SK286106B6 - Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C - Google Patents
Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C Download PDFInfo
- Publication number
- SK286106B6 SK286106B6 SK40-2005A SK402005A SK286106B6 SK 286106 B6 SK286106 B6 SK 286106B6 SK 402005 A SK402005 A SK 402005A SK 286106 B6 SK286106 B6 SK 286106B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- hcv
- region
- protein
- glycoprotein
- virus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims description 77
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 108700008783 Hepatitis C virus E1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 15
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 56
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 26
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 20
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 19
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 12
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 11
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 7
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 7
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 7
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 7
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 7
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 6
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 206010019786 Hepatitis non-A non-B Diseases 0.000 description 4
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 4
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical group 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000234271 Galanthus Species 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010068997 Mannose-Binding Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000001698 Mannose-Binding Lectins Human genes 0.000 description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108700010756 Viral Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- -1 sialic acid compound Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008482 12E7 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010020567 12E7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 101710205660 Calcium-transporting ATPase Proteins 0.000 description 1
- 101710134161 Calcium-transporting ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum type Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100170937 Mus musculus Dnmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 101000912093 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Cell division control protein 24 Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012677 causal agent Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108020003928 mannose binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000036209 mannose binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000027380 protein glycosylation in Golgi Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C (HCV,anti-HCV protilátky) spočíva v tom, že sa (a) poskytne HCV skrátený glykoproteín, ktorý je vybraný zo súboru zahrnujúceho glykoproteín exprimovaný z E1 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 330 až 380 E1 oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu, a glykoproteín exprimovaný z E2 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 660 až 830 E2 oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu, nasleduje inkubácia biologickej vzorky s uvedeným HCV skráteným glykoproteínom za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexu protilátka-antigén, a (b) stanoví sa, či sa vytvoril komplex protilátka-antigén, obsahujúci tento skrátený glykoproteín.
Description
Tento vynález je zameraný na spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C.
Doterajší stav techniky
Hepatitída typu non-A non-B (NANBH) je nákazlivá choroba (alebo skupina chorôb), o ktorej sa usudzuje, že je spôsobená vírusom a je odlíšiteľná od iných foriem s vírusom asociovaných pečeňových chorôb, ako sú choroby spôsobené vírusom hepatitídy A (HAV), vírusom hepatitídy B (HBV), delta hepatitis vírusom (HDV), cytomegalovírusom (CMV) alebo vírusom Epstein-Barrovej. Epidemiologické štúdie napovedajú, že môžu byť tri typy NANBH: vodou prenosný typ alebo ihlami prenosný typ a sporadicky sa vyskytujúci spoločne získaný typ. Počet príčinných agens je neznámy. Ale nový vírusový druh, vírus hepatitídy C (HCV) bol nedávno identifikovaný ako primárny (ak nie jediný) pôvodca krvou prenosnej NANBH (BB-NANBH). Hepatitída typu C sa javí byť hlavnou formou hepatitíd spojených s transfúziou v mnohých krajinách alebo oblastiach, vrátane Spojených štátov, Európy, Japonska. Je tu tiež evidentné prispenie HCV v indukcii hepatocelulámeho karcinómu. Existuje tak potreba účinnej metódy na prevenciu a liečenie HCV infekcie. Potreba citlivých, špecifických metód na skríning a identifikáciu nosičov HCV a HCV-kontaminovanej krvi alebo krvných produktov je zrejmá. Post-transfúzna hepatitída (PTH) sa vyskytuje približne u 10 % pacientov s transfúziou a HCV sa pripisuje 90 % týchto prípadov. Hlavným problémom pri tejto chorobe je častá progresia do chronického pečeňového ochorenia nastupujúca v 25 až 55 %.
Starostlivosť o pacienta, ako i prevencia prenosu vírusu hepatitídy C krvou a krvnými produktmi alebo tesným osobným kontaktom, potrebuje spoľahlivý diagnostický a prognostický nástroj na detekciu nukleových kyselín, antigénov a protilátok, týkajúcich sa HCV. Navyše je tu tiež potreba účinnej vakcinácie a imunoterapeutických liečebných agens na prevenciu a/alebo liečenie choroby.
HCV sa objavuje v krvi infikovaných jedincov vo veľmi nízkom stupni v porovnaní s inými infekčnými vírusmi, čo robí vírus veľmi ťažko detekovateľným. Nízke vírusové zaťaženie je pravdepodobne primárnym dôvodom, že kauzálny agens NANB hepatitídy nebol tak dlho detegovaný. I keď bol teraz klonovaný, je stále ťažké HCV kultivovať a množiť. V súlade s tým je tu silná potreba rekombinantných prostriedkov na produkciu diagnostických, terapeutických, profylaktických HCV proteínov.
Navyše je i veľká potreba HCV vakcíny. Je však problematické kultivovať HCV v bunkových líniách. Nie je tak možné produkovať atenuované vírusové kmene sériovou pasážou v tkanivovej/bunkovej kultúre.
Podstata vynálezu
Predmetom tohto vynálezu je spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C alebo HCV čiže anti-HCV protilátky, ktorého podstata spočíva v tom, že zahrnuje kroky: poskytnutie HCV skráteného glykoproteínu, kde glykoproteínje vybraný zo súboru zahrnujúceho glykoproteín exprimovaný z EI oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 330 až 380 EI oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu, a glykoproteín exprimovaný z E2 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 660 až 830 E2 oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu, inkubácia biologickej vzorky s uvedeným HCV skráteným glykoproteínom za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexu protilátka-antigén a stanovenie, či sa vytvoril komplex protilátka-antigén, obsahujúci tento skrátený glykoproteín.
Ďalej sa opisuje predmetný vynález detailne a v širších súvislostiach.
Zistilo sa, že dva HCV proteíny, EI a E2 sa javia byť s membránou asociované asialoglykoproteíny, ak sú exprimované v rekombinantných systémoch. Toto je prekvapujúce, pretože asialoglykoproteíny u cicavcov zvyčajne nezostávajú vo forme zakončenej manózou, ale sú modifikované cukrami. Manózou zakončená forma je obvykle iba prechodná. V prípade EI a E2 (ako boli exprimované v predmetnom systéme) sa javí byť asialoglykoprotein konečnou formou. EI (obalový proteín 1) je asialoglykoproteín, majúci molekulovú hmotnosť 35 000, ktorý je prepisovaný z danej oblasti HCV genómu. E2 (obalový proteín 2) je asialoglykoproteín, majúci molekulovú hmotnosť okolo 72 000, ktorý je prepisovaný z danej NS1 (neštruktúrny proteín 1) oblasti HCV genómu, na základe flavivírusového modelu HCV. Pretože vírusové asialoglykoproteíny sú často vysoko imunogénne, sú EI a E2 prvými kandidátmi pri použití v imunodiagnostických skúškach a terapeutických/profylaktických vakcínach.
Objav, že EI a E2 nie sú sialylované, je významný. Jednotlivá forma proteínu často určuje, ktoré bunky môžu slúžiť ako vhodný hostiteľ pre rekombinantnú expresiu. Prokaryoty ako E. coli neglykozylujú proteíny a sú všeobecne nevhodné na produkciu asialoglykoproteínov použitých ako antigén, pretože glykozylácia je často dôležitá pre plnú antigénnosť, solubilitu a stabilitu proteínu. Nižšie eukaryoty ako kvasinky a huby glykozylujú proteíny, ale všeobecne sú neschopné pridávať koncový zvyšok sialovej kyseliny ku komplexu cukru. Tak z kvasiniek odvodené proteíny môžu byť antigénovo odlišné od ich prirodzených (nerekombinantných) proťajškov. Expresia v cicavčích bunkách je preferovaná pre aplikáciu, v ktorej je dôležitá antigenicita produktu, pričom glykozylácia rekombinantných proteínov by sa mala veľmi podobať takej, ktorá je pri prirodzených vírusových proteínoch.
