HU228698B1 - Treatment of transgenic corn seeds with clothianidin - Google Patents

Description

A Jeten találmány nem-ideiglenes a 60/238.405 számú, 2000. október 6-án bejelentett US szabadalmi bejelentéshez képest, és elsőbbséget élvez.

Az alábbiakban megadjak a találmány hátterét.

A jelen találmány általánosságban olyan kártevők elleni védekezéssel kapcsolatos, melyek táplálkozási tevékenységük révén a kukoricát károsítják, részletesebben, olyan kukorica kártevők elleni védekezéssel kapcsolatos, melynek során egy transzgeníkus eseménnyel rendelkező kukorica magot és az Ilyen mag clothianidin peszticiddel való kezelését kombináljuk a mag vetése előtt.

Az alábbiakban bemutatjuk a találmánnyal kapcsolatos tudományterületet.

A rovarok és a rokon Ízeltlábúak az Egyesült Államokban évente a mezőgazdasági termékek mintegy 15%-át elpusztítják, a fejlődő országokban az okozott kár ennél is nagyobb. Ezen kívül, a versengő gyomok és a parazita és szaproflta növények további potenciális termés veszteségért tehetők felelőssé.

Ezen veszteségek egy része a talajban következik be, amikor a növény patogének, rovarok és egyéb talajlakó kártevők vetés után megtámadják a magokat. A kukoricatermesztésben, a további károkat a kukorica levélbogár lárvák okozzák, azok a rovarkártevők, melyek a növények gyökereivel táplálkoznak, vagy melyek más módon károsítják a növényeket, valamint a bagolypille hernyói, az európai kukoricamolyok és egyéb kártevők, melyek a növény föld feletti részeivel táplálkoznak vagy egyéb módon károsítják azt. A kártevők mezőgazdasági növények elleni támadásának típusát és mechanizmusait általánosságban leírták például

Métcalf, in Destrucfive and Usefut Insects (1962), és Agrios, in Plánt Pathology 3rd, Ed., Academic Press (1986).

Amerikában a közép-nyugati államokban a kukorica a legfontosabb termesztett gabona. Ebben a régióban a kukorica legkomolyabb kártevői közé a három D/abroáca bogár faj lárva alakja tartozik. Ezek közé tartoznak a nyugati kukorica levélbogár lárvája, a D/abrof/ca v/rg/fers virg/fera LeConíe, az északi kukorica levélbogár lárvája a Díabrot/ca berberí Smith és a D/ahrotíca berberí Lawrence és a déli kukorica levélbogár lárvája, a D/ábrottca andec/mpuactata bowardí Berber. Valójában több ínszektícídet használnak a kukorica levélbogár lárvák elleni védelemre, mint a kukorica bármely egyéb kártevője ellen, és az összes kezeit terület nagyobb, mint az Egyesült Államok bármely más kártevője ellen kezeit terület.

A kukorica levélbogár lárvák (CRW) peteként telelnek át az olyan szántóföldön, ahol korábban kukoricát termesztettek. A peték május végétől júniusig kelnek. Ha a kukoricát nem kukorica követi a következő

évben a lárvák elpusztulnak. Ennek megfelelően, a kukorica levélbogár lárvák legközvetlenebbül azokon a területeken fejtik ki hatásukat, ahol a kukoricát szisztematikusan kukorica követi, mint tipikusan az Egyesült Államok közép-nyugati területén.

Kelés után a lárvák három lárvaálíapofon mennek keresztül, ez idő alatt a kukorica gyökérrendszerén táplálkoznak. Körülbelül három hét keli a lárvaáhapot befejezéséhez. A lárvák táplálkozása miatt a kukorica gyökér rendszert ért károsodás a kukorica levélbogár lárvái által okozott betakarítási veszteségek fő oka. A meggyengülés vagy a gyökér rendszer nagyobb részének sérülése miatt a szántóföldön eldőlő és elfekvő kukorica okozza e veszteség fő részét, mivel a megdőlt gabonát nem lehet hagyományos gépekkel betakarítani, így ezek a növények a szántófőidön maradnak.

A lárva fejlődés lezajlása után a lárvák mozdulatlan bábbá alakulnak, majd bogarakká fejlődnek, melyek a nyár folyamán kibújnak a talajból; a kibújás! periódus a termesztési terület elhelyezkedésétől függ. Kibújás után a kifejlett bogarak körülbelül két hétig táplálkoznak, majd a nőstények petéket kezdenek rakni. Kezdetben a kifejlett bogarak elsősorban ugyanazon a szántófőidön táplálkoznak, ahol kibújtak, később azonban más szántóföldekre is átvándorolnak. A kifejlett állatok csúcs tevékenysége az US kukorica övezetben július végén vágy augusztus elején tapasztalható azokon a táblákon, melyeken folyamatosan kukoricát termesztenek, azonban később is bekövetkezhet az első éves kukoricánál, vagy a későn érő fajták esetében. A kukorica levélbogarak a szántófölden a kibújásuk után körülbelül két héttel kezdik meg a peterakást, (további információhoz lásd például Corn Rootworms, Eleid Crops Pest Management Circular #16, Ohio Pest Management & Survey Program, The Ohio State University, Extension Division, Columbus, OH; elérhető online: www.ao.ohio-sfate.eduAobíoline/icm-facf/fc-1 e.html, Septemer 13, 2000, és McGahen et al., Corn Insect Control: Corn ι«·

Rootworm, PENpages number 08801502, Facísheet beszerezhető a Pennsylvania State Unlverslty-tői, State College, PA, 1989).

A jelenlegi, hagyományos mezőgazdasági gyakorlatban az olyan esetekben, ahol a kukoricát kukorica kövei;, normális, ha inszekticidet használunk a kukorica gyökér rendszer kukorica levélbogár lárvák súlyos táplálkozási kártétele elleni védelméhez. A hagyományos gyakorlat a kifejlett rovarok vagy a lárvák elleni védekezés. A kifejlett rovarok ellen használt hagyományos kezelési készítmények példái magukba foglalják a következők alkalmazását; karban! inszektíeidek (például SEVIN® SOS 1,0 - 2,0 líbra aktív anyag/angol hold mennyiségben); fenvalerate vagy eszfenvaierate (például PY'DRIIM® 2,4EC 0,1 ~ 0.2 líbra aktív anyag/angol hold mennyiségben, vagy A8ANA® 0,68EC 0.03 - 0,05 líbra aktív anyag/angol hold mennyiségben); malaíhíon /G (57°^z

E 0,9 líbra anyag/angol hold mennyiségben); permetbnn (például AMSUSH® 2,ÖEC 0,1 - 0,2 líbra aktív anyag/angol hold mennyiségben, vagy POUNCE® 3,2EC 0,1 - 0,2 líbra aktív anyag/angol hold mennyiségben); vagy PENNCAP-M® 0,25 - 0,5 libra aktív anyag/angol hold mennyiségben.

A CRW lárvák kezeléséhez a hagyományos gyakorlatban talaj inszekticidet használunk vetéskor vagy a vetés után, előnyösen a peték kikeléséhez a lehető legközelebbi időpontban. A hagyományos kezelések közé tartoznak a karbofurán Inszektíeidek (például FURADAN® 15G 8 oz/1000 láb sor mennyiségben); a klórpírífosz (például a LORSBAN® 15G 8 oz/1000 láb sor mennyiségben); a fonofosz (például DYFONATE® 20G 4,5 - 8,0 oz/1000 láb sor mennyiségben); a torát (például THIMET® 20G 8 oz/1000 láb sor mennyiségben); a terbufosz (például COUNTER® 15G 8 oz/1000 láb sor mennyiségben); vagy a tefluthhn (például FORCE® 3G 4 ···· 5 oz/1000 láb sor mennyiségben),

A fent felsorolt kémiai pesztieidek közül sokról ismert, hogy általában veszélyes az emberre és az állatokra. Az ezen pesztieidek által okozott környezeti ártalom súlyosbodik azáltal, hogy a gyakorlatban ezeket a peszficídeket levél permetezéssel vagy a talaj felszínére való közvetlen kijuttatással alkalmazzák. A széíhordás, a klmosódás és az elfolvás a peszticid nagy mennyiségének kikerülését eredményezheti a kívánt hatás zónából a felszíni vizekbe, és közvetlen kapcsolatba kerülhet a madarakkal, állatokkal és az emberekkel.

A kémiai peszticidek közegészségügyi és környezet egészségügyi hatása miatti aggodalom következtében jelentős erőfeszítéseket tesznek, hogy olyan módszereket találjanak, melyek csökkentik az alkalmazott kémiai peszticidek mennyiségét. Jelenleg ezen erőfeszítések többsége az olyan transzgeníkus növények kifejlesztésére fókuszál, melyeket azért manipuláltak, hogy mikrobíá.’ís eredetű rovar foxínokaf expresszáljanak. Például, az 5.877.012 (Estruch et al.,) számú US szabadalmi alkalmazásban a BaeJ/vs, Pseodomonas, C/av/öacfer és Rbízob/um míkróbákből származó proteinek klónozását és expressziöját írták le növényekbe, hogy olyan kártevők elleni rezisztenciával rendelkező transzgeníkus növényeket nyerjenek, mint a fekete bagolypille hernyója, az amerikai sereg hernyó, különböző molyok és egyéb kártevők. A WO/EP97/07089 (Privaile et al.,) publikáció az egyszikű növények, például a kukorica, egy peroxídázt kódoló rekombínáns DNS szekvenciával történő transzformációját ismerteti a növény kukoricamollyal, kukoricamoly hernyójával és a bagolypille hernyójával szembeni védelméhez. Jansens és munkatársai (Crop Sci, 37(5):1616 ™ 1824 (1997)) beszámolnak olyan transzgeníkus kukorica létrehozásáról, mely egy a Sao///us íhadng/ens/s~bőí (Bt) származó kristályos proteint kódoló gént tartalmaz, mely az európai kukoricamoly mindkét generációját féken tartja. Az 5.625.138 és az 5.859.336 számú US szabadalmi alkalmazásokban (Köziéi et al.,) beszámoltak arról, hogy a kukorica S. fóübng/ens/s-ből származó, delta-endotoxint kódoló génnel való transzformálása az európai kukoricamoly elleni jobb rezisztenciával rendelkező transzgeníkus kukoricát eredményezett. Egy a 8.

« *

A ♦· főur/ng/ens/s-ből származó inszekücid proteint expresszáló transzgenikus kukoricával végzett szántóföldi kísérleteket bemutató átfogó jelentést írtak Armstrong és munkatársai a Crop Science c. folyóiratban (35(2)550-557, 1995),

Ismeretes, hogy a vad típusú Bt Ó-endötoxinok kis aktivitással rendelkeznek a coieoptera rovarok ellen, és Kreíg és munkatársai 1933ban beszámoltak a coleopterákkal szemben toxikus 8. tfruring/ensis törzs első izoiátumáról. (lásd a 4.766.203 számú US szabadalmi alkalmazást). A 4.797.279 és a 4.910.016 számú US szabadalmi alkalmazások is leírnak vad típusú és hibrid S. föunng/ens/s törzseket, melyek némi coíepotrera elleni aktivitással rendelkező proteineket termelnek. Nemrégiben, azonban a sokkal pontosabb génsebészeti módszerek ígéretesnek bizonyultak az olyan módosított 8. thur/ng/ens/s proteinek kifejlesztésében, melyek szignifikánsan magasabb szintű kukorica ievélbogár lárvák elleni aktivitással rendelkeznek, mint a vad-típusú szülők által termeit proteinek, (lásd, például az Ecogen inc. és a Monsanto Company WO 99/31248 számú szabadalmát.)

