JP2012521360A - Ｋｖ１．３の選択的かつ強力なペプチド阻害剤 - Google Patents

Abstract

ＳｈＫ、ＨｍＫおよびＡＥＴＸ−Ｋに関連した毒素ペプチド類似体ならびにそれらを薬学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物または薬剤を含む実施形態を含めた、配列番号４のアミノ酸配列を有する組成物またはその薬学的に許容される塩が開示される。いくつかの実施形態には半減期延長部分が含まれる。当該組成物を用いた、多発性硬化症の症状再発を予防または軽減する方法および自己免疫障害の治療法も開示される。

Description

本願は、２００９年３月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／２１０，５９４号の利益を主張するものであり、上記明細書はその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本願は、２０１０年３月１９日にＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出されたＡＳＣＩＩ「ｔｘｔ」に準拠した配列表を含み、これは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．第１．８２１（ｃ）条および第１．８２１（ｅ）条により要求されるコンピュータ読取り可能媒体形態（ＣＲＦ）および紙コピーの両方の役割を果たし、かつその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１０年３月１８日に作成された「ｔｘｔ」ファイルの名称は「Ａ−１４５５−ＷＯ−ＰＣＴ−ＳｅｑＬＩｓｔ０３１８１０−４８２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、大きさは３４８ｋｂである。

本願を通して、様々な刊行物が丸括弧または角括弧内に引用される。こうした刊行物の開示は、本発明が係る最先端技術をより十分に説明するために、ここにおいてその内容全体が参照により本願に組み込まれる。

本発明は、生化学的技術、特に治療用のペプチドおよびコンジュゲートに関する。

イオンチャネルは、膜を挟んで低分子の無機イオンの交換を可能にする多様な分子グループである。すべての細胞は、機能するためにイオンチャネルを必要とするが、これは特に、神経系および心臓に存在する細胞などの興奮性細胞に当てはまる。イオンチャネルにより編成される電気的シグナルは、脳による思考、心臓の拍動および筋収縮を制御する。イオンチャネルは細胞容積を調節する役割があり、かつ多種多様なシグナル伝達プロセスを制御する。

イオンチャネルファミリーには、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣａ２＋陽イオンチャネルおよびＣｌ−陰イオンチャネルがある。全体として、イオンチャネルはリガンド依存性または電位依存性として区別される。リガンド依存性チャネルには、細胞外および細胞内の両リガンド依存性チャネルがある。細胞外リガンド依存性チャネルには、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）受容体、グリシンおよびγ−酪酸受容体（ＧＡＢＡ）、ならびにカイニン酸、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体を含めたグルタミン酸依存性チャネルがある。（ＨａｒｔｅおよびＯｕｚｏｕｎＩｓ（２００２），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。細胞内リガンド依存性チャネルには、環状ヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）、Ｃａ^２＋およびＧタンパク質により活性化されるチャネルがある。（ＨａｒｔｅおよびＯｕｚｏｕｎＩｓ（２００２），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。電位依存性イオンチャネルは、無機イオン種に対するその選択性により分類され、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび塩素イオンチャネルが含まれる（ＨａｒｔｅおよびＯｕｚｏｕｎＩｓ（２００２），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。

電位依存性チャネルの分類に関する統一された命名法が近年提出された。（Ｃａｔｔｅｒａｌｌら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７３−４；Ｇｕｔｍａｎら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５、５８３−６；Ｃａｔｔｅｒａｌｌら（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７９−８１；Ｃａｔｔｅｒａｌｌら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７５−８；Ｈｏｆｍａｎｎら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５８７−９；Ｃｌａｐｈａｍら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．５５：５９１−６；Ｃｈａｎｄｙ（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ ３５２：２６；ＧｏｌｄＩｎら（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ ２８：３６５−８；Ｅｒｔｅｌら（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ ２５：５３３−５）。Ｋ^＋チャネルは、これまでに記載されている中で、最大でかつ最も特徴のわかっているイオンチャネルファミリーを構成している。カリウムチャネルはさらに３つの大きなグループ：６回膜貫通型（６ＴＭ）Ｋ^＋チャネル、２ＴＭ−２ＴＭ／漏洩Ｋ^＋チャネルおよび２ＴＭ／ＫＩｒ内向き整流性チャネルに分けられる。（Ｔａｎｇら（２００４），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＰｈｙｓＩｏｌ．６６、１３１−１５９）。上記３つのグループは、配列類似性に基づくファミリーにさらに細分される。（Ｋｖ１〜６、Ｋｖ８〜９）、ＥＡＧ（カリウムチャネル、電位依存性、サブファミリーＨ、メンバー１）、ＫＱＴ（カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー１）およびＳｌｏ（ＢＫＣａ；カリウムチャネル、カルシウム依存性、大コンダクタンス、サブファミリーＭ、アルファメンバー１）を含めた電位依存性Ｋ^＋チャネルは、６ＴＭグループのファミリーメンバーである。２ＴＭ−２ＴＭグループは、ＴＷＩＫ（カリウムチャネル、サブファミリーＫ、メンバー１）、ＴＲＥＫ（カリウムチャネル、サブファミリーＫ、メンバー２）、ＴＡＳＫ（カリウムチャネル、サブファミリーＫ、メンバー３）、ＴＲＡＡＫ（カリウムチャネル、サブファミリーＫ、メンバー４）およびＴＨＩＫ（カリウムチャネル、サブファミリーＫ、メンバー１３、タンデムポアドメインハロタン抑制性カリウムチャネルとしても知られる）を含むのに対し、２ＴＭ／ＫＩｒグループはＫＩｒ１−７からなる。２つのさらなるイオンチャネルのクラスには、内向き整流性カリウム（ＩＲＫ）およびＡＴＰ依存性プリン作動性（Ｐ２Ｘ）チャネルがある。（ＨａｒｔｅおよびＯｕｚｏｕｎＩｓ（２００２），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。

様々な生物により産生される毒素ペプチドは、イオンチャネルを標的とするように進化してきた。ヘビ、サソリ、クモ、ハチ、マキガイおよびイソギンチャクは、強力かつ選択的にイオンチャネルおよび受容体を標的とする低分子の生物活性毒素ペプチドまたは「毒素」の豊富な供給源として役立ち得る毒を産生する生物のいくつかの例である。多くの場合、これらの毒素ペプチドは、チャネルポアと結合してイオン伝導通路を物理的にブロックすることにより、イオンチャネルの強力なアンタゴニストまたは阻害剤として進化してきた。他のいくつかの例では、タランチュラ毒素ペプチドのように、ペプチドがポアの外側の部位（例えば、電位感知ドメイン）と結合することにより、チャネル機能に拮抗することが見出されている。

天然の毒素ペプチドは、通常約２０〜約８０個のアミノ酸の長さであり、２〜５個のジスルフィド結合を含み、かつ非常に小型の構造を形成する。毒素ペプチド（例えば、サソリ、イソギンチャクおよびイモガイの毒に由来する）が単離され、イオンチャネルに対するその影響が特徴付けられている。このようなペプチドは、効力、安定性および選択性の重要な問題への対処に特によく適した比較的少数の構造的枠組みから進化したと思われる。（例えば、ＤａｕｐｌａＩｓら，Ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔＩｏｎ ｏｆ ａｎＩｍａｌ ｔｏｘＩｎｓ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔＩｏｎ ｏｆ ａ ｄＩａｄ ｏｆ ｆｕｎｃｔＩｏｎａｌ ｒｅｓＩｄｕｅｓ Ｉｎ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ−ｂｌｏｃｋＩｎｇ ｔｏｘＩｎｓ ｗＩｔｈ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（７）：４３０２−０９（１９９７）；ＡｌｅｓｓａｎｄｒＩ−Ｈａｂｅｒら，ＭａｐｐＩｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔＩｏｎａｌ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＢｇＫ ｏｎ Ｋｖ１．１，Ｋｖ１．２，ａｎｄ Ｋｖ１．３，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５６５３−６１（１９９９）を参照されたい）。例えば、サソリおよびイモガイ毒素ペプチドの大部分は、１０〜４０個のアミノ酸および５個以下のジスルフィド結合を含み、多くの場合タンパク質分解に対して耐性である、極めて小型で限定された構造（微小タンパク質）を形成している。コノトキシンおよびサソリ毒素ペプチドは、そのジスルフィド結合およびペプチドフォールディングに基づく多数のスーパーファミリーに分けることができる。これらの多くの溶液構造が核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により決定されており、そこではその小型の構造が示され、そのファミリーのフォールディングパターンの保存が確認されている（例えば、Ｔｕｄｏｒら，ＩｏｎＩｓａｔＩｏｎ ｂｅｈａｖＩｏｕｒ ａｎｄ ｓｏｌｕｔＩｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔＩｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ．２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８）；ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄＩｓｕｌｆＩｄｅ ｂｏｎｄｓ Ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋＩｎｇ ａｃｔＩｖＩｔｙ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，ＢＩｏｃｈｅｍ． ３８（４４）：１４５４９−５８（１９９９）；ＪａｒａｖＩｎｅら，Ｔｈｒｅｅ−ｄＩｍｅｎｓＩｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｏｘＩｎ ＯＳＫ１ ｆｒｏｍ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ｖｅｎｏｍ，ＢＩｏｃｈｅｍ．３６（６）：１２２３−３２（１９９７）；ｄｅｌ ＲＩｏ−ＰｏｒｔＩｌｌｏら；ＮＭＲ ｓｏｌｕｔＩｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｎ１２，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔＩｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＭｅｘＩｃａｎ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ＣｅｎｔｒｕｒｏＩｄｅｓ ｎｏｘＩｕｓ ｗＩｔｈ ａ ｔｙｐＩｃａｌ β−ｔｏｘＩｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｕｔ ｗＩｔｈ α−ｌＩｋｅ ｐｈｙｓＩｏｌｏｇＩｃａｌ ａｃｔＩｖＩｔｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ． ２７１（１２）：２５０４−１６（２００４）；ＰｒｏｃｈｎＩｃｋａ−Ｃｈａｌｕｆｏｕｒら，ＳｏｌｕｔＩｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄＩｓｃｒｅｐＩｎ，ａ ｎｅｗ Ｋ^＋−ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋＩｎｇ ｐｅｐｔＩｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ α−ＫＴｘ１５ ｓｕｂｆａｍＩｌｙ，ＢＩｏｃｈｅｍ．４５（６）：１７９５−１８０４（２００６））。保存されたジスルフィド構造は、その毒素ファミリーの個々の薬理学的活性も反映し得る。（ＮＩｃｋｅら（２００４），Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ．２７１：２３０５−１９，表１；Ａｄａｍｓ（１９９９），Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｒｅｓ．４６：２１９−３４）。例えば、α−コノトキシンは、明確に定義される４つのシステイン／２つのジスルフィドループの構造を有し（Ｌｏｕｇｈｎａｎ，２００４）、ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害するする。これに対し、ω−コノトキシンは６つのシステイン／３つのジスルフィドループの共通構造を有し（ＮＩｅｌｓｏｎ，２０００）、カルシウムチャネルをブロックする。毒素の構造サブセットは、電位依存性またはカルシウム依存性のどちらかのカリウムチャネルを阻害するように進化してきた。

毒素ペプチドは、特定のイオンチャネルを強力かつ比較的高い選択性でブロックすることから、イオンチャネルの薬理学を研究するためのツールとして長年使用されてきた。心臓、筋肉および脳に存在する細胞などの興奮性の細胞および組織の他に、イオンチャネルは免疫細胞のような非興奮性細胞にとっても重要である。したがって、Ｋｖ１．３およびＩＫＣａ１のようなカリウムチャネルはリンパ球におけるカルシウムシグナル伝達経路を間接的に制御するため、特にこれらのチャネルの阻害による様々な免疫障害治療のための毒素ペプチドの潜在的な治療的有用性が考えられてきた。［例えば、Ｋｅｍら，ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ，米国特許第６，０７７，６８０号；Ｌｅｂｒｕｎら，ＮｅｕｒｏｐｅｐｔＩｄｅｓ ｏｒＩｇＩｎａｔＩｎｇ Ｉｎ ｓｃｏｒｐＩｏｎ，米国特許第６，６８９，７４９号；Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；ＰｏｓｓａｎＩ Ｐｏｓｔａｙら，ＶＭ２３ ａｎｄ ＶＭ２４，ｔｗｏ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ｐｅｐｔＩｄｅｓ ｔｈａｔ ｂｌｏｃｋ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ（ｓｕｂｔｙｐｅ ｋｖ１．３）ｗＩｔｈ ｈＩｇｈ ｓｅｌｅｃｔＩｖＩｔｙ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ Ｉｎ ｖＩｖｏ ＤＴＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｉｎ ｒａｔｓ，国際公開第２００８／１３９２４３号；Ｍｏｕｈａｔら，Ｋ^＋ ｃｈａｎｎｅｌ ｔｙｐｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔＩｃ ＯＳＫ１，ａ ｔｏｘＩｎ ｆｒｏｍ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ｖｅｎｏｍ，ＢＩｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８５：９５−１０４（２００５）；Ｍｏｕｈａｔら，ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌ ｐｒｏｆＩｌＩｎｇ ｏｆ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｔｏｘＩｎ １ ａｎａｌｏｇｓ ｗＩｔｈ ａ ｔｒＩｍｍｅｄ Ｎ−ｔｅｒｍＩｎａｌ ｄｏｍａＩｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：３５４−６２（２００６）；Ｍｏｕｈａｔら，ＯｓＫ１ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ，国際公開第２００６／００２８５０ Ａ２号；Ｂ．Ｓ．ＪｅｎｓｅｎらＴｈｅ Ｃａ^２＋−ａｃｔＩｖａｔｅｄ Ｋ^＋ Ｃｈａｎｎｅｌ ｏｆ ＩｎｔｅｒｍｅｄＩａｔｅ Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ？，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２：４０１−４２２（２００１）；Ｒａｕｅｒら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕＩｄｅｄ ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔＩｏｎ ｏｆ カリブドトキシン ＹＩｅｌｄｓ ａｎ Ａｎａｌｏｇ Ｔｈａｔ ＳｅｌｅｃｔＩｖｅｌｙ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａ^２＋−ａｃｔＩｖａｔｅｄ ｏｖｅｒ Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ Ｋ^＋ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２０１−１２０８（２０００）；Ｃａｓｔｌｅら，ＭａｕｒｏｔｏｘＩｎ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ ＩｎｔｅｒｍｅｄＩａｔｅ Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ Ｃａ^２＋−ＡｃｔＩｖａｔｅｄ ＰｏｔａｓｓＩｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：４０９−４１８（２００３）；Ｃｈａｎｄｙら，Ｋ^＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃＩｆＩｃ ＩｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔＩｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ＳｃＩｅｎｃｅｓ ２５：２８０−２８９（２００４）；ＬｅｗＩｓおよびＧａｒｃＩａ，ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ＰｏｔｅｎｔＩａｌ ｏｆ Ｖｅｎｏｍ ＰｅｐｔＩｄｅｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ ＤＩｓｃｏｖ．２：７９０−８０２（２００３）；Ｈａｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓＩｓ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｄｅｓＩｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｅｌ，ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２７）：１９０５８−６５（２００８）］。

リンパ球におけるカルシウム動員は、炎症性応答の活性化において重要な経路であることが知られている［Ｍ．Ｗ．ＷＩｎｓｌｏｗら（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ ＯｐＩｎＩｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２９９］。Ｔ細胞は他の細胞と比べて、細胞内カルシウムレベルの増加に対する特有の感度を示し、イオンチャネルが直接的にも間接的にもこのプロセスを制御する。イノシトール三リン酸（ＩＰ３）は、カルシウムシグナル伝達経路を活性化する天然のセカンドメッセンジャーである。ＩＰ３は、リガンドによるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化後に産生され、その細胞内受容体（チャネル）との結合の際に細胞内カルシウム貯蔵の放出を引き起こす。小胞体は１つの鍵となるカルシウムストアである。筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の阻害剤であるタプシガルギンもまた、リンパ球における細胞内貯蔵の放出およびカルシウムシグナル伝達経路の活性化を引き起こす。したがって、タプシガルギンは、Ｔ細胞におけるカルシウムシグナル伝達経路の特異的刺激剤として使用し得る。Ｔ細胞における細胞内カルシウム貯蔵の放出は、細胞表面上のカルシウムチャネル活性化を引き起こし、細胞外からカルシウムを流入させることが知られている。Ｔ細胞上のこのストア作動性カルシウムチャネル（ＳＯＣＣ）は「ＣＲＡＣ」（カルシウム放出依存性チャネル）と呼ばれ、このチャネルを介した持続的なカルシウム流入は、完全なＴ細胞活性化に重要であることが知られている［Ｓ．Ｆｅｓｋｅら（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２，６５１およびＮ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら（２００４）ＰＮＡＳ １０１，８９６９］。Ｔ細胞内への継続的なカルシウム流入を維持するためには、細胞膜がカリウムイオン流出を介した過分極状態でなければならないと長年理解されてきた。Ｔ細胞では、カリウム流出は電位依存性カリウムチャネルＫｖ１．３およびカルシウム依存性カリウムチャネルＩＫＣａ１により行われる［Ｋ．Ｇ．Ｃｈａｎｄｙら（２００４）ＴＩＰＳ ２５，２８０］。したがって、これらのカリウムチャネルは、ＣＲＡＣを介した持続的なカルシウム流入を可能にする不可欠なカリウム流出を可能にすることにより、カルシウムシグナル伝達経路を間接的に制御する。

細胞内カルシウムの持続的な増加は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核内因子）、ＮＦ−ｋＢ（Ｂ細胞内のカッパ軽鎖遺伝子エンハンサー核内因子）および［ＡＰ−１アクチベータータンパク質１；ＱｕＩｎｔａｎａ−Ａ（２００５）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．−Ｅｕｒ．Ｊ．ＰｈｙｓＩｏｌ．４５０，１］の活性化を導く経路を含めた、Ｔ細胞における様々な経路を活性化する。これらの事象は、細胞の大きさおよび膜組成の変化、細胞表面エフェクター分子の活性化、サイトカイン産生ならびに増殖を含めた、様々なＴ細胞応答を引き起こす。いくつかのカルシウム感受性分子は、カルシウムシグナルを伝達し細胞応答を編成する。カルモジュリンはカルシウムと結合する分子の１つであるが、他にも多くものが同定されている（Ｍ．Ｊ．ＢｅｒｒＩｄｇｅら（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．ＢＩｏｌ．４，５１７）。カルシウム−カルモジュリン依存性ホスファターゼであるカルシニューリンは、細胞内カルシウムの持続的な増加により活性化され、細胞質ＮＦＡＴを脱リン酸化する。脱リン酸化されたＮＦＡＴは直ちに核へ移動し、Ｔ細胞活性化にとって重要な転写因子として認められている（Ｆ．ＭａｃＩａｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，４７２およびＮ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら（２００４）ＰＮＡＳ １０１，８９６９）。シクロスポリンＡ（ネオーラル、ＳａｎｄＩｍｍｕｎｅ）およびＦＫ５０６（タクロリムス）のようなカルシニューリン阻害剤は、固形臓器移植後の拒絶を生じる障害のような重篤な免疫障害治療の主軸である（Ｉ．Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＰＩｎｔｏら（２００５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３７，１７１３およびＤ．Ｒ．Ｊ．Ｋｕｙｐｅｒｓ（２００５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ＩｎｔｅｒｎａｔＩｏｎａｌ １８，１４０）。ネオーラルは、移植拒絶反応、重症関節リウマチ（Ｄ．Ｅ．Ｙｏｃｕｍら（２０００）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３９，１５６）および重症乾癬（Ｊ．Ｋｏｏ（１９９８）ＢｒＩｔＩｓｈ Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３９，８８）の治療用に採用されている。カルシニューリン阻害剤が炎症性腸疾患（ＩＢＤ；Ｂａｕｍｇａｒｔ ＤＣ（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍａｒ ３０；印刷前電子出版）、多発性硬化症（Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９０）２７，５９１）および喘息（Ｓ．ＲｏｈａｔａｇＩら（２０００）Ｊ．ＣｌＩｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０，１２１１）の治療において有用であり得ることを示す前臨床および臨床データも提供されている。狼瘡は、ヘルパーＴ細胞の活性化をブロックする薬剤が有用であり得るもう１つの障害である。Ｔ細胞でのＮＦＡＴ調節におけるカルシニューリンの重要性にもかかわらず、カルシニューリンは他の組織（例えば、腎臓）でも発現され、機序に基づく毒性によりシクロスポリンＡおよびＦＫ５０６の安全域は狭い。腎毒性および高血圧症が、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６の有望性を制限している共通の副作用である。毒性に関する懸念から、カルシニューリン阻害剤は、ほとんどが重篤な免疫疾患の治療にのみ使用されている（ＢＩｓｓｏｎｎｅｔｔｅ−Ｒら（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５４，４７２）。Ｋｖ１．３阻害剤は、免疫障害の治療のためのカルシニューリン阻害剤のより安全な代替物となる。これは、Ｋｖ１．３もＴ細胞におけるカルシウムシグナル伝達経路を制御するために作動するが、カルシニューリン阻害剤のものとは異なる機序を介して作動するからであり、Ｋｖ１．３の発現および機能に関する証拠は、様々な非リンパ系の細胞および組織においても機能するカルシニューリンに比べ、Ｋｖ１．３がＴ細胞生物学でのより限定された役割を有することを示している。

免疫細胞におけるカルシウム動員は、重要な炎症メディエーターであるサイトカインのインターロイキン２（ＩＬ−２）およびインターフェロンガンマ（本明細書では、互換的にＩＦＮｇ、ＩＦＮ−ｇまたはＩＦＮ−γと呼ぶ）の産生も活性化する。ＩＬ−２は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加および分化から、Ｂ細胞による増殖および抗体分泌の増強、ＮＫ細胞の活性化にわたる様々な生物学的応答を誘導する［Ｓ．Ｌ．ＧａｆｆｅｎおよびＫ．Ｄ．ＬＩｕ（２００４）ＣｙｔｏｋＩｎｅ ２８，１０９］。ＩＬ−２分泌はＴ細胞活性化後に直ちに起こり、Ｔ細胞はこのサイトカインの主要な起点となる。活性化のすぐ後に、Ｔ細胞上の高親和性ＩＬ−２受容体（ＩＬ２−Ｒ）が上方制御され、ＩＬ−２に応答して増殖する能力をＴ細胞に付与する。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）はすべて、活性化の際にＩＦＮｇを分泌することができる。Ｔ細胞は、適応免疫応答の仲介においてＩＦＮｇ産生の主要な起点となるのに対し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＡＰＣは、恐らく感染に対する宿主防御の間の重要な起点なのであろう［Ｋ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒら（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．ＢＩｏｌ．７５，１６３］。元来マクロファージ活性化因子と呼ばれていたＩＦＮｇは、単球、マクロファージおよび樹状細胞による抗原の処理および提示を上方制御する。ＩＦＮｇは、多くの細胞種における多様な生物学的作用を仲介し［Ｕ．Ｂｏｅｈｍら（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，７４９］、それには増殖および分化、ＮＫ細胞活性の増強、ならびにＢ細胞の免疫グロブリン産生およびクラススイッチングの調節が含まれる。

ＣＤ４０Ｌ（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー、メンバー５）は、カルシウム動員後に活性化Ｔ細胞上で発現されるもう１つのサイトカインであり、Ｂ細胞上のその受容体との結合の際に、Ｂ細胞の胚中心形成、Ｂ細胞分化および抗体アイソタイプスイッチングを可能にする重要な補助となる。Ｂ細胞上でのＣＤ４０（Ｂ細胞関連分子ＣＤ４０；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー５としても知られる）のＣＤ４０Ｌ仲介による活性化は、免疫グロブリン（Ｉｇ）産生Ｂ細胞の十分な分化およびクローン増殖を誘導し得る［Ｓ．Ｑｕｅｚａｄａら（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２，３０７］。ＣＤ４０受容体は樹状細胞上にも見られ、ＣＤ４０Ｌシグナル伝達は樹状細胞の活性化および分化も仲介する。ＣＤ４０Ｌ結合によりＢ細胞および樹状細胞の抗原提示能力が促進され、このことは適応免疫におけるこのサイトカインの広範な役割をさらに示している。ＣＤ４０シグナル伝達のＢ細胞生物学に対する重要な役割を考慮し、全身性エリテマトーデス（組織内での抗体複合体の沈着、炎症および器官損傷を特徴とする障害）の治療における有用性に関して、ＣＤ４０Ｌに対する中和抗体が前臨床および臨床研究において調べられている［Ｊ．ＹａｚｄａｎｙおよびＪ ＤａｖＩｓ（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３，３７７］。

Ｋｖ１．３およびＩＫＣａ１カリウムチャネルならびにＴ細胞の主要なカルシウム流入チャネルであるＣＲＡＣの低分子阻害剤も免疫障害を治療するために開発されてきた（Ａ．ＳｃｈｍＩｔｚら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６８，１２５４；Ｋ．Ｇ．Ｃｈａｎｄｙら（２００４）ＴＩＰＳ ２５，２８０；Ｈ．Ｗｕｌｆｆら（２００１）Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３２０４０；Ｃ．ＺＩｔｔら（２００４）Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１２４２７）が、上記標的のいくつかに対して選択性を有する低分子物質を入手することは困難であった。

長いインビボ活性を有する選択的および強力なペプチドＫｖ１．３阻害剤を同定することが長期にわたる難題であった。毒素ペプチドの産生は有毒生物における複雑なプロセスであり、合成的にはさらにより複雑なプロセスである。毒素ペプチドは、その保存されたジスルフィド構造および効率的な酸化的リフォールディングの必要性から、合成することが困難である。毒素ペプチドはイオンチャネルの高度に選択的な薬理学的阻害剤として長年使用されてきたが、毒素ペプチドの合成およびリフォールディングのコストが高いことならびにそのインビボ半減期が短いことにより、これらのペプチドを治療法として探求することが妨げられてきた。

インビボ半減期が約３０分と短く、かつヒト神経系において発現されるＫｖ１．３イオンチャネルおよびＫｖ１．１イオンチャネルの両方の強力な阻害剤である３５残基ＳｈＫペプチドの類似体に多くの焦点が当てられてきた。（Ｅ．ｇ．，Ｈａｒｖｅｙら，Ａ ｔｈｒｅｅ−ｒｅｓＩｄｕｅ，ｃｏｎｔＩｎｕｏｕｓ ｂＩｎｄＩｎｇ ｅｐＩｔｏｐｅ ｐｅｐｔＩｄｏｍＩｍｅｔＩｃ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ａｓ ａ Ｋｖ１．３ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ，ＢＩｏｏｒｇａｎＩｃ ＆ ＭｅｄＩｃＩｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５：３１９３−９６（２００５）；ＬａｎＩｇａｎら，ＤｅｓＩｇｎｅｄ ｐｅｐｔＩｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，ＢＩｏｃｈｅｍ．４０：１５５２８−３７（２００１））。ＳｈＫの２２位がＫｖ１．３選択性を付与する鍵となる残基として特定されており、ＳｈＫのＫｖ１．３との結合は、Ｌｙｓ９およびＡｒｇ１１における置換に影響される。例えば、［Ｄａｐ２２］ＳｈＫ（配列番号３１７；ｈＫ−Ｄａｐ２２としても知られる）は、Ｋｖ１．３のピコモル範囲の阻害剤であり、マウスＫｖ１．３に対してマウスＫｖ１．１の３５倍の選択性が報告されている。（例えば、Ｋｅｍら，ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ，米国特許第６，０７７，６８０号を参照されたい）。［Ｄａｐ２２］ＳｈＫは、平衡結合アッセイではなく細胞全膜電位固定法により測定した場合に、ヒトＫ（ｖ）１．３に対してＫ（ｖ）１．１の約２０倍の選択性を示すことが報告されている（ＭＩｄｄｌｅｔｏｎ ＲＥ，ら，ＳｕｂｓｔＩｔｕｔＩｏｎ ｏｆ ａ ｓＩｎｇｌｅ ｒｅｓＩｄｕｅ Ｉｎ ＳｔＩｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ ｐｅｐｔＩｄｅ，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌ ｐｒｏｆＩｌｅ．ＢＩｏｃｈｅｍＩｓｔｒｙ．２００３ Ｎｏｖ ２５ ４２（４６）：１３６９８−７０７）。ＳｈＫ−Ｄａｐ２２分子は、全細胞パッチクランプ電気生理学による測定で、天然のＳｈＫと同様の効力を有し約２３ｐＭのＩＣ_５０でＫｖ１．３を強力にブロックすることが報告された（Ｋａｌｍａｎら，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ａ ｐｏｔｅｎｔ Ｋｖ１．３−ｓｐｅｃＩｆＩｃ ＩｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓＩｖｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４９）：３２６９７−７０７（１９９８））。

Ｎ末端にリン酸化チロシン（「ｐＹ」）または他の陽イオン荷電された化学物質またはフルオレセイン修飾を有する他のＳｈＫ類似体では、いくらか向上したｍＫｖ１．１を上回るｍＫｖ１．３選択性が得られることが報告されている。一例として、ＳｈＫペプチドのＮ末端におけるリン酸化チロシン−ＡＥＥＡ修飾を含むＳｈｋ−Ｌ５が挙げられる。（Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；Ｃｈａｎｄｙら，Ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ａｎｄ ｔｈｅＩｒ ｕｓｅｓ Ｉｎ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ＩｎｈＩｂＩｔＩｏｎ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ，国際公開第２００６／０４２１５１ Ａ２号；ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，ＥｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ ａ ｓ表ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ｂｌｏｃｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌ Ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｆａｓｔ Ｆｏｒｗａｒｄ，ｐｕｂｌＩｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ ２，２００９ ａｓ ｄｏＩ：１０．１１２４／ｍｏｌ．１０８．０５２７０４（２００９））。ＡＥＥＡは２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（ジオキサオクタン酸としても知られる）であり、ペプチド化学においてそのＮ−Ｆｍｏｃ保護形態で「リンカー」基として使用されている。ＳｈＫ−Ｌ５においては、このＡＥＥＡ親水性二官能性リンカーを、リン酸化チロシン残基とＳｈＫペプチドの間の非常に短い架橋として使用する。しかし、生化学的観点からすれば、リン酸化チロシン基は代謝的に安定でなく、生理的条件下でリン酸基が切断される可能性がある。Ｂｅｅｔｏｎら（２００５）は、ラットにおいて、ＳｈＫ−Ｌ５が皮下または血管内注射の後に、約５０分の推定循環血中半減期を有し、これは天然のＳｈＫペプチドのものに匹敵することを示した。（例えば、Ｂｅｅｔｏｎら，ＳｅｌｅｃｔＩｖｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｋ^＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｍｅｌＩｏｒａｔｅｓ ｅｘｐｅｒＩｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌＩｔＩｓ，ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍｕｌｔＩｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓＩｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．ＵＳＡ ９８（２４）：１３９４２−４７（２００１）を参照されたい）。したがって、向上した代謝安定性を有するが高い効力も保持するＳｈＫのリン酸化チロシン結合誘導体が探求されている。（Ｃｈａｕｒｄｒａｎ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２８，４０５１−４０５４（２００７））。ごく最近では、Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎらが、リン酸化チロシン−ＡＥＥＡではなくホスホノフェニルアラニン−ＡＥＥＡ−をＮ末端に組み込むＳｈＫ−１９２を記載した。（ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，ＥｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ ａ ｓ表ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ｂｌｏｃｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌ Ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５（４）：７６２−７３（２００９））。

本発明により提供される、切望されるものは、向上したＫｖ１．３阻害活性、インビボ安定性および／または選択性を有するＳｈＫペプチド類似体を含む組成物であり、これは媒体と融合されていても、または共有結合的に媒体とコンジュゲートされていてもよい。

米国特許第６，０７７，６８０号明細書 米国特許第６，６８９，７４９号明細書 国際公開第２００８／１３９２４３号 国際公開第２００６／００２８５０号 国際公開第２００６／０４２１５１号

