CN120960406A - 靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞在预防和/或治疗纤维化疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了靶向整合素αVβ6的CAR‑免疫细胞在预防和/或治疗纤维化疾病中的应用，具体地，本发明提供了一种靶向整合素αVβ6的CAR‑免疫细胞的用途，用于制备一药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤，本发明首次发现，靶向整合素αVβ6的CAR‑免疫细胞可以有效(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤。

Description

靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞在预防和/或治疗纤维化疾 病中的应用

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗或生物医药领域，具体涉及靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞在预防和/或治疗纤维化疾病中的应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T)是指经基因修饰后的，在人体内能够特异性识别特定抗原，并杀伤特定抗原所在的靶细胞的一种T细胞。嵌合抗原受体(CAR)可通过病毒感染等技术修饰T淋巴细胞，使其表达嵌合抗原受体，而这种经过CAR改造的T细胞能够以MHC非限制性的方式特异性识别并结合目的抗原，并特异性杀伤目的细胞。细胞免疫治疗在临床上的成功应用使其在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景，此外，细胞治疗技术已被用于自身免疫性疾病、神经系统疾病等多种疾病。

纤维化是一种慢性组织损伤，可发生于多种器官，主要表现为细胞外基质(Extracellular,ECM)过量堆积从而产生瘢痕组织，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。目前治疗纤维化药物较少，且副作用较大、安全性欠佳，常规用药无法逆转疾病进展，因此迫切需要开发一种安全有效的治疗手段。

TGF-β/Smad信号通路是介导器官纤维化最经典的信号通路，在促进纤维性疾病中起主导作用。其中TGF-β1是关键促纤维化因子，主要以复合物的形式分泌和储存于细胞外基质，有研究发现整合素αVβ6通过结合复合物来激活TGF-β1调节肺部炎症和纤维化，且整合素αVβ6在健康成人上皮中不表达或表达很低，但在创伤愈合、纤维化、炎症和肿瘤等生理或病理过程中的表达水平会上调，提示整合素αVβ6可能是治疗纤维化的潜在靶点。

因此，可以开发一种通过靶向整合素αVβ6的细胞治疗技术来治疗纤维化疾病。

发明内容

本发明的目的是将细胞治疗技术应用于纤维化疾病的治疗。

在本发明的第一方面，提供了一种靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞的用途，用于制备一药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤。

在另一优选例中，所述纤维化疾病选自下组：肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、胰腺纤维化、脾纤维化、视网膜纤维化、骨髓纤维化、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤包括实体肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、黑色素瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述的CAR-免疫细胞选自下组：CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞。

在另一优选例中，所述的CAR-免疫细胞是CAR-T细胞。

在另一优选例中，所述靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞中表达靶向整合素αVβ6的嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体中的抗原结合结构域包括氨基酸序列如SEQID NO:1或14所示的多肽，或与SEQ ID NO:1或14所示序列具有80％以上，较佳地，90％以上，较佳地，95％以上，更佳地，98％以上(如99％或100％)同一性并且可结合整合素αVβ6的多肽。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有如式I所示的结构，

L-Z1-Z2-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

Z1为抗原结合结构域，所述抗原结合域包括RGD蛋白；和

Z2为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8α、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD20、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcERI、CD66d、DAP10、DAP12、或其组合。

在另一优选例中，所述的L为人源或鼠源的CD8α的信号肽。

在另一优选例中，L的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或13所示。

在另一优选例中，所述RGD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或14所示，或与SEQID NO:1或14所示序列具有80％以上，较佳地，90％以上，较佳地，95％以上，更佳地，98％以上(如99％或100％)同一性并且可结合整合素αVβ6。

在另一优选例中，所述Z2为选自下组的蛋白的铰链区：CD28、CD8a、CD8、CD8α、CD137、Ig(免疫球蛋白)铰链、或其组合。

在另一优选例中，所述Z2包括野生型的铰链区和突变型的铰链区。

在另一优选例中，所述的突变型包括在上述蛋白铰链区中缺失、添加或替换一个或几个氨基酸后的融合铰链区、或其组合。

在另一优选例中，所述Z2为人源CD28或鼠源CD8a铰链区。

在另一优选例中，所述Z2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或8所示。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD8a、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD8α、ICOS、CD19、CD45、或其组合。

