PT1322164E - Tratamento de sementes de milho transgénico com clotianidina - Google Patents

Description

ΡΕ1322164 1 DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DE SEMENTES DE MILHO TRANSGÉNICO COM CLOTIANIDINA" (1) Âmbito da Invenção: A presente invenção relaciona-se em geral com o controlo de pragas que causam danos às plantas de milho enquanto se alimentam, e mais particularmente com o controlo dessas pragas da planta de milho com a combinação de uma semente de milho que sofreu uma modificação transgénica e o tratamento da referida semente com o pesticida clo-tianidina antes de se semear a semente. (2) Descrição da Técnica Relacionada

Estima-se que insectos e artrópodes relacionados destroem anualmente 15 % das culturas agrícolas nos Estados Unidos e ainda mais do que isso nos países em desenvolvimento. Adicionalmente, infestantes competitivas e plantas saprófitas e parasíticas são ainda responsáveis por mais potenciais perdas de produção.

Alguns destes danos ocorrem no solo quando agentes fitopatogénicos, insectos e outras pragas do solo atacam a semente depois de semeada. Na produção de milho, a 2 ΡΕ1322164 maioria dos restantes danos é causada por vermes da raiz -pragas de insectos enquanto se alimentam ou danificam as raízes; e por roscas, brocas do milho Europeias e outras pragas que se alimentam ou danificam as partes subterrâneas da planta. Descrições gerais de tipos de pragas e seus mecanismos de ataque nas culturas agrícolas são fornecidas, por exemplo, por Metcalf, em Destructive and Useful

Insects, (1962); e Agrios, em Plant Pathology, 3a Ed.,

Academic Press (1988). 0 milho é a cultura de grão mais importante na região central/ocidental dos Estados Unidos. Entre as mais importantes pragas de insectos do milho nesta região está a forma larvar de três espécies de escaravelho Diabrotica. Estas incluem a larva das raízes do milho do Ocidente, Diabrotica vergifera vergifera LeConte, a larva das raízes do milho do Norte, Diabrotica berberi Smith e Diabrotica berberi Lawrence e a larva das raízes do milho do Sul, Diabrotica undecimpunctata howardi Barber. De facto, usa-se mais insecticida para o controlo das larvas da raiz do milho do que para qualquer outra praga do milho e a quantidade total de acres tratados é maior do que para qualquer outra praga nos Estados Unidos.

As larvas da raiz do milho (CRW) passam o Inverno no estádio de ovo nos terrenos onde se produziu milho na época anterior. Os ovos eclodem desde o fim de Maio até Junho. Se a cultura de milho não for substituída por outra cultura de milho no ano seguinte, as larvas morrem. Deste 3 ΡΕ1322164 modo, o impacto das larvas da raiz do milho afectam mais directamente áreas em que as culturas de milho são sistematicamente seguidas por outras culturas de milho, como é típico em muitas áreas do Centro/Ocidente dos Estados Unidos.

Depois da eclosão, as larvas passam por três estádios larvares ou instares, durante os quais se alimentam do sistema radicular do milho. São necessárias cerca de três semanas para terminar a fase larvar. As lesões no sistema radicular do milho causadas pelas larvas enquanto se alimentam são a maior causa de perdas na colheita de milho provocadas pelas larvas da raiz do milho. As plantas de milho que tombam e acamam no solo devido ao enfraquecimento ou destruição de maior parte do sistema radicular são a causa da maioria das perdas, dado que este milho caído no solo não pode ser colhido pelas máquinas mecânicas convencionais ficando no terreno.

Depois de terminar o desenvolvimento larvar, as larvas transformam-se em pupas imóveis, e subsequentemente em escaravelhos adultos que emergem do solo durante o Verão, e com o período de emergência dependente do local de crescimento. Após emergência, os escaravelhos adultos alimentam-se durante cerca de duas semanas antes de as fêmeas começarem a pôr ovos. No início, os adultos alimentam-se predominantemente nos mesmos campos onde emergiram, mas mais tarde migram para outros campos. 0 pico de actividade dos adultos ocorre normalmente na "Faixa do 4 ΡΕ1322164 milho" dos E.U.A. no final de Julho, principio de Agosto, em campos plantados para produção continua de milho, mas o pico de actividade pode verificar-se mais tarde em campos de milho semeados pelo primeiro ano ou de maturação tardia. Os escaravelhos começam a depositar ovos nos campos de milho aproximadamente duas semanas após a emergência. (Para mais informações, ver, e.g., Com Rootworms, Field Crops Pest Management Circular #16, Ohio Pest Management & Survey Program, The Ohio State University, Extension Division, Columbus, OH; disponível online em www.ag.ohio-state-edu/~ohioline/icm-fact/fc-16.html, 13 de Setembro, 2000; e McGahen et al. , Corn Insect Control: Com Rootworm, PENpages número 08801502, Ficha de Informação disponível na Pennsylvania State University, State College, PA, 1989).

Na actual prática agrícola convencional, nos casos em que se planta milho a seguir a milho, é normal aplicar-se um insecticida para proteger o sistema radicular do milho dos danos graves da alimentação das larvas se raiz do milho. A prática habitual é tratar os escaravelhos adultos ou tratar as larvas. Exemplos de formulações de tratamento convencionais para escaravelhos adultos incluem a aplicação de insecticidas carbarilo (e.g., SEVIN® 80S a 1,0-2,0 lbs de componente activo/acre); fenvalerato ou esf envalerato (e.g., PYDRIN® 2,4EC a 0,1 até 0,2 lbs de componente activo/acre, ou ASANA® 0,66EC a 0,03 até 0,05 lbs de componente activo/acre); malatião (57% E a 0,9 lbs de componente activo/acre); permetrina (e.g., AMBUSH® 2,0EC a 0,1 até 0,2 lbs de componente activo/acre, ou 5 ΡΕ1322164 POUNCE® 3,2EC a 0,1 até 0,2 lbs de componente acti-vo/acre); ou PENNCAP-M® a 0,25-0,5 lbs de componente acti-vo/acre.

Para tratar larvas CRW, a prática convencional consiste em aplicar insecticida ao solo aquando da plantação e após a sementeira, mas preferencialmente o mais próximo possível da eclosão dos ovos. Tratamentos convencionais incluem insecticidas carbofurão (e.g., FURADAN® 15G a 8oz/1000 pés de fila de sementeira) ; clorpirifos (e.g., LORSBAN® 15G a 8 oz/1000 pés de fila de sementeira); fonofos (e.g., DYFONATE® 20G a 4,5 até 6,0 oz/1000 pés de fila de sementeira); forato (e.g., THIMET® 20G a 6 oz/1000 pés de fila de sementeira), ou teflutrina (e.g., FORCE® 3G a 4 até 5 oz/1000 pés de fila de sementeira).

Muitos dos pesticidas químicos listados acima são conhecidos por serem prejudiciais para seres humanos e para animais em geral. Os danos ambientais causados por estes pesticidas são muitas vezes exacerbados devido à prática da aplicação dos pesticidas por pulverização foliar ou por aplicação directa na superfície do solo. O arrastamento pelo vento, a lixiviação e o escoamento das águas podem causar a migração de uma grande fracção do pesticida para fora da zona onde a actividade é desejada, para as águas superficiais e contacto directo com aves, animais e seres humanos. 6 ΡΕ1322164

Devido à preocupação com o impacto dos pesticidas químicos na saúde pública e na qualidade do ambiente, têm sido feitos esforços significativos para se encontrarem meios de reduzir a quantidade de pesticidas químicos que são usados. Recentemente, muito deste esforço tem incidido no desenvolvimento de culturas transgénicas manipuladas de modo a expressarem tóxicos derivados de microorganismos contra insectos. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5.877.012 em relação a Estruch et al. revela a clonagem e expressão de proteínas de organismos como Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter e Rhizobium em plantas para obter plantas transgénicas com resistência a essas pragas como as roscas pretas (Agrotis), as Leucania unipuncta conhecidas como "armyworms", várias brocas do milho e outras pragas de insectos. A publicação WO/EP97/07089 por Privalle et al. ensina que a transformação de monocotiledóneas, como o milho, com uma sequência de DNA recombinante que codifica peroxidase para a protecção da planta evitando que as brocas do milho, lagartas da espiga do milho e roscas se alimentem. Jansens et al., em Crop Sei., 37(5): 1616-1624 (1997), descreveu a produção de milho transgénico contendo um gene que codifica uma proteína cristalina do Bacillus thuringiensis (Bt), que controlava também as duas gerações de brocas do milho Europeias. As Patentes U.S. N° 5.625.136 e 5.859.336 em relação a Koziel et al. descreveram que a transformação do milho com um gene do B. thuringiensis que codifica para delta-endotoxinas atribuiu ao milho transgénico resistência melhorada à broca Europeia do milho. Um relatório completo de ensaios de campo com milho trans- 7 ΡΕ1322164 génico que expressa a proteína insecticida do B. thurin-giensis foi publicado por Armstrong et al., na Crop Science, 35 (2): 550 - 557 (1995).