Nové informácie ukazujú, že HCV vírus môže preniknúť do hostiteľských buniek počas infekcie buď vďaka asialoglykoproteínovému receptoru, nachádzajúcemu sa na hepatocytoch, alebo manózovému receptoru nachádzajúcemu sa na hepatických endoteliálnych bunkách a makrofágoch (hlavne Kupfferových bunkách). S prekvapením sa zistilo, že väčšina prirodzených E1 a E2 neobsahuje terminálny zvyšok kyseliny sialovej, aleje iba glykozylovaná na jadre. Malá frakcia navyše obsahuje koncový N-acetylglukozamín.
Hepatitis C vírusový, skrátený asialoglykoproteín je bez všetkých alebo podstatných koncových zvyškov kyseliny sialovej. Hepatitis C vírusový alebo HCV, skrátený asialoglykoproteín, je vybraný zo skupiny zahrnujúcej asialoglykoproteín exprimovaný z E1 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 330 až 380 E1 oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínov a asialoglykoproteín exprimovaný z E2 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 660 až 830 E2 oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu.
Uskutočnenie vynálezu
A. Definície
Výraz „asialoglykoproteín“ označuje glykozylovaný protein, ktorý je bez zlúčeniny kyseliny sialovej. Asialoglykoproteín môže byť pripravený rekombinantne alebo purifikáciou z bunkovej kultúry alebo z prirodzeného zdroja. V súčasnosti preferované asialoglykoproteíny sú odvodené od HCV, výhodne ide o asialoglykoproteíny E1 a E2, najvýhodnejšie rekombinantne E1 a E2 (rEl a rE2). Protein „v podstate bez“ sialovej kyseliny sa získa v medziach možností tejto definície, ak množstvo zvyšku sialovej kyseliny významne neinterferuje s väzbou asialoglykoproteínu na manózu viažuce proteíny, ako je GNA. Tento stupeň sialylácie sa zvyčajne získa tam, kde je menej ako 40 % celkovo N-viazaných cukrov na sialovej kyseline, výhodnejšie menej ako 30 %, ešte výhodnejšie menej ako 20 %, obzvlášť výhodne menej ako 10 %, obzvlášť výhodne menej ako 5 % a najvýhodnejšie menej ako 2 %.
Výraz „El“ ako sa tu používa, označuje protein alebo polypeptid exprimovaný v rozmedzí prvých 400 aminokyselín HCV polyproteínu, označovaného ako E alebo S protein. Vo svojej prirodzenej forme ide o asialoglykoproteín s molekulovou hmotnosťou 35 000, ktorý je silne asociovaný s membránou. Vo väčšine HCV kmeňov je El protein kódovaný vo vírusovom polyproteíne, nasledujúci C (jadrový) protein. El proteín sa rozkladá od asi aminokyseliny 192 k asi aminokyseline 383 celkovej dĺžky polyproteínu. Výraz „El“ ako je tu použitý, tiež zahrnuje analóg a upravené mutanty, ktoré sú imunologický krížovo reaktívne s prirodzeným El.
Výraz „E2“, ako je tu použitý, označuje protein alebo polypeptid exprimovaný v rozmedzí prvých 900 aminokyselín NCV polyproteínu, niekedy označovaného ako NS1 protein. Vo svojej prirodzenej forme je to glykoproteín s molekulovou hmotnosťou 72 000, ktorý je silne asociovaný s membránou. Vo väčšine prirodzených kmeňov E2 protein nasleduje El protein. E2 protein sa rozkladá približne od aminokyseliny 384 k aminokyseline 820. Výraz „E2“, ako je tu použitý, označuje tiež analógy a spracované mutanty, ktoré sú imunologický skrížené reaktívne s prirodzeným E2.
Výraz „purifikovaný“ (čistený) ako je tu použitý, označuje kompozíciu, kde požadovaný protein tvorí aspoň 35 % celkového proteínového komponentu v kompozícii. Požadovaný protein účelne tvorí aspoň 40 %, lepšie aspoň 50 %, ešte lepšie aspoň 60 % a výhodne 70 %, výhodnejšie 80 %, ešte výhodnejšie 90 % a najvýhodnejšie aspoň 95 % celkového proteínového komponentu. Kompozícia môže obsahovať iné zlúčeniny ako cukry, soli, lipidy, rozpúšťadlá a tak podobne, bez ohrozenia uvedenej čistoty. „Izolovaným“ HCV glykoproteínom sa myslí HCV asialoglykoproteínová kompozícia, ktorá má čistotu aspoň 35 %.
„Manózu viažuci protein“ znamená lektín alebo iný protein, ktorý špecificky viaže proteíny, majúce manéžou zakončenú glykozyláciu (t. j. asialoglykoproteín), napríklad manózu viažuce lektíny, protilátky špecifické pre manózou zakončené glykozylácie, receptorový protein pre manózu (R. A. B. Ezekowitz a spol., J. Exp. Med. 176, 1785 až 1794 (1990)), receptorový protein pre asialoglykoproteín (H. Kurate a spol., J. Biol. Chem. 265. 11295 až 11298 (1990)), sérový manózu viažuci protein (I. Schuffenecker a spol., Cytogenet. Celí Genet. 56, 99 až 102 (1991), K. Sastry a spol., J. Immunol. 147. 692 až 697) (1991)), sérový asialoglykoproteín viažuci protein a podobne. Manózu viažuce lektíny zahrnujú napríklad GNA, konkavalín (ConA) a ďalšie lektíny s podobnými väzbovými vlastnosťami.
Výraz „GNA lektín“ označuje aglutinín Galanthus nivalus, komerčne dostupný lektín, ktorý viaže manózou zakončené glykoproteíny.
„Rekombinantný“ glykoproteín, ako je tu označený, je glykoproteín exprimovaný z rekombinantného polynukleotidu, v ktorom štruktúrny gén kódujúci glykoproteín je exprimovaný pod kontrolou regulačných sekvencií, nie prirodzene pripojených k štruktúrnemu génu, alebo kde štruktúrny gén je modifikovaný. Napríklad sa môže získať vektor, v ktorom je štruktúrny gén E1 umiestnený pod kontrolou funkčných fragmentov promótora kvasinkovej glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH). Súčasne preferovaným promótorom na použitie v kvasinkách je hybridný ADH2 (GAP promótor, opísaný US patentom č. 4 880 734, ktorý využíva fragment GAPDH promótora v kombinácii s protismemou aktivačnou sekvenciou, odvodenou od alkoholdehydrogenázy 2). Modifikácia štruktúrneho génu môže zahrnúť substitúciu rôznych kodónov a degeneráciu kodónov (t. j. utilizovať hostiteľom preferované kodóny, eliminovať alebo generovať miesto štiepenia reštrikčnými enzýmami, kontrolovať vlásenkové formácie atď.) a substitúciu, inzerciu alebo deléciu limitovaného množstva kodónov, kódujúcich odlišné aminokyseliny (výhodne nie viac ako 10 %, výhodnejšie menej ako 5 % z prirodzených aminokyselinových sekvencií by malo byť zmenené) a tak podobne. Podobne ako „rekombinantný“ receptor sa označuje receptorový proteín exprimovaný z rekombinantného polynukleotidu, v ktorom štruktúrny gén, kódujúci receptorový proteín, je exprimovaný pod kontrolou regulačnej sekvencie neprirodzene pripojenej k štruktúrnemu génu alebo v ktorom je štruktúrny gén modifikovaný.