Azonban, jelenleg nem ismert, hogy bármely transzgenikus esemény magában elegendően hatékony-e ahhoz, hogy védelmet biztosítson a kukoricának a kukorica ievélbogár lárvák ellen a sorozatos kukorica termesztésre szánt, erősen fertőzött szántóföldeken. Valójában, a bármely transzgenikus esemény által elért kukorica Ievélbogár lárvák által okozott károk elleni teljes védelem hosszútávon esetleg nem kívánatos, a célzott kártevő rezisztens törzsei kialakulásának lehetősége

A hagyományos pesztlcid alkalmazási formák másik alternatívája a növényi magok peszficiddel való kezelése. A fungieidek használatát a magok vetés utáni védelméhez, és a kis mennyiségű inszektieidek használatát például a kukorica mag drottérgek elleni védelméhez szintén alkalmazzák egy ideje, A magok pesziieidekke! való kezelése azzal az ♦ X ♦*· **

előnnyel jár, hogy védelmet biztosit a magok számára, miközben minimalizálja az addig szükséges pesztícid mennyiséget, és kevesebbszer kell kapcsolatba kerülni a peszticiddei, és csökken a különböző, eddig szükséges szántóföldi alkalmazások száma.

Az inszekticidek közvetlenül a magra való alkalmazása állal elért kártevők elleni védelem egyéb példáit például az 5.896.144 számú US szabadalmi alkalmazásban biztosítják, mely bemutatja, hogy a kukoricamoly kisebb táplálkozási kárt okoz az olyan magból kikelő kukoricán, melyei 1 -anl-pirazol vegyülettel kezeltek 500 gZ métermázsa mag dózisban, mint a kezeletlen magból kikelő növény esetében. Ezen kívül, az 5.876.739 számú US szabadalmi alkalmazásban (Turnblad el ai.,)(és az 5.849.320 számú „szülői” US szabadalmi alkalmazás) leírlak egy a talajból származó rovarok elleni védekezési módszert, mely magába foglalja a magok kezelését egy olyan burkoló anyaggal, mely egy vagy több polimer kötőanyagot és egy Inszekticídet tartalmaz. Ez a hivatkozás olyan Inszekticidek listáját biztosítja, melyek jelöltként szerepelhetnek az Ilyen burkolatban való alkalmazáshoz és megnevez számos szóba jöhető cél rovart is. Azonban, míg az 5.876,739 számú US szabadalmi alkalmazás megállapítja, hogy a kukorica mag egy adott inszekticídet tartalmazó burkoló anyaggal való kezelése védi a kukorica győkérzetét a kukorica levélbogár lárvák elleni károsodástól, nem említi vagy javasolja, hogy az ilyen kezelés transzgenikus eseménnyel rendelkező mag esetében Is használható.

Transzgenikus eseménnyel rendelkező mag niíro-imino- vagy nítroguanidínoo-vegyöíeíű peszticidekkeí való kezelését megemlítik (lásd például a WO 99/35913 szabadalmat), azonban nem találtunk útmutatást az ilyen kezelések lehetséges hasznára vagy hatékonyságára vonatkozóan, vagy részleteket arra nézve, hogy az ilyen kezelések hogyan befolyásolhatók - például a mag egységnyi mennyiségéhez szükséges aktív anyag mennyiségét illetően - és nem találtunk példákat, melyek okot adnának arra, hogy elhiggyük, a javasolt kezelés ténylegesen megfelelő védelmet biztosit

Ezért, bár a legutóbbi növényekkel kapcsolatos génsebészeti fejlesztések javították a növények kártevők elleni védelmét kémiai peszticidek használata nélkül, és miközben az ilyen technikák, mint a magok peszticidekkel való kezelése, csökkenti a peszticidek környezettel szembeni káros hatásait számos probléma maradt, melyek korlátozzák ezen módszerek sikeres alkalmazását a tényleges szántóföldi körülmények között. Ennek megfelelően, hasznos lenne egy javított módszert biztosítani a növények, különösen a kukorica, kártevők táplálkozási kártételével szembeni védelméhez. Különösen hasznos lenne ha az ilyen módszerek csökkentenék a hagyományos kémiai peszticidek szükséges alkalmazási mennyiségét, és ha ez korlátozhatná a növény vetése és termesztése által megkövetelt önálló szántóföldi alkalmazások számát.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a jelen találmányt.

Röviden, ezért, a jelen találmány egy olyan új módszerre irányul, mely egy transzgeníkus kukorica védelmére szolgáié módszert biztosítja egy vagy több kártevő táplálkozási károsításával szemben, a módszer magába foglalja a transzgenikus kukoricához való olyan mag biztosítását, mely egy transzgenikus eseménnyel rendelkezik, mely aktivitást mutat egy ^vasy több kártevő legalább egyikével szemben, és a magot clothianldín peszticld hatékony mennyiségével kezeljük.

A jelen találmány olyan új, transzgenikus kukorica maggal is kapcsolatos, melyet oly módon kezeltünk, hogy a transzgenikus kukoricához való, transzgenikus eseménnyel rendelkező, és egy vágytöbb kártevő legalább egyike ellen aktivitást mutató magot biztosítunk, és a magot clothianldín peszticld hatékony mennyiségével kezeljük.

A jelen találmány olyan új, transzgeníkus kukorica maggal is kapcsolatos, mely fokozott rezisztenciát biztosit a kikelő transzgeníkus kukoricának az egy vagy több kártevő táplálkozási károsításával szemben, a mag az egy vagy több kártevő legalább egyike ellen aktivitást mutató transzgeníkus eseménnyel rendelkezik, és a magot clothianidin peszticid hatékony mennyiségével kezeljük.

A jelen találmánnyal elérhetőnek talált számos előny között ezért megemlíthető a növények, különösen a kukorica, kártevők táplálkozási károsításával szembeni védelmére szolgáló módszer biztosítása, egy olyan módszer biztosítása, mely csökkenti a hagyományos kémiai pesztíddek szükséges alkalmazási arányát; valamint egy olyan módszer biztosítása, mely csökkenti a növény vetéséhez és műveléséhez szükséges önálló szántóföldi műveletek számát

Az alábbiakban részletesen leírjuk a jelen találmányt.

A jelen találmánnyal összhangban azt fedeztük fel, hogy a kukorica megvédhető egy vagy több kártevő táplálkozási kártételével szemben egy olyan módszer segítségével, mely magába foglalja a kártevők legalább egyikével szemben aktivitást mutató, transzgeníkus eseménnyel rendelkező kukorica mag biztosítását, majd a transzgeníkus kukorica magot clothianidin peszticid hatékony mennyiségével kezeljük. A jelen találmány előnyös kiviteli alakjaiban azt találtuk, hogy a kukorica levélbogár lárvákkal szemben aktivitást mutató transzgeníkus esemény és a mag clothianidin peszticiddel való kezelésének kombinációja nem várt módon színerglsta előnyöket biztosít az ily módon kezelt mag számára, ideértve a kapott növény kukorica levélbogár lárvák kártételével szembeni nem várt módon hatékonyabb védelmét. Részletesen, azt találtuk, hogy a jelen találmány kombinációja nem várt módon jobban védi a kukoricát a kukorica levélbogár lárvák sokkal súlyosabb színtű - olyan színtű, melyről tudott hogy csökkenti a kukorica terméshozamát 10 kártételével szemben, mint csak a transzgenikus esemény, vagy csak a cfothíanídinnel végzett mag kezelés.

Ismertek az olyan kukoricák és magok, melyeket úgy manipuláltak, hogy tartalmazzák a Bac/flus f/w/ng/ews~ből származó azon exogén géneket, melyek a Coleoptera kártevőkkel szemben aktivitást mutató Cry3 é-endotoxínok expresszióját kódolják, valamint ismertek a magok (akár transzgenikus magok) peszticiddel végzett kezelésére szolgáló módszerek is. Azonban a jelen találmány megjelenéséig nem sikerült megvalósítani, hogy a cloíhianidin peszticíd bizonyos hatékony mennyisége a Cry 3 eseménnyel rendelkező kukorica mag kezelésére használható legyen, azzal az eredménnyel, hogy a kombináció hatékony lenne és előnyösen nem várt módon jobban, növelje a peszticíd és a transzgenikus esemény hatékonyságát is, és azt a további előnyt biztosítsa, hogy növeli annak a lehetőségét, hogy a peszticíd aktivitás felvegye a harcot a kártevő nyomásával szemben, csökkentse a kezelési és/vagy alkalmazási költségeket, növelje a mag kezelés biztonságát és csökkentse az esemény vagy a peszticid, vagy mindkettő környezetre

Részletesebben, azt találtuk az előnyös kiviteli alakokban, hogy a bizonyos módosított Cry3Bb proteinek expresszálására képes transzgenikus kukorica mag kezelése, körülbelül 100 gm - körülbelül 400 gm cíothíanidln/100 kg mag dózisban, nem várt módon jobb védelmet biztosít a növény számára a kukorica ievélbogár lárvákkal szemben. Ezen kívül, ügy véljük, az ilyen kombinációk hatékonyan védik a kelő kukoricát a fekete bagolypílle hernyójának kártételével szemben is. A jelen találmány magjairól úgy véljük, rendelkeznek azzal a tulajdonsággal, hogy csökkentik a peszticíd alkalmazás költségeit, mivel kevesebb peszticid is elegendő ahhoz, hogy ugyanolyan szintű védelmet biztosítsunk, mintha az újító módszert nem alkalmaznánk, Sőt, mivel kevesebb peszticidet használunk és mivel ezt az önálló szántóföldi

9.Α Άλ

alkalmazás nélkül a vetés előtt alkalmazzuk, úgy véljük, a jelen módszer biztonságosabb a műveletet végrehajtó személy és a környezet számára, és potenciálisan olcsóbb, mint a hagyományos módszerek.

Mikor azt. mondjuk, hogy bizonyos hatások „szinergisták, ezen azt értjük, hogy a kombináció szinergista hatással van a transzgenikus esemény és a peszíieid kombinációjának peszticíd aktivitására (vagy hatékonyságára). Azonban, szándékunk szerint az ilyen szinergista hatások nem korlátozódnak a pesztcid aktivitásra, hanem magukba foglalják az olyan nem várt előnyöket is, mint a hatások megnövekedett köre, az előnyös aktivitási profil, ami a károsodás csökkenésének típusával és mennyiségével áll összefüggésben, a peszticíd és az alkalmazás költségének csökkenése, a peszticíd környezetben való eloszlásának csökkenése, a kukorica magot előállító, kezelő és vető személyek pesztícídnek való kitettségének csökkenése, és más, a tudomány e területén képzett szakember számára ismert előnyök.

A jelen találmány biztosítja annak a megnövekedett lehetőségét is, hogy a kártevő nyomásával szemben megtaláljuk a megfelelő peszticíd aktivitást. Ez azt jelenti, hogy meg lehet tervezni a transzgenikus esemény és a pesztícídes kezelés kombinációját oly módon, hogy a mag, vagy a kapott növény számára hatékony peszíieid aktivitást biztosítsunk arra az időszakra, amikor a célzott kártevő magon vagy növényen mutatkozó táplálkozási nyomása maximális. A példa kedvéért, ha ciöthíanidint alkalmazunk a kukorica levélbogár lárvák elleni transzgenikus eseménnyel rendelkező kukorica magon, a peszticíd alkalmazható a burkoló anyagban, amit úgy terveztünk, hogy a clothianídin szabályozott felszabadulását biztosítsa. A felszabadulási sebesség megválasztható úgy, hogy a clothianídin olyan egyéb kártevő ellen is védelmet biztosítson, mint például a fekete bagolypílle, a kukorica kelés utáni stádiumában, mig a transzgenikus esemény a növény későbbi •ί * ί

Λ* *

*.·*·

fejlődést stádiumában (amikor az ilyen védelemre szükség van) biztosítson védelmet a kukorica levéihogár lárvákkal szemben.