在另一优选例中，所述TM跨膜结构域包括野生型的蛋白跨膜结构域和突变型的蛋白跨膜结构域。

在另一优选例中，所述的突变型包括在上述蛋白跨膜结构域中缺失、添加或替换一个或几个氨基酸后的融合蛋白跨膜结构域、或其组合。

在另一优选例中，所述的TM为人源CD28蛋白或鼠源CD8a的跨膜区。

在另一优选例中，TM的序列如SEQ ID NO:4或9所示。

在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD28、CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4－1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、OX40、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、CDS、ICAM-L LFA-1(CD11a/CD18)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTBA、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、DAP10、DAP12、CD83的配体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子、或其组合。

在另一优选例中，所述的C为人源CD28或鼠源CD28的共刺激信号分子

在另一优选例中，所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或10所示。

在另一优选例中，所述CD3ζ为CD3ζ蛋白分子的胞内区域。

在另一优选例中，所述CD3ζ包括野生型的CD3ζ蛋白分子的胞内区域和突变型的CD3ζ蛋白分子的胞内区域。

在另一优选例中，所述的突变型的氨基酸序列包括在上述CD3ζ蛋白分子的胞内区域的氨基酸序列中缺失、添加或替换一个或几个氨基酸后的融合氨基酸序列或其组合。

在另一优选例中，所述CD3ζ为人源或鼠源CD3ζ蛋白分子的胞内区域。

在另一优选例中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或11所示。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或12所示。

本发明第二方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

(a)靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞；

(b)其他用于(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤的药物；和

(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述其他用于预防和/或治疗纤维化疾病的药物选自下组：吡非尼酮、尼达尼布、或其组合。

在另一优选例中，所述其他用于预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤的药物包括：阿比妥珠单抗(abituzumab)。

在另一优选例中，所述药物组合物是液态的药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物是注射剂。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞的浓度为1×10⁵-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁶-1×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞的剂量为1×10⁵-5×10⁷个细胞/kg，较佳地为1×10⁶-1.5×10⁷个细胞/kg。

本发明第三方面提供了一种预防和/或治疗纤维化疾病的方法，包括步骤：向有所需要的对象施用靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞。

在另一优选例中，所述的施用方式为静脉注射。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：hRGD-CAR质粒图。

图2：hRGD-CAR Jurkat细胞系与β6表达的靶细胞共培养后的激活检测。

图3：hRGD-CAR逆转录病毒离心感染小鼠T细胞48h后的CAR表达效率。

图4：hRGD-CAR T与β6表达的靶细胞共培养后的特异性杀伤效果。

图5：mRGD-CAR质粒图。

图6：mRGD-CAR逆转录病毒离心感染小鼠T细胞48小时后的CAR表达效率。

图7：mRGD-CAR T与β6表达的靶细胞共培养后的特异性杀伤效果。

图8：博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠肺组织Masson染色图。

图9：肺纤维化模型小鼠肺组织胶原容积分数统计结果。

图10：TAA诱导的肝纤维化模型小鼠肝组织天狼星红染色图。

图11：肝纤维化模型小鼠肝组织天狼星红阳性区域统计结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种利用CAR-T细胞技术有效(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤的方法。并且本发明首次发现，靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞可以有效(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。

如本文所用，术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

如本文所用，术语“给予”、“施用”可互换使用，是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

整合素αVβ6

整合素αVβ6是唯一由β6亚基参与形成的异源二聚体整合素，其在健康的成人上皮中不表达或表达很弱，但在创伤愈合、纤维化、炎症和肿瘤等生理或病理过程中的表达水平会上调，使整合素αVβ6在各种疾病的诊断和治疗中成为一个重要靶点。TGF-β1是肺纤维化的关键促纤维化因子，主要以复合物的形式分泌和储存于细胞外基质，研究发现整合素αVβ6通过结合复合物来激活TGF-β1调节肺部炎症和纤维化。对肺纤维化患者的肺组织进行单细胞测序，发现整合素αVβ6主要由一类异常的基底细胞表达，这类异常的基底细胞在正常人的肺部未检测到，暗示着这类异常的基底细胞可能是肺纤维化发病的主要驱动因素。

因此，本发明通过使用CAR T细胞靶向杀伤表达整合素αVβ6的异常的基底细胞来治疗纤维化疾病，比如肺纤维化。

纤维化疾病

纤维化是一种慢性组织损伤，可发生于多种器官，主要表现为细胞外基质(ECM)过量堆积从而产生瘢痕组织，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。TGF-β/Smad信号通路是介导器官纤维化最经典的信号通路，在促进纤维性疾病中起主导作用，其中TGF-β1是关键促纤维化因子。

