HU229627B1 - Radiolabeling kit and binding assay - Google Patents

Description

A találmány antitest kötést, mérőéi járásokra és radioaktív jelölő készletekre, liofilízált sejtkészítményekre, reagensekre és eljárásokra vonatkozik terápiás; antitestek klinikai hatásosságának tesztelésére tumorok és tumorsejtek kezelése/leképzése céljából. Specifikusan a találmány szerinti készleteket olyan radioaktívan jelölt antitest konjugátumok eiőáliitására és kiértékelésére használjuk, melyeket a BF35 B-sejt felszíni antigén („CD20; megcélzó.sávai B-sejt límfóma tumorok kezelésére és leképzésére alkalmazunk.

Az összes publikáció és szabadalmi bejelentés referenciaként a találmány részét képezi ugyanolyan terjedelemben, mintha mindegyik publikációnál vagy szabadalmi bejelentésnél specifikusan és egyenként megjelöltük volna, hogy az referenciaként a leírásba énül.

A gerincesek immunrendszere (például a főemlősöké, melybe az emberek, félmajmok, majmok, stb. tartoznak) , számos szervből és sejttípusbői áll, melyek abba az irányba fejlődtek, hogy hibátlanul és fajlagosan felismerjék az idegen mikroorganizmusokat („.antigén·), melyek megtámadják a gerinces gazdát; specifikusan kötődjenek az ilyen idegen mikroorganizmusokhoz; és megsemmisítsék/elpusztítsák az ilyen idegen mikroorgani zm.usokat.

A iimfocit.ák valamint, más sejttípusok alapvető fontosságúak

az: immunrendszer számára.. A iimfocitákat a csecsemőin irigy, lép·, és a csontvelő (felnőtt) termeli, és az emberek (felnőttek) keringési rendszerében jelen lévő· összes fehérvár sejt körülbelül 30%-át képviselik,

A limfocitéknak két fő szubpopulációya van: a T-sejtek és a

B-sejtek. A T-sejtek a felelősek a sejtközvetített immunitásért, míg a B-sejtek az antitest-termelésért felelősek (humorális immunitás) Mindemellett a T-sejtekre és a B~sejtekre úgy tekinthetünk, hegy azok kölcsönösen függnek egymástól - egy jellemző immunválaszban a T-sejtek akkor aktiválódnak, amikor a T-sejtreceptor egy antigén fragmentumaihoz kötődik, melyek a fő· hisztokompatibilitási komplex (MBC) giikoproteinjeihez kötődnek egy antigényrezentáló sejt felszínén; az ilyen aktiváciö biológia.; medíátorok („ínterleukínek) felszabadulását okozza, mely a B-sejteket lényegében arra stimulálja, hogy differenciálódjanak, és az antigén ellen antitesteket („immunglobulinok'') termeljenek .

A gazdában minden B-sejt különböző antitestet ezpresszái a felszínén - tehát egy B-sejt egy antigénre specifikus antitestet fog kifejezni, míg egy másik B-sejt egy eltérő antigénre specifikus antitestet fog expresszálni, Következésképpen a 8-sejtek meglehetősen sokfélék, és ez a sokféleség alapvető fontosságú az immunrendszer számára. Emberekben mindegyik B-sejt az antitest molekulák hatalmas számát (azaz körülbelül 10'-10°) képes termelni. Az ilyen antitest-termelés jellemzően megszűnik (vagy jelentősen lecsökken) , amikor az idegen antigén semlegesítődeit. Esetenként azonban egy adott B-sejt proliferációja változatlanul folytatódik; az ilyen prolíferáciő „B-sejt limfómának nevezett ο

«»>* * rákot eredményezhet.

A T sejtek és B sejtek is tartalmaznak sejtfelszíni fehérjéket, melyeket a differeneiáeiö és az azonosítás „markerei'-ként hasznosíthatunk. Egy ilyen humán B-sejt markor a csak a humán Biimfocitákra korlátozódé 8p35 differenciációs antigén, melyre ,,CD20-ként hivatkozunk, A CD20 a korai-pre-3-sejt-fejlödés alatt fejeződik ki, és a plazmasejt-diffsrencíácioig fennmarad, A CD20 molekula az aktivációs folyamatban különösen egy olyan lépést szabályoz, mely a sejtciklus beindításához és a d!íferenciácíőhoz szükséges, és általában nagy mértékben fejeződik ki a neopiasztikus („tumoros; 8-sejtokban. A definíció szerint a CD20 a „normális 8-sej teken valamint a „maiignus Bsejteken is jelen van, azaz azokon a B-sejteken, melyeknek nem csökkenő proliieráeiőja B-sejt limfömához vezet. Tehát a CD20 felszíni antigén magában foglalja annak a lehetőségét, hogy Bsejt iimfómák „megcélzására szolgáljon.

Lényegében az ilyen célbavétel a következőképpen általánosítható: A B-sejtek CD20 felszíni antigénjére specifikus antitesteket egy betegbe például beoltjuk. Ezek az anti-CD20 antitestek specifikusan kötődnek a (látszólag; normális és maiignus Bsejtek CD20 sejtfelszíni antigénjéhez; a CD20 felszíni antigénhez. kötött anti~CD2ö antitest a neopiasztikus B-sejtek megsemmisítéséhez és kimerítéséhez vezethet. Továbbá olyan kémiai szerek és radioaktív jelek koniugálhatök az anti-GDzG antitesthez, melyek megsemmisítik a tumort, úgy hogy a szert specifikusan például a neopiasztikus B-sejtekhez „szállítja. A módszertől függetlenül az elsődleges cél a tumor megsemmisítése: a specifikus módszert az adott, alkalmazott a.nti-CD20 antitest határozhat j a

mequ és így a CD2Ö antigén megcéizásának lehetséges módszerei jelentősen változhatnak.

Például már beszámoltak ilyen, a CD20 felszíni antigén célbavételére tett kísérletekről. Állítólag 1F5 egér monoklonális antitestet (egy anti-CD2ö antitestet) adtak be a 3-sejt iimfőmás betegeknek folyamatos intravénás infúzióval. Arról számoltak be, hogy az 1F5 rendkívül nagy mennyisége (2 gramm) volt szükséges a keringő tumorsejtek kimerítéséhez, és az eredményekről azt írták, hogy „átmenetik voltak. [Press et el., „honoolonai Antibody 1F5 (Ant.i~CD20·) Serotherapy of Humán Β-Ceil Lymphomas,

Biood 69/2, 584-591 (1987)).

Evvel a módszerrel kapcsolatban az a potenciális probléma áll fenn, hogy a nem-humán monoklonális antitesteknek (például egérfélék monoklonális antitest jelnek.) jellemzően hiányzik az effektor funkcióink. Azaz ezek többek között, képtelenek komplementtől függő lizist közvetíteni, vagy Izzatni a humán célsejteket az antl.testfüggö sejtes toxicífáson vagy az Fc-receptor által közvetített fagooitőzison keresztül. Továbbá: a nem humán monoklonális antitesteket a humán gazdaszervezet idegen fehérjeként ismeri fel; ezért az ilyen antitestek ismételt beadása immunválaszok kiváltásához vezethet, zelyek káros híperszenzitivitási reakciókhoz vezetnek. Az egerféiéken alapuló monoklonális antitesteknél ezt gyakran Humán Anti-Sgér Antitest válasznak vagy „HAHiA válasznak nevezik. Továbbá ezeket az idegen antitesteket a gazda immunrendszere megtámadhatja úgy, hogy ezek végeredményben sémiégésitődnek, mielőtt elérnék a célheiyükef. A limfociták és límromasejtek velük születetten érzékenyek a radioterápiára. Tehát a rosszindulatú B-sejtek vonzó célpont5 ·♦»» » * * * * * - . ♦*«. ** φ X « *** * ♦ M >

a radioaktivan eTR.'í. s s z r o ’j a ezren bel kezd vagy közvetlen közejal a radioimmunterápiának ÍRT?} több okból is: jelölt antitestek ionizáló sugárzásának lokális pusztíthatja a céiantigénnel (például CD20-szal) anélküli sejteket az antigénhez kötött antitest lében; a mélyre hatoló sugárzás, azaz a béta-sugárzók megakadályozhatják azt a problémát, hogy az antitestek korlátozottan tudnak bejutni a vastag vagy vérerekkel gazdagon ellátott tumorokba; és igy a teljes antitest-mennyiség szükségletet lecsókkenthetík. A radionuklidok radioaktív részecskéket bocsátanak ki, melyek a celluláris DNS—t azon a ponton károsíthatják, ahol a sejtes javító mechanizmusok képtelenek a sejt életének folytatását lehetővé tenni, ha a célsejtek tumorok, a radioaktív jel gyógyító hatással elpusztítja a tumcrsejteket. A radioaktivan jelölt antitestek, a definíció szerint, egy radioaktív anyag alkalmazását foglalják magukban, mely óvintézkedéseket kivan a betegtől (azaz a lehetséges csontvelő transzplantáció alanyától) valamint az egészségügyi dolgozótól (azaz nagyfokú óvatosságra van szükség, amikor radioaktivitással dolgoznak).

Tehát az egyik módszernél az egérféle monoklonális antitestek azon képességének javítására, hogy a 3-sejfc rendellenességekre hatással legyenek, egy radioaktív jelet konjugáitak az antitesthez úgy, hogy a jel vagy a toxin a tumor helyére ickalízálódjon. Toxinokat (azaz kemoterápiás szereket, mint például doxorubicínt vagy mítomicin C-t) szintén konjugáitak már az antitestekhez.

Lásd például a NO 92/074466 számú nemzetközi közzétételi iratot hl992. május 14-én publikálva) .

A „konjugált antitestek alternatívájaként „kíméra antitesteket, azaz olyan antitesteket fejlesztettek ki, melyek két vagy ♦ «

több faj (például egér és ember; részeit tartalmazzák.

Egér/humán kiméra antitesteket hoztak létre, és kimutatták a szülő egér antitest kötési jellemzőit és a humán konstans régiéhez kapcsolódó effektor funkciókat, fásé például Cabilly et eh, 4 816 567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását; Shoemaker et al., 4 978 745 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi .leírását; Beavers et al, 4 975 369 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását, és Boss et al. 4 816 397 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírását, melyek mindegyike referenciaként a leírásba épül. Általánosságban ezeket a kimér a antitesteket úgy állítják elő, hogy egy már létező egérféle hibridóraákbol kivont BüS-böl genomiális génkönyvtárat készítenek [bishímura et al., Cancer Research 47, 999(19875], A könyvtárat ezután olyan nehéz- és könnyűiáncokböl származó variábilis régin génekre szűrik, melyek helyes antitestfragmentum újrarendesödesi mintázatot mutatnak. A klónozott variábilis régió géneket ezután egy, a megfelelő nehéz- vagy könnyüíánc humán konstans régió gén klónozó kazettáit tartalmazó ezpressziős vektorba ligáiják, A kimére géneket ezután egy kiválasztott sejtvonalban, általában egérféle míelőmavonalban fejezik ki.

Például Liu A. Y. és munkatársai az „Egy CD20 elleni, hatásos

Fc-dependens biológiai aktivitással rendelkező, egér-humán kimére monoklonális antitest előállítása című müvében fő'. Immun.

133/10, 3521-3526 1987}] egy CD20 antigén ellen irányuló egér/humán kiméra antitestet írnak le. Lásd még például a WO

88/04336 számú nemzetközi közzétételi iratot is. Azonban nem közöltek információkat ezen ez irodalmi helyen a Líu-féle kiméra χ »»» »»»* * » » β η, > ·♦· ο, ♦ »·{* *► ««« »<« antitestek alkalmazásának sem. a hatásosságáról sem a praktikusságáról a B-sejt rendellenességek kezelésénél.

Megjegyzendő, hogy ar in vitrc funkcionális mérőéijárások (például komplement-függő lizis Í,,CDC?, antitest-függő sejtes citotcxioitás („AECC), stfe.? nem képesek eredendően megjósolni semelyik antitestnek sem azt a képességét, hogy in vivő elpusztít ják-e vagy kimerítik-e a specifikus antigént kifejező célsejtet. Lásd például Robinson és munkatársai munkáját [„Chimeric mouse— humán anti-oarcínoma antióodies that médiaié differexrc anti-tumor cell foíologicai actívities (Rimára egér-humáfi antikarcinéma antitestek, melyek eltérd anti-tumorsejt biológiai aktivitást közvetítenek;, hűm. Antibod. Hybridomas 2, 84-93 (1991;

(nem kimutatható ADCC aktivitással rendelkező kimére egér-humán antitest)j, Ezért az antitestek potenciális terápiás hatékonyságát valójában csak in vivő kísérletezéssel lehet mérni,

Ebből a célból a 03/475 813, 03/475 815 és 08/478 697 számú függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések, melyek referenciaként teljes terjedeimükben a leírásba épülnek, radioaktívan jelölt an.ti-CD2ü konjugátumokai .-ismertetnek B-sejt iímfoma tumorok diagnosztkai „leképzésére'⁷ a terápiás antitest, beadása előtt. A „lxi2B8 konjugátum egy humán CD20 antigénre specifikus egér monoklonális antitestet, a 238-t tartalmazza, mely az indium|Ili]-hez (Ixb''; egy bí funkcionális ke lát képzőn, azaz az MX-DTPA-n. (dietílén-triamin-pentaecetsav) át kapcsolódik, mely az 1-izotíooianátc-benzii-3-metii-DTPA és az 1-metii3-ízotiocíanáto-benzii-DTPA 1:1. arányú elegyét tartalmazza. Diagnosztikai radionuklídként azért választották az iniáiumililbt, mert az gamma-sugarakat bocsát ki, és elsődlegesen leképző « * szerként; történő alkalmazását fedezték fel.

A kelét képzetre és kelárképzö-kenjugátumokra vonatkozó szabadalmi leírások a szakterületen jói ismertek. Például Gansew 4 831 175 száráé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi .leírása többszörösen szubsztituált dietílen-tríamin-pentaeeetsav Mélátokra és ezt tartalmazó fehérjekonjugátumokra és az előállítási eljárásaira vonatkozik. Gansow 5 009 069, 5 246 692, 5 286 850 és 5 12:4 471 számúi amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírása szintén többszörösen szubsztituált DTPA kelátokra vonatkozik. Ezek a szabadalmi leírások referenciaként teljes terjedelmükben a leírásba épülnek.

A 08/475 912, 08/475 915 és 08/478 967 számú amerikai egyest;.;. államokbeli szabadalmi bejelentésekben a kelátképzés elősegítésére specifikus bifunkcionáiis keiátképzőt választottak, mivel ennek nagy az affinitása a három vegyértékű fémek iránt, és megnövekedett tumor/nem tumor arányokat, csökkent csont általi felvételt és a radionuklid nagyobb mértékű in vívó fennmaradását biztosítja a célheiyeken, azaz a B-sejt limfóma tumor helyein, Mindemellett más bifunkcionálís kelátképzök is ismertek a szakterületen, és ezek színién jótékony hatásúak lehetnek a tumorterápia során.

A 08/475 818, 08/475 815 és 08/478 967 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben radíoaktivan jelölt terápiás antitesteket is ismertetnek a B-sejt limfőíBák és tumorsejtek eipuszii zására. Pontosabban, az ¥298 konjugátum ugyanezt a 2B8 anti-humán CD20 egérféle monoklonális antitestet tartalmazza az ittrium- (99) ('^vY)-hoz kapcsolva ugyanezzel a bifunkcionálís kelátképzővel. Ezt a radionukiídót hasonló okokC' 'ν bői választották ki a terápiára. Az Ά 64 órás fél életidő j e elegendően hosszú ahhoz, hogy lehetővé tegye az antitest felhalmozódását a tumornál, és a ^;:'>oöl eltérően, ez egy tiszta, nagy energiája bétasugárzó, me.Lyhez lecsengésekor nem kapcsolódik gammasugárzás, és 100-1000 sejt átmérő tartománnyal rendelkezik. A kiszűrődő sugárzás minimális mennyisége lehetővé teszi az '^VYjelőit antitestek ambuláns beadását. Továbbá a sejt elpusztításához nem szükséges a jelelt antitestek bejutása, és az ionizáld sugárzás lokális kisugárzása letalís a céi-antígén nélküle szomszédos tumorsejtekre.

Mivel a radícnuklidst ugyanazt a bifunkoionálís kelátképző molekulát, az MX-DTPA-t alkalmazva kapcsolták a 288 antitesthez, az Y2B8 konjngátum ugyanazokkal az előnyökkel rendelkezik, mint amiket fentebb tárgyaltunk, például a radlonuklid meghosszabbodott fennmaradásával a célhelynél (tumor;. Szemben a ‘In-nel ezt nem lehet leképzési célokra felhasználni, mivel nem: jár vele gammasugárzás. Tehát egy diagnosztikai „leképző radlonuklid, mint például a ^;:1in egy tumor elhelyezkedésének és relatív méretének maghatározására alkalmazható a terápiás kimera vagy ''’Y-jelölt antitestek tumorcsökkentés céljából történő beadás előtt és/vagy követően. Továbbá az indíum-jelölt antitest lehetővé teszi dozímetriás mérés elvégzését.

Attól függően, hogy az antitestet mire kívánjuk felhasználni, azaz diagnosztikai vagy terápiás reagensként, más-más radioaktív jelek ismertek a szakterületen, és már hasonló célokra felhasználták ezeket. Például a klinikai diagnózisban már alkalmazott radionúklidok köze tartozik a 'Ί, á , ^Ji’Tc, 'Ga valamint ^UÍIn. Az antitesteket már egy sor különböző radíonakiiddal is sor

m. ί». . » »«* ’**. Ο ·»ί· ,* W «·<* **♦ * jelölték a célzott ímmanterápióban történő potenciális alkalmazás céljából [Peirersz et al.., The use of níonoclonai aritibodiy conjngates· fór the diagnosis and treátment of caacer {.'Monoklonális antitest konjngátumok alkalmazása rák diagnosztizálására és kezelésére) Iwnu.no 1 - Cel.1, Bioi. 65, 111-125 (1987;}. Ezek közé a radionakiidck közé tartoznak a és ''Re valamint a és kisebb mértékben a Au ás a Ca, Az 1íl3í]~t szintén alkalmazták már terápiás célokra. Az 5 áúö 785 száma amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás az ilyen rsözoizotőpok listáját biztosítja, és referenciaként a leírásba épál,

Ahogy a 08/475 813, 08/475 815 és 08/473 967 számú függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések beszámoltak róla, a radioaktzvan jelelt Y2B8 konjuoátum valamint a jelöletlen kiméra anti-CDzO antitest jelentős tamoresök kenést okozott. B-sejt límfoblaszt tumort hordozó egerekben. Továbbá az itt ismertetett humán klinikai kísérletek jelentős B-sejt kimerülést matattak a limiómás betegekben, melyekbe infúzióval kiméra antiCD2ö antitestet juttattak be, Valójában a kiméra 2B8-t a közelmúltban a nemzet első PDA által jóváhagyott rákellenes monoklonális antitestjenek kiáltották ki Rítuxan* néven. Tehát legalább egy kiméra anti-CD20 antitestről kimutatták mér, hogy terápiás hatékonyságot mutat a B-sejt limfőma kezelésében.

Továbbá a 08/475 815 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, mely referenciaként a leírásba épül, a RituxarÓy egy kiméra anti-CB20 egymás utáni beadását ismerteti, indiammal jelölt vagy ittriummai j elölt egér f éle monoklonális antitesttel vagy mindkettővel. Bár az ezekben a kombinált fceráA** »** * *

piákban al Raima zo-tt radíoaktivan jelölt antitestek egérfélék antitestei, a kiméra ant1-0020-szál történő kezelés elegendően kimeríti a B-sejt populációt, úgy, hogy csökken a HAHA válasz, ezáltal kombinált terápiás és diagnosztikai beadási módot tesz lehetővé.

Tehát a kombinált immunterápíának ebben az értelmezésében az egérféle antitestek különösen alkalmasak lehetnek diagnosztikai reagensként. Sőt a 08/475 813 számú amerikai egyesült államokbeli. szabadalmi bejelentésben kimutatták, hogy az ittrlommal jelölt anfi-CD2ö antitest hatásos dózisa a Rítusán beadása után elegendő (a) a megmaradt perifériás vér B-sejtek eltávolítására, melyeket a kimére ant.i-CD2ö antitest nem távolított ei; (b) Bsejt kimerítést Indít el a nyirokcsomókból; vagy (o; B-sejt kimerülést indít el a más szövetekből.

Tehát a radioaktív jeleknek a rákterápíás antitestekhez való konjugálása egy értékes klinikai eszközt biztosit, mely az ilyen antitestek potenciális terápiás hatékonyságának mérésére, a kezelés lefolyásának nyomon követésére szolgáló diagnosztikai reagensek létrehozására és további olyan terápiás reagensek tervezésére használható fel, melyeket a kiméra antitest kezdeti tumor-pusztító potenciáljának fokozására alkalmazhatunk, Figyelembe véve egy anti-CD20 antitest bizonyított hatékonyságát a nemHodqkin limfóma kezelésében, és a limfocíták érzékenységét a radioaktivitással szemben, nagyon előnyös lenne, ha az ilyen terápiás antitestek kereskedelemben készlet formájában beszerezhetőek lennének, melyek egy radioaktív jellel gyorsan módositbatök, és közvetlenül beadhatók a betegnek klinikai körülmények között.

Sár számos módszer és reagens létezik az antitestek radioaktív jelölésének végrehajtására, hiányzik a szakterületen egy hagyományos hordozó ezeknek a reagenseknek a klinikai környezetbe vivésere, olyan módon, hogy azok könnyen előállíthattak és beadhatóak legyenek a betegnek mielőtt a radioaktív jel jelentős legyengüiése vagy az antitest radioaktív jel miatti jelentős lebomlása megtörténne. Az értékes technológia kereskedelmi forgalomba hozása céljára szolgáló megfelelő eszközök hiányának az oka az, hogy gyenge a beépüiész. hatékonyság, ezt több ismert jelölő eljárással kimutattak már, és hogy utólagos oszlopon történő tisztításra van szükség a radioaktív jelölési, eljárás után, annak az oka, hogy késlekednek az ilyen készletek kifejlesztésével, részben az lehet, hogy korábban nem lehetett beszerezni tiszta, kereskedelmi forgalomban lévő radíoizotőpokat, melyeket hatásosan alkalmazhattak volna jelölt termékek létrehozására utólagos tisztítás nélkül. Másik lehetőségként talán az az oka annak, hogy Ilyen készletek általában nem hozzáférhetőek, hogy jelenleg hiányoznak azok az antitestek, melyek képesek elérni a hiturarŐ-nak a limfömák kezelésére a humán betegekben elért hozzájárulását vagy hatékonyságát.

Például, ahogy a 4 631 330 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik, mely referenciaként a leírásba épül, a tudományos világban általánosságban úgy gondoljak, hogy ahhoz, hogy egy radioaktív gyógyszer klinikai, felhasználását felfedezzék, hosszú és fáradságos szeparációs és tisztítási eljárást kell végrehajtani. Valóban nem kívánatos a nem kötött radioaktív jel beinjektálása a betegbe. A további tisztítási lépesek szüksége miatt az antitestek radioaktív jelölési eljárása lehetetlen klinikai környezetben, különösen azoknak az orvosoknak a számára, akiknek sem felszerelésük sem idejük nincs a saját gyógyszereik tisztítására.

Továbbá a radioaktívat jelölt fehérjék eredendően instabilak lehetnek, különösen azok, melyeket radiolítikus izotópokkal,

C. p.

mint például Ύ~ηη1 jelöltek, melyek annál inkább hajlamosak karositaní az antitestet, minél közelebb kapcsolódnak ahhoz. Viszont ez a radiolizis a gyógyszer megbízhatatlan hatékonyságát okozza a radioaktív jel elvesztése és/vagy a célantigén lecsökkent kötése miatt, és a denaturált fehérjére irányuló nem kívánt immunválaszokhoz vezethet. Az antitestek helyben történő jélőiésere és tisztítására szolgáló eszközök hiányában a klinikai orvosoknak nemi volt választások, vagy megrendelték a már letolt terápiás antitestet, vagy nem a helyszínen jelöltették meg egy megfelelő berendezéssel, és a jelölést követően átszállították a betegbe történő beadáshoz, Az összes ilyen manipuláció megnöveli a jelölés és a beadás közötti értékes időt, ezáltal hozzájárni a gyógyszer instabilitásához, igy tulajdonképpen csökkenti a radioaktív jelölő készlet hasznosíthatóságát a klinikai környezetben .

Mások sikertelenül próbálkoztak olyan antitest radioaktív jelölési készlet kifejlesztésével, mely elég szakszerű lett volna ahhoz, hogy elkerülhető legyen vele az antitest külön tisztítási lépése. Például a Cytogen a közelmúltban kibocsátott egy kereskedelemben kapható készletet a TAG-72 tumor~u.ss zooiált giikoprotein elleni egérféle monoklonális antitest radioaktív jelölésére. Azonban a Cytogen antiteste különösen alkalmatlan készlet készítményként, annak köszönhetően, hogy hajlamos részecskéket kialakítani a tárolás alatt, melyeket később egy foX * * β φ * * * ^Α * φ «, χ ΦΦΧ * Φ *** ** φ β * Φ «Λ Φ * *

... ».« ♦ ·» »♦ vábbi szűrési lépéssel kell eltávolítani. Továbbá a Cytogen antiteste káros reakciókat okozott a betegekben s MAMA immunválaszoknak kos zönhetoen.

Mások olyan radioaktív jelölő eljárásokat fejlesztettek ki, melyek alkalmasak olyan készlet formára, melyben .nincs szükség egy külön tisztítási lépésre (Hichardson et al., „Optimízation and batoh production of DTFA-iabeisd antibody kits fór ront iné use ín '^llJ’ln iremunoscintography ; DTPA-j elolt antitest készletek ^? 11 optimalizálása és nagy tételben történd előállítása in imimznszcintográfiában való rutin alkalmazáshoz) , k«e. kled.

Ccmun. 3, 347-356 (193); Gbinoí és ünatowieh, „Generátorprodaced yttrium-190] tor rádióimmuntheragy (Generátor által előállított itt rium-Γ 901 radioímmunterápiához) o, duói. kled.

29(9), 1465-14.70 (1937)]. Azonban ezek az eljárások nem képesek a beépülésnek azt a szintjét elérni, mint amit mi elértünk a bejelentésben ismertetett eljárások alkalmazásával, melyek legalább 95%-os beépülési. hatékonyságot eredményeznek. Egy ilyen szintű beépülés pozitív irányban járul hozzá a megnövekedett biztonsághoz, mert gyakorlatilag nem fogunk nem kötött jelet bejuttatni a betegbe a kismértékű radioaktivitás-beépülés következtében .

A találmány szerinti készlettel végzett eljárások gyors jelölést tesznek lehetővé, mely hozzávetőleg fél óra alatt elvégezhető vagy egészen kevés idő, akár öt perc alatt is, a jeltől függően. Mindemellett a találmány szerinti készlethez tartozó eljárás több mint 35^:;-os jelölési hatékonyságú, ezáltal elkerüljük azt, hogy további tisztításra legyen szükség. A további tisztítás elkerülésével a radioaktív jel féléletideje és az anΛ -<J « »«« ♦♦♦ · * *» * * «XX* * * » κ «« * * « ♦ » «Φ» ** _φ ♦ «»χ« X * * «Α* X *♦* * ^φβ ** éltest épsége megőrződik arra a terápiás célra, mely miatt a jelölést végeztük.

A bejelentés olyan hagyományos készleteket és eljárásokat ismertet, melyekkel a diagnosztikai és terápiás antitestek reprodukálható, megbízható és kényelmes módon radioaktívan megjelölhetők es beadhatok egy betegnek, A találmány szerinti készletek, az antitestek radioaktív jelölési eljárását egy zavarmentes, kellemetlenségek nélküli standardizált eljárássá változtatják, mely nagyban segíti a betegek kezelési eljárását. Ezek a készletek a technika állásához képest előnyösebbek, mivel a terápeutikumok vagy díagnosztikumok jelölésére és beadására szolgáló optimális paramétereket meghatároztuk, igy a termékek árát lecsökkentettük. Mivel a bejelöntésben ismertetett készletek az adott jelnek megfelelő optimális paramétereket biztosítják, egy adott jelhez tervezett készlet alkalmazása minimálisra csökkenti a kannibalizáoiöt, mely például akkor fordul elő, amikor egy nem megfelelő készletet alkalmazunk egy adott jelhez, A kannibalizenié elkerülésével viszont optimális jelölési hatékonyságot is biztosítunk. Mindemellett a mindegyik készletben megtalálható eljárási útmutatók és a steril, pirogénmentes összetevők sokkal jobban felhasználóbaráttá teszik az eljárást, mivel a reagensek sterilitásának, pirogéulkásának vizsgálata, és a jelölés utáni tisztítás elkerülhető.

A találmány tárgya egy készlet egy diagnosztikai vagy terápiás antitest radioaktív jelölésére egy betegbe történő beadás előtt, mely tartalmaz (i) egy kelátképzővel konjugált antitestet tartalmazd fiolát, íii) ogy, a radioaktívan jelölt antitest sta_β Φ οχ *X * # * »* ** « « Φ Φ * * *

ΦΧ» ««« Φ Φ *Χ* *» ff χ X* Φ Φ Φ » » «ί Φ Φ χ Φ * * ♦ ** bilízáiására és beadására szolgáló készítménypuffért tartalmazó fiolát, és (iii) használati útmutatót az antitest radioaktív jelöléséhez, ahol az említett fiola alkotórészeket olyan mennyiségben és koncentrációban biztosítjuk, hogy amikor ezeket egy megfelelő tisztaságú és aktivitású radioaktív jellel összekeverjük a készlet használati útmutatójának megfelelően, nincs szükség a jelölt antitest további tisztItására azelőtt, hogy azt az említett betegnek beadjuk. Továbbá ha a készlet használati útmutatójának megfelelően és egy megfelelő tisztaságú és aktivitású rádióizotóppai végezzük a. jelölést, ennek az izotópnak a beépülése több mént SSz-os mértéket érhet el, akár 98%-ot vagy többet ,

A készletben lévő antitest legelőnyösebben egy antí-€£>20 antitest. Az antitestet olyan formában biztosítjuk, melyben egy bifunkclonáiís kelátképzőhöz kapcsolódik. Előnyösen az antitest Mk-DTEA-hoz van konjugálva, de más kelátképzőket, mint például remii- vagy benziI --kenjagáit DTPA-t, oiklohexil-DTEA-t, ED1A származékokat és ΰΟΤΑ-t is alkalmazhatunk. Egy találmány szerinti kelátképző bármilyen keiáfképzö lehet, mely legalább bifunkcionálís, azaz legalább két kötési hellyel rendelkezik (legalább egy hely egy f émion keiét képzésére és legalább egy hely egy fehérjeligandum kapcsolásához),

Az alkalmazott antitesttől függően a konjugált antitestet jellemzően 0,5-30 mg/mi koncentrációban, előnyösebben 2 mg/mi koncentrációban biztosítjuk, A konjugált antitest mennyisége az optimális jelöléshez szükséges koncent.r ácrotó I és mennyiségtől függ majd a radioaktív jeltől függően, Mindemellett a konjugált antitestet egy olyan mennyiségben és koncentrációban biztosit1 7 jak, hogy a teljes mennyiséget tegyük majd bele a reakciói*lólába egy steril fecskendőt és fertőzésmentes módszert alkalmazva. Ez megnövekedett reprodukálhatóságot és könnyű alkalmazást tesz lehetővé. Az Itt ismertetett készletek összes reagense steril és pirogéntől mentes, és specifikusan az egyszerű használathoz és ahhoz terveztük, hogy az antitest tesztelésétől közvetlenül gyorsan eljussunk a beadásig. Bizonyos jelek esetében a jelölés hatékonyságának vizsgálata lehet, hogy nem szükséges.

A készlet egyik különösen előnyös alkotórésze a radioiizís hatásaival szembeni stabilitást és a radioaktív jellel ellátott konjugált antitest egy betegbe történő beadását szolgáló készitménypuffér. A készitménypuffér egy olyan gyógyászatilag elfogadható hordozó, mely a jelölt antitest oldószereként és beadási puftereként is szolgái. Noha. bármilyen gyógyászatilag elfogadható oldószert alkalmazhatunk a terápiás vagy diagnosztikai antitestek betegbe történő beadására, a találmány szerinti készitménypuffér különösen alkalmas radioaktivan jelölt antitestek beadására.

Például a találmány szerinti készitménypuffér egy radioprotektív anyagot, mint például humán szérumaibnmrnt (HSA) vagy aszkorbátot tarzalmaz, mely minimálisra csökkenti az lutriumnak, és kisebb mértékben az índiumnak köszönhető radiolízist.

Egyéb radioprotektiv anyagok is ismertek a szakterületen, és a találmány szerinti készitménypufferben alkalmazhatók, például szabadgyökkel rendelkező mentesítő anyagok (fenol, szulfítok, giutation, oisztein, gentizínsav, nikotin-sav, aszkorbílpal.mitát, H0F(:0)lb, glicerin, nátriam-formaidehíd-szulíoxilát, ha2ÍbCü, NapS^Oz és SO'g, stb; .

Meg kell jegyeznünk, hegy mig a radioprotektiv anyagokat az antitest megvédésére a radiolizissel szemben a készitménypofberben általánosan alkalmazzuk, lehetőség van további védelem elérésére úgy, hogy radioprotektiv anyagot teszünk a reakoiöpufferbe is. Ezt általában nem tesszük meg előre, például a HSA-val·,. mert a fémek jelenléte miatt meggátolhatja a jelölési eljárást, Azonban „megtiszti that jzúz a HSA-t kelátképzö gyantát alkalmazva, melyet szintén a reakoiöpuffer tartalmazhat. Az aszkorbát vagy más radioprotektiv anyag esetén szintén szükség lehet kezelésre a szennyező fémek eltávolítására.

A találmány szerinti keszitménypuffér a nem konjuoált kelátképzőt feleslegben is tartalmazhatja. A nem. konjuoált keiátképző-tartalom célja, hogy ez a kelátképző arra szolgáljon, hogy kiürítse a betegből a fehérje által nem kötött radioaktív jelet, és elérje a radioaktív jel kiválasztását, ezáltal csökkentve

Ú:' j hogy a beteg csontjai a „csont-kereső izotópokat, például a Ύ -t felvegyék. Például amikor a készlet antitestét egy DTPA kelátképzőhöz konjugáljuk, a készitménypuffer ΏΤΡΑ vagy más kelátképzö feleslegét tartalmazhatja. A készitménypuffért szintén olyan mennyiségben biztosítjuk, hogy a teljes mennyiséget tetessük be a reakciófiolába. Ahogy fentebb tárgyaltuk, ez az alkalmazást meg inkább megkönnyíti, és növeli a reprodukálhatóságot, mivel a pontos mennyiségeket nem keli kimérni és bevinni.

Az egyik előnyös készitménypoffér foszfáttal pufferolt vagy fiziológiás sooldatot, mely humán széramaifoumint és DlkA-t tartalmaz. A tárnán szeruraalbnmin előnyösen .1—25% itömeg/térfogat;, előnyösebben körülbelül 7,5% (tömcg/térfogat) koncentrációjú, A ÜT PA koncentrációja előnyösen körülbelül 1 mM. A humán szérumaii y « «I V * * ♦* * X * * bum in a 1.1-e r n a t í vá j a kén t as z k.orbin s a va t ♦ y « v * »*, ><« Φ X * * M * * **£ * * »** φφβ » «* alkalmazhatunk, és ezt jellemzően körülbelül 1-100 mg/ml koncentrációban használjuk. Mindemellett a koncentrációk egy szélesebb tartományban is alkalmazhatók a beteg biztonságának veszélyeztetése nélkül.

A radioaktiv jelölő készlet antiteste könnyen megjelölhető egy választott radioizotöppal egy bifunkcionáils kelátképzőn keresztül a találmány szerinti eljárásokat alkalmazva. Ebben a tekintetben az egyszerűség érdekében a találmány szerinti készlet egy a radioizotóp oldat ph-jának beállítására szolgáló pultért tartalmazó fiolát és a jelölés és a végső radl.oa kt 1 van jelölt antitest kész!iménypufferbe történő újra szuszpendáiására szolgáló steril üveg reákeiécsövet tartalmaz. Jellemzően egy le öles reakciőeso elegendő, de 5-20 ml tárolására alkalmas csöveket is alkalmazhatunk. A puffer előnyösen egy fémben szegény nátrium~aoetát oldat 10-100Ό mM, legelőnyösebben 50 mM koncentrációban .

A találmány szerinti spéciiikus készlet a 2B8-MX-DTPA MXOTPA-konjugáit antitestet tartalmazza. A 2B8 egy snti-CözO antitest, melyről kimutatták, hogy hatással van a B-sejt kimerülésre a iimfőmás betegeknek való beadáskor. Azonban a szakterületen jártasak számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti radioaktív jelölő készlet optimalizálható más anti-CDzö antitestek vagy más olyan antitest radioaktív jelölésére, melyeket DTFA-hoz vagy más poiivalens ke lát képzőihez kon jugádztunk, Az előnyös találmány szerinti készlet tartalmazhat legalább (i. ] egy olyan riolát, mely MX-DTPA-konjugáit 2B8 antitestet tartalmaz oldatban vagy liofílrzálva (helyreállítás szükséges); és (ii) egy, a rádióaktívan 1 elolt antitest egy betegnek történő beadásra szolgáló « β ző készítménypuffért tartalmazó fiolát. Az előnyben részesített készlet még tartalmazni fog (iií) az izotóp pH-jának beállítására szolgáló paffért, és (ív) egy reakciőcsövefc. Alternatív' lehetőségként és előnyösebben, a puffért a reakció-csőben biztosítjuk, ezáltal kiiktatjuk a puffét mérését és átvitelét, és megnöveli a készlet alkotórészek egyszerűségét, konzisztenciáját és a sterilitását. Azonban más .megvalósítási módokat is említhetünk, azaz, melynél a puffért először az izotóp fiolába tesszük be, és a puff erőit izotópot ezután visszük át a ree:kciócsö.foe. Ebben az esetben a reakciócsöfoen biztosíthatjuk a szükséges antitest mennyiséget. Alternatív lehetőségként az izotóp/puffér fiolája készíthető el olyan nagyra, hogy az megfelelő legyen ahhoz, hogy az antítestkonjugáiumot beletegyük, azaz közvetlenül a gyártó fiolájába. Ezzel elkerülhető, hogy reakciocsöre legyen szükség.

Ahogy fentebb leírtuk, egy másik előnyös készlet-elrendezés ís a találmány körébe tartozik, melynél a reakciöcső maga tartalmazza a konjugált antitest szükséges mennyiségét (azaz 1 mi a ^;; iu-seJ. illetőleg 1,5 ml a ’^;:’ϊ~ηζ1) . Az antitestet egy olyan puftermen adhatjuk, mely biztosítja a specifikus kívánt izotóp szerinti megfelelő radioaktív jelölési pH-t (azaz 3-6-os értékű j 1 '! χ) fi pH a .....In-néi és 3-5-os értékű pH a Y-nál). Különböző puffereket alkalmazhatunk az izotóptól függően (Így nátrium-acetátot a “'í-nál, nátrium-oitrátot a rn-néi) . A puffét ph-ja és összetétele szintén változhat a jelölendő líqanőum kötésének természetétől függően (azaz a jelölő peptidek ρΗ-3-nál kisebb alkalmazható pH-t is lehetővé tesznek), Lényegében ezután az izotópot közvetlenül a reakciócsőbe vihet jük, ahogy a készítménypuf fért. A készlet alkalmazását két átviteli lépésre korlátozva tovább nő ψ « « » * « « ♦»Λ **·» * * *** ** »* Φ * *·♦ * ** ** a reprodukálhatóság és az egyszerűség, és tovább csökken a sterilitás elvesztésének kockázata a készlet alkotórészeivei történő munka alatt.

A találmány szerinti radioaktív jelölő készletek továbbá tartalmazhatnak egy radioizctópos; fiolát, vagy a rádióizotépot egy megfeleld forgalmazótól külön rendelhetjük meg. A találmány szerinti, előnyben részesített radíoizotöpok a In-klorid és a 'Ύkioriö HCi-ben, bár az ismertetett eljárásokat nem korlátozzuk ezekre az izotópokra. Egyéb, a leképzési alkalmazásokban használt radionuklidok ismertek a szakterületen, például melyeket a

634 586, 5 460 785 és 5766 71 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások Írtak le, melyek referenciaként a leírásba épülnek. Az indíum-ílllí különösen előnyös a B~sejt tumorok leképzésére, és a bétasugárzók, mint például a Ύ különösen hasznosak rádióterápíás szerként. Más, erre és más célokra alkalmas rádióizotópokat, például alfa-sugárzókat is alkalmazhatunk az antitest konjugációhoz használt kelétképzőtől függően,

A 08/475 813 sorozatszámű amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetett kombinált terápiás beadási mód megfelelő hatékonyságát figyelembe véve egy további készlet kiviteli alak a radioaktivan jelölt anfi-CDkö antitest előtt vagy után beadandó kimére antitest, úgy mint a Rítaxar/' egy külön fZoláját is tartalmazza. Amikor a kimére antitestet a radioaktivan jelölt antitest előtt adjuk be, a HAMA immunválasz, mely általában egy egérféle anti~CD2v antitest beadására adott válaszban fordulhat elő, jelentősen lecsökkenhet, ezáltal megnövelve a radioaktivan megjelölt egérféle antitestek terápiás alkalmazhatóságát.. Sőt, amikor kamera anti~CD20~t alkalmazunk a keringő Bsejtek kimerítésére, a ^Ιη-jelölt antitestekkel elért diagnosztikai képek sokkal, tisztábbak lehetnek.

Az is nyilvánvaló, hogy a diagnosztikai radioaktívan jelölt •antitest és sgy terápiás radioaktívan jelölt antitest együtt alkalmazható sgy kombinált terápiás beadási módban. Ezt tekintve a diagnosztikai antitest a terápiás antitest előtt vagy után alkalmazható, hogy láthatóvá tegyük a tumor méretét a kezelés előtt és után. Ebben az esetben a találmány szerinti készlet a radioaktív jelölő antitestek és az alkalmazandó specifikus radíoizotopok optimális pH igényeinek megfelelően specifikusan kiszerelt, elkülönített, esetleg színkódolt pufferfiolákat tartalmazhat. Egy ilyen rendszer biztosítaná, hogy a megfelelő puffért alkalmazzuk mindegyik jelnél, és lehetővé tenné, hogy a klinikai orvos ugyanolyan könnyen végezze el a két antitest jelölését, mintha két készletet vett volna. Egy ilyen készlet hatásában két radioaktív készlet komponenseit egyesíti.

A találmány szerinti radioaktív jelölő készlet komponenseit megfelelő koncentrációban és pH-η biztosítjuk, úgy, hogy a sterilitás könnyen fenntartható legyen az antitest beadása előtt, és kevésbé legyen szükség további pufterekre vagy médiumokra, Mindemellett a szakterületen jártasaknak nyilvánvaló, hogy a reagensek néhánya helyben előállítható, sterilizálható és a sterilitásra tesztelhető. Tehát a találmány szerinti készlet több változata elképzelhető a vásárló anyagi lehetőségeitől és kívánságától függően.

A találmány szerinti készletet egy kelátképzővel konjogált antitest radioaktív jelölésére alkalmazhatjuk egy betegbe történő beadásra. A találmány szerint egy ilyen eljárás általában a _Φ « ο *Κ·» « X » követ kezekből áll.: (i) egy kelátképzővel konjugáít anti restes egy radiolzotőpot tartalmazó antitesttel keverünk össze; til) az eiegyet megfelelő hosszé. ideig megfelelő hőmérsékleten inkubáljuk; és íiilj a jelelt antitestet megfelező koncentrációjúra hígítjuk készitménypufférőén azért, hogy -a radioaktívat jelölt antitestet közvetlenül, be lehessen adni egy betegnek további tisztítás nélkülv

Legelőnyösebben az antitest egy anti-CD2ö antitest, és az anti-CDzü antitest különösen 2B8 lehet. Az antitestet bármilyen megfelelő kelátképzőhöz kornugálhat jmk, azaz MX-DTPA-boz, CHXDTEA-boz, fenti- vagy foenzii-DTPA-hoz, DOTA-hoz, EDTA származékokhoz, stb., melyek közül az KX-DTPA-z részesítjük előnyben. Az antitestkonjugácíő elvégzésének módszerei a szakterületen jól ismertek (Kozák et al (19895; Mírzadeh et ai. (19905 ; Brachbiel et ai. (19865].

Ügy találtuk, hogy egy ke lat képzőhöz konjugáít antitest radioaktív jelölési eljárása jobban működi;; ott, ahol a radioaktív jelet tartalmazó oldat körülbelül 3,0 és 6, ö közötti pH értékre van beállítva, és előnyösebben körülbelül 4,2-os értékre., mielőtt a kelét képző·-'konjugáít antitesttel összekeverjük. A pH beállítására különösen előnyös a kis-fémtartslmú nátrium-acélát, bár pufferokat is alkalmazhatunk. Előnyösen a nátríum-acetát körülbelül 10-1000 mM közötti koncentrációj.ú, és előnyösebben 50 mb koncentrációj ú.

Amikor a radíoizotöp ' ‘ ün-kloriö, az ““In-klorid azon mennysége, mely egyetlen beadási dózis előállítására alkalmazható, jellemzően (rörülbelüi 0,5 mii osztva a radioaktivitás koncentrációval a jelölés: időpontjában. A betegnek történő beadásra az ♦ X ^u;!In. jellemző diagnosztikai dózisa körülbelül 2-10 mCi . A pH beállítására alkalmazott nátrium-acélár mennyisége változik a zárríum-acetát koncentrációtól és az izotóp hordozó oldattól függően, és ezért meglehetősen tág tartományban mozoghat. Amikor a nátríum-acetát koncentrációja 50 mM, a pH beállításához szükséges mennyiség jellemzően az alkalmazott .....ln-kioriő. mennyiségének 1,2-szeress, bár nagyobb mennyiségek is használhatók. Tisztában keli lenni azzal, hogy a nátrium-acetát HCl-hez viszonyított aránya számit, és az alkalmazott nátrium-acetát mennyisége a pufferben lévő Hol mennyiségétől és koncentrációjától függően változik. Körülbelül 1 ml, körülbelül 2 mg/ml koncentrációjú kelátképző-konjugált antitestet elegyítünk ezután a radioaktív jel - ecetét oldattal, és az elegyet körülbelül 30 percen, ár, vagy annyi ideig inkubáljuk, mely elegendő az antitest optimális jelölésének eléréséhez. Ez az idő körülbelül 30 másodperctől kcr ölbe Ilii 60 percig terjedhet. Ezután készitménypaffért adunk hozzá olyan mennyiségben, mely a körülbelül IQ ml-es teljes végső térfogat eléréséhez szükséges.

Az antitest jelöléséhez szükséges optimális idő az antitesttől, az adott radioaktív jeltől és az adott alkalmazott fconjugátumtől függően változik. A radioaktivitási jelölésre biztosított idő optimalizálásában egy alaptényező a jelölendő reagens kelátképző/antitest aránya. Például a kelátképző/antitest aránynak elég nagynak kell lennie, hogy a beépülés terápiásán hatásos mennyiségét elérjük, azaz 9Q~üő%-ot, a radioizotopt ól függően, de túl magas sem lehet, mert az az antitest épségét és immunreaktivitását veszélyeztet1, Ehhez egy bizonyos kiegyensúlyozás! eljárásra van szükség, mely néhány esetben a konjugált *«♦ 4« · ^e«.' i honin * ♦ ♦ ·«·« ♦** « *

Φ*Φ χΑ* kelátképső kisebb mennyiségéhez és hosszabb jelölési zet h e t.

