IL- li-aktivitásúvá váljon.

A GT10-IL1Í-2A 349-351. nukleotidjai egy olyan N-egységet kódolnak, amely egy konszenzus Nglikozilezési hely része. N-glikanázzal való emésztésre való érzékenységük alapján feltételezzük, hogy az alfaés béta-IL- li glikozilezettek. Mivel az X forma nem érzékeny ezzel az enzimmel való emésztésre, feltehetőleg ez nem glikozilezett, bár ez a lehetőség is fennáll, ez a proteinszekvenálásban jártas szakember számára a leírásban adott információk birtokában könnyen kimutatható. Feltételezzük, hogy ennek az N-egységnek a glikozilezése nem szükséges ahhoz, hogy a protein hatásos IL- li aktivitást mutasson.

A GT10-IL1Í-2A 99- 101. nukleotidjai egy P-egységet kódolnak (lásd a 15. ábrán), de ez a P-egység nem mutatható ki ebben a helyzetben (az N-terminálison) az IL- li X formájában. Lehetséges, hogy ez az egység az érett fehérjében módosul. Úgy véljük, hogy ennek az egységnek a módosulása nem lényeges az IL- li-aktivitás hatékonysága szempontjából.

Az alfa- és béta-formák jelenleg ismeretlen N-terminális egységei az Edman lebontással nem teljesen mutathatók ki, feltehetőleg a GT10- ILli— 2A által kódolt fehérje bizonyos N-terminális egységeinek eltávolítását követően módosulnak. Feltételezzük, hogy ez a módosulás nem lényeges az IL- li-aktivitás hatékonysága szempontjából.

<5. példa

Az IL- li-t kódoló gének expressziója állati sejtekben

Az IL- li állati sejtekben való expressziójához a következő lépések szükségesek:

a) Expressziós vektor létrehozása

b) A gazdasejtvonal megválasztása

c) Az expressziós vektor bevitele a gazdasejtbe

d) A rekombináns gazdasejt manipulálása az IL- li expressziós szintjének növelésére.

1. Az állati sejtekben való felhasználásra szánt IL- li expressziós vektorok különféle típusúak lehetnek, köztük erősen konstitutív expressziós szerkezetek, indukálható génszerkezetek, valamint olyanok, amelyek bizonyos sejttípusokban való expresszióra megfelelőek. Minden esetben promotereket és más génszabályozó szakaszokat, például indukálható vagy nem indukálható erősítőket (enhancer) és poliadenilációs jeleket helyezünk el a plazmidalapú vektorban lévő cDNS-szekvenciához megfelelő helyzetben. A következőkben két ilyen szerkezetet ismertetünk: (1) Egy erős konstitutív promoter szakaszt tartalmazó szerkezetet készítünk majom vírus 40 (SV40)

HU 215 434 Β génkontrollszignálok olyan elrendezésben való alkalmazásával (pSV2CAT), ami plazmidra Gorman és munkatársai [Mól. Cél. Bioi., 2, 1044-1051 (1982)] által leírtaknak (amit leírásunkba referenciaként építünk be) megfelel. Ezt a plazmidot úgy manipuláljuk, hogy az IL- li cDNS-t helyettesítjük be a kloramfenikol acetiltranszferázt (CAT) kódoló szekvencia helyére a molekuláris biológiai technikában ismert módon (lásd Maniatis és munkatársai fentiekben hivatkozott munkája), amint azt a 6. ábrán bemutatjuk. (2) Indukálható génszerkezetet készítünk olyan PMK plazmid alkalmazásával, amely egér-metallotionein (MT-1) promoter szakaszát [Brinster és munkatársai: Cell, 27, 228-231 (1981)] tartalmazza. Ezt a plazmidot alkalmazhatjuk kiindulási anyagként, és manipulálhatjuk a 7. ábrán bemutatott módon, egy fémmel indukálható génszerkezet előállítására.

2. Számos különféle állati sejtvonal alkalmazható az IL- li kifejezésére az előzőekben leírt vektorok alkalmazásával, így aktív fehérjék állíthatók elő. Két olyan lehetséges sejtvonal, amelyeknek idegen gének expresszióját elősegítő képességét jól jellemezték, az egér Ltk és a kínaihörcsög-petefészek (CHO) dliír sejtek, bár az IL- li expressziója nem korlátozódik ezekre a sejtvonalakra.