Sabia-se que as δ-endotoxinas Bt do tipo selvagem tinham baixa actividade contra insectos do tipo coleóptero, e Kreig et al., em 1983, relataram o primeiro isolamento de uma estirpe de B. thuringiensis tóxica para coleópteros. (Ver a Patente U.S. N° 4.766.203). As Patentes U.S. N°s 4.797.279 e 4.910.016 também divulgam estirpes de B. thuringiensis híbrido e do tipo selvagem que produzem proteínas com alguma actividade contra coleópteros. Mais recentemente, no entanto, métodos mais precisos de manipulação transgénica mostraram-se promissores no desenvolvimento de proteínas de B. thuringiensis modificadas que têm níveis de actividade contra larvas da raiz do milho significativamente mais elevados que os produzidos pelos progenitores do tipo selvagem. (Ver, e.g., a WO 99/31248 em relação a Ecogen, Inc. e Monsanto Company).

No entanto, não se conhece presentemente se um único processo transgénico é suficientemente eficaz para proteger o milho dos danos causados por larvas da raiz do milho em terrenos altamente infestados, que estavam dedicados à produção de milho em série. De facto, o controlo total dos danos causados por larvas da raiz do milho conseguido com qualquer um dos processos transgénicos pode não ser desejado a longo prazo, devido ao potencial para o desenvolvimento de estirpes resistentes da praga-alvo. 8 ΡΕ1322164

Outra alternativa às formas convencionais de aplicação de pesticidas é o tratamento das sementes de plantas com pesticidas. 0 uso de fungicidas para protecção de sementes contra o ataque após plantação, e a aplicação de baixos níveis de insecticidas para protecção de, por exemplo, semente de milho contra o verme amarelo, tem sido usado há algum tempo. 0 tratamento de semente com pesticidas tem a vantagem de proporcionar protecção das sementes minimizando a quantidade de pesticida necessário e limitando o contacto com o pesticida e o número de campos de aplicação diferentes necessários.

Outros exemplos do controlo de pragas através da aplicação de insecticidas directamente às sementes das plantas são fornecidas, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.696.144, a qual descreve que a broca do milho quando se alimenta causa menos danos às plantas provenientes de semente tratada com um composto 1-arilpirazole, a uma taxa de 500 g por quintal de semente, do que às plantas de controlo provenientes de semente não tratada. Adicionalmente, a Patente U.S. N°. 5.876.739 de Tumblad et al. (e a sua parente, Pantente U.S. N°. 5.849.320) descrevem um método para controlar insectos do solo o qual envolve o tratamento das sementes com um revestimento contendo um ou mais aglomerantes poliméricos e um insecticida. Esta referência fornece uma lista de insecticidas identificados como potenciais para uso neste tratamento de revestimento e também refere vários insectos alvo potenciais. Porém, 9 ΡΕ1322164 enquanto que a patente 5.876.739 estabelece que o tratamento de semente de milho com um revestimento contendo um determinado insecticida protege as sementes do milho dos prejuízos causados pela lagarta da raiz do milho, não indica nem mesmo sugere que esse tratamento pode ser usado com semente com uma modificação genética.

Mencionou-se o tratamento da semente contendo uma modificação genética com compostos pesticidas nitroimino-ou nitroguanidina (Ver, e.g., a WO 99/35913), porém, não se encontrou qualquer orientação quanto à potencial utilidade ou eficácia desses tratamentos, ou os pormenores de como esses tratamentos devem ser efectuados - tais como as quantidades de componente activo necessárias por unidade de quantidade de semente - nem exemplos que permitam acreditar que os tratamentos propostos podem agora fornecer protecção adequada.

Por isso, apesar dos recentes avanços em engenharia transgénica das plantas terem possibilitado a protecção de plantas das pragas sem usar pesticidas químicos, e dado que as referidas técnicas, tal como o tratamento de sementes com pesticidas, reduzem os efeitos prejudiciais dos pesticidas no ambiente, persistem vários problemas que limitam a aplicação com sucesso destes métodos, nas condições reais de campo. Assim, seria útil fornecer um método melhorado para proteger as plantas, especialmente as plantas de milho, dos danos causados pelas pragas enquanto se alimentam. Seria particularmente útil se 10 ΡΕ1322164 esse método reduzisse a taxa de aplicação requerida para pesticidas químicos convencionais, e também se pudesse limitar o número de cada uma das operações de campo requeridas para a plantação e cultivo das culturas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em resumo, portanto, a presente invenção é dirigida para um novo método para proteger uma planta de milho transgénico contra os danos causados por uma ou mais pragas enquanto se alimentam, em que o método compreenda a obtenção de semente da planta de milho transgénico e que a semente contenha uma modificação genética que lhe confira actividade contra pelo menos uma ou mais pragas; e tratar a semente com uma quantidade eficaz de pesticida clotia-nidina. A presente invenção é também dirigida para uma nova semente de milho transgénico tratada fornecendo uma semente para a planta de milho transgénico e que a referida semente compreenda uma modificação genética com actividade contra pelo menos uma ou mais pragas, e tratar a semente com uma quantidade eficaz de pesticida clotianidina. A presente invenção é também dirigida para uma nova semente de uma planta de milho transgénico que confere uma resistência melhorada à planta de milho resultante contra os danos causados por uma ou mais pragas que delas se alimentam, compreendendo uma modificação genética que 11 ΡΕ1322164 tenha actividade contra pelo menos uma ou mais pragas, e que a referida semente tenha sido tratada com uma quantidade eficaz de pesticida clotianidina.

Assim, entre as muitas vantagens que se verificou serem alcançadas pela presente invenção, pode realçar-se o fornecimento de um método para protecção de plantas, especialmente plantas de milho, contra danos causados pelas pragas que delas se alimentam; o fornecimento de um método que possa reduzir a taxa de aplicação requerida em pesticidas químicos convencionais; e o fornecimento de um método que possa limitar o número de cada uma das operações de campo requeridas para a plantação e cultivo de culturas.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, verificou-se que as plantas de milho podem ser protegidas contra os danos causados por uma ou mais pragas quando delas se alimentam, através de um método que inclui o fornecimento de uma semente de milho que contenha uma modificação genética que tenha actividade contra pelo menos uma das pragas e seguidamente tratar a semente de milho transgénico com uma quantidade eficaz de pesticida clotianidina. Nos modos de realização preferidos desta invenção, verificou-se que a combinação de uma modificação genética que tenha actividade contra a lagarta da raiz do milho e o tratamento da semente com clotianidina proporciona vantagens sinergis-tas inesperadas às sementes que tenham esse tratamento, 12 ΡΕ1322164 incluindo uma eficácia inesperadamente superior para pro-tecção contra os danos causados pela lagarta da raiz do milho na planta de milho resultante. Em especial, verificou-se que a combinação da presente invenção era inesperadamente superior em relação quer apenas à modificação genética, quer ao tratamento da semente apenas com clotianidi-na, na protecção das plantas de milho contra danos de níveis mais severos causados pela lagarta da raiz do milho -grau de danos que se sabe que reduzem a produção de milho.

Conhecem-se sementes e plantas de milho que foram modificadas de modo a incluir genes exógenos derivados do

Bacillus thuringiensis que codificam a expressão de δ- endotoxinas Cry3 que têm actividade contra pragas de Coleópteros, assim como se conhecem métodos para o trata- mento de sementes (mesmo de algumas sementes transgénicas) com pesticidas. No entanto, não se tinha percebido até à presente invenção que certas quantidades eficazes de pesticida clotianidina podem ser usados para tratar sementes de milho com as referidas modificações Cry3, resultando daí que a combinação possa ser eficaz e, de preferência, inesperadamente superior, no aumento da eficácia tanto do pesticida como da modificação genética, e possa fornecer vantagens adicionais de aumentar a capacidade de igualar a actividade pesticida contra a pressão das pragas, diminuindo o custo do tratamento e/ou da aplicação, aumentando a segurança de manipulação das sementes, e diminuindo o impacto ambiental da modificação, do pesticida ou de ambos. 13 ΡΕ1322164

Em particular, verificou-se, nos modos de realização preferidos, que o tratamento de sementes de milho transgénico, capazes de expressar certas proteínas modificadas Cry3Bb com desde cerca de 100 g até cerca de 400 g de clotianidina por 100 kg de sementes, proporcionou uma protecção inesperadamente superior contra a lagarta da raiz do milho. Adicionalmente, acredita-se que a referida combinação também é eficaz na protecção das plantas de milho emergentes contra os danos causados pelas roscas pretas. Acredita-se também que as sementes da presente invenção têm a propriedade de diminuir os custos do uso do pesticidas, dado que pode usar-se menos quantidade de pesticida para obter a protecção desejada do que quando não é usado este método inovador. Além do mais, como se usa menos pesticida e porque este é aplicado antes da sementeira e sem outra aplicação no campo, acredita-se que o método exposto é, portanto, mais seguro para o operador e para o ambiente, e é potencialmente menos caro que os métodos convencionais.