肺纤维化是一种病因不明的、慢性的、不可逆转的间质性肺部疾病，几种含αV的整合素(αVβ1、αVβ5、αVβ6)在肺纤维化中均上调。

肝纤维化与慢性肝病的终末期有关，研究发现在终末期肝病中，肝炎患者胆管上皮和过渡性肝细胞αVβ6蛋白水平升高，αVβ6mRNA水平随疾病进展而升高。与肺纤维化一样，αVβ6与肝纤维化的发生有关，动物模型中的遗传缺失或针对αVβ6的小分子药物和单克隆抗体的药物治疗也佐证了这一点。

肾纤维化是各种肾脏疾病终末期的结果，几种慢性肾脏疾病如肾小球肾炎、糖尿病、IgA肾病和Alport综合征与上皮细胞纤维化改变和αVβ6表达升高有关。尽管一些证据支持αvβ1在肾纤维化中的作用，但大多数靶标验证研究实验结果表明与αvβ6的相关性更高。

在一优选实施方式中，纤维化疾病包括：肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、胰腺纤维化、脾纤维化、视网膜纤维化、骨髓纤维化。

αVβ6上调的肿瘤

整合素αVβ6在多种实体肿瘤中如胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中的表达均有上调。临床试验研究了泛αV抗体阿比妥珠单抗对高表达αVβ6的结直肠癌患者的疗效有所改善，提示选择靶器官αVβ6高表达的患者可更大限度提高临床疗效。基于αVβ6在多种肿瘤细胞中上调，本发明认为，靶向αVβ6的CAR-T细胞可能在治疗αVβ6上调的肿瘤及以αVβ6作为疾病潜在关键驱动因素的其他适应症上均有较高的实用价值。

在一优选实施方式中，所述肿瘤包括实体肿瘤。

在一优选实施方式中，所述肿瘤选自下组：胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、黑色素瘤或其组合。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric Antigen Receptors，CARs)由胞外抗原识别结构域，通常是scFv(single-chain variable Fragment)、跨膜区以及胞内共刺激信号结构域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个或多个特异性的抗原决定簇(epitopes)，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体或异体(健康供者)的PBMC，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入病人体内，以非MHC限制的方式通过直接识别肿瘤细胞表面抗原对其进行特异性杀伤。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。

如本文所用，术语“接头”、“铰链区”可互换使用，通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在免疫细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合肿瘤细胞上关联抗原时，导致肿瘤细胞死亡，患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28共刺激信号分子、4-1BB共刺激信号分子和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，本发明嵌合抗原受体的基础结构包括：RGD抗原结合结构域、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。

如本文所用，术语“CAR-免疫细胞”是指表达本发明的嵌合抗原受体的免疫细胞。特别值得说明的是，本发明的CAR-免疫细胞可以是在生物体内行使效应功能的不同的免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞等。CAR-T细胞是目前研究最为彻底和广泛的免疫疗法，多款产品已经被批准用于肿瘤治疗。相较于CAR-T细胞，CAR-NK细胞具有较低的细胞因子释放，并且还可以通过NK细胞受体本身来消除肿瘤细胞。CAR-巨噬细胞可通过表达促炎细胞因子和趋化因子，将附近M2巨噬细胞转化为M1，上调抗原呈递机制并激活自身免疫系统，具有更高的安全性。

在本发明的一个优选例中，选择RGD蛋白作为本发明CAR中靶向整合素αVβ6的抗原结合结构域。

在一个优选的实施方式中，所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或14所示，可以高效的与整合素αVβ6结合。

鼠源抗原结合结构域RGD蛋白(NAVPNLRGDLQVLAQKVART)(SEQ ID NO:1)

人源抗原结合结构域RGD蛋白(NAVPNLRGDLQVLAQKVART)(SEQ ID NO:14)

在本发明中，靶向整合素αVβ6的抗原结合结构域还包括所述序列的保守性变异体，指与本发明抗原结合结构域的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

优选地，本发明的CAR构建物具有以下结构：信号肽-靶向整合素αVβ6的抗原结合结构域-CD28或CD8a铰链区-CD28或CD8a TM-CD28胞内域(共刺激信号分子)-CD3ζ胞浆信号传导序列。

在一个实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或13所示，人源CD8α(MALPVTALLLPLALLLHAARP)(SEQ ID NO:2)

