HU228900B1 - Treatment of acute lung injury and fibrosis with antagonists of alphavbetha6 - Google Patents

Description

Est a kutatást rés tken a KL47412 és a HL539-4B számmal jelre tt 8XH támogatási források igénybevételével végettük» Az Amerikai Egyesült Államok kormányának lehetnek bizonyos jogai a jelen találmányban»

At integrinek heterodimer sejtfelstini adhéziós receptorok, amelyek két, a és β elnevezésű alegységből állnak, At ονβδ intagrin egy fibronektin és teuaszkin receptor, amelyet legnagyobb részben a hámsejtek expresstálnak» Az egészséges felnőtt főemlős szöveteiben a βΒ mBNS és protein ritkán mutatható ki, bár a expresszáláa a magzati fejlődés alatt, sebgyógyuléskor, és néhány hámszövetből kiinduld tumor esetében tapasztalható» Amikor a BB alegység a vastagbélben egy rákos sajtvonalban expresstáiódik, ahol normális esetben nincs jelen# at alegység megjelenése megAktastárnunk: 9X557-XÖ45/MOI χ XXX

X Λ X XX növekedett tűlburjánzási képességet bixtos.it. Sgy, a 86 alegységre jellemző, XI «iaosavas karboxil-terminális régió szükséges az av86 infegrln sejtburjánzást növelő hatásához (Agrez et al. 7.„_i;;;,Celi.Bipl,.., 47--556 (1994)} 86 axpresszáláat idéz elő az éld baktérium beoltásával előidézett trauma a XX típusú alveoius hámsejtökben, és 56 exprasszálás észlelhető a klinikai tüneteket nem mutató gyulladás gócpontjaiban is, továbbá sok, a tüdő, vagy a vese krónikus, vagy akut gyulladásában szenvedő betegekből származó klinikai mintában (Sreuss et al. J Coli Sci 106:2241( 1665}}.

Huang és mások (1. Cailglol. 133:921-925· (1696)} szerint a (Í3 alegységet kódoló génre null mutáns homozigóta egerek esetében a falősejbeknek a bőrállományba való szűrddésável összefüggő ífjükori kopaszság és aktivált limfooítáknak a vezető tüdőbeli légutak körüli felhalmozódása tapasztalható.

A tüdőfibrózis egy közismert rendellenesség, amelynek a kialakulása feltehetően a leukooitákból felszabaduló termékek káros hatásának tulajdonítható (lásd, például Marshali et al., Int, c,J,.hem.Coll Sin.29:107-120 (1097)}. A bieomioin által előidézett tüdőelváitozás és tüdőfibrózis összefüggésben van a limfociták képződésével ás aktiválódásával és az is feltehető, hogy függ tőlük (Schrier, D,J, st al., ám, 1. .....éathoi, 116:270-276 (1984}),A parenchymás tüdőelváltozás és tüdőfibrózis javallt gyógymódjai között van az antlcitokin^-terápiás kezelésmód (Cukor et al. Thoram 52 (2); 254-296 (1997}:.

' * * * X

X χ.» χ ί X X χ * 0«

V « φ 0 00«

0 0 * * X *

0 «Χ-00

A jelenlegi# akut tüdőtraumára éa tüdőfibrózisra alkalmazott terápiák azonban nagymértékben inadekvátnak mondhatók (lásd# például King et ai.. ‘’Xdiopathyic Fuimonary Fibrosis and other itiai Leng öiseases of Unknown Ftiology# * Tartbgó k g f ....fig.APA^ra-9.47 Hédiciné, Murray és Nadel# eds,# ^.S, Saunders# Philadelphia. FA, pp. 1821-1839 (1994)), Éppen átért szükség van az akut tüdbelvéltozás és tüdőfibrózis gyógyítására alkalmas terápiákra, Ennek# és más igényeknek a kielégítésére irányul a •jelen találmány*

A találmány egyrészről ax akut tüdőtraumában szenvedő betegek kezelési eljárására vonatkozik# amely magában foglalja egy ηνββ-antagonista terápiás dózisának a kezelt szómély rostéra történő beadását. A találmány a tüdődaganat áttételének meggátlására szolgáló eljárást is ismertet# amely magában foglalja egy av3»-antagóniata terápiás dózisának a kezelt személy részére történő beadását, A találmány vonatkozik továbbá a fibrosis kezelési eljárásra# amely magában foglalja egy mv^S-antagonista terápiás dózisának a kezelt személy részére történő beadását.

A találmány további vonatkozása az ATCC HB 12382 hibridóma által létrehozott monoklonálís antitest.

A találmány vonatkozik továbbá át ATCC SB 12332 hibridőváoa.

Az ábrák rövid ismartetőse

Az 1A ábra szerinti diagram a 0á integrin alegység gén null mutációját empresszáló egerek tüdő-hidroxiprolin φ « « « φ X « «Φ Φ WX»' állományát hasonlítja össze a kontroll példányokéval, bleomicin, vagy sóoidat jelenlétében.

Az 18 ábra a kis energiájú tüdőmetszetek trikróm festéséről készült fénykép# amelyen látható# hogy 30 nappal a kezelés után# a bleomicinnel-kezelt vad típusok tüdejében a kollagén extracelluláris mátix sűrű felhalmozódása tapasztalható (bőt/e)_f szemben a (88-/-) egerekkel.