ＨａｒｔｅおよびＯｕｚｏｕｎＩｓ（２００２），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４ Ｃａｔｔｅｒａｌｌら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７３−４ Ｇｕｔｍａｎら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５、５８３−６ Ｃａｔｔｅｒａｌｌら（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７９−８１ Ｃａｔｔｅｒａｌｌら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７５−８ Ｈｏｆｍａｎｎら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５８７−９ Ｃｌａｐｈａｍら（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ．５５：５９１−６ Ｃｈａｎｄｙ（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ ３５２：２６ ＧｏｌｄＩｎら（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ ２８：３６５−８ Ｅｒｔｅｌら（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ ２５：５３３−５ Ｔａｎｇら（２００４），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＰｈｙｓＩｏｌ．６６、１３１−１５９ ＤａｕｐｌａＩｓら，Ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔＩｏｎ ｏｆ ａｎＩｍａｌ ｔｏｘＩｎｓ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔＩｏｎ ｏｆ ａ ｄＩａｄ ｏｆ ｆｕｎｃｔＩｏｎａｌ ｒｅｓＩｄｕｅｓ Ｉｎ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ−ｂｌｏｃｋＩｎｇ ｔｏｘＩｎｓ ｗＩｔｈ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（７）：４３０２−０９（１９９７） ＡｌｅｓｓａｎｄｒＩ−Ｈａｂｅｒら，ＭａｐｐＩｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔＩｏｎａｌ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＢｇＫ ｏｎ Ｋｖ１．１，Ｋｖ１．２，ａｎｄ Ｋｖ１．３，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５６５３−６１（１９９９） Ｔｕｄｏｒら，ＩｏｎＩｓａｔＩｏｎ ｂｅｈａｖＩｏｕｒ ａｎｄ ｓｏｌｕｔＩｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔＩｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ．２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８） ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄＩｓｕｌｆＩｄｅ ｂｏｎｄｓ Ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋＩｎｇ ａｃｔＩｖＩｔｙ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，ＢＩｏｃｈｅｍ． ３８（４４）：１４５４９−５８（１９９９） ＪａｒａｖＩｎｅら，Ｔｈｒｅｅ−ｄＩｍｅｎｓＩｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｏｘＩｎ ＯＳＫ１ ｆｒｏｍ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ｖｅｎｏｍ，ＢＩｏｃｈｅｍ．３６（６）：１２２３−３２（１９９７） ｄｅｌ ＲＩｏ−ＰｏｒｔＩｌｌｏら；ＮＭＲ ｓｏｌｕｔＩｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｎ１２，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔＩｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＭｅｘＩｃａｎ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ＣｅｎｔｒｕｒｏＩｄｅｓ ｎｏｘＩｕｓ ｗＩｔｈ ａ ｔｙｐＩｃａｌ β−ｔｏｘＩｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｕｔ ｗＩｔｈ α−ｌＩｋｅ ｐｈｙｓＩｏｌｏｇＩｃａｌ ａｃｔＩｖＩｔｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ． ２７１（１２）：２５０４−１６（２００４） ＰｒｏｃｈｎＩｃｋａ−Ｃｈａｌｕｆｏｕｒら，ＳｏｌｕｔＩｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄＩｓｃｒｅｐＩｎ，ａ ｎｅｗ Ｋ＋−ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋＩｎｇ ｐｅｐｔＩｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ α−ＫＴｘ１５ ｓｕｂｆａｍＩｌｙ，ＢＩｏｃｈｅｍ．４５（６）：１７９５−１８０４（２００６） ＮＩｃｋｅら（２００４），Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ．２７１：２３０５−１９，表１ Ａｄａｍｓ（１９９９），Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｒｅｓ．４６：２１９−３４ Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５） Ｍｏｕｈａｔら，Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌ ｔｙｐｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔＩｃ ＯＳＫ１，ａ ｔｏｘＩｎ ｆｒｏｍ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ｖｅｎｏｍ，ＢＩｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８５：９５−１０４（２００５） Ｍｏｕｈａｔら，ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌ ｐｒｏｆＩｌＩｎｇ ｏｆ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｔｏｘＩｎ １ ａｎａｌｏｇｓ ｗＩｔｈ ａ ｔｒＩｍｍｅｄ Ｎ−ｔｅｒｍＩｎａｌ ｄｏｍａＩｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：３５４−６２（２００６） Ｂ．Ｓ．ＪｅｎｓｅｎらＴｈｅ Ｃａ２＋−ａｃｔＩｖａｔｅｄ Ｋ＋ Ｃｈａｎｎｅｌ ｏｆ ＩｎｔｅｒｍｅｄＩａｔｅ Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ？，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２：４０１−４２２（２００１） Ｒａｕｅｒら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕＩｄｅｄ ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔＩｏｎ ｏｆ カリブドトキシン ＹＩｅｌｄｓ ａｎ Ａｎａｌｏｇ Ｔｈａｔ ＳｅｌｅｃｔＩｖｅｌｙ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａ２＋−ａｃｔＩｖａｔｅｄ ｏｖｅｒ Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ Ｋ＋ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２０１−１２０８（２０００） Ｃａｓｔｌｅら，ＭａｕｒｏｔｏｘＩｎ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ ＩｎｔｅｒｍｅｄＩａｔｅ Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ Ｃａ２＋−ＡｃｔＩｖａｔｅｄ ＰｏｔａｓｓＩｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：４０９−４１８（２００３） Ｃｈａｎｄｙら，Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃＩｆＩｃ ＩｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔＩｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ＳｃＩｅｎｃｅｓ ２５：２８０−２８９（２００４） ＬｅｗＩｓおよびＧａｒｃＩａ，ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ＰｏｔｅｎｔＩａｌ ｏｆ Ｖｅｎｏｍ ＰｅｐｔＩｄｅｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ ＤＩｓｃｏｖ．２：７９０−８０２（２００３） Ｈａｎら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓＩｓ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｄｅｓＩｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｅｌ，ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２７）：１９０５８−６５（２００８） Ｓ．Ｆｅｓｋｅら（２００５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２，６５１ Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら（２００４）ＰＮＡＳ １０１，８９６９ Ｋ．Ｇ．Ｃｈａｎｄｙら（２００４）ＴＩＰＳ ２５，２８０ ＱｕＩｎｔａｎａ−Ａ（２００５）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．−Ｅｕｒ．Ｊ．ＰｈｙｓＩｏｌ．４５０，１ Ｍ．Ｊ．ＢｅｒｒＩｄｇｅら（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．ＢＩｏｌ．４，５１７ Ｆ．ＭａｃＩａｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，４７２ Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈら（２００４）ＰＮＡＳ １０１，８９６９ Ｉ．Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＰＩｎｔｏら（２００５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３７，１７１３ Ｄ．Ｒ．Ｊ．Ｋｕｙｐｅｒｓ（２００５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ＩｎｔｅｒｎａｔＩｏｎａｌ １８，１４０ Ｄ．Ｅ．Ｙｏｃｕｍら（２０００）Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３９，１５６ Ｊ．Ｋｏｏ（１９９８）ＢｒＩｔＩｓｈ Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３９，８８ ＩＢＤ；Ｂａｕｍｇａｒｔ ＤＣ（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍａｒ ３０；印刷前電子出版 Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９０）２７，５９１） Ｓ．ＲｏｈａｔａｇＩら（２０００）Ｊ．ＣｌＩｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０，１２１１ ＢＩｓｓｏｎｎｅｔｔｅ−Ｒら（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５４，４７２ Ｓ．Ｌ．ＧａｆｆｅｎおよびＫ．Ｄ．ＬＩｕ（２００４）ＣｙｔｏｋＩｎｅ ２８，１０９ Ｋ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒら（２００４）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．ＢＩｏｌ．７５，１６３ Ｕ．Ｂｏｅｈｍら（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，７４９ Ｓ．Ｑｕｅｚａｄａら（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２，３０７ Ｊ．ＹａｚｄａｎｙおよびＪ ＤａｖＩｓ（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３，３７７ Ａ．ＳｃｈｍＩｔｚら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６８，１２５４ ；Ｈ．Ｗｕｌｆｆら（２００１）Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３２０４０ ；Ｋ．Ｇ．Ｃｈａｎｄｙら（２００４）ＴＩＰＳ ２５，２８０Ｃ．ＺＩｔｔら（２００４）Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１２４２７ Ｅ．ｇ．，Ｈａｒｖｅｙら，Ａ ｔｈｒｅｅ−ｒｅｓＩｄｕｅ，ｃｏｎｔＩｎｕｏｕｓ ｂＩｎｄＩｎｇ ｅｐＩｔｏｐｅ ｐｅｐｔＩｄｏｍＩｍｅｔＩｃ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ａｓ ａ Ｋｖ１．３ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ，ＢＩｏｏｒｇａｎＩｃ ＆ ＭｅｄＩｃＩｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１５：３１９３−９６（２００５）； ＬａｎＩｇａｎら，ＤｅｓＩｇｎｅｄ ｐｅｐｔＩｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，ＢＩｏｃｈｅｍ．４０：１５５２８−３７（２００１） ＭＩｄｄｌｅｔｏｎ ＲＥ，ら，ＳｕｂｓｔＩｔｕｔＩｏｎ ｏｆ ａ ｓＩｎｇｌｅ ｒｅｓＩｄｕｅ Ｉｎ ＳｔＩｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ ｐｅｐｔＩｄｅ，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌ ｐｒｏｆＩｌｅ．ＢＩｏｃｈｅｍＩｓｔｒｙ．２００３ Ｎｏｖ ２５ ４２（４６）：１３６９８−７０７ Ｋａｌｍａｎら，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ａ ｐｏｔｅｎｔ Ｋｖ１．３−ｓｐｅｃＩｆＩｃ ＩｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓＩｖｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４９）：３２６９７−７０７（１９９８） ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，ＥｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ ａ ｓ表ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ｂｌｏｃｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌ Ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｆａｓｔ Ｆｏｒｗａｒｄ，ｐｕｂｌＩｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ ２，２００９ ａｓ ｄｏＩ：１０．１１２４／ｍｏｌ．１０８．０５２７０４（２００９） Ｂｅｅｔｏｎら，ＳｅｌｅｃｔＩｖｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｋ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ａｍｅｌＩｏｒａｔｅｓ ｅｘｐｅｒＩｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌＩｔＩｓ，ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍｕｌｔＩｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓＩｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．ＵＳＡ ９８（２４）：１３９４２−４７（２００１） Ｃｈａｕｒｄｒａｎ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２８，４０５１−４０５４（２００７） ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，ＥｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ ａ ｓ表ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ｂｌｏｃｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌ Ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５（４）：７６２−７３（２００９）

本発明は、以下の式のアミノ酸配列：
Ｘ_ａａ ^１Ｘ_ａａ ^２Ｃｙｓ^３Ｘ_ａａ ^４Ａｓｐ^５Ｘ_ａａ ^６Ｘ_ａａ ^７Ｘ_ａａ ^８Ｘ_ａａ ^９Ｘ_ａａ ^１０Ｘ_ａａ ^１１Ｃｙｓ^１２Ｘ_ａａ ^１３Ｘ_ａａ ^１４Ｘ_ａａ ^１５Ｘ_ａａ ^１６Ｃｙｓ^１７Ｘ_ａａ ^１８Ｘ_ａａ ^１９Ｘ_ａａ ^２０Ｘ_ａａ ^２１Ｘ_ａａ ^２２Ｘ_ａａ ^２３Ｘ_ａａ ^２４Ｘ_ａａ ^２５Ｘ_ａａ ^２６Ｘ_ａａ ^２７Ｃｙｓ^２８Ｘ_ａａ ^２９Ｘ_ａａ ^３０Ｘ_ａａ ^３１Ｃｙｓ^３２Ｘ_ａａ ^３３Ｘ_ａａ ^３４Ｃｙｓ^３５Ｘ_ａａ ^３６Ｘ_ａａ ^３７Ｘ_ａａ ^３８／／配列番号４
またはその薬学的に許容される塩を含む組成物であって：
Ｘ_ａａ ^１Ｘ_ａａ ^２が存在しないか；またはＸ_ａａ ^１が存在せず、かつＸ_ａａ ^２がＧｌｕ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＴｈｒであるか；またはＸ_ａａ ^１がＡｒｇもしくはＡｌａであり、かつＸ_ａａ ^２がＧｌｕ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＴｈｒであり；
Ｘ_ａａ ^４がアルキル、塩基性または酸性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^６がＴｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｌａまたはＬｅｕであり；
Ｘ_ａａ ^７がＬｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＬｙｓであり；
Ｘ_ａａ ^８がＰｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、１−ＮａｌまたはＧｌｕであり；
Ｘ_ａａ ^９がＬｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌまたは酸性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^１０がＳｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＡｌａであり；
Ｘ_ａａ ^１１がＡｒｇ、ＧｌｕまたはＡｌａであり；
Ｘ_ａａ ^１３がＴｈｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、１−ＮａｌまたはＧｌｕであり；
Ｘ_ａａ ^１４がＧｌｎ、Ａｌａまたは酸性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^１５がアルキルまたは芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^１６が、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＡｒｇ以外の塩基性、アルキルまたは芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^１８がＡｌａまたは酸性もしくは塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^１９がＴｈｒ、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^２０がＳｅｒ、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^２１が、ＡｌａまたはＭｅｔ以外のアルキルまたは芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^２２がＬｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ_ａａ ^２３がＴｙｒまたはＡｌａであり；
Ｘ_ａａ ^２４がＡｒｇ、ＬｙｓまたはＡｌａであり；
Ｘ_ａａ ^２５がＴｙｒ、ＬｅｕまたはＡｌａであり；
Ｘ_ａａ ^２６がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａまたは芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^２７がＬｅｕ、Ａｌａ、Ａｓｎまたは芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^２９が１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ａｌａまたは塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^３０がＡｌａまたは酸性もしくは塩基性アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^３１がＴｈｒ、Ａｌａもしく芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^３３がＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、１−ＮａｌまたはＧｌｕであり；
Ｘ_ａａ ^３４がＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓもしく芳香族アミノ酸残基であり；
Ｘ_ａａ ^３６、Ｘ_ａａ ^３７およびＸ_ａａ ^３８がそれぞれ、独立して存在しないか、または独立して中性、塩基性、酸性もしくはＮ−アルキル化アミノ酸残基であり；
かつ：
残基Ｃｙｓ^３と残基Ｃｙｓ^３５の間にジスルフィド結合が存在し；
残基Ｃｙｓ^１２と残基Ｃｙｓ^２８の間にジスルフィド結合が存在し；
残基Ｃｙｓ^１７と残基Ｃｙｓ^３２の間にジスルフィド結合が存在し；かつ
カルボキシ末端残基が任意にアミド化されている
組成物に関する。

１位アミノ酸の左側のＮ末端に、または３８位アミノ酸を越えて右側のＣ末端に、またはその両方に１つ以上の追加のアミノ酸残基が存在する組成物の実施形態が本発明の範囲に包含される。例えば、約１００アミノ酸残基長以下の本発明の毒素ペプチド類似体を含む本発明の組成物は、１位アミノ酸の左側のＮ末端に、または３８位アミノ酸を越えて右側のＣ末端に、またはＮ末端およびＣ末端の両方に存在する１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個またはそれを超える追加のアミノ酸残基を有し得る。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、それぞれ表５および表１１〜１７に記載されている配列番号：１０、１５、１５５、１５７、１６４、１６５、１６７〜１７２、１７９、１９４、１９６、２０３〜２０６、２１１、２１４〜２２５、２３１、２３２、２３３、２３６、２３８、２３９、２４２〜２５４、２６０、２６３および２６５〜２７３から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、それぞれ表５〜１７に記載されている配列番号：１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９〜２９、３１〜３４、３６〜５０、５２、５４、５５、５６、５９、６０、６１、６３、６５〜１００、１３０〜１４０、１４２〜１７４、１７６〜２５４および２５７〜２７４から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む約１００アミノ酸残基長以下の毒素ペプチド類似体であり：
配列番号１３の残基Ｃｙｓ^３と残基Ｃｙｓ^３５の間にジスルフィド結合が存在し；
配列番号１３の残基Ｃｙｓ^１２と残基Ｃｙｓ^２８の間にジスルフィド結合が存在し；
配列番号１３の残基Ｃｙｓ^１７と残基Ｃｙｓ^３２の間にジスルフィド結合が存在し；かつ
カルボキシ末端残基が任意にアミド化されている。

本発明の組成物の実施形態は、コンジュゲートされていない「裸の」ペプチド、または半減期延長部分と直接的もしくは間接的に（すなわち、リンカー部分を介して）、共有結合的に結合されたもしくはコンジュゲートされたペプチドとしての毒素ペプチド類似体を含む。

有用な半減期延長部分の例としては、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃを含めたヒト免疫グロブリンＦｃドメイン）またはそれらの一部分、トランスサイレチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）あるいは分子量約１０００Ｄａ〜約１０００００Ｄａのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が挙げられる。上記および本明細書に記載の他の半減期延長部分は、別々でも組み合わせても有用である。本発明の毒素ペプチド類似体は、天然のＳｈＫまたはＨｍＫ毒素ペプチドに比べて向上した強力、安定性および／またはＫｖ１．１を上回る選択性を有する、強力なＫｖ１．３のペプチド阻害剤である。

本発明はまた、本発明の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、ならびに薬剤製造における組成物の使用に関する。

本発明の組成物は、自己免疫障害の治療法の実施に使用し得る。例えば、本発明の組成物は、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、レスチノシス（ｒｅｓｔＩｎｏｓＩｓ）、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶反応、移植片対宿主病および狼瘡から選択される自己免疫障害の治療に使用し得る。

本発明の組成物は、多発性硬化症の症状再発を予防または軽減する方法の実施にも使用し得る。

本発明の組成物は主に治療剤として意図されるが、治療または診断剤のスクリーニングにおいても有用であり得る。例えば、抗Ｆｃコーティングされたプレートを用いるアッセイでＦｃ−ペプチドを使用することができる。Ｆｃのような半減期延長部分により、不溶性ペプチドが可溶化されて、数多くのアッセイにおいて有用となり得る。

