BRPI0008719B1 - Método para radiomarcação de um anticorpo conjugado a um quelante com 90y e ensaio de ligação para determinação da ligação percentual de um anticorpo radiomarcado à sua célula alvo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA RADIOMARCAÇÃO DE UM ANTICORPO CONJUGADO A UM QUELANTE COM 90Y E ENSAIO DE LIGAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DA LIGAÇÃO PERCENTUAL DE UM ANTICORPO RADIOMARCADO À SUA CÉLULA ALVO".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se a ensaios de ligação de anticorpo e a kits para radiomarcação, preparados liofilizados de células, reagentes e protocolos para a testagem da eficácia clínica de anticorpos terapêuticos para o tratamento/formação de imagens de tumores e células tumorígenas. Especificamente, os kits da presente invenção são usados para a fabricação e avaliação de conjugados de anticorpos radiomarcados que serão usados para o tratamento e formação de imagens de tumores linfóides de células B tendo como objetivo o antígeno BP35 ("CD20") sobre a superfície das células B. 2. Antecedentes Tecnológicos Todas as publicações e pedidos de patentes aqui são incorporados por referência até o mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicados como sendo incorporados por referência. O sistema imune de vertebrados {por exemplo, primatas, os quais incluem seres humanos, chimpanzés, macacos, etc.) consiste em uma variedade de órgãos e tipos de células os quais estão envolvidos: no reconhecimento preciso e específico de microorganismos estranhos ("antígeno") os quais invadem o vertebrado hospedeiro; na ligação específica a tais microorganismos estranhos; e na eliminação/destruição de tais microorganismos estranhos. Os linfócitos, bem como outros tipos de células, são críticos para o sistema imune. Os linfócitos são produzidos no timo, baço e medula óssea (adultos) e representam cerca de 30% das células sangüíneas brancas totais presentes no sistema circulatório de seres humanos (adultos).

Existem duas subpopulações principais de iinfócitos: células T e células B. As células T são responsáveis pela imunidade mediada por células, ao passo que as células B são responsáveis pela produção de anticorpos (imunidade humoral). Contudo, as células B e as células T podem ser consideradas como independentes - em uma resposta imune típica, as células T são ativadas quando o receptor das células T se liga a fragmentos de um antígeno que está ligado às glicoproteínas de um complexo principal de histocompatibilidade ("MHC") sobre a superfície de uma célula que apresenta antígeno; tal ativação acarreta a liberação de mediadores biológicos ("in-terleucinas") as quais, em essência, estimulam as células B a se diferenciarem e produziram anticorpos ("imunoglobulinas") contra o antígeno.

Cada célula B dentro do hospedeiro expressa um anticorpo diferente sobre sua superfície - assim, uma célula B expressará um anticorpo específico a um antígeno, ao passo que outra célula B expressará um anticorpo específico a um antígeno diferente. Conseqüentemente, as células B são muito diversas e essa diversidade é crítica para o sistema imune. Em seres humanos, cada célufa B pode produzir uma grande variedade de moléculas de anticorpo (isto é, cerca de 107 a 108). Tal produção de anticorpos cessa, mais tipicamente, (ou diminui substancialmente) quando o antígeno estranho foi neutralizado. Contudo, ocasionalmente, a proliferação de uma célula B em particular não diminui; tal proliferação pode resultar em um câncer referido como "linfoma de células B".

As células T e células B compreendem proteínas sobre a superfície celular as quais podem ser utilizadas como "marcadores" para diferenciação e identificação. Um de tais marcadores de células B humanas é o antígeno de diferenciação restrito a Iinfócitos B humanos Bp35, referido com "CD2G". O CD20 é expresso durante o desenvolvimento precoce das células pré-B e continua até a diferenciação celular no plasma. Especificamente, a molécula de CD20 pode regular uma etapa no processo de ativação a qual é requerida para iniciação e diferenciação do ciclo celular e é usualmente expresso em níveis muito altos em celular B neoplásicas ("tumor"). O CD20, por definição, está presente em células B "normais" assim como em células B "malignas", isto é, aquelas células B cuja proliferação que não diminui pode levar a um linfoma de células B. Assim, o antígeno sobre a superfície do CD20 tem o potencial para servir como um candidato para "ser um objetivo" em linfomas de células B.

Em essência, tal objetivação pode ser generalizada como segue: anticorpos específicos ao antígeno CD20 sobre a superfície de células B são, por exemplo, injetados em um paciente. Esses anticorpos anti-CD20 se ligam especificamente ao antígeno CD20 sobre a superfície celular de células B normais (aparentemente) e malignas; o anticorpo aníi-CD20 ligado ao antígeno CD20 sobre a superfície pode levar à destruição e deleção das células B neoplásicas. Adicionalmente, agentes químicos ou marcadores radioativos tendo o potencial para destruir o tumor podem ser conjugados ao anticorpo anti-CD20 de modo que o agente é especificamente "distribuído", por exemplo, às células B neoplásicas. A despeito da abordagem, é um objetivo primário destruir o tumor: a abordagem específica pode ser determinada pelo anticorpo anti-CD20 em particular que é utilizado e, assim, as abordagens disponíveis tendo como objetivo o anticorpo anti-CD20 podem variar consideravelmente.

Por exemplo, foram relatadas tentativas de tal objetivação do antígeno CD20 sobre a superfície. O anticorpo monoclonal de murino (ca-mundongo) 1F5 (um anticorpo anti-CD20) foi relatavelmente administrado através de infusão intravenosa contínua a pacientes com linfoma de células B. Níveis extremamente elevados (> 2 gramas) de 1F5 foram relatavelmente requeridos para eliminar as células tumorígenas em circulação e os resultados foram descritos com sendo "transitórios". Press e outros, "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas", Blood 69/2:584-591 (1987).

Um problema potencial com essa abordagem é que anticorpos monoclonais não humanos (isto é, anticorpos monoclonais de murino) carecem, tipicamente, da funcionalidade efetuadora humana, isto é, eles são incapazes de, inter alia, mediar a lise dependente de complemento ou a lise de células alvo humanas através da toxicidade celular dependente de anti- corpo ou fagocitose mediada pelo receptor Fc. Além disso, anticorpos mono-clonais não humanos podem ser reconhecidos pelo hospedeiro humano como uma proteína estranha; portanto, injeções repetidas de tais anticorpos estranhos podem levar à indução de respostas imunes que levam à reações prejudiciais de hipersensibilidade. Para anticorpos monoclonais baseados em murino, isso é, freqüentemente, referido como uma resposta pelo Anticorpo Humano Anticamundongo ou resposta "HAMA". Adicionalmente, esses anticorpos "estranhos" podem ser atacados pelo sistema imune do hospedeiro de modo que eles são, em efeito, neutralizados antes de atingirem seu local alvo.

Os linfócitos e células de linfoma são inerentemente sensíveis à radioterapia. Portanto, as malignidades das células B são alvos atraentes para radioimunoterapia (RIT) por várias razões: a emissão local de radiação ionizante de anticorpos radiomarcados pode matar células com ou sem o antígeno alvo (por exemplo, CD20) em íntima proximidade ao anticorpo ligado ao antígeno; a penetração de radiação, isto é, emissores beta, pode impedir o problema de acesso limitado ao anticorpo em tumores densos ou polivascularizados; e a quantidade total de anticorpo requerido pode ser reduzida. O radionuclídeo emite partículas radioativas as quais podem danificar o DNA celular até o ponto onde os mecanismos de reparo celular são incapazes de permitir que a célula continue vivendo; portanto, se as células alvo são tumores, o marcador radioativo matará beneficamente as ceíulas tumorígenas. Os anticorpos radiomarcados, por definição, incluem o uso de uma substância radioativa a qual pode requerer a necessidade de precauções com relação ao paciente (isto é, possível transplante de medula óssea), bem como com relação à saúde daquele que proporciona assistência (isto é, a necessidade de exercer um alto grau de cuidado quando trabalhando com radioatividade).

Portanto, uma abordagem para a melhora da capacidade dos anticorpos monoclonais de murino em efetuar o tratamento de distúrbios das células B tem sido conjugar um marcador radioativo ao anticorpo de modo que o marcador ou toxina esteja localizado no local do tumor. Toxinas (isto é, agentes quimioterápicos tais como doxorrubicina ou mitomicina C) também têm sido conjugadas a anticorpos. Veja, por exemplo, pedido PCT publicado WO 92/07466 (publicado em 14 de Maio de 1992).

Anticorpos "quiméricos", isto é, anticorpos os quais compreendem partes de duas ou mais espécies diferentes (por exemplo, camundongo e humano) têm sido desenvolvidos como uma alternativa aos anticorpos "conjugados". Anticorpos quiméricos de camundongo/humano têm sido criados e mostram exibir as características de ligação do anticorpo original de camundongo e as funções efetuadoras associadas à região constante humana. Veja, por exemplo, Cabilly e outros, Patente U.S. 4.816.567; Shoe-maker e outros, Patente U.S. 4.978.745; Beavers e outros, Patente U.S. 4.975.369; e Boss e outros, Patente U.S. 4.816.397, todas as quais são aqui incorporadas por referência. Geralmente, esses anticorpos quiméricos são construídos através do preparo de uma biblioteca genética genômica a partir de DNA extraído de hibridomas preexistentes de murino. Nishimura e outros (1987) Câncer Research 47: 999. A biblioteca é, então, selecionada com relação aos genes das regiões variáveis de cadeias pesadas e leves que exibem os padrões corretos de redistribuição do fragmento de anticorpo. Os genes clonados das regiões variáveis são, então, ligados em um vetor de expressão contendo cassetes clonados do gene apropriado da região constante humana de cadeia pesada ou leve. Os genes quiméricos são, então, expressos em uma linha de células de escolha, usualmente uma linha de mieloma de murino.

Por exemplo, Liu, A.Y. e outros, "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity", J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), descrevem um anticorpo qui-mérico de camundongo/humano dirigido contra o antígeno CD20. Veja também Publicação PCT No. WO 88/04936. Contudo, nenhuma informação é proporcionada quanto à capacidade, eficácia ou praticabilidade do uso dos anticorpos quiméricos de Liu para o tratamento de distúrbios das células B na referência. É observado que ensaios funcionais in vitro (por exemplo, lise dependente de complemento ("CDC"); citotoxicidade celular dependente de anticorpo ("ADCC"), etc.) não podem prever inerentemente a capacidade in vivo de qualquer anticorpo de destruir ou eliminar as células alvo que expressam o antígeno específico. Veja, por exemplo, Robínson, R.D, e outros, "Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological activities", Hum. Antibod. Hybridomas, 2:84-93 (1991) (anticorpo quimérico de camundongo-humano tendo atividade ADCC não detectável). Portanto, a eficácia terapêutica potencial dos anticorpos só pode ser verdadeiramente analisada através de experimentação in vivo.

Para essa finalidade, os pedidos co-pendentes 08/475.813, 08/475.815 e 08/478.967, aqui incorporados por referência em sua totalidade, divulgam conjugados anti-CD20 radiomarcados para "formação de imagens" diagnosticas de tumores linfóides de células B antes de administração do anticorpo terapêutico. O conjugado "ln2B8" compreende um anticorpo monoclonal de murino, 2B8, específico ao antígeno CD20 humano, que é preso a índio[111] (111ln) via um quelante bifuncional, isto é, MX-DTPA (ácido dietilenotriaminapentaacético) o qual compreende uma mistura a 1:1 de 1-isotiocianatobenzil-3-metil-DTPA e 1-metil-3-isotÍocianatobenzil-DTPA. O índio[111] é selecionado como um radionuclídeo diagnóstico devido ao fato de ele emitir radiação gama e encontrar uso anterior como um agente de formação de imagem.

Patentes relacionadas a quelantes e conjugados quelantes são conhecidas na técnica. Por exemplo, a Patente U.S. N° 4.831.175 para Gan-sow é dirigida a quelatos de ácido dietilenotriaminapentaacético polissubsti-tuído e a conjugados de proteína contendo o mesmo e a métodos para seu preparo. As Patentes U.S. Nos. 5.099.069, 5.246.692, 5.286.850 e 5.124.471 de Gansow também se referem a quelatos de DTPA polissubstituídos. Essas patentes são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. O quelante bifuncional específico usado para quelação nos pedidos 08/475.813, 08/475.815 e 08/478.967 foi selecionado na medida em que ele possui elevada afinidade por metais trivalentes e proporciona proporções aumentadas tumor-para-não-tumor, captação óssea reduzida e maior retenção in vivo do radionuclídeo nos locais alvo, isto é, locais com tumor ünfóide de células B. Contudo, outros quelantes bifuncionais são conhecidos na técnica e também podem ser benéficos na terapia de tumores.

Também divulgados nos pedidos 08/475.813, 08/475.815 e 08/478.967 são anticorpos terapêuticos radiomarcados para objetivação e destruição de linfomas de células B e células tumorígenas. Em particular, o conjugado Y2B8 compreende o mesmo anticorpo monoclonal de murino CD20 anti-humano, 2B8, preso a ítrio-[90] (90Y) via o mesmo quelante bifun-cíonal. Esse radionuclídeo foi selecionado para terapia por várias razoes. A meia-vida de 64 horas do 90Y é longa o bastante para permitir o acúmulo de anticorpo pelo tumor e, diferente do 1311, ele é um beta emissor puro de alta energia sem nenhuma irradiação gama associada em seu declínio, com uma faixa de 100 a 1000 diâmetros celulares. A quantidade mínima de radiação que penetra permite a administração extra-paciente de anticorpos S0Y-radiomarcados. Além disso, a internalização de anticorpos marcados não é requerida para morte das células e a emissão local de radiação ionizante seria letal para as células tumorígenas adjacentes que carecem da antígeno alvo.

Devido ao fato de o radionuclídeo S0Y ser preso ao anticorpo 2B8 usando-se a mesma molécula quelantea bifuncional MX-DTPA, o conjugado Y2B8 possui as mesmas vantagens discutidas acima, por exemplo, retenção aumentada do radionuclídeo em um local alvo (tumor). Contudo, diferente do 111ln, ele não pode ser usado para fins de formação de imagem devido à falta de radiação gama associada ao mesmo. Assim, um radionuclídeo para "formação de imagem" diagnostica, tal como 111ln, pode ser usado para determinação do local e tamanho relativo de um tumor antes de e/ou em seguida à administração dos anticorpos quiméricos terapêuticos ou 90Y-radiomarcados para fins de redução do tumor. Adicionalmente um anticorpo marcado com indio permite uma avaliação dosimétrica.

Dependendo do uso pretendido do anticorpo, isto é, como um reagente diagnóstico ou terapêutico, outros radiomarcações são conhecidos na técnica e têm sido usados para fins similares. Por exemplo, radionuclí- deos os quais têm sido usados em diagnose clínica incluem 131l, 125l, 123l, "Tc, 67Ga, bem como 111ln. Os anticorpos também têm sido marcados com uma variedade de radionuclídeos para uso potencial em imunoterapia objetiva (Peirersz e outros (1987), The use of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis and treatment of câncer, Immunol. Cell Biol. 65: 111-125). Esses radionuclídeos incluem 188Re e 186Re, bem como 90Y e, em um ponto menor, 199Au e 67Cu. I-[131] também tem sido usado para fins terapêuticos. A Patente U.S. No. 5.460.785 proporciona uma lista de tais radioisótopos e é incorporada aqui por referência.

Conforme relatado nos pedidos co-pendentes 08/475.813, 08/475.815 e 08/478.967, a administração do conjugado radiomarcado Y2B8, bem como do anticorpo quimérico anti-CD20 não marcado, resultou em uma redução significativa do tumor em camundongos que tinham um tumor linfoblástico de células B. Além disso, os experimentos clínicos em seres humanos relatados nos mesmos mostraram uma eliminação significativa de células B em pacientes com linfoma submetidos à infusão de anticorpo quimérico anti-CD20. Na verdade, ο 2B8 quimérico foi anunciado recentemente à nação como o primeiro anticorpo monoclonal anti-câncer aprovado pelo FDA sob o nome Rituxan®. Assim, foi mostrado que pelo menos um anticorpo quimérico anti-CD20 demonstra eficácia terapêutica no tratamento de linfoma de células B.

Além disso, o Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/475.813, aqui incorporado por referência, divulga a administração seqüencial de Rituxan®, um anti-CD20 quimérico, com um anticorpo monoclonal de murino marcado com índio ou ítrio. Embora os anticorpos radiomarcados usados nessas terapias combinadas sejam anticorpos de murino, o tratamento inicial com um anti-CD20 quimérico elimina, de modo suficiente, a população de células B, de modo que a resposta HAMA é diminuída, dessa forma, facilitando um regime terapêutico e diagnóstico combinado.

Assim, no contexto de imunoterapia combinada, anticorpos de murino podem encontrar utilidade particular como reagentes diagnósticos. Além disso, foi mostrado no Pedido de Patente U.S. 08/475.813 que uma dosagem terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD20 ítrio-marcado em seguida à administração de Rituxan é suficiente para (a) eliminar quaisquer células B sangüíneas periféricas não eliminadas pelo anticorpo quimérico antí-CD20; (b) começar a eliminação de células B dos nódulos linfáticos; ou (c) começar a eliminação de células B de outros tecidos.

Assim, a conjugação de radiomarcações a anticorpos terapêuticos contra o câncer proporciona uma ferramenta clínica valiosa a qual pode ser usada para avaliar a eficácia terapêutica potencial de tais anticorpos, criar reagentes diagnósticos para monitorar o progresso do tratamento e projetar reagentes terapêuticos adicionais os quais podem ser usados para intensificar o potencial inicial de morte do tumor do anticorpo quimérico. Dada a eficácia comprovada de um anticorpo anti-CD20 no tratamento de linfoma não Hodgkin e a sensibilidade conhecida dos linfócitos à radioatividade, seria altamente vantajoso que tais anticorpos terapêuticos se tornassem comercialmente disponíveis na forma de um kit, pelo que eles podem ser prontamente modificados com um radiomarcação e administrados diretamente ao paciente no ambiente clínico.

Embora existam muitos métodos e reagentes para realizar a radiomarcação de anticorpos, o que falta na técnica é um veículo conveniente para colocação desses reagentes no ambiente clínico, de uma forma que eles podem ser facilmente produzidos e administrados ao paciente antes que declínio significativo do radiomarcação ou destruição significativa do anticorpo em virtude do radiomarcação ocorra. A falta de tal meio conveniente para comercializar essa tecnologia valiosa poderia ser devido às eficácias inferiores de incorporação demonstradas por alguns protocolos conhecidos de marcação e a subsequente necessidade de purificação em coluna do re-agente em seguida ao procedimento de radiomarcação. O declínio no desenvolvimento de tais kits poderia também, em parte, ser devido à falta anterior de acessibilidade a radioisótopos comerciais puros os quais podem ser usados para gerar produtos marcados de modo eficiente sem subsequente purificação. Alternativamente, talvez a razão pela qual tais kits estão geralmente indisponíveis é a falta real de anticorpos os quais sejam capazes de obter a aprovação ou eficácia que o Rituxan® obteve para o tratamento de linfoma em pacientes humanos.

Por exemplo, conforme discutido na Patente U.S. 4.636.380, aqui incorporada por referência, geralmente acredita-se na comunidade científica que para que um radiofármaco encontre utilidade clínica, eíe deve passar por um longo e tedioso processo de separação e purificação. Na verdade, a injeção de um radiomarcação não ligado no paciente não seria desejável. A necessidade de etapas adicionais de purificação torna o processo de radiomarcação de anticorpos no ambiente clínico uma impossibilidade, particularmente para médicos que não têm nem o equipamento nem tempo para purificar seus próprios produtos terapêuticos.

Além disso, as proteínas radiomarcadas podem ser inerentemente instáveis, particularmente aquelas marcadas com isótopos radiolíticos tais como S0Y, os quais têm a tendência de causar danos ao anticorpo quanto mais eles são presos ao mesmo em proximidade íntima. Por sua vez, tal radiólise acarreta em uma eficácia não confiável do produto terapêutico devido à perda de radiomarcação e/ou ligação reduzida ao antígeno alvo e pode levar a respostas imunes indesejadas dirigidas à proteína desnaturada. Ainda sem as instalações para marcação e purificação dos anticorpos no local, os médicos não têm escolha a não ser pedir anticorpos terapêuticos já marcados ou eles marcam os mesmos fora do local em uma instalação relacionada e os transportam após a marcação para administração ao paciente. Todas essas manipulações e o tempo precioso entre o período de marcação e administração, dessa forma, contribuem para a instabilidade do produto terapêutico, ao mesmo tempo em que diminui a utilidade dos kits de radiomarcação no ambiente clínico.

Outros tentaram desenvolvem, sem sucesso, kits para a radiomarcação de anticorpos que seriam competentes o bastante para sofrer uma etapa de purificação do anticorpo. Por exemplo, a Cytogen lançou recentemente um kit comercial para radiomarcação de um anticorpo monoclonal de murino dirigido à glicoproteína associada a tumores TAG-72. Contudo, o anticorpo da Cytogen é particularmente não receptivo a uma formulação na forma de um kit devido à tendência em desenvolver partículas durante armazenamento, as quais deverão ser posteriormente removidas por meio de uma etapa de filtração. Além disso, o anticorpo da Cytogen causou reações adversas nos pacientes em virtude de respostas HAMA.

Outros reivindicaram o desenvolvimento de protocolos de radio-marcação os quais seriam passíveis do formato em um kit pelo fato de que uma etapa distinta de purificação não seria requerida (Richardson e outros (1987) Optimization and batch production of DTPA-labeled antibody kits for routine use in 111ln immunoscintography, Nun. Med. Commun. 8:347-356; Chinol e Hnatowich (1987) Generetor-produced yttrium-[90] for radioimmuno-therapy, J. Nucl. Med. 28(9):1465-1470). Contudo, tais protocolos não foram capazes de obter o nível de incorporação que os presentes inventores obtiveram usando os protocolos divulgados aqui, os quais resultaram em eficácias quanto à incorporação de pelo menos 95%. Tal nível de incorporação proporciona o benefício adicional de segurança aumentada pelo fato de que virtualmente nenhum marcador não ligado será injetado no paciente como um resultado de baixa radioincorporação.

Os protocolos incluídos nos kits da presente invenção permitem a marcação rápida que pode ser realizada em aproximadamente meia hora ou tão pouco quanto cinco minutos, dependendo do marcador. Além disso, os protocolos do kit da presente invenção têm uma eficácia de marcação de mais de 95%, dessa forma, superando a necessidade de outra purificação. Superando a necessidade de outra purificação, a meia-vida do radiomarca-ção e a integridade do anticorpo são preservadas para a finalidade terapêutica para a qual ele é marcado. O presente pedido divulga kits e métodos convenientes pelos quais anticorpos diagnósticos e terapêuticos podem ser radiomarcados e administrados a um paciente de uma forma reproduzível, confiável e conveniente. Os kits da presente invenção transformam o processo de radiomar-cação de anticorpos em um processo padronizado sem controvérsias, sem preocupações o qual facilita os protocolos de tratamento do paciente. Os presente kits proporcionam vantagens sobre a técnica anterior pelo fato de que os parâmetros ótimos para marcação e administração do produto diagnóstico ou terapêutico foram determinados, dessa forma, reduzindo o custo de produção. Uma vez que os kits descritos aqui proporcionam os parâmetros ótimos de acordo com o marcador em particular, o uso de um kit projetado para um marcador em particular também minimizará a canibalização, isto é, que ocorre quando um kit inapropriado é usado para um marcador em particular. Ao se evitar a canibalização, por sua vez, também se proporciona uma eficácia ótima de marcação. Além disso, os protocolos e os ingredientes estéreis isentos de pirogênio incluídos em cada kit tornam o processo mais livre ao usuário, uma vez que a testagem da esterilidade e de pirogênios e a purificação pós-marcação dos reagentes são eliminadas. 3. Sumário da Invenção A presente invenção inclui um kit para radiomarcação de um anticorpo diagnóstico ou terapêutico antes de administração a um paciente compreendendo pelo menos (i) um frasco contendo um anticorpo conjugado a um quelante, (ii) um frasco contendo formulação tampão para estabilização e administração ao anticorpo radiomarcado e (iii) instruções para radiomarcação do anticorpo, em que os referidos componentes dos frascos são fornecidos em uma quantidade tal e em uma concentração tal que quando eles são combinados com um radiomarcação de pureza e atividade suficientes de acordo com as instruções no kit, nenhuma purificação do anticorpo marcado é requerida antes de administração ao referido paciente. Além disso, quando marcado de acordo com as instruções no kit e com um radioisótopo de pureza e atividade suficientes, tal incorporação de isótopo pode atingir níveis maiores do que 95% e mesmo tão altos quanto 98% ou maior. O anticorpo incluído no kit é, mais preferivelmente, um anticorpo anti-CD20. O anticorpo é fornecido em uma forma pela qual ele é preso a um quelante bifuncional. De preferência, o anticorpo é conjugado a MX-DTPA, mas outros quelantes tais como DTPA fenil- ou benzil-conjugado, cicloexii-DTPA, derivados de EDTA e DOTA podem ser usados. Um quelante de a-cordo com a presente invenção pode ser qualquer quelante que é pelo menos bifuncional, isto é, o qual possui pelo menos dois locais de ligação (pelo menos um local para quelação de um íon metálico e pelo menos um local para acoplamento a um ligante proteináceo).

Dependendo do anticorpo usado, o anticorpo conjugado é, tipicamente, fornecido em uma concentração de 0,5 a 30 mg/ml, mais preferivelmente 2 mg/ml. O volume de anticorpo conjugado dependerá da concentração e da quantidade requeridas para marcação ótima, dependendo do radiomarcação. Contudo, o anticorpo conjugado será adicionado ao frasco de reação usando-se uma seringa estéril e uma técnica asséptica. Isso permitirá reprodutibilidade aumentada e facilidade de uso. Todos os reagentes dos kits divulgados aqui são estéreis e isentos de pirogênio e projetados especificamente para simplicidade e velocidade antecipada diretamente a partir de testagem antes de administração. Com alguns marcadores, a necessidade de testagem da eficácia de marcação pode não ser requerida.

Um componente particularmente vantajoso do kit é a formulação tampão para estabilização contra os efeitos da radiólise e administração do anticorpo conjugado radiomarcado a um paciente. A formulação tampão é um veículo farmaceuticamente aceitável que serve como um diluente para o anticorpo marcado e um tampão para administração. Embora qualquer diluente farmaceuticamente aceitável possa ser usado para administração de anticorpos terapêuticos e diagnósticos a um paciente, a formulação tampão da presente invenção é particularmente adequada para administração de anticorpos radiomarcados.

Por exemplo, a formulação tampão da presente invenção compreende um radioprotetor tal como albumina de soro humano (HSA) ou as-corbato, o que minimiza a radiólise devido ao ítrio e, até um grau menor, índio. Outros radioprotetores são conhecidos na técnica e também poderíam ser usados na formulação tampão da presente invenção, isto é, seqüestran-tes de radical livre (fenol, sulfitos, glutationa, cisteína, ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbila, H0P(:0)H2, glicerol, sulfoxilato de formaí-deído de sódio, Na2S20s, Na2S203 e S02, etc.).

Deve ser observado que embora radioprotetores sejam geralmente empregados na formulação tampão para proteger o anticorpo contra radiólise, pode ser possível realizar proteção adicional através de inclusão do radioprotetor no tampão de reação também. Isso geralmente não é feito antes, isto é, com HSA, devido à presença de metais os quais interferiríam com o processo de marcação. Contudo, pode ser possível "eliminar" o HSA usando-se uma resina de quelação de modo que ele poderia ser incluído no tampão de reação também. Também pode ser necessário que o ascorbato e outros radioprotetores sejam tratados a fim de remover os metais contami-nantes. A formulação tampão da presente invenção também compreende quelante não conjugado em excesso. A finalidade da inclusão do quelan-te não conjugado é que esse quelante serve para remover qualquer radio-marcação ligado a não proteínas no paciente e efetua a excreção do radio-marcação, dessa forma, reduzindo a captação de isótopos "que buscam o osso", isto é, 90Y, pelos ossos do paciente. Por exemplo, quando o anticorpo do kit é conjugado a um quelante de DTPA, DTPA em excesso ou qualquer outro quelante pode ser incluído na formulação tampão. A formulação tampão também é, de preferência, fornecida em um volume tal que os conteúdos todos são transferidos para o frasco de reação. Conforme discutido acima, isso resulta em facilidade de uso e reprodutibilidade aumentadas em virtude dos volumes exatos não precisarem ser medidos e transferidos.

Uma formulação tampão preferida compreende solução salina fisiológica ou tamponada com fosfato, albumina de soro humano e DTPA. A albumina de soro humano está, de preferência, em uma concentração de entre cerca de 1 a 25% (p/v) e mais preferivelmente em uma concentração de cerca de 7,5% (p/v). A concentração de DTPA é, de preferência, cerca de 1 mM. O ascorbato pode ser usado como uma alternativa à albumina de soro humano e é tipicamente usado em uma concentração de cerca de 1 a 100 mg/ml. Entretanto, uma faixa maior de concentrações pode ser usada sem comprometer a segurança do paciente. O anticorpo do kit de radiomarcação é prontamente marcado com um radioisótopo de escolha via um quelante bifuncíonal de acordo com os métodos da presente invenção. Para mais simplicidade a esse respeito, o kit da presente invenção também pode incluir um frasco contendo um tampão para ajuste do pH da solução de radioisótopo e um frasco de vidro estéril para reação para realizar a radiomarcação e subsequentemente para re-suspensão do anticorpo radiomarcado final na formulação tampão. Um frasco de reação de 10 ml é, tipicamente, suficiente, mas frascos com capacidades de 5 a 20 ml também podem ser usados. O tampão é, de preferência, uma solução de acetato de sódio com baixo teor de metais em uma concentração de 10 a 1000 mM, mais preferivelmente 50 mM.

Um kit específico da presente invenção compreende o anticorpo conjugado a MX-DTPA, 2B8-MX-DTPA. Ο 2B8 é um anticorpo anti-CD20 que foi mostrado não afetar a eliminação de células B quando de administração a pacientes com linfoma. Contudo, será evidente para aqueles versados na técnica que o kit de radiomarcação da presente invenção pode ser otimizado para radiomarcação de outros anticorpos anti-CD20 ou qualquer outro anticorpo o qual tenha sido conjugado à DTPA ou outro quelante polivalente. O kit preferido da presente invenção pode compreender pelo menos (i) um frasco contendo o anticorpo 2B8 conjugado a MX-DTPA, quer em solução ou liofilizado (requerendo reconstituição); e (ii) um frasco contendo formulação tampão para administração do anticorpo radiomarcado a um paciente. O kit preferido também conterá (iii) um tampão para ajuste do pH do isótopo e (iv) um frasco de reação. Alternativa e mais preferivelmente, o tampão é fornecido em um frasco de reação, dessa forma, eliminando as etapas de medição e transferência do tampão e aumentando a simplicidade, consistência e esterilidade dos componentes do kit. Contudo, outras concretizações também são consideradas, isto é, pelo que o tampão é adicionado ao primeiro frasco com isótopo e o isótopo tamponado é, então, transferido para o frasco de reação. Nesse caso, o frasco de reação podería ser fornecido com o volume requerido de anticorpo. Alternativamente, o frasco com isótopo/tampão podería ser feito grande o bastante para acomodar a adição do conjugado de anticorpo, isto é, diretamente ao frasco do fornecedor. Isso eliminaria a necessidade de um frasco de reação.

Conforme descrito acima, outra configuração preferida do kit é abrangida, em que o fraco de reação em si contém o volume requerido de anticorpo conjugado (isto é, 1 ou 1,5 ml_ para 111ln e 90Y, respectivamente). O anticorpo pode ser fornecido em um tampão que proporciona o pH adequado para radiomarcação de acordo com o isótopo específico desejado (isto é, pH de 3-6 para 111 In, pH de 3-5 para 90Y). Tampões diferentes podem ser usados, dependendo do isótopo (isto é, acetato de sódio para 90Y, citrato de sódio para 111 In). O pH e composição do tampão também podem variar, dependendo da natureza do ligante de ligação a ser marcado (isto é, peptí-deos de marcação que permitem que um pH < 3 seja usado). Essencialmente, então, o isótopo será transferido diretamente para o frasco de reação, assim como a formulação tampão. Limitando-se o uso do kit para duas etapas de transferência aumenta adicionalmente a reprodutibilidade e simplicidade e diminui ainda mais a chance de contaminação da esterilidade durante a manipulação dos componentes do kit.

Os kits de radiomarcação da presente invenção podem ainda compreender um frasco de radioisótopo ou o radioisótopo pode ser pedido separadamente de um fornecedor apropriado. Radioisótopos preferidos da presente invenção são cloreto de 111 In e cloreto de 90Y em HCI, embora os métodos divulgados na estejam limitados a esses isótopos. Outros radionu-clídeos que têm sido usados para aplicações de formação de imagem são conhecidos na técnica, isto é, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 4.634.586, 5.460.785 e 5.766.571, as quais são incorporadas aqui por referência. índio-[111] é particularmente vantajoso para formação de imagem de tumores de células B e beta emissores, tal como 90Y, são particularmente úteis como agentes radioterapêuticos. Entretanto, outros radioisótopos adequados para essas e outras finalidades, isto é, alfa emissores, podem ser usados, dependendo do quelante usado para conjugação do anticorpo.

Dada a eficácia comprovada dos regimes terapêuticos combinados divulgados no Pedido de Patente U.S. N° de Série 08/475.813, uma outra concretização do kit também incluirá um frasco separado de anticorpo quimérico, isto é, Rituxan®, a ser administrado antes ou após o anticorpo anti-CD20 radiomarcado. Quando o anticorpo quimérico é administrado an- tes do anticorpo radiomarcado, a resposta HAMA a qual ocorrería, geralmente, em resposta à administração de um anticorpo anti-CD20 de murino, pode ser significativamente diminuída, dessa forma, aumentado a utilidade terapêutica dos anticorpos radiomarcados de murino. Além disso, quando o anti-CD20 quimérico é empregado para eliminar células B em circulação, as imagens diagnosticas subseqüentes obtidas com os anticorpos 111ln-marcados podem ser muito mais claras.

Também será evidente que um anticorpo diagnóstico radiomarcado e um anticorpo terapêutico radiomarcado podem ser usados juntos em um regime terapêutico combinado. A esse respeito, o anticorpo diagnóstico pode ser usado antes ou após o anticorpo terapêutico a fim de visualizar o tamanho do tumor antes e após o tratamento. Nesse caso, o kit da presente invenção pode incluir frascos separados com tampão, talvez com códigos coloridos, especificamente formulados de acordo com os requisitos quanto ao pH ótimo para radiomarcação dos anticorpos com os radioisótopos específicos a serem usados. Tal sistema asseguraria que o tampão apropriado foi usado para cada marcador e permitiría ao médico a mesma facilidade na radiomarcação de dois anticorpos como se dois kits tivessem sido adquiridos. Tal kit combina, em efeito, os componentes de dois kits para radiomarcação em um.