A 2. ábra szerinti diagram a vad-tipusú egerekben (Sót/*·) a tüdő vízmennyiségének növekedését hasonlítja őszsze a 86~/~ egerekével# bleomicin, vagy sóoldat jelenlétében ,

A 3, ábra szerinti diagram a vad-típusú (86+/-H és β/- egerekben a limfocíták megjelenését hasonlítja össze a bleomicin# vagy sóoldat adagolása után.

A találmány részletes leírása

Az alábbiakban ismertetett találmány az akut tüdőelváltozás kezelési eljárásaira és készítményeire vonatkozik# mint amilyen például a bakteriális szepszísből származó tüdőelváltozás# vérzéses sokk# méreg belégzés és a bleomicin# vagy egyéb gyógyszer által előidézett tüdőelváltozás# de nem korlátozva tárgyát kizárólag ezekre, Ezenkívül# a találmány szerinti készítmények alkalmazhatók a hámszövettel rendelkező szervekben# mint a tüdőben# a májban# a vesében# a húgyhólyagban éa a nyelőcsőben fellépő fíbrőzia kezeléséA- A

Az ilyen készítmények alkalmazhatók mind kórmegelőző jelleggel, mind terápiásán az akut tüdőelváltozás# vagy a

X* íibrózis tüneteiben szenvedő, vagy esek által veszélyeztetett betegek esetében. Például ások a személyek, akik Megeső beiéiegző szernek voltak már kitéve, valószínűleg kezelésben részesülnének a belélegzés után, míg a bleomioinkezelésben részesülő személyek kórmegelőző jelleggel és/vagy terápiásán kezelhetők, A találmány szerinti készítmények rendszerint tipikusan naponta adagolhatók, legalább

1-5 napos periódusra, bár azok a betegek, akik előrehaladott tüdőfibrózlsban, vagy súlyosbodó betegségben szenvednek, a terápiás dózist hónapokig vagy évekig is kaphatják, A jelen leírásban a terápiás dózis kifejezés jelentése olyan dózis, amely meggátolja, enyhíti, mérsékli, vagy egyébként csökkenti a beteg tüneteinek súlyosságát.

A találmány egyes megvalósítási formáiban ονβδ-antagonisták szerepelnek. Szén antagonisták magukban foglalják azokat az antitesteket# amelyek specifikusan a βό-hoz kőtődnek; azokat az antitesteket, amelyek specifikusan a οηφό Ugandámhoz kötődnek; az ονββ ligandumokat; az antiszensz nukleinsavakét; és a peptid-; nem-peptid-; és a peptidutánzó analógjait az ilyen ligandumoknak, azonban nem korlátozódnak kizárólag ezekre.

.Az antitestek lehetnek szintetikusak, monoklonálisak, vagy poliklonállsak és ismert eljárásokkal állíthatók elő. Egy előnyős megvalósulási formájában az antagonista egy antitest, amely specifikusan felismeri a pő alegység citoplazmatikus régióját (lásd, például ffeinacker et al. d. ggll.......,ll9,t_;;;;:.; 1-g (időd) j . A terápiás alkalmazásokhoz a humán monoklonális antitestek, amelyek humán állandó és χ «·

X'X * ** φ φ * φΦΧ* » * X χ X * Φ φ *' φ Φ » Φ* φ Α változtatható részieteket tar ta l.masnak, előnyösen alkalmazhatók, azért, hogy a gyógykezelt személy antitesttel szembeni immunraakcióját minimalizáljuk. Ilyen antitesteket előállíthatunk olyan transzgén állatok immunizálásával, amelyek humán immunglobulin géneket tartalmaznak {lásd, uakobovits et al. Anu ΝΎ A-Cád 5ci 7 64:525-535 (1995;) . A szintetikus és félszintetíkus antitestekkel összefüggésben, az egyes kifejezések jelentik az antitest fragmenseket, az izotipusos váltott antitesteket, a humanizált antitesteket, (például egér-ember, ember-egér, és a hasonlók), a hibrideket, a több specifikus hatással rendelkező antitesteket, a teljesen szintetikus antitest-szerű molekulákat, és a hasonlókat, azonban nem korlátozódnak kizárólag ezekre.

Amint az az alábbiakban kifejtésre kerül, az antitestek osztályozhatók azon képességük szerint, hogy meggátolják egy llgandumnak a ανβδ-hoz, és/vagy más részekhez való kapcsolódását, ilyen képesség a bieomicin által előidézett tüdőiibrózís elleni in vivő védelem. Példát jelent az anti55 monoklonális antitestre a 1005 (ATCC letéti száma: HB12382, letétbe helyezve, 1997, augusztus 6-án).