Például a 2B8-nál és az HX-DTPA-nál felfedeztük, hogy a jelölés a '''Ύ-nál öt perc alatt és az '''Tn-néi narminc perc alatt hajtható végre úgy, hogy a radioaktivitás kívánt mértékű beépülését elérjük, a kelátképzö és antitest csupán egy lk?~l mölarányánál. Ezért nem volt szükséges a kelét képző-antitest arányt megnövelni, mivei a radioaktivitás egy kívánt mértékét értük el. Sőt n« volt előnyös a konjogait kelátkepzö mennyiségnek megnövelése, mivel ez hatással lehet az antitest immunreaktivitására. Ezek a paraméterek más antitesteknél empirikusan meghatározhatók, hogy készleteket, úgymint a találmányban leírt készleteket megtervezzük.

Amikor a radioaktív izotóp Y-riorld, az egyetlen beadási dózis előállítására alkalmazott Y-kloríd mennyisége jellemzően 10-50 mCi közötti, és előnyösen 45 mCi osztva a jelölés időpontjában lévő radioaktivitás koncentrációval. A pH beállítására használt nátrinm-acetát mennyisége a nátrium-ecetét koncentrációtól és az izotóp hordozó koncentrációj.ától. függ, és ezért széles tartományban mozoghat, amikor a nátrinm-acetát koncentrációCv:'·.

ja 50 mb és a 'Y-2 50 mb HCl tartalmazza, a pH beállításához szükséges mennyiség jellemzően 1,2~szere.se az alkalmazott ^:'^;Ykioríd mennyiségének. Körülbelül 1,5 ml, körülbelül 2 mg/mi koncentráció já relatképző-kon jogait antitestet elegyítünk ezután a radioaktív jel scetát oldatával, és az elegyet körülbelül 5 percen át, vagy annyi ideig Ínkubáljuk, mely elegendő az antitest optimális jelölésének eléréséhez. Ez az idő körülbelül 30 másodperctől körülbelül 60 percig terjedhet. Ezután készitménypuffért veib

·*·** adunk hozzá olyan mennyiségben, mely a körülbelül 10 ml-es teljes végső térfogat eléréséhez szükséges.

Előnyösen a találmány szerinti radioaktív jelölési eljárást az itt leírt készletet használva hajtjuk végre. Mindemellett a szakterületen jártasak számára nyilvánvaló kell hogy legyen, hogy az előnyben részesített komponensek és körülmények csupán elfogadható Iránymutatók a találmány szerinti eljárás megvalósításához, és bizonyos mértékben megfelelő optimalizálással megváltoztathatók. Azok a körülmények, melyek eltérnek az előnyőstől, de még az eljárás célját megvalósítják, a találmány oltalmi körébe tartozónak tekintendők.

A találmány szerinti radioaktív jelöld készletet együtt biztosíthatjuk azokkal a reagensekkel, melyek alkalmasak arra, hogy a radioaktív jelölés után az antitest kötési affinitását kényelmesen ellenőrizzük. Ebben sz esetben a találmány szerinti készletet egy radioaktívan jelölt antitest célsejtjével szembeni kötési százalékának meghatározására is felhasználhatjuk mielőtt az antitestet egy betegnek beadnánk. Azt is felismertük, hogy az ismertetett kötési mérőéi)árási készlet általánosan felhasználható bármely antitest affinitásának vizsgálatára, melynél a tisztított antitest nem áll rendelkezésre. Következésképpen a kötési mérőeljárás komponenseit egy külön készletként árusíthatjuk.

Általánosságban egy kötési mérőéijárási és radioaktív jelölési készlet tartalmaz (i) legalább egy, a készletben lévő antitest által felismert antigént kifejező líofiiízáit sejtek fioláját; (ii) egy kelátképzővel konjugált antitestet tartalmazó fiolát; (iii) készitménypuffért tartalmazó fiolát, és (iv) használati útmutatót az antitest radioaktív jelöléséhez, sly módón, hogy a radioakt Ivari jelölt antitest közvet lenül beadható legyen egy betegnek, anélkül, hogy szükség lenne ezt kővető tisztításra. Ahogy fentebb leírtuk, a radioaktív jelölési készletnél, a készlet tartalmazhat egy radioizotöp ρΗ-yát beállító paffért tartalmazó fiolát és egy steril üveg reakciöcsövet. Előnyösen a puffer egy kis fémtartalmú nátrium-acetát óidat, körüibelud. 1010000 mM közötti koncentrációban, és az üveg reakoiccsö legalább 5 mi térfogatú, Az antitest előnyösen egy an.ti~€f;20 antitest, és a kelátképző előnyösen MX-DTPA. Más kelátképzőket Is alkalmazhatunk, ahogy korábban leírtuk. Az előnyben részesített kenjugáit antitest a 2B8-HX-DTPA, bár bármilyen kelátképzö-konjugáit antitestet megjelölhetünk, és affinitását mérhetjük. A készitménypuffér foszfáttal pufferolt sóoldat, mely egy radioprotektív anyagot és nem konjugáit kelátképzőt tartalmaz, ahogy fentebb leírtok, és a rádióizotop vagy benne van vagy nincs, és előnyösen ez In-kiorid. vagy Ύ-kloríd. Más radioizotőpokat is alkalmazhatunk a kelétképzőtől függően.

A különbség a fentebb leírt kötési méröelyárási/radioaktív jelölési készlet és a radioaktív jelölési készlet között az, hogy előbbi antigén-pozitiv sejtekét tartalmaz, melyek célszübsztrátkent szolgálnak az antitest-affinitás tesztelésére. Amikor az antigén C.020, előnyben részesített Cőlö-pczitiv sejtek az SB sejtek íATCC CLB i2o ) , de bármilyen CDzO-pozitív sejtet alkalmazhatunk. A kötési merőeljárási és radioaktív jelölési készlet továbbá antigén-negatív sejteket is tartalmazhat egy negatív kontrollként történő alkalmazás céljából. Előnyben részesített CD20-negatív sejtek a HSB sejtek ÍATÜü CLL 120,1), de ··*« ...«η kötési mérőX » Λ «

*·- ^Λ bármilyen CD20--negatív sejtet alkalmazhatunk.

Természetesen a kombinált radioaktív jelölési és eljárási készlet tartalmazhatja még a kimére anti-CDzö antitest egy fioláját a jelölendő antitest mellett egy kombinált terápiás beadási mód céljából, vagy a diagnosztikai leképzés előtt a perifériás S-sejtek kiürítésére. Ez a különálló antitest előnyösen Bituzan'h de bármilyen antitest lehet, melyről kimutatták, hogy tumorsejt pusztítást hajt végre. Valójában két eltérő· típusú antitestet kombinálhatunk egy készletben, azaz két eltérő B~sejt antigén elleni antitestet, azzal a fel kezei lel, hogy a kombinált terápiás beadási mód ugyanolyan típusú sejtek, azaz a B-sejt limfóma megcéizására szolgál.

Ahogy a készlet komponenseit más antitestek jelölésére alkalmazhatjuk, az antitest affinitás tesztelésére más sejteket is készíthetünk a cél-antigéntől függően. Azonban az anti-CD'20' antitesteknél a. találmány szerinti kötési mérőeijárási és radioaktív jelölési készlet különösen alkalmas olyan kereskedelmi készletként, melyben a célsejteket iioríiizált formában biztosítjuk. Ez lehetővé teszi az antitest hatékonyság ellenőrzésének egyszerű és rendszeres elvégzését, és nincsenek a szövettenyészet feltételeinek fenntartásával· járó bonyodalmak és költségek, A liofiiizált sejteket általában 0,5 és 500 X 10° sejt/ftora alikvotokbsn biztosítjuk a találmány szerint.

Az is lehetséges, hogy bizonyos helyzetekben előnyös, ha már radioaktivan jelölt antitesteket rendelünk meg, mely esetben kötési mérőeijárási reagensekre van szükség, hogy ellenőrizzük, hogy az antitestek megtartották-e kötési affinitásukat, Ebben az esetben a találmány egy kötési mérőeijárási készletet ís bízto·· sít egy radíoaktivan jelölt antitestnek a célsejtjéhez való százalékos kötésének meghatározására. Egy ilyen késsiet tartalmaz legalább egy rögzített és/vagy lio.fi iizált antigén-pozitív sejtet tartalmazó fiolát, és adott esetben antigén-negatív sejteket is tartalmat, ahogy fentebb ismertettük, a kötési mérőéijáráshoz és a radioaktív jelölési készlethez. Másfelől nyilvánvaló hogy egy ilyen készlet változatai egy jelöletlen kontroli antitestet tartalmazhatnak a vásárló antiteste kötési spéciiírásának igazolására egy kompétitiv mérőeljáráson keresztül.

ismételten, amikor az antigén CDit, a CD20-pozitiv sejtek előnyösen SB sejtek (ATCC CCL 120) és a €D2o~negatív sejtek előnyösen HSB sejtek (ATCC CCLÍ20.1), melyeket liofíiizált formában 0,5-50 x 10° sejt mennyiségű alikvotok formájában biztosítunk. Ebben az esetben nz antitest előnyösen a Tn-nez vagy ~ Ύ~η&1 jelölt 288 MX-DTPA egy konjugátnma.

Tekintettel az itt tárgyalt további készlet kiviteli alakokra, hangsúlyozni kell, hogy a találmány szerinti radioaktív jelölési készlet és eljárás egyik előnye, hogy nincs szükség további tisztítási lépésre, és a radioaktívat jelölt antitest közvetlenül beadható a betegnek, ezáltal értékes Időt és megnövekedett antitest-stabilitást nyerve. Ezért kihangsúlyoztuk, hogy bár a klinikai orvos számára kívánatos lehet a radioaktivan jelölt antitest kötési spécit Írásának és affinitásának tesztelése vagy ellenőrzése a beadást megelőzően, egy ilyen teszt előre elvégezhető az adott radioizotőpokkai, ha az antitest stabilitása és a radiolízis gátlása különösen fontos, mint például az ittriumnái. Azzal, hogy olyan készlet kiviteli alakokat biztosítunk mellyel a kötési affinitás és specifitás tesztelhető, semmiképpen sem alapvetően szükségesek a uu állítjuk azt, hogy találmány szerinti * ΦΦ az .riyen tesztet eljárásokban vagy készletekben. Egy ilyen antitest vaiidáciős tesztelése csupán egy választható lehetőség a klinikai orvos számára.

Úgy találtuk, a találmány szerinti kötési mérőeljárási készletekhez használt rögzített és liofilizált sejtek előállítására alkalmazott eljárás különösen alkalmas a sejtek kereskedelmi készletekhez történő előállítására. A sejteket a liofílizárás előtt rögzíthetjük, hogy javítsuk a szerkezetet/stabilitást. Nevezetesen, a találmány szerinti sejtek nagy reprodnktivitást mutatnak, amikor az antitest kötési, mérőeljárásokban alkalmazzuk őket..

A találmány pontosabban liofilizált sejtek előállítási eljárását foglalja magában, mely során (1; centrifugáiással sejteket gyűjtünk Össze 0,5-2 x 10° sejt/ml sejtsürüségben; a sejteket legalább egyszer mossuk egy kiegyensúlyozott sőoldatban, úgymint HBSS-ben; (iii) a pelletizálc sejteket egy liofliizáoiős pufferben, mely egy hordozőfehérjót és legalább egy cukor-típust tartalmazó kiegyensúlyozott sóoldat# újra szuszpendáljuk; (ív) az újraszuszpendáit sejtek egy alikvotját egy mikrofugacsőbe vagy egy üvegfiolába kimérjük, és (v) a sejteket 12-96 órán át, előnyösebben 24-72 órán át körülbelül 30-60 mtorr-nái liofilisaljuk. ez eljárás különösen előnyös olyan liofilizált sejtek előállítására, ahol az említett sejtek SB sejtek {ATCC CCL 120) vagy HSB sejtek (ATCC CCh 120.1), de valószínűen más sejttípusuknál is alkalmazható. Előnyösen puffer hordozó-fehérjeként marha szérumaihumint tartalmaz 1% (tömeg/tériogat) koncentrációban, és mannitot tartalmaz 10%. koncentrációban. Mindemellett lehetsé-

♦ « * <> X* ges, hogy más hordozófeáérjék, úgymint a HSA, és más cukrok is alkalmazhatóak. A sejteket körülbelül 1300 rpm-en végett, centrifugálissal gyűjtjük össze, és HBSS-t {Hank-fél.e kiegyensúlyozott séoldat) adunk hozzá. A sejteket általánosságban 5 x 10“' sejt/mi koneentrációban szuszpenöáljuk újra. Mindemellett a szakterületen jártasak számára nyilvánvaló, hegy a fenti körülményeket némileg módosíthatjuk a sejt életképességének jelentős veszélyeztetése nélkül, Mindemellett a fenti körülmények további, az eljárásnak a sejtek nagyobb mennyiségét szolgáló optimalizálásával kiégészíthetők, például tanyenciáiis áramláson diafiterációval a sejtek iíofilixáciös pofferben történő kicserélésére.

A találmány szerinti kötési mérőéijárási készletet bármilyen, egy radioaktivan jelölt antitest kötési affinitásának mérésére szolgáló mérőeljárásban alkalmazhatjuk. Egy ilyen mércéijárás szintén a találmány tárgyát képezi. Egy radioaktív antitestnek a célsejthez való százalékos kötődését meghatározó kötési mérőé1járás általánosan a következő lépéseket tartalmazza: {id egy radioaktívan jelölt antitestnek legalább egy alikvotját antigénpozitív sejtek legalább egy alikvotjavai keverünk össze; (ii) a radioaktivan jelzett antitest legalább egy, az (i) lépés alikvot iával, azonos alikvot ját kontrollként legalább egy , az (i) lépés antigén-pozitív sejtjeinek alikvotjavai egyezd mennyiségű hígítás! pufferrei keverünk össze; (iii) a sejteket centrifuqálással paliét izéijuk; (ív) a. pelletizál.t sejtek és a kontroli feiülószójában mérjük a radioaktivitást; és <v) összehasonlítjuk a sejtfelüiúszcban iévö radioaktivitás mennyiségét és a kontroliban mért radioaktivitás mennyiségét.

Éppen úgy, ahogy a találmány szerinti radioaktív jelölési

Α ·_:: ·:

készletek adott esetben .......In^kioridct vagy *·«·** *

... ... . . ... «. Φ > «««» »' ·

Ci-V .»«. ... ♦ »’ ' ”¥~kiorzdot tártál.

maznak, a találmány szerinti kötési mérőéijárást jellemzően l'-'l <?,;·’·.

In-nel vagy ’⁷y-nai jelölt antitestekkel hajtjuk végre. Amikor ^u‘In a jel, a radioaktivitást gamma-számlalót alkalmazva mérjük. Amikor ’Ά a jel, a radioaktivitást szcintiIláoiös számlálót alkalmazva mérjük, bár gamma-számláló is használható.

A találmány szerinti kötési mérőéijáráshoz az előnyös antitest egy anti-Cü-2-Q antitest, az anti—C 820- antitest előnyösen 288, ahol a 28-8 antitestet a találmány szerinti radioaktív jelölési készlettel jelöltünk meg. Azonban bármilyen radioaktívan jelölt antitest tesztelhető, ha biztosítjuk, hogy az adott antigént expresszáló sejtek hozzáférhetőek legyenek. Amikor CD22 az antigén, a mérőeljárás végrehajtására az előnyös sejtek az S8 sejtek ÍATCC CC1 120), azonban a mérőéi járás bármilyen rsdioaktivari jelölt antitesttel és megfelelő célsejttel. is optimalizálható és végrehajtható.

A mérőéijáráshoz alkalmazott hígítás! puífernek. fenn kell tartania az antitest kötődését, Így az egy olyan fiziológiai puffer, mely egy hordozó fehérjét, például BSA-t tartalmazhat, hogy minimálisra csökkentsük a sejtekhez való nem specifikus kötődést. Bár egy hígítás! puffért tartalmazó cső szolgál kontroliként, egy további kontrolit is tartalmazhat az assay, melynél antígén-neyativ sejteket használunk. Ebben az esetben a kötési mérőéijárás a következő lépéseket is tartalmazza: (i) egy radioaktívan jelölt antitest legalább egy alikvofcját antigénnegatív sejtek legalább egy aükvot javai keverjük össze; (11) centrifugálissal peiletizáijuk az antigén-negatív sejteket; (iv) mérjük a radioaktivitást az antigén-negatív peiietizáit sejtek *·

X** felülúszójában; és (v; összehasonlít jók az antigén-negatív sejtfelülűs-zőban lévő radioaktivitás mennyiséget az antigén-poriéiv sejtfel'ülűszó radioaktivitásának mennyiségével· és a kontrollal.

Ebből a csőből kapott radioaktivitás összehasonlítása a higítási poffer kontrollal az antigén-pozitiv sejtekhez való nem specifikus kötés mennyiségének mérésére szolgál. Amikor CD20 az antigén, és a CD20~pozitiv sejtek SB sejtek, a CD2G-negetiv sejtek előnyösen HSB sejtek (ATCC CCL 12 0. X;.

Ahogy fentebb leírtok, a találmány szerinti iiofíüzált sejtek egy egyszerű, hatékony és reprodukálható- standardot biztosítanak egy radioaktívan jelölt antitest hatékonyságának tesztelésére. Tehát a találmány szerinti kötési mérőeljárást előnyösen a kötési mérőéijárási készletben lévő liofilizáit sejteket alkalmazva hajtjuk végre. Továbbá találmány szerinti radioaktív jelölési készlet a találmány szerintii kötési mérőéijárásokkal kombinál ható, ahol az antitestet először egy keletképző-konjogait antitest jelölési eljárásával jelöljük, ahogy a találmányban ismertetjük. Előnyösen a találmány szerinti kötési mérőéi járást az itt leírt kötési mérőéi járási és radioaktív jelölési készletek egyikét alkalmazva hajtjuk végre.

Lehet néhány eset, ahol az antitest affinitását tesztelni vagy ellenőrizni kell, amikor a radioaktív jelet még nem kapcsoltok hozzá. Például bizonyos körülmények között, igy hibakeresésnél, előnyös lehet az antitest kötési affinitásának a tesztelése a radioaktív jelölés előtt. Egy ilyen esetben a találmány magában foglal egy kompetitív kötési mérőéijárást egy tesztantitest egy célsejthez való affinitásának mérésére, mely a következő lépéseket tartalmazza: (i) egy ruténiummal jelölt kontroll antitestet készítünk egy ugyanarra az antigénre ♦ * « χ

spécitikus ismert antitesttel; (ii) a fesztantitestet növekvő mennyiségben és a jelöletlen kontroli antitestet. növekvő mennyiségben

Ínkubáljuk a rögzített koncentrációjú célsejtekkel és a ruténím~ jelölt antitest nyomnyí mennyiségével, ahol a teszt-antitest mindegyik koncentrációnál és a kontroll antitest mindegyik koncentrációnál sülön-kólón csövekben van; {íii) meghatározzuk a kötés mennyiségét mindegyik reakcíocsöben relatív eiektrokemilumíneszcencia (ECL) alapján OűIGBb készüléket alkalmazva; és {ív) kiszámoljuk a teszt-antitest átlagos affinitás! értékét. Az átlagos affinitás! értéket az SC50 értékekből és a nyomnyí mennyiségű antitest ismert koncentrációiból számoljuk ki Maiiét módszerével [u. immunoiogicai Methods 34., 34 5 (1950)) vagy más megfelelő módszerrel. Megjegyzendő, hegy ezt a mérőéi” járási, a radioaktívat jelölt antitestek affinitásának tesztelésére is alkalmazhatjuk, vagy bármilyen antitest tesztelésére, ahol az antigént nem tudjuk tisztítani, és antigénforrásként sejtek szükségesek. A találmány rögzített, liofilizált sejtjeit használhatjuk célsejtekként.

Amikor a találmány szerinti, kompétitlv kötési mérőéi járást hajtunk végre az anti-CDzO antitestek affinitásának tesztelésére, a kontroll antitest 2B3 vagy más. nem kong agáit antí-CD20 antitest lehet. A kontroll antitest egy kelátképzővel konjugáit antitest lehet. A teszt-antitest szintén a kontroli antitest egy kelátképzö-konjagatuma lehet. Alternatív lehetőségként a tesztantitest egy másik anti-CDzO antitest lehet, melynek a znö-cel összehasonlított, CDzö-szsi szembeni kötési affinitása számit.

Mindemellett a mérési eljárás más specifitassa! rendelkező anti2> Ε ₄Κ« «*« ♦ *^Λ testek alkalmazására is átalakítható, feltéve hegy a megfelelő oéls ej t ho z zá férhető.

A találmány szerinti kompetítiv kötési mérőéit árasban az előnyben részesített célsejtek a CDzO-pozitiv sejtek, előnyösebbek az SB sejtek (ATCC CCL 120), és még előnyösebbek a találmány szerinti eljárással előállított űjrasznszpendált liofilizált SB sejtek. Más módszerek alkalmazásával liofilizált sejtek vagy rögzített sejtek is alkalmazhatóak. A ruténiummal jelölt antitestet jellemzően egy olyan eljárással állítjuk elő, mely során a kontroll antitestet a ruténium(il)-tris-bipiridin keiátképző M-hidroxí-szakeinimíd észterével (TAG-MÜS) inknbáljnk, bár az antitestek jelölésének más ismert eljárása is elképzelhető. A jelöléshez a kontroll antitestet és a TAG-kHS-t előnyösen körülbelül 1:15 mólarányban inkubáljuk,

A találmánynak ezek és más aspektusai a következő, ábrákra, példákra és a találmány leírására hivatkozva világosan érthetővé válnak.

Az ábrák rovod ismertetése

1. ábra; A natív 238 immunreaktivitását hasonlítottak össze a kereskedelemben beszerezhető B1 (Conlter) és a ken 16 (Becton Dickinson) anti-Cb20 antitesttel egy radioimaiun mérőeljárásban közvetlen korapetícióval ''l-vel jelölt Bl-t alkalmazva. Antigénpozitív SB sejteket (1.00 0:00) adtunk VSP szUröiemezek mindegyik mérőhelyére; 10 ng radioaktívon jelölt Bl-t Összekevertünk a. jelöletlen kompetitor különböző koncentrációival, és az elegyet adtuk a sejtekhez. Az antitesteket a sejtekkel ínkubáltuk egy órán át környezeti hőmérsékleten; a meghatározásokat három példányban hajtottuk végre. Ezt követően a mérőhelyeket mostuk, szárítottuk és a szűrére kapcsolódott radioaktivitást meghatároztuk, A bemutatott adatokat a háttér aktivitáshoz korrigáltuk, és a meghatározások három példányának átlagát vettük.

2«. ábra: A nem konjugált 2BS-r növekvő mennyiségben analizáltuk a humán B~ssjtekhez (SS) való kötődésre BACS analízist alkalmazva. Összehasonlításokat végeztünk egy kereskedelemben hozzáférhető anti-CDzö monoklonáiis antitesttel (Bi) és két irreleváns izotipusú antitesttel. Egér anti-egér IgG-FITC Eiabj'r-t alkalmaztunk második reagensként. Az eredmények azt mutatják, hogy a 2B8 specifikus a CDzO antigénre, és nagyobb kötődést mutat, mint a 31,

3,. ábra: Humán S-sejteket (SB) inkubáltünk növekvő mennyiségű ^J''^{: J}l™vei jelölt zBS-oal, Három példányban mintákat inkubáitunk egy órán át, és a sejt kötött radioaktivitást meghatároztuk, miután a sejtek összegyűjtése céljából szűrtük a mintát. A Scatchard analízis lehetővé tette egy 4,3 x 1.0’”'' M-os látszólagos affinitása konstans kiszámítását,

4, ábra: A natív 2B3, 2B8-MX-DTPA és 81 immunreaktivitása. A antitestet radioaktívan jelöltük, ahogy azt a „Módszerek részben ismertetjük. Tiz nanegramm. radioaktívan jelölt Bl-t összekevertünk a kompétitor növekvő koncentrációival, és az elegyet 100 000 antigén-pozitiv SB sejtet tartalmazó V & P szüröiemezek mérőhelyeihez adtuk; mindegyik meghatározást három példányban hajtottuk végre. Egyórás környezeti hőmérsékleten végzett inkubálás után a sejteket erőteljesen mostuk. Ezt követően a szűrőket szárítottuk és a hozzájuk kapcsolódott radioaktivitást gamma-számi ál óval. határoztuk meg. Mindegyik értéket a háttérhez korrigáltuk. Az értékek a három meghatározás átlagát mu5. ábra: A 2B3 antitestet 10 mg/ad. végső koncentrációra íormaláituk normál sóoldatban vagy lö mkl giicín-HCl-t tartalmazó, 6,3 pH értékű normái sooldatban. A minták két példányát csavarkupakos fiolákba helyeztük, a fiolákat nitrogénnel füvattuk át, és lezártuk, A mintákat ezután 4*C-on vagy 30°C-on ínkubáltuk 12 héten át; a minták immanreaktivitását hetenként értékeltük ki. Nem figyeltük meg az immunreaktivítás elvesztését egyik 2B8 mintánál sem a teljes: 12 hetes vizsgálat során. Az 1.

φ φ. X tátják.

héten (5A. ábra), a 6, héten <5B. ábra) és a 12, héten. (5C. ábra) mért immunreaktívitást ábrázoljuk.

6. ábra; Kötési mérőéi járás a '^{! lA}In-nel jelölt 2B8-MX-DTPA iOT«rnreak.tivitásának meghatározására, melyet 50 mg/mi humán azérumaibumint tartalmazó PBS-ben (ptí-7,4) iüfcubáitunk <48 órás inkubálás). 6A. ábra; A radioaktívan jelölt antitest konstans mennyiségét (5ng/ml) inkubaitűk az S3 sejtek növekvő mennyiségeivel (20 x lö^b sejt/ml). A sejtekhez kötött radioaktivitás mennyiségét (cpm) a hozzáadott sejtszuszpenziő térfogatának függvényében ábrázoltuk. 6S< ábra; A kötött radioaktivitás feletti teljes, alkalmazott radioaktivitást ábrázoltuk. A lineáris extrapoláció lehetővé tette az y-metszet kiszámítását (0,927).

Az y~metszet x 100 reciproka egy 100 %-os immunreaktn. vitás i értéket eredményezett nagyon nagy antigénteleslegnél.

7. ábra: ^wY-nal jelölt 2B8-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott autoradiogrammok, mely mintát 4°C-on 75 mg/ml humán szérnmaibumint és 1 ml BTPA-t tartalmazó PBS-ben (pB-7,.4) inkabáitunk. A megjelölt időpontokban a mintákat 1-20%-os Tris-glíoin géleken eiektroferetIzáltuk nem redukáló körülményeket, és denaturáló «♦ki ♦*«« * ♦*·«· ♦ί· körülményeket fSDS) alkalmazva. A mintákat 5 μΐ-nél (l._# 2. sáv; és lö μΐ-nél (S>, 6. sáv) vittük fel. A géleket röntgenti Imre •exponáltuk hozzávetőleg 15 percig környezeti hőmérsékleten, és lefényképeztük.

8. ábra; ’^vU Y-nal jelölt

288-MX-DTPA. SDS-PAGE analíziséből kapott 0. időpontban vett autoradiogrammok denzitometriás letapogatása, mely mintát 4^ttC-on '75 mg/ml humán szérumalbumint és I mL DTPA-t tartalmazó PBS-ben (pH~7,4) inkubáltunk. A mintát /-20/os 'Tris-gl.ic.in gélen elekfcrof oretí záltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΙ-ben, 10 μΙ-ben. és 20 μΙ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert használva szkennsitük, A radioaktívat jelölt konjugátum csúcs {2, számú) relatív területe 96,2 % volt.

9. ábra; 'Ύ-naI jeleit 2B8-EX-DTPA SDS-PAGB analíziséből kapott 48 órás autoradiogrammok denzitometriás letapogatása, mely mintát 4^öC-on 75 mg/mi humán szérumalbumint és 1 mi DTPA-t tartalmazó P8S-ben ·£ρ·Η~·7,4.} inkubáltunk. A mintát 4-20%-os Trísglicin gélen elektroforetizáiéuk nem redukáló körülményeket alkalmazva , A mintákat 5 μΙ-ben, 10 μΙ-ben és 20 pl-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert használva szkennel tűk. A. radroakt ívan. jelölt konjugátum csúcs (2. számú) relatív területe 95,5 5 volt.

10. ábra; ín-nei jelölt 2B2-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott autoradiogrammok, mely mintát 4 'C-on 50 mg/ml humán azérumaibumínt tartalmazó PBS-ben (pH^:::;7,4) inkubáltunk. A mintáz 4«« * Ο ♦ ψΧ ♦*

9

201~os Trrs-gUcin gélen elektroforetízáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΙ-ben {1., 2, sáv), 10 ul-ben (3,, 4. sáv) és 20 μΐ-ben (5, és 6. sáv) vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és lefényképeztük. (Megjegyzés; 48 órás autoradiograrnmof kaptunk intenzifikáló letapogatásokat alkalmazva, mely egy intenzivebb jelet eredményez összehasonlítva a 0. időpontban felvett autoradiogramm-mal. )

11, ábra; ^;;;ln-nei jelölt 2B8-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott. 0. időpontú autoradiogrammok denzifcometriás letapogatása, mely mintát 4°C-on PBS-ben ;pu-7,4) lakúba ltunk, ami 5(5 mg/ml humán szérumalbumlnt tartalmazott. A mintát 4-20%-os Tris-glicin gélen slektrotorétízáituk nem redukáló körülményeket alkalmazva, A mintákat 5 μΙ-ben, 10 μ.Ι.-be.n és 20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában, A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert használva szkenneltük, A radioaktivan jelölt konjugátum csúcs (3. számú) relatív területe 95,9 % volt.

12. ábra; In-nei jelölt 2S8-MX-D1PA SDS-PAGE. analíziséből kapott 0, időpontú autoradiogrammok denzitometriás letapogatása, meiy mintát 4 °C-cn PBS-ben (pH=v,4) rnkubáltunk, ami 50 mg/ml humán szérumalbumlnt tartalmazott. A mintát 4-20%-os Tris-glicin gélen, elefctrofcretizáituk nem redukáló körülményeket alkalmazva, A mintákat 5 ul-ben, 1.0 μΙ-ben és 20 μΙ-ben vittük fal a mérőhelyek két példányában, A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitómétért használva szkenneltük. A radioaktivan jelölt konjugátum relatív területe 96,2 % volt (2., 3, és 4. számú csú4 « X X *

«.» « » ·*» ♦♦ •Ο»·* csők egyesített területei).

13. ábra: Humán szérumban. 37^tJC-on inkubáit 'Ύ-nai jelölt 2B8-MX-DTPA. StiS-PAGE-böl kapott autoradiogrammok, A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20% Trls~gl.icin géleken eiektroforetizáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΙ-ben (1.., 2. sáv), 10 μΙ-ben (3., 4. sáv) és 20 μΐben. í5. és 6. sáv) vittük fel a mérőhelyek két példányában, A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és lefényképeztük.

3- ,’V

14. ábra: Humán szérumban 37^:>C-on inkubáit '‘Y-nul jelölt

2B8-MX-DTEA SDS-PhGE-ből kapott 0. időpillanatban £ elvet t autoradiogramm denzítometriás letapogatása. A mintákat 4-20%

Iris-giicin géleken elsktroMretizáitak nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΐ-fosn, 10 μΙ-ben és 20 μΙ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában, A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét denzitométert alkalmazva szkenneitük. A radioaktivan jelölt konjugátnm csúcs (2. számú) relatív területe 97,9 % volt.

15. ábra: Humán szérumban 37''C~on rnkubáit 'uenl jelölt 2B8-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott 98 őrás autoradiogramm ő.enzi tomatriás letapogatása. A mintát 4-20%-os Trís-glicin gélen elektroforeti zártuk nem. redukáld körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 pl-ben, 10 μΙ-ben és 20 μΙ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert alkalmazva szkénééitük. A radioaktív konjngátum csúcs (2, számú) relatív területe 94,7% volt.

« * * *♦·« *♦·'♦ * X

Sií« ΦΧ

16, ábra: Humán szérumban 37'°C-on inkubált “Hs-nei jelölt 2B8-MX-D1PA SDS-AAGE-böl kapott autoradiogrammck. A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20% Tris-gllcin géleken elektrcforetizáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΙ-ben (1-, 2. sáv}, 10 μΙ-ben (3., 4. sáv) és 20 pihen (5. és 6. sáv) vittük fel.. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezeti hőmérsékleten, és lefényképeztük.

17. ábra: Humán szérumban 37“C-on inkubált '^!Λχ1η-ηο1 jelölt 2B8~MX~DTFA SDS-PAGE-ből kapott 0. időpillanatban felvető autoradiogramm denzitomer ráás letapogatása. A mintákat 4-20%

Tris-glícin géleken elektrofcretizáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΙ-ben, 10 μΙ-ben és 20 μΙ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 16-20 órán át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét denzitométert alkalmazva szkenneitúk. A radioaktivan jelölt konjugátum csúcs (3. számú) relatív területe 95,3 $ volt.

18. ábra: Humán szérumban 3'7°C-on inkubált ^:'ⁱ³ln-nei jelölt 2B8-HX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott 98 őrás autoradicgrammok denzitomerriás letapogatása. A mintát 4-20%-os Tris-glicin gélen elektreforetizáltuk nem redukáló körülményeket alkalmazva, A mintákat 5 μΙ-ben, 10 μΙ-ben és 20 μΙ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában, A gélt röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 16-20 órán át környezeti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert alkalmazva szkenneituk. A radioaktív konjugátum csúcs (3. számú) relatív területe 94,0% volt.

19. ábra: Jávái makákő majmoknak intravénásán minden 48. őrá42 bán injekciót adtunk, összesen hét injekciót; & beadott mennyiségeket bemutatjuk. A keringő T- és B-sejtek mennyiséget antiCD2~t (T-scjt), antr-Mo-IgG t (298), ant.i-CD2.0~fc (Leu 16;, és antí-humán-lgG-t (B-sejt) alkalmazó PAC'S analízissel határoztuk meg. Semmilyen hatást nem figyeltünk meg a keringő T-sejtek mértékére. (a V csoport állatai egyetlen dózist kaptak),

20. ábra: A keringő B-sejt mennyiségének megállapítása olyan állatokban, melyek 2B8-t kaptak, ámít a lő, ábra rövid leírásában ismertetett fiucresscenciásan jelölt antitesteket alkalmazó

FACS analízis követett. A ITT. és IV. csoport állatait nem követtük nyomon, mivel ezeket a 13. napon fájdalommentesen megölés k.

21. ábra; Jávái mak.ákö majmoknak intravénásán “^<:!¥~2BS-bX-BTvA injekciót adtunk be, melyet klinikai minőségű 2.B8~MX~DTPA~bői készítettünk. Az állatoknak minden 48. órában a fentebb bemutatott dózisokat adtuk be, összesen hét dózist. A 0,, 2,, 7., 10.,

14. napon a majmoktól vért vettünk, és kiértékeltük szérumkémiára, hematológiára és a keringő B-sejt mennyiségére (a 10. napi szérumokat a B-sejt tartalomra nem elemeztük ki).

22. ábra: A 2B8 egérféle anti-CD20 antitest kitisztulását a javai makákő majmokból BLTBA-val határoztuk meg, miután egyetlen 10 mez kg dózist tartalmazó injekciót adtunk be nekik. Ahogy az A mezében bemutatjuk, az antitest hozzávetőleg a 4,5, nap fejeződött ki pfcíx-dei. A 2B8 antitest és az MX-DTPa kenjugátúrnának kitisztniását a BALB/c egerek keringéséből a S mezőben mutatjuk be. Az egereknek intravénásán 25 gg natív vagy konjugált 2B3-t adtunk be injekcióban, és vérmintákat vettünk különböze időpontokban az injekciót, követően 264 órán át; a szérűmet ezután ki4 >>*·♦ *♦*'* * «Φ» ♦ * * ««* **_ < « * » .A·* ««* 4 *» ^W e1eme z t ü k be f o q ős s er kén t

SB sej teket alkalmazó enzimmunoassayvel. A natív és a konjugáit antitestek is 8,75 napos kitísztuiási értékeket mutattak,

23. ábra: 20 BALB/c egér mindegyikének 50 mg/ml BSA-t tartalmazó PBS-ben (pH—7,4) kiszerelt, 1,1 pCl radioaktivan jelölt konjugatumot (100 μί) adtunk be injekcióban. Az öt egérből álló csoportokat az 1., 24.., 48. és 72. órában fájdalommentesen megöltük, majd kivéreztettük, és különböző szöveteket preparáltunk, és a kapcsolt radioaktivitásra kielemeztük.

24. ábra: 20 BALB/o egér mindegyikének 75 mg/ml humán szérumalbumint tartalmazó BBS-ben {pH-7,4) kiszerelt, hozzávetőleg 1,0 poi radioaktivan jelölt konjugátumot (100 μί) adtunk be intravénás injekcióban. Az öt egérből állő csoportokat az 1., 24., 48.. és 72. órában fájdalommentesen megöltük, és a vérüket és különböző szöveteiket kipreparáltunk, ás a kapóséit radioaktivitásra ka, elemeztűk,

23. ábra: Ramos B-sejt tumorokat hordozó timusz nélküli egereknek 24 pCi ^; Gn-2B8-MX-DTPA-t adtunk be injekcióban, és a három egérből álló csoportokat fájdalommentesen megöltük a 0., 24., 40. és 72. órában. A szövetpreparálás és a kapcsolt radioaktivitás meghatározását követően meghatároztuk a százalékos beadott dózis per gramm szövet értéket és ábrázoltuk, ahogy bemutatjuk .

2u. ábra: Kötési mérőéijárás 50-75 mg/ml humán szérnmalbumint tartalmazó PBS-ben (pH-7,4) inkubáit (48 órán át) „mim-á-shoot ’^J¥-jelölt 2BS-MX-DTPA immunreaktlvitásának meghatározására. A mező: A. jelölt antitest egy állandó mennyiségét (hozzávetőleg 1 ng/ml-t) inkubáltunk az SB sejtek növekvő mennyiségével. A sejtekhez kötött radioaktivitás mennyiségét icpm? ábrázoltak a

Ο;”·, sejtkoncentráció függvényében. 8 meze; A teljes alkalmazott Ύ radioaktivitás per kötött radioaktivitást (AT/B) ábrázoltak.. A lineáris extrapolálás lehetővé tette az y~metszet kiszámolását (1,139). Az y-metszet reclproka. X 100 egy 87,9 %-os imziunreakt ivitási értéket eredményezett nagyon nagy antigén feleslegnél. Nem figyeltünk meg kötést a CD20~negativ sejtekkel (HSB).

27. ábra; 75 mg/mi humán szérnmalbumint és 1 mM DTPA-t tartalmazó PBS-ben 4^5-on inkubált, 'á-ot jelölt 2B8-MXBT PA SDS-PAGE analíziséből· kapott autoradiogrammok, A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20 % Tris-glicin géleken eiektroferetizáituk nem-redukálé körülményeket, denaturáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 ui-fcen (1-, 2. sáv), 15 μΐfcen (ő., 6. sávi vittük fel. A géleket röntgen filmre exportáltuk hozzávetőleg 15 percen át környeztet! hőmérsékleten, és lefényképeztük.

28. ábra: 75 mg/ml humán szérumalbumint és 1 mM DfPA-t tarCili taimazó PBS-ben (pK-7,4) 4‘ü-on inkubalt, Y-na.1 jelölt 2B8-MXDTPA SD3-PAGE analíziséből kapott ö. időpontban felvett autoradiogrammok denzirométriás letapogatása. A mintákat j-2ö % Tris-glicin géleken elektroforeti.záltuk nem-re dukáló körülményeket alkalmazva, A mintákat 5 fii-ben, 15 pl-fcen és 20 pl-ben vittük fel, A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezteti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométért alkalmazva szkénneltük, A radíoaktivan jelölt konjugátum relatív területe {2. számé) -96,1 % volt.

29. ábra: 7 5 mg/ml humán szérumalbumint és 1 híM DTPA~f. tar;»₄ »«« « » «*| μ» talmazó PöS-ben {ρ·Β~7,4} 4°C~on inkubált, 'l-nal jelölt 2S8-MXD1PA SDS-PAGE analíziséből kapott 48. órában felvett autoradiogrammok denzítometriás letapogatása. A mintákat 4-20 % Tris-giioin gálákén elektrotorét!zártuk nem-redukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΐ-ben, 10 μΐ-ben és 20 μΙ-ben vittük fel. A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környeztet! hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert alkalmazva szkenneltűk. A radioaktívon jelölt konjm;gátum relatív területe (2, számú) 94,1 % volt.

30. ábra: Humán szérumalbumínban 3?*C-on ín kábáit shoot ^:9'^JY-jelölt 2Β3-ΗΧ-0ΤΡΑ SDS-PAGE analíziséből kapott autoradiogrammok. A megjelölt időpontokban a mintákat 4-20 %

Tris-giioin géleken eiektroforetizáltnk nem-redukáiő körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΐ-ben (1., 2. sáv), 10 μΐ-ben (3., 4. sáv) és .20 μι-ben (5., 6. sáv) vittük fel, A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg IS percen át környezheti hőmérsékleten, és lefényképeztük.

31. ábra; Humán szárurnaibumrnban 37^<;C-on inkubált ,_;mix~&~

O í' árost -'Ύ-Jelölt 2B8-MX-DTPA SDS-PAGE analíziséből kapott 0. időpontban felvett autoradiogrammok denzitometriás letapogatása. A mintákat 4-20% Tris-glicin géleken elektrof©rétizéitek nemredukáló körülményeket alkalmazva. A mintákat 5 μΙ-ben, lö μΐ-ben és 2ö μΙ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában, A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percei; át környeztet! hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert alkalmazva szkenneltük, A. radioaktívat jelölt kon j ugat um relatív területe (2. számú) 8 0,1 % volt,

32» ábra; Humán szérumaibnminban 37°C~on inkubált .zzx-b·

6 shoot '^í0Y-jelölt 2B8-MX-DTRA SDS-PAGE analíziséből kapott 72. órában felvett auto-radiogranrook denzítometriás letapogatása. A mintákat 4-20%' Tris-glícin géleken elektródoretízáitűk nemredukáló körülményeket alkalmazva, A mintákat 5 gl-ban, 10 μΐ-ben és 20 μΐ-ben vittük fel a mérőhelyek két példányában. A géleket röntgen filmre exponáltuk hozzávetőleg 15 percen át környezteti hőmérsékleten, és a sávok egyikét egy denzitométert alkalmazva szkenneltük, A radíoaktivan jelölt konjugátum relatív területe (2. számú} 88,8 % volt.

33, ábra: 20 BAlB/c egér mindegy!kének 75 mg/mi humán szérumalbumint és 1 mM BTPA-t tartalmazó 1 X PBS-ben (pH'«7_f4) készeé!.

relt, 5 pCi “Ύ-naI radíoaktivan jelölt konjugátumot (100 pl) adtunk. be intravénás injekcióban. As Őt egérből álló osoportokat az 1., 24., 48. és 72. órában fájdalommentesen megöltük, és a vérüket és különböző szöveteiket kipreparáltunk, és a kapcsolt radioaktivitásra kielemeztük.

34, ábra: CHQ-rerdetű jelölt 2B8 antitesteket növekvő mennyiségben frissen begyűjtött, rögzített koncentrációjú CD2ö-pozitív B-sejbekkel (SB) vagy CDzG-negatív T-sejtekkei (HSB) inkubáltuk. A sejtekhez való antitest kötést kecske anti-egér IgG-BlTC F(ab) alkalmazd FAC8 analízissel mennyiségileg meghatároztuk az Itt ismertetett módon. Összehasonlítottuk egy irreleváns izotipusü antitesttel (S004), Csak A GHO-eredetű 2B8 antitest mutatott észlelhető kötődést a CD2Q~poz.lf.iv SB sejtekhez.

35, ábra; A CHG-eredetű 2B8 immunreaktivitását hasonlítottuk össze egy hiforidöma sejtvonalban termeit 2B8-49 szülő antitesttel egy ORéGER assay-ben végzett közvetlen kompeticiővai. Az antitestet növekvő mennyiségben inkubáltuk a rögzített koncentrá4 7 «ΧΛ .«♦·« * ciőjü CDcÖ-pozitiv B-sejLekkel és ruténiummal jelölt CHO 283 nyomnyi mennyiségével. Miután három órán át környezeti hőmérsékleten inkubáltnk, a kötést relatív elektrokamilnmineszcenciában kifejezve (ECLj ŐRIGEN berendezést alkalmazva határoztuk meg az „Anyagok és Módszerek fejezetben leire módon.. Az értékek két meghatározás átlagát képviselik. A CHO 2B8 és 2B8-49 átlagos af••'iO fínitási állandóját kiszámítva az 1,3 X lö ' illetőleg 2,5 X 10 ^AV M volt. Egy irreleváns izotipusú antitestet (SOO4) alkalmaztunk az összehasonlításhoz.

36. ábra: A CHO-eredetű 238-ből készített 288-MX-DTPA konjugátumok kötését összehasonlitottuk a nem kongagáit antitesttel· közvetlen kompétrolóval egy ö&TGEN assay-Pen, Konjugátumokat készítettünk oly módon, hogy a 2B8--fc MX-DTPA-val inkubáltnk és 24 órán át mielőtt a nem reagáló belátót elfávolitottuk. A kötési méréshez az antitesteket a CDzO-pozitív B-sejtek (SB} egy rögzített koncentrációjavai és ruténiummal jelölt CHO 2BH nyomnyi mennyiségével inkubáltuk. Miután három órán át környezeti hőmérsékleten inkubáltuk, a kötést relatív eiektrokomilumineszcenciaként (ECL) kifejezve határoztuk meg OXIGÉN készüléket alkalmazva, ahogy az „Anyagok és Módszerek' részben leírtuk.. Az értékek két meghatározás átlagát képviselik. A konjugátum készítmények hasonló kötődést mutatnak mint a nem konjogált 2B8 entitást.

37. ábra: A) SS sejteket mostunk, és 93 X ICk sejt/ml koncentrációig újra szaszpendáltuk higítási pufforral (1% (tőmeg/térfogat} marba szérumalfoumint tartalmazó 1 X BBS, pH-7,4). A sejteket növekvő koncentrációban. 3 órán át 7,5 ng/ml In2B8~cai inkubáltuk 2B8-~NX~DTPA öl65A jelű tételét alkalmazva, 8} A sejt48

....♦»*»» ·* Λ

:.. : .

·*:· .» ~ koncentráció kétszeresen inverz grafikonjai a kötött radioaktivitás /teljes radioaktivitás (B/TA; függvényében. Az ímmunreaktivitást l/y-metszet x 100 képlettel számoltuk ki. Az immunt©aktivitás 00,6% és a korrelációs koefficiens (R) értéke

0,981 volt.

38. ábra: A) SB sejteket mostunk, és 90 X 10'¹ sejt/ml koncentrációban higítási pufferre! (1% ítömeg/térfogat) marha szérumalbumint tartalmazó 1. X BBS, pH-7, %} újra szuszpendáituk. A sejteket növekvő koncentrációban 3 órán át 2 ng/rnl Y2B8~eai inkubálfuk, melyet 2B8~KX~DTPA 0165A számó tételét alkalmazva készítettünk el. B) A sej:tkorcentráció kétszeresen inverz grafikonja a kötött radioaktivitás/teljes radioaktivitás (B/TA) függvényében. Az immun-reaktivitást l/y~metszet x 100 képlettel számoltuk ki. Az immunreaktívitás 72,2 % és a korrelációs koefficiens (R) értéke 0,99-9 volt·.