Quando se diz que alguns efeitos são "sinergis-tas", deve entender-se que incluem os efeitos sinérgicos da combinação da actividade do pesticida (ou eficácia) e da combinação da modificação genética e do pesticida. No entanto, não se pretende que os referidos efeitos sinérgicos se limitem à actividade pesticida, mas que incluam também as vantagens inesperadas de espectro de actividade aumentado, perfil de actividade vantajoso em relação ao 14 ΡΕ1322164 tipo e à redução da quantidade de danos, diminuição dos custos com o pesticida e a aplicação, diminuição da quantidade do pesticida distribuída no ambiente, diminuição da exposição ao pesticida do pessoal que produz, manuseia e semeia as sementes de milho, e outras vantagens conhecidas dos especialistas na técnica. A presente invenção apresenta também a vantagem de aumentar a capacidade de atingir a actividade pesticida para a combater a intensidade das pragas. Isto refere-se à capacidade de conceber a combinação da modificação genética e do tratamento com pesticida de modo a que seja fornecida à semente ou à planta resultante uma actividade pesticida eficaz durante o período em que a intensidade de alimentação da praga-alvo sobre a semente ou a planta dela derivada atinja o seu máximo. A título de exemplo, quando se aplica clotianidina a uma semente de milho que tenha uma modificação genética contra a lagarta da raiz do milho, o pesticida pode ser aplicado na forma de um revestimento concebido para proporcionar uma libertação controlada de clotianidina. A taxa de libertação pode ser seleccionada de modo a que a clotianidina proporcione protecção contra outras pragas como, por exemplo, a rosca preta, no estádio de pós-emergência do milho, enquanto que a modificação genética fornece protecção contra a lagarta da raiz do milho numa fase mais tardia do desenvolvimento da planta -quando essa protecção é necessária.

Conforme aqui usado, os termos "efeito pesticida" e 15 ΡΕ1322164 "actividade pesticida", ou "actividade" referem-se a um efeito tóxico contra a praga. Os termos "actividade contra (uma ou mais) pragas", tem também o mesmo significado. Quando se diz que a semente ou a planta está "protegida contra os danos causados por uma ou mais pragas enquanto estas se alimentam", significa que a referida semente ou planta possui uma caracteristica que tem acção directa ou indirecta sobre uma ou mais pragas, resultando numa diminuição dos danos causados quando a praga ou as pragas enquanto se alimentam das sementes, raízes, rebentos e folhagem das plantas contendo essa caracteristica, do que quando comparados com os danos causados pelas pragas, sob as mesmas condições, quando se alimentam das plantas que não têm essa caracteristica. Essas acções directas ou indirectas incluem induzir a morte da praga, afugentar a praga para longe das sementes, raízes, rebentos e/ou folhagem das plantas, inibir as pragas de se alimentem, ou de depositarem os seus ovos, nas sementes, raízes, rebentos e/ou folhagem das plantas, e inibir ou evitar a reprodução da praga. 0 termo "actividade insecticida" tem o mesmo significado de actividade pesticida, excepto o facto de estar limitada aos casos em que a praga é um insecto.

Tirando os casos em que é especificamente referido, quando o termo "pesticida" é aqui usado, esse termo refere-se a um pesticida químico que é fornecido externamente à semente, e não se pretende que inclua agentes activos produzidos pela semente específica ou pela planta que se desenvolve a partir da semente específica. No entanto, os termos 16 ΡΕ1322164 "actividade pesticida" e "actividade insecticida" podem ser usados em relação à actividade de um pesticida fornecido externamente e/ou de um agente que é produzido pela semente ou pela planta, ou a ambos.

Uma particularidade da presente invenção é a semente de uma planta de milho transgénico. Conforme aqui usado, os termos "planta de milho transgénico" significa uma planta de milho ou a descendência derivada de um protoplasma ou de uma célula de planta de milho transformada, em que o DNA da planta contém uma molécula de DNA exógeno introduzido, que não estava presente originalmente na planta nativa da mesma estirpe não-transgénica. A semente de milho transgénico é uma semente que contém um gene exógeno que codifica uma proteína pesticida. Proteínas pesticidas deste tipo são descritas por Schnepf et al., em Microbiology & Molecular Biology Reviews, 62:775-806 (1998), e por French-Constant e Bowen, em CMSL Cell. Mol. Life Sei., 57:828-833 (2000). Numa aplicação da invenção, a proteína pesticida é uma proteína insecticida. É preferido que a semente contenha um gene exógeno derivado de uma estirpe de Bacillus thuringiensis, e em particular, é preferido que o gene exógeno seja um que codifique uma δ-endotoxina insecticida derivada de B. thuringiensis. As referidas δ-endotoxinas estão descritas em WO 99/31248 e na Patente U.S. N° . 6.063.597 e incluem as toxinas Cry3. Os segmentos de ácido nucleico que codificam proteínas cristalinas de B. thuringiensis modificadas, tó- 17 ΡΕ1322164 xicas para coleópteros que são úteis na presente invenção estão descritas na Patente U.S. N°. 6.060.594 e plantas transgénicas resistentes a insectos que incluem sequências de ácidos nucleicos que codificam as referidas proteínas in-secticidas estão discutidas na Patente U.S. N°. 6.023.013. É preferido que as δ-endotoxinas da presente invenção incluam as proteínas Cry3B, e é ainda mais preferido que as δ-endotoxinas incluam as proteínas Cry3Bb com actividade contra coleópteros. A nomenclatura das proteínas cristalinas insecticidas do B. thuringiensis foi dada a conhecer por Hõfte e Whitely, Microbiol. Rev., 53:242-255, 1989. Esta nomenclatura foi revista, e a nomenclatura revista pode ser encontrada em http://epunix.biols.susx.ac.uk(Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html. A nomenclatura revista será aqui usada para descrever as características da modificação genética e as proteínas δ-endotoxinas codificadas pela modificação genética.

Quando os termos "modificação genética" são aqui usados, esses termos devem referir-se ao DNA geneticamente modificado acima descrito, mas também incluem as proteína (s) que são codificadas pelo gene modificado. Portanto, uma modificação genética numa semente de milho, ou numa planta de milho, inclui a capacidade de expressar uma proteína. Quando se diz que uma "modificação genética tem actividade contra uma praga", deve ser entendido que é uma proteína que é codificada por um gene que tem na realidade essa actividade quando a proteína é expressada e entra em contacto com a praga. 18 ΡΕ1322164 WO 99/31248 e a Patente U.S. N°. 6.063.597 descrevem métodos para os genes de δ-endotoxinas de B. thu-ringiensis geneticamente modificados de modo a que possam ser expressadas as δ-endotoxinas modificadas. As δ-endo-toxinas modificadas diferem das proteínas de tipo selvagem por terem substituições, adições ou deleções de aminoácidos específicos quando comparadas com as proteínas produzidas pelos organismos do tipo selvagem. As referidas δ-endotoxinas modificadas são aqui identificadas com um asterisco (*), ou com referência a uma proteína específica pelo seu número de identificação. Assim, uma δ-endotoxina Cry3 deve ser expressa como Cry3*, exemplos da qual incluem, sem limitação: Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242 e Cry3Bb.11098.

Verificou-se que algumas das δ-endotoxinas modificadas que foram descritas na WO 99/31248 e na Patente U.S. N°. 6.063.597 têm actividade melhorada contra insectos do tipo coleóptero, e em particular contra Diabrotica spp., incluindo a lagarta da raiz do milho. Conforme aqui usados, os termos "actividade melhorada" referem-se à actividade insecticida melhorada de uma toxina modificada quando comparada com a actividade da mesma toxina sem as modificações de aminoácidos, quando ambas são testadas sob as mesmas condições. Em particular, verificou-se que as δ-endotoxinas Cry3* tinham actividade melhorada contra a lagarta da raiz do milho, e que são portanto preferidas 19 ΡΕ1322164 para o uso na presente invenção. Mais preferidas são as δ-endotoxinas Cry3B*, e ainda mais preferidas são as δ-endotoxinas Cry3Bb*. Modificações genéticas ainda muito mais preferidas são as que incluem a capacidade de expressar as δ-endotoxinas modificadas que estão listadas na tabela seguinte. São também mostradas nas tabelas as estirpes de B. thuringiensis que incluem genes para a expressão das respectivas endotoxinas novas, e a data e o número de acesso do seu depósito na Agricultural Research Service Collection (NRRL) em 1815 N. University Street, Peoria, IL 91904. ESTIRPE DATA DE PROTEÍNA NÚMERO DE DEPÓSITO ACESSO (N2 NRRL) EG11230 5/27/97 Cry3Bb.11230 B-21768 EG11231 5/27/97 Cry3Bb.11231 B-21769 EG11232 5/27/97 Cry3Bb.11232 B-21770 EG11233 5/27/97 Cry3Bb.11233 B-21771 EG11234 5/27/97 Cry3Bb.11234 B-21772 EG11235 5/27/97 Cry3Bb.11235 B-21773 EG11236 5/27/97 Cry3Bb.11236 B-21774 EG11237 5/27/97 Cry3Bb.11237 B-21775 EG11238 5/27/97 Cry3Bb.11238 B-21776 EG11239 5/27/97 Cry3Bb.11239 B-21777 EG11241 5/27/97 Cry3Bb.11241 B-21778 EG11242 5/27/97 Cry3Bb.11242 B-21779 EG11098 11/28/97 Cry3Bb.11098 B-21903 20 ΡΕ1322164

Verificou-se também que uma utilização preferida da presente invenção é para reduzir os danos causados pelas pragas enquanto se alimentam quando usada em combinação com sementes com modificações genéticas que têm determinados níveis de eficácia contra essa praga. Para ilustrar quais os níveis de eficácia preferidos, o exemplo seguinte usa o Método de Avaliação da Raiz de Iowa (Hills e Peters, J. Econ. Entomol., 64: 764-765, 1971), o qual mede os danos causados pela lagarta da raiz do milho enquanto se alimenta das raízes de milho numa escala de 1 - 6. Na classificação, l=ausência de danos ou apenas umas marcas pequenas; 2=marcas visíveis da alimentação das pragas mas nenhuma raiz foi totalmente comida até 1½ polegada da base da planta; 3=várias raízes comidas até 1½ polegada da planta, mas nunca está destruído o equivalente a um nódulo inteiro; 4=um nódulo do da raiz completamente destruído; 5=dois nódulos da raiz completamente destruídos; e 6=três ou mais nódulos destruídos. Uma raiz destruída é definida como uma raiz que foi cortada até 1½ polegada da base. As raízes cortadas não têm de ter origem apenas num nódulo, mas todas as raízes cortadas têm de igualar um nódulo inteiro para contar como um nódulo destruído.