A találmány megvalósításának más formáiban olyan antagonistákat használunk, amelyek a peptldek, polipeptidek, proteinek, vagy peptidutánzó anyagok, amelyek az αν$6 számára azon az elven tervezett ligandumok, hogy sejtfelszíni adhéziós argínin-giicin-aszparaginsav helyek vannak jelen rajtuk. Az ilyen molekulák, mint az intergrínek számára képzett ligandumok tervezésére több példa is ismert, mint Piersbacher et al., <X Cell Biochem 56:150-154 (1954));

Ruosiahti, .Αρη. Rny, Coll.^: 627-715 <1990 ; Chorov et al. Biopollmorg 37:3§7-375 {1995}}; Pasquali.nl et al., d. Cail, Bioi, .130:1199-1196 (1995)}; és Smith et al.,

3..,, Bioi <.....Chem. 289:32789-32795 {1994.})

A. találmány agyas megvalósítási formáiban antlszensz nukleinsav molekulákat használunk, mint az av58~antagonistéit. Az antlszensz nukleinsav .molekulák a nukleinaavak olyan komplementer oligonukleotíd szálai, amelyek úgy vannak konstruálva, hogy a nukleotldok agy specifikus szekvenciáját megkössék, ezzel meggátolva a célzott protein képződését. A B6 Integrin alegység nukieotid szekvenciáját USSA 07/729,215 alapszámú, 1991. július Xl-én benyújtott szabadalmi bejelentésben Írták le, amely Iratra, ezúton mint egészre hivatkozunk. Szék az vegyüíetek önmagukban, vagy más antagonistákkal kombinálva alkalmazhatók. Az antlszensz antagonisfa lehet antlszensz oligonukleotíd, például HAS (lásd, például Murayama et al. Antioenoo KLClelc Arid Drtig gev., 7:109-114 {1997}}.}. Az antlszensz gének lehetnek virusvektor formájában, mint például hepatitis S vírusban (lásd, például 31 et al., 3.,,, Jirai Hepat.4:187-173(1997)}; vagy mirigyekkel összefüggésben álló vírusban (lásd például Xiao et al. Braln^es. 756:78-83 (1397)}; vagy más rendszerekben, amelyek egy Wd (Sanda! vírus}-liposzéma gén továbbítási rendszert tartalmaznak, non korlátozva azonban kizárólag ezekre (lásd például Kanada et al. Ann H

811:299-309 }; egy ^peptld-vektor^ formájában (lásd, például Vidal et ai· CR Acad. Sci XXI 32):279-297 {1997}}; mint agy gén agy eplssornálIs, vagy plazmád hordozóban (lásd, például Cooper et al, Prpep Papéi. Acad.Sci«USA 94:6450β455 (1997), Yew et al» Hat <Sene....Ther». 8:575-584 (1997) ) ; mint egy gén egy peptid-DHS aggregátumban (lásd, például, diidcme et al, J» J> Bioi.Cégű 272:15307-15312 (1997) s; mint egy csupasz D3S^íf (lásd, például Ü13> 5,580,859 és 5,589,495); és lipid vektor rendszerekben (lásd, például hee et al» Colt Kev Ther Orug Carrier 5yst. 14:173-205 (199?) K

A lehetséges ov^á-antagonistákat funkciójuk szempontjából többféle ismert eljárással és/vagy & jelen bejelentésben későit módon osztályozhatjuk, mint például a bleomicin által előidézett fibrózis elleni védelem vizsgálata egér kísérleti modellen; a tumorsejtek burjánzásnak gátlása (Agrez et al», .5 Coll Bio,, 127:547-555 (1994)); és a sejt migráció és/vagy a sejt adhézió gátlása (lásd, a Kísérleti példák részben)»

A találmány szerinti antegonlsták kiszerelésére nagyszámú megfelelő kiszerelési forma található a gyógyszerészeti vegyészek által ismert irodalomban: Aemington*s Pharmaceutical Sciences, (IStfe Kdition, Mack PubXisfeing Company, Saston, Pennsylvania (1975), különösen 5?» fejezet, benne Slang, Seymour» Ezek a kiszerelési formák lehetnek például porok, krémek, kenőcsük, gélek, viaszok, olajok, iipidek, vízmentes abszorpciós bázisok, o/v emulziók, v/o emulziók, carbowax emulziók (különböző moXekulatümegü polietilén gilkolok), félig szilárd gélek és félig szilárd, carbowax-tartalmú elegyek.»

A. hatásos tarápiához szükséges hatóanyag mennyiség különböző tényezőktől függ# Így az adagolás módjától# a célhelytől# a kazalt személy fiziológiai állapotától # vagy az egyidejűleg adagolt más gyógyszerektől. Ezért a kezelési dózisokat úgy kell meghatározni/ hogy a biztonság és a hatékonyság legkedvezőbb értékeit érjük el. Általában az in vitro alkalmazott dózisok hasznos iránymutatással szolgálhatnak a hatóanyagok in situ adagolása esetében# a hatóanyag mennyiségét illetően. Bizonyos rendellenességek esetén a hatásos kezelési dózis meghatározásához alkalmazott, állatkísérletek további előrejelzés-szerű értéket nyújtanak az emberen alkalmazott dózisra nézve. Többféle szempont ismeretes# például ..„Goodman and Gilman js the gharmapp lóg Icai Boris g ftherapeut i cs # ?^sn Edition (ISSSi# MacMillan Bubüshing Company# Hew York. and Remingten*s Bbarmoeu t IcaiSciences 18th Edition# (1990) Msek Rublishing Co# Sastón Fenn. Ezek tárgyalják az adagolási módszereket# igy az orális# intravénás# intraperitoneális# intramuszkaláris # transzdermális# nazális adagolást# az ionotophoresist és az ezekhez hasonlókat,

