TW202430561A - 抗cd28抗體 - Google Patents
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Abstract
提供了與CD28結合的抗體及其抗原結合片段以及其使用方法。
Description
相關申請案 [0001]本申請要求2022年9月30日提交的EP申請號22315222.4的優先權，將其公開內容通過引用以其整體特此併入。
電子提交的序列表的引用 [0002]以XML格式電子提交的序列表（名稱：746135_SA9-345PC_SL.xml；大小：541,509位元組；以及創建日期：2023年9月26日）的內容通過引用以其整體併入本文。
[0003]本公開文本涉及特異性結合CD28的新型抗體及其抗原結合片段以及其使用方法。
[0004]分化簇28（CD28）是在T受體細胞表面上表現的共刺激蛋白的成員。由於共刺激受體可以調節T細胞活化並且從而調節特異性免疫反應的過程，因此測試了它們控制腫瘤學和發炎環境兩者中的T細胞反應。因此，已經研究了CD28拮抗劑用於治療自體免疫性疾病和發炎性疾病，並且已經研究了CD28促效劑用於腫瘤疾病。然而，激動性抗CD28抗體的投予與重度全身性發炎反應（包括細胞激素風暴）相關。這些危險的發炎性副作用嚴重限制了抗CD28抗體的治療窗和治療用途。因此，需要與重度發炎反應不相關的新型抗CD28抗體。
[0005]本主題說明書提供了抗CD28抗體（例如，抗CD28 VHH抗體）及其抗原結合片段。還提供了抑制CD28活性或治療CD28相關疾病的方法。
[0006]在一態樣，本公開文本提供了一種特異性結合CD28的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白單可變結構域（ISVD），其中所述ISVD結構域包含選自表1的CDR-H3、CDR-H2和CDR-H3胺基酸序列中的任一個的CDR-H1胺基酸序列、CDR-H2胺基酸序列和CDR-H3胺基酸序列。
[0007]在某些實施例中，ISVD結構域包含表2的ISVD胺基酸序列中的任一個。
[0008]在另一態樣，本公開文本提供了一種特異性結合CD28的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含含有CDR-H1序列、CDR-H2序列和CDR-H3序列的免疫球蛋白單可變結構域（ISVD），其中：
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[0068]bh) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 178所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 179所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 180所示的胺基酸序列；
[0069]bi) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 181所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 182所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 183所示的胺基酸序列；
[0070]bj) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 184所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 185所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 186所示的胺基酸序列；
[0071]bk) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 187所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 188所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 189所示的胺基酸序列；
[0072]bl) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 190所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 191所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 192所示的胺基酸序列；
[0073]bm) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 193所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 194所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 195所示的胺基酸序列；
[0074]bn) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 196所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 197所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 198所示的胺基酸序列；
[0075]bo) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 199所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 200所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 201所示的胺基酸序列；
[0076]bp) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 202所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 203所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 204所示的胺基酸序列；
[0077]bq) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 205所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 206所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 207所示的胺基酸序列；
[0078]br) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 208所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 209所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 210所示的胺基酸序列；
[0079]bs) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 211所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 212所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 213所示的胺基酸序列；
[0080]bt) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 214所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 215所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 216所示的胺基酸序列；
[0081]bu) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 217所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 218所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 219所示的胺基酸序列；
[0082]bv) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 220所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 221所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 222所示的胺基酸序列；
[0083]bw) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 223所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 224所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 225所示的胺基酸序列；
[0084]bx) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 226所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 227所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 228所示的胺基酸序列；
[0085]by) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 229所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 230所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 231所示的胺基酸序列；
[0086]bz) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 232所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 233所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 234所示的胺基酸序列；
[0087]ca) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 235所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 237所示的胺基酸序列；
[0088]cb) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 238所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 239所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列；
[0089]cc) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 241所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 242所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 243所示的胺基酸序列；
[0090]cd) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 246所示的胺基酸序列；
[0091]ce) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 247所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列；
[0092]cf) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列；
[0093]cg) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 254所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 255所示的胺基酸序列；
[0094]ch) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 256所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列；
[0095]ci) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列；
[0096]cj) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 264所示的胺基酸序列；
[0097]ck) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列；
[0098]cl) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列；
[0099]cm) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 271所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 272所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 273所示的胺基酸序列；
[0100]cn) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 274所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 275所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 276所示的胺基酸序列；
[0101]co) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 277所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 278所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 279所示的胺基酸序列；
[0102]cp) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 280所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 281所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 282所示的胺基酸序列；
[0103]cq) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 283所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 284所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 285所示的胺基酸序列；
[0104]cr) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 286所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 287所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 288所示的胺基酸序列；
[0105]cs) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 289所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 290所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 291所示的胺基酸序列；
[0106]ct) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 292所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 293所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 294所示的胺基酸序列；
[0107]cu) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 295所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 296所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 297所示的胺基酸序列；
[0108]cv) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 298所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 300所示的胺基酸序列；
[0109]cw) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 301所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 302所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 303所示的胺基酸序列；
[0110]cx) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 304所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 305所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 306所示的胺基酸序列；
[0111]cy) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 307所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 308所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 309所示的胺基酸序列；
[0112]cz) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 310所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 311所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 312所示的胺基酸序列；
[0113]da) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 313所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 314所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 315所示的胺基酸序列；
[0114]db) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 316所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 317所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 318所示的胺基酸序列；
[0115]dc) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 319所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 320所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 321所示的胺基酸序列；
[0116]dd) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 322所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 323所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 324所示的胺基酸序列；
[0117]de) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 325所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 326所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 327所示的胺基酸序列；
[0118]df) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 328所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 329所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 330所示的胺基酸序列；
[0119]dg) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 331所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 332所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 333所示的胺基酸序列；
[0120]dh) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 334所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 335所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 336所示的胺基酸序列；
[0121]di) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 337所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 338所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 339所示的胺基酸序列；
[0122]dj) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 340所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 341所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 342所示的胺基酸序列；
[0123]dk) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 343所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 344所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 345所示的胺基酸序列；
[0124]dl) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 346所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 347所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 348所示的胺基酸序列；
[0125]dm) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 349所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 350所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 351所示的胺基酸序列；
[0126]dn) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 352所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 353所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 354所示的胺基酸序列；
[0127]do) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 355所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 356所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 357所示的胺基酸序列；
[0128]dp) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 358所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 359所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 360所示的胺基酸序列；
[0129]dq) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 361所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 362所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 363所示的胺基酸序列；
[0130]dr) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 364所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 365所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 366所示的胺基酸序列；
[0131]ds) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 367所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 368所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 369所示的胺基酸序列；
[0132]dt) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 370所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 371所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 372所示的胺基酸序列；
[0133]du) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 373所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 374所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 375所示的胺基酸序列；
[0134]dv) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 376所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 377所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 378所示的胺基酸序列；
[0135]dw) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 379所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 380所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 381所示的胺基酸序列；
[0136]dx) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 382所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 383所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 384所示的胺基酸序列；
[0137]dy) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 385所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 386所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 387所示的胺基酸序列；
[0138]dz) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 388所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 389所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 390所示的胺基酸序列；
[0139]ea) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 391所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 392所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 393所示的胺基酸序列；
[0140]eb) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 394所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 395所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 396所示的胺基酸序列；
[0141]ec) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 397所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 398所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 399所示的胺基酸序列；
[0142]ed) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 400所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 401所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 402所示的胺基酸序列；
[0143]ee) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 403所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 404所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 405所示的胺基酸序列；
[0144]ef) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 406所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 407所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 408所示的胺基酸序列；