A találmány szerinti használatban a „pesztlcid hatás” és a „pesztlcid aktivitás” vagy „aktivitás” kifejezések kártevő elleni toxikus hatást jelentenek. Az „(egy vagy több) kártevő elleni aktivitás” ugyanilyen jelentéssel bir. Ha azt mondjuk, begy a mag vagy a növény „védett az egy vagy több kártevő táplálkozási kártételével szemben”, ezon azt értjük, hogy a mag vagy a növény olyan tulajdonsággal rendelkezik, ami az egy vagy több kártevőre kifejtett közvetlen vagy közvetett hatást jelent, ami a növény magján, gyökérzetén, hajtásain, és levelein táplálkozó kártevő vagy kártevők táplálkozási kártételének csökkenését eredményezi az ilyen tulajdonságokkal rendelkező növények esetében, az ilyen tulajdonságokkal nem rendelkező növényeken ugyanilyen körülmények között okozott táplálkozási kártételhez képest. Az ilyen közvetlen vagy közvetett hatás magába foglalja a kártevő pusztulását, a kártevő növényi magoktól, gyökérzettől, hajtásoktól és/vagy leveleitől való riasztását, a kártevő növényi magokon, gyökérzeten, hajtásokon és/vagy levelein való táplálkozásának, vagy az ezen részekre való peterakásnak a gátlást, valamint a kártevő szaporodásának gátlását.

Az „inszekticíd aktivitás” kifejezés ugyanolyan jelentéssel bir, mint a pesztlcid aktivitás, azzal az eltéréssel, hogy azokra az esetekre korlátozódik, amikor a kártevő rovar. Kivéve, ha másként nem jelöltük, a „pesztlcid” kifejezést a jelen találmányban úgy használjuk, hogy olyan kémiai peszticidre utal, melyet kívül alkalmazunk a magon, és a kifejezés nem foglalja magába az olyan aktív anyagokat, melyeket az adott mag, vagy a magból kifejlődő növény termel Azonban a „pesztlcid aktivitás és az „inszekticíd aktivitás” kifejezések használhatók bármelyik vagy mindkét aktivitásra, a kívülről alkalmazott peszticidre és/vagy az olyan anyagra is, melyet a mag vagy a növény termei *

ί * *

I *

A'·'⁴ * <«·

Λ· *

* -f .

A jelen találmány jellegzetessége a transzgenikus kukorica magja. A találmány szerinti használatban a „transzgenikus kukorica” olyan kukoricát vagy kukorica utódot jelent, ami egy transzformált kukorica növényi sejtből vagy protopiasztból származik, ahol a növényi DNS egy bejuttatott exogén DNS molekulát tartalmaz, ami eredetileg nincs jelen

A transzgenikus kukorica mag olyan mag, mely egy pesztlcid proteint kódoló exogén gént tartalmaz. Az ilyen típusú pesztlcid proteineket Schnepf és munkatársai (Mierobíology & Moiecular Biolögy Revlews, 62:775-308, 1998) és ffrench-Constanl és Bowen Írták le (CMSL Coli. Moll· Life Sct, 57:828-833, 2000). A jelen találmány egy alkalmazásában a pesztlcid protein tnszekticid proteint jelent.

Előnyös, ha a mag a Bacfi/us íhunngfens/s egy törzséből származó exogén gént tartalmaz, különösen előnyös, ha az exogén gén olyan gén, ami egy a Sac///us fouohg/ens/s-ből származó ínszekticld 5-endotoxínt kódol Ilyen ő-endotoxínok kerültek leírásra a WO 99/31248 és a 6.063.597 számú US szabadalmi alkalmazásokban, és ezek magukba foglalják a Cry3 toxinokat. A jelen találmányban hasznos, módosított 3. fhunng/ens/s coleoptera-toxíkus kristályos proteineket kódoló nukelínsav szegmenseket a 6,080.594 számú US szabadalmi alkalmazásban Írták le, és a rovar rezisztens transzgenikus növényeket, melyek magukba foglalják az ilyen ínszekticld proteineket kódoló nukleinsav szekvenciákat a 6..023.013 számú US szabadalmi alkalmazásban tárgyalják meg. Előnyős, ha a jelen találmány 6-endofoxinjai magukba foglalják a Cry3B proteineket, és még előnyösebb, ha a u-endotoxinok magukba foglalják a colepotera-aktív CrySBb proteineket. A B. fhurfog/ensfo Ínszekticld kristályos proteinek nomenklatúráját Höfte és Whitely tették közzé (Microbiol. Rév... 53:242-255, 1989), Ezt a nomenklatúrát átdolgozták, és az átdolgozott nomenklatúra a h ttp ;//e pun ix.blois.susx,ac. uk/Bome/NeίICrlckmore/Bt/índex.hfml_oldalon található meg. Az átdolgozott * ** * *

•.<J0 ft * * « 0 4* *

.<~0 ** ft *

5, ·* nomenklatúrát felhasználjuk a jelen találmányban, hogy leírjuk a transzgeníkus esemény jellemzőit és a transzgenikus esemény által kódolt ő-endotoxin proteineket.

Amikor a „transzgeníkus esemény” kifejezést használjuk a jelen találmányban, az ilyen kifejezések a fentiekben leírt, genetikailag módosított DNS-re utalnak, azonban magukba foglalják az(oka)t a proteín(eke)í: is, mely(ek)et a módosított gén kódok A kukorica magban, vagy a kukoricában levő transzgenikus esemény ezért magába foglalja egy protein expressziójának képességét. Amikor azt mondjuk, hogy „egy kártevő ellen aktivitással rendelkező transzgeníkus esemény”, ezen azt értjük, hogy ez egy olyan proteint jelent, melyet az a gén kódol, mely valójában Ilyen aktivitással rendelkezik, ha a protein expresszálódik és kapcsolatba kerül a kártevővel.

A WO 99/31248 és a 8.083.59? számú US szabadalmi alkalmazások leírják a S, foudng/ens/s é-endoíoxín gének genetikai manipulációjára szolgáié módszereket, hogy lehetővé váljon a módosított ő-endotoxinok expressziója. A módosított ó-endotoxinok abban térnek el a vad típusú proteinektől, hogy speciális aminosav helyettesítésekkel, addíciőkkal vagy delécíókkal rendelkeznek a vad típusú mikroba által termelt proteinekhez képest. Az ilyen módosított 5-endöfoxinokat egy csillaggal f} azonosítjuk, vagy az adott, speciális proteinre azonosító számán keresztül történő hivatkozással. így, a genetikailag módosított Cry3 é-endotoxín Cry3*~ként expresszáíódna, melynek példái az ezekre vaio

CrySBb.l 1230-at, .11233~at, nélkül a következőket foglal, a CrySBb.l 1231-et, a CrySBb.l 1232-őt, ,1

-et, a

Ϊ-1Ί2

CrySBb.l 1236-ot, CrySBb.l 1239-et, CrySBb.l 1ö88~al.

CrySBb.l 1237~et, CrvSBb.í 1241-et, a a Gry3Bb,11238-at, CrySBb.l 1242~öí és * *

*

A WO 99/31248 számú szabadalmi alkalmazásban és a 8.063,597 számú US szabadalmi alkalmazásban leírt néhány módosított 3~ endotoxínnai kapcsolatban azt találtok, hogy fokozott aktivitással rendelkeznek a coleoptera rovarokkal szemben, különösen a Diabrotica fajokkal szemben, ideértve a kukorica levéibogár lárvákat Is. A jelen találmány szerinti használatban, a „fokozott aktivitás” kifejezés egy módosított toxln megnőtt ínszekticid aktivitására utal ugyanezen toxin aminosav módosítások nélküli aktivitásához képest, ha mindkét toxint azonos körülmények között teszteljük. Részletesebben, azt találtok, hogy a Cry3* é-endotoxínok fokozott aktivitással rendelkeznek a kukorica levéibogár lárvákkal szemben, és ezért előnyösek a jelen találmányban való alkalmazáshoz. Még előnyösebbek a Cry3B* ó'-endotoxinok, és még előnyösebbek a Cry3Bb* ő-endoíoxínok. Még előnyösebbek azok a transzgenikus események, melyek rendelkeznek az alábbi táblázatban feltüntetett, módosított ö-endotoxinok expresszálásának képességével. A táblázatban bemutatjuk a transzgenikus 8. fbudng/ens/s azon törzseit, melyek magukba foglalják a megfelelő, űj endotoxínok expressziójához való géneket, valamint a deponálás időpontját, és a deponált anyagok katalógus számait az Agneultural Research Service Collection-nél (NNRL) 1815 N. University Street, Peoria, IL 91904.

X

TÖRZS	DEPONÁLÁS DÁTUMA	; PROTEIN	KATALÓGUS SZÁM (NRRL szám)
EG 11230	5/27/97	Cry38b. 11230	B-21788
| EG11231	5/27/97	Cry3Bb,11231	B-21789
EG11232	5/27/97	CrySBb.l 1232	8-21770
EG11233	5/27/97	Cry38b.11233	B-21771
EG11234	5/27/97	CrySBb.l 1234	B-21772
EG11235	5/27/97	CrySBb.l 1235	B-21773
ÉGI1236	5/27/97	CrySBb.l 1236	8-21774
EG11237	5/27/97	CrySBb.l 1237	8-21775
EG11238	5/27/97	CrySBb.l1238	8-21776
EG11239	5/27/97	Cry3Bb.11239	B-21777
EG 11241	5/27/97	CrySBb.l 1241	8-21778
EGH242	5/27/97	CrySBb.l 1242	8-21779
EG 11698	11/28/97	CrySBb.l1098	8-21903

Azt találtuk, hogy a jelen találmány előnyösen alkalmazható a kártevő táplálkozási kártételének csökkentésére, ha kombinációban használjuk olyan transzgeníkus eseménnyel rendelkező magokkal, mely esemény bizonyos szintű hatékonyságot mutat egy ilyen kártevővel szemben. Annak illusztrálása céljából, hogy melyik hatékonysági szintek az előnyösek, a következő példában az lowa Gyökér Értékelő Módszert (lowa Root Rating Method) használjuk (Hills and Peters, 3. Econ. EntomoL, 84:784-785, 1971), mely 1-8-os skálán méri a kukorica levélbogár lárvák kukorica gyökérrel szembeni táplálkozási kártételét. Az értékelésben; 1 ~ azt jelenti, hogy nincs sérülés, vagy csak néhány kisebb táplálkozási sebhely látható; 2- a táplálkozási sérülés egyértelmű, azonban nincsenek 1 % inchig visszarágott gyökerek; 3~ számos gyökeret ierágtak az 1 % Inch méretnél kisebbre, de sosem károsodik egy egész gyökér csomónak megfelelő gyökér mennyiség; 4= egy gyökér csomót teljesen lerágtak; 5~ 2 gyökér csomót teljesen lerágtak; és 6= 3 vagy több gyökér csomót teljesen leráglak, A tönkretett gyökeret úgy határozzuk meg, mint amit az alaptól 1 % inch távolságig lerágtak, A lerágott gyökerek nem feltétlenül egyetlen csomóból indulnak, de az összes lerágott gyökér annyit kell kitegyen, ami megfelel egy teljes csomónak ahhoz, hogy lerúgott csomónakszámifsnk.,