A. találmány szerinti készítmények adagolhatok különböző dőzisegység kiszerelésekben# az adagolás módjától függően. Például as orális adagolásnak megfelelő dőzisegység kiszerelések lehetnek szilárd dózisformák# Így por# tabletták# pirulák# kapszulák# drazsék# és folyadék dózisformák# igy elixírek# szirupok és szuezpenziók, A hatóanyagok adagolhatők parenterálisan is# steril folyadék dózisformák alkalmazásával, Zselatin kapszulák tartalmazzák a hatóanyagot χ ?·\ Λ ν és mint közömbös összetevőket porított hordozókat# mint glükózt# laktőzt# szacharózt# mannitot# keményítőt# cellulózt# vagy cellulóz származékokat# magnézium-sztearátot# sztearinsavat# nátrium-szaharínt# talkumot# magnézium-karbonátot és az ezekkel zokon anyagokat* További közömbös összetevők azok az anyagok# amelyek a megfelelő szín# íz# stabilitás# pufferkapacltás# diszperzió# vagy más# ismert kívánatos tulajdonság biztosítása érdekében adhatók a készítményhez# ezekre példák a vörösvaaoxld# a szilikagél# a nátrium-iauril-szulfát# a títán-díoxíd# az étkezési fehér festékanyag és az ezekhez hasonlók. Hasonló higítószereket használhatunk préselt tabletták készítésekor, Mind a rab™ látták# mind a kapszulák gyárthatók szabályozott hatóanyag™ felszabadítást! készítményként# igy órákon keresztül folyamatos hatóanyag felszabadítást érhetünk el, A komprimált tabletták elláthatók cukor™# vagy film bevonattal# hogy elfedjük a kellemetlen ízt# és védjük a tablettákat a levegőtől# vagy lehetnek bélben oldódó bevonattal ellátva# a gyomor-bél traktusban lejátszódó szelektív szétesés biztosítása érdekében. Az orális adagolásé folyadék dózis-formák tartalmazhatnak színező- és Ízesítő anyagokat# a betegeknek az adagolás-tűrésének megnövelése érdekében,

A találmány szerinti készítmények koncentrációja a gyógyszerészeti kiszerelésekben széles skálán# azaz a kevesebb# mint kb, 0#X tömeg %-től az általában használt# 2 tömeg %# vagy legkevesebb 2 tömeg %-íg# illetve 20-50 tömeg %-ig változhat# vagy ezt is meghaladhatja# és elsődlegesen folyadék térfogatok# vagy viszkozitások stb. szerint váiasztjnk ki, az adagolás meghatározott módjának megfelalősn,

A találmány szerinti készítmények adagolhatók liposzómákon keresztül is. A liposzómák lehatnék emulziók/ habok, mícellák# oldhatatlan, monomolakaláris rétegek# folyadékkristályok, foszfolipid diszperziók# lemezes rétegek és az ezekhez hasonlók, Ezekben a preparátumokban az eljuttatandó találmány szerinti gyógyszer kész ítmény a liposzőma belekevert része# akár ónállóén# akár egy olyan molekulával Összekapcsolva, amelyik megköti a kívánt célvegyületet, mint például antitestet, vagy más terápiás vagy immunodén készítménnyel» Ezáltal a líposzómák# amelyek a találmány szerinti kívánt készítménnyel vannak töltve vagy felhordva# eljuttathatók az egész szervezetbe# vagy Irányíthatók egy# érdekelt szövethez# ahol majd a liposzőmák célba juttatják a kiválasztott, terápiás/immunogén pepiid készítményeket.

A találmányban leírt felhasználásra a iiposzómákat szabályos hólyagképzö (vesicle-formíngl lípidekböl állítjuk elő# amelyek általában semleges és negatív töltésű foszfolipideket és egy szterint# mint például koleszterint tartalmaznak, A lipidek kiválasztásánál általában olyan tényezőket veszünk figyelembe# mint például a liposzómaméret# sav-bomiétenyság és a liposzőmák stabilitása a véráramban. Többféle módszer is ismeretes a liposzőmák előállítására# amint az például a Szoba et al, Ann Hev.Bíophys. Mpeng,,... 9:46? (1500), a 4#235#M1# <#5Ü1#?26# 4#83?.#Ö29# és a 5,019369 számú US szabadalmi leírásokban szerepel# amelyeket itt hivatkozásként közlünk,

A találmány szerinti készítményt tartalmazó liposzoma szuszpenziő adagolható intravénásán# lokálisan# helyi jelleggel# stb,# egy többek között az adagolás módja# az eljuttatott találmány szerinti készítmény és a kezelt betegség stádiuma szerint változó dózis alkalmazásával.

A szilárd készítményekhez szokásos# nem toxikus szilárd hordozókat használhatunk#, amelyek közé tartozik például a sasait a laktóz# a keményítő# a magnézium-sztearát# a nátríum-szaharin# a talkum# a cellulóz, a glükóz# a szacharóz# a magnézium-karbonát ás az ezekhez hasonló anyagok gyógyszerészetileg elfogadható minőségei. Orális adagolásra# egy gyógyszerészetileg alkalmazható nem toxikus készítmény lehet a bármely általában alkalmazott - például az előbb felsorolt - kötőanyagot és általában 10-95 % -egy vagy több - a találmány szerinti hatóanyagot tartalmazó készítmény# (siet gépelési hiba az eredeti dokumentumban# a ford.)# ezen belül előnyős a 25-75 %-os hatóanyag-koncentráció .