Termín „izolovaný polypeptid“ označuje polypeptid, ktorý je v podstate zbavený iných HCV vírusových komponentov, hlavne polynukleotidov. Polypeptidová kompozícia je „v podstate bez“ iných komponentov, ak hmotnosť polypeptidu v kompozícii je aspoň 70 % hmotnosti polypeptidu a ďalších komponentov, výhodnejšie aspoň asi 80 %, ešte výhodnejšie asi 90 % a najvýhodnejšie 95 % alebo viac. Napríklad kompozícia, obsahujúca 100 pg/ml E1 a iba 3 pg/ml iných HCV komponentov (t. j. DNA, lipidov atď.) je v podstate „bez iných vírusových komponentov“, a tak je kompozícia izolovaného peptidu v medziach rozsahu tejto definície.
Termín „sekrečný leader“ označuje polypeptid, ktorý kóduje N-koniec proteínu a spôsobuje, že proteín je po translácii secemovaný do kultivačného média hostiteľských buniek. Sekrečný leader bude všeobecne odvodený od použitej hostiteľskej bunky. Napríklad vhodný sekrečný leader na použitie v kvasinkách je Saccharomyces cerevisae α-faktor leader (pozri US patent č. 4 870 008).
Výraz „nižšie eukaryoty“ označuje hostiteľské bunky, akými sú kvasinky, huby a podobne. Nižšie eukaryoty sú obyčajne (ale nie nevyhnutne) jednobunkové. Preferovanými nižšími eukaryotmi sú kvasinky, hlavne druhy Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Klueromyces, Pichia, Hansenula a podobne. Najbežnejšie používanými kvasinkovými hostiteľmi sú Saccharomyces cerevisiae, S. carlsoergensis a K. lactis a sú to bežne používané hostiteľské bunky.
Termín „vyššie eukaryoty“ označuje hostiteľské bunky odvodené od vyšších živočíchov, ako sú cicavce, plazy, hmyz a podobne. Súčasne preferovanými vyššími eukaryotickými hostiteľskými bunkami sú tie, ktoré sú odvodené od čínskeho škrečka (napríklad CHO), opice (napríklad COS bunky), ľudské a hmyzie (napríklad Spodoptera frugiperda). Hostiteľské bunky môžu byť poskytnuté v suspenzii alebo v skúmavkovej kultúre, tkanivových kultúrach, orgánových kultúrach a podobne.
Výraz „kalciový modulátor“ označuje zlúčeninu schopnú sekvestrácie alebo väzby kalciových iónov vnútri endoplazmatického retikula alebo ovplyvňovať koncentráciu kalciových iónov vnútri ER svojím pôsobením na kalciové regulačné proteíny (napríklad proteíny kalciového kanálu, kalciovej pumpy atď.). Vhodné kalciové modulátory obsahujú napríklad tapsigargín, EGTA (etylénglykol-bis[3-aminoetyléter]N,N,N',N'-tetraoctová kyselina). Teraz preferovaným modulátorom je tapsigargín (pozri napr. O. Thastrup a spol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990), 87,2466 - 2470).
Termín „imunogénne“ označuje schopnosť substancie spôsobovať humorálnu a/alebo bunkovú imunitnú odpoveď, ak je sama naviazaná na nosič za prítomnosti alebo neprítomnosti prísad. „Neutralizácia“ označuje imunitnú odpoveď, ktorá blokuje infekčnosť buď čiastočne, alebo úplne, infekčného agens. „Vakcína“ je imunogénna kompozícia schopná vyvolať ochranu proti HCV úplnú alebo čiastočnú a je vhodná na liečenie indivídua.
Výraz „biologická tekutina“ označuje tekutinu získanú z organizmu, ako je sérum, plazma, sliny, žalúdočný sekrét, hlien a pod. Všeobecne je biologická tekutina skrínovaná na prítomnosť HCV častíc. Niektoré biologické tekutiny sú použité ako zdroj iných produktov, akými sú zrážacie faktory (napríklad faktor VIII:C), sérový albumín, rastový hormón a pod. V takýchto prípadoch je dôležité, že zdroj biologickej tekutiny je zbavený kontaminácie vírusom, akým je HCV.
B. Všeobecná metóda
E1 oblasť HCV genómuje opísaná v EP 388 323 ako oblasť „E“, zatiaľ čo E2 je opísaná ako „NS1“. E1 oblasť zahrnuje približne aminokyseliny 192 až 383 vo vírusovom polyproteíne plnej dĺžky. E2 oblasť zahrnuje približne oblasť aminokyselín 384 - 830. Kompletné sekvencie prototypov týchto proteínov (HCV-1 kmeň) sú v odbore dosiahnuteľné (pozri EP 388 232) a sú všeobecnými metódami na klonovanie a expresiu proteínov. Tak El, ako E2 môžu byť exprimované z polynukleotidu, kódujúceho prvých 850 až 900 aminokyselín HCV polyproteínu.' post-translačné spracovanie vo väčšine eukaryotických buniek štiepi počiatočný polyproteín na C, E1 a E2. Je možno upraviť 5' koniec kódujúcej oblasti na zníženie množstva produkovaného proteínu.
Expresia asialoglykoproteínov sa môže dosiahnuť mnohými metódami. Napríklad je možné dosiahnuť expresiu v nižších eukaryotoch (ako sú kvasinky), ktoré prirodzene nepridávajú zvyšky kyseliny sialovej ku glykozylovaným proteínom. V kvasinkovom expresnom systéme sa teraz preferuje využitie sekrečného leadera, ako je S. cerevisoae α-faktor leader, takže proteín je exprimovaný po translácii do kultivačného média. Je tiež v súčasnosti preferované využívanie glykozylácie bez mutantu, akým je pmrl, pretože tieto mutanty poskytujú iba jadrovú glykozyláciu a často secemujú heterológne proteíny s vysokou výťažnosťou (H. K. Rudolph a spol., Celí 58, 133 až 145 (1989)). Alternatívne je možné využiť iné druhy kvasiniek, ako je Pichia pastoris, ktorá exprímuje glykoproteíny, obsahujúce 8 až 9 manéžových zvyškov vo forme, o ktorej sa usudzuje, že sa podobá jadrovej glykozylácii formy pozorovanej u cicavcov a S. cerevisiae.
Alternatívne je možné uskutočniť expresiu v cicavčích bunkách a blokovať koncovú glykozyláciu (pridanie sialovej kyseliny). „Rekombinantné“ konštrukty budú výhodne zahrnovať expresný signál na zaistenie toho, že proteín je smerovaný do endoplazmatického retikula. Transport do Golgiho aparátu sa javí byť blokovaný E1 a E2 samotnými: vysoká hladina expresie E1 alebo E2 v cicavčích bunkách sa zdá byť ukončujúca sekréciu všetkých celulámych proteínov v endoplazmatickom retikule alebo cis Golgiho aparáte. Je navyše možné využiť glykozyláciu defektných mutantov. Pozri napríklad P. Stanley, Ann. Rev. Genet. 18, 525 až 552 (1984). V prípade glykozylácie alebo transportného mutantu exprimujúceho E1 alebo E2 so sialyláciou, môžu byť koncové zvyšky kyseliny sialovej oddelené pôsobením neuraminidázy.
Výťažok môže byť ďalej zvyšovaný pôsobením kalciového modulátora na získanie uvoľneného proteínu z vnútra endoplazmatického retikula. K vhodným modulátorom patria tapsigargín, EGTA a A23817 (pozri napr. O. Thastrup a spol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87, 2466 až 2470 (1990)). Je napríklad možné exprimovať veľké množstvo E1 a E2 intraceluláme v cicavčích bunkách (napríklad CHO, COS, HeLa bunkách a pod.) transfekciou rekombinantným vektorom vírusu vakcínie. Po poskytnutí času na expresiu proteínov a akumuláciu v endoplazmatickom retikule sú bunky vystavené pôsobeniu kalciového modulátora v koncentrácii vysoko dostatočnej na to, aby spôsobila uvoľnenie obsahu ER. Proteín sa získa späť z kultivačného média, odkiaľ sa zoberie do ďalšieho cyklu.