Os componentes do kit para radiomarcação da presente invenção são fornecidos na concentração e pH apropriados, de modo que a esterilidade é prontamente mantida antes de administração do anticorpo e existe pouca necessidade de tampões ou meios adicionais. Contudo, será evidentes para aqueles versados na técnica que alguns dos reagentes podem ser preparados, esterilizados e testados com relação à esterilidade no local. Assim, variações do kit da invenção são consideradas, dependendo do orçamento e preferência do consumidor. O kit para radiomarcação da presente invenção pode ser usado em um método para radiomarcação de um anticorpo conjugado a um que-lante para administração a um paciente. De acordo com a presente invenção, tal método compreende, em geral, (i) mistura de um anticorpo conjuga- do a um quelante com uma solução contendo um radioisótopo; (ii) incubação da mistura durante um período de tempo apropriado em uma temperatura apropriada; e (iii) diluição do anticorpo marcado até uma concentração apropriada na formulação tampão, de modo que o anticorpo radiomarcado pode ser administrado diretamente a um paciente sem outra purificação.

Mais preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo anti-CD20 e, em particular, o anticorpo anti-CD20 pode ser 2B8. O anticorpo pode ser conjugado a qualquer quelante apropriado, isto é, MX-DTPA, CHX-DTPA, fenil- ou benzil-DTPA, DOTA, derivados de EDTA, etc. MX-DTPA é preferido. Métodos para realizar a conjugação de anticorpo são conhecidos na técnica (Kozak e outros (1989); Mirzadeh e outros (1990), Brachbiel e outros (1986)).

Os presentes inventores descobriram que o método de radio-marcação de um anticorpo conjugado a um quelante funciona melhora quando a solução contendo o radiomarcação tem o pH ajustado para entre 3,0 e 6,0 e mais preferivelmente para cerca de 4,2 antes de ser misturada a um anticorpo conjugado a um quelante. Acetato de sódio com baixo teor de metais é particularmente preferido para ajuste do pH, embora outros tampões possam ser usados. De preferência, o acetato de sódio está em uma concentração de entre cerca de 10 e 1000 mM e mais preferivelmente 50 mM.

Quando o radioisótopo é cloreto de 111!n, quantidade volumétrica de cloreto de 111ln que deverá ser usada para preparar uma única dose administrativa é, tipicamente, cerca de 5,5 mCi dividido pela concentração de radioatividade no momento da marcação. Para administração ao paciente, uma dose diagnostica típica de 111ln é cerca de 2 a 10 mCi. A quantidade de acetato de sódio usado para ajuste do pH varia, dependendo da concentração do acetato de sódio e da solução veículo para o isótopo e pode, portanto, ser muito ampla. Quando a concentração de acetato de sódio é de 50 mM, a quantidade requerida para ajuste do pH é, tipicamente, cerca de 1,2 vezes a quantidade volumétrica de cloreto de 111ln usada, embora volumes maiores possam ser usados. Será apreciado que a proporção de acetato de sódio para HCI que é importante e a quantidade de acetato de sódio usado se alterará, dependendo da quantidade e concentração do HCI no tampão. Cerca de 1 ml de um anticorpo conjugado a um quelante em uma concentração de cerca de 2 mg/ml é, então, misturado com a solução de acetato com o radiomarcação e a mistura é incubada durante cerca de 30 minutos ou durante um tempo suficiente para se obter marcação ótima do anticorpo. Tal período de tempo pode oscilar de cerca de 30 segundos a cerca de 60 minutos. A formulação tampão é, então, adicionada em uma quantidade necessária para se obter um volume final total de cerca de 10 ml. O tempo ótimo requerido para marcação do anticorpo pode variar, dependendo do anticorpo, do radiomarcação em particular e do conjugado em particular empregado. Um fator fundamental na otimização do tempo conferido para radiomarcação é a proporção quelante para anticorpo do rea-gente o qual está sendo marcado. Por exemplo, a proporção quelante para anticorpo deve ser alta o bastante para se obter um nível terapeuticamente útil de incorporação, isto é, 90 a 95% dependendo do radioisótopo, mas também não deve ser muito alta de modo que a integridade estrutural ou imunorreatividade do anticorpo seja comprometida. Isso requer um determinado processo de equilíbrio que, em alguns casos, pode levar a um nível menor de quelante conjugado e um tempo maior de marcação.

Por exemplo, com relação ao 2B8 e MX-DTPA, descobriu-se que a marcação pode ser realizada em cerca de cinco minutos para 90Y e em cerca de trinta minutos para 111ln para se obter um nível desejado de radio-incorporação, com uma proporção molar de somente cerca de 1 V2 a 1 de quelante para anticorpo. Não seria necessário, portanto, aumentar a proporção quelante para anticorpo em virtude de que um nível desejável de radio-incorporação foi obtido. Além disso, não seria vantajoso aumentar a quantidade de quelante conjugado porque isso podería afetar a imunorreatividade do anticorpo. Tais parâmetros poderíam ser empiricamente determinados para outros anticorpo para 0 projeto de kits tais como aqueles descritos na presente invenção.

Quando 0 radioisótopo é cloreto de 90Y, a quantidade volumétri- ca de cloreto de 90Y usada para o preparo de uma única dose administrativa oscila, tipicamente, de cerca de 10 a 50 mCi e é, de preferência, cerca de 45 mCi, dividida pela concentração de radioatividade no momento de marcação. A quantidade de acetato de sódio usada para ajuste do pH varia, dependendo da concentração de acetato de sódio e da concentração do veículo para o isótopo e pode, portanto, ser muito ampla. Quando a concentração do acetato de sódio é de 50 mM e o 90Y é fornecido em HCI a 50 mM, a quantidade requerida para ajuste do pH é, tipicamente, cerca de 1,2 vezes a quantidade volumétrica do cloreto de 90Y usada. Cerca de 1,5 ml de um anticorpo conjugado a um quelante em uma concentração de cerca de 2 mg/ml é, então, misturada com a solução de acetato com radiomarcação e incubada durante cerca de 5 minutos ou durante um tempo suficiente para se obter marcação ótima do anticorpo. Tal tempo pode oscilar de cerca de 30 segundos a cerca de 60 minutos. A formulação tampão é, então, adicionada em uma quantidade necessária para se obter um volume final total de cerca de 10 ml.

De preferência, o método de radiomarcação da invenção é realizado usando-se o kit de radiomarcação descrito aqui. Contudo, será evidente para aqueles versados na técnica que os componentes e condições preferidos são meramente diretrizes aceitáveis para a prática do método da invenção e podem ser alterados, em algum grau, com a otimização apropriada. Condições que se desviam daquelas preferidas, mas que ainda realizam a finalidade do método, são consideradas como estando dentro do escopo da invenção. O kit para radiomarcação da presente invenção também pode ser fornecido com os reagentes adequados para verificação conveniente da afinidade de ligação do anticorpo em seguida à radiomarcação. Em tal caso, o kit da invenção também pode ser usado para determinação da ligação percentual de um anticorpo radiomarcado a sua célula alvo antes de administração do anticorpo a um paciente. Os presentes inventores também descobriram que o kit para ensaio de ligação divulgado em particular pode ser útil para a testagem da afinidade de qualquer anticorpo de modo geral, para o qual antígeno purificado não está disponível. Conseqüentemente, os com- ponentes para ensaio de ligação também podem ser vendidos como um kit separado.

Em geral, um kit para radiomarcação e ensaio de ligação compreende (i) pelo menos um frasco de células liofilizadas as quais expressam o antígeno que é reconhecido pelo anticorpo no kit; (ii) um frasco contendo anticorpo conjugado a um quelante; (iii) um frasco contendo formulação tampão e (iv) instruções para radiomarcação do anticorpo de modo que o anticorpo radiomarcado pode ser administrado diretamente a um paciente sem a necessidade de subseqüente purificação. Conforme descrito acima com relação ao kit de radiomarcação, esse kit também pode compreender um frasco contendo um tampão para ajuste do pH do radioisótopo e um frasco de vidro estéril para reação. De preferência, o tampão é uma solução de acetato de sódio com baixo teor de metal em uma concentração entre cerca de 10 e 1000 mMeo frasco de vidro para reação mantém um volume de pelo menos 5 ml. O anticorpo é, de preferência, um anticorpo anti-CD20 e o quelante é, de preferência, MX-DTPA. Outros quelantes podem ser usados, conforme descrito anteriormente. O anticorpo conjugado preferido é 2B8-MX-DTPA, embora qualquer anticorpo conjugado a um quelante possa marcado e sua afinidade avaliada. A formulação tampão é solução salina tamponada com fosfato compreendendo um radioprotetor e quelante não conjugado, conforme descrito acima e o radioisótopo pode ou não estar incluído e é, de preferência, cloreto de 111ln ou cloreto de 90Y. Outros radioisó-topos podem ser usados, dependendo do quelante. A diferença entre o kit para radiomarcação/ensaio de ligação e o kit para radiomarcação descrito acima é a inclusão de células antígeno-positivas para servir como um substrato alvo para testagem da afinidade ao anticorpo. Quando o antígeno é CD20, células CD20-positivas preferidas são células SB (ATCC # CCL 120), mas quaisquer células CD20-positivas podem ser usadas. O kit para radiomarcação e ensaio de ligação pode ainda incluir células antígeno-negatívas para uso como um controle negativo. Células CD20-negativas preferidas são células HSB (ATCC # CCL 120.1), mas quaisquer células CD20-negativas podem ser usadas.

Naturalmente, o kit combinado para ensaio de ligação e radio-marcação pode ainda compreender um frasco de anticorpo anti-CD20 qui-mérico além do anticorpo a ser marcado para fins de realizar um regime terapêutico combinado ou para eliminação de células B periféricas antes da formação de imagem diagnostica. Tal anticorpo distinto é, de preferência, Rituxan®, mas pode ser qualquer anticorpo que mostre efetuar a morte de células tumorígenas. Na verdade, dois tipos diferentes de anticorpos podem ser combinados em um kit, isto é, anticorpos dirigidos a dois antígenos diferentes de células B, na medida em que o regime terapêutico combinado serve para objetivar o mesmo tipo de célula, isto é, linfoma de células B.

Na medida em que os componentes do kit podem ser usados para marcar outros anticorpo, outras células para testagem da afinidade do anticorpo podem ser preparadas, dependendo do antígeno alvo. Contudo, para anticorpos anti-CD20, o kit para radiomarcação e ensaio de ligação da presente invenção é particularmente adequado para o ambiente comercial pelo fato de que as células alvo são proporcionadas na forma liofilizada. Isso permite que a verificação da eficácia do anticorpo se processe simples e sistematicamente e não conta com custo e controvérsia envolvidos na manutenção de instalações para cultura tecidual. As células liofilizadas são, de modo geral, fornecidas em alíquotas de entre 0,5 e 500 X 106 células por frasco, de acordo com os métodos da invenção. É possível que instalações em particular prefiram pedir um anticorpo que já tenha sido radiomarcado, caso no qual tal instalação podería desejar pedir os reagentes para ensaio de ligação a fim de assegurar que os anticorpos mantém a afinidade ao alvo. Nesse caso, a presente invenção também proporciona um kit para ensaio de ligação para determinação da ligação percentual de um anticorpo radiomarcado a sua célula alvo. Tal kit inclui pelo menos um frasco de células antígeno-positivas liofilizadas e/ou fixadas e pode, opcionalmente, conter células antígeno-negativas, conforme descrito acima com relação ao kit de radiomarcação e ensaio de ligação. Além disso, será evidente que variações de tal kit podem incluir um anticorpo de controle não marcado para verificação da especificidade de ligação do anticorpo do consumidor via um ensaio competitivo.

Novamente, quando o antígeno é CD20, as células CD20-positivas são, de preferência, células SB (ATCC # CCL 120) e as células CD20-negativas são, de preferência, células MSB (ATCC # CCL 120.1), as quais são fornecidas na forma íiofilizada em alíquotas de entre 0,5 e 50 X 106 células. Nesse caso, o anticorpo é, de preferência, um conjugado de MX-DTPA de 2B8 marcado com 111 In ou 90Y.

Em vista das concretizações adicionais do kit divulgadas aqui, será depreendido que uma das vantagens do kit de radiomarcação e do método da presente invenção é que nenhuma outra etapa de purificação é necessária e o anticorpo radiomarcado pode ser administrado diretamente ao paciente, dessa forma, economizando um tempo valioso e aumentando a estabilidade do anticorpo. Portanto, é enfatizado que, embora possa ser desejável para o médico testar ou verificar a especificidade e afinidade de ligação do anticorpo radiomarcado antes de administração, tal teste pode ser feito com radioisótopos em particular se a estabilidade do anticorpo e a inibição da radiólise são preocupações em particular, isto é, conforme com o í-trio. Através do fornecimento das concretizações do kit em que a afinidade e especificidade de ligação podem ser testadas, os presentes inventores não estão, de forma alguma, sugerindo que tais testes são absolutamente requeridos nos métodos ou kits da presente invenção. A opção para testar tal validade do anticorpo é puramente a opinião do médico.

Os presentes inventores também verificaram que o método usado para o preparo de células fixadas e liofilizadas para os kits para ensaio de ligação da presente invenção é particularmente adequado para o preparo de células para kits comerciais. As células podem ser fixadas antes de liofiliza-ção a fim de melhorar a estrutura/estabilidade. Em particular, as células da presente invenção demonstram alta reprodutibilidade quando usadas para ensaios de ligação de anticorpo.

Em particular, a presente invenção inclui um método de preparo de células liofilizadas compreendendo (i) a coleta de células em uma densidade de células de 0,5 a 2 X 106 células por ml através de centrifugação; (ii) lavagem das células pelo menos uma vez em uma solução salina equilibrada, isto é, HBSS; (üi) ressuspensão das células empelotadas em um tampão de liofiíização compreendendo uma solução salina equilibrada contendo proteína veículo e pelo menos um tipo de açúcar; (iv) distribuição de uma alíquota de células ressuspensas a um tubo de microcentrífuga ou um frasco de vidro; e (v) liofiíização das células 12-96 horas e mais preferivelmente 24-72 horas a cerca de 30-60 mililitros. O método é particularmente adequado para o preparo de células liofilizadas em que as referidas células são células SB (ATCC # CCL 120) ou células HSB (ATCC # CCL 120.1), mas é, da mesma forma, aplicável a outros tipos de células também.

De preferência, o tampão contém, geralmente, albumina de soro bovino como a proteína veículo em uma concentração de 1 % (p/v) e manitol em uma concentração de 10%. Contudo, de modo concebível, outras proteínas veículo, isto é, HSA e outros açúcares podem ser usados. As células são coletadas por meio de centrifugação em uma velocidade de cerca de 1300 rpm e a solução salina HBSS (solução de sal equilibrada de Hank) é adicionada. As células são, geralmente, ressuspensas em uma concentração de 50 X 106 células por ml. Contudo, será evidente para aqueles versados na técnica que as condições acima podem ser ligeiramente modificadas sem comprometer significativamente a viabilidade celular. Além disso, as condições acima podem ser suplementadas por procedimentos adicionais projetados para otimizar o processo com relação à quantidades maiores de células, por exemplo, diafiltração tangencial de fluxo para trocar as células no tampão de liofiíização.

Os kits para ensaio de ligação da presente invenção podem ser usados em um ensaio para avaliar a afinidade de ligação do anticorpo ra-diomarcado. Tal ensaio também é um assunto da presente invenção. Um ensaio de ligação para determinar a ligação percentual de um anticorpo ra-diomarcado a sua célula alvo compreende, em geral, as seguintes etapas: (i) mistura de pelo menos uma alíquota de um anticorpo radiomarcado com pelo menos uma alíquota de células antígeno positivas; (ii) mistura de pelo menos uma alíquota de um anticorpo radiomarcado idêntico à alíquota da etapa (i) com pelo menos uma alíquota de tampão de diluição do mesmo volume que a alíquota de células antígeno-positivas na etapa (i) como um controle; (iii) empelotamento das células através de centrifugação; (iv) medição da radioatividade no sobrenadante das células empelotadas e do controle; e (v) comparação da quantidade de radioatividade no sobrenadante de células com a quantidade de radioatividade no controle.

Uma vez que os kits para radiomarcação da presente invenção contêm, opcionalmente, cloreto de 111 In ou cloreto de 90Y, o ensaio de ligação da presente invenção é, tipicamente, realizado com anticorpos marcados com 111 In ou 90Y. Quando 111 In é o radiomarcação, a radioatividade nos tubos de ensaio é medida usando-se um contador gama. Quando 90Y é o marcador, a radioatividade é medida usando-se um contador de cintilação, embora um contador gama possa ser usado.

Para o ensaio de ligação da presente invenção, o anticorpo preferido é um anticorpo anti-CD20 e o anticorpo anti-CD20 é, de preferência, 2B8, em que o anticorpo 2B8 é marcado usando-se o kit de radiomarcação da presente invenção. Contudo, qualquer anticorpo radiomarcado pode ser testado, contanto que células que expressam o antígeno em particular estejam disponíveis. Quando o CD20 é o antígeno, as células preferidas para realização do ensaio são células SB (ATCC # CCL 120), contudo, o ensaio pode também ser otimizado e realizado com qualquer anticorpo radiomarcado e célula alvo apropriados. O tampão de diluição usado para o ensaio deverá manter ligação do anticorpo, isto é, tampão fisiológico, possivelmente contendo uma proteína veículo, por exemplo, BSA, a fim de minimizar a ligação não específica às células. Embora o tubo com tampão de diluição sirva como um controle, um outro controle pode ser incluído no ensaio através do uso de células antígeno-negativas. Nesse caso, o ensaio de ligação ainda compreende as seguintes etapas: (i) mistura de pelo menos uma alíquota de um anticorpo radiomarcado com pelo menos uma alíquota de células antígeno-negativas; (ii) empelotamento de células antígeno-negativas através de centrifugação; (iv) medição da radioatividade no sobrenadante das células antígeno- negativas empeíotadas; (v) e comparação da quantidade de radioatividade no sobrenadante ao sobrenadante com células antígeno-positivas e com o controle. A comparação da radioatividade obtida nesse tubo com a controle com tampão de diluição servirá como uma medida da quantidade de ligação não específica às células antígeno-positivas. Quando o CD20 é o antígeno e as células CD20-positivas são células SB, as células CD20 negativas são, de preferência, células HSB (ATCG # CCL 120.1).

Conforme descrito acima, as células liofilizadas da presente invenção proporcionam um padrão simples, eficiente e reproduzível para a testagem da eficácia de ligação de um anticorpo radiomarcado. Portanto, o ensaio de ligação da presente invenção é, de preferência, realizado usando-se as células liofilizadas incluídas nos kits para ensaio de ligação da presente invenção. Além disso, os ensaios de radiomarcação da presente invenção podem ser combinados com os ensaios de ligação da presente invenção, em que o anticorpo é primeiro marcado pelo método de marcação de um anticorpo conjugado a um quelante, conforme descrito na presente invenção. Mais preferivelmente, o ensaio de ligação da presente invenção é realizado usando-se um dos kits para radiomarcação e ensaio de ligação descritos aqui.

Existem alguns casos onde a afinidade de um anticorpo deverá ser testada ou verificada, mas um radiomarcação não está preso. Por exemplo, sob determinadas circunstâncias, isto é, problemáticas, pode ser vantajoso testar a afinidade de ligação de um anticorpo antes da radiomarcação. Para tal caso, a presente invenção também abrange um ensaio de ligação competitiva para avaliação da afinidade de um anticorpo de teste a uma célula alvo compreendendo (i) preparo de um anticorpo de controle marcado com rutênio usando-se um anticorpo conhecido específico para o mesmo antígeno; (ii) incubação de quantidades crescentes do anticorpo de teste e quantidades crescentes de anticorpo de controle não marcado com uma concentração fixa de células alvo e uma quantidade vestigial de anticorpo marcado com rutênio, em que cada concentração distinta do anticorpo de teste de cada concentração distinta de anticorpo de controle estão em tubos distintos, respectivamente; (iii) determinação da quantidade de ligação em cada tubo de reação, baseado sobre a eletroquimioluminescência relativa (ECL) usando-se instrumentação ORIGEN; e (iv) cálculo do valor médio de afinidade do anticorpo de teste. O valor da afinidade média pode ser calculado a partir dos valores de EC50 e da concentração conhecida de anticorpo vestigial usando-se o método de Muller (J. Immunological Methods (1980) 34: 345) ou qualquer outro método apropriado. Deve ser observado que esse ensaio pode também ser usado para testar a afinidade de anticorpos ra-diomarcados ou qualquer anticorpo para o qual um antígeno não pode ser purificado e são requeridas células como uma fonte de antígeno. As células fixadas liofilizadas da presente invenção podem ser usadas como células alvo.

Quando o ensaio de ligação competitiva da presente invenção é realizado para testar a afinidade de anticorpos anti-CD20, o anticorpo de controle pode ser 2B8 ou qualquer outro anticorpo anti-CD20 não conjugado. O anticorpo de controle pode ser um anticorpo conjugado a quelante. O anticorpo de teste também pode ser um conjugado a quelante da anticorpo de controle. Alternativamente, o anticorpo de teste pode ser outro anticorpo an-ti-CD20 cuja afinidade de ligação ao CD20, quando comparada ao 2B8, é de interesse. Contudo, o ensaio pode ser adaptado para uso com anticorpos tendo outras especificidades, na medida em que uma célula alvo apropriada esteja disponível.

No ensaio de ligação competitiva da presente invenção, as células alvo preferidas são células CD20-positivas, mais preferivelmente células SB (ATCC # CCL 120) e são, mais preferivelmente, células SB liofilizadas ressuspensas preparadas de acordo com o método da presente invenção. Células liofilizadas usando-se outros métodos ou células fixadas também podem ser usadas. O anticorpo marcado com rutênio é, tipicamente, preparado através de um processo compreendendo a incubação do anticorpo de controle com quelante de tri-bipiridina N-hidróxi-succinimida éster de rutênio (II) (TAG-NHS), embora outro método conhecido de marcação de anticorpos também sejam considerados. Para marcação, o anticorpo de controle e o TAG-NHS são, de preferência, incubados em uma proporção molar de cerca de 1:15.

Esses e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão mais claramente compreendidos por meio de referência às figuras, exemplos e descrição da invenção a seguir. 4. Breve Descrição dos Desenhos Figura 1. A imunorreatividade de 2B8 nativo foi comparada a anticorpos anti-CD20 comercialmente disponíveis B1 (Coulter) e Leu 16 (Becton Dickinson) através de competição direta em um radio-imunoensaio usando-se B1 125l-marcado. Células SB antígeno-positivas (100.000) foram adicionadas a cada cavidade de lâminas com filtro V&P; 10 ng de B1 radio-marcado foram misturados com várias concentrações de competição não marcada e a mistura adicionada às células. Os anticorpos foram incubados com as células durante uma hora em temperatura ambiente; as determinações foram realizadas três vezes. Subsequentemente, as cavidades foram lavadas, secas e a radioatividade associada ao filtro determinada. Os dados mostrados são corrigidos com relação à radioatividade subjacente e são a média de três determinações.

Figura 2. Quantidades crescentes de 2B8 não conjugado foram analisadas com relação à ligação a células B humanas (SB) usando-se análise por FACS. As comparações foram feitas com um anticorpo monoclonal anti-CD20 comercialmente disponível (B1) e com dois anticorpos de isótipo irrelevante. IgG-FITC F(ab)'2 anticamundongo de cabra foi usado como o reagente secundário. Os resultados mostram que ο 2B8 é especifico para o antígeno CD20 e que exibe maior ligação do que o B1.

Figura 3. Células B humanas (SB) foram incubadas com quantidades crescentes de 2B8 125l-marcado. Amostras em triplo foram incubadas durante uma hora e a radioatividade ligada às células foi determinada após filtração a fim de coletar as células. Análise de Scatchard permitiu o cálculo de uma constante evidente de afinidade de 4,3 X10'9 M.

Figura 4. Imunorreatividade de 2B8 nativo, 2B8-MX-DTPA e B1. O anticorpo B1 foi radiomarcado conforme descrito na seção Métodos. Dez nanogramas de B1 radiomarcado foram misturados com concentrações crescentes do competidor e a mistura adicionada às cavidades de iâminas com fiítro V&P contendo 100.000 células SB antígeno-positivas cada uma; todas as determinações foram realizadas três vezes. Em seguida a uma incubação de uma hora em temperatura ambiente, as células foram extensivamente lavadas. Subseqüentemente, os filtros foram secos e a radioatividade associada determinada através de contagem gama; todos os valores são corrigidos com relação à base. Os valores mostrados são a média de três determinações.

Figura 5. Anticorpo 2B8 foi formulado em uma concentração final de 10 mg/mL em solução salina normal ou solução salina normal contendo glicina-HCI a 10 mM, pH de 6,8. Grupos duplos de amostras foram, então, colocados em frascos com tampa de rosca, os frascos purgados com nitrogênio e, então, tampados. As amostras foram, então, incubadas a 4 °C ou 30 °C durante 12 semanas; a imunorreatividade das amostras foi avaliada semanalmente. Nenhuma perda de imunorreatividade foi observada com qualquer uma das amostras de 2B8 no decorrer do estudo de 12 semanas. As imunorreatividades na semana 1 (Fig. 5A), semana 6 (Fig. 5B) e semana 12 (Fig. 5C) são representadas.

Figura 6. Ensaio de ligação para determinação de 2B8-MX-DTPA marcado com 111ln incubado em PBS, pH de 7,4 contendo 50 mg/mL de albumina de soro humano (incubação de 48 horas) (Figura 6A). Uma quantidade constante de anticorpo radiomarcado (5 ng/mL) foi incubada com volumes crescentes de células SB (20 x 10® células/mL). A quantidade de radioatividade (cpm) ligada às células foi plotada contra o volume de suspensão de células adicionado (Figura 6B). A radioatividade total aplicada sobre a radioatividade ligada (AT/B) foi plotada. Extrapolação linear permitiu o cálculo da interseção-y (0,997). A recíproca da interseção-y X 100 proporcionou um valor de imunorreatividade de 100% em um excesso infinito de antígeno.

Figura 7. Auíorradiogramas obtidos a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. Nos tempos indicados, as amostras foram submetidas à eletroforese sobre géis de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução, condições de desnaturação (SDS). As amostras foram carregadas a 5 μί (colunas 1, 2), 10 μΙ_ (colunas 5, 6). Os géis foram expostos a um película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e fotografados.

Figura 8. Exploração densitométrica do autorradiograma de tempo zero obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 μί e 20 μΐ em cavidades duplas. O gel foi exposto a um película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomarcado (#2) era de 96,2%.

Figura 9. Exploração densitométrica do autorradiograma de 48 horas obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y~ marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μί, 10 μί e 20 μί em cavidades duplas. O gel foi exposto a um película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomarcado (#2) era de 95,5%.

Figura 10. Autorradiogramas obtidos a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 50 mg/mL de albumina de soro humano. Nos tempos indicados, as amostras foram submetidas à eletroforese sobre géis de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μί (colunas 1, 2), 10 μί (colunas 3, 4) e 20 μΐ (colunas 5, 6). Os géis foram expostos a um película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e fotografados. (Nota: o autorradiograma de 48 horas foi obtido usando-se seleções de intensificação resultando em um sinal mais intenso, comparado ao autorradiograma de tempo zero).

Figura 11. Exploração densitométrica do autorradiograma de tempo zero obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 50 mg/mL de albu-mina de soro humano e DTPA a 1 mM. A amostra foi submetida à eletrofore-se sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μι, 10 pL e 20 μι em cavidades duplas. O gel foi exposto a um película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomarcado (#3) era de 95,9%.

Figura 12. Exploração densitométrica do autorradiograma de 48 horas obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 111 In-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 50 mg/mL de albu-mina de soro humano. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 pL em cavidades duplas, O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomarcado era de 97,0% (áreas combinadas de picos #2, 3 e 4).

Figura 13. Autorradiogramas obtidos a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 37 °C em soro humano. Nos tempos indicados, as amostras foram submetidas à eletroforese sobre géis de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 pL (colunas 1, 2), 10 pL (colunas 3, 4) e 20 pL (colunas 5, 6). Os géis foram expostos a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e fotografados.

Figura 14. Exploração densitométrica do autorradiograma de tempo zero obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 37°C em soro humano. A amostra foi submetida à ele-troforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 μΙ_ em cavidades duplas. O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomar-cado (#2) era de 97,9%.

Figura 15. Exploração densitométrica do autorradiograma de 98 horas obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 37°C em soro humano. A amostra foi submetida à ele-troforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μΙ_, 10 pL e 20 pL em cavidades duplas. O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomar-cado (#2) era de 94,7%.

Figura 16. Autorradiogramas obtidos a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado incubado a 37 °C em soro humano. Nos tempos indicados, as amostras foram submetidas à eletroforese sobre géis de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μΙ_ (colunas 1, 2), 10 μΙ_ (colunas 3, 4) e 20 pL (colunas 5, 6). Os géis foram expostos a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e fotografados.

Figura 17. Exploração densitométrica do autorradiograma de tempo zero obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado incubado a 37 °C em soro humano. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 pL em cavidades duplas. O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 16-20 horas em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomar- cado (#3) era de 95,3%.

Figura 18. Exploração densitométrica do autorradiograma de 96 horas obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 111 In-marcado incubado a 37 °C em humano. A amostra foi submetida à eletrofo-rese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μΙ_, 10 μί e 20 μΐ em cavidades duplas. O gel foi exposto a um película de raios X durante aproximadamente 16-20 horas em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada u-sando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomar-cado (#3) era de 94,0%, Figura 19. Macacos Cynomolgus foram injetados intravenosa-mente a cada 48 horas durante um total de sete injeções; as quantidades administradas são mostradas. Os níveis de células B em circulação foram determinados através de análise por FACS usando-se anti-CD2 (células T), anti-Mo-lgG (2B8), anti-CD20 (Leu 16) e anti-lgG-humano (células B). Nenhum efeito foi observado sobre os níveis de células T em circulação. (Aos animais do Grupo V foi fornecida uma única dose).

Figura 20. A recuperação dos níveis de células B em circulação em animais que receberam 2B8 foi acompanhada através de análise por FACS usando-se os anticorpos fluorescentemente marcados descritos na breve descrição da Fig. 19. Os animais dos Grupos III e IV não foram monitorados, uma vez que eles foram sacrificados no dia 13.

Figura 21. Macacos Cynomolgus foram injetados intravenosa-mente com 89Y-2B8-MX-DTPA o qual tinha sido preparado usando-se 2B8-MX-DTPA de grau clínico. Os animais foram dosados a cada 48 horas com as quantidades mostradas acima durante um total de sete doses. Nos dias 0, 2, 7,10 e 14, o sangue dos macacos foi coletado e avaliado com relação à química hematológica do soro e os níveis de células B em circulação (os soros do dia 10 não foram analisados com relação ao teor de células B). Embora a contagem total de linfócitos fosse diminuída em todos os animais, exceto nos indivíduos do grupo II, nenhuma anormalidade significativa foi observada durante o curso do estudo.

Figura 22. A eliminação de anticorpo anti-CD20 2B8 de murino de macacos Cynomolgus foi determinada por ELISA em seguida a uma única injeção de 10 mg/kg no dia zero. Conforme mostrado no painel A, o anticorpo exibiu um valor de β t1/2 de aproximadamente 4,5 dias. A eliminação do anticorpo 2B8 e seu conjugado MX-DTPA da circulação de camundongos BALC/c é mostrada no painel B. Os camundongos foram injetados intrave-nosamente com 25 pg de 2B8 nativo ou conjugado e amostras de sangue tomadas em vários tempos até 264 horas em seguida à injeção; os soros foram subsequentemente analisados através de imunoensaio enzimático usando-se células SB como o agente de captura. Ambos os anticorpos nativo e conjugado exibiram valores de eliminação de 8,75 dias.

Figura 23. Vinte camundongos BALB/c foram injetados, cada um, com 1,1 pCi de conjugado radiomarcado (100 pL) formulado em PBS, pH de 7,4, contendo 50 mg/mL de HSA. Grupos de cinco camundongos cada um foram sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e, então, o sangue e vários tecidos preparados e analisados com relação à radioatividade associada.

Figura 24. Vinte camundongos BALB/c foram injetados, cada um, com aproximadamente 1,0 pCi (em 100 pL) de conjugado radiomarcado formulado em 1 X PBS, pH de 7,4, contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e 1 m de MDPA. Grupos de cinco camundongos cada um foram sacrificados a 1, 24,48 e 72 horas e seu sangue e vários tecidos preparados e analisados com relação à radioatividade associada.

Figura 25. Camundongos atímicos trazendo tumores de células B de Ramos foram injetados intravenosamente com 24 pCi de 111ln-2B8-MX-DTPA e grupos de três camundongos cada um foram sacrificados a 0, 24,48 e 72 horas. Em seguida ao preparo de tecido e determinação da radioatividade associada, os valores de dose percentual injetada por grama de tecido foram determinados e plotados conforme mostrado.

Figura 26. Ensaio de ligação para determinação da imunorreati-vidade de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado "misturado & desenvolvido" incubado em PBS, pH de 7,4, contendo 50-75 mg/mL de albumina de soro humano (48 horas de incubação). Painel A) Uma quantidade constante de anticorpo 90Y-marcado (aproximadamente 1 ng/ml) foi incubada com quantidades crescentes de células SB. A quantidade de radioatividade (cpm) ligada às células foi plotada contra a concentração de células. Painel B) A radioatividade 90Y total aplicada sobre a radioatividade ligada (AT/B) foi plotada. Extrapolação linear permitiu o cálculo da interseção-y (1,139). O recíproco da interseção-y X 100 proporcionou um valor de imunorreatividade de 87,9% em um excesso infinito de antígeno. Nenhuma ligação foi observada com células CD20-negativas (HSB).

Figura 27. Autorradiogramas obtidos a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. Nos tempos indicados, as amostras foram submetidas à eletroforese sobre géis de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução, condições de desnaturação (SDS). As amostras foram carregadas a 5 pL (colunas 1, 2), 10 pL (colunas 5, 6). Os géis foram expostos a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e fotografados.

Figura 28. Exploração densitométrica do autorradiograma de tempo zero obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 pL, 10 pL e 20 pL em cavidades duplas. O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada u-sando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomar-cado (#2) era de 96,1%.

Figura 29. Exploração densitométrica do autorradiograma de 48 horas obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 4 °C em PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redu- ção. As amostras foram carregadas a 5 μ!_, 10 μι. e 20 μί. em cavidades duplas. O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada u-sando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomar-cado (#2) era de 94,1%.

Figura 30. Autorradiogramas obtidos a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado incubado a 37 °C em soro humano. Nos tempos indicados, as amostras foram submetidas à eletroforese sobre géis de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução, condições de desnaturação (SDS). As amostras foram carregadas a 5 μΙ_ (colunas 1, 2), 10 μΙ_ (colunas 3, 4) e 20 μΙ (colunas 5, 6). Os géis foram expostos a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e fotografados.

Figura 31. Exploração densitométrica do autorradiograma de tempo zero obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado "misturado & desenvolvido" incubado a 37°C em soro humano. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um gel de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μί_, 10 pL e 20 μΙ_ em cavidades duplas. O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomarcado (#2) era de 89,1%.

Figura 32. Exploração densitométrica do autorradiograma de 72 horas obtido a partir de análise por SDS-PAGE de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado "misturado & desenvolvido" incubado a 37 °C em soro humano. A amostra foi submetida à eletroforese sobre um ge! de Tris-glicina a 4-20% usando-se condições de não redução. As amostras foram carregadas a 5 μ1_, 10 μ!_ e 20 μΙ_ em cavidades duplas. O gel foi exposto a uma película de raios X durante aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente e uma das colunas foi explorada usando-se um densitômetro. A área relativa do pico do conjugado radiomarcado (#2) era de 88,8%.

