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HK1198173A1 - Nav1．3和nav1．7的强效及選擇性抑制劑 - Google Patents

Nav1．3和nav1．7的强效及選擇性抑制劑 Download PDF

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HK1198173A1
HK1198173A1 HK14111760.9A HK14111760A HK1198173A1 HK 1198173 A1 HK1198173 A1 HK 1198173A1 HK 14111760 A HK14111760 A HK 14111760A HK 1198173 A1 HK1198173 A1 HK 1198173A1
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HK
Hong Kong
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methyl
matter
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amino acid
arginine
Prior art date
Application number
HK14111760.9A
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English (en)
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Justin K. Murray
Leslie P. Miranda
Stefan I. Mcdonough
Original Assignee
Amgen Inc.
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Publication date
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Description

Nav1.3和Nav1.7的强效及选择性抑制剂
在整个申请中，在圆括号或方括号内引用了多种出版物。这些出版物的公开内容整体据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本发明所属的现有技术。
发明背景
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体地讲，涉及治疗性肽和偶联物。
相关领域讨论
电压门控钠通道(VGSC)是负责诸如中枢和外周神经元、心脏和骨骼肌肌细胞以及神经内分泌细胞的可兴奋细胞中动作电位引发和传播的糖蛋白复合物。哺乳动物钠通道是由中央成孔alpha(α)亚基和辅助beta(β)亚基组成的异三聚体。alpha亚基中的突变已与人类中的阵发性障碍诸如癫痫、长QT综合征和高钾型周期性麻痹以及小鼠中的运动终板病和小脑共济失调存在关联。(Isom，Sodium channel betasubunits：anything but auxiliary，Neuroscientist7(1)：42-54(2001))。β-亚基调节α-亚基在VGSC中的定位、表达和功能特性。
电压门控钠通道包括由9种不同的亚型(Nav1.1-Nav1.9)组成的家族。如表1所示，这些亚型显示出组织特异性定位和功能差异(参见Goldin，A.L.，Resurgence of sodium channel research，Annu Rev Physiol63：871-94(2001)；Wilson等人，Compositions useful as inhibitors ofvoltage-gated ion channels，US2005/0187217A1)。该基因家族的三个成员(Nav1.8，1.9，1.5)能抵抗熟知的钠通道阻滞剂河豚毒素(TTX)的阻断，从而证实在该基因家族内的亚型特异性。突变分析已经将谷氨酸387鉴定为TTX结合的关键残基(参见Noda，M.，H.Suzuki等人，Asingle point mutation confers tetrodotoxin and saxitoxin insensitivity onthe sodium channel II”FEBS Lett259(1)：213-6(1989))。
表1.具有大鼠TTX IC50值的VGSC家族。缩写：CNS＝中枢神经系统，PNS＝外周神经系统，DRG＝背根神经节，TG＝三叉神经节。(参见Wilson等人，Compositions useful as inhibitors of Voltage-gatedion channels，US2005/0187217A1；Goldin，Resurgence of SodiumChannel Research，Annu Rev Physiol63：871-94(2001))。
一般来讲，电压门控钠通道(Nav)负责引发神经系统的可兴奋组织中动作电位的快速上升，这些电位传递组成并编码正常和异常疼痛感觉的电信号。Nav通道的拮抗剂可衰减这些疼痛信号并可用于治疗多种疼痛病症，包括但不限于急性、慢性、炎性和神经性疼痛。已表明，已知的Nav拮抗剂诸如TTX、利多卡因、布比卡因、苯妥英、拉莫三嗪和卡马西平可用于减轻人类和动物模型中的疼痛。(参见Mao，J.和L.L.Chen，Systemic lidocaine for neuropathic pain relief，Pain87(1)：7-17(2000)；Jensen，T.S.，Anticonvulsants in neuropathic pain：rationale and clinical evidence，Eur J Pain6(Suppl A)：61-68(2002)；Rozen，T.D.，Antiepileptic drugs in the management of cluster headacheand trigeminal neuralgia，Headache41Suppl1：S25-32(2001)；Backonja，M.M.，Use of anticonvulsants for treatment of neuropathic pain，Neurology59(5Suppl2)：S14-7(2002))。
TTX敏感性、电压门控Nav1.7通道的α-亚基由SCN9A基因编码。Nav1.7通道优先地在背根神经节的外周感觉神经元中表达，其中一些神经元涉及疼痛的感知。在人类中，SCN9A基因中的突变已表明此基因在疼痛通路中的关键作用。例如，通过最近的临床基因连锁分析确立了Nav1.7通道在疼痛感知中的作用，这些分析揭露了SCN9A基因中的功能获得性突变作为遗传性疼痛综合征诸如原发性红斑肢痛症(PE)、遗传性红斑肢痛病(IEM)和阵发性剧痛症(PEPD)的病因学基础。(参见例如Yang等人，Mutations in SCN9A，encoding a sodium channelalpha subunit，in patients with primary erythermalgia，J.Med.Genet.41：171-174(2004)；Harty等人，Nav1.7mutant A863P in erythromelalgia：effects of altered activation and steady-state inactivation on excitability ofnociceptive dorsal root ganglion neurons，J.Neurosci.26(48)：12566-75(2006)；Estacion等人，Nav1.7gain-of-function mutations as a continuum：A1632E displays physiological changes associated with erythromelalgiaand paroxysmal extreme pain disorder mutations and produces symptomsof both disorders，J.Neurosci.28(43)：11079-88(2008))。此外，Nav1.7的过表达已在强转移性前列腺癌细胞系中检测到。(Diss等人，Apotential novel marker for human prostate cancer：voltage-gated sodiumchannel expression in vivo，Prostate Cancer and Prostatic Diseases8：266-73(2005)；Uysal-Onganer等人，Epidermal growth factorpotentiates in vitro metastatic behavior human prostate cancer PC-3M cells：involvement of voltage-gated sodium channel，Molec.Cancer6：76(2007))。
SCN9A基因的功能丧失性突变导致原本健康的个体完全不能感受到任何形式的疼痛。(例如Ahmad等人，A stop codon mutation inSCN9A causes lack of pain sensation，Hum.Mol.Genet.16(17)：2114-21(2007))。
在条件性敲除小鼠中SCN9A基因的细胞特异性缺失降低它们感知机械性、热或炎性疼痛的能力。(Nassar等人，Nociceptor-specific genedeletion reveals a major role for Nav1.7(PN1)in acute and inflammatorypain，Proc.Natl.Acad.Sci，U S A.101(34)：12706-12711(2004))。
基于此类证据，降低背根神经节(DRG)外周感觉神经元中的Nav1.7通道活性或表达水平已被提议为有效的疼痛治疗措施，例如针对慢性疼痛、神经性疼痛和神经痛。(例如Thakker等人，Suppressionof SCN9A gene expression and/or function for the treatment of pain，WO2009/033027A2；Yeomans等人，Decrease in inflammatory hyperalgesiaby herpes vector-mediated knockdown of Nav1.7sodium channels inprimary afferents，Hum.Gene Ther.16(2)：271-7(2005)；Fraser等人，Potent and selective Nav1.7sodium channel blockers，WO2007/109324A2；Hoyt等人，Discovery of a novel class of benzazepinone Na(v)1.7blockers：potential treatments for neuropathic pain，Bioorg.Med.Chem.Lett.17(16)：4630-34(2007)；Hoyt等人，Benzazepinone Nav1.7blockers：Potential treatments for neuropathic pain，Bioorg.Med.Chem.Lett.17(22)：6172-77(2007))。
TTX敏感性、电压门控Nav1.3通道的α-亚基由SCN3A基因编码。据报道，人Nav1.3的四种剪接变体具有不同的生物物理特性。(Thimmapaya等人，Distribution and functional characterization of humanNav1.3splice variants，Eur.J.Neurosci.22：1-9(2005))。已表明，Nav1.3的表达在神经损伤后的DRG神经元内以及在脊髓损伤后的丘脑神经元中上调。(Hains等人，Changes in electrophysiological properties andsodium channel Nav1.3expression in thalamic neurons after spinal cordinjury，Brain128：2359-71(2005))。据报道，Nav1.3(K354Q)中的功能获得性突变与癫痫存在联系。(Estacion等人，A sodium channelmutation linked to epilepsy increases ramp and persistent current ofNav1.3and induces hyperexcitability in hippocampal neurons，Experimental Neurology224(2)：362-368(2010))。
由多种生物产生的毒素肽已演变为靶向离子通道。蛇、蝎子、蜘蛛、蜜蜂、蜗牛和海葵是产生毒液的生物的一些实例，这些毒液可作为强效及选择性靶向离子通道和受体的小生物活性毒素肽或“毒素”的丰富来源。在大多数情况下，这些毒素肽已通过结合到通道孔并物理阻断离子传导通路而演变为离子通道的强效拮抗剂或抑制剂。在一些其他情况下，正如狼蛛毒素肽中的一些，据发现该肽通过结合到孔外的区域(例如电压传感器域)而拮抗通道功能。
天然毒素肽通常为约20到约80个氨基酸长，包含2-5个二硫键并形成非常紧凑的结构。毒素肽(例如，得自蝎子、海葵和芋螺的毒液)已得到分离并针对它们对离子通道的影响进行了表征。此类肽似乎已从数量相对少的结构框架演变，这些结构框架尤其适合解决效力、稳定性和选择性的关键问题。(参见例如Dauplais等人，On theconvergent evolution of animal toxins：conservation of a diad of functionalresidues in potassium channel-blocking toxins with unrelated structures，J.Biol.Chem.272(7)：4302-09(1997)；Alessandri-Haber等人，Mapping thefunctional anatomy of BgK on Kv1.1，Kv1.2，and Kv1.3，J.Biol.Chem.274(50)：35653-61(1999))。蝎子和芋螺毒素肽中的大部分例如含有10-40个氨基酸和最多五个二硫键，从而形成通常耐蛋白水解的极其紧凑和受约束的结构(微蛋白)。芋螺毒素和蝎子毒素肽可基于它们的二硫键连接和肽折叠而划分成许多超家族。其中许多的溶液结构已通过核磁共振(NMR)光谱加以测定，从而示出了它们的紧凑结构并确认了它们家族折叠模式的保守性。(例如Tudor等人，Ionisationbehaviour and solution properties of the potassium-channel blocker ShKtoxin，Eur.J.Biochem.251(1-2)：133-41(1998)；Pennington等人，Role ofdisulfide bonds in the structure and potassium channel blocking activity ofShK toxin，Biochem.38(44)：14549-58(1999)；Jaravine等人，Three-dimensional structure of toxin OSK1from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom，Biochem.36(6)：1223-32(1997)；delRio-Portillo等人，NMR solution structure of Cn12，a novel peptide fromthe Mexican scorpion Centruroides noxius with a typical beta-toxinsequence but with alpha-like physiological activity，Eur.J.Biochem.271(12)：2504-16(2004)；Prochnicka-Chalufour等人，Solution structureof discrepin，a new K+-channel blocking peptide from the alpha-KTx15subfamily，Biochem.45(6)：1795-1804(2006))。保守的二硫键结构也可反映毒素家族的各药理学活性。(Nicke等人(2004)，Eur.J.Biochem.271：2305-19，表1；Adams(1999)，Drug Develop.Res.46：219-34)。例如，α-芋螺毒素具有定义明确的四个半胱氨酸/两个二硫键的环状结构(Loughnan，2004)并抑制烟碱型乙酰胆碱受体。相比之下，ω-芋螺毒素具有六个半胱氨酸/三个二硫键的环状结构(Nielsen，2000)并阻断钙通道。毒素的结构亚组已演变成抑制电压门控或钙激活钾通道。
蜘蛛毒液包含许多肽毒素，它们靶向电压门控离子通道，包括Kv、Cav和Nav通道。这些肽的其中许多是适形于抑制性胱氨酸结(inhibitory cystine knot，ICK)结构基序的门控调节剂。(参见Norton等人，The cystine knot structure of ion channel toxins and relatedpolypeptides，Toxicon36(11)：1573-1583(1998)；Pallaghy等人，Acommon structural motif incorporating a cystine knot and a triple-strandedβ-sheet in toxic and inhibitory polypeptides，Prot.Sci.3(10)：1833-6，(1994))。与一些蝎子和海葵毒素形成对比，许多蜘蛛毒素不影响失活率，但会通过限制电压传感器运动到开放通道构象而抑制通道活性，从而将它们的激活对电压的依赖性偏移到更正的电位。这些蜘蛛毒素中的许多在电压门控离子通道家族之内和之间是混杂的。
已报道了尤其是靶向VGSC的多种毒素肽。(参见Billen等人，Animal peptides targeting voltage-activated sodium channels，Cur.Pharm.Des.14：2492-2502，(2008))。已经描述了三类肽毒素：1)位点1毒素，μ-芋螺毒素，结合到通道的孔并物理阻塞传导通路；2)位点3毒素，包括α-蝎子毒素、一些海葵毒素和δ-芋螺毒素，结合到结构域IV的S3-S4接头并减缓通道失活；和3)位点4毒素，包括β-蝎子毒素，结合到结构域II中的S3-S4接头并促进通道激活。肽的位点3和位点4家族均改变Nav通道的打开概率以及影响门控转换并因而称为“门控调节剂”。
μ-芋螺毒素KIIIA(SEQ ID NO：530)(一种最初从木下芋螺(Conuskinoshitai)分离而得的位点1毒素)为16个氨基酸长的C端酰胺化肽，它包含6个用于构成3个分子内二硫键的半胱氨酸残基。其最初在两栖动物背根神经节(DRG)神经元中被表征为耐河豚毒素(TTX)钠通道的抑制剂。(参见Bulaj等人，Novel conotoxins from Conus striatus andConus kinoshitai selectively block TTX-resistant sodium channels，Biochem.44(19)：7259-7265，(2005))。随后在小鼠DRG神经元中发现其抑制TTX敏感性钠电流比抑制耐TTX钠电流更有效。(参见Zhang等人，Structure/function characterization of μ-conotoxin KIIIA，ananalgesic，nearly irreversible blocker of mammalian neuronal sodiumchannels，J.Biol.Chem.282(42)：30699-30706，(2007))。已发现，KIIIA通过以下等级次序的效力阻断在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中表达的克隆哺乳动物(啮齿动物)通道：Nav1.2＞Nav1.4＞Nav1.6＞Nav1.7＞Nav1.3＞Nav1.5。KIIIA的腹膜内注射已在福尔马林诱发的小鼠疼痛试验中以1.6nmol/小鼠(0.1mg/kg)的ED50证实了镇痛活性，而未观察到运动损害；在较高的剂量(10nmol)下观察到了一些运动损害但无麻痹活性。(参见Zhang等人，2007)。用丙氨酸取代Lys7和Arg10改变了最大阻断，而取代His12和Arg14则改变了Nav同种型特异性。(参见McArthur等人，Interactions of key charged residuescontributing to selective block of neuronal sodium channels byμ-conotoxin KIIIA，Mol.Pharm.80(4)：573-584，(2011))。KIIIA的“丙氨酸扫描”类似物已将Lys7、Trp8、Arg10、Asp11、His12和Arg14确定为对于针对rNav1.4的活性具有重要意义。(参见Zhang等人，2007)。KIIIA的NMR溶液结构将这些残基置于靠近分子C端的α-螺旋之内或附近。(参见Khoo等人，Structure of the analgesicμ-conotoxin KIIIA and effects on the structure and function of disulfidedeletion，Biochem.48(6)：1210-1219，(2009))。Cys1与Cys9之间的二硫键可通过取代丙氨酸(KIIIA[C1A，C9A])而移除，而不会在很大程度上降低化合物的活性。(参见Khoo等人，2009；Han等人，Structurallyminimized μ-conotoxin analogs as sodium channel blockers：implicationsfor designing conopeptide-based therapeutics，ChemMedChem4(3)：406-414，(2009))。将Cys2与Cys16之间的第二个二硫键替换为硒代半胱氨酸残基之间的二硒键已得到了KIIIA的二硫键缺失硒代芋螺肽(selenoconopeptide)。这些化合物保留了KIIIA的活性，但更容易合成。(参见Han等人，Disulfide-depleted selenoconopeptides：simplifiedoxidative folding of cysteine-rich peptides，ACS Med.Chem.Lett.1(4)：140-144，(2010))。天然结构已被进一步最大程度简化为具有Nav抑制活性的内酰胺稳定化螺旋肽支架。(参见Khoo等人，Lactam-stabilized helical analogues of the analgesic μ-conotoxin KIIIA，J.Med.Chem.54：7558-7566(2011))。KIIIA在VGSC传导孔的外庭中结合到神经毒素位点1并以全有或全无的方式阻断通道。最经的研究已表明，KIIIA的一些类似物只部分抑制钠电流并且可能能够同时与TTX和蛤蚌毒素(STX)结合。(参见Zhang等人，Cooccupancy of theouter vestibule of voltage-gated sodium channels by μ-conotoxin KIIIAand saxitoxin or tetrodotoxin，J.Neurophys.104(1)：88-97，(2010)；French等人，The tetrodotoxin receptor of voltage-gated sodium channels-perspectives from interactions with μ-conotoxins，Marine Drugs8：2153-2161，(2010)；Zhang等人，μ-Conotoxin KIIIA derivatives withdivergent affinities versus efficacies in blocking voltage-gated sodiumchannels.Biochem.49(23)：4804-4812，(2010)；Zhang等人，Synergisticand antagonistic interactions between tetrodotoxin and μ-conotoxin inblocking voltage-gated sodium channels，Channels3(1)：32-38，(2009))。
OD1(SEQ ID NO：589)是从伊朗黄蝎Odonthobuthus doriae的毒液中分离而得的α样毒素。(参见Jalali等人，OD1，the first toxin isolatedfrom the venom of the scorpion Odonthobuthus doriae active onvoltage-gated Na+channels，FEBS Lett.579(19)：4181-4186，(2005))。这种肽为65个氨基酸长，其酰胺化C端含有6个形成3个二硫键的半胱氨酸残基。OD1已被表征为Nav1.7调节剂，其损害快速失活(EC50＝4.5nM)、增加所有电压下的峰电流并诱导持续电流，具有针对Nav1.8和Nav1.3的选择性。(参见Maertens等人，Potent modulation ofthe voltage-gated sodium channel Nav1.7by OD1，a toxin from thescorpion Odonthobuthus doriae，Mol.Pharm.70(1)：405-414，(2006))。
虎纹捕鸟蛛毒素-IV(HWTX-IV；SEQ ID NO：528)是从中国捕鸟蜘蛛虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)中分离而得的35个残基C段肽酰胺，在6个半胱氨酸残基之间具有3个二硫桥。(参见Peng等人，Function and solution structure of huwentoxin-IV，a potent neuronaltetrodotoxin(TTX)-sensitive sodium channel antagonist from chinese birdspider Selenocosmia huwena，J.Biol.Chem.277(49)：47564-47571，(2002))。二硫键模式(C1-C4、C2-C5、C3-C6)和NMR溶液结构将HWTX-IV置于ICK结构家族中，因为C3-C6二硫键穿过由其他两个二硫桥(C1-C4和C2-C5)形成的16个残基的环。HWTX-IV以30nM的IC50值抑制成年大鼠DRG神经元中的TTX敏感性钠电流，但在高达100nM的浓度下也对耐TTX VGSC无影响。(参见Peng等人，2002)。另外，HWTX-IV针对大鼠海马神经元中的中枢神经元钠通道的效力为十二分之一，从而表明其可能对Nav1.7具有选择性。(参见Xiao等人，Synthesis and characterization of huwentoxin-IV，aneurotoxin inhibiting central neuronal sodium channels，Toxicon51(2)：230-239，(2008))。针对VGSC亚型测试HWTX-IV确定了相对灵敏性为hNav1.7(IC50＝26nM)＞rNav1.2＞＞rNav1.3＞rNav1.4≥hNav1.5。(参见Xiao等人，Tarantula huwentoxin-IV inhibits neuronalsodium channels by binding to receptor site4and trapping the domain IIvoltage sensor in the closed configuration，J.Biol.Chem.283(40)：27300-27313，(2008))。蛋白定点诱变标测了HWTX-IV与神经毒素位点4(结构域II之间的胞外S3-S4接头)的结合，并且其响应电压变化和通道激活的行为与结合到Nav1.7的电压传感器并将其捕获在静息构型一致。(参见Xiao等人，2008)。虎纹捕鸟蛛毒素-I(HWTX-I；SEQ ID NO：529)(一个相关的家族成员)对VGSC的效力较低，但对N型Cav通道具有活性。(参见Wang等人，The cross channelactivities of spider neurotoxin huwentoxin I on rat dorsal root ganglionneurons，Biochem.Biophys.Res.Comm.357(3)：579-583，(2007)；Chen等人，Antinociceptive effects of intrathecally administered huwentoxin-I，a selective N-type calcium channel blocker，in the formalin test inconscious rats，Toxicon45(1)：15-20，(2005)；Liang等人，Properties andamino acid sequence of huwentoxin-I，a neurotoxin purified from thevenom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena，Toxicon31(8)：969-78，(1993))。
从狼蛛智利绿丝绒(Thixopelma pruriens)的毒液中分离而得的ProTx-II(SEQ ID NO：531)是一种30个氨基酸的多肽，具有C端游离酸和6个形成3个二硫键的半胱氨酸残基。ProTx-II不同于ICK家族的其他成员，因为它在第五与第六个半胱氨酸残基之间只含三个残基而不是正常的4-11个。ProTx-II是若干Nav通道亚型(包括Nav1.2、Nav1.7(IC50＜1nM)、Nav1.5和Nav1.8)以及Cav3.1通道的强效抑制剂，但不包括Kv通道。(参见Middleton等人，Two tarantula peptidesinhibit activation of multiple sodium channels，Biochem.41(50)：14734-14747，(2002)；Priest等人，ProTx-I and ProTx-II：gatingmodifiers of voltage-gated sodium channels，Toxicon49(2)：194-201，(2007)；Edgerton等人，Inhibition of the activation pathway of the T-typecalcium channel CaV3.1by ProTxII，Toxicon56(4)：624-636，(2010))。针对Nav1.5测试了ProTx-II的“丙氨酸扫描”类似物，从而确定了Met6、Trp7、Arg13、Met19、Va120、Arg22、Leu23、Trp24、Lys27、Leu29和Trp30对于活性具有重要的意义。(参见Smith等人，Molecularinteractions of the gating modifier toxin ProTx-II with Nav1.5：impliedexistence of a novel toxin binding site coupled to activation，J.Biol.Chem.282(17)：12687-12697，(2007))。生物物理表征表明，ProTx-II与HwTx-IV的不同之处在于其与脂质膜相互作用的能力。(参见Smith等人，Differential phospholipid binding by site3and site4toxins：implications for structural variability between voltage-sensitive sodiumchannel comains，J.Biol.Chem.280(12)：11127-11133，(2005))。0.01和0.1mg/kg的ProTx-II静注剂量在大鼠中耐受良好，但1mg/kg的剂量是致命的。ProTx-II在机械性痛觉过敏研究中没有效果。(参见Schmalhofer等人，ProTx-II，a selective inhibitor of NaV1.7sodiumchannels，blocks action potential propagation in nociceptors，Mol.Pharm.74(5)：1476-1484，(2008))。以0.1mg/kg进行鞘内施用是致命的，而以较低的剂量在痛觉过敏研究中无效。将ProTx-II涂在去鞘皮神经上完全阻断了C纤维复合动作电位，但对完整纤维的动作电位传播影响极低。(参见Schmalhofer等人，2008)。据信，ProTx-II结合到Nav1.7的结构域II的S3-S4接头以抑制通道激活，但在较高的浓度下也可与结构域IV电压传感器相互作用并影响钠通道激活。(参见Xiao等人，The tarantula toxins ProTx-II and huwentoxin-IV differentially interactwith human Nav1.7voltage sensors to inhibit channel activation andinactivation，Mol.Pharm.78(6)：1124-1134，(2010)；Sokolov等人，Inhibition of sodium channel gating by trapping the domain II voltagesensor with protoxin II，Mol.Pharm.73(3)：1020-1028，(2008)；Edgerton等人，Evidence for multiple effects of ProTxII on activation gating inNaV1.5，Toxicon52(3)：489-500，(2008))。
毒素肽的产生在有毒生物中是一个复杂的过程，并在合成上是甚至更复杂的过程。由于它们的保守二硫键结构以及对有效氧化重折叠的需要，因此肽的合成存在挑战。(参见Steiner和Bulaj，Optimizationof oxidative folding methods for cysteine-rich peptides：a study ofconotoxins containing three disulfide bridges，J.Pept.Sci.17(1)：1-7，(2011)；Góngora-Benítez等人，Optimized Fmoc solid-phase synthesis ofthe cysteine-rich peptide Linaclotide，Biopolymers Pept.Sci.96(1)：69-80，(2011))。虽然毒素肽已用作离子通道的高选择性药理学抑制剂数年，但是毒素肽的高合成和重折叠成本以及它们在体内的短半衰期已阻碍了将这些肽用作治疗模式。对于鉴定作为离子通道治疗性拮抗剂的小分子抑制剂所作出的努力远比给予毒素肽本身的努力要多。一个例外是批准了将小ω-芋螺毒素MVIIA肽(齐考诺肽)用于治疗难治性疼痛，这种肽是神经元特异性N型电压敏感性钙通道的抑制剂。然而，齐考诺肽的合成和重折叠制备过程成本高昂，并且只产生具有极短体内半衰期(约4个小时)的小肽产物。
在人类中开展的小型临床试验表明，局部、非全身性注射非肽类河豚毒素在因癌症和/或化疗而遭受疼痛的患者中产生了疼痛缓解(Hagen等人，J Pain Symp Manag34：171-182(2007))。河豚毒素是一种非中枢神经系统渗透性钠通道(包括Nav1.3和Nav1.7)抑制剂；虽然其由于在钠通道亚型之中缺乏选择性而无法全身性使用，但是其功效对于在外周神经元中使用Nav1.7和/或Nav1.3抑制剂治疗慢性疼痛综合征可提供进一步的验证。
多肽通常表现出比小分子特有的靶标选择性更高的选择性的优点。Nav1.7和/或Nav1.3选择性的非中枢神经系统渗透性毒素肽和肽类似物是所需的，并通过本发明提供。
发明概要
本发明涉及物质组合物，该物质组合物包含分离的多肽，该分离的多肽为外周限制性Nav1.7抑制剂。在一个实施方案中，如本文所述，该分离的多肽为具有氨基酸序列DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF-NH2(SEQ IDNO：1)的Nav1.7和Nav1.3双重抑制剂，其为我们命名为“GpTx-1”的多肽，并且其从狼蛛智利红玫瑰(Grammostola porteri)中分离而得。本发明的其他实施方案包括GpTx-1的肽类似物。在其他实施方案中，本发明涉及物质组合物，该物质组合物包含具有下式的氨基酸序列的分离多肽：
Xaa 1Xaa 2Xaa 3Xaa 4Xaa 5Xaa 6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Xaa 10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15Xaa 16Xaa 17Xaa 18Xaa 19Xaa 20Xaa 21Xaa 22Xaa 23Xaa 24Xaa 25Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30Xaa 31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35Xaa 36Xaa 37Xaa 38//SEQ ID NO：475
或其药学上可接受的盐，
其中：
Xaa 1Xaa 2不存在；或者Xaa 1为任何氨基酸残基并且Xaa 2为任何氨基酸残基；或者Xaa 1不存在并且Xaa 2为任何氨基酸残基；
Xaa 3在Xaa 18为Cys时为Cys；或者Xaa 3在Xaa 18为SeCys时为SeCys；或者Xaa 3在Xaa 18为烷基氨基酸残基时为烷基氨基酸残基；
Xaa 4为酸性、疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 5为Gly、Ala、疏水性或碱性氨基酸残基；
Xaa 6为Gly、Ala、2-Abu、Nle、Nva或疏水性氨基酸残基；
Xaa 7为Gly、Ala、芳族或疏水性氨基酸残基；
Xaa 8为碱性、酸性或中性亲水性氨基酸残基，或Ala残基；
Xaa 9为碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 10在Xaa 24为Cys时为Cys；或者Xaa 10在Xaa 24为SeCys时为SeCys；
Xaa 11为任何氨基酸残基；
Xaa 12为Pro、酸性、中性或疏水性氨基酸残基；
Xaa 13为任何氨基酸残基；
Xaa 14为任何氨基酸残基；
Xaa 16为碱性、中性亲水性或酸性氨基酸残基，或Ala残基；
Xaa 17在Xaa 31为Cys时为Cys；或者Xaa 17在Xaa 31为SeCys时为SeCys；
Xaa 18为Cys、SeCys或烷基氨基酸残基；
Xaa 19为任何氨基酸残基；
Xaa 20为Pro、Gly、碱性或中性亲水性残基；
Xaa 21为碱性、疏水性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 22为疏水性或碱性氨基酸残基；
Xaa 23为疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 24为Cys或SeCys残基；
Xaa 25为Ser、Ala或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 26为Ala、酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 27为酸性、碱性、中性亲水性或疏水性残基；
Xaa 28为芳族或碱性氨基酸残基；
Xaa 29为酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 30为Trp、5-溴代Trp、6-溴代Trp、5-氯代Trp、6-氯代Trp、1-Nal、2-Nal或硫代Trp残基；
Xaa 31为Cys或SeCys；
Xaa 33为疏水性或芳族氨基酸残基；
Xaa 34为任何氨基酸残基；
Xaa 35为疏水性氨基酸残基；
Xaa 36、Xaa 37和Xaa 38的每一者独立地不存在或独立地为中性、碱性或疏水性氨基酸残基；
并且其中：
如果Xaa 3和Xaa 18均为Cys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硫键；或者如果Xaa 3和Xaa 18均为SeCys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硒键；
如果Xaa 10和Xaa 24均为Cys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硫键；或者如果Xaa 10和Xaa 24均为SeCys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硒键；
如果Xaa 17和Xaa 31均为Cys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硫键；或者如果Xaa 17和Xaa 31均为SeCys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硒键；
氨基末端残基任选地被乙酰化、生物素酰化或4-戊炔酰化或聚乙二醇化；并且
羧基末端残基任选地被酰胺化。
在特定实施方案中，该物质组合物包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：3-30、32-72、74-134、136-178、180-211、218-239、241-305、307-363、366-386、388-432、434-474、515-527、532-588、590、591、593-775、777、778、780-788、790-1049和1062-3086。
本发明包括物质组合物，该物质组合物包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：3-134、136-305、307-386、388-474、515-527、532-588、590、591、593-1049和1062-3086。
本发明还涵盖编码不含非规范氨基酸的SEQ ID NO：3-134、136-305、307-386、388-474、515-527、532-588、590、591、593-1049和1062-3086任一者的核酸(例如DNA或RNA)；包含该核酸的表达载体；以及包含该表达载体的重组宿主细胞。本发明的组合物提供治疗或预防疼痛例如持续性或慢性疼痛的有效方法。例如，Nav1.7和Nav1.3双重抑制剂可在一些形式的慢性疼痛中有效，尤其是在单独的Nav1.7抑制不够的情况下。针对脱靶钠通道尤其是控制心肌兴奋性(Nav1.5)和骨骼肌兴奋性(NaV1.4)的那些通道的敏感性是任何全身递送性治疗剂的基本要素。这种选择性对于双重抑制剂而言是一项特别高的障碍。本发明的组合物提供针对Nav1.5和Nav1.4的这种选择性。例如，GpTx-1肽(SEQ ID NO：1)是Nav1.4的弱抑制剂。此外，Nav1.4的抑制强烈依赖于状态，使得GpTx-1对Nav1.4的生理、非失活状态产生可以忽略的作用。(这是GpTx-1与河豚毒素之间的关键区别，河豚毒素具有对Nav1.4的极低选择性，并且等同地抑制Nav1.4的失活和非失活状态)。
因此，本发明还涉及包含本发明的物质组合物和药学上可接受的载体的药物组合物或药物。
GpTx-1和GpTx-1肽类似物还可用作研究工具。迄今为止，还没有可用的Nav1.7或Nav1.3特异性生化探针，尤其是没有针对活细胞质膜中正确折叠的功能性Nav1.7的探针。由于GpTx-1及其同类物抑制Nav1.7/Nav1.3，因此它们显然以高效力和选择性结合到通道分子。如通过NMR以及通过残基取代所限定在GpTx-1的非活性位点用荧光或其他示踪基团进行标记可提供适用于但不限于对钠通道进行定位、对表达钠通道的细胞进行分类以及对结合到Nav1.7或Nav1.3的肽进行筛选或淘选的研究工具。
附图简述
图1(上图)显示了从智利红玫瑰提取的粗毒液的反相(RP)HPLC分离。沿着x轴的刻度线表示分级分离的时间片。图1(下图)显示在Nav1.7IonQuatrro(IWQ)测定中分离的毒液级分的活性(对照百分比，POC)。级分31(以矩形框表示)包含RP-HPLC色谱图中的主峰，在离子通道测定中表现出＞80％的抑制，并随后进行解卷积处理得到GpTx-1(SEQ ID NO：1)。
图2(插图)显示对得自智利红玫瑰毒液初步分离的指定级分(31)进行的高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。箭头表明最终鉴定为GpTx-1的分子量为4071Da的肽不同电离状态所观测的(m/z)比。质谱中的附加峰表明毒液级分为至少四种不同肽的混合物。
图3显示对从智利红玫瑰毒液分离中获得的级分31进行的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析。插图显示低和中间质量范围。m/z比为4074.9的峰最终被鉴定为GpTx-1，但是该级分为至少四种不同肽的混合物。
图4(上图)显示对得自智利红玫瑰毒液初步分离的级分31中的材料进行的RP-HPLC分离(次分级分离)。沿着x轴的刻度线表示次分级分离的时间片。图4(下图)显示在Nav1.7IonQuatrro(IWQ)测定中分离的窄级分的活性(POC)。RP-HPLC色谱图中的主峰在Nav1.7测定中活性最高，并经解卷积处理鉴定出GpTx-1。
图5显示合成的GpTx-1的LC-MS分析。上图显示在214nm处的紫外吸收的RP-HPLC色谱图。下图显示ESI-MS检测器的总离子计数(TIC)。
图6显示在图5中保留时间(rt)为6.75分钟的峰的ESI-MS分析。m/z比为1358.8和1019.4的峰分别表示GpTx-1的[M+3H]3+和[M+3H]4+电荷态，GpTx-1具有4071.9Da的单一同位素分子量。
图7显示得自GpTx-1的NMR光谱结构测定的20个能量最低构象()的肽主链的重叠。
图8显示得自GpTx-1的NMR光谱结构测定的20个能量最低构象()的肽重原子的重叠。
图9显示得自GpTx-1的NMR光谱结构测定的肽主链和二硫键(编号对应于半胱氨酸残基)的带状图示。
图10显示由C端β链以及残基Phe5和Met6形成的疏水性推定结合面朝向读者取向而取向的GpTx-1。右侧是肽主链的带状图示，其中示出了关键残基的侧链，而左侧则显示了分子部分透明的表面的渲染。
图11(左)显示具有不透明表面的GpTx-1的疏水性推定结合面。在右侧，已将分子顺时针旋转了90°，以显示出肽的平坦疏水性面与亲水性(溶剂暴露的)面之间的拓扑对比。
图12A-N显示了本发明的组合物的一些实施方案的示意性结构，其包含通过任选的肽基接头部分(诸如但不限于本文所述的L5或L10)而与免疫球蛋白的一个或多个结构域融合的药理学活性毒素(例如GpTx-1)或毒素(例如GpTx-1)肽类似物(花体)的一个或多个单元。这些示意图显示了更典型的IgG1，但是它们也旨在适用于IgG2(其将具有铰链中的4个二硫键和不同的连接重链与轻链的二硫键排列)以及IgG3和IgG4。图12A表示单价异二聚Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物，其中毒素肽类似物融合到或偶联到免疫球蛋白Fc结构域单体之一的C端末端。图12B表示二价同二聚Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物，其中毒素肽类似物融合到两个免疫球蛋白Fc结构域单体的C端末端。图12C表示单价异二聚Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物，其中毒素肽类似物融合到或化学偶联到免疫球蛋白Fc结构域单体之一的N端末端。图12D表示二价同二聚毒素肽类似物-Fc融合体或偶联物，其中毒素肽类似物融合到两个免疫球蛋白Fc结构域单体的N端末端。图12E表示包含免疫球蛋白重链(HC)+免疫球蛋白轻链(LC)+免疫球蛋白Fc单体的单价异三聚Fc-毒素肽类似物/Ab，其中毒素肽类似物融合到其C端末端。图12F表示单价异四聚(HT)抗体HC-毒素肽类似物融合体或偶联物，其中毒素肽类似物融合到HC单体之一的C端末端。图12G表示二价HT抗体Ab HC-毒素肽类似物融合体或偶联物，其中毒素肽类似物位于两个HC单体的C端末端上。图12H表示单价HT毒素肽类似物-LC Ab，其中毒素肽类似物融合到LC单体之一的N端末端。图12I表示单价HT毒素肽类似物-HC Ab，其中毒素肽类似物融合到HC单体之一的N端末端。图12J表示单价HT Ab LC-毒素肽类似物融合体或偶联物(即LC-毒素肽类似物融合体或偶联物+LC+2(HC))，其中毒素肽类似物融合到LC单体之一的C端末端。图12K表示二价HT Ab LC-毒素肽类似物融合体或偶联物(即2(LC-毒素肽类似物融合体或偶联物)+2(HC))，其中毒素肽类似物融合到两个LC单体的C端末端。图12L表示三价HT Ab LC-毒素肽类似物/HC-毒素肽类似物(即2(LC-毒素肽类似物融合体或偶联物)+HC-毒素肽类似物融合体或偶联物+HC)，其中毒素肽类似物融合到两个LC单体和一个HC单体的C端末端。图12M表示二价抗体，其中毒素肽类似物部分插入每个HC单体的免疫球蛋白Fc结构域的内部环。图12N表示单价抗体，其中毒素肽类似物部分插入HC单体之一的免疫球蛋白Fc结构域的内部环。在表达编码单链的脱氧核糖核酸(DNA)构建体时，二聚体或三聚体将在某些宿主细胞中自发形成。在其他宿主细胞中，可将细胞置于有利于形成二聚体/三聚体的条件下，或者可以在体外形成二聚体/三聚体。如果不止一个HC单体、LC单体或免疫球蛋白Fc结构域单体构成单个实施方案的一部分，则各个单体可根据需要彼此相同或不同。
图13A-F示出在人三叉神经节中(图13A-B)以及在人背根神经节中(图13C-F)检测Nav1.7信使RNA表达的原位杂交研究。图13A、图13C、图13E显示苏木精和伊红(H ＆ E)染色的细胞；图13B、图13D和图13F显示通过作为蓝色点的33P标记反义探针的杂交而进行的Nav1.7表达。Nav1.7特异性染色也在胃和小肠的肠肌丛中检测到。未在人小脑、大脑皮层、肾上腺髓质或垂体中检测到Nav1.7特异性染色，在下丘脑核中只检测到轻微的染色。脊髓中的染色限于腹侧运动区中的轻微染色以及限于脊髓室管膜(中央管衬里的上皮细胞)。所有染色均在无RNA酶的条件下在福尔马林固定石蜡包埋组织上完成。通过以下方法确认了Nav1.7的特异性探针：确认在表达克隆人类Nav1.7的HEK-293T细胞系上存在正信号以及在表达任何以下钠通道的细胞系上以及在亲本293T细胞系上不存在信号：hNav1.1(HEK-293T)、hNav1.2(CHO)、hNav1.3(CHO)、hNav1.4(HEK-293T)、hNav1.5(HEK-293T)、hNav1.6(HEK-293T)、rNav1.3(HEK-293T)。
图14A-E显示从大鼠感觉神经节急性分离的各个神经元表达异质性钠电流群。各个神经元表达了快速、河豚毒素敏感性钠电流(可能是Nav1.7和Nav1.3)，缓慢、耐河豚毒素钠电流(可能是Nav1.8)或混合群(没有一种电流类型编码的电流大于总钠电流的90％)。图14A-C显示表达快速TTX-S(图14A)、混合(图14B)或缓慢TTX-R(图14C)钠电流的神经元的实例。图14D-E示出从经历了脊神经结扎(“SNL”)手术(图14E)的大鼠的感觉神经节分离的神经元表达的快速TTX-S电流的比例比对照大鼠(图14D)大得多。
图15A-B显示KIIIA(SEQ ID NO：530)、GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：1)、虎纹捕鸟蛛毒素-IV(SEQ ID NO：528)、虎纹捕鸟蛛毒素-I(SEQID NO：529)和ProTx II(SEQ ID NO：531)的序列比对。
图16显示在1mg/kg皮下(“s.c.”)施用后小鼠血浆中GpTx-1的浓度-时间曲线。GpTx-1浓度在三只动物的两只中低于定量下限，并且无法获得曲线。
图17A显示在1mg/kg静脉内(“i.v.”)施用后两只小鼠血浆中[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)的浓度-时间曲线。(第三只小鼠中的暴露量低于定量限，并且无法获得曲线)。
图17B显示在5mg/kg s.c.剂量(n＝3)、1mg/kg s.c.剂量(n＝2)和1mg/kg静脉内(i.v.)剂量(n＝2)后小鼠血浆中[Ala5]GpTx-1(SEQ IDNO：22)的平均血浆浓度-时间曲线。对于5mg/kg的剂量，血浆中的肽浓度以大约0.6μM持续3小时，通过(PX)测定是体外Nav1.7IC50的大约40倍。
图18显示针对hERG测试的GpTx-1(SEQ ID NO：1；n＝7)、[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22；n＝8)和BSA对照的剂量反应关系。两种化合物的IC50值均＞10μM。
图19A显示针对hNav1.5测试的GpTx-1(SEQ ID NO：1；n＝7)的剂量反应关系。GpTx-1的IC50值为9.8μM。
图19B显示针对hNav1.5测试的[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22，n＝9)的剂量反应关系。[Ala5]GpTx-1的IC50值＞30μM。
图20显示GpTx-1(SEQ ID NO：1)对hNav1.7通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向hNav1.7电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示GpTx-1前的hNav1.7电流，而‘100nM GpTx-1’曲线则显示添加GpTx-1后的hNav1.7电流。
图21显示针对hNav1.7通道的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的剂量反应曲线。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.7电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.7电流。针对hNav1.7通道的GpTx-1的IC50为7.40nM。
图22显示针对hNav1.7通道的渐增浓度的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的时间进程。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“基线”表示在不存在GpTx-1时的hNav1.7电流，而“洗涤”则表示移除GpTx-1后的hNav1.7电流。
图23显示GpTx-1(SEQ ID NO：1)对hNav1.3通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向hNav1.3电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示GpTx-1前的hNav1.3电流，而‘300nM GpTx-1’曲线则显示添加GpTx-1后的hNav1.3电流。
图24显示针对hNav1.3通道的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的剂量反应曲线。峰值内向hNav1.3电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.3电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.3电流。针对hNav1.3通道的GpTx-1的IC50为16.8nM。
图25显示针对hNav1.3通道的渐增浓度的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的时间进程。峰值内向hNav1.3电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“基线”表示在不存在GpTx-1时的hNav1.3电流，而“洗涤”则表示移除GpTx-1后的hNav1.3电流。
图26显示GpTx-1(SEQ ID NO：1)对hNav1.4通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向hNav1.4电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示GpTx-1前的hNav1.4电流，而‘3μM GpTx-1’曲线则显示添加GpTx-1后的hNav1.4电流。
图27显示针对hNav1.4通道的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的剂量反应曲线。峰值内向hNav1.4电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.4电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.4电流。针对hNav1.4通道的GpTx-1的IC50为2.9μM。
图28显示针对hNav1.4通道的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的剂量反应曲线。峰值内向hNav1.4电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。注意，GpTx-1在通道部分失活时对hNav1.4的效力更高。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.4电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.4电流。针对部分失活的hNav1.4通道的GpTx-1的IC50为0.26μM。
图29显示针对hNav1.4通道的渐增浓度的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的时间进程。峰值内向hNav1.4电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“基线”表示在不存在GpTx-1时的hNav1.4电流，而“洗涤”则表示移除GpTx-1后的hNav1.4电流。
图30显示针对hNav1.4通道的渐增浓度的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的时间进程。峰值内向hNav1.4电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV(方形)或产生约20％失活(圆形)的电位下。“基线”表示在不存在GpTx-1时的hNav1.4电流，而“洗涤”则表示移除GpTx-1后的hNav1.4电流。注意，GpTx-1在通道部分失活时对hNav1.4的效力更高。
图31显示GpTx-1(SEQ ID NO：1)对hNav1.5通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向hNav1.5电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示GpTx-1前的hNav1.5电流，而‘3μM GpTx-1’曲线则显示添加GpTx-1后的hNav1.5电流。
图32显示针对hNav1.5通道的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的剂量反应曲线。峰值内向hNav1.5电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.5电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.5电流。针对hNav1.5通道的GpTx-1的IC50为8.9μM。
图33显示针对hNav1.5通道的渐增浓度的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的时间进程。峰值内向hNav1.5电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“基线”表示在不存在GpTx-1时的hNav1.5电流，而“洗涤”则表示移除GpTx-1后的hNav1.5电流。
图34显示[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)对hNav1.7通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向hNav1.7电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示添加[Ala5]GpTx-1前的hNav1.7电流，而“300nM[Ala5]GpTx-1”迹线则显示添加[Ala5]GpTx-1后的hNav1.7电流。细胞被保持在产生约20％失活的电位下。
图35显示针对hNav1.7通道的[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)的剂量反应曲线。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的[Ala5]GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.7电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.7电流。针对部分失活的hNav1.7通道的[Ala5]GpTx-1的IC50为13.2nM。
图36显示针对hNav1.7通道的渐增浓度的[Ala5]GpTx-1(SEQ IDNO：22)的时间进程。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的[Ala5]GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV(方形)或产生约20％失活(圆形)的电位下。“基线”表示在不存在[Ala5]GpTx-1时的hNav1.7电流，而“洗涤”则表示移除[Ala5]GpTx-1后的hNav1.7电流。
图37显示在小鼠背根神经节(DRG)神经元中针对TTX敏感性Nav通道的渐增浓度的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的时间进程。峰值内向Nav电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“对照”表示在不存在GpTx-1时的Nav电流，‘TTX’表示在存在300nM TTX时的Nav电流，而“洗涤”则表示在移除GpTx-1和TTX后的Nav电流。注意，GpTx-1阻断了几乎所有TTX敏感性Nav电流。在该研究中测得的电流几乎均为基于失活的快速动力学在记录开始时鉴定的TTX敏感性电流。
图38显示在小鼠DRG神经元中针对TTX敏感性Nav通道的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的代表性剂量反应曲线。峰值内向Nav电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。在mDRG神经元中针对TTX敏感性钠通道的GpTx-1的IC50值经测得为7.1nM。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的TTX敏感性电流，而0则表示完全阻断后的TTX敏感性电流。
图39显示在小鼠DRG神经元中单一浓度的GpTx-1(SEQ IDNO：1)对TTX敏感性Nav通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向Nav电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示添加GpTx-1前的Nav电流，而“200nM GpTx-1”迹线则显示添加GpTx-1后的Nav电流。注意，对照电流在几毫秒内完全失活，其将TTX敏感性电流与耐TTX电流区分开来。
图40显示在小鼠DRG神经元中针对TTX敏感性Nav通道的渐增浓度的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的时间进程。峰值内向Nav电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。“对照”表示在不存在GpTx-1时的Nav电流，“TTX”表示在存在300nM TTX时的Nav电流，而“洗涤”则表示在移除GpTx-1和TTX后的Nav电流。注意，GpTx-1阻断了所有TTX敏感性Nav电流，因为300nM的TTX未额外阻断电流。
图41显示在小鼠DRG神经元中针对TTX敏感性Nav通道的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的代表性剂量反应曲线，如通过快速失活动力学所限定。峰值内向Nav电流在存在渐增浓度的GpTx-1时在-10mV下测量；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。在mDRG神经元中针对TTX敏感性钠通道的GpTx-1的IC50值经测得为4.7nM。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的TTX敏感性电流，而0则表示完全阻断后的TTX敏感性电流。
图42显示在小鼠DRG神经元中GpTx-1(SEQ ID NO：1)对TTX敏感性Nav通道的作用。细胞被保持在产生约20％失活的电位下，峰值内向Nav电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示添加GpTx-1前的Nav电流，而“200nM GpTx-1”迹线则显示添加GpTx-1后的Nav电流。