A jelen találmány szerinti használatban a transzgeníkus esemény az előnyös hatékonysági szint határok között van a célzott kártevővel szemben, ha az esemény olyan mértékben csökkenti az adott kártevő által okozott: táplálkozási kártételt, ami összevethető ugyanezen, azonban a transzgeníkus eseménnyel nem rendelkező növénnyel, de mely nem véd lényegében az összes, célzott kártevő által okozott kártétellel szemben. Például, ha a transzgeníkus kukorica 10%-a az 1-6-ös lowa skálán mért 4~es szintű, vagy magasabb kukorica levélbogár lárvák kártételtől szenved, rnig a nem transzgeníkus kukorica 80%-a károsodott 4-es vagy magasabb szinten, akkor azt lehet mondani, hogy a transzgeníkus kukorica károsodása a nem transzgeníkus kukoricáénak a (10/80) x TGG = 12,5%-a. A jelen találmány céljaihoz el kell fogadni, hogy a transzgeníkus esemény a kukoricában az előnyös hatékonysági szint határokon belüli, ha az ilyen eseménnyel rendelkező kukorica a nem transzgeníkus kukorica károsodásának körülbelül 5% - körülbelül 50%ától szenved, ugyanazon kártevő miatt, azonos körülmények között. Még előnyösebb, ha az ilyen transzgeníkus eseménnyel rendelkező kukorica a nem transzgeníkus kukorica károsodásának körülbelül 10% - körülbelül 40%-átől szenved, ugyanazon kártevő miatt, azonos körülmények között.

még előnyösebb, ha a károsodás körülbelül 15% ~~ körülbelül 30 % közötti és még előnyösebb, ha a károsodás a nem transzgeníkus kukorica * ♦ károsodásának körülbelül 20% - körülbelül 30%-a, ugyanazon kártevő miatt, azonos körülmények között. A találmány szerinti használatban a „körülbelül” kifejezést a kukorica károsodásának mértékére használjuk, azt kell rajta érteni, hogy a károsodás foka akár 1%-kal akár 2%-kal a leírt határértékek alatt vagy fölött lehet, de továbbra is azt tartjuk, hogy a leírt határértékek között van. Példaként a 4,5%-os károsodást „körülbelül S%”~ os károsodásnak tekinthetnénk.

Anélkül, hogy ehhez, vagy bármely más elmélethez ragaszkodnánk, úgy véljük, hogy a peszíodes mag kezelés szignifikáns előnyöket biztosíthat, ha egy olyan transzgenikus eseménnyel kombináljuk, mely olyan védelmet biztosít, mely a kívánt hatékonysági határértékek között van a célzott kártevővel szemben. Ezen kívül, ügy véljük, hogy vannak olyan esetek, melyek jól ismertek a tudomány e területén képzett szakember számára, ahol az az előnyös, ha az Ilyen transzgenikus esemény az előnyös hatékonysági határértékek közé esik.

A jelen találmány magába foglalja az egynél több transzgenikus eseménnyel rendelkező magokat és növényeket. Az ilyen kombinációkra „halmozott” transzgenikus eseményekként hivatkozunk. Ezek a halmozott transzgenikus események olyan események lehetnek, melyek ugyanazon kártevő ellen irányulnak, vagy irányulhatnak különböző célzott kártevők ellen is. Egy előnyös kiviteli alakban a Cry 3 protein expressziójára képes mag képes legalább egy egyéb, a Cry 3 proteintől eltérő, inszektícid protein expressziójára is.

Egy másik előnyös kiviteli alakban a Cry 3 protein expresszíöjára képes mag rendelkezik egy olyan transzgenikus eseménnyel is, mely herbicid toleranciát biztosit. Még előnyösebb, ha a herbicid toleranciát biztosító transzgenikus esemény olyan esemény, mely a glifozáttal, N~ (foszfonometíijglicinnel szembeni rezisztenciát is biztosít, ideértve az Ilyen herbicid ízopropilamin só formáját, és még előnyösebb az olyan transzgenikus esemény, mely hatékonyan biztosítja a Monsanto Co., (St .19

Louis, MÖ) cégtől beszerezhető ROUNDUP RE ADY® növények és magok herbicid reziszteneiátját.

A jelen módszerben a transzgenikus eseménnyel rendelkező kukorica magot egy olyan peszticiddei kezeljük, mely clothlanidinként azonosítható (N-^-ktör-S-tíazoiljmetílj-N-metil-N’-nitroJCCEjj-íSCI)guanldin, CAS RN 210880-92-5, fejlesztési száma TI-435).

Amikor a clothlanídin Inszekticídet a jelen találmányban leírjuk, ezen azt kell érteni, hogy a leírásba beleértjük az inszekticíd só formáit is, valamint az Inszekticíd bármely olyan Izomer és/vagy tautomer formáját, mely ugyanazt az inszekticíd aktivitást mutatja, mint a leírt inszekticíd forma. A jelen módszerben hasznos clothlanídin inszekticíd lehet bármilyen fokú vagy tisztaságú, mely Ilyen inszekficidként bekerül a kereskedelembe. Az egyéb anyagok, melyek az inszekticídet szennyeződésként kísérik a kereskedelmi készítményekben, tolerálhatok a jelen módszerekben és készítményekben, amennyiben az egyéb anyagok nem destabilizálják a készítményt, vagy szignifikánsán nem csökkentik, vagy rombolják a célzott kártevö(k) elleni semelyik inszektioid komponens aktivitását, vagy a transzgenikus eseményt. Az inszekticíd előállítás területén átlagosan képzett szakember könnyen azonosíthatja azokat a szennyeződéseket, melyek tolerálhatok és melyek nem tolerálhatok.

Azt találtuk, hogy a jelen módszer hasznos a magok és növények mezőgazdasági kártevők széles köre elleni védelmében, ideértve a rovarokat, az atkákat, a fonalas gombákat, élesztőgombákat, penészeket és baktériumokat.

Amikor egy rovar a jelen találmány célzott kártevője, a kártevő az ezekre való korlátozás nélkül magába foglalja a kő¹ # A a Lepldoptera rendből például az

Adens spp,, Adoxophyes spp., Aegena spp., Agrotís spp.,

A/aőama arg/Z/aceae, Amylols spp,, Aní/caxs/a gemmaZaZ/s, Archíps spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Sasseo/a fussa, Cadra cauZeZZa, Ca/pos/na o/pponens/a, Chilo spp., Choristoneura spp., C/ys/a amőZgue//e, Cnapbalocroois spp., Cnephasía spp., Cochyhs spp,, Coieophora spp., Cfoc/do/om/a ö/.oota/Zs, Cryptopbfeb/a feacotrefa, Cydia spp., Diaíraea spp., DZparops/s casfanea, Eadas spp,, Ephestía spp., Eucosma spp., Eopoec///a amő/goeZ/a, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholíta spp., Efedya nub/Zérana, Hehothis spp., He//uZa uodaZZa, Aypba/Wa cunea, Keífeba iycopers/cetia. L&ucoptera sc/ZeZ/a, Lithocoliethís spp., tobesZa bofrana, Lymantna spp., Lyonetia spp., Maíacosoma spp., Mamestra brassícae, MaaOuca sexZa, Operophtera spp., OsZnn/a aufeZZa/Zs, Pammene spp., Pandemís spp., PanoZZs fZa/nmea, Pecf/nophora gossyp/e/Za, Pbfbomnaea operou/eZZa.. P/eris rapae, Pleris spp., PZuZe/Za xyfast&tfa, Prays spp., Sdrpopbaga spp., Sesamia spp.,. Sparganotbís spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetópoea spp., Tortrlx spp., Tbchöpius/a ni és Ypooomeuta spp.;

rendből például az

Agrotes spp., Anthonomus spp., Aiomaba Z/aear/s, CZ/aeZocnerna Z/b/aZZs, Cosmopolltes spp., Curcuiío spp.,, Dermestes spp., Oiabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., tepZ/noZarsa éeeern/ZaeaZa, Lissorboptrus spp., Meiolootha spp., Örycaephílus spp., Gtiorhyncbus spp., Rhiyctlnus spp,, RopOíia spp., Esyiíiodes spp., Rhizoperlha spp,, Soarabeidae, Sltopbilus spp., Sitotroga spp., Tenebrío spp., Trlboiium spp. es í rogoderma az Orthoptera rendből például a

Blatté spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucoph&ea maderae, Loeusta spp., Períplsneta ssp., és Schístocerca spp.;

az Isoptera rendből például a a Psocoptera rendből például a is spp.

az Anoplura rendből például a

Haematoplnus spp., Unognathus spp., Pediculus spp., Pemphlgus spp. és Phylloxera spp.;

a Mallophaga rendből például a

Oamalinea spp. és Trichodectes spp,;

a Thysanoptera rendből például a

Franklinella spp., Hercinothrlps spp., Taeniothrips spp., Thrips patmi, Thrips tabaci és Saidofbrips auranf/i;

a Heteroptera rendből például a

Cimex spp., D/sfaná'e//a fheoőnoma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptecerisa spp,, Nezara spp,, Piesma spp., Rhodnius spp., Sab/bergefe s/ngu/ahs, Scotinophara spp. és Tríatoma spp.;

Λ ·>

rendből például az A/eumfbbxus fioccosus, A/eyrodes őrass/cse. Aonidiel

Cbrysompha/us aonid/um, Cbrysompáa/as d/cíyospem?/, Coccus bespebdum, Empoasca spp., Ebosoma ía/igeram, Eryíhroneura spp,, Gascardta spp., Laodétphax spp., Lacaniam corn/, Lepldosapbes spp., Macroslphus spp., Myzus spp., Nehotettlx spp., Nilaparvata spp., Paralona spp., Pemphlgus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp,, Pseudococcus spp., Psylla ssp., PaMnada aethtöpica, Quadraspldiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetla spp., Scapholdeus spp., Schizaphis spp., Sitobioo spp., Ada/eurcdes vaporadowm, Tdoza etytreae és Unasp/s e#b;

a Hymenoptera rendből például az

Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Díprlon spp., Dipríonidae, G/7p/n/a pelyfoma, Hoplocampa spp., Lasíus spp., Monomor/um pőaraon/s, Neodipríon spp, Solenopsls spp. és Vespa ssp.;

a Dlptera rendből például as

Aedes spp., Antberigona soccaía, Bib/o horíulanus, Cal/lphora enyíbröcephala, Ceratítls spp., Chrysomyla spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacos spp., DrosopMa me/anopasíer Fannie spp., Gastrophitus spp., Glosslna spp., Hypoderma spp,, Hyppobosca spp., Línomysa spp., Lucílía spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Öestrus spp., Orseolía spp., Gsc/ne//a frít Pegomyía hyoscyami, Phorbía spp., Rbapo/ef/s pomone//a, Scíara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannla spp. és Tlpula spp.,

X φ

Φ * φ <ί ♦ φ φ * * φ

X « » φ *

X < * * φ φ φ »* X a Síphonaptera rendből például a és a Thysanvra rendből például a íep/sma sacchatina,

Azi találtuk, hogy a jelen találmány különösen hatékony ha a kártevő egy Diabroíica spp.-i jelent, és különösen, ha a kártevő a Diabroiica virgjfera-t, a Diabrotica barberi-i, vagy a Diabroíica uadeciffipcrictata-t jelenti.