Aeroszolos adagoláshoz a találmány szerinti készítmények egy finom fokbeosztásos kiszerelésben# felületaktív anyaggal ás haj főgázzal együttesen kerülnek alkalmazásra. A találmány szerinti készítmények tipikus esetben 0#01-20 tömeg %# előnyösen 1-10 tömeg %-os koncentrációban alkalmazhatók. A felületaktív anyag nem lehet toxikus és előnyösen oldható a hajtógázban. Az ilyen vegyületekre példák a 6-22 szénatomot tartalmazó zsírsavak észterei vagy parciális észterei# mint a kapronsav# az oktánsav# a laurinsav# a paImitinsav# a sztearinsav# a linolsav# a linolénsav# az olesztersav {oleateric acíd) és az olaj sav, egy alifás többártékü alkohollal, vagy annak ciklikus anhidridjéval képzett észterei. Alkalmazhatók kevert észterek, mint a kevert vagy természetes gliceridék is.

A felületaktív anyag a késrltnény 0,l-2ö tömeg %-át, előnyösen 0,25-5 tömeg %-át teszi ki. A fennmaradó rész rendszerint a hajtógáz. Szükség szerint hordozóanyag is alkalmazható, mint például lecltin intranazális adagoláskor.

A találmány szerinti készítmények egy raktározójel legű rendszerben, kapszulába zárt formában, vagy ismert aljÍrásokkal beültetett formában is adagolhatók. Ehhez hasonlóan, a készítmények eljuttathatok a kezeit szövetekhez egy pumpa segítségével is.

Az előbb említett kiszerelések bármelyike megfelelő lehet a jelen találmány szerinti kezelésekhez és a terápiákhoz, feltéve, hogy a készítményben a hatóanyag nem válik inaktívvá a kiszerelés hatására, és a kiszerelés fiziológiailag megfelelő.

A következő példák célja a jelen találmány bizonyos aspektusainak a szemléltetése, és nem jelentenek korlátozást a találmány tárgyára nézve.

Kísérleti példák

1. Bevezetés

A tüdőfibrózis egy közismert rendellenesség, amelynek a feltételezett okai a laukocitákból felszabaduló termékek káros hatásai.· Bár a légúti hámszövet sérül a fibrózis kifejlődése alatt, a hámsejtekről magukról nem mutatták ki.

ο.

hogy hozzájárulnak a fenti folyamathoz, Megvizsgáltuk a bleomicin# egy ismert# tüdöfibrózist okozó gyógyszer# egy egyszerű integrin alegység IS6} gén null mutációját oxprosszáiá egereken tapasztalható hatásait# ez teljesen a hámsejtekre korlátozódott, A βό~/~ egerek esetében teljes védettség tapasztalható a bleomicin által, kiváltott fibrózisra< Azok a kezelési módszerek# amelyek ezt az integrint célozzák meg# új közelítést eredményeznek ennek a nagyon nehezen kezelhető betegségnek a gyógyításában.

Az uváó integrin kizárólag hámsejteken expresszálódik# alapvetően az org-anogenezis során és sérülés esetén válaszreakcióként. A S-Z- egereken fokozottan erős' gyulladásos válasz tünetek tapasztalhatók a bőr- és légúti sérülésre# de állapotuk, javul és helyreáll a normális állapot (Huang# X#3, Call Bioi, 133:921-928 (1S9SH .

II. A ββ' integrin alegység gén inakti válása megvédi az egereket a bleomicin által előidézett túdőfibrdristé.1

Az endotracheáiis injekció formájában beadott bleomicin (0#03 egység 60 ul sóoldatban} # vagy a adóidat vlvóanyag tüdőre gyakorolt toxikus hatását# kor és nem szerint összeválogatott vad-típusú CH/ai és (S-Z-) 12$SVBM/tar fajtájú egereken vizsgáljuk* A tüdőfibrózist 15# 30 és 00 nappal a kezelés után értékeljük# a tüdő morfológiájának vizsgálatával és a hidroxiprolin állomány# a kollagén lerakódás mutatójának mérésével* A fíbrózls jelentős a folaomioin-kezelt vad-típusú agarak esetében 30 nap után ás sz 30 napig tovább fejlődik (1A-1B ábrák)., Ezzel szemben# a β€~/--· egerek tüdejének morfológiája koséi azonos mát ad a kísérlet elejétől a végéig, a fibrózisnak csak kisméretű foltjai észlelhetők; a tüdő hidroxiprolin állománya pedig nem különbözik jelentős mértékben attól as értéktől, amelyet a csak sóoldattal kaséit állatoknál mértünk, bármely időpontban* Sz as eredmény nem jellemző a tiszta 129 egérnél, mivel hasonló eredményeket tapasztalhatunk a 129 ivadék esetében C578X/6 keresztezésekkel. Szék a váratlan eredmények rámutatnak arra, hogy az «νβδ integrin képződése szükséges a tüdőfibrőzis előidézéséhez<

Azért, hogy meghatározzuk as ανββ szerepét a bleomicin áltál előidézett fibrőzis korai stádiumaiban, megmérjük a tüdő víz tartalmát - amely a tüdővizenyő egy jele és az erek megnővekedett permeábilitásából származik-, 1, 5-, és IS nappal a bleomícin vagy a sóoldat adagolása után. á vad-típusű egerek esetében a tüdő víztartalma S nap után maximálisra növekszik és a bleomicln adagolása után legfeljebb! 5 napig a megnővekedett értéken marad (2. ábra). Mint a tüdőiíbrózis esetében, a βδ-Ζ- egerek nagymértékben védettek a bleomicln ezen korai hatásától, jelezve a hám-ανβδ szerepét a bleomyein-indukált érfai áteresztés előtt.