图43显示在小鼠DRG神经元中针对TTX敏感性Nav通道的渐增浓度的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)的时间进程。峰值内向Nav电流在存在渐增浓度的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“对照”表示在不存在[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)时的Nav电流，“TTX”’表示在存在300nM TTX时的Nav电流，而“洗涤”则表示在移除[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)和TTX后的Nav电流。注意，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)阻断了几乎所有TTX敏感性Nav电流。
图44显示在小鼠DRG神经元中针对TTX敏感性Nav通道的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)的代表性剂量反应曲线。峰值内向Nav电流在存在渐增浓度的[Ala5]GpTx-1(1-34)时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。在mDRG神经元中针对TTX敏感性钠通道的[Ala5]GpTx-1(1-34)的IC50值经测得为17.0nM。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的TTX敏感性电流，而0则表示完全阻断后的TTX敏感性电流。
图45显示在小鼠DRG神经元中[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)对TTX敏感性Nav通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向Nav电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示在添加[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)前的Nav电流，“300nM SEQ IDNO：22”迹线显示在添加SEQ ID NO：22后的Nav电流，而“300nM SEQID NO：22+300nM TTX”迹线则显示在添加SEQ ID NO：22和TTX后的Nav电流。注意，[Ala5]GpTx-1(1-34)选择性阻断了TTX敏感性Nav电流，但不阻断耐TTX Nav电流。
图46显示针对hNav1.7通道的渐增浓度的肽单体[Phe6，Atz13]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：591)同二聚偶联物(同二聚偶联物1)的时间进程。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“对照”表示在不存在同二聚偶联物1时的人类Nav1.7(hNav1.7)电流，而“洗涤”则表示在移除同二聚偶联物1后的hNav1.7电流。
图47显示针对人类Nav1.7通道的同二聚偶联物1的代表性剂量反应曲线。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。针对hNav1.7钠通道的同二聚偶联物1的IC50值经测得为1.2nM。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.7电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.7电流。
图48显示在洗出同二聚偶联物1后hNav1.7电流的恢复。峰值内向hNav1.7电流在存在3nM或300nM同二聚偶联物1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“对照”表示在不存在同二聚偶联物1时的hNav1.7电流，而“洗涤”则表示在移除同二聚偶联物1后的hNav1.7电流。注意，hNav1.7电流在洗出3nM同二聚偶联物1后部分恢复，但未在洗出300nM同二聚偶联物1后恢复。
图49显示同二聚偶联物1对hNav1.7通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向hNav1.7电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示在添加同二聚偶联物1前的hNav1.7电流，而“10nM同二聚偶联物1”迹线则显示在添加同二聚偶联物1后的hNav1.7电流。
图50显示针对hNav1.7通道的渐增浓度的同二聚偶联物1的时间进程。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。“对照”表示在不存在同二聚偶联物1时的hNav1.7电流，而“洗涤”则表示在移除同二聚偶联物1后的hNav1.7电流。
图51显示针对hNav1.7通道的同二聚偶联物1的代表性剂量反应曲线。峰值内向hNav1.7电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下测量；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。在mDRG神经元中针对TTX敏感性钠通道的同二聚偶联物1的IC50值经测得为0.66nM。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.7电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.7电流。
图52显示同二聚偶联物1对hNav1.7通道的作用。细胞被保持在产生约20％失活的电位下，峰值内向hNav1.7电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示在添加同二聚偶联物1前的hNav1.7电流，而“3nM同二聚偶联物1”迹线则显示在添加同二聚偶联物1后的hNav1.7电流。
图53显示针对hNav1.5通道的渐增浓度的同二聚偶联物1的时间进程。峰值内向hNav1.5电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在-140mV。“对照”表示在不存在同二聚偶联物1时的hNav1.5电流，而“洗涤”则表示在移除同二聚偶联物1后的hNav1.5电流。注意，hNav1.5电流在洗出同二聚偶联物1后部分恢复。
图54显示针对hNav1.5通道的同二聚偶联物1的代表性剂量反应曲线。峰值内向hNav1.5电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下测量；细胞被保持在-140mV。针对hNav1.5钠通道的同二聚偶联物1的IC50值经测得为75.5nM。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.5电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.5电流。
图55显示同二聚偶联物1对hNav1.5通道的作用。细胞被保持在-140mV，峰值内向hNav1.5电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示在添加同二聚偶联物1前的hNav1.5电流，而“2μM同二聚偶联物1”迹线则显示在添加同二聚偶联物1后的hNav1.5电流。
图56显示针对hNav1.5通道的渐增浓度的同二聚偶联物1的时间进程。峰值内向hNav1.5电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下每10秒测量一次；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。“对照”表示在不存在同二聚偶联物1时的hNav1.5电流，而“洗涤”则表示在移除同二聚偶联物1后的hNav1.5电流。
图57显示针对hNav1.5通道的同二聚偶联物1的代表性剂量反应曲线。峰值内向hNav1.5电流在存在渐增浓度的同二聚偶联物1时在-10mV下测量；细胞被保持在产生约20％失活的电位下。针对hNav1.5钠通道的同二聚偶联物1的IC50值经测得为57nM。将电流通过100和0归一化，100表示未添加肽时的Nav1.5电流，而0则表示完全阻断后的Nav1.5电流。
图58显示同二聚偶联物1对hNav1.5通道的作用。细胞被保持在产生约20％失活的电位下，峰值内向hNav1.5电流在-10mV下测量。“基线”迹线显示在添加同二聚偶联物1前的hNav1.5电流，而“2μM同二聚偶联物1”迹线则显示在添加同二聚偶联物1后的hNav1.5电流。
图59显示在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中采用5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)的作用的时间进程。肽对第一或急性期(福尔马林注射后0-5分钟)无作用。与媒介物(PBS)相比，肽显著缩短了在第二期(福尔马林注射后5-40分钟，与脊髓敏感化相关)抬起和/或舔受影响的爪子所花的时间。在该实验中，用作阳性对照的1mg/kg的吗啡皮下剂量不足以显著减轻动物中的疼痛反应，在以下的研究中将其增至3mg/kg。肽的末期血浆暴露(在福尔马林注射后45分钟时的肽血浆浓度)为0.80±0.21μM。
图60显示在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中采用5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中的作用。肽和吗啡阳性对照均未显著缩短第一期中抬起和/或舔受影响的爪子所花的时间。在该第一期中畏缩的药理学减轻通常反映对动物运动、意识或健康的非特异性作用，而非疼痛的实际减轻。
图61显示在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中采用5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在第二期(福尔马林注射后5-40分钟)中的作用。肽但非吗啡对照显著缩短了第二期中抬起和/或舔受影响的爪子所花的时间。同样，吗啡阳性对照不产生作用不能反映试验“失败”，而是反映小鼠对该浓度吗啡的反应的波动。将以后实验的吗啡剂量增至3mg/kg。
图62显示在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中采用5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)对爪子肿胀的作用。相对于媒介物(PBS)，肽和吗啡阳性对照均未显著减轻福尔马林注射所导致的爪子肿胀。
图63显示在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛重复模型中采用5、1.67和0.5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)的作用的时间进程。肽在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中在任何剂量下均无作用。阳性对照(3mg/kg的吗啡皮下剂量)确实显著缩短了第一期中抬起/舔受影响的爪子所花的时间。5mg/kg的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)皮下剂量证实了在研究第二期中抬爪/舔爪所花的时间的显著缩短，与吗啡阳性对照一样。较低的肽剂量(1.67和0.5mg/kg s.c.)相对于媒介物在第二期中无作用。末期暴露(福尔马林注射后45分钟时的肽血浆浓度)对于5.0、1.67和0.5mg/kg的剂量而言分别为0.58±0.26μM、0.15±0.05μM和0.04±0.2μM。
图64显示采用5、1.67和0.5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第一期中[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQID NO：22)的作用。肽相对于媒介物在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中在任何剂量下均无作用，但阳性对照(3mg/kg的吗啡皮下剂量)确实显著缩短了第一期中抬起/舔受影响的爪子所花的时间。
图65显示采用5、1.67和0.5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第二期中[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQID NO：22)的作用。5mg/kg的肽皮下剂量证实了在研究第二期中抬爪/舔爪所花的时间的显著缩短，与吗啡阳性对照一样。较低的肽剂量(1.67和0.5mg/kgs.c.)相对于媒介物在第二期中无作用。
图66显示采用5、1.67和0.5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)对爪子肿胀的作用。相对于媒介物(PBS)，肽和吗啡对照均未显著减轻福尔马林注射所导致的爪子肿胀。
图67显示在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛第三平行模型中采用5、3和1mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)的作用的时间进程。5mg/kg的肽剂量和3mg/kg的吗啡皮下剂量(30分钟预处理)在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中无作用。然而，较低的肽剂量(1和3mg/kg s.c.)似乎相对于媒介物对照增加了抬爪/舔爪所花的时间。5mg/kg的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)皮下剂量证实了在研究第二期中抬爪/舔爪所花的时间的显著缩短，与吗啡阳性对照一样。然而，较低的肽剂量未在第二期中显示出相对于媒介物对照抬爪/舔爪行为的减轻。1mg/kg s.c.组与媒介物对照并无明显不同，而3mg/kg s.c.组似乎显著增加了第二期中抬爪/舔爪所花的时间。末期暴露(福尔马林注射后45分钟时的肽血浆浓度)对于5.0、3和1mg/kg的剂量而言分别为1.84±0.18μM、0.53±0.23μM和0.20±0.05μM。
图68显示采用5、3和1mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第一期中[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)的作用。5mg/kg的肽剂量和3mg/kg的吗啡皮下剂量在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中无作用。然而，较低的肽剂量(1和3mg/kg s.c.)似乎相对于对照增加了抬爪/舔爪所花的时间。
图69显示采用5、3和1mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第二期中[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)的作用。5mg/kg的肽皮下剂量证实了在研究第二期中抬爪/舔爪所花的时间的显著缩短，与吗啡阳性对照一样。然而，较低的肽剂量未在第二期中显示出相对于媒介物对照抬爪/舔爪行为的减轻。1mg/kg s.c.组与媒介物对照并无明显不同，而3mg/kg s.c.组似乎显著增加了第二期中抬爪/舔爪所花的时间。
图70显示采用5、3和1mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)对爪子肿胀的作用。相对于媒介物(PBS)，肽和吗啡对照均未显著减轻福尔马林注射所导致的爪子肿胀。
图71显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在3和5mg/kg s.c.剂量下通过1小时的预处理时间对雄性CD-1小鼠自主活动的总基本运动分量的作用。没有一种肽剂量相对于媒介物对照显著减少了探索行为。末期暴露(肽注射后2h时的肽血浆浓度)对于5和3mg/kg s.c.剂量而言分别为1.79±0.38和0.89±0.33μM。
图72显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在3和5mg/kg s.c.剂量下通过1小时的预处理时间对雄性CD-1小鼠自主活动的细微运动分量的作用。在3mg/kg的剂量下，细微运动未受到显著影响。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物显著减少了总细微运动。
图73显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在3和5mg/kg s.c.剂量下通过1小时的预处理时间对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立分量的作用。没有一种肽剂量相对于媒介物对照显著减少了探索行为。
图74显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在3和5mg/kg s.c.剂量下通过1小时的预处理时间对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立时间分量的作用。在3mg/kg的剂量下，总直立时间未受到显著影响。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物显著减少了总直立时间。
图75显示在注射藜芦定后20分钟测得的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)以5mg/kg s.c.剂量通过1小时的预处理时间以及美西律以30mg/kg腹膜内(“i.p.”)剂量通过30分钟的预处理时间对藜芦定诱导的(1μg背侧爪子注射)雄性CD-1小鼠自发疼痛行为的作用。总体上，被美西律明显逆转的媒介物组中存在良好的抬爪反应。在5mg/kg下，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)未明显减少抬爪行为。在所有组中均为爪子肿胀的减轻。
图76显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)以5mg/kg s.c.剂量通过1小时的预处理时间以及美西律以30mg/kg i.p.剂量通过30分钟的预处理时间对藜芦定诱导的(1μg背侧爪子注射)雄性CD-1小鼠爪子肿胀的作用。在所有组中均为爪子肿胀的减轻。
图77显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)以5mg/kg s.c.剂量通过1小时的预处理时间以及美西律以30mg/kg i.p.剂量通过30分钟的预处理时间对藜芦定诱导的(1μg背侧爪子注射)雄性CD-1小鼠自发疼痛行为的作用的时间进程。总体上，在整个实验过程中，被美西律明显逆转的媒介物组中存在良好的抬爪反应。在5mg/kg下，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)未能明显减轻整实验过程中的抬爪行为，然而确实倾向于在第10-15和15-20分钟时间区间中减少抬爪和舔爪。末期暴露(肽注射后1.5小时的肽血浆浓度)对于5mg/kg剂量而言为0.70±0.10μM。
图78显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)以1和5mg/kg s.c.剂量通过1小时的预处理时间(n＝9-10)以及美西律以30mg/kg i.p.剂量通过30分钟的预处理时间(n＝10)对藜芦定诱导的(1μg背侧爪子注射)雄性CD-1小鼠自发疼痛行为的重复测试。总体上，被美西律明显逆转的媒介物组中存在良好的抬爪反应。在1和5mg/kg下，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)未明显减少抬爪行为。
图79显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)以1和5mg/kg s.c.剂量通过1小时的预处理时间以及美西律以30mg/kg i.p.剂量通过30分钟的预处理时间对藜芦定诱导的(1μg背侧爪子注射)雄性CD-1小鼠爪子肿胀的作用。在任何组中均无爪子肿胀的减轻。
图80显示[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)以1和5mg/kg s.c.剂量通过1小时的预处理时间以及美西律以30mg/kg i.p.剂量通过30分钟的预处理时间对藜芦定诱导的(1μg背侧爪子注射)雄性CD-1小鼠自发疼痛行为的作用的时间进程。总体上，在整个实验过程中，被美西律明显逆转的媒介物组中存在良好的抬爪反应。在1和5mg/kg下，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)未在实验过程中的任何时间点显著减少抬爪行为。末期暴露(肽注射后1.5小时的肽血浆浓度)对于5和1mg/kg剂量而言分别为0.72±0.13和0.09±0.05μM。
图81A显示通过铜催化的1，3-偶极环加成反应发生的含炔烃的肽[Phe6；Pra13]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：1049)与2kDa PEG二叠氮化物的反应，以通过将序列中的炔丙基甘氨酸或Pra残基转化成3-(1，2，3-三唑-4-基)丙氨酸或Atz残基而得到具有两个三唑键合的位点特异性同二聚肽。
图81B显示两步序列：首先通过铜催化的1，3-偶极环加成反应使含炔烃的肽[Ala5，Phe6，Pra13，Leu26，Arg28]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：640)与叠氮基-PEG11-溴乙酰胺接头反应，以通过将肽序列中的炔丙基甘氨酸或Pra残基转化成3-(1，2，3-三唑-4-基)丙氨酸或Atz残基而得到具有三唑键合的位点特异性聚乙二醇化的肽-接头构建体(SEQID NO：1062)。第二，抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ IDNO：3088)中的经工程改造的游离半胱氨酸与肽-接头中的溴乙酰胺官能团反应，形成具有稳定硫代乙酰胺键合的位点特异性免疫球蛋白-肽偶联物(免疫球蛋白-肽偶联物1)。如果一个半胱氨酸发生反应，则结果是如所示的单价免疫球蛋白-肽偶联物；但是如果两个半胱氨酸均发生反应，则结果是二价免疫球蛋白-肽偶联物。
图82显示在SP柱上纯化前肽-接头构建体(SEQ ID NO：1062)与抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088)的位点特异性偶联反应混合物的还原性SDS-PAGE凝胶。约75％的mAb重链(HC)显示出5-kD偏移，从而表明单一GpTX-1肽类似物的偶联。越高的分子量条带表示由于过度还原而得到的更高级偶联物。
图83显示肽-接头构建体(SEQ ID NO：1062)与抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ IDNO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088)的位点特异性偶联反应混合物的纯化的结果。左图显示使用5-mL HiTrap SP-HP柱时偶联反应的280nm紫外吸收的阳离子交换色谱图。右图显示得自阳离子交换色谱图的峰的非还原性SDS-PAGE凝胶(左)，表明抗体-肽偶联物的内部二硫键是完整的；以及得自阳离子交换色谱图的峰的还原性SDS-PAGE凝胶(右)。峰1显示未反应的抗体的重链(HC)。峰2显示大约50％的偏移HC，从而指示单价抗体-GpTx-1肽类似物偶联物。峰3显示几乎100％的偏移HC，从而指示二价抗体-GpTx-1肽类似物偶联物。
图84显示肽-接头构建体(SEQ ID NO：1062)与抗-DNP mAb(E273C)hIgG1结构域(SEQ ID NO：3089的同二聚体)的位点特异性偶联反应混合物的纯化的结果。左图显示使用5mL HiTrap SP-HP柱时偶联反应的280nm紫外吸收的阳离子交换色谱图。右图显示得自阳离子交换色谱图的峰的非还原性SDS-PAGE凝胶(左)，表明抗体-肽偶联物的内部二硫键是完整的；以及得自阳离子交换色谱图的峰的还原性SDS-PAGE凝胶(右)。峰1显示大约50％的偏移HC，从而指示单价抗体-肽偶联物。峰2显示近100％的偏移HC，从而指示二价抗体-肽偶联物。
图85显示在Tosoh Bioscience Super SW3000，4μM，250A，4.6mm×30cm柱上运行通过100mM磷酸钠、250mM NaC1、pH6.8按0.35mL/min等度洗脱20分钟的(上图)未修饰抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088)和(下图)二价抗体-GpTx-1肽类似物偶联物(免疫球蛋白-肽偶联物2)的280nm紫外吸收的分析型尺寸排阻色谱图。色谱图表明肽偶联物样品中无聚集。
图86显示肽-接头构建体(SEQ ID NO：1062)与抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ IDNO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088)的二价肽偶联物(即免疫球蛋白-肽偶联物2)的解卷积LC-MS TOF结果。多个峰的存在表明不同的糖基化同种型。
图87显示肽-接头构建体(SEQ ID NO：1062)与抗-DNP mAb(E52C)hIgG1Fc结构域(SEQ ID NO：3089的同二聚体)的二价肽偶联物(即Fc-肽偶联物2)的解卷积LC-MS TOF结果。多个峰的存在表明不同的糖基化同种型。
图88仅出于示意性目的显示Fc-肽偶联物1的示意图。通过免疫球蛋白晶体结构(1HZH.pdb)构建了免疫球蛋白抗-DNP mAb(E52C)hIgG1Fc结构域(SEQ ID NO：3089的同二聚体)的同源模型，并以实心带示出。SEQ ID3089的Cys52(即偶联位点)以CPK格式渲染。PEG11接头在该实施方案中以任意构象作为实心管示出，该接头将免疫球蛋白Fc结构域中的C52残基连接到肽中的Atz13残基。通过GpTx-1的NMR结构构建了肽(SEQ ID NO：1046)的同源模型，并作为实心带显示，并且在该实施方案中示为相对于免疫球蛋白Fc结构域任意取向。
图89仅出于示意性目的显示Fc-肽偶联物2的示意图。通过免疫球蛋白晶体结构(1HZH.pdb)构建了抗-DNP mAb(E52C)hIgG1Fc结构域(SEQ ID NO：3089的同二聚体)的同源模型，并以实心带示出。两Fc结构域单体(SEQ ID3089)的Cys52残基均为偶联位点，并以CPK格式渲染。PEG11接头在该实施方案中以任意构象作为实心管示出，该接头将免疫球蛋白Fc结构域中的C52残基连接到肽中的Atz13残基。通过GpTx-1的NMR结构构建了肽(SEQ ID NO：1046)的同源模型，并作为实心带显示，并且相对于免疫球蛋白Fc结构域以任意取向示出。两个肽显示为反映Fc-肽偶联物2的二价性质。
图90仅出于示意性目的显示免疫球蛋白-肽偶联物1的示意图。通过免疫球蛋白晶体结构(1HZH.pdb)构建了抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQID NO：3087、SEQ ID NO：3088)的同源模型，并以实心带示出。Cys273(即偶联位点)以CPK格式渲染。在该实施方案中，PEG11接头以任意构象作为实心管示出，该接头将免疫球蛋白中的C273残基连接到肽中的Atz13残基。通过GpTx-1的NMR结构构建了肽(SEQ IDNO：1046)的同源模型，并作为实心带显示，并且在该实施方案中示为相对于免疫球蛋白任意取向。
图91显示免疫球蛋白-肽偶联物2的示意图仅出于示意性目的。通过免疫球蛋白晶体结构(1HZH.pdb)构建了抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQID NO：3087、SEQ ID NO：3088)的同源模型，并以实心带示出。两个Cys273残基(即偶联位点)均以CPK格式渲染。在该实施方案中，PEG11接头以任意构象作为实心管示出，该接头将免疫球蛋白中的C273残基连接到肽中的Atz13残基。通过GpTx-1的NMR结构构建了肽(SEQ ID NO：1046)的同源模型，并作为实心带显示，并且在该实施方案中相对于免疫球蛋白以任意取向示出。两个肽显示为反映免疫球蛋白-肽偶联物2的二价性质。
图92显示在对小鼠(n＝3)给予1和10mg/kg s.c.剂量后GpTx-1肽类似物-Fc偶联物(Fc-肽偶联物2)和对照Fc(SEQ ID NO：3089的同二聚体)的平均血浆浓度-时间曲线。
图93显示在对小鼠(n＝3)给予1和10mg/kg s.c.剂量后肽-IgG偶联物(免疫球蛋白-肽偶联物2)和对照IgG(包含SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088的hIgG1mAb)的平均血浆浓度-时间曲线。
图94显示500nM的肽[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)对快速钠电流和电压门控钾电流的作用。曲线是得自从大鼠背根神经节酶法分离的神经元的电压钳记录。通过从-90mV的保持电压经20ms阶跃到0mV，同时诱发了合并的内向钠电流和外向钾电流。右侧曲线大约在添加500nM肽后160秒采集。500nM的[Aa5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)阻断了快速钠电流，但未阻断电压门控钾电流。
图95显示在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中采用5Mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)的作用的时间进程。5mg/kg的肽剂量和3mg/kg的阳性对照吗啡皮下剂量(30分钟预处理)在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中无明显作用。5mg/kg的[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)皮下剂量未展示出研究第二期(福尔马林注射后5-40分钟)中抬爪/舔爪所花的时间的明显缩短，但是吗啡阳性对照确实明显缩短了第二期中抬爪/舔爪所花的时间。末期暴露(福尔马林注射后45分钟的肽血浆浓度)对于5mg/kg肽剂量而言为0.502±0.271μM。
图96显示采用5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第一期中的作用。5mg/kg的肽剂量和3mg/kg的吗啡皮下剂量在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中无作用。
图97显示采用5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第二期(福尔马林注射后5-40分钟)中的作用。5mg/kg的肽皮下剂量未展示出在研究第二期中相对于媒介物对照抬爪/舔爪所花的时间的显著缩短。吗啡阳性对照确实显著缩短了第二期中抬爪/舔爪所花的时间。
图98显示采用5mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)对雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中爪子肿胀的作用。相对于媒介物(PBS)，肽和吗啡对照均未显著减轻福尔马林注射所导致的爪子肿胀。
图99显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)对雄性CD-1小鼠自主活动的总基本运动分量的作用的重复。5mg/kg的肽剂量使总基本运动显著减少。末期暴露(肽注射后2小时的肽血浆浓度)为2.1±0.47μM。
图100显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)对雄性CD-1小鼠自主活动的细微运动分量的作用。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物显著减少了总细微运动。
图101显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立分量的作用。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物对照明显减少了总直立。
图102显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立时间分量的作用。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物对照显著减少了总直立时间。
图103显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)对雄性CD-1小鼠自主活动的总基本运动分量的作用。肽剂量相对于媒介物对照未显著减少探索行为或总基本运动。末期暴露(肽注射后2小时的肽血浆浓度)对于5mg/kg皮下肽剂量而言为0.771±0.272μM。
图104显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)对雄性CD-1小鼠自主活动的细微运动分量的作用。在5mg/kg的剂量下，细微运动相对于媒介物对照未受显著影响。
图105显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立分量的作用。肽剂量相对于媒介物对照未显著减少探索行为或总直立。
图106显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立时间分量的作用。在5mg/kg的剂量下，总直立时间相对于媒介物对照未受显著影响。
图107显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu28]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：153)对雄性CD-1小鼠自主活动的总基本运动分量的作用。5mg/kg的肽剂量使总基本运动显著减少。末期暴露(肽注射后2小时的肽血浆浓度)为1.28±0.403μM。
图108显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu28]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：153)对雄性CD-1小鼠自主活动的细微运动分量的作用。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物显著减少了总细微运动。
图109显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu28]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：153)对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立分量的作用。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物对照明显减少了总直立。
图110显示以5mg/kg的皮下剂量通过1小时的预处理时间[Glu28]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：153)对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立时间分量的作用。在5mg/kg的剂量下，肽相对于媒介物对照显著减少了总直立时间。
图111显示通过1小时的预处理时间10mg/kg皮下剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2对雄性CD-1小鼠自主活动的总基本运动分量的作用。肽偶联物剂量相对于媒介物对照未显著减少探索行为或总基本运动。末期暴露(肽偶联物注射后24.5小时的肽偶联物血浆浓度)对于10mg/kg皮下剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2而言分别为0.034±0.009μM和0.051±0.007μM。
图112显示通过1小时的预处理时间10mg/kg皮下剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2对雄性CD-1小鼠自主活动的细微运动分量的作用。在10mg/kg的剂量下，相对于媒介物对照，细微运动未受任一肽偶联物的显著影响。
图113显示通过1小时的预处理时间10mg/kg皮下剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立分量的作用。肽偶联物剂量相对于媒介物对照未显著减少探索行为或总直立。
图114显示通过1小时的预处理时间10mg/kg皮下剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2对雄性CD-1小鼠自主活动的总直立时间分量的作用。在10mg/kg的剂量下，相对于媒介物对照，总直立时间未受任一肽偶联物的显著影响。
图115显示采用10mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型中Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2的作用的时间进程。10mg/kg的肽剂量和3mg/kg的阳性对照吗啡皮下剂量(30分钟预处理)在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中无明显作用。10mg/kg的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2皮下剂量未展示出研究第二期(福尔马林注射后5-40分钟)中抬爪/舔爪所花的时间的明显缩短，但是吗啡阳性对照确实明显缩短了第二期中抬爪/舔爪所花的时间。末期暴露(福尔马林注射后45分钟的肽偶联物血浆浓度)对于10mg/kg剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2而言分别为0.035±0.011μM和0.040±0.011μM。
图116显示采用10mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第一期中Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2的作用。10mg/kg皮下剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2以及3mg/kg皮下剂量的吗啡在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中无作用。
图117显示采用10mg/kg s.c.的1小时预处理剂量时在雄性CD-1小鼠福尔马林疼痛模型第二期(福尔马林注射后5-40分钟)中Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2的作用。10mg/kg皮下剂量的Fc-肽偶联物2和免疫球蛋白-肽偶联物2未展示出相对于媒介物对照在研究第二期中抬爪/舔爪所化的时间的明显缩短。吗啡阳性对照确实显著缩短了第二期中抬爪/舔爪所花的时间。
具体实施方式
本文所用的章节标题仅用于组织目的，不应视为限制所述的主题。
定义
除非在本文另有定义，否则结合本申请所用的科技术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另有需要，否则单数形式的术语应包括多个，并且多数形式的术语也应包括单个。因此，如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。例如，提及“一种蛋白”包括多个蛋白；提及“一种细胞”包括多个细胞的群。
“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，并包括通过肽键共价连接的两个或更多个氨基酸的分子链。该术语不指代具体长度的产物。因此，“肽”和“寡肽”包含在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、生物素化、4-戊炔酰化(pentynoylation)、聚乙二醇化、磷酰化等。此外，蛋白片段、类似物、突变或变体蛋白、融合蛋白等也包含在多肽的含义内。该术语还包括其中包含了一种或多种氨基酸类似物或非规范或天然氨基酸的分子，如可以使用已知的蛋白工程技术进行重组表达而包含在内。此外，融合蛋白可通过熟知的有机化学技术如本文所述进行衍生化。
包含通过接头部分直接或间接地共价连接、附接或键合到本发明另一种肽或多肽或半衰期延长部分的本发明的肽或多肽的本发明组合物为“偶联物”或“偶联的”分子，无论是通过化学手段(例如翻译后或合成后)还是通过重组融合而偶联。
“生物素”是水溶性B族复合维生素，即维生素B7，它由与四氢噻吩环稠合的脲(四氢咪唑酮)环组成(参见式I)。
式I：
戊酸取代基附接到四氢噻吩环的碳原子中的一个。在自然界中，生物素是脂肪酸和亮氨酸代谢中的辅酶，其在体内糖异生中发挥着作用。生物素以大约10-14M至10-16M的平衡解离常数KD非常紧密地结合到四聚蛋白亲和素(例如鸡亲和素、细菌链霉亲和素以及中和亲和素)，这是已知最强的蛋白-配体相互作用之一，接近共价键的强度。(Laitinen et al..Genetically engineered avidins and streptavidins，Cell MolLife Sci.63(24)：2992-30177(2006))。生物素-亲和素非共价相互作用通常用在不同的生物技术应用中。(参见Laitinen等人，Geneticallyengineered avidins and streptavidins，Cell Mol Life Sci.63(24)：2992-30177(2006))。
“生物素化的”意指物质共价偶联到一个或多个生物素部分。可用于实践本发明的生物素化肽可商购获得(例如Midwest Bio-Tech Inc.)或可容易地进行合成然后进行生物素化。诸如肽的化合物的生物素化可以通过任何已知的化学技术进行。这些包括伯胺生物素化、巯基生物素化和羧基生物素化。例如，作为赖氨酸侧链ε-胺和N端α-胺而存在的肽上的胺基团是伯胺生物素化的常用靶标。胺反应性生物素化试剂可基于水溶性分成两组。
1)生物素的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯在水溶液中的溶解性不佳。对于水溶液中的反应，它们必须首先溶解在有机溶剂中，然后再稀释成水性反应混合物。最常用于此目的的有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)，它们与低浓度的大部分蛋白相容。
2)生物素的磺基-NHS-酯在水中的溶解性更高，由于容易水解，通常将它们在临用前溶于水中。磺基-NHS-酯的水溶性源于它们在N-羟基琥珀酰亚胺环上的磺酸根基团并消除了将试剂溶解在有机溶剂中的需要。
NHS-和磺基-NHS-酯的化学反应基本上相同：酰胺键形成，而NHS或磺基-NHS变成离去基团。由于酯的靶标为去质子化的伯胺，因此反应普遍高于pH7。NHS-酯的水解是主要的竞争反应，而水解速率随着pH的升高而增加。NHS-和磺基-NHS-酯在pH7下具有数小时的半衰期，但在pH9下只有几分钟。将NHS-酯偶联到肽的伯胺的条件包括4-37℃范围内的孵育温度、7-9范围内的反应pH值和几分钟至约12小时的孵育时间。必须避免含胺(诸如Tris或甘氨酸)的缓冲液，因为它们会与反应竞争。HABA染料(2-(4-羟基偶氮苯)苯甲酸)方法可用于确定生物素化的程度。简而言之，HABA染料结合到亲和素并产生特征性吸收。当引入生物素化蛋白或其他分子形式的生物素时，其置换出染料，从而在500nm处产生吸光度变化。吸光度变化与样品中的生物素水平成正比。
氨基酸残基的“4-戊炔酰化”通常在N端或侧链通过标准酰胺键反应偶合4-戊炔酸而实现。当适合另外的聚乙二醇化时，4-戊炔酰化可选地可在铜催化的1，3-偶极环加成反应(所谓的“点击”反应)中采用炔烃以与叠氮基-PEG分子中的叠氮化物反应以通过三唑连接肽和PEG。
“分离的多肽”是从在多肽的天然来源中通常与其相关的至少一种污染性多肽分子中纯化或分离而得的多肽分子。分离的多肽分子的形式或环境不同于存在于自然界中的形式或环境。
“毒素肽”包括具有与可从毒液中分离而得的天然存在的药理学活性肽或多肽相同的氨基酸序列的肽或多肽，并且还包括此类天然存在的分子的修饰肽类似物。(参见例如Kalman等人，ShK-Dap22，apotent Kv1.3-specific immunosuppressive polypeptide，J.Biol.Chem.273(49)：32697-707(1998)；Kem等人，美国专利号6,077,680；Mouhat等人，OsK1derivatives，WO2006/002850A2；Chandy等人，Analogsof SHK toxin and their uses in selective inhibition of Kv1.3potassiumchannels，WO2006/042151；Sullivan等人，Toxin Peptide therapeuticagents，WO2006/116156A2，它们均以引用方式整体并入本文)。蛇、蝎子、蜘蛛、蜜蜂、蜗牛和海葵是产生毒液的生物的一些实例，这些毒液可作为强效及选择性靶向离子通道和受体的小生物活性毒素肽或“毒素”的丰富来源。GpTx-1(SEQ ID NO：1)、GpTx-2(SEQ IDNO：467)、GpTx-3(SEQ ID NO：468)、GpTx-4(SEQ ID NO：469)、GpTx-5(SEQ ID NO：470)、GpTx-6(1-35)(SEQ ID NO：471)和GpTx-7(1-35)(SEQ ID NO：473)是毒素肽的实例。抑制电压门控钠通道的毒素的一些其他实例包括从狼蛛虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)的毒液分离而得的虎纹捕鸟蛛毒素-IV(ECLEI FKACN PSNDQ CCKSS KLVCSRKTRW CKYQI-NH2//SEQ ID NO：528)和虎纹捕鸟蛛毒素-I(ACKGVFDACT PGKNE CCPNR VCSDK HKWCK WKL//SEQ ID NO：529)；从海洋芋螺木下芋螺的毒液分离而得的KIIIA(CCNCS SKWCRDHSRC C-NH2//SEQ ID NO：530)；以及从狼蛛智利绿丝绒的毒液分离而得的ProTxII(YCQKW MWTCD SERKC CEGMV CRLWC KKKLW//SEQ ID NO：531)。另一个实例为α毒素OD1(GVRDAYIADDKNCVYTCASN GYCNTECTKN GAESGYCQWI GRYGNACWCIKLPDEVPIRIPGKCR-NH2//SEQ ID NO：589)，这是一种从蝎子Odonthobuthus doriae的毒液分离而得的毒素。毒素肽的另一个实例为OSK1(也称为OsK1)，这是一种从约旦柱尾蝎(OrthochirusScrobiculosus)毒液中分离而得的毒素肽。(例如Mouhat等人，K+channel types targeted by synthetic OSK1，a toxin from Orthochirusscrobiculosus scorpion venom，Biochem.J.385：95-104(2005)；Mouhat等人，Pharmacological profiling of Orthochirus scrobiculosus toxin1analogs with a trimmed N-terminal domain，Molec.Pharmacol.69：354-62(2006)；Mouhat等人，OsK1derivatives，WO2006/002850A2)。另一个实例是从海葵Stichodactyla helianthus的毒液中分离而得的ShK及其肽类似物。(例如Tudor等人，Ionisation behaviour and solutionproperties of the potassium-channel blocker ShK toxin，Eur.J.Biochem.251(1-2)：133-41(1998)；Pennington等人，Role of disulfide bonds in thestructure and potassium channel blocking activity of ShK toxin，Biochem.38(44)：14549-58(1999)；Kem等人，ShK toxin compositions and methodsof use，美国专利号6,077,680；Lebrun等人，Neuropeptides originatingin scorpion，美国专利号6,689,749；Beeton等人，Targeting effectormemory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3channnels fortherapy of autoimmune diseases，Molec.Pharmacol.67(4)：1369-81(2005)；以及Sullivan等人，Selective and potent peptide inhibitors ofKv1.3，WO2010/108154A2)。
毒素肽通常为约20到约80个氨基酸长，包含2-5个二硫键并形成非常紧凑的结构。毒素肽(例如，得自蝎子、海葵和芋螺的毒液)已得到分离并针对它们对离子通道的影响进行了表征。此类肽似乎已从数量相对少的结构框架演变，这些结构框架尤其适合解决效力和稳定性的关键问题。蝎子和芋螺毒素肽中的大部分例如含有10-40个氨基酸和最多五个二硫键，从而形成通常耐蛋白水解的极其紧凑和受约束的结构(微蛋白)。芋螺毒素和蝎子毒素肽可基于它们的二硫键连接和肽折叠而划分成许多超家族。许多毒素肽的溶液结构已通过NMR光谱加以测定，从而示出了它们的紧凑结构并确认了家族折叠模式的保守性。(例如Tudor等人，Ionisation behaviour and solutionproperties of the potassium-channel blocker ShK toxin，Eur.J.Biochem.251(1-2)：133-41(1998)；Pennington等人，Role of disulfide bonds in thestructure and potassium channel blocking activity of ShK toxin，Biochem.38(44)：14549-58(1999)；Jaravine等人，Three-dimensional structure oftoxin OSK1from Orthochirus scrobiculosus scorpion venom，Biochem.36(6)：1223-32(1997)；del Rio-Portillo等人，NMR solution structure ofCn12，a novel peptide from the Mexican scorpion Centruroides noxiuswith a typical beta-toxin sequence but with alpha-like physiologicalactivity，Eur.J.Biochem.271(12)：2504-16(2004)；Prochnicka-Chalufour等人，Solution structure of discrepin，a new K+-channel blocking peptidefrom the alpha-KTx15subfamily，Biochem.45(6)：1795-1804(2006))。其他实例是本领域已知的，或可见于Sullivan等人，Toxin PeptideTherapeutic Agents，WO06116156A2或美国专利号7,833,979；Sullivan等人，Selective and potent peptide inhibitors of Kv1.3，WO2010/108154A2；Mouhat等人，OsK1derivatives，WO2006/002850A2；Sullivan等人，美国专利申请号11/978,076(标题：，2007年10月25日提交)；Lebrun等人，美国专利号6,689,749，其各自以引用方式整体并入。
术语“肽类似物”是指序列与存在于自然界中的肽序列相差至少一个氨基酸残基取代、至少一个氨基酸内部添加或内部缺失和/或氨基或羧基末端截短或添加和/或羧基末端酰胺化的肽。“内部缺失”是指在非N或C端的位置不存在见于自然界中的序列中的氨基酸。同样，“内部添加”是指在非N或C端的位置存在见于自然界中的序列中的氨基酸。
本发明物质组合物的实施方案包括毒素肽类似物，或其药学上可接受的盐。“毒素肽类似物”相对于所关注的天然毒素肽序列诸如GpTx-1(DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF-NH2//SEQ ID NO：1)包含所关注的天然毒素肽序列的修饰(例如，氨基酸残基取代、内部添加或插入、内部缺失和/或氨基或羧基末端截短，或如之前所述的添加)。本发明的毒素肽类似物为20至约80个氨基酸残基长，并且相对于SEQ ID NO：1而言具有C1-C4、C2-C5和C3-C6二硫(或二硒)键，其中C1、C2、C3、C4、C5和C6表示通常通过左侧的肽N端规定的出现在毒素肽一级序列中的半胱氨酸(或硒代半胱氨酸)残基的顺序，其中氨基酸序列中的第一和第六半胱氨酸(或硒代半胱氨酸)形成二硫键(或二硒键，如果为SeCys)，第二和第四半胱氨酸(或硒代半胱氨酸)形成二硫键(或二硒键，如果为SeCys)，并且第三和第五半胱氨酸(或硒代半胱氨酸)形成二硫键(或二硒键，如果为SeCys)。如本文所述，本发明的毒素肽类似物还可以相对于SEQ ID NO：1在N端和/或C端末端具有另外的氨基酸残基。
所谓物质组合物的“生理上可接受的盐”例如毒素肽类似物的盐是指已知或随后发现在药学上可接受的任何盐。药学上可接受的盐的一些非限制性实例为：乙酸盐；三氟乙酸盐；氢卤化物，诸如盐酸盐和氢溴酸盐；硫酸盐；柠檬酸盐；马来酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；葡糖酸盐；琥珀酸盐；甲磺酸盐；苯磺酸盐；没食子酸酯(没食子酸也称为3，4，5-三羟基苯甲酸)诸如五没食子酰葡萄糖(PGG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的盐；胆固醇硫酸酯的盐；双羟萘酸盐；鞣酸盐和草酸盐。
术语“融合蛋白”是指蛋白包含衍生自不止一种亲本蛋白或多肽的多肽组分。通常，融合蛋白由融合基因表达，在融合基因中编码一种蛋白的多肽序列的核苷酸序列在框内附到编码不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列并任选地通过接头与之分开。融合基因然后可通过重组宿主细胞作为单一蛋白而表达。
术语“模拟肽”、“肽模拟物”和“激动剂肽”是指具有与所关注的天然存在的蛋白(例如但不限于毒素肽分子)相当的生物活性的肽或蛋白。这些术语还包括间接模拟天然存在的肽分子的活性的肽，诸如通过使天然存在的分子增效。
术语“拮抗剂肽”、“肽拮抗剂”和“抑制剂肽”是指阻断或在某种程度上干扰所关注受体的生物活性或具有与所关注受体(诸如但不限于离子通道(例如Kv1.3)或G蛋白偶联受体(GPCR))的已知拮抗剂或抑制剂相当的生物活性的肽。
蛋白的“结构域”是整个蛋白的任何部分，最多并包括完整的蛋白，但是通常包括少于完整的蛋白。结构域可以但不必独立于蛋白链的其余部分发生折叠和/或与特定的生物、生化或结构功能或位置相关(例如配体结合结构域或者胞质、跨膜或胞外结构域)。
如本文所用，“可溶性”当涉及在宿主细胞中通过重组DNA技术产生的蛋白时是存在于水溶液中的蛋白；如果蛋白包含双精氨酸信号氨基酸序列，则可溶性蛋白在革兰氏阴性细菌宿主中导出到周质间隙，或通过能够分泌的真核宿主细胞或通过具有合适基因(例如kil基因)的细菌宿主分泌到培养基中。因此，可溶性蛋白是不存在于宿主细胞内的包涵体中的蛋白。可选地，取决于上下文，可溶性蛋白是不整合存在于细胞膜中的蛋白。相比之下，不溶性蛋白是以变性形式存在于宿主细胞中的细胞质颗粒(称为包涵体)内的蛋白，或者同样取决于上下文，不溶性蛋白是存在于细胞膜中的蛋白，包括但不限于胞质膜、线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜等。
在“可溶”(即溶解或能够溶解)于没有显著量的离子型洗涤剂(例如SDS)或变性剂(例如脲、盐酸胍)的水溶液中的蛋白与作为分散在溶液内的不溶性蛋白分子悬浮液存在的蛋白之间也存在区别。使用足以移除存在于液体培养基中的细胞的条件进行离心(例如以5,000×g离心4-5分钟)时，“可溶性”蛋白将不会从含有蛋白的溶液中移除。在本发明组合物的一些实施方案中，毒素肽类似物通过宿主细胞合成并在细胞包涵体内以不溶形式分离，然后可相对容易地从细胞提取物中的其他细胞组分中纯化，而毒素肽类似物可继而溶解、重折叠和/或进一步纯化。
在“可溶性”蛋白(即，在宿主细胞中表达时以可溶形式产生的蛋白)与“溶解的”蛋白之间存在区别。可通过诸如盐酸胍、脲或十二烷基硫酸钠(SDS)的变性剂处理纯化的包涵体或细胞膜而使存在于包涵体内或整合存在于细胞膜内的不溶性重组蛋白溶解(即，使得成为可溶形式)。然后必须将这些变性剂从溶解的蛋白制备物中除去，以允许将回收的蛋白复性(重折叠)。虽然本发明的组合物可以活性形式重折叠，但是并非所有的蛋白在溶解到变性剂中然后除去变性剂后都将重折叠成活性构象。许多蛋白在除去变性剂时产生沉淀。低浓度的SDS可用于使包涵体和细胞膜溶解并将蛋白维持在溶液中。然而，渗析并不总是能够除去所有的SDS(SDS会形成不会渗析出来的胶束)；因此，SDS溶解的包涵体蛋白和SDS溶解的细胞膜蛋白可溶但不重折叠。
“分泌的”蛋白是指能够因分泌信号蛋白序列而被导向ER、分泌小泡或胞外间隙的那些蛋白，以及释放到胞外间隙中而不必含有信号序列的那些蛋白。如果分泌的蛋白释放进胞外间隙，则分泌的蛋白可经历胞外加工以产生“成熟”蛋白。释放进胞外间隙可通过许多机理而发生，包括胞外分泌和蛋白水解裂解。在本发明组合物的一些其他实施方案中，毒素肽类似物可通过宿主细胞作为分泌蛋白而合成，随后可从胞外间隙和/或培养基中进一步纯化。
术语“重组”表示材料(例如核酸或多肽)已通过人为干预而人工地或合成地(即，非天然地)改变。改变可在材料的天然环境或状态内对材料进行，或脱离其天然环境或状态而进行。例如，“重组核酸”是通过例如在克隆、DNA改组或其他熟知的分子生物学程序期间对核酸进行重组而制备的核酸。此类分子生物学程序的实例见于Maniatis等人，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)。“重组DNA分子”由通过此类分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成。如本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白分子。“重组宿主细胞”是包含和/或表达重组核酸的细胞。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括含有两个或更多个核苷酸残基的单链和双链核苷酸聚合物。包含多核苷酸的核苷酸残基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸类型的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，诸如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，诸如2’，3’-二脱氧核糖；以及核苷酸间键合修饰，诸如硫代磷酸、二硫代磷酸、硒代磷酸、二硒代磷酸、苯胺硫代磷酸、苯胺磷酸(phosphoraniladate)和酰胺磷酸(phosphoroamidate)。
术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少的核苷酸残基的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其他实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以为单链或双链，例如用于构建突变基因。寡核苷酸可以为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包含标记，包括便于定量或检测的同位素标记(例如125I、14C、13C、35S、3H、2H、13N、15N、18O、17O等)，用于检测测定的荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可例如用作PCR引物、克隆引物或杂交探针。
在本文可互换使用的“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”或“核酸序列”是多核苷酸中的核苷酸残基的一级序列，包括寡核苷酸、DNA和RNA、核酸或表示核苷酸残基一级序列的字符串，取决于上下文。通过任何指定的多核苷酸序列，可以确定给定的核酸或互补多核苷酸序列。包括在内的是可以为单链或双链的并表示有义或反义链的基因组或合成来源的DNA或RNA。除非另外指明，否则本文所讨论的任何单链多核苷酸序列的左端为5’末端；双链多核苷酸序列的左侧方向称为5’方向。新生RNA转录物的5′至3′添加方向称为转录方向；处于RNA转录物5′末端5′的具有与RNA转录物相同序列的DNA链上的序列区域称为“上游序列”；处于RNA转录物3′末端3′的具有与RNA转录物相同序列的DNA链上的序列区域称为“下游序列”。
如本文所用，“分离的核酸分子”或“分离的核酸序列”是下述任一种核酸分子：(1)从在核酸的天然来源中与核酸通常相关的至少一种污染性核酸分子中鉴定并分离的，或(2)克隆的、扩增的、加标记的或以其他方式与背景核酸区分的，使得可以确定所关注核酸的序列。分离的核酸分子的形式或环境不同于存在于自然界中的形式或环境。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达多肽(例如寡肽或抗体)的细胞中的核酸分子，其中，例如该核酸分子处于不同于天然细胞中的染色体位置。
如本文所用，术语“编码...的核酸分子”、“编码...的DNA序列”和“编码...的DNA”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定沿着mRNA链的核糖核苷酸的顺序，也决定沿着多肽(蛋白)链的氨基酸的顺序。DNA序列因此编码RNA序列和氨基酸。
术语“基因”广泛地用于指代与生物功能相关的任何核酸。基因通常包括编码序列和/或表达此类编码序列所需的调控序列。术语“基因”适用于特定的基因组或重组序列，以及适用于由该序列编码的cDNA或mRNA。“融合基因”包含下述编码区，所述编码区编码的多肽具有来自不同蛋白的部分，这些部分不天然存在于一起，或者不一起天然存在于与所编码的融合蛋白(即嵌合蛋白)中所存在的序列相同的序列中。基因还包括例如形成其他蛋白的识别序列的非表达核酸片段。包含调控蛋白(诸如转录因子)所结合的转录控制元件的非表达调控序列导致相邻或附近序列的转录。
“基因的表达”或“核酸的表达”意指DNA转录成RNA(任选地包括RNA的修饰，例如剪接)，RNA翻译成多肽(可能包括多肽的后续翻译后修饰)，或转录和翻译两者，如上下文所指明。
如本文所用，术语“编码区”或“编码序列”当结合结构基因使用时是指编码存在于因mRNA分子翻译而产生的新生多肽中的氨基酸的核苷酸序列。编码区在真核生物中通过编码引发蛋氨酸的核苷酸三连体"ATG"连接在5′侧上，并通过指定终止密码子的三个三连体(即TAA、TAG、TGA)之一连接在3′侧上。
术语“控制序列”或“控制信号”是指在特定的宿主细胞中可影响其所连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可取决于宿主生物。在特定的实施方案中，原核生物的控制序列可包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。真核生物的控制序列可包含含有一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列或元件、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。控制序列可包含前导序列和/或融合伴侣序列。启动子和增强子由与转录相关细胞蛋白发生特异性相互作用的DNA的短阵列组成(Maniatis等人，Science236：1237(1987))。启动子和增强子元件已从多种真核来源分离，这些来源包括酵母、昆虫及哺乳动物细胞和病毒中的基因(类似的控制元件即启动子也存在于原核生物中)。特定启动子和增强子的选择取决于什么样的细胞类型将用于表达所关注的蛋白。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他则在有限的细胞类型亚组中具有功能(有关综述，参见Voss等人，Trends Biochem.Sci.，11：287(1986)andManiatis等人，Science236：1237(1987))。
术语“载体”意指用于将蛋白编码信息传递到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、细菌噬菌体或病毒)。