A jelen találmány módszerében a clothíanídint egy transzgenikus kukorica magon alkalmazzuk. Bár úgy véljük, hogy a jelen módszer alkalmazható transzgenikus kukorica magon is bármilyen fiziológiai állapotban, előnyös, ha a mag megfelelő tartós állapotban van, hogy ne szenvedjen károsodást a kezelési eljárás során. Tipikusan a mag olyan magot jelent, melyet a szántoföltíön takarítottak be, eltávolították a növényről, és elválasztották a kukohcaesőtőt, a szártól, a külső héjtól és a magot körülvevő pulpátöl vagy egyéb, nem magos növényi anyagtól. A mag előnyösen lehet biológiailag olyan mértékig stabil, hogy a kezelés nem okoz biológiai károsodást a magnak. Az egyik kiviteli alakban, például, a kezelés alkalmazható a betakarított, tisztított és körülbelül 15 tőmeg% nedvességtartalom alá szárított kukorica magon. Egy alternatív kiviteli alakban a mag lehet megszáritoíí, majd vízzel és/vagy egy más anyaggal telített, majd a peszticiddel való kezelés előtt vagy alatt újra szárított mag. A leírt korlátokon belül úgy véljük, a kezelés bármikor alkalmazható a magon, a mag betakarítása és elvetése közötti bármelyik időszakban.

A találmány szerinti használatban az „el nem vetett mag” kifejezés olyan magot jelent ami a mag betakarítása és a növény kicsírázása és növekedése eéíjábőí a talajba vetése közötti bármely időszakban van.

Amikor azt mondjuk, hogy az et nem vetett magot „kezeljük” a pesztlciddel· az ilyen kezelés nem vonatkozik arra a gyakorlatra, amikor a peszticidet a talajban alkalmazzuk a magon való alkalmazás helyett.. Például· az olyan kezeléseket, mint a peszticid sávokban, „T-sávokban” vagy barázdában való a mag vetésével egy időben történő alkalmazását, nem tekintjük a jelen találmány részének.

A peszticid, vagy a peszticidek kombinációi alkalmazhatók „tisztán, azaz bármilyen hígítőszer, vagy további komponens jelenléte nélkül. Azonban a peszticidet tipikusan egy peszticid készítmény formájában alkalmazzuk a magon. Ez a készítmény tartalmazhat egy vagy több egyéb kívánatos komponenst, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a folyékony hígítószereket, kötőanyagokat, melyek mátrixként szolgáinak a peszticidbez, a töltőanyagokat, melyek védik a magot stresszes körülmények között, valamint képlékenyitő anyagokat, melyek javítják a burkolóanyag rugalmasságát, adbéziöját és/vagy éloszlathatóságát Ezen kívül a kevés töltőanyagot tartalmazó vagy a töltőanyagot nem tartalmazó olajos peszticid készítményekhez kívánatos lehet, hogy szárító anyagot is hozzáadjunk a készítményhez, például kalcium-karbonátot, kaolint, vagy bentonit agyagot, perlítet, distomaíöldet vagy bármilyen egyéb adszorbens anyagot. A mag kezelésekben az ilyen anyagok használata ismert a tudomány e területén. Lásd például az 5.876,739 számú US szabadalmi alkalmazást. A tudomány e területén képzett szakember könnyen kiválaszthatja a peszticid készítményekben való alkalmazáshoz kívánatos komponenseket a kezelendő mag típusától és az adott, kiválasztott peszticidtöl függően. Ezen kívül, felhasználhatók könnyen beszerezhető, ismert peszticidek kereskedelmi készítményei is, amint azt az alábbi példákban bemutatjuk.

A magok kezelhetők az alábbi alkotórészek egyikével vagy akár ezek közül többel is: egyéb peszticidekkek ideértve az olyan vegyületeket, melyek csak a talaj felszíne alatt hatnak, fungicidekkel, például a kaptáét, a tiramoí, a rnetalaxiit (metoxam ~ a metalaxil rezolvált izomerje) fludíoxonílt, oxadixilt, és ezen anyagok izomerjeit, és más hasonló anyagokat; herbícideket ideértve a karbamátokat vagy a tiokarbamátokat, acetamidokat, vagy a triazineket, vagy a dinitroaniiineket, vagy a glicerinétereket, vagy a piridazinonokat vagy az uraeileket, vagy a fenoxikat, vagy a karbamidokat vagy a benzoesavakat; herbicidben alkalmazott antídőtumok, például benzoxazin, benzhidrii származékok, H_sN~díallildiklór-acetamid, különböző dihaloaoil, oxazölídinil és tiazolídínii vegyületek, etanon, naftaíin-anhidnd vegyületek, és oxim származékok; műtrágyák és biológiai szabályzó anyagok, például természetesen előforduló vagy rekombináns baktériumok és gombák a Pő/zoó/őm, őac/te, Pseudomonas, Se/zabá, TflcftoűterFna, G/omas, G/íodaddm és mikorriza gombák, Ezek az alkotórészek külön rétegként juttathatok a magra, vagy másik lehetőségként a peszücid készítmény részeként adhatók hozzá.

Előnyösen a mag kezeléséhez használt új készítmény vagy egyéb alkotórészek mennyisége nem gátolhatja a mag fejlődését, vagy nem okozhat fítotoxlkus károkat a magnak.

A transzgenlkus kukorica mag kezelésére használt pesztícíd készítmény a jelen találmányban lehet szuszpenzió, emulzió, vizes tápközegben (például vízben) levő részecskék szuszpenziójának, nedvesíthető por, nedvesíthető granulumok (szárazon önthető) és száraz granulumok formájában. Ha szuszpenzióként formulázzuk, az aktív alkotórész koncentrációja a készítményben előnyösen körülbelül 0,5% körülbelül 99 tőmeö%, előnyösen 5-40%.

Amint korábban említettük, egyéb hagyományos inaktív vagy inért alkotórészek is szerepelhetnek a készítményben. Az ilyen inért * $ i

alkotórészekre példák az ezekre való korlátozás nélkül a hagyományos adhéziós anyagok, dlszpergálószerek, mint például a metilceliuioz (Methocei A15LV vagy a Methooel A 15C, például, kombinált díszpergálószerként/adhézlós anyagként szerepel a mag kezelésben) pollvlnil-alkohol (például Elvanol 51-05), íecifin (például Yeikíno P), polimer dlszpergálószerek (például poíiviniS-pirrolídon/vínil-acetát PVP/VA S-630), sűrítő anyagok (például agyag sürítők, mint a Van Gél B a viszkozitás javítására és a részecske szuszpenziók leülepedésének csökkentésére), emulzió stabilízátorok, felületaktív anyagok, f'agyásgáílo vegyületek (például karbamld), festékek, színezékek és más hasonló anyagok. A jelen találmányban hasznos további inért alkotórészek találhatók a következő irodalomban: McCutcheons voí „Emulsífiers and Detergents MC Publishing Company, ölen Rock, New Jersey, U.S.A., 1996. További, a jelen találmányban használható inért alkotórészek találhatók a következő irodalomban: McCutcheon's, vök 2, Tunctfona/ .Matena/s,” MC Publishing Company, Glen Rock, New Jersey, U.S.A., 1996.

A jelen találmány pesztíoídjei és pesztieid készítményei bármilyen standard mag kezelési módszerrel a magra juttathatók, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a tartóedényben (például üvegben vagy zsákban) való összekeverést, a mechanikai alkalmazást, az összerázást, a permetezést és az immerziőt Bármely hagyományos aktív vagy inért anyag felhasználható a magok a jelen találmány peszticidjeível való kapcsolatba hozatalához, például hagyományos film burkoló anyagokkal, melyek magukba foglalják az ezekre való korlátozás nélkül a víz alapú film burkoló anyagokat, mint például a Sepiret-et fSeppíc, Inc., Faírfleld, NJ) és az Opacoat-ot (Berwínd Pharm. Services, Westpoínt, PA).

A kérdéses pesztieid egy mag burkoló anyag komponenseként alkalmazható a magon. A tudomány e területén ismert mag burkoló anyagok es készítmények hasznosak, ha ezeket módosítjuk a jelen találmány pesztlcld kombinációi egyik kiviteli alakjának hozzáadásával. Az ilyen burkoló anyagok és az alkalmazásukhoz való eszközök leírásra kérőitek például az 5,918,413, az 5,891,248, az 5,554,445, az 5,389,399, az 5,107,787, az 5,080,925, a 4,759,945 és a 4,485,017 számú US szabadalmi alkalmazásokban.

ló készítmények kerültek leírásra például, többek között, az 5,939,358, az 5,882,713, az 5,876,739, az 5,849,320, az 5,834,447, az 5,791,084, az 5,681,103, az 5,822,803, az 5,580,544, az 5,328,942, az 5,300,127, a 4,735,015, a 4,634,587, a 4,383,391, a 4,372,080, a 4,339,458,a 4,272,417 és a 4,245,432 számú US szabadalmi alkalmazásokban.

A hasznos mag burkoló anyagok egy vagy több kötőanyagot, és legalább egy szóban forgó peszíícíd kombinációt tartalmaznak.

A jelen találmányban hasznos kötőanyagok előnyösen egy adhéziós polimert tartalmaznak, mely lehet természetes vagy szintetikus polimer, és melynek nincs fitotoxikus hatása a beburkolandó magra. A kötőanyagok lehetnek poHvínil-acetátok: polívinll-acetát kopoiimerek; etilén-vlníl-acetát (ÉVA) kopoiimerek: polivinii-alkoholok; polívínil-aikohol kopoiimerek: cellulózok, ideértve az etil-cellulózokat, a metllcellulózokaf, bidroxlmetlhceliulőzokat, a hidroxlpropíl-cellulózokat, és a karhoxi meti leél luiozl; polivinil-pirrotidonok, poíiszacharidok, ideértve a keményítőt, a módosított keményítőt, a dextrineket, a maltodextrineket, az aiginátot, és a kitozánokat; zsírok; olajok; proteinek, ideértve a zselatint és a zeineket; gumlarábíkumck; sellakok; vinílídén-klorid és vinítídén-kiond kopoiimerek; kalcium-lignoszulfonátok; akrltes kopoiimerek: polivinil-akriláfok; polietllén-oxid; akrllamld polimerek és kopoiimerek: polihidroxl-etíl-akhlát, metil-akrllamíd monomerek; és polikloroprén.

Előnyős, ha a kötőanyagot úgy választjuk meg, hogy mátrixként szolgálhasson a kérdéses pesztícidek számára. Míg a fent leírt kötőanyagok hasznosak lehetnek mátrixként, a speciális kötőanyag attól függ, hegy milyenek a pesztícidek kombinációjának tulajdonságai, A „mátrix kifejezés a találmány szerinti használatban egy vagy több kötő vegyület folytonos szilárd fázisát jelöli, melyen keresztül az egy vagy főbb kérdéses peszticid nem folytonos fázisként oszlik szét. Adott esetben, egy töltőanyag és/vagy egyéb komponensek is jelen lehetnek a mátrixban. A mátrix kifejezés magába foglalja azt az anyagot is, amit mátrix rendszernek tekintünk, egy rezervoár rendszert vagy egy mikrobekapszulázott rendszert. Általában a mátrix rendszer a jelen találmány peszticidjeit és egy polimeren belül egyenletesen eloszlatott töltőanyagot jelent, míg a rezervoár rendszer a kérdéses pesztícídeket tartalmazó elkülönült fázist jelent, melyet fizikailag eloszlatunk az ezt körülvevő, sebességet korlátozó polimer fázison belük A míkrobekapszulázás kis részecskék burkolását, vagy egy folyadék cseppjelnek burkolását jelenti, azonban magába foglalja egy szilárd mátrixban való diszperziót ís.

A burkoló anyagban levő kötőanyag mennyisége változó, de a mag tömegének körülbelül 0,01% ~~ körülbelül 25%-a, még előnyösebben körülbelül 0,05% - körülbelül 15%-a, és még előnyösebben körülbelül 0,1% - körülbelül 10%-a.