Korábban említettük, hogy a βδ-Ζ- egerek felfokozott egymagvű sejtes gyulladásos válaszreakciókat mutatnak a bőrön és a légutakban (Huang, Cell_: Bioi. 133:921-928 (1996)). A bleomicln által előidézett tüdőéivé!tozás és tüdofibrózis összefüggésben van a iimfociták képződésével és aktiválódásával és feltételezhető, hogy függ azoktól (Schrier, D.J. et al., ám, J. Bárhol, 116:270-278 ( 1984)).

*Φ X <

Asért, hogy meghatározzuk hogy a β6~7~ egerek ellenálló képessége bleomicln-indukált traumával és fibrőzíssal szemben a módosult limfocita képződésnek és aktiválódásnak a következménye-e, megszámoljuk a CD4a és CDS* limfocitákat és értékeljük a limfocita aktíváoiót as interleukin 2-receptor ÍCD2S; expresszálődásának mérésével azokban a sejtekben, amelyeket a söoldat--, vagy bleomicinnel-kezelt egerek felmetszett tüdejéből nyertünk rí, a keselés után 5 és IS nappal . összhangban korábbi megállapításainkkal, több CD4t, CD8* és CD25a sajt található a S6~/~ egerek tüdejében, mint a vad-típusú állatok esetében. A bleomíein nagymértékű növekedést idéz elő a CD4e és CDS* expresssálő limfociták számában és növekedés tapasztalható a CD25a expresszáló limfociták százalékos arányában Is (3. ábra), mind a vadtípusú, mind a S6~/~ egerek esetében. Mind a vad-típusú, mind a 66~7~ egerek esetében a tüdő limfociták képződése és aktiválódása a bleomíein adagolás után 5 nappal maximális és 15 nappal a kezelés után kezd csak csökkenni. Anélkül, hogy bármilyen elméleti feltételezésre szorítkoznánk, ezen adatok alapján feltételezzük, hogy a Sé~/~ egerekben a limfocita képződés vagy aktiválódás hiánya valószínűtlen, hogy alapjául szolgái a bleomíein tüdőre gyakorolt káros hatásától való védettségüknek.

Az intergrinek a mátrix ligandumukkal való kölcsönhatása modulál több fontos sejtfunkciót, ideértve a sejtosztódást (Agrez, M. et al., J.Cell Bioi 127:547-556), a túlélést (Lukacs, N.-W. et al., Eur._ŰiImmunoi. 25:245-251 (1995)) és a citokinek (Míyake, S. et al., J._Sxp. Mód.

5Í *

177:80-868 {1.993) > és a metalioproteinázok expresszálását (Werb# 2. et al.# J. Ceil Bigl. 109:377-889 (1989)} . Csak a 86 alegységről állapítható meg# hogy egy egyszerű intergrin heterodimert# uv{sS-ot képez# és kizárólag a hámsejtekre korlátozódik. A hámsérülés után# az ονβ8 expresszélödás gyors előidézésével párhuzamosan annak az integrinnek a legalább két Xigandumának (fibronektin és tenaszkin) a lokális koncentrációja megnövekszik. Korábban megállapítottuk# hogy az ov88 expresszálódása szerepet játszik az egynngvű sejtek gyulladásos reakciói megszüntetésében a bőrben és a tüdőbeli vezető légutakban (Buang, X.&. Coll Bioi, 133:921-928 (1998)), Az itt bemutatott eredmények rámutatnak# hogy ez az integrin szintén központi szerepet játszik a bleomicin hatására bekövetkező tüdőelváltozás és tüdőiinrózis kiváltásában is.

A légúti hámsejtekről sokáig azt gondolták# hogy alapvetően egy passzív gát részei# amely elválasztja a tüdő egyéb sejtjeit a heiégzett levegő potenciálisan mérgező összetevőitől. Ezen a határfelületen azonban a sejtek megfelelő helyzetben vannak ahhoz# hogy a traumára lokális reakciókat indítsanak be éa moduláljanak. A jelenlegi bizonyíték alapján feltételezhető# hogy a légúti hámsejteknek megvan az a képessége# hogy szintetizáljon és kiválasszon bizonyos proteineket# amelyek képesek a traumára válaszreakciókat beindítani és modulálni# ideértve a kemokineket (e.g. infcerleukin-S# GRÖtc GROy# SWSS# «CSF# AXF-ln# és AC8-1)# más citokineket (e.g*# 1L-S# 11-11 és 1115) és növekedési faktorokat (például TGF8) . Anélkül# hogy bármilyen

Φ > * Φ Φ X φ Φ Φ φ Φ Φ χ Φ

Φ X « X φφ φ φ

*.«♦ ΦΦ « ΧΦ Φ Φ φ.«χ elméleti feltételezésre szorítkoznánk, a hám-ctv^ δ-nak, a tüdőelváltozás és tudöfíbrőzis kifejlődéséhez való hozzájárulásának egy lehetséges mechanizmusa az említett proteinek közül egynek, vagy többnek a képződésének modulálása.