[0145]eg) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 409所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 410所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 411所示的胺基酸序列；
[0146]eh) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 413所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列；
[0147]ei) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 417所示的胺基酸序列；
[0148]ej) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 418所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 419所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 420所示的胺基酸序列；
[0149]ek) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 421所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 422所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列；
[0150]el) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 424所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 425所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 426所示的胺基酸序列；
[0151]em) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 427所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 429所示的胺基酸序列；
[0152]en) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 430所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 431所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 432所示的胺基酸序列；
[0153]eo) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 433所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 434所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 435所示的胺基酸序列；
[0154]ep) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 436所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 437所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 438所示的胺基酸序列；
[0155]eq) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 439所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 440所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 441所示的胺基酸序列；
[0156]er) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 442所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 443所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列；
[0157]es) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 447所示的胺基酸序列；
[0158]et) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 448所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 449所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；或
[0159]eu) 所述CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 451所示的胺基酸序列，所述CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 452所示的胺基酸序列，並且所述CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 453所示的胺基酸序列。
[0160]在某些實施例中：
[0161]a) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列；
[0162]b) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 455所示的胺基酸序列；
[0163]c) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 456所示的胺基酸序列；
[0164]d) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 457所示的胺基酸序列；
[0165]e) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 458所示的胺基酸序列；
[0166]f) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 459所示的胺基酸序列；
[0167]g) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 460所示的胺基酸序列；
[0168]h) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 461所示的胺基酸序列；
[0169]i) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 462所示的胺基酸序列；
[0170]j) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 463所示的胺基酸序列；
[0171]k) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 464所示的胺基酸序列；
[0172]l) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 465所示的胺基酸序列；
[0173]m) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 466所示的胺基酸序列；
[0174]n) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 467所示的胺基酸序列；
[0175]o) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 468所示的胺基酸序列；
[0176]p) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 469所示的胺基酸序列；
[0177]q) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 470所示的胺基酸序列；
[0178]r) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 471所示的胺基酸序列；
[0179]s) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 472所示的胺基酸序列；
[0180]t) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 473所示的胺基酸序列；
[0181]u) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 474所示的胺基酸序列；
[0182]v) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 475所示的胺基酸序列；
[0183]w) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 476所示的胺基酸序列；
[0184]x) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 477所示的胺基酸序列；
[0185]y) 所述ISVD結構域包含SEQ ID NO: 478所示的胺基酸序列；
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[0312]在某些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段是嵌合或人源化抗體或其抗原結合片段。
[0313]在某些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段是單株抗體或其抗原結合片段。
[0314]在某些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段是雙特異性抗體。
[0315]在某些實施例中，所述雙特異性抗體包含對腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA）具有結合親和力的抗原結合結構域。
[0316]在某些實施例中，ISVD可操作地連接至CH1結構域和/或CL結構域。
[0317]在雙特異性抗體的某些實施例中，所述對CD28具有結合親和力的ISVD可操作地連接至CH1結構域，並且對TAA具有結合親和力的抗原結合結構域可操作地連接至CL結構域。
[0318]在雙特異性抗體的某些實施例中，所述對CD28具有結合親和力的ISVD可操作地連接至CL結構域，並且對TAA具有結合親和力的抗原結合結構域可操作地連接至CH1結構域。
[0319]在某些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段可操作地連接至Fc區。
[0320]在某些實施例中，所述Fc區是人類IgG1 Fc區。
[0321]在某些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段是包含拮抗性抗體或其抗原結合片段。
[0322]在一態樣，本公開文本提供了一種分離的核酸分子，所述分離的核酸分子編碼上述抗體或其抗原結合片段或上述雙特異性抗體。
[0323]在一態樣，本公開文本提供了一種表現載體，所述表現載體包含上述核酸分子。
[0324]在一態樣，本公開文本提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含上述表現載體。
[0325]在一態樣，本公開文本提供了一種用於抑制受試者的CD28活性的方法，所述方法包括向受試者投予上述抗體或其抗原結合片段，從而抑制所述受試者的CD28活性。
[0326]在一態樣，本公開文本提供了一種用於治療受試者的與CD28活性相關的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受試者投予上述抗體或其抗原結合片段。
[0327]在某些實施例中，所述疾病是自體免疫性疾病。
[0328]在某些實施例中，所述疾病是癌症。
[0329]上述發明內容是非限制性的，並且所公開的抗原結合蛋白和方法的其他特徵和優點將從下面的附圖說明、具體實施方式和申請專利範圍變得清楚。
[0341]在描述本公開文本之前，應當理解，本公開文本並不限於所述的特定方法和實驗條件；因為此類方法和條件可變。還應理解，本文所用的術語僅用於描述特定實施例的目的，並且不旨在是限制性的，因為本公開文本的範圍將僅受所附申請專利範圍的限制。
[0342]除非另外定義，本文所用的全部技術術語和科學術語具有與本公開文本所屬領域的具有通常知識者通常所理解的相同意義。
[0343]儘管與本文所述的任何方法和材料類似或等同的方法和材料可以用於本公開文本的實踐，但現在描述示例性方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用來描述以其整體併入本文。
[0344]術語「約」或「大約」意指在給定值或範圍的約20%內，諸如在約10%內、在約5%內或在約1%內或更少。
[0345]如本文所用，術語「抗體」或「抗原結合蛋白」是指與抗原或表位特異性結合或具有免疫反應性的免疫球蛋白分子，並且包括多株和單株抗體兩者以及其功能性抗體片段。術語「抗體」或「抗原結合蛋白」包括免疫球蛋白單可變結構域（ISVD或ISV）抗體（例如，sdAb、sdFv、Nanobody
®、VHH）。術語「抗體」包括免疫球蛋白的基因工程化的或以其他方式修飾的形式，諸如胞內抗體、肽抗體、嵌合抗體、完全人類抗體、人源化抗體、中間位使能性抗體（meditope-enabled antibody）、異接合物抗體（例如，多特異性抗體、雙特異性抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、串聯二scFv、串聯三scFv）等。
[0346]如本文所用，術語「功能性抗體片段」是指具有衍生出所述片段的目的抗體的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%親和力的抗體片段。
[0347]如本文所用的術語「多特異性抗體」是指雙特異性、三特異性或多特異性抗體及其抗原結合片段。多特異性抗體可以對一種靶多肽的不同表位具有特異性，或者可以含有對多於一種靶多肽的表位具有特異性的抗原結合結構域。多特異性抗體可以是單個多功能多肽，或者它可以是彼此共價或非共價締合的兩個或多個多肽的多聚複合物。術語「多特異性抗體」包括可以與另一種功能性分子（例如，另一種肽或蛋白質）連接或共表現的本公開文本抗體。例如，抗體或其片段可以與一種或多種其他分子實體（諸如蛋白質或其片段）功能性連接（例如，透過化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式），以產生具有第二結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。在某些示例性實施例中，本公開文本的抗體與另一種抗體或其抗原結合片段功能性連接以產生具有第二結合特異性的雙特異性抗體。在某些實施例中，第二結合特異性針對腫瘤相關抗原（TAA）。
[0348]如本文所用，與抗體有關的「單價」是指具有單個抗原識別位點的抗體，所述單個抗原識別位點對靶抗原具有特異性。單價抗體的例子包括單價免疫球蛋白單可變結構域抗體（例如，VHH）或單價抗體片段。單價抗體片段的例子包括但不限於Fab片段、Fv片段和單鏈Fv片段（scFv）。此外，多特異性抗體可以具有多個抗原結合位點，每個抗原結合位點識別不同的靶抗原。因此，每個抗原結合位點對於靶抗原將是單價的。
[0349]如本文所用，與抗體有關的「多價」是指具有多個（多於一個）對靶抗原具有特異性的抗原識別位點的抗體。
[0350]如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」是指在抗體可變區內的賦予抗原特異性和結合親和力的胺基酸序列。通常，在每個重鏈可變區中存在三個CDR（CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3）。「架構區」或「FR」在本領域中已知是指重鏈的可變區的非CDR部分。通常，在每個重鏈可變區中存在四個FR（FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4）。
[0351]給定CDR或FR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多熟知的方案中的任一種容易地確定，所述方案包括以下文獻中所述的那些：Kabat等人，(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, 貝塞斯達, 馬里蘭州（「Kabat」編號方案），Al-Lazikani等人，(1997) JMB 273, 927-948（「Chothia」編號方案），MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,」 J. Mol. Biol. 262, 732-745。（「Contact」編號方案），Lefranc M P等人，「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,」 Dev Comp Immunol, 2003年1月; 27(1):55-77（「IMGT」編號方案），以及Honegger A和Pluckthun A, 「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,」 J Mol Biol, 2001年6月8日; 309(3):657-70, （AHo編號方案）。
[0352]給定CDR或FR的邊界可能根據用於鑒定的方案而變化。例如，Kabat方案是基於結構比對，而Chothia方案是基於結構資訊。Kabat和Chothia方案的編號均是基於最常見的抗體區序列長度，其中透過插入字母（例如，「30a」）提供插入，並且在一些抗體中出現缺失。這兩種方案將某些插入和缺失（「插入缺失（indel）」）放置在不同的位置，從而產生不同的編號。Contact方案是基於對複雜晶體結構的分析，並且在許多方面與Chothia編號方案相似。
[0353]給定抗體或其區域（諸如其可變區）的「CDR」或「互補決定區」或單獨指定的CDR（例如，「CDR-H1」、「CDR-H2」、「CDR-H3」）應理解為涵蓋如由任何已知方案所定義的一個（或特定）互補決定區。同樣，給定抗體或其區（諸如其可變區）的「FR」或「架構區」或單獨指定的FR（例如，「FR-H1」、「FR-H2」）應被理解為涵蓋如由任何已知方案所定義的一個（或特定的）架構區。在一些情形下，指定了用於鑒定特定CDR或FR的方案，諸如，如透過IMGT、Kabat、Chothia、AbM或Contact方法定義的CDR。在其他情況下，給出了CDR或FR的特定胺基酸序列。除非另有指定，否則本公開文本中提及的所有特定CDR胺基酸序列均是IMGT CDR。然而，由其他方案定義的替代CDR也包括在本公開文本中，諸如由abYsis關鍵注釋（Website: abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation .cgi）確定的那些。抗CD28 VHH抗體的示例性重鏈CDR（HCDR）序列列舉在下表1中。
表 1. 每種 VHH 抗體的抗體 HCDR 胺基酸序列。
[0354]「人源化」形式的非人類抗體是含有衍生自非人類抗體的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體通常是人類抗體（受體抗體），其中來自一個或多個CDR的殘基被來自非人類抗體（供體抗體）的一個或多個CDR的殘基取代。供體抗體可以是任何合適的非人類抗體，諸如小鼠、大鼠、兔、雞、美洲駝或具有所希望的特異性、親和力或生物學效應的非人類靈長類動物抗體。在一些情況下，受體抗體的選定架構區殘基被來自供體抗體的相應架構區殘基替代。人源化抗體還可以包含在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。可以進行這樣的修飾以進一步改善抗體功能。人源化序列可以透過其一級序列來鑒定，並且不一定表示產生抗體的過程。
[0355]如本文所用，術語「特異性結合（specifically binds）」、「特異性結合（specifically binding）」、「結合特異性」或「特異性識別」是指對抗原（例如，CD28抗原）展現出明顯的親和力並且不與非CD28蛋白標靶展現出顯著的交叉反應性的抗原結合蛋白或其抗原結合片段。如本文所用，術語「親和力」是指抗原結合蛋白或其抗原結合片段抗原結合位點與其結合的表位之間相互作用的強度。在某些示例性實施例中，透過表面等離子體共振（SPR）測量親和力，例如，在Biacore儀器中。如本領域具有通常知識者容易理解的，抗原結合蛋白親和力可以報告為以莫耳濃度（M）計的解離常數（KD）。
[0356]特異性結合可以根據用於確定此類結合的任何本領域公認的手段來確定。在一些實施例中，特異性結合是透過競爭性結合測定（例如，ELISA）或Biacore測定確定的。在某些實施例中，所述測定在約20ºC、25ºC、30ºC或37ºC下進行。
[0357]如本文所用，關於抗體的術語「促效劑」意指在與細胞表面上表現的靶蛋白結合後，抗體經由靶蛋白刺激或啟動訊息傳遞。
[0358]如本文所用，關於抗體的術語「拮抗劑」意指在與細胞表面上表現的靶蛋白結合後，抗體抑制經由靶蛋白的訊息傳遞。
免疫球蛋白單可變結構域（Immunoglobulin single variable domain，ISVD）
[0359]與「單可變結構域」可互換使用的術語「免疫球蛋白單可變結構域」（ISV或ISVD）定義了其中抗原結合位點存在於單個免疫球蛋白結構域上並由其形成的免疫球蛋白分子。這使免疫球蛋白單可變結構域與「常規」免疫球蛋白（例如，單株抗體）或其片段（諸如Fab、Fab’、F(ab’)
2、scFv、二scFv）區分開來，其中兩個免疫球蛋白結構域、特別是兩個可變結構域相互作用形成抗原結合位點。典型地，在常規免疫球蛋白中，重鏈可變結構域（V
H）和輕鏈可變結構域（V
L）相互作用以形成抗原結合位點。在這種情況下，V
H和V
L兩者的互補決定區（CDR）將促成抗原結合位點，即總共6個CDR將參與抗原結合位點的形成。
[0360]鑒於以上定義，常規4鏈抗體或者衍生自這種常規4鏈抗體的Fab片段、F(ab’)
2片段、Fv片段（諸如雙硫鍵連接的Fv或scFv片段）或雙抗體（均為本領域已知）的抗原結合結構域通常將不被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情況下，與抗原相應表位的結合通常將不會透過一個（單個）免疫球蛋白結構域發生，而是透過一對共同結合至相應抗原的表位的（締合）免疫球蛋白結構域（諸如輕鏈和重鏈可變結構域）發生，即透過免疫球蛋白結構域的V
H-V
L對發生。
[0361]相比之下，免疫球蛋白單可變結構域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對的情況下特異性結合至抗原的表位。免疫球蛋白單可變結構域的結合位點是由單V
H、單V
HH或單V
L結構域形成。
[0362]因此，所述單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列（例如，V
L序列）或其合適片段；或者重鏈可變結構域序列（例如，V
H序列或V
HH序列）或其合適片段；只要其能夠形成單抗原結合單元（即，功能性抗原結合單元，其基本上由單可變結構域組成，使得單抗原結合結構域不需要與另一可變結構域相互作用以形成功能性抗原結合單元）。
[0363]免疫球蛋白單可變結構域（ISV）可以例如是重鏈ISV，諸如V
H、V
HH，包括駝類化V
H或人源化V
HH。在一個實施例中，它是V
HH，包括駝類化V
H或人源化V
HH。重鏈ISV可以衍生自常規的四鏈抗體或重鏈抗體。
[0364]例如，所述免疫球蛋白單可變結構域可以是單結構域抗體（或適合用作單結構域抗體的胺基酸序列）、「dAb」或dAb（或適合用作dAb的胺基酸序列）或Nanobody® ISV（如本文所定義，並且包括但不限於V
HH）；其他單可變結構域，或其任一種的任何合適的片段。
[0365]特別地，所述免疫球蛋白單可變結構域可以是Nanobody® ISV（諸如V
HH，包括人源化V
HH或駝類化V
H）或其合適的片段。[注意：Nanobody®和Nanobodies®是Ablynx N.V.的註冊商標]
[0366]「V
HH結構域」也稱為V
HH、V
HH抗體片段和V
HH抗體，最初已被描述為「重鏈抗體」的（即，「無輕鏈抗體」的；Hamers-Casterman等人 Nature 363: 446-448, 1993）抗原結合免疫球蛋白可變結構域。已選擇術語「V
HH結構域」以將這些可變結構域與常規4鏈抗體中存在的重鏈可變結構域（其在本文中稱為「V
H結構域」）以及與常規4鏈抗體中存在的輕鏈可變結構域（其在本文中稱為「V
L結構域」）區分開來。有關V
HH的進一步描述，參考Muyldermans的評論文章（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）。
[0367]免疫球蛋白序列（諸如VHH）的生成已經在各種出版物（其中WO 94/04678、Hamers-Casterman等人 1993和Muyldermans等人 2001（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001））中被廣泛地描述。在這些方法中，用靶抗原對駱駝科動物進行免疫接種以誘導針對所述靶抗原的免疫反應。將從所述免疫接種獲得的VHH的庫針對結合所述靶抗原的VHH進行進一步篩選。
[0368]在這些情況下，抗體的生成需要純化抗原用於免疫接種和/或篩選。可以從天然來源或在重組產生過程中純化抗原。免疫球蛋白序列的免疫接種和/或篩選可以使用此類抗原的肽片段進行。
[0369]可以在本文所述的方法中定序不同起源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驢、人類和駱駝科動物免疫球蛋白序列。此外，可以在本文所述的方法中對完全人類序列、人源化序列或嵌合序列進行定序。例如，可以在本文所述的方法中定序駱駝科動物免疫球蛋白序列和人源化駱駝科動物免疫球蛋白序列，或者駝類化結構域抗體，例如如由Ward等人（參見例如，WO 94/04678和Riechmann, Febs Lett., 339:285-290, 1994和Prot. Eng., 9:531-537, 1996）所述的駝類化dAb。此外，將ISV融合，形成多價和/或多特異性構建體（關於含有一個或多個V
HH結構域的多價和多特異性多肽及其製備，還參考Conrath等人，J. Biol. Chem., 第276卷, 10. 7346-7350, 2001，以及例如WO 96/34103和WO 99/23221）。
[0370]「人源化V
HH」包含與天然存在的V
HH結構域的胺基酸序列對應但是已經被「人源化」的胺基酸序列，即透過將所述天然存在的V
HH序列（並且特別是架構序列）的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基用來自人類的常規4鏈抗體（例如，上文所示）的V
H結構域中的一個或多個相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基取代而人源化。這可以以本身已知的方式進行，這對於熟練技術人員來說應是清楚的，例如基於現有技術（例如，WO 2008/020079）。此外，應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得此類人源化V
HH，並因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VHH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
[0371]「駝類化V
H」包含對應於天然存在的V
H結構域的胺基酸序列但已經被「駝類化」（即，透過用在（駱駝科動物）重鏈抗體的V
HH結構域中的一個或多個相應位置處出現的一個或多個胺基酸殘基取代來自常規4鏈抗體的天然存在的V
H結構域的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基）的胺基酸序列。這可以以本身已知的方式進行，這對於熟練技術人員來說應是清楚的，例如基於現有技術中的描述（例如，Davies和Riechman (1994和1996)，上文）。將這樣的「駝類化」取代插入於形成和/或存在於V
H-V
L介面的胺基酸位置處和/或所謂的駱駝科標誌（hallmark）殘基處，如本文所定義（參見例如，WO 94/04678以及Davies和Riechmann (1994和1996)，同上）。在一個實施例中，用作產生或設計駝類化V
H的起始材料或起點的V
H序列是來自哺乳動物的V
H序列，諸如人類的V
H序列，諸如V
H3序列。然而應注意，可以以任何本身已知的合適方式獲得此類駝類化V
H，並且因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的V
H結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。
[0372]免疫球蛋白單可變結構域序列的結構可以被認為由四個架構區（「FR」）構成，其在本領域和本文中分別被稱為「架構區1」（「FR1」）；「架構區2」（「FR2」）；「架構區3」（「FR3」）；和「架構區4」（「FR4」）；所述架構區被三個互補決定區（「CDR」）中斷，所述三個互補決定區在本領域和本文中分別被稱為「互補決定區1」（「CDR1」）；「互補決定區2」（「CDR2」）；和「互補決定區3」（「CDR3」）。
[0373]在這種免疫球蛋白序列中，所述架構序列可以是任何合適的架構序列，並且例如基於標準手冊以及本文中提及的另外的披露內容和現有技術，合適的架構序列的例子對於具有通常知識者將是清楚的。
[0374]架構序列是免疫球蛋白架構序列或已經（例如，透過人源化或駝類化）衍生自免疫球蛋白架構序列的架構序列（的合適組合）。例如，架構序列可以是源自輕鏈可變結構域（例如，V
L序列）和/或重鏈可變結構域（例如，V
H序列或V
HH序列）的架構序列。在一個特定態樣，架構序列是已經衍生自V
HH序列的架構序列（其中所述架構序列可以任選地已經被部分或完全人源化）或者是已經駝類化的常規V
H序列（如本文所定義）。
[0375]特別地，本文所述方法中使用的ISV序列中存在的架構序列可以含有一個或多個標誌殘基（如本文所定義），使得ISV序列是Nanobody® ISV，例如像V
HH，包括人源化V
HH或駝類化V
H。此類架構序列（的合適組合）的非限制性例子將從本文的進一步公開中變得清楚。
[0376]V
H結構域和V
HH結構域中的胺基酸殘基總數通常在110至120，通常在112與115之間的範圍內。然而，應注意，更小和更長的序列也可能適用於本文所述的目的。
[0377]然而，應注意，在本發明方法中被定序的多價ISV多肽中包含的ISV不限於ISV序列（或用於表現它的核苷酸序列）的來源，也不限於產生或獲得（或已經產生或獲得）ISV序列或核苷酸序列的方式。因此，ISV序列可以是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列。在一個特定但非限制性的態樣，ISV序列是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成的或半合成的序列，包括但不限於「人源化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，特別是部分或完全人源化的V
HH序列）、「駝類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（特別是駱駝化V
H序列）、以及已經藉由諸如以下等技術獲得的ISV：親和力成熟（例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始）、CDR移植、鑲面、組合衍生自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引子的PCR組裝、和熟練技術人員熟知的工程化免疫球蛋白序列的類似技術；或任何前述的任何合適的組合。
[0378]類似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或者合成的或半合成的序列，並且可以是例如透過PCR從合適的天然存在的模板分離的序列（例如，從細胞分離的DNA或RNA）、已經從文庫（並且特別是，表現文庫）分離的核苷酸序列、已經藉由將突變引入天然存在的核苷酸序列製備的核苷酸序列（使用本身已知的任何合適的技術，諸如錯配PCR）、已經透過使用重疊引子的PCR製備的核苷酸序列，或者已經使用本身已知的DNA合成技術製備的核苷酸序列。
[0379]通常，Nanobody® ISV（特別是V
HH序列，包括（部分）人源化V
HH序列和駝類化V