鼠源CD8α(MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEA)(SEQ ID NO:13)

在一个实施方式中，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或8所示。

人源CD28铰链区：

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:3)；

鼠源CD8a铰链区：

STTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY(SEQ ID NO:8)；

在一个实施方式中，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或9所示。

人源CD28蛋白跨膜区：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:4)

鼠源CD8a蛋白跨膜区：

IWAPLAGICVALLLSLIITLI(SEQ ID NO:9)；

在一个实施方式中，所述CD28共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或10所示。

人源CD28共刺激信号分子：

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:5)

鼠源CD28共刺激信号分子：

NSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP(SEQ ID NO:10)

在在一个实施方式中，所述源于CD3ζ的胞浆信号传导序列的氨基酸序列如SEQ IDNO:6或11所示。

人源CD3ζ：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK

NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL HMQALPPR(SEQ IDNO:6)

鼠源CD3ζ：

RAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRR

RNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA LHMQTLAPR(SEQ IDNO:11)

在一个优选的实施方式中，本发明CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或12所示。

鼠源：

MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEAYPYDVPDYANAVPNLRGDLQVLAQKVA

RTRAAASTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWA

PLAGICVALLLSLIITLICYNSRRNRLLQSDYMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARD

FAAYRPRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMG

GKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRGSG(SEQ ID NO:7)

人源：

MALPVTALLLPLALLLHAYPYDVPDYANAVPNLRGDLQVLAQKVARTRAAAIE

VMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLL

VTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRV

KFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP

QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:12)

药物组合物

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞、其他用于(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤的药物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述药物组合物为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-免疫细胞的剂量为1×10⁵-5×10⁷个细胞/kg，较佳地为1×10⁶-1.5×10⁷个细胞/kg。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明提供了本发明的靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞和本发明的药物组合物的用途，用于(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤。

在一优选实施方式中，纤维化疾病包括：肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、胰腺纤维化、脾纤维化、视网膜纤维化、骨髓纤维化。

在一优选实施方式中，所述肿瘤包括实体肿瘤。

在一优选实施方式中，所述肿瘤选自下组：胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、黑色素瘤、或其组合。

本发明的通用型CAR-免疫细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫细胞制备，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体细胞处理程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体对上述细胞进行基因修饰(即体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用于哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，CAR-修饰的细胞相对于接受者可为自体，也可为同种异基因的、同基因的(syngeneic)。

除了就离体免疫细胞而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了用于体内以增强针对患者中靶向抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗纤维化疾病的方法，其包括施用给需要的对象以有效量的本发明的CAR-免疫细胞。

本发明的CAR-免疫细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞，与一种或多种药学或临床上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症的特征、疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“治疗纤维化疾病有效量”、或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、衰老组织大小、衰老程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁷个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象，治疗方案由医学领域技术人员确定。

对象组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内、胸膜内施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.静脉内注射施用。T细胞的组合物可被直接注入纤维化组织或肿瘤组织。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩增至治疗性水平的方法活化和扩增细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：吡非尼酮、尼达尼布(预防和/治疗纤维化疾病的药物)或阿比妥珠单抗。

在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩增的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩增的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明的CAR-免疫细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞可以有效(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤。

(2)本发明首次发现，使用CAR T细胞靶向表达整合素αVβ6的异常的基底细胞可以用来治疗肺纤维化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

实施例1：hCD8α信号肽hRGD(多肽分子)hCD28铰链区hCD28跨膜区

hCD28胞内域(共刺激分子)hCD3ζ基因序列的确认及慢病毒载体构建。

从NCBI数据库检索到人CD8α信号肽基因序列，人CD28铰链区基因序列，人CD28跨膜区基因序列，人CD28胞内域基因序列以及人CD3ζ胞内区的基因序列。

委托擎科生物科技有限公司按人CD8α信号肽基因编码区序列，人RGD基因编码区序列，人CD28铰链区基因编码区序列，人CD28跨膜区基因编码区序列，人CD28胞内域基因编码区序列以及人CD3ζ胞内区的基因编码区序列顺序合成完整的hRGDCAR基因序列，并通过PCR法和诺唯赞生物科技股份有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒将hRGD-CAR连接到PHAGE慢病毒质粒上。将连接产物转化到感受态(DH5α)中，涂板过夜，挑单克隆，并送擎科生物科技有限公司进行测序，并比对测序结果，确认质粒是否构建成功。