Figura 33. Vinte camundongos BALB/c foram, cada um, injeta- dos intravenosamente com 5 pCi de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado formulado em 1 X PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. Grupos de cinco camundongos foram, cada um, sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e seu sangue e vários tecidos preparados e analisados com relação à radioatividade associada.

Figura 34. Quantidades crescentes de anticorpo 2B8 CHO-derivado marcado foram incubadas com uma concentração fixa de células B CD20-positivas (SB) ou células CD20-negativas (HSB) recentemente coletadas. A ligação do anticorpo às células foi quantificada usando-se análise por FACS usando-se IgG-FITV F(ab)'2 anticamundongo de cabra, conforme descrito aqui. Foi feita uma comparação a um anticorpo com isótipo irrelevante (S004). Somente o anticorpo 2B8 CFIO-deríbado mostrou qualquer ligação apreciável às células SB CD20-positivas.

Figura 35. A imunorreatividade de 2B8 CFIO-derivado foi comparada ao anticorpo 2B8-49 original produzido em uma linha de células de hi-bridoma através de competição direta em um ensaio ORIGEN. Quantidades crescentes de anticorpo foram incubadas com uma concentração fixa de células B CD20-positivas (SB) e uma quantidade vestigial de CHO 2B8 marcado com rutênio. Após incubação durante três horas em temperatura ambiente, a ligação, expressa como eletroquimioluminescência relativa (ECL), foi determinada usando-se o instrumento ORIGEN, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os valores representam a média de determinações duplas. As constantes médias de afinidade para CFIO 2B8 e 2B8-49 foram calculadas como sendo 1,3 X 10"10 M e 2,5 X 10'1° M, respectivamente. Um anticorpo com isótipo irrelevante (S004) foi incluído por comparação.

Figura 36. A ligação de conjugados 2B8-MX-DTPA preparados a partir de 2B8 CHO-derivado foi comparada ao anticorpo não conjugado através de competição direta em um ensaio ORIGEN. Os conjugados foram preparados através de incubação do 2B8 com MX-DTPA durante 8,17 e 24 horas antes de remoção do quelato não reagido. Para avaliação da ligação, os anticorpos foram incubados com uma concentração fixa de células B CD20-positivas (SB) e uma quantidade vestigial de CFIO 2B8 marcado com rutênio.

Após incubação durante três horas em temperatura ambiente, a ligação, expressa como eletroquímioluminescência relativa (ECL), foi determinada u-sando-se o instrumento ORIGEN, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os valores representam a média de determinações duplas. Os conjugados exibiram ligação similar, comparado ao anticorpo 2B8 não conjugado.

Figura 37. A) Células SB foram lavadas e ressuspensas a 90 X 106 células/mL com tampão de diluição (1X PBS, pH de 7,4 contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino. Concentrações crescentes de células foram incubadas durante 3 horas com 7,5 ng/mL de ln2B8 preparado usando-se o lote 0165A de 2B8-MX-DTPA. B) Plotagem dupla inversa da concentração de células vs. a radioatividade ligada/radioatividade total (B/AT). A imu-norreatividade foi calculada como 1/interseção-y x 100. Os valores da imu-norreatividade e do coeficiente de correlação eram de 80,6% e 0,981, respectivamente.

Figura 38. A) Células SB foram lavadas e ressuspensas a 90 X 106 células/mL com tampão de diluição (1X PBS, pH de 7,4 contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino. Concentrações crescentes de células foram incubadas durante 3 horas com 2 ng/mL de Y2B8 preparado usando-se o lote # 0165A de 2B8-MX-DTPA. B) Plotagem dupla inversa da concentração de células vs. a radioatividade ligada/radioatividade total (B/AT). A imu-norreatividade foi calculada como 1/interseção-y x 100. Os valores da imu-norreatividade e do coeficiente de correlação eram de 72,2% e 0,999, respectivamente. 5. Descrição Detalhada da Invenção Definições A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por aqueles versados na técnica à qua! a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes à-queles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos. Para fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

Baixo teor de metal - se refere a reagentes tratados de modo a reduzir a contaminação por metais até um nível que não prejudica a radioin-corporação.

Antíqeno-positiva - significa expressa um antígeno que é reconhecido por um anticorpo em particular da invenção de uma forma tal que o anticorpo é capaz de ligação. % de radioincorporacão - se refere à quantidade de radiomarca-ção de uma reação de radiomarcação que é conjugado ao anticorpo com relação à quantidade total de radiomarcação inicialmente adicionada à reação. % de ligação - se refere à quantidade de anticorpo de uma a-mostra que se liga ao antígeno alvo, com ou sem especificidade. % de imunorreatividade ou especificidade de ligação - se refere àquela quantidade de uma amostra de anticorpo que se liga ao antígeno alvo com especificidade.

Anticorpo diagnóstico - se refere a um anticorpo conjugado a um radiomarcação tal como 111l, o qual efetua a formação de imagens diagnosticas de tumores e células antígeno positivas.

Anticorpo terapêutico - se refere a um anticorpo conjugado a um radiomarcação alfa ou beta emissor (tal como 90Y) que pode efetuar a morte de células quando ligado ao antígeno alvo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Desenvolvimento Pré-Clínico de anticorpo Anti-CD20 Monoclonal de Murino 2B8, 2B8-MX-DTPA Conjugado, 2B8-MX-DTPA 111ln-Marcado e 90Y-MX-DTPA HPLC-Purificado I. Materiais e métodos para o desenvolvimento do anticorpo monoclonal 2B8 anti-CD20 de murino, 2B8-MX-DTPA conjugado, 2B8-MX-DTPA marcado com In111 e 90Y-MX-DTPA purificado por HPLC A. Materiais 1, Células As linhas de células humanas SB e HSB foram obtidas da American Type Culture Collection e cultivadas em RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal. A linha de células SB CD20-positiva é uma linha de células linfoblastóides B derivada da membrana de um coágulo de sangue periférico de um paciente com leucemia linfoblástica (1). A linha de células antígeno-negativas HSB é uma linha de células linfoblastóides T desenvolvida de tumores induzidos em hamsters Syrian recém-nascidos (2). A linha de células de mieloma de murino SP2/0 foi similarmente mantida em RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal. 2. Anticorpos Os anticorpos anti-CD20 B1 e Leu 16 foram adquiridos da Coul-ter Immunology e Becton/Dickinson, respectivamente. Os anticorpos IgG anticamundongo de cabra 125l-marcado e IgG anti-humano de cabra foram obtidos da ICN. O IgG anticamundongo F(ab)'2 de cabra foi obtido da Cap-pel. 3. Reaqentes Os adjuvantes completo e incompleto de Freund foram adquiridos da Sigma Chemical Company. Polietileno glicol, concentrado de HAT e concentrado de HT foram todos obtidos da Boehringer Mannheim. Isotiocia-nato de fluoresceína (FITC) foi adquirido da Sigma Chemical Company. Cloreto de índio-[111] e cloreto de 90Y foram obtidos da Amersham ou NEN Du-pont. Cloreto de ítrio-[89] foi adquirido da Aldrich Chemical Company. Todos os outros reagentes foram obtidos de fontes padrões.

Os reagentes usados para os protocolos de conjugação e ra-diomarcação foram processados a fim de remover os ions de metal pesado contaminantes os quais poderíam competir com os radioisótopos durante a etapa de radiomarcação. Os reagentes foram, tipicamente, processados passando-se as soluções através de uma coluna de resina de troca de íons Chelex 100 (BioRad Industries) ou através de processamento em lote por meio da adição de Chelex 100 a uma solução preparada. Água contendo baixo teor de metais, Milli-Q-purificada ou Água para Irrigação (WFIr) foi u-sada para todos os preparados e diluições. As soluções isentas de metal eram fiítradas-estéreis e coletadas em recipientes plásticos estéreis. B. Métodos 1. Produção e Seleção de Sobrenadantes com Hibridoma 2B8 por RIA

Dez camundongos BALB/c foram imunizados com 20 milhões de células SB suspensas em PBS contendo adjuvante completo de Freund. As células foram injetadas s.c. e i.p. em locais múltiplos no animal. Após um período de pausa de 2 semanas, os camundongos foram injetados uma segunda vez com células SB emulsificadas em adjuvante incompleto de Freund. Reforços subsequentes de imunização foram realizados em um esquema semanal com células SB suspensas em PBS. Os camundongos foram imunizados durante um período de 6 semanas a 4 meses.

Dois animais foram sacrificados através de deslocamento cervi-cal e seus baços removidos para fusão com o mieloma de murino SP2/0. Os animais foram escolhidos baseado sobre a capacidade dos soros pós-imunes de inibir efetivamente a ligação de anticorpo anti-CD20 Coulter B1 radiomarcado às células SB humanas. Três dias antes de cada fusão, aos animais selecionados foi fornecida uma última injeção intravenosa (veia da cauda) de 20 milhões de células SB em PBS. Quando de sacrifício, os baços foram removidos sob condições assépticas e os esplenócitos fundidos com células SP2/0 em uma proporção de 5:1 (esplenócitos:SP2/0). As células fundidas foram lavadas em meio de cultura e distribuídas em lâminas com 96 cavidades contendo meio de seleção FIAT. Os hibridomas foram selecionados através de radioimunoensaio de inibição usando-se anticorpo Coulter B1 após 10-14 dias. A seleção de híbridos que secretam o anticorpo anti-CD20 foi realizada usando-se métodos estabelecidos de radioimunoensaio. Resumidamente, o anticorpo anti-CD20 Coulter B1 foi purificado através de croma-tografia por afinidade à Proteína A. Quinze microgramas de anticorpo purificado foram acoplados a 125l através de breve oxidação na presença de Gotí-culas de iodo (Pierce Chemical Co.), seguindo-se o procedimento do fabricante. O anticorpo radiomarcado foi dessalinizado sobre resina de amberlita e armazenado em tampão de diluição (PBs, pH de 7,4 contendo 0,2% de gelatina, 0,02% de azida de sódio e 1,0% de BSA). Dez nanogramas de an- ticorpo radiomarcado foram colocados em cada cavidade de uma lâmina de ensaio com filtro previamente bloqueada (tampão de bloqueio: tampão de diluição contendo 10% de FBS) junto com 50 pL de sobrenadante de hibri-doma das cavidades de teste e 100.000 células SB suspensas em 50 μΙ_ de tampão de diluição. A suspensão foi incubada durante uma hora em temperatura ambiente. As lâminas foram completamente lavadas com tampão de lavagem (PBS, pH de 7,4 contendo 0,2% de gelatina e 0,02% de azida de sódio) em um coletor à vácuo V&P Scientific e os fundos do filtro contendo as células SB presas foram transferidos para um contador gama. As cavidades contendo apenas meio HAT e anticorpo B1 marcado foram usadas como controles e cavidades idênticas contendo células SB foram usadas como controles positivos. Os controles de inibição continham B1 radiomarcado e várias quantidades de anticorpo B1 não marcado, oscilando de 2 pg a 2 ng. 2. Estudos de Citometria de Fluxo a. Linhas de Células Preliminarmente, estudos de citometria de fluxo foram realizados com os sobrenadantes das culturas do hibridoma 2B8. Cem microiitros de sobrenadante de hibridoma foram incubados com células SB durante uma hora em temperatura ambiente; um segundo anticorpo (IgG anticamundongo F(ab)'2 de cabra; Cappel) usado em uma diluição a 1/400, foi adicionado subseqüentemente e a incubação continuada durante 1 hora no escuro. As células foram lavadas 5 vezes. Os controles incluíam células apenas (nenhum anticorpo primário ou secundário) a partir dos quais a autofluorescên-cia foi determinada, células com anticorpo secundário apenas para determinar a ligação não específica e B1 isotiocianato de fluoresceína-conjugado comercialmente disponível (B1-FÍTC) para um controle populacional de CD20.

Para alguns experimentos, a fluoresceína foi acoplada a anticorpo 2B8 purificado através da reação de grupos amino com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Resumidamente, o anticorpo 2B8 (1,2 mg/mL) foi incubado em tampão de carbonato de sódio a 0,1 M, pH de 9,5, com 150-200 μ9 de FITC por mg de proteína. A solução foi incubada em temperatura ambien- te durante 2 horas e o conjugado 2B8-FITC resultante foi purificado sobre uma coluna Sephadex G-25. Outros reagentes usados nesses estudos tais como B1 e Leu 16 foram adquiridos como conjugados de fluoresceína diretamente da Coulter ou da Becton Dickinson.

As células a serem analisadas foram coletadas e lavadas três vezes com PBS contendo 0,2% de BSA e 0,1% de azida de sódio. A viabilidade foi determinada através de exclusão por azul de tripano com um requisito quanto à viabilidade de > 90%. As concentrações de células foram ajustadas para 3 milhões por ml com 50 pL adicionado por cavidade em lâminas com 96 cavidades com fundo em U. O anticorpo primário (50 pL) foi adicionado às cavidades apropriadas e a mistura incubada durante 30 minutos a 1 hora em temperatura ambiente; subsequentemente, as células foram lavadas 5 vezes com 200 pL/cavidade de PBS contendo 0,2% de BSA e 0,02% de azida de sódio. As células foram centrifugadas nas lâminas a 1300 RPM durante 1 minuto em uma centrífuga Sorvall e os sobrenadantes removidos através de ligeiras "pancadas" nas lâminas. O anticorpo secundário, se necessário, foi adicionado e incubado durante mais 30 minutos a 1 hora em temperatura ambiente no escuro; as cavidades foram, então, lavadas conforme acima. Finalmente, 200 pL de tampão de fixação (cloreto de sódio a 0,15 M contendo 1% de paraformaldeído, pH de 7,4) foram adicionados a cada amostra e as células tratadas transferidas para tubos de 12 x 75 para análise. b. Sangue Completo de Macacos Cvnomolqus Após remoção do plasma, as células foram lavadas duas vezes através de centrifugação e resuspensão em FIBSS. Soro bovino fetal (2 mL) foi adicionado e as células ressuspensas. Cem microlitros das células res-suspensas foram, então, distribuídos a cada 6 de tubos cônicos de 15 ml para centrífuga. Os anticorpos monoclonais fluorescentemeníe marcados foram adicionados, como segue: Tubo #1: Anti-CD2-FITC de murino (AMAC), 2,5 pg/mL, 5 pg;

Tubo #2: ÍGM-FITC anti-humano de cabra (Fisher), 2,5 pg/mL, 5 pg;

Tubo #3: IgG-RPE anticamundongo de cabra (Fisher), 2,5 pg/mL, 5 pg;

Tubo #4: IgM-FITC anti-humano de cabra + IgG-RPE anticamundongo de cabra (absorvido), 2,5 μ9/ηιΙ_, 5 pg;

Tubo #5: CD20-FITC anti-humano (anti-Leu 16, Becton Dickinson), 5 μ9;

Tubo #6: Células apenas (autofluorescência).

Os anticorpos marcados e as células foram centrifugados durante 2 minutos a 1500 rpm a fim de misturar as células e os anticorpos e todas as 6 amostras foram, então, colocadas sobre gelo e incubadas durante 30 minutos. Subsequentemente, os tubos foram removidos do gelo e tampão de lise (pré-aquecido para 37 9C) foi adicionado até um volume de 12 mL. As amostras foram, então, incubadas durante 15 minutos em temperatura ambiente, centrifugadas durante 5 minutos a 4 °C a 1500 rpm e os sobrenadan-tes removidos. Os péletes de células foram, então, lavados duas vezes em tampão de marcação (PBs contendo 1 % de BSA e 0,05% de azida de sódio).

Subseqüentemente, as células foram fixadas através da adição de 0,5 mL de tampão de fixação (cloreto de sódio a 0,15 M, pH de 7,4 contendo 1% de paraformaldeído) por tubo e analisadas em um instrumento Becton Dickinson FACscan usando-se autocompensação e pré-calibração com glóbulos de Calibrite. A fluorescência verde da fluoresceína foi medida no modo FL1 e a fluorescência vermelha da ficoereterina foi medida no modo FL2. Os dados são expressos na forma log. As populações de linfócitos viáveis foram inicialmente identificadas por dispersão luminosa em ângulo reto vs. Dianteiro em um bitmap de plotagem por pontos. A população total de linfócitos foi, então, isolada encadeando-se todos os outros eventos. As medições subsequentes da fluorescência refletiram apenas aqueles eventos específicos que ocorreram dentro da área encadeada.

Para estudos de toxicologia/farmacoíogia em alta dose, os níveis de linfóciío pré-estudo foram determinados para cada macaco Cynomolgus e usados como os valores de base. O percentual de células T e B e as proporções T:B foram calculados e usados como referências de depleção. A população de células B pré-estudo foi enumerada com os anticorpos Leu 16 e IgM anti-humano.

Após injeção de 2B8 nos macacos, quando o antígeno CD20 estava saturado com 2B8, o percentual de células B na população total foi aproximada usando-se IgM-FITC anti-humano de cabra, igG-RPE antica-mundongo e a população contendo esses dois marcadores duplamente corada. A população duplamente corada foi usada para quantificação até que todo ο 2B8 fosse eliminado do sangue periférico dos animais. O percentual de células T na população de linfócitos totais foi estimado usando-se anti-CD2-FITC. Os dados eram a média de três medições de 10.000 eventos feitos com cada amostra. As células de cada uma das amostras de sangue designadas foram subseqüentemente avaliadas, enumerando-se, em cada caso, as subpopulações de células T e B dentro da população de linfócitos totais. As proporções T:B também foram examinadas. A depleção de células B foi calculada como o percentual de redução de células b com relação aos níveis originais de células B para cada macaco. 3. Radioiodinação e Imunoprecipitagão de CD20 Um milhão de células SB foi dividido em duas partes iguais após iodinação da superfície com 125l e Gotículas de iodo (Pierce Chemical Co.). As células foram lavadas repetidamente através de centrifugação até que os níveis de radioatividade no sobrenadante retornassem ao de base. Cem mi-crograma de anticorpo 2B8 ou B1 (Coulter Immunology) foram adicionados a cada um das duas amostras de células B marcadas. Os anticorpos e as células SB foram incubados durante a noite e, então, lavados três vezes através de centrifugação até que todo o anticorpo não ligado fosse removido. Os péletes de células contendo 2B8 e B1 ligado foram, então, submetidos à lise e extraídos através da adição de 1% de detergente NP-40 em Tris-HCI a 0,1 M, pH de 8,0, seguido por incubação em temperatura ambiente durante 1 hora. O extrato foi centrifugado em uma microcentrífuga em alta velocidade durante 30 minutos e os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos. Proteína A-Sepharose (300 μΙ_) foi adicionada a cada tubo e a resina peleti-zada através de centrifugação. A proteína A-Sepharose foi, então, lavada 20 vezes a fim de remover a proteína iodinada não especificamente ligada. Quando a proporção de radioatividade no glóbulo-para-sobrenadante atingiu um valor de 100, o pélete foi extraído com tampão de amostra para SDS PAGE e aquecido até a ebulição. Após esfriar, aproximadamente 15.000 cpm de cada um dos extratos foram adicionados às cavidades de um gel de poliacrilamida a 10%. Um padrão pré-corado de baixo peso molecular (Bio-Rad Inc.) foi adicionado a cada cavidade distinta e usado para estimativa do peso molecular. As proteínas foram removidas através de eletroforese e o gel foi seco e exposto a uma película de película de raios X durante 24 horas a -70 °C; subseqüentemente, a película foi desenvolvida e analisada. 4. Análise de Scatchard da Ligação de 2B8 2B8 purificado foi avaliado com relação à afinidade evidente a-través de análise de Scatchard. 2B8 radiomarcado foi preparado através da reação com 125l na presença de gotículas de iodo. Em seguida à remoção do iodo livre, o anticorpo radiomarcado foi incubado em várias concentrações, duas vezes, oscilando de 5000 ng por cavidade a 35 ng/cavidade com 10.000 células SB. A quantidade de ligação do anticorpo às células foi calculada a partir da atividade específica do 2B8 125l-marcado. A proporção de anticorpo ligado/livre foi plotada contra a concentração molar de anticorpo ligado e a constante de afinidade evidente foi determinada a partir da proporção das interseções dos eixos X e Y.

5. Preparação de 2B8-MX-DTPA

a. Fonte de MX-DTPA

Para alguns estudos pré-clínicos, ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminapentaacético carbono-14-marcado (MX-DTPA) foi proporcionado como um sólido seco pelo Dr. Otto Gansow no National ínstitute of Health e armazenado seco a 4 °C protegido da luz. Soluções de estoque do quelato foram preparadas em água Milli-Q e a concentração determinada através de avaliação da radioatividade e usando-se a atividade específica do composto. As soluções de estoque eram, geralmente, de 2-5 mM e foram armazenadas a -70 °C em tubos de polipropileno. Para outros estudos, MX-DTPA foi obtido da Coulter Immunology como o sal de di-sódio em água e armazenado a -70 °C. b. Manutenção de Condições Isentas de Metal Além do uso de reagentes isentos de metal, todas as manipulações de reagentes foram realizadas de modo a minimizar a possibilidade de contaminação por metal. Quando possível, recipientes plásticos de polipropi-leno tais como frascos, béqueres e cilindros graduados foram usados. Esses foram lavados com Alconox e exaustivamente enxaguados com água Milli-Q antes do uso. Além disso, pontas de pipetas isentas de metal (BioRad) foram usadas para manipulação precisa de pequenos volumes. Para manipulação de volumes maiores de reagentes, pipetas sorológicas plásticas estéreis (disponíveis nos tamanhos de 1 a 25 mL) foram usadas. As reações foram convenientemente realizadas em tubos de polipropileno com tampa de rosca para microcentrífuga (Sardstedt Industries; capacidade de 1,5 mL) ou tubos cônicos de polipropileno (Costar; 15 mL e 50 pL). Quando tubulação para diálise era manipulada, luvas cirúrgicas descartáveis, previamente enxaguadas com água Milli-Q, foram usadas. c. Preparação do Anticorpo O anticorpo anti-CD20 de murino 2B8 foi purificado inicialmente de ascites de cromatografia QAE e em Proteína A. Para experimentos posteriores, ο 2B8 foi purificado de sobrenadantes do biorreator de fibra oca u-sando-se o mesmo processo de purificação. O anticorpo derivado de fibra oca foi agora substituído, para fins comerciais, pelo anticorpo CHO-derivado descrito no Exemplo 2. O anticorpo foi preparado para conjugação através de transferência do mesmo para bicina-NaOH isento de metal a 50 mM, pH de 8,6 contendo NaCI a 150 mM, usando-se diálise ou troca de tampão repetitiva. Em alguns estudos, a troca de tampão foi realizada usando-se ultrafiltração repetitiva com filtros giratórios Centricon 30 (Amicon) (30.000D MWCO). Em geral, 50-200 pL de proteína (10 mg/mL) foram adicionados à unidade de filtro e 2 mL de tampão de bicina adicionados. O filtro foi centrifugado a 4 °C em um rotor Sorval SS-34 a 6.000 rpm durante 45 minutos. O volume de retentato era de aproximadamente 50-100 pL. Esse processo foi repetido duas vezes com o mesmo filtro. O retentato foi transferido para um tubo de polipropileno com tampa de rosca de 1,5 mL, analisado com relação à proíe- ína, diluído para 10,0 mg/mL e armazenado a 4 °C até ser usado para conjugação. Para alguns estudos, a proteína foi transferida para citrato de sódio a 50 mM, pH de 5,5 contendo NaCI a 150 mM e 0,05% de azida de sódio usando-se o mesmo protocolo descrito acima. d. Protocolo de Conjugação A conjugação do 2B8 com MX-DTPA foi realizada em tubos de polipropileno em temperatura ambiente. Soluções de estoque congeladas de MX-DTPA foram descongeladas imediatamente antes do uso. Tipicamente, 50-200 μΙ_ de anticorpo a 10 mg/mL foram reagidos com quelato em uma proporção molar de quelato-para-proteína de 4:1. As reações foram iniciadas através da adição da solução de estoque de quelato e suave mistura; a conjugação foi deixada processar durante a noite, geralmente durante 14 a 20 horas, em temperatura ambiente. O quelato não reagido foi removido do conjugado por meio de diálise ou ultrafiítração repetitiva, conforme descrito acima, em solução salina normal isenta de metal (0,9% p/v) contendo 0,05% de azida de sódio. A concentração de proteína foi ajustada para 10 mg/mL e armazenada a 4 °C em um tubo de polipropileno até ser radiomarcado. e. Determinação da Incorporação de Quelato A incorporação de quelato foi determinada através de contagem por cintilação e comparação do valor obtido para o conjugado purificado com a atividade específica do quelato carbono-[14]-marcado. Para estudos posteriores, nos quais quelato não radioativo obtido da Coulter Immunology foi usado, a incorporação de quelato foi analisado através de incubação do conjugado com um excesso de uma solução veículo radioativa de 90Y de concentração e atividade específica conhecidas.

Resumidamente, uma solução de estoque de cloreto de ítrio de concentração conhecida foi preparada em HCI a 0,05N isento de metal ao qual veículo isento de 90Y (sal de cloreto) foi adicionado. Uma alíquota dessa solução foi analisada através de contagem por cintilação de líquido a fim de determinar a atividade específica precisa para esse reagente. Um volume do reagente de cloreto de ítrio igual a 3 vezes o número de moles do quelato que se esperava que fosse preso ao anticorpo, tipicamente 2 moles/mol de anticorpo, foi adicionado a um tubo de polipropileno e o pH ajustado para 4,0-4,5 com acetato de sódio a 2M. O anticorpo conjugado foi subseqüente-mente adicionado e a mistura incubada 15-30 minutos em temperatura ambiente. A reação foi resfriada através da adição de EDTA a 20 mM até uma concentração final de 1 mM e o pH da solução ajustado para um pH de a-proximadamente 6 com acetato de sódio a 2M.

Após uma incubação de 5 minutos, o volume todo foi purificado através de cromatografia por exclusão de tamanho de alto desempenho, conforme descrito abaixo. As frações eluídas contendo proteína foram combinadas, a concentração de proteína determinada e uma alíquota analisada com relação à radioatividade. A incorporação de quelato foi calculada usan-do-se a atividade específica do preparado de cloreto de 90Y e a concentração de proteína.

f. Imunorreatividade do 2B8-MX-DTPA A imunorreatividade do 2B8 conjugado foi analisada usando-se ELISA para a célula toda. Células SB em fase mid-log foram coletadas da cultura através de centrifugação e lavadas duas vezes com 1X HBSS. As células foram diluídas para 1-2 X 106 células/mL em HBSS e transformadas em alíquotas em lâminas de microtitulação de poliestireno com 96 cavidades a 50.000-100.000 células/cavidade. As lâminas foram secas sob vácuo durante 2 horas a 40-45 °C a fim de fixar as células ao plástico. As lâminas foram armazenadas secas a -20 °C até serem usadas. Para o ensaio, as lâminas foram aquecidas para a temperatura ambiente imediatamente antes do uso, então, bloqueadas com 1X PBS, pH de 7,2-7,4 contendo 1% de BSA (2 horas). As amostras para o ensaio foram diluídas em 1CX PBS/1% de BSA, aplicadas às lâminas e serialmente diluídas (1:2) no mesmo tampão. Após incubação das lâminas durante 1 hora em temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas três vezes com 1X PBS. Anticorpo secundário (conjugado HRP lgG1-específico anticamundongo de cabra) (50 pL) foi adicionado às cavidades (diluição a 1:1500 em 1X PBS/1% de BSA) e incubado 1 hora em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas quatro vezes com 1X PBS, seguido pela adição de solução substrato ABTS (citrato de sódio a 50 mM, pH de 4,5 contendo 0,01% de ATBS e 0,001% de H202). As lâminas foram lidas a 405 nm após uma incubação de 15-30 minutos. Células hSB antíge-no-negativas foram incluídas nos ensaios para monitorar a ligação não específica. A imunorreatividade do conjugado foi calculada através de plota-gem dos valores de absorbância vs. o respectivo fator de diluição e comparando-se esses aos valores obtidos usando-se o anticorpo nativo (representando 100% de imunorreatividade) testado na mesma lâmina. Muitos valores sobre a porção linear do perfil de titulação foram comparados e um valor médio determinado.

q. Estabilidade in vitro do 2B8 nativo e 2B8-MX-DTPA

Para essa avaliação de 12 semanas sobre a estabilidade do anticorpo e do conjugado, alíquotas de anticorpo 2B8 e 2B8-MX-DTPA foram formuladas em solução salina normal ou solução salina normal contendo glicina-HCI a 10 mM, pH de 6,8. Grupos duplos de amostras foram incubados a 4o e 30 °C e as amostras analisadas semanalmente usando-se os seguintes métodos: SDS-PAGE (redução e não redução), imunorreatividade através do imunoensaio enzimático com células inteiras usando-se células SB (antígeno-positivas) ou HSB (aníígeno-negativas) como captura e eletro-forese em gel com foco isoelétrico (faixa de pH de 3-10). Além disso, a eficácia de radiomarcação do conjugado foi analisada nas semanas 4, 8 e 12 através de radiomarcação do conjugado com 90Y e analisando-se o produto por SDS-PAGE e análise autorradiográfica. Finalmente, em um estudo distinto, alíquotas de 2B8-MX-DTPA incubadas a 4o e 30 °C durante 10 semanas foram radiomarcadas com 111 In e avaliadas em um estudo de biodistribu-ição em camundongos BALB/c, conforme descrito abaixo. h. Estudos de Imuno-histoloqia Estudos de imunohistologia com os anticorpos nativo e conjugado (2B8-MX-DTPA) foram realizados pelo IMPATH Laboratories usando-se seções de tecidos humanos fixados com acetona. O anticorpo foi purificado a partir dos sobrenadantes do biorreator de fibra oca por meio de cromato-grafia sobre proteína A e Q Sepharose. O conjugado de grau clínico foi preparado usando-se MX-DTPA da Coulter Immunology de acordo com o proto- colo descrito acima. i. Imunorreatividade in vitro do 2B8-MX-DTPA Radiomarcado Para alguns experimentos, o protocolo ELISA para células inteiras usado para o 2B8-MX-DTPA não marcado foi usado. Nos experimentos posteriores, a imunorreatividade dos conjugados 111ln e 90Y-marcados (cada um preparado na IDEC Pharmaceuticals ou, alternativamente, no MPI Phar-macy Services, Inc.) foi determinada usando-se uma versão modificada do ensaio de ligação de células inteiras descrito por Lindmo (3). Resumidamente, concentrações crescentes de células SB antígeno-positivas ou células HSB antígeno-negativas em fase mid-log [20-30 X 106 células/mL em tampão de diluição (PBS, pH de 7,4 contendo 1% de BSA, 0,1% de gelatina e 0,02% de azida de sódio)] foram adicionadas a grupos duplos de tubos. O conjugado radiomarcado foi diluído para uma concentração final de anticorpo de 1-5 ng/mL com tampão de diluição de 0,35 mL foram adicionados a cada tubo. Em seguida a um período de incubação de 75-90 minutos em temperatura ambiente, as células foram peletizadas através de centrifugação e os sobrenadantes coletados. A radioatividade que permaneceu na fração do sobrenadante foi determinada com um contador gama ou de cintilação. Os dados foram plotados como o quociente da radioatividade total dividida pela radioatividade célula-associada, versus o inverso do numero de células por tubo. A interseção do eixo y representa, assim, a fração imunoreativa. j. Estabilidade in vitro do 2B8-MX-DTPA Radiomarcado no Soro Humano A estabilidade in vitro do 2B8-MX-DTPA 111ln- e 90Y-marcado foi analisada através de incubação em soro humano a 37 °C durante 96 horas. O anticorpo conjugado foi preparado e radiomarcado com 111ln (protocolo de "mistura e desenvolvimento") ou 90Y, conforme descrito acima. As atividades específicas dos conjugados 111 In e 90Y-marcados eram de 2,5 e 14,6 mCi/mg, respectivamente; os conjugados radiomarcados foram suspensos em tampão contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano (HSA) e DTPA a 1 mM (conjugado ítrio-marcado) ou tampão contendo 50 mg/mL de HSA (conjugado índio-marcado). Os conjugados radiomarcados foram diluídos a 1:10 com soro humano normal (não inativado pelo calor) e alíquotas assepti- camente colocadas em tubos estéreis tampados; esses tubos foram, então, incubados a 37 °C durante períodos de até 96 horas. Nos tempos selecionados, amostras dos conjugados foram removidas e analisadas através de SDS-PAGE de não redução em géis com um gradiente de 4-20%, seguido por autorradiografia e por cromatografia em camada fina. k. Estabilidade in vitro de 111ln-2B8-MX-DTPA Clinicamente Formulado O conjugado 2B8-MX-DTPA foi radiomarcado com 1l1ln e usado sem purificação por HPLC (protocolo de "mistura e desenvolvimento"). O anticorpo radiomarcado foi diluído em PBS e albumina de soro humano (HSA) adicionado até uma concentração final de 50 mg/ml. A atividade especifica do conjugado radiomarcado formulado era de 2,2 mCi/mg. O conjugado formulado foi subseqüentemente incubado a 4 °C durante 48 horas e alíquotas analisadas nos tempos 0, 24 horas e 48 horas usando-se SDS-PAGE de não redução em géis com um gradiente de 4-20%, seguido por autorradiografia e cromatografia em camada fina. A imunorreatividade em cada ponto de tempo foi analisada usando-se o ensaio de suspensão de células inteiras descrito na seção 1 acima. l. Estabilidade in vitro de 90Y-2B8-MX-DTPA Clinicamente Formulado O conjugado 2B8-MX-DTPA foi radiomarcado com 90Y e purificado através de cromatografia por exclusão de tamanho sobre HPLC usando-se IX PBS como um tampão de eluição. As frações do conjugado radiomarcado foram empoçadas e albumina de soro humano e DTPA foram adicionados até concentrações finais de 75 mg/mL e 1 mM, respectivamente. A atividade específica do conjugado radiomarcado formulado era de 14,6 mCi/mg, O conjugado formulado foi subseqüentemente incubado a 4 °C durante 48 horas e alíquotas analisadas nos tempos 0, 24 horas e 48 horas usando-se SDS-PAGE de não redução em géis com um gradiente de 4-20%, seguido por autorradiografia e cromatografia em camada fina. A imunorreatividade em cada ponto de tempo foi analisada usando-se o ensaio de suspensão de células inteiras descrito na seção 1 acima. 2. Estudos com Animais a. Estudo de Toxicoloqia/Farmacoloqia em Alta Dose em Primatas Usando- se 2B8 0 anticorpo 2B8 foi avaliado em um estudo de farmacologia em alta dose realizado sob as regulamentações da GLP no White Sands Research Center (Estudo Número 920111). Macacos Macaca fascicularis adultos (cynomolgus) foram usados; os grupos de estudo consistiam, cada um, de um macho e uma fêmea. O anticorpo foi injetado intravenosamente a cada 48 horas durante um total de sete injeções. O estudo consistiu de cinco grupos: Grupo l (solução salina); Grupo II (0,6 mg/kg); Grupo III (2,5 mg/kg); Grupo IV (10 mg/kg); e Grupo V (10 mg/kg no dia 0 apenas).