H序列）的特徵可以是在一個或多個架構序列（同樣如本文進一步所述）中存在一個或多個「標誌殘基」（如本文所述）。因此，通常，Nanobody® ISV可以被定義為具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列：
[0380]FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0381]其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中標誌殘基中的一個或多個是如本文進一步所定義的。
[0382]特別地，Nanobody® ISV可以是具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列：
[0383]FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0384]其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中所述架構序列是如本文進一步所定義的。
[0385]更特別地，Nanobody® ISV可以是具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列：
[0386]FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
[0387]其中FR1至FR4分別是指架構區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中：
[0388]根據Kabat編號，在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的胺基酸殘基中的選自下
表 A中提及的標誌殘基中的一個或多個。
表 A：Nanobody® ISV中的標誌殘基
[0389]如本文所用的術語「CD28」是指在T細胞上表現的跨膜共刺激訊息傳遞蛋白。CD28參與T細胞啟動、增殖、細胞激素產生、和存活。示例性野生型人類CD28胺基酸序列可以根據NCBI參考序列：NP_006130.1；和Uniprot參考號：P10747找到。
[0390]如本文所用的術語「腫瘤相關抗原」或「TAA」是指由腫瘤細胞或在腫瘤基質中高度表現的任何抗原。術語腫瘤相關抗原包括對腫瘤不完全特異但在腫瘤或其基質上過表現的TAA。術語腫瘤相關抗原還包括只在腫瘤上表現的腫瘤特異性抗原。
[0391]如本文所用，「CD28結合多肽」或「抗CD28抗體」是指具有至少一個特異性結合CD28的抗原結合位點的任何抗原結合蛋白。它包括呈具有兩個CD28結合位點的二價形式的抗體（諸如天然免疫球蛋白分子或F(ab)’2片段）以及呈具有單個CD28結合位點的單價形式的抗體。在本文中，CD28結合多肽典型地是含有免疫球蛋白單可變結構域抗體（例如，VHH）的多肽，其具有至少一個特異性結合CD28的免疫球蛋白單可變結構域（例如，VHH結構域）。在某些實施例中，抗CD28抗體或其抗原結合片段包含選自表2的VHH胺基酸序列中的任一個的VHH結構域。
表 2. VHH 胺基酸序列。
[0392]本文提供的CD28結合多肽包括單價和多價（例如，二價）構建體。在一些實施例中，本文提供的CD28結合多肽含有一個或兩個免疫球蛋白單可變結構域（例如，VHH結構域），其各自單獨結合CD28。
[0393]在某些實施例中，抗CD28抗體或其抗原結合片段包含與表2中列舉的VHH序列中的任一個的胺基酸序列至少約80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多相同的VHH結構域。
[0394]在某些實施例中，抗CD28抗體或其抗原結合片段包含與表1中列舉的HCDR1、HCDR2或HCDR3胺基酸序列中的任一個至少約90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多相同的HCDR1區、HCDR2區和HCDR3區。
[0395]在某些實施例中，所述抗CD28抗體或其抗原結合片段是嵌合或人源化抗體或其抗原結合片段。
[0396]在某些實施例中，所述抗CD28抗體或其抗原結合片段是單株抗體或其抗原結合片段。
[0397]在某些實施例中，所述抗CD28抗體或其抗原結合片段是單特異性抗體。
[0398]在某些實施例中，所述抗CD28抗體或其抗原結合片段是雙特異性抗體。
[0399]在某些實施例中，所述抗CD28抗體或其抗原結合片段是多特異性抗體。在一個實施例中，所述多特異性抗體包含至少一個Fab結構域。在某些實施例中，所述Fab的VH和VL結構域被表2中列舉的VHH胺基酸序列中的任一個替代。Fab結構域可以用作特定的異二聚化支架，所述異二聚化支架上可以連接額外的結合結構域。額外的結合結構域可以呈幾種不同的形式，包括但不限於另一種Fab結構域、scFv或sdAb（例如，VHH）。
[0400]如本文所用，「投予（administer）」或「投予（administration）」是指將存在於體外的物質（例如，本文所提供的抗體）注射或以其他方式物理遞送至患者的行為，諸如透過但不限於肺部（例如，吸入）、黏膜（例如，鼻內）、皮內、靜脈內、肌內遞送和/或本文所述或本領域已知的任何其他物理遞送方法。當要管理或治療疾病或其症狀時，物質的投予典型地在疾病或其症狀發作之後進行。當要預防疾病或其症狀時，物質的投予典型地在疾病或其症狀發作之前進行，並且可以長期持續以延遲或減少疾病相關症狀的出現或程度。
[0401]「有效量」意指活性藥劑（例如，本公開文本的分離的結合多肽）的足以在需要藥劑的個體中實現所希望的生理學結局的量。根據待治療個體的健康和身體狀況、待治療個體的分類組、組成物的調配、個體醫療狀況的評估和其他相關因素，有效量可以在個體之間有所不同。
[0402]如本文所用，術語「受試者」和「患者」可互換地使用。如本文所用，受試者可以是哺乳動物，諸如非靈長類動物（例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等）或靈長類動物（例如，猴和人類）。在某些實施例中，如本文所用，術語「受試者」是指脊椎動物，諸如哺乳動物。哺乳動物包括但不限於人類、非人類靈長類動物、野生動物、未馴服的動物、農場動物、運動動物和寵物。
[0403]如本文所用，術語「療法」是指可以用於預防、管理、治療和/或改善疾病或與其相關的症狀的任何方案、方法和/或藥劑。在一些實施例中，術語「療法」是指可以用於調節受試者對感染的免疫反應或與其相關的症狀的任何方案、方法和/或藥劑。在一些實施例中，術語「療法（therapies）」和「療法（therapy）」是指本領域具有通常知識者（諸如醫務人員）已知的可用於預防、管理、治療和/或改善疾病或與其相關的症狀的生物療法、支持療法和/或其他療法。在其他實施例中，術語「療法（therapies）」和「療法（therapy）」是指本領域具有通常知識者（諸如醫務人員）已知的可用於調節受試者對感染的免疫反應或與其相關的症狀的生物療法、支持療法和/或其他療法。
[0404]如本文所用，術語「治療（treat）」、「治療（treatment）」和「治療（treating）」是指由一種或多種療法的投予（包括但不限於投予一種或多種預防或治療劑，諸如本文所提供的分離的結合多肽）引起的疾病或與其相關的症狀的進展、嚴重程度和/或持續時間的降低或改善。如本文所用，術語「治療」還可以指代改變被治療受試者的病程。治療的治療性作用包括但不限於預防疾病的發生或復發、緩和一種或多種症狀、減少疾病的直接或間接病理後果、降低疾病進展的速度、改善或減緩疾病狀態以及緩解或改善預後。
[0405]除非另有說明，否則術語「腫瘤細胞」、「癌細胞」、「癌症」、「腫瘤」和/或「瘤」在本文中可互換使用，並且是指展現出會干擾身體器官和系統的正常功能發揮的不受控制的生長和/或異常增加的細胞存活和/或細胞凋亡的抑制的一種細胞（或多種細胞）。此定義包括良性和惡性癌症、息肉、增生以及休眠的腫瘤或微轉移。術語「癌症」和「腫瘤」涵蓋實體癌和血液/淋巴癌，並且還涵蓋惡性、惡變前和良性生長，諸如發育不良。此定義還包括具有不受免疫系統阻礙（例如，免疫逃避和免疫逃避機制）的異常增殖的細胞（例如，病毒感染的細胞）。
[0406]如本文所用，「免疫疾病」是指與個體中免疫反應（包括細胞和/或體液免疫反應）的發展相關的任何疾病。免疫疾病的例子包括但不限於發炎、過敏、自體免疫疾病、移植物相關疾病、癌症和病毒感染。
[0407]如本文所用，「自體免疫性疾病」是指這樣的疾病狀況和狀態，其中個體的免疫反應針對個體自身成分，從而導致不希望的且經常使人衰弱的狀況。如本文所用，「自體免疫性疾病」旨在進一步包括自體免疫性疾病、症候群等。
抗原結合蛋白的表現 [0408]在一態樣，提供了編碼本文所公開的抗體及其抗原結合片段的核酸分子。還提供了製備結合蛋白的方法，所述方法包括表現這些核酸分子。
[0409]典型地將編碼本文公開的抗體的核酸分子插入表現載體中以引入宿主細胞中，所述宿主細胞可以用於生產希望量的抗體。因此，在某些態樣，本公開文本提供了包含本文公開的核酸分子的表現載體以及包含這些載體和核酸分子的宿主細胞。
[0410]術語「載體」或「表現載體」在本文中用於意指根據本公開文本用作引入細胞中並且在細胞中表現所希望的基因的運載體（vehicle）的載體。如本領域具有通常知識者所知，此類載體可以容易地選自質體、噬菌體、病毒和反轉錄病毒。一般而言，與本公開文本相容的載體將包含選擇標記、促進所希望的基因的選殖的適當的限制性位點，以及進入真核或原核細胞和/或在所述細胞中複製的能力。
[0411]出於本公開文本的目的，可以使用許多表現載體系統。例如，一種類別的載體利用源自動物病毒（諸如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒（RSV、MMTV或MOMLV）或SV40病毒）的DNA元件。其他涉及具有內部核糖體結合位點的多順反子系統的使用。另外，可以透過引入一種或多種標記物來選擇已經將DNA整合至其染色體中的細胞，所述標記物允許選擇轉染的宿主細胞。標記物可以提供對營養缺陷型宿主的原營養、殺生物劑抗性（例如，抗生素）或對重金屬（諸如銅）的抗性。選擇標記基因可以直接與待表現的DNA序列連接，或者透過共轉化引入同一細胞中。還可能需要另外的元件來最佳地合成mRNA。這些元件可以包括訊號序列、剪接訊號以及轉錄啟動子、增強子和終止訊號。在一些實施例中，將選殖的可變區基因與如上所討論合成的重鏈恆定區基因（例如，人類恆定區基因）一起插入表現載體中。
[0412]在其他實施例中，抗體可以使用多順反子構建體表現。在此類表現系統中，可以從單一多順反子構建體產生多種感興趣的基因產物，諸如抗體的重鏈和輕鏈。這些系統有利地使用內部核糖體進入位點（IRES）以在真核宿主細胞中提供相對高水平的多肽。相容的IRES序列在美國專利號6,193,980中公開，出於所有目的，將所述專利通過引用以其全文併入本文。本領域具有通常知識者將理解，此類表現系統可以用於有效產生本申請中公開的全系列多肽。
[0413]更一般地，一旦製備了編碼抗體或其片段的載體或DNA序列，就可以將表現載體引入適當的宿主細胞中。也就是說，宿主細胞可以被轉化。可以透過本領域具有通常知識者熟知的各種技術來將質體引入宿主細胞中。這些技術包括但不限於轉染（包括電泳和電穿孔）、原生質體融合、磷酸鈣沉澱、與包膜DNA的細胞融合、顯微注射和用完整病毒感染。參見Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" 第24.2章, 第470-472頁 Vectors, Rodriguez和Denhardt編輯 (Butterworths, Boston, Mass. 1988)。可以透過電穿孔將質體引入宿主中。使轉化的細胞在適於產生輕鏈和重鏈的條件下生長，並且測定重鏈和/或輕鏈蛋白質合成。示例性測定技術包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）或螢光啟動細胞分選儀分析（FACS）、免疫組織化學等。
[0414]如本文所用，術語「轉化」應在廣義上使用，是指將DNA引入受體宿主細胞中，從而改變基因型。
[0415]沿著相同的思路，「宿主細胞」是指已經採用使用重組DNA技術構建的並且編碼至少一種異源基因的載體轉化的細胞。在描述用於從重組宿主中分離多肽的過程時，除非另外明確說明，否則術語「細胞」和「細胞培養物」可互換地使用以表示抗體的來源。換言之，從「細胞」中回收多肽可以意指從離心沉澱的全細胞、從裂解細胞培養物的上清液、或從含有培養基和懸浮細胞兩者的細胞培養物中回收。
[0416]在一個實施例中，用於抗體表現的宿主細胞株是哺乳動物來源的。本領域具有通常知識者可以確定最適合所需基因產物在其中表現的特定宿主細胞株。示例性宿主細胞株包括但不限於DG44和DUXB11（中國倉鼠卵巢株，DHFR-）、HELA（人類子宮頸癌）、CV-1（猴腎株）、COS（具有SV40 T抗原的CV-1的衍生物）、R1610（中國倉鼠纖維母細胞）、BALBC/3T3（小鼠纖維母細胞）、HEK（人類腎臟株）、SP2/O（小鼠骨髓瘤）、BFA-1c1BPT（牛內皮細胞）、RAJI（人類淋巴細胞）、293（人類腎）。在一個實施例中，細胞株提供由其表現的抗體的改變的糖基化，例如無岩藻糖基化（例如，PER.C6®（Crucell）或FUT8敲除CHO細胞株（POTELLIGENT®細胞）（Biowa，普林斯頓，新澤西州））。在一個實施例中，可以使用NS0細胞。CHO細胞是特別有用的。宿主細胞株典型地可從商業服務（例如，美國組織培養物保藏中心（American Tissue Culture Collection）或從公開文獻的作者獲得。
[0417]體外生產允許按比例放大以得到大量的所希望的多肽。在組織培養條件下用於哺乳動物細胞培養的技術是本領域已知的，並且包括同質懸浮培養（例如，在氣升式反應器或連續攪拌反應器中）或者在瓊脂糖微珠或陶瓷盒上的固定化或包埋的細胞培養（例如，在中空纖維、微膠囊中）。如果必要和/或需要的話，可以透過常規層析方法（例如，凝膠過濾、離子交換層析法、在DEAE-纖維素上的層析法和/或（免疫）親和層析法）純化多肽的溶液。
[0418]編碼本公開文本所述的抗體的基因也可以在非哺乳動物細胞（諸如細菌或酵母或植物細胞）中表現。在這方面，應當理解，也可以轉化多種單細胞非哺乳動物微生物諸如細菌，即能夠在培養或發酵中生長的那些微生物。易於轉化的細菌包括以下的成員：腸桿菌科，諸如大腸桿菌（
Escherichia coli）或沙門氏菌屬（
Salmonella）的菌株；芽孢桿菌科，諸如枯草芽孢桿菌（
Bacillus subtilis）；肺炎球菌屬（
Pneumococcus）；鏈球菌屬（
Streptococcus）和流感嗜血桿菌（
Haemophilus influenzae）。還應理解，當在細菌中表現時，結合蛋白可以成為包涵體的一部分。在一些實施例中，然後將結合蛋白分離出來、純化並且組裝成功能分子。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白在細菌宿主細胞中表現。在一些實施例中，將細菌宿主細胞用包含編碼本公開文本的結合蛋白的核酸分子的表現載體轉化。
[0419]除了原核生物之外，還可以使用真核微生物。釀酒酵母或普通麵包酵母是真核微生物中最常用的，儘管許多其他菌株是通常可獲得的。對於在酵母屬（
Saccharomyces）中的表現，通常使用例如質體YRp7（Stinchcomb等人，Nature, 282:39 (1979)；Kingsman等人，Gene, 7:141 (1979)；Tschemper等人，Gene, 10:157 (1980)）。此質體已經含有TRP1基因，其提供缺乏在色胺酸中生長的能力的酵母突變菌株的選擇標記物，例如ATCC編號44076或PEP4-1（Jones, Genetics, 85:12 (1977)）。然後，作為酵母宿主細胞基因組的特徵的trpl損傷的存在提供透過在沒有色胺酸的情況下生長來檢測轉化的有效環境。
投予抗原結合蛋白的方法 [0420]製備並且向受試者投予抗原結合蛋白（例如，本文所公開的抗CD28抗體或其抗原結合片段）的方法是本領域具有通常知識者熟知或容易確定的。本公開文本抗原結合蛋白的投予途徑可以是口服、腸胃外、經由吸入或局部。如本文所用的術語腸胃外包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或陰道投予。雖然所有這些形式的投予均被明確認為在本公開文本的範圍內，但投予的形式將是用於注射、具體地是用於靜脈內或動脈內注射或滴注的溶液。通常，適於注射的醫藥組合物可以包含緩衝液（例如，乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液）、表面活性劑（例如，聚山梨醇酯）、任選地穩定劑（例如，人類白蛋白）等。然而，在與本文的傳授內容相容的其他方法中，可以將經修飾的抗體直接遞送至不良細胞群體的部位，由此增加患病組織對治療劑的暴露。
[0421]用於腸胃外投予的製劑包括無菌水性或非水性溶液、混懸劑和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油（諸如橄欖油）以及可注射的有機酯（諸如油酸乙酯）。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。在本公開文本的組成物和方法中，醫藥上可接受的載劑包括但不限於0.01至0.1 M或0.05 M磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常見的腸胃外媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或固定油。靜脈內媒劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑（諸如基於林格氏右旋糖的那些）等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如像抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。更具體地，適合於注射使用的醫藥組成物包括無菌水溶液（在水溶的情況下）或分散體，以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。在此類情況下，組成物必須是無菌的並且應當是易於注射的程度的流體。它應在製造和儲存條件下穩定，並且還應防止微生物（諸如細菌和真菌）的污染作用。載劑可以是溶劑或分散介質，所述溶劑或分散介質含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物。例如通過使用包衣（諸如卵磷脂），在分散體的情況下通過維持所需細微性以及通過使用表面活性劑，可以維持適當的流動性。
[0422]防止微生物的作用可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑（例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等）來實現。也可以在所述組成物中包含等滲劑，例如糖、多元醇（諸如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉）。透過在組成物中包含延遲吸收的藥劑（例如，單硬脂酸鋁和明膠），可以實現可注射組成物的延長吸收。
[0423]在任何情況下，無菌可注射溶液可以透過如下方式來製備：將活性化合物（例如，經修飾的結合多肽自身或與其他活性劑組合）以所需的量摻入適當的溶劑中，然後過濾滅菌，所述溶劑根據需要具有本文列舉的成分中的一種或其組合。通常，透過將活性化合物摻入無菌媒劑中來製備分散體，所述無菌媒劑含有鹼性分散介質和來自以上列舉的那些的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，製備方法典型地包括真空乾燥和冷凍乾燥，所述真空乾燥和冷凍乾燥由先前無菌過濾的溶液產生活性成分和任何另外的希望成分的粉末。將用於注射的製劑加工，填充至容器（諸如安瓿、袋子、瓶、注射器或小瓶）中，並且根據本領域已知的方法在無菌條件下密封。此外，製劑可以以套組的形式包裝和銷售，諸如US 20020102208和US 6994840中描述的那些，將所述專利中的每個通過引用併入本文。此類製品可以包括標籤或包裝說明書，其表明相關組成物可用於治療患有或易患自體免疫或腫瘤障礙的受試者。
[0424]用於治療上述病症的本公開文本組成物的有效劑量根據許多不同因素而變化，所述因素包括投予方式、靶部位、患者的生理狀態、患者是人類還是動物、所投予的其他藥物以及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者是人類，但是也可以治療非人類哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。治療劑量可以使用本領域具有通常知識者已知的常規方法逐步調整，以優化安全性和功效。
[0425]如前所討論，本公開文本的抗原結合蛋白、其免疫反應性片段或重組體可以以醫藥有效量投予，用於哺乳動物障礙的體內治療。在這一方面，應當理解，所公開的抗原結合蛋白將被調配成有利於投予且促進活性劑的穩定性。
[0426]根據本公開文本的醫藥組成物典型地包括醫藥上可接受的無毒無菌載劑，諸如生理鹽水、無毒緩衝液、防腐劑等。出於本申請的目的，應保持與治療劑接合或未接合的經修飾的抗原結合蛋白、其免疫反應性片段或重組體的醫藥有效量意指足以實現與抗原的有效結合且足以獲得益處（例如，足以改善疾病或障礙的症狀或檢測物質或細胞）的量。在腫瘤細胞的情況下，經修飾的結合多肽典型地將能夠與腫瘤細胞或免疫反應性細胞上選擇的免疫反應性抗原相互作用，並且提供那些細胞死亡的增加。當然，本公開文本的醫藥組成物可以以單劑量或多劑量投予，以提供醫藥有效量的經修飾的結合多肽。
[0427]為了與本公開文本的範圍保持一致，本公開文本的抗原結合蛋白可以按照上述治療方法以足以產生治療性或預防性作用的量投予至人類或其他動物。本公開文本的抗原結合蛋白可以以常規劑型投予至這樣的人類或其他動物，所述常規劑型透過根據已知技術將本公開文本的抗體與常規醫藥上可接受的載劑或稀釋劑組合來製備。本領域具有通常知識者將認識到，醫藥上可接受的載劑或稀釋劑的形式和特徵取決於待與其組合的活性成分的量、投予途徑和其他熟知的變數。本領域具有通常知識者將進一步理解，包含本公開文本所述的一個或多個種類的結合多肽的混合物可以證明是特別有效的。
[0428]本文所定義的醫藥組成物的生物活性可以例如透過細胞毒性測定來確定，如在以下例子中、在WO 99/54440中或由Schlereth等人（Cancer Immunol. Immunother. 55 (2006), 503-514）所述。生物活性也可以透過T細胞活化測定來確定，諸如透過檢測促炎或抗炎細胞激素的表現。如本文所用的「功效」或「體內功效」是指對本發明醫藥組成物的療法的反應，使用例如標準化的NCI反應標準。使用本發明醫藥組成物的療法的成功或體內功效是指所述組成物對於其預期目的的有效性，即，所述組成物引起其所希望的效果（即，病理細胞（例如，腫瘤細胞或抑制活性免疫細胞）的耗盡）的能力。可以透過已建立的標準方法對各自的疾病實體監測體內功效，包括但不限於白血球計數、差異、螢光啟動細胞分選法、骨髓穿刺。另外，可以使用各種疾病特有的臨床化學參數和其他已建立的標準方法。
實例 [0429]提出以下實例以向本領域具有通常知識者提供關於如何製備和使用本發明中表徵的方法和組成物的完整公開內容和描述，並且不旨在限制諸位發明人視為其發明的範圍。已經努力確保關於所使用的數位（例如，量、溫度等）的準確性，但應考慮一些實驗誤差和偏差。除非另外指示，否則份數是重量份，分子量是平均分子量，溫度是按攝氏度計，並且壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實例 1. 材料與方法 細胞株和人類供體來源的細胞 [0430]來自健康供體的膚色血球層獲自法國血庫（Etablissement Français du Sang）。用Ficoll梯度純化外周血單核細胞後，根據製造商的說明書使用RoboSep™人T細胞富集套組（StemCell Technologies，19051）富集總CD3
+T細胞。透過將使用單核細胞純化套組（StemCell Technologies，17858）從外周血單核細胞分離的單核細胞在體外用200 ng/mL IL-4（Miltenyi Biotec，130-093-922）和200 ng/mL顆粒球巨噬細胞集落刺激因子（Miltenyi Biotec，130-093-866）培養7天產生樹突狀細胞（DC）。FreeStyle™ HEK293-FS細胞購自Invitrogen，Jurkat細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC，TIB-152），且Jurkat-IL-2-Luc2P細胞購自Promega。在37ºC下，使所有細胞株在含有5% CO
2的濕潤氣氛中在細胞供應商推薦的培養基中生長。所有細胞株培養基和試劑均購自Gibco。在內部產生並純化TGN1412和9.3抗體。
用於 CD28 表現的轉染 [0431]使用293fectin
TM（Gibco，12347-019），根據製造商的說明書用編碼人類CD28的高品質質體製劑轉染FreeStyle™ HEK293-FS細胞。轉染後48小時，使用AF647接合的抗人類CD28 mAb（BD Pharmingen™，560683）以流式細胞儀評價CD28表現。
實例 2. 美洲駝免疫接種與文庫構建 [0432]免疫接種和文庫構建由VIB Nanobody服務設施（VIB Nanobody Service Facility）（比利時，布魯塞爾）進行。如圖1所示，透過皮內注射四次，每次用大約2 mg攜帶目的基因（人類全長CD28和人類全長TAA）的載體，針對CD28和TAA對美洲駝進行免疫接種（DNA免疫接種）。每次注射後，將動物電穿孔以將DNA構建體引入動物細胞中。在最後一次DNA注射三周後，用重組蛋白（人類CD28 [Sino Biological，11524-HCCH]，內部產生的人類TAA；蛋白加強佐劑，GERBU LQ 3000）對動物進行皮下加強。在蛋白加強後四天，收集抗凝血血液用於VHH文庫構建，如圖1所示。圖1總結了CD28xTAA雙特異性篩選的通用工作流程：針對CD28和TAA對美洲駝進行免疫接種（DNA免疫接種），並且構建VHH文庫用於對重組蛋白和細胞進行噬菌體展示選擇；針對結合對殖株進行快速篩選，定序，並且與人類恆定結構域CH1或Cλ同框選殖，以透過在FreeStyle™ HEK293-FS細胞中的暫態轉染產生bsFab。在初代細胞測定中對細胞上清液進行功能性篩選，並且進一步表徵感興趣的殖株的結合特性和生物學功能。
[0433]如前所述，構建VHH文庫用於對重組蛋白和細胞進行噬菌體展示選擇。從外周血淋巴細胞中提取總核糖核酸，並且作為模板用於用寡聚(去氧胸腺嘧啶)引子進行第一鏈互補DNA合成。透過聚合酶鏈反應從互補DNA擴增VHH編碼序列，用PstI和NotI消化，並且選殖於噬菌粒載體pHEN4的PstI與NotI位點之間，人類流感血凝素十肽標籤的上游。獲得大約10
8個獨立轉化體的VHH文庫。如圖1所示，然後針對結合對殖株進行快速篩選，定序，並且與人類恆定結構域CH1或Cλ同框選殖，以透過在FreeStyle™ HEK293-FS細胞中暫態轉染產生bsFab。在初代細胞測定中對細胞上清液進行功能性篩選，並且進一步表徵感興趣的殖株的結合特性和生物學功能。
噬菌體展示淘選（ Phage Display Panning ） [0434]如上所述獲得即用噬菌體-VHH製劑。使細菌文庫在2YTAG培養基（2×YT培養基，胺苄青黴素100 μg/mL，葡萄糖2%）中生長直至600 nm處的吸光度（OD600）達到0.5，並且用M13K07輔助噬菌體（Invitrogen）感染。離心後，將細菌重懸於2YTAK培養基（2×YT培養基，胺苄青黴素100 μg/mL，卡那黴素50 μg/mL）中，並且生長過夜。透過添加聚乙二醇8000（PEG8000）20%（重量/體積 [w/v]）和2.5 M NaCl從培養上清液沉澱噬菌體顆粒，離心，並且重懸於磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中。使噬菌體再經受一次洗滌和沉澱步驟，並且最後重懸於冷PBS/甘油15%（體積/體積 [v/v]）中。
重組蛋白的淘選 [0435]如所述進行重組蛋白的淘選。根據製造商的推薦，用帶His標籤的CD28或TAA重組蛋白披覆M-450環氧珠（Dynabeads，Invitrogen）。在室溫（RT）下，將噬菌體-VHH文庫（10
11個噬菌體/輪選擇）和珠（經披覆的和裸露的）在PBS/乳2%（w/v）中飽和1小時。首先透過在裸珠上培育30分鐘來將噬菌體-VHH文庫耗盡兩次，以消除非特異性殖株。回收未結合的噬菌體-VHH，並且將其與靶偶聯珠在PBS/乳2%（w/v）中在室溫下培育2小時。用PBS/Tween 0.1%（v/v）洗滌10次並且用PBS洗滌兩次後，將結合的噬菌體-VHH重懸於PBS中（輸出選擇），將其添加到指數生長的TG1細菌中，並且在2YTAG培養基中擴增過夜用於新一輪淘選，或者鋪盤於2YTAG盤上。
對細胞的淘選 [0436]在4ºC下對CD28或TAA轉染的FreeStyle™ HEK293-FS細胞進行淘選。用PBS洗滌兩次後，將細胞沉澱重懸於PBS中，並且如前所述將其裝載到胎牛血清/Percoll梯度上。離心後，收集細胞層並且用PBS洗滌兩次。將具有結合的噬菌體的回收細胞添加到第二胎牛血清/Percoll梯度中，並且洗滌，然後使用珠（Dynabeads，Invitrogen）進行機械裂解。將回收的噬菌體-VHH用於感染指數生長的大腸桿菌TG1細菌，並且在2YTAG培養基中擴增過夜用於新一輪淘選，或者鋪盤於2YTAG盤上。
類 Fab 抗體（ Fab-like ）的構建、生產和純化 [0437]用聚合酶鏈反應擴增後，將抗CD28 VHH或抗TAA VHH或抗口蹄疫病毒（FMDV）VHH的互補DNA（Harmsen等人，Veterinary microbiology. 2007; 120(3-4):193-206）選殖到專有哺乳動物表現載體中，與融合至人類流感血凝素和6-His標籤的人類CL結構域或人類IgG1 CH1結構域同框。使用NucleoBond Macherey-Nagel套組純化質體並且進行Sanger定序。通過用編碼與每個Fab恆定結構域融合的兩個不同（bsFab）或兩個相同（bvFab）VHH的兩種質體的混合物共轉染FreeStyle™ HEK293-FS細胞產生雙特異性（bsFab）或二價Fab樣（bvFab）抗體。7天後收穫上清液，在鎳親和柱上純化，並且在CALIPER GXII（Perkin Elmer）上分析。
流式細胞儀結合和競爭測定 [0438]所有流式細胞儀測定均在MACSQuant細胞儀（Miltenyi Biotec，德國）上使用V形底96孔微量滴定盤進行。對細胞進行關於活單細胞的圈選（Dapi染色），並且對於每個樣品收集10
4個事件。使用MACSQuant軟體分析資料，並且將結果表示為螢光強度的中位數。
[0439]首先將Jurkat細胞與連續稀釋的bvFab在4ºC下培育1小時，並且然後與有效濃度為90%（EC90）的人CD80-Fc融合物在4ºC下培育30分鐘。用抗人類IgG（Fc特異性）mAb（Sigma，I2136），然後用Alexa647接合的山羊抗小鼠mAb（Invitrogen，A11013）檢測結合的配體。
競爭性結合測定（使用酶聯免疫吸附測定 [ELISA] 的 TGN1412 和 9.3 mAb 競爭） 在 96 孔盤中產生噬菌體 -VHH [0440]使目的CD28 VHH的單獨TG1集落在2YTA培養基中在37ºC下生長，直到OD600達到0.5。然後將細胞用M13K07輔助噬菌體感染，並且在30ºC下在2YTAK中生長過夜。收穫含有噬菌體-VHH的上清液並且用於測試。
ELISA [0441]在Nunc® MaxiSorp™ 96孔盤（Sigma）上進行ELISA，用在PBS中的1 µg/mL的人CD28重組蛋白在4ºC下預披覆過夜，並且進一步用PBS/乳2%（w/v）在室溫下飽和1小時。然後將連續稀釋的競爭者mAb（TGN1412或9.3）在室溫下培育1小時，並且在室溫下在30分鐘內進一步添加處於其EC90的噬菌體-VHH。在PBS/Tween 0.1%（v/v）中洗滌幾次後，添加抗M13辣根過氧化物酶接合的mAb（Santa Cruz Biotechnology，sc-53004）來檢測結合的噬菌體-VHH。使用3,3',5,5'-四甲基聯苯胺受質（Thermo Scientific，34029）進行過氧化物酶活性的檢測。在添加硫酸終止溶液後，在SpectraMax微盤讀取器（Molecular Devices）上在OD 450 nm處測量吸光度。
報告物測定 對於 CD3 預活化的條件 [0442]將孔用50 µL抗CD3（UCHT-1殖株，BioLegend，BLE300414）披覆（Costar 3917板），在4ºC下儲存過夜，並且然後用100 µL PBS/孔洗滌兩次。在其指數生長期內收穫Jurkat-IL-2-Luc2P細胞，並且將25 µL細胞懸浮液添加到含有25 µL測試化合物的96孔盤（50,000個細胞/孔）中。
對於交聯實驗 [0443]將測試化合物與飽和濃度的抗人類Fab（Sigma，I5260）或抗人類Fc（Sigma，I2136）在室溫下預培育30分鐘。在其指數生長期內收穫Jurkat-IL-2-Luc2P細胞，並且將25 µL細胞懸浮液添加到含有25 µL交聯或非交聯測試化合物的96孔盤（50,000個細胞/孔）中。
對於表現 TAA 的細胞的條件 [0444]在其指數生長期內收穫Jurkat-IL-2-Luc2P細胞，並且與表現TAA的細胞混合以獲得報告細胞與輔助細胞之間1：1的最終比率。將25 µL細胞懸浮液添加到含有25 µL測試化合物的96孔盤（50,000個細胞/孔）中。
[0445]對於所有三種條件（CD3預活化、交聯和表現TAA的細胞），將盤在37ºC下在5% CO