Amint fent említettük, a mátrix adott esetben magába foglalhat egy töltőanyagot is. A töltőanyag lehet egy abszorbens vagy egy ínért töltőanyag, például mint amik ismertek a tudomány e területén, és magukba foglalhatják a „falisztet”, az agyagokat, aktivált szenet, cukrokat, díatomaföldef, gabonalíszteket, finom szemcsés szervetlen szilárd anyagokat, kalcium-karbonátot és más hasonló anyagokat, A használható agyagok és szervetlen szilárd anyagok magukba foglalják a kalcíumbentonitet, a kaolint, a porcelánföldet, a talkumot, a perlítet a csillámot, a vermiculítet, a szílíkátokah a kvarz pori, a monímoriSlonítet és ezek keverékét. A használható cukrok közé tartoznak a dextrln és a maítodextrin. A gabona lisztek közé tartoznak a búzaliszt, a zabliszt és az árpaliszt.

A töltőanyagot úgy választjuk meg, hogy megfelelő mikroklímát biztosítson a mag számára, például a töltőanyagot arra használjuk, hogy növeljük az aktív alkotórészek terhelési arányát és korrigáljuk az aktív alkotórészek szabályozott felszabadulását, A töltőanyag elősegítheti a mag burkoló anyaggal való beburkolásának folyamatát. Á töltőanyag mennyisége változhat, de általában a töltő alkotórész mennyisége a mag tömegének körülbelül 0,05 ~ körülbelül 75%-a, meg előnyösebben körülbelül 0,1 - körülbelül 50 %-a és még előnyösebben körülbelül 0,5 15%~a.

A burkolóanyagban hasznos pesztícídek tipikusan azok a pesztícídek, melyeket a jelen találmányban leírunk. A magok kezelésére használt peszticid mennyisége a mag típusától és az aktív alkotórészek típusától függően változik, azonban a kezelés magába foglalja a magok pesztícídek kombinációjának peszticid szempontból hatékony mennyiségével való kezelését. Amikor a célzott kártevő rovar, ez a mennyiség az inszekticíd azon mennyiségét jelenti, mely inszekticíd szempontból hatékony. A találmány szerinti használatban az inszekticíd szempontból hatékony mennyiség az inszekticíd olyan mennyiségét jelenti, mely elpusztítja a kártevőt a lárva vagy a pulpa növekedési stádiumban, vagy mely következetesen csökkenti, vagy késlelteti a kártevő által okozott károk mennyiségét.

Általánosságban, a kezelés során a magon használt clofhianidln mennyisége a peszticid aktív alkotórészének körülbelül 10 gm körülbelül 2000 gm mennyisége 100 kg magra számítva. Előnyősén a peszticid mennyisége 100 kg magra nézve körülbelül 50 gm - körülbelül 1000 gm aktív anyag, még előnyösebben 100 kg magra nézve körülbelül

V;

1ÖÖ gm ~~ körülbelül 800 gm aktív anyag, és még előnyösebben 100 kg magra nézve körülbelül 200 gm - körülbelül 500 gm aktív anyag. Másik tehetőségként azt találtuk előnyösnek, ha a pesztlcid mennyisége körülbelül 80 gm aktív anyag/100 kg mag dózis fölött van, és még előnyösebben, ha körülbelül 80 gm/100 kg mag dózis fölött van.

A kezelésben használt pesztlcid nem gátolhatja a mag csírázását és hatékony keli legyen a mag és/vagy a növény védelmében a magot vagy a növényt károsító célzott kártevő életciklusa alatt. Általánosságban a burkolóanyag megközelítően 0-120 napig hatékony a vetés után.

A jelen találmány pesztieldje burkolóanyag formájában alkalmazható a magon. A burkolóanyag használata különösen a nagy pesztlcid terhelések alkalmazásakor hatékony, mivel szükség lehet a tipikusan ellenálló kártevők, például a kukorica Ievélbogar lárvák elleni kezelésre, ugyanakkor ki kell védeni a megnövekedett pesztlcid terhelés következtében fellépő, elfogadhatatlan fifctoxicifási.

Adott esetben, egy képlékenyítő anyag is alkalmazható a burkolóanyag készítményben. A képlékenyítő anyagokat tipikusan azért használjuk, hogy a burkoló réteg által létrehozott filmet rugalmasabbá tegyük, javítsuk az adhéziót és az eloszlathatóságot és javítsuk az eljárás sebességét. A jobb film rugalmasság fontos a sérülés, a törés vagy lehámiás minimalizálásához a tárolás, a kezelés és a vetési eljárás alatt. Sok képlékenyítő anyag használható, azonban a hasznos képlékenyítő anyagok közé a következők tartoznak: poliefiién-gükoi, glicerin, butllbenzll-ítalát, gllkol-henzoátok és a rokon vegyületek. A képlékenyítő anyagok mennyisége a burkoló rétegben körülbelül 0,1 ·- körülbelül 20 fömeq%,

Amikor a burkolóanyagban használt pesztlcid olajos típusú készítmény, és kevés töltőanyag van jelen, vagy töltőanyag nincs is jelen, hasznos lehet a szárítási folyamat felgyorsítása a készítmény szárításával. Ez a tetszés szerinti lépés elvégezhető a tudomány e * ♦ területén ismert bármely eszközzel, és magába foglalhatja kalciumkarbonát, kaolin, vagy bentonít agyag, pariit, diaíómaíöld, vagy bármely abszorbens anyag alkalmazását, melyet előnyösen egyidejűleg adunk hozzá a pesztleides burkolóanyaghoz, hogy abszorbeálja az olajat vagy a feleslegben tevő nedvességet. A száraz burkolóanyag hatékony biztosításához szükséges kalcium-karbonát vagy rokon vegyületek mennyisége a mag tömegének körülbelül 0,5 - körülbelül 10%-a.

A peszticiddel létrehozott burkolóanyagok előnyösen olyan típusúak, melyek képesek hatékonyan befolyásolni a peszticid lassú felszabadulását azáltal, hogy a környező közegbe dlíTundáinak vagy mozognak a mátrixon keresztül,

A burkoló rétegen túl, a mag kezelhető az alábbi alkotórészek közül többel: eoyéb peszticidekkeí, ideértve a funoicideket és a herbícideket, herblcidben alkalmazott antidótumokkal; műtrágyákkal és/vagy biológiai szabályozó anyagokkal. Ezek az alkotórészek hozzá adhatók külön rétegként, vagy másik lehetőségként a pesztleides burkoló alkalmazhatók.

A peszticid készítmény hagyományos burkoló technikák és gépek segítségével juttathatók a magokra, például folyadék ágyas technikával, forgó malmos módszerrel, rotosztatikus mag kezelőkkel és dobos horkolókkal. Egyéb módszerek, mint a fecskendezett ágyas módszer is alkalmazhatók. A magok burkolás előtt méret szerint előválogathatók. Burkolás után a magokat tipikusan megszárítjuk, majd egy osztályozó gépbe juttatjuk őket a méret szerinti osztályozás céljából. Az ilyen eljárások ismertek a tudomány e területén.

A peszticiddel kezelt magok egy a pesztleides burkolatot védő film burkolattal is elláthatók. Az Ilyen felső burkolatok ismertek a tudomány e területén, és hagyományos folyadék ágyas és dobos film burkoló technikákkal állíthatok elő.

A jelen találmány egy másik kiviteli alakjában a peszticid a magra vagy a magba juttatható szilárd mátrix kezeléssel Is. Például, a peszticid mennyisége összekeverhető a szilárd mátrix anyaggal, majd a mag belehelyezhető, hogy kapcsolatba kerüljön a szilárd mátrix anyaggal olyan hosszú időre, ami lehetővé teszi, hogy a peszticid a maghoz kerüljön, A mag ezután, adott esetben, szeparálható a szilárd mátrix anyagtól és tárolható vagy felhasználható, vagy a szilárd mátrix anyag és mag keverék tárolható vagy azonnal elvethető, A jelen találmányban hasznos szilárd mátrix anyagok közé tartoznak a pollakrilamid, a keményítő, az agyag, a kovaföld, a timföld, a talaj a homok, a poílkarbamíd, a poliakrílát, vagy bármely egyéb olyan anyag, mely képes egy adott időre abszorbeálni vagy abszorbeálni a peszticidet, és képes a peszticidet a magra vagy a magba juttatni. Hasznos megbizonyosodni arról, hogy a peszticid és a szilárd mátrix anyag kompatibilis-e egymással. Például, a szilárd mátrix anyagot úgy kell megválasztani, hogy elfogadható sebességgel szabadítsa fel a peszticidet, például percek, órák vagy napok alatt.

A jelen találmány továbbá magába foglalja az áztatást is, mint a magok peszliciddei való kezelésének másik módszerét. Például, a növényi mag egy időre összekeverhető egy olyan oldallal, mely körülbelül 1 tömeg% - körülbelül 75 tömeg% peszticidet tartalmaz egy oldószerben, például vízben. Előnyösen, az oldat koncentrációja körülbelül 5 tömeg% körülbelül 50 tÖmeg%, még előnyösebben körülbelül 10 tömeg% ~ körülbelül 25 tömeg%. Az alatt az időszak alatt, mialatt a magot összekeverjük az oldattal, a mag felveszi (beszlvja) a peszticid egy részét. Adott esetben a mag keverék és az oldat rázatbató, például rázással, forgatással, vagy egyéb eszközökkel. Felszívódás után a mag elkülöníthető az oldattól, és adott esetben megszánthaío, például szárazra nyomogatással vagy levegőn történő megszórhassak :4 4

más kiviteli alakban a porított pesztlcid közvetlenül n egy ragadós anyag ís

Egy

OSSZí málhatő a por mag felszínére való tapadásának elősegítése céljából. Például, a mag adott mennyisége összekeverhető a ragadós anyaggal, és adott esetben rázatható, hogy elősegítsük a magok ragadós anyaggal való egyenletes beburkolását. A ragadós anyaggal beburkolt mag ezután összekeverhető a porított peszficiddel. A keverék rázatható és így előidézzük, hogy a porított pesztlcid hozzátapadjon a maghoz.

A jelen találmány transzgenikus kukorica magot biztosit, melyet a fent leírt módszer segítségével egy peszticiddel kezeltünk.

A jelen találmány kezelt magja felhasználható a kukorica szaporítására a hagyományosan kezelt kukorica magokéval egyező módon, A kezelt magok a bármel sgyéb peszficiddel kezelt egyező módon tárolhatók, kezelhetők, vethetők, és műveihetők. A megfelelő biztonsági előírásokat be kell tartani, hogy korlátozzuk a kezelt magok és az ember, élelmiszer vagy takarmány, víz és madarak, valamint vad és házi állatc

A jelen találmány előnyös kiviteli alakjait az alábbi példákban mutatjuk be. Az itt megadott igénypontok körébe tartozó egyéb kiviteli alakok nyilvánvalóak a tudomány e területén képzett szakember számára a jelen találmány itt leírt specifikációinak vagy gyakorlatának szemre vételezése alapján. Szándékunk szerint a specifikációk, a példákkal együtt csak példáknak tekinthetők, a jelen találmány körét és szellemét a példákat követő igénypontok jelölik ki.

Az alábbi példák a jelen találmány előnyős kiviteli alakjait írják te. A megadott igénypontok körébe tartózó egyéb kiviteli alakok nyilvánvalóak a tudomány e területén képzett szakember számára a jelen találmány itt leírt specifikációinak vagy gyakorlatának szemre vételezése alapján. Szándékunk szerint a specifikációk, a példákkal együtt csak példáknak tekinthetők, a jelen találmány körét és szellemét a példákat követő ib.