本発明の図面および詳細な説明を考慮すれば、本発明の数多くのさらなる態様および利点が明らかになるであろう。

哺乳動物細胞、細菌または酵母における発現に最適化されたコドンを含む核酸配列によりコードされ得る、成熟ＳｈＫ毒素ペプチド（配列番号１）のアミノ酸配列を示す図である。 ＳｈＫペプチド内で６個のシステインにより形成される３つのジスルフィド結合（−−Ｓ―Ｓ−−）を示す図である。（Ｋｅｍら、米国特許第６，０７７，６８０号）。 ＳｈＫ毒素ペプチドの空間充填立体モデルを示す図である。Ｋｖ１．３結合に重要な鍵となる（本明細書に記載の類似体化に基づく）残基（Ｄ５、Ｉ７、Ｒ１１、Ｓ２０、Ｍ２１、Ｋ２２、Ｙ２３、Ｆ２７）は薄く着色してある。 ＳｈＫ毒素ペプチドの空間充填立体モデルを表す図である。類似体に変化させた場合にＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性が向上するアミノ酸残基は薄く着色してあり、これにはＩ７、Ｓ１０、Ｑ１６、Ｓ２０、Ｓ２６およびＲ２９が含まれる。 電位依存性カリウムチャネル阻害剤スティコダクチラ・ヘリアンサス（ＳｔＩｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ）（ＳｈＫ）と他の近縁のイソギンチャク毒素ファミリーメンバーとの配列比較を示す図である。スティコダクチラ・ヘリアンサス（ＳｔＩｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ）から単離された３５アミノ酸成熟ＳｈＫ毒素（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｐ２９１８７）の配列を、イソギンチャク科の他の近縁メンバーと配列比較して示す。コンセンサス配列および予測されるジスルフィド結合を、高度に保存された残基に陰を施して示す。示されるＨｍＫペプチド毒素配列（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｏ１６８４６）は、大型のイソギンチャク（ラジアンサス・マグニフィカ（ＲａｄＩａｎｔｈｕｓ ｍａｇｎＩｆＩｃａ）；センジュイソギンチャク（ＨｅｔｅｒａｃｔＩｓ ｍａｇｎＩｆＩｃａ））由来の未成熟前駆体のものである。推定シグナルペプチドおよびプロペプチド領域にはそれぞれ一重および二重下線が施されている。成熟ＨｍＫペプチド毒素は、長さが３５アミノ酸で、残基４０〜７４にわたると予測されるであろう。成熟ペプチドが残基４９から８３まで延長している、ミナミウメボシイソギンチャク（ＡｎｅｍｏｎＩａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来の未成熟ＡＥＴＸ−Ｋ毒素前駆体（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｑ０ＥＡＥ５）も示す。予測されるシグナルペプチドおよびプロペプチド領域にはそれぞれ一重および二重下線が施されている。ＡｅＫはウメボシイソギンチャク（ＡｃｔＩｎＩａ ｅｑｕＩｎａ）の毒（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｐ８１８９７）から単離された成熟ペプチド毒素である。ヘビイソギンチャク（ＡｎｅｍｏｎＩａ ｓｕｌｃａｔａ）およびブノドソーマ・グラニュリフェラ（Ｂｕｎｏｄｏｓｏｍａ ｇｒａｎｕｌＩｆｅｒａ）イソギンチャクからそれぞれ単離された成熟ペプチド毒素ＡｓＫＳ（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｑ９ＴＷＧ１）およびＢｇＫ（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｐ２９１８６）の配列を示す。図２Ａは、イソギンチャク毒素ファミリーの他のメンバーであるＨｍＫ（より大きい配列番号２７６（シグナル、プロペプチドおよび成熟ペプチド部分）内の配列番号２（成熟ペプチド））、ＡｅＫ（配列番号５）、ＡｓＫｓ（配列番号６）、ＢｇＫ（配列番号７）およびＡＥＴＸ−Ｋ（より大きい配列番号２７５（シグナル、プロペプチドおよび成熟ペプチド部分））内の配列番号３（成熟ペプチド））に対するＳｈＫ（配列番号１）のアミノ酸配列比較を示す。所与の位置においてすべての配列にわたり保存されているアミノ酸残基を、比較配列の下に掲載する。赤い陰または囲いは、太字の保存されたシステイン残基を表す。黒い陰は、比較配列の所与の位置においてＳｈＫと一致する残基を示す。図２Ｂは、ＳｈＫ、ＢｇＫ、ＨｍＫ、ＡｅＫＳ、ＡＥＴＸ−Ｋ、ＡｓＫおよびＤＴＸ１を含めた、３つのジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ５）を有する成熟毒素ペプチドのファミリーメンバーのジスルフィド結合マップを示す。 電位依存性カリウムチャネル阻害剤スティコダクチラ・ヘリアンサス（ＳｔＩｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ）（ＳｈＫ）と他の近縁のイソギンチャク毒素ファミリーメンバーとの配列比較を示す図である。スティコダクチラ・ヘリアンサス（ＳｔＩｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ）から単離された３５アミノ酸成熟ＳｈＫ毒素（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｐ２９１８７）の配列を、イソギンチャク科の他の近縁メンバーと配列比較して示す。コンセンサス配列および予測されるジスルフィド結合を、高度に保存された残基に陰を施して示す。示されるＨｍＫペプチド毒素配列（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｏ１６８４６）は、大型のイソギンチャク（ラジアンサス・マグニフィカ（ＲａｄＩａｎｔｈｕｓ ｍａｇｎＩｆＩｃａ）；センジュイソギンチャク（ＨｅｔｅｒａｃｔＩｓ ｍａｇｎＩｆＩｃａ））由来の未成熟前駆体のものである。推定シグナルペプチドおよびプロペプチド領域にはそれぞれ一重および二重下線が施されている。成熟ＨｍＫペプチド毒素は、長さが３５アミノ酸で、残基４０〜７４にわたると予測されるであろう。成熟ペプチドが残基４９から８３まで延長している、ミナミウメボシイソギンチャク（ＡｎｅｍｏｎＩａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来の未成熟ＡＥＴＸ−Ｋ毒素前駆体（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｑ０ＥＡＥ５）も示す。予測されるシグナルペプチドおよびプロペプチド領域にはそれぞれ一重および二重下線が施されている。ＡｅＫはウメボシイソギンチャク（ＡｃｔＩｎＩａ ｅｑｕＩｎａ）の毒（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｐ８１８９７）から単離された成熟ペプチド毒素である。ヘビイソギンチャク（ＡｎｅｍｏｎＩａ ｓｕｌｃａｔａ）およびブノドソーマ・グラニュリフェラ（Ｂｕｎｏｄｏｓｏｍａ ｇｒａｎｕｌＩｆｅｒａ）イソギンチャクからそれぞれ単離された成熟ペプチド毒素ＡｓＫＳ（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｑ９ＴＷＧ１）およびＢｇＫ（ＳｗＩｓｓ−ＰｒｏｔｅＩｎ ＡｃｃｅｓｓＩｏｎ＃Ｐ２９１８６）の配列を示す。図２Ａは、イソギンチャク毒素ファミリーの他のメンバーであるＨｍＫ（より大きい配列番号２７６（シグナル、プロペプチドおよび成熟ペプチド部分）内の配列番号２（成熟ペプチド））、ＡｅＫ（配列番号５）、ＡｓＫｓ（配列番号６）、ＢｇＫ（配列番号７）およびＡＥＴＸ−Ｋ（より大きい配列番号２７５（シグナル、プロペプチドおよび成熟ペプチド部分））内の配列番号３（成熟ペプチド））に対するＳｈＫ（配列番号１）のアミノ酸配列比較を示す。所与の位置においてすべての配列にわたり保存されているアミノ酸残基を、比較配列の下に掲載する。赤い陰または囲いは、太字の保存されたシステイン残基を表す。黒い陰は、比較配列の所与の位置においてＳｈＫと一致する残基を示す。図２Ｂは、ＳｈＫ、ＢｇＫ、ＨｍＫ、ＡｅＫＳ、ＡＥＴＸ−Ｋ、ＡｓＫおよびＤＴＸ１を含めた、３つのジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ５）を有する成熟毒素ペプチドのファミリーメンバーのジスルフィド結合マップを示す。 本明細書に記載の類似体のデータに基づく、ＳｈＫの一次アミノ酸配列および各位置での単一アミノ酸置換の効果の概要を示す図である。単一置換類似体のＫｖ１．３活性が減少する傾向にある位置（「＃」）は、残基５、７、１１、２０〜２３および２７である。単一置換類似体のＫｖ１．３の選択性が向上する傾向にある位置（「＄」）は、残基７、１０、１６、２０、２２、２３、２６、２７および２９である。単一置換類似体のＫｖ１．３活性が向上する傾向にある位置（「＊」）は、残基２、４、１０、１５、１８、３０、３１および３４である。 ラットにおいて、０．３および２ｍｇ／ｋｇでの２０ｋＤ−ＰＥＧ−ＳｈＫ（配列番号８）のインビボ半減期をＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７；Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；Ｃｈａｎｄｙら，Ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ａｎｄ ｔｈｅＩｒ ｕｓｅｓ Ｉｎ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ＩｎｈＩｂＩｔＩｏｎ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ，国際公開第２００６／０４２１５１ Ａ２号）と比較した薬物動態データを示す図である。（実施例５および実施例８を参照されたい）。 ２０ｋＤａ ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］Ｓｈｋ（配列番号１６）産物の最終プールのクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜５に以下のように負荷した：ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２分子量タンパク質スタンダード（１０μＬ；レーン１および４）、２．０μｇの還元していない産物（レーン２）、ブランク（レーン３）、２．０μｇの還元した産物（レーン５）。 ２０ｋＤａ ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］Ｓｈｋ（配列番号１６）の純度が＞９９％の純度であることを示す、最終ＰＥＧ−ペプチドプールのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 ２０ｋＤａ分岐ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］Ｓｈｋ（配列番号３１５）産物の最終プールのクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜３に以下のように負荷した：２．０μｇの還元していない産物（レーン１）、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２分子量タンパク質スタンダード（１０μＬ；レーン２）、２．０μｇの還元した産物（レーン３）。 ２０ｋＤａ分岐ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］Ｓｈｋ（配列番号３１５）の純度が＞９８％の純度であることを示す、最終ＰＥＧ−ペプチドプールのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 ２０ｋＤａ ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］Ｓｈｋ−Ａｌａ（配列番号３１６）産物の最終プールのクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜３に以下のように負荷した：２．０μｇの還元していない産物（レーン１）、ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２分子量タンパク質スタンダード（１０μＬ；レーン２）、２．０μｇの還元した産物（レーン３）。 ２０ｋＤａ ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈｋＡｌａ（配列番号３１６）の純度が＞９９％の純度であることを示す、最終ＰＥＧ−ペプチドプールのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 実施例５に記載のように、Ｎα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）がヒトＫｖ１．１電流（図６Ｂ）よりもヒトＫｖ１．３電流（図６Ａ）のブロックにおいて強力であることを、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）の電気生理学により示した図である。 同上 実施例５に記載のように、様々な濃度のＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）のヒトＫｖ１．３電流（図６Ｃ）またはヒトＫｖ１．１電流（図６Ｄ）に対する影響をＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）の電気生理学により示した図である。 同上 実施例１１および１２に記載のように、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号３３８、３３９、３４２）がヒトＫｖ１．１電流（図６Ｆ）よりもヒトＫｖ１．３電流（図６Ｅ）のブロックにおいて強力であることを、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）の電気生理学により示した図である。 同上 実施例９に記載のように、ラットにおいて、Ｋｖ１．３選択性の阻害剤２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）およびより低いＫｖ１．３選択性の２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ分子（配列番号８）のインビボ活性を比較したデータを示す図である。 実施例９に記載のように、媒体または各投与量の２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）もしくは２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ分子（配列番号８）を投与した各ラットのＡＴ−ＥＡＥデータを示す図である。 カニクイザルでの１２週間の薬理学実験において、カニクイザルにＮα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を週１回投与することにより、ＩＬ−４（図９Ａ）およびＩＬ−１７（図９Ｂ）の産生を測定する炎症のエキソビボでのカニクイザル全血ＰＤアッセイを用いた測定で、Ｔ細胞応答の持続的な抑制が得られたことを示す図である。矢印は、週１回の投与が行われたおよその時間を示す。この実験のさらなる詳細は、実施例１０および表４Ｆに記載されている。 同上 実施例１０に記載のように、カニクイザルにおける、週１回の皮下（ＳＣ）投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）後のＮα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の予測血清濃度に対する測定血清濃度を示す図である。週１回の投与後の測定された血清トラフレベル（白四角）は、単回投与の薬物動態データの反復投与モデリングに基づいて予測したレベル（実線）と厳密に一致していた。 実施例１０および図９Ａ〜９Ｃに記載されている１２週間のカニクイザル薬理学実験の間の個体の体重増加を示す図であり；ｘ軸上の矢印はＮα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）のＳＣ投与を示す。 実施例７に記載のように、１００％血漿中にペプチドコンジュゲートを２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで加え、３７℃で様々な時間の間インキュベートすることにより試験した、ラット、カニクイザルおよびヒト血漿中での２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の安定性を示す図である。 実施例５および実施例８に記載のように、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の単回皮下投与（マウスおよびラット、投与量＝２ｍｇ／ｋｇ；ビーグルおよびカニクイザル、投与量＝０．５ｍｇ／ｋｇ）の代表的なＰＫプロファイルを示す図である。 同上 実施例５および実施例８に記載のように、薬物レベルが１週間の間２５ｎＭを超えていたことを示す、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の単回皮下投与（０．５ｍｇ／ｋｇ）の代表的なカニクイザルＰＫプロファイルを示す図である。 特に限定されないが本明細書に記載のＬ５またはＬ１０のような任意のペプチジルリンカー部を介して免疫グロブリンの１つ以上のドメインと融合した薬理学的に活性な毒素ペプチド類似体（短い不規則な曲線）の単位を１つ以上含む、本発明の組成物のいくつかの実施形態の模式的構造を示す図である。これらの模式図はより典型的なＩｇＧ１を示すが、これらは、ヒンジ内の４つのジスルフィド結合および重鎖と軽鎖を連結するジスルフィド結合の異なった配列を有するＩｇＧ２、ならびにＩｇＧ３、ならびにＩｇＧ４にも適用されるものとする。図１２Ａは、毒素ペプチド類似体が一方の免疫グロブリンＦｃドメイン単量体のＣ末端と融合した、一価ヘテロ二量体のＦｃ−毒素ペプチド類似体融合体を表す。 図１２Ｂは、毒素ペプチド類似体が両方の免疫グロブリンＦｃドメイン単量体のＣ末端と融合した、二価ホモ二量体のＦｃ−毒素ペプチド類似体融合体を表す。 図１２Ｃは、毒素ペプチド類似体が一方の免疫グロブリンＦｃドメイン単量体のＮ末端と融合した、一価ヘテロ二量体の毒素ペプチド類似体−Ｆｃ融合体を表す。 図１２Ｄは、毒素ペプチド類似体が両方の免疫グロブリンＦｃドメイン単量体のＮ末端と融合した、二価ホモ二量体の毒素ペプチド類似体−Ｆｃ融合体を表す。 図１２Ｅは、免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）と、免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）と、毒素ペプチド類似体がそのＣ末端と融合した免疫グロブリンＦｃ単量体とを含む、一価ヘテロ三量体のＦｃ−毒素ペプチド類似体／Ａｂを表す。 図１２Ｆは、毒素ペプチド類似体が一方のＨＣ単量体のＣ末端と融合した、一価ヘテロ四量体（ＨＴ）の抗体ＨＣ−毒素ペプチド類似体融合体を表す。 図１２Ｇは、両方のＨＣ単量体のＣ末端上に毒素ペプチド類似体を有する二価ＨＴの抗体Ａｂ ＨＣ−毒素ペプチド類似体融合体を表す。 図１２Ｈは、毒素ペプチド類似体が一方のＬＣ単量体のＮ末端と融合した、一価ＨＴの毒素ペプチド類似体−ＬＣ Ａｂを表す。 図１２Ｉは、毒素ペプチド類似体が一方のＨＣ単量体のＮ末端と融合した、一価ＨＴの毒素ペプチド類似体−ＨＣ Ａｂを表す。 図１２Ｊは、毒素ペプチド類似体が一方のＬＣ単量体のＣ末端と融合した、一価ＨＴのＡｂ ＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体（すなわち、ＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体＋ＬＣ＋２（ＨＣ））を表す。 図１２Ｋは、毒素ペプチド類似体が両方のＬＣ単量体のＣ末端と融合した、二価ＨＴのＡｂ ＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体（すなわち、２（ＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体）＋２（ＨＣ））を表す。 図１２Ｌは、毒素ペプチド類似体が両方のＬＣ単量体および一方のＨＣ単量体のＣ末端と融合した、三価ＨＴのＡｂ ＬＣ−毒素ペプチド類似体／ＨＣ−毒素ペプチド類似体（すなわち、２（ＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体）＋ＨＣ−毒素ペプチド類似体融合体＋ＨＣ）を表す。 図１２Ｍは、毒素ペプチド類似体部分が各ＨＣ単量体の免疫グロブリンＦｃドメインの内部ループ内に挿入された二価抗体を表す。 図１２Ｎは、毒素ペプチド類似体部分が一方のＨＣ単量体の免疫グロブリンＦｃドメインの内部ループ内に挿入された一価抗体を表す。二量体または三量体は、単一の鎖をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）構築物の発現の際に、特定の宿主細胞内において自然に形成される。他の宿主細胞では、細胞を二量体／三量体の形成に好適な条件下に置くか、またはインビトロで二量体／三量体を形成し得る。２つ以上のＨＣ単量体、ＬＣ単量体または免疫グロブリンＦｃドメイン単量体が単一の実施形態の一部である場合、各単量体は必要に応じて、同一であっても互いに異なっていてもよい。 一価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２０μｇの一価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を観測したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。１２．５分において見られるふれは、注入に関連したアーチファクトである。 一価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］の最終試料のＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを用いて、産物をＷａｔｅｒｓ ＭａｓｓＰＲＥＰマイクロ脱塩カラムに通してクロマトグラフィーを行った。カラムは８０℃に設定し、０．１％ギ酸中、直線勾配で増加させたアセトニトリル濃度を用いてタンパク質を溶出した。カラム溶出物の一部を、質量分析用にＷａｔｅｒｓ ＬＣＴ ＰｒｅｍＩｅｒ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析器に回した。機器はポジティブＶモードで作動させた。キャピラリー電圧を３，２００Ｖ、コーン電圧を８０Ｖに設定した。８００〜３０００ｍ／ｚの質量スペクトルを得て、機器製造業者により提供されたＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いてデコンボリュートした。 二価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２５μｇの二価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、500 ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を観測したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。１２分において見られるふれは、注入に関連したアーチファクトである。 窒素レーザーが装備されたＭＩｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩマイクロＭＸ質量分析器を用いて分析した二価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す図である。試料をポジティブ線形モードで処理した。機器の電圧を１２ｋＶに設定し、高質量検出器を５ｋＶに設定した。約２００回のレーザーショットから得られたデータを累積して各スペクトルを作成した。既知の分子量の精製タンパク質を用いて外部質量キャリブレーションを行った。 一価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］／抗ＫＬＨ Ａｂ最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ５０μｇの一価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］／抗ＫＬＨ Ａｂ最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を観測したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。 一価Ｆｃ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］／抗ＫＬＨ Ａｂ最終試料のＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを用いて、産物をＷａｔｅｒｓ ＭａｓｓＰＲＥＰマイクロ脱塩カラムに通してクロマトグラフィーを行った。カラムは８０℃に設定し、０．１％ギ酸中、直線勾配で増加させたアセトニトリル濃度を用いてタンパク質を溶出した。カラム溶出物の一部を、質量分析用にＷａｔｅｒｓ ＬＣＴ ＰｒｅｍＩｅｒ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析器に回した。機器はポジティブＶモードで作動させた。キャピラリー電圧を３，２００Ｖ、コーン電圧を８０Ｖに設定した。８００〜３０００ｍ／ｚの質量スペクトルを得て、機器製造業者により提供されたＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いてデコンボリュートした。 一価抗ＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２５μｇの一価抗ＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を観測したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。１１分において見られるふれは、注入に関連したアーチファクトである。 窒素レーザーが装備されたＭＩｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩマイクロＭＸ質量分析器を用いて分析した一価抗ＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す図である。試料をポジティブ線形モードで処理した。機器の電圧を１２ｋＶに設定し、高質量検出器を５ｋＶに設定した。約２００回のレーザーショットから得られたデータを累積して各スペクトルを作成した。既知の分子量の精製タンパク質を用いて外部質量キャリブレーションを行った。 二価ａＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２５μｇの二価抗ＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、500ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を観測したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。１１．５分において見られるふれは、注入に関連したアーチファクトである。 窒素レーザーが装備されたＭＩｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩマイクロＭＸ質量分析器を用いて分析した二価抗ＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す図である。試料をポジティブ線形モードで処理した。機器の電圧を１２ｋＶに設定し、高質量検出器を５ｋＶに設定した。約２００回のレーザーショットから得られたデータを累積して各スペクトルを作成した。既知の分子量の精製タンパク質を用いて外部質量キャリブレーションを行った。 一価ａＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２０μｇの一価抗ＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を観測したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。１１分において見られるふれは、注入に関連したアーチファクトである。 一価抗ＫＬＨ ＨＣ−Ｌ１０−Ｓｈｋ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終試料のＬＣ−ＭＳ質量スペクトル分析を示す図である。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを用いて、産物をＷａｔｅｒｓ ＭａｓｓＰＲＥＰマイクロ脱塩カラムに通してクロマトグラフィーを行った。カラムは８０℃に設定し、０．１％ギ酸中、直線勾配で増加させたアセトニトリル濃度を用いてタンパク質を溶出した。カラム溶出物の一部を、質量分析用にＷａｔｅｒｓ ＬＣＴ ＰｒｅｍＩｅｒ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析器に回した。機器はポジティブＶモードで作動させた。キャピラリー電圧を３，２００Ｖ、コーン電圧を８０Ｖに設定した。８００〜３０００ｍ／ｚの質量スペクトルを得て、機器製造業者により提供されたＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いてデコンボリュートした。 実施例１２でさらに記載されている、ＣＨＯ−Ｆｃ（黒丸；４ｍｇ／ｋｇ）と二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］（白四角；２ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与を比較したＳＤラットにおける薬物動態実験の結果を示す図である。 ＳＤラットにおける二価二量体のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）（ここでは「ＦｃＳｈＫ」と呼ぶ）に関する薬物動態実験の結果を示す図である（実施例１２を参照されたい）。血清試料を抗ヒトＦｃ抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートに添加して、アフィニティー捕捉を可能にした。次いで、プレートを洗浄し、捕捉試料をＳＤＳにより外して、ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。次いで、抗ヒトＦｃ特異的抗体および二次ＨＲＰコンジュゲートを用いたウエスタンブロットにより試料を可視化した。静注の０．２５時間後（レーン１）に、血清試料由来のバンドの分子量は元の精製物質（レーン５および６）とほぼ一致し、このことは、分解があったとしても極わずかであることを示している。二価分子注射の１時間後（レーン２）、２４時間後（レーン３）および４８時間後（レーン４）に採取された血清は２本のバンドを示し、一方は完全長Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）と一致し、小さい方は単独のＦｃと一致したが、このことは、静注後２〜４８時間の緩やかな消失相における一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ヘテロ二量体の存在を示している。 ＳＤラットにおける二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］ホモ二量体（図１９Ｃ；２ｍｇ／ｋｇの単回静注投与量）および一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫヘテロ二量体（図１９Ｄ；１ｍｇ／ｋｇの単回静注投与量）に関する薬物動態実験の血清試料のウエスタンブロット解析を示す図である。この実験のさらなる詳細は実施例１２に記載されている。図１９Ｃおよび図１９Ｄの結果は、それぞれ代表的な単一個体から得られたものである。二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］ホモ二量体（図１９Ｃ）は、迅速かつ広範囲な分布相を示したが、１時間から１６８時間までの緩やかな消失相を示した。緩やかな消失相の間に２本のバンドが観察され、大きい方の分子量（ＭＷ）は完全長Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］鎖と一致し、小さい方は単独のＦｃと一致した。したがって、二価ホモ二量体の注射にもかかわらず、一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］ヘテロ二量体は、緩やかな消失相で存在し続けると思われる。図１９Ｄは、単回静注内投与後の一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫヘテロ二量体が二本鎖としてインタクトなままであり、二価形態に比べて著しく分布が少ないものの、緩やかな消失速度を保持する。５ｎｇまたは２０ｎｇと標識したレーンは、精製された一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫヘテロ二量体のスタンダードである。 同上 ＳＤラットで行った薬物動態実験（単回皮下投与量＝６ｍｇ／ｋｇ）の結果を示す図である。白四角は一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）（配列番号３３７と配列番号３４８のヘテロ二量体）のデータを表し；黒丸は一価抗ＫＬＨ抗体−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）（配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３３８および配列番号３４２の四量体）のデータを表し；黒三角は一価抗ＫＬＨ抗体（ループ）−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）（配列番号３３８；配列番号３４４；配列番号３３８；および配列番号３４３の四量体）のデータを表し、これらは実施例１２および表４Ｈに記載されている。 二価（白四角）および一価（黒丸）抗ＫＬＨ抗体−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）（それぞれ、［配列番号３３８、配列番号３４２、配列番号３３８、配列番号３４２］および［配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３３８、配列番号３４２］の四量体）に関してＳＤラットで行った、薬物動態実験（単回皮下投与量＝６ｍｇ／ｋｇ投与量）の結果を示す図であり、これらは実施例８、実施例１２および表４Ｊにさらに記載されている。 二価（白四角）および一価（黒丸）抗ＫＬＨ抗体（ループ）−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）（それぞれ、［配列番号３３８、配列番号３４４、配列番号３３８、配列番号３４４］および［配列番号３３８、配列番号３４３、配列番号３３８、配列番号３４４］の四量体）に関してＳＤラットで行った、薬物動態実験（単回皮下投与量＝６ｍｇ／ｋｇ）の結果を示す図であり、これらは実施例８、実施例１２および表４Ｌにさらに記載されている。 ＳＤラットにおける、一価Ｆｃ−ＳｈＫ／Ｆｃヘテロ二量体（白四角）、一価Ｆｃ−ＳｈＫ／ａＫＬＨ Ａｂ（ヘテロ三量体またはヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ））（白三角）および二価ＳｈＫ−Ｆｃ／ＳｈＫ−Ｆｃホモ二量体（黒丸）の薬物動態実験（単回の２ｍｇ／ｋｇ皮下投与量）の結果を示す図である。一価のヘテロ二量体およびヘテロ三量体は、二価ホモ二量体よりもはるかに多くの曝露量をもたらした。この実験に関するさらなる詳細は実施例１２に記載されている。 ３つの一価ｓｃＦｃ−Ｓｈｋ毒素ペプチド類似体融合体の模式図を示す図であり、２５アミノ酸残基ペプチジルリンカーによる第一Ｆｃドメイン内への毒素ペプチド類似体挿入（半月形）（Ｆｃループ（ＳｈＫ）．Ｌ２５．Ｆｃ；左）、または第二Ｆｃドメイン内に２０アミノ酸残基ペプチジルリンカーによる挿入を含む構築物（Ｆｃ．Ｌ２０．Ｆｃループ（ＳｈＫ）；中央）、またはｓｃＦｃドメインのＣ末端に毒素ペプチド類似体を含む構築物（Ｆｃ．Ｌ２０．Ｆｃ．ＳｈＫ；右）が示されている。これらの各実施形態では、ペプチジルリンカー（波線で表す）が、単一のポリペプチド鎖の一部として第一免疫グロブリンＦｃドメインのＣ末端から第二免疫グロブリンＦｃドメインのＮ末端まで伸びていることが示されている。 ３つの異なるｓｃＦｃ−Ｓｈｋ構築物の配列を示す図である。２つのＦｃドメインを連結するために使用されるアミノ酸配列には下線が施され、生物活性Ｓｈｋペプチドは太字になっている。図２５Ｃの構築物において、ＳｈｋをｓｃＦｃのＣ末端と融合するために使用される追加のリンカーにも下線が施されている。図２５ＡはＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃループ（ＳｈＫ）（配列番号４１１）、図２５ＢはＦｃループ（ＳｈＫ）．Ｌ２５．Ｆｃ（配列番号４１２）および図２５ＣはＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃ．［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号４１０）である。 ３つの異なるｓｃＦｃ−Ｓｈｋ構築物の配列を示す図である。２つのＦｃドメインを連結するために使用されるアミノ酸配列には下線が施され、生物活性Ｓｈｋペプチドは太字になっている。図２５Ｃの構築物において、ＳｈｋをｓｃＦｃのＣ末端と融合するために使用される追加のリンカーにも下線が施されている。図２５ＡはＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃループ（ＳｈＫ）（配列番号４１１）、図２５ＢはＦｃループ（ＳｈＫ）．Ｌ２５．Ｆｃ（配列番号４１２）および図２５ＣはＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃ．［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号４１０）である。 ３つの異なるｓｃＦｃ−Ｓｈｋ構築物の配列を示す図である。２つのＦｃドメインを連結するために使用されるアミノ酸配列には下線が施され、生物活性Ｓｈｋペプチドは太字になっている。図２５Ｃの構築物において、ＳｈｋをｓｃＦｃのＣ末端と融合するために使用される追加のリンカーにも下線が施されている。図２５ＡはＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃループ（ＳｈＫ）（配列番号４１１）、図２５ＢはＦｃループ（ＳｈＫ）．Ｌ２５．Ｆｃ（配列番号４１２）および図２５ＣはＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃ．［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号４１０）である。 精製されたＦｃループ（ＳｈＫ）．Ｌ２５．Ｆｃ（配列番号４１２；「１６３４７」）およびＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃループ（ＳｈＫ）（配列番号４１１；「１６３６９」）のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。 ｓｃＦｃループ（Ｓｈｋ）構築物であるＦｃループ（Ｓｈｋ）．Ｌ２５．Ｆｃ（＃１６３４７；配列番号４１２；上パネル）およびＦｃ．Ｌ２０．Ｆｃループ（Ｓｈｋ）（＃１６３６９；配列番号４１１；下パネル）のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す図である。 哺乳動物での発現に最適化され、本発明で使用し得るヒトＩｇＧ１Ｆｃの典型的な核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２７７および配列番号２７８）を示す図（Ａ，Ｂ）である。 哺乳動物での発現に最適化され、本発明で使用し得るヒトＩｇＧ１Ｆｃの典型的な核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２７７および配列番号２７８）を示す図（Ａ，Ｂ）である。 細菌での発現に最適化され、本発明で使用し得るヒトＩｇＧ１Ｆｃの典型的な核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３３８および配列番号３８９）を示す図（Ａ，Ｂ）である。 細菌での発現に最適化され、本発明で使用し得るヒトＩｇＧ１Ｆｃの典型的な核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３３８および配列番号３８９）を示す図（Ａ，Ｂ）である。 実施例１および実施例５に記載のように、様々な濃度のＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）の、ヒトＫｖ１．３電流（図２９Ａ）およびヒトＫｖ１．１電流（図２９Ｂ）に対する影響を全細胞パッチクランプ電気生理学により示した図である。全細胞パッチクランプ電気生理学により、ＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）はＫｖ１．３電流をＩＣ_５０＝０．０３９±０．００５ｎＭ（ｎ＝３）で阻害したのに対し、Ｋｖ１．１電流はＩＣ_５０＝３．３９±１．６１ｎＭ（ｎ＝２）で阻害した。Ｋｖ１．１に対する低い効力は、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ平面パッチクランプ電気生理学により確認され、ここでは、ＳｈＫ−１９２はＩＣ_５０＝３．２６±０．３６ｎＭ（ｎ＝８）であった。 実施例１および実施例５に記載のように、様々な濃度のＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）の、ヒトＫｖ１．３電流（図２９Ａ）およびヒトＫｖ１．１電流（図２９Ｂ）に対する影響を全細胞パッチクランプ電気生理学により示した図である。全細胞パッチクランプ電気生理学により、ＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）はＫｖ１．３電流をＩＣ_５０＝０．０３９±０．００５ｎＭ（ｎ＝３）で阻害したのに対し、Ｋｖ１．１電流はＩＣ_５０＝３．３９±１．６１ｎＭ（ｎ＝２）で阻害した。Ｋｖ１．１に対する低い効力は、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ平面パッチクランプ電気生理学により確認され、ここでは、ＳｈＫ−１９２はＩＣ_５０＝３．２６±０．３６ｎＭ（ｎ＝８）であった。 実施例２および５に記載のように、ヒト全血のタプシガルギン刺激により誘導されたＴ細胞からのＩＬ−２（図３０Ａ）およびＩＦＮγ（図３０Ｂ）分泌のブロックにおける、シクロスポリンＡおよび３つのロットの２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］（配列番号１６）の代表的な投与量反応曲線を示す図である。ＩＬ−２およびＩＦＮγ産生のブロックにおけるＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］のＩＣ_５０は、それぞれ０．１０９±０．０８１ｎＭ（ｎ＝３４）および０．２４０±０．１６３ｎＭ（ｎ＝３４）であった。シクロスポリンＡは約２０００〜３０００倍活性が低く、ＩＬ−２およびＩＦＮγに対する値は、それぞれ３３４．８±１７２．２ｎＭ（ｎ＝６４）および４９５．２±３０７．８ｎＭ（ｎ＝６４）であった。図３０に示される曲線は１００パーセントの対照（ＰＯＣ）に対して正規化されている。 実施例２および５に記載のように、ヒト全血のタプシガルギン刺激により誘導されたＴ細胞からのＩＬ−２（図３０Ａ）およびＩＦＮγ（図３０Ｂ）分泌のブロックにおける、シクロスポリンＡおよび３つのロットの２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］（配列番号１６）の代表的な投与量反応曲線を示す図である。ＩＬ−２およびＩＦＮγ産生のブロックにおけるＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］のＩＣ_５０は、それぞれ０．１０９±０．０８１ｎＭ（ｎ＝３４）および０．２４０±０．１６３ｎＭ（ｎ＝３４）であった。シクロスポリンＡは約２０００〜３０００倍活性が低く、ＩＬ−２およびＩＦＮγに対する値は、それぞれ３３４．８±１７２．２ｎＭ（ｎ＝６４）および４９５．２±３０７．８ｎＭ（ｎ＝６４）であった。図３０に示される曲線は１００パーセントの対照（ＰＯＣ）に対して正規化されている。 実施例５および８に記載のように、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］（配列番号１６）が、タプシガルギン刺激により誘導されたカニクイザル全血におけるＴ細胞からのＩＬ−１７分泌を強力に（平均ＩＣ_５０＝０．０９ｎＭ）阻害することを示す図である。７匹の別々のカニクイザル（ｃｙｎｏ１〜ｃｙｎｏ７と表示）から採取した血液の反応を示す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 実施例５、９、１１および１２に記載のように、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］（配列番号１６）、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号３３８；３３９；３３８；３４２）および一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）（配列番号３３７；３４８）の分子がすべて、ラットＴエフェクター記憶細胞系であるＰＡＳの抗原（ミエリン）依存性増殖（^３Ｈ−チミジン取込み）を強力に阻害することを示す図である。各分子による阻害のＩＣ_５０値を示す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 実施例５、９、１１および１２に記載のように、媒体またはＫｖ１．３選択性阻害剤である一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号３３８；３３９；３３８；３４２）および２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）で処置したラットのインビボ活性を比較したＡＴ−ＥＡＥデータを示す図である。大きい方の一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子は脳脊髄炎の抑制で２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ（３６０μｇ／ｋｇ）のＥＤ_５０を示したが、これは小さい方のＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］分子の２．４７ｎｍｏｌ／ｋｇ（１０μｇ／ｋｇ）のＥＤ_５０と同様であった。各分子は、−１日目から７日目まで毎日、皮下投与により投与した。図の説明文は投与されたｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）投与量を示す。 実施例５、９、１１および１２に記載のように、媒体、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）または様々な投与量の一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子（配列番号３３８；３３９；３３８；３４２）を投与した個々のラットのＡＴ−ＥＡＥデータを示す図（Ａ〜Ｄ）である。 実施例９、実施例１１および実施例１２に記載のように、媒体またはＫｖ１．３選択性阻害剤である一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）（配列番号３３７；３４８）で処置したラットのインビボ活性を比較したＡＴ−ＥＡＥデータを示す図である。Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）分子は、脳脊髄炎の抑制でＥＤ_５０≦２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ（１３８μｇ／ｋｇ）を示した。ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）投与量を示し、−１日目から７日目までの毎日の皮下投与を含んでいた。 実施例９、実施例１１および実施例１２に記載のように、媒体または様々な投与量の一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）分子（配列番号３３７；３４８）を投与した個々のラットのＡＴ−ＥＡＥデータを示す図（Ａ〜Ｄ）である。 実施例１０にさらに記載されているように、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに２．０ｍｇ／ｋｇ（図３７Ａ、ラット＃１〜＃３）または５．０ｍｇ／ｋｇ（図３７Ｂ、ラット＃４）のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の単回ボーラス静注を行った０．０８３時間、０．２５時間、１．０時間および９６時間後に観察された血清ヒスタミンレベルを示す図である。未処置個体のベンチマークＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ血清基準対照において測定された血清ヒスタミンのバックグラウンドレベルは１５３ｎｇ／ｍｌであった。 実施例１０に記載のように、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに０．１ｍｇ／ｋｇ（ラット＃１〜＃３）、２．０ｍｇ／ｋｇ（ラット＃７〜＃８）または５．０ｍｇ／ｋｇ（ラット＃１０〜＃１２）のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の単回皮下注射を行った０．５時間、２時間、２４時間および４８時間後に観察された血清ヒスタミンレベルを示す図である。各パネルは、３匹の別々の個体の各投与量での応答を示す。 実施例１０に記載のように、ペプチド（ＭＣＤＰ）、化合物４８／８０、Ｐ物質、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂまたは一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）を脱顆粒するマスト細胞とのインビトロインキュベーションの１時間後に、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット単離腹腔マスト細胞から放出されたヒスタミンレベルを示す図である。 実施例１０に記載のように、ペプチド（ＭＣＤＰ）、化合物４８／８０、Ｐ物質、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）または一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）を脱顆粒するマスト細胞とのインビトロインキュベーションの１時間後に、ヒトＣＤ３４由来マスト細胞から放出されたヒスタミンレベルを示す図である。この実験における総マスト細胞ヒスタミン含有量は８８２ｎｇ／ｍｌであった。 実施例１０に記載のように、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）はＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（図４１Ａ）およびＬｅｗＩｓラット（図４１Ｂ）腹腔マスト細胞からのヒスタミン放出を誘導したが、マウス腹腔マスト細胞（図４１Ｃ）またはヒトＣＤ３４由来マスト細胞（図４１Ｄ）からのヒスタミン放出は誘導しなかったことを示す図である。マウス腹腔マスト細胞およびヒトマスト細胞は、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）に応答しなかったにもかかわらず、同時に行った陽性対照および他の塩基性分泌促進物質（例えば、Ａ２３１８７、化合物４８／８０）には応答した（未掲載）。図４１に示すのはヒスタミン放出パーセントであるが、ここでは、総ヒスタミンレベルを実施例１０に記載の通りに判定した。 一価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２５μｇの一価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を検出したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。 窒素レーザーが装備されたＭＩｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩマイクロＭＸ質量分析器を用いて分析した一価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終試料（非還元は図４４Ａ；還元は図４４Ｂ）のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す図である。試料をポジティブ線形モードで処理した。機器の電圧を１２ｋＶに設定し、高質量検出器を５ｋＶに設定した。約２００回のレーザーショットから得られたデータを累積して各スペクトルを作成した。既知の分子量の精製タンパク質を用いて外部質量キャリブレーションを行った。 二価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２５μｇの二価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を検出したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。 窒素レーザーが装備されたＭＩｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩマイクロＭＸ質量分析器を用いて分析した二価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終試料（非還元は図４７Ａ；還元は図４７Ｂ）のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す図である。試料をポジティブ線形モードで処理した。機器の電圧を１２ｋＶに設定し、高質量検出器を５ｋＶに設定した。約２００回のレーザーショットから得られたデータを累積して各スペクトルを作成した。既知の分子量の精製タンパク質を用いて外部質量キャリブレーションを行った。 三価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２５μｇの三価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を検出したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。 窒素レーザーが装備されたＭＩｃｒｏｍａｓｓ ＭＡＬＤＩマイクロＭＸ質量分析器を用いて分析した三価ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終試料（非還元は図５０Ａ；還元は図５０Ｂ）のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す図である。試料をポジティブ線形モードで処理した。機器の電圧を１２ｋＶに設定し、高質量検出器を５ｋＶに設定した。約２００回のレーザーショットから得られたデータを累積して各スペクトルを作成した。既知の分子量の精製タンパク質を用いて外部質量キャリブレーションを行った。 一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１〜１２に以下のように負荷した：レーン１：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン２：０．５μｇの還元していない産物；レーン３：ブランク；レーン４：２．０μｇの還元していない産物；レーン５：ブランク；レーン６：１０μｇの還元していない産物；レーン７：Ｎｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２広範囲タンパク質スタンダード（１０μｌ）；レーン８：０．５μｇの還元した産物；レーン９：ブランク；レーン１０：２．０μｇの還元した産物；レーン１１：ブランク；レーン１２：１０μｇの還元した産物。 ２５μｇの一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終産物を５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中、およびｐＨ６．９、１ｍｌ／分でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢＩｏＳｅｐ ＳＥＣ−３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に注入し、２８０ｎｍでの吸光度を検出したサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。 一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ最終試料中の重鎖の、縮小した質量スペクトル分析を示す図である。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムを用いて、産物をＷａｔｅｒｓ ＭａｓｓＰＲＥＰマイクロ脱塩カラムに通してクロマトグラフィーを行った。カラムは８０℃に設定し、０．１％ギ酸中、直線勾配で増加させたアセトニトリル濃度を用いてタンパク質を溶出した。カラム溶出物の一部を、質量分析用にＷａｔｅｒｓ ＬＣＴ ＰｒｅｍＩｅｒ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析器に回した。機器はポジティブＶモードで作動させた。キャピラリー電圧を３，２００Ｖ、コーン電圧を８０Ｖに設定した。８００〜３０００ｍ／ｚの質量スペクトルを得て、機器製造業者により提供されたＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアを用いてデコンボリュートした。 実施例１０に記載のように、細胞は認識可能なＫｖ１．３電流またはＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫに感受性の電流を発現しないことを示す、ラット腹腔マスト細胞に関する電気生理学的実験の結果を表す図である。図５４Ａは、保持電位０ｍＶから１００ミリ秒で２０ｍＶずつ増加させて−１００ｍＶ〜＋８０ｍＶの間までの異なる電位を１０秒ごとに記録した、代表的な全細胞電流を示す。同様のプロファイルが３つの別々の細胞からの記録において観察された。図５４Ｂは、保持電位０ｍＶおよび−１２０ｍＶ〜＋１００ｍＶの異なる傾斜電位において４００ミリ秒の間に誘発された電流−電圧プロファイルを示す。過剰量（１００ｎＭ）のＫｖ１．３阻害剤ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫおよびカリブドトキシン（ＣｈＴｘ）は、電流に対して有意な効果は示さなかった。ラット腹腔マスト細胞に関する電気生理学的実験のために、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．４）中に細胞を浸した。１０ｍＭ ＮａＣｌ、９０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＫＦ、１０ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有する内液を用いて細胞をパッチした。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうでないことが示されない限り、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅＩｎ）」と言えば複数のタンパク質を包含し；「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」と言えば複数の細胞の集団を包含する。

「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合的に連結された２個以上のアミノ酸からなる分子鎖を包含する。この用語は、特定の長さの産物を指すわけではない。したがって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」がポリペプチドの定義に包含される。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを包含する。さらに、タンパク質フラグメント、類似体、突然変異またはバリアントタンパク質、融合タンパク質などがポリペプチドの意味に包含される。この用語は、既知のタンパク質工学技術を用いて組換えにより発現され得るような、１つ以上のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸を含む分子も包含する。さらに、本発明の毒素ペプチド類似体は、公知の有機化学技術により本明細書に記載の通りに誘導体化し得る。

「毒素ペプチド」は、毒から単離し得る天然に存在する薬理学的に活性なペプチドまたはポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドを包含し、またこのような天然に存在する分子の改変ペプチド類似体も包含する。（例えば、Ｋａｌｍａｎら，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ａ ｐｏｔｅｎｔ Ｋｖ１．３−ｓｐｅｃＩｆＩｃ ＩｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓＩｖｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４９）：３２６９７−７０７（１９９８）；Ｋｅｍら，米国特許第６，０７７，６８０号；Ｍｏｕｈａｔら，ＯｓＫ１ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ，国際公開第２００６／００２８５０Ａ２号；Ｃｈａｎｄｙら，Ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ＳＨＫ ｔｏｘＩｎ ａｎｄ ｔｈｅＩｒ ｕｓｅｓ Ｉｎ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ＩｎｈＩｂＩｔＩｏｎ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ，国際公開第２００６／０４２１５１号；ＳｕｌｌＩｖａｎら， ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ａｇｅｎｔｓ，国際公開第２００６／１１６１５６Ａ２号（これらはすべて、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ヘビ、サソリ、クモ、ハチ、マキガイおよびイソギンチャクは、強力かつ選択的にイオンチャネルおよび受容体を標的とする低分子の生物活性毒素ペプチドまたは「毒素」の豊富な供給源として役立ち得る毒を産生する生物のいくつかの例である。毒素ペプチドの一例は、オーソキラス・スクロビキュローサス（ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ）のサソリ毒から単離される毒素ペプチドである、ＯＳＫ１（ＯｓＫ１としても知られる）である。（例えば、Ｍｏｕｈａｔら，Ｋ^＋ ｃｈａｎｎｅｌ ｔｙｐｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔＩｃ ＯＳＫ１，ａ ｔｏｘＩｎ ｆｒｏｍ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ｖｅｎｏｍ，ＢＩｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８５：９５-１０４（２００５）；Ｍｏｕｈａｔら，ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌ ｐｒｏｆＩｌＩｎｇ ｏｆ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｔｏｘＩｎ １ ａｎａｌｏｇｓ ｗＩｔｈ ａ ｔｒＩｍｍｅｄ Ｎ−ｔｅｒｍＩｎａｌ ｄｏｍａＩｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：３５４−６２（２００６）；Ｍｏｕｈａｔら，ＯｓＫ１ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ，国際公開第２００６／００２８５０ Ａ２号）。もう１つの例はスティコダクチラ・ヘリアンサス（ＳｔＩｃｈｏｄａｃｔｙｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ）イソギンチャクの毒から単離されるＳｈＫである。（例えば、Ｔｕｄｏｒら，ＩｏｎＩｓａｔＩｏｎ ｂｅｈａｖＩｏｕｒ ａｎｄ ｓｏｌｕｔＩｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔＩｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ．２５１（１−２）：１３３ ４１（１９９８）；ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄＩｓｕｌｆＩｄｅ ｂｏｎｄｓ Ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋＩｎｇ ａｃｔＩｖＩｔｙ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，ＢＩｏｃｈｅｍ．３８（４４）：１４５４９−５８（１９９９）；Ｋｅｍら，ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ，米国特許第６，０７７，６８０号；Ｌｅｂｒｕｎら，ＮｅｕｒｏｐｅｐｔＩｄｅｓ ｏｒＩｇＩｎａｔＩｎｇ Ｉｎ ｓｃｏｒｐＩｏｎ，米国特許第６，６８９，７４９号；Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５））。