2的濕潤培養箱中培育6小時。然後將50 μL根據製造商說明書配製的Bio-GloTM（Promega，G7941）試劑添加到每個孔中並且混合。至少5分鐘允許發生完全細胞裂解，隨後使用Envision多模式盤讀取器（Perkin Elmer）測量發光。
T 細胞活化測定 [0446]將U形底384孔盤用5 μg/mL的抗人類CD3抗體（eBioscience，15288347，OKT3殖株）在4ºC下披覆過夜。將盤用PBS洗滌，並且將50,000個T細胞添加到存在10 nM、30 nM和100 nM陰性（同種型或FMDV bvFab）和陽性（TGN1412，或9.3 mAb）對照抗體或測試化合物（CD28×FMDV bsFab和CD28 bvFab）的完全X-VIVO
TM15培養基（Lonza，BE02-060F）中，並且在5% CO
2培養箱中在37ºC下培育。培育6天後，收集上清液並且儲存在-20ºC直至細胞激素測量。將Promega CellTiter-Glo
®試劑添加到細胞中進行細胞計數。根據製造商的說明書（Cisbio），使用均相時間分辨螢光人類IFNγ/腫瘤壞死因子（TNF）α細胞激素套組測量細胞激素水平。在PHERAstar FSX多模式讀取器（BMG Labtech）上讀取樣品。資料表示為與陰性對照相比的效果百分比。
混合白血球反應（ MLR ） [0447]在測定開始時，將羧基螢光素琥珀醯亞胺酯（CFSE）標記的CD3
+T細胞（1 × 10
5）和同種異體DC（1 × 10
4）與或不與10 nM陰性（FMDV bvFab）和陽性（TGN1412或9.3 mAb）對照抗體或測試化合物（CD28×TAA bsFab和CD28 bvFab）共培養。4天後，收集上清液，並且根據製造商的說明書使用CBA人類Th1/Th2/Th17套組（BD Biosciences，550749）測量細胞激素水平。用針對CD4（BD Biosciences，563550）、CD8（BD Biosciences，560662）、CD25（BD Biosciences，555434）和CD69（BD Biosciences，562617）的抗體混合物對細胞進行染色。使用CFSE稀釋液測量T細胞增殖。在Fortessa X-20流式細胞儀（BD Biosciences）上分析樣品。
表位分箱 [0448]使用BIAcore T200（升級版T100，Cytiva Life Sciences，法國）儀器用HBS EP+作為運行緩衝液（0.01 M HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mM乙二胺四乙酸，0.005% [v/v] 表面活性劑P20；Cytiva Life Sciences Biacore BR100826）用表面等離子體共振（SPR）進行CD28抗體的串聯表位分箱。將抗人類Fc抗體（人類抗體捕獲套組，Cytiva LifeSciences BR-1008-39）共價偶聯在感測器晶片CM5（Cytiva LifeSciences, Biacore BR100530）上。
[0449]獨立製備四個流通池中的每一個。將所有四個流通池首先用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺混合物（75至11.5 mg/mL）以5 µL/分鐘的流速（胺偶聯套組，Cytiva LifeSciences，BR100050）活化7分鐘。將抗人類Fc抗體在10 mM乙酸鹽pH 5.0中稀釋至25 μg/mL，並且以5 µL/分鐘的流速偶聯7分鐘。然後，使用5 µL/分鐘的流速，用1 M甲醇胺pH 8.5脈衝7分鐘，使未偶聯位點失活。典型地在所有點上觀察到大約10,000個共振單位（RU）的抗體。
[0450]表面製備後，將huCD28-huFc（Sino Biological，11524-H02H）在運行緩衝液中稀釋至0.5 μg/mL，並且以5 μL/分鐘捕獲120秒至200 RU（僅在FC2或FC4上）。以30 µL/分鐘進行雙重注射，其中在120秒內第一次注射含有第一測試bsFab的粗HEK293-FS上清液（飽和和穩定性條件），然後在60秒內第二次注射含有第二測試bsFab的粗HEK293-FS上清液（在FC1-FC2或FC3-FC4兩者上）。然後監測解離持續60秒。用3 M MgCl
2的30秒脈衝，使用10 µL/分鐘的流速將表面再生。
[0451]透過減去參考點（無huCD28-huFc）和緩衝液注射物來對傳感圖進行雙重參比。計算每個抗體對的標準化競爭訊號（C = 標準化訊號SN2 - 標準化訊號SN1）。標準化訊號對應於用huCD28-Fc捕獲標準化的訊號。對於定性資料，C ＜+5表示沒有SN2結合和競爭；C ＞+5表示SN2結合和沒有競爭。對於基於標準化訊號的定量資料（完全或部分競爭），使用方程C*100/（理論NormB SN2-NormB解離SN1）進行分析。
統計分析 [0452]使用歐幾裡得距離矩陣（Euclidian distance matrix）和瓦爾德聚集方法（Ward’s aggregation method），使用統計軟體R 3.2.3進行雙向分層聚類，以在第一次或第二次注射每種結合劑時，將具有相同特徵的結合劑重新分組在簇中。使用根據系統樹圖的慣性跳躍（其中慣性是方差準則）的類數量的圖形表示來選擇簇的數量。使用雙尾t檢定計算皮爾遜相關係數（Pearson correlation coefficient）的p值。
實例 3. 結果 VHH 的選擇、篩選和重格式化（ reformatting ） [0453]本研究旨在探究基於VHH的bsFab在透過CD28受體啟動T細胞以殺傷腫瘤細胞中的用途，並且提供了對一組CD28構建體在結合、表位多樣性、促效劑和拮抗劑特性方面的深度表徵。
[0454]使用噬菌體展示分離針對CD28和TAA的VHH。構建一大組高度多樣化的VHH序列文庫，並且在兩輪選擇中對每種抗原或標靶表現細胞的純化重組胞外結構域進行生物淘選。選擇後，使用ELISA法對重組抗原進行篩選，每輪篩選一個盤（95個殖株）（資料未示出）。對於每次選擇，超過80%的測試殖株對其標靶具有特異性。對所有特異性殖株進行進一步定序，並且序列分析揭示了分離的CD28 VHH具有高多樣性和低冗餘，如圖2所示。簡而言之，序列分析由以下組成：藉由Clustal Omega比對透過噬菌體展示選擇鑒定的所有苗頭物（hit）的VHH序列；然後使用用Clustal Omega獲得的引導樹輸出構建圖2中所示的序列樹。圖中的比例尺（scale bar）對應於序列之間的距離，矩形標籤代表在表位分箱中測試的48個VHH，每個箱有一個顏色代碼（藍色 = D，橙色 = D*，綠色 = E，紅色 = F，灰色 = 未確定），並且黑色星號突出顯示了在細胞測定中進一步測試的化合物2至18。非統計分析（第二次注射分箱）清楚地鑒定了D組中的一個亞組或16個亞組；然而，沒有觀察到統計學上顯著的差異。
[0455]基於95%序列同一性的簇多樣性分析揭示了在277個CD28特異性殖株中，對重組蛋白分離出66個VHH簇，並且對CD28轉染的細胞分離出56個VHH簇。對於TAA特異性VHH發現了類似的結果（資料未示出）。
[0456]隨後，將47個具有高序列多樣性的抗CD28 VHH（圖2中的彩色標籤）與Cλ IgG結構域融合選殖，並且將39個抗TAA VHH與CH1 IgG結構域融合選殖用於真核表現。
實例 4. CD28×TAA bsFab 的產生和功能性篩選 [0457]使用圖1 (33) 中描繪的精簡且無連接子的類Fab形式產生CD28×TAA bsFab。更精確地，以1-mL規模產生47個抗CD28（加1個陰性對照）×39個抗TAA（加1個陰性對照）bsFab（即，24個96孔盤）的基質組合。對24個96孔盤中隨機地選擇的288個孔的上清液進行品質控制，總共三個品質控制盤。品質控制由以下三個部分組成：借助在HEK293-FS上清液中的滴定抗體產生（約20 μg/mL）來確認足夠的抗體量；進行卡尺測量（caliper）以確認上清液中二聚體的存在；並且分析HEK293-FS上清液中產生的類Fab抗體對兩種標靶CD28和TAA的ELISA結合能力，以揭示幾乎所有288種測試抗體的高效結合。
[0458]然後在功能測定中測試bsFab的24個96孔盤的上清液，評價bsFab在72小時觸發被純化T細胞殺傷表現TAA的腫瘤細胞以及IL-2和IFNg分泌的能力。儘管用陽性（CD3×TAA）和陰性（CD3×非相關標靶和CD28×非相關標靶）對照bsAb獲得的預期結果進行了實驗驗證，但1800 bsFab均未顯示出腫瘤細胞殺傷和IFNg分泌（資料未示出）。用四分之一的構建體進行的重複實驗證實了最初的結果。最後，純化一組34個bsFab，並且在劑量範圍實驗（0.1至300 nM）中在相同的測定中進行測試（資料未示出）。即使在300 nM的最高測試劑量下，也沒有觀察到腫瘤細胞殺傷和IFNg分泌。在最高劑量下，一些殖株檢測到輕微的IL-2分泌。
實例 5. 抗 CD28 VHH 的深度表徵 表位多樣性 [0459]為了檢驗以下假設：所有測試bsFab缺乏殺傷特性可能是由於所選擇的CD28 VHH的表位和功能缺乏多樣性的假設，首先對抗CD28 VHH的表位多樣性進行表徵。
[0460]使用SPR對48個CD28 VHH（包括上面測試的47個）進行的表位分箱實驗揭示了三個統計學上顯著的表位簇（使用歐幾裡德距離矩陣和瓦爾德聚集方法的雙向分層聚類），所述表位簇可以進一步細化為六個子簇，如圖3中和圖11的表中所示。不久，圖3示出了CD28 bsFab的表位分箱，即抗CD28 VHH與SPR之間的競爭。圖3A描繪了以下實驗方案：使用抗人類Fc抗體在感測器晶片CM5上捕獲人CD28-Fc，隨後，添加第一個CD28×TAA bsFab，然後添加第二個用於分箱分析，並且最後測試48 × 48個構建體。圖3B描繪了收集在熱圖中的競爭資料，其指示了每個VHH對是否競爭（綠色表示阻斷，紅色表示未阻斷）。使用雙-向分層聚類處理熱圖，產生系統樹圖和3個顯著不同的表位簇（A、B、C和D、E和F，取決於注射順序）。如圖3B所示，觀察到依賴於注射順序的不對稱性。
[0461]選擇一組有限的17個CD28 VHH（化合物2-18，由圖2中的星形標識）（其跨越不同的表位箱並且使序列多樣性最大化），以在用CD80的螢光啟動細胞分選競爭測定或用TGN1412或9.3 mAb的ELISA競爭測定中對表位多樣性進行正交分析。該分析揭示了CD28 VHH可以被分類為CD80的競爭者和非競爭者，在圖8中示出，圖中使用流式細胞儀描繪了CD28 bvFab與CD80的競爭，並且獨立地作為TGN1412或9.3 mAb的完全、部分或非競爭者。總之，圖8描繪了在添加EC90的重組人類CD80-Fc蛋白之前，與Jurkat細胞一起培育的CD28 bvFab的連續稀釋液。使用Alexa 647接合的抗人類Fc mAb透過流式細胞儀檢測配體結合。結果表示為螢光強度的中位數（MFI）。VHH子集的表位分箱和所有競爭資料包告在圖7中描繪的表中，所述表是來自表位分箱和與TGN1412和9.3基準抗體或CD80（CD28的天然配體之一）的競爭的結果總結表。
實例 6. 促效劑特性：報告物測定 [0462]為了評價CD28化合物的促效劑能力，使用基於生物發光報告細胞的測定，所述測定包括表現由IL-2啟動子驅動的螢光素酶報告基因的基因工程化Jurkat T細胞株。
[0463]首先在表現TAA的HCT116細胞存在下，在透過抗CD3披覆的mAb進行工程化Jurkat細胞的次優TCR啟動的情況下和在不存在活化的情況下測試一系列CD28×TAA bsFab。在圖9中，如果TCR被預活化，則所有bsFab允許IL-2啟動子的啟動，這意味著bsFab能夠同時結合兩個細胞，其中每個細胞表現CD28或TAA。圖9示出了CD28xTAA bsFab可以同時結合表現CD28或TAA的兩個細胞。總之，將Jurkat-IL-2-Luc2P細胞和表現TAA的HCT116細胞以1：1的比率添加到預披覆或未披覆抗CD3 mAb的96孔微盤中。然後將細胞與測試化合物在37ºC下以30 nM培育6小時，然後測量發光。示出了相對於用陰性對照（IRR = FMDV bvFab）處理的細胞標準化的螢光素酶發光訊號（S/B = 訊號比背景）。圖9的圖中的每個條表示兩個獨立實驗的平均值。
[0464]保留11個CD28 VHH用於深度的功能表徵，以保證最大表位覆蓋率和序列多樣性（圖7表格中的化合物2-12）。它們以Fab樣形式產生和純化，作為CD28×FMDV bsFab（CD28上的單價）或CD28 bvFab（二價Fab樣抗體，其中同一VHH與CH1和CL兩者融合）。在不透過抗CD3披覆的mAb進行次優TCR活化的情況下這些bsFab和bvFab的評價揭示了在沒有交聯的情況下，無論價態如何，構建體都沒有活性，而TGN1412和9.3 mAb具有高活性，如圖10A和10B所示。圖4和圖10示出了在以下IL-2螢光素酶報告物測定中對CD28 bsFab和bvFab的評價：將Jurkat-IL-2-Luc2P細胞添加到用抗CD3 mAb預披覆的96孔微盤中（如圖4和圖10的C至F所示）或不這樣（如圖10A和B所示）；然後將細胞與100 nM的先前交聯或未交聯的bsFab和bvFab在37ºC下培育6小時，然後測量發光，並且示出了相對於用陰性對照（IRR = FMDV bvFab）處理的細胞標準化的螢光素酶發光訊號（S/B = 訊號比背景）。這些測定進行三次並且繪製在圖4和圖10中。
[0465]然而，當交聯時，箱E和F的一些bvFab的活性水平低於針對TGN1412和9.3 mAb所看到的活性水平，如圖10B所示。就其作為促效劑而不是超級促效劑的描述而言，9.3 mAb在沒有CD3共活化的情況下誘導螢光素酶表現的能力是出乎意料的。這表明T細胞啟動與Jurkat報告物測定之間存在一些差異。
[0466]在CD3共活化的情況下，在不存在交聯的情況下，來自箱E的一個bvFab和來自箱F的四個bvFab中的三個能夠誘導IL-2途徑活化，而所有其他bsFab和bvFab在可溶條件下均無活性，如圖4C（其示出了在不存在交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab與二價CD28 bvFab）和圖10E（其示出了在CD3預活化後在不存在交聯的情況下的單價CD28 x FMDV bsFab與二價CD28 bvFab）所示。
[0467]當交聯時，對於所有bvFab（如圖4B（其示出了在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab）和圖10D（其示出了在CD3預活化後在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab）所示）、所有箱E bsFab、和一個箱F bsFab（如圖4A（其示出了在有和沒有交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab）和圖10C（其示出了在CD3預活化後在有和沒有交聯的情況下的單價CD28 x FMDV bsFab）所示），誘導了IL-2途徑。觀察到bvFab對大多數CD28殖株的活性優於bsFab形式，揭示了當交聯與二價組合時對IL-2誘導的最大影響，如圖4B（其示出了在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab）和圖4D（其示出了在交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab與二價CD28 bvFab）以及圖10D（其示出了在CD3預活化後在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab）和圖10F（其示出了在CD3預活化後在交聯的情況下的單價CD28 x FMDV bsFab與二價CD28 bvFab）所示。
[0468]來自箱E的殖株5和7揭示了獨特的行為，因為它們的交聯允許CD28啟動，如圖4A（其示出了在有和沒有交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab）和圖4B（其示出了在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab）中的圖所示，但價態的增加不是這樣，如圖4C（其示出了在沒有交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab與二價CD28 bvFab）和圖4D（其示出了在交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab與二價CD28 bvFab）所示。在bsFab和bvFab兩種形式中，這2個殖株分別在不存在和存在交聯的情況下是無活性和有活性的；然而，bvFab並不比bsFab更有活性。
促效劑特性： T 細胞活化 [0469]然後使用初級T細胞活化測定評估構建體的促效劑特性，其中在可溶性條件下測試化合物，而不透過抗CD3披覆的mAb進行次優TCR活化交聯。如圖5所示，一些但並非全部CD28 bvFab顯示出增加IFNg分泌的能力。圖5示出了在T細胞活化測定中對CD28 bsFab和bvFab的評價。圖5A示出了以下實驗設置：在10 nM、30 nM和100 nM陰性（IRR = FMDV bvFab）和陽性（TGN1412和9.3 mAb）對照抗體或測試化合物（CD28×FMDV bsFab和CD28 bvFab）的存在下，將人類純化CD3+ T細胞添加到預先用抗CD3 mAb披覆的384孔微盤中。培育6天後，確定細胞培養上清液中的IFNγ和TNFα水平，並且計數T細胞。(B) 在100 nM處理後第6天的IFNγ分泌。資料表示為處理的細胞與用IRR陰性對照處理的細胞中IFNγ水平的比率。每個條代表5個獨立測定（5個獨立供體）的平均值 ± 平均值的標準誤差。在IFNg分泌與兩個其他讀數（即，T細胞增殖（r = 0.63和p值 = 8.10-41）和TNFa分泌（r = 0.87和p值 = 7.8.10-110））之間觀察到強相關性，具有一些供體間變化（資料未示出）。
[0470]箱D在單價和二價形式下是無活性的。另外，五個箱E構建體中的四個在單價bsFab形式（化合物5-8）下具有活性；兩個在二價形式（化合物6和8）下具有活性。這些發現與報告物測定不一致。所有箱F單價bsFab都是無活性的，而所有二價構建體都是促效劑（強度不等）。這些發現與報告物測定的那些一致。
[0471]如圖4C中的bsFab/bvFab所示，T細胞活化測定條件是與報告物測定的一些條件可比較的；然而，T細胞啟動與Jurkat報告物測定之間的相關性不強。儘管單價且不存在交聯，但來自箱E的大多數bsFab顯示出乎意料的T細胞活化。
拮抗劑特性 [0472]如圖6所示，在MLR測定中評價CD28 bsFab和bvFab。這是一種雙細胞系統，其中來自第一供體的已知表現CD28配體（CD80/86）的單核細胞衍生的DC觸發來自第二供體的T細胞的TCR啟動。圖6A示出了以下實驗設置：在測定開始時，將CFSE標記的CD3+ T細胞和同種異體單核細胞衍生的DC與或不與10 nM和100 nM陰性（IRR = FMDV bvFab）和陽性（TGN1412和9.3 mAb）對照或測試化合物（CD28 bvFab）共培養。4天後，確定細胞培養上清液中的細胞激素水平和T細胞增殖。圖6B示出了在10 nM處理後第4天的IFNg分泌。每個條代表3個獨立測定（3個獨立供體）的平均值 ± SEM。
[0473]來自箱F的所有bvFab增加了T細胞增殖（資料未示出）和細胞激素分泌，如圖6所示，並且比TGN1412和9.3 mAb更具活性。如圖6所示，圖所有其他bvFab均阻斷T細胞增殖和細胞激素分泌。相反，來自箱F的所有bsFab都是無活性的，而來自箱D和箱E的bsFab仍然是拮抗性的（資料未示出）。總之，結果揭示了在MLR測定中CD80競爭箱與拮抗劑特性之間的強關聯性。
[0474]T細胞訊息傳遞主要由控制TCR功能的共刺激和共抑制受體確定（Chen等人 Nat Rev Immunol (2013) 13(4):227-42.）。這些受體是多樣的，並且它們的功能在很大程度上受到環境的影響，如已經認識到的（Chen，同上）。共刺激受體諸如CD27、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）或GITR（糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關蛋白或CD357）及其各自的配體已成為生物製劑界的主要研究重點，致力於其啟動或抑制啟動以分別用於癌症和發炎免疫療法（Edner等人 Nat Rev Drug Discov (2020) 19(12):860-83；Blanco等人 Clin Cancer Res (2021) 27(20):5457-64；Kraehenbuehl等人 Nat Rev Clin Oncol (2022) 19(1):37-50）。
| VHH ID | HCDR1- IMGT | HCDR1 SEQ ID NO: | HCDR2- IMGT | HCDR2 SEQ ID NO: | HCDR3- IMGT | HCDR3 SEQ ID NO: |
| 1 | GLTFRNYD | 1 | ASWSEEDT | 2 | AAGLTVNGRLLTRTYEYDH | 3 |
| 2 | GSISSIDH | 4 | INSGGRT | 5 | NVLLRDRSGSGRTY | 6 |
| 3 | ERTAITYS | 7 | ISGRDGRT | 8 | ATSPLVSTDQPDFYS | 9 |
| 4 | GSIFRSVP | 10 | IFVDGST | 11 | FMNGD | 12 |
| 5 | ESRFSIKP | 13 | ITSPGMA | 14 | RDILSGS | 15 |
| 6 | GRLLSDNS | 16 | ITSGGGT | 17 | NWPRYGD | 18 |
| 7 | GRPFSSYA | 19 | IGGDGSTT | 20 | ALDFSLNRIVFGTRADY | 21 |
| 8 | GRTFSTWH | 22 | IGGSGGSR | 23 | ATGPAAFGSRKGTSYDY | 24 |
| 9 | GRAFRINS | 25 | ISWSGRDT | 26 | AARVFFDSGSYAASEYSN | 27 |
| 10 | GDTFSNYA | 28 | ISWHGGRA | 29 | AARLLGGGWSGEEYDY | 30 |
| 11 | GRTFSGTA | 31 | IWWSRYAT | 32 | AAGHRGYSRFAEAYDY | 33 |
| 12 | ERTFGIRT | 34 | IKWAGGNT | 35 | AAAKVYYYTPTMGPGSYEF | 36 |
| 13 | GRTGSHLD | 37 | ISRDGFRI | 38 | AADAAGFGSRFVSSYDY | 39 |
| 14 | GRTFDSDRFG | 40 | INWRGGGA | 41 | VADIAAWGARSAASYEY | 42 |
| 15 | RAISSRWP | 43 | ISHGSIT | 44 | YAEDWDTRVQY | 45 |
| 16 | GLTFSSYT | 46 | ASWSGGST | 47 | AAEKAPSRTVAAYEY | 48 |
| 17 | GRTSSGYA | 49 | IAWSAGST | 50 | AAGTRMPSRMTNAYDY | 51 |
| 18 | GRTSSGYA | 52 | ISWSGGST | 53 | AAGTRQVSQTTQAYDY | 54 |
| 19 | GRPFSSYI | 55 | INWSGDHT | 56 | AAKLSAGSSTDTVLHNNRWSWDS | 57 |
| 20 | GGTYTTWT | 58 | IRRTGGDP | 59 | AASPLWTSSQDDYRH | 60 |
| 21 | GAYLIVSD | 61 | IGRGGT | 62 | NIVDY | 63 |
| 22 | GFTFSSYW | 64 | MSPEGDMT | 65 | VKGRTHGSGLYGARDFES | 66 |
| 23 | GYISSTHF | 67 | ITGSDLT | 68 | RLWGLGLGDGY | 69 |
| 24 | GFTLSDYW | 70 | IKAGDDTT | 71 | ARSPYGTYRLDRRYDF | 72 |
| 25 | GSSSSINA | 73 | ISRARGDST | 74 | YVAGDRSLDFRSY | 75 |
| 26 | GTISSTDF | 76 | ITGSDLT | 77 | RVWGLGYYY | 78 |
| 27 | GRTFDYHA | 79 | IGGSGGSR | 80 | ATGPAGYGSRKSTSYDY | 81 |
| 28 | EEWFRINN | 82 | ITPSGST | 83 | RDISGGS | 84 |
| 29 | GRTLTDRTLTDYA | 85 | IRWSDYRT | 86 | VAGHRLNSRFAEAYNY | 87 |
| 30 | ERPFSSYA | 88 | IGGDGSIT | 89 | ALDFSFNRIVLGSRADY | 90 |
| 31 | GRTFNA | 91 | IRWNGYMT | 92 | AAGDRGSSRFVAAYDY | 93 |
| 32 | GFTFDDYA | 94 | ISSSRATT | 95 | AAGTRMPSRMTNAYDY | 96 |
| 33 | RAISSRWP | 97 | ISHGSIT | 98 | YAAGQSTAPSASY | 99 |
| 34 | VRTLTA | 100 | MRWSDGST | 101 | AADQVIFYSRKPTDYDY | 102 |
| 35 | GSISSFNA | 103 | ITGSGST | 104 | YADLSTYNAAWNGGVYRNNY | 105 |
| 36 | GLPFSTYF | 106 | IGGNGGSR | 107 | ATGPAAFGSRKTSSYDY | 108 |
| 37 | ESRFSSKP | 109 | ITSPGMA | 110 | RDILSDS | 111 |
| 38 | GRSFSTYF | 112 | IGGNGGSR | 113 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 114 |
| 39 | GFTLSDYW | 115 | IASGGSDT | 116 | ARSPYGTYRLDRRYDT | 117 |
| 40 | GYISSTHF | 118 | ITGSDLT | 119 | RLWGLGLGDGY | 120 |
| 41 | GSIPSTHF | 121 | ITGSDLT | 122 | RVWGVGYDY | 123 |
| 42 | GRPFSSYA | 124 | IGGDGSTT | 125 | ALDFSLNRIVFGTRADY | 126 |
| 43 | GRLISADS | 127 | ITSGGGT | 128 | HWPRYGD | 129 |
| 44 | GLTFSSYS | 130 | ISWSNGRT | 131 | AAEKAPSRTVAAYEY | 132 |
| 45 | GSSSSINA | 133 | ISRARGDST | 134 | YVAGNRDLDFRSY | 135 |
| 46 | GSISSTDF | 136 | ITGSDLT | 137 | RVWGLGYAY | 138 |
| 47 | GLTFSSYS | 139 | ISWSGGRT | 140 | AAERAPSRQVAAYEF | 141 |
| 48 | GRTVSNYA | 142 | VAWTGGRT | 143 | AARLLGGGWSGEEYDS | 144 |
| 49 | RSISSRWP | 145 | ISHGSII | 146 | YAEDWDTRVQY | 147 |
| 50 | GSIPSTHF | 148 | ITGSDLT | 149 | RVWGVGYDY | 150 |
| 51 | ERTFSTYF | 151 | IGGNGGSR | 152 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 153 |
| 52 | GRIFSTYS | 154 | IGGSGGSR | 155 | ATGPRGFGSRKTTSYDY | 156 |
| 53 | GRTVSSYA | 157 | MSWTGGRT | 158 | AGRLLGGGWSGEEYGY | 159 |
| 54 | GRAFSTYF | 160 | IGGNGGSR | 161 | ETGPRGFGSRKNISYDY | 162 |
| 55 | GLTFSSYS | 163 | ISWSGGRT | 164 | AAERAPSRQVAAYEY | 165 |
| 56 | GFTFSTYS | 166 | ISWSNGRT | 167 | AAEKAPSRKVSAYEY | 168 |
| 57 | ERTFSTYF | 169 | IGGNGGSR | 170 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 171 |
| 58 | GLTFSSYS | 172 | ISWSGGRT | 173 | AAERAPSRQVAAYEF | 174 |
| 59 | GSIPSTHF | 175 | ITGSDLT | 176 | RVWGVGYDY | 177 |
| 60 | GRTTSTYF | 178 | IGGSGGSR | 179 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 180 |
| 61 | GSIPSTHF | 181 | ITGSDLT | 182 | RVWGVGYDY | 183 |
| 62 | GGTFSSYA | 184 | IAWHGGRT | 185 | AARLLGGGWSGEEYEY | 186 |
| 63 | GSSSSINA | 187 | ISRARGDST | 188 | YVAGDRSLDFRSY | 189 |
| 64 | GRSFSTYF | 190 | IGGNGGSR | 191 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 192 |
| 65 | GRTVSTYF | 193 | IGGSGGSR | 194 | ATGPAGFGSRKSTSYDY | 195 |
| 66 | GLTFSSYS | 196 | ISWSGGRT | 197 | AAERAPSRQVAAYEY | 198 |
| 67 | GSIASTHF | 199 | LTESSLT | 200 | GVWGLGFAY | 201 |
| 68 | ERTFDTYT | 202 | IGGSGGSR | 203 | ATGPAGFGSRKTTSYDY | 204 |
| 69 | GLTFSSYS | 205 | ISWSAGRT | 206 | AAERAPSRQVAAYEY | 207 |
| 70 | GLTFSSYS | 208 | ISWSAGRT | 209 | AAERAPSRQVAAYEY | 210 |
| 71 | RSISSRWP | 211 | ISHGSII | 212 | YAEDWDTRVQY | 213 |
| 72 | GRPFSSYA | 214 | IGGDGSTT | 215 | ALDFSLNRIVFGTRADY | 216 |
| 73 | GLTFSSYS | 217 | ISWSGGRT | 218 | AAERAPSRQVAAYEF | 219 |
| 74 | GDRFSIKP | 220 | ITSPGTA | 221 | RDILSDS | 222 |
| 75 | GRTFSNYD | 223 | CSWGGENTA | 224 | VAGLTVNGRLLTRTYEYDN | 225 |
| 76 | GRTFSSTA | 226 | IRWSDYRT | 227 | VAGHRLNSRFAEAYDY | 228 |
| 77 | GRAFSTYH | 229 | IGGSGGSR | 230 | ATGPAGFGSRRSTSYDY | 231 |
| 78 | GSISSTHF | 232 | ITESSLT | 233 | GVWGLGYAY | 234 |
| 79 | GRTTSTYF | 235 | IGGSGGSR | 236 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 237 |
| 80 | GSRFSTKP | 238 | ITTPGMA | 239 | RDILSDD | 240 |
| 81 | GRSFSTYF | 241 | IGGNGGSR | 242 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 243 |
| 82 | GRTFSSTA | 244 | IRWSDYRT | 245 | VAGHRLNSRFAEAYDY | 246 |
| 83 | GLPFSTYF | 247 | IGGNGGSR | 248 | ATGPAAFGSRKTSSYDY | 249 |
| 84 | GRSFSTDF | 250 | IGGNGGSR | 251 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 252 |
| 85 | GRLISANS | 253 | ITSGGGT | 254 | NWPRYGD | 255 |
| 86 | GLTFSSYS | 256 | ISWSAGRT | 257 | AAERAPSRRVDAYEY | 258 |