使用康为世纪公司的质粒大提试剂盒提出纯化的hRGD-CAR慢病毒质粒(质粒图例如图1所示)。

实施例2：hRGD-CAR慢病毒包装与浓缩

将实施例1得到的hRGD-CAR质粒采用PEI法转染293T来包装病毒(慢病毒包装系统包括慢病毒表达载体pHIV和慢病毒包装载体psPAX2、pMD2.G，购自淼灵)，并通过超速离心来浓缩病毒，具体步骤如下：

第1天：将293T细胞(购自ATCC)以30％的细胞密度铺板于含有30mL DMEM完全培养基(购自gibco)的15cm皿中，充分混匀细胞，于37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。

第2天：观察293T细胞密度达到70％90％，弃去培养基，加入27ml新鲜含10％血清的DMEM培养基，准备进行转染；准备质粒混合物，各种质粒的量为：于洁净15ml离心管中加入DMEM培养基1500uL，并加入实施例1得到的hRGD-CAR慢病毒质粒22.5ug，psPAX2(慢病毒包装质粒，购自淼灵)16.875ug和pMD2.G(慢病毒包装质粒，购自淼灵)5.625ug，充分混匀；另取洁净15ml离心管，加入DMEM培养基1500uL，并加入上海翊圣生物科技有限公司的PEI40000转染试剂112.5uL，充分混匀；将PEI混合物滴入到质粒混合物中，充分混匀，静置20分钟。将3ml混合物沿培养皿壁加入到293T细胞皿中，37℃培养8h，吸弃培养基，轻柔沿培养皿壁重新加入37℃预热的新鲜的含10％血清的DMEM完全培养基。

第4天：转染48h后收集病毒上清并用0.45um滤器过滤。过滤后的上清转移到超速离心管并配平，于4℃条件下在超速离心机中离心90分钟，转速35000rpm。离心结束，吸弃上清，每30ml病毒原液所得沉淀用300uL DMEM培养基重悬，所得浓缩好的hRGD-CAR慢病毒液24h内用于感染或者于80℃保存。

实施例3：hRGD-CAR Jurkat与hβ6靶细胞共培养后CD69表达检测

将实施例2浓缩的hRGD-CAR病毒感染Jurkat细胞系(购自ATCC)得到hRGD-CARJurkat稳转细胞系。实验组每孔含hRGD-CAR Jurkat细胞1*10^5个，含hβ6靶细胞(293T细胞系)1*10^5个；阴性对照组每孔含hRGD-CAR Jurkat细胞1*10^5个，含不带hβ6的靶细胞(293T细胞系)1*10^5个；空白组每孔仅含hRGD-CAR Jurkat细胞1*10^5个。总体系为200ul含10％血清的1640完全培养基(购自gibco)，两种细胞充分混匀之后加入96孔板中共培养。

培养箱中分别孵育24小时后收集细胞，每管细胞用1ml PBS清洗1次，400g离心5分钟，去上清。加入100ul PBS和0.5ul Biolegend公司的人CD69流式抗体(PE荧光)，4℃，避光染色30分钟。每管细胞用1ml PBS清洗1次，400g离心5分钟，去上清。加入200ul PBS重悬，利用流式细胞仪检测hRGD-CAR Jurkat细胞表面CD69的表达。

结果如图2所示，图2显示了共培养后hRGD-CAR Jurkat被hβ6靶细胞显著激活。

实施例4：鼠T细胞的纯化与培养

将Biolegend品牌的anti mouse CD3因子和anti mouse CD28因子用PBS稀释到2ug/ml，并加入到24孔板中，每孔加入500ul，于37摄氏度孵育箱孵育2小时，待用。通过颈椎离断方式处死C57BL/6品系小鼠(购自上海斯莱克)，在超净台中取出脾脏并研磨，用红细胞裂解液裂红，用滤网过滤得到脾脏单细胞悬液。利用Biolegend品牌的小鼠CD3 T淋巴细胞阴选试剂盒分离纯化T淋巴细胞。用1640完全培养基调整细胞密度至1*10^6/ml。取出在37摄氏度孵育箱孵育的24孔板，吸去液体，每孔加入1*10^6的T淋巴细胞，于37摄氏度孵育箱孵育48小时。