Okrem toho môže byť výhodné exprimovať skrátenú formu obalového proteínu. Tak El, ako E2 receptor má silne hydrofóbnu doménu, ktorá výrazne kotví proteín v endoplazmatickom retikule a zabraňuje účinnému uvoľneniu. Tak šije možné želať deléciu oblasti sekvencie nájdenej v jednej alebo viacerých oblastiach aminokyselín 170 až 190, 260 až 290 alebo 330 až 380 El (počítané od začiatku polyproteínu) a aminokyselín 660 až 830 E2 (pozri napríklad obr. 20-1 EP 388 232). Je pravdepodobné, že aspoň jedna z týchto hydrofóbnych domén formuje transmembránovú oblasť, ktorá nie je nevyhnutná pre antigénnosť proteínu, a ktorá tak môže byť deletovaná bez nežiaduceho účinku. Najlepšia oblasť pre deléciu môže byť určená vykonaním malého množstva delečných experimentov skúseným odborníkom. Delécia hydrofóbneho 3' konca v E2 vedie k sekrécii exprimovanej časti E2 so sialyláciou secemovaného proteínu.
Je možné použiť akýkoľvek variant vektorov na získanie sekrécie. Nižšie eukaryoty, ako sú kvasinky, sú typicky transformované plazmidy s použitím metódy zrážania fosforečnanom vápenatým alebo transfekciou rekombinantným vírusom. Vektory sa môžu replikovať v hostiteľskej bunke nezávisle alebo sa môžu integrovať do genómu hostiteľskej bunky. Vyššie eukaryoty môžu byť transformované plazmidmi, ale sú zvyčajne infikované rekombinantným vírusom, napríklad rekombinantným vírusom vakcínie. Preferovaná je najmä vakcínia, pretože infekcia vakcíniou zastavuje expresiu proteínov hostiteľskej bunky. Teraz sú preferovanými hostiteľskými bunkami HeLa a plazmacytómové bunkové línie. V prítomnom systéme to znamená, že El a E2 sa akumulujú ako väčšinový glykozylovaný typ ER hostiteľa. Pretože rEl a rE2 budú prevažujúce glykoproteíny, ktoré sú zakončené manózou, môžu byť ľahko purifikované z buniek s použitím lektínov, ako je aglutinín Galanthus nivalus (GNA), ktorý viaže koncové manózové zvyšky.
Proteíny, ktoré sú prirodzene exprimované ako manózou zakončené glykoproteíny, sú relatívne vzácne v cicavčej fyziológii. Vo väčšine prípadov je cicavčí glykoproteín manózou zakončený iba ako prechodný intermediát v metabolickej ceste glykozylácie. Skutočnosť, že HCV proteíny, exprimované rekombinantne, obsahujú manózou ukončenú glykozyláciu alebo (v menšom stupni) N-acetylglukózamín, znamená, že HCV proteíny a všetky virióny môžu byť separované a čiastočne purifikované z endogénnych proteínov použitím lektínov špecifických pre koncovú manózu alebo N-acetylglukózamín. Rekombinantné proteíny sa javia byť autentické a zdajú sa byť v podstate identické s obalovými proteínmi zistenými v zrelom, voľnom virióne, alebo k vytvoreným s bunkou asociovaným obalovým proteínom. Je tak možné použiť lektíny, akým je GNA pre manózou zakončené proteíny a WGA (zárodočný aglutinín pšenice) a jeho ekvivalenty pre N-acetylglukózamínom zakončené proteíny. Môžu sa využiť lektíny, viazané na pevnú fázu (napríklad lektín - Sepharose® kolónu) na separáciu El a E2 zo supematantov bunkových kultúr a iných tekutín, napríklad na purifikáciu počas produkcie antigénov pre vakcínu alebo na použitie pri imunodiagnostickej skúške.
Alternatívne je možné poskytnúť vhodný lektín na izoláciu El, E2 alebo HCV viriónu z tekutiny alebo tkanivových vzoriek zo subjektu, o ktorom sa predpokladá, že je infikovaný HCV. Pretože manózou zakon čené glykoproteíny sú relatívne vzácne, môže takýto postup slúžiť na čistenie proteínov prítomných vo vzorke, významne redukujúcim pozadie. Po väzbe na lektín môže byť HCV proteín detegovaný použitím anti-HCV protilátok. Ak je prítomný celý virión, je možné alternatívne detegovať HCV nukleové kyseliny použitím PCR techník alebo iných metód amplifikácie nukleovej kyseliny, smerujúcich k zachovaniu oblasti HCV genómu (napríklad 5' nekódujúca oblasť). Táto metóda dovoľuje izoláciu a charakterizáciu odlišných kmeňov HCV s ohľadom na antigénny drift alebo variáciu, t. j. v prípadoch, kde nové kmene nie sú skrížené imunologický reaktívne s kmeňmi použitými na prípravu protilátok. Je tu mnoho ďalších ciest využitia výhodnosti unikátneho rozpoznania manózou zakončených glykoproteínov jednotlivými lektínmi. Napríklad je možné inkubovať vzorky, o ktorých sa predpokladá, že sú kontaminované HCV viriónmi alebo proteínmi s biotínom alebo avidínom označenými lektínmi a zrážať proteín-lektínový komplex s použitím avidínu alebo biotínu. Je možné tiež použiť afinitu lektínu k HCV proteínom na zameranie zlúčenín na virión na terapeutický účel, napríklad konjugáciou antivírusovej zlúčeniny s GNA. Alternatívne je možné použiť vhodné lektíny na vylúčenie manózou zakončených glykoproteínov zo séra alebo frakcie plazmy, a tak redukovať alebo eliminovať riziko HCV kontaminácie.
V súčasnosti je preferované izolovať E1 a/alebo E2 asialoglykoproteíny zo surového bunkového lyzátu inkubáciou s imobilizovaným manózu viažucim proteínom, hlavne lektínom, ako je ConA alebo GNA. Bunky sú lyzované, t. j. napr. mechanickou disrupciou v hypotonickom pufre nasledovanou odstredením na prípravu post-nukleámeho lyzátu a ďalším odstredením na získanie surovej frakcie mikrozomálnej membrány. Surová membránová frakcia je následne solubilizovaná v pufre, obsahujúcom povrchovo aktívnu látku akou je Triton X-100, NP-40 a podobne. Detergentový extrakt je ďalej vyčistený od nerozpustných častíc odstredením a výsledný vyčistený lyzát je inkubovaný v chromatografickej kolóne, obsahujúcej proteín viažuci imobilizovanú manózu, výhodne GNA viazaný na pevný nosič, akou je agaróza alebo SepharosaR v čase dostatočnom na väzbu, typicky 16 až 20 hodín. Suspenzia je potom aplikovaná do kolóny až do toho času, kým sa nezačne objavovať v eluente, potom je inkubovaná v kolóne v čase dostatočnom na viazanie, zvyčajne asi 12 až 24 hodín. Väzbový materiál je potom vymývaný ďalším pufor obsahujúcim detergentom (t. j. napr. Triton X-100, NP-40 a podobne) a eluovaný manózou na poskytnutie čisteného asialoglykoproteínu. Pri elúcii je preferované eluovať iba do toho času, kým sa proteíny objavia v eluáte, v tomto bode je elúcia zastavená a kolóna sa ekvilibruje 3 až 2 hodiny pred elúciou proteínov. O tom sa predpokladá, že je dostatočný čas na spomalenie stupňa očakávaných veľkých proteínových agregátov. V prípadoch, keď E1 a E2 sú exprimované spoločne v natívnej forme (t. j. bez skrátenia domény viažucej membránu) sa podstatná frakcia asialoglykoproteínu javí ako E1 : E2 agregáty. Ak sú skúmané elektrónovým mikroskopom, javí sa podstatný podiel týchto agregátov ako takmer sférické častice, majúce priemer asi 40 nm, čo je veľkosť očakávaná pre intaktný vírus. Tieto častice sa javia byť samozhromažďujúcimi s časticami subvírusovými. Pri týchto agregátoch sa očakáva, že budú mať kvartému štruktúru veľmi podobnú štruktúre autentických HCV viriónových častíc, a tak sa predpokladá ich využitie ako vysoko imunogénnej vakcíny.