Antes do início do estudo, o sangue foi obtido de todos os 10 animais e usado para determinar as bases de reagente e as populações iniciais de células B. Todas as amostras subsequentes de sangue foram coletadas antes de cada injeção de anticorpo. Os Grupos III e IV foram sacrificados no dia 13 para necropsia e histopatologia completa. O sangue dos animais nos grupos I, II e V foi coletado nos dias 0, 1, 3, 7, 13, 21, 37 e 52; aproximadamente 5 mL de sangue completo foram extraídos em tubos heparinizados. O sangue completo foi mantido a 4 °C e analisado dentro de 24 horas. O sangue de cada animal foi centrifugado a 2000 rpm durante 5 minutos e o plasma sobrenadante foi removido para ensaio dos níveis de 2B8 no soro através de RIA (veja procedimento RIA para métodos específicos de ensaio). O material peletizado contendo PBLs e RBCs foi ressuspenso em FCS para análise por FACS.

b. Estudos de Farmacocinética com 2B8 e 2B8-MX-DTPA A meia vida beta média no soro do 2B8 em macacos cynomolgus foi determinada usando-se os animais do Grupo V (acima). lgG1 anti-camundongo de cabra (Fisher Scientific) foi diluído para 2,0 pg por ml em tampão de borato a 10 mM, pH de 9,6 e 50 pl_ foram adicionados a cada cavidade de uma lâmina com 96 cavidades. O anticorpo foi deixado se ligar à lâmina durante uma incubação durante a noite a 4 °C ou 2 horas em temperatura ambiente. Cada lâmina foi bloqueada durante 30 minutos em temperatura ambiente com 150 μΙ_ por cavidade de PBS contendo 1% de BSA. As lâminas foram lavadas com água destilada e amostras de soro ou plasma foram aplicada três vezes às cavidades individuais em uma diluição inicial a 1:100, seguido por diluições em série a 1:2. 2B8 purificado foi adicionado ao soro pré-coletado e diluído para uso como uma curva padrão começando com 0,5 mg/ml_; as amostras foram diluídas a 1:100 e, então, seríalmente diluídas conforme com as outras amostras. As lâminas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente e lavadas 4 vezes com água destilada. O reagente secundário (lgG1-HRPO anticamundongo de cabra) foi, então, adicionado em uma diluição a 1:4000 e incubado em temperatura ambiente durante mais 1 hora. As lâminas foram lavadas novamente em água destilada e 0,1 m!_ de substrato de peroxidase foi adicionado contendo peró-xido de hidrogênio. A cor foi deixada se desenvolver a partir da reação durante 20 minutos; a absorbância foi subseqüentemente determinada a 405 nm usando-se uma leitora ELISA para micro-lâmina. Os resultados foram plotados em pg de anticorpo por mL de soro.

Além disso, os valores β t1/2 do 2B8 e 2B8-MX-DTPA foram determinados em camundongos BALB/c. 2B8 não conjugado armazenado a -70 °C em 1X PBS, pH de 7,4/10% de glicerol foi descongelado, diluído para 0,5 mg/mL e filtrado estéril. O anticorpo conjugado foi preparado seguindo-se protocolos padrões mas com quelato carbono-[14]-marcado; a incorporação de quelato era de 1,5 mol/mol de anticorpo. O conjugado purificado foi diluído para 0,5 mg/mL em solução salina normal (0,9%), filtrado estéril e armazenado a 4 °C com o anticorpo nativo até ser usado.

Camundongos de seis a oito semanas de idade foram injetados com 100 pL de anticorpo 2B8 purificado em uma concentração de 250 pg/mL. O sangue dos camundongos foi subseqüentemente coletado através de punctura retro-orbital em vários tempos, oscilando de 0 a 264 horas e seus soros analisados com relação à presença do anticorpo 2B8 nativo e conjugado por meio de um imunoensaio enzimático com células inteiras u-sando-se a linha de células B antígeno-positivas SB como a captura. Os dados resultantes foram plotados como a concentração de 2B8 ou 2B8-MX-DTPA versus o tempo; a partir desses resultados, uma plotagem de regressão linear foi gerada e o declínio usado para determinar os valores de β t1/2. c. Estudo de Farmacoloqia/Toxicidade de Í891-Y-2B8-MX-DTPA em Macacos Cynomolgus 2B8-MX-DTPA trazendo ítrio-[89] foi preparado usando-se o protocolo descrito para inserção de 90Y, exceto que purificação por HPLC não foi usada, O conjugado trazendo metal não radioativo foi formulado em 1X PBS contendo 75 mg/ml_ de HSA e DTPA a 1 mM e avaliado em um estudo GLP número 920611 no White Sands Research Center. Um macaco macho e uma fêmea foram incluídos em cada um de quatro grupos. Os animais foram injetados intravenosamente a cada 48 horas durante um total de 7 injeções com as seguintes quantidades de droga: grupo 1 (solução salina); grupo II (0,003 mg/kg); grupo III (0,03 mg/kg); e grupo IV (0,3 mg/kg). Os animais foram avaliados durante o estudo através de determinação dos pesos corporais e temperatura, consumo de alimento e água, eliminação, químicas do soro, hematologia, urinálise e exames físicos. O sangue dos animais nos grupos I a IV foi coletado antes de infusão nos dias 0, 2, 7, 10 e 14 e o sangue analisado com relação aos níveis de células B em circulação através de análise por FACS. d. Biodistribuição do 2B8-MX-DTPA Radiomarcado Em um estudo preliminar, 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado foi avaliado com relação à biodistribuição tecidual em camundongos BALB/c de seis a oito semanas de idade. O conjugado radiomarcado foi preparado u-sando-se 2B8-MX-DTPA de grau clínico seguindo-se o protocolo de "mistura e desenvolvimento" descrito acima. A atividade específica do conjugado era de 2,3 mCi/mg e o conjugado foi formulado em PBS, pH de 7,4 contendo 50 mg/mL de HSA. Os camundongos foram injetados intravenosamente com 100 pL de 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado (aproximadamente 21 pCi) e grupos de três camundongos foram sacrificados através de deslocamento cervical a 0, 24, 48 e 72 horas. Após o sacrifício, a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo e fêmur foram removidos, lavados, pesados; uma amostra de sangue também foi removida para análise. A radioatividade associada com cada amostra foi determinada através de contagem gama e a dose injetada por paciente por grama de tecido subseqüentemente determinada. Ne- nhuma tentativa foi feita para deduzir a contribuição à atividade representada pelo sangue associado a órgãos individuais.

Em um protocolo distinto, alíquotas de 2B8-MX-DTPA incubado a 4o e 30 °C durante 10 semanas foram radiomarcadas com 111ln até uma atividade específica de 2,1 mCi/mg para ambos os preparados. Esses conjugados foram, então, usados em estudos sobre a biodistribuição em ca-mundongos, conforme descrito acima.

Para determinações da dosimetria, o 2B8-MX-DTPA foi radio-marcado com 111ln até uma atividade específica de 2,3 mCi/mg e aproximadamente 1,1 pCi foi injetado em cada um de 20 camundongos BALB/c. Subsequentemente, grupos de cinco camundongos cada um foram sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e seus órgãos removidos e preparados para análise. Além disso, porções da pele, músculo e osso foram removidas a processadas para análise; a urina e fezes também foram coletadas e analisadas com relação aos pontos de tempo de 24-72 horas.

Usando-se uma abordagem similar, 2B8-MX-DTPA também foi radiomarcado com 90Y e sua distribuição biológica avaliada em camundongos BALB/c durante um período de tempo de 72 horas. Em seguida à purificação através de cromatografia por exclusão de tamanho em HPLC, quatro grupos de cinco camundongos cada um foram injetados intravenosamente com aproximadamente 1 pCi de conjugado clinicamente formulado (atividade específica: 12,2 mCi/mg); os grupos foram subsequentemente sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e seus órgãos e tecidos analisados conforme descrito acima. A radioatividade associada com cada amostra de tecido foi determinada através de medição da energia de Bremsstrahlung com um contador de cíntilação gama. Os valores da atividade foram subseqüente-mente expressos como a dose percentual injetada por grama de tecido ou a dose percentual injetada por órgão. Embora os órgãos e outros tecidos tivessem sido enxaguados repetidamente a fim de remover o sangue superficial, os órgãos não foram borrifados. Assim, os valores de atividade nos órgãos não foram descontados com relação à contribuição para a atividade representada pelo sangue internamente associado. e. Localização de Tumor pelo 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado A localização do 2B8-MX-DTPA radiomarcado foi determinada em camundongos atímicos trazendo tumores de células B. Camundongos atímicos de seis a oito semanas de idade foram injetados subcutaneamente (flanco traseiro esquerdo) com 0,1 mL de RPMI-1640 contendo 1,2 X 107 células tumorígenas de Ramos as quais tinham sido previamente adaptadas para desenvolvimento em camundongos atímicos. Os tumores surgiram dentro de duas semanas e oscilavam, quanto ao peso, de 0,07 a 1,1 gramas. Os camundongos foram injetados intravenosamente com 100 pL de 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado (16,7 pCi) e grupos de três camundongos foram sacrificados através de deslocamento cervical a 0, 24, 48 e 72 horas. Após o sacrifício, a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo, fêmur e tumor foram removidos, lavados, pesados; uma amostra de sangue também foi removida para análise. A radioatividade associada com cada amostra foi determinada através de contagem gama e a dose percentual injetada por grama de tecido determinada. 3. Cálculos de Dosimetría Usando-se o dados de biodistribuição obtidos usando-se camundongos BALB/c injetados com 2B8-MX-DTPA 111!n ou 90Y-marcado (Tabelas 1-4 e 5-8), estimativas da dose de radiação absorvida a partir de uma dose de 1,0 mCi administrada a um paciente de 70 kg foram calculadas u-sando-se a abordagem formalizada pelo Medicai Internai Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine. As meias-vidas biológicas dos conjugados radiomarcados foram determinadas a partir dos valores de dose injetada por grama determinados dos dados de biodistribuição para cada radioimuneconjugado. Para alguns tecidos, por exemplo, sangue, admite-se que o declínio biológico do radioconjugado seguia um modelo em dois-compartimentos com um declínio exponencial a partir desses compartimentos. Para outros tecidos, por exemplo, o fígado, cujos níveis de atividade permaneciam aproximadamente constantes no decorrer do estudo de biodistribuição de 72 horas, admite-se que a meia-vida biológica era muito longa e foi atribuído um valor de 1000 horas.

Tabela 1 Ditribuição da Atividade a 1,0 Hora em Seguida à Injeção I.V. de 111In-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 5 Peso médio = 20,97 ± 2,46 gramas Tabela 2 Ditribuição da Atividade a 24 Horas em Seguida à injeção I.V. de 111ln-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 5 Peso médio = 21,03 ± 0,94 gramas Tabela 3 Ditribuição da Atividade a 48 Horas em Seguida à Injeção I.V. de 111ln-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 5 Peso médio = 20,65 ± 1,93 gramas Tabela 4 Ditribuição da Atividade a 72 Horas em Seguida à Injeção I.V. de 111ln-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 5 Peso médio = 21,46 ± 0,84 gramas Tabela 5 Ditribuição da Atividade a 1,0 Hora em Seguida à Injeção I.V. de 90Y-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios + DP

No. de camundongos = 5 Peso médio = 18,17 ± 0,81 gramas Tabela 6 Ditribuição da Atividade a 24 Horas em Seguida à Injeção I.V. de 9tY-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 3 Peso médio = 21,671+1,11 gramas Tabela 7 Ditribuição da Atividade a 48 Horas em Seguida à Injeção I.V. de 90Y-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 5 Peso médio - 19,07 ± 0,91 gramas Tabela 8 Ditribuição da Atividade a 72 Horas em Seguida à Injeção I.V. de 90Y-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 5 Peso médio = 19,21 ± 0,27 gramas De uma maneira similar, os outros valores de meia-vida biológica foram atribuídos ou calculados usando-se a equação padrão para cálculo de t1/2 com relação ao declínio exponencial. Uma vez que esses valores tivessem sido determinados, as variáveis para Tue, Tei, Te2, Ai, A2 e A, listadas nas Tabelas 9 e 10, foram determinados para cada conjugado radiomar-cado usando-se as equações proporcionadas em cima dessas tabelas (variáveis de saída). Esses valores, bem como aqueles mostrados nas tabelas subsequentes, foram calculados usando-se um programa escrito na folha de dados Symphony (Lotus Deveiopment Corp.) por Mr. Phillip Hagan, MS, Nuclear Medicine Service, VA Medicai Center, La Jolla, CA 92161.

Tabela 9 variAveís de entrada variáveis de saída AO = Dose Tue administrada = meia-vida eficaz de cap- Te1 = Meia-vida eficaz de desaparecimento do primeiro componente tação Tp = Meia-vida física do radionuclídeo Te2 = Meia-vida eficaz de desaparecimento do segundo componente Tu = Meia-vida biológica de captação A1 = Atividade acumulada do primeiro componente Tb1 = Meia-vida biológica de desaparecimento do pri- A2 = Atividade acumulada do segundo componente meiro componente Tb2 = Meia-vida biológica de desaparecimento do se- A = Atividade acumulada total gundo componente f1 = Fração de AO com meia-vida biológica de Tb1 Tue = Tu * Tp/(Tu + Tp) A1 - 1,44*f1*A0*Te1*(Tue/Tu) f2 = Fração de AO com meia-vida biológica de Tb2 Te1 = Tb1 * Tp/(Tb1 + Tp) A2 - 1,44*f2*A0*Te2 S = Dose média/atividade acumulada unitária Te2 = Tb2 * Tp/(Tb2 + Tp) A - A1 + A2 Exemplo: A1 PARA O FÍGADO - 1,44 * 11,000% * 1000 * 63,2 * 1,00 = atividade acumulada de 10007,5 microcuries TABELA DOS VALORES DE ENTRADA E SAÍDA USADOS PARA AVALIAR A ATIVIDADE ACUMULADA (A) Tu f1 f2 Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 Α1 A2 A <hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi-hr) (uCi-hr) Supra-Renais 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Conteúdos Da Bexiga 2.78E-04 1,000% 0,00% 4 0 2.78E-04 3,8 0,0 54,4 0,0 54 Conteúdos Do Estômago 2.78E-04 6,650% 0,00% 1,5 0 2.78E-04 1,5 0,0 140,5 0,0 141 Conteúdos Do Int. Delgado 2.78E-04 6,650% 0,00% 3,5 0 2/78E-04 3,3 0,0 318,6 0,0 319 Conteúdos ULI_ 2/78E-04 6,650% 0,00% 4,5 0 2.78Ε-Ό4 4,2 0,0 404,0 0,0 404 continuação Tu f1 fl Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 Α1 A2 A (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi-hr) (uCi-hr) Conteúdos LLI_ 2.78E-04 6,650% 0,00% 4,2 0 2,78E-04 4,0 0,0 378,6 0,0 379 Rins 2,78E-04 1,220% 0,00% 35 0 2.78E-04 23,0 0,0 404,8 0,0 405 Fígado 2,78E-Ü4 11,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 1 0007,5 0,0 1 0008 Pulmões 2,78E-04 2,100% 1,20% 30 1000 2.78Ε-Ό4 20,8 63,2 627,9 1091,7 1720 Outros Tecidos (Total) 2.78E-04 0,000% Músculo 2.78ΕΌ4 10,400% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 9461,7 0,0 9462 Adiposo 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Sangue 2.78E-04 58,400% 32,22% 15 1 000 2.78E-04 12,3 63,2 10319,2 29313,1 39632 Cérebro 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Coração 2.78E-04 0,510% 0,38% 57 1000 2.78E-04 30,9 63,2 226,9 345,7 573 Ovários 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Pâncreas 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Esqueleto (Total) 2.78Ε-Ό4 0,000% Osso Cortical 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Osso Trabecular 2/8E-04 9,100% 6,30% 45 1000 2,78E-04 27,0 63,2 3536,8 5731,6 9268 Medula (Vermelha) 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 continuação Tu f1 f2 Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 Α1 A2 A (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi-hr) (uCi-hr) Medula (Amarela) 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Cartilagem 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Outros Constituintes 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Pele 2.78E-04 11,770% 0,00% 1000 0 2.78E-04 63,2 0,0 10708,1 0,0 10708 Baço 2,78E-04 0,610% 0,40% 39 1000 2.78E-04 24,7 63,2 217,1 363,9 581 Testículos 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Tiróide 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 63,2 0,0 0,0 0,0 0 Corpo Total 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 2,78E-04 Tabela 10 VARíAVEIS DE ENTRADA variAveis DE SAÍDA AO = Dose administrada Tue = Meia-vida eficaz de captação Tp = Meia-vida física do radionuclídeo Te1 = Meia-vida eficaz de desaparecimento do primeiro componente Tu = Meia-vida biológica de captação Te2 = Meia-vida eficaz de desaparecimento do segundo componente Tb1 = Meia-vida bioiógica de desaparecimento do pri- A1 = Atividade acumulada do primeiro componente meiro componente Tb2 = Meia-vida biológica de desaparecimento do se- A2 = Atividade acumulada do segundo componente gundo componente f1 = Fração de AO com meia-vida biológica de Tb1 A = Atividade acumulada total f2 = Fração de AO com meia-vida biológica de Tb2 Tue = Tu * Tp/(Tu + Tp) A1 - 1,44*f1*A0*Te1*(Tue/Tu) S = Dose média/atividade acumulada unitária Te1 = Tb1 * Tp/(Tb1 + Tp) A2 - 1,44*f2*A0*Te2 Te2 = Tb2 * Tp/(Tb2 + Tp) A - A1 + A2 Exemplo: A1 PARA O FÍGADO -1,44 * 9,000% * 1000 * 60,2 * 1,00 = atividade acumulada de 7795,5 microcuries TABELA DOS VALORES DE ENTRADA E SAÍDA USADOS PARA AVALIAR A ATIVIDADE ACUMULADA (A) Tu f1 12 Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 Α1 A2 A (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi-hr) (uCi-hr) Supra-Renais 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Conteúdos Da Bexiga 2.78E-04 1,000% 0,00% 4 0 2.78E-04 3,8 0,0 54,2 0,0 54 Conteúdos Do Estômago 2,78E-04 4,220% 0,00% 1,5 0 2,78E-04 1,5 0,0 89,1 0,0 89 Conteúdos Do Int Delgado 2.78E-04 4,220% 0,00% 3,5 0 2,78E-04 3,3 0,0 201,7 0,0 202 Conteúdos ULI_ 2.78E-04 4,220% 0,00% 4,5 0 2.78Ε-Ό4 4,2 0,0 255,5 0,0 255 continuação Tu f1 f2 Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 Α1 A2 A (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi-hr) (uCi-hr) Conteúdos LLI_ 2,78ET>4 4,220% 0,00% 4,2 0 2.78E-04 3,9 0,0 239,5 0,0 240 Rins 2.78E-04 1,150% 0,87% 70 1000 2.78E-04 33,4 60,2 553,6 753,6 1307 Fígado 2.78E-04 9,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 7795,5 0,0 7795 Pulmões 2/8E-04 1,200% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 1039,4 0,0 1039 Outros Tecidos (Total) 2.78E-04 0,000% Músculo 2.78E-04 8,720% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 7552,9 0,0 7553 Adiposo 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Sangue 2.78Ε-04 49,770% 25,90% 13 1000 2,78E-04 10,8 60,2 7743,9 22433,7 30178 Cérebro 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Coração 2.78Ε-Ό4 0,500% 0,36% 51 1000 2,78E-04 28,4 60,2 204,4 311,8 516 Ovários 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Pâncreas 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Esqueleto (Total) 2.78E-04 0,000% Osso Cortical 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78Ε04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Osso Trabecular 2.78E-04 11,890% 9,28% 67 1000 2.78Ε-Ό4 32,7 60,2 5604,4 8038,0 13642 continuação Tu f1 f2 Tb1 Tb2 Tue Te1 Te2 Α1 A2 A (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (hr) (uCi-hr) (uCi-hr) (uCi-hr) Medula (Vermelha) 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Medula (Amarela) 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Cartilagem 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Outros Constituintes 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2,78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Peie 2.78E-04 15,600% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 13512,1 0,0 13512 Baço 2.78E-04 0,740% 0,56% 60 1000 2.78E-04 31,0 60,2 330,0 485,1 815 Testículos 2,78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Tiróide 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Corpo Total 2.78E-04 0,000% 0,00% 1000 0 2.78E-04 60,2 0,0 0,0 0,0 0 Usando-se os valores da Atividade Total Acumulada (A) das Tabelas 9 e 10 e os valores S proporcionados no folheto MIRD Número 11 (Tabelas 11 e 12 e 13 e 14), as estimativas da dose absorvida de radiação foram determinadas para cada um dos conjugados radiomarcados com relação aos tecidos listados (Tabelas 15,16, 17 e 18). Na determinação das estimativas da dose de radiação resumida com relação ao conjugado marcado com índio proporcionado na Tabela 19, a meia-dose de um determinado órgão foi somada com a dose absorvida produzida pela atividade nos órgãos ou tecidos adjacentes. Contudo, no cálculo dos valores de estimativa da dose de radiação atribuídos ao conjugado marcado com ítrio (Tabela 20), alguns dos valores estão ausentes com relação aos tecidos listados (por e-xemplo, supra-renais). Isso se deve à extensão de trajeto mais curto da partícula 13 liberada com relação à extensão de trajeto da partícula g emitida, conseqüentemente, proporcionando uma contribuição negligenciável para a atividade a partir dos tecidos adjacentes e à ausência de dados sobre a bio-distribuição primária no que se refere a esses tecidos.