| 87 | GRSFSTYF | 259 | IGGNGGSR | 260 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 261 |
| 88 | GLTFSSYS | 262 | ISWSGGRT | 263 | AAERAPSRQVAAYEF | 264 |
| 89 | GLTFSSYS | 265 | ISWSYGST | 266 | AAEKAPSRRVAAYEY | 267 |
| 90 | GRSFSTYF | 268 | IGGNGGSR | 269 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 270 |
| 91 | GYISSTHF | 271 | ITGSDLT | 272 | RLWGLGLGDGY | 273 |
| 92 | GRTFSSTA | 274 | IRWSDYRT | 275 | VAGHGLNSRFAEAYDY | 276 |
| 93 | GLTFSSYS | 277 | ISWSAGRT | 278 | AAERAPSRRVDAYEY | 279 |
| 94 | GLTFSSYS | 280 | ISWSAGRT | 281 | AAERAPSRQVAAYEY | 282 |
| 95 | GGTFSTYF | 283 | IGGSGGSR | 284 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 285 |
| 96 | GRPFSSYI | 286 | INWSGDHT | 287 | AAKLSAGSSTDTVLHNNRWSWDY | 288 |
| 97 | GLPFSTYF | 289 | IGGNGGSR | 290 | ATGPAAFGSRKTSSYDY | 291 |
| 98 | ERTAFTYS | 292 | ISGRDGRT | 293 | ATSPLVSTDQPDFYS | 294 |
| 99 | GLTFSSYT | 295 | ASWSGGNT | 296 | AAEKAPSRTVAAYEY | 297 |
| 100 | GRSFITYF | 298 | IGGNGGSR | 299 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 300 |
| 101 | GRSFITYF | 301 | IGGNGGSR | 302 | ATGPRGFGSRKSNSYDY | 303 |
| 102 | GRSFITYF | 304 | IGGNGGSR | 305 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 306 |
| 103 | GRSFITYF | 307 | IGGNGGSR | 308 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 309 |
| 104 | GSITSFNA | 310 | ITGSGST | 311 | YADLSTYNAEWNGGAYRNNY | 312 |
| 105 | GSSSSINA | 313 | ISRARGDST | 314 | YVAGNRDLDFRSY | 315 |
| 106 | GLTFSSYS | 316 | ISWSGGRT | 317 | AAERAPSRQVAAYEY | 318 |
| 107 | GPTFGTYA | 319 | MSWSNGRT | 320 | AAEKAPSRKVSAYEY | 321 |
| 108 | GRTFSSTA | 322 | IRWSDYRT | 323 | VAGHRLNSRFAEAYDY | 324 |
| 109 | GRSFISYF | 325 | IGGNGGSR | 326 | ATGPRGFSSRKSTSYDY | 327 |
| 110 | GRTFSTWH | 328 | IGGSGGSR | 329 | ATGPAAFGSRKSTSYDY | 330 |
| 111 | ERTFDTYT | 331 | IGGSGGSR | 332 | ATGPAGFGSRKTTSYDY | 333 |
| 112 | GRTSSGYA | 334 | IAWSAGST | 335 | AAGTRMPSRMTNAYDY | 336 |
| 113 | GRTFSSTA | 337 | IRWSDYRT | 338 | VAGHRLNSRFAEAYDY | 339 |
| 114 | GRTVSTYF | 340 | IGGSGGSR | 341 | ATGPAGFGSRKTTSYDY | 342 |
| 115 | GRTFSSTA | 343 | IRWSDYRT | 344 | VAGHRLNSRFAEAYDY | 345 |
| 116 | GRTFSSTA | 346 | IRWSDYRT | 347 | VAGHRLITRITEAYDY | 348 |
| 117 | GRLISADS | 349 | ITSGGGT | 350 | NCPRYGD | 351 |
| 118 | GLTFSSYT | 352 | ASWSGGST | 353 | AAEKAPSQTVAAYEY | 354 |
| 119 | GRLISANS | 355 | ITSGGGT | 356 | NWPRYGD | 357 |
| 120 | GRAFRINS | 358 | ISWSGRDT | 359 | AARVFFDSGSYAASEYSN | 360 |
| 121 | GRTTSTYF | 361 | IGGSGGSR | 362 | ATGPRGFGSRRSTSYDY | 363 |
| 122 | GSSSSINA | 364 | ISRARGDST | 365 | YVAGNRDLDFRSY | 366 |
| 123 | ERTFSTYF | 367 | IGGNGGSR | 368 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 369 |
| 124 | GRTSSTYF | 370 | IGGSGGSR | 371 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 372 |
| 125 | GRPFSSYA | 373 | IGGDGSTT | 374 | ALDFSLNRIVFGTRADY | 375 |
| 126 | ATISSTDF | 376 | ITSSDLT | 377 | RVWGLGYYY | 378 |
| 127 | GRTFSMYN | 379 | IGGNGGSR | 380 | ATGPRGFGSQKSNSYDY | 381 |
| 128 | GRTVSTYF | 382 | IGGSGGSR | 383 | ATGPAGFGSRKTTSYDY | 384 |
| 129 | FSSSY | 385 | IGGNGGSR | 386 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 387 |
| 130 | GRAFSTYF | 388 | IGGSGGSR | 389 | ATGPRGFGSRKTTSYDY | 390 |
| 131 | GRTFSSYA | 391 | ISWTGGRT | 392 | TARLLGGGWSGEEYDY | 393 |
| 132 | GRSFITYF | 394 | IGGNGGSR | 395 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 396 |
| 133 | GRTASSYA | 397 | MPWTGGRT | 398 | AARLLGGGWSGEEYDY | 399 |
| 134 | GRSFSTYF | 400 | IGGNGGSR | 401 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 402 |
| 135 | GLTFSSYS | 403 | ISWSGGRT | 404 | AAERAPSRQVAAYEF | 405 |
| 136 | GSISSTHF | 406 | ITESSLT | 407 | GVWGLGYAY | 408 |
| 137 | GSIASTHF | 409 | LTESSLT | 410 | GVWGLGFAY | 411 |
| 138 | GSIFSTNI | 412 | ITGSDLT | 413 | RVWGLGYYY | 414 |
| 139 | GGTFSTYF | 415 | IGGSGGSR | 416 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 417 |
| 140 | GSISSTHF | 418 | ITTSSAT | 419 | GVWGVGYAY | 420 |
| 141 | GYISSTHF | 421 | ITGSDLT | 422 | RLWGLGLGYGY | 423 |
| 142 | GRPFSSYA | 424 | IGGDGSIT | 425 | ALDFSFNRIVLGTRADY | 426 |
| 143 | ERTFSTYF | 427 | IGGNGGSR | 428 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 429 |
| 144 | GRTFSNYD | 430 | CGWKAEDT | 431 | AAGLTVNGRLLTRTYEYDI | 432 |
| 145 | GRTVSTYF | 433 | IGGSGGSR | 434 | ATGPAGFGSRKSTSYDY | 435 |
| 146 | GRSFSTYF | 436 | IGGNGGSR | 437 | ATGPRGFGSRKSNSYDY | 438 |
| 147 | GRSFSTYF | 439 | IGGNGGSR | 440 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 441 |
| 148 | GGTYTTYT | 442 | IRRTGGDP | 443 | AGSPLWTSSQDDYRH | 444 |
| 149 | ERTFSTYF | 445 | IGGNGGSR | 446 | ATGPRGFGSRKSTSYDY | 447 |
| 150 | GSIPSTHF | 448 | ITGSDVT | 449 | RVWGVGYDY | 450 |
| 151 | GSIPSTHF | 451 | ITGSDLT | 452 | RVWGVGYDY | 453 |
| 位置 | 人 V H3 | 標誌殘基 |
| 11 | L，V；主要是L | L、S、V、M、W、F、T、Q、E、A、R、G、K、Y、N、P、I；優選L |
| 37 | V、I、F；通常為V | F (1)、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T、P；優選F (1)或Y |
| 44 (8) | G | E (3)、Q (3)、G (2)、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M、I； 優選G (2)、E (3)或Q (3)；最優選G (2)或Q (3)。 |
| 45 (8) | L | L (2)、R (3)、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、V；優選L (2)或R (3) |
| 47 (8) | W、Y | F (1)、L (1)或W (2)、G、I、S、A、V、M、R、Y、E、P、T、C、H、K、Q、N、D；優選W (2)、L (1)或F (1) |
| 83 | R或K；通常為R | R、K (5)、T、E (5)、Q、N、S、I、V、G、M、L、A、D、Y、H；優選K或R；最優選K |
| 84 | A、T、D；主要是A | P (5)、S、H、L、A、V、I、T、F、D、R、Y、N、Q、G、E；優選P |
| 103 | W | W (4)、R (6)、G、S、K、A、M、Y、L、F、T、N、V、Q、P (6)、E、C；優選W |
| 104 | G | G、A、S、T、D、P、N、E、C、L；優選G |
| 108 | L、M或T；主要為L | Q、L (7)、R、P、E、K、S、T、M、A、H；優選地是Q或L (7) |
| 注意： 特別地，但非排他地，與位置43-46處的KERE或KQRE組合。 通常在位置44-47處為GLEW。 通常在位置43-46處為KERE或KQRE，例如在位置43-47處為KEREL、KEREF、KQREL、KQREF、KEREG、KQREW或KQREG。可替代地，諸如以下的序列也是可能的：TERE（例如，TEREL）、TQRE（例如，TQREL）、KECE（例如，KECEL或KECER）、KQCE（例如，KQCEL）、RERE（例如，REREG）、RQRE（例如，RQREL、RQREF或RQREW）、QERE（例如，QEREG）、QQRE（例如，QQREW、QQREL或QQREF）、KGRE（例如，KGREG）、KDRE（例如，KDREV）。一些其他可能的但不太優選的序列包括例如DECKL和NVCEL。 具有位置44-47處的GLEW和位置43-46處的KERE或KQRE兩者。 通常為天然存在的V HH結構域的位置83-84處的KP或EP。 特別地，但非排他地，與位置44-47處的GLEW組合。 前提是當位置44-47為GLEW時，在還含有103處的W的（非人源化）V HH序列中，位置108始終為Q。 GLEW組還在位置44-47處含有類GLEW序列，例如像GVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLER和ELEW。 |
| VHH ID | VHH 序列 | SEQ ID NO: |
| 1 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFRNYDLGWFRQAPGKEREFVAGASWSEEDTYYLNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAIYYCAAGLTVNGRLLTRTYEYDHWGQGTQVTVSS | 454 |
| 2 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVASGSISSIDHVGWYRQAPGKERVMVAFINSGGRTTYPDAVKGRFTISRDGASNTVFLQMDGLKPDDTAVYYCNVLLRDRSGSGRTYWGQGTQVTVSS | 455 |
| 3 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASERTAITYSMGWFRQAPGKDRDFVALISGRDGRTAYADSVKGRFTISQNYAANTVWLQMNSLNPEDTAVYYCATSPLVSTDQPDFYSWGQGTQVTVSS | 456 |
| 4 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFRSVPVSWYRQAPEKQREFVARIFVDGSTHLADPVKGRFTISRDNAKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCFMNGDWGQGTQVTVSS | 457 |
| 5 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAATESRFSIKPMGWYRQAPGKQREFVATITSPGMANYEDSVKGRFTISKDIPKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCRDILSGSWGQGTQVTVSS | 458 |
| 6 | QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCVASGRLLSDNSMTWYRQAPEKQREFVAHITSGGGTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYSQMISLKPEDTAVYYCNWPRYGDRGQGTQVTVSS | 459 |
| 7 | QVQLQESGGGLVQAGDSVRLSCAASGRPFSSYAMGWIRQAPGKEREFVAAIGGDGSTTRYTESAKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLIPEDTAVYYCALDFSLNRIVFGTRADYWGQGTQVTVSS | 460 |
| 8 | QVQLQESGGGLVQGGGSLRLSCAASGRTFSTWHAAWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTVYLQMTALKVEDTAVYYCATGPAAFGSRKGTSYDYWGQGTQVTVSS | 461 |
| 9 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRAFRINSIGWFRQAPGKEREFVAAISWSGRDTYYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLEMNSLKPADTAVYSCAARVFFDSGSYAASEYSNWGQGTQVTVSS | 462 |
| 10 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRVSCGASGDTFSNYAMAWFRQLAGKEREFVAAISWHGGRATYADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYVCAARLLGGGWSGEEYDYWGQGTQVTVSS | 463 |
| 11 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAFSGRTFSGTAMGWFRQPPGKEREFVASIWWSRYATDYADSVKDRFTVSRDNAANTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGHRGYSRFAEAYDYWGQGTQVTVSS | 464 |
| 12 | QVQLQESGGGLVQCGGSLRLSCAASERTFGIRTIGWFRQAPGKEREFVGAIKWAGGNTHYADPVKGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLKPEDTAVYVCAAAKVYYYTPTMGPGSYEFWGQGTQVTVSS | 465 |
| 13 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGRTGSHLDMAWFRQAPGKEREFVATISRDGFRIFYADSVKGRFTMSRDNGKNSVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADAAGFGSRFVSSYDYWGQGTQVTVSS | 466 |
| 14 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFDSDRFGMGWFRQAPGKEREFVAQINWRGGGAFYADSVKGRFTISRDTVKNTVTLQMNSLQVEDTAVYFCVADIAAWGARSAASYEYWGRGTQVTVSS | 467 |
| 15 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVASRAISSRWPMGWYRQAPGKQRELVAQISHGSITNIMDSVKGRFTISRDYAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYAEDWDTRVQYWGQGTQVTVSS | 468 |
| 16 | QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGLTFSSYTMAWFRQAPGKEREFVAAASWSGGSTYYADSVEGRFTISRDYAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCAAEKAPSRTVAAYEYWGQGTQVTVSS | 469 |
| 17 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSSGYAMGWFRQAPGKEREFVAAIAWSAGSTYYADSVQGRFTISRDKPKITVYLQMDSLTPEDTAVYYCAAGTRMPSRMTNAYDYWGRGTQVTVSS | 470 |
| 18 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSSGYAMGWFRRAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSLRGRFTISRDKPKMTVYLQMDSLTPEDTAVYYCAAGTRQVSQTTQAYDYWGRGTQVTVSS | 471 |
| 19 | QVQLQESGGGLAQPGGSLRLSCAASGRPFSSYILGWFRQAPGKERELVAQINWSGDHTYYANSVKGRFTISRDNAENTGYLQMNSLKPEDTAVYFCAAKLSAGSSTDTVLHNNRWSWDSWGQGTQVTVSS | 472 |
| 20 | QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGGTYTTWTMGWFRQAPGKDRTIVAAIRRTGGDPYYTTSVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASPLWTSSQDDYRHWGQGTQVTVSS | 473 |
| 21 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCSASGAYLIVSDMNWYRQSPGKERELVATIGRGGTNYAESVKGRFTISRDNTKNFWYLQMSSLKPEDTAIYYCNIVDYWGQGTQVTVSS | 474 |
| 22 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSYWMYWVRQRPGKGLEWVSGMSPEGDMTGYTDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSDDTAVYSCVKGRTHGSGLYGARDFESRGQGTQVTVSS | 475 |
| 23 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYISSTHFMGWYRQAPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISRDNAKNTVALEMNSLKPEDTAVYHCRLWGLGLGDGYWGQGTQVTVSS | 476 |
| 24 | QVQLQESGGGVVQSGGSLRLSCAASGFTLSDYWMSWLRQAPGKGLEWVSVIKAGDDTTYDLGSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLESEDTAVYYCARSPYGTYRLDRRYDFRGQGTQVTVSS | 477 |
| 25 | QVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAASGSSSSINAMAWYRQAPGKQRELVAHISRARGDSTIYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYVAGDRSLDFRSYWGQGTQVTVSS | 478 |
| 26 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGTISSTDFMGWYRQAPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISRDNAPNTVALQMNSLKPEDTATYYCRVWGLGYYYWGQGTQVTVSS | 479 |
| 27 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDYHAVAWFRQAPGKERELVATIGGSGGSRYYADPVLGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTPVSYCATGPAGYGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 480 |
| 28 | QVQLQESGGGVVQAGGSLRLSCASSEEWFRINNMGWYRQAPGKQRELVAYITPSGSTNYADFVKGRFTISRDNAKKTVLLQMDSLRPEDTAIYYCRDISGGSWGQGTQVTVSS | 481 |
| 29 | QVQLQESGGGLVQAGESLRISCAASGRTLTDRTLTDYAVGWFRQPPGKEREFVAAIRWSDYRTDYADSVKDRFTvSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGHRLNSRFAEAYNYWGQGTQVTVSS | 482 |
| 30 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASERPFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIGGDGSITQYTESAAGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTATYYCALDFSFNRIVLGSRADYWGQGTQVTVSS | 483 |
| 31 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNAMAWFRQPPGKEREFIAAIRWNGYMTDYADSVKGRFTVSRDNAKNTEFLQMNSLKPEDTAVYYCAAGDRGSSRFVAAYDYWGQGTQVTVSS | 484 |
| 32 | QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFDDYAIGWFRQAPGKDREGVSCISSSRATTSYADAVKGRFRTSIDNAKKTVYLQTNNLEPEDTAVYYCAAGTRMPSRMTNAYDYWGRgTQVTVSS | 485 |
| 33 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVASRAISSRWPMGWYRQAPGKQRELVAQISHGSITNIMDSVKGRFTISRDYAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYAAGQSTAPSASYWGQGTQVTVSS | 486 |
| 34 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASVRTLTAMGWFRQAPGKERELVGSMRWSDGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADQVIFYSRKPTDYDYWGQGTQVTVSS | 487 |
| 35 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSISSFNAMGWYRQAPGQQRQLVARITGSGSTNYADSVKGRFTISRVNAKNTVVLQMNSLRSDDTSVYLCYADLSTYNAAWNGGVYRNNYWGQGTQVTVSS | 488 |
| 36 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLPFSTYFMAWFRQAPGEEREFVASIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKTTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPAAFGSRKTSSYDYWGQGTQVTVSS | 489 |
| 37 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAATESRFSSKPMGWYRQAPGKQREYVATITSPGMANYADSVRGRFTISKDIPKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCRDILSDSWGQGTQVTVSS | 490 |
| 38 | QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGRSFSTYFAAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 491 |
| 39 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLSDYWMSWLRQAPGKGLEWVSVIASGGSDTYYLNSVKGRFTISRDNDKNTLYLQMNNLKSEDTAVYYCARSPYGTYRLDRRYDTRGQGTQVTVSS | 492 |
| 40 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYISSTHFMGWYRQAPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISRDNAKNTVALEMNSLKPEDTAVYYCRLWGLGLGDGYWGQGTQVTVSS | 493 |
| 41 | QVQLQESGGGLVQAGGSLGLSCAASGSIPSTHFMGWYRQPPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISREHAQNTVALQMNSLKPEDTAVYYCRVWGVGYDYWGQGTQVTVSS | 494 |
| 42 | QVQLQESGGGLVQAGDSVRLSCAASGRPFSSYAMGWIRQAPGKEREFVAAIGGDGSTTRYTESAKGRFTISRDNAKNTMYLRMNSLIPEDTAVYYCALDFSLNRIVFGTRADYWGQGTQVTVSS | 495 |
| 43 | QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCVVSGRLISADSITWYRQAPEKQREFVAHITSGGGTNYADFVKGRFAISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCHWPRYGDWGQGTQVTVSS | 496 |
| 44 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSNGRTYYADFVKGRFTISRDNAKNTVYMQMNSLKPEDTAVYYCAAEKAPSRTVAAYEYWGQGTQVTVSS | 497 |
| 45 | QVQLQESGGGLLQAGESLRLSCAASGSSSSINAMAWSRQAPGKQREMVAHISRARGDSTIYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYFCYVAGNRDLDFRSYWGQGTQVTVSS | 498 |
| 46 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSISSTDFMGWYRQAPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISREHAGNTMALQMNSLKPEDTAVYYCRVWGLGYAYWGQGTQVTVSS | 499 |
| 47 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTGVYYCAAERAPSRQVAAYEFWGQGTQVTVSS | 500 |
| 48 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCGASGRTVSNYAMGWFRQAAGKEREFVAAVAWTGGRTTYADSVKGRFTLSRNSAKDTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARLLGGGWSGEEYDSWGQGTQVTVSS | 501 |
| 49 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCVTSRSISSRWPMGWYRQAPGKQRELVAQISHGSIINIMDSVKGRFTISRDYAESTVYLQMNSLKPEDTAVYTCYAEDWDTRVQYWGQGTQVTVSS | 502 |