3. A DNS-vektor ezekbe a sejtvonalakba számos génátviteli eljárással vihető be. Az itt alkalmazott eljárás a kalcium-foszfát- DNS precipitációs eljárás, amelyet S. L. Graham és A. S. van dér Eb [Virology, 52, 456-467 (1973)] írnak le. Ebben az eljárásban az IL- li expressziós vektorát egy másik, egy kiválasztó markert kódoló expressziós vektorral együtt csapják ki. Ltk- sejttranszfekció esetén a kiválasztó marker egy timidin-kináz gén, és a kiválasztást (szelekció) Wigler és munkatársai [Cell, 16, 777-785 (1979)] eljárásával végezzük, CHO dli ír sejtek esetén a kiválasztó marker dihidrofolátreduktáz (DHFR), és a szelekciót Ringold és munkatársai [J. Mól. Appl. Génét., 1, 165-175 (1981)] eljárásával végezzük.

4. Ezt követően az IL- li génszerkezetet kifejező sejteket olyan körülmények között szaporítjuk, amelyek mellett az IL- li-termelés szintje nö. A metallotionein promoter szerkezetet hordozó sejteket már nehézfémek, például kadmium jelenlétében szaporíthatjuk, amely az MT- 1 promoter hasznosítását ötszörösére növeli (Mayo és munkatársai: Cell, 29, 99-108), ez az IL- li fehérjeszint jelentékeny növekedéséhez vezet. Azokat a sejteket, amelyek IL- li expressziós vektorokat (SV40 vagy MT- 1 alapú) DHFR expressziós vektorokkal együtt tartalmaznak, a Ringold és munkatársai [J. Mól. Appl. Génét., 1, 165-175 (1981)] által leírt génszaporítási eljárás szerint kezelhetjük methotrexate alkalmazásával, ami a DHFR-nek kompetitív antagonistája. Ez a sejtben a DHFR gén több másolatának jelenlétéhez vezet, ennek folytán az IL- li gének megnövekedett kópiaszámához, ami több IL- li fehérje termelődéséhez vezet a sejtben.

9. példa

IL-1 i tisztítása rekombináns állati sejtekből

Tekintettel arra, hogy az IL- li-t természetes anyagok sejtjeiből kívánjuk kiválasztani, feltételezzük, hogy az előzőekben a természetes fehérjék tisztítására leírt eljárások hasonló tisztítást és jellemzőket eredményeznek rekombináns fehérjék esetén.

10. példa

Az IL-1 i szekvenciája

Az IL- li aminoterminális egységét néhányszor közvetlen fehérjeszekvencia-meghatározással argininként (R) azonosítottuk. Az ilyen szekvenálás eredményét a 3. példában mutatjuk be. Ezzel ellentétben az IL- li cDNS-szekvenálás alapján előrelátható aminoterminális egysége egy prolin (P). Ez az aminoterminális egység felel meg a 13. ábrán látható 85- 87. nukleotidoknak, és ez van körrel megjelölve a 14. és 15. ábrákon. Ez a látszólagos eltérés a cDNS-szekvencia és a közvetlen proteinszekvencia között feloldható azzal a feltételezéssel, hogy a cDNS-szekvenciába egy hiba épült be, miközben az mRNS-böl reverz transzkriptáz által katalizált módon szintetizálódott. Azaz az mRNSen az aminoterminális egység kódolására alkalmas módon elhelyezkedő CGA (arginin) kodon változhatott a reverz transzkriptáz reakció során CCA (prolin) kodonná a cDNS-ben. Ilyen típusú reverz transzkriptáz problémát ismertettek már korábban a szakirodalomban [B. D. Clark és munkatársai: Nucleic Acids Research, 14, 7897 (1986)].

Feltételezzük, hogy a protein helyes aminosavszekvenciája a cDNS által elöreláthatónak megfelelő, kivéve azt, hogy az aminoterminális aminosav prolin helyett arginin, amint az a 13- 15. ábrákon jelölve van. Mind a DNS-szekvenciák, mind a nekik megfelelő peptidszekvenciák a találmány oltalmi körén belül esnek, azzal a megjegyzéssel, hogy előnyös az aminoterminálison az argininszekvencia.