Tabela 11 ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA POR ATIVIDADE ACUMULADA UNITÁRIA, (RAD/UCI-H) ÍNDIO-[111] MEIA-VIDA 67,44 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos da Trato gastrointestinal bexiga a - . Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos rgaos a vo____________________________________________estômago_____intestino delgado__do Uli_____do Lli SUPRA-RENAIS 7.4E-03 5.7E-07 7.3E-06 4.4E-06 2.8E-06 1.3E-06 PAREDE DA BEXIGA 3.6E-07 4.5E-04 7.5E-07 8,0E-06 6.4E-06 2,0E-05 OSSO 5.2E-06 2,3E-06 2.3E-06 3.2E-06 2,9E-06 4.2E-06 Gi {PAREDE DO ESTÔMAGO) 8.8E-06 8,5E-07 3.4E-04 1.1E-05 1.2E-05 5.4E-06 Gl (INTESTINO DELGADO) 2.5E-06 8.6E-06 7.9E-06 2.1E-04 5.4E-05 3.0E-05 Gl (PAREDE DO ULI) 2.8E-06 6,9E-06 1.1E-05 8,3E-05 3.3E-04 1,4E-05 Gl (PAREDE DO LU) 7.1E-07 2.2E-05 3.8E-06 2.4E-05 9.5E-06 4,7E-04 RINS 3,7E-05 8,5E-07 1.1E-05 9.2E-06 8.3E-06 2,8E-06 FÍGADO 1.5E-05 6.3E-07 5,9E-06 5.6E-06 7.8E-06 8.4E-07 PULMÕES_______________________7.6E-06______8.2E-Q8_______5,2E-06 7.5E-07_______8.3E-07 2,6E-07 Tabela 11 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo____________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS 3.4E-05 1.5E-05 7.6E-06 4,8E-06 PAREDE DA BEXIGA 9.3E-07 5.2E-07 1,5E-07 5,5E-06 OSSO 3,7E-06 2.9E-06 3.8E-06 3.2E-06 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) 1.0E-05 5.8E-06 5.7E-06 4,3E-06 Gl (INTESTINO DELGADO) 8,6E-06 5.0E-06 6.1E-07 4.8E-06 Gl (PAREDE DO ULI) 8,6E-06 7.5E-06 7.4E-07 5.0E-06 Gl (PAREDE DO LLI) 2.5E-06 7.3E-07 3.0E-07 5.2E-06 RINS 5.2E-04 1.2E-05 2.7E-06 4.4E-06 FÍGADO 1.2E-05 1.2E-04 7.7E-06 3.4E-06 PULMÕES_______________________2.5E-06_________7.8E-06___________1,4E-04_______________4,2E-06__________ Tabela 11 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos Trato gastrointestinal da bexiga ^ „ . Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos rgaos a vo ___________________________________estômago intestino delgado do Uli___________do Lli MEDULA (VERMELHA) 9.4E-06 5,3E-06 4.0E-06 1.1E-05 9.1E-06 1.3E-05 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 4.8E-06 5.5E-06 4.3E-06 4.8E-06 4,5E-06 5.2E-06 OVÁRIOS 1.8E-06 2.3E-05 1.3E-06 3.3E-05 3.7E-05 6,4E-05 PÂNCREAS 2.6E-05 8.6E-07 5.7E-05 6.1E-06 7,1E-06 2,1E-06 PELE 1.8E-06 1,7E-06 1,4E-06 1,4E-06 1.4E-06 1.6E-06 BAÇO 2.0E-05 7.6E-07 3.1E-05 4.6E-06 4.2E-06 2.4E-06 TESTÍCULOS 1.4E-07 1.4E-05 1.8E-07 1.0E-06 9t8E-07 5.9E-06 TIRÓIDE 4.7E-07 1.2E-08 3.5E-07 6.9E-08 7.5E-08 2.7E-08 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 5,8E-06 4.9E-05 2.4E-06 2.9E-05 1.5E-05 2.1E-05 CORPO TOTAL___________________6.6E-06 6.2E-06_______6.1E-06________7.3E-06_______6.8E-06 6.9E-06 Tabela 11 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo____________________________________________________________________________________ MEDULA (VERMELHA) 9.6E-06 4.1E-06 4,8E-06 5.3E-06 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 4.4E-06 3,4E-06 4.4E-06 7.5E-06 OVÁRIOS 3.6E-06 1.4E-06 3,6E-07 6.3E-06 PÂNCREAS 2.0E-05 1.2E-05 7.7E-06 5.7E-06 PELE 1.8E-06 1.6E-06 1.8E-06 2.5E-06 BAÇO 2.8E-05 2.8E-06 7.1E-06 4.6E-06 TESTÍCULOS 3.4E-07 2.5E-07 3.9E-08 3.6E-06 TIRÓÍDE 2.0E-07 6,2E-07 2,6E-06 4.3E-06 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 3.1E-06 1.2E-06 2,8E-07 7.4E-06 CORPO TOTAL___________________6.6E-06_________6.6E-06 5,9E-06 5.6E-06_________ REFERÊNCIA - FOLHETO MIRD N° 11 PAGINA 164 Tabela 12 ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA POR ATIVIDADE ACUMULADA UNITÁRIA, (RAD/UCl-H) ÍNDIO-[111] MEIA-VIDA 67,44 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto Órgãos alvo__________________________________________Medula vermelha_____Osso cortical___Osso trabecular SUPRA-RENAIS 1,1E-06 2.6E-05 7.9E-06 3.9E-06 3.9E-06 PAREDE DA BEXIGA 2.1E-05 4.7E-07 2,4E-06 1.5E-06 1.5E-06 OSSO 3.8E-06 3,6E-06 1.2E-05 3.0E-05 2.6E-05 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) 2,4E-06 5,9E-05 3.2E-06 1.7E-06 1.1E-06 Gl (INTESTINO DELGADO) 3.8E-05 5.5E-06 7.9E-06 2.3E-06 2.3E-06 Gl (PAREDE DO ULI) 3.7E-05 6,6E-06 6.4E-06 2.2E-06 2.2E-06 Gl (PAREDE DO LLI) 4.8E-05 1.7E-06 9.0E-06 3,2E-06 3.2E-06 RINS 2.9E-06 1.9E-05 6.8E-06 2.7E-06 2.7E-06 FÍGADO 1.7E-06 1.3E-05 2.9E.06 2.0E-06 2.0E-06 PULMÕES 2,2E-07______7.6E-06________3.7E-06___________3,0E-06__________3,0E-06 Tabeia 12 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo____________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS 2.4E-06 2.0E-05 1.4E-047 4,7E-07 7.0E-06 PAREDE DA BEXIGA 1.6E-06 4.7E-07 1.5E-05 1.2E-08 6.9E-06 OSSO 2,9E-06 2.9E-06 2.4E-06 2.6E-06 6,9E-06 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) 1,7E-06 3,0E-05 1.5E-07 1.5E-07 7.1E-06 Gl (INTESTINO DELGADO) 1.5E-06 4,2E-06 1.2E-06 4.2E-08 7,5E-06 Gl (PAREDE DO ULI) 1.4E-06 3.8E-06 1.1E-06 3.3E-08 7.0E-06 Gi (PAREDE DO LU) 1.5E-06 1.9E-06 8.3E-06 2.2E-08 6.7E-06 RINS 2.0E-06 2.8E-05 1.7E-07 1.2E-07 6.6E-06 FÍGADO 1.7E-06 3,0E-06 1.2E-07 3.5E-07 6.5E-06 PULMÕES_________________________1.9E-06________6,9E-06________3.4E-08________2.9E-06________5.9E-06 Tabela 12 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto ^ _ , Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular Urgaos alvo____________________________________________________________________________________________ MEDULA (VERMELHA) 1r3E-05 6.8E-06 7.5E-05 1.3E-05 2,6E-05 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 6.3E-06 5.7E-06 3.8E-06 3,2E-06 3.2E-06 OVÁRIOS 1.0E-02 1.0E-06 7.7E-06 2.2E-06 2.2E-06 PÂNCREAS 1.5E-06 1.6E-03 4.9E-06 3.1E-06 3.1E-06 PELE 1.4E-06 1.3E-06 2,0E-06 2.3E-06 2.3E-06 BAÇO 1.6E-06 6.2E-05 2r7E-06 2.0E-06 2.0E-06 TESTÍCULOS 0.0E+00 2.1E-07 1.0E-06 1,9E-0,6 1.9E-06 TIRÓIDE 2.5E-08 4.5E-07 2.2E-06 2.8E-06 2.8E-06 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 6.5E-05 1.9E-06 6,7E-06 1.8E-06 1.8E-06 CORPO TOTAL__________________7,7E-06_____7.5E-06________6,4E-06 5,9E-06_________ 5,9E-06 Tabela 12 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo__________________________________________________________________________________________ MEDULA (VERMELHA) 2.7E-06 4,4E-06 1,9E-06 2,9E-06 7,7E-06 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 2.5E-06 4.6E-06 3,6E-06 4,3E-06 5.6E-06 OVÁRIOS 1,4E-06 1.7E-06 O.OE+OO 2,5E-08 7,0E-06 PÂNCREAS 1.7E-06 6.1E-05 2,1E-07 3.0E-07 7,8E-06 PELE 3,7E-05 1.5E-06 4.9E-06 2.5E-06 3.7E-06 BAÇO 1.7E-06 9.1E-04 8.9E-08 3.5E-07 6.8E-06 TESTÍCULOS 3,4E-06 2.0E-07 3.6E-03 3.3E-09 4(9E-06 TIRÓIDE 2.4E-06 3.4E-07 3.3E-09 5.8E-03 5,2E-06 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 1.2E-06 1.2E-06 Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.4E-08 7,8E-06 CORPO TOTAL 3,8E-06________6.6E-06_______5.6E-06_________5.3E-06_______5,8E-06 REFERÊNCIA - FOLHETO MIRD N° 11 PÁGINA 165 Tabela 13 ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA POR ATIVIDADE ACUMULADA UNITÁRIA, (RAD/UCI-H) ÍTRIO-[90] MEIA-VIDA 64 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos Trato gastrointestinal da bexiga óraãos alvo Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos y____________________________________________________estômago intestino delgado do Uli________do Lli SUPRA-RENAIS 1,4E-01 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 PAREDE DA BEXIGA 0,0 5.0E-03 0,0 0,0 0,0 0,0 OSSO 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) 0,0 0,0 4.0E-03 0,0 0,0 0,0 Gl (INTESTINO DELGADO) 0,0 0,0 0,0 2,5E-03 0,0 0,0 Gl (PAREDE DO ULI) 0,0 0,0 0,0 0,0 4.5E-03 0,0 Gl (PAREDE DO LLI) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 7.4E-03 RINS 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 FÍGADO 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 PULMÕES________________________0,0__________0,0 0J)____________0J)__________0,0_________0,0 Tabela 13 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS 0,0 0,0 0,0 0,0 PAREDE DA BEXIGA 0,0 0,0 0,0 0,0 OSSO 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (INTESTINO DELGADO) 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (PAREDE DO ULI) 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (PAREDE DO LLI) 0,0 0,0 0,0 0,0 RINS 6,4E-03 0,0 0,0 0,0 FÍGADO 0,0 1,1E-03 0,0 0,0 PULMÕES_________________________0JD____________OO____________ 2.0E-03_________________O0___________ Tabela 13 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos Trato gastrointestinal da bexiga ^ - , Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos rga s avo____________________________________________estômago intestino delgado do Uli_________do Lli MEDULA (VERMELHA) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 OVÁRIOS 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 PÂNCREAS 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 PELE 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 BAÇO 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 TESTÍCULOS 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 TIRÓIDE 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 CORPO TOTAL _________________2,8E-05 3.2E-06_______8.5E-05________2,3E-05_______1,4E-05 1.7E-Q5 Tabela 13 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo_______________________________________________________________________________ MEDULA (VERMELHA) 0,0 0,0 0,0 0,0 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 0,0 0,0 0,0 7.1E-05 OVÁRIOS 0,0 0,0 0,0 0,0 PÂNCREAS 0,0 0,0 0,0 0,0 PELE 0,0 0,0 0,0 0,0 BAÇO 0,0 0,0 0,0 0,0 TESTÍCULOS 0,0 0,0 0,0 0,0 TIRÓIDE 0,0 0,0 0,0 0,0 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 0,0 0,0 0,0 0,0 CORPO TOTAL ______________ 2,8E-05___________2.8E-05__________2,8E-05______________2.8E-05________ REFERÊNCIA - FOLHETO MIRD N2 11 PÁGINA 144 Tabela 14 ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA POR ATIVIDADE ACUMULADA UNITÁRIA, (RAD/UCI-H) ÍTRIO-[90] MEIA-VIDA 6,4 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto Λ „ . Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular Orgaos alvo_________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAÍS 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 PAREDE DA BEXIGA 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 OSSO 0,0 0,0 1.1E-04 4,0E-04 2.3E-04 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (INTESTINO DELGADO) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (PAREDE DO ULi) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Gl (PAREDE DO LLI) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 RINS 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 FÍGADO 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 PULMÕES_______________________ÇL0_________0,0 O0______________0,0______________0,0 Tabela 14 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo___________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 PAREDE DA BEXIGA 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 OSSO 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8E-05 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 Gl (INTESTINO DELGADO) 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8E-05 Gl (PAREDE DO ULI) 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 Gl (PAREDE DO LLI) 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 RINS 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 FÍGADO 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8E-05 PULMÕES ____________0,0_____________0,0____________0,0 O0_________2.8E-05 Tabela 14 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto Órgãos alvo_______________________________________Medula vermelha_____Osso cortical__Osso trabecular MEDULA (VERMELHA) 0,0 0,0 8.6E-04 3,3E-05 5,7E-04 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 OVÁRIOS 1.8E-01 0,0 0,0 0,0 0,0 PÂNCREAS 0,0 2,0E-02 0,0 0,0 0,0 PELE 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 BAÇO 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 TESTÍCULOS 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 TIRÓIDE 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 CORPO TOTAL_________________2,8E-05 2.8E-05________2.8E-05__________2.8E-05_________2,8E-05 Tabela 14 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo__________________________________________________________________________________________ MEDULA (VERMELHA) 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 OUTROS TECIDOS (MÚSCULO) 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8E-05 OVÁRIOS 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 PÂNCREAS 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8E-05 PELE 7,6E-04 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 BAÇO 0,0 1,1E-02 0,0 0,0 2.8E-05 TESTÍCULOS 0,0 0,0 5.7E-02 0,0 2.8E-05 TIRÓIDE 0,0 0,0 0,0 9.9E-02 2.8E-05 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 0,0 0,0 0,0 0,0 2.8E-05 CORPO TOTAL 2,8E-05________2,8E-05________2.8E-05________2.8E-05_______2.8E-05 REFERÊNCIA - FOLHETO MIRD N2 11 PÁGINA 145 Tabela 15 ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA POR ATIVIDADE ACUMULADA UNITÁRIA, (RAD=A*S) ÍNDIO-E111] MEIA-VIDA 67,44 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos da Trato gastrointestinal bexiga a _ , Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos rgaos a vo________________________________ estômago intestino delgado do Uli___________________do Lli SUPRA-RENAIS Ο,ΟΕ+Ο,Ο 3,1E-05 1.0E-03 1,4E-03 1.1E-03 4.9E-04 PAREDE DA BEXIGA 0,0E+00 2.4E-02 1.1E-04 2.SE-03 2.6E-03 7.6E-03 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) Ο,ΟΕ+ΟΟ 4,6E-05 4,8E-02 3.5E-03 2.2E-02 2.0E-03 Gl (INTESTINO DELGADO) 0.0E+00 4.7E-04 1.1E-03 6.7E-03 2.2E-02 1.1E-02 Gl (PAREDE DO ULI) Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.8E-04 1,5E-03 2.6E-02 1.3E-01 5.3E-03 Gl (PAREDE DO LLI) O.OE+OO 1.2E-03 5.3E-04 7.6E-03 3.8E-03 1.8E-01 RINS Ο,ΟΕ+ΟΟ 4.6E-05 1.5E-03 2.9E-03 3.4E-03 1.1E-03 FÍGADO Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.4E-05 8.3E-04 1.8E-03 3.2E-03 3.2E-04 PULMÕES______________________Ο,ΟΕ+ΟΟ______4.5E-06______7.3E-04________2.4E-04________3.4E-04 9.8E-05 Tabela 15 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo___________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS 1,4E-02 1.5E-01 1.3E-02 2.4E-01 PAREDE DA BEXIGA 3.8E-04 5.2E-03 2.6E-04 2.7E-01 Gl (PAREDE DO EST0MAGO) 4.0E-03 5.8E-02 9.8E-03 2,1 E-01 Gí (INTESTINO DELGADO) 3.5E-03 5,0E-02 1,0E-03 2.4E-01 Gl (PAREDE DO ULI) 3.5E-03 7,5E-02 1.3E-03 2.5E-01 Gl (PAREDE DO LLI) 1.0E-03 7.3E-03 5.2E-04 2r6E-01 RINS 2,1 E-01 1.2E-01 4,6E-03 2.2E-01 FÍGADO 4.9E-03 1.3E+00 1.3E-02 1.7E-01 PULMÕES_______________________1.0E-03_________7,8E-02 2.4E-01 2,1 E-01________ Tabela 15 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos da Trato gastrointestinal bexiga λ „ . Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos rgaos a vo________________________________________estômago intestino delgado do Utí_______do Lli OUTROS TECIDOS MÚSCULO Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0E-04 6.0E-04 1.5E-03 1.8E-03 2.0E-03 ADIPOSO 0,0E+00 3.0E-04 6.0E-04 1.5E-03 1.8E-03 2.0E-03 SANGUE 0,0E+00 3.0E-04 6,0E-04 1.5E-03 1.8E-03 2.0E-03 CÉREBRO Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,0E-04 6,0E-04 1.5E-03 1.8E-03 2.0E-03 CORAÇÃO Ο,ΟΕ+ΟΟ 4.1E-05 4.4E-03 1.5E-03 1.7E-03 9.1E-04 OVÁRIOS Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.3E-03 1.8E-04 1.1E-02 1.5E-02 1.4E-02 PÂNCREAS Ο,ΟΕ+ΟΟ 4.7E-05 8.0E-03 1.9E-03 2.9E-03 8.0E-04 ESQUELETO OSSO CORTICAL ______________Ο,ΟΕ+ΟΟ 1,3E-04______3.2E-04_______1.0E-03______1.2E-03 1,6E-03 Tabela 15 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) órgãos alvo___________________________________________________________________________________ OUTROS TECIDOS MÚSCULO 1.ΘΕ-03 3.4E-02 7.6E-03 3.7E-01 ADIPOSO 1.8E-03 3.4E-02 7.6E-03 3.7E-01 SANGUE 1.8E-03 3.4E-02 7.6E-03 3.7E-01 CÉREBRO 1.8E-03 3.4E-02 7.6E-03 3.7E-01 CORAÇÃO 1.1E-02 2,8E-02 1.2E-02 3.7E-01 OVÁRIOS 1.5E-03 1t4E-02 6.2E-04 2.8E-01 PÂNCREAS 8,1 E-03 1.2E-01 1.3E-02 1.2E-01 ESQUELETO OSSO CORTICAL _____________1.5E-03 2.9E-02_________6,5E-03_____________1.6E-01 Tabela 15 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos da Trato gastrointestinal bexiga ^ ~ , Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos ^___________________________________________________estômago intestino delgado do Uli_________do Lli OSSO TRABECULAR 0,0E+00 1.3E-04 3,2E-04 1.0E-03 1,2E-03 1.6E-03 MEDULA (VERMELHA) 0,0E+00 2.9E-04 5.6E-04 3,5E-03 3.7E-03 4.6E-03 MEDULA (AMARELA) Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.9E-04 5.6E-04 3,5E-03 3.7E-03 4.9E-03 CARTILAGEM 0,0E+00 1.3E-04 3,2E-04 1.0E-03 1,2E-03 1,6E-03 OUTROS CONSTITUINTES Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.3E-04 3.2E-04 1.0E-03 1,2E-03 1.6E-03 PELE Ο,ΟΕ+ΟΟ 9,2E-05 2,0E-04 4.5E-04 5.7E-04 6.1E-04 BAÇO 0,0E-00 4,1 E-05 4.4E-03 1.5E-03 1.7E-03 9.1E-04 TESTÍCULOS Ο,ΟΕ-ΟΟ 7,6E-04 2.5E-05 3.2E-04 4,0E-04 2.2E-03 TIRÓIDE 0,0E+00 6,SE-07 4.9E-05 2.2E-05 3.0E-05 1.0E-05 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,4E-04 8.6E-04 2.3E-03 2.7E-03 2,6E-03 CORPO TOTAL__________________Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.7E.03_______3.4E.04________9,2E-03 6.1E-03 8,0E.03 Tabela 15 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo_________ OSSO TRABECULAR 1,5E-03 2.9E-02 6,5E-03 1.6E-01 MEDULA (VERMELHA) 3.9E-03 4.1E-02 8,3E-03 2.6E-01 MEDULA (AMARELA) 3,9E-03 4.1E-02 8.3E-03 2.6E-01 CARTILAGEM 1.5E-03 2.9E-02 6.5E-03 1.6E-01 OUTROS CONSTITUINTES 1.5E-03 2,9E-02 6.5E-03 1.6E-01 PELE 7.3E-04 1.6E-02 3.1E-03 1,2E-01 BAÇO 1.1E-02 2.8E-02 1.2E-02 2.3E-01 TESTÍCULOS 1.4E-04 2.5E-03 6.7E-05 1.8E-01 TIRÓIDE 8.1E-05 6.2E-03 4.5E-03 2.1E-01 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) 2,7E-03 6.6E-02 1.0E-02 3.7E-01 CORPO TOTAL___________________1.3E-03_______ 1.2E-02___________4.8E-Q4_____________ 2.8E-01__________ Tabela 16 ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA POR ATIVIDADE ACUMULADA UNITÁRIA, (RAD=A*S) ÍNDlO-[111] MEIA-VIDA 67,44 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto Órgãos alvo________________________________________Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular SUPRA-RENAIS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 0.0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.6E-02 PAREDE DA BEXIGA Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 1.4E-02 Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 1,6Ε-02 Gl (INTESTINO DELGADO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.1Ε-02 Gl (PAREDE DO ULI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.0Ε-02 Gl (PAREDE DO LLI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0Ε-02 RINS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.5Ε-02 FÍGADO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.9Ε-02 PULMÕES____________________Ο,ΟΕ+ΟΟ______Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ_________ Ο,ΟΕ+ΟΟ__________2.8Ε-02 Tabela 16 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo__________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS 2,6E-02 1.2E-02 0,0E+00 0,0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ PAREDE DA BEXIGA 1.7E-02 2,7E-04 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ G! (PAREDE DO ESTÔMAGO) 1.8E-02 1.7E-02 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ G! (INTESTINO DELGADO) 1,6E-02 2.4E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO ULl) 1.5E-02 2.2E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO LLI) 1.6E-02 1.1E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ RINS 2.1E-02 1.6E-02 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ FÍGADO 1.8Ε-02 1.7Ε-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PULMÕES________________________2.0E-Q2 4.0Ε-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 16 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto Órgãos alvo________ ____________________________Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular OUTROS TECIDOS MÚSCULO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0E-02 ADIPOSO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0Ε-02 SANGUE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,0Ε-02 CÉREBRO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0Ε-02 CORAÇÃO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.0Ε-02 OVÁRIOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,0Ε-02 PÂNCREAS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.9Ε-02 ESQUELETO OSSO CORTICAL_____________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ_________Ο,ΟΕ+ΟΟ________2.4Ε-01 Tabela 16 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo____________________________________________________________________________________ OUTROS TECIDOS MÚSCULO 2.7E-02 2.7E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ADIPOSO 2.7E-02 2.7E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ SANGUE 2.7Ε-02 2.7Ε-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CÉREBRO 2,7Ε-02 2.7Ε-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CORAÇÃO 2.7Ε-02 2.7Ε-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OVÁRIOS 1.5Ε-02 9.9Ε-04 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PÂNCREAS 1.8Ε+02 3.5Ε+02 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ESQUELETO OSSO CORTICAL________________3.1Ε-02_______1,7Ε-03_______Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ______Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 16 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto Órgãos alvo Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular OSSO TRABECULAR Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.4E-01 MEDULA (VERMELHA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.4Ε-01 MEDULA (AMARELA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4Ε-01 CARTILAGEM Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,4Ε-01 OUTROS CONSTITUINTES Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.4Ε-01 PELE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.1Ε-02 BAÇO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.9Ε-02 TESTÍCULOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.8Ε-02 TIRÓIDE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,6Ε-02 ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 1,7Ε-02 CORPO TOTAL_________________Ο,ΟΕ+ΟΟ_____Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ_________Ο,ΟΕ+ΟΟ_________5.5Ε-02______ Tabela 16 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo__________________________________________________________________________________________ OSSO TRABECULAR 3.1E-02 1.7E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ MEDULA (VERMELHA) 2,9E-02 2,6E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ MEDULA (AMARELA) 2.9E-02 2,6E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CARTILAGEM 3.1E-02 1.7E-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OUTROS CONSTITUINTES 3.1Ε-02 1.7Ε-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PELE 4.0Ε-01 8.7Ε-04 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ BAÇO 1.8Ε-02 5.3Ε-01 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TESTÍCULOS 3.6Ε-02 1.2Ε-04 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TIRÓIDE 2,6Ε-02 2,0Ε-04 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) Ο,ΟΕ+ΟΟ 7.0Ε+04 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CORPO TOTAL____________________4.1Ε-02________3,8Ε-03 Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 17 DOSE ABSORVIDA DE RADIAÇÃO, (RAD = A * S) ÍTRIO-[90] MEIA-VIDA 64 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos da Trato gastrointestinal bexiga ^ _ , Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos urgaos aivo ______________________estômago intestino delgado do Uli_________do Lli SUPRA-RENAIS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 PAREDE DA BEXIGA Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,7E+-01 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ G! (PAREDE DO ESTÔMAGO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3,6Ε-01 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (INTESTINO DELGADO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 5.0Ε-01 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO ULI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.1Ε+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO LLI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.8Ε+00 RINS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ FÍGADO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PULMÕES______________________Ο,ΟΕ+ΟΟ_____Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 17 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo_________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 PAREDE DA BEXIGA Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (INTESTINO DELGADO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO ULI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO LLI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ RINS 8.4Ε+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ FÍGADO Ο,ΟΕ+ΟΟ 8,6Ε+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PULMÕES_______________________Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,1Ε+00________________Ο,ΟΕ+ΟΟ________ Tabela 17 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos da Trato gastrointestinal bexiga „ , Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos gaos a vo_________________________________________estômago intestino delgado do Uli_______do Lli OUTROS TECIDOS MÚSCULO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ADIPOSO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ SANGUE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CÉREBRO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CORAÇÃO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OVÁRIOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PÂNCREAS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ESQUELETO OSSO CORTICAL_______________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ_____Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 17 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo___________________________________________________________________________________ OUTROS TECIDOS MÜSCULO Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ 2,7E+00 ADIPOSO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.7E+00 SANGUE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.7Ε+00 CÉREBRO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.7Ε+00 CORAÇÃO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 2.7Ε+00 OVÁRIOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PÂNCREAS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ESQUELETO OSSO CORTICAL_______________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 17 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Supra-renais Conteúdos da Trato gastrointestinal bexiga ^ ~ . Conteúdos do Conteúdos do Conteúdos Conteúdos 9___________________________________________________estômago intestino delgado do Uli________do Lli OSSO TRABECULAR Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ MEDULA (VERMELHA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ MEDULA (AMARELA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CARTILAGEM Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OUTROS CONSTITUINTES Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PELE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ BAÇO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TESTÍCULOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TIRÓIDE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) Ο,ΟΕ+ΟΟ 1.7Ε-04 7.6Ε-03 4.6Ε-03 3,6Ε-03 4.1Ε-03 CORPO TOTAL__________________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabeia 17 (Continuação) Rins Fígado Pulmões Outros Tecidos (músculo) Órgãos alvo_________________________________________________________________________________________ OSSO TRABECULAR Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ MEDULA (VERMELHA) Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 MEDULA (AMARELA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CARTILAGEM Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OUTROS CONSTITUINTES Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PELE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ BAÇO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TESTÍCULOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TIRÓIDE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ÜTERO (NÃO GRÁVIDO) 3.7Ε-02 2.2Ε-01 2.9Ε-02 Ο,ΟΕ+ΟΟ CORPO TOTAL___________________Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ__________Ο,ΟΕ+ΟΟ_______________1.1E+0Q_________ Tabela 18 DOSE ABSORVIDA DE RADIAÇÃO, (RAD = A * S) ÍTRIO-[90] MEIA-VI DA 64 HORAS

ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto , Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular Orgaos alvo__________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PAREDE DA BEXIGA Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO ESTÔMAGO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (INTESTINO DELGADO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO ULI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO LLI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ RINS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ FÍGADO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PULMÕES_____________________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ__________Ο,ΟΕ+ΟΟ__________Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 18 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo__________________________________________________________________________________________ SUPRA-RENAIS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0Ε+00 PAREDE DA BEXIGA Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ G! (PAREDE DO ESTÔMAGO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (INTESTINO DELGADO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO ULI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Gl (PAREDE DO LLI) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ RINS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ FÍGADO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PULMÕES Ο,ΟΕ+ΟΟ_________Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 18 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto , Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular Urgaos alvo________________________________________________________________________________ OUTROS TECIDOS MÚSCULO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ADIPOSO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ SANGUE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CÉREBRO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CORAÇÃO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OVÁRIOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PÂNCREAS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ESQUELETO OSSO CORTICAL_____________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ_________Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.1Ε+00 Tabela 18 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos alvo___________________________________________________________________________________ OUTROS TECIDOS MÚSCULO 0,0E+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ADIPOSO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ SANGUE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CÉREBRO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CORAÇÃO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OVÁRIOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PÂNCREAS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ESQUELETO OSSO CORTICAL_______________Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ______ Ο,ΟΕ+ΟΟ_______Ο,ΟΕ+ΟΟ______Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 18 (Continuação) ÓRGÃOS FONTE

Ovários Pâncreas Esqueleto Medula vermelha Osso cortical Osso trabecular Orgaos alvo________________________________________________________________________________________ OSSO TRABECULAR Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.1E+00 MEDULA (VERMELHA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 7.8Ε+00 MEDULA (AMARELA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 7.8Ε+00 CARTILAGEM Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.1Ε+00 OUTROS CONSTITUINTES Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 3.1Ε+00 PELE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ BAÇO Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TESTÍCULOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TIRÓIDE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CORPO TOTAL Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ__________3.8Ε-01 Tabela 18 (Continuação) Pele Baço Testículos Tiróide Corpo Total Órgãos aívo_________________________________________________________________________________________ OSSO TRABECULAR Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ 0,0E+00 MEDULA (VERMELHA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ MEDULA (AMARELA) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CARTILAGEM Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ OUTROS CONSTITUINTES Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ PELE 1 ,ΟΕ+01 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ BAÇO Ο,ΟΕ+ΟΟ 9,0Ε+00 Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TESTÍCULOS Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ TIRÓIDE Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ ÚTERO (NÃO GRÁVIDO) Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΕ+ΟΟ CORPO TOTAL___________________3,8Ε+01 2,3Ε-02_______Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ________Ο,ΟΕ+ΟΟ Tabela 19 Estimativas de Dosimetria de Radiação Resultantes da Administração de 2B8-MX índio-[111] Marcado Uniformemente Distribuído em Homens Padrão {70 kg) e Baseado Sobre os Dados de Distribuição Animal Durante 72 Horas Após Injeção Ref.: A scheme for Absorved-dose Calculation for Biologically Distributed Radionuclides, MIRD, J, of Nucl. Med./Suplemento#1, 2/68 Cálculos Realizados Usando-se um Modelo de Folha de Dados em Symphony (Lotus Development Corporation) e Criado por Phillip L. Hagan, MS Nuclear Medicine Service VA Hospital San Diego, CA 92161 Tabela 20 Estimativas de Dosimetria de Radiação Resultantes da Administração de 2Β8-ΜΧ ítrio-[90] Marcado Uniformemente Distribuído em Homens Padrão (70 kg) e Baseado Sobre os Dados de Distribuição Animal Durante 72 Horas Após Injeção Ref.: A Scheme for Absorved-dose Calculation for Biologically Discributed Radionucíeidis, MIRD, J. Of Nucl. Med./Suplemento #1, 2/68 Cálculos Realizados Usando-se um Modelo de Folha de Dados em Symphony (Lotus Development Corporation) e Criado por Phillip L. Hagan, MS Nuclear Medicine Service VA Hospital San Diego, CA 92161 1 II. Resultados A. Estudos in vitro com 2B8 e 2B8-MX-DTPA 1. Produção e Caracterização do Anticorpo Anti-CD20 2B8 Um total de nove fusões resultou em três hibridomas que produzem anticorpos os quais competem eficazmente com o anticorpo Couíter B1 radiomarcado. Em cada caso, o hibridoma for expandido em uma placa de 24 cavidades. Os dois primeiros anticorpos isolados das fusões 3 e 4 tiveram o isótipo analisado e ambos foram identificados como IgM. O terceiro anticorpo, produzido na fusão 5 e designado 2B8, foi determinado como sendo um isótipo kappa !gG1 e foi selecionado para estudos contínuos. O clone 2B8.H1I foi expandido e colocado em armazenamento a longo prazo em nitrogênio líqüido. O clone 2B8.H1I foi subclonado a fim de produzir o clone 2B8.H1I.G3 e novamente para produzir o clone 2B8.H1I.G3.G9. Esse clone foi expandido, para outro estudo e o anticorpo foi purificado através de cro-matografia por afinidade à proteína A.

Ensaios de competição usando-se 2B8, B1 e Leu 16 não marcado e Coulter B1 radiomarcado demonstraram que ο 2B8 era capaz de inibir a ligação de B1 ao CD20 mais eficazmente do que concentrações iguais de B1 ou Leu 16 (Fig. 1). Resultados similares foram obtidos (dados não mostrados) em um estudo de competição usando-se 2B8 FITC-conjugado, B1 nativo e os anticorpos irrelevantes UPC-10 e S-003 (isótipos IgG 2a e 1, respectivamente). A ligação direta ao antígeno celular CD20 pelos anticorpos 2B8 e B1 foi comparada através de análise por FACS usando-se células SB CD20-positivas e células HSB CD20-negativas. Os resultados mostrados na Figura 2 indicam que para quantidades comparáveis de anticorpo, mais 2B8 do que B1 ligaram-se às células SB. Nenhuma ligação significativa às células SB foi observada com os anticorpos irrelevantes. Somente a fluorescência ao nível de base foi observada com qualquer reageníe usado com as células HSB. Esses resultados confirmam a especificidade da interação de 2B8 com o antígeno CD20 e sugerem que ο 2B8 pode ter maior afinidade pelo antígeno na superfície celular do que o B1.

Para determinar a afinidade aparente do 2B8, o anticorpo purificado foi radiomarcado com 125l e concentrações crescentes do anticorpo marcado foram incubadas com células SB antígeno-positivas; a radioatividade associada à célula foi determinada em seguida a um período de incubação de 1 hora (Fig. 3). Os resultados sugerem que o anticorpo 2B8 liga-se ao antígeno CD20 com uma constante de afinidade evidente de 4,3 X 10'9 M.

Estudos de citometria de fluxo com linfócitos sangüíneos periféricos normais humanos indicaram que ο 2B8 era específico às células B e não reagem com outros tipos de linfócitos (por exemplo, células T, monóci-tos, macrófagos). Ο 2B8 FITC-marcado foi comparado ao B1-FITC e em 16-FITC usando-se a mesma população de linfócitos humanos. Os resultados mostrados na Tabela 21 indicam que ο 2B8 reagiu com aproximadamente 14 por cento dos linfócitos sangüíneos periféricos versus aproximadamente 12 por cento para Leu 16 e 11 por cento para B1. A população de linfócito baseado sobre outro marcador de linfócitos B (CD-19) estava entre 11 e 14 por cento. Finalmente, quando linfócitos sangüíneos periféricos humanos foram incubados com 2B8 e B1 ou Leu 16 e, então, contracorados com o marcador CD19 (Becton/Dickinson), a população duplamente corada de linfócitos B era de 9 por cento com 2B8 e 10 por cento com B1 ou Leu 16. Esses resultados confirmam a similaridade desses reagentes.

Tabela 21 Comparação da Ligação de 2B8 a Linfócitos Sangüíneos Periféricos Humanos com outros Reagentes Linfócitos B e T Específicos Marcador do anticorpo A. Coloração Simples________________________Percentual de Linfócitos CD45 Nenhum (autofluorescência) 0 B1-FITC (Coulter Immunology, (lgG2a,k)) 11 Leu 16-FITC (Becton Dickinson, lgG1,k) 12 2B8-FITC (EDEC, lgG1,k) 14 B72.3-FITC (lgG1 ,k controle irrelevante) 4 Anti-CD4-FITC (Coulter Immunology) 37 continuação A. Coloração Simples______________________Percentual de Linfócitos CD45 Anti-CD3-FITC {Becton Dickinson) 59 Anti-CD19-RPE (Becton Dickinson) 11 Anti-CD19-FITC (Becton Dickinson) 14 B. Coloração Dupla: B1-FITC/anti CD19-RPE 10 Leu 16-FITC/anti CD19-RPE 10 2B8 FITC/anti CD19-RPE 9 Anti-CD19 FITC/anti CD19-RPE 13 B1-FITC/anti Hu Ig RPE 10 2B8-FITC/anti Hu Ig RPE 10 B72.3-FITC/anti Hu Ig RPE 2 Teste Simultâneo com Leucogates 99 A imunoprecipitação de antígeno celular CD20 radiomarcado pelo 2B8 ou B1 resultou na precipitação de espécies de proteínas duplas indistingüíveis com pesos moleculares de aproximadamente 33 e 35 kD (dados não mostrados).

2. Produção e Caracterização de 2B8-MX-DTPA O conjugado 2B8-MX-DTPA foi produzido através de reação do anticorpo com um excesso molar a 4:1 de ácido isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triaminapentaacético (4). Tipicamente, 1-2 moles de quelato MX-DTPA foram introduzidos por mol de anticorpo 2B8. Conforme mostra os resultados apresentados na Figura 4, o conjugado 2B8-MX-DTPA não exibiu perda evidente de imunorreatividade, vis a vis ο 2B8 nativo, na medida em que os anticorpos 2B8 nativo e conjugado exibiram virtualmente perfis idênticos de inibição ao B1; os valores de IC50 para 2B8 e 2B8-MX-DTPA eram de aproximadamente 3 e 4 pg/mL, respectivamente. Esses resultados foram obtidos usando-se anticorpo B1 125l marcado em um radioimunoensaio com células inteiras realizado usando-se células SB. Resultados similares foram obtidos usando-se 2B8 ou 2B8-MX-DTPA como inibidores da ligação de 2B8 125l-marcado às células SB; ambos 2B8 e seu conjugado MX-DTPA inibiram a ligação de 125I-2B8 às células SB em concentrações de aproximadamente 3-4 pg/mL (dados não mostrados).

Para avaliar a estabilidade in vitro do anticorpo 2B8 nativo e do conjugado 2B8-MX-DTPA, amostras em solução salina normal ou solução salina contendo glicina-HCI a 10 mM, pH de 6,8, foram incubadas a 4o e 30 °C durante 12 semanas e alíquotas foram analisadas semanalmente usando-se os seguintes ensaios: imunorreatividade pelo imunoensaio enzimático com células inteiras, SDS-PAGE sob condições de redução e não redução e eletroforese em gel com foco isoelétrico. Embra os ensaios de imunorreatividade não detectassem perda de reconhecimento do antígeno pelas amostras de anticorpo incubadas em qualquer temperatura (Figura 5), a faixa de foco isoelétrico com relação ao anticorpo (pH de 7,30-8,40 na semana zero), a qual era estável a 4 °C, exibiu um aumento de 0,2 no pH até 30 °C após a semana seis (Tabela 22). Esse resultado pode estar equivocado, contudo, na medida em que ele está no limite de erro experimental para o ensaio.

Tabela 22 __________________________________________ RESUMO DE pl para 2B8/2B8-MX-DTPA_____________________________________________ SEMANA 2B84SAL 2B8 30 SAL 2B8 4GLY 2B8 30 GLY 2B8-MX4 2B8-MX30 2B8-MX4 2B8-MX30 ___________________SAL___________SAL____________GLY___________GLY 0 7,46-8,37 7,46-8,37 6,30-8,21 6,30-8,21 1 7,39-8,24 7,42-8,27 7,46-8,31 7,46-8,24 6,39-8,26 6,39-8,26 6,32-8,24 6,25-8,24 2 7,38-8,27 7,45-8,34 7,45-8,40 7,45-8,34 6,02-8,40 6,02-8,34 6,02-8,40 5,95-8,27 3 7,47-8,35 7,33-8,35 7,40-8,29 7,33-8,29 6,0-8,29 6,0-8,29 6,0-8,22 6,0-8,15 4 7,38-8,24 7,38-8,24 7,38-8,35 7,38-8,28 5,99-8,28 5,99-8,35 5,99-8,35 5,99-8,35 5 7,29-8,25 7,29-8,25 7,37-8,32 7,37-8,32 5,90-8,32 5,90-8,27 5,90-8,32 5,90-8,27 6 7,24-8,12 7,20-8,27 7,27-8,27 7,20-8,12 5,85-8,27 5,85-8,27 5,85-8,27 5,85-7,95 7 7,39-8,32 7,17-8,32 7,35-8,25 7,17-8,47 6,02-8,25 5,95-8,32 5,95-8,32 8 7,33-8,29 7,26-8,36 7,40-8,36 5,86-8,36 5,86-8,36 5,86-8,36 5,86-8,21 9 7,49-8,53 7,26-8,45 7,41-8,45 7,34-8,30 5,93-8,45 5,93-8,45 5,93-8,45 5,93-8,23 10 7,26-8,27 7,19-8,27 7,26-8,27 7,19-8,27 5,95-8,35 5,95-8,35 5,88-8,35 5,95-8,13 11 7,40-8,27 7,18-8,27 7,40-8,35 7,18-8,13 5,93-8,35 5,93-8,27 5,93-8,27 5,93-8,13 12 7,26-8,18 7,04-8,18 7,26-8,18 7,19-8,11 5,90-8,26 5,90-8,18 5,90-8,26 5,90-8,18 Amostras de 2B8 nativo e 2B8-MX-DTPA foram formuladas em diferentes tampões e incubadas a 40° ou 30 °C durante 12 semanas. Durante esse período, vários ensaios, incluindo determinações do ponto isoelétrico, foram realizados. Os valores acima mostram a faixa de ponto isoelétrico para o anticorpo nativo e conjugado incubado em cada temperatura, em cada uma das formulações e para cada uma das doze semanas durante o estudo de estabilidade. Os cabeçalhos representam: 2B8 4 Sal, 2B8 incubado a 4 °C em solução salina; 2B8 30 Sal, 2B8 incubado a 30 °C em solução salina; 2B8 4 Gly, 2B8 incubado a 4 °C em solução salina normal contendo glicina a 10 mM; 2B8 30 Gly, 2B8 incubado a 30 °C em solução salina normal contendo glicina a 10 mM; 2B8-MX 4 SAL, 2B8-MX-DTPA (conjugado) incubado a 4 °C em solução salina; 2B8-MX 30 SAL, conjugado incubado a 30 °C em solução salina; 2B8-MX, 4 Gly, conjugado incubado a 4 °C em solução salina normal contendo glicina a 10 mM; e 2B8-MX 30 Gly, conjugado incubado a 30 °C em solução salina normal contendo glicina a 10 mM.

Finalmeníe, usando-se SDS-PAGE de não redução, as amostras de anticorpo a 30 ‘O exibiram os agregados de maior peso molecular após a semana 1 (Tabela 23). Análises densitométricas dos géis indicaram que os agregados representavam entre 8 e 17% das amostras (Tabela 23). Contudo, quando essas amostras foram analisadas através de SDS-PAGE, nenhuma evidência das espécies de elevado peso molecular foi encontrada, sugerindo a formação de agregados covalentes de anticorpo a 30 °C. Novamente, nenhuma perda de imunorreatividade foi observada.

Tabela 23 Estabilidade do 2B8 ín vitro A. Explorações Densitométricas dos Géis de SDS de Não Redução B. Explorações Densitométricas dos Géis de SDS de Redução Durante o curso desse estudo de estabilidade, amostras de 2B8-MX-DTPA incubadas a 4o e 30 °C também foram testadas com relação à incorporação de radiometais usando-se 90Y. As amostras analisadas nas semanas 4, 8 e 12 incorporaram > 90% do 90Y, a despeito da temperatura de incubação.

Finalmente, em um estudo separado, alíquotas de 2B8-MX- DTPA incubadas a 4o e 30 °C durante 10 semanas foram radiomarcadas com 111ln e sua biodistribuição tecidual analisada em camundongos BALB/c. Conjugados de ambas as temperaturas de incubação produziram biodistribu-ições similares (dados não mostrados). Além disso, os resultados obtidos eram similares aos resultados de biodistribuição obtidos em camundongos BALB/c usando-se conjugado 111l-marcado armazenado a 4 °C (veja abaixo).

Verificou-se que os protocolos de radiomarcação para 111ln e 90Y eram reproduzíveis. Tipicamente, radioincorporações de > 95% para 111ln e > 90% para 90Y foram obtidas. As atividades específicas para os conjugados 111l- e 90Y-marcados estavam, comumente, na faixa de 2-3 e 10-15 mCi/mg de anticorpo, respectivamente. No desenvolvimento inicial dos protocolos de 111l-e 90Y- radiomarcação, radioisótopos não complexados foram removidos do 2B8-MX-DTPA radiomarcado usando-se cromatografia por permeação de gel em HPLC. Nos experimentos posteriores, purificação por HPLC do conjugado índio-marcado foi eliminada em virtude das elevadas radioincorporações obtidas (> 95%) com esse isótopo. A imunorreatividade dos preparados de 2B8-MX-DTPA 111ln e 90Y-marcados foram analisadas por meio do método de Lindmo (3). Verificou-se que o 2B8-MX-DTPA 111ln marcado era 100% imunoreativo (Fig. 6) e o conjugado 90Y-marcado foi determinado como sendo 60% imunoreativo (dados não mostrados). 3. Caracterização de 2B8-MX-DTPA1111- e 90Y-marcado Experimentos preliminares com o conjugado 90Y-marcado demonstraram que degradação e perda de imunorreatividade significativas do anticorpo ocorriam em atividades específicas > 10 mCi/mg de anticorpo. Portanto, uma formulação foi desenvolvida para minimizar os efeitos da radióli-se. Embora um número de seqüestrantes de radical livre de baixo peso molecular tivesse sido avaliado e verificado como sendo eficazes, elevadas concentrações de albumina de soro humano (HSA) eram mais eficazes na preservação da integridade e imunorreatividade do anticorpo (Figuras 7-9). O anticorpo 90Y-marcado foi formulado em 1X PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de HSA; ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) também foi adicionado até uma concentração final de 1 mM a fim de assegurar que qualquer 90Y que pudesse estar perdido do anticorpo fosse quelado. A degradação de 2B8-MX-DTPA, radiomarcado até uma atividade específica de 14,6 mCi/mg, foi avaliada a 0 e 48 horas usando-se SDS-PAGE e autor-radiografia. As Figuras 8 e 9 mostram que o anticorpo radiomarcado não exibiu degradação significativa durante um período de 48 horas quando incubado a 4 °C. Análise usando-se cromatografia em camada fina mostrou que a perda de 90Y era de menos do que 2% durante a incubação de 48 horas (Tabela 24). A imunorreatividade também era relativameníe constante a 60% (Tabela 24).

Tabela 24 Estabilidade do 90Y-2B8-MX-DTPA Clinicamente Formulado O conjugado radiomarcado (atividade específica de 14,6 mCi/mg) foi formulado em PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM e as alíquotas incubadas a 4 °C. A estabilidade do conjugado foi analisada nos tempos mostrados por SDS-PAGE e autorradiografia, cromatografia em camada fina e através do ensaio de ligação a células inteiras. Os resultados mostram que aproximadamente 96% do radiometal continuou associado ao conjugado após 48 horas a 4 °C e que a imunorreatividade do anticorpo continuou constante em aproximadamente 60%.

Estudos da formulação também foram realizados com o conjugado 111ln-marcado; a atividade específica era de 2,2 mCi/mg. O anticorpo radiomarcado foi analisado em 1X PBS, pH de 7,4 contendo 50 mg/mL de HSA. A Figura 10 mostra fotografias dos autorradiogramas para as amostras de incubação em tempo zero e 48 horas; análise densitométrica dos autorradiogramas indicam que não houve degradação do anticorpo radiomarcado durante o curso do estudo (Figuras 11, 12). Análise por cromatografia em camada fina das amostras não demonstrou perda de 111ln (Tabela 25); além disso, a imunorreatividade foi mantida em aproximadamente 100% (Tabela 25).