毒素ペプチドは、通常約２０〜約８０個のアミノ酸の長さであり、２〜５個のジスルフィド結合を含み、かつ非常に小型の構造を形成する。毒素ペプチド（例えば、サソリ、イソギンチャクおよびイモガイの毒に由来する）が単離され、イオンチャネルに対するその影響が特徴付けられている。このようなペプチドは、効力、安定性および選択性の重要な問題への対処に特によく適した比較的少数の構造的枠組みから進化したと思われる。例えば、サソリおよびイモガイ毒素ペプチドの大部分は、１０〜４０個のアミノ酸および５個以下のジスルフィド結合を含み、多くの場合タンパク質分解に対して耐性である、極めて小型で限定された構造（微小タンパク質）を形成している。コノトキシンおよびサソリ毒素ペプチドは、そのジスルフィド結合およびペプチドフォールディングに基づく多数のスーパーファミリーに分けることができる。多数の毒素の溶液構造がＮＭＲ分光法により決定されており、そこではその小型の構造が示され、そのファミリーのフォールディングパターンの保存が確認されている。（例えば、Ｔｕｄｏｒら，ＩｏｎＩｓａｔＩｏｎ ｂｅｈａｖＩｏｕｒ ａｎｄ ｓｏｌｕｔＩｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔＩｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ．２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８）；ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄＩｓｕｌｆＩｄｅ ｂｏｎｄｓ Ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋＩｎｇ ａｃｔＩｖＩｔｙ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ，ＢＩｏｃｈｅｍ． ３８（４４）：１４５４９−５８（１９９９）；ＪａｒａｖＩｎｅら，Ｔｈｒｅｅ−ｄＩｍｅｎｓＩｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｏｘＩｎ ＯＳＫ１ ｆｒｏｍ ＯｒｔｈｏｃｈＩｒｕｓ ｓｃｒｏｂＩｃｕｌｏｓｕｓ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ｖｅｎｏｍ，ＢＩｏｃｈｅｍ．３６（６）：１２２３−３２（１９９７）；ｄｅｌ ＲＩｏ−ＰｏｒｔＩｌｌｏら；ＮＭＲ ｓｏｌｕｔＩｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｎ１２，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔＩｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＭｅｘＩｃａｎ ｓｃｏｒｐＩｏｎ ＣｅｎｔｒｕｒｏＩｄｅｓ ｎｏｘＩｕｓ ｗＩｔｈ ａ ｔｙｐＩｃａｌ β−ｔｏｘＩｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｕｔ ｗＩｔｈ α−ｌＩｋｅ ｐｈｙｓＩｏｌｏｇＩｃａｌ ａｃｔＩｖＩｔｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ． ２７１（１２）：２５０４−１６（２００４）；ＰｒｏｃｈｎＩｃｋａ−Ｃｈａｌｕｆｏｕｒら，ＳｏｌｕｔＩｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄＩｓｃｒｅｐＩｎ，ａ ｎｅｗ Ｋ^＋−ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋＩｎｇ ｐｅｐｔＩｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ α−ＫＴｘ１５ ｓｕｂｆａｍＩｌｙ，ＢＩｏｃｈｅｍ．４５（６）：１７９５−１８０４（２００６））。その他の例が当該技術分野で公知であり、またはＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第０６１１６１５６Ａ２号または米国特許出願第１１／４０６，４５４号（題名：ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号として公開）；Ｍｏｕｈａｔら，ＯｓＫ１ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ，国際公開第２００６／００２８５０Ａ２号；ＳｕｌｌＩｖａｎら，米国特許出願第１１／９７８，０７６号（題名：コンジュゲートｄ ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，２００７年１０月２５日に出願），Ｌｅｂｒｕｎら，米国特許第６，６８９，７４９号（それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見ることができる。もう１つの例であるＨｍＫ毒素ペプチドは、大型のイソギンチャク（ラジアンサス・マグニフィカ（ＲａｄＩａｎｔｈｕｓ ｍａｇｎＩｆＩｃａ）；センジュイソギンチャク（ＨｅｔｅｒａｃｔＩｓ ｍａｇｎＩｆＩｃａ））に由来する。その他の例としては、上記のようなイソギンチャク毒素ＨｍＫ、ＳｈＫ、ＢｇＫ、ＡｓＫｓ、ＡｅＫおよびＡＥＴＸ−Ｋのファミリーメンバーが挙げられる。ＡＥＴＸ−Ｋはイソギンチャクであるミナミウメボシイソギンチャク（ＡｎｅｍｏｎＩａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）から単離され、より大きなアミノ酸配列（推定シグナル配列を含む）ＭＫＧＱＭＩＩＣＬＶＬＩＡＬＣＭＳＶＶＶＭＡＱＮＬＲＡＥＥＬＥＫＡＮＰＫＤＥＲＶＲＳＦＥＲＮＱＫＲＡＣＫＤＹＬＰＫＳＥＣＴＱＦＲＣＲＴＳＭＫＹＫＹＴＮＣＫＫＴＣＧＴＣ／／配列番号２７５内にアミノ酸配列ＲＡＣＫＤＹＬＰＫＳＥＣＴＱＦＲＣＲＴＳＭＫＹＫＹＴＮＣＫＫＴＣＧＴＣ／／配列番号３を有する。（Ｈａｓｅｇａｗａら，ＩｓｏｌａｔＩｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｃｌｏｎＩｎｇ ｏｆ ａ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｅｐｔＩｄｅ ｔｏｘＩｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅａ ａｎｅｍｏｎｅ ＡｎｅｍｏｎＩａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ，ＴｏｘＩｃｏｎ ４８（５）：５３６−４２（２００６）を参照されたい）。ＨｍＫは配列番号２を有する（（表５；成熟ペプチド）より大きなＭＫＳＱＭＩＡＡＶＬＬＩＡＦＣＬＣＶＶＶＴＡＲＭＥＬＱＤＶＥＤＭＥＮＧＦＱＫＲＲＴＣＫＤＬＩＰＶＳＥＣＴＤＩＲＣＲＴＳＭＫＹＲＬＮＬＣＲＫＴＣＧＳＣ／／配列番号２７６（シグナルおよび成熟ペプチド部分を含む）内）。

「ペプチド類似体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基置換、少なくとも１つのアミノ酸の内部付加もしくは内部欠失、および／またはアミノもしくはカルボキシ末端の切断もしくは付加、および／またはカルボキシ末端のアミド化により、天然に存在するペプチド配列とは異なる配列を有するペプチドを指す。「内部欠失」は、天然に存在する配列のＮまたはＣ末端以外の位置におけるアミノ酸の欠如を指す。同様に、「内部付加」は、天然に存在する配列におけるＮまたはＣ末端以外の位置でのアミノ酸の存在を指す。

本発明の組成物の実施形態は、毒素ペプチド類似体またはその薬学的に許容される塩を含む。「毒素ペプチド類似体」、例えば、特に限定されないがＡＥＴＸ−Ｋペプチド類似体、ＳｈＫペプチド類似体またはＨｍＫペプチド類似体などは、ＳｈＫ、ＨｍＫまたはＡＥＴＸ−Ｋのような対象となる天然の毒素ペプチド配列と比べて、対象となる天然の毒素ペプチド配列の改変（例えば、上記のようなアミノ酸残基置換、内部付加もしくは挿入、内部欠失および／またはアミノもしくはカルボキシ末端の切断もしくは付加）を含む。本発明の毒素ペプチド類似体は、３３〜約１００アミノ酸残基長であり、配列番号４に関して、Ｃ^１−Ｃ^６、Ｃ^２−Ｃ^４およびＣ^３−Ｃ^５ジスルフィド結合を有し、ここでは、Ｃ^１、Ｃ^２、Ｃ^３、Ｃ^４、Ｃ^５およびＣ^６は、従来通りにペプチド（１つまたは複数）のＮ末端を左に記載した毒素ペプチドの一次配列に現れるシステイン残基の順序を表し、アミノ酸配列中の１番目と６番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、２番目と４番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、３番目と５番目のシステインがジスルフィド結合を形成している。このようなＣ^１−Ｃ^６、Ｃ^２−Ｃ^４、Ｃ^３−Ｃ^５ジスルフィド結合パターンを有する毒素ペプチドの例としては、ＳｈＫ、ＢｇＫ、ＨｍＫ、ＡｅＫＳ、ＡｓＫ、ＡＥＴＸ−ＫおよびＤＴＸ１、ならびに上記のいずれかの類似体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のように、本発明の毒素ペプチド類似体は、配列番号４に関して、Ｎ末端および／またはＣ末端に追加のアミノ酸残基も有し得る。

組成物の「生理的に許容される塩」、例えば毒素ペプチド類似体の塩により、薬学的に許容されることが既知であるかまたは後に見出される、任意の１つまたは複数の塩を意味する。薬学的に許容される塩のいくつかの非限定的な例は：酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩および臭化水素酸塩のようなハロゲン化水素；硫酸塩；クエン酸塩；マレイン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；グルコン酸：コハク酸塩；メシル酸塩；ベシル酸塩；ペンタガロイルグルコース（ＰＧＧ）およびエピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）のような没食子酸エステルの塩（没食子酸は、３，４，５トリヒドロキシ安息香酸としても知られる）、コレステロール硫酸の塩、パモ酸塩、タンニン酸塩およびシュウ酸塩である。

「融合タンパク質」という用語は、そのタンパク質が２つ以上の親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド要素を含むことを意味する。通常、融合タンパク質は融合遺伝子から発現されるが、融合遺伝子では、１つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで、または任意でリンカーによりその配列と離れて付加されている。次いで、融合遺伝子は、単一のタンパク質として組換え宿主細胞により発現され得る。

「−模倣ペプチド」、「ペプチド模倣物」および「−アゴニストペプチド」という用語は、対象となる天然に存在するタンパク質、例えば、特に限定されないが毒素ペプチド分子、例えば、天然に存在するＳｈＫ、ＨｍＫ、ＡＥＴＸ−ＫまたはＯＳＫ１毒素ペプチドに匹敵する生物学的活性を有する、ペプチドまたはタンパク質を指す。上記用語はさらに、天然に存在する分子の作用を増強することなどにより、天然に存在するペプチド分子の活性を間接的に模倣するペプチドを包含する。

「−アンタゴニストペプチド」、「ペプチドアンタゴニスト」および「阻害ペプチド」という用語は、対象となる受容体の生物学的活性をブロックするか、もしくは何らかの方法で阻害する、または対象となる受容体、例えば特に限定されないが、イオンチャネル（例えば、Ｋｖ１．３）もしくはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）などに対する既知のアンタゴニストもしくは阻害剤に匹敵する生物学的活性を有するペプチドを指す。

タンパク質の「ドメイン」とは、完全タンパク質以下であるが通常は完全ではないタンパクを含む、全タンパク質の任意の部分のことである。ドメインは、必ずしもそうではないが、残りのタンパク質鎖とは独立してフォールディングし得る、および／または特定の生物学的、生化学的もしくは構造的な機能もしくは配置と関連し得る（例えば、リガンド結合ドメインまたは細胞質、膜貫通型もしく細胞外ドメイン）。

本明細書で使用される「可溶性」とは、組換えＤＮＡ技術により宿主細胞内で産生されるタンパク質に関する場合、水溶液中に存在するタンパク質のことであり；タンパク質がツインアルギニンシグナルアミノ酸配列を含む場合、その可溶性タンパク質はグラム陰性菌宿主内の細胞周辺腔まで搬出されるか、または分泌可能な真核宿主細胞により、もしくは適当な遺伝子（例えば、ｋＩｌ遺伝子）を保有する細菌宿主により培地中に分泌される。したがって、可溶性タンパク質とは、宿主細胞内の封入体中には見られないタンパク質のことである。あるいは文脈によっては、可溶性タンパク質とは、細胞膜中に組み込まれていないタンパク質のことである。一方、不溶性タンパク質とは、宿主細胞内の細胞質顆粒（封入体と呼ばれる）内に変性形態で存在するタンパク質のことであり、または同様に文脈によっては、不溶性タンパク質とは、特に限定されないが原形質膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、小胞体膜などを含めた細胞膜中に存在するタンパク質のことである。

また、有意な量のイオン界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）または変性剤（例えば、尿素、塩酸グアニジン）が存在しない水溶液に「可溶」である（すなわち、溶解しているか、または溶解可能である）タンパク質と、溶液内に拡散した不溶性タンパク質分子の懸濁液として存在するタンパク質とが区別される。「可溶性」タンパク質は、液体培地中に存在する細胞を除去するのに十分な条件を用いた遠心分離によって（例えば、５，０００×ｇで４〜５分間の遠心分離）、タンパク質を含有する溶液から除去されない。本発明の組成物のいくつかの実施形態では、毒素ペプチド類似体は宿主細胞により合成されて、不溶型で細胞の封入体内に隔離され、次いで、これを細胞抽出物中の他の細胞成分から比較的容易に精製することができ、そして今度は、毒素ペプチド類似体を可溶化する、リフォールディングするおよび／またはさらに精製することができる。

「可溶性」タンパク質（すなわち、宿主細胞内で発現されたときに可溶型で産生されるタンパク質）と、「可溶化」タンパク質とは区別される。封入体内に見られるまたは細胞膜中に組み込まれて見られる不溶性組換えタンパク質は、塩酸グアニジン、尿素またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような変性剤で封入体または細胞膜を処理することにより可溶化し得る（すなわち、可溶型にし得る）。次いで、これらの変性剤を可溶化タンパク質調製物から除去して、タンパク質を回復させて復元（リフォールディング）しなければならない。本発明の組成物は活性型にリフォールディングし得るが、すべてのタンパク質が、変性剤中での可溶化および変性剤の除去の後に活性なコンホメーションにリフォールディングされるわけではない。多くのタンパク質は変性剤除去の際に沈殿する。ＳＤＳを用いて封入体および細胞膜を可溶化してもよく、ＳＤＳは溶液中のタンパク質を低濃度に維持する。しかし、透析により常にすべてのＳＤＳが除去されるわけではない（ＳＤＳは透析で除去されないミセルを形成し得る）；したがって、ＳＤＳで可溶化された封入体タンパク質およびＳＤＳで可溶化された細胞膜タンパク質は可溶性であるが、リフォールディングされない。

「分泌」タンパク質は、分泌シグナルペプチド配列によりＥＲ、分泌小胞または細胞外間隙に移動することができるタンパク質のみならず、必ずしもシグナル配列を含まなくても細胞外間隙内に放出されるタンパク質も指す。分泌タンパク質が細胞外間隙内に放出される場合、その分泌タンパク質は細胞外プロセシングを受けて「成熟」タンパク質を生成し得る。細胞外間隙内への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含めた数多くの機序により生じ得る。本発明の組成物の他のいくつかの実施形態では、毒素ペプチド類似体が分泌タンパク質として宿主細胞により合成さ得、次いで、これを細胞外間隙および／または培地からさらに精製し得る。

「組換え」という用語は、ヒトの介入により物質（例えば、核酸またはポリペプチド）が人為的にまたは合成的に（すなわち、非自然的に）改変されることを意味する。改変は、物質に対してその天然の環境もしくは状態内で、またはそこから取り出して行われ得る。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、ＤＮＡシャフリングまたは他の公知の分子生物学的手法の間に核酸を組み換えることにより作製される核酸である。「組換えＤＮＡ分子」は、上記分子生物学的技術により連結されたＤＮＡセグメントからなる。本明細書で使用される「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。「組換え宿主細胞」とは、組換え核酸を含有するおよび／または発現する細胞のことである。

本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」とは、文脈により、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ、核酸、またはヌクレオチドポリマーを表す文字列を含めた、ヌクレオチドのポリマーのことである。任意の特定のポリヌクレオチド配列から、所与の核酸または相補的なポリヌクレオチド配列のいずれかを決定し得る。一本または二本鎖であり、かつセンスまたはアンチセンス鎖を表し得る、ゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。

本明細書で使用される「コードする核酸分子」、「コードするＤＮＡ配列」および「コードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序がｍＲＮＡ鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、さらにポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序も決定する。このようにして、ＤＮＡ配列はＲＮＡ配列およびアミノ酸配列をコードする。

「遺伝子の発現」または「核酸の発現」は、文脈により示されるが、ＤＮＡのＲＮＡへの転写（ＲＮＡの修飾、例えばスプライシングを任意に含む）、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳（それに続くポリペプチドの翻訳後修飾を含むこともある）または転写および翻訳の両方を意味する。

「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連する任意の核酸を指すために広く使用される。遺伝子は通常、コード配列および／またはこのようなコード配列の発現に必要な調節配列を含む。「遺伝子」という用語は、特定のゲノムまたは組換え配列のみならず、その配列にコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡにも適用される。「融合遺伝子」は、毒素ペプチド類似体をコードするコード領域を含んでいる。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する発現されない核酸セグメントも含む。転写因子のような調節タンパク質が結合して隣接または近接する配列の転写を生じる転写制御エレメントを含めた、発現されない調節配列。

本明細書で使用される「コード領域」または「コード配列」という用語は、構造遺伝子に関連して使用される場合、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果生じる新生ポリペプチド中に見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。真核生物では、コード領域は、開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」が５’側の境界となり、停止コドンを指定する３つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうちの１つが３’側の境界となっている。

真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いＤＮＡ配列からなる（ＭａｎＩａｔＩｓら，ＳｃＩｅｎｃｅ ２３６：１２３７（１９８７））。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞ならびにウイルスを含めた様々な真核源から単離されている（類似の制御エレメント、すなわち、プロモーターが原核生物でも見られる）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、対象タンパク質を発現させるためにどの細胞型を使用するかによって決まる。真核プロモーターおよびエンハンサーには、広範な宿主範囲を有するものもあれば、限られた細胞型のサブセットにおいて機能するものもある（概説には、Ｖｏｓｓら，Ｔｒｅｎｄｓ ＢＩｏｃｈｅｍ．ＳｃＩ．，１１：２８７（１９８６）およびＭａｎＩａｔＩｓら，ＳｃＩｅｎｃｅ ２３６：１２３７（１９８７）を参照されたい）。

本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列および特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要とされる適当な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。原核生物での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、任意でオペレーター配列、リボソーム結合部位および場合により他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、エンハンサーならびに終止およびポリアデニル化シグナルを用いることが知られている。必要に応じて、本発明の毒素ペプチド類似体のより容易な細胞からの単離のために、発現された毒素ペプチド類似体が組換え宿主細胞により分泌され得るように、分泌シグナルペプチド配列も本発明の毒素ペプチド類似体のコード配列と作動可能に連結された発現ベクターにより任意にコードされ得る。こうした技術は当該技術分野で公知である。（例えば、Ｇｏｏｄｅｙ，Ａｎｄｒｅｗ Ｒ．ら，ＰｅｐｔＩｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，米国特許第５，３０２，６９７号；ＷｅＩｎｅｒら，ＣｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅＩｎ ｓｅｃｒｅｔＩｏｎ，米国特許第６，０２２，９５２号および米国特許第６，３３５，１７８号；Ｕｅｍｕｒａら，ＰｒｏｔｅＩｎ ｅｘｐｒｅｓｓＩｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｕｔＩｌＩｚａｔＩｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第７，０２９，９０９号；Ｒｕｂｅｎら，２７ ｈｕｍａｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，米国特許出願公開第２００３／０１０４４００ Ａ１号）。

本明細書で使用される「作動可能な組合せの」、「作動可能な順序の」および「作動可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が産生されるような核酸配列の連結を指す。この用語は、機能性タンパク質が産生されるようなアミノ酸配列の連結も指す。

ペプチド
組換えＤＮＡおよび／またはＲＮＡを介したタンパク質発現およびタンパク質工学技術、あるいはペプチド調製のための他の任意の方法が、本発明の毒素ペプチド類似体およびその融合タンパク質コンジュゲート（例えば、毒素ペプチド類似体と、免疫グロブリンＦｃドメイン、トランスサイレチンまたはヒト血清アルブミンとを含む、融合タンパク質）の作製に適用される。例えば、形質転換宿主細胞内でペプチドを作製し得る。簡潔には、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子または構築物を調製する。このようなＤＮＡ分子の調製法は当該技術分野で公知である。例えば、ペプチドをコードする配列を適当な制限酵素を用いてＤＮＡから切り取り得る。数多くの入手可能な公知の宿主細胞のいずれも本発明の実施に使用し得る。特定宿主の選択は、当該分野により認められる数多くの要因によって決まる。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によりコードされるペプチドの毒性、形質転換率、ペプチド復元の容易さ、発現特性、バイオセーフティーおよびコストが含まれる。すべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有用であるとは限らないということを理解した上で、上記要因のバランスを考え出さなければならない。これらの全般的なガイドライン内で、有用な培養微生物宿主細胞としては、細菌（大腸菌（ＥｓｃｈｅｒＩｃｈＩａ ｃｏｌＩ）種など）、酵母（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種など）ならびに他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物（ヒトを含む）細胞、例えばＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。ＤＮＡレベルでの改変も可能である。ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞とより適合するコドンに変更し得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌＩ）に関しては、最適化コドンが当該技術分野で公知である。コドンを置換して、制限部位を削除するか、または選択された宿主細胞内でのＤＮＡプロセシングを補助し得るサイレント制限部位を含ませることができる。次に、形質転換宿主を培養し純化する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように、従来の発酵条件下で培養し得る。このような発酵条件は当該技術分野で公知である。さらに、ＤＮＡは任意に、融合タンパク質、発現される毒素ペプチド類似体と作動可能に連結されたシグナルペプチド配列（例えば、分泌シグナルペプチド）のコード領域の５’側をさらにコードする。薬理学的に活性な本発明の毒素ペプチド類似体とコンジュゲートした二量体Ｆｃ融合タンパク質（「ペプチボデイ」）またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（「ヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）」）を含めた本発明の組成物の、哺乳動物細胞による組換え発現に有用な、適当な組換え方法および典型的なＤＮＡ構築物のさらなる例に関しては、例えば、ＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号およびＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）（共にその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

本発明のペプチド組成物は合成的方法により作製することもできる。固相合成法は、小さいペプチドを作製する最も費用効果の高い方法であるため、個々のペプチドを作製する好適な技術である。例えば、公知の固相合成法としては、保護基、リンカーおよび固相支持体の使用、ならびに特定の保護および脱保護反応条件、リンカー切断条件、捕捉剤の使用、ならびに固相ペプチド合成法のその他の態様が挙げられる。適当な技術は当該技術分野で公知である。（例えば、ＭｅｒｒＩｆＩｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．ＰｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（ＫａｔｓｏｙａｎｎＩｓおよびＰａｎａｙｏｔＩｓ編）；ＭｅｒｒＩｆＩｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；ＤａｖＩｓら（１９８５），ＢＩｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９６９），ＳｏｌＩｄ Ｐｈａｓｅ ＰｅｐｔＩｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓＩｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；ＦＩｎｎら（１９７６），Ｔｈｅ ＰｒｏｔｅＩｎｓ（第３版）２：１０５−２５３；ならびにＥｒＩｃｋｓｏｎら（１９７６），Ｔｈｅ ＰｒｏｔｅＩｎｓ（第３版）２：２５７−５２７；"ＰｒｏｔｅｃｔＩｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ ＯｒｇａｎＩｃ ＳｙｎｔｈｅｓＩｓ，" 第３版，Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ編，Ｊｏｈｎ ＷＩｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢＩｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ，２０００；"ＳｙｎｔｈｅｔＩｃ ＰｅｐｔＩｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ ＧｕＩｄｅ，" Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２；"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＣｏｍｂＩｎａｔｏｒＩａｌ ＆ ＳｏｌＩｄ Ｐｈａｓｅ ＯｒｇａｎＩｃ ＣｈｅｍＩｓｔｒｙ，" Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．ＣｈｒＩｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ＲｈｏｄｅｓおよびＨ．Ｈ．ＳａｎｅＩＩ編，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；"ＰｒＩｎｃＩｐｌｅｓ ｏｆ ＰｅｐｔＩｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓＩｓ第２版，" Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編，ＳｐｒＩｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；"Ｔｈｅ ＰｒａｃｔＩｃｅ ｏｆ ＰｅｐｔＩｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓＩｓ第２版，" Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＡ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編，ＳｐｒＩｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；"ＰｒｏｔｅｃｔＩｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，" Ｐ．Ｊ．ＫｏｃＩｅｎｓｋＩ編，Ｇｅｏｒｇ ＴｈＩｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４；"Ｆｍｏｃ ＳｏｌＩｄ Ｐｈａｓｅ ＰｅｐｔＩｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓＩｓ，Ａ ＰｒａｃｔＩｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，" Ｗ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰ．Ｄ．ＷｈＩｔｅ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，２０００，Ｇ．Ｂ．ＦＩｅｌｄｓら，ＳｙｎｔｈｅｔＩｃ ＰｅｐｔＩｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ'ｓ ＧｕＩｄｅ，１９９０，７７−１８３）。本発明の組成物の作製に適用される当該技術分野で公知の合成および精製法のさらなる例に関しては、例えば、ＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号およびＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号（国際公開第２００８／０８８４２２ Ａ２号として公開）（共にその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

本明細書において毒素ペプチド類似体をさらに説明する際に、天然に存在するペプチドおよびタンパク質中に一般に組み込まれる２０の個々の「標準的な」アミノ酸残基を指すために、１文字略記法がよく適用される（表１）。このような１文字略記は、意味において３文字略記または略さないアミノ酸名と完全に互換性がある。本明細書で使用される１文字略記法では、大文字はＬ−アミノ酸を表し、小文字はＤ−アミノ酸を表す。例えば、略記「Ｒ」はＬ−アルギニンを指し、略記「ｒ」はＤ−アルギニンを指す。

アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、本明細書においては通常、特定の位置におけるアミノ酸残基の１文字略記、次に、対象となる天然配列に対するアミノ酸の数字による位置により命名され、次いで置き換わって入ったアミノ酸残基に対する１文字記号がこの後に付く。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、対象となる天然配列に対するアミノ酸位置３０において、スレオニン残基がアスパラギン酸残基により置換されたことを表す。

非標準的アミノ酸残基を、組換え発現細胞を使用する既知のタンパク質工学技術を用いて本発明の範囲のペプチド内に組み込み得る。（例えば、ＬＩｎｋら、Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎＩｃａｌ ａｍＩｎｏ ａｃＩｄｓ Ｉｎ ｐｒｏｔｅＩｎ ｅｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ＯｐＩｎＩｏｎ Ｉｎ ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（６）：６０３−６０９（２００３）を参照されたい）。「非標準的アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するタンパク質内に一般に組み込まれる２０の標準的アミノ酸に含まれないＤまたはＬ型のアミノ酸残基、例えば、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化された側鎖を有するアミノ酸を指す。例としては、（Ｌ型またはＤ型の）β−アラニン、 β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ^α−エチルグリシン、Ｎ^α−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、ω−メチルアルギニン、Ｎ^α−メチルグリシン、Ｎ^α−メチルイソロイシン、Ｎ^α−メチルバリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−リン酸化セリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ^α−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジンおよびその他の同様のアミノ酸、および下の表２に記載のアミノ酸、および本明細書に記載の任意のアミノ酸の誘導体型が挙げられる。表２は、本発明に基づき有用である典型的な非標準的アミノ酸残基および本明細書で一般的に使用される関連した略記をいくつか含んでいるが、本明細書において異なる略記および命名法が同じ物質に対して適用され、互換的に表記され得ることを当業者は理解するであろう。

ＵＰＡＣ−ＩＵＢ ＪｏＩｎｔ ＣｏｍｍＩｓｓＩｏｎ ｏｎ ＢＩｏｃｈｅｍＩｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）によるアミノ酸およびペプチドの命名法および記号体系が以下の文献中に公開されている：ＢＩｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４，２１９，３４５−３７３；Ｅｕｒ．Ｊ．ＢＩｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，９−３７；１９８５，１５２，１；１９９３，２１３，２；Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，１９８４，２４，ｆｏｌｌｏｗＩｎｇ ｐ．８４；Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，１４−４２；Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，５６，５９５−６２４；ＡｍＩｎｏ ＡｃＩｄｓ ａｎｄ ＰｅｐｔＩｄｅｓ，１９８５，１６，３８７−４１０；ＢＩｏｃｈｅｍＩｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，第２版，Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ，１９９２，ｐ．３９−６９。

本発明の組成物のペプチドドメインに対する１つ以上の有用な修飾としては、既知の化学的技術により達成される、アミノ酸付加もしくは挿入、アミノ酸削除、ペプチド切断、アミノ酸置換および／またはアミノ酸残基の化学的誘導化を挙げることができる。例えば、上記のように修飾されたアミノ酸配列は、対象となる天然配列のアミノ酸配列に対して、そこに挿入または置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、その挿入または置換されたアミノ酸残基は、ペプチドをリンカーおよび／または半減期延長部分とコンジュゲートする求核または求電子反応性の官能基を含む側鎖を有する。本発明によれば、上記求核または求電子反応性の官能基の有用な例としては、チオール、一級アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、被覆（保護）アルデヒドまたは被覆（保護）ケト官能基が挙げられるが、これらに限定されない。求核反応性の官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の例としては、リジン残基、ホモリジン、α，β−ジアミノプロピオン酸残基、α，γ−ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモシステイン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基またはセレノシステイン残基が挙げられるが、これらに限定されない。

アミノ酸残基は一般に、異なる化学的および／または物理的特徴に従って分類される。「酸性アミノ酸残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な酸性残基としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基が挙げられる。「アルキルアミノ酸残基」という用語は、直線状、分岐状または環状であり得るＣ_１〜６アルキル側鎖を有する、プロリン中におけるようなアミノ酸アミンまでを含めたＤまたはＬ型のアミノ酸残基であって、Ｃ_１〜６アルキルが、Ｃ_１〜４ハロアルキル、ハロ、シアノ、ニトロ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−Ｃ（＝ＮＲ^ａ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＮＲ^ａＣ（＝ＮＲ^ａ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＯＲ^ａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＯＣ_２〜６ａｌｋｙｌＮＲ^ａＲ^ａ、−ＯＣ_２〜６ａｌｋｙｌＯＲ^ａ、−ＳＲ^ａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｂ、−Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＮＲ^ａＲ^ａ、−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｂ、−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^ｂ、−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｃ（＝ＮＲ^ａ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｂ、−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＮＲ^ａＣ_２〜６ａｌｋｙｌＮＲ^ａＲ^ａおよび−ＮＲ^ａＣ_２〜６ａｌｋｙｌＯＲ^ａから選択される、０個、１個、２個もしくは３個の置換基により置換されており；ここでは、Ｒ^ａは、各場合に独立してＨまたはＲ^ｂであり；かつＲ^ｂは、各場合に独立して、ハロ、Ｃ_１〜４アルク、Ｃ_１〜３ハロアルク、ＯＣ_１〜４アルク、−ＮＨ_２、−ＮＨ_１〜４アルクおよび−Ｎ（Ｃ_１〜４アルク）Ｃ_１〜４アルクから選択される、０個、１個、２個もしくは３個の置換基により置換されているＣ_１〜６アルキルであるアミノ酸残基；またはこれらの任意のプロトン化型を指し、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、ヒドロキシプロリンを含むが、その残基はアリールまたは芳香族基を含まない。「芳香族アミノ酸残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な芳香族残基としては、トリプトファン、チロシン、３−（１−ナフチル）アラニンまたはフェニルアラニン残基が挙げられる。「塩基性アミノ酸残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な塩基性アミノ酸残基としては、ヒスチジン、リジン、ホモリジン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジンおよびホモアルギニン（ｈＲ）残基が挙げられる。「親水性アミノ酸残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な親水性残基としては、システイン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミンおよびシトルリン（ＣＩｔ）残基が挙げられる。「脂溶性アミノ酸残基」という用語は、非荷電の脂肪族または芳香族基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な脂溶性側鎖としては、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。アラニン（Ａ）は両親媒性であり、親水性または脂溶性として作用することができる。したがって、アラニンは「脂溶性残基」および「親水性残基」の両方の定義に含まれる。「非官能性アミノ酸残基」という用語は、酸性、塩基性または芳香族基を欠く側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な中性アミノ酸残基としては、メチオニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシンおよびノルロイシン（Ｎｌｅ）残基が挙げられる。

毒素ペプチド類似体のさらなる有用な実施形態は、本明細書に開示される毒素ポリペプチドのアミノ酸配列の保存的修飾から生じ得る。保存的修飾により、こうした修飾が行われるコンジュゲートされた（例えば、ＰＥＧコンジュゲートされた）ペプチドのものと同様の機能的、物理的および化学的特徴を有する、半減期延長部分がコンジュゲートされたペプチドが生成される。本明細書に開示されるコンジュゲート毒素ペプチド類似体のこのような保存的に修飾された形態も、本発明の実施形態として意図される。

一方、ペプチドの機能的および／または化学的特徴の実質的な修飾は、（ａ）置換領域における分子骨格の構造、例えば、α−へリックス構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性または（ｃ）分子の大きさの維持に対するその効果が有意に異なる、アミノ酸配列における置換を選択することにより達成し得る。

例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する効果がほとんどまたは全くないように、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」に関して既に記載されているように、アラニンでも置換し得る（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発について論じている、ＭａｃＬｅｎｎａｎら，Ａｃｔａ ＰｈｙｓＩｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．，６４３：５５−６７（１９９８）；ＳａｓａｋＩら，１９９８，Ａｄｖ．ＢＩｏｐｈｙｓ．３５：１−２４（１９９８）を参照されたい）。

所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的に関係なく）は、このような置換が望まれるときに当業者により決定され得る。例えば、ペプチド配列の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のペプチドもしくは媒体コンジュゲートペプチド分子の親和性を増加もしくは減少させるためにアミノ酸置換を使用し得る。

天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいていくつかの種類に分類し得る：１）1) 疎水性：ノルロイシン（ＮｏｒまたはＮｌｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：ＨＩｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

保存的アミノ酸置換は、上記種類のうちの１種類のメンバーを同じ種類の別のメンバーと交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物システムでの合成ではなく、化学的ペプチド合成により通常組み込まれる、非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらは、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分のその他の逆方向または逆位の形態を含む。

非保存的置換は、上記種類のうちの１種類のメンバーを別の種類のメンバーと交換することを含み得る。このような置換残基を毒素ペプチド類似体の領域内に導入し得る。

特定の実施形態に従って上記改変を行うときには、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。それは次の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。

相互作用的な生物学的機能のタンパク質への付与におけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は当該技術分野において理解されている（例えば、Ｋｙｔｅら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．ＢＩｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照されたい）。特定のアミノ酸は、同様のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸に対して置換され、それでもなお同様の生物学的活性を保持し得ることが知られている。ある実施形態では、ハイドロパシー指標に基づいて改変を行うときには、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある実施形態では、±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。

類似したアミノ酸の置換は、特に、本明細書に開示されるような、それにより作出される生物学的に機能性のタンパク質またはペプチドが免疫学的実施形態での使用に対して意図される場合に、親水性に基づいて効率的に行われ得ることも当該技術分野において理解されている。ある実施形態では、その隣接するアミノ酸の親水性により支配される、タンパク質の局所的な最大平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性と相関がある。

以下に挙げる親水性値が上記アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。ある実施形態では、類似した親水性値に基づいて改変を行うときには、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープも同定し得る。これらの領域は「エピトープコア領域」とも呼ばれる。

保存的置換の例としては、１つの非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、ノルロイシン、アラニンもしくはメチオニンなどを別のアミノ酸残基に対して置換すること、１つの極性（親水性）アミノ酸残基を別のアミノ酸残基に対して、例えばアルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間などで置換すること、１つの塩基性アミノ酸残基、例えばリジン、アルギニンもしくはヒスチジンなどを別のアミノ酸残基に対して置換すること、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のような１つの酸性残基を別のアミノ酸残基に対して置換することを含む。「保存的アミノ酸置換」という語句は、誘導体化されていない残基の代わりに化学的に誘導体化された残基の使用も包含するが、ただし、それはそのようなポリペプチドが、必要な生物活性を示す場合である。本発明に基づき有用であり得る、他の典型的なアミノ酸置換を下の表３に記載する。