E1/E2 komplexy môžu byť ďalej purifikované gólovou chromatografiou v základnom médiu, napríklad Fractogel-DEAE alebo DEAE-Sepharose®. Použitím Fractogel-DEAE gélovej chromatografie je možné získať E1/E2 komplexy približne so 60 až 80 % čistotou. Je možné ďalej purifikovať E1 pôsobením lyzínproteázy, pretože E1 má 0 až 1 lyzínový zvyšok. Pôsobením lyzínproteázy na komplex sa ničí E2 a umožňuje sa tak ľahká separácia El.
Tkanivová špecifickosť HCV v kombinácii s pozorovaním, že HCV obalové glykoproteíny sú manózou zakončené, napovedá, že vírus využíva manéžový receptor alebo asialoglykoproteínový receptor (ASGR), aby vstúpil do hostiteľskej bunky. Manózový receptor sa nachádza na makrofágoch a bunkách hepatálnych sínusov, zatiaľ čo ASGR sa nachádza na parenchymálnych hepatocytoch. Je tak možné kultivovať HCV využitím hostiteľských buniek, ktoré exprimujú jeden alebo obidva tieto receptory. Je možné využiť buď primárne bunkové kultúry, ktoré prirodzene exprimujú receptor, s použitím podmienok, pri ktorých je receptor udržiavaný, alebo môže byť transfekovaná iná bunková línia, ako je HeLa, CHO, COS a podobne, vektorom poskytujúcim expresiu receptora.
Klonovanie manózového receptora a jeho transfekcia a expresia vo fibroblastoch bola demonštrovaná M. E. Taylorom a spol., J. Biol. Chem. 265, 12156 až 12162 (1990). Klonovanie a sekvenovanie ASGR opísal K. Drickamer a spol., J. Biol. Chem. 259, 770 až 778 (1984), a M. Spiess a spol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 6465 až 6469 (1985), transfekciu a expresiu funkčného ASGR v krysých HTC bunkách opísal M. McPhaul a P. Berg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 8863 až 8867 (1986) a M. McPhaul a P. Berg, Mol. Celí. Biol. 7, 1841 až 1847 (1987). Je tak možné transfekovať jeden alebo obidva receptory do vhodných bunkových línií a použiť výsledné bunky ako hostiteľov na propagáciu HCV v kultúre. Sériová pasáž HCV v takej kultúre by mala priniesť vývoj atenuovaných kmeňov vhodných na použitie ako živé vakcíny. Je možné využiť buď primáme bunkové kultúry, ktoré prirodzene exprimujú receptor s použitím podmienok, v ktorých je receptor zachovaný, alebo je možné transfekovať inú bunkovú líniu ako HeLa, CHO, COS a podobne, vektorom, poskytujúcim expresiu receptora. Klonovanie manózového receptora a jeho transfekcia a expresia vo fibroblastoch bola demonštrovaná Taylorom a spol., pozri skôr, zatiaľ čo transfekcia a expresia funkčného
ASGR v krysích HTC bunkách bola opísaná McPhaulom a spol., pozri skôr. Teraz je preferované použitie imortalizovaných bunkových línií transfekovaných jedným alebo oboma rekombinantným receptormi.
Imunogénne kompozície môžu byť pripravené podľa metód známych v odbore. Prítomné kompozície obsahujú imunogénne množstvo polypeptidu, napríklad El, E2 alebo E1/E2 časticových kompozícií obvykle kombinované s farmaceutický prijateľným nosičom, pričom ďalej výhodne obsahujú prísadu. Ak je žiaduci „kokteil“, môže byť kombinácia HCV polypeptidu, ako napríklad El plus E2 antigénu, zmiešaná dohromady na zvýšenie účinnosti. Vírusu podobné častice E1/E2 agregátu sú považované za obzvlášť vhodný vakcínový antigén.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Ďalej uvedené príklady predstavujú praktické uskutočnenie pre odborníkov v odbore a neznamenajú v žiadnom prípade obmedzenie tohto vynálezu.
Príklad 1 (Klonovanie a expresia) (A) Vektory boli konštruované z plazmidov, obsahujúcich 5' časť HCV genómu, ako je opísané v EP 318 216 a EP 388 232. Kazeta HCV(S/B) obsahuje Stul-Bglll DNA fragment, ktorý kóduje 5' zakončenie polyproteínu od Metl do Leu906, začínajúci pri nukleotide -63 vzhľadom na Met]. Zahrnuje jadrový proteín (C), El proteín (niekedy tiež označovaný ako S), E2 proteín (označovaný tiež ako NS1) a 5' časť NS2a oblasti. Po expresii konštruktu sa jednotlivé C, El a E2 proteíny produkujú proteolytickým spracovaním.
Kazeta HCV(A/B) obsahuje ApsLl-Bglll DNA fragment, kódujúci 5' koniec polyproteínu od Met] až do Leuw„ začínajúci pri nukleotide -6 vzhľadom na Metb Zahrnuje jadrový proteín (C), El proteín (niekedy tiež označovaný ako NS1) a 5' časť NS2a oblasti. Po expresii konštruktu sa jednotlivé C, El a E2 proteíny produkujú proteolytickým spracovaním.
Kazeta C-E1(S/B) (Stul-BamHI časť) obsahuje 5' koniec od Met! až do 11ε34ο (BamHI miesto v géne). Expresia tejto kazety vedie k expresii C a určitého skráteného El (Eľ). Časť skrátená od 3' konca je hydrofóbna oblasť, o ktorej sa predpokladá, že slúži ako translokačný signál.
Kazeta NSI(B/B) (BamHI-Bglll časť) obsahuje malú 3' časť od El (od Met364), celý E2 a časť NS2a (do Leu9o6). V tomto konštrukte slúži El fragment ako translokačný signál.
Kazeta TPA-NS1 využíva leader aktivátora ľudského tkanivového plazminogénu (tPa) ako translokačný signál namiesto 3' časti El. Kazeta obsahuje skrátenú formu E2 od Gly406 do Glu66l, v ktorej je hydrofóbny 3' koniec vypustený.
Každá kazeta bola inzertovaná do vektora pGME3Z (Promega) s a bez synteticky β-globín 5'-nekódujúcej sekvencie na transkripciu a transláciu s použitím T7 a expresiu in vitro v králičom retikulocyte. Rekombinantné vektory vírusu vaccinia (rVV) boli pripravené vsunutím kaziet do plazmidu pSCl 1 (získaný od Dr. B. Mosse, NIH) a nasledujúcou rekombináciou s vaccinia vírusom, ako opísal Charkrabarty a spol., Mol. Celí. Biol. 5,3403 až 3409(1985).
(B) Pozmenený expresný vektor bol skonštruovaný inzertom HCV(A/B) medzi Stul a Spel miesta pSCS9 (získaný od Dr. B. Mosse, NIH) a nasledujúcou rekombináciou s vaccinia vírusom, ako opísal Charkrabarty a spol., Mol. Celí. Biol. 5,3403 - 3409 (1985).