Tabela 25 Estabilidade do 111ln-2B8-MX-DTPA Clinicamente Formulado O conjugado radiomarcado (atividade específica de 2,2 mCi/mg) foi formulado em PBS, pH de 7,4 contendo 50 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM e as alíquotas incubadas a 4 °C. A estabilidade do conjugado foi analisada através de SDS-PAGE e autorradiografia, cromatografia em camada fina e através do ensaio de ligação a células inteiras. Os resultados mostram que aproximadamente 96% do radiometal continuou associado ao conjugado após 48 horas a 4 °C e que a imunorreatividade do anticorpo continuou constante em aproximadamente 100%.

Quando um preparado clinicamente formulado de 2B8-MX-DTPA, radiomarcado com 90Y até uma atividade específica de 14,6 mCi/mg foi incubado durante 96 horas a 37 °C em soro humano e analisado através de SDS-PAGE de não redução e autorradiografia, menos de 4% do radioisó-topo foi perdido durante o curso do período de incubação. Explorações den-sitométricas dos autorradiogramas no tempo zero e 96 horas não indicaram degradação significativa do conjugado radiomarcado (Figuras 13-15). Esses resultados foram corroborados por análises cromatográficas analíticas em camada fina das amostras em tempo zero e 96 horas (Tabela 26). Tomados juntos, esses resultados sugerem que o conjugado ítrio-marcado é estável sob as condições usadas nesse estudo. Resultados similares foram obtidos com o conjugado 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado (Figuras 16-18).

Tabela 26 Análise Cromatográfica Analíticas em Camada Fina do conjugado 90Y-2B8- MX-DTPA Incubado em Soro Humano durante 96 Horas a 37 °C

Amostras de soro humano contendo 90Y-2B8-MX-DTPA (atividade específica de 14,6 mCi/mg) foram analisadas nos tempos mostrados colocando-se 1 μΙ de uma diluição a 1:20 das amostras sobre tiras de cromatografia em camada fina instantânea; as amostras foram analisadas três vezes. As tiras de cromatografia foram desenvolvidas através de cromatografia ascendente em acetato de amônio a 10% em metanokágua (1:1, v/v), secas e cortadas íransversalmente ao meio. A radioatividade associada com as metades superior e inferior de cada tira foi, então, determinada e a radioatividade percentual conjugado-associada calculada. (O radiometal livre migra com o solvente enquanto que a radioatividade proteína-associada continua conforme original). A média de cada determinação da radioatividade conjugado-associada é mostrada. B. Estudos com Animais 1. Estudos de Farmacoloqia/Toxicoloqia em Alta Dose com 2B8 e 2B8-MX-DTPA

Em um estudo GLP realizado no White Sands Research Center (Estudo Número 920111), a macacos cynomolgus foram fornecidas injeções intravenosas de várias doses de 2B8. Amostras de sangue foram tomadas antes de cada nova injeção e o sangue foi processado para avaliação cito-métrica de fluxo das populações de linfócitos (Tabela 27).

Tabela 27 Populações de células B em Primatas Determinadas por Citometria de Fluxo, Em Seguida à Infusão de Anticorpo Monoclonal Anti-CD20 de Murino, 2B8 continuação a Percentual de linfócitos totais. b População de células B quantificada através de reagentes marcadores de coloração dupla IgG-RPE anticamundongo + IG-F1TC anti-humano (IgG RPE anti camundongo detecta o CD20 bloqueado por 2B8 e o IgG FITC anti-humano detecta o Ig na superfície de células B de macaco).

Os animais nos grupos I a IV foram injetados a cada 48 horas durante um total de sete injeções; os animais no grupo V foram injetados uma vez no dia 0. Os animais nos Grupos III e IV foram sacrificados no dia 14.

Nenhum efeito farmacotóxico significativo relacionado à administração do anticorpo anti-CD20 2B8 foi observado em qualquer parâmetro clínico avaliado durante ou em seguida ao estudo. Similarmente, nenhuma anormalidade foi observada durante análise das várias amostras histopato-lógicas obtidas dos animais nos grupos lll e IV. A duração do estudo foi de 14 dias e os animais foram avaliados durante o estudo nas seguintes categorias: observações clínicas, pesos corporais, temperatura corporal, ingestão de alimentos e água, eliminação fecal, químicas do soro, hematologia, urinálise e exames físicos. Adicionalmente, o sangue dos animais em cada grupo foi coletado nos dias 0, 1, 7 e 13 e o sangue analisado com relação aos níveis de anticorpo no soro (2B8) e com relação aos níveis de Células T e B. No dia 13, os animais nos Grupos lll e IV foram sacrificados e os tecidos selecionados examinados por microscopia eletrônica em seguida ao preparo da amostra. Os tecidos avaliados foram: coração, baço, fígado, rim, pulmão, córtex cerebral, cordão espinhal, nódulo linfático, estômago, íleo, cólon, músculo esquelético, testículo/ovário, pâncreas e medula óssea.

Quando o sangue dos animais tratados foi analisado com relação aos níveis de células T e B em circulação, os animais nos Grupos II a V exibiram uma perda de > 50% das células B em circulação no dia 13 (Fig. 19) ; a administração do anticorpo não teve efeito sobre os níveis de células T (dados não mostrados). Todos os grupos que receberam 2B8 mostraram saturação de células B e anticorpo em excesso no plasma (não mostrado). Os animais no grupo V, os quais receberam uma única dose de 10,0 mg/kg de 2B8 também exibiram redução nos níveis de células B em circulação e-quivalente àquela observada em animais nos outros grupos.

Os animais nos grupos I, II e V foram examinados no dia 52 (Fig. 20) . Os níveis de células B retornaram para > 70% do normal no dia 38, exceto para um animal no Grupo II (Pro804) e um animal no Grupo V (Pro716). Os níveis de células B em circulação nesses animais permaneceram em a-proximadamente 40% dos níveis normais após 52 dias.

Além desse estudo, os efeitos farmacotóxicos do 89Y-2B8-MX-DTPA foram analisados em macacos cynomolgus em um estudo de GLP realizado no White Sands Research Center (Estudo No. 920611). O conjugado de grau clínico foi carregado com 89Y não radioativo. O conjugado trazendo ítrio foi formulado em PBS, pH de 6,8 contendo 75 mg/mL de albumi-na de soro humano e DTPA a 1 mM (formulação clínica) e administrado in-travenosamente conforme descrito na Seção Métodos.

Conforme mostra os resultados da Figura 21, o 2B8-MX-DTPA 89Y-marcado tinha pouco, se algum, efeito sobre as células B em circulação nesses animais, a despeito da dose administrada. Além disso, nenhuma outra anormalidade significativa que não redução de linfócitos (20-43%) foi encontrada em qualquer parâmetro clínico avaliado, incluindo química do soro, urináíise, pesos e temperaturas corporais.

2. Estudos de Farmacocinética com 2B8 e 2B8-MX-DTPA

Conforme descrito acima, os animais no Grupo V do estudo GLP receberam uma única dose de 10,0 mg/kg de 2B8. Análise por regressão linear dos dados sugere que o anticorpo nativo foi eliminado da circulação desses macacos com um valor de β t1/2 de aproximadamente 4,5 dias. Em um estudo similar usando-se camundongos BALB/c, os valores de β t1/2 para ο 2B8 nativo e conjugado foram determinados a partir de análise por regressão linear (não mostrada) como sendo de 8,75 dias (Fig. 22). Esses resulta- dos sugerem que a conjugação de 2B8 não tinha efeito sobre sua eliminação em camundongos BALB/c. 3. Estudos de Biodistribuição e Localização de Tumor com 2B8-MX-DTPA radiomarcado Com base no experimento preliminar de biodistribuição descrito acima (Seção 2d), ο 2B8 conjugado foi radiomarcado com 111 In até uma atividade específica de 2,3 mCi/mg e aproximadamente 1,1 pCi foi injetado em cada um de vinte camundongos BALB/c a fim de determinar a biodistribuição do material radiomarcado. Subsequentemente, grupos de cinco camundongos cada um foram sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas e seus órgãos e uma parte da pele, músculo e ossos foi removida e processada para análise. A-lém disso, a urina e fezes foram coletadas e analisadas com relação aos pontos de tempo de 24-72 horas. O nível de radioatividade no sangue caiu de 40,3% da dose injetada por grama em 1 hora para 18,9% em 72 horas (Tabelas 1-4; Figura 23). Os valores para coração, rim, músculo e baço permaneceram na faixa de 0,7-9,8% no decorrer do experimento. Os níveis de radioatividade encontrados no pulmão diminuíram de 14,2% em 1 hora para 7,6% em 72 horas; similarmente, os respectivos valores de dose injetada por grama no fígado eram de 10,3% e 9,9%. Esses dados foram usados na determinação das estimativas de dose de radiação absorvida com 111ln-2B8-MX-DTPA (Tabela 19). A biodistribuição de conjugado 90Y-marcado, tendo uma atividade específica de 12,2 mCi/mg de anticorpo, foi avaliada em camundongos BALB/c. Radioincorporações de > 90% foram obtidas e o anticorpo radiomarcado foi purificado por HPLC. O depósito de radioatividade no tecido foi avaliado nos órgãos principais e na pele, músculo, osso e urina e fezes durante 72 horas e expresso como a dose percentual injetada/g de tecido. Os resultados mostrados nas Tabelas 5-8 e Figura 24 demonstram que embora os níveis de radioatividade associada com o sangue caíssem de aproximadamente 39,2% de dose injetada por grama em 1 hora para aproximadamente 15,4% após 72 horas, os níveis de radioatividade associada à cauda, coração, rim, músculo e baço permaneceram uniformemente constantes a 10,2% ou menos no decorrer do curso do experimento. De modo importante, a radioatividade associada com o osso oscilou de 4,4% da dose injetada por grama de osso em 1 hora a 3,2% a 72 horas. Tomados juntos, esses resultados sugerem que pouco ítrio livre estava associado com o conjugado e que pouco radiometal livre foi liberado durante o curso do estudo. Esses dados foram usados na determinação das estimativas de dose de radiação absorvida com relação ao 90Y-2B8-MX-DTPA (Tabela 20).

Para estudos de localização de tumor, 2B8-MX-DTPA foi preparado e radiomarcado com 111ln até uma atividade específica de 2,7 mCi/mg. Cem microlitros de conjugado marcado (aproximadamente 24 pCi) foram subseqüentemente injetados em cada um de 12 camundongos atímicos trazendo tumores de Células B de Ramos. Os tumores oscilavam, quanto ao peso, de 0,1 a 1,0 grama. Nos pontos de tempo 0, 24, 48 e 72 horas em seguida à injeção, 50 pL de sangue foram removidos através de perfuração retro-orbital, os camundongos sacrificados por deslocamento cervical e a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo, fêmur e tumor removidos. Após processamento e pesagem dos tecidos, a radioatividade associada com cada amostra de tecido foi determinada usando-se um contador gama e os valores expressos como dose percentual injetada por grama.

Os resultados (Fig. 25) demonstram que as concentrações de tumor do 111ln-2B8-MX-DTPA aumentaram grandemente no decorrer do curso do experimento. Trinta por cento da dose injetada estava acumulada no tumor após 72 horas. Os níveis no sangue, em contraste, caíram durante o experimento de 30% no tempo zero para 13% a 72 horas. Todos os outros tecidos (exceto músculo) continham entre 1,3 e 6,0% da dose injetada por grama de tecido ao final do experimento; o tecido muscular continha aproximadamente 13% da dose injetada por grama. C, Dosimetria Os dados resumidos de dosimetria derivados de estudos de bio-distribuição em camundongos BALB/c normais e apresentados nas Tabelas 19 e 20, para os conjugados índio- e ítrio-marcados, respectivamente, estão em concordância com os dados apresentados na literatura quando compa- rados por milicurie de dose injetada (5) e sugerem que os conjugados de 2B8 índio- e ítrio-marcados podem ser seguramente avaliados quanto à eficácia clínica em pacientes com linfoma. D. Toxicoloqia 1. 2B8: Teste de Segurança Geral com Dose Única Camundongos e porcos-da-índia foram administrados com uma única dose intraperitoneal de 2B8 (0,5 mL ou 5,0 ml_, respectivamente) e observados durante sete dias. Nenhum sinal de toxicidade foi observado. 2. 2B8 e 2B8-MX-DTPA: Estudos de Imuno-histoloqia com Tecidos Humanos A reatividade tecidual do anticorpo monocional de murino 2B8 foi avaliada usando-se um painel de 32 diferentes tecidos humanos fixados com acetona. O anticorpo 2B8 reage com o antígeno anti-CD20 o qual tem um padrão muito limitado de distribuição tecidual, sendo observado apenas em um subconjunto de células em tecidos linfóides, incluindo aqueles de origem hematopoiética.

No nóduio iinfático, a imunorreatividade foi observada em uma população de linfócitos B corticais maduros, bem como em células de proliferação nos centros germinais. A reatividade positiva também foi observada em áreas de células B no sangue periférico das tonsilas, polpa branca do baço e com 40-70% dos linfócitos medulares encontrados no timo. Reatividade positiva também foi observada nos folículos da lamina própria (Peyer's Patches) do intestino grosso. Finalmente, células linfóides agregadas ou dispersas no estroma de vários órgãos, incluindo bexiga, mama, cérvix, esôfago, pulmão, paratiróide, próstata, intestino delgado e estômago também e-ram positivas ao anticorpo 2B8.

Verificou-se que todas as células epiteliais simples, bem como o epitélio estratificado e epitéíio escamoso de diferentes órgãos, eram não reativas. Similarmente, nenhuma reatividade foi observada com as células neu-roectodérmicas, incluindo aquelas no cérebro, cordão espinhal e nervos periféricos. Verificou-se que os elementos mesenquimais, tais como células do músculo esquelético e liso, fibroblastos, células endoteliais e células inflama- tórias polimorfonucleares também eram negativas. A reatividade tecidual do conjugado 2B8-MX-DTPA foi avaliada usando-se um painel de dezesseis tecidos humanos os quais tinham sido fixados em acetona. Conforme previamente demonstrado com o anticorpo nativo, o conjugado 2B8-MX-DTPA reconheceu o antígeno CD20 que exibia um padrão aitamente limitado de distribuição, sendo encontrado somente em um subconjunto de células de origem linfóide. No nódulo linfático, a imunor-reatividade foi observada na população de células B. Forte reatividade foi observada na polpa branca do baço e nos linfócitos medulares do timo. Imu-norreatividade também foi observada em linfócitos dispersos na bexiga, coração, intestino grosso, fígado, pulmão e útero e foi atribuída à presença de células inflamatórias presentes nesses tecidos. Conforme descrito com o anticorpo nativo (acima), nenhuma reatividade foi observada com as células neuroectodérmicas ou com os elementos mesenquimais. III. Discussão O anticorpo anti-CD20 monoclonal de murino 2B8 produzido a-través de um clone com a mesma designação, exibe uma afinidade pelo antígeno anti-CD20 a qual pode ser maior do que aquela observada com relação ao anticorpo B1, conforme determinado através de competição com anticorpos de especificidade conhecido pelo antígeno CD20 e por análise de Scatchard. Ainda, dados de imuno-precipitação sugerem que o antígeno precipitado pelo 2B8 parece ser o mesmo antígeno que aquele precipitado pelo B1, na medida em que ambos os anticorpos precipitaram uma dupla com pesos moleculares relativos de 33 e 35 kD. Análise citofluorográfica da especificidade do anticorpo 2B8 com relação aos linfócitos do sangue periférico demonstra que o anticorpo reage especificamente com as células B e não demonstrou reatividade com as células T ou outros tipos de linfócitos. Finalmente, os dados preliminares de estabilidade sugerem que o anticorpo é estável a 30 °C durante 12 semanas sem perda da imunorreatividade.

Quando o anticorpo 2B8 foi conjugado ao ácido metilbenzil dieti-lenotriaminapeníaacético (MX-DTPA), virtualmente nenhuma redução na imunorreatividade, com relação ao anticorpo nativo, foi observada. Ainda, a radiomarcação do conjugado com 111ln ou 90Y produziu conjugados marcados com imunorreatividades de 100% e 60%, respectivamente. Estudos de estabilidade dos conjugados 111ln- ou 90Y-marcados incubados em soro humano durante 96 horas a 37 °C indicaram perda negligenciável de radiome-tal durante o curso do estudo, sugerindo que os conjugados serão estáveis quando clinicamente usados.

Estudos de localização de tumor em camundongos atímicos u-sando-se um preparado índio-conjugado de 2B8-MX-DTPA demonstraram que quantidades crescentes do conjugado se ligaram às células tumorígenas durante o curso do experimento sem acúmulos incomuns em outros tecidos. Além disso, estimativas de dosimetria derivadas de estudos de biodistribui-ção estão em concordância com os dados publicados na literatura. Finalmente, estudos de reatividade-cruzada em tecidos humanos com os anticorpos nativo e conjugado indicaram que ambos os anticorpos reconhecem um antígeno com distribuição tecidual altamente limitada, reagindo com somente um subconjunto de células nos tecidos linfóides, incluindo aqueles de origem hematopoiética. Tomados juntos, esses resultados sugerem que a conjugação não altera a especificidade tecidual do anticorpo e que os conjugados radiomarcados são estáveis in vivo e reconhecem o antígeno CD20 presente sobre a superfície de tumores produzidos experimentalmente em camundongos atímicos.

Quando ο 2B8 foi usado em um estudo de farmacoíogi-a/toxicologia em alta dose, o anticorpo não produziu efeitos farmaco-tóxicos significativos em qualquer parâmetro avaliado, durante ou em seguida ao estudo. Similarmente, nenhuma anormalidade foi observada durante análise das várias amostras histopatológicas examinadas através de microscopia eletrônica. Surpreendentemente, todas as doses de anticorpo usadas produziram eliminação acentuada das células B em circulação. Os níveis de células B em circulação, contudo, retornaram aos níveis aproximadamente normais uma vez que a administração de anticorpo cessasse. No grupo de macacos com dose única (Grupo V), o anticorpo nativo foi eliminado da circulação com um valor β tm evidente de aproximadamente 4,5 dias. De modo previsível, quando esse estudo farmacocinético foi realizado em camundon-gos BALB/c, o anticorpo 2B8 foi eliminado com um valor β lV2 de 8,75 dias. Assim, tomados juntos, esses dados sugerem que o anticorpo nativo também pode proporcionar algum efeito clínico quando administrado como um adjunto aos conjugados radiomarcados.

Os dados gerais indicam que o anticorpo 2B8 de alta afinidade e seu conjugado MX-DTPA exibem um padrão limitado de reatividade no tecido humano. Além disso, em primatas, uma vez que o anticorpo é eliminado, os níveis de células B em circulação retornam de modo razoavelmente rápido. Adicionalmente, os conjugados 2B8-MX-DTPA índio- e ítrio-marcados parecem estáveis in vitro, não exibindo perda de radiometal durante incubação prolongada no soro humano. Finalmente, as estimativas quanto à dose de radiação derivadas da biodistribuição de 2B8-MX-DTPA 90Y- ou 111In-marcado em camundongos BALB/c estão em concordância, em milicurie por dose injetada, com as estimativas de dose derivadas de estudos clínicos em seres humanos usando anticorpos conjugados com um idiotipo não semelhante radiomarcado com esses isótipos.

IV. SUMÁRIO DO DESENVOLVIMENTO PRÉ-CLINICO DO PROTOCOLO DE RADIOMARCACÃO POR "MISTURA & DESENVOLVIMENTO" PARA O PREPARO DE 90Y-2B8-MX-DTPA A. Introdução Um anticorpo anti-CD20 monoclonal de murino (2B8) 90Y-marcado foi avaliado em um experimento clínico em I Fase para o tratamento de linfoma reincidente de células B. O protocolo original usado para o preparo do anticorpo ítrio-marcado usava uma etapa de cromatografia de líqüi-do de elevado desempenho (HPLC) para remoção do radioisótopo ligado a não proteínas antes de formulação e administração aos pacientes. Infeliz-mente, esse processo consome tempo, resultando em uma exposição mais longa do anticorpo ao radioisótopo em um estado não protegido. Isso resulta em radiólise aumentada do anticorpo com uma concomitante diminuição na imunorreatividade. Adicionalmente, o aspecto trabalhoso do processo torna difícil preparar mais do que uma dose por dia na radiofarmácia. A simplifica- ção do processo possibilitaria implementação no local clínico como uma alternativa ao uso da NIPI Pharmacy Services como uma radiofarmácia.

Consequentemente, um procedimento revisado de radiomarca-ção foi desenvolvido, referido como o método de "mistura & desenvolvimento", o qual elimina a necessidade de purificação por HPLC ao mesmo tempo em que mantém uma elevada radioincorporação e retenção aperfeiçoada da imunorreatividade. Estudos de estabilidade in vitro, bem como estudos de biodistribuição em camundongos mostraram que o anticorpo radiomarcado preparado usando-se o método de "mistura & desenvolvimento" é comparável ao material produzido usando-se o processo corrente por HPLC. Os resultados desses estudos pré-clínicos indicam que esse novo protocolo de "mistura & desenvolvimento" pode ser usado para preparar 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado adequado para uso em experimentos clínicos. B. Materiais e Métodos Materiais 1. Células As linhas de células linfoblásticas humanas SB {CD20 positivas) e HSB (CD20 negativas) foram obtidas de American Type Culture Collection e mantidas em RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal e suplementado com glutamina. 2. Anticorpos O anticorpo 2B8 foi purificado pelo departamento de Fabricação a partir do sobrenadante do biorreator de fibra oca usando-se os protocolos previamente descritos no IND (BB-IND 4850/4851). 3. Reaqentes adicionais Cloreto de ítrio-[90] foi obtido da Amersham. Todos os outros reagentes foram obtidos das fontes descritas nos relatórios em anexo citados abaixo. Os reagentes usados para os protocolos de radiomarcação foram processados a fim de remover os íons de metal pesado contaminantes os quais poderíam competir com os radioisótopos durante a etapa de radiomarcação (veja Seção Métodos). Os reagentes foram feitos sob condições de GMP pelo departamento de Fabricação do IDEC seguindo-se os Regis- tros de Produção em Lote estabelecidos. Métodos 1. Preparo de 2B8-D4X-DTPA MX-DTPA de grau clínico foi obtido da Coulter Immunology como o sal de dissódio em água e armazenado a -70 °C. O conjugado (2B8-MX-DTPA) foi preparado pelo departamento de Fabricação. Dois lotes diferentes de conjugado foram usados nesses estudos; ambos foram proporcionados em solução salina normal a 10 mg/mL. Os conjugados foram enxhidos em seringas estéreis de polipropileno de 2 mL e armazenados a 2-8 °C. 2. Manutenção de Condições Isentas de Metal Todas as manipulações dos reagentes foram realizadas a fim de minimizar a possibilidade de contaminação por metal. Recipientes plásticos de polipropileno ou poliestireno tais como frascos, béqueres e cilindros graduados foram usados. Esses foram lavados com Alconox e exaustivamente enxaguados com água Milli-Q ou Água para Irrigação (WFIr) antes de uso. Pontas de pipetas isentas de metal (BioRad) foram usadas para manipulação precisa de pequenos volumes. Volumes maiores de reagentes foram manipulados usando-se pipetas sorológicas plásticas estéreis. As reações foram convenientemente realizadas em tubos para microcentrífuga com tampa de rosca de 1,8 mL feitos de polipropileno. 3. Determinação da Radioincorporacão A radioincorporação foi determinada usando-se cromatografia em camada fina (ITLC) três vezes de acordo com SOP SP-13-008. Em geral, o protocolo era como segue: o conjugado radiomarcado foi diluído a 1:20 em 1X PBS contendo DTPA a 1 mM ou EDTA a 5 mM, então, 1 pL colocado em uma extremidade de uma tira de 1 x 5 cm de papel SG para ITLC (Gelman Sciences). O papel foi desenvolvido usando-se acetato de amônio a 10% em metanol:água (1:1; v/v). As tiras foram secas, cortadas pela metade transversalmente e a radioatividade associada com cada seção determinada a-través de contagem por cintilação. A radioatividade associada à metade inferior da tira (radioatividade proteína-associada) foi expressa como um percentual da radioatividade total determinada somando-se os valores das metades superior e inferior. 4. Protocolo de "Mistura & Desenvolvimento" para 2B8-MX-DTPA Ítrio-Í901-marcado Os anticorpos foram radiomarcados com Cloreto de 90Y isento de veículo proporcionado pela Amersham em HCI a 0,04 M. Uma alíquota de radioisótopo (10-20 mCi/mg de anticorpo) foi transferida para um tubo de polipropileno e um volume de 0,02X de acetato de sódio a 2 M isento de metal foi adicionado a fim de ajustar a solução para um pH de 3,6. 2B8-NaDTPA (0,3 mg; 10,0 mg/mL em solução salina normal) foi adicionado i-mediatamente e a solução gentilmente misturada. A solução foi verificada com papel de pH para inspecionar um pH de 3,8-4,1 e incubada durante 5 minutos. A reação foi resfriada através de transferência da mistura de reação para um tubo de polipropileno distinto contendo 1X PBS com 75 mg/mL de albumina de soro humano (HSA) e ácido dietilenotriaminapentaacético a 1 mM (DTPA) e gentilmente misturada. O anticorpo radiomarcado foi armazenado a 2-8 °C.

As atividades específicas foram determinadas através de medição da radioatividade de uma alíquota apropriada do conjugado radiomarcado. Esse valor foi corrigido para contagem eficiente, relacionada à concentração de proteína do conjugado, determinado pela absorbância a 280 nm e expresso como mCi/mg de proteínas. 5. ímunorreatividade in vitro do 2B8-MX-DTPA ítrio-901-marcado A Ímunorreatividade do conjugado 90Y-marcado foi determinada usando-se SOP #SP13-009 baseado em uma versão modificada do ensaio de ligação com células inteiras descrito por Lindmo. Concentrações crescentes de células SB CD20-positivas ou células HSB CD20-negativas em fase log foram adicionadas a conjuntos duplos de tubos de polipropileno de 1,5 mL; volume final de células de 0,40 mL. O conjugado radiomarcado foi diluído até uma concentração final de anticorpo de 1-2,5 ng/mL e 0,35 mL adicionados a cada tubo. Em seguida a uma incubação de 90 minutos, as células foram empelotadas através de centrifugação e os sobrenadantes coletados. A radioatividade restante na fração do sobrenadante foi determinada com um contador de cintilação. Os dados foram plotados como o quociente da radioatividade total adicionada dividido pela radioatividade célula-associada versus o inverso do número de células por tubo. A interseção com o eixo y representa a fração imunoreativa. 6. Estabilidade in vitro do ítrio-f901-2B8-MX-DTPA Clinicamente Formulado O conjugado 2B8-MX-DTPA foi radiomarcado com 90Y e formulado conforme descrito no protocolo de "mistura & desenvolvimento" proporcionado acima. Dois lotes de conjugado radiomarcado foram preparados; um lote foi usado para avaliar a estabilidade de radioincorporação e o outro lote usado para avaliar a retenção da imunorreatividade. Os conjugados formulados foram incubados a 4 °C durante 48 horas e alíquotas analisadas nos tempos 0, 24 horas e 48 horas usando-se SDS-PAGE de não redução e au-torradiografia. A imunorreatividade em cada ponto de tempo foi analisada usando-se o ensaio descrito acima. 7. Estabilidade in vitro do ítrio-í901-2B8-MX-DTPA em Soro Humano A estabilidade do 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado foi analisada através de incubação em soro humano a 37 °C durante até 72 horas. O anticorpo conjugado foi radiomarcado com ítrio-[90] e formulado conforme descrito acima. O conjugado radiomarcado foi diluído a 1:10 com soro humano normal (não inaíivado pelo calor) e alíquotas incubadas em tubos plásticos a 37°C. Nos tempos selecionados, as amostras foram removidas e analisadas através de SDS-PAGE de não redução e autorradiografia.

8. Biodistríbuicão de ítrio-[901-2B8-MX-DTPA 2B8-MX-DTPA ítrio-[90]-marcado foi avaliado com relação à bio-distribuição tecidual em camundongos BALB/c de oito a dez semanas de idade. O conjugado radiomarcado foi preparado e formulado conforme descrito acima. Os camundongos foram injetados intravenosamente com 5 uCi de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado e grupos de cinco camundongos foram sacrificados a 1, 24, 48 e 72 horas. Após sacrifício, a cauda, coração, pulmões, fígado, rim, baço, músculo e fêmur foram removidos, lavados, pesados; uma amostra de sangue e da pele também foi removida para análise. A radioatividade associada com cada amostra de tecido foi determinada através de medição da radição de Bremstrahlung usando-se um contador gama e a dose percentual injetada por grama de tecido e a dose percentual injetada por órgão determinadas. 9. Dosimetria Os dados de bíodistríbuição obtidos usando-se camundongos injetados com 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado foram usados para calcular estimativas das doses de radição absorvidas a partir de uma dose administrada de 1,0 mCi a um paciente de 70 kg. As estimativas foram feitas de acordo com os métodos adotados pelo Medicai Internai Radiation Dose (MIRD) Committee of the Society of Nuclear Medicine. Esses cálculos foram realizados por Mr. Phillip Hagan, Nuclear Medicine Service, VA Medicai Center, La Jolla, CA 92161.

10, Validação do Protocolo para Preparo de Doses Clínicas de Ítrio-Í901-2B8-MX-DTPA (Relatório de Referência R&D intitulado "Validation of "Mix-and-Shoot" Radiolabeling Protocol for the Preparation of Clinicai Doses of 90Y-2B8-MX-DTPA; autor: P. Chinn; datado de 22 de Abril de 1994). C. Resultados 1. Preparo de 2B8-MX-DTPA Itrio-lOOl-marcado usando-se o Protocolo de "Mistura & Desenvolvimento" Experimentos preliminares avaliando a cinética da reação de radiomarcação com 2B8-MX-DTPA e 90Y mostraram que em um pH de 3,6-4,0, 95% do radioisótopo era incorporado para um tempo de reação de 5 a 10 minutos. A reprodutibílidade dessa radioincorporação (95,7% ± 1,7%) foi subseqüentemente confirmada em um estado de vaüdação para o protocolo em escala (relatório de Referência R&D intitulado "Validation of "Mix-and-Shoot" Radiolabeling Protocol for the Preparation of Clinicai Doses of 90Y-2B8-MX-DTPA; autor: P. Chinn; datado de 22 de Abril de 1994). O preparo de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado usando esse protocolo de "mistura & desenvolvimento" proporcionou um produto comparável àquele produzido com o método de HPLC (veja BB-IND 4850/4851). Verificou-se que o protocolo de radiomarcação era reproduzível com atividades específicas oscilando, tipi- camente, de 10 a 15 mCi/mg de anticorpo. A imunorreatividade do 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado preparado usando-se esse protocolo era, tipicamente, maior do que 70%, comparado a 55-60% observado para as operações de validação do protocolo de HPLC (Figura 26). Essa diferença é provavelmente devido aos efeitos reduzidos da radióiise em virtude do tempo reduzido de incubação com o protocolo de "mistura & desenvolvimento". Esse resultado era típico e, conforme discutido abaixo, era representativo das operações de validação com relação ao protocolo em escala para o preparo de doses clínicas do conjugado radiomar-cado. 2. Estabilidade do 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado in vitro Experimentos preliminares com conjugado de anticorpo 90Y-marcado não protegido preparado usando-se o processo de HPLC demonstraram que a radióiise causou degradação significativa do anticorpo e perda da imunorreatividade. Portanto, uma formulação tampão foi desenvolvida para minimizar os efeitos da radióiise. Foi mostrado que albumina de soro humano (HSA) era eficaz na minimização da degradação de anticorpo devido à radióiise. Uma avaliação foi feita com o conjugado radiomarcado preparado com o método de "mistura & desenvolvimento" a fim de confirmar a eficácia da formulação na minimização da radióiise. O anticorpo 90Y-marcado, radiomarcado para uma atividade específica de 14,5 mCi/mg de anticorpo, foi formulado em 1X PBS, pH de 7,4 contendo 75 mg/mL de HSA e DTPA a 1 mM. A degradação do conjugado 2B8-MX-DTPA foi avaliada a 0, 24 e 48 horas usando-se SDS-PAGE e autorradiografia. As Figuras 2, 3 e 4 mostram que o conjugado radiomarcado não exibiu degradação significativa durante um período de 48 horas quando incubado a 4 °C. Análise por cromatografia em camada fina não mostrou perda de 90Y durante a incubação de 48 horas; esses resultados foram corrobados através de análise por SDS-PAGE/autorradiográfica (Tabela 28). A imunorreatividade também era relativamente constante a > 88% (Tabela 29).

Tabela 28 Estabilidade do 90Y-2B8-MX-DTPA "misturado & desenvolvido" em PBS contendo Albumina de Soro Humano e DTPA

Percentual de Radioatividade Conjugado-Associada Tempo Choras) ÍTLC SDS/PAGE 0 92,9 96,0 24 95,5 95,4 48 91,3 94,6 Tabela 29 Imunorreatividade do 90Y-2B8-MX-DTPA "misturado & desenvolvido" em PBS contendo Albumina de Soro Humano e DTPA

Um 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado ciinicamente formulado em uma atividade específica de 15,7 mCi/mg foi incubado durante 72 horas a 37 °C em soro humano. As amostras analisadas através de SDS-PAGE de não redução e autorradiografia (Figura 30) não mostraram perda de radioisótopo durante o curso do período de incubação (Tabela 30). Explorações densito-métricas dos autorradiogramas no tempo zero e 72 horas não indicaram degradação significativa do conjugado radiomarcado (Figuras 31 e 32). Esses resultados foram corrobados por análises cromatográficas em camada fina (Tabela 30). Deve ser observado que a radioincorporação com relação ao anticorpo usado nesse estudo era menor do que aquela obtida nos estudos de validação do protocolo de marcação. Essa radioincorporação menor era devido à qualidade reduzida do lote de cloreto de 90Y usado para esse preparado em particular de anticorpo radiomarcado. A menor radioincorporação não alterou a conclusão de que o conjugado ítro-marcado preparado pelo método de "mistura e desenvolvimento" é estável sob essas condições de incubação.

Tabela 30 Estabilidade do Conjugado 90Y-2B8-MX-DTPA Incubado em Soro Humano Amostras de soro humano contendo S0Y-2B8-MX-DTPA (atividade específica de 15,7 mCí/mg) foram analisadas com relação ao 90Y ligado a não proteína nos tempos mostrados usando-se tiras de cromatografia em camada fina e SDS-PAGE/autorradiografia.

3. Estudos de Biodistribuição com ítrio-f9Q]2B8-MX-DTPA A biodistribuição do conjugado 90Y-marcado, com uma atividade específica do anticorpo de 11,5 mCi/mg e uma radioincorporação de > 95%, foi avaliada em camundongos BALB/c. O depósito de radioatividade nos tecidos foi avaliada com relação aos órgãos principais, pele, músculo, osso, urina e fezes durante 72 horas e expresso como dose percentual injetada por g de tecido e como dose percentual injetada por órgão. Os resultados mostrados nas Tabelas 31-34 e Figura 33 mostram que os níveis de radioatividade associada ao sangue diminuíram de uma dose injetada de aproximadamente 43% por grama (%ID/g) em 1 hora para aproximadamente 16% após 72 horas; a 24 horas e depois, os níveis de radioatividade associada ao coração, rim e baço permaneceram aproximadamente constantes a 4-8%. Para o pulmão e fígado, a radioatividade diminui de 10-12% em 1 hora para 8%-10% em 72 horas. Para a pele, radioatividade foi relativamente constante a aproximadamente 3%, de 24 h até 72 h. A radioatividade no trato gastrointestinal era constante a 0,5-1% de 24 horas a 72 horas. A radioatividade com relação ao músculo permaneceu em aproximadamente 0,6% no decorrer do curso do estudo. A captação de radioatividade pelo fêmur (osso) permaneceu em menos do que 4% em todos os pontos de tempo, indicando que a quantidade de ítrio livre no preparado de conjugado era negligenciável e que pouco radiometal livre foi liberado durante o curso do estudo.