Conforme aqui usado, uma modificação genética está dentro da gama preferida de níveis de eficácia contra uma praga-alvo se essa modificação reduzir os danos causados por essa praga enquanto se alimenta numa determinada quantidade comparativamente à mesma cultura sem a modifi- 21 ΡΕ1322164 cação genética, mas não evita completamente todos os danos causados pela praga-alvo. Por exemplo, se 10% do milho transgénico sofreu danos causados pelo lagarta da raiz do milho de nivel 4 ou superior na Escala de 1-6 de Iowa, enquanto que 80 % do milho não transgénico sofreu danos de 4 ou superiores, então pode dizer-se que o dano sofrido pelo milho transgénico foi (10/80) x 100 = 12,5 % do dano em milho não transgénico. Para os objectivos da presente invenção, entende-se que uma modificação genética no milho se encontra numa gama de níveis de eficácia preferidos se o milho com a referida modificação sofre desde cerca de 5 % até cerca de 50 % dos danos sofridos pelo milho não transgénico, causados pela mesma praga e sob as mesmas condições. É mais preferido que o milho com a referida modificação genética sofra desde cerca de 10 % até cerca de 40 % dos danos sofridos por milho não transgénico, com a mesma praga e sob as mesmas condições, é ainda mais preferido danos desde cerca de 15 % até cerca de 30 %, e é ainda muito mais preferido danos desde cerca de 20 % até cerca de 30 % dos danos sofridos por milho não transgénico, causados pela mesma praga e sob as mesmas condições. Conforme aqui usado, quando o termo "cerca de" é usado para descrever o grau de danificação do milho, deve ser entendido que o grau de danificação pode estar acima ou abaixo dos limites descritos por uma diferença de 1 % ou 2 % e, ainda assim, ser considerado como estando dentro dos limites descritos. A título de exemplo, um nível de 4,5 % de danos seria encarado como sendo "cerca de 5 %". 22 ΡΕ1322164

Sem se pretender ficar prezo a esta ou a qualquer outra teoria, acredita-se que o tratamento pesticida da semente pode fornecer vantagens significativas quando combinado com uma modificação genética que fornece protecção dentro da gama preferida de eficácia contra determinada praga-alvo. Adicionalmente, acredita-se que existem situações que são bem conhecidas pelos especialistas na técnica, em que é vantajoso ter essas modificações genéticas dentro da gama de eficácia preferida. A presente invenção também inclui sementes e plantas com mais de uma modificação genética. Essas combinações são chamadas de modificações genéticas sobrepostas. Estas modificações genéticas sobrepostas podem ser modificações direccionadas para a mesma praga-alvo, ou podem ser direccionadas para diferentes pragas-alvo. Num método preferido, uma semente com a capacidade de expressar a proteína Cry 3 tem também a capacidade de expressar pelo menos outra proteína insecticida que é diferente da proteína Cry 3.

Noutro método preferido, a semente com capacidade de expressar uma proteína Cry 3 tem também uma modificação genética que lhe fornece tolerância herbicida. É mais preferido que a modificação genética que fornece tolerância herbicida seja uma modificação que proporcione resistência ao glifosato, N-(fosfonometil)glicina, incluindo a forma de sal de isopropilamina do referido herbicida, é ainda mais preferido que a modificação genética seja eficaz a fornecer 23 ΡΕ1322164 resistência herbicida a plantas e sementes da ROUNDUP READY® disponizáveis pela Monsanto Co., St. Louis, MO.

No presente método, uma semente de milho com uma modificação genética é tratada com um pesticida que é identificado como clotianidina, (N-[(2-cloro-5-tiazoil)metil]— N'-metil-N"-nitro,[C(E)]-(9C1)-guanidina, CAS RN 210880-92-5, com o número de desenvolvimento de TI-435).

Quando o insecticida clotianidina é aqui descrito, deve ser entendido que se pretende que a descrição inclua formas de sal do insecticida assim como qualquer forma isomérica e/ou tautomérica do insecticida que apresentem a mesma actividade insecticida que a forma do insecticida descrita. O insecticida clotianidina que é útil no presente método pode ser de qualquer grau ou pureza que passe no registo do insecticida. Outros materiais que acompanham o insecticida em preparações comerciais como impurezas, podem ser toleradas nos métodos e composições apresentados, desde que esses outros materiais não desta-bilizem a composição ou não reduzam significativamente ou destruam a actividade de qualquer um dos componentes insec-ticidas ou da modificação genética contra a(s) praga(s) alvo. Um qualquer perito na técnica de produção de insecticidas pode facilmente identificar as impurezas que podem ser toleradas e as que não podem.

Verificou-se que o presente método é útil para proteger sementes e plantas contra uma variedade de pragas ΡΕ1322164 - 24 - agrícolas, incluindo insectos, piolhos, fungos, leveduras, bolores e bactérias.

Quando a praga-alvo para a presente invenção é um insecto, essa praga inclui, mas não está limitada aos: da ordem Lepidoptera, por exemplo,

Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nippo-nensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocris spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleo-phora spp., Crocidolomla binotalis, Cryptophlebia leuco-treta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphan-tria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plu-tella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.; da ordem Coleóptera, por exemplo,

Agrotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, 25 ΡΕ1322164

Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melo-lontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhyncus spp., Phlycti-nus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. E Trogoderma spp.; da ordem Orthoptera, por exemplo,

Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp. e Schistocerca spp.; da ordem Isoptera, por exemplo,

Reticulitemes spp.; da ordem Psocoptera, por exemplo,

Liposcelis spp.; da ordem Anoplura, por exemplo,

Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. E Phylloxera spp.; da ordem Mallophaga, por exemplo,

Damalinea spp. e Trichodectes spp.; da ordem Thysanoptera, por exemplo,

Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci e Scirtothrips aurantii; da ordem Heteroptera, por exemplo,

Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp. e Triatoma spp.; da ordem Homoptera, por exemplo, 26 ΡΕ1322164

Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aoni-diella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp.,

Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae e Unaspis citri; da ordem Hymenoptera, por exemplo,

Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp.,

Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp. e Vespa spp.; da ordem Díptera, por exemplo,

Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucília spp., Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. e Tipula spp.; da ordem Siphonaptera, por exemplo, 27 ΡΕ1322164

Ceratophyllus spp., e Xenopsylla cheopis e da ordem Thysanura, por exemplo,

Lepisma saccharina.

Verificou-se que a presente invenção é particularmente eficaz quando a praga de insectos é Diabrotica spp., e especialmente quando a praga é Diabrotica virgi-fera, Diabrotica barberi, ou Diabrotica undecimpunctata.

No método da presente invenção, a clotianidina é aplicada a sementes de milho transgénico. Apesar de se acreditar que o presente método pode ser aplicado numa semente de milho transgénico em qualquer estado fisiológico, é preferido que a semente esteja num estado suficientemente durável que não fique sujeito a danos durante o processo de tratamento. Tipicamente, a semente deverá ser uma semente que foi colhida do campo; retirada da planta; e separada da maçaroca, caule, casca exterior e a polpa envolvente ou outros materiais que não a semente. Preferencialmente a semente deve ser estável biologicamente, de modo a que o tratamento não cause danos biológicos à semente. Numa forma de realização, por exemplo, o tratamento pode ser aplicado à semente de milho que tenha sido colhida, limpa e seca até um conteúdo de humidade inferior a cerca de 15% em peso. Numa forma de realização alternativa, a semente pode ser seca e seguidamente molhada com água e/ou outro material e novamente seca antes ou durante o tratamento com o pesticida. Dentro das limitações agora mencionadas, acredita-se que o tratamento pode ser aplicado 28 ΡΕ1322164 à semente a qualquer altura entre o colher da semente e o semear da semente. Conforme aqui usado, o termo "semente não semeada" é suposto incluir a semente em qualquer período entre a colheita da semente e a sua sementeira no terreno para qerminação e crescimento da planta.