如本文所用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指包含以下部分的重组DNA分子：所需的编码序列，以及在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的合适的核酸控制序列。表达载体可包括但不限于下述序列：其影响或控制转录、翻译并在存在内含子时影响可操作地连接到其上的编码序列的RNA剪接。在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。真核细胞已知利用启动子、增强子以及终止和多聚腺苷酸化信号。分泌信号肽序列也可任选地由可操作地连接到所关注编码序列的表达载体编码，使得表达的多肽可由重组宿主细胞分泌，以在需要时更容易地从细胞中分离所关注的多肽。此类技术是本领域熟知的。(例如Goodey、Andrew R.等人，Peptide and DNAsequences，美国专利号5,302,697；Weiner等人，Compositions andmethods for protein secretion，美国专利号6,022,952和美国专利号6,335,178；Uemura等人，Protein expression vector and utilizationthereof，美国专利号7,029,909；Ruben等人，27human secreted proteins，US2003/0104400A1)。
如本文所用的术语“可操作的结合”、“可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列的连接方式使得产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白分子的合成的核酸分子。该术语也指核酸序列的连接方式使得产生功能蛋白。例如，“可操作地连接”到蛋白编码序列的载体中的控制序列的连接方式使得蛋白编码序列的表达在与控制序列的转录活性相容的条件下实现。
术语“宿主细胞”意指已通过核酸转化或能够通过核酸转化并因而表达所关注的基因的细胞。该术语包括亲代细胞的子代，而不论子代是否在形态上或在基因组成上与原始亲代细胞相同，只要存在所关注的基因即可。大量可用的和熟知的宿主细胞中的任何一种均可用于实践本发明。特定宿主的选择取决于本领域公认的许多因素。这些因素包括例如与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化率、肽的易回收性、表达特性、生物安全性和成本。考虑到并非所有的宿主对于表达特定的DNA序列都是等效的，这些因子必须达成平衡。在这些一般性指导原则内，在培养中可用的微生物宿主细胞包括细菌(诸如大肠杆菌属(Escherichia coli sp.))、酵母(诸如酵母属(Saccharomyces sp.))和其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物(包括人类)细胞，例如CHO细胞和HEK-293细胞。修饰也可在DNA水平上进行。可将编码肽的DNA序列改变为与所选的宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌，优化的密码子是本领域已知的。可对密码子进行取代以消除限制性位点或包括沉默限制性位点，这可有助于在所选的宿主细胞中加工DNA。接下来，可对转化的宿主进行培养和纯化。宿主细胞可在常规发酵条件下培养，使得所需的化合物得以表达。此类发酵条件是本领域熟知的。
术语“转化”意指细胞摄入外来或外源DNA，当已将外源DNA引入细胞膜内部时细胞即被“转染”。许多转染技术是本领域熟知的并在本文进行了公开。参见例如Graham等人，1973，Virology52：456；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，同上；Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等人，1981，Gene13：197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞。
术语“转化”是指细胞遗传特性的变化，当已对细胞进行了修饰以包含新的DNA或RNA时细胞即被转化。例如，如果通过转染、转导或其他技术引入新的遗传物质而使细胞相对于其天然状态发生遗传修饰，则细胞被转化。在转染或转导后，转化性DNA可通过物理整合到细胞染色体中而与细胞DNA重组，或者可作为游离基因元件瞬时维持而不进行复制，或者可作为质粒独立地进行复制。当转化性DNA随细胞的分裂而一起复制时，则将细胞视为已“稳定转化”。
术语“转基因”是指起源于与宿主不同的物种的分离核苷酸序列，其可插入哺乳动物或哺乳动物胚胎的一个或多个细胞。转基因任选地可操作地连接到其他遗传元件(诸如启动子、多聚腺苷酸序列等)，这些遗传元件可用于直接地或与细胞机器相结合而间接地调节转基因的转录和/或表达。可选地或除此之外，转基因可连接到有助于将转基因整合到哺乳动物细胞或胚核的染色体DNA中(例如，在同源重组中)的核苷酸序列。转基因可由哺乳动物内源性遗传物质中的特定核苷酸序列的同源或异源核苷酸序列组成，或为杂合序列(即，转基因的一个或多个部分为哺乳动物遗传物质同源的，而一个或多个部分为哺乳动物遗传物质异源的)。转基因核苷酸序列可编码内源性存在于哺乳动物中的多肽或多肽变体，可编码非天然存在于哺乳动物中的多肽(即外源多肽)，或者可编码内源和外源多肽的杂合体。如果转基因可操作地连接到启动子，则启动子可以为哺乳动物和/或转基因同源或异源的。可选地，启动子可以为内源和外源启动子元件(增强子、沉默子、抑制子等)的杂合体。
肽。重组DNA和/或RNA介导的蛋白表达和蛋白工程技术或任何其他制备肽的方法适用于制备本发明的多肽，例如毒素肽类似物及其融合蛋白偶联物(例如，包含毒素肽类似物和免疫球蛋白Fc结构域、转甲状腺素蛋白或人血清白蛋白的融合蛋白)。例如，可在转化的宿主细胞中产生肽。简而言之，制备编码该肽的重组DNA分子或构建体。制备此类DNA分子的方法是本领域熟知的。例如，可使用合适的限制酶从DNA切离编码肽的序列。大量可用的和熟知的宿主细胞中的任何一种均可用于实践本发明。特定宿主的选择取决于本领域公认的许多因素。这些因素包括例如与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化率、肽的易回收性、表达特性、生物安全性和成本。考虑到并非所有的宿主对于表达特定的DNA序列都是等效的，这些因子必须达成平衡。在这些一般性指导原则内，在培养中可用的微生物宿主细胞包括细菌(诸如大肠杆菌属)、酵母(诸如酵母属)和其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物(包括人类)细胞，例如CHO细胞和HEK293细胞。修饰也可在DNA水平上进行。可将编码肽的DNA序列改变为与所选的宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌，优化的密码子是本领域已知的。可对密码子进行取代以消除限制性位点或包括沉默限制性位点，这可有助于在所选的宿主细胞中加工DNA。接下来，可对转化的宿主进行培养和纯化。宿主细胞可在常规发酵条件下培养，使得所需的化合物得以表达。此类发酵条件是本领域熟知的。此外，DNA任选地还编码可操作地连接到所表达的毒素肽类似物的位于融合蛋白编码区5’的信号肽序列(例如分泌信号肽)。有关可用于通过哺乳动物细胞进行本发明组合物的重组表达的合适重组方法和示例性DNA构建体的另外实例，包括偶联到本发明药理学活性毒素肽类似物的二聚Fc融合蛋白(“肽体”)或嵌合免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异三聚体(“半体(hemibody)”)，参见Sullivan等人，Toxin Peptide Therapeutic Agents，US2007/0071764和Sullivan等人，Toxin Peptide Therapeutic Agents，PCT/US2007/022831(作为WO2008/088422公开)，所述专利均以引用方式整体并入本文。
本发明的肽组合物也可通过合成方法制备。固相合成是制备各个肽的优选技术，因为它是制备小肽最具成本效益的方法。例如，熟知的固相合成技术包括使用保护基团、接头和固相载体，以及具体的保护和去保护反应条件、接头裂解条件、使用清除剂以及固相肽合成的其他方面。合适的技术是本领域熟知的。(例如Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，pp.335-61(Katsoyannis and Panayotis编辑)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.85：2149；Davis等人(1985)，Biochem.Intl.10：394-414；Stewart和Young(1969)，Solid Phase Peptide Synthesis；美国专利号3,941,763；Finn等人(1976)，The Proteins(第三版)2：105-253；以及Erickson等人(1976)，The Proteins(第三版)2：257-527；″ProtectingGroups in Organic Synthesis，″第三版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts编辑，John Wiley ＆ Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog，2000；″Synthetic Peptides，A User′s Guide，″G.A.Grant编辑，W.H.Freeman ＆Company，New York，N.Y.，1992；″Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial ＆ Solid Phase Organic Chemistry，″W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii编辑，Advanced Chemtech，1998；″Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky编辑，Springer-Verlag，1993；″The Practice ofPeptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky and A.Bodanszky编辑，Springer-Verlag，1994；″Protecting Groups，″P.J.Kocienski编辑，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994；″Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis，A Practical Approach，″W.C.Chan and P.D.White编辑，Oxford Press，2000，G.B.Fields等人，Synthetic Peptides：A User′s Guide，1990，77-183)。有关适用于制备本发明物质组合物的本领域已知的合成和纯化方法的另外实例，参见Sullivan等人，Toxin PeptideTherapeutic Agents，US2007/0071764和Sullivan等人，Toxin PeptideTherapeutic Agents，PCT/US2007/022831(作为WO2008/088422A2公开)，所述专利均以引用方式整体并入本文。
在本文对毒素肽类似物的进一步描述中，频繁地将单字母缩写系统应用于对通常结合到天然存在的肽和蛋白中的二十个“规范”氨基酸的种类命名(表2)。此类单字母缩写在含义上完全可与三字母缩写或非缩写的氨基酸名称互换。在本文所用的单字母缩写系统内，大写字母表示L-氨基酸，小写字母表示D-氨基酸。例如，缩写“R”指定L-精氨酸而缩写“r”指定D-精氨酸。
表2.规范氨基酸的单字母缩写。
三字母缩写处于小括号中。
氨基酸序列中的氨基酸取代在本文中通常通过以下方式指定：特定位置的氨基酸残基的单字母缩写，然后是相对于所关注的天然序列的以数字表示的氨基酸位置，再接着是代入的氨基酸残基的单字母符号。例如，“T30D”用符号表示相对于所关注的天然序列在氨基酸第30位通过天冬氨酸残基取代苏氨酸残基。
在本发明的范围内可通过采用使用重组表达细胞的已知蛋白工程技术，将非规范氨基酸残基结合到肽中。(参见例如Link等人，Non-canonical amino acids in protein engineering，Current Opinion inBiotechnology，14(6)：603-609(2003))。术语“非规范氨基酸残基”是指不在通常结合到天然存在的蛋白中的20个规范氨基酸之中的D或L形式的氨基酸残基，例如β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸以及具有衍生化侧链的氨基酸。实例包括(L形式或D形式的)β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、Nα-乙基甘氨酸、Nα-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、ω-甲基精氨酸、Nα-甲基甘氨酸、Nα-甲基异亮氨酸、Nα-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、Nα-乙酰基丝氨酸、Nα-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和其他类似的氨基酸，和在下表3中列出的那些，以及如本文所述的那些的任一者的衍生化形式。表3包含可根据本发明使用的一些示例性非规范氨基酸残基以及通常在本文使用的相关缩写，但是技术人员将理解到不同的缩写和命名可适用于相同的物质并且在本文可以互换地出现。如本文所列举的一些氨基酸序列可在N端包含表示N端氨基的“{H}-″，和/或可在C端包含表示C端羧基的“-{游离酸}”。
表3.可用于在根据本发明的肽序列中进行氨基酸添加、插入或取代的非规范氨基酸。在表3所列的缩写与本文其他地方所公开的相同物质的另一缩写不同的情况下，两个缩写都被视为适用的。除非另外指明，否则表3所列的氨基酸可以为L形式或D形式。
UPAC-IUB生物化学命名联合会(Joint Commission onBiochemical Nomenclature，JCBN)对氨基酸和肽给出的命名和符号已在以下文献中有所公开：Biochem.J.，1984，219，345-373；Eur.J.Biochem.，1984，138，9-37；1985，152，1；1993，213，2；Internat.J.Pept.Prot.Res.，1984，24，第84页之后；J.Biol.Chem.，1985，260，14-42；PureAppl.Chem.，1984，56，595-624；Amino Acids and Peptides，1985，16，387-410；Biochemical Nomenclature and Related Documents，第2版，Portland Press，1992，第39-69页。
本发明组合物的肽结构域的一个或多个可用修饰可以包括通过已知的化学技术实现的氨基酸添加或插入、氨基酸缺失、肽截短、氨基酸取代和/或氨基酸残基化学衍生化。例如，因而修饰的氨基酸序列相对于所关注的天然序列的氨基酸序列包含至少一个在其中插入或取代的氨基酸残基，其中插入或取代的氨基酸残基具有包含亲核或亲电反应性官能团的侧链，肽通过所述官能团共价偶联到接头和/或半衰期延长部分。根据本发明，这样的亲核或亲电反应性官能团的可用实例包括但不限于硫醇、伯胺、硒代、酰肼、醛、羧酸、酮、氨基氧基、被掩蔽(受保护)的醛或被掩蔽(受保护)的酮官能团。具有包含亲核反应性官能团的侧链的氨基酸残基的实例包括但不限于赖氨酸残基、高赖氨酸、α，β-二氨基丙酸残基、α，γ-二氨基丁酸残基、鸟氨酸残基、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷氨酸残基、天冬氨酸残基或硒代半胱氨酸(“SeCys”)残基。
氨基酸残基通常根据不同的化学和/或物理特性进行归类。术语“酸性氨基酸残基”是指具有包含酸性基团的侧链的D或L形式的氨基酸残基。示例性酸性残基包括天冬氨酸和谷氨酸残基。术语“烷基氨基酸残基”是指具有可为直链、支链或环状的C1-6烷基侧链的D或L形式的氨基酸残基，包括如在脯氨酸中的氨基酸胺，其中C1-6烷基被0、1、2或3个选自以下的取代基取代：C1-4卤代烷基、卤素、氰基、硝基、-C(＝O)Rb、-C(＝O)ORa、-C(＝O)NRaRa、-C(＝NRa)NRaRa、-NRaC(＝NRa)NRaRa、-ORa、-OC(＝O)Rb、-OC(＝O)NRaRa、-OC2-6烷基NRaRa、-OC2-6烷基ORa、-SRa、-S(＝O)Rb、-S(＝O)2Rb、-S(＝O)2NRaRa、-NRaRa、-N(Ra)C(＝O)Rb、-N(Ra)C(＝O)ORb、-N(Ra)C(＝O)NRaRa、-N(Ra)C(＝NRa)NRaRa、-N(Ra)S(＝O)2Rb、-N(Ra)S(＝O)2NRaRa、-NRaC2-6烷基NRaRa和-NRaC2-6烷基ORa；其中Ra在每种情况下独立地为H或Rb；而Rb在每种情况下独立地为被0、1、2或3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基：卤素、C1-4烷基、C1-3卤代烷基、-OC1-4烷基、-NH2、-NHC1-4烷基和-N(C1-4烷基)C1-4烷基；或其任何质子化形式，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、羟基脯氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-氨基丁酸，但是所述残基不含芳基或芳族基团。术语“芳族氨基酸残基”是指具有包含芳族基团的侧链的D或L形式的氨基酸残基。示例性芳族残基包括色氨酸、酪氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、组氨酸或苯丙氨酸残基。术语“碱性氨基酸残基”是指具有包含碱性基团的侧链的D或L形式的氨基酸残基。示例性碱性氨基酸残基包括组氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸和高精氨酸(hR)残基。术语“亲水性氨基酸残基”是指具有包含极性基团的侧链的D或L形式的氨基酸残基。示例性亲水性残基包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和瓜氨酸(Cit)残基。术语“亲脂性氨基酸残基”是指具有包含不带电、脂族或芳族基团的侧链的D或L形式的氨基酸残基。示例性亲脂性侧链包括苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸。丙氨酸(A)是两亲的，即它能够用作亲水性或亲脂性(即疏水性)残基。丙氨酸因此包括在“亲脂性”(即“疏水性”)残基和“亲水性”残基两者的定义内。术语“非官能性”或“中性”氨基酸残基是指具有不含酸性、碱性或芳族基团的侧链的D或L形式的氨基酸残基。示例性中性氨基酸残基包括蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和正亮氨酸(Nle)残基。
毒素肽类似物的另外可用实施方案可通过本文所公开的毒素多肽的氨基酸序列的保守修饰而产生。保守修饰将产生具有与进行此类修饰的偶联(如PEG偶联)肽相似的功能、物理和化学特性的半衰期延长部分偶联的肽。本文所公开的偶联毒素肽类似物的此类保守修饰形式也被设想为本发明的实施方案。
相比之下，肽的功能和/或化学特性的实质性修饰可通过在氨基酸序列中选择下述取代而实现，所述取代在它们对于维持以下方面的作用上存在显著差异：(a)取代区域中分子主链的结构，例如，作为α-螺旋构象，(b)靶点处分子的电荷或疏水性，或(c)分子的大小。
例如，“保守氨基酸取代”可涉及通过非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置的氨基酸残基的极性或电荷具有很少的影响或无影响。此外，多肽中的任何天然残基也可被丙氨酸取代，如之前已针对“丙氨酸扫描诱变”进行了描述(参见例如MacLennan等人，ActaPhysiol.Scand.Suppl.，643：55-67(1998)；Sasaki等人，1998，Adv.Biophys.35：1-24(1998)，其讨论丙氨酸扫描诱变)。
在本发明组合物的一些可用实施方案中，对毒素肽的氨基酸序列以一种或多种方式相对于所关注的天然毒素肽序列进行修饰，所关注的天然毒素肽序列诸如但不限于天然GpTx-1序列(SEQ ID NO：1)、GpTx-1的肽类似物或任何其他具有如表5A、表5B和表31或本文其他地方所示的氨基酸序列的毒素肽。一个或多个可用的修饰可以包括通过已知的化学技术实现的氨基酸添加或插入、氨基酸缺失、肽截短、氨基酸取代和/或氨基酸残基化学衍生化。此类修饰可例如出于增强效力、选择性和/或蛋白水解稳定性等目的而进行。本领域的技术人员了解设计具有此类增强性质的肽类似物的技术，诸如丙氨酸扫描、以使用已知毒素肽序列的比对介导诱变为基础的合理设计和/或分子建模。
术语“蛋白酶”与“肽酶”同义。蛋白酶包括两组酶：裂解蛋白内某些点处的肽键的肽链内切酶，以及分别从N或C端移除一个或多个氨基酸的肽链端解酶。术语“蛋白酶”也作为肽链内切酶的同义词使用。蛋白酶的四种机理分类为：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。除了这四种机理分类外，还存在一部分被分配到未确定催化机理的蛋白酶的酶命名。这表示催化机理尚未确定。
裂解亚位点命名法通常采取自Schechter和Berger建立的方案(Schechter I.＆ Berger A.，On the size of the active site in proteases.I.Papain，Biochemical and Biophysical Research Communication，27：157(1967)；Schechter I.＆ Berger A.，On the active site of proteases.3.Mapping the active site of papain；specific inhibitor peptides of papain，Biochemical and Biophysical Research Communication，32：898(1968))。根据此模型，经历裂解的底物中的氨基酸残基从裂解的键以N端方向被指定为P1、P2、P3、P4等。同样，C端方向的残基被指定为P1′、P2′、P3′、P4′等。
技术人员知道鉴定所关注的蛋白酶结合或蛋白酶裂解位点的多种工具。例如，PeptideCutter软件可通过瑞士生物信息学研究所(SIB；www.expasy.org/tools/peptidecutter)的ExPASy(蛋白质分析专家系统)蛋白质组学服务器获得。PeptideCutter对SWISS-PROT和/或TrEMBL数据库中的蛋白序列或用户输入的蛋白序列搜索蛋白酶裂解位点。可以使用单一蛋白酶和化学品、蛋白酶和化学品的选定列表或完整列表。可以采用不同形式的结果输出：根据酶名称按字母顺序分组的或根据氨基酸数按顺序分组的裂解位点的表格。第三种输出选项是裂解位点的图谱。序列及绘制到其上的裂解位点按区块分组，区块的大小可由用户选择。确定蛋白酶裂解位点的其他工具是已知的。(例如Turk，B.等人，Determination of protease cleavage site motifs usingmixture-based oriented peptide libraries，Nature Biotechnology，19：661-667(2001)；Barrett A.等人，Handbook of proteolytic enzymes，Academic Press(1998))。
丝氨酸蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶家族，该家族包括哺乳动物蛋白酶，诸如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或弹性蛋白酶或激肽释放酶。丝氨酸蛋白酶表现出不同的底物特异性，这些特异性与底物残基发生相互作用的各种酶亚位点中的氨基酸取代相关。一些酶具有扩展的与底物的相互作用位点，而其他的则具有限于P1底物残基的特异性。
胰蛋白酶优先地在位置P1中的R或K处裂解。Keil(1992)进行的统计研究描述了围绕Arg-和Lys-键(即，分别为位置P2和P1′)的残基在胰蛋白酶裂解过程中的负面影响。(Keil，B.，Specificity ofproteolysis，Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York，335(1992))。位置P1′中的脯氨酸残基通常对胰蛋白酶裂解产生强烈的负面影响。相似地，P1′中的R和K的定位与位置P2和P1′中的带负电残基一样导致抑制。
胰凝乳蛋白酶优先地在位置P1中的W、Y或F处裂解(高特异性)，并在较低程度上在位置P1中的L、M或H残基处裂解。(Keil，1992)。这些规则的例外是：当W存在于位置P1中时，裂解在M或P同时存在于位置P1′中时阻断。此外，位置P1′中的脯氨酸残基几乎完全独立于存在于位置P1中的氨基酸阻断裂解。当M残基存在于位置P1中时，裂解因位置P1′中存在Y残基而阻断。最后，当H位于位置P1中时，存在D、M或W残基也会阻断裂解。
膜金属肽链内切酶(NEP；中性肽链内切酶、肾脏刷状缘中性蛋白酶、脑啡肽酶、EC3.4.24.11)在疏水性氨基酸残基的侧链处裂解肽。(Connelly，JC等人，Neutral Endopeptidase24.11in HumanNeutrophils：Cleavage of Chemotactic Peptide，PNAS，82(24)：8737-8741(1985))。
凝血酶优先地在位置P1中的R残基处裂解。(Keil，1992)。凝血酶的天然底物为纤维蛋白原。最佳的裂解位点是当R残基处于位置P1而Gly处于位置P2和位置P1′时。同样，当疏水性氨基酸残基存在于位置P4和位置P3中时，位置P2中的脯氨酸残基、位置P1中的R残基以及位置P1′和位置P2′中的非酸性氨基酸残基。对于其天然底物纤维蛋白原非常重要的残基是P10中的D残基。
半胱天冬酶是一个半胱氨酸蛋白酶家族，这些蛋白酶包含具有保守氨基酸序列的活性位点并在D残基之后特异性裂解肽。(EarnshawWC等人，Mammalian caspases：Structure，activation，substrates，andfunctions during apoptosis，Annual Review of Biochemistry，68：383-424(1999))。
Arg-C蛋白酶优先地在位置P1中的R残基处进行裂解。裂解行为似乎只适度地受位置P1′中的残基影响。(Keil，1992)。Asp-N肽链内切酶特异性裂解位置P1′中与D残基的键合。(Keil，1992)。
前述内容仅仅是示例性的，决不是关于技术人员在实践本发明中可能感兴趣消除的蛋白酶结合位点和/或裂解位点的技术人员可用知识的详尽探讨。
所需的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可在需要此类取代时由本领域的技术人员确定。例如，氨基酸取代可用于鉴定肽序列的重要残基，或者用于增加或降低本文所述的肽或媒介物-偶联肽分子的亲和力。
天然存在的残基可基于共同的侧链性质分类：
1)疏水性：正亮氨酸(Nor或Nle)、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
3)酸性：Asp、Glu；
4)碱性：His、Lys、Arg；
5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及
6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
保守氨基酸取代可涉及这些分类之一中的成员与相同分类中的另一成员交换。保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，它们通常通过化学肽合成而不是生物系统中的合成加以结合。这些包括模拟肽以及氨基酸部分的其他逆转或颠倒形式。
非保守取代可涉及将这些分类之一中的成员交换成另一分类中的成员。可将此类取代的残基引入毒素肽类似物的区域中。
在作出此类变化时，根据某些实施方案，可以考虑氨基酸的亲疏水性指数。为每个氨基酸基于其疏水性和电荷特性赋予亲疏水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
氨基酸亲疏水性指数在为蛋白赋予相互作用性生物功能中的重要性在本领域中已得到理解(参见例如Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知的是，某些氨基酸可用其他具有相似亲疏水性指数或评分的氨基酸取代并仍保持相似的生物活性。在基于亲疏水性指数作出这些变化时，在某些实施方案中，将亲疏水性指数处于±2内的氨基酸取代包括在内。在某些实施方案中，将处于±1内的那些包括在内，而在某些实施方案中，将处于±0.5内的那些包括在内。
在本领域中还应当理解的是，相似的氨基酸的取代可基于亲水性有效地进行，尤其是当因而产生的生物功能性蛋白旨在用于免疫实施方案中时，如本文所公开。在某些实施方案中，蛋白的最大局部平均亲水性(如通过其相邻氨基酸的亲水性所控制)与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白的生物性质相关。
以下亲水性值已赋给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值作出这些变化时，在某些实施方案中，将亲水性值处于±2内的氨基酸取代包括在内，在某些实施方案中，将处于±1内的那些包括在内，以及在某些实施方案中，将处于±0.5内的那些包括在内。基于亲水性，还可以鉴定一级氨基酸序列中的表位。这些区域也称为“表位核心区”。
保守取代的实例包括将一个非极性(疏水性)氨基酸残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、丙氨酸或蛋氨酸替换为另一者；将一个极性(亲水性)氨基酸残基替换为另一者，诸如在精氨酸与赖氨酸之间、在谷氨酰胺与天冬酰胺之间、在甘氨酸与丝氨酸之间；将一个碱性氨基酸残基诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸替换为另一者；或者将一个酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸替换为另一者。短语“保守氨基酸取代”还包括使用化学衍生化的残基替代非衍生化的残基，前提是此类肽显示出必需的生物活性。可根据本发明使用的其他示例性氨基酸取代在下表4中示出。
表4.一些可用的氨基酸取代。
以举例说明的方式，本发明的实施方案涉及物质组合物，该物质组合物包含具有下式的氨基酸序列的分离多肽：
Xaa 1Xaa 2Xaa 3Xaa 4Xaa 5Xaa 6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Xaa 10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15Xaa 16Xaa 17Xaa 18Xaa 19Xaa 20Xaa 21Xaa 22Xaa 23Xaa 24Xaa 25Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30Xaa 31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35Xaa 36Xaa 37Xaa 38//SEQ ID NO：475
或其药学上可接受的盐，
其中：
Xaa 1Xaa 2不存在；或者Xaa 1为任何氨基酸残基并且Xaa 2为任何氨基酸残基；或者Xaa 1不存在并且Xaa 2为任何氨基酸残基；
Xaa 3在Xaa 18为Cys时为Cys；或者Xaa 3在Xaa 18为SeCys时为SeCys；或者Xaa 3在Xaa 18为烷基氨基酸残基时为烷基氨基酸残基(例如Xaa 3和Xaa 18可以独立地为Ala或2-Abu残基)；
Xaa 4为酸性、疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基(例如Xaa 4可选自Ala、Glu、Asp、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基)；
Xaa 5为Gly、Ala、疏水性或碱性氨基酸残基(例如Xaa 5可选自Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 6为Gly、Ala、2-Abu、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)或疏水性氨基酸残基(例如Xaa 6可选自Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、脯氨酸、硫杂脯氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环戊基甘氨酸(Cpg)、苯基甘氨酸、N-甲基亮氨酸、N-甲基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 7为Gly、Ala、芳族或疏水性氨基酸残基(例如Xaa 7可选自Gly、Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Pro、2-吡啶基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 8为碱性、酸性或中性亲水性氨基酸残基或Ala残基(例如Xaa 8可选自Ala、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Ser、Thr、Asn、Gln、Cit、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Asp和Glu残基)；
Xaa 9为碱性或中性亲水性氨基酸残基(例如Xaa 9可选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基)；
Xaa 10在Xaa 24为Cys时为Cys；或者Xaa 10在Xaa 24为SeCys时为SeCys；
Xaa 11为任何氨基酸残基(例如Xaa 11可选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 12为Pro、酸性、中性或疏水性氨基酸残基(例如Xaa 12可选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、Cha和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、羟基脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)；
Xaa 13为任何氨基酸残基(例如Xaa 13可选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 14为任何氨基酸残基(例如Xaa 14可选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 16为碱性、中性亲水性或酸性氨基酸残基或Ala残基(例如Xaa 16可选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr、Cit、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Asp和Glu残基)；
Xaa 17在Xaa 31为Cys时为Cys；或者Xaa 17在Xaa 31为SeCys时为SeCys；
Xaa 18为Cys、SeCys或烷基氨基酸残基；
Xaa 19为任何氨基酸残基(例如Xaa 19可选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 20为Pro、Gly、碱性或中性亲水性残基(例如Xaa 20可选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基)；
Xaa 21为碱性、疏水性或中性亲水性氨基酸残基(例如Xaa 21可选自Ala、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基)；
Xaa 22为疏水性或碱性氨基酸残基(例如Xaa 22可选自Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 23为疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基(例如Xaa 23可选自Ala、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基)；
Xaa 24为Cys或SeCys残基；
Xaa 25为Ser、Ala或中性亲水性氨基酸残基(例如Xaa 25选自Ala、Gly、Pro、Met、甘氨酸、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基)；
Xaa 26为Ala、酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基(例如Xaa 26可选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、Asp、Glu、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基)；
Xaa 27为酸性、碱性、中性亲水性或疏水性残基(例如Xaa 27可选自Thr、Leu、Ile、Val、Ser、Met、Gln、Asn、Phe、Tyr、Trp、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Asp、Glu、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Glu、Asp和Gly残基)；
Xaa 28为芳族或碱性氨基酸残基(例如Xaa 28可选自Phe、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、1-Nal、2-Nal、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-吡啶基-丙氨酸、4-哌啶基-丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 29为酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基(例如Xaa 29可选自Ala、Asp、Glu、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Phe、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸和Dab残基)。在一些可用的实施方案中，Xaa29为酸性或中性亲水性残基(例如Ala、Asp、Glu、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸或γ-羧基谷氨酸残基[例如SEQ ID NO：1071-2798])；
Xaa 30为Trp、5-溴代Trp、6-溴代Trp、5-氯代Trp、6-氯代Trp、1-Nal、2-Nal或硫代Trp残基；
Xaa 31为Cys或SeCys；
Xaa 33为疏水性或芳族氨基酸残基(例如Xaa 33可选自Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-吡啶基-丙氨酸、4-哌啶基-丙氨酸、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 34为任何氨基酸残基(例如Xaa 34可选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-羧基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 35为疏水性氨基酸残基(例如Xaa 35可选自Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
Xaa 36、Xaa 37和Xaa 38的每一者独立地不存在或独立地为中性、碱性或疏水性氨基酸残基(例如Xaa 36、Xaa 37和Xaa 38的每一者可独立地不存在或独立地选自Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基)；
并且其中：
如果Xaa 3和Xaa 18均为Cys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硫键；或者如果Xaa 3和Xaa 18均为SeCys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硒键；
如果Xaa 10和Xaa 24均为Cys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硫键；或者如果Xaa 10和Xaa 24均为SeCys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硒键；
如果Xaa 17和Xaa 31均为Cys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硫键；或者如果Xaa 17和Xaa 31均为SeCys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硒键；
氨基末端残基任选地被乙酰化、生物素酰化或4-戊炔酰化或聚乙二醇化；并且
羧基末端残基任选地被酰胺化。此类C端酰胺化的许多特定实例在表5A和表5B中示出。
就在上面加以描述的本发明组合物(SEQ ID NO：475)的另一个实例是其中分离的多肽包含下式的氨基酸序列的物质组合物：
Xaa 1Xaa 2Cys3Xaa 4Xaa 5Ala6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Cys10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15Xaa 16Cys17Cys18Xaa 19Xaa 20 aa 21Xaa 22Xaa 23Cys24Xaa 25Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30Cys31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35Xaa 36Xaa 37Xaa 38//SEQ ID NO：476，并且SEQ IDNO：476的可变位置如就在前面关于SEQ ID NO：475的可变位置的段落中示例性示出。物质组合物尤其可用的实施方案包含SEQ IDNO：475的位置Xaa 6处的Ala、Gly、2-Abu、Nle或Nva残基，而其中一些实施方案还具有SEQ ID NO：475的位置Xaa 27处的Glu残基，例如[Ala5，Glu26]GpTx-1、[Gly5，Glu26]GpTx-1、[2-Abu5，Glu26]GpTx-1、[Nle5，Glu26]GpTx-1或[Nva5，Glu26]GpTx-1肽类似物，其任选地还可以具有在其他氨基酸位置处的另外的取代氨基酸残基和/或在N端和/或C端末端的另外残基。其他可用的实例包括在SEQ ID NO：475的位置Xaa 29或SEQ ID NO：476的Xaa 29处的Asp、Glu或Gln残基，具有或不具有在SEQ ID NO：475的位置Xaa 27处的Glu残基，例如[Ala5，Asp28]GpTx-1、[Ala5，Glu28]GpTx-1、[Ala5，Gln28]GpTx-1、[Ala5，Glu26，Asp28]GpTx-1、[Ala5，Glu26，Glu28]GpTx-1、[Ala5，Glu26，Gln28]GpTx-1、[Gly5，Asp28]GpTx-1、[Gly5，Glu28]GpTx-1、[Gly5，Gln28]GpTx-1、[Gly5，Glu26，Asp28]GpTx-1、[Gly5，Glu26，Glu28]GpTx-1、[Gly5，Glu26，Gln28]GpTx-1、[2-Abu5，Asp28]GpTx-1、[2-Abu5，Glu28]GpTx-1、[2-Abu5，Gln28]GpTx-1、[2-Abu5，Glu26，Asp28]GpTx-1、[2-Abu5，Glu26，Glu28]GpTx-1、[2-Abu5，Glu26，Gln28]GpTx-1、[Nle5，Asp28]GpTx-1、[Nle5，Glu28]GpTx-1、[Nle5，Gln28]GpTx-1、[Nle5，Glu26，Asp28]GpTx-1、[Nle5，Glu26，Glu28]GpTx-1和[Nle5，Glu26，Gln28]GpTx-1、[Nva5，Asp28]GpTx-1、[Nva5，Glu28]GpTx-1、[Nva5，Gln28]GpTx-1、[Nva5，Glu26，Asp28]GpTx-1、[Nva5，Glu26，Glu28]GpTx-1以及[Nva5，Glu26，Gln28]GpTx-1。
所含的氨基酸序列包含SEQ ID NO：475的位置Xaa 6处的Ala残基的物质组合物的一些实例包括：SEQ ID NO：22、252-263、419-439、518-521、524、525、562-580、602、691、692、696-703、715、721-735、737-749、756、757、761、762、764-771、787-796、798、800、802、803、809-812、1028、1030-1040、1043-1047、1062-1065、1068-1070、1082、1096、1110、1124、1135、1146、1157、1165、1173、1181、1192、1203、1214、1222、1230、1238、1249、1260、1271、1279、1287、1295、1306、1317、1328、1336、1344、1352、1360、1368、1376、1384、1392、1400、1408、1416、1424、1432、1440、1448、1456、1464、1472、1480、1488、1496、1504、1512、1520、1528、1536、1544、1552、1560、1568、1576、1584、1592、1600、1608、1616、1624、1632、1640、1658、1672、1686、1700、1711、1722、1733、1741、1749、1757、1768、1779、1790、1798、1806、1814、1825、1836、1847、1855、1863、1871、1882、1893、1904、1912、1920、1928、1936、1944、1952、1960、1968、1976、1984、1992、2000、2008、2016、2024、2032、2040、2048、2056、2064、2072、2080、2088、2096、2104、2112、2120、2128、2136、2144、2152、2160、2168、2176、2184、2192、2200、2208、2216、2234、2248、2262、2276、2287、2298、2309、2317、2325、2333、2344、2355、2366、2374、2382、2390、2401、2412、2423、2431、2439、2447、2458、2469、2480、2488、2496、2504、2512、2520、2528、2536、2544、2552、2560、2568、2576、2584、2592、2600、2608、2616、2624、2632、2640、2648、2656、2664、2672、2680、2688、2696、2704、2712、2720、2728、2736、2744、2752、2760、2768、2776、2784、2792、2808、2822、2833、2844、2855、2863、2871、2879、2890、2901、2912、2920、2928、2936、2944、2952、2960、2968、2976、2984、2992、3000、3008、3016、3024、3032、3040、3048、3056、3064、3072和3080，如在表5A和表5B中所示。其他实例在前述任一者的C端包含游离酸(而不是酰胺化C端残基)，诸如SEQID NO：597-601和813-1027，如在表5A和表5B中所示。
所含的氨基酸序列包含SEQ ID NO：475的位置Xaa 6处的Gly残基的物质组合物的一些实例包括：SEQ ID NO：265、751、752、754、755、1081、1095、1109、1123、1134、1145、1156、1164、1172、1180、1191、1202、1213、1221、1229、1237、1248、1259、1270、1278、1286、1294、1305、1316、1327、1335、1343、1351、1359、1367、1375、1383、1391、1399、1407、1415、1423、1431、1439、1447、1455、1463、1471、1479、1487、1495、1503、1511、1519、1527、1535、1543、1551、1559、1567、1575、1583、1591、1599、1607、1615、1623、1631、1639、1657、1671、1685、1699、1710、1721、1732、1740、1748、1756、1767、1778、1789、1797、1805、1813、1824、1835、1846、1854、1862、1870、1881、1892、1903、1911、1919、1927、1935、1943、1951、1959、1967、1975、1983、1991、1999、2007、2015、2023、2031、2039、2047、2055、2063、2071、2079、2087、2095、2103、2111、2119、2127、2135、2143、2151、2159、2167、2175、2183、2191、2199、2207、2215、2233、2247、2261、2275、2286、2297、2308、2316、2324、2332、2343、2354、2365、2373、2381、2389、2400、2411、2422、2430、2438、2446、2457、2468、2479、2487、2495、2503、2511、2519、2527、2535、2543、2551、2559、2567、2575、2583、2591、2599、2607、2615、2623、2631、2639、2647、2655、2663、2671、2679、2687、2695、2703、2711、2719、2727、2735、2743、2751、2759、2767、2775、2783、2791、2807、2821、2832、2843、2854、2862、2870、2878、2889、2900、2911、2919、2927、2935、2943、2951、2959、2967、2975、2983、2991、2999、3007、3015、3023、3031、3039、3047、3055、3063、3071和3079，如表5A和表5B中所示。
所含的氨基酸序列包含SEQ ID NO：475的位置Xaa 6处的2-Abu残基的物质组合物的一些实例包括：SEQ ID NO：605、636、649、706、707、718、753、758、797、799、801、804、807、808、1029、1041、1042、1048、1066、1067、1083、1097、1111、1125、1136、1147、1158、1166、1174、1182、1193、1204、1215、1223、1231、1239、1250、1261、1272、1280、1288、1296、1307、1318、1329、1337、1345、1353、1361、1369、1377、1385、1393、1401、1409、1417、1425、1433、1441、1449、1457、1465、1473、1481、1489、1497、1505、1513、1521、1529、1537、1545、1553、1561、1569、1577、1585、1593、1601、1609、1617、1625、1633、1641、1659、1673、1687、1701、1712、1723、1734、1742、1750、1758、1769、1780、1791、1799、1807、1815、1826、1837、1848、1856、1864、1872、1883、1894、1905、1913、1921、1929、1937、1945、1953、1961、1969、1977、1985、1993、2001、2009、2017、2025、2033、2041、2049、2057、2065、2073、2081、2089、2097、2105、2113、2121、2129、2137、2145、2153、2161、2169、2177、2185、2193、2201、2209、2217、2235、2249、2263、2277、2288、2299、2310、2318、2326、2334、2345、2356、2367、2375、2383、2391、2402、2413、2424、2432、2440、2448、2459、2470、2481、2489、2497、2505、2513、2521、2529、2537、2545、2553、2561、2569、2577、2585、2593、2601、2609、2617、2625、2633、2641、2649、2657、2665、2673、2681、2689、2697、2705、2713、2721、2729、2737、2745、2753、2761、2769、2777、2785、2793、2809、2823、2834、2845、2856、2864、2872、2880、2891、2902、2913、2921、2929、2937、2945、2953、2961、2969、2977、2985、2993、3001、3009、3017、3025、3033、3041、3049、3057、3065、3073和3081，如表5A和表5B中所示。
所含的氨基酸序列包含SEQ ID NO：475的位置Xaa 6处的Nle残基的物质组合物的一些实例包括：SEQ ID NO：607、638、651、1085、1099、1113、1127、1138、1149、1160、1168、1176、1184、1195、1206、1217、1225、1233、1241、1252、1263、1274、1282、1290、1298、1309、1320、1331、1339、1347、1355、1363、1371、1379、1387、1395、1403、1411、1419、1427、1435、1443、1451、1459、1467、1475、1483、1491、1499、1507、1515、1523、1531、1539、1547、1555、1563、1571、1579、1587、1595、1603、1611、1619、1627、1635、1643、1661、1675、1689、1703、1714、1725、1736、1744、1752、1760、1771、1782、1793、1801、1809、1817、1828、1839、1850、1858、1866、1874、1885、1896、1907、1915、1923、1931、1939、1947、1955、1963、1971、1979、1987、1995、2003、2011、2019、2027、2035、2043、2051、2059、2067、2075、2083、2091、2099、2107、2115、2123、2131、2139、2147、2155、2163、2171、2179、2187、2195、2203、2211、2219、2237、2251、2265、2279、2290、2301、2312、2320、2328、2336、2347、2358、2369、2377、2385、2393、2404、2415、2426、2434、2442、2450、2461、2472、2483、2491、2499、2507、2515、2523、2531、2539、2547、2555、2563、2571、2579、2587、2595、2603、2611、2619、2627、2635、2643、2651、2659、2667、2675、2683、2691、2699、2707、2715、2723、2731、2739、2747、2755、2763、2771、2779、2787、2795、2811、2825、2836、2847、2858、2866、2874、2882、2893、2904、2915、2923、2931、2939、2947、2955、2963、2971、2979、2987、2995、3003、3011、3019、3027、3035、3043、3051、3059、3067、3075和3083，如表5A和表5B中所示。
所含的氨基酸序列包含SEQ ID NO：475的位置Xaa 6处的Nva残基的物质组合物的一些实例包括：SEQ ID NO：606、637、650、705、708、717、759、760、805、806、1084、1098、1112、1126、1137、1148、1159、1167、1175、1183、1194、1205、1216、1224、1232、1240、1251、1262、1273、1281、1289、1297、1308、1319、1330、1338、1346、1354、1362、1370、1378、1386、1394、1402、1410、1418、1426、1434、1442、1450、1458、1466、1474、1482、1490、1498、1506、1514、1522、1530、1538、1546、1554、1562、1570、1578、1586、1594、1602、1610、1618、1626、1634、1642、1660、1674、1688、1702、1713、1724、1735、1743、1751、1759、1770、1781、1792、1800、1808、1816、1827、1838、1849、1857、1865、1873、1884、1895、1906、1914、1922、1930、1938、1946、1954、1962、1970、1978、1986、1994、2002、2010、2018、2026、2034、2042、2050、2058、2066、2074、2082、2090、2098、2106、2114、2122、2130、2138、2146、2154、2162、2170、2178、2186、2194、2202、2210、2218、2236、2250、2264、2278、2289、2300、2311、2319、2327、2335、2346、2357、2368、2376、2384、2392、2403、2414、2425、2433、2441、2449、2460、2471、2482、2490、2498、2506、2514、2522、2530、2538、2546、2554、2562、2570、2578、2586、2594、2602、2610、2618、2626、2634、2642、2650、2658、2666、2674、2682、2690、2698、2706、2714、2722、2730、2738、2746、2754、2762、2770、2778、2786、2794、2810、2824、2835、2846、2857、2865、2873、2881、2892、2903、2914、2922、2930、2938、2946、2954、2962、2970、2978、2986、2994、3002、3010、3018、3026、3034、3042、3050、3058、3066、3074和3082，如表5A和表5B中所示。
本发明组合物的其他示例性实施方案是未偶联的和偶联的GpTx-1的肽类似物，其具有如表5A、表5B和表31中所示的氨基酸序列之一。本发明的分离多肽的特定实施方案包括具有选自以下的氨基酸序列的那些：SEQ ID NO：3-134、136-305、307-386、388-474、515-527、532-588、590、591、593-1049和1062-3086，更具体地讲具有选自以下的氨基酸序列的那些：SEQ ID NO：3-30、32-72、74-134、136-178、180-211、218-239、241-305、307-363、366-386、388-432、434-474、515-527、532-588、590、591、593-775、777、778、780-788、790-1049和1062-3086。进一步包含任选的接头部分和药学上可接受的共价连接的半衰期延长部分(如本文所述)的这些多肽中的任一者也涵盖在本发明的范围内。包含这些多肽(具有或不具有共价连接的半衰期延长部分)任一者和药学上可接受的载体的药物组合物也涵盖在本发明的范围内。
表5A.GpTx-1和GpTx-1肽类似物的氨基酸序列。{H}-＝N端的氨基；-{酰胺}＝酰胺化C端；Ac-＝乙酰化N端；-{游离酸}＝羧化C端；{生物素}-＝生物素化N端；{4-Pen}-＝4-戊炔酰化N-端；{溴乙酰胺-PEG11-三唑}-＝共价偶联到N端的3-(1-(1-溴-2-氧代-6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十一氧杂-3-氮杂三十八烷-38-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)丙酰基。
如上文所述，根据本发明，本发明物质组合物的肽部分也可通过已知的有机化学技术在一个或多个氨基酸残基处进行化学衍生化。“化学衍生物”或“化学衍生化的”是指具有一个或多个通过官能性侧基的反应而化学衍生化的残基的主题肽。此类衍生化分子包括例如其中游离氨基已衍生化形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可衍生化形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可衍生化形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可衍生化形成N-im-苄基组氨酸。也作为化学衍生物包括在内的是包含一个或多个20个规范氨基酸的非天然存在的氨基酸衍生物(无论是L-还是D-形式)的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可被脯氨酸取代；5-羟赖氨酸可被赖氨酸取代；3-甲基组氨酸可被组氨酸取代；高丝氨酸可被丝氨酸取代；以及鸟氨酸可被赖氨酸取代。
可用的衍生化在一些实施方案中包括其中肽的氨基末端被化学封端使得将阻止在N端的游离氨基处发生与媒介物的偶联的那些衍生化。这样的修饰可以存在其他有益效果，例如降低毒素肽类似物对于酶促蛋白水解的易感性。N端可被酰化或修饰成取代的胺，或用另一官能团诸如芳族部分(例如吲哚酸、苄基(Bzl或Bn)、二苄基(DiBzl或Bn2)或苄氧羰基(Cbz或Z))、N，N-二甲基甘氨酸或肌酸修饰。例如，在一些实施方案中，诸如但不限于甲酰基、乙酰基(Ac)、丙酰基、丁酰基、庚酰基、己酰基、辛酰基或壬酰基的酰基部分可共价连接到肽的N端末端，这可防止在媒介物与肽的偶联中发生不需要的副反应。其他示例性N端衍生基团包括-NRR1(而非-NH2)、-NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR1、琥珀酰亚胺或苄氧羰基-NH-(Cbz-NH-)，其中R和R1各自独立地为氢或低级烷基并且其中苯环可被1至3个选自以下的取代基取代：C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氯和溴。
在一些实施方案中，氨基酸残基之间的一个或多个肽基[-C(O)NR-]键合(键)可被非肽基键合替换。示例性非肽基键合为-CH2-氨基甲酸[-CH2-OC(O)NR-]、膦酸、-CH2-磺酰胺[-CH2-S(O)2NR-]、脲[-NHC(O)NH-]、-CH2-仲胺以及烷基化肽[-C(O)NR6-，其中R6为低级烷基]。
在一些实施方案中，可对一个或多个单独的氨基酸残基进行衍生化。已知多种衍生化试剂与选定的侧链或末端残基发生特异性反应，如在下文以举例的方式详细描述。
赖氨酰残基和氨基末端残基可与琥珀酸或其他羧酸酐反应，它们可使赖氨酰残基的电荷反转。其他适于使含α-氨基的残基衍生化的试剂包括酰亚胺酯，诸如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；以及与乙醛酸的转氨酶催化反应。
精氨酰残基可通过与若干常规试剂的任何一种或组合反应而修饰，这些试剂包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生化由于胍官能团的高pKa而需要反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
酪氨酰残基的具体修饰已得到了广泛的研究，其中尤其关注通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而向酪氨酰残基中引入光谱标记。最常见的是，将N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。
羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰)可通过与碳二亚胺(R′-N＝C＝N-R′)诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应而选择性修饰。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基可通过与铵离子反应而转化成天冬氨酰胺酰(asparaginyl)和谷氨酰胺酰(glutaminyl)残基。
谷氨酰胺酰和冬氨酰胺酰残基可去酰胺化形成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。可选地，这些残基在适度的酸性条件下去酰胺化。这些残基的任一形式均落在本发明的范围内。
半胱氨酰残基可通过氨基酸残基或其他部分替代以消除二硫键或者反之使交联稳定。(参见例如Bhatnagar等人，J.Med.Chem.，39：3814-3819(1996))。
通过双官能试剂的衍生化可用于将肽或其官能衍生物交联到水不溶性载体基质(根据需要)或交联到其他大分子媒介物。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮基水杨酸形成的酯)、同双官能酰亚胺酯(包括二琥珀酰亚氨基酯，诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯))以及双官能马来酰亚胺(诸如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷)。诸如3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙亚氨酸甲酯的衍生化试剂产生在存在光的情况下能够形成交联的光可活化的中间体。可选地，采用反应性水不溶基质诸如溴化氰活化的碳水化合物和反应性底物(例如，如在美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述)进行蛋白固定。