A találmány részletes ismertetés®

Maghatározások

Ha másképpen nem határozzuk meg, az összes leírásban használt műszaki és tudományos kifejezés ugyanolyan jelentéssel bír, ahogy egy azon a szakterületen szokásosan jártas személy értené, mely szakterületbe a találmány tartozik. Bár akármilyen, az itt leírtakhoz hasonló vagy azzal egyenértékű eljárás és anyag alkalmazható a találmány megvalósításában vagy tesztelésénél, az előnyős eljárásokat és anyagokat ismertetjük. A találmány céljából a következő kifejezéseket határozzuk meg a következőkben:

Kis fémtartalmú - olyan reagensekre vonatkozik, melyeket kezeltünk, hogy leceökkentsük a fémszennyeződést egy olyan szintre, mely nincs hatással a radioaktivitás beépülésére.

9

4. ♦.·♦ X «« * amit az adott ta·

Antigén-pozitív - olyan antigént fejez ki, lálmány szerinti antitest felismer oly módon, képes a kötésére.

hogy az antitest % radioktív beépülés - egy radioaktív jelölési reakcióból származó antitesthez kenjugálódott radioaktív jel mennyisége, a reakcióeiegyhez kezdetben adott radioaktív jel teljes mennyiségéhez viszonyítva.

% kötés - egy mintából származó antitest azon mennyiségére vonatkozik, mely a cél-antigénhez kötődik spécifikusan vagy nem spécirikusan.

% imm.unreaktívitás vagy kötési specifitás - egy mintából származó antitest azon mennyiségére vonatkozik, mely specifikusan kötődik a cél-antigénhez, diagnosztikai antitest - egy olyan antitestre vonatkozik, mely egy radioaktív jelhez van konjugálva, mint például ''Ü-nez, mely a tumorok és antigén-pozitív sejtek diagnosztikai leképezését. képes végrehajtani.

Terápiás antitest ~ egy alfa- vagy bétasugárző radioaktív jelhez (mint például ''Ü-hozj kon/j agáit antitestre vonatkozik, mely képes sejtpusztulást okozni, amikor a megcélzott antigénhez kötődik.

ismer tétése

TBé egérféle monoklonálís enbi-CDTP anfcxfcesfc# konjug^álfc

1' 1 ~ Y-j elöl fc preJfelfcl fej 1esetése

Σ. Anyagok és módszerek a 2B8 egérféle monoklonálís anti-CD20 énéi fent, 2B8~WC~DTP&, ^χχ1Ιη~ jelölt 2B8-Mk-BTPA és H3?I»C-vel tisztított '°Y™M2£~BTPA kialakítására

* « φ .Sejtek

Az SB és HSB humán sejtvonaiakat az American Type Cuiture

Coll.eot ion-tol szereztük be, és 1.0% magzati, borjüszérumot tartalmazó RPMI~l£40~foen tenyésztettük. A CD2B-pozitív SB sejtvonal egy akut iímfoblaszt leukémiás beteg perifériás vér „fcuffy coat-jáböi. származó B-limfobiasztoid sejtvonal (1). A HSB antigén-negativ sejtvonal egy újszülött szíriéi hörcsögökben indukált tumorokból kifejlesztett T-limfoblasztoid sejtvonal (2j , Az egérféle SP2/2 mieloma seútvonalat hasonló módon 10% magzati borjúszérumot tartalmazó REMI -1.640-ben tartottuk, fenn.

Az bitestok

A B1 anéi-CDzCí antitesteket a Couiter Izmznology-éöl és a Len

1.6 anti-CD2ö antitesteket a Bocton/Dickinsontői vásároltuk,. A jelölt kecske anti-egér IgG—t és a kecske anti-humán IgG antitesteket az ICN-től. szereztük be. A kecske Bíab'jy anti-egér

IgG-t a Csepeltől szereztük be.

3, Reagensek

A Freund komplett és .inkomplett adjucánsf a Sigma Chemical Company-töl. vásároltuk. A pclietiién-glikol, HAT-koncéntrátum és a BT koncentrátum mindegyikét a Boehringer Mannhcimtöi szereztük be. Az indium-(111]-kioridot és a '^T-klorídot az Amershamtól vagy a NSN Duponttól szereztük be. Az ittrium-[891-kioridot az Aldrich Chemical Company--tói vásároltuk. Minden más reagenst szokásos forrásokból szereztünk be,

A konjugációs és radioaktív jelölési eljárásokhoz használt reagenseket feldolgoztuk, hogy eltávolítsuk a szennyező nehézfém-ionokat, melyek kompeticiőfea lépnek a radioizotőpokkal a ra-

dioaktiv jelzés alatt. A reagenseket jellemzően úgy dolgozzak fel, hogy az oldatokat egy Cneiex 100 ioncserélő gyantán {BioRad Industries) visszük keresztül vagy Cherem 100 hozzáadásával adagonként feldolgozzak egy preparált oldattá. billi-Q-vai tisztított vagy Mater fór Irrigation (éFlr) kis fémtartalmú vizet alkalmaztunk az összes készítménynél és oldatnál. A .féraxnentes oldatokat sterilre szűrtük, és steril műanyag tartályokban gyűjtöttük össze.

1. 2BB hlbrldóma feiűlúszők előállítása és szkrínelése R1Ayal

Tíz EALB/c egeret 20 millió, Freund féle komplett adjuvánst tartalmazó PBS-bs szuszpendált SB sejttel immunizáltunk. A sejteket szubkután és intraperitoneálisan is, az állat több helyére beoltottuk. Eqy kéthetes várakozási időszak után az egereket másodszor is beoltottuk Freund féle inkomplett adjuvánsban emuigeált SB sejtekkel. Az immunizálás után emlékeztető oltásokat adtunk be hetenkénti ütemezésben PBS-ben szuszpendált SB sejtekkel, Az egereket 6 hetes - 4 hónapos időszakon át immunizáltuk.

Időpontonként két állatot cervikális disziokáciovul fájdalommentesen megöltünk, és a lépőket eitávoiitottuk az SP2/0 egér mieiőmávai történő fúzió céljából. Az állatokat azon képességűk alapján választottuk ki, hogy a poszt-immunszérum hatásosan gátolta-e a radioaktívan jelölt Couiter 31 antí-Cu2O antitest kötődését az SB sejtekhez. Három nappal, mindegyik fúzió előtt a kiválasztott állatoknak egy utolsó intravénás (farokvénába történő} injekciót adtunk, mely 20 millió SB sejtet tartalmazott PBS-ben. A f áj da fonatén tes megölés után a lépőket fertőzésmentes «'.♦ * >

χ«* * χ « *«* ** ^:·Ι· körülmények között kivettük, és a iépsejteket SB2/0 sejtekkel fuzionáltuk 5:1 arányban {lépnejtek:SPz/0) . A fuzionált sejteket szövsttenyésztő tápközegben mostok, és HAT szelekciós tápközeget tartalmazó- 96 férőhelyes lemezekre osztottuk szét. A híbradomákat 10-14 nap múlva inhifcíciös radioimmunassay-vei szűrtük Coulter Bl antitestet alkalmazva.

Az -antí“CD2O antitestet szekretálő hibridek szűrését ismert radioimmnnassay módszerekkel hajtottuk végre. Röviden, Coulter

Bl anti~CD2O antitestet tisztítottunk Protein A affinitáskromatográfiával. ötven mikrogramm. tisztított antitestet kap·; 2 ^í; csoitunk ''I-hez rövid oxidációval lodobeads (Prerce Chemical

Cd-.) jelenlétében a gyártó eljárását követve. A radioaktivan jelölt antitestet szintetikus ámbts gyantán sömentesitettük, és hígítás! pufferben tároltuk (BBS, pH^::::?,4; mely tartalmaz 0,2% zseistint és 0,02% nátrium-azidot és 1,0% BSA-ij, A radioaktív jel 10 nanograrmjét helyeztük a korábban blokkolt szűrő assay lemez mindegyik mérőhelyére (blokkoló puffét;. 10% PBS-t tartalmazó higitési puffer) a teszt-mérőhelyekről származó 50 ul hlbridőma felüiűszók 50 μΐ-ével és 50 pl higitési pufferben szuszpendált 100 000 SB sejttel együtt. A szuszpenziöt egy órán át környezeti hőmérsékleten Ínkubáltuk. A lemezeket mosóporferre! (BBS, pH-7,4, raely 0,2% zselatint és 0,02% nátrium-azidot tartalmazottj erőteljesen mostuk egy VöB Scientiíic vákuum-elosztón, és a befogott SB sejteket tartalmazó filteraljakat egy garamaszámláloba tettük át. A csak HAT tápközeget és jelölt Bl antitestet tartalmazó mérőhelyeket használtuk háttérkontrollként és az azonos, SB sejteket tartalmazó mérőhelyeket alkalmaztuk pozitív kontrollként, A radioaktivan jelölt gátlás!

ÖO »».·.►♦«· «χχ ... X . ‘*· .**.

. » »*«♦ χ. Χί

X.. ... * ** · kontrollok a radioaktívon jelölt Bl-és a jelöletlen Bl különböző, 2 mg-tói 2 ng-ig- terjedő mennyiségét tartalmazták.

2. Áramlásom citometrías vizsgálatok a. Sejtvonalak

Előzetes áramiásos citometriás vizsgálatokat hajtottunk végre .288 hibrídöma tenyészetekből származó felülászökksl. A hibridóma felülűszo száz míkreliterét SB sejtekkel inkubáltuk egy órán át környezeti hőmérsékleten; egy második, l/4öö~ss hígításban használt antitestet {kecske P{ab')2 anti-egér IgG; Cappel) adtunk ezután hozzá, és az inkubálást 1 órán át sötétben folytattuk. A sejteket ötször mostuk. A kontrollók a következőkből álltak:

olyan sejtek (első és második antitestet nem), melyekből csak az autof 1 uo.ro szoen-ciát határoztuk meg, csak második antitest és sejtek a nem specifikus kötés meghatározására, és kereskedelemben hozzáférhető fiuoreszcein izotlocianát-konjugsit Bt ÍBI~ EITC) egy CD20 populációs kontroliként.

Néhány kísérletben a fluoreszceint tisztított 2B8 antitesthez kapcsoltuk az aminoosopertok fiuoreszceín-izotiooianáttsl (F1TC;

végzett reakciójával. Röviden, 2BS antitestet (1,2 rag/ml) inkubáltunk 9,ö-ös pH. értékű 0,1M nátrium-karbonát pof fórban, mely 150-zoö pg FITC/mg fehérjét tartalmazott. Az oldatot szobahőmérsékleten inkubáltuk 2 órán át, és a kapott 2B8-FITC konjugátumot egy Sephaőez G-25 oszlopon tisztítottuk. A. többi, ezekben a vizsgálatokban használt reagenst, mint például a Bi~t és a Len 16-t fluoreszoein konjugátumként közvetlenül a Coultertöl vagy a Becton Üiokinsontől vásároltuk meg.

Az analizálandó sejteket összegyűjtöttük, és háromszor 0,2% BSA-t és 0,1% nátrzum-azídot tartalmazó PBS-ben mostuk. Az életr:. /, νφ' *·*♦ *

XX képességet tripán-kékes kizárással határoztuk meg, az életképesség! követelmény >903 volt. A. sejtkoncentrációkat 3 mi!lió/mi~re állítottuk be mérőhelyenként 50 pl hozzáadásával a 96 mérőhelye» O-aijű lemezeken. Hozzáadtuk az első antitestet (50 ni) a megfelelő mérőhelyekre, és az elegyet 30 percen ···· 1 órán át környezeti hőmérsékleten inkubáltuk; ezt követően a sejteket ötször 200 μΐ/mérőhely 0,2% BSA-t és 0,02 % nátrium-azidot tartalmazó PBSben mostuk. A lemezekben lévé sejteket iecentrifugáitok 1300 nPM-mel 1 percen át egy Sorvall centrifugán, és a felülúszökat a lemezek óvatos „megpöcköiésévei eitávclitottuk. A szükséges esetekben második antitestet adtunk hozzá, és további 30 percen -1 órán át inkubáltuk környezeti hőmérsékleten, sötétben; majd a mérőhelyeket fenti siódon mostuk. Végül 200 μΐ rögzitőpui fért (0,15 M nátrium-klorid, mely 1% pa.raformaldehidet tartaimaz) adtunk mindegyik mintához, és a kezeit sejteket 12X75 mm-es csövekbe vittük át az elemzéshez,

b. ua re i makákö magnókból szárma ző teljes vér A plazma eltávolítása után a sejteket centrifugálással kétszer mostuk, és BBSS-ben újra szuszpendáltűk. Az ujraszuszpendáit sejtekhez magzati bor jászérumot (2mi) adtunk. Az ujraszuszpandáit sejtek száz mikroliterét ezután 6 darab 15 ml-es kúpos centrafugacsőbe szétosztottuk. Fluoreszcensen jeleit monckionáiis antitesteket adtunk hozzá a következőképpen;

1. cső: egérféle antÍ-CD2-FITC (AMAC) , 2,5 pg/ml; S pg;

2. Cső; kecske anti-hunmán IGM-F1TC (Fisher), 2,5 pg/ml; 5 pg;

3. Cső: kecske anti-egér IgG-RPE (Fisher), 2,5 mg/ml, 5 pg;

4. Cső: kecske anti-humán IgFí-FTTC t kecske snti-egér IgG-RPE ♦ φ (abszorbeált), 2,5 ug/ml, 5 μρ;

5. Cső; antí-hus:án CD2Q-FITC (anti-Leu .16, Secton Dickinson) , gg;

6. Cső: csak sejtek (autói.'iaoreszcencia)

A jelölt antitesteket és sejteket 2 percig 1500 rpm-néi centrifugáltuk, hogy összekeverjük a sejteket és az antitesteket, és ezután mind a. hat mintát jégre tettük, és 30 percen át inkubáituk, Szt követően a csöveket kivettük, a jégről, és li.zis puffért (37°C-ra előmelegítve) adtunk hozzá 12 ml mennyiségben, A mintákat ezt követően 1.5 percen át szobahőmérsékleten inkubáituk, 5 percen át 4°C-on 1.500 rpm-mel centrifugáltuk, és a feiülűszőkat eltávolítóttűk. A sejtpelleteket ezután jelölőpufferben (1% BSA-t és 0,05% nátrium-azidot tartalmazó

PBS; kétszer mostuk.

Ezt követően a sejteket csövenként Ό., paraformaidehídet tartalmazó 0,15 M nátrium-korid, ráadásával rögzítettük, és Becton Dickinson FACScsn elemeztük .autó kompenzációt és Calibrite gyöngyökkel kalibrálást alkalmazva. A. f luoreszceinböl származó zöld reszcenoiát ELI. módban mértük, és a fikoeritrínből rös fluoreszcenciát EL2 módban mértük. Az adatokat alakban fejeztük ki. Először az életképes limroeita azonosítottuk menetirány versus jobb biot · ml rőgzitöpuffér (15 pH-7,4} hoz™ készüléken történő előf !uo~ származó völogaritmikus populációkat szöget bezáró fényszórással bittérképen. Ezután a. teljes az összes egyéb eset kizárásával, mérések csak azokra a specifikus melyek a körülhatárolt területen egy pontsor ábrázolásé (dót 1 í m.f ο c i t a pop u 1 á c i őt izolál t u k

Az ezt követő fluoreszcencia eseményekre világítottak rá, belül történtek meg.

φ«(ί »**

A nagy dözisos farmakolögiat/tomlkológiai tanulmányokhoz az elővizsgáiati Iimfocita mennyiségeket minden egyes jávai makákő majomnál meghatároztak, és alapértékként felhasználtak.

A T- és B-sejtek. százalékát és a T:B arányokat kiszámoltok, és kimeritési referenciákként használtak, Az elővizsgáiati 3~ sejt populációt Leulő-fcal és anti-humán IgM antitestekkel számoltak.

'Miután a majmokba 2B8~t oltottunk be, amikor a CD20 antigén zBií-cal telítődött., a B-sejtek százalékát a teljes populációban kecske anti-humán IgM-FTTC-ei, anti-egér IgG-RkF-t és ezt a két markért tartalmazó kétszeresen festcdő populációt alkalmazva becsültük meg. A kétszeresen festődö populációt alkalmaztuk a mennyiségi meghatározáshoz addig, amíg az összes 2B8 ki nem tisztáit az állatok perifériás véréből. A T-sejtek százalékát a teljes iimfocita populációban anti-CDz-FiTC-et alkalmazva becsültök meg. Az adatokat három, minden mintánál 10 000 esetet tartalmazó mérésbői átlagoltuk. A megjelelt vérminták mindegyikéből a sejteket ezután értékeltük, kiszámolva a T~ és B-sejt szabpopulácíőt a teljes iimfocita populáción belül. Szintén megvizsgáltuk a T;3 arányokat, A B-sejtek kimerülését a B-sejtek eredeti B-sejt mennyiségéhez viszonyított százalékos csökkenéseként számoltak kí mindegyik majomnál,

3. Radioaktív jódozás és a CD20_ ímmunprecipótáblája Százmillió SB sejtet két egyenlő részre osztottunk a ^iz;5T-vel és lodoheaő-dal (Piarcé Chemical Co,) történő felszíni jódozás arán, A sejteket centrifugáiással többször mostak, amíg a rádióaktivitás mértéke a feiülászőban vissza nem. állt a háttér értékre. 100 mikrogrsmm 2BS vagy B1 (Coalter Immunoíogy) antitestet

adtunk a jelölt B-sejtek két mintájának egyikéhez. Az antitesteket és az SS sejteket egy éjszakán át Ínkubáltuk, majd háromszor centrifugálissal mostak, míg az összes nem kötött antitestet ez nem távciítottuk. A kötött 2B8-t és Bl-t tartalmazó sejtpeizeteket ezután zlzáztnk., és 1% NP40 detergensi tartalmazó 0,1 M Trís-HCl (pH-8,0; hozzáadásával extraháituk, majd. szobahőmérsékleten í órán át Ínkubáltuk, Az extraktumot egy mikrofagában nagy sebességnél centrifugáltuk 30 percen át, és a fezuzászökat üj csövekbe tettük át. Mindegyik csőbe Protein ASepharose-t (300 μΐ) adtunk, és a gyantát centrifuoálással pelletizáituk. A protein-A-Sepharose-t szakán 20-szor mostuk, hogy eltávolítsák a nem specifikusan kötődött jódozott fehérjét. Amikor a gyöngy-feiülusző .radioaktivitás! arány elérte a 100-as értéket, a pelletel SDS PAGE mintapufforral kivontuk, és forrásig hevítettük, Miután iehütöttuk, mindegyik extraktum hozzávetőleg 15 000 cpm-jét adtuk egy 10 %-os poliakrilamid gél mérőhelyeire. Sgy kis mozekaiatömegü elöíestett standardot (BioRaá Inc.) adtunk egy közön mérőhelyre, és ezt használtak a molekulatömeg megbecslésére. A fehérjéket ezektroferezesse! feloldottuk, és a gézt szárítottuk és egy röngenfilm lapra exponáltuk 24 órán át -70'°C-on; ezt követően a filmet előhívtuk és kielemeztük»

4. A 2B8 kötés Scatchard analízise

A tisztított 2B3~t Scatchard analízissel látszólagos affinitásra értékeltük ki. Radioaktívon jelölt 2E8-t állítottunk elő

eltávolítását követően a radioaktívan jelölt antitestet különböző, 5000 ng/méröhely-tői 35 ng/méröheiyig terjedő koncentrációkban ínkubáltuk két példányban 10 000 S'B sejttel. A sejtekhez: kö~ »Η* * * ·»

tüdő antitest mennyiségét a -vei jelölt 2S8 specifikus aktivitásból számoltuk ki, A kötött/szabad antitest arányát a kötött antitest moláris koncentráció javai szemben .ábrázoltuk, és a látszólagos affinitást állandót az X és Y tengeiymetszetek .arányából számoltuk ki.

5. 2B8-MX BTPA előállítása a, Az fff-FTFA .forrása

Bizonyos preklinikai vizsgálatokhoz a 14-es szénnel jelölt 1izotiocisnáto-benzll-o-metil-áieíilén-trismin-pentaecetsavat (MX-DTPA) szárított szilárd anyagként a National Instítute of Höalth-ből, Ottó Gansowtói szereztük be, és szárított állapotban 4’C~on tároltuk fénytől védve. A kelét törzsoldatait Mílni-Q vízben állítottuk elő, és a. koncentrációt a radioaktivitás mérésével és a vegyület specifikus aktivitását alkalmazva határoztuk meg. A. törzsoldatok általában 2-5 mM koncentráciőjűak voltak, és ~7<P'€~on polipropilén csövekben tároltuk. Más vizsgálatokban, MX-DTPA-t dinátrium-sóként a Coulter Immunol.ogytól szereztük be, és -fO^C-on tároltuk.

ο......Fémmentes körülmények _fenn tartása

Fémmentes reagensek alkalmazása mellett a reagensekkel végzett összes munkát úgy hajtottuk végre, hogy minimalizáljuk a fémszennyeződés lehetőségét. Amikor lehetséges, polipropilén műanyag tartályokat, mint például lombikokat, főzőpoharakat és mérőhengereket alkalmaztunk. Ezeket Aioonox-szal mostuk, és alaposan kiöblítettük Milii-Q vízzel a használat előtt. Továbbá lommentes pipettabegyeköt (BicEad; használtunk a kis mennyiségek pontos kezelésére, A reagensek nagyobb mennyiségeinek kimérésére műanyag szerolőgisi pipettákat (1-25 ml-es méretekben szerezhető be) alkalmaztunk. A reakciókat kényelmesen csavaros tetejű polipropilén mikrofuga csövekben (Sardtedt Industries; 1,5 ml befogadőképessség? vagy polipropilén kúpos csövekben íCostar? 15 ml és 50 μ.1 > hajtottuk végre.

egyszer használatos sebészeti

Müii-Q vízzel leöblítettünk.

c. Antitest előállítása

A 2B8 egérféle antí-CD20 tiszti toltuk Protein A-val és kísérletekhez a 2B8-t üreoes s

Amikor dialízisesével dolgoztunk, kesztyűt viseltünk, melyet előtte antitestet először aszciteszbei

QAE kromatográfiával. A későbbi zái bioreaktor felül úszókból· tisztítottuk ugyanezt a tisztítási eljárást alkalmazva. Az üregesszál eredetű antiestet a kereskedelmi forgalomba hozatal céljából a 2, példában leirt CKO-eredetű antitesttel helyettesítettük. Az antitestet a konjugációhoz úgy készítettük elő, hogy dialízist vagy többszöri puffercserét alkalmazva fémmentes, 5Q mM bicin-NAOtí-ba vittük át (ρΗ^:::8,6) , mely 150 mM úaCi-t tartalmazott, Bizonyos vizsgálatokban a puffercserét Centricon 30 (Amicou) spin. filtereken <30 000 D MWCO) végzett ismételt ultraszűrés alkalmazásával hajtottuk végre. Általában 50-2000 μΐ fehérjét (lö mg/ml? adtunk a szűrőegységhez, és 2 ml bicinpuffert adtunk hozzá. A szűrőt 4⁰c~on centrifugáltuk egy Sorval SS-34 rotorban 6 000 rpm-nél 45 percig. A retenciös mennyiség hozzávetőleg 50-100 μ.1 volt. Ezt az eljárást kétszer megismételtük ugyanazzal a szűrővel. A retentátumot egy 1,5 ml-es polipropilén csavaros tetejű csőbe tettük, a fehérjére mértük, 10,0 mg/ml koncentrációig hígítottuk, és 4°C-on tároltuk amíg a centrifugaIáshoz nem használtuk fel. Bizonyos vizsgálatokban a fehérjét 50 md nátrium-nitrátba (pü-5,5) vittük át, mel.v 150 m NaCl.....t és ··% :4. ;ι$ <

0,05% nátrium-azidot tartalmazott, a fentebb leírt eljárást alkaImazva.

d. Kon7agáclős eljárás

A 288 MX-ölPA-val történő konjugációját polipropilén csövekben hajtottak végre környezeti hőmérsékleten. Az HX-DTRA fagyasztott tőrzsoldataít közvetlenül a felhasználás előtt olvasztottuk fel, Jellemzően 50-200 ui, 10 mg/ml antitestet reagáitattunk a keláttal 4:1 kelét:fehérje mőlsrányban. A reakciókat a kelét-torzsóidat hozzáadásával és élénk keveréssel Indítottuk be; hagytuk, hogy a konjugáció egy éjszakán át folytatódjék; általában 14-20 órán át, környezeti hőmérsékleten, A nem reagált keiátot dialízissel vagy ismételt ultraszűréssel eitávoütottuk s konjugatumbói a fent leírt módon, 0,05% nátrium-azíöot tartalmazó fémmentes normái sőoldatha (0,05%). A fehérjekcncentrácíot 10 mg/mi-re állítottuk be, és 4 'C-on egy polipropilén csőben tároltuk.

e. A kelátbeépülés S;og;hatá rozása

A kelátbeépüiést szcintilláciös számlálással és a tisztított konjugátummal kapott értéket a szén-/14j-jelölt kelét, specifikus aktivitásával összehasonlítva határoztuk meg. A későbbi vizsgálatokhoz, melyekben a Couiter iízmnnoiogytől kapott nemradioaktív keiátot alkalmaztunk, a kelátbeépüiést ügy határoztuk meg, hogy a konjugáfumot a 'Ύ ismert koncentrációjú és specifikus aktivitású radioaktív hordozó oldalának feleslegével inkubáituk,

Röviden, egy ismert koncentrációjú íttríum-klorid törzsoldatot készítettünk fémmentes 0,05 M HCi-ben, melyhez hordozőmentes ^Ύ-t (klorid-sö) adtunk. Ennek az oldatnak az aiikvot ját φ»«* χ * * # λ » Λ.

*** «*« « * _{Λφχ Λ}* _Μ„ „* ♦ ·*«« Μ ♦ folyadékszcintilláczös számlálással analizáltuk,· hogy meghatározzuk a reagens pontos specifikus aktivitását. Az rttriumkloríd reagens egy olyan mennyiségét, mely egyenlő a várhatóan az antitesthez kapcsolódó kefétek móiszamának háromszorosával, jellemzően 2 moi/moi antitestet tettünk egy polipropilén csőbe, és a pH.-t 4,0-4,5-re állítottuk be 2 M nátrium-aeetáttal. Ezután .kongugáit antitestet adtunk hozzá, és az elegyet 15-30 percre környezeti hőmérsékleten inkubáltuk. A reakciót 20 EDTA r ταΜ végső koncentrációban való hozzáadásával állítottuk le, és az oldat pH-ját hozzávetőleg 6-ra állítottuk he 2M nátriumacetáttal.

ötperces inkubálás után a teljes térfogatot nagyteljesítményű méret kizárásos kromatográfiával tisztítottuk a lentebb leírt ivódon. Az eloszt fehérje-tartalmü frakciókat egyesítettük, a fehér jekoneentráciőt meghatároztuk, és egy alikvotot raöloaktiviö ÍV hasra mértünk. Λ keiátbeépüiést a 'Y-kész ítmény specifikus aktivitását és a fehérjekonoentráciőt alkalmazva határoztuk meg,

b. -- löd-ük-D TFA immun.reaktívitása

A konjugáit 2Be immunreaktIvitását teljes sejtes ELISA-t alkalmazva mértük, Tenyészetbői közepes Iog-fázisú SB sejteket gyűjtöttünk össze centri.fugálással, és kétszer 1 X HSSS-ben mostuk. A sejteket 1-2 X 10^v sej t/ml-re hígítottuk HBSS-ben., és 96 férőhelyes míkrotitráió lemezekbe szétosztottuk 50 000 -100 000 sejt/méröhely koncentráclóban. A lemezeket vákuum alatt 2 órán át szárítottuk 40-45°C-on, hogy a sejteket a műanyaghoz rögzítsük. A lemezeket -20^vC-on szárazon tartottuk a felhasználásig, A méréshez a lemezeket környezeti hőmérsékletre felmelegítettük közvetlenül a felhasználás előtt, maid 1% BSA~t tartalmazó IX

« φ

PBS-sel <ρΗ~7,2-7,4) blokkoltuk (2 őrs). A mintákat az mérőeljáráshoz 1 X BBSZlh BSA-ban hígítottuk, a lemezekre felvittük és ugyanabban a puffezben sorazathigitásokat hajtottunk végre (1:2). Mintán a lemezeket 1 órán át környezeti hőmérsékleten

Inkubáltuk, a lemezeket háromszor 1 X PBS-sel mostuk. A mérőhelyekre második antitestet (kecske antí-egér IgGl-specifíkus BRRkonjugátum) (50 μΐ) adtunk (1:1500-as hígítás IX PBS/1% Bonban), és 1 órán át környezeti hőmérsékleten inkubáltuk- A lemezeket négyszer 1 X PBS-sel mostuk, majd ABTS szubsztrátoldatot (50 mM nátrium-oitrát, pH=4,5, mely 0,01% ATBS-t és 0,001% HdSm-t tartalmazott) adtunk hozzá. A lemezeket 405 n.m-en olvastuk le

15-30 perces inkubálás után. Az assay-k antigén-negativ HS.B sejteket tartalmaztak a nem specifikus kötés nyomon követésére. A konjugátum ímBunreaktívitását az abszo-rbanciaértékeket a megfelelő higítási faktorral szemben ábrázolva számoltuk ki, és összehasonlítottuk az ugyanazon a lemezen tesztelt natív antitestet alkalmazva kapott értékekkel (ezek a lööt-os immunreaktivitást képviselik) . .A trfrálási görbe lineáris részén több értéket összehasonlítottunk., és kiszámoltuk az átlagot.

g......A natív 256 és a zSR-MX-öTRá la ültre stabil!tára

Az antitest és a konjugátum stabilitásának ehhez a Íz-hetes méréséhez a 2B8 antitest, és a 2B8-MX-BTPA alikvotjait normál sóoldatban vagy 10 mM glicin-BCl-t (pB~6,8j tartalmazó normái sóoldatban készítettük el, A mintasorozatok két példányát 4“C-on és 30^cC-on inkubáltuk, és a mintákat hetente mértük a következő módszereket alkalmazva: SQS-PAGS (redukáló és nem redukáló is) , ímmunraektívitás teljes-sejt immaroassay-vel, melyhez befogóként SB (antigén-pozitív) vagy HSB (antigén-negativ) sejteket hasz* φ néltunk, és izoelektromos fókuszáló géi-elektroforázis (pH érték tartomány: 3-10?. Továbbá a konjogátua radioaktív jelölési haté<j p konyságát is mértük a ü, 8., és 12. héten a konjugátum ''2-nal történő radioaktív jelölésével, és a termék SDS-PAGS-n végzett analízisével és autoradiográflés elemzéssel. Végül egy külön vizsgálatban a 2B8-MX-DTPA aükvot jait, melyeket 4°C-on és 30Üon inknbáltuk lö héten át, ^£iiln-sel radioaktívan jelöltük, és egy biológiai megoszlási vizsgálatban BALB/c egerekben kiértékeltük a lentebb ismertetett módon.

h. lom u n ó ü deliem:. vizsga latok

Az IMPATH Laboratoríes-szei immonhisztológiai vizsgálatokat hajtottunk végre mind a natív mind a konjógáit (2B8-MX-DTPA? antitestekkel acetonnsl rögzített humán szövetmetszeteket alkalmazva. Az antitesteket üreges szál bioreaktor feiülúszőkből tisztítottuk protein A-n és Q Sepharo.se-n végzett kromatográfiávai. Klinikai minőségű konjugatumot állítottunk elő a Couiter Immunoiogy~töl származó MX-DTPA-t alkalmazva, a fentebb leírt eljárásnak megfelelően.

ü...............A________radioaktívan j. elolt______2B6 -Aü-öTPA in vlfro immunreaktivitása

Bizonyos kísérletekhez teljes-sejt ELISA eljárást alkalmaztunk a jelöletlen 2B8-MX~DTPA~nái. A későbbi kísér letekben a

Uí

In-nel és 'ü'-nal jelölt konjugátumok (mindegyiket az IDEG

Bharmaceutieals-nál vagy alternatív lehetőségként a:

ΜΒΣ

Bharmaoy Services, Inc.-néi készítették? immunreaktivítását Id.ncmo által leírt teljes-sejt kötési mérőéi járás 13? módosított változatát használva határoztuk meg. Röviden, növekvő koncentrációkban középső log-fázísá antigén-pozitiv SS sejteket vagy an»»*« ψ tigén-negatív BSS sejteket (20-30· xlO sejt/ml hígítás.!, puffénben (ABS (pB^;“7,4), mely 1% 3SA~t 0,1% zselatint és 0,02% nátrinm-azidet tartalmas)1 adtunk két példányban a csövek sorozatába. A radíoaktivan jelölt konjugátum ot 1-5 ng/ml végső antitestkoncentrációra. hígítottuk hígitási pufferrel, és 0,35 ml-t adtunk mindegyik csőbe. 75-90· perces inkuhálási idd után környezeti hőmérsékleten a sejteket centrifugáiással peiletizáltuk, és a feiulűszét Összegyűjtöttük. A felüiúszé frakcióban megmaradó radioaktivitást egy gammaszámlálöval vagy egy szeletíllációs számlálóval határoztuk meg. Az adatokat a teljes hozzáadott radioaktivitás osztva a sejthez kapcsolt radioaktivitás hányadosként ábrázoltuk a sejtszám/cső recíprokával szeriben. Az y tengely reetszete igy az immunreaktív frakciót képviseli.

j. A radlcak11 van_ jeΪölf zód-15/-.0TffA in vitro stabIli fása a humán s zérumban

A in- és i - jeléit 2B8-HX-DTPA in vit.ro stabilitását úgy határoztuk meg, hogy humán szérumban inkubáltuk 37'X-on 96 órán át. Konjugált antitestet állítottunk ele, és ^!''In-nei t,,mix~s~ shoot eljárással) vagy a fent leírt módon ⁹'Ύ-·ηη1 radíoaktivan •1 1 1 Qp.

jelöltük. A .....in és ''Y~ jelölt konjugátumok koncentrációja 2,5 illetőleg 14,6 mCi/mg volt; a radioaktívan jelölt konjugatumokat 75 mg/mi. humán szérumalbumint (HSA) és 1 mM. DTPA-t (ittriumjelölt konjugátum) tartalmazó pufterhe vagy 50 mg/ml HSA-t tartalmazó puf terhe fIndiámmal, j elölt konjugátum:} szuszpendáituk. A radíoaktivan jelölt konjugátumokat 1:10 arányban hígítottak normái humán szérummal (nem höinafctívéit}, és alíkvotokat helyeztünk fertözésmentes körülmények között steril zárható csövekbe; ezeket a csöveket, ezután 37°C~on inkubáltuk xrazímum 96 óráig s?

ÖÖ **** *«*Φ Λ * * Φ' A φ V “** *** * Φ ΦΦ* *>

ΦΦΦ * φ./ ^β*ί* _φΦ ^Α tartó időtartamig, A kiválasztott időpontokban a mintákat kivettük, és nem redukáló SDS-PAGE-vel 4-20%-os gradiens géleken analizáltak, melyet autoradiográfia és instant vékonyréteg kromatográfia követett.

b. A ilinüaliag formulázott '^:'^<J'In-2B8~fói~fTPA in vitro szabi fi írása

A 2B8-MX-DTPA konjugátumot ~'^:Ιη~ηο1 radioaktivan jelöltük, és HFLC tisztítás nélkül alkalmaztuk, („mix-and shoot eljárás).

A radioaktivan jelölt antitestet PBS-ben hígítottuk, és humán szérnmalbumint (HSA) adtunk hozzá 50 mg/ml végső koncentrációban. A formai ázott radioaktivan jelölt konjugátum specifikus aktivitása 2,2: mCí/mg volt. A formulázott konjugátumot ezt követően 4°C~on ínkubáltuk 48 órán át, és az alikvo tokát a ö., 24,,

48. órában elemeztük nem-redukáló· SDS-PAGS-fc alkalmazva 4~20%~os gradiens géleken, majd auforsáiográfiával, és instant vékonyréteg kromatográfIával. Az ímmunraaktivitást mindegyik időpontban teljes-sejt szuszpenziős assay-t alkalmazva mértük az 1. fejezetben fentebb leírt módon.

I, Λ kiinikailag fvrmvlszcítt ¹ fn-2.B8-fíZ-DTPA in vitro stabil í fása

A rüS-BX-öTPA konjugátumot ^Y-nal radioaktivan jelöltük, és méretkizárásos kromatográfiával üPfC-n tisztítottuk IX PBS-t alkalmazva elúciős pufférként. A radioaktivan jelölt konjugátumfrakciókat összegyűjtöttük, és humán szérumalbumint (HSA) és DXPA-t adtunk hozzá 75 mg/ml illetőleg 1 mM végső koncentrációban. A formulázott radioaktivan jelölt konjugátum specifikus aktivitása 14,6 mCí/mg volt. A formulázott konjugátumot ezt követően 4“C-on Ínkubáltuk 48 órán át, és az alikvotokat a Cm, 24.,

0

48. órában elemeztük nem-redukálő SDS-PAGS~t alkalmazva 4-2Oi-os gradiens géleken, majd aatoradiográf .iával, és Instant vékonyréteg kromatográfiával. Az ímmunreaktivitást mindegyik időpontban teljes-sejt szuszpenziós as.s-.ay-t alkalmazva mértük az 1. fejezetben fentebb leírt módon,

2. Állatokon végzett vizsgálatok ar Főemlős nagy dórisós farmakológla1/toxikológiai vizsgálat zff # -1 a 1 i a l m a z va

A 2B8- antitestet egy nagydózisú farmekológiaí vizsgálatban értékeltük ki a GLP szabályzásnak megfelelően a bűzte Sanos Research Centernél (Vizsgálati szám:: 920111) . Felnőtt Maosca fascicazs.ris (javai makákó) majmokat használtunk; mindegyik vizsgálati csoport egy nőstényből és egy hímből állt. Antitestet adtunk be intravénás injekcióval 42 óránként, összesen hét injekciót, A vizsgálatban öt csoport vo.lt: I. csoport ísőoldat) ; II: csoport (0,6 mg/kg); Ili. csoport (2,5 mg/kg); IV. csoport (10 mg/kg); és V. csoport (10 mg/kg csak a 0. napon),

A vizsgálat megkezdése előtt vért vettünk mind a 10 állattól, és arra használtuk fel, hogy meghatározzuk a reagens-háttereket és a kezdeti B-sejfc populációkat, Az összes ez utáni vérmintát mindegyik antitest-injekciót megelőzően vettük le, A 111. és IV, csoportot a 13. napon a teljes boncolás és hisztopacológia előtt fájdalommentesen megöltük.

Az 1, II. és V, csoport állataitól a 0,, I., 3,, 7., 13,,

21., 37, és 52. napon vért vettünk, és hozzávetőleg 5 ml teljes vért vettünk le a heparinnal. kezeit csövekbe, A teljes vért Vo-on tároltuk, és 24 órán belül analizáltuk. Mindegyik állat vérét 2000 rpm-néi 5 percen át centrifugáltuk, és a felülászö *

plazmát a RTA-vai végzett szérum 23S szintek mérőét járásához kivettük (lásd a. ETA eljárást a specifikus assay módszereknél> . A. PBL-eket és EBC-ket tartalmazó pelletizált anyagot FCS-ben újra szuszpendáltuk a FACS analízishez.

b. raxmafeoklnetlkal vizsgálatok, a 2Ββ-oal és a 2 Bá -Mr -A TPA var

A 238 átlagos szérum béta féléletidejét javai makákö majmokban határoztuk meg az V. csoport állatait (fentebb) használva. Kecske anti-egér TgGl-t (Fisher Soientlflo) hígítottunk 2,0 ng/ml koncentrációra 10 mM boráé-pnftőrben (pH-9,6), és 50 μΙ-t adtunk egy 96 férőhelyes lemez mindegyik férőhelyére. Hagytuk, hogy az antitest a lemezhez kötődjön egy éjszakás 4°C-on történő inkubálássai, vagy 2 órán át környezeti hőmérsékleten történő inkubálássai. Mindegyik lemezt blokkoltuk 30 percen át környezeti hőmérsékleten ISO μϊ/férőhely, 1% BSA~t tartalmazó PBSsel, A lemezeket desztillált vízzel mostuk, ás a szérum- vagy piazmamlntákat három, példányban vittük fel külön-külön mérőhelyre 1:100 kezdeti hígításnál, melyet 1:2 serozathigatás követett. Tiszt Írott 238-t adtunk az eiövérvételí szérumhoz, és standard görbeként való alkalma záshoz hígítottuk 0,5 mg/ml-rel kezdve; a mintákat 1:100 arányban hígítottuk, majd sorozathigitusokat hajtottunk végre úgy, mint a többi mintánál. A lemezeket 1 órán át mkubáltuk környezeti hőmérsékleten, és négyszer mostuk desztillált vízzel. A második reagenst (kecske antí-eger IgGl-KRPO) ezután 1:400-as hígításban adtuk hozzá, és környezeti hőmérsékleten inkubáituk további egy órán ár. A lemezeket újra mostuk desztillált vízben, és 0,1 mi, hidrogén-peroxidot tartalmazó peroxidáz-szubsztrátot adtunk hozzá. Hagytuk, hogy a * ο* >

szín kialakuljon a reakciótól számított 20 percig; az abszorbanoiát ezután 405 njs-en meghatároztuk egy mikroiemez ELISA leolvasót használva. Az eredményeket ,μο antrtest/mi szérum értékként ábrázoltuk.

Továbbá meghatároztuk a 2B8 és a 2B8-MX-DTPA β ti értékeit SALB/o egerekben. A nem konjugált 2B-8-t -70°C-on 1 X BBS (pB-7,4)/glicerinben lefagyasztottuk, 0,5 mg/mi-re hígítottuk, és sterilre szűrtük. Konjugált antitestet készítettünk szokásos eljárási módokat követve, de szén-[14'j-jeléit keláttai; a kelátbeépülés 1,5 mól /mól. antitest volt. A tisztított kenj'ugátumot. 0,5 mg/mi-re hígítottuk normái sőoldatban (0,9%), sterilre szúrtuk, és 4^aC-on tároltuk a natív antitesttel a felhasználásig.

Hat-nyolc hetes egereket oltottunk be 100 μΐ tisztított 288 antitesttel 250 μο/mi koncentrációnál. Az egerektől ezután szemüreg mögötti punkciósai vért vettünk különböző, 0-264 óra közé eső időpontokban, és a szérumaikat natív és konjugált 2B8 antitest jelenlétére elemeztük teljes sejt enzim-immunoassay-vei, befogóként SB antigén-pozitiv B-seútvonalat alkalmazva. A kapott adatokat a 2B8 vagy 2B8-MX-DTBA koncentrációjaként ábrázoltuk az idő függvényében; ezekből az eredményekből egy lineáris regressziós görbét hoztunk létre, és a meredekséget használtuk a P ti értékek meghatározására.

o. A /89/-Y-2BS-XX-ο2TA farmakolőglai/coxikologlal visagáIata javai makáló majmokban

Ittríam-[89]~t hordozó 2B8-MX-DTBA-t állítottunk elő a ⁹⁰Y beépítésére leért eljárást alkalmazva, kivéve, hogy HPLC tisztítást ne® alkalmaztunk. A nem radioaktív, fémet hordozó **♦' ♦ ««* « #4» «« * « Φ * 9 >

****** « «· «·«* «,χ

...’»«♦· *ί· konjugátumot 1 χ BBS-ben formuláztuk, ami 75 mg/ml HSA-t és 1 mik DTPA-t tartalmazott, és 920611 számú GLP vizsgálatban értékeltük ki a bhite Sanda Research Center-néi. Egy hím és agy nőstény majmot tartalmazott mind a négy csoport. Az állatok Intravénás injekciót kaptak 48 óránként, összesen 7 injekciót, a következő gyógyszer mennyiségekkel: I. csoport - söoldat, II. csoport - 0,003 mg/kg; III; csoport - 0,03 mg/kg; és IV. csoport - 0,3 mg/kg. Az áraitokat a vizsgálat alatt kiértékeltük, meghatározva a testtömegeket és a hőmérsékleteket, a táplálékén a vízfogyasztást, kiválasztást, szérumkémiai elemzést, hematológiai, vizelet analízist, és fizikai vizsgálatokat. Az 1-1V, csoportok állataitól az infúzió előtt a 0, , 2., 7., 10. és 14. napon vért vettünk, és a keringő B-sejtek mennyiségére analizáltuk FACS Analízissel.

d, A radioaktívat jelelt 2B3-MX-DTPA blolópíai ®eposz2ása

Sgy elővizsgálatban a In-nel jelölt 2P8-MX-DTPA-t a szöveti eloszlásra értékeltük ki 6-8 hetes BALP/C egerekben. A. radioaktívan jelölt fconjacátárnokát a klinikai minőségű 2B8-MX-DTPAt alkalmazva állítottuk elő a fentebb ismertetett „míx-andshoot eljárást alkalmazva, A konjugátum specifikus aktivitása 2,3 mü/mg volt, és a konjugátümot 50 mg/ml HSA-t tartalmazó PBS-ben ípH-7,4} formuláztuk. AZ egereknek intravénás injekcióval 100 μί ‘In-jelölt 2B8-MX-DTPA-t (hozzávetőleg 21 mCi; adtunk be, és a három egérből álló csoportokat cervikáiis dlszlokácidval fájdalommentesen megöltük a 0., 24., 48. és 72. órában. Miután megöltük Őket, a farkat, szivet, tüdőket, májat, vesét, Iépet, izmot és combcsontot kivettük, mostuk, lemértük; és vérmintát is vettünk az elemzéshez. Mindegyik mintához kap>;·*«* # csol.ódő radioaktivitást gamma-számlái ássál meghatároztuk, és ezután a beadott dőzis/gramm szövet százalékot meghatároztak. Nem tettünk .kísérletet arra, hogy a különböző szervekkel járd vér által hordozott aktivitásmegoszlást ne vegyük számításba. Sgy külön eljárásban a 2B8-MX-DTPA alikvotiáit. inkubáltuk 4°Con, és SChC-on 10 héten át radloaktivan jeleltük ‘‘‘In-ael 2,1 mCi/mg specifikus aktivitásig mindegyik készítménynél. Ezeket a konjugátumokat ezután egerekben végzett biológiai eloszlási, vizsgálatokban használtuk fel a fentebb leírt módon.

A dozimefcriás meghatározásokhoz a 2B8-MX~DTPA~t ‘“In-nel radioaktívat jelöltük 2,3 mCi/mg specifikus aktivitásig, és hozzávetőleg .1,1 pCi-t injektáltunk mind a 2ü EALB/c egérbe. Ezután öt egérből álló csoportok mindegyikét az 1., 24., 40. és 72. érában fájdalommentesen megöltük, és a szerveiket kivettük, és az elemzéshez kipreparáltufe. Továbbá bőr-, izom- és csentdarabokát vettünk ki, és dolgoztunk fel az elemzéshez; vizeletet és ürüléket is gyűjtöttünk, és a 24-72 órás időpontokban elemeztük.

Hasonló módszert alkalmazva a 2B8-XX-BTPA~t szintén ''X-nai radloaktivan jelöltük, és a biológiai megoszlását BALB/c egerekben kiértékeltük egy 72 órás időszakon át, A HPLC méret kizárásos kromatográíiával végzett tisztítás után négy, öt egérből álló csoportnak intravénás injekcióban hozzávetőleg 1 μ£ί klinika ilag formuláit konjugátumot (specifikus aktivitás: 12,2 mCi/mg) adtunk be, a csoportokat ezután az 1,, 24., 48. és 72. órában fájdalommentesen megöltük, és a szerveiket és szöveteiket a fentebb leirt módon kielemeztük. Mindegyik szövetmintához kapcsolódó radioaktivitást meghatároztuk a fékezéséi sugárzási * * K'*·?'. <! .. Λ * * * **Κ « χ φ *θΐ *χ “f* .. * energiát egy gamma szeretillá-ciós számlálóval. Az aktivitási értékeket ezután beadott tíőzis/gramm szövet százalékéként vagy beadott, dőzis/szerv százalékként fejeztük ki, Míg a szerveket.