Quando é dito que a semente não colhida é "tratada" com o pesticida, o referido tratamento não deve incluir as práticas nas quais o pesticida é aplicado ao solo, em vez da semente. Por exemplo, esses tratamentos como a aplicação do pesticidas em bandas, bandas em T ou em sulcos, ao mesmo tempo que as sementes são semeadas não são consideradas como estando incluídas na presente invenção. 0 pesticida, ou a combinação de pesticidas, pode ser aplicado "puro", ou seja, sem qualquer diluição ou sem a presença de quaisquer componentes adicionais. No entanto, o pesticida é tipicamente aplicado às sementes na forma de uma formulação pesticida. Esta formulação pode conter um ou mais componentes desejáveis incluindo mas não se limitando a diluentes líquidos, ligantes para servirem como matriz para o pesticida, enchimentos para proteger as sementes durante condições de stress, e plasticizantes para melhorar a flexibilidade, adesão e/dispersibilidade do revestimento. Adicionalmente, para formulações oleosas de pesticidas que contêm pouco ou nenhum enchimento, pode ser desejável adicionar à formulação agentes secantes tais como carbonato de cálcio, caulino ou argila de bentonite, perlite, terra de diatomáceas ou qualquer outro material adsorvente. 0 uso 29 ΡΕ1322164 dos referidos componentes nos tratamentos das sementes é conhecido na técnica. Ver, e.g. a Patente U.S. N° 5.876.739. 0 trabalhador especializado pode seleccionar componentes desejáveis para usar na formulação pesticida dependendo do tipo de semente a ser tratada e do pesticida particular que é seleccionado. Adicionalmente, as formulações comerciais prontamente disponíveis de pesticidas conhecidos podem ser usadas, conforme demonstrado nos exemplos a seguir.

As sementes podem também ser tratadas com um ou mais dos seguintes componentes: outros pesticidas, incluindo compostos que actuam apenas abaixo do solo; fungicidas, tais como captano, tirame, metalaxilo, (metoxame=isómero resolvido de metaxalilo) , fludioxonilo, oxadixilo, e isómeros de cada um desses materiais, e semelhantes; herbicidas, incluindo compostos seleccionados de carba-matos, tiocarbamatos, acetamidas, triazinas, dinitroani-linas, éteres de glicerol, piridazinonas, uracilos, fenoxis, ureias, e ácidos benzóicos; safeners herbicidas tais como benzoxazina, derivados benzidrilo, N,N-dialil-dicloroacetamida, vários dihaloacilos, compostos de oxazolidinilo e tiazolidinilo, etanona, compostos de anidrido naftálico, e derivados oxima; fertilizantes; e agentes de biocontrolo tais como bactérias de ocorrência natural ou recombinantes e fungos do género RhÍzobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium e fungos micorrizais. Estes componentes podem ser adicionados como uma camada separada na semente ou 30 ΡΕ1322164 alternativamente pode ser adicionado como parte da composição pesticida.

Preferencialmente, a quantidade da nova composição ou outros componentes usados no tratamento da semente não deve inibir a germinação da semente, ou causar danos fitotóxicos à semente. A formulação pesticida que é usada para tratar a semente de milho transgénico na presente invenção pode estar na forma de uma suspensão; emulsão; mistura semilíquida de partículas em meio aquoso (e.g., água); pó molhável; grânulos molháveis (fluidizáveis a seco); e grânulos secos. Quando formulado como uma suspensão ou mistura semi-líquida, a concentração do componente activo na formulação é preferencialmente cerca de 0,5% até cerca de 99% em peso (p/p), preferencialmente 5-40%.

Conforme mencionado acima, outros componentes inertes ou inactivos convencionais podem ser incorporados na formulação. Esses componentes inertes incluem mas não se limitam a: agentes adesivos convencionais, agentes disper-santes tais como metilcelulose (Methocel A15LV ou Methocel A15C, por exemplo, funcionam como agentes dispersan-tes/adesivos combinados para uso em tratamentos de sementes), álcool de polivinilo (e.g., Elvanol 51-05) lecitina (e.g., Yelkinol P) , dispersantes poliméricos (e.g. polivi-nilpirrolidona/acetato de vinilo PVP/VA S-630), espessantes (e.g., espessantes de argila tais como Van Gel B para 31 ΡΕ1322164 melhorar a viscosidade e reduzir o depósito das suspensões de partículas), estabilizantes de emulsões, tensoactivos, compostos anti-congelantes (e.g., ureia), tintas, coloran-tes, e semelhantes. Outros componentes inertes úteis na presente invenção podem ser encontrados em McCutcheon's Vol. 1, "Emulsifiers and Detergents", MC Publishing Company, Glen Rock, New Jersey, U.S.A., 1996. Outros componentes inertes adicionais úteis na presente invenção podem ser encontrados em McCutcheon's, vol. 2, "Functional Materials, " MC Publishing Company, Glen Rock, New Jersey, U.S.A., 1996.

Os pesticidas e as formulações pesticidas da presente invenção podem ser aplicados às sementes por qualquer metodologia padrão de tratamento de sementes, incluindo mas não se limitando a misturar num recipiente (e.g., uma garrafa ou um saco), aplicação mecânica, agitação em torno rotativo, pulverização, e imersão. Qualquer material convencional inerte ou activo pode ser usado para fazer as sementes contactar com os pesticidas de acordo com a presente invenção, tais como materiais convencionais de revestimento em película incluindo mas não se limitando a materiais de película de revestimento à base de água tais como Sepiret (Seppic, Inc., Fairfield. NJ) e Opacoat (Berwind Pharm. Services, Westpoint, PA).

Os pesticidas expostos podem ser aplicados a uma semente como um componente de um revestimento da semente. Os métodos e composições de revestimento de sementes 32 ΡΕ1322164 conhecidos na técnica são úteis quando são modificados pela adição de um dos modos de realização da combinação de pesticidas da presente invenção. Os referidos métodos e aparelhos para a sua aplicação estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.918.413, 5.891.246, 5.554.445, 5.389.399, 5.107.787, 5.080.925, 4.759.945 e 4.465.017. As composições de revestimento de sementes estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.939.356, 5.882.713, 5.876.739, 5.849.320, 5.834.447, 5.791.084, 5.661.103, 5.662.003, 5.580.544, 5.328.942, 5.300.127, 4.735.015, 4.634.587, 4.383.391, 4.372.080, 4.339.456, 4.272.417 e 4.245.432, entre outros.

Revestimentos úteis das sementes contêm um ou mais ligantes e pelo menos uma das combinações dos pesticidas expostos. incluindo

Os ligantes que são úteis na presente invenção compreendem preferencialmente um polímero adesivo que pode ser natural ou sintético e não tem efeito fitotóxico na semente a ser revestida. O ligante pode ser seleccionado de acetatos de polivinilo; copolímeros de acetato de poli-vinilo; copolímeros de acetato de vinilo etileno (EVA); álcoois de polivinilo; copolímeros de álcool de polivinilo; celuloses, incluindo etilceluloses, metilceluloses, hidro-ximetilceluloses, hidroxipropilceluloses e carboximetil-celuloses; polivinilpirrolidonas; polissacáridos, incluindo amido, amido modificado, dextrinas, maltodextrinas, algina-to e quitosanos; gorduras; óleos; proteínas, 33 ΡΕ1322164 gelatina e zeína; gomas arábicas; gomas-lacas; cloreto e copolímeros de vinilideno; lenhinosulfonatos de cálcio; polímeros e copolímeros de acrilamida; acrilato de poli-hidroxietilo, monómeros de metilacrilamida; e policloro-preno. É preferido que o ligante seja seleccionado de forma a poder funcionar como matriz para os pesticidas expostos. Enquanto que os ligantes descritos acima podem ser todos úteis como matriz, o ligante específico vai depender das propriedades da combinação de pesticidas. 0 termo "matriz", conforme aqui usado, significa uma fase sólida contínua de um ou mais compostos ligantes ao longo da qual está distribuída uma ou mais fases descontínuas dos pesticidas expostos. Opcionalmente, um enchimento e/ou outros componentes podem também estar presentes na matriz. 0 termo matriz deve ser entendido como incluindo aquilo que pode ser visto como um sistema de matriz, um sistema reservatório ou um sistema microencapsulado. Em geral, um sistema de matriz consiste em pesticidas da presente invenção e um enchimento dispersado uniformemente num polímero, ao passo que um sistema reservatório consiste numa fase separada que compreende os pesticidas expostos, ou seja dispersado fisicamente numa fase polimérica circundante limitadora de grau. A microencapsulação inclui o revestimento de pequenas partículas ou gotículas de líquido, mas também dispersões numa matriz sólida. A quantidade de ligante no revestimento pode 34 ΡΕ1322164 variar, mas estará dentro da gama de cerca de 0,01 até cerca de 25% do peso da semente, mais preferencialmente desde cerca de 0,05 até cerca de 15%, e ainda mais preferencialmente desde cerca de 0,1% até cerca de 10%.

Conforme mencionado anteriormente, a matriz pode opcionalmente incluir um enchimento. O enchimento pode ser um absorvente ou um enchimento inerte, tais como os conhecidos na técnica, e podem incluir farinha de madeira, argilas, carbono activado, açúcares, terra de diatomáceas, farinhas de cereais, sólidos inorgânicos de grãos finos, carbonato de cálcio, e semelhantes. Argilas e sólidos inorgânicos, que podem ser usados, incluem bentonite de cálcio, caulino, argila de porcelana, talco, perlite, mica, vermiculite, sílicas, pós de quartzo, montmorilonite e misturas destes. Os açúcares que podem ser úteis incluem dextrina e maltodextrina. As farinhas de cereais incluem farinha de trigo, farinha de aveia e farinha de cevada. O enchimento é seleccionado de modo a proporcionar um microclima apropriado para a semente, por exemplo o enchimento é usado para aumentar o grau de carregamento dos componentes activos e para ajustar a libertação controlada dos componentes activos. O enchimento pode ajudar na produção ou no processo de revestimento da semente. A quantidade de enchimento pode variar, mas geralmente o peso dos componentes do enchimento estará na gama de cerca de 0,05 até cerca de 75% do peso da semente, mais 35 ΡΕ1322164 preferencialmente cerca de 0,1 até cerca de 50%, e ainda mais preferencialmente cerca de 0,5% até 15%.