本発明の組成物の典型的な実施形態では、配列番号４に関して：
Ｘ_ａａ ^４のアルキル、塩基性または酸性アミノ酸残基がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＣＩｔ、ホモシトルリン、ＯＩｃ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、ＴＩｃ、Ｄ−ＴＩｃ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｇｕｆ、および４−アミノ−Ｐｈｅ、Ｔｈｚ、ＡＩｂ、Ｓａｒ、ＰＩｐ、ＢＩｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、ＨＩｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｎ^αメチル−Ａｒｇ；ホモアルギニン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、α−アミノアジピン酸およびパラ−カルボキシル−フェニルアラニン；またはより具体的には、Ｘ_ａａ ^４はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^９およびＸ_ａａ ^１４の酸性アミノ酸残基がそれぞれ独立して、Ｇｌｕ、Ａｓｐおよびα−アミノアジピン酸から選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^１５のアルキルまたは芳香族アミノ酸残基がＡｌａ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択され、またはより具体的には、Ｘ_ａａ ^１５のアミノ酸残基がＰｈｅ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^１６の塩基性、アルキルまたは芳香族アミノ酸残基がＬｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＰＩｐ、２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、アルファ−メチル−リジン、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）_２、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）_３、パラ−メチル−Ｐｈｅ、ＡＭｅＦ（アルファ−メチル−フェニルアラニン）およびホモＰｈｅから選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^１８およびＸ_ａａ ^３０の塩基性または酸性アミノ酸残基がそれぞれ独立して、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＨＩｓ、Ｔｒｐおよび２−フェニル酢酸（Ｐａｃ）から選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^１９、Ｘ_ａａ ^２０およびＸ_ａａ ^２９の塩基性アミノ酸残基がそれぞれ独立して、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＨＩｓ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、１ＰＩｐ、２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎαメチル−Ａｒｇ；ホモアルギニン、ＣＩｔ、Ｎα−メチル−ＣＩｔ、ホモシトルリン、Ｇｕｆおよび４−アミノ−ＰｈｅおよびＮ−Ｍｅ−Ｏｒｎから選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^２１のアルキルまたは芳香族アミノ酸残基がＮｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ［Ｏ］、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ［Ｏ_２］、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、パラ−メチル−Ｐｈｅ、アルファ−メチル−ＰｈｅおよびホモＰｈｅから選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^２６、Ｘ_ａａ ^２７、Ｘ_ａａ ^３１およびＸ_ａａ ^３４がそれぞれ独立して、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択され；かつ／あるいは
Ｘ_ａａ ^３６、Ｘ_ａａ ^３７およびＸ_ａａ ^３８のアミノ酸残基が、存在すればそれぞれ独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ−アミド、ＡＩｂ−アミド、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ−アミド、Ｔｈｒ−アミド、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−アミド、ベータ−ＡｌａおよびＮ−Ｍｅ−Ａｌａから選択される。

いくつかの実施形態では、カルボキシ末端残基がアミド化される。例えば、いくつかのＣ末端アミド化の実施形態を表１１、表１２、表１４、表１６および表１７に記載する。

組成物のいくつかの実施形態は、Ｘ_ａａ ^３５位を越えるＣ末端伸長を含む。いくつかの例を表１５および表１６に記載する。

毒素ペプチド類似体の効力、安定性、選択性および／または合成の容易さの向上に特定の有用性を有する本発明の組成物のある実施形態は、下の表４において配列番号４および天然ＳｈＫ配列と比較してまとめたような置換を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、配列番号：１０、１１、１２、１４、１５、１６、１９〜２９、３１〜３４、３６〜５０、５２、５４、５５、５６、５９、６０、６１、６３、６５〜１００、１３０〜１４０、１４２〜１７４、１７６〜２５４および２５７〜２７４から選択されるアミノ酸配列を含む、毒素ペプチド類似体を含む。

本明細書において上で述べたように、本発明に従って、本発明の組成物のペプチド部分を、既知の有機化学技術により１つ以上のアミノ酸残基において化学的に誘導体化し得る。「化学的誘導体」または「化学的に誘導体化された」は、官能性側基の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ペプチドを指す。このような誘導体化された分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他のタイプのエステル、またはヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されてＮ−Ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成し得る。また、ＬまたはＤ型を問わず２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を１つ以上含むペプチドも化学的誘導体として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに対して置換し得る；５−ヒドロキシリジンをリジンに対して置換し得る；３−メチルヒスチジンをヒスチジンに対して置換し得る；ホモセリンをセリンに対して置換し得る；およびオルニチンをリジンに対して置換し得る。

いくつかの実施形態において、有用な誘導体化には、媒体とのコンジュゲーションがＮ末端の遊離アミノ基で起こらないようにペプチドのアミノ末端が化学的にブロックされているものが含まれる。このような修飾の他の有用な効果、例えば、酵素的タンパク質分解に対する毒素ペプチド類似体の感受性の低下もあり得る。Ｎ末端を置換アミンにアシル化または修飾する、あるいは別の官能基、例えば芳香族部分（例えば、インドール酸、ベンジル（ＢｚｌもしくはＢｎ）、ジベンジル（ＤＩＢｚｌもしくはＢｎ_２）またはベンジルオキシカルボニル（ＣｂｚまたはＺ））、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンまたはクレアチンなどで誘導体化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、アシル部分、例えば特に限定されないが、ホルミル、アセチル（Ａｃ）、プロパノイル、ブタニル、ヘプタニル、ヘキサノイル、オクタノイルまたはノナノイルなどをペプチドのＮ末端と共有結合により連結してもよく、これにより、媒体とペプチドとのコンジュゲーションの間の不要な副反応を防ぐことができる。その他の典型的なＮ末端誘導体基としては、−ＮＲＲ^１（−ＮＨ_２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、スクシンイミドまたはベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（Ｃｂｚ−ＮＨ−）が挙げられ、ここでは、ＲおよびＲ^１がそれぞれ独立して水素または低級アルキルであり、かつフェニル環が、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ、クロロおよびブロモから選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい。

いくつかの実施形態では、アミノ酸残基間の１つ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）を非ペプチジル連結で置き換え得る。典型的な非ペプチジル連結は、−ＣＨ_２−カルバマート［−ＣＨ_２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホン酸、−ＣＨ_２−スルホンアミド［−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ_２−第二級アミンおよびアルキル化ペプチド［Ｒ^６が低級アルキルである−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６−］である。

いくつかの実施形態では、１つ以上の個々のアミノ酸残基を誘導体化し得る。以下に例として詳細に記載されるように、様々な誘導化剤が、選択された側鎖または末端残基と特異的に反応することが知られている。

リジニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応し、これがリジニル残基の電荷を逆転させ得る。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬としては、メチルピコリンイミダートのようなイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。

アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンを含めた、いくつかの通常試薬のいずれか１つまたは組合せとの反応により修飾し得る。アルギニル残基の誘導体化では、グアニジン官能基が高ｐＫａであるため、アルカリ性条件で反応を行う必要がある。さらに、上記試薬はアルギニンイプシロン−アミノ基のみならず、リジン基とも反応し得る。

チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入という目的で、広く研究されてきた。Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌＩｍＩｄＩｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するのが最も一般的である。

カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）との反応により選択的に修飾し得る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基を、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換し得る。

グルタミルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化し得る。あるいは、これらの残基を弱酸性条件下で脱アミド化する。上記残基のいずれの形態も本発明の範囲内にある。

システイニル残基は、アミノ酸残基または他の部分に置き換えて、ジスルフィド結合を除去するか、または逆に架橋を安定化することができる。（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：３８１４−３８１９（１９９６）を参照されたい）。

二官能性物質による誘導体化は、ペプチドまたはその機能性誘導体を、不水溶性の支持基質または必要に応じて他の高分子媒体と架橋するのに有用である。一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３'−ジチオビス（スクシンイミジルスルホナート）のようなジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダート（ｐｒｏｐＩｏＩｍＩｄａｔｅ）のような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生じる。あるいは、例えば米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；および第４，３３０，４４０号に記載のような、臭化シアン活性化糖質などの反応性の不水溶性基質および反応性基質をタンパク質固定化に使用する。

他の可能な修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化が挙げられる。（ＣｒｅＩｇｈｔｏｎ，ＰｒｏｔｅＩｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰｒｏｐｅｒｔＩｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ ＦｒａｎｃＩｓｃｏ），７９−８６（１９８３））。

上記誘導体化の例は、網羅することを意図するものではなく、単なる具体例に過ぎない。

組成物の生成には、適用できる場合、適当なタンパク質精製技術も含まれ得る。本発明の組成物のいくつかの実施形態では、定量または検出を容易にするために適当な同位体標識（例えば、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^１３Ｃ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^２Ｈ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^１７Ｏなど）を含むよう調製し得る。

半減期延長部分
任意で、分子の薬物動態プロファイルを治療の必要性に合わせて調節するために、本発明の組成物は様々な質量および構造の半減期延長部分を１つ以上含んでもよく、その１つまたは複数の半減期延長部分または部分は、毒素ペプチド類似体と共有結合により融合、付着、連結またはコンジュゲートし得る。「半減期延長部分」は、タンパク質分解または活性を減少させる他の化学修飾によるインビボ分解を阻止または軽減する、インビボ半減期または特に限定されないが、吸収率の増加のなどの他の薬物動態特性を増加させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、溶解性を向上させる、対象となる標的に対する毒素ペプチド類似体の生物学的活性および／または標的選択性を増大させる、および／または非コンジュゲート型の毒素ペプチド類似体と比べて製造可能性を高める分子を指す。本発明に従えば、半減期延長部分は薬学的に許容されるものである。

半減期延長部分は、本発明の組成物が、インビボでの腎臓ろ過による排除をブロックするのに十分な流体力学的サイズを得るように選択し得る。例えば、実質的に直鎖、分岐鎖（ｂｒ）または樹状形態の高分子である半減期延長部分を選択し得る。あるいは、インビボにおいて本発明の組成物が血清タンパク質と結合して複合体を形成し、こうして形成された複合体が実質的な腎クリアランスを回避するように、半減期延長部分を選択し得る。半減期延長部分は、例えば、脂質；コレステロール類（ステロイドなど）；炭水化物もしくはオリゴ糖；またはサルベージ受容体と結合する任意の天然もしくは合成のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドであり得る。

使用し得る典型的な半減期延長部分半減期延長部分としては、本発明に従えば、免疫グロブリンＦｃドメインもしくはその一部分、または生物学的に適したポリマーもしくはコポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール化合物が挙げられる。その他の適当なポリアルキレングリコール化合物としては、以下のタイプの荷電または中性ポリマー：デキストラン、ポリリジン、コロミン酸もしくは他の糖質系ポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの単量体融合タンパク質の実施形態では、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖を含む）またはその一部分、好ましくはヒト起源の免疫グロブリンを半減期延長部分として使用し得が、これには、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４など（これらに限定されない）の任意の免疫グロブリンが含まれる。

半減期延長部分の他の例としては、本発明に従えば、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジンもしくはポリオルニチン）、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖状もしくは分岐状グリコシル化鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族類、またはポリシアル酸が挙げられる（例えば、ＰｏｌｙＸｅｎ（商標）技術；その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＧｒｅｇｏｒＩａｄＩｓら，ＩｍｐｒｏｖＩｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ｅｆｆＩｃａｃｙ ｏｆ ｐｅｐｔＩｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅＩｎｓ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｏｌｙｓＩａｌＩｃ ａｃＩｄｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃｓ，３００：１２５−３０（２００５））。

組成物の他の実施形態では、半減期延長部分は、毒素ペプチド類似体のＮ末端と共有結合により連結された陰イオン荷電化学物質であり、この陰イオン荷電化学物質としては、特に限定されないがリン酸化チロシン、リン酸化セリン、ｐ−ホスホノ（ジフルオロ−メチル）−フェニルアラニン（Ｐｆｐ）、ｐ−ホスホノ−メチル−フェニルアラニン（Ｐｍｐ）、ｐ−ホスファチジル−フェニルアラニン（Ｐｐａ）またはｐ−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン（Ｐｋｐ）が挙げられ、これらは共有結合により、任意で本明細書に記載のようにＡＥＥＡリンカーまたは他のリンカーを介して間接的に、毒素ペプチド類似体のＮ末端と連結し得る（Ｃｈａｎｄｙら，Ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ａｎｄ ｔｈｅＩｒ ｕｓｅｓ Ｉｎ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ＩｎｈＩｂＩｔＩｏｎ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ，国際公開第２００６／０４２１５１ Ａ２号；Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，ＥｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ｂｌｏｃｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｅｌ Ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｆａｓｔ Ｆｏｒｗａｒｄ，２００９年１月２日にｄｏＩ：１０．１１２４／ｍｏｌ．１０８．０５２７０４として公開（２００９）（これらはすべてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ＡＥＥＡとは２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸としても知られる）のことである。（例えば、Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）を参照されたい）。

半減期延長部分の他の実施形態には、本発明に従えば、生理的条件下の温度、ｐＨおよびイオン強度で長半減期血清タンパク質に対する結合親和性を有する、ペプチドリガンドまたは小（有機）分子リガンドが含まれる。例としては、アルブミン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、チロキシン結合グロブリン結合ペプチドもしくは小分子リガンド、抗体結合ペプチドもしくは小分子リガンド、または長半減期血清タンパク質に対する親和性を有する別のペプチドもしくは小分子リガンドが挙げられる。（例えば、Ｂｌａｎｅｙら，Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ｆｏｒ ＩｎｃｒｅａｓＩｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌＩｆｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ａｃｔＩｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｂｙ ｂＩｎｄＩｎｇ ｔｏ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔＩｎ−ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｌＩｇａｎｄｓ，米国特許第５，７１４，１４２号；Ｓａｔｏら，Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍＩｎ ｂＩｎｄＩｎｇ ｍｏＩｅｔＩｅｓ，米国特許出願公開第２００３／００６９３９５Ａ１号；Ｊｏｎｅｓら，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃａｌ ａｃｔＩｖｅ コンジュゲートｓ，米国特許第６，３４２，２２５号を参照されたい）。「長半減期血清タンパク質」は、いわゆる「担体タンパク質」（アルブミン、トランスフェリンおよびハプトグロビンなど）、フィブリノーゲンおよび他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害物質、アンジオテンシンおよびブラジキニンのような物質の前駆体、ならびに他の多くの種類のタンパク質を含めた、哺乳動物血漿中に溶解している何百もの異なるタンパク質の１つである。本発明は、特に限定されないが本明細書に記載のような薬学的に許容される半減期延長部分の任意の単一種の使用、あるいは２つ以上の異なる半減期延長部分、例えばＰＥＧと免疫グロブリンＦｃドメインもしくはＦｃのＣＨ２ドメインのようなその一部分（例えば、ＦｅＩｇｅら，ＭｏｄＩｆＩｅｄ ｐｅｐｔＩｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ａｇｅｎｔｓ，米国特許第６，６６０，８４３号を参照されたい）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；例えば、Ｒｏｓｅｎら，ＡｌｂｕｍＩｎ ｆｕｓＩｏｎ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，米国特許第６，９２６，８９８号および米国特許出願公開第２００５／００５４０５１号；ＢｒＩｄｏｎら，ＰｒｏｔｅｃｔＩｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ｐｅｐｔＩｄｅｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔＩｄａｓｅ ａｃｔＩｖＩｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ コンジュゲーション ｔｏ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，米国特許第６，８８７，４７０号を参照されたい）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；例えば、Ｗａｌｋｅｒら，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔＩｎ ｐｅｐｔＩｄｅ／ｐｒｏｔｅＩｎ ｆｕｓＩｏｎｓ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌＩｆｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ａｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅｓ／ｐｒｏｔｅＩｎｓ，米国特許出願公開第２００３／０１９５１５４ Ａ１号；第２００３／０１９１０５６ Ａ１号を参照されたい）またはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）などの組合せ、あるいは例えばＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている、免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）とＦｃドメイン（ヘテロ三量体の組合せ、いわゆる「ヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）」）のような組合せの使用を包含する。

毒素ペプチド類似体（１つまたは複数）と１つまたは複数の半減期延長部分とのコンジュゲーションは、毒素ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端を介するか、あるいはＦ１が毒素ペプチド類似体のＮ末端の方により接近して連結される、その一次アミノ酸配列に関して介在性であり得る。

特に有用な半減期延長部分としては、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含めたヒト免疫グロブリン）である。「免疫グロブリン」という用語は、それぞれが軽鎖（ＬＣ）と共有結合で連結している２本の二量体化された重鎖（ＨＣ）を含む完全抗体；１本の二量体化されていない重鎖および共有結合で連結した軽鎖（ＨＣ＋ＬＣ）；またはキメラ免疫グロブリン（軽鎖＋重鎖）−Ｆｃヘテロ三量体（いわゆる「ヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）」）を包含する。

「抗体」または互換的に「Ａｂ」は四量体糖タンパク質である。天然に存在する抗体では、各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１つの約２００アミノ酸（約２５ｋＤａ）の「軽」鎖および１つの約４４０アミノ酸（約５０〜７０ｋＤａ）の「重」鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主として抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる「可変」（「Ｖ」）領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分では、主としてエフェクター機能に関与する定常領域が定められている。可変領域は異なる抗体の間で異なっている。定常領域は異なる抗体の間で同じである。各重鎖または軽鎖の可変領域内には、抗原に対する抗体の特異性決定に役立つ３つの超可変小領域が存在する。超可変領域の間の可変ドメイン残基は、フレームワーク残基と呼ばれ、一般に異なる抗体の間でやや相同的である。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって異なるクラスに割り当てることができる。ヒト軽鎖はカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、さらに重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，第２版 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本発明の範囲においては、「抗体」は、組換えにより作製された抗体およびグリコシル化を欠く抗体も包含する。

「軽鎖」または「免疫グロブリン軽鎖」という用語は、完全長軽鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを包含する。完全長軽鎖は、１つの可変領域ドメイン（Ｖ_Ｌ）および１つの定常領域ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む。軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖にはカッパ鎖およびラムダ鎖がある。

「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という用語は、完全長重鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを包含する。完全長重鎖は、１つの可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）および３つの定常領域ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）を含む。Ｖ_Ｈドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、Ｃ_Ｈドメインはカルボキシル末端にあり、Ｃ_Ｈ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖はミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）に分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥという抗体アイソタイプを定める。本発明の個々の実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含めた任意のアイソタイプであり得る。これらのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分かれ得る。異なるＩｇＧアイソタイプは、異なるエフェクター機能（Ｆｃ領域により仲介される）、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などを有し得る。ＡＤＣＣでは、抗体のＦｃ領域がナチュラルキラーおよびマクロファージのような免疫エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と結合し、標的細胞の貪食または溶解を引き起こす。ＣＤＣでは、抗体が細胞表面で補体カスケードを誘起することにより、標的細胞を殺す。

「Ｆｃ領域」または本明細書において互換的に使用される「Ｆｃドメイン」もしくは「免疫グロブリンＦｃドメイン」は、完全抗体においては抗体のＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインを含む、２つの重鎖フラグメントを含む。この２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用により結び付けられている。

「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４）のインビボ血中半減期の増加に関与するＩｇＧ分子Ｆｃ領域のエピトープを指す。

「アロタイプ」とは、多くの場合は定常領域における、抗体配列のバリエーションのことであり、免疫原性になることができ、ヒトでは特定の対立遺伝子によりコードされている。５つのヒトＩＧＨＣ遺伝子、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２およびＩＧＨＥ遺伝子に対するアロタイプが同定されており、それぞれＧ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍおよびＥｍアロタイプと命名されている。次の少なくとも１８のＧｍアロタイプが知られている：ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）。２つのＡ２ｍアロタイプ、Ａ２ｍ（１）およびＡ２ｍ（２）が存在する。

抗体の構造および生成の詳細な説明に関しては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＣｒａＩｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）を参照されたい。簡潔には、重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡ生成のプロセスは、主として発達中のＢ細胞内で起こる。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの再編成および連結前は、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは一般に、単一染色体上で比較的近接して見られる。Ｂ−細胞分化の間に、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または、軽鎖遺伝子の場合、ＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの適当な各ファミリーメンバーの１つが組み合わさって、機能的に再編成された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の可変領域を形成する。この遺伝子セグメント再編成のプロセスは逐次的であると思われる。最初に重鎖ＤとＦの連結が生じ、次いで、重鎖ＶとＤＪの連結および軽鎖ＶとＪの連結が起こる。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再編成に加え、軽鎖のＶセグメントとＪセグメントが連結され、重鎖のＤセグメントとＪセグメントが連結される位置における様々な組換えにより、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおけるさらなる多様性が生じる。軽鎖におけるこのようなバリエーションは、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内で生じる。連結における同様の不正確性が重鎖染色体上でＤセグメントとＪ_Ｈセグメントとの間に生じ、１０ヌクレオチドにも及び得る。さらに、Ｄ遺伝子セグメントとＪ_Ｈ遺伝子セグメントの間およびＶ_Ｈ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントの間に、ゲノムＤＮＡにコードされていないヌクレオチドがいくつか挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として知られている。可変領域遺伝子セグメントにおける上記再編成および上記連結中に生じ得る可変的な組換えの最終的な効果は、一次抗体レパートリーの生成である。

「超可変」領域という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲ［すなわち、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰｒｏｔｅＩｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇＩｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版 ＰｕｂｌＩｃ Ｈｅａｌｔｈ ＳｅｒｖＩｃｅ，ＮａｔＩｏｎａｌ ＩｎｓｔＩｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）による記載のように、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）］由来のアミノ酸残基を含む。単一のＣＤＲでも抗原を認識しこれと結合し得るが、すべてのＣＤＲを含んだ全抗原結合部位よりも親和性は低い。

超可変「ループ」由来の残基の別の定義がＣｈｏｔｈＩａら，Ｊ．Ｍｏｌ．ＢＩｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）のように記載されている。

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、超可変領域残基以外の可変領域残基のことである。

「抗体フラグメント」は、インタクトな完全長抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａら，ＰｒｏｔｅＩｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントが生じ、これらはそれぞれ単一の抗原結合部位と、定常領域を含む残存「Ｆｃ」フラグメントとを有する。Ｆａｂフラグメントは、すべての可変ドメイン、ならびに軽鎖定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆｃフラグメントは糖質を提示し、１つの抗体クラスを別のクラスから区別する多くの抗体エフェクター機能（補体および細胞受容体との結合など）に関与する。

ペプシン処理により、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む２つの「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントを有するＦ（ａｂ'）_２フラグメントが生じ、ここでは、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、数個の追加の残基を含むことにより、Ｆａｂ'フラグメントとは異なる。Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗体結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含むことが好ましい。ｓｃＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔＩｂｏｄＩｅｓ，第１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，ＳｐｒＩｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。

「Ｆａｂフラグメント」は１本の軽鎖と１本の重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域とからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

「Ｆａｂ'フラグメント」は、１本の軽鎖と１本の重鎖の一部分とを含み、この重鎖がＶ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメイン、さらにはＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の領域も含んでいるため、２つのＦａｂ'フラグメントの２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成して、Ｆ（ａｂ'）_２分子を形成することができる。

「Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント」は、２本の軽鎖と２本の重鎖とを含み、この重鎖がＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の定常領域の一部分を含むため、２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ'）_２フラグメントは、２本の重鎖間のジスルフィド結合により結び付いた２つのＦａｂ'フラグメントからなる。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合により強く会合した１本の重鎖可変ドメインと１本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この立体配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位が定められる。単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む、Ｆｖの半分）は、抗原を認識しそれと結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性は低い。

「一本鎖抗体」とは、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーで連結されて単一のポリペプチド鎖を形成し、これが抗原結合領域を形成しているＦｖ分子のことである。一本鎖抗体については、国際特許出願公開第８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３において詳細に論じられており、その開示はその内容全体が参照により組み込まれる。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在し、またＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを任意に含む（ＢＩｒｄら，ＳｃＩｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８ およびＨｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。「Ｆｄ」フラグメントはＶ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインからなる。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同一ポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上において２つのドメイン間で対形成できない程度の短いリンカーを用いて、ドメインを強制的に別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作出する。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌＩｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより完全に記載されている。

「ドメイン抗体」とは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のみを含む、免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントのことである。いくつかの場合では、２つ以上のＶ_Ｈ領域をペプチドリンカーにより共有結合的に連結して、二価ドメイン抗体を作出する。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同じかまたは異なる抗原を標的とし得る。

「ＤＮＰ」または「ジニトロフェノール」という用語は、本明細書においては互換的に使用され、抗原２，４−ジニトロフェノールを表す。「抗ＤＮＰ」または「αＤＮＰ」または「ａＤＮＰ」は、本明細書においては、ＤＮＰと特異的に結合する抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗体フラグメントを指すために互換的に使用される。

「ＫＬＨ」または「キーホールリンペットヘモシアニン」という用語は、本明細書においては互換的に使用され、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）ＭａｒＩｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙｈｏｌｅ ＬＩｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎＩｎ（ｍｃＫＬＨ；ＰＩｅｒｃｅ ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を表す。製造業者によれば、ｍｃＫＬＨは、野生集団から採取されたものではなく、海洋養殖で育成された軟体動物のスカシガイ（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａ）（キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌＩｍｐｅｔ））の厳選された集団から収集されたものであり；ＫＬＨは高い分子質量を有し（４．５×１０^５〜１．３×１０^７ダルトンの３５０および３９０ｋＤａサブユニットの混合凝集体）、ＢＳＡまたはオボアルブミンよりも強い免疫応答を誘発する。「抗ＫＬＨ」または「αＫＬＨ」または「ａＫＬＨ」は、本明細書においては、ＫＬＨと特異的に結合する抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗体フラグメントを指すために互換的に使用される。

「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する分子の一部分のことである。この用語は、抗体のような抗原結合タンパク質またはＴ細胞受容体と特異的に結合することができる任意の決定基を包含する。エピトープは連続または不連続（例えば、単一鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中では互いに隣接していないが、分子という枠において抗原結合タンパク質と結合するアミノ酸残基）であり得る。ある実施形態では、エピトープは、それが抗原結合タンパク質を生成するのに使用されるエピトープと同様の三次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を生成するのに使用されるそのエピトープ中に見られるアミノ酸残基を全く含まないか、またはその一部のみを含むという点で模倣性であり得る。エピトープはタンパク質上に存在する場合が最も多いが、核酸のような他の種類の分子上に存在し得る場合もある。エピトープ決定基は、化学的に活性な、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基のような表面分子集団を含んでいてもよく、特定の三次元構造特性および／または特定の荷電特性を有していてもよい。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。

「同一性」という用語は、配列を整列させて比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の間の関係を指す。「パーセント同一性」は、比較分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間で一致する残基のパーセントを意味し、比較分子中で最小のものの大きさに基づき計算される。こうした計算では、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により、配列比較におけるギャップ（存在する場合）に対処しなければならない。配列比較される核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用し得る方法としては、ＣｏｍｐｕｔａｔＩｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢＩｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ ＵｎＩｖｅｒｓＩｔｙ Ｐｒｅｓｓ；ＢＩｏｃｏｍｐｕｔＩｎｇ ＩｎｆｏｒｍａｔＩｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（ＳｍＩｔｈ，Ｄ．Ｗ．編），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍＩｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＡｎａｌｙｓＩｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（ＧｒＩｆｆＩｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒＩｆｆＩｎ，Ｈ．Ｇ．編），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ ＨｅＩｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＡｎａｌｙｓＩｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢＩｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍＩｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＡｎａｌｙｓＩｓ ＰｒＩｍｅｒ，（ＧｒＩｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＣａｒＩｌｌｏら，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．ＡｐｐｌＩｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されている方法が挙げられる。例えば、配列同一性を、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般的に用いられる標準的方法により決定し得る。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを用いて、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドの配列を、それぞれの残基の最適マッチングに関して（一方または両方の配列の完全長にわたって、または一方もしくは両方の配列のあらかじめ決められた部分にわたって）配列比較する。これらのプログラムは、デフォルト開始ペナルティおよびデフォルトギャップペナルティを与え、コンピュータプログラムと併せてＰＡＭ２５０のようなスコア行列［標準的なスコア行列；Ｄａｙｈｏｆｆら，Ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ ＰｒｏｔｅＩｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５巻，ｓｕｐｐ．３（１９７８）を参照されたい］を使用し得る。そして、例えば、パーセント同一性を以下のように計算することができる：同一マッチの総数に１００を乗じ、次いで、マッチスパン中の長い方の配列の長さの合計および２つの配列を配列比較するために長い方の配列に挿入したギャップ数で割る。パーセント同一性を計算する際には、配列間で最大のマッチが得られるように、比較する配列を整列させる。

ＧＣＧプログラムパッケージは、パーセント同一性を決定するために使用し得るコンピュータプログラムであり、このパッケージにはＧＡＰが含まれる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌ．ＡｃＩｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；ＧｅｎｅｔＩｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，ＵｎＩｖｅｒｓＩｔｙ ｏｆ ＷＩｓｃｏｎｓＩｎ，ＭａｄＩｓｏｎ，ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムであるＧＡＰを用いて、パーセント配列同一性を決定する２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドを配列比較する。それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適マッチに関して配列を比較する（アルゴリズムにより決定される「マッチスパン」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角の３倍として計算され、ここでは「平均対角」とは、使用される比較行列の対角の平均であり；「対角」とは、特定の比較行列により完全なアミノ酸マッチそれぞれに割り当てられるスコアまたは数値のことである）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１０分の１である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較行列をアルゴリズムと併せて使用する。ある実施形態では、標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列に関しては、Ｄａｙｈｏｆｆら，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ ＰｒｏｔｅＩｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２；ＬＯＳＵＭ６２比較行列に関しては、ＨｅｎＩｋｏｆｆら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）もアルゴリズムにより使用される。

ＧＡＰプログラムを用いた、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列のパーセント同一性決定のための推奨されるパラメーターは以下のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．ＢＩｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較行列：ＨｅｎＩｋｏｆｆら，１９９２，（上記）のＢＬＯＳＵＭ 62；
ギャップペナルティ：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
同一性の閾値：０。

２つのアミノ酸配列を配列比較するための特定の配列比較スキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングを生じ得、この短い配列比較領域は、２つの完全長配列の間に有意な関係がなくても、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、必要であれば、目的ポリペプチドの少なくとも５０の隣接アミノ酸にわたる配列比較が得られるように、選択された配列比較法（ＧＡＰプログラム）を調節し得る。

「修飾」という用語は、本発明の抗体および抗体フラグメントを含めた免疫グロブリンとの連結において使用される場合、１つ以上のアミノ酸改変（置換、挿入または削除を含む）；化学修飾；治療または診断剤とのコンジュゲーションによる共有結合的修飾；標識（例えば、放射性核種または様々な酵素による）；ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）のような共有結合によるポリマー付加；および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換を包含するが、これらに限定されない。

「誘導体」という用語は、本発明の範囲内の免疫グロブリン（抗体および抗体フラグメントを含む）に関連して使用される場合、治療または診断剤とのコンジュゲーション、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）のような共有結合によるポリマー付加および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換により、共有結合的に修飾された免疫グロブリンタンパク質を指す。本発明の誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を保持する。

本発明のいくつかの実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、アロタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＦｃを含めたヒト免疫グロブリンＦｃドメイン）またはその一部分（例えば、ＦｃドメインのＣＨ２ドメイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、あるいはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、特に分子量約１０００Ｄａ〜約１００００ＤａのＰＥＧである。

一価二量体または二価二量体Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合体は、本発明の組成物の有用な実施形態である。「一価二量体」Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合体または互換的に「一価二量体」または互換的に「一価ヘテロ二量体」とは、二量体化Ｆｃドメインの一方のみとコンジュゲートされた毒素ペプチド類似体を含むＦｃ−毒素ペプチド類似体融合体のことである（例えば、ＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号およびＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）（共にその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）の図２Ｂに模式的に示されている）。「二価二量体」Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合体または互換的に「二価二量体」または互換的に「二価ホモ二量体」とは、それぞれが別々に毒素ペプチド類似体とコンジュゲートされた二量体化Ｆｃドメインの両方を有するＦｃ−毒素ペプチド類似体融合体のことである（例えば、ＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号およびＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）の図２Ｃに模式的に示されている）。