és más szöveteket többször átöblltettük a felületi vér eltávolítására, a. szerveket nem áramoltattuk át. Tehát a szerv aktivitási értékekből nem vontuk le a belsőleg kapcsolódó vér által képviselt aktivitási szennyeződést.

e. Az ^{; J 4} in -? el ölt 238-MX-DT8Á tumorz oka1izáclója.

A radioaktivan jelölt 28S-MXDTPA lokalizációját Ramos B-sejt tumorokat hordozó tífusz nélküli egerekben határoztuk meg. Hatnyolc hetes tífusz nélküli egerekbe szubkután injekcióval (jobb hátsó herpesz; 0,1 ml, 1,2 X I0‘ Rumos tűmőrsejtét tartalmazó RFMI-1640-t adtunk be, mely tumorsejteket előzőleg timosz nélküli egerekben való növekedésre adaptáltuk. Tumorok keletkeztek két héten belül, és a tömegük 0,()7-1,1 gramm közötti volt. AZ egereknek intravénásán .100 pl ‘In-jelölt 288-MX~DTPA-t (16,7 műi) adtunk be, és- a három egérből álló csoportokat cervikálís diszlokáciöval fájdalommentesen megöltük a 0,, 24., 48. és 72. órában. Mintán megöltük, a farkat, szivet, tüdőket, májat, vesét, Lépőt, izmot, combcsontot és a tumort kivettük, mostuk, lemértük, és egy vérmintát is vettünk az elemzéshez. Gammaszámlálással meghatároztuk mindegyik mintához kapcsolt radioaktivitást., és a százalék beinjekáit dőzis/grarara szövet értéket meghatároztuk.

3. Soríraetriás számítások

A ^A“In-neI vagy ^J''Y-n.al jeléit 2B8-MX-DTPA-vai injekciózott BALS/c egereket alkalmazva kapott biológiai megoszlási adatok (1-4. és 5-S.. táblázat) felhasználásával a Medinai Internál

Ί·

Eadiation Dose (MÍRD) Committee of the Society of Muciear Medíclne áltól kialakított módszert alkalmazva kiszámoltuk egy 70 kg-os betegnek beadott 1,0 mCi dózisból abszorbeált sugárzási dózis becsült: értékeket. A radioaktíven jelölt konjugátumok biológiai íéleletidejét a biológiai megoszlási adatokból meghatározott beinjektáit dőzis/szerv értékekből határoztuk meg mindegyik radioimmun-konjugaromnál. Bizonyos szöveteknél, például a vérnél feltételeztük, hogy a rádiókonjugátum biológiai lebomlása egy kétrészes modellt követ, melynél egy exponenciális hanyatlás van ezekben a részekben. Más szövetekben, például a májban az aktivitási szintek durván állandók maradnak a 72 órás biológiai megoszlási vizsgálatban, feltételezve, hogy a biológiai féléletidő nagyon hosszú, és S2 1000 érának megfelelő értéket határozzuk meg.

• « « « <

1.. táblázat órával a '^u\Ea~2B8-MX~D$P& .intravénás injekciója után. normál BáX>B/c egerekben Átlagértékek ± SD (standard hiba)

Minta	Szarv tömege	% XD/gramm	% ID/szerv
Vér	1,17 ± 0,17	10,3 ± 5,32	58,1 ± 3,1
Szív	0,087 ± 0,01	5,88 £ 0,76	0,51 ± 0,05
Tüdő (2)	0,149 ± 0,00.	14,2 ± 1,4	2,10 1 0,17
Vese (1)	0,127 ± 0,02	9,82 £ 0,86	1,22 1 0,12
Máj	1,06 i 0,20	10,32 ±1,58	10,76 ± 1,93
Lép	0,0 90 1 0,01	6,04 ± 1,17	0,61 1 0,03
írom	8,39 ± 0,08	0,70 1 0,25	5,67 1 1,35
Csont	3,15 ± 0,35	2,97 1 0,71	9,10 ± 1,09
Sor	3,15 t 0,35	0,96 1 0,29	3,0 ± 1,12
Gyomor-bél rendez.	2,58 ± 0,31	6,10 ± 2,00	7,80 ± 1,8 0 :
Vizelet			...
Széklet			...
Télies	99,öl ± 4,8

egerek száma - 5

Átlagos tömeg - 20,-97 i 2,16 g

2. táblázat

ΦΦΦ lója után normál BALB/c egerekben

Átlagértékek ± SB (standard hiba)

Minta	Szerv tömege	% ΣΒ/gramm	% ID/szerv
	grawaa
Vér	1,47 ± 0,07	21,97 1 1,87	32,22 i 1, 3.5
Szív	0,128 1 0,03	4,02 ± 0,23	0,33 ± 0,01
Tüdő (2)	0,152 ± 0,02	7,90 í 1,81.	1,20 10,18
Vese <1)	0,128 ± 0,01	5,24 í 0,40	0,76 i 0,04
Máj	1,11 ± 0,10	10,03 ± 1,83	11,20 ± 2,23
Lép	0,082 i 0,01	5,04 i 0,75	0,40 ± 0,02
Izom	8,41. 1 0,38	1,24 ± 0,05	10,44 ± 0,7 fe
Csont	3,15 ± 0,14	2,02 ± 0,33	6, 3 0 1 0,81
Bőr	3,15 ± 0,14	3,75 ± 0,39	11,77 ± 1,09
Gyomor-bél rendes,	2,91 ± 0,27	4,50 ± 0,52	8,65 ±0,56
Vizelet			0,98
Széklet			2,54
Teljes	37,10 ± 1,68

'Egerek száma - 5

Átlagos tömeg - 21,3 ± 0,94 g **»» Φ*Α

3. táblázat

AkfcivitásxsegoazXás 48 órával a ^iilIn~2B8“MK-'DTPA intravénás in

Átlagértékek ± SB (standard hiba)

Minta	Szerv tömege grammra	% XB/gremm	% ID/szerv
Vér	1,4 5 t 0,18	22,41 ± 3,95	11,90 :·.· 2,39
Szív	0,050 i 0,01	4,05 1 0,94	0,36 ± 0,08
Tüdő <2>	0,155 z 0,02	8,45 ± 0,51	1,31 ± 0,19
Vese (1)	0,125 i 0,01	0,16 ± 1,15	0,76 ± 0,07
Máj	1,040 i 0,11	9,41 ± 2,33	9,3 4 ± 3,18
lép	0,002 t 0,01	5,32 ± 0,71	0,4 3 ± 0, 11
izom	5,2 6 ±. 0 , 7 i	1,42 ± 0,58	11,62 ± 4,67
Csont	3,10 ± 0,29	2,0« ί 0,16	0,41 1: 0, 4 4
Bor	3,10 ±0,29	3,43 i 0,59	10,54 ± 1,69
Gyomor-bél rendsz«.	2,90 ± 0,20	5,05 ;± 0,03	7,46 1 0,60
Vizelet			1,4 6
Széklat			6,41
Teljes	88,49 ± 6,87

Egerek száma - 5

Átlagos tömeg = 20,65 i 1/93 g * X ·*· Φ φ ΦΦ« χ_φ * * «*♦* X « χ **· ♦'»* * ** «ΧΓ :txvitásmegoszlás 72 órával a ^Ιη 5a után normál

-DTPA intravénás inAtlagértékek ± SD (standard hiba)

Minta	Szerv tömege	% XD/gramm	% ID/szerv
Vér	1,52 ± 0,06	18,97 + 1,31	28,51 i 2,03
Szív	0,094 ± 0,01	3,71 ± 0,31	0,35 1 0,04
Tüdő (2)	0,161 1 0,01	7,60 i 0,30	1,13 ± 0,09
Vese (1)	0,135 1 0,01	5,55 1 0,53	0,76 1 0,09
Máj	1,11 ± 0,11	: 9,90 1 Ι,’’’'	11,00 ± 2,0 3
Lép	0,095 1 0,01	5,12 ± 0,75	0,48 1 0,04
Izöíb	8,58 ± 0,34	1,04 1 0,09	9,35 1 0,68
Csont	3,22 ± 0,12	1,73 1 0,34	6,04 1 0,51
Bőr	3,22 ± 0,12	3,16 1 0,60	10,19 ± 2,03
Gyomor-bél rendsz,	2,79 ± 0,19	4,53 1 0, 03	6,37 1 1,38
Viselőt			2,49
Széklet			11,50
Teljes	87,8 0 i 4, / 9

Egerek száma — 5

Átlagos tömeg ~ 21,46 1 0,84 ** X·»

5. táblázat ♦ * * * »«χ<

» φ ♦'·· ·♦«

Aktivitáamegeeslás 1, ^SÖY-2SS-MXDTbá intravénás injek-

Minta	Sserv tömege	% IB/grasam	% ID/ezerv
Vér	1,27 ± 0,06	30,23 1 2,43	4 9,77 ± 1,72
Szív	0,086 1 0,01.	5,80 ± 0,84	0,50 1 0,09
Tüdő (2)	0,137 ± 0,01	12,11 ± 1,00	1,66 i 0,17
Vese (1)	0,120 1 0,01	10,23 ± 1,30	1,15 ± 0,12
Mag	0,921 ± 0,05	12,12 ± 1,72	11,17 ± 1,66
lép	0,080 ± 0,01	9,27 ± 0,4 6	0,7 4 1 0,67
Izom	7,27 ± 0,32	0,78 i 0,13	5,72 i 1,05
Csont	2,73 ± 0,12	4,35 i 0,39	11,39 ± 1,47
Bőr	2,73 ± 0,12	2,12 ± 0,78	5,32 ± 2,24
Gyomor-bé1 rendsz.	2,22 1 0,06	3,32 ± 1,1.2 .................:___________;.................	4,22 ± 0,34
Viselet			-
Széklet	-	-	--
Teljes	94,85 ± 3,47

Egerek száma - 5

Átlagos tömeg 18,17 g ± 0,84 g

Φ * X Φ Λ > V <, _{Λ Α} *

Aktivitásmegoszlás 24 órával '^ÍÖX“-2B8“MX“-DTPA Intravénás injek-

Minta	Szarv tömege gramm	% XD/gt&mm	% XD/szerv
Vér	1,517 ± 0,090	8,35 i 2,547	12,83 1 4,60
Szív	0,092 ± 0,005	2,63 ± 0,142	0,240 ± 0,006
Tüdő (2)	0,141 ± 0,00 5	4,5 6 2 0,393	0, 644 t 0,047
Vasa <1>	0,138 ± 0,002	5,63 ± 0,222	0,779 i 0,040
Máj	0,438 1 0,098	5,22 ± 0,335	2,259 i 0,399
Láp	0,081 1 0,003	4,23 ± 0,180	0,345 1 0,011
Ír ősi	8,668 ± 0,514	0,076 ± 0,164	8,55 ± 1,945
Csont	3,246 ± 0,136	1, 32 6 ± 0, 102	4,239 1 0,154

Egerek száma - 3

Átlagos tömeg === 21,671 g ± 1,11 g

7, táblázat

Aktivitásmagoszlás 48 órával a ^$0X~2B8-MX-D'TPA intravénás injakdója «tán normál BALB/c agaraiéban.

Átlagártékák ± SD (standard hiba)

Minta	Szerv	tömege	% XB/gramm®	% XD/szerv
	gramm®
Vér	1, 33	± 0, 06	17,34 i 2,0	23,03 1: 1,95
Sót	0,083	± 0,01	3,56 1 0,31	0,31 1 0,04
Tüdő (2)	0, 139	+ 0,01	7,54 1 0,88	1,05 1 0,15
Vasa (X)	0, 122	i 0,01	6,53 ± 0,42	0,7910,01
Máj	0, 968	3: 0:,04	9,05 ± 1,70	8,92 1 1,57
lép	0,087	i 0,01	6,52 ± 1,13	0,57 l 0,07
Írom	7,26	1 0,36	1,05 1 0,18	8,01 1 1,17
Csont	2,86	i 0,14	3,34 1 0,42	9,53 1 1,08
Bor	2, 86	1 0,14	; 4,13 1 0,76	11,73 ± 1,82
Gyomor-bél rendez.	2,8 4	i 0,19	2,74 1 0,34	3,80 1 0,30
Vizelet	-		4,2 9
Széklet	...	-	7, 67
Teljes	79,72 ± 3,23

19,07 g 1 0,91 g

Egerek száma - 5

Átlagos tömeg ~

X* χ φ « X ·*ί ***φ ♦ ♦♦ ákfcivxtásmegoszlás 72 órával a ^S0Y~2B8~Mk-~BTFá Intravénás injekciója után normál BALB/c egerekben

Átlagértékek ± SD (standard hiba)

: ....... Minta	Szerv tömege gramm®	% W/gr—™	% ID/szerv
Vér	1,35 ± 0,02	15,40 ± .1,63	20,71 ± 2,13
Szív	0,038 i 0,01	3,12 ± 0,24	0,28 1 6,01
Tüdő (2)	0,142 1 0,01	8,2 3 1 1,05	1,1.7 1 0,20
Vese (1)	0,123 1 0,01	6,45 ± 0,57	0,79 1 0,Q7
Máj	0,02 ± 0,Ot	8,39 1 1,14	3,50 1 1,31
Lép	0,103 ± 0,öl	5,90 1 1,19	0,57 ± 0,03
Izom	7,63 ± 0,11	1,01 1 0,15	7,73 1 1,05
Csont	2,38 ± 0,05	3,20 ::: 0,25	9,20 1 0,61
Bőr	2,88 ± 0,05	3,97 i 0,49	11,42 1 1,36
Gyomor-bél rendsz.	2,30 ± 0,18	2, 90 1 0, 65	4,06 1 0,93
Viselet	...		3,0 0
Széklet	...	-	11,08
Teljes	7 8,62 ± 2,63

Egerek száma 5

Átlagos tömeg - 19,2.1 g :i 0,27 g

»* *

Hasonló módon más biológiai féléiétidő értékeket is meghatároztunk vagy kiszámoltuk az exponenciális csökkenés tb értékének, kiszámolására szolgáló standard egyenlettel. Miután ezeket az értékeket meghatároztuk, a T_ue, T_el, T.,.₂, Aí , A₂, és A-nak a változóit, melyeket a 9. és 10. táblázatban soroltunk fel, meghatároztuk mindegyik radioaktívat jelölt kenj agát uránál, ereknek a táblázatoknak, a tetején megadott egyenleteket használva (kimenő változók') , Ezeket az értékeket, valamint a következő táblázatokbán bemutatott értékeket a Symphony spreadsheet-ben (Lotus Development Oorp.) leírt programot (MR. Fhillíp Hágán, MS,

Nuciear 'Medicine Service, VA Medical Center, La Collá, CA 921 Cl;

alkalmazva számoltuk ki.

8,

BEI® VÁLTOZÓK

AO beadott dózis Tse- hatásos felvétel féiéktideje ?p * a tadíomiíd féléietideje h ~ Biológiai felvétel félélet Ideje

Ibi - ez első k^p. biológiai eltűnésének féléietideje

Π - az Aü-nak e Tbl biológiai íéiéletidejévei máéi kezd frakcióié íz ~ az kQ-nak a Tb2 biológiai féiéletídejével rendelkező frakciója

·. * v «

Síit

KIÍOÍÓ VÁMöEÓK

Tel « az első komponens tényleges eltűnési félelatideje

Tel ~ a második komponens tényleges eltűnési iéléletídaje

Al - az első komponens összesít ott aktivitása

Az * A második, komponens összesített aktivitása

A ~ teljes összesített aktivitás

Tue * Ts * Tp/í'm?p} AbUCflWTeipw/W

Tel - Tbl * Tp/ivbieTpl A2~l_fH*i2<*W2

Te2 * Tb2 * W íTbíteTpí A-ÁÍ + Az <r a íb^; Átlagos dózis/egyséq összesített aktivitás

Példa: Al a Bájnál - 1,44 * 11,006% ’ 1000 * 1000 * ö,z * 1,00 = 10007,5 pCÍ összesített aktivitás * ♦« *X« * <1 ««« *

♦»* ♦

« ? í- X Μ» x x 4 * 4 ' » ♦ * » κ :« // /

	Tu (óraj	fi	f2	:&i (óra)	S2 {óra)	te {ón)	tel íóra)	T«2 iára)	Ál (uCi4,r)	A2 juCi4r)	A (uCi-hr!
Mellékvesék	2/88-34	ο,οοοι	yot	loob	ö	2,780-04	03,2	y	0,0	oy	0:
Húgyh. tart,	2/ϋΕ··ίϋ	yooi	ű/üíM		0	2,700714	y :	1 3,8 :	54,4	2,0 í	31
Gywrurt.	2/88-3,4	/7	(bőül	1/	0 :	2/8E44	3,3	8,0	yy	0/	319 ::
Vébnyb/art		5/508	0,00¾ :	3/3	Ö	2/08-34	V	o,o	313,3	: 0/	2/
üli. tárt.	:2/78e~üJ	6,5503	0,838 :	'3,5	0	2,W<	4,2	y	oy	0,3	404
Lh. tűrt.	2,/8MM	/7	0,338		0	2,W	y	0,2	378,8	0,(1	548 )
Vesék	2/88-34	í;221	Ü,W	33	0	2,788-34	23,0	g,ö	404,8	0,0	y i
!4a)	2,78E1-0r4	11, Mí	0,538	1330	0	2/88-34	6.1,2	0,0	10907/5	0,0	10003
	2/7BE-Ö4	2,10/	1,2M	38	1088	2/B7M	20,1	ö{2	: 0270	yy	1720 j
Egyéb ssöv. ítélj.):	V?W	0,öOOt			í..................................				;......................................
I:a	2/SE-O4	13/033	0/38	1838	0	2/08-34	53,2	0,3	5481/	0,0	* * 3452 1
bnsxov.	2/8S-04	0,5308	0,()0¾	1508	8	2/88-04	03,1	0/	0/	8,0	( 0 .............................4
W í	2JSM4	7/77	32,227	13 i...........................	1000	2,788-04	12,3	00,2	10319,2	293137	39132 l

Μ.

* » > «

	Tv Sora)	fi	f2	Tfel(ón)	W2 (óra)	Tae(óra)	-- la!(óra)	?82{óra}	álíyü-órai	WiHral	SüCi-sai (
	2,782-04	MB	,,,,-™·.'.— il; Öl!« ’ ........	1W«	0	2.W04	03,2	OJ	0.0	3,0	G
szív	2,ϊ3.£~04	3,5104	0,385	5?	1000	2,780-04	33,9	oy	220.5	345,7	573
	2,738-04	'8,513*	Ü,y ;	$0	1Ű00	2,782-34	33,9	OJ	229,9	w	573
:OTfeigy	2,?«$	0,000?.	0, Ok	1000	0	yyy	Ö,2	0,0	0,0	y	ö
CateOtyO	2, yy	0,3304
Etikái is cs.	w$	0,0803	0,035	1800	0	1/78E-04	0,2	y	¢.,0	y	0 i
Trtóű es.	2,W	yoe		45	1000	2,703-34	; 2L0	83,2	3538,8	3731,8	9260
Gs.WlÖ ÍWEÖSi	2,788-39	0,0008	0,335	1033	0		83,2	0,0	oy	0,0'	0 ;
Cs.vslő ísáraí	2,18Mí	3,3004	yy	ó	0	2,792-34	6312	8,0	8,3	0,3	o ;
Porc	2,.78E->3í	Ö(000¾	0.00¾	1000	i	2,782-34	63 <2	0,0	ί o.o	0,0	0
Sgsfc altos.	2,780-04	0,3304	0.00¾	1000		2,7804	63,2	y	0.0	y	0
	2/7§E>04	n,w	0.00¾	IfflS	0	2,782-04	61,2	0,0	10758,1	8,0	1.070.8
	2,782-04	Ifi	o,y	39	1ÖÖ0	2J8S-04	28,7	oy	yy	303.0	y
«	2,282-04	0,0335	ye	; 1.0	3	yiH*	OJ	3,0	8,0	y	c
Pajzssdri®	2,788-38	2,3009	0,508	1300	5	2,732-04	OJ	•M	0,0	0,8	0
test	W	0,000¾	5,004	2030

*Λ.<

ί

1Ö.

AO^;; bízott dózis ’fp^;;; s radorihiLíd féiéiefideje iü - Biológiai felvétel féléletíoeje

Tbl as első k«. biológiai eltűnés léíéleüdeje

Tb2 - a második komp. biológiai el tűnés féíéletideje fi«az Αδ-nak a Tbl biok féléktidejével rend. frakciója £2 ~ az Aö-nak a Tb2 bioi. íéléieddejével rend. frakciója ;> Átlagos ézis/egysén összesített aktivitás

SMÖ VÁLTOZÓK

Hr hatásos felvétel féleíetidd

Tel * as első komponens tényleges eltűnési féiéletídeje

Te2 ·* a eáscdik komponens tényleges eltűnési, fciélatideie

Al ~ az első komponens összesített aktivitása

Ai - A második komponens Psszesítetz aktivitása

Oí

A -· teljes összesített aktivitás ina - Tn ⁺ ?p/ ÍTud-Tpj AH, 4VftWrd

Töl * ® * Tp/'«pJ A2Má^£2^'íe2

Tel - Tb2. * Tp·/ IWnpí Λ-Αί * S?

Példa: Al a tójíál - M< ‘ 9,0001 ♦ 1009 * 1000 * 60,2 * IJÖ = 7795,5 pCi összesített aktivitás í « A lt ♦ « > » ♦ í « X « »♦«

X X < « » í

X >

ifi* »

<·»<

í «

» » « < > í í <

♦ 0 táblUata

ÁZ

AKTIVITÁS (A) ÉRÉSÉ® MM BSHŐ ÉS KM»

MM

	Sí (órai	fi	f2	ai (órai	az (órai	Tue (Óra)	Sál (óra)	lei (óra)	Ál (pCi-óra)	« ípCi-óra)	A EpCi-áraj
Mföllékv-ííJék	2,1Η4	0,0001	5,551		0	2J»4	y2	0,5	6,3	5,3	0
HúgylL tart.	2JM	w	¢,20¾	4	e	2JMi	3,6	0,0	M,2	5,8	, 54
Gyom-tart	2,?SE--O,4	4,220¾	0,,661	2,5	0		1,3	9,0	03,1	y	$9
Vekenyfc,tart	2,7S~ü	4,2201	w	33	0	2,762-01	3,3	0J;	261,7	y	202
Üli. tart.	;i, SE-W	á ,220,5	OzÖOt	: 65	ö		y	6,0	: 255,5	y	255
LiL tart.	2,lW,i	2,225	5,861	u	0	2,?8S~ÍM	3,5	y	235,5	0,5	340
Vese	2,>«4	1.,.1501	5,522	70	300		35,i	<2	553,6	75M	1307
Sj	XB-iM	3,0001	0,052	1005	0	2,750-33	60,2	(bű	7755,5	6,3	7795
Ttidók	2,185-64	1,200¾	0,052	1500	0	2,760-55	60,2	5,0	Í03M	5,3	1030
Egyéb srov,	Υ,Β-Μ	0,OOöt
feli.’
hűti	2,7Β-ΐΐ4	8,M	0,00$	1530	0	72,786-01	65,2	0,0	7552,9	5,5	7553 ‘
Bsírszcv.	2,«-6Ι	0,5081	0;00t	1500	0	1,786-31	60,2	0,< ö	5,3	6,5	0
hr	2i?§£-04	49,?W	2W	.............................	1003	f,76E-0í	16,6	50,2	77433		V 30178 .................................i

β »$ <?

(h x >

’ ♦ » * x x t X.

χ a

	Te (ón!	fi	Í2	Wa)	Tb2(Ón)	Tn{o)	Mióra! í	MM	Al juCi-öra)	A2.iuCiöra)	A{p.Ci-ón)
Ay	2,7§H4	0,3031	8,W	1000	3	2,7^54	60,2	5,0	3,3	3,3	0
Szív	;;t78s~íü	0,500¾	0,505	öl	1228	2,782-04	28,4	. 60,2	251,0	511,0	536
.Petefészkek	2,75Rl	0,0901	w	lööö	3	rroi	23,2	5,0	8,3	8,3	2
IWMkigy	2,704	0,000%	8,833	LOGO	0	2J6ER	63,2	3,3	8,3	8,3	s
(teázíteiy	2R2R	0,,000¾
Kortikális cs.	2,7«	ysh	3,884	5888	3	2,782-84	60,2	6,0	2,3	0;0	0
TíÉöfeiL cs.	2,WÖ4	n,m		O‘Í	1000	8,742-34	B, 7	65,2	5884,4	aor5	13612
tS.VSiÖ >OTÖSj	2,7§H4	Ο,ΟΟΟΐ	3,831	1003	6	2,?RG1	66,2	6,0	8,8	0,0	6
CXvelő (sárga)	2JSH1	0,,000¾	3,834	1003	0	2,788-64	65,2	y	2,8	0,0	0
Porc	2,751-04	0,000¾	8,WÍ	1000	5	2,0<-51	55,2	6,0	0,0	0,5	8
Egyéb alkotón	2,780	0,000¾	0,555	1600 i™	0	2/78E-04	55,2	8,3	3,8	0,6	0:
Sör	2,78S-04	15,6505	0,80%	1600	0:	2,788-84	55,2	60)	12512,1	3,8	13512
Lép	2,78S-©4	0,^0¾	0,065	00	1GG0	2,738-34	31,3	' 60,2	338,3	665,1	615
Herék	2,782-04 ;	0,000¾	8,362	1500	0	2,738-34	66,2	8,6	2,0	3,3	« o ;
ífejságy	2,782-84	Ο,ΰΟδΐ	8,881	5888	2	2,B-04	— 88,2	3,8	6,8	8,8	„ ±.j
Míes tat	2,782-04	0,000¾	8,081	1888	2	2,782-04	82,2	3,8	6,3	0,0	----------------- »*

<

t 4 » A ά

8S φ Φ* <*

Φ X » Φ Φ * * * * .> »»» X « *φ« ** * * x»í« X ♦ * ex* «** * ** **

A 9. és .a Iö. táblázatból· származó teljes összesített aktivitás értékeket <A> ás a M1RD Psmphlet 11-ből (11. és 12., és 13.

és lé, táblázat) származó S értékeket alkalmazva a felsorolt szöveteknél a radloaktivan jelölt konjugátumok mindegyikénél kiszámoltuk a sugárzás adszorbeált dózis becsült értékeket (15.,

16., 17. és 18. táblázatok). A 19. táblázatból, származó összes sugárzás dózis becslések meghatározásában az Indiám-jelölt konjugátumnál egy adott szerv saját dózisát a szomszédos szervekbe vagy szövetekben lévé aktivitás által létrehozott abszorbeált dózissal együtt összegezzük. Mindemellett az ittriomjelölt konjugátumnak tulajdonítható sugárzás dózis becsült értékek kiszámolásában (2ö. táblázat) bizonyos értékek hiányoznak a felsorolt szöveteknél (például a mellékveséknél). Ez a kibocsátott 13 részecske rövidébe úthosszának köszönhető az emitiált g részecskéhez képest, mely igy egy jelentéktelen szomszédos szövetekből származó aktivitásszennyeződést eredményez, valamint az elsődleges biológiai megoszlási adatok hiányának köszönhető ezeknél a szöveteknél.

» ί

Ιηίάία-ίΠΙ] Féiéletidő 67,44 óra

Forrásszerzek
Céhének		Hqyhóly, tart,	Sélrsodsser	Vesék :	«3	®a	& sw. (ÍZffl)
	»,b,tet	UK tart,	Hitet
Mellékvesék	W3	3,72-07	7,32-06	4,42-06	2,8Ε*δΐ	1,35-00	3,42-85:	1,52-05	7,62-36	4,32-06
a^Lfel	w	4,52-04	7,52-06	8,02-80	6,42-06	2,02-05	0,32-37	5,22-07	1,55-87	5,32-80
Csont	w	2,32-06	2,32-06	3,22-00	2.306	4,22-06	3,75-36	2JE-G6	3,32-86	3,25-30
poriéi r. ís», fai)	§>06	3,52-07	3,42-04	1,12-65	1,22-85	5,42-06	1,02-35	5,02-06	5,72-86	4,32-36
tértél r. (Amjtól)	2,52-86	8/oE“uG	7,>06	2,12-34	5,42-05	3,02-85	8,62-06	5,02-06	6,12-87	4,85-06
portél r. (üli. fel}	2,82-66	£,9E~űS	1,12-35	8,32-34	3,1«	1,42-85	3,68-36	7,52-00	7,>87	8,05-00 :
(gátiéi. r, (Ili, fal)	7,1H7	2,2E~G5	3,82-05	2,42-05	§,52-06	4,72-36	2,>00	7,32-07	3,02-87	5,25-06
teát	3,7E-S5	0,0	1,12-05	§,22-06	3,32-06	2,6E~Uö	5,25-84	1,22-05	2,7E-86	4,42-36
	1,52-85	S,$~0?	L9E-0S	5,02-06	7,32-87	3,4E-0?	1,22-05	: 1,32-84	7,706	3,45-00
4OT	w	§,22-03	5,25-00	7,52-07	3,32-87	2,02-07	2,88-36	7,85-80	1,42-04	4,2E-06
Cs.wló (vörös)	ws	5,32-06	4,02-06	1,12-05	9,M	1,32-85	§,62-05	4,12-86	4,82-06	5,32-36

Ö β » φ

Ferrámarve
Célszervek	Méfe,	«'u-Uí. tart,	Bék®h^	Ytíí?ö&	Máj	tUUJt	fe SZOT. ilM)
Gyaa.tart.	?&.b.tart	W tart.	Ui tart.
Effb szw. ükb)	40	5,58-04	4,3E<	40	4,5E-06	5,2E-06	40	: 3,4«	•1,42-06	7,52-06
TOWlwsííSSft.	ι,κ	2,3«	i,m	3,305	3,7«	6,42-05	3,62-05	1,45-06	3,62-07	6,32-06
^Sasttjáhmg'	2fSHS	8,62-0?	5,?E-05.	6,1B-OS	7,1«	2,12-06	2,02-85	I,.2E~35	yg-es	5,72-06
Bőr	ifbE“Öé	1,7S~Ö6	1,45-06	1O	1,42-06	y«	1,3«	1,.62-05	1,3«	20
	w$	7,48-87	yis-os	40	4,M	23E<	12,SX!$	2,62-05	70	4,6E-Ö6
feéfc	1,&87	1O	1O	w	9,80?	5,32-06	w	2,52-0?	3,32-08	3,8«
fejeiül®	y«	1,2«	3,$E-Ö7	6,95-08	we	2,72-08	I>87	6,22-0?	2,62-86	40
®i (nm tat)	M«	4,95-05	2,4«	2, 32-05	1,32-05	2,12-33	IMS	1,22-06	2,82-0?	?,4«
aljas test	40	y«	s,í«	7,3«	6/ 8Ε-0δ	6,32-06	ύ,6Ε~ΰδ	6,62-06	5,32-06	50

ο e

Irodaim hivatkozás: Mird Fanphiet No. Π, 164. Oldal < X * # « -X » ΐ

Χ»ί» «

#*« ί

X «

Í * * ΐ » ο X X ί

*

Ma-(111] Féléietidő 67,« óra

Pommemk

Cálszsrvsk		teyáh,	t Vörös cs, wló,	tóiíális csmt	Utóul· csat	&	Iá			tet
ftUáteék	14E-06	2,S~S5	7>56	3>S6	3,906	2,46-06	2,96-06	1,0	4,76-07	7,36-06
Húgyb. fal	2,IS-Ö5	w	w	1,56-36	1,1-36	1,1-06	0-07	1,56-35	1,26-32	6,92-06
Csat	3,806	J, $rO6	w	3,36-35	2,1-35	2,96-06	2,96-36	2,0	2,66-36	6,96-56
poriéi r. igja. fal!	w	ws	2,2E-G6	1; .'E~Ob	1,16-06	1,76-06	2,06-35	1,56-37	1,56-37	7,18-26
poriéi r. (vékonyéi!	3,3E*05	5,56-06	7,96-06	2,36-26	2,306	1,56-06	4/2Ε“Οδ	1,26-25	4,26-36	7,56-06
Sp-bél r. (üli. fal)	3,76-55	6,2-56	6,46-06	2,2E-36	2,26-96	lí SH&	2,66-36	1,16-25	3,36-36	7,06-06
Sprtélr. (1E. fal)	M6-35	1,76-36	5,36-06	3/2E-C6	3,26-96	1,56-06	1,96-06	0,26-36	2,26-32	5,76-06
Vsát	w	l,3E-05 :	6,66-06	2,>Ct	2,76-96	2(<0Ε*υδ	2,66-05	1,76-37	2,26-37	5,56-06
w	ws	1,305	2,56-36	2,06-36	2/0EO6	1,76-06	3,Mi	1,26-37	3,56-07	5,56-06
aa	2,2M	7,66-66	3,76-36	3,06-56	3,36-96	1,96-06	bfSE-3S	3,16-35	2,95-36	5,95-26 :

♦»* » *

Mi« *

Forrásszervak
Célszervát	fetsfe.	taplrn.		Bőr	ϊφ	ίβκ	Pajasnáx.	Teljes test
Vörös cs. sdo.	kortíkális csat	tötefaL csont
Cs. «Iá (vörös)	1,305	6,306	7,52-35	1,1-55	2,605	006	4,906	1,906	2, >06·	7,706
Sjsássw, (izo)	6,306	5,706	3,82-½	í,»5	3,206	2,52-58	006	3,606	4,32-86	5,62-56
fcte&M	1,002	1,506	7,72-35	' 2, M	2,26-06	1,42-56	1, /E-Ö6	0,005	2,508	7,08-86
	1,32-56	L6E-03	4,92-36	3,IE~06	3,16-06	1,75-55	6,18-55	2dE-ö7	007
Bőt	; 1,42-56	1,306	ws	2/ÍE-G6	2,306	3,705	1,50$	4, >06	2,506	3,>36
	i,$M$	6,2-35	2,706	2,0E-C6	2,505	lx7HrO6	3,12,-04	3, >08	3,52-57	6,606
fed	5,iB30	2,lE-37	yoo	1,90$	1,905	yos	2,507	3,>03	3,38-85	4,92-36
I&izssirigy·	2főg~Ö3	4,5£-07	2,206	2,1-05		2,406	3,42-07	3,303	5,32-83	5,22-36
tói» tata)	6,8E-35	1,906	6,7E-öí	1,806	lf8E'05	1,22-86	1,206	CjOEtSö	2,42-08	?,SE~06
Teljes test	7/7E-QS	7,506	s,o	5,306	.5,98-56	3,82-86	5,606	5,605	5,38-56

Μ

Irodalmi hivatkozás; Hird Fasohieí No, 11, 165. oldal « m ; » o x> * $ « >

« m * 4 >

♦ k > 4 « «« «

t > í k * ^{: 16} Λ Λ

4 * X * * 4 X » X > (

Förrásmnd „ ........................................................................................................................................................................................................... ....................j
				Béktó			fesk	Mi]		I Ϊ& SOT,
Célsz&rok		Űrt,	0^».tart.	Vékvbvbrt	Üli, Űrt,	lAí.				«
ífeUápwek	W	0,0	0,0	0,0	0,0	0,3	Ö,0	0,0	0,0	0,0
iS$t fal	3,5	5,08-03	0,0	0,0	w	ö/0	0,0	0,0	0,0	5,0
Owst	0,3	0,0	) 0,0	s,a	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
partéi r, í®». fai)	0,0	0,0	4,38-03	0,0	0,0	0,0	0,0.	0,0	0,0	0,0
^®wfcél £♦ ίν&φέΐ)	0,0	0,0	0,0	2,55-03	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
portái r, (üli. fai)	0,0	0,0	ö,3:	0,0	4,58-03	3,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Spiw-bál r, (Ili. falj	0,0	0,3	0/	0,0	0,0	7,&03	0,0	0,0	0,0	5,3
feék	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	δ,Ό	0,0	0,0	0,0
	0,0	0,0	0,0	0,0	0,3	0,0	: 0,0	1,12-03	0,0	0,0
Mk	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	: 0,0	0,0	2í5£wö3	0,0
Cs.vele jwös)	0,0	0,0	0,0	0,0·	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0

»Λί ίFerrásszervek

	5feW	Sógialy.		SálmfeM·		Bék		β	5& szw,
CélswTOk		tart.	^CB.tart.	Vétb.tró	tlí. tart.	ffi. tart.
Egyéb szőj. fiiaj	0rö	0,0	3,3	3,3	3,0	y	8,0	0,3	ί/0	7,105
Petefészkek	0,3	y	3,3	3,3	3,8	0,3	•Λ M. l'fV	3,0	0,0	·Ί V,tV
Hasiéban®	y	3,5	0,3	3,0	y	y	f\ n V? V	5,0	3,0	3,0
&	0,3	ö,ü	............................. 0> 0	............................. 0/0	0,0	ty	n n· \/f V		Μ	0,0
ΙΦ	y	y	y	0,3	5,8	y	y	8,5	0,8	0,0
tók	y	0,0	3,3	3,3	5,8	0,0	3,8	M	0,0	n n
íajmrigy	y	0,0	3,3	3,3	5,8	3,0	0,0	0,3	0,0	: 3,0
Ö (neetah.)	y	0,0	y	3,8	5,8	3,0	ö,ö	8,3	3,0	i y
Mj® test	2,M	ysy	yy$	0-35	1,0	l,íE-Ö5	J W.u, V'.'	2,83-35	2>85	? ώ/íü \W

P íü

Irodalmi hivatkozás: Mírd Pssiphlst 8o.ll, 144. oldal * m * ;♦ κ » « » ♦ í » ♦»« > < <

* « » « « <

» »

«* <·

» » > * « * v * < s

Ittráa-ISO] Féléletidő M óra

Forrásszervek
Célszervek	Petefész.	tenják		Sor	Ιφ	Beát	ΐ Fajzsaiir.	Teljes test
Vöröses. velő.	Malis Cfflt	cstó
	3,0	3,3	3,3	................................ 3,3	5,3	3,3	3,0	5,3 :	3,0	ys-os
Sj^óljagfal	3,0	3,3	3,3	3,3	5,3	3,3	3,0:	3,0	3,5	2,33-55
Crot	0,0	0,3	1,12-3(	W	23-«	3,0	3,0	0,0	0,5	2,1-35
portél r. !gja. fai)	3,3	0,3	3,3	5,3	3,3	: 3,0	0,5	3,0	3,0	2,1-05
ejofiélr, («tagtól)	0,0	3,3	3.-3	3,3	0,3	0,3	0,3	3,3	0,0	2,§E-05
facetéi r. {üli. fai)	3,0	0,0	0,3	3,3	3,0	y	0,5	0,3	0,5	2,1-05
periéi r. {Iii, fai)	0/0	5,5	3,5	3,3	0,3:	0,3	3,0	3,3	5,5	2,1-05
Vesék	3,3	8,3	3,0	0,0	8,5	3,0	3,3	3,5	0,3	2,82-05
«3	3,3	3,3	3,3	0,3	y	3,0	3,0	0,3	0,3	2>05
S&	3,3	3,3	0,3	0,0	3,0	3,3	0,0	0,3	y	yyí

* A« « *

Eorrámerai
Céiszenek		Has^Sa,	toWsm	&	W	teát :	fejsÉr.	tejes test
Vőks cs, wlő.	kcrtxtólis csat	uM, csont
:CS, WlŐ {WH»j	10	0,0	WE-öí	3>05	5,1-0(	0,0	10	8,0	10	2>05
Bg&sxw, {áaö	10	10	10	10	10	lö :	0,0	O	10	2,88-05
Mész»	I>82	10	0,0	0,0	1,0	10	10	0,9	10	2,82-05 :
Basnsfálmíxigy	öfG	2,06-02	0,0	0,3	ö,ö:	10	M	10	10	2,82-05
&	Qfo	Qfö	Ö,Q	10	10	w	M	0,0	io	2,05
ΪΦ	io	io	io	0,0	io	10	US-02	10	10	2>S5
Wc	io	10	io	0,0	0,0	0,0	10	5,78-02	io	2,82-05
fejmri®	0,0	y	io	............................. io	10	0,0	10	: 0,0	3,92-82	2,8E-05
& {ra tetei	10	0,0	10	10	10	0,0	10	0,0	10:	2,82-05
tejes test	2>95	2>05	2,82-05	2,82-05	í>85	2,82-85	7 ci? 11 i/Oizw	2,00-05	2,®HS	2,82-85

β

Irodaijai hivatkozás: Mixd Paisphlet >11, 145. oldal >

*

15. táblásat

SUGÁRZÁS-ABSZORSSÁLT DÓZIS (HD = A * Sj ifflixuij ram s?,44 ®

taásmmk
	llléte.			----------------------------- Vesék		«	& aw.
		tó,	Gp,tó,	Vékktó	ffll tó,	Ui tet,				(tó)
fcUftnwft	3,000	3;1É~OS	I,ÖE-Ű3	1,403	1,12-003	4,804	1,42-04		1,301	2,401
f&I	Ö,®H#	2,4B-C2	l,iE-04	2,503	2,303	3,803	3,304	5,203	2,804	2,72-04
Sps-hél r. igya. fal)	0,000	4,704	1,12-03	003	2,202	1,12-02	3,32-03	5,02-02	1,002	2,401
portél r. {uü.fal}	örQE+öG	3,0	1,503	2,52-02	1,301	5,32-03	3,503	3,52-02	1,303	2,52-01
SpAö. r. (lli.fal)	8,008	1,203	5,304	3,503	3,803	1,303	1,001	3,32-03	5,22-04	2,501
	δ,ΟΗδδ	4,805	1,0	2,803	3,42-03	1,103	: 2,101	1,22-01	4,52-03	2,201
Háj	S,8O0	3,405	8,304	1,303	3,203	3,204	4>O3	1,32<	1,32-02	1,72-01
fflítJjüí* w		4,5S-S6	7,3E~04	2,42-04	3,404	3,205	1,808	3,82-02	2,42-31	2,101
ΪΚίΛΥΜίΧ AlwIwwnilrt'Í* ftgy® SSOTSTOK
Ira	yo,o	X0S-04	έ,ΟΕ^	1,52-33	1,82-03	2,02-03	.1,803	3,42-12	3,803	3,32-01
tóröt	GifWO	jfÖE-04	ózOE-Oí	1,52-03	1,203	2,803	1,303	3,42-02	3,503	3,32-01

v o ♦ ♦ t * * ♦» « » ♦

taásszervek
Céhzervek	ífelW.	Bagytóly, tart.	Séteriszer	Vtó	Máj	uníjft	& szik, w
8ja.tet	Vét.b.tarfc	5Si tart,	Lli tart.
Ak	Ο,ύΕΟ	3,ÖeKM	6,83-3!	Í,5E-Ö3	1,83-43	2/0)^03	UE-03	3,4002	9,83-33	3,301
V	3,0E<!	3,03-41	ί,δΗΙ	1,503	1,603	2,0503	1,803:	3,0	3,03	3,801
Szxv	wo	!,1E-Í5	1,13-03	w	1,8343	9,12-04	1,102	: 2,8E-02	l,2£-42	3,801
tetett	8,803	l,3E-03	1,801	1,13-02 i	l,5E-32	2,0	1,5003	1,0	6,23-81	2,801
Basnyálairigy	8>33	4,7E--05	S,OE-03	1,93-03	2,903	8,3-4!	8,13-03	: US-31	1,302	1,201
Mik&lis csont	3,3E<	1,30!	i 12&-Ö4	1,33-33	1,23-33	1,63-43	1,1-83	2,33-32	6,53-33	1,63-01
Tntókuléds cs®t	3,ÖE43·	l,3E-3!	3? 2^-04	1,303	i,2E-03	1,603	1,503	2,9E-02	6,53-03	1,63-01
COTttóo jvörö)	3>33	2,9E-4!	ys<	3/SS-Ö3	3,803	4,02-03	3,503	1,13-32	8,303	2,63-01
Csontvelő íssra!	3,®98	w	5/6E-04	3,5E-03	3,8E-43	1,903	3,903	1,13-32	8,303	2,601
tere	3,308	i,3E-04	3t2E~04	1,33-03	l,2E-83	1,62-03	1,503	2,93-03	6,52-33	1,63-31
Egyéb alb&ézek	3>03	w$	2,52-04	1,50!	5,601	SűE-04	8,3E-3!	1/63-02	3,!E-3J	l,2E-01 i
Ιφ	8,83453	1,105	1,13-03	US-03	1,803	9,12-04.	1,13-32	2,83-82	l,2E-82	2,33-31
Serek	8,0343	w	w$	3,23-3!	1>Ö1	í 2,22-03	1,0	2,53-83	W5	1,801

ee

ί

Célszervek		Sgtóly, tart,	Séiifflter	Vast			fe!ö.
5 Gitárt, VO.tart,	ü tart.	Ui tart.
	>>	8>3?	j; 4,0 | 2,2E-85	3,32-35	1,8Ε-35	8,2-85	5,22-33	4.5E-33	2,0
	3,32<	3,0	3,0 2,2-33	2,0	2,£-03	2,0	8,£-32	1,32-32	3,?E-31
’Mjes test	ϋ/θ	2/S-33	3,0 : 9,2E-03	6,0	8,33-33	1,2-03	1,22-32	4,32-33	2,0

Irodaid hivatkozás: fod Pasphlet No.11, 161 oldal

IC »» * « » 0 s Φ » («« » »» ♦ í s ♦ » '» <

Hí » <

* A <.· sugárzás-abszorbeált dózis (rád = a * s) msKÓ «?,« oá

Forrásszenek
Célszervek	Petefész.	tonyáh.	^-ifu .AWl AvAftAlW. i^.VIí A Am USwUKW&Bk	Sár	lép	fe&	Bgxsái.	teljes test
Vörös cs< ulí	teöális s«fc	trtóoL CStó
Oétask	3,02+33	5>so:	8,02+35	5,32+03	3AE-ÍI2	2,0	ó<	5,0	0,02+33 :	C, ÖEHSö
Húgyhólyag fal	3,02+55	OMOG	Q,QEWí	0,82+05	1,0	1,71-52	)2,73-04	5,02+00	OfOOO	0,02+30
Gyoa-fcél r, (gye. fal)		0,02+55	0f ur+öC	w	1,0;	1,83-02	1,72-52	5,02+00	0,0	0,52+00
partéi r. (Aqb.)	üzlBOO	0,02+55	OfüBSö	0,02+35	1.. 102	1,52-32	2,0	5,02+00	0,52+08	0,52+30
Gyáriéi. r, (üli fal)	0,02+®	0,02+53	Wö	2,02+35	1,0	2,22-32	0,ΟΕ<>	OfC&uö	0,52+30	0,52+03
Győriéi, r. (Ili. falj	0,02+05	ÍJ, «8	VfOStOö	δ,ΟΕ+ΟΟ	1,0	1,6E-O2	1,0	O,OE+öO	í\ fa+Oö	0,02+03
Vacak	Ο,ΟΕ+Οδ	0,.OE+Gö	Of GEH'OO	Ö,OE4ÖÖ	2,502	2,0	1,602	3,02+®	0,32+30	G/iWO
fii	5,52+00	5,52+80	δ/GEWQ	ÖfiSOö	1,0	1,0	1,72-03	......m™“ 3,02+05	5,32+00	0,02+53
{BfUfL Irak	3,52+80	5,02+50	5,BÖ0	3,52+85	2,0	2,51-52	í>03	--------------------------------------- 0,02+55	Of o&w	0,52+53
sjőwtek —

OO T ί *

Forrássíervsk

	Petsfész,	Sasiak		&		tók	— ajsár,	teje : test 1
Vörös cs, «ló·	torWális csat	teabebL csont
íze	s>y	0,32+03 :	Ο? OSK’O	8,32+83 :	0,32-03	2;	3,32+83	8,52+03	3,82+30	3,52+33 ::
tossröt	0,02+33	0,82+03	3,82+38	3,32+83	3,82-82 l	2,12-82	2,>33	3,32+88	3,82+08	3,82+08
Vér	Ö^E-íffi	8,32+58	0/üE^Cö	8,82+33	3,82-32	2,12-32	2,12-03	8,02+83	0,02+08	3,88+08
*S	w	3,82+83	3,82+33	ö/öE+OO	3,82+32	2,12-02	5,82+80	3,02+38	0,02+03	5,32+00
Sáv	3,02+33	8,02+33	3,8E+83	8,32+30	3,32-32	2,12-33	2,>83	3,32+30	0,32+33: :	3,82+00
	3,02+30	3,02+38	3,32+38	ο,οε+οο	2,58-32	1,52-82	9,38-8(	3,82+00	Ορ/Ε'ίΐΟ	3,82+33
F^wákíiri^y	0,32+33	3,82+03	3,82+88	8,32+03	2,32+32	1,38-82	3,52-02	8,02+08	8,32+82	0,32+00
Csontotok
Kbrtikális csont	3,02+08	8,32+88	0,32+80	3,32+33	2,(2-01	3,18-32	1,12-83	8,02+83	0,82+83	O/vEtöO
Trahekolárís csont	0,80»	8,02+32	3,82+88	3,02+33	2,(2-81	3,18-32	1,>33	0,82+33	3,82+08	8,82+58
Cstótóo (vőics)	öfÖE^i	3,32+53	3,82+30	0,82+83	2,(2-31	: 2,08-32	2,8-33	0,32+33	3,52+03	8,32+83
CotWő {ώξ&ί	0,GEtíö	GjStOO	8,82+38	3,82+03	2,(01	2,98-32	2,82-03	0,32+38	5,82+83	8,32+33
íte : . .	ye+oo	3,32+30	3,32+03	8,82+33	2,(2-81	3,18-82	1,12-83	8,22+05	0,82+30	0,32+58

* Λ ¢.