Os pesticidas que são úteis no revestimento são aqueles pesticidas que estão aqui descritos. A quantidade de pesticida que é usada para o tratamento da semente irá variar em função do tipo de semente e do tipo de componentes activos, mas o tratamento compreenderá fazer contactar as sementes com uma quantidade da combinação de pesticidas que é eficaz como pesticida. Quando a praga-alvo são insectos, essa quantidade será uma quantidade de insecti-cida que é eficaz como insecticida. Conforme aqui usado, uma quantidade eficaz como insecticida significa que a quantidade de insecticida que irá causar a morte da praga de insectos no estado de desenvolvimento larvar ou de pupa, ou vai reduzir significativamente ou atrasar a quantidade de danos causados pela praga de insectos.

Em geral, a quantidade de clotianidina que é aplicada à semente no tratamento deve variar numa gama de cerca de 10 g até cerca de 2000 g de componente activo do pesticida por lOOkg de peso da semente. Preferencialmente, a quantidade de pesticida estará numa gama de cerca de 50 g até cerca de 1000 g de componente activo por 100 kg de semente, mais preferencialmente numa gama de cerca de 100 g até cerca de 600 g de componente activo por 100 kg de semente, e ainda mais preferencialmente dentro da gama desde cerca de 200 g até cerca de 500 g de componente activo por 100 kg de peso de semente. Alternativamente, 36 ΡΕ1322164 verificou-se ser preferido que a quantidade do pesticida estivesse acima dos cerca de 60 g de componente activo do pesticida por 100 kg de semente, e mais preferencialmente acima de cerca de 80 g por 100 kg de semente. O pesticida usado no tratamento não pode inibir a germinação da semente e deve ser eficiente na protecção da semente e/ou da planta durante o periodo do ciclo de vida do insecto alvo durante o qual este causa lesões na semente ou na planta. Em geral, o revestimento será eficaz durante aproximadamente 0 até 120 dias após a sementeira. O pesticida da invenção em questão pode ser aplicado à semente na forma de um revestimento. O uso de um revestimento é particularmente eficaz na acomodação de elevadas cargas pesticidas, como pode ser requerido para o tratamento de pragas tipicamente refractárias, tais como lagarta da raiz, enquanto que ao mesmo tempo previne fito-toxicidade inaceitável devida ao aumento da carga pesticida .

Opcionalmente, pode ser usado um plastificante na formulação de revestimento. Os plastificantes são tipicamente usados para fazer um película que é formada pela camada de revestimento mais flexível, para melhorar a aderência e dispersibilidade, e para aumentar a velocidade de processamento. A flexibilidade melhorada da película é importante para minimizar a descamação, a quebra ou lasca-gem durante os processos de armazenamento, manuseamento ou 37 ΡΕ1322164 sementeira. Muitos plastificantes podem ser usados, no entanto, plastificantes úteis incluem polietilenoglicol, gli-cerol, butilbenzilftalato, benzoatos de glicol e compostos relacionados. A gama de plastificantes na camada de revestimento deverá ser de cerca de 0,1 até cerca de 20% em peso.

Quando o pesticida usado no revestimento é uma formulação de tipo oleoso e pouco ou nenhum enchimento está presente, pode ser útil acelerar o processo de secagem da formulação. Este passo opcional pode ser executado por meios bem conhecidos na técnica e pode incluir a adição de carbonato de cálcio, caulino ou argila de bentonite, perlite, terra de diatomáceas, ou qualquer material absorvente que é adicionado de preferência em simultâneo com a camada de revestimento pesticida para absorver o óleo ou o excesso de humidade. A quantidade de carbonato de cálcio ou de compostos relacionados necessários para proporcionar eficazmente um revestimento seco será na gama de cerca de 0,5% até cerca de 10% do peso da semente.

Os revestimentos formados com o pesticida são preferencialmente do tipo que é capaz de afectar a taxa de libertação lenta do pesticida por difusão ou por movimento através da matriz do meio envolvente.

Adicionalmente à camada de revestimento, a semente pode ser tratada com um ou mais dos seguintes 38 ΡΕ1322164 componentes: outros pesticidas incluindo fungicidas e herbicidas; safeners herbicidas; fertilizantes e/ou agentes de biocontrolo. Estes componentes podem ser adicionados como uma camada separada ou alternativamente podem ser adicionados na película pesticida de revestimento. A formulação pesticida pode ser aplicada às sementes usando técnicas e máquinas convencionais de revestimento, tais como técnicas de leito fluidizado, o método do moinho de rolamentos, tratadores de semente rotostá-ticos, e revestidores de tambor. Outros métodos, tais como os leitos de descarga podem também ser úteis. As sementes podem ser pré-calibradas antes do revestimento. Após o revestimentos, as sementes são tipicamente secas e depois transferidas para uma máquina de calibração para serem organizadas por tamanho. Os referidos processos são conhecidos na técnica.

As sementes tratadas com pesticida podem também ser envolvidas com uma película sobre o revestimento para proteger o revestimento de pesticida. Esses duplos revestimentos são conhecidos na técnica e podem ser aplicados usando técnicas convencionais de cama fluidizada e película de revestimento em tambor.

Noutra forma de realização da presente invenção, um pesticida pode ser introduzido sobre ou dentro da semente através do uso de um primário de matriz sólida. Por 39 ΡΕ1322164 exemplo, a quantidade do pesticida pode ser misturada com um material de matriz sólida e depois a semente pode ser colocada em contacto com o material de matriz sólida durante um determinado período de tempo para permitir que o pesticida seja introduzido na semente. A semente pode depois ser opcionalmente separada do material de matriz sólida e armazenada ou usada, ou a mistura de material de matriz sólida e a semente podem ser armazenadas ou plantadas directamente. Materiais de matriz sólida que são úteis na presente invenção incluem poliacrilamida, amido, argila, sílica, alumina, solo, areia, poliureia, poliacri-lato, ou qualquer outro material capaz de absorver ou adsorver o pesticida durante algum tempo e libertar o pesticida dentro ou sobre a semente. É útil garantir que o pesticida e o material de matriz sólida são compatíveis um com o outro. Por exemplo, o material de matriz sólida deve ser escolhido de modo a poder libertar o pesticida a uma taxa razoável, por exemplo durante um período de minutos, horas ou dias. A presente invenção inclui ainda formas embebição como outro método de tratamento da semente com o pesticida. Por exemplo, a semente da planta pode ser combinada durante um período de tempo com uma solução que compreenda desde cerca de 1% em peso até cerca de 75% em peso de pesticida num solvente como água. Preferencialmente a concentração da solução é desde cerca de 5% em peso até cerca de 50% em peso, mais preferencialmente desde cerca de 10% em peso até cerca de 25% em peso. Durante o período em que a semente é 40 ΡΕ1322164 combinada com a solução, a semente adquire (embebe) uma porção de pesticida. Opcionalmente, a mistura da semente da planta e a solução podem ser agitadas, por exemplo por agitação, rolamento, rolamento ou por outros meios. Após embebição, a semente pode ser separada da solução e opcionalmente seca, por exemplo por batimentos leves com a mão ou secagem com ar.

Ainda noutra forma de realização, um pesticida em pó pode ser misturado directamente com a semente. Opcionalmente, pode ser usado um agente adesivo para fazer aderir o pó à superfície da semente. Por exemplo, a quantidade de semente pode ser misturada com um agente adesivo e opcionalmente agitada para promover um revestimento uniforme da semente com o agente adesivo. A semente revestida com o agente adesivo pode depois ser misturada com o pesticida em pó. A mistura pode ser agitada, por exemplo revolvendo-a, para promover o contacto do agente adesivo com o pesticida em pó levando, deste modo, a que o pesticida em pó adira à semente. A presente invenção também fornece uma semente de milho transgénico que foi tratada com um pesticida pelo método descrito acima.

As sementes tratadas da presente invenção podem ser usadas para a propagação de plantas de milho do mesmo modo como as sementes de milho convencionais tratadas. As 41 ΡΕ1322164 sementes tratadas podem ser armazenadas, manuseadas, semeadas e lavradas da mesma maneira que outras sementes tratadas com pesticida. Devem ser tomadas medidas de segurança apropriadas para limitar o contacto da semente tratada com seres humanos, produtos alimentares ou rações, água e pássaros e animais domésticos ou selvagens.

Modos de realização preferidos da invenção estão descritos nos exemplo seguintes. Outros modos de realização no âmbito das reivindicações aqui inseridas serão óbvias para um especialista na técnica quanto à especificação ou prática da invenção conforme aqui descrito. Pretende-se que a especificação, em conjunto com os exemplos, seja considerada apenas a titulo de exemplo, sendo o âmbito e o espirito da invenção indicados nas reivindicações que se seguem aos exemplos.