(C) HeLa S3 bunky boli zhromaždené odstreďovaním počas 7 minút pri frekvencii otáčok 2000 min'1 pri teplote miestnosti v sterilných 500 ml odstreďovacích nádobách (JA-10 rotor). Pelety boli resuspendované na konečnú koncentráciu 2 x 107 buniek/ml v ďalšom kultivačnom médiu (Joklik modifikované MEM Spinner médium + 5 % konského séra a gentamycín) („spinner médium“). Ultrazvukom spracovaný surový vv/SCS9-HCV zásobný vírus bol pridaný v násobku infekcie 8 pfu/bunka a zmes bola miešaná pri teplote 37 °C 30 minút. Infikované bunky boli potom prenesené do nádoby, obsahujúcej 8 1 spiner-média a inkubované 3 dni pri 37 °C.
Kultivované bunky potom boli zhromaždené odstredením a pelety boli resuspendované v pufre (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 152 ml). Bunky boli potom homogenizované s použitím 40 ml Dounce homogenizátora (50 rázov) a jadrá peletované odstredením (5 min., frekvencia otáčok 1600 min'1, 4 °C, JA-20 rotor). Jadrové pelety boli resuspendované v Tris pufre (24 ml), rehomogenizované a opäť peletované pri zhromaždení všetkých supematantov.
Zhromaždený lyzát bol rozdelený na 10 ml podiely a spracovaný ultrazvukom 3 x 30 minút v sonifikátore pri strednej sile. Sonifikovaný lyzát (15 ml) bol navrstvený na 17 ml sacharózové vankúšiky (36 %) v SW28 odstreďovacích skúmavkách a odstreďovaný pri frekvencii otáčok 13 500 min'1 počas 80 min. pri 4 °C na peletovanie vírusu. Peleta vírusu bola resuspendovaná v 1 ml Tris pufra (1 mM Tris HC1, pH 9,0) a zmrazená pri -80 °C.
Príklad 2 (Porovnanie produktov in vitro a in vivo) (A) E1 a E2 boli exprimované obidva in vitro a in vivo a 35S-Met označené s použitím vektorov opísaných v príklade 1. BSC-40 a HeLa bunky boli infikované rVV vektormi na in vivo expresiu. Médium a bunkové lyzáty boli skúšané na rekombinantné proteíny. Produkty boli imunoprecipitované s použitím ľudského HCV antiséra, zatiaľ čo in vitro proteiny boli analyzované priamo. Výsledné proteíny boli analyzované SDSPAGE.
Retikulocytový expresný systém (pGEM3Z s HCV(S/B) alebo HCV(A/B) produkuje C, E1 a E2 proteíny, majúce molekulové hmotnosti približne 18 000, 35 000 a 72 000. Lyzáty z BSC-40 a HeLa buniek transfekovaných rVV, obsahujúcim HCV(S/B), HCV(A/B) alebo C-E1(S/B) majú rovnaké proteíny. Pretože retikulocytový systém neposkytuje účinné golgi spracovanie, a preto neposkytuje sialovú kyselinu, skutočnosť, že obidva in vitro a in vivo produkty majú identické pohyblivosti, potvrdzuje, že proteíny nie sú in vivo sialylované. Iba rVV vektor, obsahujúci TPA-NS1 vedie v akejkoľvek extracelulámej sekrécii E2, ktorá má zmenenú pohyblivosť spojenú so sialyláciou.
(B) HCV(S/B) bol exprimovaný in vitro a inkubovaný s panelom biotinylovaných lektínov: GNA, SNA, PNA, WGA a ConA. Po inkubácii boli komplexy zhromaždené na avidín-akrylových guľôčkach, premyté, eluované Laemmli-vzorkovým pufrom a analyzované SDS-PAGE. Výsledky ukazujú, že E1 a E2 sa viaže na GNA a ConA, čo indikuje prítomnosť manózy. GNA sa viaže na koncové manózové skupiny, zatiaľ čo ConA sa viaže na akúkoľvek aa-napojenú manózu. Neprítomnosť väzby k SNA, PNA a WGA indikuje, že žiaden z proteínov neobsahuje sialovú kyselinu, galaktóza-N-acetylgalaktózamín alebo N-acetylglukózamín.
(C) Rádioaktívne značené E1 a E2 boli produkované v BSC-40 bunkách infekciou rVV, obsahujúcich HCV(SZB) (vv/SCll-HCV) a imunoprecipitované s ľudským HCV+ antisérom. Polovica imunoprecipitovaného materiálu bola ošetrená cez noc neuraminidázou na odstránenie akejkoľvek sialovej kyseliny. Po tomto spracovaní sa ošetrené a neošetrené proteíny analyzujú pomocou SDS-PAGE. Nebol pozorovaný žiaden významný rozdiel v mobilite, indikujúci neprítomnosť sialylácie in vivo.
(D) Rádioaktívne značené E1 a E2 boli produkované v BSC-40 bunkách infekciou rVV, obsahujúcich HCV(A/B) (vv/SCS9-HCV) a buď imunoprecipitované ľudským HCV+ sérom, alebo precipitované s použitím biotinylovaného GNA lektínu pripojeného k akrylovým guľôčkam s použitím w/SCl 1 bez HCV sekvencie ako kontroly. Precipitáty boli analyzované SDS-PAGE. Údaje demonštrujú, že E1 a E2 boli hlavnými druhmi manózou zakončených proteínov vo vv/SCS9-HCV infikovaných bunkách. CNA bol účinný ako ľudské antisérum v zrážaní E1 a E2 z bunkového kultivačného média. Bol pozorovaný komponent s molekulovou hmotnosťou 25 000, ale javí sa byť špecifický k vakcínia-infikovaným bunkám.
Príklad 3 (Purifikácia s použitím lektínu) (A) HeLa S3 bunky boli inokulované purifikovaným základným vírusom s vysokým titrom vv/SCSG-HCV pri násobnej infekcii 5 pfu/bunka a zmes bola miešaná pri 37 °C 30 minút. Infikované bunky boli potom prenesené do nádoby obsahujúcej 8 litrov spinner-média a inkubované 3 dni pri 37 °C. Bunky boli opäť zhromaždené odstredením a resuspendované v hypotonickom pufre (20 mM HEPES, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 120 ml) na ľade. Bunky potom boli homogenizované Dounce homogenizátorom (50 rázov) a jadrá peletované odstredením (5 minút, frekvencia otáčok 1600 min'1, 4 °C, JA-20 rotor). Pelety boli spojené, resuspendované v 48 ml hypotonického pufra, rehomogenizované, znova odstredené, opäť spojené a zmrazené na -80 °C.
Zmrazené supematanty potom boli roztavené a mikrozomálne membránové frakcie post-jadrového lyzátu izolované odstredením počas 20 min. v JA-20 rotore pri frekvencii otáčok 13 500 min'1 pri 4 °C. Supematant bol odstránený ašpiráciou.
Pelety boli vybraté do 96 ml detergentového pufra (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DDT, 0,5 % Triton X-100, pH 7,5) a homogenizované (50 rázov). Produkt bol vyčerený odstredením pri frekvencii 13 500 min'1 počas 20 minút pri teplote 4 °C a supematant bol zhromaždený.
GNA-agarózová kolóna (1 cm x 3 cm, 3 mg GNA/ml guľôčok, 6 ml objem lôžka, Vector Lebs, Burlingame, CA) bola vopred ekvilibrovaná s detergentovým pufrom. Vzorka supematantu bola aplikovaná na kolónu s recirkuláciou pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min. počas 16 až 20 hodín pri 4 °C. Kolóna bola potom premytá detergentovým pufrom.