| 50 | QVQLQDSGGGLVQPGGSLGLSCAASGSIPSTHFMGWYRQPPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISREHAQNTVALQMNSLKPEDTAVYYCRVWGVGYDYWGQGTQVTVSS | 503 |
| 51 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCLASERTFSTYFKAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYAEPVEGRFFISRDNAKNTVYLEMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 504 |
| 52 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRIFSTYSMGWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTMYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKTTSYDYWGQGTQVTVSS | 505 |
| 53 | QVQLQESGGGLVQAGNSLRLSCVASGRTVSSYAMGWFRQALGKEREFVAAMSWTGGRTTYADSVKGRFTMSRDNAKSTAYLQMNNLKPEDTAVYYCAGRLLGGGWSGEEYGYWGQGTQVTVSS | 506 |
| 54 | QVQLQESGGGLVQDGGSLRLSCAASGRAFSTYFMAWFRQGPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTMYLQMNALKPEDTDVYYCETGPRGFGSRKNISYDYWGQGTQVTVSS | 507 |
| 55 | QVQLQESGGGLLQAEGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAERAPSRQVAAYEYWGQGTQVTVSS | 508 |
| 56 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFSTYSMGWFRQAAGKEREFVGAISWSNGRTYYADSVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEKAPSRKVSAYEYWGQGTQVTVSS | 509 |
| 57 | QVQLQESGGGLVQAGGSVRLSCLASERTFSTYFKAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYAEPVEGRFFISRDNAKNTVYLEMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 510 |
| 58 | QVQLQESGGGLVPAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTGVYYCAAERAPSRQVAAYEFWGQGTQVTVSS | 511 |
| 59 | QVQLQDSGGGLVQAGGSLGISCAAYGSIPSTHFMGWYRQPPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISREHAQNTVALQMNSLKPEDTAVYYCRVWGVGYDYWGQGTQVTVSS | 512 |
| 60 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTTSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRHYADPVQGRFTISRDNAKSTMYLQMNALKPEDTAAYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 513 |
| 61 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGSIPSTHFMGWYRQPPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISREHAKNTVALQMNSLKPEDTAVYYCRVWGVGYDYWGQGTQVTVSS | 514 |
| 62 | QVQLQESGGGLVQAGDSLRVSCGASGGTFSSYAMAWFRQAAGKEREFVAAIAWHGGRTSYADSVRGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLKPADTAVYYCAARLLGGGWSGEEYEYWGQGTQVTVSS | 515 |
| 63 | QVQLQESGGGVVQAGGSLTLSCAASGSSSSINAMAWYRQAPGKQRELVAHISRARGDSTIYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYVAGDRSLDFRSYWGQGTQVTVSS | 516 |
| 64 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVSGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 517 |
| 65 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTVSTYFMTWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPAGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 518 |
| 66 | QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAERAPSRQVAAYEYWGQGTQVTVSS | 519 |
| 67 | QVQLQESGGGSVQAGGSLLSCAACGSIASTHFMGWYRQAPGKQRELVAGLTESSLTNYADSVKGRFIISREHAKNTVALQMNSLKPEDTAVYYCGVWGLGFAYWGQGTQVTVSS | 520 |
| 68 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAYSERTFDTYTMAWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRYYTDPVMGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPAGFGSRKTTSYDYWGQGTQVTVSS | 521 |
| 69 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSAGRTYYADSVQGRFTISRDNSKNTVYLKMNSLKPEDTAKYYCAAERAPSRQVAAYEYWGQGTQVTVSS | 522 |
| 70 | QVQLQESGGGLVQAGASLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSAGRTYYADSVQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAKYYCAAERAPSRQVAAYEYWGQGTQVTVSS | 523 |
| 71 | QVQLQESGGGFVQPGGSLRLSCVTSRSISSRWPMGWYRQAPGKQRELVAQISHGSIINIMDSVKGRFTISRDYAESTVYLQMNSLKPEDTAVYTCYAEDWDTRVQYWGQGTQVTVSS | 524 |
| 72 | QVQLQESGGGLVQAGDSVRLSCAASGRPFSSYAMGRIRQAPGKEREFVAAIGGDGSTTRYTESAKGRFTISRANAKNTMYLQMNSLIPEDTAVYSCALDFSLNRIVFGTRADYWGQGTQVTVSS | 525 |
| 73 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSLGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTGVYYCAAERAPSRQVAAYEFWGQGTQVTVSS | 526 |
| 74 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAATGDRFSIKPMGWYRQAPGKQREFVATITSPGTANYEDSVKGRFTISKDIAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCRDILSDSWGQGTQVTVSS | 527 |
| 75 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYDMGWFRQAPGKEREFVAACSWGGENTAYYVNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCVAGLTVNGRLLTRTYEYDNWGQGTQVTVSS | 528 |
| 76 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSTAMGWFRQPPGKEREFVAAIRWSDYRTDYADSVKDRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGHRLNSRFAEAYDYWGQGTQVTVSS | 529 |
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| 79 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTTSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRHYADPVQGRFTISRDNAKSTMYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 532 |
| 80 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAATGSRFSTKPMGWYRQAPGKQRDYVATITTPGMANYAASVKGRFTISKDITKNTVYLQMNSLKPEDTATYYCRDILSDDWGQGTQVTVSS | 533 |
| 81 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSFSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 534 |
| 82 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSTAMGWFRQPPGEEREFVAAIRWSDYRTDYADSVKDRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGHRLNSRFAEAYDYWGQGTQVTVSS | 535 |
| 83 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLPFSTYFMAWFRQAPGKEREFVASIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKTTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPAAFGSRKTSSYDYWGQGTQVTVSS | 536 |
| 84 | QVQLQESGGGLVQAGESLRLSCAASGRSFSTDFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 537 |
| 85 | QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCVASGRLISANSMGWYRQAPEKQREFVAHITSGGGTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNWPRYGDWGQGTQVTVSS | 538 |
| 86 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSAGRTYYSDSVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKAEDTAVYYCAAERAPSRRVDAYEYWGQGTQVTVSS | 539 |
| 87 | QVQLQESGGGLVEAGGSLRLSCAASGRSFSTYFAAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 540 |
| 88 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTGVYYCAAERAPSRQVAAYEFWGQGTQVTVSS | 541 |
| 89 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSYGSTYYADSVKGRFAISRDNAQNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEKAPSRRVAAYEYWGQGTQVTVSS | 542 |
| 90 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYRGQGTQVTVSS | 543 |
| 91 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYISSTHFMGWYRQAPGEQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISRDNAKNTVALEMNSLKPEDTAVYYCRLWGLGLGDGYWGQGTQVTVSS | 544 |
| 92 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSTAMGWFRQPPGKEREFVAAIRWSDYRTDYADSVKDRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGHGLNSRFAEAYDYWGQGTQVTVSS | 545 |
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| 94 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSAGRTYYADSVQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAKYYCAAERAPSRQVAAYEYWGQGTQVTVSS | 547 |
| 95 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSTYFMTWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRHYADPVQGRFTISRDNAKSTMYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 548 |
| 96 | QVQLQESGGGLAQPGGSMRLSCAASGRPFSSYILGWFRQAPGKERELVSQINWSGDHTYYANSVKGRFTISRDNAENTGYLQVNSLKPEDTAVYFCAAKLSAGSSTDTVLHNNRWSWDYWGQGTQVTVSS | 549 |
| 97 | QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTYFMAWFRQAPGKEREFVASIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKTTVCLQMNALKPEDTAVYYCATGPAAFGSRKTSSYDYWGQGTQVTVSS | 550 |
| 98 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASERTAFTYSMGWFRQAPGKDRDFVALISGRDGRTAYADSVKGRFTISQNYAANTVWLQMNSLKPEDTAVYYCATSPLVSTDQPDFYSWGQGTQVTVSS | 551 |
| 99 | QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGLTFSSYTMAWFRQAPGKEREFVAAASWSGGNTYYADSVEGRFTISRDYAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCAAEKAPSRTVAAYEYWGQGTQVTVSS | 552 |
| 100 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCSASGRSFITYFMAWFRQFPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTGYLQMNALQPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYRGQGTQVTVSS | 553 |
| 101 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFITYFMAWFRQAPGREREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNALEPEDTAIYYCATGPRGFGSRKSNSYDYWGQGTQVTVSS | 554 |
| 102 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFITYFMAWFRQTPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRLTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 555 |
| 103 | QVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAASGRSFITYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTMYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 556 |
| 104 | QVQLQESGGGLVQAGGSLSLSCAASGSITSFNAMGWYRQAPGQQRQLVARITGSGSTNYADSVKGRFTISRVGAKNTVVLQMNSLKSEDTSVYLCYADLSTYNAEWNGGAYRNNYWGQGTQVTVSS | 557 |
| 105 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSSSINAMAWYRQAPGKQREMVAHISRARGDSTIYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNNLKPEDTAAYFCYVAGNRDLDFRSYWGQGTQVTVSS | 558 |
| 106 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAERAPSRQVAAYEYWGQGTQVTVSS | 559 |
| 107 | QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGPTFGTYAMGWFRQAPGKERDFVAAMSWSNGRTYYADSVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEKAPSRKVSAYEYWGQGTQVTVSS | 560 |
| 108 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSTAMGWFRQPPGKEREFVAAIRWSDYRTDYADSVKDRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLEPEDTAVYYCVAGHRLNSRFAEAYDYWGQGTQVTVSS | 561 |
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| 111 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAYSERTFDTYTMAWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRYYTDPVMSRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPAGFGSRKTTSYDYWGQGTQVTVSS | 564 |
| 112 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSSGYAMGWFRQAPGKEREFVAAIAWSAGSTYYADSVQGRFTISRDKPKIMVYLQMDSLTPEDTAVYYCAAGTRMPSRMTNAYDYWGRGTQVTVSS | 565 |
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| 114 | QVQLQESGGGLMQAGGSLRLSCAASGRTVSTYFMSWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTVYLQMTALKPEDTAVYYCATGPAGFGSRKTTSYDYWGQGTQVTVSS | 567 |
| 115 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAAFGRTFSSTAMGWFRQPPGKEREFVAAIRWSDYRTDYADSVKDRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGHRLNSRFAEAYDYWGQGTQVTVSS | 568 |
| 116 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSTAMGWFRQAPGKEREFVAAIRWSDYRTYYADSVKDRFTVSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVAGHRLITRITEAYDYWGQGTQVTVSS | 569 |
| 117 | QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCVVSGRLISADSMTWYRQAPEKQREFVAHITSGGGTNYADSVQGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNCPRYGDWGQGTQVTVSS | 570 |
| 118 | QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGLTFSSYTMAWFRQAPGKEREFVAAASWSGGSTYYADSVEGRFTISRDYAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCAAEKAPSQTVAAYEYWGQGTQVTVSS | 571 |
| 119 | QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCVASGRLISANSMGWYRQAPEKQREFVAHITSGGGTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNWPRYGDWGQGTQVTVSS | 572 |
| 120 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRAFRINSIGWFRQAPGKEREFVAAISWSGRDTYYDDSVKGRFTISRDNAKNTVYLEMNSLKPADTAVYSCAARVFFDSGSYAASEYSNWGQGTQVTVFSS | 573 |
| 121 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTTSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRHYADPVQGRFTISRDNAKSTMYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRRSTSYDYWGQGTQVTVSS | 574 |
| 122 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSSSINAMAWYRQAPGKQREMVAHISRARGDSTIYADSVKGRFTISRENAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYFCYVAGNRDLDFRSYWGQGTQVTVSS | 575 |
| 123 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCSASERTFSTYFEAWFRQTPGKEREFVATIGGNGGSRYYAEPVEGRFFISRDNAKNTVYLEMSALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 576 |
| 124 | QVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTSSTYFMTWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRHYADPVQGRFTISRDNAKSTMYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 577 |
| 125 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSSYAMGWIRQAPGKEREFVAAIGGDGSTTRYTESAKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLIPEDTAVYYCALDFSLNRIVFGTRADYWGQGTQVTVSS | 578 |
| 126 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASATISSTDFMGWYRQAPGKQRELVAGITSSDLTNYADSVKGRFIISRDNAKNTVALQMNSLKPEDTATYYCRVWGLGYYYWGQGTQVTVSS | 579 |
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| 128 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTVSTYFMSWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRHYADPVQGRFTISRDNAKNTVYLQMTALKPEDTAVYYCATGPAGFGSRKTTSYDYWGQGTQVTVSS | 581 |
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| 130 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRAFSTYFMAWFRQGPGKEREFVATIGGSGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTMYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKTTSYDYWGQGTQVTVSS | 583 |
| 131 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCGASGRTFSSYAVGWFRQAAGKEREFVGAISWTGGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTARLLGGGWSGEEYDYWGQGTQVTVSS | 584 |
| 132 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFITYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 585 |
| 133 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCGASGRTASSYAMGWFRQAAGKEREFVAAMPWTGGRTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMNSLKPEDTGVYYCAARLLGGGWSGEEYDYWGQGTQVTVSS | 586 |
| 134 | QVQLQESGGGLVQTGGSLRLSCAASGRSFSTYFMAWFRQFPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVQGRFTISRDNAKNTGYLQMNALQPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 587 |
| 135 | QVQLQESGGGLVRAGGSLRLSCAASGLTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVGAISWSGGRTYYADSVTGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTGVYYCAAERAPSRQVAAYEFWGQGTQVTVSS | 588 |
| 136 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSISSTHFMGWYRQAPGKQRELVAGITESSLTNYADSVKGRFIISREHAKNTVALQMNSLEPEDTAVYYCGVWGLGYAYWGQGTQVTVSS | 589 |
| 137 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIASTHFMGWYRQAPGKQRELVAGLTESSLTNYADSVKGRFIISREHAKNTVALQMNSLKPEDTAVYYCGVWGLGFAYWGQGTQVTVSS | 590 |
| 138 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSTNIMGWYRQAPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISRDNAPNTVALRMNSLKPEDTATYYCRVWGLGYYYWGRGTQVTVSS | 591 |
| 139 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSTYFMTWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRHYADPVQGRFTISRDNAKSTMYLQMNALEPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 592 |
| 140 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGSISSTHFMGWYRQAPGNQRELVAGITTSSATSYADSVKGRFIISREHAKNTVALQMNSLKPEDTAVYYCGVWGVGYAYWGQGTQVTVSS | 593 |
| 141 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYISSTHFMGWYRQAPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISRDNAKNTVALEMNSLKPEDTAVYYCRLWGLGLGYGYWGQGTQVTVSS | 594 |
| 142 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRPFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIGGDGSITQYTESAKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSLKPEDTAVYVCALDFSFNRIVLGTRADYWGQGTQVTVSS | 595 |