实施例5：hRGD-CAR逆转录病毒感染鼠T细胞与流式检测病毒感染效率

利用实施例2得到的hRGD-CAR浓缩病毒并采用离心感染法感染鼠T细胞来制备CART细胞，并通过流式细胞术检测hRGD-CAR的表达情况，具体步骤如下：

T细胞活化培养两天后，进行细胞计数并调整T细胞密度至1*10^6/孔，每孔加入500ul新鲜的1640完全培养基，接种到新的24孔板中。

配制病毒液：每孔加入实施例2的病毒浓缩液100ul，6ug/mL Polybrene，400ul1640完全培养基。

离心感染T细胞：将24孔板置于离心机中，32℃，1500g，离心2h。

离心完毕后，感染好的T细胞于1600rpm条件下离心5分钟，吸弃上清，每孔用1ml新鲜1640完全培养基种于新的24孔板。于37℃，5％CO2的培养箱中培养。

培养72h后，分别收集5*10^5hRGD-CAR T细胞和T细胞(对照组)于流式管，PBS洗涤1次后弃上清，加入Biolegend公司的HA流式抗体避光染色30分钟，随后PBS洗涤，200ul PBS重悬，流式细胞仪检测。结果如图3所示，实施例1得到的hRGD-CAR逆转录感染T细胞72h后，hRGD-CAR的表达效率为27％。

实施例6：hRGD-CAR T与hβ6表达的靶细胞共培养后的杀伤检测(荧光素酶检测法)。

通过慢病毒感染法构建带有荧光素酶的hβ6-293T靶细胞(293T细胞)，并通过荧光素酶发光强度检测hRGD-CAR T细胞杀伤能力，具体步骤如下：

准备WHB的全白色96孔板，用100ul 1640完全培养基重悬hβ6293T

Luciferase靶细胞、293T Luciferase细胞，调整细胞密度为1*10^4/孔。

用50ul 1640完全细胞培养基重悬实施例5制备好的hRGD-CAR T细胞，调整细胞密度为2*10^6/mL，梯度稀释并以5*10^4/孔、2.5*10^4/孔、1.25*10^4/孔的细胞密度种板，每孔100ul。

实验组96孔板中每孔加入100uL hβ6293TLuciferase靶细胞，100uL不同细胞密度hRGD-CAR T细胞；阴性对照组96孔板中每孔加入100uL hβ6293TLuciferase细胞，100uL不同细胞密度未感染的T细胞；空白对照组和阳性对照组96孔板中每孔加入100uL hβ6 293TLuciferase和100uL 1640完全培养基，充分混匀后，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时。

24小时后，取出96孔板。倒弃孔板里的培养基，每孔加入1uL辅酶A和1uL D荧光素以及100ul PBS，避光10分钟，利用M5酶标仪检测其化学发光强度。

结果如图4所示，hRGD-CAR T细胞与hβ6 293TLuciferase靶细胞共培养后，随着效靶比的增加，其杀伤能力也增强，并呈现剂量依赖性。细胞裂解率(Lysis)定义为(1(RLUsample)/(RLUmax))*100。RLUsample是指酶标仪检测到的样本的相对光强度，RLUmax是指酶标仪检测到的未加入杀伤细胞的靶细胞对照组的相对光强度。

实施例7：mCD8α信号肽mRGD(多肽分子)mCD8a铰链区mCD8a跨膜区

mCD28胞内域(共刺激分子) mCD3ζ基因序列的确认及慢病毒载体构建。

从NCBI数据库检索到小鼠源CD8α信号肽基因序列，小鼠源RGD基因序列，小鼠源CD8a铰链区基因序列，小鼠源CD8a跨膜区基因序列，小鼠源CD28胞内域基因序列以及小鼠源CD3ζ胞内区的基因序列。

委托擎科生物科技有限公司按小鼠源CD8α信号肽基因编码区序列，小鼠源RGD基因编码区序列，小鼠源CD28铰链区基因编码区序列，小鼠源CD28跨膜区基因编码区序列，小鼠源CD28胞内域基因编码区序列以及小鼠源CD3ζ胞内区的基因编码区序列顺序合成完整的mRGD-CAR基因序列，并通过PCR法和诺唯赞生物科技股份有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒将mRGD-CAR连接到PMX逆转录病毒质粒上。将连接产物转化到感受态(DH5α)中，涂板过夜，挑单克隆，并送擎科生物科技有限公司进行测序，并比对测序结果，确认质粒是否构建成功。