A tüdőfibrózis kezelésére alkalmazott jelenlegi terápiák nagymértékben inadekvátnak mondhatók. A jelen tanulmány eredményei rámutatnak, hogy a légúti hámsejtek és az σνβδ hám-integrin fontos szerepet játszanak a parenchymális tüdőelváltozás és tüdőfibrózis patogenezisében és azok a terápák, amelyeket specifikusan úgy alakítunk ki, hogy. befolyásolják ennek az intergrinnek a funkcióját, hasznosak ezeknek a nehezen kezelhető tüdőbetegségeknek a gyógykezelésében.

XII: A blokkoló antitest előállítása

A. A monoklonális.antitest előállítása A <χνβ6 ellenes antitestek előállítása érdekében ββ-/~ egereket vagy vad-típusú egerekből kinyert keratinocitákkai, vagy rekomhináns, Freunds-segédanyagfoan képzett, kiválasztott emberi ανβδ-tal (Weinacker et al., J. Bioi. Cú ham. 263:6940-0948 (1994)} immunizálunk. Egér splenocytákat gyűjtünk és egyesítünk SP2/0 egér myenoma sejtekkel, az általános eljárás szerint. A βδ- és az ál-transzfektáit S$ 430 sejteket alkalmazzuk a képződő felülúszó osztályozására, áramlásos citometria segítségével. Azokat az antitesteket használjuk a további kísérletekben, amelyekről azt találjuk, hogy képesek felismerni a βδ-transzíektált sejteket, de nem az ál-transzfektáit SW 480 sejteket.

XS

8« A jnonoklonális antitestek jellemzése

Az egér nvff elleni antitestek előállítása érdekében, kiválasztott humán ηνβδ-ot ée egér keratinocitákat használunk mint immunogéneket# 129/CS? £6-/-háttár egerekben. A képződött hibrídómákból származó felütészót az ál- és a ββtranszíektált sejtek differenciált festése szerint osztályozzuk. A keletkező CS66 és 10DS antitestek festik mind az SW 480 sejteken expresszált humán ββ-ot, mind a vad-tipusú keratinocitákban expresszált egér ββ-ot. A CSilá további jellemzését (35S)-jelzett egér keratinodra lysatnm immunokicsapódásával végezzük. Sz az antitest kicsapja a ββ*/* keratinocitákhói származó «νβ6-nak megfelelő molekulatőmegű heterodimereket# de nem a ββ-Ζ—bői származóknak megfelelőket# ami azt mutatja# hogy ezek az antitestek specifikusan az <χνβ6 íntegrinnek megfelelők,

A cspő és a lODő blokkoló hatását sejtadhéziós' kísérletek elvégzésével ββ-transzfektált SW480 sejtekkel és egér keratinocltákkal fibronektinen szintén megvizsgáltuk. Csak a 10D5 mutat azonban blokkoló hatást az egér sejteken. A 10ö5 a β§-Ζ- keratínocítáknál tapasztálbatóval azonos mértékig gátolja meg a vad-tipusú keratincciták migrációját fibronektinen.

C. Sejt-adhéziós vizsgálat üregű nem-szöveti tenyészet-kezeit polisztirol tőbböregű míkrotltráió tálcákat (Línbro/Titertek# Flow Laboratories# McLean# VA) vitronektinnel# fibronektinnel# vagy kollagénnel vonunk be. 100 pl# a mátrix különböző mennyiségeit tartalmazó oldatot adunk, hozzájuk és 37 ®C-on 1 óráig inkubáljuk, Az inkubáció után az egységeket PBS-sel mossuk# majd 1 ·%# szérummentes BMSM1-ben levő SSA-val# 3? *C~on# 33 percig blokkoljuk. Az összehasonlító mikrotitrálő egységeket 1 % BSA-tartalmű WEM-vnel töltjük meg. A sejteket a migrációs kísérleteknél leírtakkal azonos módon begyújtják# majd szérummentes KCM-ben reszuszpendáljuk és azután minden protein-bevonatú titrálőegységbe bemérjük# BMA jelenlétében# vagy annak hiányában. A blokkolási kísérletekhez a sejteket az antitestekkel a tálcákra mérés előtt 5 percig# 4 *C-on inkubáljuk. A tálcákat {felső résszel felfelé) 10 g mellett# 5 percig centrifugáljuk# ezután 1 óráig# 34 ’C-on és párásított# 7 % C02-tartalmú atmoszférában inkubáljuk, A nem összekapcsolódott sejteket a tálcák alsó részének felfelé állításával végzett# 5 perces# 48 g melletti centrifugálással eltávolítjuk. Az összekapcsolódott sejteket 1 %-os formaldehiddel fixáljuk és 0# 5 %-os kristályibolyáx^al festjük# majd a titráló egységeket FBS-sel mossuk. A sejtek relatív számát minden titrálóegységben az S9S nm-en, egy Microplate Reader (Bio-Rad) segítségével# az abszorbancia megmérésével értékeljük.