免疫グロブリンＦｃドメインはＦｃバリアントを含み、これらは本発明の範囲内の適当な半減期延長部分である。サルベージ受容体との結合が維持される限り、本発明に従って天然Ｆｃを大幅に改変しＦｃバリアントを形成し得る；例えば、国際公開第９７／３４６３１号、同第９６／３２４７８号および同第０４／１１０４７２号を参照されたい。このようなＦｃバリアントでは、本発明の融合分子に必要とされない構造的特性または機能的活性をもたらす、天然Ｆｃの１つ以上の部位を除去し得る。こうした部位は、例えば、残基の置換もしくは削除、その部位への残基の挿入、またはその部位を含む部分の切断により除去し得る。挿入または置換される残基は、ペプチド模倣物またはＤ−アミノ酸のような改変アミノ酸であってもよい。Ｆｃバリアントは多くの理由で望ましいものであり得るが、その理由のうちのいくつかを以下に記載する。典型的なＦｃバリアントは次のような分子および配列を含む：
１．ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去されている。こうした除去により、本発明の分子を生成するために使用する宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。この目的で、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを切断するか、またはシステイン残基を削除するもしくは他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換することができる。具体的には、配列番号２７８のＮ末端の２０アミノ酸セグメントを切断するか、または配列番号２７８の７および１０位のシステイン残基を削除もしくは置換することができる。システイン残基が除去された場合でも、単一鎖Ｆｃドメインは依然として、非共有結合により結び付ついた二量体Ｆｃドメインを形成し得る。
２．選択された宿主細胞との適合性が増すように天然Ｆｃが改変されている。例えば、典型的な天然ＦｃのＮ末端近くのＰＡジペプチド配列は、プロリンイミノペプチダーゼのような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌＩ）の消化酵素により認識され得るが、これを除去することができる。また、特に、分子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌＩ）のような細菌細胞内で組換えにより発現される場合、Ｎ末端メチオニン残基を付加することもできる。配列番号２７８（図２７Ａ〜Ｂ）のＦｃドメインがこのようなＦｃバリアントの１つである。
３．選択された宿主細胞内で発現される際のＮ末端の不均一性を防ぐために、天然ＦｃのＮ末端の一部分が除去されている。この目的で、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基のいずれか、特に１、２、３、４および５位の残基を除去することができる。
４．１つ以上のグリコシル化部位が除去されている。通常にグリコシル化されている残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解反応をもたらし得る。このような残基は、削除するか、または非グリコシル化残基（例えば、アラニン）で置換することができる。
５．Ｃ１ｑ結合部位のような、補体との相互作用に関与する部位が除去されている。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫトリペプチド配列を削除または置換することができる。補体動員は本発明の分子に有利でない場合があるため、このようなＦｃバリアントでそれを回避することができる。
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合に影響を与える部位が除去されている。天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要ではない、特定の白血球細胞と相互作用するための部位を有し得るため、これを除去することができる。
７．ＡＤＣＣ部位が、ＡＤＣＣエフェクター機能を低下させるか、もしくは消去するために除去されている、またはＡＤＣＣエフェクター機能増強のために、非フコシル化または脱フコシル化により修飾されている。ＡＤＣＣ部位は当該技術分野で公知であり；ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関しては、例えば、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照されたい。また、この部位は本発明の融合分子に必要ではないため、必要に応じて、除去するかまたはＡＤＣＣエフェクター機能のために増強することができる。（ＩＩｄａら，Ｔｗｏ ｍｅｃｈａｎＩｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔＩｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘＩｃＩｔｙ（ＡＤＣＣ）ｅｆｆＩｃａｃｙ ｏｆ ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ａｎｔＩｂｏｄＩｅｓ Ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ９：５８ ｄｏＩ：１０．１１８６／１４７１−２４０７−９−５８（２００９）を参照されたい）。
８．天然Ｆｃが非ヒト抗体由来である場合、その天然Ｆｃをヒト化することができる。通常、天然Ｆｃをヒト化するためには、非ヒト天然Ｆｃ中の選択された残基を、ヒト天然Ｆｃでは通常見られない残基で置換する。抗体ヒト化の技術は当該技術分野で公知である。９．米国特許第７，４４２，７７８Ｂ２号に開示されているように、免疫グロブリンＦｃドメインのループ領域内の１つまたは複数の内部コンジュゲーション部位に１つ以上の毒素ペプチド類似体配列を挿入することができる。「ループ」領域または「Ｆｃループ」領域という用語は、ループ領域由来の一次構造のＮ末端およびＣ末端側で直接、α−へリックスまたはβ−シートのような二次構造を含む２つの領域を連結する、アミノ酸残基の一次配列を指す。例としては、ＣＨ２またはＣＨ３ループ領域が挙げられるが、これらに限定されない。ループ領域は、それ自体は二次構造を含まないが、二次以上のタンパク質構造に影響または寄与し得ることを当業者は理解する。「内部」コンジュゲーション部位という用語は、１つまたは複数の毒素ペプチド類似体部分が非末端性である、すなわち、Ｆｃドメインのα−アミノ部位またはα−カルボキシ部位を介しないことを意味するが、任意に、ＦｃドメインのＮ末端および／またはＣ末端において末端にコンジュゲートされた追加部分も存在し得る。（例えば、本明細書の実施例１１、実施例１２、表４Ｈおよび表４Ｌを参照されたい）。
１０．適当な長さで中性電荷のリンカー、例えば「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２９３）または「Ｌ２０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号８６）などを、Ｆｃドメインの１つの単量体のＣ末端と第二Ｆｃドメイン単量体のＮ末端との間で共有結合により融合させ、毒素ペプチド類似体を、第一Ｆｃドメイン単量体のＮ末端または第二Ｆｃドメイン単量体のＣ末端、あるいは第一および／または第二Ｆｃドメイン単量体のループ領域内に融合させることができる。このような分子は、細菌または哺乳動物細胞内で組換えにより発現されて、Ｆｃ単量体間に典型的なジスルフィド結合形成を有するバリアント「一価二量体」Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合体を生成し得る。（例えば、本明細書の実施例１３を参照されたい）。

Ｆｃバリアントの他の例としては、以下のものが挙げられる：配列番号２７８において、１５位のロイシンをグルタミン酸で；９９位のグルタミン酸をアラニンで；ならびに１０１および１０３位のリジンをアラニンでそれぞれ置換し得る。さらに、フェニルアラニン残基で１つ以上のチロシン残基を置き換え得る。本発明の目的のために、バリアントＦｃドメインは単量体免疫グロブリン重鎖、抗体またはヘテロ三量体ヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）（ＬＣ＋ＨＣ＋Ｆｃ）の一部でもあり得る。

別の半減期延長部分は、サルベージ受容体と結合することができるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメントまたは小分子（例えば、ペプチド模倣化合物）であり得る。例えば、Ｐｒｅｓｔａらに対して１９９８年４月１４日に発行された米国特許第５，７３９，２７７号に記載のようなポリペプチドを半減期延長部分として使用し得る。ペプチドは、ＦｃＲｎサルベージ受容体との結合に関してファージディスプレイにより選択することもできる。このようなサルベージ受容体結合化合物も「半減期延長部分」の意味に包含され、本発明の範囲内にある。上記半減期延長部分は、半減期の増加（例えば、プロテアーゼにより認識される配列の避けることによる）および免疫原性の減少（例えば、抗体ヒト化において見出されるような、非免疫原性の配列を優先することによる）に関して選択しなければならない。

上記のように、ポリマー性半減期延長部分も使用し得る。半減期延長部分として有用な化学的部分を付加するための様々な手段が現在利用可能であり、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｎ−ＴｅｒｍＩｎａｌｌｙ ＣｈｅｍＩｃａｌｌｙ ＭｏｄＩｆＩｅｄ ＰｒｏｔｅＩｎ ＣｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」という題名の特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号を参照されたい。このＰＣＴ出願では、特にタンパク質Ｎ末端への水溶性ポリマーの選択的付加が開示されている。

本発明の組成物いくつかの実施形態では、ポリマー性半減期延長部分は、毒素ペプチド類似体のＮ末端、Ｃ末端において、または１つ以上の介在側鎖において共有結合により連結されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本発明の組成物のいくつかの実施形態には、非ＰＥＧ半減期延長部分もしくは毒素ペプチド類似体、またはこれらの任意の組合せとコンジュゲートされた１つ以上のＰＥＧ部分がさらに含まれる。例えば、本発明の組成物中のＦｃドメインまたはその一部分は、還元的アルキル化のプロセスによりモノ−ペグ化、ジ−ペグ化または多−ペグ化し得る。

タンパク質およびペプチドとポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）との共有結合コンジュゲーションは、治療用タンパク質のインビボ循環血中半減期を著しく延長するための方法として広く認められてきた。ＰＥＧ化は、主に腎クラランスを遅らせることによりこの効果をもたらすが、これはＰＥＧ部分がタンパク質の流体力学的半径を大幅に増加させるからである。（ＺａｌＩｐｓｋｙ，Ｓ．ら，Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔＩｏｎａｌＩｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｓ ｆｏｒ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅｓ．，Ｉｎ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍＩｓｔｒｙ：ＢＩｏｔｅｃｈｎＩｃａｌ ａｎｄ ｂＩｏｍｅｄＩｃａｌ ａｐｐｌＩｃａｔＩｏｎｓ．，Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒＩｓ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．，３４７−３７０（１９９２））。タンパク質およびペプチドのＰＥＧ化によりしばしばもたらされる、さらなる利益としては、溶解性の増加、タンパク質分解に対する耐性および治療用ポリペプチドの免疫原性の減少が挙げられる。タンパク質ＰＥＧ化の利点は、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（Ａｄａｇｅｎ（商標）／Ｅｎｚｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（商標）／Ｅｎｚｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（商標）／ＳｃｈｅｒＩｎｇ／Ｅｎｚｏｎ）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（商標）／Ｒｏｃｈｅ）およびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（商標）／Ａｍｇｅｎ）ならびに臨床試験中の他の多くのものを含めたいくつかのペグ化タンパク質の商品化によって証明される。

「ペグ化ペプチド」または「ペグ化タンパク質」は、ペプチド自体のアミノ酸残基またはペプチドの残基と共有結合したペプチジルもしくは非ペプチジルリンカーと共有結合しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有するペプチドを意味する。

「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、ポリアルキレングリコール化合物、あるいはカップリング剤、またはカップリングもしくは活性化部分による（例えば、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジド、チオール、トリフラート、トレシラート、アジルジン（ａｚＩｒｄＩｎｅ）、オキシラン、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドまたはマレイミド部分による）誘導体化によるかまたはそれによらない、その誘導体を意味する。本発明に従えば、有用なＰＥＧとしては、実質的に直線状の直鎖ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ（ｂｒＰＥＧ）または樹状ＰＥＧが挙げられる。（例えば、ＭｅｒｒＩｌｌ，米国特許第５，１７１，２６４号；ＨａｒｒＩｓら，ＭｕｌｔＩａｒｍｅｄ，ｍｏｎｏｆｕｎｃｔＩｏｎａｌ，ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｏｒ ｃｏｕｐｌＩｎｇ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ，米国特許第５，９３２，４６２号；Ｓｈｅｎ，Ｎ ｍａｌｅＩｍＩｄｙｌ ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ，米国特許第６，６０２，４９８号を参照されたい）。

簡潔には、ＰＥＧ基は一般に、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基）から本発明の化合物上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基）に及ぶアシル化または還元的アルキル化（または還元的アミノ化）を介して、本発明の組成物のペプチド部分に付加される。

合成ペプチドのＰＥＧ化に有効な方法は、それぞれ互いに相手に対して反応性である特有の官能性を有するペプチドとＰＥＧ部分を、溶液中でのコンジュゲート結合形成により結合させることからなる。ペプチドは、従来の固相合成法（例えば、本明細書の図５および６ならびに添付の文を参照されたい）により容易に調製し得る。ペプチドを特定部位の適当な官能基で「予め活性化」させる。ＰＥＧ部分との反応の前に、前駆体を精製して十分に特徴付けする。ペプチドとＰＥＧとの連結は通常、水相において起こり、逆相分析用ＨＰＬＣにより容易にモニターし得る。ペグ化ペプチドは容易に、調製用ＨＰＬＣにより精製し、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特徴付け得る。

ＰＥＧはよく知られた水溶性ポリマーであり、市販であるか、または当該技術分野で公知の方法に従って、エチレングリコールの開環重合により調製し得る（ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ ＳｙｎｔｈｅｓＩｓ，ＡｃａｄｅｍＩｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第３巻，ｐ１３８−１６１）。本出願では、「ＰＥＧ」という用語は、大きさまたはＰＥＧ末端での修飾に関係なく単官能、二官能または多官能型の任意のポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、式：
Ｘ−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−１ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ （Ｉ）
により表すことができ、上式中、ｎは２０〜２３００であり、かつＸはＨまたは末端修飾、例えばＣ_１〜４アルキルである。

いくつかの有用な実施形態では、本発明で使用するＰＥＧは、一端がヒドロキシまたはメトキシで終わる、すなわち、ＸがＨまたはＣＨ_３（「メトキシＰＥＧ」）である。ＰＥＧのもう一端は、式（Ｉ）ではＯＨで終わるように示されているが、エーテル酸素結合、アミン結合またはアミド結合を介して活性化部分に共有結合的に付加されることに留意する。化学構造において使用される場合、「ＰＥＧ」という用語は、示されるヒドロキシル基の水素がなく、酸素がリンカーの遊離炭素と反応してエーテル結合を形成するために利用可能な状態になっている、上式（Ｉ）を包含する。より具体的には、ＰＥＧをペプチドとコンジュゲートするために、ペプチドは「活性化」型のＰＥＧと反応しなければならない。活性化ＰＥＧは以下の式：
（ＰＥＧ）−（Ａ） （ＩＩ）
により表すことができ、上式中、ＰＥＧ（上で定義される）は活性化部分（Ａ）の炭素原子と共有結合してエーテル結合、アミン結合またはアミド結合を形成し、かつ（Ａ）は、ペプチドのアミノ酸残基上のアミノ、アジド、アルキン、イミノ、マレイミド、Ｎ−スクシンイミジル、カルボキシル、アミノオキシ、セレノもしくはチオール基またはペプチド、例えば毒素ペプチド類似体と共有結合したリンカー部分と反応し得る、反応基を含む。

活性化ＰＥＧの調製および生物学的に活性なペプチドとのコンジュゲーションのための技術は当該技術分野で公知である。（例えば、米国特許第５，６４３，５７５号，第５，９１９，４５５号，第５，９３２，４６２号および第５，９９０，２３７号；ＫＩｎｓｔｌｅｒら，Ｎ−ｔｅｒｍＩｎａｌｌｙ ｃｈｅｍＩｃａｌｌｙ ｍｏｄＩｆＩｅｄ ｐｒｏｔｅＩｎ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ，米国特許第５，９８５，２６５号および第５，８２４，７８４号；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＰＥＧｙｌａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅｓ，欧州特許第０５７５５４５Ｂ１号；ＰｅｔＩｔ，ＳＩｔｅ ｓｐｅｃＩｆＩｃ ｐｒｏｔｅＩｎ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ，米国特許第６，４５１，９８６号および第６，５４８，６４４号；Ｓ．Ｈｅｒｍａｎら，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｗＩｔｈ ｒｅａｃｔＩｖｅ ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．ＭｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，Ｊ．ＢＩｏａｃｔＩｖｅ ＣｏｍｐａｔＩｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）；Ｙ．Ｌｕら，Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔＩｄｅｓ ＩＩＩ：ＳｏｌＩｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓＩｓ ｗＩｔｈ ＰＥＧｙｌａｔＩｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｒｙＩｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅＩｇｈｔ：ｓｙｎｔｈｅｓＩｓ ｏｆ ｍｕｌｔＩｐｌｙ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔＩｄｅｓ，ＲｅａｃｔＩｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：２２１−２２９（１９９４）；Ａ．Ｍ．ＦｅｌＩｘら，ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ＰｅｐｔＩｄｅｓ ＩＶ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂＩｏｌｏｇＩｃａｌ ａｃｔＩｖＩｔｙ ｏｆ ｓＩｔｅ−ｄＩｒｅｃｔｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ＧＲＦ ａｎａｌｏｇｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔＩｄｅ ＰｒｏｔｅＩｎ Ｒｅｓ．，４６：２５３−２６４（１９９５）；Ａ．Ｍ．ＦｅｌＩｘ，ＳＩｔｅ−ｓｐｅｃＩｆＩｃ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔＩｄｅｓ，ＡＣＳ ＳｙｍｐｏｓＩｕｍ ＳｅｒＩｅｓ ６８０（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））：２１８−２３８（１９９７）；Ｙ．Ｉｋｅｄａら，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ，ｔｈｅＩｒ ｍｏｄＩｆＩｅｄ ｐｅｐｔＩｄｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃＩｎｇ ｔｈｅｍ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄＩｆＩｅｄ ｐｅｐｔＩｄｅｓ，欧州特許第０４７３０８４Ｂ１号；Ｇ．Ｅ．Ｍｅａｎｓら，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｅｃｈｎＩｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅＩｎ ｓＩｄｅ ｃｈａＩｎｓ，Ｉｎ：ＣｈｅｍＩｃａｌ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，２１９（１９７１）を参照されたい）。

ＰＥＧ−アルデヒドまたはＰＥＧ−アルデヒド水和物のような活性化ＰＥＧは、既知の手段により化学的合成するか、または商業的供給源、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＨｕｎｔｓｖＩｌｌｅ，Ａｌ）もしくはＥｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．（ＰＩｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から入手し得る。

本発明の目的に有用な活性化ＰＥＧの例は、ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドのようなＰＥＧ−アルデヒド化合物（例えば、メトキシPＥＧ−アルデヒド）であり、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＨｕｎｔｓｖＩｌｌｅ，Ａｌ）から購入できる。ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドは式ＰＥＧ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨＯで表される。（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。ＰＥＧ−アルデヒド水和物、例えば、ＰＥＧアセトアルデヒド水和物およびＰＥＧビスアルデヒド水和物（後者は二官能性の活性化構造を生じる）も「ＰＥＧアルデヒド化合物」の意味に包含される。（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ａｌｄｅｈｙｄｅ ｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ａｐｐｌＩｃａｔＩｏｎｓ Ｉｎ ｍｏｄＩｆｙＩｎｇ ａｍＩｎｅｓ，米国特許第５，９９０，２３７号を参照されたい）。活性化多分岐ＰＥＧ−アルデヒド化合物を使用し得る（二価、三価、四価、八価の構造体を生じる複数の腕を含むＰＥＧ誘導体）。４腕のＰＥＧ誘導体を用いて、４つの（４）毒素ペプチド類似体を各ＰＥＧ分子に付加する。例えば、本発明に従って、毒素ペプチド類似体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１、２、３または４つのアミノ官能性部位においてＰＥＧとコンジュゲートし得る。

本発明の方法に従ってコンジュゲートする際には、本明細書に記載のように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を還元的アミノ化によって、毒素ペプチド類似体自体のアミノ酸残基の溶媒に露出した少なくとも１つの遊離アミン部分と直接、共有結合させる。本発明の方法のいくつかの実施形態では、毒素ペプチド類似体を、毒素ペプチド類似体上の１つ以上の第一級もしくは第二級アミンにおいて１つのＰＥＧとコンジュゲートするか、または毒素ペプチド類似体上の単一の第一級アミン部位において２つのＰＥＧ基とコンジュゲートする（例えば、これは還元的アミノ化反応が過剰のＰＥＧ−アルデヒド化合物の存在を含む場合に起こり得る）。還元的アミノ化によるＰＥＧ化がペプチド上の第一級アミンにおいて生じる場合、１分子当たりに存在するＰＥＧが２つ以上である反応生成物をいくらか（１〜１００％の範囲）有することは珍しくないことを本発明者らは観察しており、所望のＰＥＧ化生成物が１分子当たりＰＥＧを１つのみ有する生成物であれば、この「過度のＰＥＧ化」は望ましくないかもしれない。ＰＥＧ化生成物１分子当たり１つのＰＥＧを有するペグ化生成物が望まれる場合、薬理学的に活性なペプチドの第二級アミンを使用するＰＥＧ化を含む本発明の方法の実施形態を用い得るが、これは、１分子当たり１つのＰＥＧ基のみが還元的アミノ化反応において転移されるからである。

第一級アミン部分を供給し得るアミノ酸残基としては、リジン、ホモリジン、オルニチン、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）およびα、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）およびα−アミノ−イソ酪酸（ＡＩｂ）の残基が挙げられる。ポリペプチドＮ末端もＰＥＧ化のための有用なα−アミノ基を供給する。第二級アミン部分を供給し得るアミノ酸残基としては、アルキルがＣ_１〜Ｃ_６である、ε−Ｎ−アルキルリジン、α−Ｎ−アルキルリジン、δ−Ｎ−アルキルオルニチン、α−Ｎ−アルキルオルニチンまたはＮ末端プロリンが挙げられる。

本発明のペグ化毒素ペプチド類似体の生成に有用な別の活性化ＰＥＧはＰＥＧ−マレイミド化合物、例えば特に限定されないが、マレイミドモノメトキシＰＥＧのようなメトキシＰＥＧ−マレイミドなどであり、これは特に、本発明のＰＥＧコンジュゲートペプチドの生成に有用である。（例えば、Ｓｈｅｎ，Ｎ−ｍａｌｅＩｍＩｄｙｌ ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ，米国特許第６，６０２，４９８号；Ｃ．Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｔｈｅ ｕｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔＩｅｓ ｏｆ ＰＥＧ−ｌＩｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅＩｎｓ．，ＣｒＩｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ ＣａｒｒＩｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，９：２４９−３０４（１９９２）；Ｓ．ＺａｌＩｐｓｋｙら，Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔＩｏｎａｌＩｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｓ ｆｏｒ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅｓ，Ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍＩｓｔｒｙ：ＢＩｏｔｅｃｈｎＩｃａｌ ａｎｄ ｂＩｏｍｅｄＩｃａｌ ａｐｐｌＩｃａｔＩｏｎｓ（Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒＩｓ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３４７−３７０（１９９２）；Ｓ．Ｈｅｒｍａｎら，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｗＩｔｈ ｒｅａｃｔＩｖｅ ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．ＭｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，Ｊ．ＢＩｏａｃｔＩｖｅ ＣｏｍｐａｔＩｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）；Ｐ．Ｊ．Ｓｈａｄｌｅら，コンジュゲーション ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ ｔｏ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔＩｍｕｌａｔＩｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１，米国特許第４，８４７，３２５号；Ｇ．Ｓｈａｗら，ＣｙｓｔｅＩｎｅ ａｄｄｅｄ バリアントｓ ＩＬ−３ ａｎｄ ｃｈｅｍＩｃａｌ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第５，１６６，３２２号および欧州特許第０４６９０７４Ｂ１号；Ｇ．Ｓｈａｗら，ＣｙｓｔｅＩｎｅ ａｄｄｅｄ バリアントｓ ｏｆ ＥＰＯ ａｎｄ ｃｈｅｍＩｃａｌ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，欧州特許第０６６８３５３Ａ１号；Ｇ．Ｓｈａｗら，ＣｙｓｔｅＩｎｅ ａｄｄｅｄ バリアントｓ Ｇ−ＣＳＦ ａｎｄ ｃｈｅｍＩｃａｌ ｍｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ，欧州特許第０６６８３５４Ａ１号；Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅら，ＩｎｔｅｒｌｅｕｋＩｎ−２ ｍｕｔｅＩｎｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒ コンジュゲーション ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第５，２０６，３４４号；Ｒ．Ｊ．ＧｏｏｄｓｏｎおよびＮ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，ＳＩｔｅ−ｄＩｒｅｃｔｅｄ ｐｅｇｙｌａｔＩｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂＩｎａｎｔ ＩｎｔｅｒｌｅｕｋＩｎ−２ ａｔ Ｉｔｓ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔＩｏｎ ｓＩｔｅ，ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３４３ ３４６（１９９０））。

ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンは、チオラート化アミノ酸残基、例えばＣ残基におけるコンジュゲーションによる本発明のＰＥＧコンジュゲート毒素ペプチド類似体の生成に有用なもう１つの活性化ＰＥＧである。（例えば、Ｍ．Ｍｏｒｐｕｒｇｏら，ＰｒｅｐａｒａｔＩｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒＩｚａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｖＩｎｙｌ ｓｕｌｆｏｎｅ，ＢＩｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，７：３６３−３６８（１９９６）；また、ＨａｒｒＩｓ，ＦｕｎｃｔＩｏｎａｌＩｚａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｆｏｒ ｆｏｒｍａｔＩｏｎ ｏｆ ａｃｔＩｖｅ ｓｕｌｆｏｎｅ−ｔｅｒｍＩｎａｔｅｄ ＰＥＧ ｄｅｒＩｖａｔＩｖｅｓ ｆｏｒ ｂＩｎｄＩｎｇ ｔｏ ｐｒｏｔｅＩｎｓ ａｎｄ ｂＩｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ｃｏｍｐａｔＩｂｌｅ ｍａｔｅｒＩａｌｓ，米国特許第５，４４６，０９０号；第５，７３９，２０８号；第５，９００，４６１号；第６，６１０，２８１号および第６，８９４，０２５号；ならびにＨａｒｒＩｓ，Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｃｔＩｖｅ ｓｕｌｆｏｎｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ），国際公開第９５／１３３１２Ａ１号も参照されたい）。

本発明に従って有用なもう１つの活性化型ＰＥＧは、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルである。

ヘテロ二官能性活性化型のＰＥＧも有用である。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＰＥＧｙｌａｔＩｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｂＩｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ａｃｔＩｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅｒｅｗＩｔｈ，米国特許第６，５５２，１７０号を参照されたい）。

本発明の組成物生成法のさらに他の実施形態では、毒素ペプチド類似体を既知の化学的技術により、活性化ＰＥＧ化合物、例えば特に限定されないが、チオール−活性化ＰＥＧ化合物、ジオール−活性化ＰＥＧ化合物、ＰＥＧ−ヒドラジド化合物、ＰＥＧ−オキシアミン化合物またはＰＥＧ−ブロモアセチル化合物などと反応させる。（例えば、Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｗＩｔｈ ＲｅａｃｔＩｖｅ Ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．ＭｏｄＩｆＩｃａｔＩｏｎ ｏｆ ＰｒｏｔｅＩｎｓ，Ｊ．ＢＩｏａｃｔＩｖｅ ａｎｄ ＣｏｍｐａｔＩｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）；Ｓ．ＺａｌＩｐｓｋｙ，ＣｈｅｍＩｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ コンジュゲートｓ ｗＩｔｈ ＢＩｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ＡｃｔＩｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ ＤｅｌＩｖｅｒｙ ＲｅｖＩｅｗｓ，１６：１５７−１８２（１９９５）；Ｒ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）コンジュゲートｄ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｒｕｇｓ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓＩｖｅ ｒｅｖＩｅｗ，ＣｒＩｔＩｃａｌ ＲｅｖＩｅｗｓ Ｉｎ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ｄｒｕｇ ＣａｒｒＩｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１７：１０１−１６１（２０００）を参照されたい）。

本発明のＰＥＧコンジュゲート毒素ペプチド類似体生成のための、さらにより好適な活性化ＰＥＧは、２つ以上の活性化残基を有する多価ＰＥＧである。好適な多価ＰＥＧ部分としては、特に限定されないが、以下に示すものが挙げられる：

組成物生成のさらに他の実施形態では、本発明の毒素ペプチド類似体を既知の化学的技術により、活性化多分岐ＰＥＧ化合物（二価、三価、四価、八価の構造体を生じる複数の腕を含むＰＥＧ誘導体）、例えば特に限定されないが、ペンタエリスリトールテトラ−ポリエチレングリコールエーテルなどと反応させる。官能基化および活性化誘導体、例えば特に限定されないが、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）プロピル、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル、（−ＣＯ_２−ｐ−Ｃ_６Ｈ_４ＮＯ_２）、３−（Ｎ−マレイミド）プロパンアミド、２−スルファニルエチルおよび３−アミノプロピルなど。４腕のＰＥＧ誘導体を用いて、４つの毒素ペプチド類似体を各ＰＥＧ分子に付着させる。例えば、本発明に従って、毒素ペプチド類似体を：
（ａ）ＰＥＧの１、２、３または４つのアミノ官能性部位；
（ｂ）ＰＥＧの１、２、３または４つのチオール官能性部位；
（ｃ）ＰＥＧの１、２、３または４つのマレイミド官能性部位；
（ｄ）ＰＥＧの１、２、３または４つのＮ−スクシンイミジル官能性部位；
（ｅ）ＰＥＧの１、２、３または４つのカルボキシル官能性部位；
（ｆ）ＰＥＧの１、２、３または４つのｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル官能性部位
においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートさせ得る。

ＰＥＧの最小の実用的な大きさは約５００ダルトン（Ｄａ）であり、これを下回るとＰＥＧは毒性となる。実用的な所望に応じて、約５００Ｄａを超える任意のＰＥＧの分子質量、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは２０〜２３００）を使用し得る。ＰＥＧ単量体の数（ｎ）は、各単量体に対してＭＷ＝４４Ｄａを用いた平均分子質量から概算される。活性化リンカー上のＰＥＧの合計分子質量が治療的使用に適することが好ましい。したがって、ＰＥＧ分子の合計分子質量は約１００，０００Ｄａ超えるべきではない。

いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧコンジュゲート毒素ペプチド類似体で使用されるＰＥＧの合計または総平均分子質量は約３，０００Ｄａ〜６０，０００Ｄａ（総ｎは７０〜１，４００）、より好ましくは約１０，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａ（総ｎは約２３０〜約９１０）である。もっとも好ましいＰＥＧの総質量は、約２０，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａ（総ｎは約４５０〜約６８０）である。

毒素ペプチド類似体（介在リンカー部分を有するか、または有さない）とのコンジュゲーションに使用される半減期延長部分は、半減期延長部分がコンジュゲートされ得るアミノ酸残基数に関して多価（例えば、二価、三価、四価またはそれより高い価数）であり得るため、組成物の「多量体」が生成され得るということが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、本発明の組成物のペプチド部分は多価（例えば、二価、三価、四価またはそれより高い価数）であり得、したがって、本発明の組成物の「多量体」のいくつかのは２つ以上の半減期延長部分を有し得る。その結果、本発明の組成物生成法により様々なコンジュゲート半減期延長部分：ペプチド構造を生成することが可能である。例として、一価の半減期延長部分と一価のペプチドにより１：１コンジュゲートが生成される；二価のペプチドと一価の半減期延長部分により、２つの半減期延長部分を有するペプチドコンジュゲートが形成され得るのに対し、二価の半減期延長部分と一価のペプチドにより、２つのペプチド単位が単一の半減期延長部分と連結した種が生成され得る；より高価数の半減期延長部分を使用すれば、単一の半減期延長部分と結合したペプチド単位の集団が形成され得るのに対し、より高価数のペプチドは複数の半減期延長部分で覆われ得る。さらなる例として、多価の半減期延長部分の毒素ペプチド類似体とのコンジュゲーション部位がシステインまたは他のアミノチオールであれば、Ｄ’ＡｍＩｃｏらにより開示されている方法を用い得る（Ｄ’ＡｍＩｃｏら，Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔＩｎｇ ａｍＩｎｏｔｈＩｏｌ ｃｏｎｔａＩｎＩｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｖｅｈＩｃｌｅｓ（米国特許出願公開第２００６／０１９９８１２号として公開され、この出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ペプチド部分は、活性化された半減期延長部分と反応する２つ以上の反応基を有してもよいが、複雑な構造形成の可能性を常に考慮しなければならず；半減期延長部分とペプチドの１：１付加体のような単純な構造を形成すること、または二価の半減期延長部分を用いてペプチド：半減期延長部分：ペプチド付加体を形成することを望む場合、所定の比率の活性化された半減期延長部分とペプチド材料、それらの所定の濃度を使用し、ある比率の記載の生成物が形成されるように所定の条件（例えば、持続時間、温度、ｐＨなど）の下で反応を行い、次いで、記載の生成物を他の反応生成物から分離することが有効であろう。試薬の反応条件、比率および濃度は、必要に応じて適当にスケールアップさせながら、当業者の能力の範囲内である比較的簡単な試行錯誤による実験により得ることができる。生成物の精製および分離は、当業者に公知の従来技術により同様に遂行する。

さらに、本発明の毒素ペプチド類似体と融合またはコンジュゲートされる半減期延長部分の生理的に許容される塩も本発明の組成物の範囲に包含される。

上記半減期延長部分および本明細書に記載の他の半減期延長部分は、個別でも組合せでも有用であり、当該技術分野において、例えば、ＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号およびＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号（国際公開第２００８／０８８４２２号として公開）（共にその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）においてさらに記載されている通りである。本発明は、特に限定されないが、本明細書に記載のような薬学的に許容される半減期延長部分の任意の単一種の、毒素ペプチド類似体とのコンジュゲーションでの使用、または２つ以上の類似のもしくは異なった半減期延長部分との組合せの使用を包含する。

リンカー
本明細書で使用される「リンカー部分」は、本発明の組成物中に含まれる毒素ペプチド類似体または他のポリペプチド鎖（例えば、免疫グロブリンＨＣもしくはＬＣまたは免疫グロブリンＦｃドメイン）のアミノ酸残基と共有結合する生物学的に許容されるペプチジルまたは非ペプチジル有機基を指し、このリンカー部分は、毒素ペプチド類似体または他のポリペプチド鎖を、組成物中の別のペプチドもしくはポリペプチド鎖または半減期延長部分と、共有結合により連結またはコンジュゲートする。組成物のいくつかの実施形態では、半減期延長部分は、本明細書に記載のように、例えば、毒素ペプチド類似体自体のアミノ酸残基と、または任意で毒素ペプチド類似体のアミノ酸残基と共有結合しているペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー部分（芳香族もしくはアリールリンカーを含むが、これらに限定されない）とコンジュゲートされる、すなわち直接、共有結合する。いかなるリンカー部分の存在も任意である。存在する場合、その化学構造は主として、１つの機能的部分の提示または位置を、本発明の組成物の分子の他の１つ以上の機能的部分と関連させて位置付ける、連結する、結合するまたは最適化するのためのスペーサーとして働くため、それは重要ではない。リンカー部分の存在は、本発明の組成物のいくつかの実施形態の薬理活性を最適化するのに有用であり得る。リンカーは、好ましくはペプチド結合により連結されたアミノ酸からなる。リンカー部分は、存在すれば、本発明の組成物中に存在し得る任意の他の１つまたは複数のリンカーと、無関係に同じであるかまたは異なり得る。