| 143 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCSASERTFSTYFKAWFRQAPGKGREFVATIGGNGGSRYYADPVKGRFFISRDNAKNTVYLEMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 596 |
| 144 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYDLGWFRQAPGKEREFIAACGWKAEDTYYLNSVKGRFTISRDNAKNTVTLQMNSLNPEDTAIYYCAAGLTVNGRLLTRTYEYDIWGQGTQVTVSS | 597 |
| 145 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTVSTYFMSWFRQAPGKEREFVATIGGSGGSRYYADPVKGRFTISRDNAKNTVYLQMTALEPEDTAVYYCATGPAGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 598 |
| 146 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTLYLQMNALEPEDTAIYYCATGPRGFGSRKSNSYDYWGQGTQVTVSS | 599 |
| 147 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFSTYFMAWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADPVEGRFTISRDNAKNTVYLQMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 600 |
| 148 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTYTTYTMGWFRQAPGKDRTIVAAIRRTGGDPYYSTSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGSPLWTSSQDDYRHWGQGTQVTVSS | 601 |
| 149 | QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCSASERTFSTYFKVWFRQAPGKEREFVATIGGNGGSRYYADSVEGRFFISRDNAKNTVYLEMNALKPEDTAVYYCATGPRGFGSRKSTSYDYWGQGTQVTVSS | 602 |
| 150 | QVQLQESGGGLVQAGGSLGLSCAAYGSIPSTHFMGWYRQPPGKQRELVAGITGSDVTNYADSVKGRFIISREHAQNTVALQMNSLKPEDTAVYYCRVWGVGYDYWGQGTQVTVSS | 603 |
| 151 | QVQPQESGGGLVQAGGSLGLSCAASGSIPSTHFMGWYRQPPGKQRELVAGITGSDLTNYADSVKGRFIISREHAQNTVALQMNSLKPEDTAVYYCRVWGVGYDYWGQGTQVTVSS | 604 |
無
[0330]根據以下說明性實施例的詳細描述結合附圖，將更充分地理解本發明的前述和其他特徵和優點。本專利或申請文檔含有至少一幅彩色附圖。在請求並支付必要的費用後，官方將會提供帶有彩色附圖的本專利或專利申請公開案的副本。
[0331] 圖 1示出了CD28 x TAA雙特異性篩選的通用工作流程。
[0332] 圖 2示出了在初步篩選中鑒定的所有CD28結合劑的序列多樣性。
[0333] 圖 3示出了CD28雙特異性Fab（bsFab）的表位分箱（epitope binning）。用SPR探究抗CD28 VHH之間的競爭。
圖 3A示出了用SPR探究抗CD28 VHH之間的競爭的實驗方案。
圖 3B示出了在熱圖中收集的競爭資料。
[0334] 圖 4示出了在IL-2螢光素酶報告物測定中在CD3預活化的情況下對CD28 bsFab和二價Fab（bvFab）的評價。
圖 4A示出了在有和沒有交聯的情況下的單價抗CD28 x 抗口蹄疫病毒（FMDV）bsFab。
圖 4B示出了在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab。
圖 4C示出了在沒有交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab與二價CD28 bvFab。
圖 4D示出了在交聯的情況下的單價CD28 × FMDV bsFab與二價CD28 bvFab。
[0335] 圖 5示出了在T細胞啟動測定中對CD28 bsFab和bvFab的評價。
圖 5A示出了實驗設置。
圖 5B示出了在100 nM處理後第6天的IFNγ分泌。
[0336] 圖 6示出了在MLR測定中對CD28 bvFab的評價。
圖 6A示出了MLR測定的實驗設置。
圖 6B示出了在10 nM處理後第4天的IFNγ分泌。
[0337] 圖 7示出了含有關於48個CD28 VHH的全表位分箱結果的表。
[0338] 圖 8示出了使用流式細胞儀檢測CD28 bvFab與CD80的競爭。
[0339] 圖 9示出了同時結合表現CD28或TAA的兩種細胞的CD28 x TAA bsFab。
[0340] 圖 10示出了在IL-2螢光素酶報告物測定中對CD28 bsFab和bvFab的評價。
圖 10A示出了在不存在CD3預活化的情況下在有和沒有交聯的情況下的單價CD28 x FMDV bsFab。
圖 10B示出了在不存在CD3預活化的情況下在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab。
圖 10C示出了在CD3預活化後在有和沒有交聯的情況下的單價CD28 x FMDV bsFab。
圖 10D示出了在CD3預活化後在有和沒有交聯的情況下的二價CD28 bvFab。
圖 10E示出了在CD3預活化後在沒有交聯的情況下的單價CD28 x FMDV bsFab與二價CD28 bvFab。
圖 10F示出了在CD3預活化後在有交聯的情況下的單價CD28 x FMDV bsFab與二價CD28 bvFab。
圖 11示出了48個CD28 VHH的全表位分箱結果。
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Claims (19)
- 一種特異性結合CD28的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含含有CDR-H1序列、CDR-H2序列和CDR-H3序列的免疫球蛋白單可變結構域（immunoglobulin single variable domain，IVSD），其中： a) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列； b) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列； c) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 9所示的胺基酸序列； d) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列； e) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 14所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 15所示的胺基酸序列； f) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 16所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 17所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列； g) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 21所示的胺基酸序列； h) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 22所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 24所示的胺基酸序列； i) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 25所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 27所示的胺基酸序列； j) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 28所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 29所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 30所示的胺基酸序列； k) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 31所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 32所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 33所示的胺基酸序列； l) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 34所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 36所示的胺基酸序列； m) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 37所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 38所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 39所示的胺基酸序列； n) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 40所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 41所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 42所示的胺基酸序列； o) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 43所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 44所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 45所示的胺基酸序列； p) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 46所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 47所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列； q) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 49所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 50所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 51所示的胺基酸序列； r) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 52所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 53所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 54所示的胺基酸序列； s) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 55所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 57所示的胺基酸序列； t) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 58所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 59所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 60所示的胺基酸序列； u) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 61所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 63所示的胺基酸序列； v) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 64所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 65所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 66所示的胺基酸序列； w) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 68所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 69所示的胺基酸序列； x) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 70所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 71所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 72所示的胺基酸序列； y) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 73所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 74所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 75所示的胺基酸序列； z) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 76所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 77所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 78所示的胺基酸序列； aa) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 79所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 80所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 81所示的胺基酸序列； ab) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 82所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 83所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 84所示的胺基酸序列； ac) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 85所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 86所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 87所示的胺基酸序列； ad) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 88所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 89所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 90所示的胺基酸序列； ae) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 91所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 92所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 93所示的胺基酸序列； af) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 94所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 95所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 96所示的胺基酸序列； ag) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 97所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 98所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 99所示的胺基酸序列； ah) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 100所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 101所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 102所示的胺基酸序列； ai) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 103所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 104所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 105所示的胺基酸序列； aj) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 106所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 107所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 108所示的胺基酸序列； ak) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 109所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 110所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 111所示的胺基酸序列； al) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 112所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 113所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 114所示的胺基酸序列； am) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 115所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 116所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 117所示的胺基酸序列； an) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 118所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 119所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 120所示的胺基酸序列； ao) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 121所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 122所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 123所示的胺基酸序列； ap) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 124所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 125所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 126所示的胺基酸序列； aq) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 127所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 128所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 129所示的胺基酸序列； ar) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 130所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 131所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 132所示的胺基酸序列； as) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 133所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 134所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 135所示的胺基酸序列； at) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 136所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 137所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 138所示的胺基酸序列； au) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 139所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 140所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 141所示的胺基酸序列； av) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 142所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 143所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 144所示的胺基酸序列； aw) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 145所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 146所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 147所示的胺基酸序列； ax) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 148所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 149所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 150所示的胺基酸序列； ay) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 151所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 152所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 153所示的胺基酸序列； az) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 154所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 155所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 156所示的胺基酸序列； ba) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 157所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 158所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 159所示的胺基酸序列； bb) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 160所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 161所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 162所示的胺基酸序列； bc) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 163所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 164所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 165所示的胺基酸序列； bd) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 166所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 167所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 168所示的胺基酸序列； be) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 169所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 170所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 171所示的胺基酸序列； bf) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 172所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 173所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 174所示的胺基酸序列； bg) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 175所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 176所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 177所示的胺基酸序列； bh) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 178所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 179所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 180所示的胺基酸序列； bi) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 181所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 182所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 183所示的胺基酸序列； bj) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 184所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 185所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 186所示的胺基酸序列； bk) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 187所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 188所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 189所示的胺基酸序列； bl) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 190所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 191所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 192所示的胺基酸序列； bm) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 193所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 194所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 195所示的胺基酸序列； bn) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 196所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 197所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 198所示的胺基酸序列； bo) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 199所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 200所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 201所示的胺基酸序列； bp) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 202所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 203所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 204所示的胺基酸序列； bq) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 205所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 206所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 207所示的胺基酸序列； br) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 