·*♦ igénypontok jelölik ki, A példákban a százalékokat tömeg alapon adjak meg, hacsak másként nem jelöljük.

Az alábbiakban példákkal szemléltetjük a jelen találmányt.

1. példa

Transzgenikus kukorica mag előállítása és clothlanldinnel való kezelés

A kukorica magokat úgy állítjuk elő a WO 98/31248 vagy a 6,023.913 számú US szabadalmi alkalmazásokban leírt módszert alkalmazva, hogy expresszálják a Sac.7/us thw'ng/ens/s CrySBb. 11231

Ugyanezen hibrid kukorica magjait - a transzgenikus eseménnyel vagy anélkül - clothianidin peszticsddeí kezeljük az alábbiak szerint, A mag kezelő készítményt ügy állítjuk elő, hogy összekeverjük a clothianidin kimért mennyiségét vízzel, mint hordozóval, és a készítményt egy percig szobahőmérsékleten kukorica magok kimért mennyiségével keverjük össze rotosztatíkus mag kezelő készülékben. A peszticid készítmény és a kukorica mag megfelelő mennyiségeit úgy számítjuk ki, hogy a magon a kívánt peszticid kezelési arányt biztosítsa. A peszticidet olyan mennyiségű vízzel keverjük össze, ami elegendő ahhoz, hogy a készítmény az összes magra eloszoljon a töltetben, miközben minimalizáljuk a kezelési készítmény abból adódó veszteségét, hogy a magok nem veszik fel a készítményt. A kezelt magokat letakarás nélkül legalább 4 órán keresztül állni hagyjuk vetés előtt.

2, példa

Á Cry3Bb. 11231 transzgeníkus esemény hatékonyságának meghatározására szolgáló szántóföldi kísérletek kukorica mag esetében eloihianídin mag kezeléssel kombinációban a nyugati és északi kukorica levéíbogár lárvák ellen

A szántóföldi kísérleteket a vonatkozó eljárásoknak megfelelően végezzük el az USDA bejelentési kötelezettségek betartása mellett. A kísérlet célja a CrySBb. 11231 transzgeníkus esemény hatékonyságának meghatározása kukorica mag esetében a clothíanidinf alkalmazó kukorica levélbogár lárvák elleni mag kezeléssekkel kombinációban.

Az egyes kiválasztott termesztési területekhez a tábla tervek a következőket foglalják magukba:

inch 1 sor x 20 láb

vetési sűrűség

Használt hibrid

1,5-2,0 mag/láb, az elhelyezéstől MO17 X Al

Ismétlések Kísérleti terv

Raodomizált telles blokk

Lárva forrás természetes fertőzöttség, amit az 1200 pete/lab (V2 növekedési állapot) kukorica levélbogár petékkel végzett mesterséges fertőzésével biztosítunk.

·* ζο ο

Az egyes tenyész területeken használt mag kezelési kombinációk a

No Kukorica mag

SO

Isohybhd zm_h;1t231

11231

Peszticid és mennyiség (gramm A1/100 kg mag) cfothíanidín @ 100 gm A1/100 kg clcthianidin @ 300 gm A1/1Ö0 kg ctofhianidin @ 400 gm A1/1ÖÖ kg dothianidin @ 100 gm A1/1Ö0 kg dothianidin @ 300 gm A1/1ÖÖ kg a Porcé® 3G @0,15 oz A1/1000 láb sor standard kezeléseként 5”es sávként alkalmazva a talaj felszínén, a vetés Idején

A peszticiddel végzett összes mag kezelést az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre. Az 1-es és 2-es számú kezelést kapó mag nem részesül olyan peszticid kezelésben, amit hatékonynak várnánk a kukorica levélbogár lárvák ellen.

A 3~7~es kezeléseket kapó magokhoz a peszticidet az 1. példában leírt módszer szerint alkalmazzuk. A 8-as számú mag kezelésben a kereskedelemben beszerezhető Fércé® 3G~t alkalmazzuk a talajon, 5”-es sávban, a vetés idején. Az alkalmazás szintjei a bemutatottaknak megfelelő, és a standard kereskedelmi gyakorlathoz javasolt határértékek közötti.

A tesztelendő kukorica magokat az Egyesült Államok kukorica övezetének két közép-nyugati államában, öt különböző területen vetjük el, és termesztjük a fent leírt eljárásnak megfelelően.

* fc •K

A kukorica levélbogár lárvák által okozott károk meghatározását az alábbi eljárás szerint végezzük. A VT-R1 állapotban a kukorica levélbogár lárvák károsításának értékelését az iparban jól ismert módszerekkel végezzük el, és a kukorica levélbogár lárvák károsítását az lowa 1-6 értékelő rendszer szerint jelentjük le. Ebben a rendszerben területenként 10 kukorica gyökér rendszerét emeljük ki, és értékeljük az 1~8~os skálát használva, ahol 1= azt jelenti, hogy nincs sérülés, vagy csak néhány kisebb táplálkozási sebhely látható; 2~ a táplálkozási sérülés egyértelmű, azonban nincsenek 1 % inchig visszarágott gyökerek; 3~ legalább 1 gyökeret lerágtak az 1 14 inch méretnél kisebbre, de sosem károsodik az egész gyökér csomó; 4= egy gyökér csomót 1 % inchnél rövidebbre rágnak; 5= 2 gyökér csomót (kört) 1 % Inchnél rövidebbre rágnak; 6~ 3 csomót (kört) 1 % inchnél rövidebbre rágnak.

.táblázat

A kukorica levélbogár lárvák károsítása izohybrid kukoricában és a csak a CrySBb. 11231 transzgenikus eseménnyel rendelkező kukoricában, valamint az ezzel kombinációban clothlanidines mag kezelést kapó kukoricában 7 termesztési területen az első kísérleti évben

Kezelés	Kukorica levéSbogár lárvák kártétele az egyes lowa osztályokban (lowa 1-8 skála)
1	2	3	4	5	8	A tér. Átlaga
Kezeletlen kontroll	0	0	| 32	74	44	27	: 4,4
CryS.Bb.11231	5	45	109	18	4	1	2,9
Ciötbianídin @ 100 g/100 kg	0	6	45	98	23	5	3,9
Ciötbianídin @ 300 g/1öö kg	0	16	94	80	18	2	3,4
Cloíbianidin @ 400 g/100 kg	1	34	113	37	1	0	3,0 |
; CryS.Bb. 1 '1231 és I Cloíbianidin @ 100 g/100 kg	1	55	88	16	1	0	2,8
Cry3.Bb.11231 és Ciötbianídin @ 300 g/100 kg	2	80	90	16	2	0	2,7
FORCE'® 3G felszíni sáv vetéskor	4	89	88	10	5	5	2,7 :

Az adatok azt mutatják, hogy a transzgenikus esemény és a clothianldín is biztosít némi védelmet a kukorica levélbogár lárvák kártétele ellen. A magasabb (azaz 4-6-os) színtű károsodás esetében a transzgenikus esemény a transzgenikus eseménnyel nem rendelkező kontrolihoz képest 14,5%-os károsodást szenved. Ezért a Cry3Bb. 11231 eseményt úgy értékeljük, hogy az előnyös hatékonysági határértéken belül van,

A clothianldín hatékony a kukorica leyélbogár lárvák kártételével szemben az összes tesztelt szinten, azonban a ctothíanidin hatékonysága az összes szinten kisebb, mint csak a transzgenikus esemény hatékonysága, magéban. A transzgenikus magok clothianidinnel való kezelésének összes kombinációja sokkal hatékonyabb a kukorica levélbogár lárvák kártételével szemben, mint bármely csak peszticides kezelés vagy csak transzgeníkus esemény. A Cry3Bh,11231 300 gm/100 kg mag dőzisú clothianidinnel való kombináció lényegében ugyanolyan védelmet biztosit, mint a vetéskor felszíni sávként 1ÖÖ lábnyi soron 4,25 gm mennyiségben alkalmazott FORCE® 3G kereskedelmi standard kezelésével elért védelem. A transzgenikus mag csupán 100 gm/100 kg clothianidinnel való kombinálása majdnem ugyanilyen szintű védelmet biztosít.

A traszgenlkus magok clothianidinnel végzett jelen kezelésének előnyei közé tartoznak a vetés egyszerűsítése, mivel nincs szükség a peszticld külön alkalmazására. Ezen kívül, a vetés könnyebb és biztonságosabb, mivel a vetést végző személynek nem kell koncentrált peszticiddef dolgoznia.

A dothianidines mag kezelés és a CrySBb.l 1231 transzgenikus eseménnyel rendelkező kukorica mag kombinációkat a lehetséges színergísta hatásra tesztelek a kukorica levélbogár lárvák kártételének három szintjén. .Az első tesztben, amit a 2(a) táblázatban mutatunk be, az 1-6 lowa skálán 3-6 szintű károsodással rendelkező teszt növények

százalékát meghatározzuk a kontrolihoz, valamint a peszticiddel 2 szinten kezelt magokhoz, valamint a csak a transzgenikus eseménnyel rendelkező, illetve a kombinált kezelésben részesült magokhoz képest.

Ezután a következő képletet használjuk a „szinergista küszöb” (a kontroll Cry38b.11231 %-a)*(a kontroll cfothianidin kezelés %-aj/1ŐÖ.

Ezt a küszöbértéket a kezelési kombinációk kontrolljának százalékához hasonlítjuk (azaz Cry3Bb.11231 ciotbianidin @ 10Ö gm/100 kg kezeléssel és Cry3Bb. 11231 ciotbianidin @ 300 gm/'1ÖO kg kezeléssel). Ha a kontroll kezelési kombináció százaléka a küszöb alatt van, akkor azt a következtetést vonjuk le, hogy szinergizmus van. Ha a kontroll kezelési kombináció százaléka a küszöb felett van, akkor azt a következtetést vonjuk le, hogy a szinergizmust nem tudtuk demonstrálni az adott kombinációhoz. Ezt a számítást megismételjük a 4-6 és az 5-6 károsodási szintekhez is, és a számítások eredményeit a 2(b) és 2(c) táblázatokban mutatjuk be.

Úgy véljük, hogy a kukorica levélbogár lárvák kártételének mérése a magasabb károsodási szinteken (azaz 3-6, 4-6 és 5-6 szinteken) használható jelzés, mely korrelációban áll a későbbi, ilyen kárból származó termés veszteséggel. Ennek oka az, hogy az 1-es és 2-es szintű kukorica levélbogár lárva kártétel ritkán okozza a kukorica eldőlését és ügy véljük, az ilyen minimális gyökér veszteség nem csökkenti a csövenként! magok számát vagy tömegét. Azonban a 3-as és e fölötti szinteken a gyökér károsodás fokozott mértékben okozza a növény eldőlését. Ezért úgy véljük, hogy a 3-6, 4-6 és 6-ös és 6-os összegzett károsodási szintjei hasznos jelzői a kukorica levélbogár lárva kártétel későbbi kukorica hozamra kifejtett hatásának.