Purifikované E1/E2 asialoglykoproteíny boli eluované a-D-manozidom (0,9 M v detergentovom pufre) pri prietokovej rýchlosti 0,5 ml/min. Elúcia bola zastavená pri výskyte E1/E2 v eluente a kolóna sa nechala ekvilibrovať počas 2-3 hodín. Frakcie boli analyzované pomocou Westem blot a vyfarbením striebrom. Pikové frakcie boli spojené a ožiarené UV na inaktiváciu akéhokoľvek zvyškového vaccinia vírusu.
(B) GNA-agarózou purifikované E1 a E2 asialoglykoproteíny boli sedimentované 20 až 60 % glycerínovými gradientmi. Gradienty boli frakcionované a proteíny boli analyzované SDS-PAGE a Westemblottingom. Bloty boli skúšané s GNA na identifikáciu E1 a E2. Výsledky ukazujú prítomnosť E1 : E2 hete rodiméru, ktorý sedimentuje očakávanou rýchlosťou (t. j. poloha charakteristická pre protein s molekulovou hmotnosťou 110 000). Sú tiež prítomné väčšie agregáty HCV obalových proteínov. E2 : E2 homodiméry sú tiež evidentné. E2 sa prejavuje ako prevládajúci vo väčších druhoch vzhľadom na El, i keď tiež boli detegované diskrétne El : E2 druhy. Väčšie druhy sedimentujú výrazne rýchlejšie ako tyroglobulínový markér.
(C) GNA-agarózou punfikované El a E2 boli sedimentované v 20 až 60 % glycerínových gradientoch, obsahujúcich 1 mM EDTA. Frakcie boli analyzované SDS-PAGE s a bez β-merkaptoetanolu (βΜΕ). Nebol pozorovaný žiaden alebo len malý rozdiel v zjavnom zastúpení El a E2 za prítomnosti alebo neprítomnosti βΜΕ, indikujúci neprítomnosť disulfidových väzieb medzi heterodimérmi.
(D) E1/E2 komplexy (približne 40 % čistoty) boli analyzované na Coulter DM-4-sub-mikrónovom časticovom analyzátore. Materiál v rozmedzí 20 až 60 nm bol detegovaný.
(E) E1/E2 komplexy (približne 40 % čistoty) boli analyzované elektrónovou mikroskopiou s použitím negatívneho vyfarbenia fosforwolfrámovou kyselinou. Elektrónový mikrograf odhaľuje prítomnosť častíc, majúcich sférický zjav a priemer asi 40 nm. E1/E2 komplexy boli inkubované s HCV+ ľudským antisérom, potom analyzované EM s negatívnym vyfarbením. Boli pozorované komplexy protilátky, obsahujúce veľké agregáty a malé častice.
Príklad 4 (Chromatografické čistenie) (A) GNA lektínom purifikovaný materiál pripravený v príklade 3 (0,5 až 0,8 ml) bol zriedený 10-krát pufrom A (20 mM Tris-Cl pufor, pH 8,0, 1 mM EDTA) a aplikovaný na 1,8 x 1,5 cm kolónu Fractogelu EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, kat. č. 16883) ekvilibrovanú v pufri A. Proteínová frakcia obsahujúca E1/E2 bola eluovaná rovnakým pufrom pri rýchlosti prietoku 0,2 ml/min. a boli odoberané 1 ml frakcie. Frakcie, obsahujúce El a E2 (stanovené SDS-PAGE) boli spojené a uložené pri -80 °C.
(B) Materiál purifikovaný v časti (A) mal čistotu 60 až 80 %, hodnotené pomocou SDS-PAGE. Identifikácia domnelých El a E2 pruhov bola potvrdená analýzou N-koncovej sekvencie s použitím transferovej techniky. Na tento účel bol Fractogel-DEAE purifikovaný E1/E2 materiál redukovaný prídavkom Laemli pufra (pH 6,8, 0,06 M Tris-Cl, 2,3 % SDS, 10 % glycerín, 0,72 M β-merkaptoetanol) a varený 3 minúty. Vzorka potom bola vložená na 10 % polyakrylamidový gél. Po SDS-PAGE bol protein prenesený na polyvinylidéndifluorid-(PVDF)-ovú 0,2 pm membránu (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Z blotu boli vyrezané pruhy domnelých El a E2 proteínov a podrobené analýze N-koncových aminokyselín, i keď nebola venovaná žiadna zvláštna starostlivosť ochrane amino-koncovej blokáde počas prípravy materiálu. Prvých 15 cyklov ukazuje, že El vzorka má sekvenciu
Tyr-Gln-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Asp, zatiaľ čo sekvencia E2 je
Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-Gly-Phe.
Tieto údaje o aminokyselinových sekvenciách sú v súlade s údajmi predpokladanými zo zodpovedajúcich DNA sekvencií.
E1/E2 produkt purifikovaný Fractogel-DEAE chromatografiou je považovaný za agregovaný, ako je zrejmé zo skutočnosti, že veľké množstvo El a E2 koeluuje v oblasti prázdneho objemu kolóny pre gélovú chromatografiu Bio-Sil TSK-4000 SVV. Toto ukazuje, že za natívnych podmienok má významné množstvo E1/E2 komplexu molekulovú hmotnosť najmenej 800 000. E1/E2 materiál, majúci molekulovú hmotnosť asi 650 000, bol rovnako pozorovaný.
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C alebo HCV čiže anti-HCV protilátky, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky: poskytnutie HCV skráteného glykoproteínu, kde glykoproteín je vybraný zo súboru zahrnujúceho glykoproteín exprimovaný z El oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 330 až 380 El oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu a glykoproteín exprimovaný z E2 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 660 až 830 E2 oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu; inkubácia biologickej vzorky s uvedeným HCV skráteným glykoproteinom za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexu protilátka-antigén a stanovenie, či sa vytvoril komplex protilátka-antigén, obsahujúci tento skrátený glykoproteín.
- 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že skrátený glykoprotein sa exprimuje z E1 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 330 až 380 E1 oblasti, číslovanej od začiatku HCV polyproteínu.