1. Migrációs vizsgálat

A sejt migrációs vizsgálatokat mátrix bevonatú átjárható egységű (transwell) tálcákon végezzük (8 pm-es pórusméret# Costar# Cambridge# HA). A membrán alsó felületét BBS-ben oldott kollagénnel (10 pg/ml) # fibronektinnel (10 pg/mi) vagy vibronektinnei (10 pg/ml) vonjuk be# a bevonást 1 órán

Ibul&ácco’s Ksedified SagXa's mdivm χφ·5 át, 37 ^φΟοη végrehajtva, és 1 é BSA-val blokkolva. A primer keratinocita tenyészeteket tripszin/EDTA segítségével gyűjtjük össze és a tripszínt szójabab tripszin inhibitorral inaktiváljuk. A sejteket szárummentes KGí-ben szuszpendáljuk és a felső kamrában helyezzük el, 3,6 x 104 per titrálóedény sűrűség mellett, 100 pl közegben, fórbólmirisztát-acetát (PMA, 10 ug/ml) jelenlétében, vagy hiányában. A gátlás! kísérletekhez antitestet adunk hozzá felső és alsó kamrákban, jelenlétében. 0 őrás inkubáció után a sejteket 2 % paraformaldehiddel fixáljuk és 1 %-os formaldehidben oldott 0,5 t-os kristályibolyával festjük. A felső kamrában levő sejteket eltávolítjuk és az alsó felületen megszámlál juk 10 x-es rácsozattal, nagy teljesítményű nagyítással (40x|. A mezőket megszámláljuk és átlagoljuk minden tanulmányozott körülmény esetében.

XV. A $ő-kikapcselt egerek esetében kisebb a tüdőáttétel gyekor! sága

Transzgén egerek egy csoportját, amelyben spontán áttételes mellrák alakul ki (HMTV-mTAg egerek) keresztezünk $6-kikapcsolt egerekkel. Azokban az utódokban, amelyekből hiányzik a 05, gyorsan kifejlődő emlőtumor alakult ki, de nagymértékben csökkent a tüdőáttétel előfordulása ás terjedelme azokhoz at alomtársakéhoz képest, amelyek expresszáltak βΒ-ot. Immunohiszfcokérnia segítségével kimutatható, hogy a βδ expresszálása erőteljes az áttételes károsodás széle környezetében, Sz alapján feltehető, hogy a maximális áttétel megvalósulásához szükséges a ββ ebben a modellben.

** * X *

Φ «*Φ Φ * # * * φ φφφ.# X Α ΦΦ* *# Φ Φ»Φ* **·#

Mivel a βδ-kikapesolt egereknek krónikus tüdőgyulladása van, lehetséges, hogy a csökkent áttétei a tüdőben jelenlévő, az áttételes növekedést akadályozó gyulladásnak feleltethető meg. Két kísérletet végeztünk a kérdés tisztázására :

1. Egy ββ-ot expresszáiő, primer tumorból származó sejtvenaiat olyan szingenetíkus egerekbe injektálunk, amelyek között vannak vad-típusúak és ^é-kikapcsoltak is. A tüdő áttétei gyorsan kifejlődött mindkét egércsoport esetében, amiből az feltételezhető, hogy a ^-kikapcsolt egerek esetében a gyulladás nem akadályozza a tumorsejtek növekedését a tüdőben.

2. Mind β6-kikapcsolt, mind vad-típusú egerekben levő tumorbői származó sejtvonalakat szingsnetikus vad-típusú egerekbe fecskendezünk. A vad-típusú sejtvonalak mindig tüdőtumort idéznek elő, míg a őő-kikapcsolt sejtek nem. A kísérletből arra lehet következtetni, hogy a tumorsejt szükséges a maximális áttétel megvalósulásához a rendszerben.

Minden itt idézett utalás (ideértve a könyveket, a cikkeket, a dolgozatokat, a szabadalmakat és a szabadalmi bejelentéseket! kifejezetten mint egész hivatkozás képzi részét a jelen leírásnak, minden célnak megfelelően.

Bár a jelen találmány leírása annak egy specifikus megvalósítási formájával összefüggésben történt meg, magától értetődően az alkalmas további módosításra ás a jelen bejelentés célja szerint magában foglalja a találmány bármely változatát, alkalmazását vagy átdolgozását, amelyek általában a találmány alapelveit követik és minden a jelen leírásból származó következtetést# mint as ismert# vagy szokásosan alkalmazott# a találmánnyal kapcsolatos technika állásába tartozókat# mint a fentiekben, közzétett lényegi jellemzőkre vonatkozókat és mint a találmány# valamint a mellékelt igénypontok által megbatározott tárgykörbe tartozókat.

Claims (6)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Az tttjlő loiegtmhez spedfikasan kötődő és egy ligandmnoak sz avf.16 inlegrinhez való kötődését blokkoló antitest alkalmazása veseftbrózis kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására,
2. 2, Az L igóeypom szerinti alkalntazb, ahol az antitest egy monoklonálís antitest
3. 3. Az 1. vagy 2, igénypont. szerinti alkalmazás, ahol az antitestet wtalmazó készítmény téripia keretében adható be.
4. 4, Az, 1. vagy 2. igényjxmt szerinti alkalmazás, atol az antitestet tartalmazó készítmény megelőzés keretében adható be.
5. 5> Az ATCC HB 1230 hibridóma által termeit mormklonális antitest.
6. 6, Az ATCC CB 1230 hihrídóma.