(a) táblázat

A mag kezelés hatékonysága a csak clothianidinneí végzett kezelés két szintjén, és kukorica Cry3Sh, 11231 transzgenikus eseménnyel rendelkező maggat való kombinációban a kukorica tevélbogár lárva 1-6os Iowa skála szerinti 3-6-os károsodást szintjeivel szemben

| Kezelés	3-6 károsodást szinttel rendelkező növények %-a	Á kontroll %-a	Küszöb szí nerg izmus
Kezeletlen kontroll	100	100
Cry3BbJ1231	72,2	72,2	-
Clotbianídin @ 100 gm/100 kg	96,6	96,6
Ctothianidm @ 3ÖÖ gm/100 kg	91,5	91,5
Cry38b. 11231 + ; Clotbianídin @ 100 gm/100 kg	65,2	65,2	69,8
CrySBb. 11231 + Ciöthíanidin @ 300 gm/100 kg	56,8	56,8	66,1

2{b) táblázat

A mag kezelés hatékonysága a csak clotrilanldinnel végzett kezelés két színijén, és kukorica CrySBb. 11231 transzgenikus eseménnyel rendelkező maggal való kombinációban a kukorica levéibogár lárva 1-6os lowa skála szerinti 4-8-os károsodás! szintjeivel szemben

Kezelés

11231 Clothianldin @ I 100gm/1ÖÖkg

Kezeletlen .11231 + | ci | lOOgm/lOOkg (“Cry3BbJl23l”+' j Clothianldin @ ^9

4~6 károsodási	A kontroli %~a	Küszöb
szinttel		szinergizmus
rendelkező
növények %~a
81,9	100	i
11,7	14,24
71,2	86,9
41,5 |	50,65	~ t I )
10,6 ΐ 12,9	12,4
9,5 j 11,6	7,2 I i

V * «>

zeies szintjén, és kukorica Cry38b,1 rendelkező maggal való kombinációban es lowa skála szerinti 5-8-os 5-8 károsodást szintiét rendelkező növények %-a

Kezelés ciothianidtnnel való kezelés két transzgenikus eseménnyel a kukorica levélbogár lárva 1 -8károsodási szintjeivel szemben

0/ /0*3

Küszöb szinergizmus

Kezeletlen

Cry3Bb.11231 CSothianidin @ 100 gm/100 kg

......................7ΪΪ234 + ín @

100 gm/100 kg .11231 + j Clothlanidin @ 300 gm/100 kg

Ez az elemzés azt jelzi, hogy a kukorica Cry3Bb. 11231 transzgenikus esemény és a clothianidlnnel végzett mag kezelés kombinációja akár 100 gm/100 kg, akár 300 gm/100 kg dózisokban szinergísta, és nem várt módon hatékony a kukorica levélbogár lárvák kártételével szemben a 3-6 szinteken. A 4-8-os károsításí szinten a clothlanidin egyik dózisa sem mutat szinergizmust a transzgenikus· eseménnyel való kombinációban, bár az alacsony szintű clotbianidín kezeléssel (160 gm/100 kg mag) való kombináció olyan védelmi szintet mutat, ami megközelíti azt, ami a szinerqizmushoz szükséges. Az 5~6~os kárositasi szinten, az alacsonyabb dózisé (100 gm/100 kg mag) ciofhianidin kezeíés és a Cry3Bh. 11231 esemény kombinációja szinergizmust jelez, míg a magasabb dózisé clothianidln kezeíés nem mutat szinergizmust. Azonban, a károsodás az 5~6 szinten nagyon alacsony bármely tesztelt kombinációban, és sokkal alacsonyabb, mint a hagyományos felszíni sávos kijuttatással kezelt nem transzgenikus kukorica esetében (körülbelül 5,6% károsodásé 5-6~os szinten).

Ennek megfelelően, azt a következtetést vontok le, hogy a transzgenikus esemény ctothianidb.es mag kezeléssel való kombinációja szignifikáns előnyöket biztosít bármelyik magában alkalmazott módszerhez képest, valamint azt, hogy az ilyen védelem nem várt módon hatékonyabb a kukorica levélbogár lárvák által okozott komoly károk ellen.

A találmányban tárgyait hivatkozások csupán a szerzők állításainak összefoglalására szolgálnak, és nem Ismerjük ei, hogy bármely hivatkozás elsőbbséget jelezne. A leírók fenntartják azt a jogot, hogy kétségbe vonják az idézett hivatkozások pontosságát és helytállóságát.

A fentiek fényében, látható, hogy a jelen találmány számos előnyét elérjük, és egyéb előnyös eredményeket is megvalósítunk.

Miután számos változtatást lehet végrehajtani a fenti módszerekben és összetételekben a jelen találmány körétől való eltérés nélkül, szándékunk szerint a fenti leírásban szereplő összes esetet illusztrációként és nem korlátozó értelemben kell figyelembe venni.

Claims (31)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Transzgenikus kukorica egy vagy több kártevő táplálkozási kártételével szembeni védelmére szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy annak során

   - olyan transzgenikus kukorica magot, állítunk elő, amely mag egy transzgenikus eseménnyel rendelkezik, amely az említett egy vagy több kártevő legalább valamelyikével szemben aktivitást matat; és

   - a magot körülbelül lő - körülbelül 2000 g/100 kg mag mennyiségű cfothianidinnd kezeljük.
2. 2. .Az L igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény egy Ínszekticld protein expressziójának képességét foglalja magában.
3. 3. Az L igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény a Cry protein expressziójának képességét foglalja magában.
4. 4. A 3. Igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény a Cry 3 protein expressziőjának képességét foglalja magában.
5. 5. A 4. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény a Cry3* protein expressziőjának képességét foglalja magában.
6. 6. Az 5, igénypont szerinti mód-szer azzal jellemezve, hogy a Cry3* protein a Cry 3B* proteint jelenti.
7. 7. A 6. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Cry 3R* protein a

   Cry3Bb.ll23ü-at, vagy a Cry3Bb,11231-et, vagy a CrySBb.I 1232-Ót, vagy a CrySBb.I 1233-at, vagy a CryoBbJ 1234-ei. vagy a CrySBb.I 1235-öt, vagy a CrySBb, 11236-ot, vagy a Cry3.Bb,11237-et, vagy a CrySBbJ I.238-at vagy a CrySBb, 11239-et, vagy a C.rv3Bb, II241-et, vagy a CryoBb.l 1242-ör, vagy a

   CryaBb. 11098-at jelenti.

   *4 .· *
8. 8. A 7. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Cry 3B·* protein a Cry3Bh.f 1231 -et jelenti.
9. 9. A 7, igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Cry 3B* protein Cry5 Bh. 11098-at jelenti.
10. 10. Á 4. Igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény képes csökkenteni a kukorica bvéíbogár lárvák által okozott kárt oly módon, hogy a transzgenikus kukorica károsodása a nem transzgenikus kukorica ugyanolyan körülmények közötti károsodásának körülbelül 5% - körülbelül 50%-a közötti határok közé esik, ha. az Ilyen károsodást az lowa Kukorica Roottvonn 1-6 skála, alapján mért 4-6 értéket kapó növények százalékaként fejezzük, ki.
11. 11. Á 1Ö. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény képes csökkenteni a kukorica levélbogár lárvák által okozott kárt oly módon, hogy a transzgenikus kukorica károsodása a nem transzgenikus kukorica ugyanolyan körülmények közötti károsodásának, körülbelül 10% -- körülbelül 40%-a közötti határok közé esik, ha az ilyen károsodást az lowa Corn Rootworm 1-6 skála alapján mért 4~6 értéket kapó növények százalékaként fejezzük ki.
12. 12. A 11. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény képes csökkenteni a kukorica levélbogár lárvák által okozott kárt oly módon, hogy a transzgenikus kukorica károsodása a nem transzgenikus kukorica ugyanolyan körülmények közötti károsodásának körülbelül 15% ··- körülbelül 39%-a közötti határok közé esik, ha az ilyen károsodást az lowa Kukorica Rooíworm 1-6 skála alapján mért 4-6 értéket kapó növények százalékaként fejezzük kí
13. 13. Á. 11.. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény képes csökkenteni a kukorica levél bogár lárvák álta l okozott kárt oly módon, hogy a transzgenikus kukorica károsodása a nem transzgenikus kukorica ugyanolyan körülmények közötti károsodásának körülbelül 20% ·· körülbelül 30%-a közötti határok közé esik, ha az ilyen károsodást az tova Kukorica Roohvotni 1-6 skála alapján mért 4-6 értékei kapó növények százalékaként fejezzük ki.
14. 14. A 4. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Cry 3 protein expresszálására képes mag a Cry 3 proteintől eltérő legalább egy másik inszekticid protein expresszi-ójára is képes.
15. 15. A 4. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Cry 3 protein expressziójára képes mag olyan transzgeníkus eseménnyel is rendelkezik, mely herbíeid toleranciát biztosit
16. 16. A 15. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgeníkus esemény a glifozattal szembeni herbícid toleranciát biztosít.
17. 17. A 4. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a transzgeníkus esemény egy rovar elleni aktivitással rendelkezik.
18. 18. A 17. Igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a rovar a Lepídoptera, Coleoptera és Hemiptera rendek tagjait jelentik.
19. 19. A 18. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a rovar Coleoptera rovart jelent.
20. 20. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a rovar egy í&ővA;? tájt jelent.
21. 21. A 2(h igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a rovar a Diührotica virgifara, vagy a Drimrorico berbert vagy a Dütbrotica undecimpunctate legalább egy faját jelenti.
22. 22. Az L igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a clothianidin mennyisége legalább körülbelül 70 g - körülbelül 1000 g/löö kg mag.
23. 23. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a cktthiamdin mennyisége legalább körülbelül löü g- körülbelül 600 g/100 kg mag.
24. 24. Az L igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a clothianidin mennyisége legalább körülbelül 200 g - körülbelül. 5ÖÖ g/l00 kg mag.
25. 25. Transzgeníkus kukorica mag azzal jellemezve, hogy egy vagy több kártevő táplálkozási kártételével szembeni fokozott rezisztenciát biztosit a magból kikelő növénynek, ahol az említett mag olyan transzgeníkus eseménnyel rendelkezik, amely az említett egy vagy több kártevő legalább valamelyikével szemben aktivitást mutat, és ahol a magot körülbelül IÖ - körülbelül 2000 g/100 kg mag mennyiségű cíotfúanidiratéi kezeljük.
26. 26. A 25. Igény pont szerinti mag azzal jellemezve, hogy a transzgeníkus esemény egy oly an gént jelent, ami egy inszektleld proteint kódo t
27. 27. A 26, igénypont szerinti mag azzal jellemezve, hogy a. transzgeníkus esemény olyan gént jelent, ami egy Cry proteint, kódol.
28. 28. A 27, igénypont szerinti mag azzal jellemezve, hogy a transzgeníkus esemény olyan gént jelent, mely a Bod/At? AtnAng/mtrA-böl származó Cry3 proteint kódolja.
29. 29. A 28. igénypont szerinti mag azzal jellemezve, hogy a transzgeníkus esemény egy olyan gént kódol, mely a Baei/Jus /óarmg/em-/.?~bői származó €ry3Bh proteint kódolja.

    * ’ V
30. 30. A 29. igénypont szerinti mag azzal jellemezve, hogy a transzgenikus esemény egy olyan gént ködői, mely a Baei/Bs //?.«-ringiem'Z5-ből származó €ry3Bh.11230; vagy CryoBb.l 1231, vagy Cry3Bb,l 1232, vagy Cry3Bb.i 1233, vagy Cry3Bb.li234, vagy Cry3Bb.l 1235, vagy CryaBb.í1236, vagy Cry3Bb. 11237, vagy CryoBb. 11238, vagy Cry3Bb..l 1239, vagy Cry3Bb. 11241. vagy CrySRh.l 1242, vagy CryaBb. 11098 proteint kódolja.
31. 31. A 25 . igénypont szerinti mag azzal jellemezve, hogy a clothianidin menynyisége körülbelül 200 g ··· körülbelül 500 g/í 00 kg mag.