Tabela 31 Distribuição de Atividade em 1,0 Hora Em Seguida à Injeção I.V. de 90Y-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 3 Peso médio = 19,58 gramas ± 0,71 gramas Tabela 32 Distribuição de Atividade em 24 Horas em Seguida à Injeção I.V. de 90Y-2B8-MX-DTA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 3 Peso médio = 22,09 gramas ± 1,73 gramas Tabela 33 Distribuição de Atividade em 48 Horas Em Seguida à Injeção I.V. de 90Y-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 3 Peso médio = 21,48 gramas ± 2,05 gramas Tabela 34 Distribuição de Atividade em 72 Horas Em Seguida à Injeção I.V. de 90Y-2B8-MX-DTPA em Camundongos BALB/c Normais Valores médios ± DP

No. de camundongos = 3 Peso médio = 20,76 gramas ± 0,97 gramas 4. Dosimetria As doses absorvidas de radiação para um ser humano "padrão" de 70 kg calculadas para o conjugado 90Y-marcado usando-se os dados de biodistribuição de camundongos (valores de %ID/órgãos nas Tabelas 31-34) são apresentados na Tabela 35. Esses resultados são comparáveis aos resultados obtidos previamente usando-se 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado preparado usando-se o método de radiomarcação por HPLC.

Tabela 35 Estimativas da Dosimetria de Radiação Resultantes da administração de 2B8-MX-DTPA ítrio-[90]-marcado Uniformemente Distribuído a um Homem Padrão (70 kg) e Baseado sobre os Dados de distribuição em Animais 72 Horas Após Injeção Ref.: Esquema para Cálculo da Dose Absorvida para Radionuclídeos Biologicamente Distribuídos, MIRD, J. Of Nucl. Med./Suplemento #1, 2/68 Cálculos Realizados Usando-se um Modelo de Folha de Dados em Symphony (Lotus Development Corporation) e Criado por Phillip L. Ha-gan, MS, Nuclear Medicine Service, VA Hospital, San Diego, CA 92161.

5. Validação do Protocolo para o Preparo de Doses Clínicas de Ítrio-Í90í-2B8-MX-DTPA

Um total de dez lotes de validação foi preparado no MPI Phar-macy Services, Inc. Os resultados da testagem de cada lote são resumidos na Tabela 36. O valor médio para cada resultado de teste foi calculado e os desvios padrões observados, onde apropriado. Para avaliar a variabilidade do processo devido a diferentes tempos de marcação, os lotes #1 a #8 foram preparados usando-se um tempo de marcação de 10 minutos; os lotes #9 e #10 foram preparados usando-se um tempo de reação de 5 minutos. Baseado sobre os resultados dos testes para os dez lotes de validação, especificações para liberação foram estabelecidas. As especificações para liberação são resumidas na Tabela 37.

Tabela 36 Resultados do Ensaio para os Dez Lotes de Validação de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado Preparado Usando-se "Mistura & Desenvolvimento" Tabela 37 Especificações de Liberação para 2B8-MX-DTPA S0Y-marcado Preparado Usando-se o Protocolo "Mistura & Desenvolvimento" Teste__________________Especificação_____________Método Imunorreatividade >60% RIA

Endotoxina < 5 EU/ml LAL

Incorporação de radíomarcação > 90% ITLC

Concentração de anticorpo 0,075-0,150 mg/m! A28o Concentração de radioatividade1 > 6,0 mCi/ml Calibração de dose Atividade específica1 > 9,0 mCi/mg de anticorpo A28o/calibração de dose Radioatividade total no frasco1 > 6,0 mCi Calibração de dose pH 6,0-8,0 Papel de pH

Concentração total de proteínas 65-85 mg/ml A280 Testagem de esterilização passes CFR 610.12 1 (calibração em tempo zero) D. Discussão O protocolo original de radíomarcação para o preparo de 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado utilizava uma etapa de purificação por HPLC particularmente trabalhosa e que consome tempo para a remoção do 90Y ligado a não proteína do preparado. De forma a simplificar esse processo e torná-lo mais passível ao uso no local clínico, esforços foram dirigidos para a eliminação da etapa de HPLC em favor daquilo que foi denominado um protocolo de "mistura & desenvolvimento". A meta era identificar condições de radio-marcação as quais resultariam em uma radioincorporação muito alta do isó-topo no conjugado, dessa forma, eliminando a necessidade da etapa de purificação. Descobriu-se que uma radioincorporação > 95% podería ser obtida em um pH de 3,6 com uma incubação de cinco a dez minutos. Um benefício adicional desse protocolo foi a retenção aumentada da imunorreatividade (> 70%), presumivelmente devido ao tempo mais curto de exposição do anticorpo ao radioisótopo de alta energia antes de adição de albumina de soro humano, a qual proporciona proteção contra radiólise. Essa retenção da i-munorreatividade é superior àquela previamente observada usando-se o método de HPLC.

Estudos de estabilidade com o conjugado 90Y-marcado preparado usando-se o protocolo de "mistura & desenvolvimento" incubado em formulação tampão (1X PBS contendo 75 mg/mL de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM) por até 48 horas a 4 °C não mostrou perda de radioisótopo e retenção completa da imunorreatividade. Estudos de estabilidade conduzidos com soro humano durante 72 horas a 37 °C também indicaram perda mínima do radioisótopo. Esses resultados de estabilidade são comparáveis àqueles previamente observados com o conjugado radiomarcado usando-se o protocolo de HPLC. A biodistribuição em camundongos BALB/c usando-se o conjugado 90Y-marcado preparado pelo método de "mistura e desenvolvimento" não indicou depósito incomum nos tecidos. Esses resultados sugerem que o anticorpo radiomarcado não foi significativamente alterado de modo a afetar dramaticamente as características in vitro do anticorpo. Também, esses resultados são comparáveis àqueles obtidos previamente com o conjugado radiomarcado preparado usando-se o método de HPLC de radiomarcação (veja BB-IND 4850/4851).

As estimativas de dosimetria para um ser humano "padrão" de 70 kg calculadas a partir dos dados de biodistribuição para camundongos estão em concordância com aqueles obtidos com o conjugado radiomarcado usando-se o procedimento de HPLC (veja BB-IND 4850/4851). Adicionalmente, os resultados de dosimetria são comparáveis aos resultados obtidos para pacientes envolvidos em um experimento clínico em andamento (estudo IDEC #1315), quando comparado por milicurie de dose injetada. Para seis pacientes no estudo, os valores médios (rads ± DP) para o corpo todo, coração, fígado e baço eram de 1,40 ±0,57, 10,50 ±4,68, 9,89 ±8,91 e 9,75 ± 6,00, respecfivamente.

Antes de implementação do protocolo de marcação por "mistura & desenvolvimento" para o preparo de 90Y-2B8-MX-DTPA de grau clínico, foi necessário avaliar a reprodutibilidade do protocolo. Portanto, dez lotes de validação foram preparados usando-se diferentes lotes de cloreto de 90Y. Para os dez lotes preparados, os valores de imunorreatividade obtidos u-sando-se o método de "mistura & desenvolvimento" estavam na faixa de 60,6% a 93,3% com uma média de 74,5% e uma média de 72,1%. Essa retenção da imunorreatividade é significativamente melhor do que os aproximadamente 60% previamente obtidos usando-se o método corrente de H-PLC (faixa de 54,9% a 65,1%; média de 60,2%). A radioincorporação média para os dez lotes era de 95,7% (média de 93,5% a 97,5%). Esse valor é comparável àquele previamente observado com o método de HPLC (faixa de 91,7% a 93,7% e uma média de 93,1%). Também, os resultados para endo-toxina, concentração de anticorpo, concentração de radioatividade, atividade específica, radioatividade total no frasco, concentração total de proteínas, pH e esterilidade eram comparáveis para os dez lotes. Juntos, esses resultados confirmaram a reprodutibilidade do método de "mistura & desenvolvimento". Além disso, avaliou-se a variabilidade do processo devido aos diferentes tempos de marcação realizando reações durante 5 e 10 minutos. Uma vez que não existem diferenças significativas observadas entre os dois tempos de reação, foi decidido que o tempo de incubação mais curto seria usado no protocolo final. E. Sumário Desenvolveu-se um procedimento de marcação referido como o método de "mistura e desenvolvimento" para o preparo de doses clínicas de 2B8-MX-DTPA 9aY-marcado que elimina a necessidade da etapa cromato-gráfica de ííqüido de alto desempenho correntemente usada (HPLC) para remoção de radioisótopo ligado a não proteína. O protocolo simplificado elimina essa etapa trabalhosa de purificação ao mesmo tempo em que mantém um alto nível de incorporação de radioisótopo (> 95%) e retenção aper- feiçoada de imunorreatividade (> 70%). Verificou-se que o conjugado radio-marcado ciinicamente formulado era estável in vitro quando incubado a 4 °C durante 48 horas, baseado sobre a retenção de radioisótopo e imunorreatividade. Adicionalmente, o conjugado radiomarcado era estável quando incubado em soro humano a 37 °C durante 72 horas. Estudos de biodistribuição em camundongos BALB/c não demonstraram depósitos incomuns nos tecidos, incluindo o osso. As estimativas das doses de radiação absorvida por um ser humano "padrão" de 70 kg eram comparáveis àquelas obtidas em um experimento clínico em andamento usando-se 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado. Os resultados desses estudos mostraram que o 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado produzido usando-se o protocolo de "mistura & desenvolvimento" era comparável àquele preparado usando-se o processo convencional de HPLC. A validação do protocolo em escala para o preparo de conjugado radiomarcado de grau clínico mostrou que o método era reproduzível e que o produto era comparável àquele produzido usando-se o método corrente de HPLC. Os resultados desses estudos pré-clínicos indicam que esse novo protocolo de "mistura & desenvolvimento" pode ser usado para preparar 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado adequado para uso em experimentos clínicos. Descrição Detalhada das Concretizações Específicas Exemplo 1. Radioincorporação - Kits e Ensaios I. Sumário Um objetivo da presente invenção era o de projetar protocolos para um kit de radiomarcação para o preparo de 2B8-MX-DTPA 111 In e 90Y-marcado (ln2B8 e Y2B8, respectivamente) e estabelecer as especificações de liberação para produtos clínicos. Os protocolos do kit de radiomarcação são reproduzíveis com relação à radioincorporação e ligação a células SB antígeno-positivas e indicam a adequabilidade do kit de radiomarcação para uso em experimentos clínicos. É recomendado que as especificações de liberação do ln2B8 e Y2B8 para radioincorporação e ligação sejam estabelecidos a > 95% e > 70%, respectivamente. II. Introdução Um anticorpo anti-CD20 monoclonal de murino 90Y-marcado (Υ2Β8) está, atualmente, sendo avaliado em experimentos clínicos para o tratamento de linfomas reincidente de células B. O isótopo de ítrio carece de um componente gama o que o torna inadequado para sistemas de formação de imagens. Portanto, o 2B8-MX-DTPA 111ln-marcado (ln2B8) será usado para avaliar a localização de tumor e dosimetria em pacientes antes ou após tratamento com o terapêutico ítrio-marcado. Os protocolos usados atualmente para o preparo de Y2B8 e ln2B8, referidos como métodos de "mistura-&-desenvolvimenío", produzem anticorpos radiomarcados adequados para estudos clínicos. Contudo, a simplificação do processo de marcação facilitaria o preparo de doses em um ambiente clínico. O novo kit para radiomarcação é, de preferência, compreendido de quatro componentes: 1) 2B8-MX-DTPA em solução salina normal com baixo teor de metais a 2 mg/mL, 2) acetato de sódio a 50 mM usado para ajustar a solução de radioisótopo para um pH apropriado de marcação; 3) formulação tampão {1X PBS, pH de 7,4 contendo 7,5% de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM), 4) um frasco de vidro vazio de 10 mL (frasco de reação). Todos os componentes são testados como sendo estéreis e isentos de pirogênio.

Esse relatório resume a validação desse kit de radiomarcação, o qual é simples e fácil de usar e proporciona anticorpos radiomarcados com > 95% de radioincorporação e retenção aceitável da ligação às células antíge-no-positivas. As especificações quanto à testagem para liberação são recomendadas para os produtos clínicos. III. Materiais e Métodos para Radioincorporação A. Reagentes no Kit de Radiomarcação 1. 2B8-MX-DTPA, IDEC; Lote # 082395RM2 2. Acetato de sódio a 50 mM, baixo teor de metais, IDEC; Lote # 082395RM3 3. Formulação Tampão (1X PBS, pH de 7,4 contendo 7,5% (p/v) de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM), IDEC, Lote # 082395RM1 4. Frasco de reação, 10 mL, IDEC B. Materiais e Equipamento 1. Kit de Radioincorporação Biodex Tec-Control, Cat. # 151-770 2. Luvas: isenta de poeira 3. Seringas estéreis de polipropileno 4. Agulhas estéreis para seringa 5. Tubos pequenos com vedação, 1,5 ml C. Métodos 1 Preparo de Y2B8 e ln2B8 Usando-se o Kit de Radiomarcacão Os reagentes no kit foram preparados e enchidos em frascos de vidro com um septo. Frascos de boro-silicato do Tipo I (2 ou 10 mL) foram enxaguados com água estéril para injeção (WFI) e submetidos à autoclave antes de enchimento. Os septos de borracha de butila foram enxaguados com WFI estéril e submetidos à autoclave antes do uso. Os reagentes foram manualmente enchidos e fechados em uma área Class 100 e testados com relação à pirogenicidade e esterilidade usando-se métodos USP. a. Preparação do in2B8 Reagentes adicionais: 1. Sal de cloreto de índio-[111], isento de veículo, em HCI. Precauções: 1. Todas as etapas são, de preferência, realizadas usando-se uma técnica asséptica. 2. Os componentes do kit de radiomarcação deverão estar em temperatura ambiente antes do uso. 3. O produto final deverá ser administrado a um paciente dentro de 8 horas após finalização da etapa 9 abaixo.

Protocolo para Radiomarcacão de ln2B8 Procedimento 1. O volume de 111lnCl3 a ser adicionado ao frasco de reação foi calculado como segue: a. Concentração de radioatividade no momento de radiomarcação em mCi/ml: C0 = Concentração de radioatividade no momento de calibração (veja Certificado de Análise do fabricante) At = Alteração no tempo (um número positivo é pós-calibração, um número negativo é pré-calibração) Concentração de radioativade no momento de marcação = b. Volume de 111lnCI3 a ser adicionado ao frasco de reação: = Volume a ser adicionado ao frasco de reação 2. O volume de acetato de sódio a 50 mM a ser adicionado ao frasco de reação foi calculado como segue: Volume de 111 lnCI3 adicionado (Etapa 1b) X (1,2) = Volume de acetato de sódio a 50 mM a ser adicionado. 3. O septo do frasco de reação e do frasco com acetato de sódio a 50 mM foram limpos com álcool. Usando-se uma seringa de 1 cm3, o volume calculado de acetato de sódio a 50 mM (Etapa 2) foi transferido para o frasco de reação. 4. O septo da fonte de 111lnCI3 foi limpo com álcool. O frasco foi perfurado com uma agulha adaptada com um filtro estéril de 0,2 μηι. Usan-do-se uma seringa estéril de 1 cm3, o volume requerido (Etapa 1b) de 111 lnCI3 foi transferido para o frasco de reação. O frasco foi misturado invertendo-se o mesmo várias vezes. 5. O septo do frasco de 2B8-MX-DTPA foi limpo com álcool. U-sando-se uma seringa de 1 cc, 1,0 m!_ de 2B8-MX-DTPA foi lentamente transferido para o frasco de reação. O frasco foi misturado invertendo-se o mesmo várias vezes. 6. A reação foi deixada processar durante 30 minutos ± 5 minutos em temperatura ambiente. 7. O volume total da mistura de reação foi calculado somando-se o volume de 111 lnCI3 (Etapa 4), o volume de acetato de sódio a 50 mM adicionado (Etapa 3) e o volume de 2B8-MX-DTPA adicionado (Etapa 5). 8. O volume de Formulação Tampão a ser adicionado ao Frasco de Reação para se obter um volume final de 10 mL foi calculado subtraindo-se a quantidade total calculada na etapa 7 de 10. 9. O frasco com Formulação Tampão foi limpo com álcool e o frasco foi perfurado. Devido à viscosidade da Formulação Tampão, o frasco de reação foi perfurado usando-se uma agulha adaptada com um filtro para seringa de 0,2 μιτι. Usando-se uma seringa estéril de 10 cm3 adaptada com uma agulha de calibre apropriado, o volume de Formulação Tampão calculado na Etapa 8 foi transferido para o frasco de reação. A agulha de perfuração foi removida do frasco de reação e o frasco foi misturado invertendo-se o mesmo várias vezes (Produto Final). Esse frasco foi incubado pelo menos 5 minutos antes de se fazer o "Ensaio de Radioincorporação". A cor da solução era ambar e o frasco estava completo, confirmando que a Formulação Tampão foi adicionada. 10. A radioatividade total no frasco com o Produto Final foi medida usando-se o conjunto de instrumentação apropriada para medição de 111ln. 11.0 Produto Final foi armazenado imediatamente a 2o - 8 °C para "Ensaio de Ligação" e "Ensaio de Radioincorporação". b. Preparo de Y2B8 Reaqentes adicionais: 1. Sal de cloreto de íírio-[90]: isento de veículo, em HCI. Precauções: 1. Todas as etapas são, de preferência, realizadas usando-se uma técnica asséptica. 2. Os componentes do kit de radiomarcação deverão estar em temperatura ambiente antes do uso. 3. O produto final deverá ser administrado a um paciente dentro de 8 horas após finalização da etapa 8 abaixo.

Protocolo para Radiomarcação de Y2B8 Procedimento 1. O volume de 90YCl3 a ser adicionado ao frasco de reação foi calculado como segue: a. Concentração de radioatividade no momento de radiomarca-ção: Co = Concentração de radioatividade no momento de calibração (veja Certificado de Análise do fabricante) Δΐ = Alteração no tempo (um número positivo é pós-caíibração, um número negativo é pré-calibração) Concentração de radioativade no momento de marcação = b. Volume de 90YCl3 a ser adicionado ao frasco de reação: = Volume a ser adicionado ao frasco de reação 2. O volume de acetato de sódio a 50 mM a ser adicionado ao frasco de reação foi calculado como segue: a. Para 90YCI3 em HCI a 0,040 M (Amersham): Volume de 90YCI3 (Etapa 1b) X (0,8) = Volume de acetato de sódio a ser adicionado. b. Para 90YCI3 em HCI a 0,050 M (Nordion): Volume de 90YCI3 (Etapa 1b) X (1,0) = Volume de acetato de sódio a ser adicionado. 3. O sepio do frasco de reação e do frasco com acetato de sódio foram limpos com álcool. Usando-se uma seringa de 1 cm3, o volume calculado (Etapa 1a ou 1b) de acetato de sódio a 50 mM (Etapa 2) foi transferido para o frasco de reação. O frasco foi misturado invertendo-se o mesmo várias vezes. 4. O septo da fonte de 90YCI3 foi limpo com álcool. O frasco foi perfurado com uma agulha adaptada com um filtro estéril de 0,2 μιτι. Usando-se uma seringa estéril de 1 cm3, o volume requerido (Etapa 1 b) de 90YCI3 foi transferido para o frasco de reação. O frasco foi misturado invertendo-se o mesmo várias vezes. 5. O septo do frasco de 2B8-MX-DTPA foi limpo com álcool. U-sando-se uma seringa de 3 cm3,1,5 mL de 2B8-MX-DTPA foram lentamente transferidos para o frasco de reação. O frasco foi misturado invertendo-se o mesmo várias vezes. 6. O volume total da mistura de reação foi calculado somando-se o volume de cloreto de Y-90 adicionado (Etapa 4), mais a quantidade de acetato de sódio a 50 mM adicionado (Etapa 3), mais a quantidade de 2B8-MX-DTPA adicionado (Etapa 5). 7. O volume de Formulação Tampão a ser adicionado ao Frasco de Reação para se obter um volume final de 10 mL foi calculado subtraindo-se a quantidade total calculada na etapa 6 de 10. 8. O frasco com Formulação Tampão foi limpo com álcool e o frasco foi perfurado. Devido à viscosidade da Formulação Tampão, o frasco de reação foi perfurado usando-se uma agulha adaptada com um filtro para seringa de 0,2 pm. Usando-se uma seringa estéril de 10 cm3 adaptada com uma agulha de calibre apropriado, o volume de Formulação Tampão calculado na Etapa 7 foi transferido para o frasco de reação. A agulha de perfuração foi removida do frasco de reação e o frasco foi misturado invertendo-se o mesmo várias vezes (Produto Final). O frasco foi incubado pelo menos 5 minutos antes de se fazer o "Ensaio de Radioincorporação". A cor da solução era ambar e o frasco estava completo, confirmando que a Formulação Tampão foi adicionada. 9. A radioatividade total no frasco com o Produto Final foi medida usando-se o conjunto de instrumentação apropriada para medição de 90Y. 10. O Produto Final foi armazenado imediatamente a 2° - 8°C até ser requerido para administração ao paciente. 11. Testagem da imunorreatividade: Usando-se uma seringa de 1 mL, 0,1 mL foi assepticamente removido do frasco de reação e transferido para um tubo com tampa de rosca de 1,5 mL distinto. O tubo foi imediatamente armazenado a 2o - 8 °C para "Ensaio de Ligação" e "Ensaio de Radioincorporação". A validação dos protocolos do kit para radiomarcação foi realizada na IDEC Pharmaceuticais (San Diego, CA), MD Anderson Health Center (Houston, TX), Mayo Clinic (Rochester, MN) e City of Hope (Duarte, CA).

Todos os componentes do kit, incluindo 2B8-MX-DTPA de grau clínico, foram preparados pela IDEC Pharmaceuticals sob condições de GMP (Good Manufacturing Conditions de acordo com o Code of Federal Regulations) e determinados como sendo estéreis e isentos de pirogênio.

Os anticorpos radiomarcados foram formulados com 1X PBS contendo 7,5% (p/v) de albumina de soro humano (HSA; grau ciínico; Bax-ter-Hyland) e DTPA a 1 mM. Os resultados dos testes de liberação realizados em cada lote de validação são descritos abaixo.

Seis lotes de validação de cada um de ln2B8 e Y2B8 foram preparados por cinco operadores. Esses lotes foram designados como segue e realizados nas seguintes instalações: ln2B8: #1: IDEC Pharmaceuticals #2: IDEC Pharmaceuticals #3: IDEC Pharmaceuticals #4: MD Anderson Health Center #5: Mayo Clinic #6: City of Hope Y2B8: #1: IDEC Pharmaceuticals #2: IDEC Pharmaceuticals #3: IDEC Pharmaceuticals #4: MD Anderson Health Center #5: Mayo Clinic #6: City of Hope 2. Preparo de Células SB e HSB Liofílizadas As linhas de células humanas SB (CD20-positivas) e HSB (CD20-negativas) foram obtidas da American Type Culture Collection e cultivadas em frascos-T usando-se RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal suplementado com 2% de glutamina. As culturas foram mantidas a 37 °C e 5% de C02. As células foram, tipicamente, divididas a 1:2 no dia seguinte e coletadas a 0,5-2,5 x 106 células/mL e sua viabilidade era de > 80%.

As concentrações de células foram determinadas usando-se um hemacitô-metro e a viabilidade determinada através de exclusão por azul de tripano.

As células foram coletadas em temperatura ambiente em uma densidade de células de 0,5-2 X 106 células/mL através de centrifugação (1300 rpm em uma centrífuga Sorvall) e lavadas duas vezes com 1X HBSS. As células empelotadas foram ressuspensas a 50 x 106 células/mL em 1X HBSS contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) e 10% (p/v) de manitol (tampão de liofilízação), 0,5 ml_ distribuídos em tubos de polipropile-no para microcentrífuga de 1,5 mL com gaxetas de anel em o e armazenadas a -70 °C e liofilizadas durante a noite a 30 - 60 militorr. Tubos de células liofilizadas foram armazenados secos a 2 - 8 °C e reconstituídos em água estéril para ensaios; os tubos de células liofilizadas em tubos para microcentrífuga foram armazenados com um díssecante. 3. Ensaios Analíticos Os métodos analíticos usados para testar os lotes de validação de ln2B8 e Y2B8 são descritos abaixo. Os ensaios a seguir foram realizados para cada lote de validação: 1. Ensaio de Ligação usando-se células SB liofilizadas 2. Ensaio de Radioincorporação de Y2B8/ln2B8 usando-se o Kit Biodex a. Ensaios de Ligação A ligação percentual foi avaliada por cada operador usando-se células SB CD20 positivas liofilizadas de acordo com os protocolos a seguir para ln2B8 e Y2B8, respectivameníe. Esses ensaios proporcionam um método rápido e eficiente para confirmar se o anticorpo radiomarcado ainda reconhece CD20 como um antígeno. Em um local clínico, células HSB CD20-negativas também foram avaliadas. As células liofilizadas foram preparadas e armazenadas de acordo com o método acima, "Preparo de Células SB e HSB Liofilizadas". i. Ensaio de Ligação de ln2B8 Reaqentes adicionais: 1. índio-[111]-2B8-MX-DTPA 2. Células SB liofilizadas; três tubos contendo 25 X 106 célu- las/tubo. 3. Células HSB liofilizadas; três tubos contendo 25 X 106 célu- las/tubo. 4. Água estéril para irrigação ou água estéril para injeção. 5. Tampão de diluição (1X PBS, pH de 7,2-7,4 contendo 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) e 0,02% de Azida de Sódio, filtrado a 0,2 μιη e armazenado em temperatura ambiente). 6. Tubos plásticos ou de vidro de teste para contagem da radioatividade.

Procedimento: Setup para o ensaio (porção não radioativa) 1. Três tubos de células SB e HSB liofilizadas foram obtidos. 2. Um volume de 0,50 mL de SWFI (água estéril para injeção) foi adicionado a cada tubo e os tubos foram submetidos a vórtice até que suspensões homogêneas fossem obtidas. 3. Quatro tubos vazios de 1,5 mL para microcentrífuga. A três dos tubos, 0,50 mL de tampão de diluição foram adicionados, representando um controle sem células. 4. Ao outro tubo de 1,5 mL para microcentrífuga, 0,99 mL de tampão de diluição foram adicionados; esse tubo foi marcado a 1:100. 5. Um tubo estéril de polipropileno de 50 mL com tampa foi obtido e 10 mL de tampão de diluição foram adicionados ao tubo.

Setup para o ensaio (porção radioativa) 1. O anticorpo radiomarcado armazenado a 2o - 8 °C foi obtido. 2. Um volume de 0,01 mL foi retirado com uma P20 e adicionado ao tubo para microcentrífuga de 1,5 mL contendo 0,99 mL de tampão de diluição (diluição a 1:100). A ponta foi enxaguada e o tubo ligeiramente submetido à vórtice para misturar. 3. Um volume de 0,20 mL foi retirado com uma P200 do tubo com diluição a 1:100 e adicionado ao tubo cônico contendo 10 mL de tampão de diluição. O tubo foi completamente misturado.

Protocolo de ensaio 1. Um volume de 0,50 mL do 111ln2B8-MX-DTPA diluído foi adicionado a todos os tubos. 2. As tampas foram firmemente presas sobre todos os tubos e os tubos misturados continuamente durante 60 minutos. 3. Após 60 minutos de incubação em temperatura ambiente, todos os tubos foram centrifugados durante 5 minutos no mínimo de 2000 g. 4. Um volume de 0,75 mL de cada sobrenadante foi transferido para tubos apropriados para contagem com um instrumento. 5. A radioatividade nos tubos foi contada usando-se um contador gama, ajustado para a base. ii. Ensaio de Ligação de Y2B8 Reaqentes adicionais: 1.90Y2B8-MX-DTPA 2. Células SB liofilizadas. 3. Água estéril para irrigação ou água estéril para injeção. 4. Tampão de diluição (1X PBS, pH de 7,2-7,4 contendo 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) e 0,02% de Azida de Sódio).

Procedimento: Preparação da amostra do anticorpo radiomarcado 1. O anticorpo radiomarcado armazenado a 2o - 8 °C foi obtido. 2. Um volume de 10 pL foi retirado com uma P20 e adicionado ao tubo para microcentrífuga de 1,5 mL contendo 990 pL de tampão de diluição (diluição a 1:100). A ponta foi enxaguada e o tubo foi ligeiramente submetido à vórtice. 3. Um tubo estéril de polipropileno de 50 mL com tampa foi obtido e 10 mL de tampão de diluição adicionados ao tubo, usando-se uma pipe-ta sorológica de 10 mL. 4. Um volume de 35 pL foi retirado com uma P20 do tubo com diluição a 1:100 e adicionado ao tubo cônico contendo 10 mL de tampão de diluição. Misturar completamente.

Preparação de Células Liofilizadas 1. Três tubos de células SB liofilizadas foram obtidos. 2. Um volume de 0,5 ml_ de SWFI foi adicionado a cada tubo e os tubos foram submetidos a vórtice até que suspensões uniformes de células fosses obtidas. 3. Três tubos vazios de 1,5 mL para microcentrífuga foram obtidos; aos três tubos, 0,5 mL de tampão de diluição foram adicionados, representando um controle sem células.

Protocolo de Ensaio 1. Um volume de 0,5 mL do 90Y2B8-MX-DTPA diluído foi adicionado a cada tubo. 2. Os tubos foram colocados sobre um misturador durante 45 minutos, após certificar-se que as tampas estavam firmemente presas. 3. Após 45 minutos de incubação em temperatura ambiente, as células foram peletizadas através de microcentrifugação durante 5 minutos. 4. Um volume de 0,8 mL do sobrenadante foi transferido para frascos de cintilação. 5. O coquetel de cintilação foi adicionado a cada frasco. 6. A quantidade de radioatividade em cada frasco foi determinada usando-se um contador de cintilação, ajustando-se para a base. b. Ensaio de radioincorporacão O percentual de radioincorporação foi determinado por cromato-grafia em camada fina instantânea (ITLC) usando-se o Kit Radiocromatográ-fico Biodex Tec-Control de acordo com o seguinte protocolo: Materiais e Equipamento Adicionais: 1. 2B8-MX-DTPA111 In- ou 90Y-marcado 2. Tubos para contagem de tiras radioativas por TLC 3. Tesouras 4. Seringa estéril, 1 cc 5. Agulhas estéreis, 26G 6. Contador gama ou contador de cintilação 7. Pipetas Procedimento: 1. Todo o Manual de Operação da Biodex deverá ser lido primeiro. 2. Cada amostra radiomarcada foi testada três vezes de acordo com as instruções no kit; uma tira por frasco foi desenvolvida. 3. Para corar a amostra radiomarcada sobre a tira de cromato-grafia, uma pipeta foi usada para colocar 1 μΙ sobre a linha original. Alternativamente, uma pequena gota distribuída com uma agulha de 26G presa a uma seringa estéril de 1 cc pode ser usada. 4. Cada seção foi contada com relação à atividade usando-se o contador apropriado, isto é, contador gama para 111 In e um contador de cinti-lação para 90Y, ajustados para a base. 5. As instruções da Biodex para cálculo do percentual de anticorpo radiomarcado foram seguidas. IV. Resultados Os resultados da testagem de cada lote de validação de ln2B8 ou Y2B8 são resumidos nas Tabelas 38 e 39.

Tabela 38 Resultados do Ensaio de Liberação para Validação de Y2B8 Média = 98,8 Média = 82,3 Desvio padrão = 1,24 Desvio padrão = 3,4 % de CV = 1,25% CV = 4,2% Tabela 39 Resultados do Ensaio de Liberação para Lotes de Validação de !n2B8 Média = 99,0 Média = 85,2 Desvio padrão = 0,43 Desvio padrão = 2,06 % de CV = 0,45% CV = 2,42% V. Discussão e Conclusões Para simplificar os métodos atuais de radiomarcação de ln2B8 e Y2B8, um kit com quatro componentes foi desenvolvido. As concentrações de acetato de sódio e 2B8-MX-DTPA foram reduzidas para 50 mM e 2 mg/mL, respectivamente, a fim de permitir transferência dos volumes precisos usando-se seringas. Todos os componentes do kit foram, de preferência, enchidos em frascos de vidro com septo e testados com relação à esterilidade e pirogenicidade pela IDEC antes de liberação, assim, eliminando a necessidade de que esses testes sejam realizados nos locais clínicos. No local, todas as manipulações dos reagentes são realizadas usando-se seringas e agulhas estéreis. Portanto, a adesão à técnica asséptica comumente encontrada em um ambiente de radiofarmácia assegura que os anticorpos radio-marcados e formulados são adequados para administração ao paciente. A reprodutibilidade e os critérios dos protocolos de radiomarcação para o in2B8 e Y2B8 foram avaliados realizando-se várias operações de validação usando-se diferentes lotes de cada radioisótopo. Para os seis lotes de validação de ln2B8 preparados, a ligação oscilou de 82,1% a 86,8% com uma média de 85,1%; os valores de radioincorporação eram de aproximadamente 99% (faixa de 98,3% a 99,4%). Para os seis lotes de validação de Y2B8 preparados, a ligação percentual obtida estava na faixa de 78,6% a 87,0%, com uma média de 82,3%. Os valores de radioincorporação para o Y2B8 oscilavam de 98,8% (média de 96,3% a 99,5%). Juntos, esses resul- tados confirmam a reprodutibilidade e criteriosidade dos métodos do kit de radiomarcação para a preparação de ln2B8 e Y2B8. Baseado nesses resultados de validação, recomenda-se que as especificações de liberação no que se refere à radioincorporação e ligação sejam estabelecidas a > 95% e > 70%, respectivamente, para o !n2B8 e Y2B8.

Adicionalmente, em virtude da facilidade de uso aumentada e do potencial reduzido de erros durante a preparação, é recomendado que a ligação percentual usando-se células CD20-positivas liofilizadas e a radioincorporação sejam usadas para o teste de liberação de ln2B8 e Y2B8 nos locais clínicos.