X Ο χ ♦ 4'

íJAYÁWrt M fVM .Λ lMUUlXih £öin$32IOT8K
Cétansx	Efetefésa.	Hasnyálx	totrwfesr	Sor	1φ	Wc	Pajzssiir,	teljes test
Vörös cs. velő	tertíális csent	tatóol, csőit
Sígéb albtóíészsk	9,81+30	0>80’	( 0,32+33	8,38x80	2,11+-81	ME-92	i,/E-m3	8,32+03	3,81x33	Ο, vkH-CO
Sár	W>	yöE+Sö	* 0,02+03	5,91+88	2,11-92	4,M	9,O	9,91x39	3,81x93 +	3,32+89
	0,02*03	O,ÖE*03	Ο,ΟΕ+ϋϋ	8,01+39	1,92-92	1,81-32	5,32-83	3,81x39	3,82+88	δ,ΟΕΌ
tat	g,ow	3,81x30	Ο,ΟΒίδΟ	ο,όε+οδ	1,31-92	3.,$:-ö2	1,22-98	3,61x90	8,31+98	3,81+90
Pajzssíiigif	0,»	3>38	0,02+88	5,31+03	2,51-82	2,(2-92	2,31-01	Ο,&βθ	8,91+99	8,08+93
ra (M ÖTOSJ	δ,κ+δδ	8,31x88	O,GE+öG	8,δΜ .........................	. 71-32	8,32+09	7,02-98	9,81+93 ................	0,81+39	3,82+83
telje test	Ö,QS+Oű	Ο,Οε+ΟΟ	8,32+35	3,31x88	5,51-02	Ι,ίΕ-82	w	8,81x93	8,01x09	9,82*98

zro r x m * x x * < x V X * «Χί * » S « ♦ X * «

X

Hx s

XXX x 4

X « !»

Forrásszervek
Célszervek	oáw,	Hóstóly. tart.		Vesék	Mg	műit MOK	* awr.
	V&.b,tari	:ffii tart.	Ui tart.
MsUékvesek	ws	Mao	3,38+30	Ö/öEtSü	HÍM	Of®39	0,38+08	0,08+03	0,1+3-3	O/ÖEnÖ
i&vhólysgfal	>S,ÖE<i	3,/E-Oi	Q,®O	0,02+00	-0,02+00	0>83	0,02+00	0,1+50	3,88+80	0,88+08
partéi r. {gye. falj	4,02-0	Ο,ΟΕΜΟ	wi	O,öE+Oö	0,02+00	0,02+00	0,02+80	0,32+00	3,3E+83	3, ©83
Gyoméi i, (vétagb.fal)	0,©33	O,CfBü	0,©$	3,0-2+01	0,02+00	0,08+83	0,32+00	3,1+83	8,88+83	0,©33
paristi. «falj	8,33833	3,©83	8,3E+83	ö;ÍE<!	1,18+30	ÜÁBG5	8,©53	3,©53	v/uE+íO	8,1+88
(Uí. fal?	3,©38	3,©80	5,©00	:3>53	0,02+00	Ι,Βί	0,©38	S,tW	ö,<OE+OŐ	3,©53
fesk	S,0s+83	8,B38	:8,B88	5,38+88	QfOE+SÖ	3,08+38	8,42+00	O^OEtüö	3,88+83	u,QE+03
Éj	3,03+88	8,BQ8	4,©80	3,08+83	δ,«< '	4,82+OS	Ο,δΕ+ÖO	8,ffit0ö	0,88+33	3,©83
Sft	Ο,ΟΕτδΟ	8,3Ε+03	0,©G8	Ο,ΟίΒΟΟ	4>00	18,38+80	Ο/ΑίπΛ	3, ©08	2, ©35	0,02+00
Egyé szőre»
1»	0,020	Ö,OE+OÖ	0,020	Ο,ΟΕ-ί-Oö	LOE+OO	- 8,©00	:8,3405	OfO&tí®	3,38+03	2,72+00

c οτ

Μ«· $ λ

Eorrásszetvek

Gélszenrek	SIB,	Bagjiály, M	Sslrafasr	Vsa '		Mr	SZOT,
Sje.tart.	Vsütó	©tart,	Ili tart.
tóswet	0,000	Ο,ΟΕτΟΟ	0>+36	O,WöO	8,32+33	3,$+55	CftO	5,32+53	3,02+30	2,72+88
fe .......	0,32+00	G>35	8,32+56	8,W)	3,32+33	3,32+00	Ο,ΟΕΚίΟ		l\öEíÖf)	2,02+00
S®	w®	0,02+35	3,52+53:	0,0£·;·00	3,0EtÍÖ	5,£+65	3,®+00	3,üEhíO	3,32+®	2JE+QÖ
tó	0fG£<!	s,w	3,.82+53	o/e+oö	5,52+00	0,02+83	0,82+60	0,8E+00	0,32+$	2,>00
te&ztt	ÖíöE4-GG	Ű,OE+SÖ	5>30	0,52+00	0,82+35	3,32+35	5,32+56	0,32+35	5,52+03	3,82+0ö:
HaajáMrij	0,32+$	5,(0	ÖyLS'tÜÖ	0,02+03	8,32+50	0,52+00	8,$+83	Ο,ΟΕ®	5,32+30	5,32+30: +
										1
tetikálú csont	yw	3,02+00	,«,qs+oö	3,82+35	6,$+03	5,$+$	Á®+3ű	:5,52+30	0,82+30	0,32+-83 ,
	3,32+00	öfSi/röö	:0,OE+$	3,02+35	5,02+30	G/öE^OO	3,02+50	ö/'vEtíS	0,02+58	0,02+05
Λ»Μμ4»·μΛ£ uootaö {vörös}	Ö,ü£+ÖO	Á02+00	.8,(0	3,32+58	5,52+30	3,02+30	0,02+08	5,52+80	0,32+50	3,32+50
Csctótíá {sárgái	0,32+00	0,02+80	0,02+50	8,52+08	0,02+00	0,02+30	8,02+85	ifúi'J'Oö	8,32+00	+0,32+55
te	3,>38	0,02+35	0f®+05	8,02+00	:5,32+80	i\ OE+öö	.................. ::3,02+30	0,02+35	0,32+03	3,52+53
Egyéb altofetók	0,02+55	0,Q£+00	8,52+50	3,02+00	5;ÍBOO	3,02+50	VfÍfe'ÜÖ	5,02+53	3,52+00	5,02+55
Sör	$,32+08	5,<O	OyOEROO	0,:8E+03	0,82+00	8, $+03	3,$+08	0,82+35	3,02+53	Ο# OS-tOü

* Λ >:

Ο τ « X

Fommenek
Célszerűek	tfeiléfo.	Hatály. tart.	SélradsM	Vűml·	»j	5®	BjS& szöv.
^«.tet,	Vékb.tart	Öli. tart.	Liitart
Ιφ	Wá	Ο,ΟύΟΟ	δ,ίΜί	0,08403	S;ÖEi30	o,s<	:0,55400	v/OEiGÖ	0,35«	0,05«
feék	AöO	WO	0,35400	0,05400	%,08430	0,05400	(3,05«	0,05«	1 4,55«	O>0O
fejein®	«GE«	a,os«	0,f0E<;	Q,öEn®	MM!	:8,0540}	3/OEíöO	0,05«	«05400^	0,05«
1 Κλ*\ΐ»\ ÍmAűW ^AvSftAtftV m jn® twsí	OfCO	13-84	.....-......... ' w	yw	:W3	90	w	2,25-01	2,35-02	0,05400
tejes tat	o>os	0>SS	Cös+oű	ö,ÖE+00	ŰfGE+öO	0,05+03	0,vM>	0,05«	6,05«	i,18«

ο ύ’ * Μ » < » ♦ í , » Α « »W 8 » tt * « 8 <* « »

*»8 $ ή ♦»>

* Λ *

imsHSSl ÉfflEWŐ SUööffi ------------------................—

Forrássaexvek
öábztwek		Sasiak,	ftiéMMtJ·» wGkíXWuSS.	Bőr	Isp	BS	Bjzstair,	Teljes test )
Vörös cs. velő.	tatíkális CStó :	irtó, csont
Mellékvesék	W6	3,»53	3,52+33	3,32+53	3,52+33	3,32+55	5,32+03	0,62+93	3,»50	3,02+53 +
:Sü$i. fal	5,02+00	0,52+03	3,02+30	Q,0E+53	0,32+39	3,32+35	0;>3Ö	0,52+33	O,feöö	3,32+53
partéi í. (®a. fali	OÚ'E+OÍ)	1!Í Uüi-röö	5,32+33 i	3,52+53	0,32+30	0,32+35	O/ö&vö	0,52+35	3,02+35	5,32+30
Syaa-hél r, (vsfcco§b.)	íi/SMí	3,35+33	3,32+30	3,62+33	0,32+33	0f (feí	3,32+33	0,ÖS^ÖC	0,32+35
: partéi. !, Juli fal)	wo	: 3,32+33	3,32+03	5,52+53	3,32+50	3,52+30	0,52+33	5,32+03	3,»03	3,02+30
5wir. íili.fal)	W3	0,02+35	3,02+63	5,32+50	3,32+50	Ö/jEtÖÖ	0,32+33	0,32+1	3,52+35	vföEKS
«c	Wö	3,52+33	3,02+53	9,32+03	, 3,02+50	5,52+03	0,32+03	......................... 3,32+53	3,32+35	) 5,02+05 :
Sí	0,»33	3,32+05	5,32+33	3,0E+33	3,»33	5,32+33	5,32+33	ö,üE+53	3,02+33	űíOEtüO
	WS	3,02+53	3,32+33	3,»05	3,52+33	5,32+53	5,32+53	5,32+00	3,02+35	0,02+55
^swetá									ί

*«« < ί

feássiervek
Célssfflá	fetefez.	Hassák	Cata&z.	Sör	láp	fea	fejzsár.	tejes test
Bőse. velő.	któkális^ csont	U&WV; □mt
I»	Ο,ΟΕ^ΟΟ	oys-too	3,0600	0,0633 !	6,36®	0,0680	3,36®	0>Ö0	0,36®	yyo
Sswssöwt	5,8608	8,03+06	Ο,ΟΕτϋΟ	0,3688	5,3600	0,06® !	8,®+®	Ö/JStOO	Ο,δΕ+33	3,36® +
fe	8,86®	5,8600	0,0600	3,0650 (	0,0600	V/vEtGO	G?ö£^CO	0,83+80	G,0St3ö	8,0653 )
«φ	3,86®	0,06®	0,3600	0,0638	3,0680	0,8683	0,3638	; 0,3608	Ο,ΘΕ+53	3,0630
&	5,8680	3,3600 i	0,0600	0,0600	0,3655	3,3630	5,6600	8,36®	5,03+08	3,06®
KKSSffi	6,8688	0,3600	GfüEf-O-ö·	0,0£83	0,0630:	3,3600	/86®	0,86®	0,3638	3,©08
toyáMrígy	0,36«!	0,3600	0,0633	3,0633	0,35+08	3,0600	0,3.600	3,ÖE+38	8,8600	8,06®'
	......
Wtikáiis csent	8,0E+83	0,3600	3,83+58	0,0603	3,1683	0,0600	8,3688	3,0633	3,8600	OyHOG
Trstóuláds csent	6,0600	3,5600	0,0633	3,0600	3/ W)	0,8603	/86®	0,3680	Ο,Ο'Ε/30	8,06®
Cstótóo (vörös)	8,3600	Ö,< (yÖv	5,5600	0,3600	V/öE+GG	0,3635	0,03+33	0,8600	0,06®	0,06® ;
Csísttóó (sárgaj	0,©·®	0,06®	8,0603	öföS+Oö	WSO	8,03+03	/0603	0,3630	0,3608	0,0633
te	3,3653	0,83+53	3,3600	0,36®	3,1600	0,86®	/03*30	8,3680	( 0,33+®	8,0608

L· V X

Mr s

ítaásszsmk
Célssosk	feteféss.	tapk.	Csmtaote,	&	lép	Mt	Sajísár,	teje test
®»s©, «lő,	torükálte csont	totó, csent
83A albtÓHszek	3>30	0föEí30	Ö,WOO	030	ooo	Ο,ΟΕΧίΟ	0,3«	(083	Ο,ΟΕόθ	0080
$&	Ö,«0	Ο,ΟΕΟ	ΰ,ΟΕτΰΟ	0,©88	WG3	Í,8E<	0,BS8	008	8,0«	o>ee
W	ISE®	0,CB+00	Ο,ΟΕίΟΟ	0,®00	UföEíüO			oeo	Ο,ΟΕίΟΟ	: 8,©00
swk	ö/C&QÍ!	<080	δ,ΟΕίΟΟ	ÍLOEHíö	080	8, ©00	ya®	0>88	Ο,ΟΡΧίδ	3,0«
íajssüiri®	OOO	δ,Βϋδ	WO	0>3Ö	8,3«	8,3«	§,M	Ο,ΟΟδ	0/&0δ	3,0«
Méh {» teste)	0,öE+Q8	©BOG	Ι,Β-δΟ	0,©8Ö	W	OfJüH'Oö	ooő	9>33	088	δ,ΟΕ+δΟ
tejes test	8,BŐS	OfOS+Oü	á>83	0,©00	á,M	ooí	23-02	ooo	ö,OwC	ο®

e ο τ

X ««♦ ♦ * ♦ » » X ♦ ♦ ♦ ♦♦♦ ♦ x x ♦ « f

X ♦ ♦ *

X φ « t»x ♦

19. táblázat

Sugárzás dozimetriás becslések, melyek egy „átlagos emberben (70 kg) egységesen, szétoszlatott indium-[1X1]-gyal jelöl t 2B8-MX beadásából származnak,, és az injekció beadása után 72 óra elteltével mért állati megoszlási adatokon alapulnak

Aktivitás mennyisége —	BAB	1000 gCi/bateg dózis	SAD
Mellékvesék	0, 4 93	Petefészkek	0,387
Hbgynölyagfai	0, 343	He snyálmirigy	0, 362
Gyomorfal	0, 412	Csontváz
Vékonybél	0, 434	Kort. csont	0,4 74
Cl, bélfal	0, 533	trab. osont	0,474
Ll. bélfal	0, 5ö5	Csontvelő (vörös)	0, 602
Vesék	0,625	Csontvelő (sárga)	0,602
Máj	1,533	Porc	0,474
Tudók	0,532	Egyéb alkotórészek	0, 474
Egyéb szövetek		Bőr	0, 564
.1. i. (.>'		Lép	0,854
Zsírszövet		Herék	0,239
Ver		Paj zamirigy	0,2 76
Agy		Méh (nem terhes)	0,473
Cziv		Teljes test	0,417

Hivatkozás: M1HD J. oí Hnci. Med./Suppl. 1, 2../-68,· ,,A Sebem fox' Absorbed-dose Calculatíon fór Blologically Distributed

Radi o rm e 11 d e s

A számításokat egy Spreadeheet Templat-e in Symphony ('Lotus Developmeut Corporation) segítségével hajtottuk végre, melyet Phlllip L, Hágán alkotott meg (M8 Huclear Medícine. Service, VA Hőseitől San Diego, CA 92161).

i Ο

19. táblázat

Sugárzás dozimetriád becslések, melyek egy „átlagos emberben 70 kg) egységesen szétoszlatott ittrium-[90]~nel jelölt 2B8-MX beadásából származnak, és az injekció beadása után 72 óra elteltével mért állati megoszlási adatokon alapulnak

Aktivitás mennyisége ~	BSD	10ÖÖ pCi/beteg dózis	RÁD
Mellékvesék	6,608	Petefészkek	0,806:
Bügyhőiyagfai	6,.271	Hasnyálmirigy	0, 880
Gyomorral	0,35δ	Csontváz
Vékonybél	0,504	Kor 11 ká I i s csont	2,138
Dl. bélfal	1/156	Trabekuláris csont	3,158
Ll. bélfal	1, '772	Csontvelő (vörös)	7,77 6
Vesék	3,366	Csontvelő (sárga)	7,77 6.
Máj	8,57 5	Porc	2,8 38
Tüdők	2,07 8	Egyéb alkotórészek	2, 318
Egyéb szövetek		Bőr	10,268
1 zom	2,716	Lép	8,965
/sirszövet	2,715	Herék	0,068
Vér	2,715	Pajzsmirigy	«:, 860 :
Agy	2,716	Méh (nem terhes)	Öl, 28 9
Szív	2,716	Teljes test	1,8 54

Hivatkozás: MIRD J. of buci. Med./Suppl. 1, 2/68 „A Schema főt Absofbed-dose Calcuistion fór Biciogícaily

Distributed Radionuclides*⁷

A számitásókat egy Spreadsheet Terápia te in Symphony (Lotus Developmsnt Corporation) .segítségévei hajtottuk végre, melyet Phíllip !. Hágán alkotott meg (MS Nuclear Medicina Service, VA Hoepital San Diego, C'A 9.2 lói).

111

A. in vitno vizsgál átok a 288-cal és a_2B8-MX-DTPA~val í, A 2Ső a.nfcl-Cü2ó antitest előalíitasa és jellemzése

Az Összesen kilenc fúzió hárem, olyan antitesteket termelő híbridőmát eredményezett, melyek hatásosan versengtek a rádiónktivan jelölt Couiter Bl antitesttel. Mindegyik esetben a hibrídómát egy 24 férőhelyes lemezre széiesztettük, Az első kettő, 1, és 4. fúzióból izolált antitestet ízotípusát meghatároztak, és mindkettőről megállapítottuk, hogy ighb A. harmadik antitestről, melyet az 5. fúzió termeit,, és 2B8-nak neveztük el, meghatároztuk, hogy IgGl kappa. izotipusű, és ezt választottuk ki a további vizsgálatokhoz. A 2B8.K11 kiönt szaporítottuk, és a hosszan tartó tároláshoz folyékony nitrogénbe helyeztük. A. 2B8.Bll~t szubklőnoztuk, hogy előállítsuk a 2B8.Hli.G3-t, és ismét szubklőnoztuk, hogy létrehozzuk a 2B8.Hl1.G3,Gr kiónt. Ezt a klönt szaporítottuk a további vizsgálatokhoz., és az antitestet protein A affinitás kromatográtiával tisztítottuk.

A jelöletlen 2B8, 31 és Len 16-t és radioaktívan jelölt Couiter Bl-t alkalmazó kompetíciós mérőéijárásokká 1 kimutattuk, hogy a 238 hatásosabban volt képes meggátolni a 31 kötődését a CDiö-hoz, mint az azonos koncentrációjú 31 vagy Len 16 d.. ábra} . Hasonló eredményeket kaptunk {adatokat nem mutatunk be} a fITC-kongugált 2St~t, a natív Bl-t és az üPC-10 és S-0D3 irreleváns antitesteket (IgG 2a illetve 1 izotóposok} alkalmazó kompetíciós mérőéijárásban.

A 288 és Bí antitestek közvetlen kötődését a CD20 antigénhez CDzO-pozitiv SB sejteket és CD28~negatíyv ESS sejteket alkalmazó FACS analízissel hasonlítottuk össze, A 2. ábrán bemutatott

eredmények azt mutatják, hogy az antitestek hasonló mennyiségénél a 81 helyett inkább a IBS kötődött az .SB sejtekhez. Nézi figyeltünk meg szignifikáns kötődést az irreleváns antitesteknél. Csak háttér fluoreszcenciát figyeltünk meg mindegyik HSB sejtekkel alkalmazott reagensnél. Ezek az eredmények igazolják a 238 CD 20 antigénnel való kölcsönhatásának spécititását, és azt sugallják, hogy lehetséges, hogy a zBB-nak nagyobb az affinitása a sejtfelszíni antigén iránt, mint a Bl-nek,

Abból a célból, hogy meghatározzak a 2Bü látszólagos affinitását, a tisztított antitestet ^1-vei radioaktlvan jelöltük, és a jelölt antitestet növekvő koncentrációban antigén-pozitiv SB sejtekkel inkubáituk; a sejthez kapcsolódé radioaktivitást egy egyórás Inkubációs Időszak után határoztuk meg (3. ábrák. Az eredmények azt mutatják, hogy a 2S8 antitest a CD20 antigénhez egy 1,3 X 10 M látszólagos affinitás! konstanssal kötődik.

A humán normái perifériás vér Izmfocitákkal végzett áramlásos citometriás vizsgálatok azt jelezték, hogy a 2B8 specifikus a Bsejbekre, és nem reagál más limfoeita típusokkal (például T~ sejtekkel, monocitákkal, makrofágokkai). A F1TÜ-jelölt 2B8~t összehasonlitöttuk a Bl-FITC-cei és a Len 16-FITC-cel a humán iimfocd.táknak ugyanazt a populációját alkalmazva. Az eredmények, melyeket a 21. táblázatban mutatunk be, azt jelzik, hogy a 2B8 a perifériás vér iimfocftáknak hozzávetőleg 11 százalékával reagál, szemben a Leu 16-tal, mely hozzávetőleg 12%-fcaI reagál, és szemben a Bl-gyel, mely hozzávetőleg lii-kai reagál. Egy másik limfoeita marker (CD-19) alapján a limfoeita populáció 11 és 14 százalék között volt. Végezetül, amikor humán periférián vér ilmfocitákat inkubáitunk a 288--cal és vagy a Bl-gyel vagy a Leu

Λ ** * φ κ ** ♦ X» *

♦ * *

16-tal, és CDI 9 markerrel (Bocton/Diokinson} kontraszt festettük# a B-iimfocíták kétszeresen fostődött populációja 9% volt a 2B3~

Bl-gyei vagy Leu 16-ta) íagensek hasonlóságát igazolták.

**% » + * ««·-** ♦ *

A 2Β8 humán perifériás vár limfocitákhoz való kötődésének összehasonlítása más B~ ás T-limfocita-specifikus reagensekkel

An ütést -ma r ke r á, Egyszeres festés CB4S-tel szűrt iimfociták szásaléka

Semmi (autóziuoreszcencía) 0

Bl-FX'TC (Coüter Immunologyg IgG2a_fk) XI

Len 16-FXTC (Booton Qickinson., J.gGl,k) 12

2B8-F1TC ÍEDEC, IgGlü) 14

B7 2.3---FITC (IgGlk irreleváns kontroll) 4 art 1-CD4-FTTC (Cedter Immuntlogy) 37 ao.t 1-CD3--FÍTC (Becton-Dickinson) 59 anti-CDi9-RPS (Seeton Dicklnson) 11 tüÍ-CD19-FITC (Bectct Dickinson) 14

B. Kettős festés:

Bl-FITCÁanti CD19-EFE 10

Len I6~FTTC/anü CD19-RPE 10

2.B8 FTTC/anü CD19-PPE 9 anti-CDI 9 FITC/anti CD19-RPE 13

Bl - FI TC/s.n ti Hu lg EPE 2Bö~RITC/anü Hu lg EPE

Loucogato Simultest

A radioaktivan jelölt sejtse CD20 antigén 2B3~cal vagy Blgyel végzett immumprecipitáciőja hozzávetőleg 33 és 35 kDA molekulát omegű meg különböztet hetétlen kettős fehérje precipitáciöját eredményezte -(adatokat nem műtétünk be) .

2, A zBu-íkó-öTAA előállítása és jellemzése

A. 2S-8-MX-DTPA konjugátunot úgy állítottuk elő, hogy az antitestet az izotiocíanáto-benzil-3-metii-dietilen-trieminpentaecetsav 4:1 arányé moláris feleslegével reagáltattuk (4). Jellemzően 1-2 möl MX.-DTBA belátót vittünk be a 2B8 antitest egy móljára nézve. Ahogy a 4. ábrán bemutatott eredmények mutatják, a 2:B8-MX-DTPA konjugátum nem mutatott látható irmnunreaktivitáscsökkenést, szemben a natív zBö-cal, míg a natív és konjugált 2BS antitest is látszólag azonos B1 inhibiciős profilt fejezett ki; az 1C50 érték a 2B8~náI és a 2B8-MX-DTBA-nál hozzávetőleg 3 pg/ml illetőleg 4 volt. Ezeket az eredményeket ^XI~jelölt SÍ antitest alkalmazásával kaptuk egy teljes sejt radioimmunoassayvei, melyet SB-sejteket alkalmazva hajtottuk végre. Hasonló eredményeket kaptunk a 2B8-at vagy 2B8~MX~DTPA-t alkalmazva a

......1 -jelölt 2B8 SS sejtekhez veié kötődésének inhibitoraként, és a 2Bö és MX-STBA konjugálássá is gátolta a Ι -2B8 SB sejthez való kötődését hozzávetőleg 3-4 ai/ml koncentrációnál (adatokat nem mutatunk be).

A natív 2B8 antitest és a 2B8-MX-D-TFA konjugátum in vit.ro stabilitásának mérésére a mintákat normál sőoidatban vagy ló mM glicln-HCi-t tartalmazó normái sőoidatban (pH~ü,8) inkubaltak 4'''C-on és ő-Pő-on 12 héten át, és az alikvotokat hetenként kiértékeltük a következő mérőéijárásokat alkalmazva: immunreaktvitás mérése teljes sejt enzím-immunoassay-vel, SDS-PAGE redukáló és

X Φ * * φφφ* *φ* *φ* * nem redukáló körülmények között, és isoelektromos fókuszáló gé elektroforézls·., Míg az. ísssu-nreaktivitási assay~k nem mutattak k az antItestmlcták antígénfelísmerésében csökkenést egyik inkubá ciős hőmérsékleten sem (5. ábra), az antitest bil volt. 0,2. pH egység csökkenés

Tí’S

0. heten;·, mely 4^vC-on sfa mutatott 30°C~o.n a hatod!

hét tamazai az eredmény azcsoan nem eovertermü assav k:

sebé ítáa « )

		238 30 SÁL	2Βδ 4 GM	................................	Μ 39 Sa	2« , S	2Β8-ΜΧ 30 ®
η u	? >4V~	,46-	.fi 07 v Z ű f		7,46-	A A ’Ί • Α V Ü j J ι	j 6,39-8,21		6,30-1,21	......... .......................5
	’ ' 1		.fi vz	2 4;	7,42-3,27	7,48-	•3,31	A	............................... 46-8,24	6/.9-8,26	6/H/5	6,32-3,24	6,25-8,23 |
	Ί ,t ......	,38-	8,	21	!,45-3,34 .	7,95-	.................... -5,69 ί	A <<	45-8,34	6,82-8,40	6,32-3,34	6,92-3,99	5,95-8,27
! s 5	A ,(	í * 1	-a,	X j j	7,33-8,35	7,49-	•3,29	t-y ' /	33-8,29	6,9-8,29	/* Λ Λ Λ ο,ί·/(^	6,0-8,22	,ί 6,0-8,15 j
1	1 „„„„	,38-	-8,	24	7,38-8,24	?*ί Λ Λ Λ Λ	7*1 7	38-8,28	5,39-8,28	5,99-8,35	5,99-8,35	ί 5,53-8,35
‘ 1* 1 3	1	,29·	8,	25	7,29-8,25	7,37-	•8,32	} 1 /	33-8,32	5,38-8,32	5,30-8,27	5,90-8,32	5,99-8,27
h	Ί	a/, z Z‘f	-íf V(	13	7,29-3,27	1,21-	-8,27	/	A A λ Ί A Zd~5 51.Z	fi 5X.fi y? Ο z ö J v z Z 3	5,35-8,27	S &Μ η w f U ν' V < λ, .'	5,85-7,95 ί
Η· j 1 1 '	: 7	W Z	.fi vz	Λ Λ	7,17-8,32	ί χ, / ζ X	.fi V f ί* V?	/	1 7-fi; fi /	6,02-8,25	| 5,95-3,32	---------------{ 5,95-8,32 ]
i 3	A 1	,33-8,	29	- 7,26-8/36	7,40·	•8,36	5,86-8,36	5,86-8,36	5,86-8,36	5,86-8,21
! A !	' ti ϊ /	,49-3,	53	7,26-3,45	*7 /Ί όί	-8,45	A ’í	34-8,39	5,93-8,45	5,93-8,45	5,93-8,45	3,93-8,23
J 10	Ί	z 26	3,	27	7,19-3,27	'' 7,26'	4/7	A !	19-8,27	5,35-8,35	5,85-8,35	5,33-8,35	j 5,95-3,13
11	'? )	,40-	Λ	21	7,13-8,27	) 7,49-8,35	Λ ?·	13-8,13	ΐ ! !‘ λ A A A''' 1 V/ v V V J S.1	5,83-8,27	5,33-3,27	j.................................................. 5,93-3,13
12	1	A A	rt »A	13	t****................................... 7,94-8,18	J...................... 7,26· ^4444444.4444444444444	c ‘ifi ’öf ÁÖ	í 2*44	19-8,11	7,19-8,26	5,59-8,18	5,50-8,26	5,90-8,18

* A « tx« ***X '·: Ί .Ad.

A natív 2.8-8 és 288~MX-D3?PA hintáit eltérő pufferekben formu.....

ráztuk, és vagy 40 vagy 30*C-on Inkubaltuk 12 h-éfen át. Ezalatt az időszak alatt különböző assay-ket hajtottunk végre, ezek közé tartoztak az izoelektromos pont meghatározások, A fentebb bemutatott értékek a natív és a konjugáit antitest izoelektromos pont tartományát mutatják be, mely antitesteket mindegyik hőmérsékleten mindegyik készítményben, és a tizenkét hét mindegyikében Inkubaltuk a stabilitási vizsgálat alatt,

A fejléc feliratai; .288 4 SÁL: i*C~on söoldatban Inkubáit

288;- 238 30 SÁL: 30°C--on só-oldatban inkubáit 288? 28« 4 GLY: 4°C-on 10 mb gi leint tartalmazd normái, söoldatban inkubáit 288? 2B8 30 GLY; 30°C-on. 10 mM glicint tartalmazó normái söoldatban inkubáit 288; 288 -Mx 4: SÁL; 4°G-on söoldatban inkubáit 2:8-8-MXDTTA (konjugátnm;? 288-MX 30 SÁL: 30*C~on söoldatban inkubáit konjugátum? 2B8-MX 4 GLY: 4'*C”On 10 mM glicint tartalmazó normál söoldatban inkubáit konjugátum; 2B8-MX 30 GLY; 30°C-on 10 md glicint tartalmazd normál söoldatban inkubáit konjugátum.

Végezetül, nem redukáló SDS-PAGE-t alkalmazva 3ö°C-on az antitestmínták nagy molekulátómega aggregátumokat mutattak egy hét múlva (23, táblázat).

A gélek denzitörnetrlás analízise azt mutatta, hogy az aggregátumok a minták 8-17%-ában mutatkoznak. (23, táblázati. Mindemellett, amikor ezeket a mintákat redukáló SDS-PAGE-vel elemeztük, nem találtuk meg a nagy molekulatömegű tipus bizonyítékát, ízely az antitest aggregátumok 30^cC-on történő képződését sejteti, Az immunreaktivífás csökkenése megint nem volt megfigyelne23, táblázat & 2B$ in vitro stabilitása

A: A s«b redukáló SOS gélek, deszitoráétriás vizsgálata

Minta	Százalék
Nagy ssolaknlatönegű	Monomer	Kis mnlaknXatónegő
) Referencia	0	100,00	0
12 n é t /1 0 C /' s ο ο 1 d a t	ö	95, 42	4,58
12. hét/4 C/glicin	0	100,00	0
12 hét/30°C/sőoidat	?, 63	33, 34	9, 03
12 hét/3OsC/glicin	16 f 70	72, 11	11,18

B. Redukáló SDS-gálak denzztosnetriás vizsgálatai

Minta	Százalék
Nagy solakulatömegű	Monomer	Kis nolekulatömegí
Referencia	0	Iöö, 00:	0
12 h é t / 3 0 ;i C / s ő o .1 d a t	ö	100,00	0:
12 hőt/30’C/glioin	G	10,00:	Ο

.Ezalatt a stabilitási vizsgálat alatt a 40'C-on és 30^:°C-on ínfcufoált 2BB-MX-DT'?A mintáit is teszteltük a radioaktív fém beépülésére ''V-t alkalmazva. A mintákat a 4., 8, és 12 héten mér™ <ρ·\ tök a 90%-nál nagyobb 'Y-ra, tekintet nélkül az inkubációé hőmérsékletre Végül egy különálló vizsgálatban a 4°C-on és SO'C-or 10 héten át inkubált 2S8-MX-DTPA aiikvotjait radloaktivan jelöltük *'^ulnnél, és a szöveti biológiai megoszlást BAtB/o egerekben vizsgáltuk meg. Mindkét inkubációs hőmérsékletnél az előállított konjugátum hasonló biológiai megoszlást mutatott (adatokat nem mutatunk be) . Sőt a kapott adatok, hasonlóak voltak azokhoz a bielögial megoszlási adatokhoz, melyeket BALB/c egerekben 4®C-on 11·!

tárolt i-jelölt konjugátumokat alkalmazva kaptunk {lásd lentebb ) .

ügy találtuk, hogy a radioaktív jelölési eljárás a ‘Arrnél

Ö-O Ί Ί és az .....Y~nál is reprodukálható volt. Jellemzően az In-nél >951 <1;> 'í 7 1 Ö.f) és az A-nái >90% beépülést kaptunk. A 'Άη~ és ' A-jelölt konjugátumok specifikus aktivitása szokásosan 2-3 mCi/mg antitest illetőleg 10-15 mCi/mg antitest tartományba esett. A '“''inCg,A és 'Ά radioaktív jelölési eljárás kezdeti kifejlesztésekor a komplexbe nem vitt. .radioizotőpokat eltávol.ítottuk a radioaktívan jelölt 2S8—DTPA-bóI HPLC gélpermeációs kromatográfiát alkalmazva. A későbbi kísérletekben az. indium~jelölt konjugátum HPLC tisztítását kihagytuk, mivel igen nagy radioaktivitás-beépUlést kaptunk, ezzel az izotóppal {>95%) .

A 2B8-MX-BTPA 'in- és A-j elölt készítményeinek sz ímmunreaktivítását Lindmo eljárásával (3> elemeztük. A ^iln-nel jelölt zBB-KXD'TPA-röl úgy találtuk, hogy 100%-osan immunreaktiv (6. ábra)·, és a Υ-jelölt konjugátum esetében €0%-os immunreaktívitást határoztunk meg (adatokat nem mutatunk be).

7 : ííh

J,_A .......Alt- és A-Jelölt .2BB-éOf-OTFA jellemzése

A 'A-jelölt konjugátummai végzett elővizsgálatok bebizonyították, hogy jelentős antitest-lebomlás és ez ímmunreaktivitás elvesztése fordul elő 10 mOi/mg antitestnél nagyobb specifikus aktivitásnál. Ezért egy készítmnényt fejlesztettünk ki, hogy minimálisra csökkentsük a rádióiisis hatásait. Bár számos kis moiekuiatömegü szabadgyökös rmantesítöanyagct értékeltünk ki és hatásosnak találtunk, a humán szérumaibumin (HSA) nagy koncentrá121 „

Φ·** *<* * •cíóí voltak a leghstásosafobak sz antitest épségének és immunreaktivitásának megőrzésében (7-9. ábra).

A ^:*^uY“jelölt antitestet 75 mg/ml HSA-t tartalmazó 1 X PBS-ben (pH~7,4) formnláztuk; diétáién-triamin-pentasceisavat (DTPA) is adtunk hozzá 1 mM végkoncentráciöban, hogy biztosítsuk, hogy valamennyi *^VY, mely az antitestről· elveszhetett, keiértá alakuljon A 2B9-MX-BTPA degradációját, mely 14,6 mCi/mg specifikus aktivitásig radioaktívat jelölt, a 0, és 48. órában kiértékeltük

SDS-BAGE-t és autoradiográflát alkalmazva. A 8, és 9. ábra azt mutatja, hogy a radioaktivan jelölt antitest nem mutat szignifikáns lebomlást egy 48 őrás időszakon át, amikor i^C-on inkubáituk. Az instant vékonyréteg fcromatográfiát alkalmazó anaiizh.s azt mutatta, hogy az .....Y~veszteség kevesebb mint 2% a 48 órás inkubálás alatt (21. táblázat) . Az immunreaktivitás .szintén viszonylag: állandó, 60% (24. táblázat).

24. táblássá.fe

Qf>

^linxkailag foraxuláasofet Y-2BS-HX-DTPA sfe&bilífeása

Idő (óra 4':‘C-on)	Százalék konjugátumhoz	Százalék
	kapcsolt radioaktivitás	immunreakt ivi tás
0	97,2	62
24	96, 2	60
4 8	96, 2	69

A radioaktivan jelölt konjugátumot (14,6 mCi/mg specifikus aktivitás) PBS~ben (pH-?,!) formuláztunk, mely 75 mg/ml humán szérum albumint és 1 mM DTPA-t tartalmazott, és az aiikvotokat 4°C--'On inkubáituk. A konjugátum stabilitását a bemutatott időpontokban SDS-PASS-vel és autoradiográfiával, instant vékonyréteg kromstográfiával és teljes sejt kötési assay-vei analizál,j. Ζ Ζ tűk. Az eredmények azt. mutatják, hogy a radioaktív fém hozzávetőleg 96%-a konjugátumhoz kapcsolódva marad 48 óra múlva. 4°C-oa_f ás az antitest immunreaktivitása állandó, hozzávetőleg 601 maradt .

Formuláiási vizsgálatokat is végrehajtottunk a “'in-jelölt kenj nyakúmmal; a specifikus aktivitás 2,2 mCí/mg volt. A rádióaktívan jelölt antitestet 50 mg/ml HSA-t tartalmazó I X PBS-ben (pb^:::7_f4) értékeltük ki. A 10, ábra az autoradiogrammok fényképeit mutatja a 0. időpillanatban és 40, órás inkubálási mintáknál;

az autoradiogrammok denzitomet ri.ás analízise azt jelzi, hogy a radíoaktivan jelölt antitest nem bomlik le a vizsgálat folyamán (11., íz. ábra.; A minták instant vékonyréteg kromatográfiás analízise igazolta, négy nem volt .....In-veszteség (25. táblázati; sőt az immunreaktivitás hozzávetőleg 100 %-ba.n fennmaradt (25. táblázati.

25. táblásat

Klxaikailag formulázott ^λΛ~1η~2Β8~Μ^·~ΠΤΒ& stabilitása

Idő (óra onj	Százalék k on j a gát umh ο z	u X cl ± íX k.
	kapcsolt radioaktivitás	immunreakt ivitás
0	94,0	105
24	96,5	104
4 8	96, 0	100

A radíoaktivan jelölt konjugátumot (2,2. mCi/mg specifikus aktivitás) PBS-ben (pH-7,4) formulaztunk, mely 50 mg/ml humán szérum albumint tartalmazott, és az alikvotokat 4^cC-on inkubáltuk.

A konjugátum stabilitását a bemutatott időpontokban SDS-FAGF-vel és autorauiográtiával, azonnali vékonyréteg kromatográfiával és teljes sejt kötési assay-vei analizáltuk. Az eredmények, azt mut, tátják, hogy a radioaktív fém hozzávetőleg 969 a kapcsolódva marad 4 8 őrá múlva 4 ^eC-os, és konjugátumhoz az antitest immunreaktivitása konstans, hozzávetőleg 100 % maradt.

ÖvO

Amikor egy 'Y-nal 14,6 mCi/mg specifikus aktivitásig radioaktívan jelölt 238-MX-DTPA egy krinikailag formuláit készítményét Ínkubáltuk 96 órán át 37^öC-on humán szérumban, és nemredukáló SDÖ-PAéE-vel és autoradiográfiával analizáltuk, a radioizotóp kevesebb, mint 4 %-a veszett el az inkubációs idő alatt. Az autogramok denzitometriás vizsgálatai a ü. időpontban és a 96. órában azt mutatták, hogy a radioaktívan jelölt konjugátum nem bomlott le szignifikánsan- <13-15. ábra). Ezeket a ö. időpont szerinti és a 96 őrás minták analitikai vékonyréteg kromatográfiás analízise igazolta (26. táblázat). összegezve ezeket az eredményeket, feltételezhető , hogy az ittrium-jelöit konjugátum stabil az ebben a vizsgálatban használt körülmények között. Hasonló eredményeket kaptunk a “^Xn-nei jelölt 2B8-MX-DTPA. konjugátummal )16-18. ábra).

26. táblázat: A humán szérumban §6 órán át 37⁰C-oa inkubált

Q A y~2B8~MX~DTPA analitikai vékonyréteg kromatográfiás analízise

Idő (óra 37öC-oiií	i Százalék kon)agát untot kt radioaktivitás	pcsóit
0	95,1
24	95,2
4 8	93,2
'*? ··> 7 xl	92,0
96	91, 4

on

A 'Y-2B8-d9X-öTPA-t (14,6 mCi/mg specifikus aktivitás) tartalmazó humán szeruzuaintákat a bemutatott időpontokban elemeztük ** ·* * « X ·> * « * * · » * ' * χ « «Χ«« * * * >«♦ #Χ« * ** ** a minták 1:20-as hígításának 1 μΙ-ét azonnali vékonyréteg kromatográfiás csíkokra pöttyezve; a mintákat három példányban elemeztük, A kromatográfiás csíkokat úgy fejlesztettük ki, hogy a kromatográfiai metanol:vízben (1:1, tf/tf) léve 10% ammóniámacetátfoan végeztük, szárítottuk, és keresztbe félbevágtuk. Mindegyik csík alsó és felső teléhez kapcsolt radioaktivitást ezután meghatároztuk, és a százalékos kongugátumhoz kapcsolódó radioaktivitást kiszámoltuk. (A szabad radioaktív fém az oldószerfronttal mozog, míg a fehérjéhez kapcsolt radioaktivitás a kiindulási ponton maradt. A konjngátumhoz kapcsolódott radioaktivitás meghatározásának átlagát mutatjuk be,

B. Álaltokon végzett vizsgálatok

1- hagy dózisé f a r m a k o iö g 1 a 1 /1 ο χ 1 c 11 á s 1 vizsgálatok a 2B8-oal és a 288~MX~ü'TPA~val

Egy Wh.ite Sanda Research Centerben végrehajtott GLR vizsgálatban (vizsgálati szám: 9201112, javai makákö majmoknak intravénás injekcióban különböző dózisa 238-t adtunk be. Mindenegyes újabb injekció előtt vérmintát vettünk, és a vért a limfoeita populációk áramlásos citometriás kiértékeléséhez feldolgoztuk (2h táblázat)

5 φ««Φ ΦΑΧΦ «*♦ ♦ ««

Φ φ Α ♦ <

* « **Φ Φ*

Φ ♦ φ Φ * * ί « χ* **

27, táblázat

Árasztásos cxtometriával maghatározott főemlős B-sejt populációk 2B8 asttl~CD2ö monoklonális antitest infúziója ufcáa Dózis ” —·δα._<,.*.·Β

X. csoport sóoldat

20, 1 18,3 21, 6 14.-· 6 zü

8, -s

XX . csopot b mp/kq i 6, '.·. 7,1 6,0 « Oá u, 6 mg /κο

5,7

XXX. csop,

701

1.5 χ -.5

6, 1. 8, 6 sí

71.

2,5 mg/kg 21, 6

Állat száma Dózis Nap S~saj kimerülés

	126
13	• *·♦♦ φ ** * * * ♦ * ««« *** »4 ~ ***** .;W, Ο'	«« ♦♦ * * * <' **;♦ * * «♦* *5 0
7 54	2,5 mg/kg 0	19, 9	0
	1	11, 2	44
	7	10,5	47
	13	9, 0	55

IV. csop.
	782 10 ina/kg	ö	15,9	0
		1.	3,0	81
		7	3,5	78
		13	6,5	59
	164 10 mg/kg	0	17,7	0
		1	8,4	47
		~ •A	7, 9	50
		13	7,7	42
V. csoport
	’ö r 16 eg/kg	0	17,2	0
		1	- '·>	7 0
		7	1,3	69
		13	8,2	52
		38	17,1	1
		52	13,3	7 7
	716 lö mg/kg	0	34,7	0
		1	18,6	46
		7	8,1	77
		13	3,5	90
		n Ζ 3	6, 9	80
		•xZ.4.	0 > Sg A,-	61
:: Az ossz llmfocíták százaléka
anti-egér IGG-RPE ·;· anti-homán	1G-P1TC kétszeresen festő
markér reage	msekkel mért B—sejt populá	cló (az anti-egér	IgG·	APS
a CD2Q-szal	blokkéit 2B8-L és az	ant χ —	humán Ige F1TC a	ma 3 om.	B-
sejtfelszíni	l'g-t. matatja ki) .
Az 1-17.	csoport állatai minden 48	. órában, összesen	í héts	zár
kaptak in jak	ölöt; Az V. csoportba	tartozó állatok egyez	er, a	0,

-·. ζ.

φ, Φ « « κ ψ * Φ *

JXÍ «♦» * ** ** napon kaptak injekciót., A III, és IV. csoport állatait a 14. napon fájdalommentesen megöltük.

Nem jegyeztünk fel e 2B8 anti-CDzO antitest beadásához kapcsolódó szignifikáns farmakotoxikus hatást .sémiiyen, a vizsgálat alatt vagy után értékelt klinikai paraméternél sem. Hasonlóan semmilyen abnormalitást sem figyeltünk meg a Ili. és IV. csoport állataiból kapott különböző hisztopatológiai minták elemzése során .