其他可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化。Creighton，Proteins：Structure and MoleculeProperties(W.H.Freeman ＆ Co.，San Francisco)，79-86(1983)。
衍生化的以上实例不旨在详尽探讨，而仅仅是示例性的。
物质组合物的产生在适用时还可以涉及合适的蛋白纯化技术。在本发明物质组合物的一些实施方案中，可将分子制备为包含合适的同位素标记(例如125I、14C、13C、35S、3H、2H、13N、15N、18O、17O等)以便于定量或检测。
半衰期延长部分。任选地，为了调节分子的药动学形式以满足治疗性需要，本发明的组合物可包含多种质量和构型的一个或多个半衰期延长部分，所述一个或多个半衰期延长部分可共价稠合、附接、连接或偶联到毒素肽类似物。“半衰期延长部分”是指与毒素肽类似物的非偶联形式相比具有以下作用的分子：防止或减少蛋白水解或其他导致活性降低的化学修饰产生的体内降解，延长体内半衰期或增强其他药动学性质诸如但不限于增加吸收率，降低毒性，降低免疫原性，提高溶解性，增加毒素肽类似物对所关注靶标的生物活性和/或靶标选择性，和/或提高可制造性。根据本发明，半衰期延长部分是药学上可接受的部分。
半衰期延长部分的选择可使得本发明的组合物实现足够的流体动力学尺寸以防止被体内肾脏过滤清除。例如，可以选择基本上呈直链、支链(br)或树枝状形式的为聚合物大分子的半衰期延长部分。可选地，半衰期延长部分的选择可使得在体内本发明的物质组合物将结合到血清蛋白形成复合物，使得因而形成的复合物避免显著的肾清除。半衰期延长部分可以为例如脂质；胆固醇基团(诸如类固醇)；碳水化合物或低聚糖；或结合到补救受体(salvage receptor)的任何天然或合成蛋白、多肽或肽。
可以根据本发明使用的示例性半衰期延长部分包括免疫球蛋白Fc结构域或其部分，或生物学合适的聚合物或共聚物，例如聚亚烷基二醇化合物，诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇。其他合适的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于以下类型的带电或中性聚合物：葡聚糖、聚赖氨酸、多聚乙酰神经氨糖酸或其他碳水化合物类聚合物、氨基酸聚合物以及生物素衍生物。在一些单体融合或偶联蛋白实施方案中，免疫球蛋白(包含轻链和重链)或其部分可用作半衰期延长部分，优选地为人源免疫球蛋白，并包括免疫球蛋白的任一种，诸如但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
根据本发明的半衰期延长部分的其他示例包括：乙二醇的共聚物，丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷，乙烯-马来酸酐共聚物，聚氨基酸(例如聚赖氨酸或聚鸟氨酸)，葡聚糖N-乙烯基吡咯烷酮，聚N-乙烯基吡咯烷酮，丙二醇均聚物，环氧丙烷聚合物，环氧乙烷聚合物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，直链或支链糖基化链，聚缩醛，长链脂肪酸，长链疏水性脂族基团或聚唾液酸(例如PolyXenTM技术；Gregoriadis等人，Improvingthe therapeutic efficacy of peptides and proteins：a role for polysialic acids，Intl.J.Pharmaceutics，300：125-30(2005)，该文献以引用方式整体并入本文)。
在物质组合物的其他实施方案中，半衰期延长部分为共价连接到毒素肽类似物的N端的带阴离子电荷的化学实体，该带阴离子电荷的化学实体包括但不限于磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、对膦酰基(二氟甲基)-苯丙氨酸(Pfp)、对膦酰基-甲基-苯丙氨酸(Pmp)、对磷脂酰基-苯丙氨酸(Ppa)或对膦酰基-甲基酮-苯丙氨酸(Pkp)，它们可共价连接到毒素肽类似物的N端，任选地通过如本文所述的AEEA接头或其他接头间接连接。(参见Chandy等人，Analogs of ShK toxin and their uses in selectiveinhibition of Kv1.3potassium channels，WO2006/042151A2；Beeton等人，Targeting effector memory T cells with a selective peptide inhibitor ofKv1.3channels for therapy of autoimmune diseases，Molec.Pharmacol.67(4)：1369-81(2005)；Pennington等人，Engineering a stable and selectivepeptide blocker of the Kv1.3channel in T lymphocytes，MolecularPharmacology Fast Forward，2009年1月2日作为doi：10.1124/mol.108.052704公布(2009)，所有这些参考文献均以引用方式整体并入本文)。AEEA是2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸(也称为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)。(参见例如Beeton等人，Targeting effectormemory T cells with a selective peptide inhibitor of Kv1.3channels fortherapy of autoimmune diseases，Molec.Pharmacol.67(4)：1369-81(2005))。
根据本发明的半衰期延长部分的其他实施方案包括在温度、pH和离子强度生理条件下具有与长半衰期血清蛋白的结合亲和力的肽配体或小(有机)分子配体。实例包括白蛋白结合肽或小分子配体，转甲状腺素蛋白结合肽或小分子配体，甲状腺素结合球蛋白结合肽或小分子配体，抗体结合肽或小分子配体，或具有与长半衰期血清蛋白的亲和力的另一肽或小分子。(参见例如Blaney等人，Method andcompositions for increasing the serum half-life of pharmacologically activeagents by binding to transthyretin-selective ligands，美国专利号5,714,142；Sato等人，Serum albumin binding moieties，US2003/0069395A1；Jones等人，Pharmaceutical active conjugates，美国专利号6,342,225)。“长半衰期血清蛋白”是溶于哺乳动物血浆的数百种不同蛋白之一，包括所谓的“载体蛋白”(诸如白蛋白、转铁蛋白和触珠蛋白)、纤维蛋白原和其他凝血因子、补体成分、免疫球蛋白、酶抑制剂、诸如紧张素和缓激肽的物质的前体以及许多其他类型的蛋白。本发明涵盖使用药学上可接受的半衰期延长部分的任何单一物质，诸如但不限于在本文所述的那些，或使用两种或更多种不同的半衰期延长部分的组合，诸如PEG和免疫球蛋白Fc结构域或其部分(参见例如Feige等人，Modifiedpeptides as therapeutic agents，美国专利号6,660,843)，诸如Fc的CH2结构域、白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)；参见例如Rosen等人，Albumin fusion proteins，美国专利号6,926,898和US2005/0054051；Bridon等人，Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidaseactivity through conjugation to blood components，US6,887,470)、转甲状腺素蛋白(TTR；参见例如Walker等人，Use of transthyretinpeptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologicallyactive peptides/proteins，US2003/0195154A1；2003/0191056A1)或甲状腺素结合球蛋白(TBG)，或诸如免疫球蛋白(轻链+重链)和Fc结构域的组合(异三聚组合，所谓的“半体”)，例如，如以引用方式整体并入本文的Sullivan等人，Toxin Peptide Therapeutic Agents，PCT/US2007/022831(作为WO2008/088422公开)中所述。
一个或多个毒素肽类似物与一个或多个半衰期延长部分的偶联可通过毒素肽的N端和/或C端进行，或可插入其一级氨基酸序列，F1的连接更接近毒素肽类似物的N端。
尤其可用的半衰期延长部分包括免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。术语“免疫球蛋白”涵盖包含两条各自共价连接到轻链(LC)的二聚重链(HC)的全抗体；单条未二聚化的免疫球蛋白重链和共价连接的轻链(HC+LC)；或嵌合免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异三聚体(所谓的“半体”)。图12A-N和图88-91示出了此类免疫球蛋白-毒素肽偶联物的多个不同实施方案。
本发明的GpTx-1肽类似物与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型任一者的重组免疫球蛋白的重组融合或化学偶联可用于延长药动学半衰期。(参见例如Doellgast等人，WO2010/108153A2)。在Doellgast等人，WO2010/108153A2或Walker等人，PCT/US2011/052841中公开的载体免疫球蛋白的任一者，或者它们之中包含不同同种型恒定结构域的任一者的同种型转化，或者本领域已知的其他载体免疫球蛋白均可在本发明的范围内用作半衰期延长部分。
人IgG2重链(HC)恒定区的一个实例具有以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPP
CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENN
YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK//SEQ.ID NO：3090.
如果需要，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白同种型的其他IgG同种型恒定区序列是本领域已知的。一般来讲，在不需要效应子功能时可将人IgG2可用于靶标，而在需要此类效应子功能(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))的情形下可以使用人IgG1。人IgG3具有相对短的半衰期，而人IgG4会形成抗体“半分子”。人IgG1存在四种已知的同种异型。优选的同种异型称为“hIgG1z”，也称为“KEEM”同种异型。人IgG1同种异型“hIgG1za”(KDEL)、“hIgG1f”(REEM)和“hIgG1fa”也是可用的；所有的似乎都具有ADCC效应子功能。
人hIgG1z重链(HC)恒定结构域具有以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK//SEQ ID NO：3091.
人hIgG1za重链(HC)恒定结构域具有以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK//SEQ ID NO：3092.
人hIgG1f重链(HC)恒定结构域具有以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK//SEQ ID NO：3093.
人hIgG1fa重链(HC)恒定结构域具有以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP
AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK//SEQ ID NO：3094.
人免疫球蛋白轻链(LC)恒定区序列的一个实例如下(指定为“CL-1”)：
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGV
ETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS//
SEQ ID NO：3095.
CL-1可用于增加抗体的pI，并且是便利的。存在三个其他的人免疫球蛋白轻链恒定区，指定为“CL-2”、“CL-3”和“CL-7”，它们也可在本发明的范围内使用。CL-2和CL-3在人类种群中更常见。
CL-2人轻链(LC)恒定结构域具有以下氨基酸序列：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVE
TTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS//
SEQ ID NO：3096.
CL-3人LC恒定结构域具有以下氨基酸序列：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVE
TTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS//
SEQ ID NO：3097.
CL-7人LC恒定结构域具有以下氨基酸序列：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGV
ETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS//
SEQ ID NO：3098.
免疫球蛋白链的可变区通常表现出相同的总体结构，该结构包含通过三个高变区接合的相对保守的骨架区(FR)，而高变区又更通常地被称为“互补决定区”或CDR。上述每个重链/轻链对的两条重链中的CDR通常通过骨架区对齐，以形成与靶蛋白上的特定表位或结构域(若有)特异性结合的结构。从N端或C端起，天然存在的轻链和重链可变区均通常都符合这些元件的以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已经设计了编号系统向占据这些结构域每一者中的位置的氨基酸赋予数值。该编号系统在Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，MD)或Chothia ＆Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature342：878-883中有所定义。
“抗体”或可互换地称为“Ab”是四聚糖蛋白。在天然存在的抗体中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条约220个氨基酸(约25kDa)的“轻”链和一条约440个氨基酸(约50-70kDa)的“重”链。每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的“可变”(“V”)区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。不同的抗体中的可变区不同。不同的抗体中的恒定区相同。在每条重链或轻链的可变区内，存在三个高变亚区，它们有助于决定抗体的抗原特异性。高变区之间的可变结构域残基称为骨架残基，并且通常在不同的抗体之中有一定程度的同源性。免疫球蛋白可根据它们重链恒定区的氨基酸序列而分配到不同的类别。人轻链被分类为kappa(κ)和lambda(λ)轻链。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的″J″区接合，而重链还包含约10多个氨基酸的″D″区。一般可参见Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.编辑，第2版Raven Press，N.Y.(1989))。在本发明的范围内，“抗体”还涵盖重组制备的抗体以及缺乏糖基化的抗体。
术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”包括全长轻链及其具有足够的可变区序列以赋予结合亲和性的片段。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括kappa链和lambda链。术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括全长重链及其具有足够的可变区序列以赋予结合亲和性的片段。全长重链包含可变区结构域、VH以及三个恒定区结构域：CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，CH结构域位于羧基末端，而CH3最靠近多肽的羧基末端。重链被分类为mu(μ)、delta(Δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)并将抗体同种型分别限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明的单独实施方案中，重链可以具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。其中几种可进一步划分成亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每个轻链/重链对的可变区通常形成抗体的抗原结合位点，但是可用的载体抗体不必具有已知的抗原结合位点也能使用。(参见例如Doellgast等人，WO2010/108153A2；Walker等人，PCT/US2011/052841)。不同的IgG同种型可具有不同的效应子功能(由Fc区域介导)，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区结合到诸如自然杀伤细胞和巨噬细胞的免疫效应细胞表面上的Fc受体(FcγR)，从而导致靶向的细胞发生吞噬或裂解。在CDC中，抗体通过在细胞表面触发补体级联反应而杀伤靶向的细胞。
“Fc区”或在本文可互换使用的“Fc结构域”或“免疫球蛋白Fc结构域”包含两个重链片段，这些片段在全长抗体中包含抗体的CH1和CH2结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键并通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
术语“补救受体结合表位”是指负责延长IgG分子体内血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。
“同种异型”是在抗体序列中通常在恒定区中的变型形式，其可以为免疫原性的并在人类中由特异性等位基因编码。已经鉴定出了人类IGHC基因中的五种即IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHA2和IGHE基因的同种异型，并分别指定为G1m、G2m、G3m、A2m和Em同种异型。至少18种Gm同种异型是已知的：nG1m(1)、nG1m(2)、G1m(1、2、3、17)或G1m(a、x、f、z)、G2m(23)或G2m(n)、G3m(5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m(b1、c3、b5、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)。存在两种A2m同种异型：A2m(1)和A2m(2)。
有关抗体的结构和生成的详细说明，参见以引用方式整体并入本文的Roth，D.B.和Craig，N.L，Cell，94：411414(1998)。简而言之，生成编码重链和轻链免疫球蛋白序列的过程主要在发育中的B细胞中发生。在重新排列和接合各种免疫球蛋白基因片段前，V、D、J和恒定(C)基因片段通常相对靠近地存在于单条染色体上。在B细胞分化期间，V、D、J(或就轻链基因而言只有V和J)基因片段的合适家族成员的每一者之一重组形成功能重排的重链和轻链免疫球蛋白基因的可变区。该基因片段重排过程似乎是按顺序进行的。首先，进行重链D与J接合，然后是重链V与DJ接合和轻链V与J接合。除了V、D和J片段的重排外，还通过轻链中V与J片段接合位置以及重链D与J片段接合位置处的可变重组在免疫球蛋白重链和轻链一级库(primaryrepertoire)中产生了其他多样性。轻链中的这种变化通常在V基因片段的最后一个密码子以及J片段的第一个密码子内发生。接合中相似的不精确性出现在重链染色体上D与JH片段之间，并可延伸多达10个核苷酸。此外，若干核苷酸可插入不由基因组DNA编码的D与JH基因片段之间以及VH与D基因片段之间。这些核苷酸的添加称为N区多样性。可变区基因片段的此类重排以及可在这种接合期间发生的可变重组的净效果是产生一抗库。
术语“高变”区是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基[即，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1991)所述]。即使单一CDR可识别并结合抗原，但亲和力低于含有所有CDR的完整抗原结合位点。
来自高变“环”的残基的替代性定义由Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述为轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。
“骨架”或“FR”残基是除高变区残基以外的那些可变区残基。
“抗体片段”包括完整全长抗体的一部分，优选地为完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(zapata等人，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自具有单个抗原结合位点；以及残余“Fc”片段，其包含恒定区。Fab片段含有整个可变结构域，以及轻链恒定结构域和重链第一恒定结构域(CH1)。Fc片段呈现碳水化合物并负责许多抗体效应功能(诸如结合补体和细胞受体)，其使一类抗体区别于另一类。
胃蛋白酶处理产生具有两个包含抗体VH和VL结构域的“单链Fv”或“scFv”抗体片段的F(ab′)2片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。Fab片段因在重链CH1结构域的羧基末端包含几个另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab′片段不同。优选地，Fv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，其使得Fv能够形成抗原结合的所需结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab′片段”含有一条轻链以及一条重链中含VH结构域和CH1结构域及CH1结构域与CH2结构域之间的区域的部分，使得在两个Fab′片段的两条重链之间可以形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链以及两条含CH1结构域与CH2结构域之间的一部分恒定区的重链，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段构成。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域的二聚体组成。在此构型中，各可变结构域的三个CDR相互作用以界定VH VL二聚体表面上的抗原结合位点。单一可变结构域(或仅含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)能够识别并结合抗原，但亲和力低于完整结合位点。
“单链抗体”是重链可变区和轻链可变区已通过柔性接头连接以形成单条多肽链的Fv分子，该单条多肽链形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开号WO88/01649和美国专利号4,946,778与5,260,203中有详细的讨论，这些专利的公开内容以引用方式整体并入。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中，并任选地在VH与VL结构域之间包含使Fv能够形成抗原结合的所需结构的多肽接头(Bird等人，Science242：423-426，1988，和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883，1988)。“Fd”片段由VH和CH1结构域组成。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含连接到同一多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而无法使同一链上的两个结构域配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP404,097、WO93/11161和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中有更全面的描述。
“结构域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价接合以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
术语“表位”是分子中由抗原结合蛋白(例如抗体)结合的部分。该术语包括能够特异性结合到抗原结合蛋白(诸如抗体)或结合到T细胞受体的任何决定子。表位可为连续或非连续的(例如在单链多肽中，在多肽序列中彼此不连续但在分子背景下由抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。在某些实施方案中，表位可为模拟物，因为其包含与用于产生抗原结合蛋白的表位相似的三维结构，但不包含或仅包含一些存在于用于产生抗原结合蛋白的该表位中的氨基酸残基。最常见的是，表位位于蛋白上，但在一些情况下，可位于其他种类的分子诸如核酸上。表位决定子可包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特定的三维结构特性和/或比电荷特性。一般来讲，对特定标靶抗原具有特异性的抗体将优先识别蛋白和/或大分子复杂混合物中靶抗原上的表位。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列而测定。“百分比同一性”意指所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于所比较的最小分子的大小进行计算。对于这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来处理比对中的空位(若存在)。可用于计算进行比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology，(Lesk，A.M.编辑)，1988，New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics andGenome Projects，(Smith，D.W.编辑)，1993，New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑)，1994，New Jersey：Humana Press；von Heinje，G.，1987，SequenceAnalysis in Molecular Biology，New York：Academic Press；SequenceAnalysis Primer，(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)，1991，New York：M.Stockton Press以及Carillo等人，1988，SIAM J.Applied Math.48：1073。例如，可通过通常用于比较两个多肽的氨基酸位置相似性的标准方法来测定序列同一性。使用诸如BLAST或FASTA的计算机程序，比对两个多肽序列或两个多核苷酸序列以获得其相应残基的最佳匹配(沿一个或两个序列的全长，或沿一个或两个序列的预定部分)。这些程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，并且可结合计算机程序使用评分矩阵，诸如PAM250[标准评分矩阵；参见Dayhoff等人，于Atlas ofProtein Sequence and Structure，vol.5，supp.3(1978)]。例如，然后可如下计算百分比同一性：相同匹配的总数乘以100，然后除以所匹配跨度内较长序列的长度与引入较长序列中以比对两个序列的空位数之和。在计算百分比同一性时，以在序列之间产生最大匹配的方式比对进行比较的序列。
GCG程序包是可用于测定百分比同一性的计算机程序，该程序包包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid Res.12：387；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)。使用计算机算法GAP来比对待测定百分比序列同一性的两个多肽或两个多核苷酸。对序列进行比对，以获得其相应氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配的跨度”，如通过算法测定)。与算法相结合使用空位开放罚分(其计算方式为3×平均对角线，其中“平均对角线”是所用比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是特定比较矩阵分配给各完美氨基酸匹配的评分或数值)和空位延伸罚分(其通常为空位开放罚分的1/10)以及比较矩阵(诸如PAM250或BLOSUM62)。在某些实施方案中，算法还使用标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等人，1978，Atlasof Protein Sequence and Structure5：345-352；对于BLOSUM62比较矩阵，参见Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。
使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的百分比同一性的推荐参数包括以下：
算法：Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.48：443-453；
比较矩阵：来自Henikoff等人，1992，同上的BLOSUM62；
空位罚分：12(但无末端空位的罚分)
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致仅匹配两个序列的较短区域，并且此小比对区域可具有极高的序列同一性，即使两个全长序列之间不存在明显关系。因此，如果需要实现跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对，则可调整所选的比对方法(GAP程序)。
术语“修饰”在结合免疫球蛋白(包括本发明的抗体和抗体片段)使用时包括但不限于一个或多个氨基酸变化(包括取代、插入或缺失)；化学修饰；偶联到治疗剂或诊断剂的共价修饰；进行标记(例如使用放射性核素或各种酶)；共价聚合物连接，诸如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)以及通过化学合成非天然氨基酸实现的插入或取代。
术语“衍生物”在结合本发明范围内的免疫球蛋白(包括抗体和抗体片段)使用时是指通过偶联到治疗剂或诊断剂、进行标记(例如使用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接(诸如聚乙二醇化，即用聚乙二醇衍生化)以及通过化学合成非天然氨基酸实现的插入或取代而共价修饰的免疫球蛋白。本发明的衍生物将保留本发明的未衍生化分子的结合性质。
在本发明的一些实施方案中，半衰期延长部分是免疫球蛋Fc结构域(例如人免疫球蛋白Fc结构域，包括同种异型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc)或其部分(例如Fc结构域的CH2结构域)、人血清白蛋白(HSA)或聚(乙二醇)(PEG)，尤其是分子量为约1000Da至约100000Da的PEG。
单价二聚或二价二聚Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物是本发明物质组合物的可用实施方案。“单价二聚”Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物或可互换地称为“单价二聚体”或可互换地称为“单价异二聚体”是包含仅结合一个二聚Fc结构域的毒素肽类似物的Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物(例如，如Sullivan等人，Toxin Peptide Therapeutic Agents，US2007/0071764和Sullivan等人，Toxin Peptide Therapeutic Agents，PCT/US2007/022831(作为WO2008/088422公开)的图2B中示意性图示，两者均以引用方式整体并入本文)。“二价二聚”Fc-毒素肽类似物融合体或可互换地称为“二价二聚体”或“二价同二聚体”是具有两个各自独立地与毒素肽类似物偶联的二聚Fc结构域的Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物(例如，如Sullivan等人，Toxin Peptide Therapeutic Agents，US2007/0071764和Sullivan等人，Toxin Peptide Therapeutic Agents，PCT/US2007/022831(作为WO2008/088422公开)的图2C中示意性图示)。
免疫球蛋白Fc结构域包括Fc变体，这些Fc变体是本发明范围内的合适半衰期延长部分。天然Fc可经广泛修饰以形成根据本发明的Fc变体，前提是保持与补救受体的结合；参见例如WO97/34631、WO96/32478和WO04/110472。在此类Fc变体中，可移除天然Fc中一或多个提供本发明融合体或偶联物分子不需要的结构特征或功能活性的位点。可通过例如取代或缺失残基、向位点中插入残基或截短含有相应位点的部分来移除这些位点。插入或取代的残基也可以是发生改变的氨基酸，诸如模拟肽或D-氨基酸。Fc变体可因许多原因而合乎需要，其中多种原因描述于下。示例性Fc变体包括如下分子和序列，其中：
1.移除了涉及二硫键形成的位点。这种移除可避免与用于产生本发明分子的宿主细胞中所存在的其他含半胱氨酸蛋白反应。为此，可截短N端的含半胱氨酸片段，或者使半胱氨酸残基缺失或用其他氨基酸(例如丙氨酰、丝氨酰)取代。具体地讲，可以截短SEQ ID NO：478的N端20个氨基酸片段：
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Lcu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Gln
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
Ala Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
Ser Leu Ser Pro Gly Lys//SEQ ID NO：478.
或缺失或取代SEQ ID NO：478的第7和10位的半胱氨酸残基即使在移除半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍可形成以非共价方式保持在一起的二聚Fc结构域。
2.修饰天然Fc以使其与所选的宿主细胞更相容。例如，可移除典型天然Fc的N端附近的PA二肽序列，该序列可由大肠杆菌中的消化酶(诸如脯氨酸亚胺基肽酶)识别。也可添加N端甲硫氨酸残基，尤其是将分子在细菌细胞诸如大肠杆菌中重组表达时。SEQ ID NO：478的Fc结构域是一个这样的Fc变体。
3.移除天然Fc N端的一部分以防止在所选宿主细胞中表达时出现N端异质性。为此，可使N端前20个氨基酸残基中的任一者，尤其是第1、2、3、4和5位的那些缺失。
4.移除一个或多个糖基化位点。通常发生糖基化的残基(例如天冬酰胺)可赋予细胞溶解反应。此类残基可缺失或用未糖基化的残基(例如丙氨酸)取代。
5.移除涉及与补体相互作用的位点，诸如C1q结合位点。例如，可缺失或取代人类IgG1的EKK三肽序列。补体募集可能对本发明的分子不利并因此可通过这样的Fc变体而加以避免。
5.移除将对结合除补救受体之外的Fc受体产生影响的位点。天然Fc可具有与某些白血球相互作用的位点，本发明的融合体或偶联物分子不需要这些位点并因此可将其移除。
7.将ADCC位点移除以降低或消除ADCC效应功能，或者可选地，通过非岩藻糖基化或去岩藻糖基化进行修饰以增强ADCC效应功能。ADCC位点在本领域中是已知的；关于IgG1中的ADCC位点，参见例如Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)。本发明的融合体或偶联物分子也不需要这些位点，并因此可将其移除，或在需要时增强ADCC效应功能。(参见Iida等人，Two mechanisms of the enhancedantibody-dependent cellular cytotoxicity(ADCC)efficacy ofnon-fucosylated therapeutic antibodies in human blood，BMC Cancer9：58doi：10.1186/1471-2407-9-58(2009))。
8.当天然Fc来源于非人类抗体时，可将天然Fc人源化。通常，为了人源化天然Fc，将用通常存在于人类天然Fc中的残基取代非人类天然Fc中的所选残基。抗体人源化技术在本领域中是熟知的。
9.可将一个或多个毒素肽类似物序列插入免疫球蛋白Fc结构域的环区域内的一个或多个内部偶联位点中，如美国专利号7,442,778、7,645,861、7,655,764、7,655,765、7,662,931、7,750,127和7,750,128中所公开。术语“环”区域或“Fc-环”区域是指氨基酸残基的一级序列，其在环区域一级结构的紧接N端和C端方向连接两个包含二级结构(诸如α螺旋或β折叠)的区域。实例包括但不限于CH2或CH3环区域。本领域的技术人员理解，环区域虽然自身不含二级结构，但是可影响或有助于二级或更高级蛋白结构。术语“内部”偶联位点意指一个或多个毒素肽类似物部分不处于末端，即不经由Fc结构域的α-氨基位点或α-羧基位点，但在Fc结构域的N端和/或C端也可任选地存在另外的末端偶联部分。
10.具有合适长度和电中性的接头诸如“L25”(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO：493)或“L20”(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO：477)可在Fc结构域一个单体的C端与第二Fc结构域单体的N端之间共价融合，其中毒素肽类似物融合到第一Fc结构域单体的N端或第二Fc结构域单体的C端，或第一和/或第二Fc结构域单体的环区域内。这样的分子可在细菌或哺乳动物细胞中重组表达以产生变体“单价二聚”Fc-毒素肽类似物融合体或偶联物，其中Fc单体之间形成典型的二硫键。(参见例如本文的实施例13)。Fc变体的其他实例包括以下：在SEQ ID NO：478中，可用谷氨酸取代第15位的亮氨酸；用丙氨酸取代第99位的谷氨酸；以及用丙氨酸取代第101和103位的赖氨酸。此外，苯丙氨酸残基可替代一或多个酪氨酸残基。出于本发明的目的，变体Fc结构域也可以为单体免疫球蛋白重链、抗体或异三聚半体(LC+HC+Fc)的一部分。
替代性半衰期延长部分将为能够结合到补救受体的蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段或小分子(例如拟肽化合物)。例如，可使用如1998年4月14日授予Presta等人的美国专利号5,739,277中所述的多肽作为半衰期延长部分。也可通过噬菌体展示来选择结合到FcRn补救受体的肽。此类补救受体结合化合物也包括在“半衰期延长部分”的含义内和本发明的范围内。应选择此类半衰期延长部分以延长半衰期(例如通过避免由蛋白酶识别的序列)并降低免疫原性(例如通过偏好非免疫原性序列，如在抗体人源化中所发现)。
如上所述，也可使用聚合物半衰期延长部分。当前可获得用于附接可用作半衰期延长部分的化学部分的各种手段，参见例如以引用方式整体并入本文的标题为“N-Terminally Chemically Modified ProteinCompositions and Methods”的专利合作条约(“PCT”)国际公开号WO96/11953。此PCT公开案尤其公开了水溶性聚合物选择性附接到蛋白的N端。
在本发明组合物的一些实施方案中，聚合物半衰期延长部分是共价连接在毒素肽类似物的N端、C端或一条或多条插入侧链的聚乙二醇(PEG)。本发明物质组合物的一些实施方案还包括一个或多个偶联到非PEG半衰期延长部分或偶联到毒素肽类似物或偶联到任何这些物质的任何组合的PEG部分。例如，可通过还原性烷基化工艺使本发明组合物中的Fc结构域或其部分单聚乙二醇化、二聚乙二醇化或者多聚乙二醇化。
蛋白和肽与聚(乙二醇)(PEG)的共价偶联已被广泛认为是明显延长治疗性蛋白体内循环半衰期的途径。聚乙二醇化主要通过延迟肾清除来实现此效应，因为PEG部分显著增加蛋白质的流体动力学半径。(Zalipsky，S.等人，Use of functionalized poly(ethylene glycol)s formodification of polypeptides.，in poly(ethylene glycol)chemistry：Biotechnical and biomedical applications.，J.M.Harris编辑，Plenum Press：New York.，347-370(1992))。蛋白和肽的聚乙二醇化通常所赋予的另外益处包括增加溶解度、耐蛋白水解降解以及降低治疗性多肽的免疫原性。若干聚乙二醇化蛋白的商业化证明了蛋白聚乙二醇化的优点，包括PEG-腺苷脱胺酶(AdagenTM/Enzon Corp.)、PEG-L-天冬酰胺酶(OncasparTM/Enzon Corp.)、PEG-干扰素α-2b(PEG-IntronTM/Schering/Enzon)、PEG-干扰素α-2a(PEGASYSTM/Roche)和PEG-G-CSF(NeulastaTM/Amgen)以及处于临床试验中的许多其他聚乙二醇化蛋白。
所谓“聚乙二醇化肽”或“聚乙二醇化蛋白”是指具有聚乙二醇(PEG)部分的肽，该聚乙二醇部分共价结合到肽自身的氨基酸残基，或者共价结合到直接地或经由另一接头部分间接地共价结合到肽残基的肽基或非肽基接头。非限制性实例为肽与3-(1-(1-溴-2-氧代-6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十一氧杂-3-氮杂三十八烷-38-基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)丙酰基的N端偶联(本文中以缩写“{溴乙酰胺-PEG11-三唑}-”来表示)。
所谓“聚乙二醇”或“PEG”是指聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，具有或不具有偶合剂或用或不用偶合或活化部分(例如用醛、羟基琥珀酰亚胺基、酰肼、硫醇、三氟甲磺酸、三氟乙磺酸、氮丙啶、环氧乙烷、邻吡啶基二硫化物、乙烯基砜、碘乙酰胺或马来酰亚胺部分)衍生化。根据本发明，可用的PEG包括基本上线性的直链PEG、支链PEG(brPEG)或树枝状PEG。(参见例如Merrill，美国专利号5,171,264；Harris等人，Multiarmed，monofunctional，polymer for coupling to molecules andsurfaces，美国专利号5,932,462；Shen，N-maleimidyl polymer derivatives，美国专利号6,602,498)。
简而言之，PEG基团通常经由PEG部分上的反应性基团(例如醛、氨基、硫醇或酯基团)与本发明化合物上的反应性基团(例如醛、氨基或酯基团)发生酰化或还原性烷基化(或还原性胺化)而连接到本发明组合物的肽部分。可用于合成类肽的聚乙二醇化的策略由通过在溶液中形成共轭键来组合肽与PEG部分而构成，肽与PEG部分各自具有彼此相互反应的特殊官能团。肽可用常规的固相合成容易地制备(参见例如图5和图6以及本文所附的文本)。在特定位点处用合适的官能基将肽“预活化”。在与PEG部分反应前纯化并充分表征前体。肽与PEG的连接通常在水相中发生并可通过反相分析型HPLC容易地监测。聚乙二醇化肽可容易地通过制备型HPLC加以纯化并通过分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸质谱来表征。
PEG是可以商购获得的或可根据本领域熟知的方法通过乙二醇开环聚合而制备的熟知水溶性聚合物(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，Vol.3，第138-161页)。在本申请中，术语“PEG”广泛用于涵盖呈单官能、双官能或多官能形式的任何聚乙二醇分子而不考虑PEG的大小或末端修饰，并且可由下式表示：
X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，    (I)
其中n为20至2300，并且X为H或末端修饰，例如C1-4烷基。
在一些可用的实施方案中，本发明所用的PEG在-端以羟基或甲氧基终止，即X为H或CH3“甲氧基PEG”)。应当注意，式(I)中示为以OH终止的PEG的另一端经由醚氧键、胺键合或酰胺键合共价连接到活化部分。当用于化学结构中时，术语“PEG”包括不具有所示羟基的氢从而留下可用于与接头游离碳原子反应形成醚键的氧的上式(I)。更具体地讲，为了使PEG偶联到肽，肽必须与“活化”形式的PEG反应。活化的PEG可由下式表示：
(PEG)-(A)    (II)
其中PEG(定义同上)共价连接到活化部分(A)的碳原子以形成醚键、胺键合或酰胺键合，并且(A)含有可与肽的氨基酸残基或共价连接到肽的接头部分(例如毒素肽类似物)上的氨基、叠氮基、炔烃、亚氨基、马来酰亚胺基、N-琥珀酰亚胺基、羧基、氨基氧基、硒基或硫醇基团反应的反应性基团。
制备活化的PEG及其与生物活性肽的偶联技术在本领域中是熟知的。(参见例如美国专利号5,643,575、5,919,455、5,932,462和5,990,237；Kinstler等人，N-terminally chemically modified protein compositions andmethods，美国专利号5,985,265和5,824,784；Thompson等人，PEGylationof polypeptides，EP0575545B1；Petit，Site specific protein modification，美国专利号6,451,986和6,548,644；S.Herman等人，Poly(ethylene glycol)with reactive endgroups：I.Modification of proteins，J.BioactiveCompatible Polymers，10：145-187(1995)；Y.Lu等人，PEGylated peptidesIII：Solid-phase synthesis with PEGylating reagents of varying molecularweight：synthesis of multiply PEGylated peptides，Reactive Polymers，22：221-229(1994)；A.M.Felix等人，PEGylated Peptides IV：Enhancedbiological activity of site-directed PEGylated GRF analogs，Int.J.PeptideProtein Res.，46：253-264(1995)；A.M.Felix，Site-specific poly(ethyleneglycol)ylation of peptides，ACS Symposium Series680(poly(ethyleneglycol))：218-238(1997)；Y.Ikeda等人，Polyethylene glycol derivatives，their modified peptides，methods for producing them and use of the modifiedpeptides，EP0473084B1；G.E.Means等人，Selected techniques for themodification of protein side chains，in：Chemical modification of proteins，Holden Day，Inc.，219(1971))。
活化的PEG诸如PEG-醛或PEG-醛水合物可通过已知的手段化学合成或得自商业来源，例如Shearwater Polymers(Huntsville，A1)或Enzon，Inc.(Piscataway，N.J.)。
出于本发明的目的，可用的活化PEG的实例为PEG-醛化合物(例如甲氧基PEG-醛)，诸如PEG-丙醛，其可从Shearwater Polymers(Huntsville，A1)商购获得。PEG-丙醛由式PEG-CH2CH2CHO表示。(参见例如美国专利号5,252,714)。“PEG醛化合物”的含义还包括PEG醛水合物，例如PEG乙醛水合物和PEG双醛水合物，后者产生双官能活化的结构。(参见例如Bentley等人，Poly(ethylene glycol)aldehydehydrates and related polymers and applications in modifying amines，美国专利号5,990,237)(参见例如Bentley等人，Poly(ethylene glycol)aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifyingamines，美国专利号5,990,237)。可使用活化的多分支PEG-醛化合物(包含多条臂以获得二价、三价、四价、八价构建体的PEG衍生物)。使用4臂PEG衍生物时，将四(4)个毒素肽类似物连接到各PEG分子。例如，根据本发明，毒素肽类似物可在PEG的1、2、3或4个氨基官能化位点偶联到聚乙二醇(PEG)。
在根据本发明的方法进行偶联时，如本文所述的聚乙二醇(PEG)通过还原胺化直接共价结合到毒素肽类似物自身氨基酸残基的至少一个溶剂暴露的游离胺部分。在本发明方法的一些实施方案中，毒素肽类似物在毒素肽类似物上的一个或多个伯胺或仲胺处偶联到PEG，或在毒素肽类似物上的单个伯胺位点处偶联到两个PEG基团(例如此情况可在还原胺化反应涉及存在过量的PEG-醛化合物时发生)。我们已观察到，当在肽上的伯胺处通过还原胺化进行聚乙二醇化时，常见的是获得一定量(1至100％范围)的每分子具有两个或更多个PEG的反应产物，并且如果所需的聚乙二醇化产物是每分子仅具有一个PEG的产物，则此“过度聚乙二醇化”可能不合需要。当需要每个聚乙二醇化产物分子具有单个PEG的聚乙二醇化产物时，可采用涉及使用药理学活性肽的仲胺进行聚乙二醇化的本发明方法的实施方案，因为每个分子中仅一个PEG基团将在还原胺化反应中转移。
可提供伯胺部分的氨基酸残基包括赖氨酸、高赖氨酸、鸟氨酸、α，β-二氨基丙酸(Dap)、α，β-二氨基丙酸(Dpr)和α，γ-二氨基丁酸(Dab)、氨基丁酸(Abu)和α-氨基-异丁酸(Aib)。多肽N端也提供可用于聚乙二醇化的α-氨基。可提供二级胺部分的氨基酸残基包括ε-N-烷基赖氨酸、α-N-烷基赖氨酸、δ-N-烷基鸟氨酸、α-N-烷基鸟氨酸或N-端脯氨酸，其中烷基为C1至C6。
另一可用于产生本发明的聚乙二醇化毒素肽类似物的活化PEG为PEG-马来酰亚胺化合物，诸如但不限于甲氧基PEG-马来酰亚胺，诸如马来酰亚胺基单甲氧基PEG，尤其可用于产生本发明的PEG偶联肽。(例如Shen，N-maleimidyl polymer derivatives，美国专利号6,602,498；C.Delgado等人，The uses and properties of PEG-linked proteins.，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems，9：249-304(1992)；S.Zalipsky等人，Use offunctionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides，in：Poly(ethylene glycol)chemistry：Biotechnical and biomedical applications(J.M.Harris，Editor，Plenum Press：New York，347-370(1992)；S.Herman等人，Poly(ethylene glycol)with reactive endgroups：I.Modification ofproteins，J.Bioactive Compatible Polymers，10：145-187(1995)；P.J.Shadle等人，Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1，美国专利号4,847,325；G.Shaw等人，Cysteine added variants IL-3and chemicalmodifications thereof，美国专利号5,166,322和EP0469074B1；G.Shaw等人，Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof，EP0668353A1；G.Shaw等人，Cysteine added variants G-CSF andchemical modifications thereof，EP0668354A1；N.V.Katre等人，Interleukin-2muteins and polymer conjugation thereof，美国专利号5,206,344；R.J.Goodson and N.V.Katre，Site-directed pegylation ofrecombinant interleukin-2at its glyCoSylation site，Biotechnology，8：343-346(1990))。
聚(二醇)乙烯基砜是另一可用于通过在硫醇化氨基酸残基处(例如在C残基处)偶联而产生本发明的PEG偶联毒素肽类似物的活化PEG。(例如M.Morpurgo等人，Preparation and characterization ofpoly(ethylene glycol)vinyl sulfone，Bioconj.Chem.，7：363-368(1996)；另见Harris，Functionalization of polyethylene glycol for formation of activesulfone-terminated PEG derivatives for binding to proteins and biologicallycompatible materials，美国专利号5,446,090、5,739,208、5,900,461、6,610,281和6,894,025；以及Harris，Water soluble active sulfones ofpoly(ethylene glycol)，WO95/13312A1)。可根据本发明使用的另一PEG活化形式是PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯化合物，例如甲氧基PEG-N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯。
PEG的杂双官能活化形式也可使用。(参见例如Thompson等人，PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith，美国专利号6,552,170)。
在产生物质组合物的本发明方法的另外其他实施方案中，毒素肽类似物通过已知的化学技术与活化的PEG化合物诸如但不限于硫醇活化的PEG化合物、二醇活化的PEG化合物、PEG-酰肼化合物、PEG-羟基胺化合物或PEG-溴乙酰基化合物反应。(参见例如S.Herman，Poly(ethylene glycol)with Reactive Endgroups：I.Modification of Proteins，J.Bioactive and Compatible Polymers，10：145-187(1995)；S.Zalipsky，Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically ActiveMolecules，Advanced Drug Delivery Reviews，16：157-182(1995)；R.Greenwald等人，Poly(ethylene glycol)conjugated drugs and prodrugs：acomprehensive review，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，17：101-161(2000))。
用于产生本发明的PEG偶联毒素肽类似物的甚至更优选的活化PEG是具有不止一个活化残基的多价PEG。优选的多价PEG部分包括但不限于以下所示的那些：
在制备物质组合物的另外其他实施方案中，本发明的毒素肽类似物通过已知的化学技术与活化的多分支PEG化合物(包含多条臂以获得二价、三价、四价、八价构建体的PEG衍物，诸如但不限于季戊四醇四聚乙二醇醚)反应。官能化和活化衍生物诸如但不限于N-琥珀酰亚胺基氧基羰基)丙基、对硝基苯基氧基羰基、(-CO2-p-C6H4NO2)、3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基、2-巯乙基和3-氨基丙基。使用4臂PEG衍生物时，将四个毒素肽类似物连接到各PEG分子。例如，根据本发明，毒素肽类似物可在以下位点偶联到聚乙二醇(PEG)：
(a)PEG的1、2、3或4个氨基官能化位点；
(b)PEG的1、2、3或4个硫醇官能化位点；
(c)PEG的1、2、3或4个马来酰亚胺基官能化位点；
(d)PEG的1、2、3或4个N-琥珀酰亚胺基官能化位点；
(e)PEG的1、2、3或4个羧基官能化位点；
(f)PEG的1、2、3或4个对硝基苯基氧基羰基官能化位点。
PEG的最小适用大小为约500道尔顿(Da)，低于该值PEG将变得具有毒性。高于约500Da时，可根据实际需要使用任何PEG分子质量，例如约1,000道尔顿(Da)至100,000Da(n为20至2300)。PEG单体数目(n)是根据平均分子质量针对各单体使用MW＝44Da获得的近似值。优选的是，活化接头上的PEG的组合分子质量适合药学用途。因此，PEG分子的组合分子质量不应超过约100,000Da。在一些实施方案中，用于本发明的PEG-偶联毒素肽类似物的PEG的组合或总平均分子质量为约3,000Da至60,000Da(总n为70至1,400)，更优选地为约10,000Da至40,000Da(总n为约230至约910)。PEG的最优选组合质量为约20,000Da至30,000Da(总n为约450至约680)。
应当理解，可制备物质组合物的“多聚体”，因为用于偶联到毒素肽类似物(具有或不具有居间接头部分)的半衰期延长部分可关于可偶联半衰期延长部分的氨基酸残基数为多价的(例如二价、三价、四价或更高价)。在一些实施方案中，本发明的物质组合物的肽部分可以为多价的(例如二价、三价、四价或更高价)，并因此本发明物质组合物的一些“多聚体”可具有不止一个半衰期延长部分。因此，可通过产生物质组合物的本发明方法来产生多种偶联的半衰期延长部分肽结构。例如，单价半衰期延长部分和单价肽将产生1：1偶联物；二价肽和单价半衰期延长部分可形成其中肽偶联物具有两个半衰期延长部分的偶联物，而二价半衰期延长部分和单价肽可产生其中两个肽实体连接到单个半衰期延长部分的物质；使用更高价态的半衰期延长部分可导致形成结合到单个半衰期延长部分的肽实体簇，而更高价态的肽可通过多个半衰期延长部分包裹。又如，若个多价半衰期延长部分与毒素肽类似物的偶联位点为半胱氨酸或其他氨基硫醇，则可采用D′Amico等人公开的方法(D’Amico等人，Method of conjugating aminothiolcontaining molecules to vehicles，作为US2006/0199812而公开，该申请以引用方式整体并入本文)。
肽部分可具有不止一个将与活化的半衰期延长部分反应的反应性基团，并且必须始终考虑形成复杂结构的可能性；当需要形成简单结构诸如半衰期延长部分和肽的1：1加合物或需要使用二价半衰期延长部分形成肽：半衰期延长部分：肽加合物时，将会有益的是：使用预定比率的活化半衰期延长部分与肽物质、其预定的浓度以及在预定条件下(诸如持续时间、温度、pH等)进行反应以便形成一定比例的所述产物然后将所述产物与其他反应产物分离。反应条件、试剂比例和浓度可通过在普通技术人能力范围内的相对简单的试错实验并视需要进行适当的放大而获得。类似地，通过本领域技术人员熟知的常规技术实现产物的纯化和分离。
另外，融合到或偶联到本发明毒素肽类似物的半衰期延长部分的生理上可接受的盐也涵盖在本发明的物质组合物的范围内。
上述半衰期延长部分和本文所述的其他半衰期延长部分可单独地或组合地使用，并且如本领域进一步描述，例如在Sullivan等人，ToxinPeptide Therapeutic Agents，US2007/0071764和Sullivan等人，ToxinPeptide Therapeutic Agents，PCT/US2007/022831(作为WO2008/088422公开)中，两者均以引用方式整体并入本文。本发明涵盖任何单一种类的药学上可接受的半衰期延长部分(诸如但不限于本文所述的那些)与毒素肽类似物结合使用，或使用两种或更多种类似或不同的半衰期延长部分的组合。
接头。如本文所使用的“接头部分”是指共价结合到本发明组合物中所含的毒素肽类似物或其他多肽链(例如免疫球蛋白HC或LC或免疫球蛋白Fc结构域)的氨基酸残基的生物学上可接受的肽基或非肽基有机基团，该接头部分将毒素肽类似物或其他多肽链共价接合或偶联到组合物中的另一肽或多肽链，或半衰期延长部分。在组合物的一些实施方案中，如本文所述的半衰期延长部分偶联(即直接共价结合)到毒素肽类似物自身的氨基酸残基，或任选地结合到肽基或非肽基接头部分(包括但不限于芳族或芳基接头)，该接头部分共价结合到毒素肽类似物的氨基酸残基。任选地存在任何接头部分。当存在时，其化学结构并不重要，因为其主要充当定位、接合、连接或优化本发明组合物分子的一个官能部分相对于一个或多个其他官能部分的呈现或位置的间隔物。存在接头部分可用于优化本发明组合物的一些实施方案的药理学活性。接头优选地由通过肽键连接在一起的氨基酸构成。接头部分在存在时可独立地与本发明组合物中可存在的任何一个或多个其他接头相同或不同。如上所述，接头部分在存在时(无论是在毒素肽类似物的一级氨基酸序列内还是作为将半衰期延长部分连接到毒素肽类似物的接头)本质上可以为“肽基”(即，由通过肽键连接在一起的氨基酸组成)并在长度方面优选地由1至约40个氨基酸残基构成，更优选地由1至约20个氨基酸残基构成，并且最优选地由1至约10个氨基酸残基构成。优选但不必须地，接头中的氨基酸残基来自20种规范氨基酸，更优选地来自半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和/或丝氨酸。甚至更优选地，肽基接头主要由无空间位阻的氨基酸构成，诸如通过肽键连接的甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。也可取的是若存在肽基接头，则选择避免在体内循环中发生快速蛋白水解转换的肽基接头。这些氨基酸的其中一些可经糖基化，如本领域的技术人员充分了解。例如，构成唾液酸化位点的可用接头序列为X1X2NX4XsG(SEQ ID NO：479)，其中X1、X2、X4和X5各自独立地为任何氨基酸残基。
在其他实施方案中，肽基接头部分的1至40个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。优选地，接头主要由无空间位阻的氨基酸(诸如甘氨酸和丙氨酸)构成。因此，优选的接头包括聚甘氨酸、聚丝氨酸和聚丙氨酸，或任何这些聚氨基酸的组合。一些示例性肽基接头为poly(Gly)1-8，尤其是(Gly)3、(Gly)4(SEQ IDNO：480)、(Gly)5(SEQ ID NO：481)和(Gly)7(SEQ ID NO：482)，以及GlySer和poly(Gly)4Ser，诸如“L15”(GGGGSGGGGSGGGGS；SEQ IDNO：483)、poly(Gly-Ala)2-4和poly(Ala)1-8。肽基接头的其他具体实例包括(Gly)5Lys(SEQ ID NO：484)和(Gly)5LysArg(SEQ ID NO：485)。可用的肽基接头的其他实例为：
(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO：486)；
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO：487)；
(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO：488)；和
GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO：489).