Em resumo, esses resultados juntos indicam que o ln2B8 e Y2B8 preparados usando-se o kit de radiomarcação são adequados para uso no ambiente clínico. Adicionalmente, para ambos os anticorpos radio-marcados, especificações de liberação são estabelecidas, refletindo os resultados de muitas operações de validação por cinco operadores diferentes. Exemplo 2. Radioincorporação e Ligação - Kits e Ensaios I. Sumário O anticorpo monocional antí-CD20 de murino designado 2B8 foi clonado em células CHO a fim de proporcionar uma linha de células de elevada expressão. A especificidade do anticorpo CHO-derivado com relação às células humanas CD20-positivas foi demonstrada através de análise por FACS e ligação competitiva. Ligação negligenciável às células humanas foi observada. A afinidade do anticorpo por células CD20-positivas foi determinada como sendo de 1,3 X 10'10 M usando-se um ensaio de ligação competitiva. O anticorpo foi reagido com o agente de quelação MX-DTPA a fim de formar um conjugado, 2B8-MX-DTPA, com perda negligenciável de imunor-reatividade (o valor de afinidade era de 4,4 X 10'10 M). Conjugação ótima do quelante, conforme determinado através de medição da radioincorporação de In, foi obtida após oito horas de reação. Os protocolos de radiomarca-ção para 2B8-MX-DTPA foram otimizados para 90Y ou 111ln com relação ao pH e tempo de incubação a fim de assegurar radioincorporação máxima (> 95%) e retenção da imunorreatividade (> 70%). As especificações de libera- ção do ln2B8 e Y2B8 preparados usando-se 2B8-MX-DTPA CHO-derivado em experimentos clínicos foram recomendadas para radioincorporação (> 95%) e ligação a células CD20-positivas humanas íiofilizadas e reconstituídas (> 70%). Tomados juntos, esses resultados indicam a adequabilidade do 2B8-MX-DTPA CHO-derivado para uso em experimentos clínicos. II. Introdução O anticorpo 2B8 previamente usado foi produzido em biorreato-res de fibra oca. Para reduzir os custos de fabricação do anticorpo, ele foi clonado e expresso em células CHO a fim de proporcionar uma linha de células de produção de elevada expressão. Esse exemplo descreve os resultados da caracterização in vitro do anticorpo 2B8 CHO-derivado, do anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA) e dos produtos de anticorpo 90Y e 111 ln-marcado preparados usando-se os protocolos do kit para radiomarcação clínica. III. Materiais e Métodos A. Reaqentes As linhas de células humanas SB (CD20-positivas) e HSB (CD20-negativas) foram obtidas da American Type Culture Collection e cultivadas em frascos em T usando-se RPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal suplementado com 2% de glutamina. As culturas foram mantidas a 37 °C e 5% de C02. As células foram, tipicamente, divididas a 1:2 a cada dia e coletadas a 0,5-2,5 x 106 células/mL e uma viabilidade de > 80%. As concentrações de células foram determinadas usando-se um hemacitômetro e a viabilidade determinada através de exclusão por azul de tripano. A informação específica sobre os lotes de células é registrada no Notebook N° 1553 e no anexo intitulado "Cell Activity Logbook 1995 & 1996", de autoria de Ron Morena. 2B8 CHO-derivado foi produzido sob condições GMP na unidade de fabricação da IDEC. O anticorpo foi formulado em solução salina normal com baixo teor de metais a 11,5 mg/ml. Os anticorpos foram determinados como sendo homogêneos através de SDS-PAGE. 2B8-MX-DTPA foi produzido sob condições GMP de acordo com PSBR-043 a partir de 2B8 CHO- derivado e formulado em solução salina com baixo teor de metais a 2 mg/mL (LoteN0 0165A e 0165B).

Cloreto de 111ln de grau farmacêutico foi adquirido da Amersham (Reino Unido) ou Cyclotron Products Inc. (Cora! Gables, FL). Cloreto de í-trio[90] foi obtido da Amersham (Reino Unido), Nordion Internacional (Kanat-ta, Canadá) ou Pacific Northwest National Laboratory (Richland, WA). MX-DTPA preparado sob GMP foi obtido da Hauser Chemical (Boulder, CO). Ácido dietilenotriaminapentaacético tri-sódico de cálcio (DTPA) de grau clínico foi obtido da Heyl (Berlin, Alemanha). TAG-NHS foi obtido da IGEN Inc. (Rockville, MD). Glóbulos anti-CD19 de murino foram adquiridos da Dynal Inc. (Lake Success, NY). F(ab')2 FITC-marcado anticamundongo de cabra foi adquirido da Jackson ImmunoResearch.

Os reagentes que requeriam remoção de metais pesados con-taminantes foram tratados às bateladas com Chelex 100 (BioRad Industries) ou com Chelating Sepharose (Pharmacia) passando-se as soluções através de uma coluna. Soluções de estoque com baixo teor de metais foram diluídas com Água Estéril para Irrigação (SWFIr). As soluções foram armazenadas em recipientes plásticos estéreis.

Reagentes adicionais são descritos abaixo para os métodos específicos. B. Materiais e Equipamento 1. Analízador Origen; IGEN Inc. Modelo # 1100-1000; IDEC # 1492 2. Contador de cintilação Top-Count; Packard, Modelo #A9912; IDEC #1329 3. Contador gama; Isodata, Modelo # 20-10; IDEC # 0628 4. Kit Radiocromatográfico Tec-Control, Biodex, Modelo # 151-770 5. Liofilizador; Virtis, Modelo Freezemobile 12; IDEC # 0458 Materiais e equipamento adicionais são descritos com relação aos métodos específicos. C. Métodos 1. Preparação de Células SB e HSB Liofilizadas As células foram cultivadas conforme descrito acima e coletadas em temperatura ambiente em uma densidade de células de 0,5-2 X 106 céiu-las/mL através de centrifugação (1300 rpm em uma centrífuga Sorvall) e lavadas duas vezes com 1X HBSS. As células peletizadas foram ressuspen-sas a 50 x 106 células/mL em 1X HBSS contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) e 10% (p/v) de manitol (tampão de liofilização), 0,5 mL distribuídos em tubos de poliproprleno de 1,5 mL para microcentrífuga com gaxetas de anel em o e armazenadas a -70 °C e liofilizadas durante a noite a 30 - 60 militorr. Os tubos de células liofilizadas foram armazenados secos a 2 - 8 °C e reconstituídos em água estéril para os ensaios; os tubos de células liofilizados em tubos para microcentrífuga foram armazenados com um dissecante.

2. Ensaios de Ligação por FACS A ligação direta dos anticorpos às células B humanas foi determinada através de citometria de fluxo. Concentrações crescentes de anticorpo foram incubadas em 1X PBS, pH de 7,2 contendo 1% (p/v) de BSA (tampão de ligação) com 5 X 10s células CD20-positivas (SB) ou CD20-negativas (HSB) durante 30 minutos sobre gelo. As células foram lavadas através de centrifugação, ressuspensas em tampão de ligação e incubadas com F(ab')2 anticamundongo de cabra FITC-marcado durante 30 minutos sobre gelo. Após incubação com o reagente secundário, as células foram lavadas através de centrifugação e ressuspensas em 1X PBS contendo 1,1% (v/v) de formaldeído a fim de fixar as células. A intensidade média de fluorescência foi determinada usando-se citometria de fluxo. 3. Ensaios de Ligação Competitiva A imunorreatividade do 2B8 e 2B8-MX-DTPA foi determinada através de ligação competitiva às células SB CD20-positivas usando-se o método de eletroquimioluminescência da ORIGEN (Leland e Powell). Células SB em fase log foram coletadas da cultura e lavadas duas vezes com 1X HBSS. As células foram diluídas em 1X PBS, pH de 7,2 contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino. Em alguns experimentos, células liofiíizadas foram usadas após reconstituição com água estéril.

Anticorpo vestigial marcado com rutênio foi preparado através de incubação de 2B8 CHO-derivado (Lote # 165) em 1X PBS, pH de 7,2 com o quelante tris-bipiridina N-hidróxi-succinimida éster de rutênio (II) (TAG-NHS) em uma proporção molar a 15:1 de TAG-NHS para anticorpo. Após 1 hora de incubação em temperatura ambiente, protegida da luz, a reação foi resfriada com glicina durante 10 minutos. TAG não reagido foi removido através de cromatografia por exclusão de tamanho usando-se uma coluna Pharmacia PD-10 equilibrada com 1X PBS. A concentração de proteína foi determinada usando-se o ensaio de proteína de Bradford, A incorporação de TAG foi determinada através de medição da absorbância a 455 nm. A proporção molar de TAG para proteína foi calculada como sendo de 3,0.

Os ensaios foram realizados em tubos de polipropileno de 12 X 75 mm. Quantidades variadas de anticorpo de competição (0,002 - 17 ug/mL) foram incubadas em 1X PBS, pH de 7,2 contendo 1% (p/v) de BSA com 0,08 ug/mL de CHO 2B8 TAG-marcado, 0,08 mg/mL de glóbulos anti-CD19 e 167.000 células/mL. Após incubação em temperatura ambiente com mistura orbital durante 3 horas, a eletroquimioluminescência relativa (ECL) foi determinada usando-se o instrumento ORIGEN. Os valores médios de ECL foram determinados para amostras duplas e plotados vs. a concentração de anticorpo de competição usando-se o software Kaleidagraph. Para alguns experimentos, a inibição percentual foi plotada. As curvas de competição foram adaptadas e os valores de EC50 (concentração de anticorpo que proporciona ligação máxima de 50%) determinados usando-se o seguinte programa com 4 parâmetros: y = ({m[-m4)/(1+(mO/m3)Am2))+m4; ml =; m2 =; m3 =; m4 = mO = variável independente m1 = resposta de sinal zero em unidades de ECL relativa m2 = parâmetro de curvatura m3 = EC50 em ug/mL m4 = resposta de sinal máximo em unidades de ECL relativa Os valores médios de afinidade foram calculados a partir dos valores de EC50 e da concentração conhecida de anticorpo vestigial usando-se o método de Muller.

4. Preparação de 2B8-MX-DTPA O agente de quelação, ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminapentaacéíico (MX-DTPA) foi proporcionado como um pó seco (isento de ácido) e armazenado seco a -20° ou -70 °C. Aproximadamente 3 mg de anticorpo CHO 2B8 em solução salina normal com baixo teor de metais foram ajustados para um pH de 8,6 através da adição de um volume de um décimo de borato de sódio a 50 mM, pH de 8,6. Anticorpo a 10-11 mg/mL foi incubado em uma proporção molar a 4:1 de MX-DTPA para proteína através da adição de MX-DTPA dissolvido em borato de sódio a 50 mM, pH de 8,6. Após incubação em temperatura ambiente (2 a 24 horas), o quelante não reagido foi removido do conjugado através de diafiltração repetitiva em solução salina normal com baixo teor de metais usando-se filtros giratórios Centricon 30. 5. Preparação de ln2B8 e Y2B8 ln2B8 foi preparado usando-se o protocolo do kit de radiomarca-ção conforme descrito aqui. O anticorpo foi marcado em uma atividade específica de 3 mCi/mg e formulado a 0,2 mg/mL. Resumidamente, 0,5 a 2 mCi de cloreto de 111In foram transferidos para um tubo de microcentrífuga isento de metal e ajustados para um pH de aproximadamente 4,2 usando-se um volume de 1,2X de acetato de sódio a 50 mM com baixo teor de metais. 2B8-MX-DTPA a 2 mg/mL foi adicionado à solução de acetato de índio e, após incubação em temperatura ambiente durante 30 minutos, o anticorpo marcado foi formulado a 0,2 mg/mL usando-se 1X PBS, pH de 7,2 contendo 7,5% (p/v) de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM (concentração final de HSA de 4% a 6%). Todas as amostras foram testadas com relação à ra-dioincorporação três vezes; os valores foram de > 95%. Y2B8 também foi preparado usando-se uma versão em pequena escala do protocolo do kit de radiomarcação descrito no Exemplo 1. O anticorpo foi marcado em uma atividade específica de 15 mCi/mg e formulado a 0,3 mg/mL Resumidamente, 0,5 a 2 mCi de cloreto de 90Y foram transferidos para um tubo de microcentrífuga isento de metai e ajustados para um pH de aproximadamente 4,2 usando-se um volume de 1,2X de acetato de sódio a 50 mM com baixo teor de metais. 2B8-MX-DTPA a 2 mg/mL foi adicionado à solução de acetato de 90Y e, após incubação em temperatura ambiente durante 5 minutos, o anticorpo marcado foi formulado a 0,3 mg/mL usando-se 1X PBS, pH de 7,2 contendo 7,5% (p/v) de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM (concentração final de HSA de 4% a 6%). Todas as amostras foram testadas com relação à radioincorporação três vezes; os valores foram de > 95%.

As concentrações de radioatividade dos produtos radiomarcados finais foram calculadas baseado sobre a quantidade de radioatividade adicionada à mistura de reação e por referência ao Certificado de Análise do radioisótopo. A concentração de anticorpo das misturas de reação resfriadas foi calculada a partir da quantidade conhecida de anticorpo adicionado.

Para estudos da cinética de radiomarcação avaliando o efeito do pH sobre a radioincorporação e ligação, o pH das misturas de reação foi a-justado através da adição de quantidades variadas de acetato de sódio a 50 mM com baixo teor de metais (0,8 a 2,2X o volume da solução de radioisótopo). 6. Determinação da Radioincorporação com relação ao ln2B8 e Y2B8 A quantidade de radioatividade associada aos conjugados (radioincorporação) nos produtos finais ou nas amostras de incubação foi determinada usando-se um kit comerciaímente disponível fabricado pela Bio-dex (Tec-Control Radiochromatographic Kit; veja Exemplo 1). Em geral, 1 pL das amostras de teste foi aplicado duas ou três vezes usando-se uma mi-cropipeta e desenvolvido de acordo com o anexo de instruções da Biodex. Metades das tiras foram consideradas para contagem da radioatividade em tubos de vidro usando-se um contador gama Isodata ou um contador de cin-tilação Packard Top Count, conforme descrito abaixo. A incorporação de radiomarcação foi calculada através de divisão da quantidade de radioatividade na metade superior da tira pela radioatividade encontrada nas metades superior e inferior. Esse valor foi expresso como um percentual e o valor médio determinado. 7. Determinação da Imunorreatividade do ln2B8 e Y2B8 A imunorreatividade foi analisada usando-se o método de Lind-mo e outros e conforme descrito acima no Exemplo 1. 8. Ensaio de Ligação Direta para ln2B8 e Y2B8 Os mesmos protocolos conforme descrito aqui foram usados para determinar a ligação de ln2B8 e Y2B8 a células SB CD20-positivas, respectivamente. ln2B8 e Y2B8 foram preparados e formulados conforme descrito acima. Para ensaio, amostras de ln2B8 e Y2B8 foram diluídas com tampão de diluição para ensaio (1X PBS, pH de 7,2 contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) a 40 ng/mL e 11 ng/mL, respectivamente). Células antígeno-positivas (SB) e antígeno-negativas (HSB) foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro a 37 °C e 5% de C02. As células (viabilidade de >90%, conforme determinado através de exclusão por azul de íripano) foram coletadas em temperatura ambiente em uma densidade de células de 0,5 - 2 x 106 células/mL através de centrifugação (1300 rpm em uma centrífuga Sorvaíl) e lavadas duas vezes com 50 mL de 1X HBSS. As células peletizadas foram ressus-pensas a 50 x 106 células/mL em 1X HBSS pré-resfriado contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) e 10% (p/v) de manitol (tampão de liofili-zação). As suspensões de células foram distribuídas em tubos de polipropi-íeno de 1,5 mL para microcentrífuga com gaxetas de anel em o a 50 X 106 células/mL (0,5 mL por tubo) e liofilizadas durante a noite a 30 a 60 militorr. As células liofilizadas foram armazenadas secas a 2 - 8 °C e reconstituídas em água estéril para os ensaios. Células SB e HSB liofilizadas em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram reconstituídas a 50 X 106 células/mL usando-se água estéril. ln2B8 ou Y2B8 diluído foi adicionado às células, três vezes, e incubado durante 45 a 60 minutos com mistura total em temperatura ambiente, respectivamente. Após incubação, as células foram peletizadas através de centrifugação e a radioatividade ligada à célula determinada por meio de contagem das amostras em um Contador Gama Isodata ou um contador de cintiíação Packard Top Count, conforme descrito abaixo. A radioatividade ligada (B) às células foi calculada subtraindo-se a radioatividade não ligada (sobrenadan-te) da radioatividade total adicionada. A radioatividade total foi determinada a partir da radioatividade contada em tubos sem células. A ligação percentual foi calculada expressando-se as contagens de ligação como um percentual das contagens totais. 9. Medição da Radioatividade As amostras de radioincorporação foram contadas durante 1 minuto usando-se um contador gama Isodata. O contador foi ajustado para janelas de energia de 100-500 KeV e a base ajustada para zero imediatamente antes do uso com relação às amostras usando 111 In. O contador gama Isodata também foi usado para contagem das tiras de ITLC tendo 90Y sobre as mesmas. As janelas de energia para detecção da radiação de Bremstrulung eram de 100 -1000 KeV.

Para os ensaios de ligação, amostras de 90Y foram transferidas para lâminas de 24 cavidades e com o coquetel MicroScint 40 e contadas em um Packard TopCount durante 1 minuto usando-se os ajustes máximo e mínimo de energia. Amostras de índio-[111] foram contadas durante 1 minuto usando-se um contador gama Isodata. O contador foi ajustado para janelas de energia de 100 - 500 KeV e a base ajustada para zero imediatamente antes do uso. 10. Especificações de Liberação para Doses Clínicas de ln2B8 e Y2B8 As especificações de liberação para radioincorporação e ligação a células CD20-positivas foram estabelecidas através da preparação de seis doses de ln2B8 e Y2B8 usando-se dois lotes de 2B8-MX-DTPA de grau clínico (lotes # 0219 e 0220) preparados de acordo com a presente invenção e enchidos sob condições GMP. Os ensaios de liberação foram realizados conforme descrito acima. IV. Resultados A. Caracterização de 2B8 CHO-derivado Usando-se análise citométrica de fluxo, foi demonstrado que o CHO 2B8 se liga diretamente às células SB CD20-positivas sem ligação às células HSB CD20-negativas (Figura 34). Nenhuma ligação significativa às células SB ou HSB foi observada com relação a um anticorpo (S004) com isótipo irrelevante na técnica (γ1κ). A ligação de CHO 2B8 a células CD20-positivas foi avaliada em ensaios de competição usando-se o sistema de detecção quimioluminescen-te da ORIGEN. Células SB antígeno-positivas liofilizadas e reconstituídas foram incubadas com quantidades crescentes de anticorpo na presença de CHO 2B8 vestigial rutênio-marcado. Os resultados mostraram que o CHO 2B8 inibe a ligação às células CD20-positivas até o mesmo grau conforme o anticorpo derivado dos biorreatores de fibra oca (2B8-49) (Figura 35). Os valores de EC50 foram determinados graficamente e o método de Muller (1980) usado a fim de calcular os valores de afinidade média. A afinidade com relação ao CHO 2B8 foi determinada como sendo de 1,3 X 10'10 Μ; o anticorpo 2B8 derivado dos biorreatores de fibra oca proporcionou um valor de afinidade de 2,5 x 10'10 Μ. A ligação não específica era neglígenciável, conforme demonstrado pela falta de competição com o anticorpo de isótipo irrelevante, S004. B. Caracterização de 2B8-MX-DTPA CHO-derivado O conjugado de 2B8 (2B8-MX-DTPA) foi preparado usando-se um protocolo similar àquele usado para ο 2B8-49 previamente caracterizado. As reações foram realizadas usando-se aproximadamente 3 mg de anticorpo e uma proporção molar de 4:1 de quelante para anticorpo. Tempos de incubação de 2, 4, 8,17 e 24 horas foram avaliados a fim de determinar o tempo de reação que proporcionava retenção aceitável de ligação às células CD20 positivas e elevada radioincorporação com 111!n. As curvas de ligação competitiva comparando o CHO 2B8 ao conjugado CHO 2B8-MX-DTPA reagido durante 8-24 horas eram similares, indicando que o processo de conjugação não alterou significativamente a ligação do anticorpo ao antígeno CD20 (Figura 36). Usando-se os valores de EC50 determinados graficamente (Figura 36), as constantes de afinidade para os anticorpos conjugado e não conjugado oscilavam de 2,3 X 10'10 M a 5,9 X 10'10 M (Tabela 40). A radioin- corporação foi de > 95% para tempos de conjugação de 8 a 24 horas (Tabela 30).

Tabela 40 Efeito do Tempo da Reação de Conjugação sobre a Radioincorporação e Imunorreatividade de CHO 2B8-MX-DTPA C. Caracterização de ln2B8 e Y2B8 Preparados a partir de 2B8-MX-DTPA CHO-derivado CHO 2B8-MX-DTPA índio-[111]-marcado (ln2B8) foi preparado usando-se o protocolo do kit de radiomarcação em pequena escala previa-meníe descrito para o anticorpo derivado de biorreator de fibra oca (Exemplo 1). Resumidamente, o anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA CHO-derivado; lote # 0165A) foi incubado com acetato de 111ln no pH indicado durante 30 minutos em temperatura ambiente. As misturas de reação foram formuladas com PBS, pH de 7,2 contendo 7,5% (p/v) de albumina de soro humano e DTPA a 1 mM. As amostras formuladas de ln2B8 foram analisadas com relação à radioincorporação usando-se cromatografia em camada fina instantânea. A ligação de In2B8 às células CD20-positivas foi determinada usando-se células SB liofilizadas e reconstituídas. Por comparação, o conjugado preparado a partir do anticorpo hibridoma-produzido (2B8-49) foi incubado com acetato de 111 In durante 30 minutos em um pH de 4,2 (condições previamente estabelecidas para esse anticorpo).

Os estudos de cinética foram realizados a fim de determinar as condições de marcação que proporcionam retenção máxima da ligação às células CD20-positivas e elevada radioincorporação (Tabelas 41 e 42). O anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA CHO-derivado) foi incubado em tempe- ratura ambiente com acetato de 111ln em um pH de 4,2 durante os tempos indicados (Tabela 42).

Tabela 41 Cinétíca de Radiomarcação de ln2B8: Efeito do pH sobre a Radioincorpora-ção e Ligação a Células CD20-positivas Tabela 42 Cinética de radiomarcação de ln2B8: Efeito do Tempo de Incubação sobre a Radioincorporação e Ligação a Células CD20-positivas Os resultados demonstraram que para a faixa de pH de 3,0 a 4,6 e um tempo de incubação de 30 minutos, > 97% de radioincorporação do radioisótopo foi obtida, ao mesmo tempo em que mantinha uma ligação de aproximadamente 84%. Os valores de radioincorporação e ligação eram invariáveis com relação aos tempos de incubação de 15 a 45 minutos para reações em um pH de 2,9 a 4,6 (Tabela 42). Os resultados eram comparáveis àqueles obtidos usando-se o anticorpo 2B8-49 (Tabelas 41 e 42). O anticorpo ítrio-[90]-marcado foi preparado através de incubação do anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA CHO-derivado) com acetato de 90Y no ρΗ indicado durante 5 minutos em temperatura ambiente. As misturas de reação foram formuladas em PBS, pH de 7,2 contendo 7,5% (p/v) de al-bumina de soro humano e DTPA 1 mM. As amostras formuladas de Y2B8 foram analisadas com relação à radioincorporação usando-se cromatografia em camada fina instantânea. A ligação de Y2B8 às células CD20-positivas foi determinada usando-se células SB liofilizadas e reconstituídas. Por comparação, o conjugado preparado a partir do anticorpo hibridoma-produzido (2B8-49) foi incubado com acetato de 90Y durante 5 minutos em um pH de 4,2 (condições previamente estabelecidas para esse anticorpo).

Estudos similares de cinética foram realizados para avaliar a preparação do anticorpo 90Y-marcado (Y2B8). Para reações de radiomarca-ção na faixa de pH de 3,9 a 4,7 em um tempo de incubação de 5 minutos, a radioincorporação foi de > 96% com > 80% de retenção da ligação às células CD20-positivas (Tabela 43). Resultados similares foram obtidos com os tempos de incubação de 3, 5 e 10 minutos para a faixa de pH de 2,9 a 4,6 (Tabela 44). Então, o anticorpo conjugado (2B8-MX-DTPA CHO-derivado) foi incubado em temperatura ambiente com acetato de 90Y em um pH de 4,2 durante os tempos indicados (Tabela 44). Os resultados eram comparáveis àqueles obtidos usando-se o anticorpo 2B8-49 (Tabelas 43 e 44).

Tabela 43 Cinética de Radiomarcação de Y2B8: Efeito do pH sobre a Radioincorporação e Ligação a Células CD20-positivas Tabela 44 Cinética de radiomarcação de Y2B8: Efeito do Tempo de Incubação sobre a Radioincorporação e Ligação a Células CD20-positivas As imunorreatividades com relação ao ln2B8 e Y2B8 preparados a partir de CHO 2B8 foram determinadas usando-se o método de Lindmo e outros. Quantidades crescentes de células SB CD20-positivas recentemente coletadas foram incubadas com uma quantidade fixa de ln2B8 ou Y2B8 sob condições com excesso de antígeno. Análise por plotagem recíproca dos dados de ligação permitiu que imunorreatividades de 80,6% e 72,2% para ln2B8 e Y2B8, respectivamente, fossem determinadas (Figuras 37 e 38). D, Especificações de Liberação para ln2B8 e Y2B8 CHQ-derivados Dois lotes de kits de radiomarcação de ln2B8/Y2B8 de grau clínico foram usados para preparar seis lotes de ln2B8 e Y2B8. ln2B8 e Y2B8 foram preparados usando-se versões em pequena escala dos protocolos de radiomarcação atualmente usados nos experimentos clínicos. Cada lote de 2B8-MX-DTPA radíomarcado foi testado com relação à radioincorporação e ligação a células humanas CD20-positivas (SB) e CD20-negativas (HSB). Esses resultados são resumidos nas Tabelas 45 e 46. Para os seis lotes de ln2B8 preparados, a radioincorporação oscilou de 98,9% a 99,3% com uma média de 99,1%. A ligação às células CD20-positivas oscilou de 81,9% a 85,1%, com uma média de 83,6%; a ligação às células CD20-negativas era de < 4%. Para os seis lotes de Y2B8 preparados, a radioincorporação oscilou de 97,4% a 98,7%, com uma média de 98,2%. A ligação às células CD20-positivas oscilou de 81,4% a 82,7%, com uma média de 81,9%; a ligação às células CD20-negativas era de < 8%.

Tabela 45 Resultados do Ensaio de Liberação para ln2B8 CHO-derivado Preparado usando-se o Protocolo do Kit de Radiomarcação Ligação (%) Tabela 46 Resultados do Ensaio de Liberação para Y2B8 CHO-derivado Preparado usando-se o Protocolo do Kit de Radiomarcação Ligação (%) V. Discussão e Conclusões O anticorpo monoclonal de murino anti-CD20 (2B8) clonado e expresso em células CHO (2B8 CHO-derivado) mantém a especificidade por células humanas CD20-positivas, conforme mostrado através de análise por FACS e de ligação competitiva. A ligação a células T humanas era mínima. A afinidade do anticorpo por células CD20-positivas humanas foi determinada como sendo de 1,3 X 10"10 M usando-se um ensaio de ligação competitiva. Usando-se o mesmo ensaio, o anticorpo 2B8 derivado dos biorreatores de fibra oca proporcionaram um valor de afinidade de 2,5 X 10'10 M. O anticorpo CHO 2B8 foi reagido com MX-DTPA a fim de formar um conjugado, 2B8-MX-DTPA, ao mesmo tempo em que mantém retenção adequada da imunorreatividade. Incorporação ótima de quelaníe foi determinada através de medição da radioincorporação com 111 In e foi obtida após oito horas de incubação em temperatura ambiente. Os protocolos de radio-marcação com relação ao conjugado 2B8-MX-DTPA foram otimizados para 90γ ou 111 [n no que se refere ao tempo de incubação e pH a fim de assegurar radioincorporação e retenção máximas da imunorreatividade.

Os resultados de muitas preparações de ln2B8 e Y2B8 demonstraram a reprodutibilidade do protocolo de radiomarcação usado para preparar doses clínicas. Baseado sobre esses resultados de radiomarcação, é sugerido que as especificações de liberação para radioincorporação e ligação, usando-se células CD20-positivas liofilizadas, sejam estabelecidas em > 95% e > 70%, respectivamente. Tomados juntos, esses resultados demonstram a compatibilidade do 2B8 CHO-derivado e 2B8-49 fibra oca-derivado e indicam a adequabilidade do 2B8-MX-DTPA CHO-derivado para uso em experimentos clínicos.

Finalmente, a presente invenção divulga um procedimento de marcação, referido como método de "mistura e desenvolvimento", para a preparação de doses clínicas de anticorpos radiomarcados que eliminam a necessidade da etapa atualmente usada de cromatografia de líqüido de elevado desempenho (HPLC) para remoção de radioisótopo ligado a não proteína. O protocolo simplificado elimina essa etapa trabalhosa de purificação ao mesmo tempo em que mantém um alto nível de incorporação do radioisótopo (> 95%) e retenção aperfeiçoada de imunorreatividade (> 70%). Verificou-se que o conjugado radiomarcado clinicamente formulado é estável in vitro quando incubado a 4 °C durante 48 horas, baseado sobre a retenção de ra-dioisótopo e na imunorreatividade. Adicionalmente, o conjugado radiomarcado era estável quando incubado em soro humano a 37 °C durante 72 horas. Estudos de biodistribuição em camundongos -BALB/c não demonstraram depósitos incomuns nos tecidos e nenhum acúmulo significativo no osso. As estimativas das doses absorvidas de radiação em um ser humano "padrão" de 70 kg eram comparáveis àquelas obtidas em um experimento clínico em andamento usando-se 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado. Os resultados desses estudos mostraram que o 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado produzido usando-se o protocolo de "mistura e desenvolvimento" era comparável àquele preparado usando-se o processo convencional por HPLC. A validação do protocolo em escala para preparação do conjugado radiomarcado de grau clínico mostrou que os métodos eram reproduzíveis e que o produto era comparável àquele produzido usando-se o método corrente de HPLC. Os resultados desses estudos pré-clinicos indicam que esse novo protocolo de "mistura e desenvolvimento" pode ser usado para preparar 2B8-MX-DTPA 90Y-marcado adequado para uso em experimentos clínicos.

Referências Cada uma das seguintes citações é aqui incorporada por referência: 1. Adams, R.A., Flowers, A., and Davis, B.J. Direct Implatation and Transplantation of Human Acute Lymphoblastic Leukermia in Hamsters SB-2. Câncer Research 28: 1121-1125,1968. 2. Adams, R.A., Formal Discussion: The Role of Transplantation in the Experimental Investigatlon of Human Leukemia and Lym-phoma. Câncer Res. 27(1): 2479-2482,1967. 3. Líndmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedoroko, J., and Bunn, P.A., J. Immunol. Methods, 72: 77-1984. 4. Kozak, R.W., Raubitschek, A., Mirzadeh, S., Brechbiel, M.W., Junghaus, R., Gansow, O.A., and Waldmann, T.A. Câncer Res. (1989) 49:2639-2644. 5. Parker, B.A., Halpern, S.E., Miller, R.A., Hupf, H., Shawler, D.L., Collins, H.A., Amox, D., White, C.A. and Royston, I.N. Eng. J. Med., submitted. 6. Leland, J.K. and Powell, M.J.J. (1990) Electrochem. Soc. 137, 3127. 7. Muller, R.J. Immunological Methods (1980) 34, 345. 8. Mirzadeh, S., Brechbiel, M.W., Aícher, R.W. and Gansow, O.A. (1990) Bioconjugate Chemistry 1(1), 59. 9. Brechbiel, M.W., Gansow, O.A., Atcher, R.W., Sclom, J., Este-ban, J., Simpson, D.E. and Colcher, D. (1986) 25, 2772.

Claims (27)

1. Método para radiomarcação de um anticorpo conjugado a um quelante com 90Y para administração a um paciente compreendendo: (i) misturar um anticorpo conjugado a um quelante com uma solução contendo 90Y para formar uma mistura, em que a solução contendo 90Y é ajustada para um pH de 3 a 6 antes de ser misturada com o anticorpo conjugado a quelante; o referido método sendo caracterizado pelo fato de (ii) incubar a mistura em uma temperatura apropriada por 10 minutos ou menos para produzir um anticorpo radiomarcado, em que o anticorpo radiomarcado apresenta radioincorporação superior a 95% de forma que pode ser administrado diretamente a um paciente sem purificação adicional do 90Y não incorporado; e (iü) diluir o anticorpo radiomarcado em uma formulação tampão até uma concentração apropriada para a referida administração ao paciente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo conjugado a um quelante compreende um anticorpo anti-CD20.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD20 é 2B8-MX-DTPA.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado com uma solução de acetato de sódio com baixo teor de metal.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solução de acetato de sódio está em uma concentração de 10 a 1000 mM.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade volumétrica de 90Y usada é entre 5 e 100 mCi, dividida pela concentração de radioatividade no momento da marcação.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade volumétrica de 90Y usada é 45 mCi, dividida pela concentração de radioatividade no momento da marcação.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que de 1 a 2 mL de anticorpo conjugado a MX-DTPA em uma concentração de 0,5 a 30 mg/mL são misturados com a solução de contendo 90γ

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a formulação tampão é adicionada em uma quantidade necessária para se obter um volume final total de 10 mL a 50 mL.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a formulação tampão compreende uma solução salina fisiológica, um radioprotetor e um quelante conjugado a substância não-protéica.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o radioprotetor é albumina de soro humano (HSA), ascorbato, ácido ascórbico, fenol, sulfitos, glutationa, cisteína, ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbila, HOP(:0)H2, glicerol, sulfoxilato de formaldeído de sódio, Na2S205, Na2S203 ou S02.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o radioprotetor é HSA.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o HSA está em uma concentração de 1 a 25% (p/v).

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a concentração do HSA é de cerca de 7,5% (p/v).

15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o radioprotetor é ascorbato.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ascorbato está em uma concentração de 1 a 100 mg/mL.

17. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o quelante conjugado a substância não-protéica é DTPA ou EDTA.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a concentração de DTPA é de cerca de 1 mM.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão da formulação apresenta pH 6 a 8.

20. Ensaio de ligação para determinação da ligação percentual de um anticorpo radiomarcado à sua célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) radiomarcar um anticorpo através do método, como definido na reivindicação 1, para produzir um anticorpo radiomarcado; (ii) misturar e incubar uma alíquota do anticorpo radiomarcado com uma alíquota de células antígeno-positivas; (iii) misturar e incubar uma alíquota do anticorpo radiomarcado idêntico à alíquota da etapa (ii) com uma alíquota de tampão de diluição de mesmo volume que a alíquota de células antígeno-positivas na etapa (ii) como controle; (iv) peletizar as células através de centrifugação; (v) medir a radioatividade no sobrenadante das células peletizadas e no controle; e (vi) comparar a quantidade de radioatividade no sobrenadante de células com a quantidade de radioatividade no controle.

21. Ensaio de ligação de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo anti-CD20.

22. Ensaio de ligação de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD20 é 2B8.

23. Ensaio de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o referido antígeno é CD20.

24. Ensaio de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que as referidas células antígeno-positivas são células SB (ATCC # CCL 120).

25. Ensaio de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (i) misturar uma alíquota do anticorpo radiomarcado com uma alíquota de células antígeno-negativas; (ii) peletizar as células antígeno-negativas através de centrifugação; (iii) medir a radioatividade no sobrenadante das células antígeno-negativas peletizadas; e (iv) comparar a quantidade de radioatividade no sobrenadante de células antígeno-negativas com a quantidade de radioatividade no sobrenadante de células antígeno-positivas e no controle.

26. Ensaio de ligação de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as referidas células antígeno-negativas são CD20-negativas.

27. Ensaio de ligação de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as referidas células CD20-negativas são células HSB (ATCC # CCL 120.1).