Os exemplos seguintes descrevem modos de realização preferidos da invenção. Outros modos de realização dentro do âmbito das reivindicações aqui inseridas serão óbvias para um especialista na técnica considerando a especificação ou a prática da invenção conforme aqui descrito. Pretende-se que a especificação, em conjunto com os exemplos, seja considerada apenas a titulo de exemplo, sendo o âmbito e o espirito da invenção indicados nas reivindicações que se seguem aos exemplos. Nos exemplos, todas as percentagens são dadas com base no peso a não ser se indicado de outra maneira. ΡΕ1322164 42 EXEMPLO 1

Produção de sementes < com clotianidina. Foram preparadas sarem a endotoxina Cry3Bb. pelo método descrito na WO 6.023.013. mrlho transgenico e tratamento sementes de milho para expres-1231 do Bacillus thuringiensis 99/31248 ou na Patente U.S. N°

Sementes de milho das mesmas espécies híbridas, com e sem a modificação genética, foram tratadas com pesticida clotianidina como se segue. Foi preparada uma formulação de tratamento de semente misturando uma quantidade medida de clotianidina em água como um transportador e aplicando a formulação durante um minuto à temperatura ambiente até um dado peso de sementes de milho num tratador de sementes rotostático. Os respectivos pesos da preparação pesticida e da semente de milho foram calculados para proporcionar a desejada taxa de tratamento do pesticida na semente. O pesticida foi misturado numa quantidade de água suficiente para permitir uma distribuição eficiente da formulação a todas as sementes no lote ao mesmo tempo que se minimizam as perdas da formulação pesticida devidas à falta de retenção da formulação pelas sementes. As sementes tratadas foram deixadas pousar a descoberto durante pelo menos quatro horas antes de plantar. 43 ΡΕ1322164 EXEMPLO 2

Ensaios de campo para a determinação da eficácia da modificação genética Cry3Bb.11231 em sementes de milho em combinação com tratamentos de semente com clotianidina contra larva da raiz do milho do norte e do ocidente.

Realizou-se um ensaio de campo de acordo com os protocolos pertinentes e em conformidade com os requisitos de notificação USDA. 0 objectivo do ensaio foi determinar a eficácia da modificação genética Cry3Bb.11231 em sementes de milho em combinação com tratamentos de sementes contra a larva da raiz do milho usando clotianidina.

Para cada local de crescimento que foi selecci-onado, a unidade experimental compunha-se do seguinte:

Espaçamento dos sulcos: 30 polegadas Tamanho da parcela: 1 sulco x 20 pés

Densidade de plantação: 1,5-2,0 sementes/pé, dependendo da localização Híbrido usado: Réplicas: Esquema: Localizações: Origem das larvas:

MOÍ 7 X AI 4

Bloco completo aleatório 5 infestações naturais suplementadas por infestação artificial de ovos de larvas da raiz do milho com 1200 ovos/pé (estádio de crescimento V2) 44 ΡΕ1322164

Foram usadas as seguintes combinações de tratamento de sementes para cada área de crescimento: N° Tipo de semente Pesticida e quantidade de milho (gramas de Al/100 kg de semente) 1 Iso-híbrido 2 Cry3Bb.11231 3 Iso-híbrido Clotianidina@100gm de Al/lOOkg 4 Iso-híbrido Clotianidina@30Ogm de Al/lOOkg 5 Iso-híbrido Clotianidina04OOgm de Al/lOOkg 6 CryBb.11231 ClotianidinaQlOOgm de Al/lOOkg 7 CryBb-11231 Clotianidina@300gm de Al/lOOkg 8 Iso-híbrido Tratamento padrão de Force®3G0 0,15 oz de Al/1000 pés ; de sulco, aplicado como uma banda de 5" na superfície do terreno no momento da plantação. Todos os tratamentos de sementes com pesticidas foram realizados conforme descrito no Exemplo 1. As sementes que receberam os tratamentos número 1 e 2 não tiveram tratamento pesticida porque se esperava fosse eficaz contra a larva da raiz do milho.

Em relação às sementes que tiveram os tratamentos numerados de 3 até 7, os pesticidas foram aplicados através dos métodos descritos no Exemplo 1. No tratamento de sementes número 8, aplicou-se Force®3G disponível no 45 ΡΕ1322164 comércio no solo, numa banda com 5" no momento da sementeira. Os níveis de aplicação são como apresentado e encontram-se dentro dos limites recomendados para a prática comercial padrão.

As sementes de milho a serem testadas foram plantadas e cresceram em cinco localizações diferentes de dois estados do Centro-ocidente da faixa do milho dos Estados Unidos de acordo com o protocolo descrito acima. A determinação dos danos causados pela larva da raiz do milho foi feita de acordo com o seguinte protocolo. Na fase VT-R1, realizou-se uma avaliação dos danos causados pela larva da raiz do milho através de métodos que são bem conhecidos na indústria, e os danos foram descritos de acordo com o sistema de classificação Iowa 1-6. Neste sistema, os sistemas radiculares de 10 plantas de milho por unidade experimental de campo foram recolhidos e classificados usando a escala de classificação de 1-6, na qual: Na classificação, 1 = ausência de danos ou apenas umas marcas pequenas; 2 = marcas evidentes de que pragas se alimentaram mas nenhuma das raízes foi comida até 1½ polegada da planta; 3 = pelo menos uma raiz comida até 1½ polegada da planta, mas nenhum nodo inteiro da raiz foi destruído; 4 = um nodo das raízes comido até 1 Ú2 polegada; 5 = dois nodos (círculos) das raízes comidos até 1 b2 polegada; e 6 = três nodos (círculos) das raízes comidos até 1 ^ polegada da planta. 46 ΡΕ1322164

Tabela 1. Danos da lagarta da raiz do milho em plantas de milho iso-hibridas e plantas de milho com apenas uma modificação genética Cry3Bb.11231 e em combinação com o tratamento da semente com clotianidina em sete locais de crescimento durante o primeiro ano do ensaio. TRATAMENTO DANOS DE LAGARTA DA RAIZ DO MILHO EM CADA CLASSE DE IOWA (ESCALA IOWA DE 1-6) 1 2 3 4 5 6 MÉDIAS ENTRE LOCALIZAÇÕES Controlo não tratado 0 0 32 74 44 27 4,4 Cry3.Bb.11231 5 45 109 16 4 1 2,9 Clotianidina Θ 100g/100 kg 0 6 45 98 23 5 3,9 Clotianidina Θ 300g/100 kg 0 16 94 60 16 2 3,4 Clotianidina Θ 400g/100 kg 1 34 113 37 1 0 3,0 Cry3Bb.11231 com Clotianidina Θ 100g/100 kg 1 55 88 16 1 0 2,8 Cry3Bb.11231 com Clotianidina Θ 300g/100 kg 2 80 90 16 2 0 2, 7 Banda de FORCE® 3G à superfície na altura da plantação 4 89 66 10 5 5 2,7

Os dados demonstram que tanto a modificação genética como a clotianidina proporcionaram algum nível de danos (i.e., níveis de danos de 4-6), a modificação genética sofreu 14,5% de danos em relação ao controlo não trans-génico. Deste modo, considera-se que a modificação 47 ΡΕ1322164

Cry3Bb.11231 está dentro de uma gama de eficácia preferida. A clotianidina foi eficaz contra os danos causados pela larva da raiz do milho a todos os níveis testados, mas a eficácia da clotianidina em todos os níveis foi inferior à eficácia da modificação transgénica isoladamente. Todas as combinações de tratamento da semente transgénica com clotianidina foram mais eficazes contra os danos da larva da raiz do milho do que qualquer tratamento pesticida isoladamente ou que a transformação genética por si só. A combinação de Cry3Bb.11231 com clotianidina a 300 g/lOOkg de semente proporcionaram essencialmente a mesma protecção que o tratamento com o padrão comercial de 4,25 g de FORCE®3G por 100 pés de sulco aplicado como uma faixa à superfície aquando da plantação. O tratamento de sementes transgénicas com apenas 100 g/100 kg de clotianidina proporcionou quase o mesmo nível de protecção.

As vantagens do presente tratamento de sementes transgénicas com clotianidina incluem a simplificação da plantação, pela eliminação do requisito de aplicações separadas de pesticidas. Além disso, a plantação torna-se mais fácil e mais segura, uma vez que o técnico que está a fazer a plantação não tem de manusear um pesticida concentrado.

As combinações de tratamento de semente com clotianidina em sementes de milho com a modificação genética Cry3Bb.11231 foram detectadas em relação a possíveis sinergias a três níveis de danos causados pela larva da 48 ΡΕ1322164 raiz do milho. No primeiro teste, apresentado na Tabela 2(a), a percentagem de plantas de teste com niveis de danos de 3 até 6, na Escala Iowa de 1-6, foi determinada em relação ao controlo e às sementes tratadas com o pesticida a dois niveis, e em relação às sementes com a modificação genética, isoladamente ou em combinação. A fórmula seguinte foi depois usada para calcular o "limiar de sinergia": (% de controlo Cry3Bb.11231)*(% de controlo do tratamento com clotianidina)/100.

Este limiar foi comparado em relação à percentagem de controlo para as combinações de tratamentos (i.e., Cry3Bb.11231 com clotianidina @ 100 g/100 kg e Cry3Bb. 11231 com clotianidina @ 300 g/100 kg. No caso em que a percentagem de controlo na combinação de tratamentos foi inferior ao limiar, então concluiu-se que existia sinergia. Se a percentagem de controlo na combinação de tratamentos foi acima do limiar, então concluiu-se que não exista demonstração de sinergia para essa combinação. Estes cálculos foram repetidos para os níveis de danos entre 4-6 e 5-6, e os resultados dos cálculos estão apresentados nas Tabelas 2(b) e 2(c).