Claims (28)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Rekombináns DNS-eljárás interleukin-1 inhibitor (IL- li) előállítására, azzal jellemezve, hogy

   i) IL- 1 inhibitoraktivitású fehérjét kódoló DNSszekvenciát állítunk elő;

   ii) a DNS-szekvenciát gazdasejtbe bevihető és abban replikálódó vektorba klónozzuk, amely a DNSszekvencia expressziójához szükséges operációs elemeket is tartalmaz;

   iii) a DNS-szekvenciát és az operációs elemeket tartalmazó vektort az IL- 1 inhibitort kódoló DNS kifejezésére alkalmas gazdasejtbe visszük;

   iv) a gazdasejtet a vektor sokszorozódására és az inhibitor kifejeződésére alkalmas körülmények között tenyésztjük;

   v) az inhibitort kinyerjük, és vi) kialakítjuk a kinyert inhibitor IL- 1 inhibitoraktivitású, aktív tercier szerkezetét. (Elsőbbsége: 1988. 05. 27.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként cDNS-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 05. 27.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként genomi eredetű polinukleoon

   HU 215 434 Β tidszekvenciát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.

   05. 27.)
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként emlőssejtekből származó DNS-szekvenciát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 5

   05. 27.)
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként humán monocita sejtekből származó DNS-szekvenciát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.05.27.)
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.05.27.)
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként E. colit alkalmazunk. (Elsőbbsége: 15 1988.05.27.)
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlőssejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.05.27.)
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejtként CHO-sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 05. 27.)
10. 10. Eljárás interleukin-1 inhibitor (IL-li) polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy IL- li-t kódoló DNS-molekulát tartalmazó rekombináns gazda10 sejtben interleukin-1-et (IL-l-et) gátló aktivitású IL- li polipeptidet termeltetünk, és kódoló molekulaként az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazó DNS-molekulát alkalmazunk:

    (A)

    10 20 4- 30 40 50 60

    GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA

    MEICRGLRSHLI

    470 80 90 100 110 120

    CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSE T ICXPSGRKS

    130 140 150 160 170 180

    GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA S KMQAFRIWDVNQKTFYLRN

    190 200 210 220 230 240

    ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVN LEEKID

    250 260 270 280 290 300

    TGGTACCC ATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVPIE PHALFLG IHGGKMCL

    310 320 330 340 350 360

    CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD

    370 380 390 400 410 420

    TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSE NRKQDKRFAFIRS DSGP

    430 440 450 460 470 480

    CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFE SAACPGWFLCTAME A

    490 500 510 520 530 540

    ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQ PV SLTNMPDE GVMVTKFY

    550 4-560 570 580 590 600

    TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E DE* ahol S nukleotid jelentése C vagy G;

    (B) az (A) szekvenciában található kódoló régió vagy az (A) szekvencia IL- 1-et gátló IL- li-t kódoló részlete;

    (C) az (A) szekvenciában található kódoló régiónak vagy IL- 1-et gátló IL- li-t kódoló részletének degenerált szekvenciája;

    (D) az (A) szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;

    O 1

    HU 215 434 Β (E) az (A) szekvencia kódoló régiójának 99-554. pozíciói közötti szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;

    (F) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL- 1-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló szekvencia:

    (U) (X)PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNN

    QLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLG

    IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLS

    ENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWF

    LCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQ

    EDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL- li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja, és (X) jelentése R vagy P; vagy (G) az (F) amino sav szekvenciával legalább 70%ban homológ aminosavszekvenciát kódoló szekvencia;

    és a gazdasejteket a DNS-molekula expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1988. 11.03.)
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 80%ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNSmolekulát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 90%ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNSmolekulát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
13. 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 95%ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNSmolekulát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
14. 14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legfeljebb 5 %-ban különböző szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNS-molekulát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11.03.)
15. 15. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi szekvenciák egyikét tartalmazó DNS-molekulát alkalmazunk:

    (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL- 1-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:

    (U) (X)PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNN

    QLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLG

    IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLS

    ENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWF

    LCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQ

    EDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL- li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja, és (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 5%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia. (Elsőbbsége: 1988.11.03.)
16. 16. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi szekvenciák egyikét tartalmazó DNS-molekulát alkalmazunk:

    (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL- 1-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:

    (U) (X)PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNN

    QLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLG

    IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLS

    ENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWF

    LCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQ

    EDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL- li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja, és (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 1 %-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia. (Elsőbbsége: 1988.11.03.)
17. 17. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi aminosavszekvenciájú polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát alkalmazunk:

    MRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNN

    QLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLG

    IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLS

    ENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWF

    LCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQ

    EDE. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
18. 18. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak részletét tartalmazó N-terminális szekréciós szignál peptidet kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát alkalmazunk:

    MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC. (Elsőbbsége: 1988. 11.03.)
19. 19. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy IL- li-ként a humán urináris IL- li-étől eltérő glikozilációs mintázatú IL— li-t, vagy glikozilálatlan IL- li-t állítunk elő. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
20. 20. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként prokarióta sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként E. coli sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
22. 22. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként emlőssejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként CHO-sejtet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
24. 24. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként a natív IL- li inhibitor promóterétől eltérő promótert funkcionálisan a kódoló szekvenciához kapcsoltan tartalmazó DNS-molekulát alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
25. 25. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns gazdasejteket a DNS-molekula sokszorozódására alkalmas tápközegben tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1988.11.03.)

    HU 215 434 Β
26. 26. A 10-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expresszált polipeptidet begyújtjuk. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy végrehajtunk egy további lépést is, amely szerint a begyűjtött polipeptidet úgy módosítjuk, hogy IL- li inhibitoraktivitása legyen. (Elsőbbsége: 1988. 11. 03.)
28. 28. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy további lépés során a begyűjtött polipeptidet gyógyászatilag elfogadható hordozóval elegyítjük, és így gyógyászati készítményt állítunk elő. (Elsóbbsé5 ge: 1988. 11.03.)

    HU 21? 4?4 Β Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    -0^280 ·*—* radioaktivitás

    -bioaktivitás “· NaCl gradiens

    0D280 radioaktivitás

    1. B abra

    0/1

    HU 21? 4?4 β Int.Cl.⁶: C 12 P 21/00

    FCS lemez IgG lemez

    Ezüsttel festett gélek

    2.A ábra

    -^! μίήίί > '«>»> C.

    I tsOSXfsr »«ctiC íktotKli hl. μAutoradiogramok

    2. B ábra

    Os tiu 213 4J4 β Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    0D2I5

    OOzio radioaktivitás

    HU 213 434 β Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    43 KD -25 KD

    Ezüsttel festett gél

    3.B ábra —43 KD

    - -—25 KD

    V

    Autoradiogram

    3.C ábra

    0*7

    RO·!

    riu 21? 4?4 u Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    0Ü280 radioaktivitás bioaktivitás

    Λ.Β ábra

    OQ

    WU 210 4J4 u

    Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    Western Ezüst-festés

    5. A ábra λ I t 0 £ íi

    5. B ábra

    ΤΩ

    HU 21? 4?4 B Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    Hpal

    Polilinker restrikciós helyei α kővetkezők:

    Hindin, Sme l, Bg H,...

    “^T r’ ... j wuuim Hpal

    Kari, EcoRI.Hpa

    EcoRI

    EcoRI

    KTU-IL-li

    IL-li

    h.Hasítás EcoRI-vei |2. A kis (IL-licDNS) fragmens tisztítása

    1. Ligálás szintetikus polilinker rel

    2 Transzformálás _u . _ E. coliba Hind ΙΠ

    1. Hasítás EcoRI-vel

    2. A lineáris fragmens izolálása,

    1 Két fragmens keverése

    2. Ligálás

    3. Az alábbi plazmidot tartalmazó E.coli transzformánsok szelekciója

    EcoRI

    PSVXVPL2IL-Ü

    6. ábra

    EcoRI

    HU Z13 4J4 B Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    7 óbra

    Q1 tlU 21? 4?4 b Int. Cl.⁶: C 12 P 21/00

    3. Li gátás

    EcoRI

    LAMBDA4

    GT11-IL-lí#10l

    EcoRI —IHasitas Eco Rl-vel

    Hasítás EcoRI-vei Akis (IL-licDNS) fragmens tisztítása agaróz gél elektroforézissel

    Az EcoRI-vei hasított pMK-SGE2-t és az IL—1 icDNS-t elegyítjük és ligetijük. E. coliba transzformáljuk a plazmidokat izoláljuk. Az lL-1icDNS fragmens jelenlétét és orientációját p||pnnrÍ77Íik