上述のように、リンカー部分は、存在すれば（毒素ペプチド類似体の一次アミノ酸配列内でも、または毒素ペプチド類似体に半減期延長部分を付加するためのリンカーとしてでも）、本来的に「ペプチジル」であり（すなわち、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなる）、かつ好ましくは１〜約４０アミノ酸残基まで、より好ましくは１〜約２０アミノ酸残基まで、そしてもっとも好ましくは１〜約１０アミノ酸残基までの長さからなり得る。必ずというわけではないが、リンカー中のアミノ酸残基は、２０の標準的アミノ酸、より好ましくはシステイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよび／またはセリンの中からのものであることが好ましい。さらにより好ましくは、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合により連結された、立体障害のないアミノ酸の大部分、例えば、グリシン、セリンおよびアラニンなどからなる。またペプチジルリンカーは、存在すれば、インビボ循環血中での迅速なタンパク質分解性のターンオーバーを回避するように選択されることが望ましい。上記アミノ酸の一部は、当業者により十分理解されているように、グリコシル化されていてもよい。例えば、シアリル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_５がそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である、Ｘ_１Ｘ_２ＮＸ_４Ｘ_５Ｇ（配列番号２７９）である。

他の実施形態では、ペプチジルリンカー部分の１〜４０のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。リンカーは、グリシンおよびアラニンのような立体障害のないアミノ酸の大部分からなることが好ましい。したがって、好適なリンカーとしては、ポリグリシン、ポリセリンおよびポリアラニン、またはこれらのいずれかの組合せが挙げられる。いくつかの典型的なペプチジルリンカーは、ポリ（Ｇｌｙ）_１〜８、特に（Ｇｌｙ）_３、（Ｇｌｙ）_４（配列番号２８０）、（Ｇｌｙ）_５（配列番号２８１）および（Ｇｌｙ）_７（配列番号２８２）、ならびにポリ（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ（配列番号２８３）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）_２〜４およびポリ（Ａｌａ）_１〜８である。ペプチジルリンカーの他の特定の例としては、（Ｇｌｙ）_５Ｌｙｓ（配列番号２８４）および（Ｇｌｙ）_５ＬｙｓＡｒｇ（配列番号２８５）が挙げられる。有用なペプチジルリンカーのその他の例は：
（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号２８６）；
（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号２８７）；
（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号２８８）；および
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号２８９）である。

上記命名法の説明として、例えば、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２９０）を意味する。ＧｌｙとＡｌａの他の組合せも有用である。

その他の好適なリンカーは、本明細書において「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；または「Ｇ_４Ｓ」；配列番号２９１）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２９２）、「Ｌ２５」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２９３）として識別されるリンカーおよび下の実施例で使用される任意のリンカーである。

ペプチドリンカー部分を含む本発明の組成物のいくつかの実施形態では、酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基がリンカー部分のアミノ酸配列内に配置されている。例としては、以下のペプチドリンカー配列が挙げられる：
ＧＧＥＧＧＧ（配列番号２９４）；
ＧＧＥＥＥＧＧＧ（配列番号２９５）；
ＧＥＥＥＧ（配列番号２９６）；
ＧＥＥＥ（配列番号２９７）；
ＧＧＤＧＧＧ（配列番号２９８）；
ＧＧＤＤＤＧＧ（配列番号２９９）；
ＧＤＤＤＧ（配列番号３００）；
ＧＤＤＤ（配列番号３０１）；
ＧＧＧＧＳＤＤＳＤＥＧＳＤＧＥＤＧＧＧＧＳ（配列番号３０２）；
ＷＥＷＥＷ（配列番号３０３）；
ＦＥＦＥＦ（配列番号３０４）；
ＥＥＥＷＷＷ（配列番号３０５）；
ＥＥＥＦＦＦ（配列番号３０６）；
ＷＷＥＥＥＷＷ（配列番号３０７）；または
ＦＦＥＥＥＦＦ（配列番号３０８）。

他の実施形態では、リンカーはリン酸化部位、例えば、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_５がそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である、Ｘ_１Ｘ_２ＹＸ_４Ｘ_５Ｇ（配列番号３０９）；Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_５がそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である、Ｘ_１Ｘ_２ＳＸ_４Ｘ_５Ｇ（配列番号３１０）；またはＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_５がそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である、Ｘ_１Ｘ_２ＴＸ_４Ｘ_５Ｇ（配列番号３１１）を構成する。

ここに示したリンカーは例示的なものであり；本発明の範囲内にあるペプチジルリンカーは、さらにより長いものであってよく、他の残基を含んでもよい。ペプチジルリンカーは、例えば、半減期延長部分とのコンジュゲーションのためのシステイン、別のチオールまたは求核剤を含み得る。別の実施形態では、リンカーは、官能性半減期延長部分であるマレイミド、ヨードアセトアミドまたはチオエステルとのコンジュゲーションのためのシステインもしくはホモシステイン残基、または他の２−アミノ−エタンチオールもしくは３−アミノ−プロパンチオール部分を含む。

別の有用なペプチジルリンカーは、１ｋＤａＰＥＧ分子とほぼ同じ大きさであると推定される、ランダムなＧｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列、例えば：ＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴＨ（配列番号３１２）またはＨＧＳＧＳＡＴＧＧＳＧＳＴＡＳＳＧＳＧＳＡＴ（配列番号３１３）を含む大きく、柔軟なリンカーである。あるいは、有用なペプチジルリンカーは、強固なヘリックス構造を形成する当該技術分野で公知のアミノ酸配列からなり得る（例えば、強固なリンカー：−ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧ−／／配列番号３１４）。さらに、ペプチジルリンカーは、式−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−の６炭素脂肪族分子のような非ペプチジルセグメントも含み得る。本明細書に記載のように、ペプチジルリンカーを改変して誘導体を形成し得る。

任意で、非ペプチジルリンカー部分も、半減期延長部分コンジュゲート毒素ペプチド類似体のペプチド部分と半減期延長部分をコンジュゲートするのに有用である。例えば、ｓ＝２〜２０である−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｃ（Ｏ）−のようなアルキルリンカーを使用し得る。上記アルキルリンカーは、立体障害を起こさない任意の基、例えば低級アルキル（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなどによってさらに置換され得る。典型的な非ペプチジルリンカーはＰＥＧリンカーであり（例えば、以下に示すもの）：

式中、ｎは、リンカーが約１００〜約５０００ダルトン（Ｄａ）、好ましくは約１００〜約５００Ｄａの分子量を有するようなｎである。

一実施形態では、非ペプチジルリンカーはアリールである。本明細書に記載のものと同じ方法で、リンカーを改変して誘導体を形成し得る。さらに、ＰＥＧアルデヒドを用いた還元的アルキル化またはヒドロキシスクシンイミドもしくはＰＥＧ炭酸エステルを用いたアシル化により、あるいはチオールコンジュゲーションにより、ＰＥＧ部分をＮ末端アミンまたは選択された側鎖アミンに付加し得る。

「アリール」とは、フェニルまたは飽和、部分飽和もしくは不飽和の３、４もしくは５員炭素橋と隣接して融合されたフェニルのことであり、フェニルまたは橋は、Ｃ_１〜８アルキル、Ｃ_１〜４ハロアルキルまたはハロから選択される０、１、２または３個の置換基により置換されている。

「ヘテロアリール」とは、不飽和の５、６もしくは７員単環式環、または少なくとも１つの環が不飽和である、部分飽和もしくは不飽和の６、７、８、９、１０もしくは１１員二環式環のことであり、単環式および二環式環は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１、２、３または４個の原子を含み、環は、Ｃ_１〜８アルキル、Ｃ_１〜４ハロアルキルおよびハロから選択される０、１、２または３個の置換基により置換されている。

本発明の組成物の非ペプチド部分、例えば非ペプチジルリンカーまたは非ペプチド半減期延長部分などは、従来の有機化学反応により合成し得る。

上記のものは単なる具体例に過ぎず、本発明に従って任意に使用し得るリンカーの種類を網羅するものではない。

電位依存性カリウムチャネルＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを組み入れた本発明の組成物、特に本発明の毒素ペプチド類似体は、半減期延長部分とコンジュゲートされているか否かにかかわらず、自己免疫疾患に対して治療効果のある免疫抑制剤として有用である。例えば、上記分子は、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患および関節リウマチの治療に有用である。（例えば、Ｈ．Ｗｕｌｆｆら（２００３）Ｊ．ＣｌＩｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１７０３−１７１３およびＨ．Ｒｕｓら（２００５）ＰＮＡＳ １０２，１１０９４−１１０９９；Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｐｅｐｔＩｄｅ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；１ Ｂｅｅｔｏｎら（２００６），Ｋｖ１．３：ｔｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｍｅｄＩａｔｅｄ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅ，／／ｗｅｂｆＩｌｅｓ．ｕｃＩ．ｅｄｕ／ｘｙｔｈｏｓｗｆｓ／ｗｅｂｕＩ／２６７００２９．１の電子プレプリントを参照されたい）。電位依存性カリウムチャネルＫｖ１．３の阻害剤は、様々な前臨床炎症動物モデルにおいて調べられてきた。Ｋｖ１．３の小分子およびペプチド阻害剤は、オボアルブミン［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら（２００５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７，１３６９］および破傷風トキソイド［Ｇ．Ｃ．Ｋｏｏら（１９９９）ＣｌＩｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７，９９］に対する遅延型過敏性反応をブロックすることが示されている。皮膚における炎症抑制に加え、阻害剤は抗体産生も減少させた［Ｇ．Ｃ．Ｋｏｏら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，５１２０］。Ｋｖ１．３アンタゴニストは、多発性硬化症（ＭＳ）のラット養子移植実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）モデルにおける有効性をしめしており、このモデルは、多発性硬化症の症状再発を予防または軽減する本発明の方法または自己免疫障害を治療する本発明の方法を実施する際に、本発明の組成物の治療効果の評価に使用し得る。（Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：９３６（２００１）；Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら，ＰＮＡＳ ９８：１３９４２（２００１）；ＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，米国特許出願公開第２００７／００７１７６４号の図６１（これらはすべてその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。Ｋｖ１．３チャネルは、ＭＳ患者由来のミエリン特異的Ｔ細胞上で過剰発現され、これにより、Ｋｖ１．３阻害剤がＭＳ治療にもたらし得る有用性がさらに支持される。歯周病の前臨床養子移植モデルにおいて、炎症性骨吸収もＫｖ１．３阻害剤により抑制された［Ｐ．Ｖａｌｖｅｒｄｅら（２００４）Ｊ．Ｂｏｎｅ ＭＩｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．１９，１５５］。この研究では、阻害剤はさらに、細歯肉炎を誘発するのに使用される細菌の一成分である菌外膜タンパク質に対する抗体産生をブロックした。近年、前臨床ラットモデルにおいて、プリスタン関節炎および糖尿病の治療におけるＫｖ１．３阻害剤の有効性が示された［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら（２００６），／／ｗｅｂｆＩｌｅｓ．ｕｃＩ．ｅｄｕ／ｘｙｔｈｏｓｗｆｓ／ｗｅｂｕＩ／＿ｘｙ−２６７００２９＿１で入手可能なプレプリント］。Ｋｖ１．３チャネルはＴ細胞およびＢ細胞のすべてのサブセット上で発現されるが、エフェクター記憶Ｔ細胞およびクラススイッチした記憶Ｂ細胞は特にＫｖ１．３依存性である［Ｈ．Ｗｕｌｆｆら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３，７７６］。新規発症１型糖尿病の患者由来のＧａｄ５／インスリン特異的Ｔ細胞、ＭＳ患者由来のミエリン特異的Ｔ細胞および関節リウマチ患者の滑膜由来のＴ細胞はすべて、Ｋｖ１．３を過剰発現する［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら（２００６），／／ｗｅｂｆＩｌｅｓ．ｕｃＩ．ｅｄｕ／ｘｙｔｈｏｓｗｆｓ／ｗｅｂｕＩ／＿ｘｙ−２６７００２９＿１のプレプリント］。Ｋｖ１．３欠損マウスが、高脂肪食で飼育した場合に体重があまり増加せず［Ｊ．Ｘｕら（２００３）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２，５５１］、またグルコース利用の変化を示した［Ｊ．Ｘｕら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．１０１，３１１２］ことから、Ｋｖ１．３は肥満症および糖尿病の治療に関しても研究されている。乳癌標本［Ｍ．Ａｂｄｕｌら（２００３）ＡｎｔＩｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３，３３４７］および前立腺癌細胞系［Ｓ．Ｐ．Ｆｒａｓｅｒら（２００３）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．４４６，５５９］もＫｖ１．３を発現することが示されており、Ｋｖ１．３ブロックは癌治療に有用であり得る。Ｋｖ１．３阻害剤毒素ペプチド類似体（１つまたは複数）を含めた本発明の組成物により治療し得る障害としては、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、レスチノシス（ｒｅｓｔＩｎｏｓＩｓ）、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶反応、移植片対宿主病ならびに全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および他の形態の狼瘡が挙げられる。

本発明の自己免疫障害治療法の実施は、患者、例えば、自己免疫障害、例えば特に限定されないが、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、接触性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、レスチノシス（ｒｅｓｔＩｎｏｓＩｓ）、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶反応、移植片対宿主病または狼瘡などであると診断された患者に、その患者において障害の少なくとも１つの症状が軽減されるように、治療有効量の本発明の組成物を投与することを含む。

多発性硬化症の症状再発を予防または軽減する本発明の方法の実施は、患者、例えば、多発性硬化症の少なくとも１つの症状をこれまでに経験したことのある患者に、多発性硬化症の少なくとも１つの症状が再発予防または軽減されるように、予防有効量の本発明の組成物を投与することを含む。

本発明に記載されている疾患および薬理学的に活性な組成物は単なる例示的なものに過ぎず、本発明の組成物を用いて調製し得る本発明の薬理学的に活性な化合物、組成物および薬物、または本発明の恩恵により治療し得る疾患および障害の範囲を一切制限しない。

したがって、本発明は、本明細書に記載の疾患、障害または他の医学的状態の治療または予防のための薬物の製造における、１つ以上の本発明の組成物の使用にも関する。

このような医薬組成物は、多種多様な送達経路、例えば、注射もしくは注入などによる血管内送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外もしくは髄腔内送達経路、または経口、経腸、肺（例えば、吸入）、鼻腔内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮もしくは他の送達経路、および／または当該技術分野で公知の投与形態により患者へ投与されるように形成し得る。本発明の医薬組成物は、液体形態で調製してもよく、または凍結乾燥形態のような乾燥粉末形態であってもよい。経口または経腸使用のために、医薬組成物を例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性粉末もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤または経腸処方として形成し得る。

医薬組成物
概論
本発明は、本発明の組成物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、多種多様な送達経路、例えば、注射もしくは注入などによる血管内送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外もしくは髄腔内送達経路、または経口、経腸、肺（例えば、吸入）、鼻腔内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮もしくは他の送達経路、および／または当該技術分野で公知の投与形態により患者へ投与されるように形成し得る。本発明の医薬組成物は、液体形態で調製してもよく、または凍結乾燥形態のような乾燥粉末形態であってもよい。経口または経腸使用のために、医薬組成物を例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性粉末もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤または経腸処方として形成し得る。

本発明の実施において、「薬学的に許容される担体」とは、医薬組成物の製剤化において有用であることが当業者に既知である、任意の薬学的に許容される単独のまたは組み合わせた、希釈剤、賦形剤、分散剤、結合剤、増量剤、流動促進剤、減摩剤、圧縮補助剤、錠剤崩壊剤（崩壊剤）、懸濁化剤、潤滑剤、香味剤、着香剤、甘味剤、透過もしくは浸透促進剤、保存剤、界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、増粘剤、補助剤、着色剤、コーティング剤、カプセル化材料（１つまたは複数）および／または他の添加剤を含めた、任意の生理学的に許容される物質のことである。このような医薬組成物は、様々な緩衝内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）のような添加剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、ＴｈＩｍｅｒｓｏｌ（登録商標）、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の微粒子調製物内またはリポソーム内への材料組込みを含み得る。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環血中における持続時間維持の促進作用を有する。このような組成物は、存在するタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響し得る。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＲｅｍＩｎｇｔｏｎ'ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃａｌ ＳｃＩｅｎｃｅｓ，第１８版．（１９９０，Ｍａｃｋ ＰｕｂｌＩｓｈＩｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８０４２）ｐ．１４３５−１７１２を参照されたい。組成物は、液体形態で調製してもよく、または凍結乾燥形態のような乾燥粉末形態であってもよい。埋め込み型放性製剤も、経皮または経粘膜製剤と同様に有用である。さらに（また代わりに）、本発明は、当業者に既知である任意の様々な持続放出性もしくは徐放性製剤または微粒子製剤、例えば、肺、鼻腔内または皮下送達経路を介して投与し得る徐放性微粒子製剤において使用される組成物を提供する。（例えば、Ｍｕｒｔｈｙら，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ａｃｔＩｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ，米国特許第６，８８７，４８７号；ＭａｎｎＩｎｇら，ＳｏｌｕｂＩｌＩｚａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ Ｉｎ ａｎ ｏｒｇａｎＩｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔＩｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃａｌ ｐｏｗｄｅｒｓ ｕｓＩｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ，米国特許第５，７７０，５５９号および第５，９８１，４７４号；ＬＩｅｂｅｒｍａｎら，ＬＩｐｏｐｈＩｌＩｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ａｃｔＩｖｅ ＩｎｏｒｇａｎＩｃ ｍＩｎｅｒａｌ ａｃＩｄ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ｏｒｇａｎＩｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，米国特許第５，００２，９３６号；Ｇｅｎ，ＦｏｒｍａｔＩｖｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅＩｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，米国特許出願公開第２００２／０１１９９４６Ａ１号；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，ＳｕｓｔａＩｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔＩｏｎｓ，国際公開第２００５／１０５０５７Ａ１号を参照されたい）。

不活性な材料により、本発明の組成物を希釈するか、または本発明の医薬組成物の体積を増加させ得る。このような希釈剤としては、糖質、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを挙げ得る。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含めた特定の無機塩も増量剤として使用し得る。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖＩｃｅｌｌである。

従来の様々な増粘剤は、医薬組成物のクリーム剤、軟膏剤、坐剤およびゲル剤形成において有用であり、例えば特に限定されないが、アルギン酸、キサンタンガムまたはワセリンなどもこのような本発明の医薬組成物の形成に使用し得る。透過または浸透促進剤、例えばポリエチレングリコールモノラウラート、ジメチルスルホキシド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリドンまたは３−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ピロリドンなども使用し得る。ヒドロゲルマトリックスを作成するのに有用な技術が知られている。（例えば、ＦｅＩｊｅｎ，ＢＩｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍａｔｒＩｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ａｃｔＩｖｅ ａｇｅｎｔｓ，米国特許第４，９２５，６７７号；Ｓｈａｈら，ＢＩｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐＨ／ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓＩｔＩｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａＩｎｅｄ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｏｆ ｂＩｏｌｏｇＩｃａｌｌｙ ａｃｔＩｖｅ ａｇｅｎｔｓ，国際公開第００／３８６５１Ａ１号）。このような生物分解性ゲルマトリックスは、例えば、タンパク質性成分と多糖もしくはムコ多糖成分を架橋し、次いで、送達するべき本発明の組成物を含ませることにより形成し得る。

無菌の液剤または懸濁剤である本発明の液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、血管内（例えば、静脈内もしくは動脈内）、腹腔内または皮下への注射により患者へ投与し得る。（例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，ＳｕｓｐｅｎｓＩｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｓｔａＩｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，米国特許第６，２４５，７４０号および国際公開第００／３８６５２Ａ１号を参照されたい）。無菌液剤は静脈内注入によっても投与し得る。本発明の組成物は、無菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水または他の適当な無菌注射用媒体を用いて、患者への投与前の都合の良い時間に溶解または懸濁させ得る、凍結乾燥粉末のような無菌の固体医薬組成物中に含まれ得る。

埋め込み型徐放性製剤も本発明の医薬組成物の有用な実施形態である。例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物の体内または皮下に埋め込まれた生物分解性マトリックスである薬学的に許容される担体は、上記のものと同様のヒドロゲルであり得る。あるいは、それをポリーアルファーアミノ酸成分から形成し得る。（ＢＩｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ，Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｄｅｖＩｃｅ，ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒＩｎｇ ａｎｄ ｕｓＩｎｇ ｓａｍｅ，米国特許第４，３５１，３３７号）。薬物送達のための埋め込み物作成のための技術も既知であり、本発明に従って有用である。

粉末形態において、薬学的に許容される担体とは、本発明の組成物を含めた微粉化された有効成分（１つまたは複数）との混合物である、微粉化された固体のことであり。例えば、いくつかの実施形態では、粉末形態は、医薬組成物を吸入剤として形成する場合に有用である。（例えば、Ｚｅｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｒｅｐａｒＩｎｇ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ ＩｎｈａｌａｔＩｏｎ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ，国際公開第２００４／０１７９１８号；Ｔｒｕｎｋら，Ｓａｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＧＲＰ ａｎｔａｇｏｎＩｓｔ ＢＩＢＮ４０９６ ａｎｄ Ｉｎｈａｌａｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｍｅｄＩｃａｍｅｎｔｓ ｃｏｎｔａＩｎＩｎｇ ｔｈｅｍ，米国特許第６，９００，３１７号を参照されたい）。

不活性な材料により、本発明の組成物を希釈するか、またはその体積を増加させ得る。こうした希釈剤としては、糖質、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストランおよびデンプンを挙げ得る。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含めた特定の無機塩も増量剤として使用し得る。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ（商標）、Ｅｍｄｅｘ（商標）、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００（商標）、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ（商標）およびＡｖＩｃｅｌｌ（商標）である。

医薬組成物の固形剤形への製剤化には崩壊剤が含まれ得る。崩壊剤として使用される材料としては、市販のデンプン系崩壊剤のＥｘｐｌｏｔａｂ（商標）が挙げられるが、これに限定されない。グリコール酸デンプンナトリウム、ＡｍｂｅｒｌＩｔｅ（商標）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジ果皮、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿およびベントナイトはすべて使用し得る。不溶性陽イオン交換樹脂は崩壊剤のもう１つの形態である。粉末ゴムを崩壊剤および結合剤として使用することができ、これらは、寒天、カラヤまたはトラガカントのような粉末ゴムを含み得る。アルギン酸およびそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。

結合剤は、治療剤を結び付けて固い錠剤を形成するために使用することができ、アラビアゴム、トラガカント、デンプンおよびゼラチンのような天然物由来の材料を含む。他にはメチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は共に、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用し得る。

減摩剤は、製剤化の過程の間に粘着するのを防ぐために治療剤の製剤中に含まれ得る。潤滑剤は、治療剤とダイ壁の間の層として使用することができ、これには、そのマグネシウムおよびカルシウム塩を含めたステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびワックスが含まれるが、これらに限定されない。可溶性の潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス４０００および６０００なども使用し得る。

製剤化の間の薬物の流動性を向上させ得る、および圧縮の間の再構成を補助するための流動促進剤を添加し得る。流動促進剤としては、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和ケイアルミン酸を挙げ得る。

本発明の化合物の水性環境への溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加し得る。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムのような陰イオン界面活性剤を挙げ得る。陽イオン界面活性剤を使用することができ、これには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれ得る。界面活性剤として製剤中に含まれ得る、可能性のある非イオン界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアラート、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースである。上記界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤中に、単独で、または様々な比の混合物として存在し得る。

経口剤形
本発明の組成物の経口剤形も有用である。必要であれば、経口送達が効果的になるように組成物を化学的に修飾し得る。一般に、意図される化学修飾は、少なくとも１つの部分を分子自体に付加することであり、前記部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸から血流中への取込みを可能にする。また、化合物の全般的な安定性の増加および体内での循環時間の増加も望まれる。本発明において共有結合的に付加される半減期延長部分として有用な部分も、この目的で使用し得る。このような部分の例としては：ＰＥＧ、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが挙げられる。例えば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋＩおよびＤａｖＩｓ（１９８１），Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ（Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，編），ＷＩｌｅｙ−ＩｎｔｅｒｓｃＩｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ３６７−８３；Ｎｅｗｍａｒｋら（１９８２），Ｊ．Ａｐｐｌ．ＢＩｏｃｈｅｍ．４：１８５−９を参照されたい。使用し得るその他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔＩｏｘｏｃａｎｅ）である。医薬用途に好適なのは、前述の通りＰＥＧ部分である。

経口送達剤形用に、Ｎ−［−８−（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］カプリル酸一ナトリウム（ＳＮＡＣ）のような修飾脂肪族アミノ酸の塩を担体として使用して、本発明の治療用化合物の吸収を促進することも可能である。ＳＮＡＣを用いたヘパリン製剤の臨床的有効性が、ＥｍＩｓｐｈｅｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＩｅｓにより行われた第二相試験において示されている。米国特許第５，７９２，４５１号、「Ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたい。

一実施形態では、薬学的に許容される担体は液体であってもよく、医薬組成物を液体、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシルまたは加圧された組成物の形態で調製する。有効成分（１つまたは複数）（例えば、本発明の組成物）を、薬学的に許容される液体担体、例えば水、有機溶媒、これら２つの混合物または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの中に溶解、希釈または懸濁し得る。液体担体は、他の適当な医薬添加剤、例えば界面活性剤および／または可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、適当なｐＨの緩衝剤（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、補助剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、ＴｈＩｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、甘味剤、着香剤、懸濁化剤、増粘剤、増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、着色剤、粘性調整剤、安定化剤、電解質、オスモライトまたは浸透圧調節剤などを含有し得る。添加剤を製剤中に含めて、本発明の組成物の取込みを促進することもできる。この特性を潜在的に有する添加剤は、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。

経口固形剤形は有用であり、これらは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＲｅｍＩｎｇｔｏｎ'ｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃａｌ ＳｃＩｅｎｃｅｓ（１９９０）、上記、第８９章に全般的に記載されている。固形剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくは舐剤、カシェ剤または小丸剤が挙げられる。また、リポソームカプセル化またはプロテイノイドカプセル化を用いて本発明の組成物を製剤化し得る（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号で報告されているプロテイノイドマイクロスフィア）。リポソームカプセル化を使用することができ、リポソームは様々なポリマーで誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療剤用の可能な固形剤形は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｍｏｄｅｒｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃｓ（１９７９），Ｇ．Ｓ．ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編，第１０章に記載されている。一般に製剤は、本発明の化合物ならびに胃環境に対する防御および生物学的に活性な物質の腸内での放出を可能にする不活性成分を含む。

本発明の組成物は、粒子サイズが約１ｍｍの顆粒剤または小丸剤形態の微小な多微粒子として製剤中に含まれ得る。またカプセル投与のための材料の製剤化は、粉末剤、軽く圧縮した充填剤として、または錠剤としてのものでもあり得る。治療剤は圧縮により調製し得る。

着色剤および着香剤はすべて含まれ得る。例えば、タンパク質（または誘導体）を製剤化し（リポソームまたはマイクロスフィアカプセル化などによる）、次いで、着色剤および着香剤を含有する冷蔵保存飲料のような食用品中にさらに含ませ得る。

錠剤形態では、有効成分（１つまたは複数）を、必要な圧縮特性を有する薬学的に許容される担体と適当な割合で混合し、所望の形状および大きさに圧縮する。

粉末剤および錠剤は、好ましくは９９％以下の有効成分（１つまたは複数）を含有する。適当な固体担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。

徐放製剤が望ましいものであり得る。本発明の組成物は、拡散または浸出機序による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴムの中に組み込み得る。また徐々に分解するマトリックス、例えば、アルギン酸、多糖類の製剤中に組み込んでもよい。本発明の組成物の放出制御のもう１つの形態は、Ｏｒｏｓ（商標）治療システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）による方法、すなわち、薬物を、浸透圧効果により単一の小孔から水を浸入させて薬物を押し出す半透膜内に封入することによるものである。いくつかの腸溶コーティングも遅延放出作用を有する。

その他のコーティングを製剤に使用し得る。これにはコーティングパンに適用され得る様々な糖類が含まれる。治療剤をフィルムコーティング錠剤で投与することも可能であり、この場合に使用される材料は２つのグループに分けられる。第一のグループは、非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールが挙げられる。第二のグループは、通常はフタル酸エステルである腸溶性材料からなる。

材料の混合物を用いて最適なフィルムコーティングをもたらし得る。フィルムコーティングは、パンコーターまたは流動床内で、または圧縮コーティングにより行い得る。

肺送達形態
本発明の組成物の肺送達も有用である。タンパク質（または誘導体）が吸入の間に哺乳動物の肺へ送達され、肺上皮層を横断して血流まで行く。（これに関する他の報告としては、ＡｄｊｅＩら，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９；ＡｄｊｅＩら（１９９０），Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔＩｃｓ ６３：１３５−４４（ロイプロリド酢酸）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９），Ｊ．ＣａｒｄＩｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９），Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６−１２（１−アンチトリプシン）；ＳｍＩｔｈら（１９８９），Ｊ．ＣｌＩｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（１−プロテイナーゼ）；ＯｓｗｅＩｎら（Ｍａｒｃｈ １９９０），"ＡｅｒｏｓｏｌＩｚａｔＩｏｎ ｏｆ ＰｒｏｔｅＩｎｓ，" Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ ＤｅｌＩｖｅｒｙ ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子）およびＰｌａｔｚら，米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる）。治療製品の肺送達用に設計された広範な機械装置が本発明の実施に有用であり、特に限定されないが、噴霧器、定量吸入器および粉末吸入器が挙げられ、これらはすべて当業者に公知である。本発明の実施に適した市販装置のいくつかの特定の例は、ＭａｌｌＩｎｃｋｒｏｄｔ社（Ｓｔ．ＬｏｕＩｓ，ＭＩｓｓｏｕｒＩ）製のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器；Ｍａｒｑｕｅｓｔ ＭｅｄＩｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）製のＡｃｏｒｎＩＩ噴霧器；Ｇｌａｘｏ社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＴｒＩａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ ＣａｒｏｌＩｎａ）製のＶｅｎｔｏｌＩｎ計量吸入器；およびＦＩｓｏｎｓ社（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）製のＳｐＩｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。（例えば、Ｈｅｌｇｅｓｓｏｎら，ＩｎｈａｌａｔＩｏｎ ｄｅｖＩｃｅ，米国特許第６，８９２，７２８号；ＭｃＤｅｒｍｅｎら，Ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ Ｉｎｈａｌｅｒ，国際公開第０２／１１８０１Ａ１号；ＯｈｋＩら，Ｉｎｈａｌａｎｔ ｍｅｄＩｃａｔｏｒ，米国特許第６，２７３，０８６号を参照されたい）。

上記装置はすべて、本発明の化合物の投与に適した製剤を使用する必要がある。通常、各製剤は使用する装置のタイプに特異的であり、治療に有用な希釈剤、補助剤および／または担体に加え、適当な噴射剤材料の使用を含み得る。

本発明の化合物は、最も有利には、肺末端までの最も効率的な送達のために、平均粒子サイズが１０μｍ（またはミクロン）未満、もっとも好ましくは０．５〜５μｍの微粒子形態で調製するべきである。

薬学的に許容される賦形剤としては、糖質、例えばトレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトースおよびソルビトールなどが挙げられる。製剤中での使用のための他の成分としては、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣを挙げ得る。天然または合成界面活性剤を使用し得る。ＰＥＧを使用し得る（タンパク質または類似体の誘導体化でのその使用とは別でも）。シクロデキストランのようなデキストランを使用し得る。胆汁酸塩および他の関連する促進剤を使用し得る。セルロースおよびセルロース誘導体を使用し得る。緩衝製剤での使用のように、アミノ酸を使用し得る。

リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフィア、包接錯体または他のタイプの担体の使用も意図される。

ジェット式または超音波式いずれかの噴霧器での使用に適した製剤は通常、溶液１ｍＬ当たり約０．１〜２５ｍｇの生物学的に活性なタンパク質の濃度で水に溶解させた本発明の化合物を含む。製剤は緩衝剤および単純糖も含み得る（例えば、タンパク質安定化および浸透圧調節のため）。噴霧製剤は、エアロゾル形成における溶液の噴霧化により引き起こされる、表面に誘起されたタンパク質の凝集を減少させるまたは防ぐために、界面活性剤も含有し得る。

計量吸入装置で使用する製剤は一般に、界面活性剤の補助により噴射剤中に懸濁した本発明の化合物を含有する微粉化粉末を含む。噴射剤は、この目的で使用される任意の従来の材料、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含めた炭化水素、あるいはそれらの組合せなどであり得る。適当な界面活性剤としては、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸も界面活性剤として有用である。（例えば、Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら（「ａ」と「ｏ」にウムラウト有り），Ａｅｒｏｓｏｌ ｄｒｕｇ ｆｏｒｍｕｌａｔＩｏｎｓ ｃｏｎｔａＩｎＩｎｇ ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏａｌｋａｎｅｓ ａｎｄ ａｌｋｙｌ ｓａｃｃｈａｒＩｄｅｓ，米国特許第６，９３２，９６２号を参照されたい）。

粉末吸入装置から投与するための製剤は、本発明の化合物を含有する微粉化乾燥粉末を含み、かつ装置からの粉末散布を促進する量、例えば、製剤重量で５０〜９０％で増量剤、例えばラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールなども含み得る。