为了阐述以上命名法，例如(Gly)3Lys(Gly)4意指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：490)。Gly和Ala的其他组合也可使用。
其他优选的接头是在本文中鉴定为“L5”(GGGGS；或“G4S”；SEQID NO：491)、“L10”(GGGGSGGGGS；SEQ ID NO：492)、“L20”(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO：477)、“L25”(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；SEQ ID NO：493)的那些接头以及用于下文工作实施例中的任何接头。
在包含肽接头部分的本发明组合物的一些实施方案中，将酸性残基(例如谷氨酸或天冬氨酸残基)置于接头部分的氨基酸序列中。实例包括以下肽接头序列：
GGEGGG(SEQ ID NO：494)；
GGEEEGGG(SEQ ID NO：495)；
GEEEG(SEQ ID NO：496)；
GEEE(SEQ ID NO：497)；
GGDGGG(SEQ ID NO：498)；
GGDDDGG(SEQ ID NO：499)；
GDDDG(SEQ ID NO：500)；
GDDD（SEQ ID NO：501)；
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(SEQ ID NO：502)；
WEWEW(SEQ ID NO：503)；
FEFEF(SEQ ID NO：504)；
EEEWWW(SEQ ID NO：505)；
EEEFFF(SEQ ID NO：506)；
WWEEEWW(SEQ ID NO：507)；或
FFEEEFF(SEQ ID NO：508).
在其他实施方案中，接头构成磷酸化位点，例如X1X2YX4X5G(SEQID NO：509)，其中X1、X2、X4和X5各自独立地为任何氨基酸残基；X1X2SX4X5G(SEQ ID NO：510)，其中X1、X2、X4和X5各自独立地为任何氨基酸残基；或X1X2TX4X5G(SEQ ID NO：511)，其中X1、X2、X4和X5各自独立地为任何氨基酸残基。
此处所示的接头为示例性的；本发明范围内的肽基接头可长得多并且可包含其他残基。肽基接头可包含例如半胱氨酸、另一硫醇或亲核物质以供与半衰期延长部分偶联。在另一实施方案中，接头包含半胱氨酸或高半胱氨酸残基或者其他2-氨基-乙硫醇或3-氨基-丙硫醇部分以供与马来酰亚胺、碘乙酰胺或硫酯官能化半衰期延长部分偶联。
另一可用的肽基接头为柔性大接头，其包含随机Gly/Ser/Thr序列，例如：GSGSATGGSGSTASSGSGSATH(SEQ ID NO：512)或HGSGSATGGSGSTASSGSGSAT(SEQ ID NO：513)，据估计大约具有1kDa PEG分子的大小。可选地，可用的肽基接头可由本领域已知的氨基酸序列构成以形成刚性螺旋结构(例如刚性接头：-AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-//SEQ ID NO：514)。另外，肽基接头也可包含非肽基片段，诸如式-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-的6碳脂族分子。肽基接头可发生改变以形成如本文所述的衍生物。
任选地，非肽基接头部分也可用于将半衰期延长部分偶联到半衰期延长部分偶联的毒素肽类似物的肽部分。例如，可以使用烷基接头，诸如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可进一步被任何无空间位阻的基团诸如低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等取代。示例性非肽基接头为PEG接头(例如，如下所示)：
其中n使得接头具有约100至约5000道尔顿(Da)，优选地约100至约500Da的分子量。
在一个实施方案中，非肽基接头为芳基。接头可发生改变以按如本文所述的相同方式形成衍生物。此外，PEG部分可通过使用PEG醛的还原性烷基化或使用羟基琥珀酰亚胺基或PEG碳酸酯的酰化或通过硫醇偶联而连接到N端胺或所选的侧链胺。
“芳基”为苯基或与饱和、部分饱和或不饱和的3、4或5元碳桥邻位稠合的苯基，该苯基或桥被0、1、2或3个选自C1-8烷基、C1-4卤代烷基或卤素的取代基取代。“杂芳基”是不饱和的5、6或7元单环或部分饱和或不饱和的6、7、8、9、10或11元双环，其中至少一个环为不饱和的，单环和双环含有1、2、3或4个选自N、O和S的原子，其中环被0、1、2或3个选自C1-8烷基、C1-4卤代烷基和卤素的取代基取代。
本发明的物质组合物的非肽部分诸如非肽基接头或非肽半衰期延长部分可通过常规的有机化学反应来合成。
上文仅为说明性的，而非对可根据本发明任选地采用的接头种类的详尽探讨。
结合了电压门控钠通道Nav1.3和/或Nav1.7的经分离的多肽拮抗剂的本发明组合物，尤其是本发明的GpTx-1和GpTx-1毒素肽类似物(无论是否偶联到半衰期延长部分)，均可用作例如人类中的疼痛治疗的治疗剂。临床遗传学信息(由若干小组独立地重复得到)清楚地表明Nav1.7(SCN9A)基因的产物是感知疼痛的关键控制点。在人类中，基因的功能丧失性截短突变导致对所测量的所有疼痛形式完全不敏感，而人类慢性疼痛综合征原发性红斑性肢痛和阵发性剧痛症由Nav1.7中的功能获得性突变引起，这些突变使Nav1.7通道更容易或更长时间开放。值得注意的是，在Nav1.7中携带截短突变或功能获得性突变的患者中不存在其他主要的神经学异常(Goldberg等人，Clin Genet71：311-319(2007)；Cox等人，Nature444：894-898(2006)；Ahmad等人，Hum Mol Genet16：2114-2121(2007)；Fertleman等人，Neurology69：586-595(2007))。因此，可预期阻断Nav1.7的治疗剂在人类疼痛治疗方面具有较大的实用性。
具体的临床慢性疼痛综合征包括但不限于与以下有关或由以下所致的疼痛：癌症、化疗、骨关节炎、纤维肌痛、原发性红斑性肢痛、疱疹后神经痛、疼痛性糖尿病神经病变、特发性疼痛性神经病变、神经瘤、阵发性剧痛症、偏头痛、三叉神经痛、颌面痛、丛集性头痛或其他头痛、复杂性局部疼痛综合征(CRPS)、腰椎手术失败综合征、坐骨神经痛(包括下背痛)、间质性膀胱炎和骨盆痛、炎症引起的疼痛(包括蜂窝组织炎)以及风湿性疼痛或关节疼痛。Nav1.7抑制剂也可在治疗急性或持续性疼痛(包括但不限于创伤、烧伤或手术后的疼痛)方面具有较大的实用性。要注意的是，预期抑制Nav1.7不会对认知和胃肠系统产生限制使用阿片类药物的不良作用。另外，不同于阿片类，Nav1.7抑制剂不应产生呼吸抑制、患者耐受性或成瘾性。此外，人类和非人灵长类动物中的Nav1.7表达绝大部分处于外周神经系统中，而脑或脊髓中几乎不存在信使或蛋白(Ahmad等人，Hum Mol Genet16：2114-2121，2007)。与这些研究一致，我们的数据显示在用原位杂交检查的死后人类CNS区域中，仅在下丘脑核中以及脊髓和脊髓室管膜的腹侧运动区中发现了少量Nav1.7的信使RNA，已知这些区域不牵涉疼痛反应。相比之下，在大脑皮层、小脑、肾上腺髓质、垂体或腰脊髓背侧区域或较深区域中未发现Nav1.7。在包括背根神经节、三叉神经节以及胃肠的肠肌丛的外周神经中发现了强Nav1.7表达。(参见图13A-E)。此结果表明，Nav1.7抑制剂将经由外周神经系统发挥镇痛功效而无需渗透CNS。由于肽一般不跨过血脑屏障，因此肽抑制剂与具有一定CNS渗透性的小分子相比优势在于肽不会产生由脑介导的常见脱靶副作用，诸如头晕、混乱或镇静。
Nav1.7的临床遗传学数据未阐明Nav1.7是否在神经系统损伤并随后重塑的患者中维持其在疼痛感知方面的关键作用。这种重塑可能是许多慢性疼痛综合征的特征(Woolf and Ma，Neuron55：353-364(2007))。对于此类情况，可证明Nav1.3钠通道的拮抗作用具有较大的治疗有益效果。已公开的结果显示，在进行脊神经结扎手术的大鼠的感觉神经元(人类神经性疼痛的标准模型)中，编码Nav1.3的mRNA上调(Hains等人，J Neurosci24：4832-4839，2004)。此结果暗示，对于一些慢性疼痛综合征，尤其是神经性疼痛，除了Nav1.7外还抑制Nav1.3可产生最佳的镇痛功效。大鼠感觉神经元细胞体的电生理学研究显示，脊神经结扎引起钠通道表达急剧偏向最可能由SCN9A(Nav1.7)和SCN3A(Nav1.3)编码的快速、河豚毒素敏感性亚型(参见图14A-E)。另外，此结果暗示，对于一些疼痛综合征，Nav1.7和Nav1.3的同时双重抑制可产生最有效的疼痛抑制。
因此，本发明还涉及本发明物质组合物中的一种或多种在制造用于治疗或预防疾病、障碍或本文所述的其他医疗病症(例如但不限于慢性疼痛、急性疼痛或持续性疼痛，或本文所述的疼痛综合征的任一者)的药物中的用途。
此类药物组合物可被构造成通过多种递送途径施用给患者，例如血管内递送途径，诸如通过注射或输注；皮下(“s.c.”)、静脉内(“i.v.”)、肌内、腹膜内(“i.p.”)、硬膜外或鞘内递送途径；或经口、经肠、经肺(例如吸入剂)、鼻内、经粘膜(例如舌下施用)、经皮或本领域已知的其他递送途径和/或施用形式。递送含有GpTx-1或本发明的其他物质组合物的药物或药物组合物可经由标准可注射状态进行，无论是自行施用还是在医院环境中施用；或者也可经由可植入的递送泵来实现最精确的给药和最稳定的血浆暴露水平。本发明的药物组合物可制备成液体形式，或可呈干燥粉末形式(诸如冻干形式)或结晶形式。对于经口或经肠使用而言，这些药物组合物可被构造成例如片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、分散性粉末或颗粒、乳液、硬胶囊或软胶囊、糖浆、酏剂或经肠调配物。
药物组合物
概要。本发明还提供包含本发明的物质组合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。此类药物组合物可被构造成通过多种递送途径施用给患者，例如血管内递送途径，诸如通过注射或输注；皮下、肌内、腹膜内、硬膜外或鞘内递送途径；或经口、经肠、经肺(例如吸入剂)、鼻内、经粘膜(例如舌下施用)、经皮或本领域已知的其他递送途径和/或施用形式。本发明的药物组合物可制备成液体形式，或可呈干燥粉末形式，诸如冻干形式。对于经口或经肠使用而言，这些药物组合物可被构造成例如片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、分散性粉末或颗粒、乳液、硬胶囊或软胶囊、糖浆、酏剂或经肠调配物。
在本发明的实践中，“药学上可接受的载体”是本领域普通技术人员已知的可用于配制药物组合物的任何生理上耐受的物质，包括单一的或组合的任何药学上可接受的稀释剂、赋形剂、分散剂、粘合剂、填充剂、助流剂、抗摩擦剂、压缩助剂、片剂崩解剂(崩解剂)、助悬剂、润滑剂、矫味剂、除臭剂、甜味剂、穿透或渗透增强剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、乳化剂、增稠剂、佐剂、染料、包衣料、包封材料和/或其他添加剂。此类药物组合物可包含多种缓冲液内含物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH值和离子强度的稀释剂；诸如洗涤剂和增溶剂的添加剂(例如80，聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如苯甲醇)和増量物质(例如乳糖、甘露糖醇)；将材料掺入聚合化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的颗粒制剂中或掺入脂质体中。也可使用透明质酸，并且此酸可具有促进循环的持续时间延长的作用。此类组合物可影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如以引用方式整体并入本文的Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)第1435-1712页。此类组合物可制备成液体形式，或者可以为干燥粉末，诸如冻干形式。可植入持续释放制剂也可使用，如经皮或经粘膜制剂。除此之外(或可选地)，本发明提供用于技术人员已知的各种缓慢释放或持续释放制剂或微粒制剂任一者中的组合物，例如持续释放微粒制剂，其可经由肺、鼻内或皮下递送途径施用。(参见例如Murthy等人，Injectable compositions for the controlled delivery of pharmacologicallyactive compound，美国专利号6,887,487；Manning等人，Solubilizationof pharmaceutical substances in an organic solvent and preparation ofpharmaceutical powders using the same，美国专利号5,770,559和5,981,474；Lieberman等人，Lipophilic complexes of pharmacologicallyactive inorganic mineral acid esters of organic compounds，美国专利号5,002,936；Gen，Formative agent of protein complex，US2002/0119946A1；Goldenberg等人，Sustained release formulations，WO2005/105057A1)。
可用惰性材料稀释本发明的组合物或增加本发明药物组合物的体积。此类稀释剂可包括碳水化合物，尤其是甘露糖醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂为Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。
多种常规的增稠剂可用于药物组合物的乳膏、软膏、栓剂和凝胶剂型，诸如但不限于海藻酸盐、黄原胶或凡士林，也可用于本发明的药物组合物的此类剂型。也可采用穿透或渗透增强剂，诸如聚乙二醇单月桂酸酯、二甲基亚砜、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-(2-羟乙基)-吡咯烷酮或3-羟基-N-甲基-2-吡咯烷酮。可用于产生水凝胶基质的技术是已知的。(例如Feijen，Biodegradable hydrogel matrices for the controlledrelease of pharmacologically active agents，美国专利号4,925,677；Shah等人，Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery ofbiologically active agents，WO00/38651A1)。可例如通过使蛋白组分与多糖或粘多糖组分交联，接着加载待递送的本发明的物质组合物来形成此类可生物降解的凝胶基质。
作为无菌溶液或悬浮液的本发明的液体药物组合物可通过例如肌内、鞘内、硬膜外、血管内(例如静脉内或动脉内)、腹膜内或皮下注射而施用给患者。(参见例如Goldenberg等人，Suspensions for thesustained release of proteins，美国专利号6,245,740和WO00/38652A1)。无菌溶液也可通过静脉内输注而施用。本发明的组合物可包含在无菌固体药物组合物中，诸如冻干粉，其可在施用给患者之前在方便时使用无菌水、盐水、缓冲盐水或其他合适的无菌注射用介质溶解或悬浮。
可植入持续释放制剂也是本发明药物组合物的可用实施方案。例如，作为可生物降解的基质植入人类或非人类脊椎动物体内或皮肤下的药学上可接受的载体可以是与如上所述的那些相似的水凝胶。可选地，其可以由聚-α-氨基酸组分形成。(Sidman，Biodegradable，implantabledrug delivery device，and process for preparing and using same，美国专利号4,351,337)。用于制备供药物递送的植入物的其他技术是已知的并可根据本发明使用。
在粉末形式中，药学上可接受的载体为细分的固体，其与包括本发明组合物在内的细分活性成分配混。例如，在一些实施方案中，当将药物组合物构造成吸入剂时，可以使用粉末形式。(参见例如Zeng等人，Method of preparing dry powder inhalation compositions，WO2004/017918；Trunk等人，Salts of the CGRP antagonist BIBN4096andinhalable powdered medicaments containing them，美国专利号6,900,317)。
可用惰性材料稀释或增加本发明化合物的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，尤其是甘露糖醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂为Fast-FloTM、EmdexTM、STA-RxTM1500、EmcompressTM和AvicellTM。
崩解剂可以药物组合物制剂形式包含在固体剂型中。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的市售崩解剂ExplotabTM。羧甲淀粉钠、AmberliteTM、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、海藻酸钠、明胶、橘皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土均可使用。不溶性阳离子交换树脂是崩解剂的另一种形式。粉状胶可用作崩解剂并可用作粘合剂并且这些物质可包括诸如琼脂、Karaya或黄蓍胶的粉状胶。海藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
粘合剂可用于将治疗剂保持在一起以形成硬片剂并且包括来自天然产物的材料，诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他物质包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)均可用于醇性溶液中以使治疗剂粒化。抗摩擦剂可包含在治疗剂制剂中以防止在配方过程中发生粘附。润滑剂可用作治疗剂与模具壁之间的层，并且这些润滑剂可包括但不限于硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。也可使用可溶性润滑剂，诸如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、Carbowax4000和6000。
可添加可在配方期间改善药物流动性并在压缩期间有助于重排的助流剂。助流剂可包括淀粉、滑石、火成二氧化硅和水合硅铝酸盐。
为了有助于将本发明的化合物溶于水性环境中，可添加表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可包括阴离子洗涤剂，诸如月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。可使用阳离子洗涤剂并且其可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可包含在制剂中作为表面活性剂的潜在非离子型洗涤剂的列表为聚桂醇400、聚烃氧40硬脂酸酯、聚氧乙稀氢化蓖麻油10、50及60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、60、65及80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独地或以不同比率的混合物形式存在于蛋白或衍生物的制剂中。
经口剂型。本发明组合物的经口剂型也是可用的。需要时，可对组合物进行化学修饰以使得经口递送是有效的。一般来讲，设想的化学修饰是将至少一个部分连接到分子本身，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解；以及(b)从胃或肠吸收到血流中。还希望增加化合物的整体稳定性并延长体内循环时间。可在本发明中用作共价连接的半衰期延长部分的部分也可用于此目的。此类部分的实例包括：PEG、乙二醇与丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮以及聚脯氨酸。参见例如Abuchowski和Davis(1981)，Soluble Polymer-Enzyme Adducts，Enzymes as Drugs(Hocenberg and Roberts编辑)，Wiley-Interscience，New York，NY，pp367-83；Newmark，等人(1982)，J. Appl.Biochem.4：185-9。其他可以使用的聚合物为聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧八环(poly-1，3，6-tioxocane)。如上所指出，对于药学用途，PEG部分是优选的。
对于经口递送剂型，也可使用经改性的脂族氨基酸的盐(诸如N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸钠(SNAC))作为增强本发明治疗性化合物的吸收的载体。已在由Emisphere Technologies开展的II期试验中证实了使用SNAC的肝素制剂的临床功效。参见美国专利号5,792,451，“Oral drug delivery composition and methods”。
在一个实施方案中，药学上可接受的载体可为液体并且药学组合物以溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂或加压组合物的形式制备。一种或多种活性成分(例如本发明的物质组合物)可溶解、稀释或悬浮在药学上可接受的液体载体诸如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可含有其他合适的药学添加剂，诸如洗涤剂和/或增溶剂(例如Tween80、聚山梨醇酯80)、乳化剂、适当pH值的缓冲剂(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、佐剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如Thimersol、苯甲醇)、甜味剂、矫味剂、助悬剂、增稠剂、增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)、着色剂、粘度调节剂、稳定剂、电解质、渗透溶质或渗透调节剂。增强本发明组合物吸收的添加剂也可包含在制剂中。可能具有此性质的添加剂例如为脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。
经口固体剂型是可用的，其通常描述于同上的Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)第89章中，该文献据此以引用方式整体并入。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、糖锭剂或锭剂、扁囊剂或颗粒剂。此外，脂质体或类蛋白包封也可用于配制本发明的组合物(例如美国专利号4,925,673中报道的类蛋白微球)。可使用脂质体包封并且可将脂质体用多种聚合物衍生化(例如美国专利号5,013,556)。对用于治疗剂的可能固体剂型的描述在Marshall，K.，Modern Pharmaceutics(1979)，G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑，第10章中有所提供，该文献据此以引用方式整体并入。一般而言，制剂将包含本发明的化合物以及保护免受胃环境及肠内生物活性物质释放影响的惰性成分。
本发明的组合物可以粒度为约1mm的颗粒或球粒的形式作为细小多粒子包含在制剂中。用于经胶囊施用的材料的制剂也可以作为粉末、略微压缩的栓或甚至作为片剂。治疗剂可通过压缩而制备。
着色剂和调味剂均可包含在内。例如，可配制蛋白(或衍生物)(诸如通过脂质体或微球包封)，接着进一步使其包含在可食用产品内，诸如含有着色剂和调味剂的冷藏饮料。
在片剂形式中，以合适的比例将活性成分与具有必要压缩性质的药学上可接受的载体混合并压制成所需的形状和尺寸。
粉末和片剂优选地包含高达99％的活性成分。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。
可能需要控释制剂。可将本发明的组合物掺入允许通过扩散或浸出机理释放的惰性基质(例如树胶)中。也可将缓慢变性基质掺入制剂中，例如海藻酸盐、多糖。本发明组合物的另一控释形式是利用基于OrosTM治疗系统(Alza Corp.)的方法，即将药物封闭在半透膜中，该半透膜因渗透效应允许水进入而通过单一小孔将药物推出。一些肠溶衣也具有延迟释放的作用。
其他包衣料也可用于制剂。这些包衣料包括可施加到包衣锅中的多种糖。治疗剂也可以薄膜衣片的形式提供并且将此情况中的所用材料分成2组。第一组为非肠溶性材料并包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟基-乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮以及聚乙二醇。第二组由通常为邻苯二甲酸酯的肠溶性材料组成。
材料混合物可用于提供最佳的薄膜衣。包薄膜衣可在包衣锅中或流化床中或通过压制包衣而进行。
经肺递送形式。经肺递送本发明的组合物也是可用的。蛋白(或衍生物)在吸入时被递送到哺乳动物肺中，并横向穿过肺上皮衬里进入血流。此形式的其他报道包括Adjei等人，Pharma.Res.(1990)7：565-9；Adjei等人(1990)，Internatl.J.Pharmaceutics63：135-44(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人(1989)，J.Cardiovasc.Pharmacol.13(supp1.5)：s.143-146(内皮素-1)；Hubbard等人(1989)，Annals Int.Med.3：206-12(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等人(1989)，J.Clin.Invest.84：1145-6(α1-蛋白酶)；Oswein等人(March1990)，″Aerosolization of Proteins，″Proc. Symp.Resp.Drug Delivery II，Keystone，Colorado(重组人生长激素)；Debs等人(1988)，J.Immunol.140：3482-8(干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)以及Platz等人，美国专利号5,284,656(粒细胞集落刺激因子)。
可用于实践本发明的是多种设计用于经肺递送治疗产品的机械装置，包括但不限于喷雾器、定剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些装置都是本领域技术人员熟悉的。适用于实践本发明的市售装置的一些具体实例是由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri制造的Ultravent喷雾器；由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado制造的AcornII喷雾器；由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，North Carolina制造的定剂量吸入器；以及由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造的Spinhaler粉末吸入器。(参见例如Helgesson等人，Inhalation device，美国专利号6,892,728；McDerment等人，Dry powder inhaler，WO02/11801A1；Ohki等人，Inhalant medicator，美国专利号6,273,086)。所有此类装置均需要使用适合分配本发明化合物的制剂。通常，各制剂特定针对于所用装置的类型并且可涉及除了可用于治疗的稀释剂、佐剂和/或载体外还使用合适的推进剂材料。
本发明的化合物最有利地应当以平均粒径小于10μm(或微米)，最优选地0.5至5μm的颗粒形式制备，以便最有效地递送到远侧肺。
药学上可接受的赋形剂包括碳水化合物，诸如海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨糖醇。用于制剂的其他成分可包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可使用天然的或合成的表面活性剂。可使用PEG(甚至与其在蛋白或类似物衍生化方面的用途无关)。可使用葡聚糖，诸如环糊精。可使用胆汁盐和其他相关的增强剂。可使用纤维素和纤维素衍生物。可使用氨基酸，诸如用于缓冲制剂。
此外，设想了使用脂质体、微囊或微球、包合复合物或其他类型的载体。
适于与喷雾器(喷射或超声)一起使用的制剂通常将包含以每毫升溶液约0.1至25mg生物活性蛋白的浓度溶于水中的本发明化合物。制剂也可包含缓冲剂和简单糖(例如，用于蛋白稳定化以及调节渗透压)。喷雾器制剂也可含有表面活性剂以降低或防止在形成气溶胶时因溶液雾化所致的表面诱发的蛋白聚集。
与定剂量吸入器装置一起使用的制剂一般将包含细分的粉末，其含有借助表面活性剂而悬浮在推进剂中的本发明化合物。推进剂可以为用于此目的的任何常规材料，诸如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇以及1，1，1，2-四氟乙烷或它们的组合。合适的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可适用作表面活性剂。(参见例如等人，Aerosol drug formulations containing hydrofluoroalkanes and alkylsaccharides，美国专利号6,932,962)。
由粉末吸入器装置分配的制剂将包含含有本发明化合物的细分干粉，并且还可以包含有助于从该装置分散粉末的量(例如制剂的50重量％至90重量％)的增量剂，诸如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或木糖醇。
经鼻递送形式。根据本发明，本发明物质组合物和/或药物组合物的鼻内递送也是可用的，由此使其在鼻内施用后直接通向血流，而不必在肺中沉积药品。适于鼻内施用的制剂包括具有葡聚糖或环糊精的那些制剂，并且鼻内递送装置是已知的。(参见例如Freezer，Inhaler，美国专利号4,083,368)。
经皮及经粘膜(例如经颊)递送形式。在一些实施方案中，将本发明的组合物构造成药学上可接受的经皮或经粘膜贴片或糖锭的一部分。经皮贴片药物递送系统(例如基质型经皮贴片)是已知的并可用于实践本发明药物组合物的一些实施方案。(例如，Chien等人，Transdermal estrogen/progestin dosage unit，system and process，美国专利号4,906,169和5,023,084；Cleary等人，Diffusion matrix for transdermaldrug administration and transdermal drug delivery devices including same，美国专利号4,911,916；Teillaud等人，EVA-based transdermal matrixsystem for the administration of an estrogen and/or a progestogen，美国专利号5.605,702；Venkateshwaran等人，Transdermal drug delivery matrixfor coadministering estradiol and another steroid，美国专利号5,783,208；Ebert等人，Methods for providing testosterone and optionally estrogenreplacement therapy to women，美国专利号5,460,820)。用于经粘膜递送治疗剂的多种药学上可接受的系统在本领域中也是已知的并且可与本发明的实践相容。(例如Heiber等人，Transmucosal delivery ofmacromolecular drugs，美国专利号5,346,701和5,516,523；Longenecker等人，Transmembrane formulations for drug administration，美国专利号4,994,439)。
经颊递送本发明的组合物也是可用的。与肽一起使用的经颊递送制剂是本领域已知的。例如，被构造成用于通过口腔粘膜(例如舌下粘膜)进行药物递送的已知片剂或贴片系统包括一些包含内层的实施方案，该内层含有药物、渗透增强剂(诸如胆汁盐或夫西地酸盐)和亲水性聚合物(诸如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、葡聚糖、果胶、聚乙烯吡咯啶酮、淀粉、明胶)或已知可用于此目的的许多其他聚合物。此内层可具有一个适于接触并粘附到口腔湿润粘膜组织的表面并且可具有粘附到上覆非粘性惰性层的相对表面。任选地，这样的经粘膜递送系统可以为双层片剂的形式，其中内层还含有另外的粘合剂、调味剂或填充剂。一些可用的系统采用与渗透增强剂一起的非离子型洗涤剂。经粘膜递送装置可呈自由形式，诸如乳膏、凝胶或软膏，或可包含诸如片剂、贴片或糖锭的确定形式。例如，可经由经粘膜递送系统递送本发明的组合物，该递送系统包含例如粘合层、背衬层、界定容纳本发明组合物的贮存器的渗透膜、膜下面的剥离密封圆片、一或多个热密封以及可移除的防粘衬里的层压复合物。(例如，Ebert等人，Transdermal delivery system with adhesive overlay andpeel seal disc，美国专利号5,662,925；Chang等人，Device foradministering an active agent to the skin or mucosa，美国专利号4,849,224和4,983,395)。这些实例仅为可用的经粘膜递送技术的示例性实例，不是对本发明的限制。
剂量。在治疗上述病症的方法中所涉及的给药方案将由主治医师考虑到改变药物作用的多种因素来决定，这些因素例如为患者年龄、病症、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度，施用时间以及其他临床因素。一般而言，每日方案应在每公斤体重0.1至1000微克本发明化合物的范围内，优选地每公斤0.1至150微克。
作为进一步说明，本发明涵盖以下带编号的实施方案：
1.一种物质组合物，该物质组合物包含具有下式的氨基酸序列的分离多肽：
Xaa 1Xaa 2Xaa 3Xaa 4Xaa 5Xaa 6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Xaa 10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15Xaa 16Xaa 17Xaa 18Xaa 19Xaa 20Xaa 21Xaa 22Xaa 23Xaa 24Xaa 25Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30Xaa 31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35Xaa 36Xaa 37Xaa 38//SEQ ID NO：475
或其药学上可接受的盐，
其中：
Xaa 1Xaa 2不存在；或者Xaa 1为任何氨基酸残基并且Xaa 2为任何氨基酸残基；或者Xaa 1不存在并且Xaa 2为任何氨基酸残基；
Xaa 3在Xaa 18为Cys时为Cys；或者Xaa 3在Xaa 18为SeCys时为SeCys；或者Xaa 3在Xaa 18为烷基氨基酸残基时为烷基氨基酸残基；
Xaa 4为酸性、疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 5为Gly、Ala、疏水性或碱性氨基酸残基；
Xaa 6为Gly、Ala、2-Abu、Nle、Nva或疏水性氨基酸残基；
Xaa 7为Gly、Ala、芳族或疏水性氨基酸残基；
Xaa 8为碱性、酸性或中性亲水性氨基酸残基，或Ala残基；
Xaa 9为碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 10在Xaa 24为Cys时为Cys；或者Xaa 10在Xaa 24为SeCys时为SeCys；
Xaa 11为任何氨基酸残基；
Xaa 12为Pro、酸性、中性或疏水性氨基酸残基；
Xaa 13为任何氨基酸残基；
Xaa 14为任何氨基酸残基；
Xaa 16为碱性、中性亲水性或酸性氨基酸残基，或Ala残基；
Xaa 17在Xaa 31为Cys时为Cys；或者Xaa 17在Xaa 31为SeCys时为SeCys；
Xaa 18为Cys、SeCys或烷基氨基酸残基；
Xaa 19为任何氨基酸残基；
Xaa 20为Pro、Gly、碱性或中性亲水性残基；
Xaa 21为碱性、疏水性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 22为疏水性或碱性氨基酸残基；
Xaa 23为疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 24为Cys或SeCys残基；
Xaa 25为Ser、Ala或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 26为Ala、酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 27为酸性、碱性、中性亲水性或疏水性残基；
Xaa 28为芳族或碱性氨基酸残基；
Xaa 29为酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 30为Trp、5-溴代Trp、6-溴代Trp、5-氯代Trp、6-氯代Trp、1-Nal、2-Nal或硫代Trp残基；
Xaa 31为Cys或SeCys；
Xaa 33为疏水性或芳族氨基酸残基；
Xaa 34为任何氨基酸残基；
Xaa 35为疏水性氨基酸残基；
Xaa 36、Xaa 37和Xaa 38的每一者独立地不存在或独立地为中性、碱性或疏水性氨基酸残基；
并且其中：
如果Xaa 3和Xaa 18均为Cys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硫键；或者如果Xaa 3和Xaa 18均为SeCys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硒键；
如果Xaa 10和Xaa 24均为Cys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硫键；或者如果Xaa 10和Xaa 24均为SeCys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硒键；
如果Xaa 17和Xaa 31均为Cys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硫键；或者如果Xaa 17和Xaa 31均为SeCys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硒键；
氨基末端残基任选地被乙酰化、生物素酰化或4-戊炔酰化或聚乙二醇化；并且
羧基末端残基任选地被酰胺化。
2.实施方案1的物质组合物，其中Xaa 4选自Ala、Glu、Asp、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Cit残基。
3.实施方案1-2的物质组合物，其中Xaa 5选自Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
4.实施方案1-3的物质组合物，其中Xaa 6选自Ala、Gly、2-Abu、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、脯氨酸、硫杂脯氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环戊基甘氨酸(Cpg)、苯基甘氨酸、N-甲基亮氨酸、N-甲基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
5.实施方案1-4的物质组合物，其中Xaa 7选自Gly、Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、Pro、2-吡啶基丙氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
6.实施方案1-5的物质组合物，其中Xaa 8选自Ala、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Ser、Thr、Asn、Gln、Cit、Asp、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Glu残基。
7.实施方案1-6的物质组合物，其中Xaa 9选自Al、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
8.实施方案1-7的物质组合物，其中Xaa 11选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
9.实施方案1-8的物质组合物，其中Xaa 12选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、Cha和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、羟基脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
10.实施方案1-9的物质组合物，其中Xaa 13选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
11.实施方案1-10的物质组合物，其中Xaa 14选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
12.实施方案1-11的物质组合物，其中Xaa 16选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr、Cit、Asp、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Glu残基。
13.实施方案1-12的物质组合物，其中Xaa 19选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
14.实施方案1-13的物质组合物，其中Xaa 20选自Ala、Gly、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
15.实施方案1-14的物质组合物，其中Xaa 21选自Ala、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
16.实施方案1-15的物质组合物，其中Xaa 22选自Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
17.实施方案1-16的物质组合物，其中Xaa 23选自Ala、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
18.实施方案1-17的物质组合物，其中Xaa 25选自Ala、Gly Pro、Met、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
19.实施方案1-18的物质组合物，其中Xaa 26选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、Glu、Asp、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
20.实施方案1-19的物质组合物，其中Xaa 27选自Thr、Leu、Ile、Val、Ser、Met、Gln、Asn、Phe、Tyr、Trp、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Asp、Glu、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Gly残基。
21.实施方案1-20的物质组合物，其中Xaa 28选自Phe、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、1-Nal、2-Nal、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-吡啶基-丙氨酸、4-哌啶基-丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
22.实施方案1-21的物质组合物，其中Xaa 29选自Ala、Asp、Glu、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Phe、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸和Dab残基。
23.实施方案1-22的物质组合物，其中Xaa 33选自Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-吡啶基-丙氨酸、4-哌啶基-丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
24.实施方案1-23的物质组合物，其中Xaa 34选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-羧基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
25.实施方案1-24的物质组合物，其中Xaa 35选自Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
26.实施方案1-25的物质组合物，其中Xaa 36、Xaa 37和Xaa 38的每一者独立地不存在或独立地选自Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
27.实施方案1-26的物质组合物，其中Xaa 3和Xaa 18为烷基残基。
28.实施方案27的物质组合物，其中Xaa 3和Xaa 18独立地为Ala或2-Abu残基。
29.实施方案1-28的物质组合物，其中羧基末端残基被酰胺化。
30.实施方案1-29的物质组合物，其中分离的多肽包含下式的氨基酸序列：
Xaa 1Xaa 2Cys3Xaa 4Xaa 5Ala6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Cys10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15Xaa 16Cys17Cys18Xaa 19Xaa 20Xaa 21Xaa 22Xaa 23Cys24Xaa 25Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30Cys31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35Xaa 36Xaa 37Xaa 38//SEQ ID NO：476。
31.实施方案1-29的物质组合物，其中Xaa 6为Ala。
32.实施方案31的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
33.实施方案31-32的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
34.实施方案31的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：22、252-263、419-439、518-521、524、525、562-580、602、691、692、696-703、715、721-735、737-749、756、757、761、762、764-771、787-796、798、800、802、803、809-812、1028、1030-1040、1043-1047、1062-1065和1068-1070。
35.实施方案31的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：1082、1096、1110、1124、1135、1146、1157、1165、1173、1181、1192、1203、1214、1222、1230、1238、1249、1260、1271、1279、1287、1295、1306、1317、1328、1336、1344、1352、1360、1368、1376、1384、1392、1400、1408、1416、1424、1432、1440、1448、1456、1464、1472、1480、1488、1496、1504、1512、1520、1528、1536、1544、1552、1560、1568、1576、1584、1592、1600、1608、1616、1624、1632、1640、1658、1672、1686、1700、1711、1722、1733、1741、1749、1757、1768、1779、1790、1798、1806、1814、1825、1836、1847、1855、1863、1871、1882、1893、1904、1912、1920、1928、1936、1944、1952、1960、1968、1976、1984、1992、2000、2008、2016、2024、2032、2040、2048、2056、2064、2072、2080、2088、2096、2104、2112、2120、2128、2136、2144、2152、2160、2168、2176、2184、2192、2200、2208、2216、2234、2248、2262、2276、2287、2298、2309、2317、2325、2333、2344、2355、2366、2374、2382、2390、2401、2412、2423、2431、2439、2447、2458、2469、2480、2488、2496、2504、2512、2520、2528、2536、2544、2552、2560、2568、2576、2584、2592、2600、2608、2616、2624、2632、2640、2648、2656、2664、2672、2680、2688、2696、2704、2712、2720、2728、2736、2744、2752、2760、2768、2776、2784、2792、2808、2822、2833、2844、2855、2863、2871、2879、2890、2901、2912、2920、2928、2936、2944、2952、2960、2968、2976、2984、2992、3000、3008、3016、3024、3032、3040、3048、3056、3064、3072和3080。
36.实施方案31的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：597-601和813-1027。
37.实施方案1-29的物质组合物，其中Xaa 6为Gly。
38.实施方案37的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
39.实施方37-38的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
40.实施方案37的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：265、751、752、754、755、1081、1095、1109、1123、1134、1145、1156、1164、1172、1180、1191、1202、1213、1221、1229、1237、1248、1259、1270、1278、1286、1294、1305、1316、1327、1335、1343、1351、1359、1367、1375、1383、1391、1399、1407、1415、1423、1431、1439、1447、1455、1463、1471、1479、1487、1495、1503、1511、1519、1527、1535、1543、1551、1559、1567、1575、1583、1591、1599、1607、1615、1623、1631、1639、1657、1671、1685、1699、1710、1721、1732、1740、1748、1756、1767、1778、1789、1797、1805、1813、1824、1835、1846、1854、1862、1870、1881、1892、1903、1911、1919、1927、1935、1943、1951、1959、1967、1975、1983、1991、1999、2007、2015、2023、2031、2039、2047、2055、2063、2071、2079、2087、2095、2103、2111、2119、2127、2135、2143、2151、2159、2167、2175、2183、2191、2199、2207、2215、2233、2247、2261、2275、2286、2297、2308、2316、2324、2332、2343、2354、2365、2373、2381、2389、2400、2411、2422、2430、2438、2446、2457、2468、2479、2487、2495、2503、2511、2519、2527、2535、2543、2551、2559、2567、2575、2583、2591、2599、2607、2615、2623、2631、2639、2647、2655、2663、2671、2679、2687、2695、2703、2711、2719、2727、2735、2743、2751、2759、2767、2775、2783、2791、2807、2821、2832、2843、2854、2862、2870、2878、2889、2900、2911、2919、2927、2935、2943、2951、2959、2967、2975、2983、2991、2999、3007、3015、3023、3031、3039、3047、3055、3063、3071和3079。
41.实施方案1-29的物质组合物，其中Xaa 6为2-Abu。
42.实施方案41的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
43.实施方案41-42的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
44.实施方案41的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：605、636、649、706、707、718、753、758、797、799、801、804、807、808、1029、1041、1042、1048、1066、1067、1083、1097、1111、1125、1136、1147、1158、1166、1174、1182、1193、1204、1215、1223、1231、1239、1250、1261、1272、1280、1288、1296、1307、1318、1329、1337、1345、1353、1361、1369、1377、1385、1393、1401、1409、1417、1425、1433、1441、1449、1457、1465、1473、1481、1489、1497、1505、1513、1521、1529、1537、1545、1553、1561、1569、1577、1585、1593、1601、1609、1617、1625、1633、1641、1659、1673、1687、1701、1712、1723、1734、1742、1750、1758、1769、1780、1791、1799、1807、1815、1826、1837、1848、1856、1864、1872、1883、1894、1905、1913、1921、1929、1937、1945、1953、1961、1969、1977、1985、1993、2001、2009、2017、2025、2033、2041、2049、2057、2065、2073、2081、2089、2097、2105、2113、2121、2129、2137、2145、2153、2161、2169、2177、2185、2193、2201、2209、2217、2235、2249、2263、2277、2288、2299、2310、2318、2326、2334、2345、2356、2367、2375、2383、2391、2402、2413、2424、2432、2440、2448、2459、2470、2481、2489、2497、2505、2513、2521、2529、2537、2545、2553、2561、2569、2577、2585、2593、2601、2609、2617、2625、2633、2641、2649、2657、2665、2673、2681、2689、2697、2705、2713、2721、2729、2737、2745、2753、2761、2769、2777、2785、2793、2809、2823、2834、2845、2856、2864、2872、2880、2891、2902、2913、2921、2929、2937、2945、2953、2961、2969、2977、2985、2993、3001、3009、3017、3025、3033、3041、3049、3057、3065、3073和3081。
45.实施方案1-29的物质组合物，其中Xaa 6为Nle。
46.实施方案45的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
47.实施方案45-46的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
48.实施方案45的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：607、638、651、1085、1099、1113、1127、1138、1149、1160、1168、1176、1184、1195、1206、1217、1225、1233、1241、1252、1263、1274、1282、1290、1298、1309、1320、1331、1339、1347、1355、1363、1371、1379、1387、1395、1403、1411、1419、1427、1435、1443、1451、1459、1467、1475、1483、1491、1499、1507、1515、1523、1531、1539、1547、1555、1563、1571、1579、1587、1595、1603、1611、1619、1627、1635、1643、1661、1675、1689、1703、1714、1725、1736、1744、1752、1760、1771、1782、1793、1801、1809、1817、1828、1839、1850、1858、1866、1874、1885、1896、1907、1915、1923、1931、1939、1947、1955、1963、1971、1979、1987、1995、2003、2011、2019、2027、2035、2043、2051、2059、2067、2075、2083、2091、2099、2107、2115、2123、2131、2139、2147、2155、2163、2171、2179、2187、2195、2203、2211、2219、2237、2251、2265、2279、2290、2301、2312、2320、2328、2336、2347、2358、2369、2377、2385、2393、2404、2415、2426、2434、2442、2450、2461、2472、2483、2491、2499、2507、2515、2523、2531、2539、2547、2555、2563、2571、2579、2587、2595、2603、2611、2619、2627、2635、2643、2651、2659、2667、2675、2683、2691、2699、2707、2715、2723、2731、2739、2747、2755、2763、2771、2779、2787、2795、2811、2825、2836、2847、2858、2866、2874、2882、2893、2904、2915、2923、2931、2939、2947、2955、2963、2971、2979、2987、2995、3003、3011、3019、3027、3035、3043、3051、3059、3067、3075和3083。
49.实施方案1-29的物质组合物，其中Xaa 6为Nva。
50.实施方案49的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
51.实施方案49-50的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
52.实施方案49的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO：606、637、650、705、708、717、759、760、805、806、1084、1098、1112、1126、1137、1148、1159、1167、1175、1183、1194、1205、1216、1224、1232、1240、1251、1262、1273、1281、1289、1297、1308、1319、1330、1338、1346、1354、1362、1370、1378、1386、1394、1402、1410、1418、1426、1434、1442、1450、1458、1466、1474、1482、1490、1498、1506、1514、1522、1530、1538、1546、1554、1562、1570、1578、1586、1594、1602、1610、1618、1626、1634、1642、1660、1674、1688、1702、1713、1724、1735、1743、1751、1759、1770、1781、1792、1800、1808、1816、1827、1838、1849、1857、1865、1873、1884、1895、1906、1914、1922、1930、1938、1946、1954、1962、1970、1978、1986、1994、2002、2010、2018、2026、2034、2042、2050、2058、2066、2074、2082、2090、2098、2106、2114、2122、2130、2138、2146、2154、2162、2170、2178、2186、2194、2202、2210、2218、2236、2250、2264、2278、2289、2300、2311、2319、2327、2335、2346、2357、2368、2376、2384、2392、2403、2414、2425、2433、2441、2449、2460、2471、2482、2490、2498、2506、2514、2522、2530、2538、2546、2554、2562、2570、2578、2586、2594、2602、2610、2618、2626、2634、2642、2650、2658、2666、2674、2682、2690、2698、2706、2714、2722、2730、2739、2746、2754、2762、2770、2778、2786、2794、2810、2824、2835、2846、2857、2865、2873、2881、2892、2903、2914、2922、2930、2938、2946、2954、2962、2970、2978、2986、2994、3002、3010、3018、3026、3034、3042、3050、3058、3066、3074和3082。
53.实施方案1的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：3-30、32-72、74-134、136-178、180-211、218-239、241-305、307-363、366-386、388-432、434-474、515-527、532-588、590、591、593-775、777、778、780-788、790-1049和1062-3086。
54.一种物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：3-134、136-305、307-386、388-474、515-527、532-588、590、591、593-1049和1062-3086。
55.一种分离的核酸，编码不含非规范氨基酸的SEQ ID NO：3-134、136-305、307-386、388-474、515-527、532-588、590、591、593-1049或1062-3086的任一者。
56.一种表达载体，包含实施方案55的核酸。
57.一种重组宿主细胞，包含实施方案56的表达载体。
58.实施方案1-54任一项的物质组合物，还包含任选的接头部分和药学上可接受的、共价连接的半衰期延长部分。
59.实施方案58的物质组合物，其中半衰期延长部分为分子量为约1000Da至约100000Da的聚乙二醇、IgG Fc结构域、转甲状腺素蛋白或人血清白蛋白。
60.实施方案58的物质组合物，其中半衰期延长部分包含人免疫球蛋白或人免疫球蛋白Fc结构域或两者。
61.实施方案60的物质组合物，具有如图12A-N或图88-91任一者中所示的构型。
62.实施方案60的物质组合物，其中组合物包含单价免疫球蛋白-肽或Fc-肽偶联物。
63.实施方案60的物质组合物，其中组合物包含二价免疫球蛋白-肽或Fc-肽偶联物。
64.一种药物组合物，包含实施方案1-54或58-63任一项的物质组合物和药学上可接受的载体。
65.一种预防疼痛的方法，包括施用预防有效量的实施方案1-54或58-63任一项的物质组合物。
66.一种治疗疼痛的方法，包括施用治疗有效量的实施方案1-54或58-63任一项的物质组合物。
67.实施方案66的方法，其中疼痛为慢性疼痛、急性疼痛或持续性疼痛。
68.实施方案67的方法，其中慢性疼痛与癌症、化疗、骨关节炎、纤维肌痛、原发性红斑性肢痛、疱疹后神经痛、疼痛性糖尿病神经病变、特发性疼痛性神经病变、神经瘤、阵发性剧痛症、偏头痛、三叉神经痛、颌面痛、丛集性头痛、复杂性局部疼痛综合征(CRPS)、腰椎手术失败综合征、坐骨神经痛、间质性膀胱炎、骨盆痛、下背痛、炎症引起的疼痛或关节痛相关。
69.实施方案67的方法，其中急性或持续性疼痛与创伤、烧伤或手术相关。
70.实施方案1-30的物质组合物，其中Xaa 29为酸性或中性亲水性残基。
71.实施方案70的物质组合物，其中Xaa 29选自Ala、Asp、Glu、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸和γ-羧基谷氨酸残基。
72.实施方案70的物质组合物，包含选自SEQ ID NO：1071-2798的氨基酸序列.