A vizsgálat 14 napon, át tartott, és az állatokat a vizsgálat alatt a következő kategóriákban értékeltük: klinikai megfigyelések, testtömegek, testhőmérséklet, táplálék és víz-felvétel; bélsárkiürités, szérum-vegyeiemzés, hematolőgía, vizeletanaiízis és fizikai vizsgálatok. Továbbá az áialtoktől mindegyik csoportban vért vettünk a 0,, 1., ?, és 13. napon, és a vért a szérumantitestek (2B8) mennyiségére és a T~ és B-sejtek mennyiségére kielemeztük. A 13. napon a 111. és IV. csoportba tartozó állatokat. fájdslommentesen megöltök, és a kiválasztott szöveteket mintapreparációt követé fénymikroszkópos vizsgálattal megvizsgáltuk. A kiértékelt szövetek a következők voltak: szív, lép, máj, vese, tüdő, agykéreg, gerincvelő, nyirokcsomó, gyomor, ileum, vastagbél, vázizom, here/petefészek, hasnyálmirigy, és csontvelő.

Amikor a kezelt állatokból származó vért a keringő T- és 3sejtek mennyiségére elemeztük ki, a ii~Vi csoportba tartozó állatok >50% keringő B-sejt veszteséget mutattak a 13. napig (13. .ábra); az antitest beadása nem volt hatással a T-sejt mennyiségére (adatokat nem mutatunk bej , Az összes 2S8-t kapó csoport a B-sejtek telítődését és a plazmában az antitestek nagy mennyisé12 8 « * « > « X* * * gét mutatta- (nem mutatjuk bei , Az V. csoportba tartozó állatok, melyek a 38 egyszeri 10,0 mg/kg-os dózisát kapták, szintén csökkenést mutattak a keringő B-sejtek mennyiségében, mely azonos volt- a más csoportokba tartozó állatoknál megfigyeittel.

Az I., II.. és V. csoportokba tartozó állatokat 52 napon át vizsgáltuk (20, ábrái. B sejtek mennyisége a normálisnál 70%-nál nagyobb mennyiségre tért vissza a 3-8. napra, kivéve egy állatot a II csoportban (PRQ604; és egy állatot az Vt csoportban (PRO716). A keringő B-sejtek mennyisége erekben az állatokban a normális mennyiség hozzávetőleg 40%-a maradt 52: nap után.

S mellett a vizsgálat mellett a ^O'¥-2B8-MX~D-TPA farmakotoxikus hatásait is mértük javai makákő majmokban a White Sánds Research Centernél végrehajtott CLP vizsgálatban (Vizsgálat száma:: 920011} . Klinikai minőségű konjugátumot nem radioaktív 'Y-nal telítettük. Az ittrium-hordozó konjogátúrnőt 75 mg/ml humán szérumaibumint és ImH DTFA~-t (klinikai készítmény) tartalmazó P3S~ben (p5-0,8; formrláztuk, és intravénásán adtuk be a Módszerek fejezetben leírtak szerint.

Ahogy a 21. ábrán levő eredmények mutatják, a ^O'A-jelölt 2B8MK-DTFA-nak kicsi hatása van, ha egyáltalán van, a keringő Bsejtekre ezekben az állatokban, függetlenül a beadott dózistól.

Továbbá a Iimfociták általános kimerülésén (20-45 %} kívül semmilyen szignifikáns abnormalitást nem találtunk semelyik becsült klinikai paraméterben, ide értve a szérum vegyelemzését, vízele tanaiizist testtömegeket és hőmérsékleteket, .2. zérmakoklnetlkal yizsgálőtesk ,_a 2B0goal_^s^_2öá-/Ct-0TPAval φ Φ X Φ * * « φφφ » * * * * ♦· _Λ Φ φ * * φ * * » χφφ φ»Φ * ** **

Ahogy fentebb leírtuk, az V. csoportba tartozó állatok egyetlen 10/0 mg/kg 2B8 dózist kaptak. Az adatok lineáris regressziós analízise azt sugallják, hogy a natív antitest kiürült ezeknek a majmoknak a keringéséből hozzávetőleg 4,5 napos β tb-s értékkel. Egy hasonló vizsgalatban BALB/c egereket alkalmazva a β tb-s értéket lineáris regressziós analízissel meghatároztuk a nativ és a konjugált 21B8-ra is (nem mutatjuk be}, ars! 3,75 nap volt (22, ábra}. Szék az eredmények azt mutatják, hegy a 2BS konjugációnak nincs hatása a BAPB/c egerekből való kiürülésre.

.3. Biológiai megoszlási és tumorlokalizációs vizsgálatok ra~ dloakfl van jelö11 2S8-MX~DTPA-va1

A fentebb leírt előzetes biológiai megoszlási kísérletekre '1 ·; 1 építve (2d, fejezet), konjugált 2B8-t '......In-nel jelöltük 2,3 ruCí/sig specifikus aktivitásig, és durván 1,1 gCi-t oltottunk be húsz BALS/c egér mindegyikébe, hogy meghatározzuk a radioaktivan jelölt anyag biológiai megoszlását. Ezt követően öt egérből állócsoportok mindegyikét az 1,, 24,, 48. és 72. órában fájdalommentesen megöltük, és a szerveiket és a bőr, izom és csont egy részét kivettük, és az elemzéshez feldolgoztuk. Továbbá 24-72 órás időpontokban vizeletet és ürüléket gyűjtöttünk össze, és elemeztük. A radioaktivitás mértéke a vérben az első órában mért a

40,3 % beadott dózis/gramm-röl a 71, órára 18,1%-ra esett vissza (1-4. táblázat; 23. ábra). A szív, vese, izom és lép értékei 0,7-9,8 % tartományban maradtak a kísérlet folyamán. A tüdőkben található radioaktivitás mértéke az 1 órás 14,2%-röl a 72. órára 7,6%-ra csökkent; hasonló módon a megfelelő májba injektált dózís/gramm érték 10,3% és 9,9% volt. Ezeket az adatokat alkalmaz130 χΦΦΦ Φ*** ♦ »* ** β φ * * * * ' ΦΦ* φφφ * φ *** ** φ X- ΧΦφΧ Φ Φ * «ΦΦ φφφ * ** ** tűk a '^{: :}'^;ln-2B8-MX-DíPA sugárzás abszorbeált dózis becslések meghatározására (19, ábra),

A 12,2 mCi/rag antitest specifikus aktivitású ‘Ύ-jelölt konjugátum biológiai megoszlását BALB/c egerekben értékeltük ki. úö%-nái nagyobb radioaktív beépülést kaptunk, és a radioaktivan jelölt antitestet HPLC-vei tisztítottuk. A radioaktivitás szöveti lerakódását kiértékeltük a fő szervekben, és a bőrben, csontban, és a vizeletben és a bélsárban 72 órán át, és százalékos beinjektált dózis/szövet értékként fejeztük ki. Az 5-8. táblázatban és a 24. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy míg a vérhez kapcsolt radioaktivitás mértéke hozzávetőleg az 1. óránál mért .39,2 ó injektált dözis/grammröl 15,4-s-ra csökken 72 óra múlva; a farokhoz, szívhez, izomhoz és lép hez kapcsolódó· radioaktivitás mértéke közei állandó 10,2%, vagy kevesebb a kísérlet alatt. Lényeges, hogy a csonthoz kapcsolódó radioaktivitás az egy óra múlva mért 4,4% beadott dózis/gramm-töi 3,21-ig változott a 72. órára, összességében ezek az eredmények azt sejtetik, tőgy kevés szabad ittrium kapcsolódik a konjugátnmhoz, és ez a kevés szabad radioaktív fém. szabadult fel a vizsgálat folyamán, Ezeket az adatokat alkalmaztuk a sugárzás abszorbeált dózis becsült értékek meghatározására a 9ny~2&ö-bX~DTPA-nái. (20.

táblázat).

A tumoriokalizéciós vizsgálatoknál a 2B8-MX-DTBA-t elkészítettük, és ^Jln-nei radioaktivan jelöltük 2,7 mCí/rag specifikus aktivitásig. A jelölt fconj ugátum. száz mikröliterét (hozzávetőleg 24 üCi) oltottuk ezután 12 tirnusz nélküli egér mindegyikébe, melyek Hamos B-sejt tumorokat hordoztak, A tumorok tömege 0,1-1,0 gramm között változott.. Az injekció utáni ö., 24.,

48. és 72 φφφ» φ órában 50 μύ. vért vettünk szemüreg mögötti ounkciőval, az egereket cervikális diszlokác.iöval fájdalommentesen megöltük, és a farkat, szivet, tüdőket, májat, vesét, lépet, izmot, combcsontot és tumort kivettük. Miután előkészítettük és lemértük a szöveteket, mindegyik szövetfaj fához kapcsolódó radioaktivitást egy gamma számlálót alkalmazva meghatároztuk, és: az értékeket százalék beoltott dőzis/gramm értékként fejeztük ki.

Az eredmények (25. ábra) azt matatják, hogy ^!'^ΑΛΙη~2Β8~ΜΧ-δΤΡΑ tumor koncentrációi egyenletesen nőnek a kísérlet elejétől a végéig. A. beoltott dózis harminc százaléka a tumorban halmozódik fel 72 óra múlva. A vérszintek ezzel szemben, a kísérlet alatt a

0, időpont szerinti 30% feletti értékről a 72. órára 132-ra csökkent. Az összes más szövet (kivéve az izmot) a. beínjektált dőzís/gramm l,3-6B-át tartalmazta a kísérlet vegére; az Izomszövet hozzávetőleg a beínjektált dőzís/gramm 13%-át tartalmazta.

C. Dozimetria

Az összesített dozimetriás adatok, melyek a normái BALB/c egerekből származó biológiai megoszlási vizsgálatokbéd. származtak, és a 19. és 20, táblázatban mutatjuk be az indiummai illetőleg ittriummal jelölt konjugá túrnak, esetében, összhangban állnak a szakirodalomban megtalálható adatokkal mCi beoltott dózisonként összehasonlítva (5) , és azt sejtetik, hogy _a 2BS ittriummal és irídiummal jelölt konjugátumai is biztonságosán kiértékelhetők a Iimfőmás betegekben e klinikai hatékonyságra.

D, Toxikológia

1. 2B8:Bgydőziaos általános biztonsági teszt

Egereknek és tengeri malacoknak egyetlen intraperitoneális 2B8 dózist (0,5 ml illetőleg 5,0 ml) adtunk be, és hét napon át '2 *'>

J. ,.ί <..

«»* * * ** *» « « X ♦ * · -♦ v <·>♦ **<► X * >** ** <r·*·** «s* # «* ** megfigyeltük őket. A toxicitásnak szemmel látható tüneteit nem figyeltük meg,

2, 2B3 és 2B3-MX-DTBA: immunhisztológial vizsgálatok humán szövetekkel

A 2B8 egér monoklonális antitest szöveti reaktivitását különböző humán szövet 32 acetónnal rögzített paneljét alkalmazva becsültük meg. A 2B8 antitest az anti~^:CD20 antigénnel reagál, mely szöveti megoszlásának nagyon korlátozott mintázata van, a nyirokszöveteknek csak egy kicsi, hematopoietikus eredetű csoportjában figyelhető meg.

A nyirokcsomóban immunreaktivitást figyeltünk meg érett kérgi B-limfociták populációjában valamint a germinálís központok proiíferálö sejtjeiben, Szintén pozitív reaktivitást figyeltünk meg a perifériás vérben a mandulák B-sejt területein, a lép fehér velőáliományában, és a Limuszban található velöállományi iimfociták 40-70%-ában. Szintén pozitív reaktivitást figyeltünk meg a vastag bél iamrna propriajában (Peyer plakkok foilikulusaibanj. Végezetül különböző szervek, igy a húgyhólyag, mell, tüdő, méh, nyelőcső, tüdő, füitőmirigy, prosztata, vékonybél és gyomor támasztőszövetében lévő sejtek szintén pozitívak voltak a 2B8 antitestre.

Az összes egyedülálló epitéiiális sejtet valamint a réteges epítéiiumokat és a különböző szervek pikkelyes epitéiiumát nem találtuk reaktívnak. Hasonló módon nem figyeltünk meg reaktivitást a neuroektodermális sejtekkel, ide tarosnak az agyban, gerincvelőben és perifériás idegekben lévő neuroektodermális sejtek. A mezenchlmális elemeket, úgymint a váz és száj izomsej teket, fibreblasztokat, endotéliáiis sej teket és a polim-orfo.nukleáris gyulladásos sejteket szintén negatívnak találtuk .

A 2Β8-ΜΧ-ΠΤΡΑ konjugátum szöveti reaktivitását tizenhat humán szövetből álló panelt alkalmazva értékeltük ki, melyet acsfonnal rögzítettünk. Ahogy korábban azt a natív antitesttel kimutattuk, a 2B8-MX-DTPA konjugátűm felismerte a CD20 antigént, ami a biológiai megoszlás igen korlátozott mintázatát mutatta, csak a nyiroieredetu sejtek egy kis csoportjában volt megfigyelhető. A nyír okosoméban immunreaktivitást figyeltünk meg a 8-sejfc populációban. Erős reaktivitást találtunk a lép fehér velőállományában és a csecsemőmirigy velő-állományi iímfocítáiban... Szintén immunreaktivifást figyeltünk meg a húgyhólyag, szív, vastagbél, máj, tüdő és méh szétszórt iimfooitáiban, és ez az ezekben a szövetekben levő gyulladásos sejtek jelenlétének tulajdonítható. Ahogy a natív antitestnél leírtuk (fentebb), sem figyeltünk meg reaktivitást a neuroektodermáiis sejtekkel vagy a mezenehimáiis elemekkel.

III

A 28-8 egér monoklonális anti~CD~20 antitest, melyet egy ugyanilyen elnevezésű klőnnal termeltettünk, affinitással rendelkezik a 8-sejt CD2Ö antigénnel szemben, és ez magasabb lehet mint a 31 antitestnél megfigyelt, melyet ismert CD20 antigénspecíf1tásű antitestek kompétíciőjavai és Scatchard. analízissel határoztunk meg. Továbbá az imunprecipítáoiós adatok azt sejtetik, hogy a 2B8-caI kicsapott antigén ugyanaz, mint a Bi~gyel kicsapott antigén, mivel mindkettő antitest egy 33 és- 3-5 kD-os relatív molekulatömegn dubíettet csap ki. A 283 antitest spécifitásának cítofiuorográfiás analízise a perifériás vér

134

iimfocitáknál Igazolta, hogy az antitest specifikusan reagál a B--sejtekkel, és nem matatható ki reaktivitás a iimiocíták T~ sejtjeivel vagy más sejttípusaival. Végezetül az előzetes stabilitási adatok alapján feltételezhető, hogy az antitest lű^C-on héten át stabil az immunreaktivitás csökkenése nélkül.

Amikor a 2Bű antitestet metil-benzil-oietiién-triamínpentascetsavhoz (MX-DT.PA) konjugáituk, gyakorlatilag nem figyeltünk meg immnnraktivitás-csökkenést a natív antitesthez képest.

Ϊ '1 ¢. ö

Továbbá a konjugátumnak in-nel vagy 'Ύ-naI való radioaktív jelölése 100% illetőleg 60% rmmunraktivitással rendelkező jelölt konjugátumokat hozott létre, A humán szérumban 96 órán át 3?⁴C11 ο <.>,·>

on inkubáit '^iJ'In- vagy “^Y-jalölt konjugátumok stabilitási vizsgálatai a radioaktív fém elhanyagolható veszteségét mutatták a vizsgálat sorén, mely alapján feltételezhető, hogy a konjugátumok stabilak lesznek, amikor klinikaiiag alkalmazzák majd Őket.

A timusz nélküli egerekben végzett tumorlokalizáciés vizsgálatok egy irídiummal jelölt 2B8-MX-DTPA készítményt alkalmazva igazolta, hogy a konjugátum növekvő mennyisége kötődik a tumorsejbekhez a kísérlet időtartama alatt anélkül, hogy a többi szövetnél, a szokásostól eltérő felhalmozódás megfigyelhető lett volna. Sőt, a biológiai megoszlásból származó dozimetrias értékek összhangban álltak a szakirodalomban publikált adatokkal. Végezetül a natív és a konjugált antitestekkel végzett humán szöveti keresztreaktívitásl vizsgálatok azt mutatták, hogy az antitestek mindegyike egy olyan antigént ismer fel, mely nagyon korlátozott szöveti megoszlású, és a nyirokszövetekben csak egy kis csoporttal reagál, melyek közé a bemetopoetikas eredetű sej*χ tek tatoznak. Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a konjugáció nem változtatja meg az antitest szövetspecifiiását, és hogy a radioaktivan jelölt konjugátumok stabilak .ín vivő, és felismerik a tímusz nélküli egerekben létrehozott tumorok felszínén jeleniévő CD2G antigént.

Amikor 2B8-t használtunk egy nagydözisú farmakoíógiaü./toxikoiógíai vizsgálatokban, a termelt antitest nem. hozott létre szignifikáns farmakotoxlkus hatást egyik mért paraméternél, sem a vizsgálat alatt, sem utána. Hasonló módon nem jegyeztünk fel rendellenességet a fénymikroszkóppal megvizsgált különböző hisztopatolőgiai minták elemzése során. Meglepő módon az alkalmazott antitest összes dózisa a keringő 3-sejtek feltűnő kimerülését okozta. A keringő B-áejt mennyisége azonban durván a normális szintre tér vissza, amikor az antitest beadását abbahagyjuk. A majmok cgydőzisos csoportjában (V. csoport} a natív antitest a keringésből egy hozzávetőleg 4,5 napos látszólagos β iá értékkel ürült ki. Megjósolható módon, amikor ezt a farmakokinetlkai vizsgálatot BALE/c egerekben hajtottuk végre, a 2B8 antitest egy 8,75 napos β tk> értékkel, ürült ki. így együttesen ezek az adatok alapján feltételezhető, hogy a natív antitest is hasonló klinikai hatást biztosit, amikor járulékos anyagként a radioaktívat jelölt kenjugátumhoz adjuk.

Általánosságban az adataink azt jelzik, hogy a nagy affinitása 2B8 antitest és MX-DTPA konjugaturna a humán szöveti reaktivitás korlátozott mintázatát fejezi ki. Mindemellett a főemlősök ben a natív antitest nem toxikus, és a S-sejtek átmeneti kiürülését okozza; azonban ha egyszer az antitest kiürült a keringésből, a δ-sejt mennyisége meglehetősen gyorsan visszatér. Továbbá.

♦ «4 4 x » «ζ Indiámmal és ittrínmmal jelölt 288-MX-DTPA kenjugátumok stabilnak tűnnek in vitro, aas mutatják a radioaktív fém csökkenését a meghosszabbodott. inkubálás alatt a humán szérumban. Végezetül a ''Ύ- vagy '‘'‘''In-jel ölt 2.B8-MX-DTPA biológiai megoszlásából származó sugárzásdózis becslései a BALS/c egerekben mCi injektált dózisonként egyezik a humán klinikai vizsgálatokból származó dózisbeeslésekkel, melyekhez ezekkel az izotópokkal radioaktivan jelölt, konjugált anti-idiotipas antitesteket alkalmaztunk .

A. Bevezetés

Egy '‘Ύ-jelölt, egér monoklonális anti-CDzö antitestet (2B8) értékeltünk ki egy I. fázisé klinikai kísérletben egy súlyosbodó B-sejt limfóma kezelésére. Az ittrium-jelölt antitest előállítására alkalmazott eredeti eljárás egy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC; lépést használt a nem. fehérjéhez kötött radioizotóp eltávolítására a formulazás előtt és a betegeknek való beadás előtt. Sajnos ez az eljárás nagyon időigényes, mely azt eredményezi, hogy az antitest hosszabb ideig van kitéve: a .rab.ioizot6pn.ak védetlen állapotban. Ez az antitest megnövekedett rádiói isisét eredményezi, melyet az invnunreakf ivitás csökkenése kisér. Továbbá az eljárás fárasztó volta nehézzé teszi, hogy egynél több adagot készítsünk el naponta a radioaktív gyógyszergyártásban, Az eljárás egyszerüsitését elősegítené, ha a NIPI Pharmacy Services radioaktív gyógyszergyártásának aiternatíváként a megvalósítás klinikai körülmények között történne.

«««» *««* *

Következésképpen sgy javított radioaktív jelölő eljárást fejlesztettünk ki, melyre „mix-and-shoot^{1 2} eljárásként hivatkozunk, mellyel kikerülhető a HPLC tisztítás szükségessége, míg megmarad a magas radioaktivitás beépülés, és a jé immunreaktivitás. Egerekben végzett in vitro stabilitási vizsgálatok valamint biológiai megoszlási vizsgálatok kimutatták, hogy a „mx-S-shoot eljárást alkalmazva készített radioaktivan jelölt antitest összehasonlítható az elterjedt HPLC eljárást alkalmazva létrehozott anyaggal, Ennek a preklinikai vizsgálatnak az eredményei azt jelzik, hogy ez az új „míx-l-shoot^ eljárást alkalmazhatjuk klinikai kísérletekben velő használatra alkalmas jelölt 2Βθ~ΜΧDTPA előállítására„

B. Anyagok és módszerek

1, .....Sejtek

Az So és HSB (CDzö-negativ) humán limfobiaszt sej tvon.alakat az American Type Culture Coliectiontól szereztük be, és lö % magzati borjúszérumot tartalmazó BPMI-I640-ben tartottuk fenn, melyet glutamínnai egészítettük ki.

2. .....Aö ti testek·

A 2B8 antitestet a Manuíactureing Departmen tiszittotta üreges szál bioreaktor feluiúszébbl a korábban az IND-ben (BB-IN.D

4850/4851) leírt protokollt alkalmazva, ű, További reagensek

Az ittríum-j90)-kioridot az Amershamtói szereztük be. Az összes többi reagenst a lentebb hivatkozott irodalmi, helyeken leírt forrásokból szereztük be, A radioaktív jelölési eljáráshoz használt reagenseket kezeltük, hogy eitávoiitsuk a szennyezd ne138 < «*♦ ** * X Φ * * * ♦ *** * * *** ♦* « χ Ο;φ _s « 9 4 ₆<« *'** * **· «** hézfém ionokat, melyek kompetícióba léphetnének a rádióizotópokkal a radioaktív jelölési eljárás alatt (lásd a Módszerek fejesetei; , A reagenseket GAP körülmények körött az IDEG Gyártási Osztálya készítette el az igazolt Batch Productíon Records-ot követve.

Módszerek

2, 2Bá-D42-üAPA előáll!tára

Klinikai »in.ő.ségű MX-DTPA-t. szereztünk be vízben oldott dinátriumsőként a Coulter immunoiogy~tól, és ~70°C-on tároltuk, A kenjugátumot (IBS-bx-DTPA; a Gyártási osztály készítette el, A konjugátum két különböző tételét használtuk ezekben a vizsgálatokban; mindkettőt normál sőolöatban lö mg/ml koncentrációban biztosítottuk. A konjugátumokat steril 2 mi-es polipropilén fecskendőbe töltöttük, és 2~8°C~on tároltuk.

2. A fémmembes körűiményék feηntarfcása

A reagensekkel végzett összes tevékenységet ügy hajtottuk végre, hogy minimálisra csökkentsük a fémszennyeződések lehetőségét. Polipropilén és poliszfirén műanyag tárolóedényeket, úgy mint lombikokat, főzőpoharakat és mérőhengereket használtunk.. Ezeket Alconor-szal mostuk, és a használat előtt alaposan kiöblítettük Miili-0 vízzel, vagy öblítővízzel (bater fór Irrigati.cn, WFlr) . Eémmentes pipettahegyeket (fiioRad) a lka ima ztunk a kis mennyiségek pontos kezelésére., A reagensek nagyobb mennyiségeinél steril, műanyag szeroiögiai pipettákkal dolgoztunk. A reakciókat kényelmesen 1,8 mi-es csavaros tetejű, polipropilén mikrofugaosövekben hajtottuk végre,

3. A radloaktl vl tás beépü lésének mégha tarozása q < a* .

$ ♦ φ * * * $ * A”'* **·

V * $*»$ -ί ^Λ^^ν ,νΧ * V'x ··< «.* w

A radíoktivités beépülését instant vékonyréteg kromatográfíávai (1TCL) határoztuk meg három példányban a SOP SP--13-008 szerint. Általánosságban, az eljárás a következő volt: a radioaktivan jelölt konjugátumot .1:20 arányban 1 mM DTPA-t vagy 5 mM SDTA-t tartalmazó 1 x PBS-ben hígítottuk, majd 1 mi-t 1x5 cmes ITLC SG papírcsík {Selmán Sciences) egyik végétől 1,5 cm-re cseppentettünk. A papírt metanol: víz el egyében (1:5.; tf/tf) lévő

10%-os ammóniám. acetáttal hívtuk elő. A csikót szárítottuk, keresztbe kettévágtuk, és mindegyik darabhoz kapcsolt radioaktivitást szoíntilláciös számlálással meghatároztuk. A csík alsó feléhez kapcsolódó radioaktivitást (fehérjéhez kapcsolt radioaktivitást) a felső és alsó fél értékének összeadásából meghatározott teljes radioaktivitás százalékaként fejeztük ki.

4. ,ϋΐη-ϋϋοοϋ eljárás í ttrl üss - /'90 / - jel öl 5 _2£8 -M-OTHá-hcz

Az antitiesteket az Amershamtől beszerzett, 0,04 M HCl-ben lévő, hordozótól mentes Y-kloriádsi radioaktívan jelöltök. A radioizotőp egy aükvotját (1Ö-20 mCi/mg antitest? egy polipropilén csőbe vittük át, és 0,02-szeres térfogatú fémmentes 2M~os nátríum-acetátot adtunk hozzá, hogy az oldat pH-ját 3,6~ra állítsuk be, 2B8-NaDTPA-t (0,3 mg?10,0 mg/ml normái sőoidatban;

adtunk hozzá azonnal, és az oldatot óvatosan kevertük. Az oldat pH-ját pH papírral ellenőriztük, hogy biztosan a pH értek 3,84,5 legyen, és 5 percig inkubáltuk, A reakciót úgy állítottuk le, hogy az eiegyet egy különálló, 75 mg/ml humán szérumaibumint (HSA) és 2mhi dxetiién-triam.in-pentaecetsavat (ÖTPA) tartalmazó IXBBS-t tartalmazó polipropilén csőbe vittük át, és óvatosan összekevertük, A radioaktívan jelölt antitestet 2~8*C~on tároltuk.

* # χ'¹ 4* y « $ * * 4

Sxv * X **<· «<

,s * ♦*:» ΐ '#*

A specifikus aktivitást úgy határoztuk meg, hogy a radioaktívon jelölt konjugátum megfelelő- alikvotjának radioaktivitását Kiértük. Ezt az értéket a számláló hatékonyságával korrigáltuk, a konjugátum fehérjekoncentráclőiához viszonyítva, melyet 280 nmen az abszor bandával határoztuk meg, és mCi/mg fehérje értkékén t fejeztük ki,

5. .Az gmtrium-/áé ? -zS8-2kX-ü2^:Pá in vit.ro immun-reak ti vitása

A jelölt konjugátum immanraktivitását SOP#SPi3-009-t alkalmazva határoztuk meg a lindmo által leirt teljes sejt kötési assay módosított változata alapján. A lóg fázis koncéntrációit növelve CD20-~pozitÍv SBS sejteket vagy CD20-negatiiv HSB sejteket adtunk két sorozatban 1,5 ml—es polipropilén csőbe; a sejtek végső térfogata 0,4ö ml volt, A radioaktívan jelölt konjugátumot 1-2,5 ng/1 végső antítestkoncantrácíőra hígítottuk, és 0,35 mi-t adtunk mindegyik csőbe. 90 perces inkubálás után a sejteket centrifugálással pelletizáituk, és a felülúszőt összegyűjtöttük. A felűlűsző frakcióban megmaradó radioaktivitást egy szcintxllácíös számlálóval határoztuk meg.

Az adatokat az összes bevitt radioaktivitás per a sejtkapcsolt radioaktivitás hányadosként ábrázoljuk a sejtszám/cső reoiprokának függvényében. Az y-tsngeiymetszet az immunreaktiv frakciót képviseli.

v, A klinika 11-sg.fórra.?!ázott___ittrium - /'5'0j -2.Ρο-5?ν-.ΡΡp/j in vítro stabilitása

A 2E8-AX-DTPA konjugátumot 'l-nai radioaktívan jelöltük, és ügy formuiáztuk, ahogy a „Míx-S-shoot eljárásban fentebb leírtuk. A radioaktív konjugátum két tételét készítettük el; az egyik tételt a radioaktív beépülés stabilitásának mérésére, és a »*** * másik tételt az iÉmu-nreaktívitás fennmaradásának mérésére alkalma ztuk. A készítménnyé alakitett konjugátumo ká t 4^cC--on 48 érán át inkubáituk, és az aiíkvotokat a ö., 24.,és 48. órában kielemeztük nem redukáló SDS-PAGE-t és autoradiográfiát alkalmazva.

Mindegyik időpontban az iasaunreaktivitást a fentebb leírt mérőeljárást alkalmazva határoztuk meg.

7, Az.....1 átrium-fád;-239-ábt-PEPA In vitro stabilitása humán szérumban

A ''Y-jeiölt 238-MX-DTPA stabilitását úgy mértük, hogy humán szérumban inkubáituk 37°C~on 72 érán át. A konjugált antitestet .ittrium- [9'0J -nel radioaktivan jelöltük, és a fentebb leírt módon formuláztuk. A radioaktivan jelölt konjagatumot 1:10 arányban normál humán szérummal (nincs hővel inaktíválva; hígítottuk, és· az aiíkvotokat műanyag csövekben, inkubáituk 37°C~on, A kiválasztott időpontokban a mintákat kivettük, és nem redukáló 3bS-PAGEvel és autoradiográfiával analizáltuk.

8. Az Ittrium- í90j--2B8-MX-DTPA. biolőgiai megesz1ása

Az Ittrium-(90]-nel jelölt 2B8-MX-DTPA~t szöveti megoszlásra vizsgáltuk 8-10 hetes BALB/c egerekben. A radioaktivan jelölt konjugátumot a fentebb leírt módon készítettük el és formulázλ.λ tűk, Az egereknek intravénás injekcióban 5m€i ^vY~jelölt zEű-MXDTPA-t adtunk, és öt egérből álló csoportokat az 1., 24.,· 48. és 72. érában fájdalommentesen megöltük. Miután elpusztítottuk őket, a farkat, szivet, tüdőket, májat, vesét, lápét, izmot, és combcsontot, kivettük, mostuk, lemértük; és vér- és bőrmintát is vettünk az elemzéshez. Mindegyik mintához kapcsolódó radioakti-vitást a fékezési sugárzás gamma-számlálóval történő mérésével

2

X»ÍX « * * ** β » * * * * * « *** * * *»* *· « V »»«« » * * «<·.« «»# * X ' »’ meghatároztuk, és a .százalék beadott dózis/gramm. szövet értéket és a százalék, beadott dózis per szerv értéket meghatároztuk.

9. Dozimetria

A ^'Ύ-jelölt .2B3-MX-DTPA-val beoltott egereket alkalmazva kapott biológiai megoszlási adatokat használtuk fel. egy 70 kg-os: betegnek beadott 1,0 műi dózisból abszorbeáiödott sugárzásdözís becsült értékeinrek kiszámítására,. A becsléseket, a Socrefy of buciear Medicina Medinai Internál. Eadiation Dose íMIBn)

Committee által elfogadott módszerek szerint hajtottuk végre. Ezeket a számításokat Philip Hágán úr végezte el (Nuolear

Medioine Service, V.A Medical Center, LA Üolla, CA 92161).

in. Az itt.rium- /' 9ü j -zBá-M.T-DTPA ki i nlkai dózisainak eldá 1 ii tásár.a szolgáló eljárás valIdádé ja [Irodalmi hivatkozás: P&D beszámoló, címe: „Validation of „Mix-and Shood radíolabeiing Protocoi fór the Preparation of Clinical Doses of d-2B8~MX~DT?A ; P - Chinn; 1994. április 22.].

C. Sredmények

I__. 111 r 1 nm ~~ [90] - j el. ól ?; 2-Bff -MX ^TPA el oá 17 itass „Mix- S Shoo t eljárással

Az 2BP-MX-DTPA~vai és 'Ύ-nai végzett radioaktív jelölés kinetikájának értékelésére szolgáló elökísérletek azt mutatták, hogy pHd, 6-i, 0-nái a radíoizotöp 95%-a épült be 5-10 perces reakcióidő alatt. Ennek a radioaktivitás-beépülésnek (55,7% ± 1,7 %) a reprodukálhatóságát ezután, egy scaie-up eljárás validáciös vizsgálatában igazoltuk [Irodalmi hivatkozás: R&D beszámoló, címe: „Validation of „Mi.z-and Sho-ot radiolabeling Protocoi fór the Preparation of Clinical Doses of *'Ύ-2Β3-ΜΧ~ϋΤ9Α''; B, Chinn; 1794. április 22.]. A ^Si;l~ jelölt 2B8-MX-DTPA előállítása ezzel a

X φ φ Φ * φ φ χ >

. · Φ Φ. φ * ν *

Φ Φ Φ* ΛΦ X Φ <

««« φ χ Φ * * * ** „mix-i-shoot eljárással egy olyan terméket eredményezett, mely összehasonlítható a HELC eljárással, előállítottal· {.lásd a BB-1ND 4δ50/«δ51) , Úgy találtuk, hogy a radioaktív jelölési eljárás jellemzően 18-15 mCi/mg antitest közötti, specifikus aktivitással r e p roduká1ha16.

fi

Az eszel az eljárással készített 'l-j elölt .2B8-HX-DTPA imeanresktivítása jellemzően nagyobb, mint 70%, összehasonlítva

HPLC eljárásnál a validációs meneteknél megfigyelt 55-60 %-kal (26. ábra}. Ez az eltérés valószínűleg a radiolízis lecsökkent hatásának köszönhető, melyet a „mlx-k-shoot eljárással járó lecsökkent inkubációs idő okoz. Ez az eredmény jellemző volt, és ahogy lentebb tárgyaltuk, a radioaktívan jelölt konjugátum klinikai dózisainak előállítására szolgáló seale-op eljárás validációs meneteire reprezentatív volt.

Λ ·>

1. Az_' “ y-tea ölt zőü-jék- 5 TFA in vi t r o sta b a lírása A HPLC eljárást alkalmazva előállított nem védett ^dvy-jelölt antitest kenjugátummal végzett előzetes kísérletek azt igazolták, hogy a radiolizís jelentős antitestlebomlást és az immunreaktivitás elveszítését okozza. Ezért egy készitménypuffért fejlesztettünk ki, hogy a radiolízis hatásait minimálisra -csökkentsük. Kimutattuk, hogy a humán szérumaIbumin (HSA) hatásos az radiolízis miatti antitestlebomiás minimalizálásában. .Egy becslést végeztünk a „mix-&-shoot módszerrel, előállított radioaktívan jeléit konjngátutztai, hogy Igazoljuk a készitmény hatásosságát a radiolízis minimálisra csökkentésében. A

14,5 mCÍ/mg antitest specifikus aktivitásig radioaktívan jelölt 0*1!

jelölt antitestet 75 mg /ml HEA-t és 1 nil DTPA-t tartalmazó 1

X PBS-ben f ormuláz.tuk. A 2BS-MX-DTPA kon jugátum lebomlását a 0,, φ XX <, 48.. órában értékeltük ki SDS~űAGS~t és autoradiográfiát alkalr&azva, A 2-, 3., 4, ábrák art mutatják, hogy a radioaktívan jelölt konjugátum nem mutat szignifikáns lebomlást egy 48 órás időszakon át, amikor 4®C-on inkebáijuk. Az instant vékonyréteg ¢:(1 kromatográfiás analízis azt mutatta, hogy nem volt 'Ύ veszteség a 48 órás inkubálás alatt; ezeket az eredményeket alátámasztotta az SDS-FAGE/autoradiográfiás analízis (2-8. táblázat). Az immunreaktivitás is viszonylag állandó volt, >88% ;25. táblázat) .

őrt

28. táblázat: A „Miz-S-Shoot T-SBS-MX-DTPA. stabilitása humán azérumalbamint és DTPA-t tartalmazó PBS-ben

A konjugátumrsal asszociált radioaktivitás százaléka

-i------------

Idő (óra)	y rp y* T	SBS/PAG-E
0	' ............................... fi 7 7 ·'·’ y s	96, 0
24	95,5	95,4
4 8	91, 3	94,6

29. táblázat

A „Mix-k-Shoot ' Y-2B8-MA-DTPA ammunraaktivitása humán szérum albumint és DTPA-t tartalmazó PBS-ben

Idd (óra á^C-on)	Százalék immunreáktlvitas
0	87, 9
24	88,5
48	90, 4

Sgy klinikailag formulázott, 15,7 mCi/mg spéci tikos aktivitáOf) sű ''Y-jeiölt 2B8-bX~DTFA~t 72 órán át 37G-on inkubáitunk, A nem redukáló SDS-PAGE-vei és autoradiográfiával elemezett minták azt « « «X »«

X * * * ·» * * , * X *· «* * X « · ♦ * * * « X X*** * X # **« «χί * ** *♦ mutatták, hogy nincs rádióizotőp veszteség ez inkubációs idő alatt (30. táblázat). A 0. és 72. órában mórt autoraóiogranmck denzltométriás letapogatása azt jelezte, hogy a radioaktíven jelölt konjugátum jelentősen nem bomlott le (31. és 32. ábrák).

Ezeket a2 eredményeket alátámasztották a vékonyrétegkromatográfiás elemzések (30. táblázat). Meg kell jegyeznünk, hogy a radioaktivitás beépülése az ebben a vizsgálatban alkalmazott antitestnél kisebb volt, mint amit a jelölési eljárás validáoiös vizsgálataiban kaptunk. Ennek az alacsonyabb radioaktívitás-beépülésnek az volt az oka, hogy a radioaktívan jelölt antitestnek ehhez az ei készítéséhez a '‘Y-k.l.oríd használt adagja gyengébb minőségű volt. A kisebb radioaktivitás-beépniési érték nem változat ja meg azt a következtetésünket, hogy a „mix-xshoot eljárással előállított ittttommal jelölt konjugátum stabil ezek között az: inkubációs körülmények között.

30, táblázat: A humán szérumban xmkufeált ' X-2B8-MK-DTPA kon j ugátűm stabi1í feása

Idő (őrá 37°C-on)	Százalék konjugátumho vitás	z kapcsolt radioakti-
ö	85,7	87, S
21	76,4	90, 0
72	3 7,6	88,7

A ^::'A-2b8-MX”DTFA“t (specifikus aktivitása 15,7 mCi/mg) tartalmazö humán szérummintákat nem: fehérje-kötött ' Ύ-re elemeztük kia bemutatott időpontokban instant vékonyréteg .kromatográfiás csikókat es SDS-PAGE/autoradiográfiát alkalmazva.

Őt rt trüu.m~ jffőj véges t1 Jziolőguai megoszlási vizsgálatok

4 6

X* «*« ΧΦΦ Φ X

V Φ ΦΦφΦ

XXΦ ΦΦΧ *

90, φ X » # Φ Φ XX

Αζ ''1-jelölt konjugátum biológiai megoszlását, melynek a specifikus aktivitása 11,5 mCi/mg antitest és a radioaktivitásbeépülés >95%-nái, BALB/c egerekben értékeltük ki. A radioakti-vitás felhalmozódását a szövetekben a fő szervekre, bőrre, izomra, csontra, vizeletre és .bélsárra 72 óra múlva értékeltük ki, és százalék beoltott dózis/g szövet értékben és százalék beadott dózis/szerv értékben fejeztük ki. A 31-34.. táblázatban és a 33. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hegy a vérhez kapcsolódó radioaktivitás mennyisége az 1 óra múlva mért hozzávetőleg 43% heinjektált dózis/gram (% ID/g) mennyiségről hozzávetőleg

16%-ra csökken 72 óra múlva; a 24. órában és később, a szívhez, veséhez és 1éphez kapcsolt radíoaktivitás mérteke meglehetősen állandó, 4~u%. A tüdőnél és a szívnél az egy óra múlva mért radioaktivitás 10~12%~ről a 72. őrára 8-10%-ra csökkent. A bőrnél a radioaktivitás viszonylag állandó, hozzávetőleg 3% a 24. őrá™ tői a 72. óráig, A gyomor-bél-rendszerben a radioaktivitás állandó, 0,5-1% volt a 24. órától a 72. óráig. A radioaktivitás az izomnál hozzávetőleg 6% a vizsgalat egész során. A combcsont általi radioaktivitás felvétel kevesebb, mint 4% az összes idő— pontban, ami azt jelzi, hogy a szabad ittrium mennyisége a konju-gátűm-készítményben jelentéktelen volt, és kevés szabad radioaktív fém szabadult fel a vizsgálat alatt.

φφφ* Φ Φ« «*

-V φ * * * φ *

ΦΧΧ ΦΦ» * * *** ** φ Φ ΦΦφΛ * * » φφφ ««Φ ^φ *** **

31. táblásat: Az aktivitás megoszlása egy órával a normál BALB/c egereknek beadott ' Y~2H8-MX~DTPA intravénás injekciója ntán

Átlagértékek i SD

Hinta	Szerv tömege gramm	% 10/ gramm.	% 10/szerv
Vér	1,37 ± 0,053	42,74 1 ,078	58,52 1 1,74
Szív	0,101 ± 0,01	8,03 1 3,33	0,82 ± 0,37
Tüdő (2).	0,126 ± 0,01	12,4 4 i 0,94	1,56 1 0,05
Vese (1)	0,120 1 0,01	7,81 ± 1,24	0,99? 1 0,10
Máj	0,5 59 1: 0,07	10,08 1 1,28	9,01 ± 0,52
Lép	0,077 ± 0,004	10,74 1 0,96	0,823 z 0,04
1 zom	7,83 ± 0,£8	0,44 i 0,0 8	3, 4 3 1 ö, 51
Csont	1,94 ± 0,11	3,44 i 0,57	10,11 1 1,80
Bőr	2,94 1 0,11	1,46 ± 0,58	4,24 1 1,5?
Gyomor-bél r.	2,33 ± 0,08	1,02 ± 0,19	2,36 1 0,35
Vizelet		-	-
Bélsár	-	...	-
		Összesen	94,66 i 3,47

Egerek száma = 3

Átlagos tömeg ~ 19,58 g 1 0,71 g ♦ ** *- »#«s

V * « * *** ««.*

32. táblázat

Ar aktivitás megoszlása 24 órával a normál BALB/c egereknek

ÖÖ X beadott Y~2B8~MX~DTPA intravénás injekciója után Átlagértékek ± SD

Minta	5terv tömege gramm.	% 10/gramm	%	ID/szerv
Vér	1,15 1 0,12	19,77 ± 2,42	30, 7 7	i 6,04
Szív	ρθ, 1 O S ± 0, 01	4,44 ± 0,55	0,47	± 0,08
Tüdő íz)	0,12? ± 0,02	6,78 1 1,01	1, 11	± 0,21
Vese (1)	0,1.39 ± 0,01	5,02 1 0,52	0, 09	± 0,05
Máj	0,90 b i 0,09	8,02 i 2,7 3	8,20	± 1,97
Lép	0,83 ± 0,01	6,75 ± 1,27	0,55	± 0,064
Izom	8,83 i 0,09	0,692 ± 0,01	6,12	± 0,52
Csont	3,31 ± 0,26	2,24 ± 0,31	7,47	± 1,53
Bőr	3,31 ± 0,26	3,33 ± 0,7 b	10,86	±1,76
Gyomor-bél r.	2,39 ± 0,4 3	0,73 ± 0,09	1, 02	± 0,05
Vizelet			2,31
Bélsár	...	-	1,23
		összeren	‘7 -«ξ A ? ·' f út	i 6,13%

Egerek száma ~ 3

Átlagos tömeg ~ 22,09 ± 1,73 g

Az aktivitás magoss.iása 48 órával a sornál B&LS/c egereknek $0 beadott ” Y-2B8-M2£“DTPA intravénás injekciója után

Átlagértékek ± SD

Minta	Szerv tömege gramm	% ID/gramm	% ID/szerv
Vér	1,50 1 0, 14	14,97 ± 5,77	22,53 ± 8,48
Szív	0,104 ± 0,01	3,99 ± 1,4 3	0, 4.1.5 1 0,16
Tüdő (2)	0, 122 ± 0,02	3,41 ± 1,57	1,07 t 0,31
Vese (1)	0,124 ± 0,01.	3,99 ± 1,62	0,49 ± 0,19
Máj	0,966 1 0,13	£ '! -? ? -· V y ,i. f <.· Λ.	5,69 ± 2,25
Lép	0,079 ± 0,01	6,05 1 2,38	0,46 ± 0,16
2- i-Oílí.	8,59 + 0,82	0,54 ± 0,1.9	4 , 6 .·’ ±1,67
Csont	3,22 ± 0,31	2,07 ± 0,8 4	6, 6 5 ± 2,5 6
Bőr	3,2.2 i 0,8;	2,30 ± 0,70	7,34 ± 1,95
Gyomor-bél r.	2,63 ± 0 f4 0	0,652 ± 0,50	1,67 ± 0,64
Vizelet	...		2,83
Eélsár	-	-	2,06
		összesen	57,28 z 17,608

Egerek száma ~ 3 .Átlagos tömeg ~ 21,48 ± 2,05 g ♦ ΦΦ φφφ

W

ΦΦΦ ΦΧΦ

ΦΦ ·♦·« φ φ * ♦ Φ* ΦΦ φ φ φ •90»

Άζ aktivitás megoszlása 72 órával a normál ΒΜ»Β/α egereknek §Λ , „ beadofcb Y-2B3-MX-DVPA intravénás injekciója ntan

Átlagértékek ± SO

Minta	Szerv tömege gramm	% ID/graram	% ID/szerv
Vér	1, 45 ± 0,07	15,87 ± 4,81	23,14 ± 7,26
Szív	0,003 ± 0,01	4/16 ± 1,27	0,302 ± 0,13
Tüdő (2)	0,123 ± 0,02	10,67 1 3,79	1,30 ± 0,45
Vese <1)	0,123 ± 0,01	4,79 ± 1,03	0,596 i 0,16
Máj	0,876 ± 0,07	7,26 ± 1,79	6,39 ± 1,76
Lép	0,081 ± 0,01	7,37 ± 2,34	0,584 ± 0,16
j> Z, kJiíí	8,30 1 0,33	0,67 1 0,13	5,5:8 ± 1,22
Csont	3,11 ± 0,15	2,58 ± 0,51	3,05 ± 1,76
Bor	3,11 ±0,15	.3,00 1 0,82	0,66 ±2/68 0
(Gyomor-bél r.	2,50 1 0, 20	i 0, / 3 ± 0,18	2,0 5 ± 0,5 3
Vizelet	-		3,5 6
Bélsár	-	...	2,82
		összesen	65, 47 ± 14,0

Egerek száma - 3

Átlagos tömeg - 20,76 1 <5,97 g

151 ♦ KJ φ 4 Φ Φ 4 » Φ ««# Φ Κ * « φ ΦΦΦ Φ* ·*ί* «.’·.»*

4t._ Dozimetria

A sugárzás-abszorbeált -dózisokat egy átlagos 70 kg-os embernél, melyet a ''ϊ-jelölt konjugátumra egér biológiai megoszlási adatokat alkalmazva í% ID/szerv értékek a 31-34. táblázatokban) számoltuk ki, a 35. táblázatban mutatjuk be. Ezek az eredmények összevethetők a korábban HFLC radioaktivitás! jelölési eljárást •b λ alkalmazva előállított ''Y-nai jelölt 2S8-MX~DTPA-t alkalmazva kapott e r e dmé n ye k ke I.,

152 < « X « ♦ * » y** ♦ χ *x * * ««xe » · ·«♦ »«« * **

35, táblásat

Egy átlagos emberben egyenletesen eloszlatott Ittrlnm-[90jjelölt 2BS-MX beadásából származó, és az állati megoszlási adatokon alapuló -sugárzás dozímetriás becslések az injekció után 72 órával

Aktivitás mennyisége -	1000 μηi/beteg dózis
	RADS		RADS
mellékvesék	0, 5 34	petefészkek	0,534
húgyhólyagéal	0,534	hasnyálmirigy	0,534
gyomorfal	0,534	os ont váz.
vékonyáé1	1,153	kortzkális osont	1,466
ul. bélfal	1,657	trabekulárís csont	1,466
11, bélfal	'2,380	csontvelő (vörös)	4,452
vesék	7,015	csontvelő (sárga)	2,0 96
máj	7,14 9	porc	1,466
tüdők	2,157	más a1kotórészek	m. ; ér Ö <3
más szövetek		bőr	6, 603
izom	2,64 6	lép	4,97 3
zsírszövet	2,64 6	herék	0, 534
ver	2,646	pa j zsrzirlgy	0,534
agy	2,112	méh (nem terhes)	0,767
stiv	2,6 4 6	teljes test	1, 755

Ref: Mird a, , buci. Red./Suppi. 1. 2/68, A Sehema tor

Absorbed-dose calculation fór B'iologicaily Distributed

RadionucIides

A számításokat Spreadsheet lempiate in Symphony (Lotus Deveiopment Corporation) alkalmazásával hajtottuk végre, és Pnrlílp L, Hágán M.S. (Ruclear Medicina Service, VA Hospítal, San Rieqc, CA, 92161) hajtotta vemre.