- 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že skrátený glykoprotein sa exprimuje z E2 5 oblasti HCV, ktorá zahrnuje deléciu časti sekvencie, nachádzajúcej sa v oblasti aminokyselín 660 až 830 E2
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61141990A | 1990-11-08 | 1990-11-08 | |
| US61196590A | 1990-11-08 | 1990-11-08 | |
| US75888091A | 1991-09-13 | 1991-09-13 | |
| PCT/US1991/008272 WO1992008734A1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Hepatitis c virus asialoglycoproteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK286106B6 true SK286106B6 (sk) | 2008-03-05 |
Family
ID=27417050
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK40-2005A SK286106B6 (sk) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C |
| SK442-93A SK285623B6 (sk) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Spôsob produkcie asialoglykoproteínu hepatitis C vírusu |
| SK690-97A SK285624B6 (sk) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Hepatitis C vírusový (HCV) skrátený asialoglykoproteín, kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK442-93A SK285623B6 (sk) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Spôsob produkcie asialoglykoproteínu hepatitis C vírusu |
| SK690-97A SK285624B6 (sk) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Hepatitis C vírusový (HCV) skrátený asialoglykoproteín, kompozícia s jeho obsahom a jeho použitie |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0556292B2 (sk) |
| JP (8) | JPH06504431A (sk) |
| AT (1) | ATE188220T1 (sk) |
| AU (1) | AU668078B2 (sk) |
| CA (2) | CA2095521C (sk) |
| CZ (1) | CZ289006B6 (sk) |
| DE (1) | DE69131882T3 (sk) |
| DK (2) | DK0842947T4 (sk) |
| ES (1) | ES2139591T5 (sk) |
| FI (1) | FI107803B (sk) |
| GR (1) | GR3032771T3 (sk) |
| HU (2) | HUT66063A (sk) |
| NO (2) | NO304380B1 (sk) |
| PT (2) | PT99466B (sk) |
| RO (1) | RO115446B1 (sk) |
| SK (3) | SK286106B6 (sk) |
| WO (1) | WO1992008734A1 (sk) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6274148B1 (en) | 1990-11-08 | 2001-08-14 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus asialoglycoproteins |
| JP3158177B2 (ja) * | 1991-10-08 | 2001-04-23 | 国立感染症研究所長 | Ｃ型肝炎診断薬 |
| WO1993015193A1 (en) * | 1992-01-31 | 1993-08-05 | Abbott Laboratories | Mammalian expression systems for hcv proteins |
| UA39944C2 (uk) * | 1992-07-07 | 2001-07-16 | Чірон Корпорейшн | Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі |
| ATE249838T1 (de) | 1993-05-12 | 2003-10-15 | Chiron Corp | Konserviertes motiv der hepatitis c virus e2/ns1 region |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US5610009A (en) * | 1994-01-28 | 1997-03-11 | Abbott Laboratories | Mammalian expression systems for hepatitis C virus envelope genes |
| EP1845108A3 (en) | 1994-07-29 | 2007-10-24 | Innogenetics N.V. | Monoclonal antibodies to purified hepatitis c virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| WO1996004301A2 (en) * | 1994-07-29 | 1996-02-15 | Chiron Corporation | Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same |
| DK1510580T3 (da) | 1994-07-29 | 2009-02-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Trunkeret hepatitis C E2-polypeptid og fremgangsmåder til opnåelse heraf |
| IT1271593B (it) * | 1994-11-30 | 1997-06-04 | Sanitaria Scaligera Spa | Procedimento ed apparecchiatura per l'immunoadsorbimento specifico di virus hiv, di antigene gp120 e complesso cd4-gp120. |
| US6127116A (en) * | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
| FR2744725B1 (fr) * | 1996-02-09 | 1998-04-30 | Pasteur Institut | Anticorps specifiques des complexes formes par les glycoproteines e1 et e2 du virus de l'hepatite c, procedes de determination de la presence, et d'isolement de ces complexes |
| US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| KR100209095B1 (ko) * | 1996-06-28 | 1999-07-15 | 성재갑 | C형 간염 바이러스의 프로테아제의 활성을 측정할 수 있는 c형 간염 대체 바이러스, 그 재조합 유전자 및 그 용도 |
| JP4021493B2 (ja) | 1996-11-08 | 2007-12-12 | ザ ガヴァメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ、レプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー、 デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サーヴィスィズ | Ｃ型肝炎ウイルス様粒子の合成および精製 |
| US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
| US7049428B1 (en) | 1998-03-04 | 2006-05-23 | Washington University | HCV variants |
| ES2328536T3 (es) | 1997-05-06 | 2009-11-13 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Produccion intracelular de polipeptido e2 truncado de la hepatitis c. |
| EP0947525A1 (en) | 1998-03-27 | 1999-10-06 | Innogenetics N.V. | Epitopes in viral envelope proteins and specific antibodies directed against these epitopes: use for detection of HCV viral antigen in host tissue |
| US7108855B2 (en) | 1998-06-24 | 2006-09-19 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| JP5175417B2 (ja) | 2000-08-17 | 2013-04-03 | トリペップ アクチ ボラゲット | リバビリンを含むワクチンおよびその使用方法 |
| US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US6858590B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US7101561B2 (en) | 2000-12-01 | 2006-09-05 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| US7022323B2 (en) | 2001-06-26 | 2006-04-04 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Uses of DC-SIGN and DC-SIGNR for inhibiting hepatitis C virus infection |
| US20030232745A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-12-18 | Olson William C. | Uses of DC-sign and DC-Signr for inhibiting hepatitis C virus infection |
| AU2003265454A1 (en) * | 2002-08-16 | 2004-03-03 | Ohio University | Hepatitis c viral-like particle purification |
| CA2618429A1 (en) | 2005-05-25 | 2007-03-22 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
| WO2009022236A2 (en) | 2007-08-16 | 2009-02-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| WO2009130588A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Tripep Ab | Immunogen platform |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3886363T3 (de) * | 1987-11-18 | 2004-09-09 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | NANBV-Diagnostika |
| IL88599A0 (en) * | 1987-12-10 | 1989-07-31 | Cell Bio Group Ltd | Glycoprotein cell growth modulating materials,their preparation and compositions containing them |
| UA50829C2 (uk) * | 1989-03-17 | 2002-11-15 | Чірон Корпорейшн | Очищений поліпептид, що містить антиген вірусу гепатиту с, полінуклеотид, вектор, клітини, система експресії, моноклональне антитіло, препарат поліклональних антитіл, нуклеотидна проба, аналітичні набори, спосіб виявлення нуклеїнових кислот, способи імуноаналізу, вакцина, спосіб одержання антитіл |
| KR100206150B1 (ko) * | 1990-04-04 | 1999-07-01 | 로버트 피. 블랙버언 | 항-에이치씨브이 항체에 대한 면역분석용 씨형 간염 바이러스(에이치디브이)항원의 조합체 |
-
1991
- 1991-11-07 SK SK40-2005A patent/SK286106B6/sk unknown
- 1991-11-07 JP JP4500944A patent/JPH06504431A/ja active Granted
- 1991-11-07 DK DK97120661T patent/DK0842947T4/da active
- 1991-11-07 CZ CZ1993824A patent/CZ289006B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 DE DE69131882T patent/DE69131882T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 DK DK92900091T patent/DK0556292T4/da active
- 1991-11-07 EP EP92900091A patent/EP0556292B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 HU HU9301336A patent/HUT66063A/hu unknown
- 1991-11-07 ES ES92900091T patent/ES2139591T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 EP EP97120661A patent/EP0842947B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 HU HU9301336A patent/HU227498B1/hu unknown
- 1991-11-07 CA CA002095521A patent/CA2095521C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 AT AT92900091T patent/ATE188220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 SK SK442-93A patent/SK285623B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 CA CA002203443A patent/CA2203443C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 RO RO93-00626A patent/RO115446B1/ro unknown
- 1991-11-07 AU AU90267/91A patent/AU668078B2/en not_active Expired
- 1991-11-07 SK SK690-97A patent/SK285624B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 WO PCT/US1991/008272 patent/WO1992008734A1/en not_active Ceased
- 1991-11-08 PT PT99466A patent/PT99466B/pt not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-05 FI FI932025A patent/FI107803B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-05-07 NO NO931680A patent/NO304380B1/no not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-14 NO NO972213A patent/NO304381B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-06-26 PT PT102022A patent/PT102022B/pt not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-14 JP JP10317898A patent/JP3207155B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-02-28 GR GR20000400473T patent/GR3032771T3/el unknown
-
2001
- 2001-03-02 JP JP2001059335A patent/JP2001286290A/ja not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-07-08 JP JP2002199317A patent/JP4056306B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-04 JP JP2002353148A patent/JP2003174875A/ja not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-02-10 JP JP2005035317A patent/JP2005187479A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-05-25 JP JP2006145982A patent/JP2006219503A/ja not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-10-12 JP JP2007267258A patent/JP2008031181A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK286106B6 (sk) | Spôsob vykonávania imunodiagnostickej skúšky na detekciu protilátky proti vírusu hepatitídy C | |
| US7105303B2 (en) | Antibodies to hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| RU2175657C2 (ru) | Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа | |
| JP2945759B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 | |
| EP1471073B1 (en) | Hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| FI107804B (fi) | Immunomäärityksissä käytettäviä hepatiitti-C-viruksen asialoglykoproteiineja | |
| CZ289923B6 (cs) | Hepatitis C virový, zkrácený asialoglykoprotein, farmaceutická kompozice s jeho obsahem a jeho pouľití | |
| IE84479B1 (en) | Hepatitis C Virus Asialoglycoproteins |