以下工作实施例为示例性的，不应以任何方式视为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：从毒液中分离和纯化GpTx-1
毒液样品制备.通过对麻醉的蜘蛛进行电刺激提取了狼蛛智利红玫瑰的毒液。收集毒液样品、冻干、溶于0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液，达到约1mg毒液/mL。将粗制毒液溶液通过固相萃取(SPE)脱盐，其中使用在0.1％TFA中平衡的Sep-Pak C18柱(Waters，Milford，MA，USA)，用60％乙腈水溶液洗脱，然后蒸发。将干燥的材料溶于0.1％TFA中达到1mg毒液/mL的浓度，通过10kDa分子量截留Ultrafree-CL(Millipore)移除高分子组分。然后将＜10kDa的毒液提取物真空干燥，并保存在-80℃下。
分级分离。将粗毒液通过反相(RP)HPLC分级分离，收集了时间片中的84个样品。将低于10kDa的毒液提取物溶于0.1％TFA中达到约1mg毒液/mL，然后通过C18RP HPLC色谱分离并收集到大约1分钟宽的级分中。HPLC方法：1mL/min的缓冲液A(0.1％的TFA水溶液)和缓冲液B(90％乙腈/10％含0.1％TFA的水)，以1％/min的梯度从0到100％缓冲液B。接着将级分转移到板上，真空干燥，然后保存在-80℃下。
在Nav1.7和Nav1.3Quatrro(IWQ)测定法中筛选毒液级分的活性。(参见实施例3和图1)。鉴定了多种具有明显(＞对照的80％)Nav1.7抑制活性的级分，其中第一种为级分31。对级分31的第二等分试样在Nav1.7、Nav1.3和Nav1.5IWQ测定法中进行了测试，以确认“命中”活性并评估选择性。然后将样品通过高分辨率电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)分析，其表明级分为至少四种不同的肽物质的混合物。(参见图2和图3)。然后将级分31通过RP-HPLC分离，在Nav1.7和Nav1.5测定法中筛选相应子级分的活性。子级分11为RP-HPLC色谱图中的主峰，并显示出＞90％的Nav1.7活性抑制。(参见图4)。子级分11的解卷积揭露出GpTx-1的一级肽序列。与所有蛋白一样，预计GpTx-1基本上不会进入中枢神经系统。
使用表达的序列标签方法，通过智利红玫瑰毒腺的转录组分析，鉴定了GpTx-2至GpTx-7(SEQ ID NO：467-474；参见表5A)。(参见Siang AS，Doley R，Vonk FJ，Kini RM.，“Transcriptomic analysis of thevenom gland of the red-headed krait(Bungarus flaviceps)using expressedsequence tags”，BMC Molecular Biology2010，11：24；Jiang Y，Li Y，Lee W，Xu X，Zhang Y，Zhao R，Zhang Y，Wang W.，“Venom gland transcriptomesof two elapid snakes(Bungarus multicinctus and Naja atra)and evolution oftoxin genes”，BMC Genomics2011，12：1；Wagstaff SC，Sanz L，Juárez P，Harrison RA，Calvete JJ.，“Combined snake venomics and venom glandtranscriptomic analysis of the ocellated carpet viper，Echis ocellatus.”，JProteomics.200971(6)：609-23；GS，Junqueira-de-Azevedo IL，Lopes-Ferreira M，Lorenzini DM，Ho PL，Moura-da-Silva AM.“Transcriptome analysis of expressed sequence tags from the venom glandsof the fish Thalassophryne nattereri”，Biochimie200688(6)：693-9；WagstaffSC，Harrison RA.，“Venom gland EST analysis of the saw-scaled viper，Echis ocellatus，reveals novel alpha9betal integrin-binding motifs in venommetalloproteinases and a new group of putative toxins，renin-like asparticproteases.”Gene2006377：21-32)。
肽测序：埃德曼降解和从头MS/MS.通过埃德曼降解对肽进行了N端测序(参考文献：(1)Edman，P.(1950)，″Method for determination ofthe amino acid sequence in peptides″，Acta Chem.Scand.4：283-293；(2)Niall，H.D.(1973).″Automated Edman degradation：the protein sequenator″.Meth.Enzymol.27：942-1010)。通过Applied Biosystems自动化473A测序仪分析了苯基硫代乙内酰脲(PTH)-氨基酸衍生物。
肽从头测序通过串联质谱完成(参考文献：VladoTheresa A.Addona，Karl R.Clauser，James E.Vath，Pavel A.Pevzner.，J.Comp.Biol.，Volume6，3/4，(1999)；(2)Favreau，P.，Menin，L.，Michalet，S.，Perret，F.，Cheneval，M.，Bulet，A.和R.，Toxicon，47(6)，676-687，(2006)；(3)Favreau，P.，Cheneval，O.，Menin，L.，Michalet，S.，Gaertner，H.，Principaud，F.，Thai，R.，Ménez，A.，Bulet，P.和R.(2007)，Thevenom of the snake genus Atheris contains a new class of peptides withclusters of histidine and glycine residues.Rapid Communications in MassSpectrometry，21：406-412)。
实施例2：GpTx-1肽类似物的合成
小规模肽合成。使用Nα-Fmoc固相合成肽方法通过合适的正交保护和树脂接头策略组装了肽。使用Rink Amide MBHA树脂(100-200目，1％DVB，RFR-1063-PI，0.52meq/g初始上样量，408291，PeptidesInternational，Louisville，KY)以0.012mmol的规模合成了肽。使用树脂装载器(Radley)将干树脂(17mg/孔)加到Phenomenex深孔蛋白沉淀板(CEO-7565，38710-1)中。在自动肽合成仪(Intavis Multipep)上使用标准固相方法将氨基酸逐步添加到正在生长的肽链上。将氨基酸(5摩尔当量，120μL，0.5M的DMF溶液)通过(1-氰基-2-乙氧基-2-氧乙烯基氨基氧基)二甲氨基-吗啉代-碳鎓六氟磷酸盐(5摩尔当量，170μL，0.35M的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA；7.5摩尔当量，70μL，1.25M的二氯甲烷(DCM)溶液)预活化(1min)。将预活化的氨基酸转移的合适的孔中。将树脂孵育30分钟，沥干，重复以上循环。在第2次氨基酸孵育后，将板沥干，用DMF洗涤8次(每列的8个孔3mL)。然后通过在500μL20％哌啶的DMF溶液中连续孵育2次将Fmoc基团移除。第1次孵育为5分钟，沥干树脂，第2次孵育持续20分钟。将树脂沥干，用DMF洗涤10次(每列的8个孔3mL)。移除最终的Fmoc保护基团后，将树脂用DCM洗涤5次(每列的8个孔3mL)，然后让其风干。
裂解。向滤板的底部装上排放孔密封垫(Arctic White，AWSM-1003DP)。使用多道移液器向每个孔中的树脂加入三异丙基硅烷(100μL)、DODT(100μL)和水(100μL)。使用Dispensette Organic分配器向每个孔中的树脂加入TFA(1mL)。向树脂中加入三角形微型搅拌棒，将混合物搅拌3小时。移除密封垫，将裂解溶液洗脱到固底96孔深孔板中。将每个孔中的树脂用另外1mL TFA洗涤。使用旋转蒸发(Genevac)对溶液进行浓缩。使用Dispensette Organic分配器向连接有底部密封垫的新96孔滤板中的每个孔加入1mL冷乙醚。使用具有宽孔吸头的多道移液器向乙醚中加入浓缩的肽溶液。将溶液用移液器搅拌以确保完全混合和沉淀。滤出白色固体，用第二个1mL冷乙醚洗涤，过滤，真空干燥。
折叠。向每个孔中的粗肽通过多道移液器加入0.9mL50：50水/乙腈以及加入微型搅拌棒。将混合物搅拌1h。将溶液过滤到固底96孔深孔板中。向每个孔中的粗肽通过多道移液器加入另外0.9mL50：50水/乙腈。将溶液过滤到相同的固底96孔深孔板中。在4L瓶中制备了4.0L折叠缓冲液(3.3L水，300mL乙腈，2.0g氧化的谷胱甘肽，1.0g还原的谷胱甘肽，400mL1M Tris-HCl pH7.5)。使用Dispensette分配器向96根50mL离心管中加入40mL肽折叠缓冲液。使用Tecan自动液体处理器向折叠缓冲液中加入1.8mL溶解的肽。折叠溶液的pH经测量为约7.7。将折叠反应物静置过夜。向每根管中加入1mL冰醋酸。通过多道移液器向96孔滤板中加入作为浆液的SP Sepharose HighPerformance(1mL/孔)。使用Tecan自动液体处理器，将凝胶用折叠缓冲液(3×0.9mL)调节，用折叠的肽溶液(50×0.9mL，pH＝4.0，在Tecan自动液体处理器上)上样，洗涤(4×0.9mL，20mM NaOAc，pH＝4.0)，然后在真空歧管上用2×1mL(1M NaCl，20mM NaOAc，pH＝4.0)人工洗脱到固底96孔深孔板中。
肽与PEG的偶联。将一些GpTx-1肽类似物偶联到叠氮基-NPEG10(例如参见下文的表30、表31和表32)。向1mL溶于IEX洗脱缓冲液中的折叠肽按顺序加入：32-叠氮基-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧杂三十二烷-1-胺(70μL，50mM水溶液)、三(2-苯基-1-(1H-1，2，3-三唑-4-基)乙基)胺(TBTA；88μL，10mM的DMSO溶液)、L-抗坏血酸钠盐(438μL，75mM水溶液)和无水硫酸铜(ii)粉末(188μL，35mM水溶液)。反应混合物在添加TBTA后变得略微浑浊。过夜孵育后，将板在1600rpm下离心1h以沉降任何沉淀。将上清液通过多道移液器转移到96孔滤板中，然后过滤到固底96孔板中。
分子的纯化和表征。将折叠的(偶联的)肽(2mL)通过质量触发式半制备型HPLC(Agilent/LEAP′Ariel′，Jupiter5u C18300A，100×10mm5μm)在8mL/min下以15-35％B的梯度经45min纯化，其中5min冲洗和5min平衡。将收集的级分合并，在Tecan上重新装到小瓶中。进行了最终QC(Phenomenex Jupiter20×2mm，5μm柱，以0.750mL/min的流速通过10至60％的梯度经10min洗脱，在220nm处监测吸光度)和CLND定量。筛选了具有＞95％的纯度和正确的(m/z)比的肽。(有关合成的GpTx-1的LC-MS表征，参见图5和6)。
大规模肽合成。称取Rink Amide Chem Matrix树脂(0.2mmol，0.45mmol/g的上样量，0.444g，Matrix Innovation)加到CS BIO反应容器中。将反应容器连接到CS BIO336X自动肽合成仪的通道，将树脂用2×DMF洗涤，然后让其在DMF中溶胀15min。将Fmoc-氨基酸(1.0mmol，Midwest Biotech或Novabiochem)溶于2.5mL0.4M6-氯-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBt，Matrix Innovation)的DMF溶液中。向溶液中加入1.0mL1.0M1，3-二异丙基碳二亚胺(DIC，Sigma-Aldrich)的DMF溶液。将溶液通过氮气鼓泡搅拌15min以实现预活化，然后加入树脂中。将混合物振摇2h。将树脂过滤，用3×DMF、2×DCM和3×DMF洗涤。通过用20％的哌啶的DMF溶液(5mL，2×15min，Fluka)处理而移除Fmoc。将树脂过滤，用3×DMF洗涤。通过重复上述Fmoc-氨基酸偶合和Fmoc移除步骤将所有残基单个偶合。
裂解和线性肽纯化。在最终从N端残基移除Fmoc后，将树脂结合的线性肽(0.2mmol规模)转移到25mL固相萃取(SPE)滤管，用3×DMF和3×DCM洗涤，再进行真空干燥。向树脂中加入三异丙基硅烷(1.0mL)、3，6-二氧杂-1，8-辛烷-二硫醇(DODT，1.0mL)、水(1.0mL)、三氟乙酸(TFA，15mL)和搅拌棒，然后将混合物搅拌3h。将混合物过滤到50mL离心管中。将树脂用TFA(约5mL)洗涤，将合并的滤液通过在Genevac HT-12(30℃的腔室温度，压力斜坡经40min从500至50mbar，最终压力为8mbar持续2h)中旋转蒸发而浓缩。向残余物(约5mL)中加入40mL冷乙醚。白色沉淀形成。将固体在醚中搅拌。将混合物离心(4min，4,400rpm)，滗析醚。向管中加入另外40mL冷醚，对沉淀进行搅拌。将混合物离心，滗析醚。将固体在真空下干燥过夜。将粗的线性肽通过制备型LC-MS纯化。将过滤后的样品(500mg溶于10mL DMSO)进样到制备型HPLC柱(Jupiter10u C18300A，250×50mm10μm)。将肽通过10-40％B的梯度经60min在50mL/min下洗脱，然后为10min冲洗和10min平衡。将级分通过LC-MS分析，合并，冻干得到纯的线性肽前体。
折叠。在2L FEP瓶中通过水(944mL)、乙腈(55.5mL)、Tris-HCl pH7.5(111mL)、氧化的(-)-谷胱甘肽(680mg，1.110mmol)和还原的1-谷胱甘肽(340mg，1.110mmol)配制了折叠缓冲液。向纯的线性肽(111mg，0.028mmol)中加入2.5mL乙腈和2.5mL水。将混合物涡旋，以完全溶解肽。将肽溶液加到折叠缓冲液(0.1mg/mL肽浓度、1mM氧化的谷胱甘肽、1mM还原的谷胱甘肽、10％v/v乙腈、0.1M Tris pH7.5)中。pH值经测得为7.7。将折叠混合物在室温下以80rpm搅拌过夜。取出小等分试样，将样品通过LC-MS分析以确保折叠完成。将溶液通过添加4mL AcOH和4mL TFA(pH＝2.5)而猝灭。将水溶液过滤(0.45uM纤维素膜)。
纯化。使用Agilen制备型上样泵以30mL/min将过滤后的溶液(1110mL，111mg肽)上样到制备型HPLC柱(Phenomenex Synergi4uMAX-RP80A AXIA，250×30mm)。将柱子用10％B以30mL/min冲洗10min，将AcOH/TFA洗脱。将柱子连接到制备型HPLC：Agilent/LEAP制备型LC-MS，将肽通过10-40％B的梯度经60min洗脱，然后是10min冲洗和10min平衡。将级分通过LC-MS分析，合并，冻干得到纯的折叠肽。
肽体内研究的反离子交换。将4mL装有VariPure IPE(Varian，PL-HCO3MP-树脂，聚合物负载碳酸氢盐，1.8mmol/g，100A，150-300μm)的SPE管用2mL MeOH然后用2mL水预调节，在重力下沥干。将2.0mL≤5.0mM的纯化折叠肽水溶液施加到树脂床上。将装置用4×2.0mL水洗涤，以洗脱出所有肽。向洗脱液中加入50μL乙酸。将溶液通过旋转蒸发(Genevac)浓缩得到纯化折叠肽的乙酸盐。通过以下方式现配了100mM的三氟乙醇(TFE)的氧化氘(D2O)储备液：称取50mg TFE加到5mL容量瓶中，然后将D2O加入达到5mL的最终体积。然后通过稀释配制了5mM的TFE的D2O溶液，以用于溶解所有样品进行19F-NMR。将溶液用于溶解肽达到1mM的浓度，使用氟长延迟(d1＝5s)方法将样品通过19F-NMR进行分析。将TFE积分(-76.75ppm的三重峰)归一化到5，记录TFA的积分(-75.6的单重峰)。切割NMR管，通过旋转蒸发(Genevac)回收样品。
实施例3：电生理
表达Nay通道的细胞系。将组成型表达(h)电压门控钠(Nav)通道的稳定细胞系(HEK293-hNav1.2、CHO-hNav1.3、HEK293-hNav1.4、HEK293-hNav1.5和HEK293-hNav1.7)或在诱导型启动子下表达hNav1.8的CHO细胞用于实验。
Quatro细胞群膜片钳电生理。将贴壁细胞使用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理10分钟而从组织培养瓶分离，然后重悬在由140mM NaCl、5.0mM KCl、10mM HEPES、2mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM葡萄糖组成的外部溶液(pH7.4)中。内部溶液由70mM KCl、70mM KF、10HEPES、5mM EDTA组成(pH7.3)。在室温(约22℃)下使用穿孔膜片钳配置将细胞电压钳制到-110mV，并在添加测试化合物之前以及添加测试化合物之后5分钟去极化至-10mV。化合物稀释样含有0.1％的牛血清白蛋白以将非特异性结合减至最少。测量了不同细胞在各化合物浓度下的峰值内向电流并用Excel软件计算了IC50值。所有化合物均一式两份地进行测试(n＝2)。
7000A电生理。使用1：10稀释的0.25％胰蛋白酶-EDTA处理2至3分钟从组织培养瓶中分离了贴壁细胞，接着在含有10％胎牛血清的完全培养基中孵育至少15分钟，然后重悬在由70mMNaCl、140mM D-甘露糖醇、10mM HEPES、2mM CaCl2、1mM MgCl2组成的外部溶液(用NaOH调至pH7.4)中。内部溶液由62.5mM CsCl、75mM CsF、10HEPES、5mM EGTA、2.5mM MgCl2组成(用CsOH调至pH7.25)。使用全细胞膜片钳配置在室温(约22℃)下电压钳制细胞，保持电位为-125mV，测试电位为-10mV(hNav1.2、hNav1.3、hNav1.4和hNav1.7)或-20mV(hNav1.5)。为了从部分失活的通道进行记录，将细胞转换至产生约20％通道失活的电压。添加测试化合物并在0.1Hz在合适的测试电位下监测Nav电流。所有化合物稀释样均含有0.1％的牛血清白蛋白以将非特异性结合减至最少。如果在洗出化合物后电流恢复到＞起始值的80％，则将细胞用于另外的化合物测试。通过汇集不同化合物浓度下的单点测定值并在DataXpress2.0软件中通过Hill(四参数逻辑)拟合法拟合所得的数据集而计算IC50值。
全细胞膜片钳电生理。在室温(约22℃)下使用全细胞膜片钳配置来电压钳制细胞。电极电阻在1.5与2.0MΩ之间。全细胞电容和串联电阻无补偿。将电流在50kHz下数字化，并使用pClamp10.2在10kHz下过滤(4极Bessel)。将细胞从培养皿提离，并直接置于连接到用于化合物灌流的溶液交换歧管的微电极前。为了从非失活的通道进行记录，将细胞保持在-140mV下并去极化至-10mV(对于hNav1.8为0mV)。为了从部分失活的通道进行记录，最初将细胞保持在-140mV下，然后转换至产生约20％通道失活的电压。每10秒递送10ms脉冲并在添加化合物之前和之后记录了峰值内向电流。化合物稀释样含有0.1％的牛血清白蛋白以将非特异性结合减至最少。对于hNav1.8通道记录，添加了河豚毒素(TTX，0.5μM)以抑制内源性TTX敏感性电压门控钠通道并且仅记录Nav1.8介导的TTX耐性电流。外部溶液由140mM NaCl、5.0mM KCl、2.0mM CaCl2、1.0mM MgCl2、10mM HEPES和11mM葡萄糖组成(用NaOH调至pH7.4)。内部溶液由62.5mM CsCl、75mMCsF、2.5mM MgCl2、5mM EGTA和10mM HEPES组成(用CsOH调至pH7.25)。在同一细胞上分析了递增化合物浓度，并通过Clampfit10.2软件且在Origin Pro8软件中通过Hill(四参数逻辑)拟合法拟合所得的数据集而计算了IC50值。
DRG神经元分离。用戊巴比妥钠(Nembutal，80mg/kg，腹膜内，Western Med Supply，Arcadia，CA)对成年雄性和雌性C57BL/6小鼠(Harlan Laboratories，Indianapolis，IN)实施安乐死，接着断头。从颈段、胸段及腰段取出DRG，置于不含Ca2+和Mg2+的Hanks’平衡盐溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，然后在解剖显微镜下修剪附接的纤维。将DRG在37℃下依次用不含Ca2+和Mg2+的Hanks’溶液(pH7.4)中的木瓜蛋白酶(20U/ml，Worthington Biochemical Corporation，Lakewood，NJ)和L-半胱氨酸(25μM)消化20至30分钟，然后用胶原酶2型(0.9％w/v，Worthington Biochemical Corporation)消化20至30分钟。用DMEM与补充了10％小牛血清(Invitrogen)的Ham′s F-12营养混合物(Invitrogen)的1：1混合物猝灭消化，用经火焰抛光的Pasteur吸管研磨细胞，接着铺到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)上。在存在1％NSF-1(Lonza，Basel，Switzerland)下将细胞维持在28℃、含5％CO2的潮湿培养箱中3至7天以增加河豚毒素敏感性钠通道电流的表达。
DRG神经元的人工膜片钳电生理。在室温(21℃至24℃)下，使用Axopatch200B或MultiClamp700B放大器以及具有pCLAMP软件的DIGIDATA1322A(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)以全细胞膜片钳配置电压钳制DRG神经元。由硼硅酸盐玻璃毛细管拉制的电极(World Precision Instruments，Sarasota，FL)具有1.0与3.0MΩ之间的电阻。使用＞80％的串联电阻补偿将电压误差减至最小。P/4方案用于漏减。将电流在50kHz下数字化，并在10kHz下过滤(4极Bessel)。将细胞从培养皿提离，并直接置于连接到用于化合物灌流的溶液交换歧管的微电极前。将细胞保持在-140mV或产生约20％失活的电压下，并且每10秒去极化至-10mV，维持40毫秒。在添加肽后使用河豚毒素(TTX，Sigma)阻断任何残余的TTX敏感性钠电流。电极溶液包含(以mM计)：62.5CsCl、75CsF、2.5MgCl2、5EGTA和10HEPES(用CsOH调至pH7.25)。浴溶液包含(以mM计)：70NaCl、5.0KCl、2.0CaCl2、1.0MgCl2、10HEPES和11葡萄糖、140甘露糖醇(用NaOH调至pH7.4)。通过Clampfit和Origin Pro8(OriginLab Corp，Northampton，MA)对数据进行了分析。
电生理研究的结果和构效关系。电生理研究的结果在下文的表6至表32中示出。广泛的系统类比对GpTx-1(SEQ ID NO：1)内的各个位置如何有助于其整体VGSC活性特征提供了深入的认识。关于整个分子骨架，Cys9(或SeCys9)与Cys23(或SeCys23)(C2-C5)之间以及Cys16(或SeCys16)与Cys30(或SeCys30)(C3-C6)之间的二硫键(或二硒键)对功能必不可少。然而，移除(C1-C4)二硫键的Cys2和Cys17的同时取代(如在[2-Abu2，17]GpTx-1(SEQ ID NO：125)中)保持了针对Nav1.7和Nav1.3的显著活性，以及针对Nav1.4可能改善的选择性。(参见表29)。
包含N-端、Asp1、Leu3和Gly4的GpTx-1的N端部分适于修饰而与GpTx-1相比不影响VGSC效力或选择性。(参见表7、表8、表9和表10)。通过将另外的氨基酸偶合到N端而延伸肽链耐受良好。(参见表7)。在(PX)形式的测定中，对N-端天冬氨酸残基乙酰化得到Ac-GpTx-1(SEQ ID NO：132)维持了在Nav1.7的效力，并增加了针对Nav1.3和Nav1.4的选择性。(参见表30)。可将GpTx-1的Asp1截短或用多种氨基酸取代，而不影响在Nav1.7和Nav1.3的效力或针对Nav1.4和Nav1.5的选择性。(参见表8)。GpTx-1中的Leu3和Gly4可单独地被疏水性或碱性氨基酸替代，并仍保持针对Nav1.7和Nav1.3的效力，但是这些位置不太耐受酸性残基的取代。(参见表9和表10)。然而，在PX形式的测定中，用谷氨酸取代Leu3增加了针对Nav1.4的选择性。(参见表30)。
相对于SEQ ID NO：1在第5和6位的疏水性残基(GpTx-1中的Phe5和Met6)对于Nav1.7和Nav1.3抑制性效力必不可少。(参见表11和表12)。GpTx-1(SEQ ID NO：1)中第5位氨基酸的特性也对肽在Nav1.7、Nav1.3与Nav1.4之间的选择性具有重要影响。用脂族或芳族疏水性残基取代天然苯丙氨酸维持或增加了针对Nav1.7的效力，同时增加了针对Nav1.4的选择性，并且不降低针对Nav1.5的选择性。(参见表11)。在PX形式的测定中，将丙氨酸结合到[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)中保持了针对Nav1.7的选择性，同时大大增加了针对Nav1.3和Nav1.4的选择性。除了丙氨酸之外，许多其他脂族残基也可结合到第5位以改善针对Nav1.4的选择性，包括但不限于甘氨酸、2-氨基丁酸(Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、正缬氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。(参见表30)。两个对位取代的苯丙氨酸衍生物-[pI-Phe5]GpTx-1(SEQ IDNO：247)和[Bip5]GpTx-1(SEQ ID NO：242)具有针对Nav1.3增强的效率并对Nav1.7具有选择性。(参见表30)。在第6位结合疏水性残基与其大小成比例地增加了针对所测试的所有四种Nav亚型的效力。(参见表12)。可与第5位的丙氨酸一起在第6位结合包括亮氨酸和苯丙氨酸的多种疏水性残基，以在PX形式的测定中维持良好的针对Nav1.7的效力和针对Nav1.4的选择性。(参见表30)。
虽然每个位置都具有可辨认的偏好，但是除了相对于SEQ ID NO：1的Asp14外，从Arg8至Thr26的氨基酸序列都非常耐受单独的取代。不具有在GpTx-1第14位的天冬氨酸残基而合成的肽未能以对于筛选而言足够纯的形式分离出来，从而表明这个残基可能对于肽的正确折叠至关重要。碱性或中性亲水性氨基酸可相对于SEQ ID NO：1被接受作为Arg7和Lys8的取代，以维持Nav1.7和Nav1.3抑制性效力。(参见表13)。然而，用谷氨酸取代Arg7在PX测定形式中增加了针对Nav1.4的选择性。(参见表30)。相对于SEQ ID NO：1的Ile10、Pro11、Asp12、Asn13、Lys15、Arg18和Pro19可用多种氨基酸取代，而对针对Nav1.7和Nav1.3的效力的影响甚微。(参见表14、表15、表16、表17和表18)。用替代性残基取代Pro11即[Glu11]GpTx-1(SEQ IDNO：147)和[Trp11]GpTx-1(SEQ ID NO：171)而不影响Nav1.7活性的能力值得注意，因为该残基在HWTX-IV SEQ ID NO：528)和HWTX-I(SEQID NO：529)的肽序列中是保守的。(参见表15；图15A-B)。第10或11位的酸性残基取代可改善针对Nav1.4的选择性，即[Asp10]GpTx-1(SEQ ID NO：119)、[Glu10]GpTx-1(SEQ ID NO：146)和[Glu11]GpTx-1(SEQ ID NO：147)(参见表30)。Asn13的取代改善肽类似物的Fmoc固相合成，这可能是通过在后续Fmoc移除步骤中减少天冬酰亚胺(aspartimide)的形成。第18位的取代可改善针对Nav1.4的选择性。(参见表18和表30)。相对于SEQ ID NO：1的Asn20、Leu21、Val22、Ser24、Arg25和Thr26可单独地被非酸性氨基酸取代，并保持完全的Nav1.7和Nav1.3抑制性效力。(参见表19、表20、表21和表22)。在GpTx-1(SEQ ID NO：1)的第26位的苏氨酸不同于HWTX-IV(SEQ ID NO：528)和HWTX-I(SEQ ID NO：529；参见图15A-B)中的保守赖氨酸。在该位置的取代增加针对Nav1.4的选择性，如在[Leu26]GpTx-1(SEQ IDNO：121)和[Glu26]GpTx-1(SEQ ID NO：152)中。(参见表30)。可通过插入或缺失一个氨基酸残基而延长或缩短GpTx-1(SEQ ID NO：1)中的Cys17与Cys23之间的环长度，而对肽针对所测试的VGSC的活性无实质性影响，如[Ser-Ser19]GpTx-1(SEQ ID NO：93)和[Glu18；desAsn20]GpTx-1(SEQ ID NO：134)所示。(参见表18和表29)。
GpTx-1序列的C端部分对于肽针对Nav1.7和Nav1.3的活性最为重要。取代GpTx-1(SEQ ID NO：1)中的His27而保持效力和选择性能通过芳族和碱性残基最好地实现。(参见表23)。相对于SEQ ID NO：1的残基Lys28和Val33最耐受多种不同氨基酸的取代，而不影响Nav1.7和Nav1.3抑制性效力。(参见表23和表26)。[Arg28]GpTx-1(SEQ IDNO：72)、[Glu28]GpTx-1(SEQ ID NO：153)、[Asp28]GpTx-1(SEQ IDNO：750)、[Gln28]GpTx-1(SEQ ID NO：763)和[Glu33]GpTx-1(SEQ IDNO：33)显示出针对Nav1.4增强的选择性。(参见表30)。GpTx-1(SEQ IDNO：1)第29位的色氨酸(或硫代色氨酸)似乎对于获得高水平的针对Nav1.7和Nav1.3的效力具有重要意义。(参见表24)。具有大疏水性取代的类似物[1-Nal29]GpTx-1(SEQ ID NO：79)和[2-Nal29]GpTx-1(SEQID NO：129)保持了最大的活性，但是效力仍比GpTx-1低5倍，然而它们具有针对Nav1.4增强的选择性。(参见表30)。相对于SEQ ID NO：1的Lys31显然也对GpTx-1针对Nav1.7和Nav1.3的强效抑制具有重要意义。(参见表25)。GpTx-1(SEQ ID NO：1)第32位的酪氨酸可被脂族或芳族疏水性氨基酸取代，而保持针对Nav1.7和Nav1.3的效力，但是这些取代通常增加针对Nav1.5和Nav1.4的活性，从而导致降低的选择性。(参见表25)。GpTx-1(SEQ ID NO：1)第34位的苯丙氨酸只能被其他疏水性氨基酸取代而不丧失针对Nav1.7和Nav1.3的效力，然而大的疏水性氨基酸往往会增强效力并因而降低针对Nav1.4和Nav1.5的选择性。(参见表27)。GpTx-1(SEQ ID NO：1)的C端适于通过至少一个氨基酸延伸，而保留Nav抑制性活性，但是GpTx-1的C端截短或天然C-端酰胺被游离酸取代会降低针对Nav1.7和Nav1.3的效力。(参见表28)。结合各个取代的GpTx-1(SEQ ID NO：1)的另外类似物已证实了针对Nav1.4和Nav1.5的选择性以及对Nav1.7和Nav1.3的效力的进一步改善，即[Ala5，Phe6，Leu26，Arg28]GpTx-1(SEQ ID NO：262)和[Ala5，Phe6，Glu10，2-Abu13，Leu26，Arg28]GpTx-1(SEQ ID NO：1035)。(参见表29和表30)。针对部分失活的hNav1.2通道的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)的IC50为0.265μM。
对GpTx-1(SEQ ID NO：1)和[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)针对Nav1.7、Nav1.3、Nav1.4和Nav1.5的人克隆体的作用进行了人工全细胞膜片钳电生理分析。用100nM GpTx-1进行测试显示出对Nav1.7电流的完全抑制。(参见图20)。GpTx-1的Nav1.7抑制IC50值为7.40nM。(参见图21)。记录了渐增浓度的GpTx-1添加和洗出对Nav1.7电流的作用。(参见图22)。用300nM GpTx-1进行测试显示出对Nav1.3电流的完全抑制。(参见图23)。GpTx-1的Nav1.3抑制IC50值为16.8nM。(参见图24)。记录了渐增浓度的GpTx-1添加和洗出对Nav1.3电流的作用。(参见图25)。用3.0μMGpTx-1进行测试显示出对Nav1.4电流的部分抑制。(参见图26)。GpTx-1的Nav1.4抑制IC50值对于关闭和比分失活状态而言分别为2.9μM和0.26μM。(参见图27和图28)。分别记录了对于关闭和部分失活状态而言渐增浓度的GpTx-1添加和洗出对Nav1.4电流的作用。(参见图29和图30)。GpTx-1在通道部分失活时对hNav1.4的效力更高。用3.0μM GpTx-1进行测试显示出对Nav1.5电流的弱抑制。(参见图31)。GpTx-1的Nav1.5抑制IC50值为8.9μM。(参见图32)。记录了渐增浓度的GpTx-1添加和洗出对Nav1.5电流的作用。(参见图33)。这些结果证明GpTx-1(SEQ ID NO：1)是Nav1.7和Nav1.3的强效双重肽抑制剂，具有针对Nav1.4和Nav1.5的选择性。用300nM[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)进行测试显示出对Nav1.7电流的完全抑制。(参见图34)。[A1a5]GpTx-1的Nav1.7抑制IC50值为13.2nM。(参见图35)。记录了渐增浓度的[Ala5]GpTx-1添加和洗出对Nav1.7电流的作用。(参见图36)。这些结果证明[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)也是Nav1.7的强效抑制剂。
对GpTx-1(SEQ ID NO：1)和[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)针对分离的小鼠DRG神经元的作用进行了人工膜片钳电生理分析。记录了渐增浓度的GpTx-1添加和洗出对小鼠DRG神经元中钠通道电流的作用。(参见图37)。GpTx-1的TTX敏感性钠通道电流抑制IC50值为7.1nM。(参见图38)。用200nM GpTx-1进行测试显示出对小鼠DRG神经元中TTX敏感性钠电流几乎完全的抑制。(参见图39)。记录了渐增浓度的GpTx-1添加和洗出在产生20％失活的保持电压下对小鼠DRG神经元中钠通道电流的作用。(参见图40)。GpTx-1在产生20％失活的保持电压下的TTX敏感性钠通道电流抑制IC50值为4.7nM。(参见图41)。用200nM GpTx-1进行测试在产生20％失活的保持电压下显示出对小鼠DRG神经元中TTX敏感性钠电流的完全抑制(参见图42)。记录了渐增浓度的[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)添加和洗出对小鼠DRG神经元中钠通道电流的作用。(参见图43)。[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)的TTX敏感性钠通道电流抑制的IC50值为17.0nM。(参见图44)。用300nM GpTx-1进行测试显示出对小鼠DRG神经元中TTX敏感性钠电流几乎完全的抑制。(参见图45)。
对同二聚偶联物1针对Nav1.7和Nav1.5的人克隆体的作用进行了人工全细胞膜片钳电生理分析(参见实施例5)。记录了渐增浓度的同二聚偶联物1添加和洗出对Nav1.7电流的作用。(参见图46)。同二聚偶联物1的Nav1.7抑制IC50值为1.2nM。(参见图47)。用3nM同二聚偶联物1进行测试显示出化合物在延长洗涤(10min)期间非常慢地洗出，而用300nM同二聚偶联物1进行测试显示出化合物在延长洗涤(10min)期间不洗出。(参见图48)。用300nM同二聚偶联物1进行测试产生了Nav1.7电流的完全抑制。(参见图49)。记录了渐增浓度的同二聚偶联物1添加和洗出在产生约20％失活的保持电压下对Nav1.7电流的作用。(参见图50)。同二聚偶联物1在产生约20％失活的保持电压下的Nav1.7抑制IC50值为0.66nM。(参见图51)。用3nM同二聚偶联物1进行测试在产生约20％失活的保持电压下产生了对Nav1.7电流的完全抑制。(参见图52)。记录了渐增浓度的同二聚偶联物1添加和洗出对Nav1.5电流的作用。(参见图53)。同二聚偶联物1的Nav1.5抑制IC50值为75.5nM。(参见图54)。用2μM同二聚偶联物1进行测试产生了Nav1.5电流的完全抑制。(参见图55)。记录了渐增浓度的同二聚偶联物1添加和洗出在产生约20％失活的保持电压下对Nav1.5电流的作用。(参见图56)。同二聚偶联物1在产生约20％失活的保持电压下的Nav1.5抑制IC50值为57nM。(参见图57)。用2μM同二聚偶联物1进行测试在产生约20％失活的保持电压下产生了对Nav1.5电流的完全抑制。(参见图58)。
钾通道研究。从成年SD大鼠(14至15周龄)收获了背根神经节，剪掉结缔组织，然后在37℃下用木瓜蛋白酶(3mL不含钙和镁的Hank’s缓冲液+1mg L-半胱氨酸+4μL饱和碳酸氢钠+60μL木瓜蛋白酶，Worthington biochemical)进行30分钟的酶解离。将制备物在1000rpm下离心2分钟，将沉淀重悬以进行第二次酶孵育，第二次酶孵育采用胶原酶和分散酶(4mL不含钙和镁的Hank’s缓冲液+120μL得自Roche的胶原酶/分散酶混合物100mg/mL)进行60分钟，每10分钟进行一次温和的研磨。将细胞在2000rpm下再次离心2分钟，重悬在F-12培养基中，铺到聚-D-层粘连蛋白包被的盖玻片上，置于含5％CO2的潮湿37℃培养箱中，用于在当天进行电生理记录。
电生理记录采用膜片钳技术的全细胞配置进行(Hamill OP等人，“Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recordingfrom cells and cell-free membrane patches，Pfluger’s Archiv391：85-100，1981)，其中内部(电极)溶液包含单位为毫摩尔的70KF、70KCl、10HEPES、5HEDTA，用KOH调至pH7.25。外部溶液包含单位为毫摩尔的140NaCl、5KCl、2CaCl2、1MgCl2、10HEPES、10葡萄糖，用NaOH调至pH7.4。在形成膜片钳的全细胞配置后，通过移动膜片电极将细胞从皿底提起，在电子控制(BioLogique)下手动置于重力驱动的微灌流阵列前。每5秒通过20ms测试去极化到由-90mV保持电位递送的0mV而诱发组合钠电流和钾电流。通过转换灌流管而添加[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22；500nM)肽，虽然快速钠电流(可能具有河豚毒素敏感性，至少部分地由Nav1.7编码)稳定降低，从而反映肽所致的阻断，但是外向钾电流无变化。图94中所示的电流未进行漏减，但是随着测试脉冲变为0mV，漏电流的污染应当最小。图94中所示的结果证明500nM[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)未阻断电压门控钾电流。
表32.测定的偶联GpTx-1肽类似物的Nav1.7使用IC50。
实施例4：血浆稳定性研究
在人类、大鼠和小鼠血浆中研究了GpTx-1肽和GpTx-1肽类似物的稳定性。通过GpTx-1肽和GpTx-1肽类似物参考标准品在50/50(v/v)甲醇/水中制备了肽储备溶液，然后保存在-20℃下。将1mg/mL的肽储备溶液用于在HPLC级水中配制20μg/mL的肽工作溶液。在使用前，将肽工作溶液保存在2至8℃的冷藏机中。
通过将225μl血浆加到装有25μl20μg/mL的肽工作溶液的小瓶中制备了稳定性样品，然后在37℃下孵育。人、大鼠或小鼠血浆中各肽的初始浓度为2μg/mL。在五个时间点(0、2、4、8和24小时)取25μl等分血浆样品加到96孔板的合适孔中，然后添加25μl内标溶液(100ng/mL，在50/50甲醇/水中制备的NAV肽类似物)和100μL0.1％的甲酸，将样品涡旋混合。将Oasis HLB μElution96孔固相萃取板用于从预处理的血浆样品中萃取GpTx-1或GpTx-肽模拟肽，将萃取物进样到(10μL)LC-MS/MS系统进行分析。
LC-MS/MS由与具有Turbo电离源的5500QTRAP质谱仪(AB Sciex，Toronto，Canada)联用的Acquity UPLC系统(Waters，Milford，MA)组成。分析柱为Acquity UPLC BEH C182.1mm×50mm柱。流动相为0.1％的甲酸的乙腈/水溶液(5/95，v/v，流动相A)和0.1％的甲酸的乙腈/水溶液(95/5，v/v，流动相B)。使用AB Sciex软件(版本1.5)收集和处理数据。
所测试的肽的血浆稳定性来源于从LC-MS/MS分析中获得的对应于肽和内标的峰面积比，将所有数据归一化到0小时时间点的值。结果在下文的表33、表34和表35中示出。所测试的GpTx-1和GpTx-1肽类似物显示出在人、小鼠和大鼠血浆中显著的稳定性，这可能是由于它们紧凑、二硫键稳定化的结构。
表33.GpTx-1和GpTx-1肽类似物在人血浆中的稳定性。
表34.GpTx-1和GpTx-1肽类似物在小鼠血浆中的稳定性。
表35.GpTx-1和GpTx-1肽类似物在大鼠血浆中的稳定性。
实施例5：GpTx-1肽类似物的聚乙二醇化偶联物研究
为了鉴定GpTx-1内能够通过半衰期延长部分修饰的位点，制备了一些列在各个非半胱氨酸位置包含炔丙基甘氨酸的位置类似物。在折叠后，使含有炔烃的肽接受与约500Da分子量的叠氮基PEG的铜催化1，3-偶极环加成反应，以得到具有三唑键合的位点特异性聚乙二醇化肽，从而将序列中的炔丙基甘氨酸或Pra残基转化成3-(1，2，3-三唑-4-基)丙氨酸或Atz残基。该系列类似物的电生理筛选(上文的表30、31和32)鉴定出了GpTx-1内的多个位点，包括SEQ ID NO：1的N端以及第1、10、12、13、15、22、28和33位，其中大的化学部分能够引入而不显著降低在Nav1.7或Nav1.3的效力。一般来讲，这些位置往往位于GpTx-1的亲水性表面上，远离疏水性结合面或围绕疏水性结合面的周边。鉴定了这些位置后，制备了[Phe6；Atz131GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：591)或[Ala5；Phe6；Atz13]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：1028)或生物素-Ahx--[Ala5，Phe6，Atz13，Leu26，Arg28]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：1031)的较高分子量偶联物(20kDa PEG；SEQ ID NO：590)和同二聚构建体(参见图81A)并进行了测试(参见表30和图46-58)。将这些在相对于天然GpTx-1序列(SEQ ID NO：1)第13位具有不同大小的共价连接到两种肽每一者的PEG接头的同二聚体中的四种命名如下(*＝乙基)：
[Phe6，Atz(2kDaEtO-PEG*-{[Phe6，Atz13*]GpTx-1(1-34)})13]GpTx-1(1-34)(“同二聚偶联物1”)(参见图81A)；
[Phe6，Atz(500DaEtO-PEG*-{[Phe6，Atz13*]GpTx-1(1-34)})13]GpTx-1(1-34)(“同二聚偶联物2”)；
[Ala5，Phe6，Atz(2kDaEtO-PEG*-{[Ala5，Phe6，Atz13*，Leu26，Arg28]GpTx-1(1-34)})13，Leu26，Arg28]GpTx-1(1-34)(“同二聚偶联物3”)；
生物素-Ahx-[Ala5，Phe6，Atz(2kDa EtO-PEG*-{生物素-Ahx-[Ala5，Phe6，Atz13*，Leu26，Arg28]GpTx-1(1-34)})13，Leu26，Arg28]GpTx-1(1-34)(“同二聚偶联物4”)。
实施例6：GpTx-1的NMR结构测定
在水中、pH约3和T＝298K条件下通过高分辨率NMR光谱获得了GpTx-1的结构。使用标准2D实验在Bruker Avance III800MHz光谱仪上采集了数据。(参见Wutchrich，NMR of Proteins and NucleicAcids，John Wiley ＆ Sons，Canada，(1986))。使用Cyana2.1软件，根据500NOE限制条件(216长程)、45二面角限制条件、11氢键限制条件以及3二硫键限制条件计算了结构。主链原子的最终RMSD为0.1±0.05A，而所有重原子的最终RMSD为0.74±0.12A。(有关肽主链的20种最低能量构象的叠加图，参见图7；有关来自肽的20种最低能量构象的重原子的叠加图，参见图8；有关肽主链的带状图示，参见图9)。该结构证实6个半胱氨酸残基的二硫键连接为C2-C17、C9-C23和C16-C30或C1-C4、C2-C5、C3-C6模式，从而使GpTx-1成为肽的抑制性胱氨酸结(ICK)家族的成员。
GpTx-1(SEQ ID NO：1)的折叠结构在性质上为两亲的，其中平坦疏水面在分子的一侧，而亲水(在大多数情况下为阳离子型)面在相对侧。GpTx-1的系统类比(具体地讲，用丙氨酸和谷氨酸进行位置扫描)鉴定出若干残基对Nav1.7和Nav1.3处的活性至关重要。这些残基，即相对于SEQ ID NO：1的Phe5、Met6、His27、Trp29、Lys31、Tyr32和Phe34聚集在GpTx-1的一个面上。SEQ ID NO：1的第27至34位残基形成C端β链，而Phe5和Met6与该链相邻并形成该疏水面的其余部分。由于改变该面的性质的变化会破坏针对Nav1.7和Nav1.3的活性，因此，该结构可为与VGSC在结合界面处相互作用的分子的一部分。(参见图10和图11)。
实施例7：在小鼠中进行初步药代动力学测定
药代动力学研究。进行了初步药代动力学(PK)研究。一项PK研究用得自Charles River Laboratories的7周龄雄性CD-1小鼠进行。小鼠具有由供应商置于颈动脉中的导管。经静脉内向3只小鼠并经皮下向3只小鼠给予[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)。经皮下向3只小鼠给予GpTx-1(SEQ ID NO：1)。所有剂量均为1mg/kg并且静脉内注射经由侧尾静脉进行。在给药后3、15、30分钟以及1、2、4、6、8和24小时采集经静脉内给药动物的血样，在给药后15、30分钟以及1、2、4、6、8和24小时采集经皮下给药动物的血样。对于各样品，经由颈动脉导管收集15μL血液并混合在35μL0.1M的柠檬酸盐缓冲液中。接着将样品冷冻在-80℃下直至分析。
另一PK研究用得自Taconic的7周龄未经改造的雄性CD-1小鼠进行。将[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)以1mg/kg经皮下给予12只小鼠且以1mg/kg经由侧尾静脉经静脉内给予12只小鼠。在给药后0.5、1、2、4、8和24小时，对各给药途径的2只小鼠实施安乐死并采集血样和脑。将脑称重并立即冷冻在-80℃下。将血样收集在经EDTA处理的微型容器中然后在13000rpm下离心5分钟，之后，提取血浆并在96孔板中在-80℃下冷冻。
另一PK研究用得自Taconic的7周龄未经改造的CD-1小鼠进行。以5mg/kg经皮下向21只小鼠给予[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)。在给药后0.5、1、1.25、1.5、2、3和4小时，对3只小鼠实施安乐死并采集血样和脑。将脑称重并立即冷冻在-80℃下。将血样收集在经EDTA处理的微型容器中然后在13000rpm下离心5分钟，之后，提取血浆并在96孔板中在-80℃下冷冻。
LC-MS/MS分析程序。在50/50(v/v)甲醇/水中由肽参考标准品制备了肽储备溶液(1mg/mL)并保存在-20℃下。使用1mg/mL肽储备溶液在50/50(v/v)甲醇/水中制备了100μg/mL的肽工作溶液。将肽工作溶液保存在2至8℃的冷藏机中。
在经柠檬酸盐缓冲的小鼠血液(血液/0.1M柠檬酸盐缓冲液，30/70，v/v)中制备了标准样品。通过在经柠檬酸盐缓冲的小鼠血液中使用100μg/mL肽工作溶液连续稀释现制的5000ng/mL溶液制备了5、10、25、50、100、250、500和1000ng/mL的标准浓度。取25μl等分血样加到96孔板的合适孔中，接着添加50μl内标溶液(100ng/mL，在50/50甲醇/水中制备的肽类似物)和150μl0.1M ZnSO4，将样品涡旋混合5分钟，然后在4000rpm下离心10分钟。接着使用Oasis HLB μElution96孔固相萃取板萃取上清液以提取肽，然后将萃取物进样(10μL)到LC-MS/MS系统进行分析。
LC-MS/MS由与具有Turbo电离源的5500QTRAP质谱仪(AB Sciex，Toronto，Canada)联用的Acquity UPLC系统(Waters，Milford，MA)组成。分析柱为Acquity UPLC BEH C182.1mm×50mm柱。流动相为0.1％的甲酸的乙腈/水溶液(5/95，v/v，流动相A)和0.1％的甲酸的乙腈/水溶液(95/5，v/v，流动相B)。使用AB Sciex软件(版本1.5)收集和处理数据。
相对于相应肽标准品的浓度，使用面积比的1/x2加权线性最小二乘回归法，由峰面积比(肽/内标)得出了校准曲线。使用得自校准标准品的回归方程来反算各标准品和血样的测量浓度。
结果。在药代动力学研究中，据发现GpTx-1(SEQ ID NO：1)在1mg/kg和0.5mg/kg静脉内剂量下对小鼠是致死性的。GpTx-1(SEQ IDNO：1)的1mg/kg皮下剂量对小鼠而言可耐受，并显示出持续1小时的可测血浆浓度。(参见图16)。[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)的1mg/kg静脉内剂量在小鼠中耐受，大致体内半衰期为15分钟。(参见图17A和图17B)。[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)的1mg/kg皮下剂量在血液中也产生了可测暴露量。(参见图17B)。在另一研究中，5mg/kg皮下剂量在血浆中产生了持续3小时在约0.6μM的肽浓度，该值比(PX)测得的体外Nav1.7IC50高40倍，计算得到的t1/2＝0.6h，高于1mg/kg皮下剂量和静脉内剂量并适用于进一步的体内测试。(参见图17B)。
实施例8：离子通道反向筛选(counterscreen)
心脏离子通道反向筛选(hERG和hNav1.5)。
如下文所述进行了心脏离子通道反向筛选(hERG和hNav1.5)，其代表性结果显示于图18和图19A-B中。
使用 系统针对克隆的人类Nav1.5钠通道进行反向 筛选。
细胞系。经人类hNav1.5稳定转染的HEK293细胞购自Cytomyx，Inc.。
细胞外(HB-PS)记录溶液含有70mM NaCl、67mM N-甲基-D-葡糖胺、4mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM HEPES、10mM葡萄糖，用HCl调节至pH7.4。内部记录溶液含有130mM CsF、10mM NaCl、10mM EGTA、2mM MgCl2、10mM HEPES，用CsOH调节至pH7.20。在应用前将参考标准品或供试品的储备溶液稀释到HB-PS中。供试品包括本文所述的肽或肽偶联物。使用标准化步骤方案引发通过hNav1.5钠通道的离子电流。将细胞保持在-80mV下。使用以10秒间隔重复的具有固定幅度的脉冲模式(条件化前脉冲：-120mV，维持50ms；去极化测试步骤达到-30mV后维持20ms)，测量了由于供试品所致的hNav1.5钠电流的初始阻断及稳态阻断。以间断模式在10kHz下获取电流并在3kHz下过滤。当建立全细胞配置时，将细胞洗涤3分钟，然后应用对照媒介物5分钟。接着，PatchXpress脚本工具的DataStable_PC功能仅在基线电流稳定或再经过5分钟时才允许实验开始。然后应用对照和各浓度的供试品5分钟。各浓度以1分钟的间隔添加三次。为了测定IC50，将供试品以1μM、3μM、10μM和30μM累积地应用于细胞(在各供试品浓度之间不洗出；n≥3，其中n＝细胞数)。使用PatchXpress Commander v1.4(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)进行了电生理数据采集并使用DataXpressv2.04(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)进行了分析。使用在供试品应用之前和之后的三个峰值内向电流来计算各浓度下的电流抑制百分比。良好记录的接受标准包括：(1)密封电阻＞200MΩ，(2)接入电阻＜10MΩ，(3)峰值尾电流＞200pA，(4)漏电流＜峰值尾电流的25％，(5)对照媒介物中的停止＜2.5％/分钟。
使用 系统针对人类IKr(hERG)钾通道进行反向筛 选。
细胞培养。稳定表达人类ERG(hERG)钾通道的HEK293细胞购自Millipore(目录号CYL3039)。HEK-hERG细胞的生长培养基含有DMEM/F12(Invitrogen#11320)、1X非必需氨基酸(Gibco#11140)、10％胎牛血清(Gibco#16000)和400μg/ml遗传霉素(Gibco#10131-027)。将细胞在37℃、潮湿、含95％空气与5％CO2的环境中维持培养。T75Corning培养瓶的接种密度为400万个细胞，每周两次或只要细胞密度达到80％的汇合度时即按1：3的比率传代。在PatchXpress实验当天，通过在37℃下使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Sigma)3分钟将细胞从T75培养瓶提离。接着在37℃、潮湿、含95％空气与5％CO2的氛围中将它们重悬在生长培养基中至少30分钟，然后加载到SealChip记录室(AVIVA Biosciences)上。
通过 7000A(Molecular Devices)进行电生理记录。全细胞膜片钳记录的细胞内溶液含有(以mM计)氯化钾(70)、氟化钾(60)、氯化镁(2)、乙二醇四乙酸(EGTA，11)、三磷酸腺苷镁(5)和HEPES(10)。用KOH将pH值调节至7.2，将最终同渗容摩设为295mOsm。细胞外溶液含有(以mM计)氯化钠(135)、氯化钾(4)、氯化镁(1)、氯化钙(1.8)、HEPES(10)和葡萄糖(10)。用NaOH将pH值调节至7.4，并将最终同渗容摩设为305mOsm。
达到全细胞记录模式后，将细胞保持在-80mV的保持电位下。使用从-80mV的保持电压达到-50mV后持续500毫秒的电压阶跃来建立峰值外向尾电流测量的基线或参考点。此后进行去极化步骤，达到+30mV后持续2秒以驱动通道达到失活状态。返回-50mV后持续2秒的阶跃取消失活，从而揭露最大峰值外向尾电流。每10秒重复电压阶跃一次。由复极化-50mV阶跃的峰值外向尾电流与通道活化前-50mV下的第一基线电流之间的差值确定总hERG外向尾电流。
测试样品制备。将包括本文所述的肽和肽偶联物的测试化合物(最多10μM)连续稀释到含有0.1％w/v牛血清白蛋白(BSA)的细胞外记录缓冲液中，随后转移到玻璃灌注贮存器中。接着将3μL连续稀释样转移到900μL测定缓冲液中，测定缓冲液中含有0.1％w/vBSA。