5......Ifcfcrlum-fSΰ] ~2B8~MX~DTfr'A klinikaidón inainak előállítására azalgálG eljárás valldáoldja összesen tíz vaiidácibs tételt készítettünk az MPI Pharraacy Services, Inc.-nél. Mindegyik tétel tesztelésének eredményeit a 36. táblázatban foglaltuk össze. Mindegyik teszteredmény átlagértékét kiszáradtuk, és a standard hibákat a megfelelő helyen jelezzük. A különböző jelölési idők miatt az eljárás variabilitásának becslésére az 1-8, számú tételt egy 10 perces jelölési időt alkalmazva, a 9. és 10. számú tételt egy S perces reakcióidőt alkalmazva állítottak elő, A tíz valldácíős tétel teszteredményei alapján a forgalomba hozatali elbírásokat meghatároztak. A forgalomba hozatali elbírásokat a 37. táblázatban foglaljuk össze.

7í\ ábra

JJt &λΛ1. S „íÖx-s-Sboot”-ot alkalmazva előállított ^-jelölt M-ffi-WA tíz vaiidáciős tételének vizsgálati eredsé&yei

	L	i.	3.	t	5.	6<	?..	e.	1	™”1 13. ;	átlag ,
t imnreaktivitás	<θ	A 3	l’A	<2	60,6	00/2	13,5	72,1	25,2	00,0 :	oy t y ;
eaífaUxíE	<öú25 ;	<0,U5		<3/125	<125 :	<55	<2$	<25 ;	<5,125	<125	<3,162 í 0,36
'1 rádión, beépülés	91/5	31,3	«3,5	36/3	<7	oy	$3,3	<5	/51,5	93,5	05,7 t <
antitest bnc, </<	&, <ö	0<2	yw	0,120	0/124	/5,119	/002	13,033	5,111	0,396	3,133 í 3,311
radioaktivitás íiííCí/rí}	ι,η	U2	3,32	,1,26	:yi	1,55	1,06	0,93	1,23	/02	1,21 * 0,21
specifikus aktivitás	iy	12,0	í.y	4,3	11,3	13,0	11,3	11,1	11,3 .................	/y	71,2 ϊ 0,9

& A T

X **» < ΐ < » < * « ♦ * m * * » ♦ * >

» *

HM ♦

tyx »

f « *

»* * Λ <!

Α V <ί ν V * *

Φ*χ· *·«.$ Φ * *-ν» »* « « »«.»« V . >

*<** Í4· <ν «*

37. táblásat '·>·'>

„Mix-S-Shoot eljárást alkalmazva előállított “''Y-jeiöIt 288MX-DTEA forgalomba hozatali elbírásai

Teszt	Előírás	Eljárás
Immunreaktivitás	> 60%	R1A
Endotoxin	5 OU/mi	LAL
Radioaktív jel· beépülés	>90%	ITLC
An t11 e s t - ko n c e n t r á c i ő	0»Ό75-8,öl50 mg/mi
Radioaktivitás konc,!	>6,0 mCi/mi	dóziskalibráció
Specifikus aktivitási	>9,0 mCi/mg antitest	őzao/bázis kai ib,
Teljes fiola radioakt. 1	> 6,0 mCi	dóziskalibráció
pH	6,0-8,0	pH papír
teljes fehérje konc.	65-85 mg/mi	betű
sterilitás vizsg.	megfelelő	CER 610.12

(0. időpont szerinti kalibrálás)

D, Eredmények megvitatása

Az eredeti radioaktív jelölési eljárás a '“'Y-jelÖlt 2B8-MXDTPA előállítására egy különösen fárasztó- és- időigényes HPLC

Ο,;'.

tisztítási lépést használ a fehérjéhez nem kötött .....Y eltávolítására a készítményből. Abból a célból, hogy egyszerűsítsük est az eljárást, és alkalmassá tegyük a klinikai helyen történő alkalmazásra, a. kísérletek arra irányultak, hogy megszüntessük a HPLC lépést, ennek érdekében egy „mix-*~shot-hak nevezett eljárást hajtottunk végre. A cél az volt, hogy megállapítsuk azokat a radioaktivitási jelölési körülményeket, melyek az izotóp nagyon nagy mértékű. radioaktivitás beépülését eredményezi a kon-jugátumba, ezáltal elkerülve a tisztítási lépés szükségességét. Felfedeztük, hogy >95% radioaktivitás-beépülés érhető el pH3,6-on öt-tíz perces inkubálássai. Ennek az eljárásnak egy további előnye az immunreafctivitás megnövekedett fennmaradása (> 70%>, mely valószínűleg annak köszönhető, hogy rövidebb az az idő, ameddig az antitestet a nagy energiájú, radioizotópnak ki van téve a humán szérumaifoumin hozzáadása előtt, mely védelmet nyújt a radiolízissel szemben. Az immunreaktívitás fennmaradása nagyobb, mint amit a HPLC módszert alkalmazva korábban megfigyeltek.

A „mix-i-shoot eljárást alkalmazva előállított és készítménypnffezben {75 mg/mi humán szérumalbumint és 1 md DTPAt tartalmazó 1 X PBS) inkubált 'á'-jelölt konjugátummal végzett stabilitási vizsgálatok azt mutatják, hogy nincs radioizotöp veszteség, és az immnnreaktivitás teljesen megmarad. A barnán •szérummal 72 órán át 37^űC~on végzett stabilitási vizsgálatok szintén minimális radioizotöp veszteséget jeleztek. Ezek a staφ««φ Φ*** « '·<' φ*

Φ φ *Φ»» **» * * φ * χ ** ’ « Φ Φ»#Φ * * ·

Μ Φ φ Φ * Φ * * * ** foliltási eredmények összevethetöek azokkal az eredményekkel, melyeket a HPLC eljárást alkalmazva kaptunk a radioaktivan jelölt kenj agatumma 1,

A biológiai megoszlási vizsgálat olyan BALB/c egerekben, melyhez -shoot eljárással előállított '''Ύ-jelölt konjugátumot -alkalmaztunk, nem matatott a szokásostői eltérő szöveti felhalmozódást., Ezeknek az eredményeknek az alapján feltételezhető, hogy a radioaktivan jelölt antitest nem. változik meg annyira jelentősen, hogy drámai hatással lenne az antitest in vivő jellemzőire.. Szintúgy, ezek az eredmények hasonlóak azokhoz az eredményekhez, melyeket korábban a radioaktív jelöléshez HPLC eljárást alkalmazva előállított radioaktivan jelölt konjugátammal kaptunk (lásd BB-TND 4850/4851).

Egy „átlagos'⁷ 7 0 kg-os ember esetében a biológiai megoszlási adatokból számított, dozimetriás becslések összhangban állnak azokkal az eredményekkel, melyeket a HPLC eljárást alkalmazva kaptunk a radioaktivan jelölt konjugátumokkal (lásd BB-XND 4 850/4 851} . Továbbá a dozimetriás adatok összevethetnek azokkal az eredményekkel, melyeket egy jelenleg folyó klinikai kísérletbe tartozó betegeknél kaptunk (1315. számú IDEG vizsgálat), ha az eredményeket beadott dózis mCl-nként összehasonlítjuk. Ebben a. vizsgálatban hat betegnél az átlagérték (rád f SD) a teljes testnél 1,4 0 ± 0,57, a szívnél 10,50 ± 4,58, a májnál .3,8-9 1 8,91 és a lépnél 1,75 1 6,00 volt.

Mielőtt a ,,míx~t~ shoot” jelölési eljárást klinikai minőségű '1~238~MX~DTPA előállításához kidolgoztuk volna, szükség volt az eljárás reprodukálhatóságának vizsgálatára. Tehát fiz vaiidáciős tételt hoztunk létre a ''''Y-klorid különböző tételeit alkalmazva.

eljárást alkalmazva között voltak, az immunreaktivitásnak jobb, mint a koránkaoott 60%-os érték

Az előállított tíz tételnél a „miz-t-shoot kapott iTamunreaktlvitási értékek 60,6-93,3% átlag 74,5%, és a középérték 72,1% volt. Az az ilyen mértékű fennmaradása szignifikánsan bán a használatos HPLC módszert alkalmazva (54,9—65,1% között; átlaga 60,2 %>. Az átlagos radioaktivitás beépülés a tíz tételnél 95,7%. volt (.93,5-97,5% között). Ez az értek összevethető azzal az értékkel, melyet korábban a HPLC módszernél láttunk (91,7-93,7% közötti tartomány, és az átlag 93,1%), Úgyszintén. az endoroxinra kapott eredmények, a koncentráció, radioaktivitás koncentráció, specifikus aktivitás, teljes fiola radioaktivitás, teljes fehérjekoncentrácíö, pH, és a sterilitás összevethető volt a fiz tételnél, összességében, ezek az eredmények a „mix~&-shoot eljárás reprodukálhatóságét igazolták. Továbbá 5 és 10 perces reakciókkal kiértékeltük az eljárás különböző jelölési időknek köszönhető variabilitását. Mivel nem. volt szignifikáns különbség a két reakcióidőnél, úgy határoztunk, hogy a rövidebb inkubációs időt fogjuk használni a végleges eljárásban.

A '^vY”jelölt 2B8~MX~OTPá klinikai dózisainak előállítására kifejkésztettünk egy jelölési eljárást, amit „míx-á-shoot eljárásnak nevezünk, mellyel elkerülhető a jelenleg alkalmazott nagy tel j esi tményü folyadék kromatográfiás (HP1C) lépés a. nem fehérje-kötött radioizotőp eltávolítására. Az egyszerűsített eljárás kiiktatja ezt a fáradságos tisztítási lépést, mig fenntartja a radioízotóp nagymértékű beépülését ·(> 90% >, és az immunreaktivitás jobb fennmaradását (> 70%) biztosítja. A rádióX Φ * Φ * * * > φφφ ΦΦΦ « W Φφφ *Φ < ΦΦΦ X Φ X Φ Φ

ΦΦΦ Φ*Φ ♦ *· ** izotóp fennmaradása és az immunrsaktivitás alapján ágy találtak, hogy a kiiníkaiiag íormulázott radioaktivan jelölt konjugátum stabil in ültre, amikor 4^eC-on 48 órán át inkubáljuk, továbbá a radioaktivan jelölt konjugátum stabil, amikor humán szérumban 3?’'C-on 72 órán át inkabáijak. A BALB/o egerekben végzett biológiai megoszlási vizsgálatok azt igazolták, hogy nincs a szokottól eltérő felhalmozódás, ide értve a csontot is. Egy „átlagos 70 kc-os embernél a sugárzás abszorbeált dózisok becsült értékei összehasonlíthatóak voltak azokkal az értékekkel, melyeket a 'ϊj el ölt 2B8~HX~DT?A~t egy jelenleg folyó kiírd, kai kísérletben alkalmazva kaptunk. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei azt mutárták, hogy a „miz-l-shoot eljárást alkalmazva előállított 'Ύjelölt 2B8-MX-D1PA összehasonlítható azokkal az eredményekkel, melyeket a hagyományos HPLC eljárásokat alkalmazva kaptunk. A klinikai minőségű radioaktivan jelölt konjugátum előállítására alkalmazott seale~up eljárás vaiidáoiőja azt mutatta, hogy az eljárás reprodukálható volt, és a termék összehasonlítható azzal, melyet a jelenlegi HPLC eljárást alkalmazva állítottunk elő. Ezeknek az előzetes vizsgálatoknak az eredményei azt jelzik, hogy ez az üj „míx-t-shoot eljárás a klinikai kísérletekben használható ^3v‘Y-jelölt 2B8-MX-DTPA előállítására alkalmazható..

As előnyös megvalósítási. módok részletes leírása

1. példa; Radioaktivitás-beépülés- Késeietek és mérőéi járások

I, ÖssKefcglalss

A találmány egyik célja az volt, hogy radíoaktívitási jelölési készleteket tervezzünk a “hn- és ⁹''^:Y~ielölfc 2B8-MX-DTPA előIbi

3f φφ* * «Φ» Φ állítására (InSSS illetőleg ¥288}, és megállapítsuk a forgalombahozatali előírásokat, a klinikai termékeknél. A radioaktív jelölési készlet eljárások reprodukálhatók a radioaktív .beépülés és az antigén-porit ív SB sejtek kötése tekintetében, és jelzi. a radioaktív jelölési készlet alkalmasságát a klinikai kísérletekben való alkalmazásra. Javasoljuk, hogy az In2B8 és ¥288 radioaktivitás beépülés és a kötődés forgalombahozatali előírását >-95%-bán illetőleg >7Q%~ban határozzuk meg.

XX. Bevezetés '-íj

Egy jelölt egér monoklonális an.ti-CD20 antitestet (Y2B8) jelenleg értékelnek ki a súlyosbodó B-sejt limfőma kezelésére. Az ittrinm izotópnak hiányzik a gamma-komponense, mely ezt az elemet alkalmatlanná teszí a leképző rendszereknél való alkalmazásra. Tehát a ⁿⁱIn~jeiő.lt 2B8~MX~DTPÁ~t rogyok alkalmazni a tumor elhelyezkedésének vizsgálatára és dozimetriára a betegekben, mielőtt vagy miután azokat ittriummal jelölt terápeutikummal kezeljük. Az Y2BS és InzBS előállítására jelenleg alkalmazott eljárásokkal, melyeket „mix-i-shoot eljárásoknak nevezünk, klinikai vizsgálatokra alkalmas radioaktivan jelölt antitesteket állítunk elé. Mindemellett a jelölési folyamat egyszerűsítése elősegíti a klinikai körülmények közötti dóziselőállítást.

Az. új radioaktív jelölési készlet előnyösen négy alkotórészt tartalmaz: 1} 2 mg/ml SBs-MX-oTFA-t kis fémtartalmú normái sőoldatban 2) a radioizotóp oldatot a megfelelő jelölési pK-ra beállító 50 mM nátriom-acetátot 3} készitménypuffért ΠΧ PBS, ph-'7,4, mely 7,5% humán s-zérumalbumint és 1 mM DTP.A-t tártál««Χ« « Μ * # * » * » X ο * * ' »«:« · φ »** ** * * χ *« φ: * * * «Μ **« X ·* ** aaz), 4) üres 10 ml-es. üvegcsövet (reakciócső} . Az összes komponenst a sterilitásra és a pirogén-mentességre teszteltük.

Ez az ismertetés Összefoglalja ennek a radioaktív jelölési készletnek a vaiidácíóiát, mely készlet egyszerű és könnyen használható, és ami 95% radioaktivitás beépülési értékkel és az antigén-pozitív sejtekhez való kötés elfogadható fennmaradásával rendelkező radioaktívan jelölt antitesteket eredményez. A forgalorabahozatalt vizsgáló előírásokat javaslunk a klinikai termékekhez.

XIX. Anyagok ős módszerek a radioaktivitás beepltésebez

A. A radioaktív jelölési készletben lévé reagensek

1, 2B8-XX-DTPA, IDEG; 082395RM2 számú tétel

2. 50 mM nátr.ium-acetát, kis fémtartalmú,. IDEG, 082395Rd3, számú, tétel

3, Készltménypuffer -7,5 % (tömeg/térfogat·) humán szérum albumint és 1 mM. DTPA-t tartalmazó Ix BBS, pH^::::7,i), IDEG, Ö8239SRMI számú tétel.)

4. reakoiöoső, 10^: ml-is, IDEG

B. Anyagok és eszközök

1. Biodex Tec-Control Radioincorporation Készlet, katalógusszám: 151-770

2. kesztyűn pormentes

3. Steril polipropilén fecskendők

4. Steril fecskendőtűk

5. kis zárható csövek;1,5 mi

C. Módszerek

1. Y2B8 és ln.238 elkészítése radioaktív jelölő készlettel

162 « Λ V ♦ Φ * Λ ♦ X ,Φ

A készletreagenseket elkészítettük, és üveg terslőlemezes fiolákba töltöttük. Az 1. típusú boroszilikát fiolákat (2 vagy 10 mi-es) injekcióhoz való steril vízzel (MTI) kiöblített Ok, és a faltöltés előtt autoklávoztuk. Sutilkaucsuk terelőlemezekst öblítettünk steril kul-vel, és- használat előtt autoklávoztuk - A reagenseket manuálisan megtöltöttük, és egy Class 100 szobába összegyűjtöttük, és USP módszereket alkalmazva pirogenitásra és sterilitásra leteszteltük.

a. InaSá előállítása

További reagensek;

1. Ináium-(íllj: kloridsó , hordozőmentes, HCi-ben

Élői rások;

1« Mindegyik lépést előnyösen, fertÖzésmentes módszereket alkalmazva végezzük.

2. A radioaktív jelölő- készlet komponenseit hagyni kell, hogy szobahőmérsékletűvé váljanak a használat előtt.

3. A végterméket a betegnek a lentebb leírt 9. lépés után 8 órán beiéi be kell. adna.

InzBS radioaktív jelölő eljárás

1. A reakoiőcsöbe adandó ^Xi!'lnC13 mennyiségét a következőképpé n. s zámolink ki;

a. Radioaktivitás koncentráció mCi/ml-ben a radioaktív jelölés időpontjában:

C’o - Radioaktivitás koncentráció a kalibrálás időpontjában (lásd a gyártő Analízis tanúsítványát) át = időbeli változás (pozitív szám kalibrálás után, negatív szám a kalibrálás előtt).

Radioaktivitás koncentráció a jelölés időpontjában « * X «

X X « «« ♦ X <

Φ φ * ·*·♦·

Co / eo, 0 r u d <Δζ;

b. A. reakció-csőbe. adandó InCiu térfogata:

5,5 mCi / radioakti vitás konc « a reakció-csőbe adandó mennyiség a jelöléskor

2. A reakció-csőbe adandó 50 mb nstrium-acetát mennyiségét a következőképpen számoltuk ki:

A hozzáadott ^{J :}InCÍ3 mennyisége (1b lépés) X (1,2) a hozzáadandó 50 mM nátriuxa-acetát mennyisége

3. A reakciócső terelőlemezeit és 50 mb nátrium-acetátos fiolát alkohollal letöröltük, agy 1 cc fecskendőt alkalmazva az 50 mb náfcrium-acetát mennyiségét (2. lépés) a reakoiöcsőbe tettük át.

'1_z

4. A ' InCIforrás tereiőlemezét alkohollal letöröltök. A fiolát egy steril 0,2 pm-es szűrővel töltött tűvel csapoltuk meg. Egy steril 1 cc fecskendőt alkalmazva az InCi.3 kívánt mennyiségét -(lb. lépés) átvittük a reakciócsőbe. A fiola tartalmát. összekevertük többször megforgatva.

5. A 238-bX-DTfA fiola terelőlemezét alkohollal letöröltük.

Egy 1 cc-s fecskendőt alkalmazva 1,0 ml 2B8-bX~DTPA.~t vittünk át lassan a reakció-csőbe. A csövet összekevertük többször megforgatva,.

6, A reakciót 30 perc 1 5 percig hagytuk lejátszódni környezeti hőmérsékleten .

?. A reakcióeiegy teljes térfogatát ügy számoltuk ki, hegy összeadtuk a hozzáadott ^:.bü mennyiségét ü. lépés) a hozzáadott 30 mM nátrium-ecetét mennyiségét <3. lépés) és a hozzáa dót t 2 B 8 - AX- DT PA mén n y i sé gé t (5 . lápé s >

Φ φ Φ φ φ φφ S φ

φ.

Φ » Φ κ » * » φΐφφ ♦«* Φ Φ *ΦΦ Φ Μ

Φ « φ«φφ Φ « Μ φφ« ®Φ* * ** 'ί*

8. A reakciőcsőbe adandó készitménypuffér mennyiségét, ahhoz, hogy 10 ml végtérfogatot, kapjunk, úgy számoltuk ki, hogy 10-böl kivontuk a 7. lépésben kiszámolt teljes mennyiséget.

9. A készitménypufférés fiolát alkohollal letöröltük, és a fiolát megcsapoltuk. A készitménypuffér viszkozitása miatt a reakciócsövet egy 0,2 .μΐ-es fecskendőt literrel töltött tüt alkalmazva csapoltuk meg. Egy megfelelő méretű tűvel ellátott lö cc steril fecskendőt alkalmazva a készétménypuffér 8. lépésben kiszámított mennyiségét vittük át a reakciöosőbe. A csapolőtüt eltávoiitottuk a reakeiöcsőböi, és a csövet többször megforgatva összekevertük (végtermék), Ezt a csövet legalább 5 percig ínkubáltuk a „Radioaktivitás beépülés! mérőéijáras elvégzése előtt. Az oldat színe sárga volt, és a cső tele volt, igazolva hogy a készitménypuffért hozzáadtuk.

10., A végtermék teljes radioaktivitását megfelelő, 'Inmérésre beállított berendezéssel mértük.

11. A végterméket a „Kötési mérőéijárás-hoz és a „Radioaktivitás beépülés mérőéijárás-hoz azonnal 2-8'C-ra helyeztük.

b. ΙζΒβ előállítása

További reagensek;

1, ittrium-I30j; kloriöső , hordozómentes, HCi-ben

Elöl rások;

1. Mindegyik lépést fertőzésmentes módszereket alkalmazva kell elvégezni.

2. .A radioaktív jelölő készlet komponenseit hagyni keli, hogy szobahőmérsékletűvé váljanak a használat előtt.

3. A végterméket a betegnek a lentebb leírt 9, lépés után 8 órán belül be keli adni.

V

ΦχνΦ

Υ2Β8 radioaktív jelölő eljárás;

C},·'·

1. A reakciőcscbe adandó- '''YCI3 mennyiségét a kővetkezőképpen számoltuk ki;

a. Radioaktivitás koncentráció mCi/ml-ben a radioaktív jelölés időpont; jáfean:

Cq ~ Radioaktivitás· koncentráció a kalibrálás időpontjában (lásd a gyártó Analízis tanúsítványát)

Át ^::: időbeli változás (pozitív szám kalibrálás után, negatív szám a kalibrálás előtt).

Radioaktivitás koncentráció- a jelölés időpontjában =

C_o / eu,0103(Át)

b. A reakciőcsőfoe adandó '^υΥ01₃ térfogata:

45' mCi / radioaktivitás konc. a jelöléskor a reakcíócsöfoeadandó mennyiség

2. A reakciőcsöbe adandó 50 mK nátrium-acetát mennyiségét a követketőképpen számoltuk ki:

íín

a. 0,040 M HCi-ben levő YCl^-nél (Amersham)-:

<k fi

11; mennyisége (1b lépés) X (0,8) = a hozzáadandó 50 ni nátrium-acetét mennyisége

b. 0,050 M HCl-ben lévő ^{s -}YCl3-nél (Xordionj :

''ACie mennyisége (lő lépés) X (1,0: ~ a hozzáadandó 50 mM nátrinm- a e e t á t mennyisége

3. A reakció-cső terelőiemezeít és nátríum-acetátos fiolát alkohollal letöröltük. Egy 1 cc-s fecskendőt alkalmazva az 50 raM nátrium-acetát (2, lépés) számított mennyiségét (la. vagy 1b. lépés) a reakciőcscbe tettük át, A cső tartalmát többször megforgatva összerázzuk.

«τφφ « Φ « Φ * Φ

X * Φ * Φ * ’ «Ζ«« -««Μ X « **·* *♦ ,,.·„,’·'Γ

4. A. *^vyci₃ forrás terelőleMez-ét alkohollal letöröltük. A. fiolát egy steril 0,2 pro-es szűrővel töltött tövei csapoltuk meg. Egy steril 1 cc fecskendőt alkalmazva az InCl.^ kívánt mennyiségét {lb. lépés} átvittük a reakciőcsőbe, A fiola tartalmát összekevertük többször megforgatva.

5. A 2BS-MX-DTPA fiola terelőiemezét alkohollal letöröltük.

Egy 3 cc-δ fecskendőt alkalmazva 1,5 ml 2S8-MX-DTPA~t vittünk ám a reakcíócsöfee. A csövet összekevertük többször megforgatva.

6. A reakcióeiegy teljes térfogatát úgy számoltuk ki, hogy összeadtuk a hozzáadott y-90-kiorid mennyiségét í4. lépés) a hozzáadott 59 mM nátrium-acstát mennyiségét <3. lépés) és a hozzáadott 2B8-MX-DTPA mennyiségét (5. lépés) .

7. A. reakció-csőbe adandó készítménypuf fér Mennyiségét, ahhoz, hogy 19 mi végtérfogatot kapjunk, úgy számoltuk ki, hogy lö-bői kivontuk a 6. lépésben kiszámolt teljes mennyiséget.

9. A készítménypufférés fiolát alkohollal letöröltük, és a fiolát megcsapoltuk. A készítménypuffér viszkozitása miatt a reakciöcsövei egy 0,20 μΙ-es fecskendőiliterrel töltött tüt alkalmazva csapoltuk meg. Egy megfelelő méretű tűvel ellátott 10 cc steril fecskendőt alkalmazva, a készítménypuffér 7. lépésben kiszámított mennyiséget vittük át a reakciőcsőbe. A csapolótűt eltávolítottak a reá kei ó-csőből, és a csövet többször megforgatva összekevertük (végtermék).. Ezt a csövet legalább 5 percig inkubáltuk a „Radioaktivitás beépülési mérőéijárás elvégzése előtt. Az oldat színe sárga volt, és- a cső tele veit, igazolva hogy a készítménypuffért hozzáadtuk,

9. A végtermék teljes radioaktivitását megfelelő, ‘“Inmérésre beállított berendezéssel mértük.

ΙΌ / « Φ Λ Φ * « · φ χ »«Φ *Φ ,*·**’

10. A végterméket azonnal 2-8^aC-on tároltuk, amíg a betegnek való beadáshoz nincs szükség rá.

11, Az immunreaktivitás tesztelése:

Egy 1 ml~es fecskendőt alkalmazva 0,1 ml-t kivettünk a reakció-csőből. és egy külön 1,5 ml-es csavaros tetejű csőbe vittük át. A csövet rögtön 2-8°C~ra helyeztük a „Kötési mérőéijáráshoz és a „Radioaktivitás beépülés! mérőéi j árás-hoz

A radioaktív jelölési készlet eljárások vaiidáciöjat az IDEG Pharmaoeuticals~nái (San Diego, CA), MD Andersen Health Centernél (Houston, IX), a Ma.yo Cünlc-néi (Hochester, MN), és a City of Hope-néi (Duarte, Ca) hajtottuk végre. Az összes készietkompotenst, ide értve a klinikai minőségű 2BS-MX~DlPA~t, az IDEG Pharmaceutical készítette el GMP körülmények (A Szövetségi Előírások kódjának megfelelő gyártási körülmények) között, és meghatároztuk, hogy steril és pirogén-mentes-e.

A radioaktivan jelölt antitesteket 7,51 (tömeg/térfogat) humán szérumaIbuminnal (HSA, klinikai minőségű, Baxter-Hyisnd) és 1 mb DTPA-t tartalmazó 1 X FBS-ben formuláztuk, Minden egyes vaiidációs tételnél a végrehajtott kibocsátási teszt eredményeit lentebb ismertetjük, Öt operátorral az ln2B8--nál és az 12B8-nál is hat vaiidációs tételt készítettünk. Ezeket a tételeket a következőképpen jelöltük meg, és a kővetkező berendezésnél hajtottuk végre a vizsgálatot:

Xn2B8:

I .	számú tétel: 1E+EC Pharmacentical
	számú	tétel:	IDEG	Pha rma c e n ti c a1
3.	számú	tétel:	IDEG	P harmac e a 11 c a 1
4.	s zámú	tétel::	MD Andersen Health Central

*.*·*:« * * “r

5 <.	•S Z HRVU	tétel.;: dayo	Clinic
6.	számú	tétéin City	of Hope
Y2B8::
1 .	számú	tétel; IDEG	Ph a rma c a u11o a1
9	számú	tétel: 1DEC	Ph a r m a c e a t i c a 1
3.	számú	tétel: IDEG	PharmaceutIcai
4.	számú	tétel: MD Andersen Health Central
5.	számú	tétel: Mayo	C lini.c
fe.	számú	tétel: City	of Hope
•’T'	Liofiiizáit SS és	HÚB sejtek e1 oá!111 á sa

Az SB (CD2'ö-pózitív). és MSB (CD20-negatiν) kát az American Type Celture Coilectíon-tő.1 szereztük be, és Tlombíkokban tenyésztettük lö % magzati borjúszérumot tartalmazó és 2% giutaminnal kiegészített RBXl-1640-t alkalmazva. A tenyészeteket 37°C~on és 5% C02“ben tartottuk fenn. A sejtek jellemzően minden második nap kettéosztódtak, és 0,5-2,5 x 10° sejt/mlnél és >30% életképességnél gyűjtöttük össze őket. A sejtkoncentráciőks't egy hemocitométert alkalmazva határoztuk meg, és az életképességet tripán-kékes kizárással, határoztuk meg.

A sejteket környezeti hőmérsékleten 0,5-2 x 1.0^v sejt/ml sejtsűrűségnél centrifugáiással összegyűjtöttük (1300 rpm sgy Sor vall centrifugában), és kétszer 1 X BBSS-ben. mostuk. A pelíetizáit sejteket 50 x 10 sejt/ml koncentrációig 1% (tömeg/terf.s marha szerurnaibumint (BSA) és 10% (tömeg/térf.) mannltot tartalmazó 1 X BBBS-he (liofiiízálö puffét) űjraszuszpendáltuk, 0,5 mi-t 1,5 ml-es, o-alakü tömítőgyűrűkkel rendelkező polipropilén mi krofugaosovekbe osztottunk szét, és ~7-0*C™on tároltuk, és 30-60 militorr-~on egy éjszakán át liofilizalfcuk. A humán sejtvonala.«-» «»·>< « _»<

X <· V * * * * ' * ** v«* X ♦ s** .·♦*.

x>,‘..Ο-’?· „ aí liofíii.zált sejteket tartalmazó csöveket 2-8’C-on szárítva tároltuk, és a mércéi járásokhoz steril vízben állított ak helyre , A sejteket tartalmazó csöveket mikrofugacső vekben száritöszerrel együtt tároltak.

3, Anaii tlkal mérőéijárások

Az in/BB és Y2B8· validáoiös tételeinek tesztelésére használt analitikai eljárásokat ismertetjük a továbbiakban,. A következő mérőéi járásokat hajtottuk végre mindegyik validáoiös tételnél;

1. Kötési mérőéijárás liofilizált SS sejteket alkalmazva

2. Y2B3/in2B8 radioaktivitás-beépülési mérőéi járás Biode.x

Készletet alkalmazva

a. Kötési mércéi jarások

Mindegyik operátor mérte a százalékos kötést az Tn288~nál illetőleg a Y288~nái liofliizáit CDzö-bOzitiv SB sejteket alkalmazva a következő eljárások szerint. Szék a mérőeljárások gyors és hatásos módszerét biztosítják annak igazolására, hogy a radíoaktivan jelölt antitest még felismeri antigénként a CD20-t. A GDzQ-negatív HSB sejteket klinikai környezetben is kiértékeltük, Liofliizáit sejteket készítettünk, és a fenti Ltofiiizáit SB és RS3 sejtek készítése'· módszer szerinti állítottuk elő, és tárolta X X

i._ln2B8 kötési mérőeljárás

További reagensek;

1, Indiám ··[111)-2B8-MX-Ó1BA

2, Liofliizáit SB sejtek; három, 25 X 10^υ sejt/csö mennyiséget tartalmazó csövek,

3, Liofliizáit HSB sejtek; három, 25 X L0'^: sejt/csö mennyiséget tartalmazó csövek.

4. Steril víz az öblítéshez, vagy steril víz ez injekcióhoz

5. Hígítás1 puffer dl Marha szérum albumáét (BSA) , és 5,02% nátrium-azidet tartalmazó 1 X PBS-ben (pH-7 , 2-74) , 0,2 pm-es vágási értékű szórón átszűrve és szobahőmérsékleten tárolva.

6. Üveg vagy műanyag csövek a radioaktivitás mérésére.

Eljárás:

Mérőeljárás beállítása (Nem radioaktív rész)

1. Három cső líofilirált SB és HSB sejtet kaptunk.

2. 0,50 ml mennyiségű S'WFI-t (injekcióhoz szolgáló steril viz) adtunk mindegyik csőbe, és a csöveket vortexeitük amíg homogén szuszpenziö-t nem kaptunk.

3. Mégy üres 1,5 ml~es mikrofugacső. A csövek közül háromba 0,50 m higitási puffért adtunk, melyek sejtek nélküli kontrollókat képviselték.

4. A másik 1,5 ml~es mikrofugacsöbe 0,99 ml higitási puffért adtunk; ezt a csövet 1:105 aranyban jelöltük.

5. Egy tetővel rendelkező 50 ml-es steril polipropilén csövet vettünk, és 10 ml hígítás! puffért tettünk a csőbe.

Méröeijárás beállítása (Radioaktív rész)

1, z-B^C-on tárolt, radioaktívan jelölt antitestet vettünk,

2, Egy P20-szar 0,01 mi mennyiséget kiszívtunk, és 1,5 ml-es mikrofugaosöfce tettünk, mely 0,59 ml. higitási puffért (1:100-as hígítás) tartalmazott, A hegyet ieöblitettük és a csövet óvatosan vortexeitük, hogy összekeverjük,

3, Az 1:100-as higitási csőből POöO-as pipettával 0,20 ml-t kiszívtunk, és 10 mi higitási puffért tartalmazó kúpos csőbe tettük. A csövet alaposan összekevertük.

Me rővíz s gálati elj árá s « φ **** «««» V * * X Φ X -X Φ . *♦» *♦* «Μ **« ί» * * <$« χ « φ * χ φφφ φ*« * φφ φ*

2. Α higifott Ιη2Β8-ΜΧ-ΑΓΡΑ 0,50 mi mennyiségét adtuk az összes csdh.cz .

2. A kupakokat erősen becsavartuk as összes csövön, és a csöveket 60 percen át folyamatosan kevertük.

3. 60 pere környezeti hőmérsékleten történő inkubálás után az összes csövet 5 percig minimum. 2000 g-nél centrifugáltuk.

4. Mindegyik feiülúszc 0,75 mi-es mennyiségét a számláickészüléknek megfelelő csövekbe vittük át.

5·. A csövekben lévő radioaktivitást egy gammaszámlálövsl számoltuk,. a háttérhez beáiiitva.

ii. Y2B8 kötésí_ méröe 1 járás

További reagensek:

1. ' 5(228-MX-DThA

2. Liofilizált SB sejtek

3. Steril víz sz öblítéshez, vagy steril viz az injekcióhoz

4. Higitási puffer 01% Marha szérum albumint (SSAi , és 0,02% nátrium-azidct tartalmazó 1 '.< PBS (pH~7 , 2-7,4 ) ,

Eljárás«

Radioaktivan jelölt antitest minta készítése:

1. 2-3*C-on tárolt, radioaktivan jelölt antitestet vettünk,

2. Egy F20~as pipettával 10 μΙ. mennyiséget kiszívtunk, és 1,S mi-es mikrofugacsőbe tettunk, mely 990 μΐ higitási puffért (1:100-as hígítás) tartalmazott, A hegyet leöblítettük és a csövet óvatosan vortexeltük.

3. Egy 50 mi-es, kupakos steril polipropilén csövet vettünk, és ml higitási. puffért tettünk a csőbe egy 10 mi-es szerciögiai pipettát alkalmazva.

φ X « φ φ φφ φ * φ ♦ φ » * , ΦΦΦ ΦΚ« * « »«Λ» ί»

X Φ «ΦΦΦ Φ Φ * »*φ ΦΦΦ * «* ♦*

4, Az 1:100-as higítási csőből p-200-a-s pipettával 35 ul-t kiszívtunk, és 10 ml higítási pufiért tartalmazó- xöpos csőbe tettük. A csövet alaposan összekevertük.

Liofiiizált sejt-preparátum

1. Három, liofiiizált SB sejtet tartalmazó csövet vettünk.

2. ö,5 ml SWFl-t tettünk mindegyik csőbe, és a csöveket addig vortexeltük, míg egysejf —szuszp-enzíó.kat nem kaptunk,

3. Három üres i,5 ml-es mikrofugacsö-vet vettünk elő, a három esőbe 0, 5 ml higítási puffért adtunk, melyek sejtek nélküli kon.trollókat képviselték.

Mérővizsgálati eljárás

1. A hígított '^ΎζΒδ-ΜΧ-DTPA 0,5 ml mennyiségét adtuk az összes csőhöz.

2. A csöveket a végükkel felfelé egy keverése helyeztük 45 percre, miután megbizonyosodtunk arról, hogy a kupakokat erősen becsavartuk.

3. 45 perc környezeti hőmérsékleten történő inkubáiás után a sejteket 5 percig tartó mikrocentrífugálással pelletizáituk.

4. A felül úszó '0,8- ml-es mennyiségét szcíntiíiáciős csövekbe vittük át.

5. Mindegyik csőbe szcintillációs koktélt tettünk.

6. A csövekben lévő radioaktivitást egy szcíntiíiáciős számlálóval számoltuk, a háttérhez beállítva.

h. .kaöioakf Ívj tás-beépül esi mérőéi járás

A százalékos radioaktivitás beépülést instant vékonyréteg kromatográfiával (ITLC) határoztuk meg Biodex Tec-Control Badiochromatographio hitet alkalmazva a következő eljárás szerint :

« Φ * φ Φ X X »♦« ♦ *» V « >χ

Φ V ΦΧ «φ ♦ Φ X

ΦΦΧ ΧΦΦ X «.* X*

További anyagok és felszerelés;

1. ^uhn~ vagy ^?’^ÖY~ jelölt 2B8-MX-DTPA

2. Csövek a radioaktív TBC csikók számlálására

3. Olló

1, Steril fecskendő, 1 cc

5. Steril tűk, 2üC

6. Gamma-számiálé vagy szelniíllácíős számláié

7. Pipetta

Eljárás:

1. Először el kell olvasni a teljes Biodex Működési kézikönyvet.

2. Mindegyik radioaktivan jelölt mintát három példányban teszteltük a készlet használati útmutatója szerint? csövenként egy csikót hívtunk ele.

3. A radioaktivan jelölt minta kromatográfiás csíkra történő pöttyözéséhez, egy pipettát alkalmaztunk, hogy 1 μΐ-t cseppentsünk az eredeti sávra. Alternatív lehetőségként egy steril 1 cc fecskendőhöz kapcsolt 26G-S tűből kiadagolt kis cseppet pöttyintettünk,

4. Mindegyik darabot az aktivitásra kiértékeltük egy megfelelő számláiét, azaz a '^J'^:ln-néi egy gammaszámlalöt, és a ^Y-nál egy szcintiliáciös számlálót alkalmazva, a háttérhez beállítva ,

5. Követtük a radioaktivan jelölt antitest százalékának kiszámolására szolgáló Biodex útmutatót.

Az I.n238 vagy Y2B8 mindegyik validáciös tételének tesztelési eredményeit a 38. és 39, táblázatban összegezzük.

174 « ·> « * ' * A * * ** « A ♦ * 4>Χ«« X V A

38, táblázat: Forgalosxbahozatuili mérőéijárás eredményei az X2B8 validáciőjánál

Tételszám	% radioaktivitás beépülés	% kötés
1	59,5	! 8 , b
•7	59,3	87,0
3	99, 4	85,9
4	4. σ·> í	81,8
£	99,2	7 9,6
6	96,3	9 0,8

Átlag ~ 98,8 Átlag: 82', 3

Standard hiba - 1.,24 Standard hiba = 3,4 % CV - 1,25 % CV - 4,2 %

39. táblázat: Bergalombáhosatali mérőéijárás eredményei ar Xn2B8 validáciojánál

Tételszám	% radioaktivitás beépülés	% kétes
1	99,4	b b, 2
·*>	98,7	86, 8
J	99,3	8 5, 8
4	98,3	86, 7
5	99, 0	82, 1
6	99,3	83,0 c.................................... .....................

Átlag ~ 99,0 Átlag ~ 85,2:

Standard hiba ==== 0,4 3 Standard hiba « 2,06 % CV ^::: 0,45 6 CV ~ 2,42 %

V, Elemzés és következtetések

A jelenleg használatos radioaktivitási jelölési eljárások egyszerűsítésére az in2B8~nái és az Y2S8-nál, egy négykomponensü készletet fejlesztettünk ki. A nátrium-acetát koncentrációját 50

ΦΦΦ» ΦΦΦΛ « « # « φ « * * • ΦΦ Φ C « « φ Φ ΦΦ ΦΦ ♦ Φ Φ* «φ * Φ *

Φ»* *«Φ Φ ·Χ·* Φ» mM-ra és a 2Β8-MX-DTPA koncentrációját 2 mg/ml~re csökkentettük, hogy lehetővé tegyük a pontos mennyíségátvrtelt fecskendőket alkalmazva., Az összes készietkomponenst előnyösen üveg terelölemezes fiolákba töltöttük, és az IDEG sterilitásra és pirogenirásra letesztelte ezeket, mielőtt forgalomba hozta, igy nincs szükség arra, hogy ezeket a teszteket a klinikai környezetben elvégezzilk. Helyben az összes reagenssel végzett műveletet steril fecskendőket és csöveket alkalmazva hajtjuk végre. Ezért a radíofarmakolőgiai környezetben szokásosan megtalálható fertőzésmentes körülmények betartása biztosítja, hogy a radioaktivan jelölt, és formulázott antitestek alkalmasak legyenek arra, hogy a betegeknek beadjuk.

Az In2B:8~nái és YzSS-nál a radioaktív jelölési eljárások reprodukál hatosagát es stabilitását több vaiidáciős mérés végrehajtásával értékeltük ki mindegyik radioizotóp különböző tételeit alkalmazva, Az előállított InzBs hat vaiidáciős tételénél a kötés S2,l%~től 86,8%-ig terjedt, az átlag 85,1 % volt; a radioaktivitás .beépülés! érték hozzávetőleg 99% volt {98,3%-től 99, álig terjedt). Az: előállított Y2B8 hat vaiidáciős tételénél a kapott százalékos kötés 78,6%-töI 87,0%~ig terjedt, az átlag 82,3% volt, A radioaktivitási beépüiésr érték az Y2B8-nái átlagosan 98,8% volt <96,3%~tői 99,5%-ig terjedt), összességében ezek az eredmények igazolják a radioaktiv jelölésű, készlet eljárások repodnkáihatőságát és stabilitását az In2B8-n.l ás az Yz&S-nái is, Ezeknek a vaiidáciős eredményeknek, az alapján javasolt, hogy a radioaktivitás beépülés és kötés forgalomba hozatali előírását > 95%-bán illetőleg >70%~ban határozzuk meg az ln2B8-nál és az

Y2S8-nál is.

φ φ

Továbbá mivel az alkalmazás könnyebbé vált, és csökkent a hibalehetőség az előállítás alatt, javasoljuk,- hogy liofíiizált CD20~pozitiv sejteket alkalmazó százalékos kötést és radioaktivitás-beépülést használjunk az In288 és 22B8 forgalomba hozatali tesztelésére a klinikai körülmények között.*

Összefoglalva, ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a radioaktív jelölő készletet alkalmazva előállított ln2B8 és Y2S8 alkalmasak arra, hogy klinikai körülmények. között használjuk fel azokat. Továbbá mindkét radíoaktivan jelölt antitestnél, forgalomba hozatali óiéi sásokat határozunk meg öt különböző operátor által végzett több va-iídác-ió-s- mérés eredményére támaszkodva .

2, példa Radioaktivitás beépülés és kötődés - Készletek és mérőéijárások

X. Összefoglalás

A 288 jelű egér anci~CD2Q monoklonális antitestet CHO sejtekben kiónoztuk, hogy egy erősen expresszálő sejtvonalat kapjunk. A CtíO-eredetu antitest CD2ö-po-zitív humán sejtekkel szembeni specifikusságát FACS analízissel és- kom-petitív kötéssel igazoltuk. Jelentéktelen kötődést figyeltünk meg a humán ΐ-sej sekkel szemben. Az antitest Cö20-pozitiv sejtekkel szembeni affinitását

... 1 P

1,3. x 10 M értékként határoztuk meg egy kompet.itiv kötési mérőéi járást alkalmazva. Az antitestet MX-DTPA kelátképző szerrel reagáltatt uk, hogy egy kenj ugátumot, a- 2.88-MX-DTPA-1 hozzuk létre, az immunreaktivítás jelentéktelen vesztesége mellett (az affinitás! érték 4,4 χ 10 ^Av M volt}-. A ^iliIs radioaktív beépülésének mérésével meghatározva a kelátképző optimális konjugációját nyolcórás reakció után értük le. A radioaktív jelölési e-ljáráso* » ««tt« ♦ : ♦ x ♦ »♦ «·♦ * *-* **

In esetében a pH -és az inX »♦ kát a 2B8-HX-DTPA-nái a

Sö ¥ vagy a;

111 kubációs idő tekintetében optimalizáltuk, hogy maximális radioaktív beépülést (> 95%) és az immunreaktívitás fennmaradását (>'70%; biztosítsak. Az in2B8~nái és az Y2B3~nál, melyeket CHOeredetű. 288 -MX-DTPA-t alkalmazva áll ltot tank elő, forgalombahozatali előírásokat javasoltunk a radioaktivitás beépülésére (> 95%) és a liofilizált és helyreállított CD2ö-pozitív humán sejtek kétesére (>70%) . Együttesen ezek az eredmények, szí jelzik, hogy a CHO-ereöetü 2B8-MX-UTPA alkalmas a klinikai kísérletekben való felhasználásra.

XX. Bevezetés

A korábban alkalmazott 2E8 antitestet üreges szál bioreakfcorOkben, termeltük., hogy .lecsökkentsék ennek az antitestnek a gyártási költségeit, CHO sejtekben, klónoztuk, és fejeztük ki, hogy egy erősen expresszálő termelő sejtvonalat kapjunk. Ez a példa a CHG-eredetű 2B8 antitestnek, a konjugáit antitestnek (2B-8-MK-DTPA) és a klinikai radioaktív jelölési készlet eljárásait alkalmazva elkészített ^5v¥- és ^‘in-jelölt antitesttermékek 1 r/ varró jellemzésének eredményeit írja le.