使用康为世纪公司的质粒大提试剂盒提出纯化的mRGD-CAR慢病毒质粒(质粒图例如图5所示)。

实施例8：mRGD-CAR逆转录病毒包装与浓缩

将实施例7得到的mRGD-CAR质粒采用PEI法转染PlatE细胞系(购自ATCC)来包装病毒，并通过超速离心来浓缩病毒，具体步骤如下：

第1天：将Plat E细胞以30％的细胞密度铺板于含有30mL DMEM完全培养基的15cm皿中，充分混匀细胞，于37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。

第2天：观察PlatE细胞密度达到70％90％，弃去培养基，加入27ml新鲜含10％血清的DMEM培养基，准备进行转染；准备质粒混合物，各种质粒的量为：于洁净15ml离心管中加入DMEM培养基1500uL，并加入实施例7得到的mRGD-CAR慢病毒质粒45ug，充分混匀；另取洁净15ml离心管，加入DMEM培养基1500uL，并加入转染试剂PEI 112.5uL，充分混匀；将PEI混合物滴入到质粒混合物中，充分混匀，静置20分钟。将3ml混合物沿培养皿壁加入到PlatE细胞皿中，37℃培养8h，吸弃培养基，轻柔沿培养皿壁重新加入预热的新鲜的含10％血清的DMEM完全培养基。

第4天：转染48h后收集病毒上清并用0.45um滤器过滤。过滤后的上清转移到超速离心管并配平，于4℃条件下在超速离心机中离心90分钟，转速35000rpm。离心结束，吸弃上清，每30ml病毒原液所得沉淀用300uL DMEM培养基重悬，所得浓缩好的mRGD-CAR逆转录病毒液24h内用于感染或者于80℃保存。

实施例9：mRGD-CAR逆转录病毒感染鼠T细胞与流式检测病毒感染效率

利用实施例8得到的mRGD-CAR浓缩病毒并采用离心感染法感染鼠T细胞来制备CART细胞，并通过流式细胞术检测mRGD-CAR的表达情况，具体步骤如下：

T细胞活化培养两天后，进行细胞计数并调整T细胞密度至1*10^6/孔，每孔加入500ul新鲜的1640完全培养基，接种到新的24孔板中。

配制病毒液：每孔加入实施例8的病毒浓缩液100ul，6ug/mL Polybrene，400ul1640完全培养基。

离心感染T细胞：将24孔板置于离心机中，32℃，1500g，离心2h。

离心完毕后，感染好的T细胞于1600rpm条件下离心5分钟，吸弃上清，每孔用1ml新鲜1640完全培养基种于新的24孔板。于37℃，5％CO2的培养箱中培养。

培养48h后，分别收集5*10^5mRGD-CAR T细胞和T细胞(对照组)于流式管，PBS洗涤1次后弃上清，加入200ulPBS重悬，流式细胞仪检测GFP。结果如图6所示，实施例8得到的mRGD-CAR逆转录感染T细胞48h后，mRGD-CAR的表达效率为54％。

实施例10：mRGD-CAR T与mβ6表达的靶细胞共培养后的杀伤检测(荧光素酶检测法)。

通过慢病毒感染法构建带有荧光素酶的mβ6-293T靶细胞(293T细胞)，并通过荧光素酶发光强度检测mRGD-CAR T细胞杀伤能力，具体步骤如下：

准备WHB的全白色96孔板，用100ul 1640完全培养基重悬mβ6293T

Luciferase靶细胞、293TLuciferase细胞，调整细胞密度为1*10^4/孔。

用50ul 1640完全细胞培养基重悬实施例5制备好的mRGD-CAR T细胞，调整细胞密度为2*10^6/mL，梯度稀释并以5*10^4/孔、2.5*10^4/孔、1.25*10^4/孔的细胞密度种板，每孔100ul。

实验组96孔板中每孔加入100uL mβ6293TLuciferase靶细胞，100uL不同细胞密度mRGD-CAR T细胞；阴性对照组96孔板中每孔加入100uL mβ6 293TLuciferase细胞，100uL不同细胞密度未感染的T细胞；空白对照组和阳性对照组96孔板中每孔加入100uL mβ6293TLuciferase和100uL 1640完全培养基，充分混匀后，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时。