程序。对于药物效力测量，由4种浓度(0.3、1、3和10μM)生成累积浓度反应曲线。间隔60秒三次添加各浓度的测试化合物以确保记录室中的测定缓冲液完全交换。随后的添加之间存在3分钟等待时间。添加测试化合物之前，将装有测定缓冲液和媒介物对照(0.3％DMSO)的两个玻璃小瓶用作对照(即1x测定缓冲液、1x0.3％DMSO以及4种递增浓度的测试化合物)。
数据分析。必须目视检查每个成功的全细胞记录的外向hERG尾电流的质量。良好质量记录的一般标准是：1)在药物添加程序期间，-80mV下的保持电流不得超过300pA；2)峰值外向尾电流必须大于300pA；以及3)在8分钟控制期期间0.3％DMSO中的峰值外向尾电流改变不大于2.5％/分钟。由Protocol Engine(Amgen)使用非线性混合模型生成效力估计值，以定量细胞间测定的一致性并对相同细胞类型群体提供药物效力的准确测量(Miu等人，2006，JALA11：195)。
GpTx-1(SEQ ID NO：1)和[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)相对于hERG的反向筛选结果显示在图18中。GpTx-1(SEQ ID NO：1)和[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)相对于hNav1.5的反向筛选结果显示在图19A和图19B中。
实施例9：体内疼痛模型
可在任何相关的体内疼痛模型中测试本发明的组合物。实施例包括：
触诱发痛-Von Frey测试。使用Von Frey细丝来评估啮齿动物的机械敏感性。将小鼠置于金属丝网底面上，封闭在单独的测试室中并使其驯化直至镇静。接着向小鼠爪子施加具有各种弯曲力的经校准细丝以测量对无害触觉(例如触摸)刺激的反应。对细丝系列的反应和无反应模式决定动物的机械阈值。此阈值用作测定法的终点。
大鼠神经性疼痛模型。通过异氟烷吸入麻醉将雄性SD大鼠(200g)麻醉，并在背根神经节的远侧且在进入坐骨神经之前在L5和L6节段将左腰脊神经紧密结扎(4-0丝质缝合线)，如Kim和Chung首先描述(An experimental model for peripheral neuropathy produced bysegmental spinal nerve ligation in the rat.Pain50：355-363，(1992))。闭合切口，使大鼠恢复。该程序在左后爪中引起机械(触觉)异常疼痛，如通过记录在经由金属丝网观察笼垂直于爪跖面(足垫之间)施加分级刺激(在4.0至148.1mN范围内的von Frey细丝)时受影响的爪子(与神经损伤位点同侧)从中缩回时的压力而评估。通过依序增加及降低刺激强度并使用如Chaplan，S.R.等人所述的Dixon非参数测试分析缩爪数据而测定缩爪阈值(PWT)(Quantitative assessment of tactileallodynia in the rat paw.J.Neurosci.Meth，53：55-63(1994))。
大鼠CFA炎性疼痛模型。在雄性SD大鼠(200g)左后爪中注射完全弗氏佐剂(CFA)。该程序在左后爪中引起机械(触觉)和热异常疼痛，如通过记录在经由金属丝网观察笼或通过施加热辐射而垂直于爪跖面(足垫之间)施加分级刺激(在4.0至148.1mN范围内的von Frey细丝)时受影响的爪子从中缩回时的压力而评估。通过依序增加及降低刺激强度并使用如Chaplan等人(1994)所述的Dixon非参数测试分析缩爪数据而测定PWT。仅在大鼠未表现出运动功能障碍(例如爪拖地或下垂)或皮肤破损且其PWT低于39.2mN(相当于4.0g)时才将大鼠包括在研究中。在CFA注射后的适当时间，通过皮下注射而用测试肽和/或测试媒介物-偶联肽(通常为60mg/kg的筛选剂量)或对照溶液(PBS或其他媒介物)将大鼠处理一次并测定PWT。使用下式将平均缩爪阈值(PWT)转化成最大可能效应百分比(％MPE)：％MPE＝100*(经处理大鼠的PWT-对照大鼠的PWT)/(15-对照大鼠的PWT)。因此，截止值15g(对于机械异常疼痛为148.1mN)相当于100％的MPE并且对照反应相当于0％MPE。
预计本发明的优选分子在与对标靶的IC50相比适当的暴露下产生具有PD的镇痛作用。
小鼠福尔马林疼痛模型实验程序。向啮齿动物爪子中注射福尔马林激发已得到充分研究的疼痛形式，该疼痛由动物缩爪次数来定量。福尔马林注射后的疼痛在两个特征性时期中产生：第一期持续约10分钟并且可能对应于由外周神经元介导的即刻疼痛。在福尔马林注射后约10分钟开始并且再持续30至40分钟的第二期对应于脊髓中神经元的敏感化以及外周疼痛感觉神经元的亢进。对该应用中所提供的化合物进行了测试以观察其是否减少福尔马林反应II期中的缩爪次数并因此是否为潜在的镇痛药物(Bregman H等人，“Identification of apotent，state-dependent inhibitor of Nav1.7with oral efficacy in theformalin model of persistent pain.”J Med Chem54(13)：4427-4445，2011)。
所有体内功效实验中均使用雄性CD-1小鼠(8至12周龄，HarlanLaboratories，Frederick，MD)。动物受试者自由取食(Teklad Global无大豆蛋白挤出型啮齿动物饲料2020X)及饮水，并在整个研究期间维持12小时光/暗循环。将所有动物以每笼4只动物分组圈养在具有玉米芯垫料的标准固底笼中。将动物群落维持在约21℃和60％湿度下。根据国际疼痛研究协会(International Association for the Study of Pain)指南开展所有实验。
在测试当天，在驯化期间或在驯化之前，向动物给予研究化合物或媒介物。给药后，使所有小鼠(n＝12)习惯行为分析室(尺寸：10cm直径、14cm高，在高架玻璃顶部具有盖板的圆柱体)5分钟，接着注射福尔马林。在下面设置摄像机以记录小鼠行为(5分钟驯化和40分钟测试阶段)。在测试时，将小鼠稍微限制在布手套中并使用胰岛素注射器(U100，0.3cc，28-30G)在左后爪背面注射20μL2％福尔马林溶液。福尔马林注射后立即将动物放回腔室中并观察40分钟。记录5分钟间隔内的抬爪/舔爪行为，此后测量了同侧和对侧爪宽度。研究完成后，立即对动物施以安乐死。
在第一项小鼠福尔马林疼痛模型研究中，以5mg/kg皮下1小时预处理给予[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)，用吗啡以1mg/kg皮下30分钟预处理作为阳性对照。(参见图59)。肽对第一或急性期(福尔马林注射后0-5分钟)无作用。(参见图60)。与媒介物(PBS)相比，肽显著缩短了在第二期(福尔马林注射后5-40分钟)抬起和/或舔受影响的爪子所花的时间。(参见图61)。在该实验中，用作阳性对照的1mg/kg的吗啡皮下剂量未明显减轻动物中的疼痛反应，在以下的研究中将其增至3mg/kg。肽的末期血浆暴露(福尔马林注射后45分钟时的肽血浆浓度)为0.80±0.21μM。肽和吗啡阳性对照相对于媒介物(PBS)均未明显减轻由福尔马林注射所引起的爪子肿胀。(参见图62)。
用5、1.67和0.5mg/kg皮下1小时预处理剂量重复小鼠福尔马林疼痛模型以测定[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)的剂量反应。(参见图63)。肽在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中在任何剂量下均无作用。(参见图64)。阳性对照(3mg/kg的吗啡皮下剂量)确实显著缩短了第一期中抬起/舔受影响的爪子所花的时间。5mg/kg的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)皮下剂量证实了在研究第二期中抬爪/舔爪所花的时间的显著缩短，与吗啡阳性对照一样。(参见图65)。然而，较低的肽剂量(1.67和0.5mg/kg s.c.)相对于媒介物在第二期中无明显作用。末期暴露(福尔马林注射后45分钟时的肽血浆浓度)对于5.0、1.67和0.5mg/kg的剂量而言分别为0.58±0.26μM、0.15±0.05μM和0.04±0.2μM。相对于媒介物(PBS)，肽和吗啡阳性对照均未显著减轻福尔马林注射所导致的爪子肿胀。(参见图66)。在前两项小鼠福尔马林实验中，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在0.60-0.80μM之间的血浆浓度下显示出抬爪/舔爪的显著可重现减少。在福尔马林疼痛模型中测试了另一种肽[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)。用谷氨酸取代第29位的色氨酸大大降低针对Nav1.7的效力，因此制备了[Glu29]GpTx-1并作为阴性对照加以测试。5mg/kg的[Glu29]GpTx-1皮下剂量对小鼠福尔马林疼痛模型中抬爪/舔爪所花的时间无明显作用，末期平均肽血浆浓度为0.502±0.271μM，从而表明肽Nav1.7效力与在福尔马林疼痛模型中的功效有关。(参见图95-98)。
用5、3和1mg/kg皮下1小时预处理剂量重复小鼠福尔马林疼痛模型以进一步研究[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)的剂量反应。(参见图67)。肽在第一期(福尔马林注射后0-5分钟)中在任何剂量下均无作用。(参见图68)。5mg/kg的肽皮下剂量证实了在研究第二期中抬爪/舔爪所花的时间的显著缩短，与吗啡阳性对照一样。然而，较低的肽剂量未在第二期中显示出相对于媒介物对照抬爪/舔爪行为的减轻。1mg/kg s.c.组与媒介物对照并无明显不同，而3mg/kgs.c.组似乎显著增加了抬爪/舔爪所花的时间。(参见图69)。末期暴露(福尔马林注射后45分钟时的肽血浆浓度)对于5、3和1mg/kg的剂量而言分别为1.84±0.18μM、0.53±0.23μM和0.20±0.05μM。相对于媒介物(PBS)，肽和吗啡阳性对照均未显著减轻福尔马林注射所导致的爪子肿胀。(参见图70)。
小鼠旷场分析实验方案。为了确认福尔马林模型中由测试化合物产生的功效不归因于动物镇静或损害，还测试了化合物对动物总体运动的作用(旷场测试)。向未经处理的动物施用测试化合物并将其置于新环境中，自动记录动物在探索新环境期间进行的运动。运动减少50％或以上表示福尔马林测试中的功效不能归于真实痛觉缺失。
所有体内功效实验中均使用雄性CD-1小鼠(8至12周龄，HarlanLaboratories，Frederick，MD)。动物受试者自由取食(Teklad Global无大豆蛋白挤出型啮齿动物饲料2020X)及饮水，并在整个研究期间维持12小时光/暗循环。将所有动物以每笼4只动物分组圈养在具有玉米芯垫料的标准固底笼中。将动物群落维持在约21℃和60％湿度下。根据国际疼痛研究协会(International Association for the Study of Pain)指南开展所有实验。
在测试当天，向动物给予研究化合物或媒介物，并使其适应测试室至少30分钟。在给药后的适当时间，将小鼠(N＝8)置于清洁的旷场室内(Kinder Scientific Photobeam Activity System)。在无光条件下，记录了系统上总体动物运动的变化，持续60分钟。评估了以下参数：总基本运动、总直立、总直立时间和总细微运动。
旷场分析的结果。3mg/kg皮下剂量的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQID NO：22)在1小时预处理时间下对CD-1小鼠的总基本运动、总细微运动、总直立或总直立时间无影响。没有一种肽剂量相对于媒介物对照显著减少了探索行为。然而，在5mg/kg皮下剂量与1小时预处理下，肽相对于媒介物显著减小了CD-1小鼠自主活动的总细微运动和总直立时间分量。总基本运动和总直立也减少。(参见图71-74)。末期暴露(肽注射后2h时的肽血浆浓度)对于5和3mg/kg s.c.剂量而言分别为1.79±0.38μM和0.89±0.33μM。在此实验中，对自主活动无明显作用的3mg/kg剂量使肽血浆浓度相当于已在福尔马林疼痛模型中显示出可重现功效的那些肽血浆浓度。较高的肽血浆浓度(＞1.5μM)对自主活动产生了明显的作用，如通过5mg/kg剂量下末期暴露为2.1±0.47μM的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)的重复旷场分析所证实。(参见图99-102)。在旷场分析中测试了其他三种肽：[Glu29]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：30)、[Glu28]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：153)和[Ala5，Phe6，Glu10，2-Abu13，Leu26，Arg28]GpTx-1(SEQ IDNO：1035)。用谷氨酸取代第29位的色氨酸大大降低针对Nav1.7的效力，因此制备了[Glu29]GpTx-1(SEQ ID NO：30)并作为阴性对照加以测试。5mg/kg皮下剂量的[Glu29]GpTx-1在旷场分析中对小鼠自主活动无明显作用，末期平均肽血浆浓度为0.771±0.272μM。(参见图103-106)。5mg/kg剂量的[Glu28]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：153)显著减少了旷场分析中的自主活动，末期平均肽血浆浓度为1.28±0.403μM，与5mg/kg剂量的[Ala5]GpTx-1(SEQ ID NO：22)的结果相似。(参见图107-110)。在旷场分析中5mg/kg剂量的[Ala5，Phe6，Glu10，2-Abu13，Leu26，Arg28]GpTx-1(SEQ ID NO：1035)引起动物垂死行为或致死，末期平均肽血浆浓度为1.72±0.313μM。
小鼠藜芦定疼痛模型实验方案。藜芦定是在注射到啮齿动物爪子中时引起疼痛退缩(舔爪和抬爪或警惕)反应的电压门控钠离子通道的非选择性活化剂(Hille B，Ion Channels of Excitable Membranes，Sinauer Associates，Sunderland MA2001)。因此，作为钠通道抑制剂的测试化合物(如本发明的那些化合物)不仅定量其对疼痛的作用，还定量对由钠通道活化所引起的疼痛的作用。也就是说，测试化合物对藜芦定诱导的抬爪和舔爪的作用不仅度量镇痛功效，还度量钠通道的体内受体占用率。
所有体内功效实验中均使用雄性CD-1小鼠(8至12周龄，HarlanLaboratories，Frederick，MD)。动物受试者自由取食(Teklad Global无大豆蛋白挤出型啮齿动物饲料2020X)及饮水，并在整个研究期间维持12小时光/暗循环。将所有动物以每笼4只动物分组圈养在具有玉米芯垫料的标准固底笼中。将动物群落维持在约21℃和60％湿度下。根据国际疼痛研究协会(International Association for the Study of Pain)指南开展所有实验。
在测试当天，在驯化期间或在驯化之前，向动物给予研究化合物或媒介物。给药后，使所有小鼠(n＝12)习惯行为分析室(尺寸：10cm直径、14cm高，在高架玻璃顶部具有盖板的圆柱体)5分钟，接着注射藜芦定。在下面设置摄像机以记录小鼠行为(5分钟驯化和20分钟测试阶段)。在测试时，将小鼠稍微限制在布手套中并使用胰岛素注射器(U100，0.3cc，28-30G)在左后爪背面注射20μL溶于1％乙醇/磷酸盐缓冲生理食盐水悬浮液中的1μg藜芦定(Sigma-Aldrich#V109)。藜芦定注射后立即将动物放回腔室中并观察20分钟。记录5分钟间隔内的抬爪/舔爪行为，此后测量了同侧和对侧爪宽度。研究完成后，立即对动物施以安乐死。
在第一个小鼠藜芦定疼痛模型中，在1小时预处理时间下经皮下给予5mg/kg的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)，并在30分钟预处理时间下经腹膜内(“i.p.”)给予30mg/kg的美西律作为对照。在CD-1小鼠中测量了对藜芦定诱导(1μg爪背注射)的自发伤害感受行为的抗伤害感受作用。总体上，被美西律明显逆转的媒介物组中存在良好的抬爪反应。在5mg/kg下，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)未能显著减少抬爪行为。(参见图75)。在所有组中均为爪子肿胀的减轻。(参见图76)。然而，在研究实验的进程时，肽确实在10-15分钟和15-20分钟时间区间中呈现出一定的作用。(参见图77)。末期暴露(肽注射后1.5小时的肽血浆浓度)对于5mg/kg剂量而言为0.70±0.10μM。
在重复小鼠藜芦定疼痛模型时，在1小时预处理时间下经皮下给予1和5mg/kg的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)，并在30分钟预处理时间下经腹膜内给予30mg/kg的美西律作为对照。媒介物组存在强烈的抬爪反应，与美西律明显相反。在1和5mg/kg下，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)对抬爪行为无作用。(参见图78)。任何组中爪子肿胀均未减轻。(参见图79)。肽剂量在整个实验进程中无显著作用。(参见图80)。末期暴露(肽注射后1.5h的肽血浆浓度)对于5和1mg/kg剂量而言分别为0.72±0.13μM和0.09±0.05μM。
用于筛选本发明分子的治疗性实施方案的体内疼痛模型的上述实例不具有限制性。技术人员应了解其他相关的疼痛模型。
实施例10：初步心脏安全性评估
分离的灌注兔心(Langendorff制备物)。如下文所述，测定了[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在分离的灌注兔心(Langendorff制备物)测定法中的作用，其结果显示在下表36和表37中。
表36.1μM[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在经分离的灌注兔心测定法(Langendorff制备物)中对心电图间期的作用。肽对心室复极(QTc或JTc间期)无延迟作用。肽对心率(HR)无作用。肽也对心室去极化和传导(QRS和PR间期)无作用。(缩写：HR，心率；PR间期，心房去极化开始(P波)至心室去极化开始(QRS复合波)的时间间隔；QRS持续时间，QRS复合波自开始至结束的时间间隔，其为心室去极化的持续时间；QT间期，自QRS复合波开始至T波结束的时间间隔，其为心室去极化和复极化的持续时间；QTc间期，经HR修正的QT间期；JT间期，QT间期与QRS持续时间之间的差(JT＝QT-QRS)，其为心室复极化的持续时间；以及JTc间期，经HR修正的JT间期)。
表37.1μM[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在经分离的灌注兔心测定法(Langendorff制备物)中对血液动力学参数的作用。肽对LV收缩力(dP/dt+)无作用，对冠状血流量(CF)也无作用。肽对冠状动脉血管无直接作用。(缩写：LVSP，左心室收缩压；LVDP，左心室舒张压；dP/dt+，LV压力的最大增加速率；dP/dt-，LV压力的最小降低速率；LVDevP，LV形成压，LVDevP＝LVSP-LVDP；以及CF，冠脉流量)。
获取和驯化。从Harlan Laboratories获得6只14至22周龄且2.5至3.5公斤的雌性新西兰白兔。接收后，由兽医人员检查兔子以确保健康状态可接受。由兽医和工作人员提供兽医护理。在使用前将兔子驯化至少7天。不健康兔子不用于研究。
识别方法。由供应商为各兔子分配识别号。由供应商向各兔子粘贴含有识别号的耳标。此识别号与兔子到达日期、出生日期、来源和性别一起显示在笼子卡片上。将本研究中所用兔子的识别号及其最终体重记录在笔记本中。灌注介质的组成。灌注介质由经改性的充氧Krebs-Henseleit缓冲液(心脏37℃)组成，该缓冲液由以下各物质构成(mM)：NaCl(120)、KCl(4.7)、MgSO4(1.2)、KH2PO4(1.2)、d-葡萄糖(11.1)、CaCl2(1.8)、NaHCO3(25)和丙酮酸钠(2.0)。用95％O2/5％CO2对此灌注介质不断鼓泡。为测试[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ IDNO：22)，在缓冲液中添加1％BSA。
麻醉和心脏摘除。用戊巴比妥(50mg/kg，IV；耳静脉)麻醉各兔子。通过捏爪(足部退缩反射)评估疼痛完全抑制。将兔子限制在兔笼限制器中，同时进行麻醉诱导以避免伤害动物和研究者。
暴露心脏：在将动物麻醉后切除心脏。通过经腹切口接近膈膜并小心地切开以暴露胸腔。由双侧切口沿最后一根肋骨下缘向第一根肋骨打开胸部，然后将胸廓折到动物头上，从而暴露出心脏。为摘取心脏，将该器官轻轻地托在手指之间以避免损伤，在切割主动脉、腔静脉和肺血管之前稍微抬起。
通过Langendorff设备灌注经分离的心脏制备物。快速摘取心脏，安装到Langendorff设备上，在恒定压力下用充氧的Krebs-Henseleit缓冲液灌注。如果自发搏动(无节奏)的心脏在平衡期间对于各参数(机械活动、心率、心脏间期等)表现出可接受而稳定的基线值，则将相应的心脏包括在研究中。在整个研究期间将灌注缓冲液温度维持在约37℃。
实验计划。将各个心脏(N＝总计4)平衡约30至60分钟。此平衡时期后，在1％BSA中采集基线测量值约10分钟。此时期之后，将心脏暴露于1μM的[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)20分钟。在研究期间使用计算机化数据采集系统连续测量心脏参数。(有关详细信息和验证研究，参见Qu等人，BeKm-1，A Peptide Inhibitor of hERGpotassium currents，prolongs QTc intervals in isolated rabbit heart，J.Pharmacol.Exp.Ther.(337)：2-8(2011))。
心电图测量。用置于心脏上的柔性单极电极记录同步双导联表面接触心电图，一个电极位于心室的心外膜上，而另一个电极位于左心房的心外膜上。
血液动力学测量。用水使左心室(LV)中的乳胶球囊膨胀至达到约5-10mmHg的LVEDP。用管子将球囊与压力传感器连接以测量LVEDP和LVSP。用连接到主动脉套的侧臂口的压力传感器测量了冠脉灌注压(CPP)。
数据分析。采用Notocord自动执行了左心室压力(LVP)和CPP分析。评估了平衡时期最后30秒以及各剂量暴露时期的测量值并用于确定效应。用EMKA ecgAUTO软件(EMKA Technologies，Paris，France)分析了心电图(ECG)，并分析了1分钟连续ECG波形(下一事件标记之前30秒)的HR、PR、QRS和QT间期。汇集各个心脏的值以确定各变量在各个浓度下的平均值。还确定了各变量在基线与各浓度之间的平均变化百分比。对于QT间期的HR修正，使用了Fridericia’s等式(QTcF＝QT/RR1/3)。将数据表示为各变量在基线与各浓度之间的平均变化百分比。HR、PR、QRS、QTc和JTc变化≥10％以及+dP/dt和CF变化≥15％被视为具有药物相关性。所有值均表示为平均值土S.D.。
结果。在1μM的浓度下，[Ala5]GpTx-1(1-34)(SEQ ID NO：22)在经分离的灌注兔心测定法(Langendorff制备物)中无作用。肽对心室复极化(QTc或JTc间期)无延迟作用且对心率无作用。肽也对心室去极化和传导(QRS和PR间期)无作用。肽对LV收缩力(dP/dt+)无作用，对冠状血流量(CF)也无作用。肽对冠状动脉血管无直接作用。
实施例11：位点特异性肽偶联
使用以下方案将毒素肽类似物(有关毒素肽类似物氨基酸序列，参见表5A和表5B)位点特异性地偶联到人类免疫球蛋白重链上的键合位点(SEQ ID NO：3087的C273)处或人类免疫球蛋白Fc结构域上(SEQ ID NO：3089的C52处)。
制备肽-接头构建体。使含炔烃的肽与两种不同长度的叠氮基-PEG溴乙酰胺进行铜催化的1，3-偶极环加成反应，得到具有三唑键合的位点特异性聚乙二醇化肽，从而将序列中的炔丙基甘氨酸或Pra残基转化成3-(1，2，3-三唑-4-基)丙氨酸或Atz残基。(参见图81B)。现制了在第13位含有炔丙基甘氨酸(Pra)或在N端含有4-戊炔酰基(4-Pen)的肽(7.4mM，溶于6.7mL水中)、叠氮基-PEG11-溴乙酰胺(150mM，0.964mL，溶于水中)、三((1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)胺(TBTA，10nM，2.2mL，溶于DMSO中)、抗坏血酸钠(50mM，10.1mL，溶于水中)和硫酸铜(II)(35mM，2.9mL，溶于水中)溶液。按以下顺序向50mL离心管中添加肽和试剂以达到以下最终浓度。添加肽储备溶液(6.7mL)，最终浓度为3.7mM，接着添加叠氮基-PEG11-溴乙酰胺(0.402mL)，最终浓度为4.5mM。添加TBTA(0.603mL)，最终浓度为0.45mM，并充分混合。接着添加抗坏血酸钠(4.522mL)，最终浓度为16.9mM，并充分混合。添加CuSO4(1.292mL)，最终浓度为3.4mM。使溶液静置1小时，此时通过LC-MS判断反应完成。用吸管向25mL SPE滤管中添加SP高性能琼脂糖(SPSepharose High Performance)浆液(8mL)。用洗涤缓冲液(50mL20mMNaOAc，pH＝4.0)调节凝胶，用肽溶液上样，洗涤(50mL，20mMNaOAc，pH＝4.0和50mL，20mM NaOAc，pH＝4.0，0.1M NaCl)并用45ml1M NaCl，20mM NaOAc，pH＝4.0洗脱到50mL离心管中。通过使用Agilent制备型上样泵以30mL/min上样到制备型HPLC柱(Phenomenex Luna5u C18(2)100A AXIA，250×30mm)而纯化产物混合物。将柱子用10％B冲洗10分钟。将柱子连接到制备型HPLC(Agilent)，将肽通过10-40％B的梯度经60min洗脱，然后是10min冲洗和10min平衡。通过LC-MS分析级分，合并并冻干，得到纯的肽-接头构建体以供偶联IgG或Fc结构域。
抗体制备/还原。在反应缓冲液(20mM磷酸钠pH6.8、2mMEDTA)中将抗-DNP mAb(E273C，hIgG1)(κ/IgG1z)浓缩至约5mg/ml。
所用的人IgG重链单体的氨基酸序列如下(可变区带下划线； C273键合位点为斜体并带有下划线)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAP GKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCARYNFNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPCVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//SEQ ID NO.：3087。
所用的人IgG kappa轻链单体的氨基酸序列如下(可变区带下划 线)：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRRLAWYQQKPGK APKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ QANSFPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC//SEQ ID NO.：3088。
所用的人IgG1z Fc结构域单体的氨基酸序列如下(C52键合位点 为斜体并带有下划线)：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPCVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK//SEQ ID NO.：3089。
表38.所制备的免疫球蛋白-肽偶联物和Fc结构域-肽偶联物。“单价”偶联分子在分子中具有一个毒素肽(即肽经由接头共价偶联到分子中的一个HC或Fc结构域单体，但不偶联到另一HC或Fc结构域单体)；“二价”偶联分子具有两个毒素肽(即一个肽经由接头共价偶联到分子中的各HC或Fc结构域单体)。SEQ ID NO：1046、1047和1048在表5A中示出。
通过在室温下将mAb与1：1摩尔比的TCEP：半胱氨酸(2：1的TECP：mAb)孵育30分钟而还原经工程改造的半胱氨酸。使用经反应缓冲液平衡的Zeba离心式脱盐柱(≥7kD Pierce)移除TCEP。在上样前，使用amicon ultra(10,000-30,000MWCO)离心浓缩机将大规模制备物浓缩至适当体积。
肽制备。将含有溴乙酰胺官能团的冻干肽-接头以20mg/ml重悬在水中，接着立即进行偶联反应。
偶联反应。在反应缓冲液中将肽与经还原的mAb以2.5：1摩尔比的肽：半胱氨酸混合(5：1的肽：mAb)，mAb的浓度为5mg/ml，且在4℃下孵育12-16小时。免疫球蛋白中经工程改造的游离半胱氨酸与肽-接头中的溴乙酰胺官能团反应，形成具有稳定硫代乙酰胺键合的位点特异性免疫球蛋白-肽偶联物。(参见图81B和图82)。如果一个半胱氨酸发生反应，则结果是单价免疫球蛋白-肽偶联物；但是如果两个半胱氨酸均发生反应，则结果是二价免疫球蛋白-肽偶联物。
偶联物的纯化。孵育后，将偶联反应物脱盐以移除过量的游离肽，然后上样到HiTrap SP-HP柱(GE Healthcare；制备物＜10mg时，1ml柱；制备物＞10mg时，5ml柱)。在5倍柱体积的90％缓冲液A(10mM磷酸钠pH6.5、5％乙醇)、10％缓冲液B(10mM磷酸钠pH6.5、5％乙醇、1M NaCl)中冲洗柱子。从10％缓冲液B至70％缓冲液B经20倍柱体积梯度洗脱偶联物(参见表38)。未经修饰的mAb首先洗脱，接着是单价免疫球蛋白-肽偶联物(1个肽/mAb)，再是二价免疫球蛋白-肽偶联物(2个肽/mAb)。由mAb过度还原产生的更高级偶联物随后洗脱。(有关mAb免疫球蛋白-肽偶联物，参见图83；有关Fc结构域-肽偶联物，参见图84)。纯化后，将偶联物在A5SU储存缓冲液(10mM乙酸钠pH5.0、9％蔗糖)中配制，并浓缩至10mg/ml以便在-80℃下保存。
偶联物的分析。对偶联物进行了还原性SDS-PAGE，以确认与重链的偶联(大小增加约5kD)；并进行了非还原性SDS-PAGE，以确认内部二硫键保持完整。(有关mAb免疫球蛋白-肽偶联物，参见图83；有关Fc结构域-肽偶联物，参见图84)。对偶联物进行了分析型SEC以确定是否存在聚集(Superdex-20010/300柱，100mM磷酸钠、250mM NaCl、pH6.8等度洗脱，1ml/min，持续35min)。(参见图85)。
偶联物的LC-MS-TOF分析。使用Agilent6224TOF LC/MS光谱仪，通过非还原法记录了肽偶联物的LC/MS光谱。校准后，将5μg完整的样品上样到Zorbax300SB C6柱(1×50mm，3.5μm，AgilentTechnologies)，在75℃下以50μl/min的流速运行。使用90％正丙醇/0.1％TFA(缓冲液B)和0.1％TFA/水(缓冲液A)的梯度从柱中洗脱肽-偶联物。梯度条件为20％至90％缓冲液B，14分钟。(有关二价mAb-肽偶联物，参见图86；有关二价Fc结构域-肽偶联物，参见图87)。MS光谱表明分别向免疫球蛋白和免疫球蛋白Fc结构域添加了两个肽。存在多个峰归因于不同的糖基化同种型。
特异性反应结果。由100mg抗-DNP mAb(E273C，hIgG1)和15mg肽-接头构建体(SEQ ID NO：1062)获得了22mg二价偶联物(免疫球蛋白-肽偶联物2)和11mg单价偶联物(免疫球蛋白-肽偶联物1)。在A5SU缓冲液中将样品浓缩至10mg/mL，并在-80℃下以等分试样的形式保存。
肽偶联物的模型。仅出于说明性目的，建立了Fc-肽偶联物1、Fc-肽偶联物2、免疫球蛋白-肽偶联物1和免疫球蛋白-肽偶联物2的模型(MOE；Chemical Computing Group：Montreal，Quebec，Canada，2010)。(参见图88-91)。使用程序MOE(MOE；Chemical ComputingGroup：Montreal，Quebec，Canada，2010)由免疫球蛋白晶体结构(1HZH.pdb)构建了抗-DNP mAb(E273C)hIgG1(包含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ IDNO：3088)和抗-DNP mAb(E52C)hIgG1Fc结构域(SEQ ID NO：3089的同二聚体)的同源模型。指明了免疫球蛋白中的结合位点Cys273和免疫球蛋白Fc结构域中的结合位点Cys52。PEG11接头以任意构象示为将免疫球蛋白和免疫球蛋白Fc结构域中的适当半胱氨酸残基连接到肽中的Atz13残基。通过GpTx-1的NMR结构构建了肽(SEQ IDNO：1046)的同源模型(MOE；Chemical Computing Group：Montreal，Quebec，Canada，2010)并相对于免疫球蛋白和免疫球蛋白Fc结构域以任意取向显示。显示了一个或两个肽以反映各肽偶联物的单价或二价性质。
实施例12：肽偶联物在小鼠中的初步药代动力学
毒素肽偶联物的药代动力学(PK)研究。用得自Taconic的7周龄未经改造CD-1小鼠进行了初步PK研究。以1mg/kg或10mg/kg向四个独立组中的12只小鼠经皮下给予Fc-P2(Fc-肽偶联物2)或其对照Fc(SEQ ID NO：1062)。在单独的队列中，以1mg/kg或10mg/kg向四个独立组中的12只小鼠经皮下给予Ab-P2(免疫球蛋白-肽偶联物2)或其对照Ab(抗-DNP mAb(E273C，hIgG1；含免疫球蛋白单体SEQ ID NO：3087、SEQ ID NO：3088、SEQ ID NO：3087、SEQ IDNO：3088))。在颈背进行皮下注射。在给药后0.5、1、2、4、8和24小时，对来自4种给药途径中每一者的2只小鼠施以安乐死并采集血样和脑。将脑称重并立即冷冻在-80℃下。将血样收集在经EDTA处理的微型容器中然后在13000rpm下离心5分钟，之后，提取血浆并在96孔板中在-80℃下冷冻。
LC-MS/MS分析程序。在含1％BSA的DPBS中由偶联物参考标准品制备了肽偶联物(免疫球蛋白-肽偶联物2或Fc-肽偶联物2)储备溶液(100μg/mL)，并保存在-20℃下。在小鼠血清中制备了标准样品。通过在小鼠血清中使用100μg/mL肽偶联物储备溶液连续稀释现制的10,000ng/mL溶液而制备25、50、100、250、500、1000、2500、5000和10,000ng/mL的标准浓度。取25μl等分血清样品加到96孔板的合适孔中，然后添加25μl内标溶液(1μg/mL，在含1％BSA的DPBS中制备的用[15N，13C6]-Leu均匀标记的αDA-IgG2)。接着通过在96孔板格式下使用经抗人Fc小鼠抗体固定的磁珠进行免疫亲和捕获而处理血浆样品，然后进行胰蛋白酶消化并使用Oasis HLB μElution96孔固相萃取板进行固相萃取以萃取胰蛋白酶肽，将萃取物进样(10μL)到LC-MS/MS系统上进行分析。
LC-MS/MS由与具有Turbo电离源的5500QTRAP质谱仪(AB Sciex，Toronto，Canada)联用的Acquity UPLC系统(Waters，Milford，MA)组成。分析柱为Acquity UPLC BEH C18(100×2.1mm，1.7um)。流动相为0.1％的甲酸的乙腈/水溶液(5/95，v/v，流动相A)和0.1％的甲酸的乙腈/水溶液(95/5，v/v，流动相B)。使用肽SEQ IDNO：1062的N端DCLGAFR(SEQ ID NO：1050)作为替代肽用于肽偶联物(免疫球蛋白-肽偶联物2或Fc-肽偶联物2)定量分析。
使用AB Sciex软件(版本1.5)收集和处理数据。
相对于相应肽偶联物标准品的浓度，使用面积比的1/x2加权线性最小二乘回归法，由峰面积比(肽/内标)得出了校准曲线。使用得自校准标准品的回归方程来反算各标准品和小鼠血浆样品的测量浓度。
初步PK研究的结果表明，肽偶联物的暴露分别略低于未经修饰的IgG和Fc。(参见图88和图89)。在两种情况下，10mg/kg皮下剂量在24小时时产生了等于或接近相应肽偶联物的体外Nav1.7IC50的血浆浓度。(Fc-肽偶联物2)的Cmax在8小时与24小时之间达到，但(免疫球蛋白-肽偶联物2)的Cmax出现在24小时时或之后。由于实验短暂而不能计算准确的体内t1/2。以10mg/kg皮下剂量与24小时的预处理时间，在小鼠旷场分析中对免疫球蛋白-肽偶联物2和Fc-肽偶联物2两者进行了测试，它们对动物的自主活动无明显作用。(参见图111-114)。以10mg/kg皮下剂量与24小时的预处理时间，在小鼠福尔马林疼痛模型中对免疫球蛋白-肽偶联物2和Fc-肽偶联物2两者进行了测试，它们对研究第一期或第二期中抬起/舔受影响的爪子所花的时间无明显作用。(参见图115-117)。可能的是，该剂量不足以覆盖体内靶标并观察到功效。
缩写
除非在具体的环境中另外定义，否则在此整个说明书中使用的缩写均如下所定义。
Ac    乙酰基(用于指代乙酰化残基)
AcBpa 乙酰化对苯甲酰基-L-苯丙氨酸
ACN   乙腈
AcOH  乙酸
ADCC  抗体依赖性细胞毒性
Aib   氨基异丁酸
bA    β-丙氨酸
Bpa   对苯甲酰基-L-苯丙氨酸
BrAc  溴乙酰基(BrCH2C(O)
BSA   牛血清白蛋白
Bzl   苄基
Cap   己酸
CBC   全血计数
CNS   中枢神经系统
COPD  慢性阻塞性肺病
CTL    细胞毒性T淋巴细胞
DCC    二环己基碳二亚胺
Dde    1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代-亚环己基)乙基
DOPC   1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DOPE   1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
DPPC   1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DRG    背根神经节
DSPC   1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DTT    二硫苏糖醇
EAE    实验性自身免疫性脑脊髓炎
ECL    增强的化学发光
ESI-MS 电子喷雾电离质谱
Et     乙基
FACS   荧光活化细胞分选
Fmoc   芴甲氧羰基
HOBt   1-羟基苯并三唑
HPLC   高效液相色谱
HSL    高丝氨酸内酯
IB     包涵体
IWQ   Quattro
KCa   钙活化钾通道(包括IKCa、BKCa、SKCa)
KLH   琥珀酰化钥孔傶血兰蛋白
Kv    电压门控钾通道
Lau   月桂酸
LPS   脂多糖
LYMPH  淋巴细胞
MALDI-MS 基质辅助激光解吸电离质谱
Me    甲基
MeO   甲氧基
MeOH   甲醇
MHC   主要组织相容性复合体
MMP   基质金属蛋白酶
MW    分子量
MWCO   截留分子量
1-Nap  1-萘基丙氨酸
Nav，Nav 电压门控钠通道
NEUT   中性粒细胞
Nle   正亮氨酸
NMP   N-甲基-2-吡咯烷酮
OAc   乙酸盐(酯)
PAGE  聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBMC  外周血单核细胞
PBS   磷酸盐缓冲盐水
Pbf   2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PCR   聚合酶链反应
PD    药效动力学
Pec   哌可酸
PEG   聚(乙二醇)
Pic   吡啶甲酸
PK    药代动力学
PNS   外周神经系统
PX    
pY    磷酸酪氨酸
RBS   核糖体结合位点
RT    室温(25℃)
Sar   肌氨酸
SDS   十二烷基硫酸钠
STK   丝氨酸-苏氨酸激酶
t-Boc 叔丁氧羰基
tBu   叔丁基
TCR   T细胞受体
TFA   三氟乙酸
TG    三叉神经节
THF   胸腺体液因子
Trt   三苯甲基
TTX   河豚毒素

Claims (72)

1. 一种物质组合物，所述物质组合物包含具有下式的氨基酸序列的分离多肽：
 Xaa 1Xaa 2 Xaa  3Xaa 4Xaa 5Xaa 6Xaa 7Xaa 8Xaa 9Xaa 10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15 Xaa 16 Xaa 17 
Xaa 18Xaa 19 Xaa 20 Xaa 21Xaa 22Xaa 23 Xaa 24Xaa 25 Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29Xaa 30 
Xaa 31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35 Xaa 36Xaa 37Xaa 38//SEQ ID NO:475
或其药学上可接受的盐，
其中：
Xaa 1Xaa 2不存在；或者Xaa 1为任何氨基酸残基并且Xaa 2为任何氨基酸残基；或者Xaa 1不存在并且Xaa 2为任何氨基酸残基；
Xaa  3在Xaa 18为Cys时为Cys；或者Xaa  3在Xaa 18为SeCys时为SeCys；或者Xaa  3在Xaa 18为烷基氨基酸残基时为烷基氨基酸残基；
Xaa 4为酸性、疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 5为Gly、Ala、疏水性或碱性氨基酸残基；
Xaa 6为Gly、Ala、2-Abu、Nle、Nva或疏水性氨基酸残基；
Xaa 7为Gly、Ala、芳族或疏水性氨基酸残基；
Xaa 8为碱性、酸性或中性亲水性氨基酸残基，或Ala残基；
Xaa 9为碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa  10在Xaa 24为Cys时为Cys；或者Xaa  10在Xaa 24为SeCys时为SeCys；
Xaa 11为任何氨基酸残基；
Xaa 12为Pro、酸性、中性或疏水性氨基酸残基；
Xaa 13为任何氨基酸残基；
Xaa 14为任何氨基酸残基；
Xaa 16为碱性、中性亲水性或酸性氨基酸残基，或Ala残基；
Xaa 17在Xaa 31为Cys时为Cys；或者Xaa 17在Xaa 31为SeCys时为SeCys；
Xaa 18为Cys、SeCys或烷基氨基酸残基；
Xaa 19为任何氨基酸残基；
Xaa 20为Pro、Gly、碱性或中性亲水性残基；
Xaa 21为碱性、疏水性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 22为疏水性或碱性氨基酸残基；
Xaa 23为疏水性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 24为Cys或SeCys残基；
Xaa 25为Ser、Ala或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 26为Ala、酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 27为酸性、碱性、中性亲水性或疏水性残基；
Xaa 28为芳族或碱性氨基酸残基；
Xaa 29为酸性、碱性或中性亲水性氨基酸残基；
Xaa 30为Trp、5-溴代Trp、6-溴代Trp、5-氯代Trp、6-氯代Trp、1-Nal、2-Nal或硫代Trp残基；
Xaa 31为Cys或SeCys；
Xaa 33为疏水性或芳族氨基酸残基；
Xaa 34为任何氨基酸残基；
Xaa 35为疏水性氨基酸残基；
Xaa 36、Xaa 37和Xaa 38的每一者独立地不存在或独立地为中性、碱性或疏水性氨基酸残基；
并且其中：
如果Xaa 3和Xaa 18均为Cys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硫键；或者如果Xaa 3和Xaa 18均为SeCys残基，则在残基Xaa 3与残基Xaa 18之间存在二硒键；
如果Xaa 10和Xaa 24均为Cys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硫键；或者如果Xaa 10和Xaa 24均为SeCys残基，则在残基Xaa 10与残基Xaa 24之间存在二硒键；
如果Xaa 17和Xaa 31均为Cys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硫键；或者如果Xaa 17和Xaa 31均为SeCys残基，则在残基Xaa 17与残基Xaa 31之间存在二硒键；
氨基末端残基任选地被乙酰化、生物素酰化或4-戊炔酰化或聚乙二醇化；并且
羧基末端残基任选地被酰胺化。
2. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 4选自Ala、Glu、Asp、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Cit残基。
3. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 5选自Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
4. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 6选自Ala、Gly、2-Abu、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、脯氨酸、硫杂脯氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环戊基甘氨酸(Cpg)、苯基甘氨酸、N-甲基亮氨酸、N-甲基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
5. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 7选自Gly、Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、Pro、2-吡啶基丙氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
6. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 8选自Ala、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Ser、Thr、Asn、Gln、Cit、Asp、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Glu残基。
7. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 9选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
8. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 11选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
9. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 12选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、Cha和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋氨酸、羟基脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
10. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 13选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
11. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 14选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
12. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 16选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr、Cit、Asp、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Glu残基。
13. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 19选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
14. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 20选自Ala、Gly、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
15. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 21选自Ala、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
16. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 22选自Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
17. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 23选自Ala、Phe、Pro、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
18. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 25选自Ala、Gly Pro、Met、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
19. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 26选自Ala、Pro、Met、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、甘氨酸、Glu、Asp、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Gln、Asn、Ser、Thr和Cit残基。
20. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 27选自Thr、Leu、Ile、Val、Ser、Met、Gln、Asn、Phe、Tyr、Trp、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、4-苯基-苯丙氨酸(Bip)、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、Asp、Glu、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸和Gly残基。
21. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 28选自Phe、Trp、Tyr、Arg、Lys、His、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、1-Nal、2-Nal、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-吡啶基-丙氨酸、4-哌啶基-丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
22. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 29选自Ala、Asp、Glu、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、γ-羧基谷氨酸、Phe、Gly、His、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸和Dab残基。
23. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 33选自Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-吡啶基-丙氨酸、4-哌啶基-丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
24. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 34选自Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、Pra、Atz、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸、2-吡啶基-丙氨酸、3-吡啶基-丙氨酸、4-羧基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
25. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 35选自Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、1’NMe-Trp、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)、2-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-三氟甲基-苯丙氨酸和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
26. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 36、Xaa 37和Xaa 38的每一者独立地不存在或独立地选自Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr、高赖氨酸、鸟氨酸、N-甲基-精氨酸、ω-氨基精氨酸、ω-甲基-精氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、高精氨酸、N-甲基-赖氨酸、N-ε-甲基赖氨酸、Dab、正亮氨酸、正缬氨酸、1-Nal、2-Nal、环己基甘氨酸(Chg)、环己基丙氨酸(Cha)和4-苯基-苯丙氨酸(Bip)残基。
27. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 3和Xaa 18为烷基残基。
28. 根据权利要求27所述的物质组合物，其中Xaa 3和Xaa 18独立地为Ala或2-Abu残基。
29. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述羧基末端残基被酰胺化。
30. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中所述分离的多肽包含下式的氨基酸序列：
Xaa 1Xaa 2Cys3Xaa 4 Xaa 5Ala6 Xaa 7Xaa 8Xaa 9Cys10Xaa 11Xaa 12Xaa 13Xaa 14Asp15 Xaa 16