XII. Anyagok és módszerek

Az SB (CDáP-pozitiv) és HS'B (CD20~n-egat.lv) hűmén sejt vonalakat az American Type Culture Coilectiontől szereztük be, és 7iombikokban tenyésztettük .10 % magzati borjűszérumot tartalmazó és 2% giatamínnal kiegészített HPbl-lüiO-t alkalmazva. A tenyészeteket 37^cC~on és 5% COz-ben tartottak fenn. A sejtek jellemzően minden második nap kettéosziödtak, és 0.,5-2,5 χ 10³ sejt /minél és >80% életképességnél arattuk le. A sejtkoncentrációkat * * X X X « * .· «XX ♦ «♦ ♦ J* »« « * «0«Χ * X » **» 4ΧΧ * «ς>» «Α egy hemaeltörnétért alkalmazva határoztak meg, és as életképességet tripán-kékes kizárással határoztuk meg.

A sejt sarasokra vonatkozó specifikus információkat a 1553. számú jegyzetfüzetbe és a kon Moréna által irt „Sejtaktivitási jegyzőkönyv 1995 & 1996 című iratgyűjtőbe irtuk fel.

CHO-eredetű 2B8-t állítottunk elő GMP körülmények között 1DEC gyártó berendezésben. Az antitestet kis fémtartalmú, normál sőoldatban formuláztuk 11,5 mg/ml koncentrációban. Az antitestekről SDS-PAGE-vel megállapítottuk, hogy homogének. 2B8-MX~DIPA-t állítottunk elő a PSBR-Ü43 szerinti GMP körülmények kozott CHGeredetű 2B8-ból, és kis fémtartalmú sőoldatban 2 mg/ml koncentrációban formuláztuk (tételszámok: 0165A és ölhöS).

A gyógyszerminőségú 'iln-kioridoé az Amershamtói (U.K,} vagy a Cyciotron Products Inc..-tol. (Gorái Gafoles, PL) vásároltuk. Az ittrium(901-kloridot az Amershamtói (IJ.K.), Eordion InternationaI-tői (Kanatta, Kanada) vagy a Pacific Nortwest National Laboratory-tbl (Ríchiand, NA) szereztük be. A GMP szerint előállított MX-DTPA~t a Hauser Chemicaitöl (Boulder, Cc) szereztük be. A klinikai minőségű kálcium-trinátrinm-dietilértrismin-pentaeoetsavat (DTPA) a Heyltől (Berlin, Németország} szereztük be. A TAG-NHS-t az IGEN Inc.-tol (Rockeville, MD) vásároltuk. Egérféle antí~CD19 gyöngyöket vásároltunk a Dynal Inc.-tői {Laké Success, NY).

Kecske anti-egér FITC-jelölt F(ab’ y^-t a öaokson Immuno

Research-től vásároltunk,

A szennyező nehézfémek eltávolítását igényid reagenseket adagonként Chelex 100-zal (BíoRad Industries) vagy Chelating Sepharose-zal (Pharmacia) kezeltük, az oldatokat egy osziooon '179 *ΦΦΦ φχχφ φ „ φ » Φ Φ » Φ Φ * . ΦΦΦ ΧΦΦ Φ « «Φ» ΦΦ * φ φφφφ * φ φ φφφ φφφ φ φ* ** áteresztve. A kis fémtartalmú törzsoldatokat öblítésre szolgáló steril vízzel (SWFI.rj hígítottuk. Az oldatokat steril műanyag tároloedényekben tartottak.

További, a specifikus módszerekhez való reagenseket írunk le lentebb.

B. Anyagnk ás £&lsz&:&&2.á&

1. Origen Analizáló; IGEN Inc. Modeiiszám; 1100-1000; IDEG Szám:

92

2. Top-Connt szcíntiliáoiös számláló; Packard, Modellszám:

A9912; IDEG szám; 1129

3. Gamma-számláló, Isodata, modellszám: 28—lö; IDEG szám: 062S

4. Tec-Controi Badíokromatográfíás készlet, Bíodex, modellszám:

151-770

5. Liofllizáló; Virtls, Medál Freezemobii 12; IDEG szám: 0458

A további anyagokat és berendezéseket a. specifikus módszereknél Írjak le.

C. Módszerek

.....Liofilízált SS és HSB sejtek előá.11 í t á s a

A sejteket a fentebb leirt módon tenyésztettük, és környezeti hőmérsékleten 0,5-2 x 10 sejt/ml sejtsürűségnéi centrifugatással learattuk (1300 rom egy Sorvadd, centrifugában), és kétszer 1 X HBSS-ben mostuk, A peiletizáít sejteket 50 x iö^<:< sejt/mi koncentrációig 1% (tömeg/térf.) marha szérumaibumint (BSA) és 10 % z:omeg/térf,} mannától taralmázo 1 X HBSS-be (iiofílizálö puffer) űjraszuszpendáltuk, 0,5 ml-t 1,5 ml o-alakü tömítőgyűrűkkel rendelkező polipropilén mikrofugacsövekbe osztottunk szét, és ICGC-on tároltuk, és 30-bü miditorr-on egy éjszakán át li.ofilizáituk. A iicfílizáit sejteket tartalmazó csöveket 2~8C~ on szárítva tároltuk, és a mérőéijárasokhoz steril vízben

ΧΦΦ-Φ Φ*Χ * * χ Φ Ϊ·Λ·

X Φ * X X * Φ ν *»* **♦ Φ X »ΦΦ ΦΦ ♦ φ ΦΦφΧ Φ Φ Λ

ΦΦΦ Μ'« * ** Φ* va tároltuk, és a mérőéi járásokhoz. steril vízben állítottuk helyre. A sejteket tartalmazó csöveket mikrofugaosövekben száritószerrel együtt tároltuk.

2. FACÍj kötési analízis

Az antitestek, humán. B~.se jtekhez való közvetlen kötődését áramlásos cltométriávei határoztuk meg. Az antitestet növekvő koncé írt rációban 1% (tömeg/térf.} 8SA-t tartalmazó IX PBS-ben <pH~7,2> (kötési puffer) inkubáltuk 5 X 10 CD20-pozitív (SB) vagy CDzO-negativ ÍHSB} sejtekkel 30 percig jégen. A sejteket centrifugálássai mostuk, kötési pufíerben újra szuszpendáltuk, és FITC-jeioit kecske anti-egér Fíab'jj-vel 30 percen át jégen inkubáltuk. Miután a második reagenssel inknbáituk, a sejteket centrifugálássai mostuk, és 1,1% (térfogat/térfogatj formaldehidet tartalmazó 1 X PBS-ben újra szuszpendáitnk, hogy rögzítsük a sejteket. As átlagos fluoreszcencia intenzitást áramlásos citometriát alkalmazva határoztuk meg,

3.. Kompét itív kötési mérőéi járás

A 2BS és a 2B8-XX-DTBA immnnreaktivitását CDzö-pozítiv SB sejtekhez való kompetitiv kötéssel határoztuk meg OEIGEN eiektrokemilumineszeenciás eljárást (Leianö. and Ecwellö alkalmazva. A iog-fázisű SB-sejteker a tenyészetből összegyűjtöttük, és kétszer mostuk 1 X HBSS-sei. A sejteket 1% (tömeg/térfogat} marha szérumaibumint tartalmazó IX PBS-ben hígítottuk. Bizonyos kísérletekben iiofiiizáit sejteket alkalmaztunk, miután azokat steril vizzei helyreállítottuk.

Értén;ómmal jelölt nyomjelző antitestet állítottunk ele a CHö-eredetű 288-t (1-65. száma tétel) 1 X PBS-ben (ρΗ~7,2) ruténiumull;-tris-bípiridin kelátor X-hidroxi-szukcinímiö észterével

ΧΦΦ* ΧΦ*Φ Φ «6-«

Φ X X X Λ Φ

ΦΧΧ «ΦΦ * V #** *»

Φ » *««Χ Φ X * .·♦*- «'«« * »« χ» (TAG-NHS) inkubálva 15:3. TAG-hSH:antitest mól arányban. Környezeti hőmérsékleten végzett 1 órás inkubálás után fénytől védve, a. reakciót glicinnel. 10 perc alatt leállítottuk. A ne© reagált TAG-ot méretkizárásos kromatográíiával eltávolitoftuk egy 1 X PBB-sel kiegyensúlyozott Pharmacia PD-IO oszlopot alkalmazva. A fehérjekonoentrácíőt Bradford fehérje asssy-t alkalmazva határoztuk meg. A TÁG beépülest az abszorbancia 455 nm-en való mérésével határoztuk meg. Kiszámoltuk, hogy a TAG/fehérje ©ólaránya

3,0.

Mérővizsgálatokat hajtottunk végre 12 X 75 aan-ss polipropilén csövekben. A ko©petí.cíőba lépő- antitestek különböző mennyiségeit (0,002- 17 yg/mi) inkubáltuk 1 X PBS-ben (PH~7,2, mely 1% (tömeg/férf.) BSA-t tartalmazott; 0,0S yg/ml TAG-jelölt CHG 2B8vel, 0,08 mg/ml anti-CDiy gyöngyökkel és 167 000 sejt/ml-rei.

Miután környezeti hőmérsékleten inkubáltuk 3 érán át orbltáiisan keverve, meghatároztuk a relatív eiektrokemiiumineszoenciát (ECL) OR1GE.N készüléket alkalmazva. Meghatároztuk az átlagos ECL értekeket a két példányos mintákban, és a kcmpeticiöban álló antitest koncentrációjának függvényében ábrázoltuk Kaleidagraph szoftvert alkalmazva. Bizonyos kísérletekben a százalékos gátlást ábrázoltuk, A kompetíciós görbéket hozzálilesztettuk, és az EG 50 értékeket (50 % maximális kötést adó antitest koncentráció) meghatároztuk a következő 4-paramétares programot alkalmazva:

y = ((©1 -mí ) / (mű/m3) ^Am2) ) tm4 ;ml^;m2^:::;m3^::::;mimö ~ független változó ml nulla jel válasz relatív ECL egységekben mz - görbületi paraméter ©3 - ECöu gg/ml-ben kifejezve ,1 Ο φ ««·* Φ-ΧΧ » ««« *«♦ *** ΦΦΧ

Φ Α * *

m4 ~ maximális jelválasz relatív ECL egységekben.

Az átlagos affinitás! értékeket sz SC50 értékekből és a nyomjelző antitest ismert koncentrációiból számoltuk ki, Mnller módszerét alkalmazva.

£......2B8-MX-OTPA előállítása

A kelátképző szert, az i-izotiocianáto-benzii-S-umetiidistiíén-triamín-pentaeeetsavat (MX-DTPA) száraz porként (szabad sav) szereztük be, és szárítva tároltuk •-2ö°C-on vagy -lö^C-on, Hozzávetőleg 3 mg CHO 288 antitestet kis fémtartalmú normál söoldatban pK”8_f£~os értékre állítottuk be 1-10 térfogatnyi, 8,6 pH érétkö 50 mM nátrium-borát hozzáadásával. Az antitestet 10-11 mg/ml koncentrációban 4:1 MX-DTPA:fehérje mélarányban inkubáltuk 50 mM nátr lum-borátban <p.H~8,6} oldott MX-DTBA hozzáadásával. Környezeti hőmérsékleten történő inkubálás után (2-24 éra) a nem reagált keiátképzőt eltávoiitottuk a konjugátumből kis fémtartalmú sóoldatban végzett ismételt diai11trióiéval Centricon 30 spin-fiitereket alkalmazva.

, In2B_8 . és ¥258 előállítása

In2B8-t ál11toltunk elő a radioaktív jelölési készlet eljárást alkalmazva az itt leírt módon. Az antitestet 3 mCi/mg specifikus aktivitásnál jelöltük, és 0,2 mg/mi-re formuláztuk,. Röviden, 0,5-2 mCi ·** in-klór időt vittünk át egy fémmentes mikrofugaosőbe, és hozzávetőleg pHM,2 értékre állítottuk be 1,2 X térfogatnyi kis fémtartalmú 50 mM nátrium-acetátot alkalmazva, mg/ml 2B3-B1X-DTPA-t adtunk az indium-aeetát oldathoz, és miután. környezeti hőmérsékleten 30 percen át inkubáltuk, a jelölt antitestet 0,2 mg/ml-re formuláztuk 7,5% (tömeg/térf,) humán szérum alhuraint és 1 tó) úTPA-t tartalmazó 1 X PBS-ben (pH^7,2) ν Φ ♦·*' φ φ φφφ*

ΦΦ* Φ φ ««X »ν <a HSA végső koncentrációja 4-6%). Az összes mintát teszteltük a radioaktivitás beépülésére három példányban; az értékek áSé-nál nagyobbak voltak.

Az ¥2B8-t az 1, példában leírt radioaktív jelölési készlet eljárás egy kisbérétben végzett változatával is előállítottuk. Az antitestet 15 mCl/mg specifikus aktivitásnál jelöltük, és 0,3

C (0 mg/ml koncentrációjura formuláztuk. Röviden, 0,5-2 mCi ' Ύkioridot tettünk, egy fémmentes mikro fuga-csőbe, és a pH-t hozzávetőleg 4,2 érékre állítottuk be 1,2 X térfogatnyi kis fémtartalmú 50 mM nátrium-acetátot alkalmazva. .2 mg/ml SES-MX-DTPA-t adtunk az Ύ-aoetát oldathoz, és miután környezeti hőmérsékleten 30 percen át Ínkubáltuk, a jelölt antitestet 0,2 m.g/mi~re formuiáztuk 7,5 % (tömeg/térf,) humán szérum alfoumint és 1 mM DTPA-t tartalmazö 1 X PBS-cen (pH«7,2.) (a HSA végső koncentrációja 4~ 6%) . Az összes mintát teszteltük a radioaktivitás beépülésére bárom példányban; az értékek 95%-nál nagyobbak voltak,

A végső radioaktivan jelölt termékek radioaktivitáskoncentrációit a reakciöelegybez adott radioaktivitás mennyisége alapján és a radioizotóp Analízis Tanúsítványát figyelembe véve számítottuk ki. A leállított reakciöelegyek antitestkonoentráoíöját a hozzáadott antitest ismert mennyiségéből számítottuk ki.

A radioaktív jelölési kinetikai vizsgálatokhoz, melyek a pH hatását vizsgálják a radioaktivitás beépülésre és a kötésre, a reakcíöeiegyek p-H-ját különböző mennyiségű kis fémtartalmú 50 mM nátrium-acélát (0,8-2,2 X a radioizotóp oldat térfogata) hozzáadásával állítottuk be.

IS 4 φ φφ «?«-*» φ „,. «» ♦ * V Φ « * * . ÍÍV ΦΧ* Λ V «φ» ϊχ »“$·

6_......A Radioaktivitás-beépülés meghatározása az.....inzBS-nái. és _ az iáBS-nái

A végtermékekben vagy az inkubációs mintákban s. kenj agát urnákhoz kapcsolódó radioaktivitás mennyiségét (radioaktivitás beépülés) egy kereskedelemben beszerezhető Blodex által gyártott készletet (Tec-Control Radlochromatographí c: Kit; lásd az 1. példát; határoztuk meg, Általánosságban I μΐ tesztmintát viszünk fel két vagy három példányban egy mikropipettavai és a Blodex útmutatójának megfelelően.. A félbevágott esi kokat radioaktivitásra mértük üvegcsövekben egy T sódat a. gamma-számiálét vagy egy Packard Top Cunt szcintilláoiös számlálót alkalmazva , ahogy lentebb leírjuk, A radioaktív jel beépülését úgy számoltuk ki, hogy a esik felső felében lévő radioaktivitás mennyiségét osztottuk a felső és alsó félben található teljes radioaktivitássalEzt az értéket százalékban fejeztük ki, és- az átlagértéket meghatároztuk.

_. IvÁSB és Y2B8 immunreaktivitásónak meghatérozása

Az immunreaktivitást Lindmo és munkatársai eljárását alkalmazva és az 1. példában fentebb leírt módon mértük.

8. Közvetlen kötési mérőéijárás az ln2B8~hoz és az Y238-hoz

Ugyanazokat az eljárásokat, melyeket itt leírtunk, alkalmaztuk a CD20~pozitiv SB sejtekhez való kötődés meghatározására az Jn2B8-nál illetőleg az ¥2B8'~nál. Az In2B3~t és az Y2B8~t a fentebb leírt módon állítottuk elő és formuiáztuk, A mérőeljáráshoz az ln2B8 vagy Y2S8 mintákat assav higitásí pufférrel (IXBBS, pB-l,2, mely 1% (tomeg/térf.) marha szerurnaIhumint (BSA) tartalmazott) 40 ng/ml~re illetőleg II ng/m.l-re hígítottuk.

Az antigén-pozitiv (BB) és antigén-negativ (HSB) sejteket 10% magzati borjúszérómmal kiegészített RPM1 1640-ben tartottuk fenn

.3:7C-on és 5% Cö;? tartalom mellett. A sejteket (30%-nál nagyobb életképesség tripán-kékes kizárással meghatározva) környezeti hőmérsékleten 0,5-2 X IQ* sejt/ml sűrűségnél centrifugálással {1300 rpm egy Sorvall -centrifugában}' összegyűjtöttük, és kétszer 50 ml IX HBSS-sei mostuk. A petletizált sejteket. 50 X 10 sejt/ml koncentrációig újra sznszpendáituk 1% (tömeg/térfogat} marha szérumalbumínt (SSA) és 10% (tömeg/térf.) rn.ann.ltot tartalmazó előhűtött IX HBSS-ben (lioíilizélé puffer) . A sejtszuszpenziőkat 1,5 al-es, zömltŐgyürűs polipropilén mikrofugacsövekbe osztottuk szét 50 X 15* sejt/ml {koncentrációban {0,5 ml/csö) , és egy éjszakán át 30-60 militorr-nál liofi.lizáltuk, A iiofilizáit sejteket szárítva tároltuk 2--8^sC-on, és steril vízben állítottuk helyre a mérőéijárásokhoz,

A iiofilizáit SB es HSB sejteket 1,5 mű-es polipropilén csövekben állítottuk helyre 50 X 10^v sejt/ml koncentrációban, steril vizet használva. A hígított In283 vagy Y2B8-t a sejtekhez adtuk három példányban, és 45-60 percig függőleges dobkeverővei környezheti hőmérsékleten kevertük. Az inkufoáiás után a sejteket centrifugálással pelletizáltuk, és a sejthez kötött radioaktivitást a minták egy Isodata Gamma Számlálóban vagy egy Packard Top

Count szointiilációs számláiéban való mérésével, a lentebb leírt módon meghatároztuk, A sejtekhez kötött radioaktivitást (B) úgy számoltuk ki, hogy kivontuk a nem kötött radioaktivitást (felülúszó) a teljes hozzáadott radioaktivitásból. A teljes radioaktivitást a csövekben sejtek nélkül mért radioaktivitásból határoztuk meg. A százalékos kötődést a kötött értéknek teljes érték százalékában kifejezve számoltuk kí.

9. Radioaktivitás mérés * X ΦΦ Φ » ♦ * X > Φ Φ *«« «ΦΦ φ φ φφχ φφ

Φ ♦ «*Φ* ♦ X Φ

ΦΦ X φ V « ♦ φ φ χ«

A radioaktivitás beépülés! mintákat I percig mértük egy Isodáte gamma-számláiét alkalmazva. A számlálót 100-500 KeV energzaabiakokra állítottuk be, és a hátteret nullára állítottuk közvetlenül a minták alkalmazása előtt ‘‘'“In-t alkalmazva. Szintén az íscdata gamma-számiálót alkalmaztuk az 1TLC csíkok számlálására, melyekre- cseppentettünk. A fékezési sugárzás kimutatására szolgáló energiaablakok löö-iuöO KeV értékűek voltak.

A kötési mérőeljárásokhoz az Y-mintákat 24 mérőhelyes lemezekre és bieroScint 40 koktélba vittük át, és egy Packard TopCount-ban számoltuk egy percen át minimum és maximum energiabeállításokat használva. Indium-[111] mintákat számoltunk 1 percen át I sódat a gammaszárnialóval. A számlálót 100-500 KeV energiaablakokra állítottuk be, és a hátteret közvetlenül az alkalmazás előtt nullára állítottuk be.

IQ. Az fn.2B§ és Y'2B8 klinikai dózisainak forga.lomfoahotataii előírásai

A radioaktivitás beépülés és a Cb20-pozitiv sejtekhez való kötődés forgalombahozatai.i előírásait úgy állapítottuk meg, hogy az InzBu és Y2B8 mindegyikéből hat dózist készítettünk klinikai minőségű 2B8-MX-BTPA két tételéből <0219 és 0220. számú tételek) , melyeket a találmány szerint állítottunk elő, és GMP körülmények között töltöttük,. A £orqalombahozatall mérőeljárásokat a fentebb ieixt módon hajtottuk végre.

IV, Eredmények

A. A CJEfO-eredetű 2BŰ jellemzése

Áramláson öltömetriás analízist alkalmazva kimutattuk, hogy a CHO 2B8 közvetlenül kötődik a CDzO-pozitív SB sejtekhez, anélkül, hegy a CB20-negativ 2BB sejteket kötné (34. ábra). Nem le187 ♦ » veié kötődést ez gyesiünk fel szignifikáns SB vagy KSB sejtben irreleváns izptípusú (γΐκ) antitestnél (Sö04(.

A CHö 2B8-n.sk a CD2ö-~pozítlv sejtekhez kcmpeticiös mérőéi járásokban értékeltük kemilumineszcens: kimutatási rendszert használva való kötődését ki OHIGÉM

Liofiiizált és helyreállított antigén-pozitiv SB sejteket ínkubáltunk az antigén növekvő mennyiségeivel ruténíummal jelölt CHO 238 nyomkövető jelenlétében. Az eredmények azt mutatják., hogy a CHO 2B8 gátolja a CD20~pozitiv sejtekhez való kötődést ugyanolyan mértékben, mint a üreges-szál bio-reaktorokból származó antitest '('268-49} (35, ábra). Az ECSÖ értékeket grafikusan és határoztuk meg, és Muller eljárását (1980; használtuk az átlagos affinitás! értékek kiszámítására. Meghatároztuk, hogy a CHO 2B8 affinitása 1,3 X 10 ^lL; M; az üreges szál bioresktorofcböi származó 238 antitest egy 2,5 X 10^iy -M affinitás! értéket adott. A nem specifikus kötés elhanyagolható volt, melyet az 3004 irreleváns izotipusu antitesttel végzett kompét!ció hiánya igazolt.

B. A CHÖ-eredefcu jellemzése

2B8 konjugátumot (2B8-MX-DTPA) készítettünk egy hasonló eljárással, mint amit a korábban jellemzett 238-49-nél alkalmaztunk. A reakciókat hozzávetőleg 3 mg antitestet és a 4:1 kelátcr:antitest arányt alkalmazva hajtottuk végre. A 2, 4, 8, 17 és 24 órás inkubációs időket értékeltük ki, hegy meghatározzuk azokat a reakcióidőket, amik a CD20-pozitiv sejtek kötésének elfogadható fennmaradását és magas radioaktív!tás-beépüiést eredményeznek a ‘“In-nel. A kompetitiv kötési görbék, melyek a 8-24 órán át reagálhatott CHO 230-t hasonlították össze a CHO 238-MX-DTPA konjagátummal, azt jelezték, hogy a konjugációs el18 8 ♦** ·*♦ * ♦ «χ« «« * « Λ « « » « » ♦ »*·♦ « > * :♦ « * y* járás nem változtatta meg jelentősen az antitest kötődését a CD2G antigénhez (36. ábra). Grafikusan meghatározott SC50 értékeket alkalmazva -(36.- ábra), a konjugált és nem konjugált antitestek affinitás! konstansai 2,3 X 20 K-töl 5,9 X 10 X~ig változtak (40. táblázat) .

A radioaktív!tás-beépülés 95%-nál nagyobb volt a 8-24 órás konjugációs időnél (40, táblázat).

40. táblázat: A konjugációs reakcióidő hatása a CHO 2B8-MXOTHA radioaktivitásának beépülésére és az immunreaktivitására

Inkubációs idő	Radioaktévitás-beépü-	Affinitás (X)
(óra)	lés (%}
ö	N inos méghat á ro zva	2,3 X lu10
2	83,5	nincs meghat.-va
4	50, 5	nincs meghat.-va
δ	56, 1	3,9 X 10“··°
1.7	57,3	5,9 X 10“10
2 4	98,6	1,4 X 10~'LG

C, CHO-eredetu előáll!totó AnGSŐ és XABö jeliamzése

Indium-[Ili]-jelölt CHO 2S8-MXDTPA-t (In2:B8) állítottunk elő a korábban az üreges szál bio-reaktor eredetű antitestre leirt kisméretű radioaktív jelölő készlet eljárás szerint (1. példa), Röviden, konjugált antitestet (CHO-eredetű 2B8-MX-DTPA; 0165A ssámú tétel) inkubaitunk in-acetáttal a megjelölt pH-n 30 percig környezeti hőmérsékleten, a reakeiőelegyet 7,5% (tömeg/ tériogat) humán szérumalburnint és 1 mH DT?A-t tartalmazó

PBS-sel formnláztuk. Az Xn2B8 formulázott mintáit radioaktivitás-beépülésre vizsgáltuk instant vékonyréteg kromatográfiával.

χ * * Φ Φ χ Φ φ ♦ ♦ χφφ φ φ **χ *Φ * # *φφ« * * φ «** ΦΦχ * ΦΦ

Αζ Χη2Β8 kötődését a CD2O-pozitiv sejtekhez liofilizált és helyreállított SB sejteket alkalmazva határoztuk meg. Az összehasonlításhoz a hibridömate.rmelö antitestből (288-49) előállított •t j j konjugátumot .....In-acetáttal inkubáituk 30 percen át pH~4,2~n (a körülmények erre az antitestre korábban határoztuk meg).

Kinetikai vizsgálatokat hajtottunk végre, hogy meghatározzuk a CDzö-pozitiv sejtek kötődésének maximális fennmaradását és a nagy radioaktivitás-beépülést biztosító jelölési körülményeket (41. és 42. táblázat). A konjugált antitestet (CHO-eredetű 2.B8MX-DTPA) környezeti hőmérsékleten ^J'~~In~acetáttal indukáltuk pH^:4,2-n a megjelölt Időkig (42. táblázat).

41. táblásat:. Xn2B8 radioaktív jelölési kinetika. A pH hatása a radioaktivitás-beepülősre és a CD2G-pozitiv sejtekhez való kötődésra

Reakció pH-ja	Rad ί oa kti v itás beépalés	Kötés (%;
3,0	97,7	85,3
'··’ ·’	98,5	83,9
4, 0	98,0	84,1
4,3	98,0	84, u
4, 6	98,9	83,4
Kontroli (2B8-49J	99, 3	80,5

42. táblázat: Ja2B8 radioaktív jelölési kinetika: Az inkubációs idő hatása a .radioaktív jelölésre és a CB2Ö~pozitiv sejtekhez való kötésre

inkubációs idő	Radioaktivitás beépülés (%)	Kötés(%)
pH~2,9	15	97,2	85,3
30	99,1	85,2
45	97,2	84,8

» φ φ * φ *ΦΦ φ H ΦΦΦ ·* »**

pH- 4,6 i	15	99, 0	φ φ X φ Φ » * «r* ** 87,2
30	97,2	8 6, 8
45	99, 4	86, 3
i Kontroli	(288-4 9)	99,4	87,8

Az eredmények. azt mutatják, hogy a 3,0-4,6 ρΗ-tartományban és 30 perces inkubációs időnél a radíoizotóp 97%-nál nagyobb radioaktivitás-beépülését értük al, zúg a kötés hozzávetőleg 84%-ban maradt meg. A radioaktivitás beépülése es a kötési értékek nem változtak a reakciók .15-45 perces inkubációs időinél pH~2,S-4, 6on (42. táblázat). At eredmények hasonlóak a 288-49 antitestet alkalmazva kapott eredményekhez (41. és 42. táblázat;.

rttrium-(90]-nel jelölt antitestet állítottunk elő úgy, hogy ·3 a konjugáit antitestet (CHO-eredetü 2B8-MX-DTPA) Y-acetáftel inkubáltuk a megjelölt pn-n 5 percen át környezeti hőmérsékleten. A reakcíőelegyet 7,5% (tömeg/térfogat) humán szérumalbuzd.nt és 1 mM DTBA-t tartalmazó PBS-ben formuiáztuk. Az Y2B8 formulazott mintáit raditiaktivitás beépülésére mértük instant vékonyréteg kromatográfiát alkalmazva. Az Y2B8 kötődését a CD20-pozitiv sejtekhez liofilizált és helyreállított SB sejteket alkalmazva határoztuk meg. Az összehasonlításhoz a üibridómatermelő antitestből (2.88-49): előállított konjugátnmot ^Y-acetáfctal inkubáltuk 5 percen át pH^:-4,2-n (a körülmények erre az antitestre korábban határoztuk meg).

Hasonló kinetikai vizsgálatokat hajtottunk végre, hogy mégha<V;G tározzuk az Y-jelöit antitest (Y2S8) előállítását, A radioaktiv jelölési reakcióknál 3,9-4,7 pH tartományban 5 perces inkubációs időnél a radioaktivitás beépülés 96%-nál nagyobb volt a CD20pozitív sejtek kötésének 80%-nál nagyobb megmaradásával, (43.

**** >««» φ «φ * ♦ V X Φ Φ φ . Φ XX X φ φ φ φ Φ Φ χ φ φ

Φ φ φφφχ * χ φ φφφ Φ«« Φ ** ** táblázat). Hasonló eredményeket kaptunk a 3, 5, és 10 perces inkubációs időknél, 2,9-4,6 pH tartománynál (44. táblázat). Ezután a konjugált antitestet (CHO-eredőtű 2B8-MX-DTFA) környeztet! hőmérsékleten ^Y-acetártai inkubáltuk pR-4,2~n a megjelölt időkig (44, táblázat).. Az eredmények hasonlóak a 288-49 antitestet alkalmazva kapott eredményekhez.(43. és 44. táblázat).

43. táblázat. Y2S3 radioaktív jelölési kinetika. A pH hatása a radioaktív beépülésre és a CD20-pozitív sejtekhez való kötődésre

Reakció pH-ja	Radioaktivitás-beépülő s	Kötés -(·%)
2, 0	98,4	80,7
4,2	97,8	31, 0
4,4	96,1	80,0
4,6	97, 0	80,2
4,7	97, 4	80, 6
Kontrol1 (288-49;	99, 3	82,6

42. táblázat: T2B8 radioaktív jelölési kinetika; Az inkubációs idő hatása a radioaktív jelölésre és a Cb2ö~pozitiv sejtekhez való kötésre

inkubációs idő (perc)	Radioakt!vitás beépülés (%)	Kö t és (%.)
pH-3, 9	3	97,0	82,0
5	98,9	82,1
10	99,2	Q Λ- ft ft <2 y ·!
oH= 4,7	3	97,2	82,5
‘3	96,7	81,8
	97,6	81,5
Kontroli	(2B8-4 9)	99,2	8 4,2

As imiaunre-aktivitást a CHQ- 2B8~bói előállított In238-nái é.s

Y2B8-nsl I-índm-o -és munkatársai eljárását alkalmazva határoztak meg. Frissen begyűjtött CD20~pozitlv SB sejteket növekvő mennyiségben inkub-áltunk az ln.2B8 vagy 12B8 rögzített mennyiségével antigén feleslegében, A kötési adatok recípro-k grafikonon analízise lehetővé tette az immunreaktívitások meghatározását, mely

80,6% volt az In2B8-nál és 72,2 % volt az Y2:B8~náI . í 37, és 38, ábrák;, bo Forgslossbsho^afcalí előírások a CHO-eredetű Z»J?B£?~z3á.l ás

YPBS-nál

Két tétel klinikai minőségű in2B3/l2B3 radioaktív jelölési készletet alkalmaztunk arra, hogy az InzBS és Y2S8 mindegyikéből hat tételt elkészítsünk, ln.2B8 és Y2B8~t állítottunk ele a jelenleg a klinikai kísérletekben alkalmazott radioaktív jelölési eljárások kisméretű változatait alkalmazva. A radíoaktivan jelölt 238-KX-DTFA mindegyik tételét a radioaktivitás beépülésére -és a CDzO-pozitív (SB; és a CDzO-negatív (HSB; sejtekhez való kötődésre vizsgáltuk. Ezeket az eredményeket a 45. és 46. táblázatban foglaljuk össze. Az In-288 előállított hat tételénél a radioaktivitás beépülés 98,9%-tői 99,3%-ig terjedt, az átlag 99,1 %. A CD20-p-oz.itív sejtekhez való kötődés 81,9%-tól 35,1%-l.g terjedt, az átlag 33,6% volt; a €D20—negatív sejtekhez való kötődés ái-nái kisebb volt. A hat előállított Y288 tételnél a radioaktivitás beépülés 97,4%-tól 98,7%-íg terjedt, az átlag 98,Elvolt, A CD20-pozitív sejtekhez való kötődés 81,4%-tói 32,7%-tg terjedt, az átlag 31,9 % volt; a CD20--negativ sejtekhez való kötődés 8%~ nál kisebb volt.

X «X X ♦*«·X

X V <ι X <

* * * « * X *

XXV X Α XXX χχ

X X X*»f X X Α

XXX Α«Χ X φί* «»

45. táblázat: Forgalossbahosatali mérőeljárási eredmények a radioaktivitási jelölési késsiet eljárást alkalmazva előállított

CHŐ-eredetú Xn2B8-náX

Kötés (%í

•f·;. £	uttatás	száma	Oadioakt ivitás	beépülés (%)	jj‘( <5 k.S	jtek	HS.fe	) sej
2.,	<0219.	-r <£ f* θ £ '<	C: ’d	·<	η	Cs		9 & , V
2.	{0219.	tétel)	tv z\ A· Áy #	3.	•Ö -3: V —· f	/		2, 8
4 »:	(0219.	tétel)	·> :>	7	b 0 f	8		3,7
	(0220.	tétel)	Z\ ZV s.· >·/	0	83,	q		í-2 · R
5.	( Π 9 '2 0	tétel)	98,		04,	ϊ		2, 6
6.	\ V <í fii- V v	tétel)	98,	0	ö 0,	η		*γ **s k n -· ?

99, .ag-83,6% Átlag rtr\ _.··> -·\ o

i.-'— V ít Z. <..

> IJ'· .·. Λ Λ. 9>

tivitasi

46. táblázat: Kibocsátási mérőeljárási eredmények a radioakCHO~ készlet eljárást alkalmazva eredeté Xn2BS~nál

Kötői

SB sejtek

HSB sejtek i 0 219. z é t e 1;

{0219. tétel) {0219. tétel) :0220. tétel) v 0 2 2 v . t. e t © 1) .· r. ··*:< 'á Λ Λ x- 3 \

M >< : ^x-·' ? · _f 6

90,3

9'? . £

0z_? 3

81,0

81,4

R 2 _s. 4

7,2

Átlag - 98,2% Átlag - 81,9% Átlag

V. Tárgyalás és követkéztetősek ♦ *«»» Φ φφ χχ • Φ * φ X X Φ . *«« ΦΧφ 4 „ «φφ φ» * » ΦΦΧ* Φ Φ Α »*< *** 4 «* «*

A CHO sej tekben (CHO-eredetü 288 > klónozott és kifejezett anti-CD20 egér monoklonális antitest (2B8) fenntartja a CÖ2Cpozitív humán sejtekkel szembeni spécititását, melyet FACH analízissel és kompetitív kötési mérőeljárás analízissel mutattunk ki. A humán T-sejtekhez való kötődés minimális volt. A humán CD2ö-poziflv sejteknél az antitest, affinitást meghatároztuk, az 1,3 X 10^J'^v H volt egy kompetitív kötési mérőéi járást alkalmazva. Ugyanezzel a mérőéijárassal az üreges szál bioreaktorokból származó 2B8 antitest egy 2,5 X 10 ^Λυ affinitás! értéket adott.

A CHO 2BS antitestet MX-DTBA-vai reagálhattak, hogy egy konjugátumot, a 2B8~MX~DTPA~t hozzuk létre, mig az immunreaktivitás megfelelő fennmaradását megőrizzük.

Az optimális kelét képző beépülést a rádióértivitás beépülés ^ΑΑΑϊ.η~ηβ1 végzett mérésével határoztuk meg, és- nyolc órás környezeti hőmérsékleten történő inkubálás után értük el, A radioaktiv p, p, jelölési eljárást a 238-MX-DTBA-nái optimalizáltuk a '’Y-nál vagy a ’* in-nél a pH es az inkubációs idő- tekintetében, hogy biztosítsuk a maximális radioaktivitás beépülést és az immunteaktivi tás fennmaradását.

Az InzBÖ és Ϊ2Β3 különböző készítményeinek eredményei igazolták a radioaktiv jelölési eljárás reprodukálhatóságát abból, a óéiból, hogy klinikai dózisokat állítsunk elő. Ezeknek a rádióaktivitási eredmények azt sugallják, hogy a forgalombahozatali előírás a radioaktivitás-beépülésnél >90% és a kötődésnél >70%, líofilízált CDBö-pozitlv sejteket alkalmazva. Összességében ezek az. eredmények azt demonstrálják, hogy a CHO-eredetü 288 é-s az üreges szál-eredetű 2B8-49 összevethető, és azt jelzik, hogy a

ΦΦ* ΦΧ«φ ν

CHO-eredetü 2B8-MX-DT.PA alkalmas a klinikai kisé.rletekban való alkalmazásra,

Végezetül a találmány egy jelölési eljárást, egy úgynevezett „mix-and-shoot eljárást ismertet a radioaktívan jeleit antitestek klinikai, dózisainak előállítására., melyhez nincs szükség a jelenleg alkalmazott nagy teljesítményű folyadék kromatográfiás (HPLC) lépésre a nem. fehérjéhez kötött radioizetöp eltávolítására. Az egyszerűsített eljárás megszűnteti a fáradságos tisztítási lépést, míg fenntartja a rádióizotöp beépülés magas szintjét (>95%) és az immunreaktivitás jobfc fennmaradását eredményezi . A radíoizotóp rsteneiöja és az immunreaktivitás alapján úgy találtuk, hogy a kliníkailag: formuláit radloaktivan jelölt konjugátum in vitro stabil, amikor i^:’C-on 48 órán át inkubáljuk. Továbbá a radioaktívan jelölt konjugátum stabil volt, amikor humán szérumban ínkubáltuk 3?°C~on 72 érán át. A BALB/c egerekben végzett biológiai megoszlási vizsgálatok azt igazolták, hogy nincs a megszokottól eltérő szöveti lerakódás, és nincs jelentős felhalmozódás a csontban. A sugárzás abszorbeált dózisok becsült értékei egy „átlagos 70 kg~os embernél összevethetöek a folyamatban lévé, 'Y-jelölt 2B8-d.k~DTPA~vat alkalmazó klinikai kísérletben kapott értékekkel, Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei azt mutatják, hogy a „mix-and-shoot eljárást alkalmazva előálCi'j

Irtott Y-nal jelölt 2BS-MX-DTPA összehasonlítható a hagyományos .HPLC eljárást alkalmazva előállítottal. A klinikai minőségű radioaktivan jelölt konjugátum soaie-up eljárásának validáeiöja azt mutatta, hogy a módszer reprodukálható, és hogy a termék összehasonlítható azzal, melyet a jelenlegi HPLC módszert alkalmazva állítanak elő. Ezeknek a prekünikaí vizsgálatoknak az t eb

Φ Λ * χ» #*

Φ φ ♦ < » Φ Φ «·ΦΦ φ * **« ♦* * ♦ #««« * φ *

ΦΦ« >«»: φ «' Φ«ί '<0

n.lka.i kísérletekben veié alkalmazáshoz megfelelő ' Y~jelölt 2B8MX-DTPA előállítására használhatjuk, fel.

Irodalmi hivatkozások r** _r

«.♦x X'·'

A következő irodalmi helyek hivatkozásként, a leírásba épülne; k:

1. Adams, R. A. Flowers, A. és Davis B. J. Direot Irnpiantation and transelantation of Humán. Acute Lymphoferastíe Leukémia ín

Hesters, SB— 2. Cancsr Research. 28, 1121-1125 {19-68).

2. Adams, R. A. Formai Dísonssion.: The Role of Transplantation in the Experimentai Lnvestigatíon of üuman Leukémia and Lymphoma. Cancer Rés. 27 (1), 2479-2482 {*967).

3. Lindn-o, T. Bőven, E„, Cuttitta, F. Fedoroko J. and Sunn, F.

A., J. Immuno!. Metbods, 72, 77-19-84

4. Kozák., R	. W., Raubitschek	A,, Mirrsdeb, S	., Breohbiei M.	K. ,
önnghaus.	R., Gansow 0. A,,	és Wa.ldma.nn T..	A. Cancer Rés.	4 9,
2639-2644	(1989).
5. Parker,	B. A., Halpern,	S. E.-, Miller	R. A.. Hűti,	H.,
Shawler D.	L., Collins B.	A. , Amox, D.,	White, C. A,	é S

Royston I. h. Eng. J7 Med., benyújtva.

6. Le land, J. PL és Poweii, M. J., J. , Eiectroohem. Soc. 137,

3127 (1990)

7. Muller, R. dk, Immunoiogicai Metbods 34, 345 (1980)

8. Mirzadeh, S,, Breichbiel ti. W., Atoher, R. K. és Cansow, 0.

A., Bioccnjugate Chemístry 1(1), 59 (1990)

9. Breohbiei, M. W,, Cansow, 0. A,, Atoher, R. W, , Sorom, J,,

Esteban, u. , Símpson, D. E. és- Colcher, D, 25, 2772 (1988)

Claims (22)

1. Eljárás egy kelátképzdhöz konjugáit antitest ^l-nsl való radioaktív jelölésére agy betegnek történd beadáshoz, ahol (I) a kelátképzdvel konjugáit antitestet egy ^s0Y~t tartalmazd oldattal keverjük össze és igy egy elegyet képzünk;

(II) az elegyet megfeleld hőmérsékleten 10 peréig vagy ennél rövidebb ideig inkubáljuk, smeiiyel egy radioaktivan jelzett antitestet állítunk éld, ahol s rsdiosktivan isiseit antitest radloinkorporáoiója SS 1-nái nagyobb, amelynek eredményeképpen a páciensnek a nett inkoiporált ^t-töi veid további tisztítás nélkül közvetlenül beadható; és (Ili) a jelölt antitestet egy készitménypufferben megfeleld koncentrációra hígítjuk a páciensnek ez említett ütőn történő beadására.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol s keiátképzőhoz konjngált antitest egy snti-ÜDzO antitestet tartalmaz,

3, A 2. igénypont szerinti eljárás ahol sz anti-CD2ö antitest ihö-MX-blkh.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a ^Y~'t tartalmazó oldatot körülbelül 3-é-os pH értékre állítjuk be mielőtt a kelátképzőhőz konjugált antitesttel összekevernénkv

5« A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol a pH-t egy alacsony fémtartalmú nátrium-acetát oldattal állítjuk be.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a nátriumecetét oldat koncentrációja 10-1000 méh

7. Az 1-0. igénypontok bármelyike szerinti aljaráé ahol az alkalmazott '^ΪΧΎ mennyisége 5-100 mCi osztva a jelölés időpontjában lévé rsdiosktivitáe-koncentrácioval.

8. A 7, Igénypont szerinti eljárás· ahol sz alkalmazott 1 mennyisége körülbelül 45 mCi osztva a jelölés időpontjában lévő radioaktivitás-konoantráolövai.

0. A S, igénypont szerinti eljárás, ahol 1-2 ml-nyi, 0,5-30 g/mi koncentrációjú MX-DTAA konjugált antitestet keverünk össze a ^Sy¥~t tartalmazó oldattal.

10. Az 1-0. igénypontok bármelyike szerinti eljárás ahol a készitménypuffért olyan mennyiségben adjuk, amennyi ahhoz szükséges, hogy 10-50 ml végtérfogatot érjünk el.

XI, Az 1-X0. igénypontok bármelyika szerinti eljárás, ahol a készitménypuffér agy fiziológiás sdoldetot,· egy rádióprotaktánat ée egy nem-protein kenjngált kelátképzót tártál«yj 'x <·>

{>.{«. <s»

12» A IX. igénypont szerinti eljárás, ahol a radioprotaktáns a humán szérum albumin (HSA), aszkorbét, aszbrbinsav, fenol, szulfitok, glutstion, risztéin, gentizinssv, nikotinsav, sszkorbii-pslmitát, HOP(:O)Hg, glioerel, nátrium formaldehid sznlfozilát ,· Ha.gSgO§, BagS^ög vagy SOg.

X3« A 12» igénypont szerinti eljárás, ahol a radioprotaktána a HSA»

14, A 13, igénypont szerinti eljárás, ahol a HSA konoentráeiójs 1-25 tómeg/téríogst %,

XS« A 14» igénypont szerinti eljárás, ahol a HSA koncentrációja kb, 7,5 tömag/térfogat %,

16» A 1.2» igénypont szerinti eljárás, ahol a radioprotaktáns asakorbátx

X7, A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol ez asskorbát koncentrációja l-löö mg/ml.

18. » A 11, igénypont szerinti eljárás, ahol nem-protein konjugáit kólátképző DTPA vagy EDTA,

19. A 18, igénypont szerinti eljárás, ahol a ΏΤΡΑ koncentrációja kb. 1 mM,

20. Kötési mérőéijárás radloaktivan jelölt antitest célsejthez való százalékos kötődésének meghatározására, ahol (i) az 1. igénypont szerinti eljárással egy antitestet radioaktív jelzéssel látunk el, és igy radloaktivan jelzett antitestet állítunk elő (ii) a radloaktivan jelölt antitest legalább egy alikvotját az antígén-pozitÍv sejtek legalább egy alikvotjával keverjük össze és Ínkubáljuk?

íill) a radloaktivan jelölt antitestnek a (11) lépés alikvotjával azonos legalább egy alikvotját és a hígítási paffén legalább egy# az (íí) lépésben szereplő antigén-pozitlv sejtek alikvotjával azonos mennyiségű alikvotját kontroliként összekeverjük és Ínkubáljuk?

(iv) a sejteket centrifugálással pelletizáijuk?

(v) a radioaktivitást mérjük a paliétizéit sejtek és a kontroll íeiülúszbjéhan? és (vi) Összehasonlítjuk a sejtfeiüiűszöban lévő radioaktivitás mennyiségét a kontroliban lévő radioaktivitás mennyiségévei«

21. Α 20, igénypont szerinti kötési mérőéijárás, ahol az említett antitest egy CD20 antitest.

22. A 21. igénypont szerinti kötési mérőéijárás, ahol az anti-CD20 antitest 288.

23. A 20-22, igénypontok bármelyike szerinti kötési mérőeljárás, ahol az antigén CD20.

24. A 20-23. igénypontok bármelyike szerinti kötési mérőeljárás ahol a CD2Q-pozitiv sejtek SB sejtek (ATCC CCL 120),

25. A 20, igénypont szerinti kötési mérőéijárás, ahol továbbá (!) a radioaktívan jelölt antitest legalább egy alíkvotját az antigén-negatív sejtek legalább egy alikvotjavai keverjük össze;

(ii) az antigén-negatív sejteket zentriíngálássaX pelletlzáljak;

(iii) mérjük a radioaktivitást az antigén-negatív pelietizált sejtek relüiűszőjáfoan; ás (ív) összehasonlítjuk az antigén-negatív sejtfelülűszőban lévő radioaktivitás mennyiségét az antigén-pozitív sejtfaluiúszóban és a kontroliban lévő radioaktivitás mennyiségével.

.jt

26. A 25. igénypont szerinti kötési mérőéijárás, ahol az említett antigén-negatív aejtek C020-negatívak.

27. A 26. igénypont szerinti kötési mérőéijárás, ahol ar említett CB2Ö~negatív sejtek HSB eejtek (ATCC CCL 120.1).