208所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 209所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 210所示的胺基酸序列； bs) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 211所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 212所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 213所示的胺基酸序列； bt) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 214所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 215所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 216所示的胺基酸序列； bu) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 217所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 218所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 219所示的胺基酸序列； bv) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 220所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 221所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 222所示的胺基酸序列； bw) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 223所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 224所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 225所示的胺基酸序列； bx) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 226所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 227所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 228所示的胺基酸序列； by) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 229所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 230所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 231所示的胺基酸序列； bz) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 232所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 233所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 234所示的胺基酸序列； ca) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 235所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 236所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 237所示的胺基酸序列； cb) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 238所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 239所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 240所示的胺基酸序列； cc) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 241所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 242所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 243所示的胺基酸序列； cd) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 244所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 245所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 246所示的胺基酸序列； ce) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 247所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 248所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 249所示的胺基酸序列； cf) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 250所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 251所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 252所示的胺基酸序列； cg) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 253所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 254所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 255所示的胺基酸序列； ch) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 256所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 257所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 258所示的胺基酸序列； ci) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 259所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 260所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 261所示的胺基酸序列； cj) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 262所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 263所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 264所示的胺基酸序列； ck) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 265所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 266所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 267所示的胺基酸序列； cl) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 268所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 269所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 270所示的胺基酸序列； cm) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 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298所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 299所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 300所示的胺基酸序列； cw) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 301所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 302所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 303所示的胺基酸序列； cx) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 304所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 305所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 306所示的胺基酸序列； cy) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 307所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 308所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 309所示的胺基酸序列； cz) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 310所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 311所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 312所示的胺基酸序列； da) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 313所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 314所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 315所示的胺基酸序列； db) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 316所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 317所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 318所示的胺基酸序列； dc) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 319所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 320所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 321所示的胺基酸序列； dd) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 322所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 323所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 324所示的胺基酸序列； de) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 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406所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 407所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 408所示的胺基酸序列； eg) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 409所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 410所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 411所示的胺基酸序列； eh) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 412所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 413所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 414所示的胺基酸序列； ei) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 415所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 416所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 417所示的胺基酸序列； ej) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 418所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 419所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 420所示的胺基酸序列； ek) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 421所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 422所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 423所示的胺基酸序列； el) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 424所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 425所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 426所示的胺基酸序列； em) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 427所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 428所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 429所示的胺基酸序列； en) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 430所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 431所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 432所示的胺基酸序列； eo) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 433所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 434所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 435所示的胺基酸序列； ep) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 436所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 437所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 438所示的胺基酸序列； eq) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 439所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 440所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 441所示的胺基酸序列； er) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 442所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 443所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 444所示的胺基酸序列； es) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 445所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 446所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 447所示的胺基酸序列； et) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 448所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 449所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 450所示的胺基酸序列；或 eu) 該CDR-H1序列包含SEQ ID NO: 451所示的胺基酸序列，該CDR-H2序列包含SEQ ID NO: 452所示的胺基酸序列，並且該CDR-H3序列包含SEQ ID NO: 453所示的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中該ISVD包含VHH結構域，其中： a) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 454所示的胺基酸序列； b) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 455所示的胺基酸序列； c) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 456所示的胺基酸序列； d) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 457所示的胺基酸序列； e) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 458所示的胺基酸序列； f) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 459所示的胺基酸序列； g) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 460所示的胺基酸序列； h) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 461所示的胺基酸序列； i) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 462所示的胺基酸序列； j) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 463所示的胺基酸序列； k) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 464所示的胺基酸序列； l) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 465所示的胺基酸序列； m) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 466所示的胺基酸序列； n) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 467所示的胺基酸序列； o) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 468所示的胺基酸序列； p) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 469所示的胺基酸序列； q) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 470所示的胺基酸序列； r) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 471所示的胺基酸序列； s) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 472所示的胺基酸序列； t) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 473所示的胺基酸序列； u) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 474所示的胺基酸序列； v) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 475所示的胺基酸序列； w) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 476所示的胺基酸序列； x) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 477所示的胺基酸序列； y) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 478所示的胺基酸序列； z) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 479所示的胺基酸序列； aa) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 480所示的胺基酸序列； ab) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 481所示的胺基酸序列； ac) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 482所示的胺基酸序列； ad) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 483所示的胺基酸序列； ae) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 484所示的胺基酸序列； af) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 485所示的胺基酸序列； ag) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 486所示的胺基酸序列； ah) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 487所示的胺基酸序列； ai) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 488所示的胺基酸序列； aj) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 489所示的胺基酸序列； ak) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 490所示的胺基酸序列； al) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 491所示的胺基酸序列； am) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 492所示的胺基酸序列； an) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 493所示的胺基酸序列； ao) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 494所示的胺基酸序列； ap) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 495所示的胺基酸序列； aq) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 496所示的胺基酸序列； ar) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 497所示的胺基酸序列； as) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 498所示的胺基酸序列； at) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 499所示的胺基酸序列； au) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 500所示的胺基酸序列； av) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 501所示的胺基酸序列； aw) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 502所示的胺基酸序列； ax) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 503所示的胺基酸序列； ay) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 504所示的胺基酸序列； az) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 505所示的胺基酸序列； ba) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 506所示的胺基酸序列； bb) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 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588所示的胺基酸序列； ef) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 589所示的胺基酸序列； eg) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 590所示的胺基酸序列； eh) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 591所示的胺基酸序列； ei) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 592所示的胺基酸序列； ej) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 593所示的胺基酸序列； ek) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 594所示的胺基酸序列； el) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 595所示的胺基酸序列； em) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 596所示的胺基酸序列； en) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 597所示的胺基酸序列； eo) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 598所示的胺基酸序列； ep) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 599所示的胺基酸序列； eq) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 600所示的胺基酸序列； er) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 601所示的胺基酸序列； es) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 602所示的胺基酸序列； et) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 603所示的胺基酸序列；或 eu) 該VHH結構域包含SEQ ID NO: 604所示的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段是嵌合或人源化抗體或其抗原結合片段。
- 如前述請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段是單株抗體或其抗原結合片段。
- 如前述請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段是雙特異性抗體。
- 如請求項5所述的抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性抗體包含對腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA）具有結合親和力的抗原結合結構域。
- 如前述請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段可操作地連接至CH1結構域和/或CL結構域。
- 如請求項6或7所述的抗體或其抗原結合片段，其中對CD28具有結合親和力的該抗體可操作地連接至CH1結構域，並且對TAA具有結合親和力的該抗原結合結構域可操作地連接至CL結構域。
- 如請求項6或7所述的抗體或其抗原結合片段，其中對CD28具有結合親和力的該抗體可操作地連接至CL結構域，並且對TAA具有結合親和力的該抗原結合結構域可操作地連接至CH1結構域。
- 如前述請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段可操作地連接至Fc區。
- 如請求項10所述的抗體或其抗原結合片段，其中該Fc區是人類IgG1 Fc區。
- 如前述請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含拮抗性抗體或其抗原結合片段。
- 一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子編碼如前述請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種表現載體，該表現載體包含如請求項13所述的核酸分子。
- 一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項14所述的表現載體。
- 一種用於抑制受試者的CD28活性的方法，該方法包括向受試者投予如請求項1至12中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，從而抑制該受試者的CD28活性。
- 一種用於治療受試者的與CD28活性相關的疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者投予如請求項1至12中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項17所述的方法，其中該疾病是自體免疫性疾病。
- 如請求項17所述的方法，其中該疾病是癌症。
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