24小时后，取出96孔板。倒弃孔板里的培养基，每孔加入1uL辅酶A和1uL D荧光素以及100ul PBS，避光10分钟，利用M5酶标仪检测其化学发光强度。

结果如图7所示，mRGD-CAR T细胞与mβ6 293TLuciferase靶细胞共培养后，随着效靶比的增加，其杀伤能力也增强，并呈现剂量依赖性。细胞裂解率(Lysis)定义为(1(RLUsample)/(RLUmax))*100。RLUsample是指酶标仪检测到的样本的相对光强度，RLUmax是指酶标仪检测到的未加入杀伤细胞的靶细胞对照组的相对光强度。

实施例11：mRGD-CAR T治疗小鼠肺纤维化模型

取8-10周SPF级别的雄性C57BL/6小鼠(购自上海斯莱克)，饲养在浙江大学动物中心。

第1天造模：小鼠麻醉后气道滴注博来霉素(selleck，2.5mg/kg)。

第7天回输mRGD-CAR T：每只小鼠尾静脉注射3×10^6mRGD-CAR T细胞，注射体积为200ul的生理盐水，对照组注射同样体积的生理盐水。

第14天处理小鼠：每只小鼠腹腔注射1.5％戊巴比妥钠200ul，待小鼠麻醉后，剪开小鼠胸腔，心脏取血；暴露气道与两侧肺叶，用细线在右侧肺近肺门处结扎右肺，在气道远端剪开一个小口子，准备好注射器(20ml手动磨钝的注射器针头和1ml注射器的针筒)，抽取400ul 4％甲醛溶液灌入左肺中，并结扎气道防止甲醛漏出，提起结扎气道的线，往下剪出左侧整叶肺，连同心脏一起放入装有13ml 4％甲醛的15ml离心管中，送病理进行Masson和HE染色。

结果如图8所示，结果表明与回输T细胞的对照组相比，在博来霉素造模后第7天回输mRGD-CAR T细胞，能有效改善小鼠肺部的纤维化程度。小鼠肺组织胶原容积分数统计结果如图9所示，与对照组相比，回输mRGD-CAR T细胞的造模组小鼠的肺组织胶原容积分数降低大于50％，表明mRGD-CAR T对肺纤维化的治疗效果。

实施例12：mRGD-CAR T治疗小鼠肝纤维化模型

取8-10周SPF级别的雄性C57BL/6小鼠(购自上海斯莱克)，饲养在浙江大学动物中心。

小鼠肝纤维化模型的建立：第1周腹腔注射TAA溶液(100mg/kg)，一周3次；第2周增加至150mg/kg，一周3次；第3～8周增加至200mg/kg，一周3次，连续5周。第5周，除正常组和TAA组外，其余小鼠尾静脉回输3×10^6mRGD-CAR T细胞。

小鼠处理：第8周后，对小鼠进行安乐死，收集血液和肝组织，取肝脏样本保存在-80℃中用于后续组织病理学(苏木精-伊红染色、天狼猩红染色)检查。

结果如图10所示，结果表明在TAA诱导的肝纤维化模型中，回输mRGD-CAR T细胞能在一定程度上改善小鼠肝组织的纤维化程度。小鼠肝组织天狼星红阳性区域统计结果如图11所示，与对照组(天狼星红阳性区域约6％)相比，回输mRGD-CAR T细胞的造模组小鼠的肝组织天狼星红阳性区域面积降低了约50％，说明mRGD-CAR T在一定程度上能治疗肝纤维化。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备一药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述纤维化疾病选自下组：肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、胰腺纤维化、脾纤维化、视网膜纤维化、骨髓纤维化、或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括实体肿瘤。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、甲状腺癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、黑色素瘤、或其组合。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CAR-免疫细胞选自下组：CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞中表达靶向整合素αVβ6的嵌合抗原受体。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述嵌合抗原受体中的抗原结合结构域包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1或14所示的多肽，或与SEQ ID NO:1或14所示序列具有80％以上，较佳地，90％以上，较佳地，95％以上，更佳地，98％以上同一性并且可结合整合素αVβ6的多肽。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有如式I所示的结构，

L-Z1-Z2-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

Z1为抗原结合结构域，所述抗原结合域包括RGD蛋白；和

Z2为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述RGD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或14所示，或与SEQ ID NO:1或14所示序列具有80％以上，较佳地，90％以上，较佳地，95％以上，更佳地，98％以上同一性并且可结合整合素αVβ6。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：

(a)靶向整合素αVβ6的CAR-免疫细胞；

(b)其他用于(i)预防和/或治疗纤维化疾病；和/或(ii)预防和/或治疗αVβ6上调的肿瘤的药物；和

(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。