Acredita-se que as medições dos danos da larva da raiz do milho a níveis mais elevados de danos (i.e., níveis de 3-6, níveis de 4-6 e níveis de 5 e 6) são um indicador útil que se relaciona com subsequentes perdas de produção devidas aos referidos danos. A razão para isto é que os danos causados pela larva da raiz do milho com níveis de 1 49 ΡΕ1322164 e 2 raramente levam a que a planta do milho caia e acame, e pensa-se que esses danos mínimos não reduzem o número ou o peso dos grãos de cereais em cada bandeira. No entanto, os danos na raiz de níveis 3 ou acima causam cada vez mais acama e perdas de produção. Por essa razão, acredita-se que os níveis de danos de 3-6, 4-6, 5 e 6 somados, proporcionam uma indicação útil do efeito dos danos da larva da raiz do milho em produções de milho subsequentes.

Tabela 2 (a) . Eficácia do tratamento de sementes com dois níveis de clotianidina sozinha e em combinação com a modificação genética Cry3Bb.11231 contra os danos da larva da raiz do milho em níveis de 3-6 na Escala Iowa de 1-6 . TRATAMENTO PERCENTAGEM DE PLANTAS COM NÍVEIS DE DANOS DE 3-6 PERCENTAGEM DO CONTROLO LIMIAR DE SINERGIA Controlo não tratado 100 100 - Cry3Bb.11231 72,2 72,2 - Clotianidina @ 100 g/100 kg 96,6 96,6 - Clotianidina @ 300 g/100 kg 91,5 91,5 - Cry3Bb.11231 com clotianidina Θ 100 g/100 kg 65, 2 65, 2 69, 8 Cry3Bb.11231 com clotianidina @ 300 g/100 kg 56,8 56, 8 66,1

Tabela 2(b). Eficácia do tratamento de sementes 50 ΡΕ1322164 com dois níveis de clotianidina sozinha e em combinação com a modificação genética Cry3Bb.11231 contra os danos da larva da raiz do milho em níveis de 4-6 na Escala Iowa de 1-6. TRATAMENTO PERCENTAGEM DE PLANTAS COM NÍVEIS DE DANOS DE 4-6 PERCENTAGEM DO CONTROLO LIMIAR DE SINERGIA Controlo não tratado 81,9 100 - Cry3Bb.11231 11, 7 14, 24 — Clotianidina Θ 100 g/100 kg 71,2 86,9 - Clotianidina @ 300 g/100 kg 41,5 50,65 - Cry3Bb.11231 com clotianidina @ 100 g/100 kg 10,6 12,9 12, 4 Cry3Bb.11231 com clotianidina Θ 300 g/100 kg 9,5 11,6 7,2

Tabela 2(c). Eficácia do tratamento de sementes com dois níveis de clotianidina sozinha e em combinação com a modificação genética Cry3Bb.11231 contra os danos da larva da raiz do milho em níveis de 5-6 na Escala Iowa de 1-6.

TRATAMENTO PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM LIMIAR DE PLANTAS COM DO CONTROLO SINERGIA 51 ΡΕ1322164 NÍVEIS DE DANOS DE 5-6 Controlo nao tratado i—1 O 100 - Cry3Bb.11231 2, 8 6,9 - Clotianidina Θ 100 g/100 kg 15, 8 39,4 - Clotianidina Θ 300 g/100 kg 9,6 23,9 - Cry3Bb.11231 com clotianidina Θ 100 g/100 kg 0,6 1,6 2, 7 Cry3Bb.11231 com clotianidina Θ 300 g/100 kg 1,1 2,6 1, 7

Esta análise indicou que a combinação da modificação transgénica Cry3Bb.11231 no milho com o tratamento com clotianidina quer a 100 g/ 100 kg quer a 300 g/100 kg era sinérgica e inesperadamente eficaz contra os danos por larva da raiz do milho no nivel 3-6. No nível de danos de 4-6, nenhum nível de clotianidina em combinação com a modificação genética indicou sinergia, apesar da combinação do nível baixo do tratamento com clotianidina (100 g/100 kg de sementes) ter mostrado um nível de protecção que se aproximou do necessário para que se visse sinergia. No nível de danos 5-6, a combinação do nível mais baixo do tratamento com clotianidina (100 g/ 100 kg de semente) com a modificação Cry3Bb.11231 evidenciou sinergia, ao passo que a combinação com o nível mais elevado de clotianidina 52 ΡΕ1322164 não. No entanto, os danos no nível 5-6 foram muito baixos para qualquer das combinações testadas, e estavam muito abaixo dos sofridos por milho não transgénico tratado convencionalmente em bandas à superfície (cerca de 5,6% de danos nos níveis 5-6).

Consequentemente, concluiu-se que a combinação da modificação genética com o tratamento da semente com clotianidina proporcionou vantagens significativas em relação ao uso de qualquer dos métodos isoladamente, e que essa protecção foi inesperadamente superior em termos de eficácia contra danos severos causados pela larva da raiz do milho.

Lisboa, 13 de Novembro de 2006

Claims (19)

1. ΡΕ1322164 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para proteger uma planta de milho transgénico contra danos causados por uma praga de Cole-ópteros enquanto se alimentam, método que compreende fornecer uma semente de planta de milho transgénico, em que a semente inclui uma modificação genética que codifica a expressão de uma δ-endotoxina Cry3B com actividade contra uma praga de Coleópteros e tratar a semente com uma quantidade de clotianidina que, em combinação com a modificação genética, é eficaz para proteger uma planta de milho desenvolvida a partir da semente de milho contra danos causados por Coleópteros enquanto se alimentam, numa extensão superior ao que seria de esperar com a clotianidina ou apenas com a modificação genética.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína Cry3B é uma δ-endotoxina modificada com substituições, adições ou delecções de aminoácidos quando comparada com as proteínas produzidas pelo tipo selvagem de Bacillus thuringiensis (uma proteína Cry3B*).
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína Cry3B* é seleccionada do grupo que consiste em Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, 2 ΡΕ1322164 Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242 e Cry3Bb.11098.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína Cry 3B* é Cry3Bb.11231.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína Cry3B* é Cry3Bb.11098.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a semente com a capacidade de expressar a proteína Cry 3B tem também a capacidade de expressar pelo menos uma outra proteína insecticida diferentes da proteína Cry 3B.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a semente com a capacidade de expressar a proteína Cry 3B tem também uma modificação genética que proporciona tolerância herbicida.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a modificação genética proporciona tolerância herbicida contra glifosato.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o insecto é uma Diabrotica spp.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o insecto inclui pelo menos um membro seleccionado do 3 ΡΕ1322164 grupo que consiste em Diabrotica virgifera, Diabrotica barberi e Diabrotica undecimpunctata.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade eficaz de clotianidina é desde pelo menos cerca de 10 gramas até cerca de 2000 gramas do componente activo pesticida por 100 quilogramas de semente.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a quantidade eficaz de clotianidina é desde pelo menos cerca de 70 gramas até cerca de 1000 gramas do componente activo pesticida por 100 quilogramas de semente.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a quantidade eficaz de clotianidina é desde pelo menos cerca de 100 gramas até cerca de 600 gramas do componente activo pesticida por 100 quilogramas de semente.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a quantidade eficaz de clotianidina é desde pelo menos cerca de 200 gramas até cerca de 500 gramas do componente activo pesticida por 100 quilogramas de semente.
15. 15. Semente de uma planta de milho transgénico que fornece uma resistência aumentada à planta de milho resultante contra danos causados por uma praga de Coleópteros enquanto se alimentam, em que a semente inclui uma modificação genética que codifica para a expressão de uma δ-endotoxina Cry3B com actividade contra uma praga de 4 ΡΕ1322164 Coleópteros, em que a semente foi tratada com uma quantidade desde pelo menos 100 gramas até 2000 gramas de componente activo pesticida por 100 quilogramas de semente.
16. 16. Semente de acordo com a reivindicação 15, em que a modificação genética inclui um gene que codifica uma proteína Cry3 derivada do Bacillus thuringiensis.
17. 17. Semente de acordo com a reivindicação 16, em que a modificação genética inclui um gene que codifica uma proteina Cry3Bb derivada do Bacillus thuringiensis.
18. 18. Semente de acordo com a reivindicação 17, em que a modificação genética inclui um gene que codifica uma proteína seleccionada de entre as proteínas Cry3Bb.11230, Cry3Bb.11231, Cry3Bb.11232, Cry3Bb.11233, Cry3Bb.11234, Cry3Bb.11235, Cry3Bb.11236, Cry3Bb.11237, Cry3Bb.11238, Cry3Bb.11239, Cry3Bb.11241, Cry3Bb.11242 ou Cry3Bb.11098 derivada do Bacillus thuringiensis.
19. 19. Semente de acordo com a reivindicação 15, em que a quantidade eficaz de clotianidina é desde pelo menos cerca de 200 gramas até cerca de 500 gramas do componente activo pesticida por 100 quilogramas de semente. Lisboa, 13 de Novembro de 2006