Cys17Cys18Xaa 19Xaa 20Xaa 21Xaa 22Xaa 23Cys24Xaa 25Xaa 26Xaa 27Xaa 28Xaa 29
Xaa 30 
Cys31Lys32Xaa 33Xaa 34Xaa 35 Xaa 36Xaa 37Xaa 38// SEQ ID NO:476。
31. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 6为Ala。
32. 根据权利要求31所述的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
33. 根据权利要求31所述的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
34. 根据权利要求31所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22、252-263、419-439、518-521、524、525、562-580、602、691、692、696-703、715、721-735、737-749、756、757、761、762、764-771、787-796、798、800、802、803、809-812、1028、1030-1040、1043-1047、1062-1065和1068-1070。
35. 根据权利要求31所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1082、1096、1110、1124、1135、1146、1157、1165、1173、1181、1192、1203、1214、1222、1230、1238、1249、1260、1271、1279、1287、1295、1306、1317、1328、1336、1344、1352、1360、1368、1376、1384、1392、1400、1408、1416、1424、1432、1440、1448、1456、1464、1472、1480、1488、1496、1504、1512、1520、1528、1536、1544、1552、1560、1568、1576、1584、1592、1600、1608、1616、1624、1632、1640、1658、1672、1686、1700、1711、1722、1733、1741、1749、1757、1768、1779、1790、1798、1806、1814、1825、1836、1847、1855、1863、1871、1882、1893、1904、1912、1920、1928、1936、1944、1952、1960、1968、1976、1984、1992、2000、2008、2016、2024、2032、2040、2048、2056、2064、2072、2080、2088、2096、2104、2112、2120、2128、2136、2144、2152、2160、2168、2176、2184、2192、2200、2208、2216、2234、2248、2262、2276、2287、2298、2309、2317、2325、2333、2344、2355、2366、2374、2382、2390、2401、2412、2423、2431、2439、2447、2458、2469、2480、2488、2496、2504、2512、2520、2528、2536、2544、2552、2560、2568、2576、2584、2592、2600、2608、2616、2624、2632、2640、2648、2656、2664、2672、2680、2688、2696、2704、2712、2720、2728、2736、2744、2752、2760、2768、2776、2784、2792、2808、2822、2833、2844、2855、2863、2871、2879、2890、2901、2912、2920、2928、2936、2944、2952、2960、2968、2976、2984、2992、3000、3008、3016、3024、3032、3040、3048、3056、3064、3072和3080。
36. 根据权利要求31所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 597-601和813-1027。
37. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 6为Gly。
38. 根据权利要求37所述的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
39. 根据权利要求37所述的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
40. 根据权利要求37所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 265、751、752、754、755、1081、1095、1109、1123、1134、1145、1156、1164、1172、1180、1191、1202、1213、1221、1229、1237、1248、1259、1270、1278、1286、1294、1305、1316、1327、1335、1343、1351、1359、1367、1375、1383、1391、1399、1407、1415、1423、1431、1439、1447、1455、1463、1471、1479、1487、1495、1503、1511、1519、1527、1535、1543、1551、1559、1567、1575、1583、1591、1599、1607、1615、1623、1631、1639、1657、1671、1685、1699、1710、1721、1732、1740、1748、1756、1767、1778、1789、1797、1805、1813、1824、1835、1846、1854、1862、1870、1881、1892、1903、1911、1919、1927、1935、1943、1951、1959、1967、1975、1983、1991、1999、2007、2015、2023、2031、2039、2047、2055、2063、2071、2079、2087、2095、2103、2111、2119、2127、2135、2143、2151、2159、2167、2175、2183、2191、2199、2207、2215、2233、2247、2261、2275、2286、2297、2308、2316、2324、2332、2343、2354、2365、2373、2381、2389、2400、2411、2422、2430、2438、2446、2457、2468、2479、2487、2495、2503、2511、2519、2527、2535、2543、2551、2559、2567、2575、2583、2591、2599、2607、2615、2623、2631、2639、2647、2655、2663、2671、2679、2687、2695、2703、2711、2719、2727、2735、2743、2751、2759、2767、2775、2783、2791、2807、2821、2832、2843、2854、2862、2870、2878、2889、2900、2911、2919、2927、2935、2943、2951、2959、2967、2975、2983、2991、2999、3007、3015、3023、3031、3039、3047、3055、3063、3071和3079。
41. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 6为2-Abu。
42. 根据权利要求41所述的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
43. 根据权利要求41所述的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
44. 根据权利要求41所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 605、636、649、706、707、718、753、758、797、799、801、804、807、808、1029、1041、1042、1048、1066、1067、1083、1097、1111、1125、1136、1147、1158、1166、1174、1182、1193、1204、1215、1223、1231、1239、1250、1261、1272、1280、1288、1296、1307、1318、1329、1337、1345、1353、1361、1369、1377、1385、1393、1401、1409、1417、1425、1433、1441、1449、1457、1465、1473、1481、1489、1497、1505、1513、1521、1529、1537、1545、1553、1561、1569、1577、1585、1593、1601、1609、1617、1625、1633、1641、1659、1673、1687、1701、1712、1723、1734、1742、1750、1758、1769、1780、1791、1799、1807、1815、1826、1837、1848、1856、1864、1872、1883、1894、1905、1913、1921、1929、1937、1945、1953、1961、1969、1977、1985、1993、2001、2009、2017、2025、2033、2041、2049、2057、2065、2073、2081、2089、2097、2105、2113、2121、2129、2137、2145、2153、2161、2169、2177、2185、2193、2201、2209、2217、2235、2249、2263、2277、2288、2299、2310、2318、2326、2334、2345、2356、2367、2375、2383、2391、2402、2413、2424、2432、2440、2448、2459、2470、2481、2489、2497、2505、2513、2521、2529、2537、2545、2553、2561、2569、2577、2585、2593、2601、2609、2617、2625、2633、2641、2649、2657、2665、2673、2681、2689、2697、2705、2713、2721、2729、2737、2745、2753、2761、2769、2777、2785、2793、2809、2823、2834、2845、2856、2864、2872、2880、2891、2902、2913、2921、2929、2937、2945、2953、2961、2969、2977、2985、2993、3001、3009、3017、3025、3033、3041、3049、3057、3065、3073和3081。
45. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 6为Nle。
46. 根据权利要求45所述的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
47. 根据权利要求45所述的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
48. 根据权利要求45所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 607、638、651、1085、1099、1113、1127、1138、1149、1160、1168、1176、1184、1195、1206、1217、1225、1233、1241、1252、1263、1274、1282、1290、1298、1309、1320、1331、1339、1347、1355、1363、1371、1379、1387、1395、1403、1411、1419、1427、1435、1443、1451、1459、1467、1475、1483、1491、1499、1507、1515、1523、1531、1539、1547、1555、1563、1571、1579、1587、1595、1603、1611、1619、1627、1635、1643、1661、1675、1689、1703、1714、1725、1736、1744、1752、1760、1771、1782、1793、1801、1809、1817、1828、1839、1850、1858、1866、1874、1885、1896、1907、1915、1923、1931、1939、1947、1955、1963、1971、1979、1987、1995、2003、2011、2019、2027、2035、2043、2051、2059、2067、2075、2083、2091、2099、2107、2115、2123、2131、2139、2147、2155、2163、2171、2179、2187、2195、2203、2211、2219、2237、2251、2265、2279、2290、2301、2312、2320、2328、2336、2347、2358、2369、2377、2385、2393、2404、2415、2426、2434、2442、2450、2461、2472、2483、2491、2499、2507、2515、2523、2531、2539、2547、2555、2563、2571、2579、2587、2595、2603、2611、2619、2627、2635、2643、2651、2659、2667、2675、2683、2691、2699、2707、2715、2723、2731、2739、2747、2755、2763、2771、2779、2787、2795、2811、2825、2836、2847、2858、2866、2874、2882、2893、2904、2915、2923、2931、2939、2947、2955、2963、2971、2979、2987、2995、3003、3011、3019、3027、3035、3043、3051、3059、3067、3075和3083。
49. 根据权利要求1所述的物质组合物，其中Xaa 6为Nva。
50. 根据权利要求49所述的物质组合物，其中Xaa 27为Glu。
51. 根据权利要求49所述的物质组合物，其中Xaa 29为Asp、Glu或Gln。
52. 根据权利要求49所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 606、637、650、705、708、717、759、760、805、806、1084、1098、1112、1126、1137、1148、1159、1167、1175、1183、1194、1205、1216、1224、1232、1240、1251、1262、1273、1281、1289、1297、1308、1319、1330、1338、1346、1354、1362、1370、1378、1386、1394、1402、1410、1418、1426、1434、1442、1450、1458、1466、1474、1482、1490、1498、1506、1514、1522、1530、1538、1546、1554、1562、1570、1578、1586、1594、1602、1610、1618、1626、1634、1642、1660、1674、1688、1702、1713、1724、1735、1743、1751、1759、1770、1781、1792、1800、1808、1816、1827、1838、1849、1857、1865、1873、1884、1895、1906、1914、1922、1930、1938、1946、1954、1962、1970、1978、1986、1994、2002、2010、2018、2026、2034、2042、2050、2058、2066、2074、2082、2090、2098、2106、2114、2122、2130、2138、2146、2154、2162、2170、2178、2186、2194、2202、2210、2218、2236、2250、2264、2278、2289、2300、2311、2319、2327、2335、2346、2357、2368、2376、2384、2392、2403、2414、2425、2433、2441、2449、2460、2471、2482、2490、2498、2506、2514、2522、2530、2538、2546、2554、2562、2570、2578、2586、2594、2602、2610、2618、2626、2634、2642、2650、2658、2666、2674、2682、2690、2698、2706、2714、2722、2730、2738、2746、2754、2762、2770、2778、2786、2794、2810、2824、2835、2846、2857、2865、2873、2881、2892、2903、2914、2922、2930、2938、2946、2954、2962、2970、2978、2986、2994、3002、3010、3018、3026、3034、3042、3050、3058、3066、3074和3082。
53. 根据权利要求1所述的物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 3-30、32-72、74-134、136-178、180-211、218-239、241-305、307-363、366-386、388-432、434-474、515-527、532-588、590、591、593-775、777、778、780-788、790-1049和1062-3086。
54. 一种物质组合物，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 3-134、136-305、307-386、388-474、515-527、532-588、590、591、593-1049和1062-3086。
55. 一种分离的核酸，编码不含非规范氨基酸的SEQ ID NO: 3-134、136-305、307-386、388-474、515-527、532-588、590、591、593-1049或1062-3086的任一者。
56. 一种表达载体，包含权利要求55所述的核酸。
57. 一种重组宿主细胞，包含权利要求56所述的表达载体。
58. 根据权利要求1、30、31、37、41、45、49、53或54任一项所述的物质组合物，还包含任选的接头部分和药学上可接受的、共价连接的半衰期延长部分。
59. 根据权利要求58所述的物质组合物，其中所述半衰期延长部分为分子量为约1000 Da至约100000 Da的聚乙二醇、IgG Fc结构域、转甲状腺素蛋白或人血清白蛋白。
60. 根据权利要求58所述的物质组合物，其中所述半衰期延长部分包含人免疫球蛋白或人免疫球蛋白Fc结构域或两者。
61. 根据权利要求60所述的物质组合物，具有如图12A-N或图88-91任一者中所示的构型。
62. 根据权利要求60所述的物质组合物，其中所述组合物包含单价免疫球蛋白-肽或Fc-肽偶联物。
63. 根据权利要求60所述的物质组合物，其中所述组合物包含二价免疫球蛋白-肽或Fc-肽偶联物。
64. 一种药物组合物，包含权利要求1、30、31、37、41、45、49、53、54或59-63任一项所述的物质组合物和药学上可接受的载体。
65. 一种预防疼痛的方法，包括施用预防有效量的权利要求1、30、31、37、41、45、49、53、54或59-63任一项所述的物质组合物。
66. 一种治疗疼痛的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1、30、31、37、41、45、49、53、54或59-63任一项所述的物质组合物。
67. 据权利要求66所述的方法，其中所述疼痛为慢性疼痛、急性疼痛或持续性疼痛。
68. 根据权利要求67所述的方法，其中所述慢性疼痛与癌症、化疗、骨关节炎、纤维肌痛、原发性红斑性肢痛、疱疹后神经痛、疼痛性糖尿病神经病变、特发性疼痛性神经病变、神经瘤、阵发性剧痛症、偏头痛、三叉神经痛、颌面痛、丛集性头痛、复杂性局部疼痛综合征(CRPS)、腰椎手术失败综合征、坐骨神经痛、间质性膀胱炎、骨盆痛、下背痛、炎症引起的疼痛或关节痛相关。
69. 根据权利要求67所述的方法，其中所述急性或持续性疼痛与创伤、烧伤或手术相关。
70. 根据权利要求1或30所述的物质组合物，其中Xaa 29为酸性或中性亲水性残基。
71. 根据权利要求70所述的物质组合物，其中Xaa 29选自Ala、Asp、Glu、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸和γ-羧基谷氨酸残基。
72. 根据权利要求70所述的物质组合物，包含选自SEQ ID NO: 1071-2798的氨基酸序列。
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014165277A2 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Amgen Inc. POTENT AND SELECTIVE INHIBITORS OF Nav1.7
AR096927A1 (es) 2013-03-12 2016-02-10 Amgen Inc INHIBIDORES POTENTES Y SELECTIVOS DE NaV1.7
DK2968495T3 (da) * 2013-03-15 2019-10-14 Daniel J Capon Hybrid immunoglobulin indeholdende en ikke-peptid-bro
US11066459B2 (en) 2014-03-14 2021-07-20 Biomolecular Holdings Llc Hybrid immunoglobulin containing non-peptidyl linkage
EP3973994A1 (en) * 2014-06-12 2022-03-30 RA Pharmaceuticals, Inc. Modulation of complement activity
CN105348392B (zh) * 2015-11-18 2019-08-02 北京华金瑞清生物医药技术有限公司 一种Nav1.7抑制剂及其改造方法
US20170239183A1 (en) * 2016-02-23 2017-08-24 PixarBio Corporation COMPOSITIONS COMPRISING NAv1.7 SELECTIVE INHIBITORS FOR TREATING ACUTE, POST-OPERATIVE, OR CHRONIC PAIN AND METHODS OF USING THE SAME
EP3512870B1 (en) * 2016-09-16 2022-08-03 Olipass Corporation Scn9a antisense oligonucleotides
WO2018138585A1 (en) * 2017-01-24 2018-08-02 Olipass Corporation Scn9a antisense pain killer
CN109517041B (zh) * 2018-11-14 2019-09-17 青海芬陀利华生物科技有限公司 Gptx-1毒素及其应用
IL300385A (en) * 2020-08-05 2023-04-01 Aist A method for screening for a polypeptide that acts on a target protein
WO2022066767A2 (en) 2020-09-23 2022-03-31 Aldevron, Llc Potent and selective inhibitors of nav1.7
CN113429463B (zh) * 2021-05-18 2022-08-23 湖南百尔泰克生物医药有限公司 一种具有镇痛作用的多肽及其应用
CN114805492B (zh) * 2022-03-15 2025-07-22 上海元炘执药科技有限公司 一种用于抑制电压门控钠离子通道1.4的芋螺毒素kiiia突变体及其制备方法和应用
CN114805491B (zh) * 2022-03-15 2025-10-03 青岛海洋生物医药研究院 一种芋螺毒素kiiia突变体及其制备方法和应用
JP2025513452A (ja) 2022-04-22 2025-04-24 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 疼痛の治療のためのヘテロアリール化合物
CN119522214A (zh) 2022-04-22 2025-02-25 沃泰克斯药物股份有限公司 用于治疗疼痛的杂芳基化合物
CN114917324B (zh) * 2022-04-22 2025-05-30 江苏好上医生物医药有限公司 一种含虎纹毒素-iv的药物组合物及其应用
KR20250005373A (ko) 2022-04-22 2025-01-09 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 통증 치료를 위한 헤테로아릴 화합물
WO2023205468A1 (en) 2022-04-22 2023-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heteroaryl compounds for the treatment of pain
AU2023391870A1 (en) 2022-12-06 2025-06-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Process for the synthesis of substituted tetrahydrofuran modulators of sodium channels
WO2025090511A1 (en) 2023-10-23 2025-05-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods of preparing modulators of sodium channels and solid forms of the same for treating pain
WO2025090480A1 (en) 2023-10-23 2025-05-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heteroaryl compounds for the treatment of pain
TW202523313A (zh) 2023-10-23 2025-06-16 美商維泰克斯製藥公司 用於治療疼痛之雜芳基化合物
WO2025090516A1 (en) 2023-10-23 2025-05-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods of preparing compounds for treating pain and solid forms thereof
WO2025104668A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Pfizer Inc. Anti-gastric inhibitory polypeptide receptor (gipr) antibodies and antibody conjugates for the treatment of metabolic disorders
US20250186419A1 (en) 2023-12-07 2025-06-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dosing regimens for treating pain
TR2024005209A2 (tr) * 2024-04-30 2024-05-21 Vsy Bi̇yoteknoloji̇ Ve İlaç Sanayi̇ Anoni̇m Şi̇rketi̇ Bi̇lhassa i̇ntersti̇syel si̇sti̇t hastaliğinin tedavi̇si̇ i̇çi̇n bi̇r formülasyon
US20260001877A1 (en) 2024-06-28 2026-01-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Heteroaryl compounds for the treatment of pain
WO2026013449A2 (en) 2024-07-11 2026-01-15 Sea4Us - Biotecnologia E Recursos Marinhos, Sa Oxazolidone-derived compounds and their use in the treatment of chronic and acute pain

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4351337A (en) 1973-05-17 1982-09-28 Arthur D. Little, Inc. Biodegradable, implantable drug delivery device, and process for preparing and using the same
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4083368A (en) 1976-09-01 1978-04-11 Freezer Winthrop J Inhaler
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US5002936A (en) 1985-04-12 1991-03-26 Seymour Lieberman Lipophilic complexes of pharmacologically active inorganic mineral acid esters of organic compounds
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
NL8720442A (nl) 1986-08-18 1989-04-03 Clinical Technologies Ass Afgeefsystemen voor farmacologische agentia.
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
AU607172B2 (en) 1986-12-22 1991-02-28 Cygnus, Inc. Diffusion matrix for transdermal drug administration
US5023084A (en) 1986-12-29 1991-06-11 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process
US4906169A (en) 1986-12-29 1990-03-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process
US4849224A (en) 1987-11-12 1989-07-18 Theratech Inc. Device for administering an active agent to the skin or mucosa
US4983395A (en) 1987-11-12 1991-01-08 Theratech Inc. Device for administering an active agent to the skin or mucosa
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
JP3092811B2 (ja) 1988-07-23 2000-09-25 デルタ バイオテクノロジー リミテッド ペプチドおよびｄｎａ配列
US4925677A (en) 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US4994439A (en) 1989-01-19 1991-02-19 California Biotechnology Inc. Transmembrane formulations for drug administration
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
WO1992016192A1 (en) 1991-03-15 1992-10-01 Amgen Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
DE69233069T2 (de) 1991-03-15 2003-11-27 Amgen Inc., Thousand Oaks Pegylation von polypeptiden
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
US5792451A (en) 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
JPH0640945A (ja) 1992-07-23 1994-02-15 Kureha Chem Ind Co Ltd Ｆｃフラグメント結合抗腫瘍剤
AU5171293A (en) 1992-10-14 1994-05-09 Regents Of The University Of Colorado, The Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery
US5346701A (en) 1993-02-22 1994-09-13 Theratech, Inc. Transmucosal delivery of macromolecular drugs
US5432155A (en) 1993-06-29 1995-07-11 The Salk Institute For Biological Studies Conotoxins I
US5514774A (en) 1993-06-29 1996-05-07 University Of Utah Research Foundation Conotoxin peptides
US5460820B1 (en) 1993-08-03 1999-08-03 Theratech Inc Method for providing testosterone and optionally estrogen replacement therapy to women
US6342225B1 (en) 1993-08-13 2002-01-29 Deutshces Wollforschungsinstitut Pharmaceutical active conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
EP0802798A1 (en) 1994-02-23 1997-10-29 Chiron Corporation Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents
FR2717688B1 (fr) 1994-03-28 1996-07-05 Lhd Lab Hygiene Dietetique Système matriciel transdermique d'administration d'un oestrogène et/ou un progestatif à base d'EVA.
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
WO1996019205A1 (en) 1994-12-21 1996-06-27 Theratech, Inc. Transdermal delivery system with adhesive overlay and peel seal disc
EP0806940B1 (en) 1994-12-22 2003-04-09 AstraZeneca AB Aerosol drug formulations
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5756663A (en) 1996-01-03 1998-05-26 Zeneca Limited Antiarrhythmic peptide from venom of spider Grammostola spatulata
US5776896A (en) 1996-01-03 1998-07-07 Zeneca Limited Analgesic peptides from venom of grammostola spatulata and use thereof
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5783208A (en) 1996-07-19 1998-07-21 Theratech, Inc. Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid
WO1998023639A2 (en) 1996-11-27 1998-06-04 University Of Florida ShK TOXIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
CA2247328C (en) 1996-12-26 2007-01-30 Suntory Limited Neuropeptides originating in scorpion
WO2000055371A1 (en) 1999-03-18 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. 27 human secreted proteins
US6548644B1 (en) 1997-03-10 2003-04-15 Immunex Corporation Site protected protein modification
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
JP3530004B2 (ja) 1998-02-06 2004-05-24 株式会社日立ユニシアオートモティブ 吸入式投薬器
US6022952A (en) 1998-04-01 2000-02-08 University Of Alberta Compositions and methods for protein secretion
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
AUPP589598A0 (en) 1998-09-14 1998-10-08 University Of Queensland, The Novel peptides
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
DE69940785D1 (de) 1998-11-20 2009-06-04 Fuso Pharmaceutical Ind Proteinexpressionsvektor und benutzung desselbigen
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
SI1140018T1 (en) 1998-12-23 2003-12-31 Amgen Inc. Polyol/oil suspensions for the sustained release of proteins
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
EP2112234A3 (en) 1999-11-26 2010-06-16 McGill University Loci for idiopathic generalized epilepsy, mutations thereof and method using same to assess, diagnose, prognose or treat epilepsy
CA2393616A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
SE0000935D0 (sv) 2000-03-21 2000-03-21 Astrazeneca Ab An inhalation device
US7125847B1 (en) 2000-04-07 2006-10-24 The Research Foundation Of State University Of New York At Buffalo Mechanically activated channel blocker
CN1133461C (zh) 2000-04-11 2004-01-07 厦门北大之路生物工程有限公司 虎纹捕鸟蜘蛛毒素提取物在制备镇痛药物中的应用
ES2484966T3 (es) 2000-04-12 2014-08-12 Novozymes Biopharma Dk A/S Proteínas de fusión de albúmina
EP1280895B1 (en) 2000-05-10 2005-08-03 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Polypeptide inhibiting a proton-gated na+ channel
EP1177806A1 (en) 2000-08-04 2002-02-06 The Technology Partnership Public Limited Company Dry powder inhaler
GB0021617D0 (en) 2000-09-02 2000-10-18 Imp College Innovations Ltd Diagnosis and treatment of cancer
JP5013152B2 (ja) 2001-02-28 2012-08-29 株式会社ビーエムジー 蛋白質複合体形成剤
CA2440582A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20050054051A1 (en) 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2443968A1 (en) 2001-04-12 2002-10-24 Imperial College Innovations Limited Diagnosis and treatment of cancer: i
GB0120238D0 (en) 2001-08-20 2001-10-10 Univ College Of London Sodium channel regulators and modulators
EP1446103B1 (en) 2001-10-19 2015-12-23 Idexx Laboratories, Inc. Injectable compositions for the controlled delivery of pharmacologically active compound
US6900317B2 (en) 2002-02-19 2005-05-31 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 and inhalable powdered medicaments containing them
AU2003219933A1 (en) 2002-02-25 2003-09-09 Vanderbilt University Expression system for human brain-specific voltage-gated sodium channel, type 1
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
WO2003101972A1 (en) 2002-05-30 2003-12-11 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
GB0219512D0 (en) 2002-08-21 2002-10-02 Norton Healthcare Ltd Inhalation compositions with high drug ratios
US7396816B2 (en) 2003-03-14 2008-07-08 Pharmadesign, Inc. Low-molecular weight peptides inhibiting ion channel activity
DK1641483T3 (da) 2003-06-12 2008-06-02 Lilly Co Eli Fusionsproteiner
KR20060118398A (ko) 2003-08-05 2006-11-23 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 전압 개폐 이온 채널 억제제로서의 축합 피라미딘 화합물
NZ579370A (en) 2003-08-08 2011-06-30 Vertex Pharma Heteroarylaminosulfonylphenyl derivatives for use as sodium or calcium channel blockers in the treatment of pain
US7615563B2 (en) 2003-08-08 2009-11-10 Gonzalez Iii Jesus E Compositions useful as inhibitors of voltage-gated sodium channels
US7125908B2 (en) 2003-08-29 2006-10-24 Allergan, Inc. Treating pain using selective antagonists of persistent sodium current
US7060723B2 (en) 2003-08-29 2006-06-13 Allergan, Inc. Treating neurological disorders using selective antagonists of persistent sodium current
AU2005207002B2 (en) 2004-01-21 2011-03-17 University Of Utah Research Foundation Mutant sodium channel Nav1.7 and methods related thereto
WO2005118614A1 (en) 2004-04-08 2005-12-15 Avigen, Inc. Methods and compositions for treating neuropathic pain
EP1750683B1 (en) 2004-04-23 2013-01-09 Amgen Inc. Sustained release formulations
EP1759437A1 (de) 2004-06-23 2007-03-07 Huber+Suhner Ag Breitband-patchantenne
GB0414272D0 (en) 2004-06-25 2004-07-28 Cellpep Sa OsK1 derivatives
WO2006014493A2 (en) * 2004-07-07 2006-02-09 The Research Foundation Of State University Of New York Stor Mechanically activated channel blocker
WO2006036834A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
CN101072577B (zh) 2004-10-07 2013-12-18 加利福尼亚大学董事会 ShK毒素类似物及其在选择性抑制Kv1.3钾通道中的应用
EP1809290A2 (en) 2004-11-03 2007-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Pyrimidine derivatives as ion channel modulators and methods of use
US20060199812A1 (en) 2005-01-24 2006-09-07 Amgen Inc. Method of conjugating aminothiol containing molecules to vehicles
WO2006101629A2 (en) 2005-02-17 2006-09-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated SODIUM CHANNEL PROTEIN TYPE III α-SUBUNIT SPLICE VARIANT
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
GB0517487D0 (en) 2005-08-26 2005-10-05 Isis Innovation Antibodies
US7972813B2 (en) 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
US20120087969A1 (en) 2005-11-08 2012-04-12 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Mu-Conotoxin Peptides and Use Thereof as a Local Anesthetic
WO2007109324A2 (en) * 2006-03-21 2007-09-27 Xenon Pharmaceuticals, Inc. Potent and selective nav 1.7 sodium channel blockers
JP4742345B2 (ja) * 2006-06-20 2011-08-10 独立行政法人産業技術総合研究所 カルシウムチャネルを遮断するグラモストラ・スパチュラタ由来のポリペプチドおよびその遺伝子
WO2007149542A2 (en) 2006-06-20 2007-12-27 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Antimicrobial kinocidin compositions and methods of use
WO2008088422A2 (en) 2006-10-25 2008-07-24 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
WO2009033027A2 (en) 2007-09-05 2009-03-12 Medtronic, Inc. Suppression of scn9a gene expression and/or function for the treatment of pain
CN101480393A (zh) * 2008-01-07 2009-07-15 云南昊邦制药有限公司 草乌甲素作为制备治疗Nav1.7疼痛病症药物的应用
US8674071B2 (en) 2008-01-30 2014-03-18 Baylor College Of Medicine Peptides that target dorsal root ganglion neurons
BRPI0924225A2 (pt) 2009-02-02 2016-10-11 Chromocell Corp linhagens de células que expressam nav e métodos de uso
JPWO2010104115A1 (ja) 2009-03-10 2012-09-13 独立行政法人産業技術総合研究所 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法
WO2010104114A1 (ja) * 2009-03-10 2010-09-16 独立行政法人産業技術総合研究所 ポリペプチドライブラリーを調製する方法
EP2432488A4 (en) 2009-03-20 2014-01-08 Amgen Inc SELECTIVE AND POWERFUL KV1.3 PEPTIDE INHIBITORS
BR112012005860A2 (pt) 2009-09-15 2017-01-31 Alomone Preclinical Ltd peptídeos isolados do veneno de aranha, e usos dos mesmos
GB0922435D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucb Pharma Sa Method
GB0922434D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucb Pharma Sa antibodies and fragments thereof
WO2011051350A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Ucb Pharma S.A. Function modifying nav 1.7 antibodies
US8871996B2 (en) 2010-06-09 2014-10-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing human voltage-gated sodium channels
WO2012004664A2 (en) 2010-07-07 2012-01-12 Purdue Pharma L.P. Analogs of sodium channel peptide toxin
JP6771282B2 (ja) 2012-05-18 2020-10-21 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド フエントキシンｉｖ変異体及びその使用方法

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Publication number Publication date
SG193434A1 (en) 2013-10-30
AR088413A1 (es) 2014-06-11
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PH12013501865A1 (en) 2014-01-06
WO2012125973A2 (en) 2012-09-20
MA35385B1 (fr) 2014-09-01
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JP2017031157A (ja) 2017-02-09
KR20140145947A (ko) 2014-12-24
US9796766B2 (en) 2017-10-24
PE20140593A1 (es) 2014-05-10
CO6821886A2 (es) 2013-12-31
US20160304570A1 (en) 2016-10-20
BR112013023674A2 (pt) 2016-12-13
TW201300407A (zh) 2013-01-01
MX2013010497A (es) 2013-12-16
AU2012228990A1 (en) 2013-09-19

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