経鼻送達形態
本発明に従えば、本発明の組成物および／または医薬組成物の鼻腔内送達も有用であり、これにより、鼻の中に投与した後、製品を肺の中に堆積させる必要なしに直接、組成物を血流まで通過させることができる。鼻腔内投与に適した製剤としては、デキストランまたはシクロデキストランを含む製剤が挙げられ、鼻腔内送達装置は既知である。（例えば、Ｆｒｅｅｚｅｒ，Ｉｎｈａｌｅｒ，米国特許第４，０８３，３６８号を参照されたい）。

経皮および経粘膜（例えば、バッカル）送達形態
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を薬学的に許容される経皮または経粘膜パッチまたはトローチの一部として形成する。経皮パッチ薬物送達システム、例えば、マトリックス型経皮パッチが知られており、本発明の医薬組成物のいくつかの実施形態の実施に有用である。（例えば、ＣｈＩｅｎら，Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｅｓｔｒｏｇｅｎ／ｐｒｏｇｅｓｔＩｎ ｄｏｓａｇｅ ｕｎＩｔ，ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ，米国特許第４，９０６，１６９号および第５，０２３，０８４号；Ｃｌｅａｒｙら，ＤＩｆｆｕｓＩｏｎ ｍａｔｒＩｘ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｒｕｇ ａｄｍＩｎＩｓｔｒａｔＩｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｄｅｖＩｃｅｓ ＩｎｃｌｕｄＩｎｇ ｓａｍｅ，米国特許第４，９１１，９１６号；ＴｅＩｌｌａｕｄら，ＥＶＡ−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｍａｔｒＩｘ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｄｍＩｎＩｓｔｒａｔＩｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ／ｏｒ ａ ｐｒｏｇｅｓｔｏｇｅｎ，米国特許第５．６０５，７０２号；Ｖｅｎｋａｔｅｓｈｗａｒａｎら，Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｍａｔｒＩｘ ｆｏｒ ｃｏａｄｍＩｎＩｓｔｅｒＩｎｇ ｅｓｔｒａｄＩｏｌ ａｎｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｓｔｅｒｏＩｄ，米国特許第５，７８３，２０８号；Ｅｂｅｒｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｖＩｄＩｎｇ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｎｄ ｏｐｔＩｏｎａｌｌｙ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ ｗｏｍｅｎ，米国特許第５，４６０，８２０号）。治療剤の経粘膜送達のための様々な薬学的に許容されるシステムも当該技術分野で公知であり、本発明の実施と適合する。（例えば、ＨｅＩｂｅｒら，Ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｒｕｇｓ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ米国特許第５，３４６，７０１号および第５，５１６，５２３号；Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒｍｕｌａｔＩｏｎｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ａｄｍＩｎＩｓｔｒａｔＩｏｎ，米国特許第４，９９４，４３９号）。

本発明の組成物のバッカル送達も有用である。バッカル送達製剤は、ペプチドとの使用に関して当該技術分野で公知である。例えば、口腔粘膜（例えば、舌下粘膜）を介した薬物送達用に形成された既知の錠剤またはパッチシステムには、薬物、透過促進剤（胆汁酸塩もしくはフシジン酸など）および親水性ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、ペクチン、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチンなど）またはこの目的に有用であることが知られている他のあらゆるポリマーを含有する内層を含む、いくつかの実施形態が含まれる。この内層は、口腔の湿潤粘膜組織に接触および付着するように適合させた片面を有し、かつ上を覆う非接着の不活性層に付着している反対面を有し得る。任意で、このような経粘膜送達システムは、内層が追加の結合剤、着香剤または増量剤も含有する二層錠剤の形態であり得る。いくつかの有用なシステムでは、透過促進剤と共に非イオン界面活性剤を用いる。経粘膜送達装置は、クリーム、ゲルもしくは軟膏のような自由な形態であり得、または錠剤、パッチもしくはトローチのような決まった形態を含み得る。本発明の組成物の送達は、例えば、接着層、裏打ち層、本発明の組成物を含有する貯蔵部分を規定する透過性膜、膜を裏打ちする剥離シールディスク、１つ以上のヒートシールおよび取り外し可能な剥離ライナーの積層材料を含む経粘膜送達システムを介してもよい。（例えば、Ｅｂｅｒｔら，Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｅｌＩｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｗＩｔｈ ａｄｈｅｓＩｖｅ ｏｖｅｒｌａｙ ａｎｄ ｐｅｅｌ ｓｅａｌ ｄＩｓｃ，米国特許第５，６６２，９２５号；Ｃｈａｎｇら，ＤｅｖＩｃｅ ｆｏｒ ａｄｍＩｎＩｓｔｅｒＩｎｇ ａｎ ａｃｔＩｖｅ ａｇｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｓｋＩｎ ｏｒ ｍｕｃｏｓａ，米国特許第４，８４９，２２４号および第４，９８３，３９５号）。これらの例は、利用可能な経粘膜薬物送達技術の単なる具体例に過ぎず、本発明を限定するものではない。

投与量
上記状態を治療するための方法に含まれる投与レジメンは、薬物の作用を変化させる様々な因子、例えば、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、任意の感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床因子を考慮して担当医により決定される。一般的に、１日のレジメンは、体重１キログラム当たり、本発明の化合物が０．１〜１０００マイクログラム、好ましくは１キログラム当たり０．１〜１５０マイクログラムの範囲にあるべきである。

下の実施例は具体例であり、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

実施例１
Ｋｖ１．３およびＫｖ１．１の電気生理
Ｋｖ１．１からＫｖ１．７までを発現する細胞系
ＣＨＯ−Ｋ１細胞をヒトＫｖ１．３で、またはカウンタースクリーン（実施例６を参照されたい）用にｈＫｖ１．４、ｈＫｖ１．６もしくはｈＫｖ１．７で安定にトランスフェクトした；ＨＥＫ２９３細胞は、ヒトＫｖ１．３を安定に発現するかまたはヒトＫｖ１．１を有していた。細胞系はＡｍｇｅｎまたはＢＩｏＦｏｃｕｓ ＤＰＩ（Ｇａｌａｐａｇｏｓ社の１つ）のものであった。ｈＫｖ１．２を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、カウンタースクリーン用にＭＩｌｌＩｐｏｒｅ（カタログ番号ＣＹＬ３０１５）から購入した。

全細胞パッチクランプ電気生理
全細胞電流を、ホウケイ酸ガラスを引き伸ばした３〜５ＭΩピペット（Ｗｏｒｌｄ ＰｒｅｃＩｓＩｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を備えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のＭｕｌｔＩＣｌａｍｐ７００Ｂ増幅器を用いて室温で記録した。データ収集中に、容量性電流をアナログ減算により相殺し、シリーズ抵抗補正は使用せず、電流はすべて２ｋＨｚでフィルタリングした。細胞を１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＫＣｌ、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する細胞外液（ｐＨ７．４、２９０〜３００ｍＯｓｍ）中に浸した。内液は９０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＫＦ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有していた（ｐＨ７．２、２９０〜３００ｍＯｓｍ）。−８０ｍＶの保持電位で、−８０ｍＶ〜＋３０ｍＶまでの段階的な脱分極電圧を２００ミリ秒の時間間隔で、３０秒（Ｋｖ１．３）または１０秒（Ｋｖ１．１）毎に加えることにより、電流を誘発した。ＩＣ５０を決定するために、０．１％ＢＳＡを含む細胞外液中、１：３希釈の５〜６つのペプチドまたはペプチドコンジュゲート濃度を作成して、ＲａｐＩｄ ＳｏｌｕｔＩｏｎ Ｃｈａｎｇｅｒ ＲＳｃ−１６０（ＢＩｏＬｏｇＩｃ ＳｃＩｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で局所的に細胞へ送った。各濃度に対して電流を定常状態にした。ｐＣＬＡＭＰ（バージョン９．２）およびＯｒＩｇＩｎＰｒｏ（バージョン７）を用いたデータ解析を行い、各被検試料適用の前および後のピーク電流を用いて、各濃度における電流阻害のパーセントを計算した。

ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）、平面パッチクランプ電気生理
細胞を１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＫＣｌ、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する細胞外液（ｐＨ７．４、２９０〜３００ｍＯｓｍ）中に浸した。内液は９０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ ＫＦ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有していた（ｐＨ７．２、２９０〜３００ｍＯｓｍ）。ＩＣ５０を決定するために、通常、１：３希釈の５つのペプチドまたはペプチドコンジュゲート濃度を作成した。０．１％ＢＳＡを含む細胞外液中でペプチドまたはペプチドコンジュゲートを調製した。デンドロトキシン−ｋおよびマルガトキシンをＡｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ社（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）から購入し；ＳｈＫ毒素をＢａｃｈｅｍ ＢＩｏｓｃＩｅｎｃｅ社（ＫＩｎｇ ｏｆ ＰｒｕｓｓＩａ，ＰＡ）から購入し；４−ＡＰをＳＩｇｍａ−ＡｌｄｒＩｃｈ社（Ｓｔ．ＬｏｕＩｓ，ＭＯ）から購入した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ社（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）７０００Ａ電気生理システムを用いて、電流を室温で記録した。ｈＫｖ１．３およびｈＫｖ１．１に対する電圧プロトコールを、下の実施例６の表４Ｅに示す。最初に、１００％のパーセント対照（ＰＯＣ）を得るために０．１％ＢＳＡを含む細胞外液に、次いで、５つの異なる濃度の１：３ペプチドまたはペプチドコンジュゲート希釈物に、４００ミリ秒のインキュベーション時間毎に印加した。最後に、過剰の特異的ベンチマークイオンチャネル阻害剤（実施例６の表４Ｅ）を加えて、完全なまたは１００％のブロックを定めた。ゼロパーセントの対照を計算するために、ベンチマーク阻害剤の添加後に存在する残留電流ををいくつかの場合に使用した。Ｋｖ１．３およびＫｖ１．１に対するベンチマーク阻害剤を実施例６の表４Ｅに記載する。トレースまたは試行の各個別のセットを視覚的に調べ、採用または棄却した。採用のための概略的な基準は次の通りであった：
１．ベースライン電流が安定していなければならない
２．初期ピーク電流が＞３００ｐＡでなければならない
３．初期Ｒｍおよび最終Ｒｍが＞３００オームでなければならない
４．ピーク電流が最初の化合物添加の前に定常状態に達しなければならない。

次の濃度の化合物添加前の最後の５スイープの平均ピーク電流からＰＯＣを計算し、ＩＣ５０計算のためにＥｘｃｅｌにエクスポートした。

ＩｏｎＷｏｒｋｓ、ハイスループットな平面パッチクランプ電気生理
ｈＫｖ１．３を安定に発現するＣＨＯ細胞およびｈＫｖ１．１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞に関して電気生理を行った。ＩＷＱ電気生理のためのＳｈＫ類似体およびコンジュゲートを含有する「アッセイプレート」の調製手順は以下の通りであった：すべての類似体を、０．３％ＢＳＡを含む細胞外緩衝液（０．９ｍＭ Ｃａ^２＋および０．５ｍＭ Ｍｇ^２＋を含むＰＢＳ）中に溶解し、９６ウェルポリプロピレンプレートの行Ｈに１００ｎＭの濃度で列１〜列１０まで分注した。列１１および１２は、陰性および陽性対照用に残しておき、後で１：３の比で行Ａまで連続希釈した。ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏ（ＩＷＱ）電気生理およびデータ解析を以下の通りに行った：再懸濁した細胞（細胞外緩衝液中）、アッセイプレート、ＰｏｐｕｌａｔＩｏｎ Ｐａｔｃｈ Ｃｌａｍｐ（ＰＰＣ）ＰａｔｃｈＰｌａｔｅならびに適当な細胞内（９０ｍＭグルコン酸カリウム、２０ｍＭ ＫＦ、２ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５）および細胞外緩衝液をＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏに配置した。類似体をパッチプレートに添加する際に、最終試験濃度の範囲が３３．３ｎＭ〜１５ｐＭになるように、それらをアッセイプレートから０．１％ＢＳＡでさらに３倍希釈した。電気生理の記録は、アンホテリシンによる穿孔パッチクランプ法を用いてＣＨＯ−Ｋｖ１．３およびＨＥＫ−Ｋｖ１．１細胞から行った。ＩｏｎＷｏｒｋｓ Ｑｕａｔｔｒｏの電圧固定回路を用いて、細胞を−８０ｍＶの膜電位に固定し、４００ミリ秒間、膜電位を＋３０ｍＶまで段階的に変化させることにより、電圧依存性Ｋ^＋電流を誘発した。実験の開始時に対照条件下、すなわち、阻害剤の非存在下で、１０分間のインキュベーション後に類似体および対照の存在下で、Ｋ^＋電流を誘発した。４３０ミリ秒と４４０ミリ秒の間で平均Ｋ^＋電流振幅を測定し、データをＭＩｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシートにエクスポートした。各濃度の類似体および対照の存在下でのＫ^＋電流の振幅を、同一ウェルでの化合物前の電流振幅のＫ＋電流のパーセントとして表した。これらの対照値の％を濃度の関数としてプロットすると、以下の等式を用いるＥｘｃｅｌフィットプログラムの投与量反応フィットモデル２０１を使用して、各化合物のＩＣ５０値を計算することができた：

式中、ｙｍＩｎは曲線のｙの最小値であり、ｙｍａｘは曲線のｙの最大値であり、ｃｏｎｃ．は試験濃度であり、ｎは曲線のＨＩｌｌ勾配である。

実施例２
ヒト全血中での生物活性測定
ＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇ分泌に対する毒素ペプチド類似体Ｋｖ１．３阻害剤の影響を調べるためのエキソビボアッセイ
以前に記載されているエキソビボアッセイ（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例４６を参照されたい）を用いて、ヒト全血中でのＴ細胞炎症のブロックにおけるＳｈＫ類似体およびコンジュゲートの効力を調べた。簡潔には、５０％ヒト全血をタプシガルギンで刺激して、貯蔵枯渇、カルシウム動員およびサイトカイン分泌を誘導した。Ｔ細胞サイトカイン分泌のブロックにおける分子の効力を評価するために、様々な濃度のＫｖ１．３ブロッキングペプチドおよびペプチドコンジュゲートを、タプシガルギン刺激を加える前の３０〜６０分間、ヒト全血試料と共にプレインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間後、調整済み培地を回収し、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ ＤＩｓｃｏｖｅｒの４スポット電気化学発光イムノアッセイを用いてサイトカイン分泌レベルを測定した。タプシガルギン刺激を用いて、複数の供与者から単離した血液からサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇを強力に分泌させた。タプシガルギン刺激の後にヒト全血中で産生させたＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇは、細胞内サイトカイン染色および蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析から明らかなように、Ｔ細胞から産生された。

Ｋｖ１．３は、Ｔ細胞上に存在する主要な電位依存性カリウムチャネルである。Ｋ^＋を流出させることにより、Ｋｖ１．３は、効率的なＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌に必要な細胞内カルシウムの持続的な上昇に必要とされる、継続的なＣａ^２＋流入の駆動力を供給する。Ｋｖ１．３阻害剤が、ＴＣＲ連結反応によりこのカルシウム流動を抑制することが以前に示されている（Ｇ．Ｃ．Ｋｏｏら，１９９９，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７，９９−１０７）。タプシガルギン誘導性の貯蔵枯渇およびＴＣＲ連結反応は、単離Ｔ細胞において同様のパターンのＣａ^２＋動員を誘発する（Ｅ．ＤｏｎｎａｄＩｅｕら，１９９１，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２５８６４−２５８７２）が、本発明者らは、タプシガルギンがより全血においてより強力な応答を引き起こすことを見出した。したがって、本発明者らは、ヒト全血中においてタプシガルギンにより誘導されるＴ細胞からのサイトカイン分泌をブロックするＫｖ１．３阻害剤の能力を調べることによりその生物活性を評価するための、バイオアッセイを開発した。全血は高レベルのタンパク質を含有する複雑な液体であり、この全血アッセイにおけるペプチドおよびペプチドコンジュゲートの活性は、生物学関連の液体中での４８時間にわたる分子の安定性の評価においてさらなる利点を有する。電気生理学（ｅＰｈｙｓ）アッセイは一般に持続時間が短く（＜１〜２時間）、タンパク質を含有しない生理的食塩水を使用するため、ｅＰｈｙｓにより判定されたＫｖ１．３の分子効力の重要な確認が全血アッセイで得られる。全血アッセイの持続時間が長いほど、持続時間が短いｅＰｈｙｓ実験に比べて、平衡結合速度のより有効な判定が可能となり得る。

例えば、ＳｈＫ−Ｄａｐ２２（配列番号３１７）はＳｈＫのＬｙｓ２２類似体であり、向上したＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を有することが以前に報告されている（Ｋａｌｍａｎら，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ａ ｐｏｔｅｎｔ Ｋｖ１．３−ｓｐｅｃＩｆＩｃ ＩｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓＩｖｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔＩｄｅ，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４９）：３２６９７−７０７（１９９８））。ＳｈＫ−Ｄａｐ２２分子は、天然ＳｈＫと同様の効力を有し、全細胞パッチクランプ電気生理による測定で約２３ｐＭのＩＣ５０の強力なＫｖ１．３ブロックをもたらすことが報告された（Ｋ．Ｋａｌｍａｎら，１９９８，同上）。本発明者らは、全細胞パッチクランプ電気生理により、ＳｈＫ−Ｄａｐ２２（Ｂａｃｈｅｍから購入）が約１２ｐＭのＩＣ５０でＫｖ１．３を強力にブロックすることを見出した（実施例３、実施例５および表４Ｅを参照されたい）が、それはヒト全血からのＩＬ−２産生ブロックにおいては効力が約300倍弱い（約３７６３ｐＭのＩＣ５０）ことを見出す。これに対し、天然ＳｈＫは、Ｋｖ１．３およびＩＬ−２全血応答においてほぼ等しい効力を有する。Ｒ．Ｅ．ＭＩｄｄｌｅｔｏｎら（ＢＩｏｃｈｅｍＩｓｔｒｙ ４２，１３６９８−１３７０７，２００４）は、放射性リガンド結合競合により、ＳｈＫ−Ｄａｐ２２が天然ＳｈＫに比べて、Ｋｖ１．３に対する平衡結合親和性が約７００倍弱いということを報告するが、これはＳｈＫ−Ｄａｐ２２の効力が低いという本発明者らの全血での知見と一致する。したがって、パッチクランプ電気生理単独では、毒素ペプチド類似体の真の効力または親和性を明らかにすることができないと思われ、毒素ペプチド類似体の平衡結合親和性に有意な変化が起こったか否かを把握するために別の方法を用いるべきである。

こうした理由で、本発明者らは、２つの異なるアッセイ：（ａ）Ｋｖ１．３またはＫｖ１．１に対する影響を測定する電気生理学的アッセイおよび（ｂ）平衡結合を測定すると本発明者らが考える、本明細書に記載の４８時間のヒト全血アッセイにおいてすべての毒素ペプチド類似体およびコンジュゲートを試験する、パレレルスクリーニング法を開発した。後者のアッセイを用いて、毒素ペプチド類似体をそのＮ末端で直鎖状ＰＥＧによりペグ化したものである、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６；下の実施例４を参照されたい）が、０．０９２ｎＭ（ｎ＝１４）のＩＣ５０および１．０１３ｎＭ（ｎ＝１４）のＩＣ９５で全血ＩＬ−２分泌の強力なブロックをもたらすことを見出した。炎症の全血アッセイにおける毒素ペプチド類似体およびコンジュゲートの生物活性を、本明細書に開示される他の実施例および表に記載する。

実施例３
毒素ペプチド類似体
Ｃｙｓ残基を除くすべてのＳｈＫアミノ酸残基の位置をそれぞれ、単一の位置でＡｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕまたは１−Ｎａｌ残基のいずれかにより置換した。従来の固相合成法を用いて、毒素ペプチドおよび毒素ペプチド類似体を作製および精製した。（例えば、下の実施例４を参照されたい）。Ｋｖ１．３およびＫｖ１．１活性を電気生理（ＩＷＱ）およびエキソビボ全血アッセイ（ＷＢ）を用いて測定し、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌に対するＫｖ１．３阻害剤毒素ペプチド類似体の影響を調べた。電気生理（ＩＷＱ）データおよびヒト全血（ＷＢ）機能アッセイデータを、実施例１および実施例２に記載のように回収し、解析した。Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕまたは１−Ｎａｌスキャンに関する電気生理および全血アッセイの結果を下の表６〜１０に記載する。本発明者らはＩＷＱおよびＷＢアッセイにおいて、既に特定されている２２位に加え、特定のＳｈＫ残基の単一残基の変化が、毒素ペプチド類似体のＫｖ１．３阻害効力および／またはＫｖ１．３選択性（すなわち、Ｋｖ１．３対Ｋｖ１．１阻害）を独自に修正することを見出した。結果の概略を図３に示すが、これらは以下の（ａ）〜（ｃ）により支持される。

（ａ）配列番号４に関して、様々な位置における特定の単一置換毒素ペプチド類似体は、天然ＳｈＫ配列（配列番号１）に比べて、Ｋｖ１．３阻害活性を有意に減少させる（すなわち、ＩＣ５０が増加した）ことが見出された。これらには以下の位置が含まれる（丸括弧内はＫｖ１．３活性を減少させたアミノ酸残基）：Ａｓｐ５（Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｎａｌ、［Ｄ５Ａは行われず］）、Ｉｌｅ７（Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｎａｌ）、Ａｒｇ１１（Ａ、Ｅ、Ｎａｌ）、Ｓｅｒ２０（Ｒ、Ｅ、Ｎａｌ）、Ｍｅｔ２１（Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｎａｌ）、Ｌｙｓ２２（Ｒ、Ｅ、Ｎａｌ）、Ｔｙｒ２３（Ｒ、Ｅ、Ｎａｌ、［Ｙ２３Ｋは行われず］）、Ｐｈｅ２７（Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｎａｌ、［Ｆ２７Ｅは行われず］）。これらのＳｈＫ残基（Ｄ５、Ｉ７、Ｒ１１、Ｓ２０、Ｍ２１、Ｋ２２、Ｙ２３、Ｆ２７）は、Ｋｖ１．３に対する鍵となる結合部位と考えることができ、ＳｈＫの三次元溶液構造の単一面に集まることが見出された（図１Ｃ）。

（ｂ）配列番号４に関して、様々な位置における特定の単一置換毒素ペプチド類似体は、天然ＳｈＫ配列（配列番号１）に比べて、Ｋｖ１．３阻害活性を向上させる（すなわち、ＩＣ５０が減少した）ことが見出された。これらには以下の位置が含まれる（丸括弧内はＫｖ１．３活性を向上させたアミノ酸残基）：Ｓｅｒ２（Ｅ）、Ｉｌｅ４（Ｋ、Ｅ、Ａ）、Ｓｅｒ１０（Ｒ、Ｅ）、Ｐｈｅ１５（Ａ）、Ｌｙｓ１８（Ｒ、Ａ）、Ｌｙｓ３０（Ｒ、Ｅ）、Ｔｈｒ３１（Ｎａｌ）、Ｔｈｒ３４（Ｎａｌ）。

（ｃ）配列番号４に関して、様々な位置における特定の単一置換毒素ペプチド類似体は、天然ＳｈＫ配列（配列番号１）に比べて、Ｋｖ１．３に対する選択性を向上させる（対Ｋｖ１．１；すなわち、ＩＣ５０Ｋｖ１．１／ＩＣ５０Ｋｖ１．３が増加した）が、Ｋｖ１．３阻害活性に対する実質的な効果はもたないことが見出された。これらには以下の位置が含まれる（丸括弧内はＫｖ１．３に対する選択性を向上させたアミノ酸残基）：Ｉｌｅ７（Ｋ）、Ｓｅｒ１０（Ａ）、Ｇｌｎ１６（Ｋ、Ｎａｌ）、Ｓｅｒ２０（Ｋ，Ｒ）、Ｌｙｓ２２（Ａ）、Ｔｙｒ２３（Ａ、［Ｙ２３Ｋは行われず］）、Ｓｅｒ２６（Ｎａｌ）、Ｐｈｅ２７（Ｎａｌ［Ｆ２７Ｅは行われず］）、Ａｒｇ２９（Ｋ、Ｎａｌ）。ＳｈＫの原子構造の解析から、類似体化の際にＫｖ１．３選択性を向上させる鍵となるいくつかの残基は、周辺部に位置し、一部上記（ａ）に記載されているＫｖ１．３結合に重要なＳｈＫ残基を取り囲んでいることが明らかとなった。類似体に変換されたときにＫｖ１．３選択性の向上が生じるこれらの残基（Ｉ７、Ｓ１０、Ｑ１６、Ｓ２０、Ｓ２６、Ｒ２９）は、ＳｈＫのＮＭＲ構造の空間充填立体モデルを示す図１Ｄにおいて薄く着色してある。Ｋｖ１．３結合に重要ないくつかの残基の類似体、例えばＩｌｅ７（Ｋ）、Ｌｙｓ２２（Ａ）、Ｔｙｒ２３（Ａ）およびＰｈｅ２７（１−Ｎａｌ）なども選択性を向上させる。しかし、上記類似体のいくつかに関しては、この選択性の獲得が許容されない大きさの効力低下を伴う場合があり、これによりその類似体は望ましくないものとなる。

データは、配列番号４に関して、８、１３および３３位のアミノ酸残基は、Ｋｖ１．３阻害効力を大きく低下させることなくスキャン残基（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、１−ＮａｌおよびＧｌｕ）で置換され得ることを示していた。

同じことは残基Ａｓｐ５に関しては言えず、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、１−Ｎａｌおよびリジン置換はあまり許容性がなかった。本発明者らはＫｖ１．３阻害活性の大きな低下を観察した。（５位のＡｌａの置換は、この分子の調製が非常に難しいため、まだアッセイしていない。）５位は非常に感受性が高く、Ａｓｐ（酸性の短側鎖）からＧｌｕ（長側鎖の酸性残基）への変化でさえ、あまり許容性がなかった。全体のマルチパスＳｈＫスキャンから、本発明者らは、置換で最も許容性の高い残基はＡｓｐ５（もっとも高許容性）、Ｓｅｒ２０、Ｌｙｓ２２およびＴｙｒ２３であることを見出した。ＳｈＫ残基Ｌｙｓ２２およびＴｙｒ２３は、Ｋｖ１．３に対する重要な結合部位として以前報告されている。Ｌｙｓ２２およびＴｙｒ２３のＡｌａ類似体が活性の減少を示したのに対し、これらの残基の他のすべての類似体は不活性であった。Ｌｙｓ２２（Ａ）およびＴｙｒ２３（Ａ）類似体は、天然ＳｈＫに比べて、Ｋｖ１．３に対して７〜１０倍活性が低く、Ｔ細胞炎症のヒト全血アッセイでは３５〜５６倍活性が低かった。向上したＫｖ１．３選択性を有することが以前報告されているＳｈＫ−Ｄａｐ２２類似体（Ｋ．Ｋａｌｍａｎら，１９９８，同上）は、この全血アッセイにおいては５６倍活性か低かった。したがって、ＳｈＫのＬｙｓ２２のＡｌａおよびジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）類似体により付与されるＫｖ１．３選択性のわずかな向上にもかかわらず、効力の大きな低下が、わずかな選択性の向上の利益の大部分を打ち消した。

本発明者らは文献の知見から、１６位でのアラニン置換が選択性を付与することは見出されていないことを確認した。（例えば、Ｋｅｍら，ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ｃｏｍｐｏｓＩｔＩｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ，米国特許第６，０７７，６８０号を参照されたい）。しかし、天然ＳｈＫ配列（配列番号１）の１６位がＧｌｎ残基から塩基性のリジン残基に変化した場合、高い効力および非常に優れた選択性が得られた（表５および表１０）。興味深いことに、別の塩基性残基であるアルギニンでは同じ結果は得られなかった（表６）が、Ａｒｇ側鎖はリジンに比べてほぼ１Å長かった。さらにアルギニンは、そのグアニド官能基により、第一級アミンにおけるピラミッド型構造と比べて、かさ高い平面構造を正電荷に与える。優れたＫｖ１．３選択性は、１６位での１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）のような大きなかさ高い中性基の導入でも見られた（表８）。しかし、１６位での１−Ｎａｌ修飾は、Ｋｖ１．３阻害に関する（＞５倍の低下）および全血アッセイにおける（約３２５〜５００倍の活性低下）分子の効力を確かに低下させた。Ｋｖ１．３選択性は、ＳｈＫの２６または２７位での１−Ｎａｌ導入でも観察されたが、１６位での１−Ｎａｌとまた同様に、これらの置換も全血アッセイにおける効力の低下をもたらした。

表１１（１６位毒素ペプチド類似体）のデータに基づいて本発明者らが行った別の観察では、天然ＳｈＫ配列において、中性のＧｌｎ側鎖による極性を長い塩基性残基（例えば、Ｌｙｓ）に変化させることにより、向上したＫｖ１．３選択性が得られ、ＩＷＱまたはＷＢアッセイにより測定されたＫｖ１．３活性における実質的な変化はなかった。Ｋｖ１．３に対する選択性（Ｋｖ１．１と比較した）は、１回に１メチレン基ずつ側鎖を短くするにつれて徐々に失われた（Ｌｙｓ〉Ｏｒｎ〉Ｄａｂ〉Ｄａｐ）。興味深いことに、ＨＩｓ１６置換（塩基性、アリール残基）は選択的分子を生じることができなかった。中性のＧｌｎ側鎖による極性を大きな芳香族（アリール）残基であるＡｈｐに変化させることにより、向上した、Ｋｖ１．１を上回るＫｖ１．３選択性が得られた。［Ａｌａ２３］ＳｈＫおよび［Ａｒｇ３０］ＳｈＫのような他の毒素ペプチド類似体もＫｖ１．３選択性を付与したが、Ｋｖ１．３に対する阻害効力は著しく低かった。

毒素ペプチド類似体分子の調製において、合成、フォールディングおよび凍結乾燥工程に間に＋１６Ｄａの副産物が観察された。ＳｈＫペプチドが２１位に単一のメチオニン残基を含んでおり（配列番号１を参照されたい）、この硫黄含有残基がそのＭｅｔ［Ｏ］型（＋１６Ｄａ）に酸化することが十分に裏付けられていることを考えれば、配列番号４に関して、２１位の残基を易酸化性でない別の残基に置き換えることが望ましかった。よく知られたＭｅｔに対する同配体置換はノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、この場合、同配体側鎖基は同じ原子数で構成されているが、Ｎｌｅ残基では硫黄原子（Ｍｅｔ残基中に存在する）がメチレン（−ＣＨ_２−）単位により置換されているという点で異なる。Ｎｌｅ組込みは、２１位において適度に許容性が高いが、Ｋｖ１．３阻害効力はわずかに低下していた（表１７）。残基２１における位置スキャンにより、この位置がＫｖ１．３効力および選択性に影響することが示された。Ｎｌｅ置換の他に、Ｍｅｔ［Ｏ］、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、Ｃｈｇ、ＰｈｅおよびＮｖａが、ＩＷＱアッセイによる判定で、適度に許容性が高かった。これらの変化のうち、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、Ｃｈｇ、ＰｈｅおよびＮｖａがさらに、Ｋｖ１．１を上回るＫｖ１．３に対する優れた選択性をもたらした。全血アッセイにおいて、［Ｌｙｓ１６，Ｎｌｅ２１］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号２３６）、［Ｌｙｓ１６，Ｍｅｔ（Ｏ）２１］ＳｈＫ−アミド（配列番号２５７）および［Ｌｙｓ１６，Ｎｖａ２１］ＳｈＫ−アミド（配列番号２６０）がＩＬ−２応答に対してより大きな効力を示した。（表１５および表１７）。

ＳｈＫ構造活性をさらに調査し、またＣ末端システイニルカルボキシラートを避けるためにも、本発明者らは、より適切なＣ末端官能基を特定しようとした。Ｃ末端システイニルカルボキシラートはそれらの調製に関連した化学合成の困難さを増加させ得る。本発明者らは、遊離カルボン酸からカルボキサミドへのＣ末端の変化を含むＣ末端アミド化を調べた（表５および表１４）。［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）から［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−アミド（配列番号１４）に変化させることにより、Ｋｖ１．３（ＩＷＱ ＩＣ５０＝０．２ｎＭ）およびＷＢ ＩＬ−２分泌（ＩＣ５０＝０．１ｎＭ）のブロックにおいてほぼ等しい活性を有する分子が得られた。しかし、Ｌｙｓ１６、Ｎｌｅ２１の二重置換とＣ末端アミド化との組合せにより、向上したＫｖ１．３選択性（Ｋｖ１．１を上回る）を有する分子が得られ、これは［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３；ＩＣ５０＝０．１１）に比べて、Ｋｖ１．３のブロックの効力が等しい（ＩＷＱ ＩＣ５０＝０．１５ｎＭ）にもかかわらず、炎症のＷＢ ＩＬ−２アッセイにおける活性が約７倍低かった（ＩＣ５０＝０．８２ｎＭ）（表５および表１４を参照されたい）。興味深いことに、残基１６においてＬｙｓ１６を塩基性でかつより大きなヒスチジン残基で置換した［ＨＩｓ１６；Ｎｌｅ２１］ＳｈＫ−アミド（配列番号１５７；表１１）は、Ｋｖ１．３に対する効力は高いが、Ｋｖ１．１（ＩＷＱ ＩＣ５０＝１５ｐＭ）を上回るＫｖ１．３（ＩＷＱＩＣ５０＝１３９ｐＭ）に対する選択性は示さなかった。Ｃ末端アミドを含む毒素ペプチド類似体（表１４）のうち、以下に挙げる類似体が、向上したＫｖ１．３選択性を示し、かつＫｖ１．３およびＷＢ ＩＬ−２分泌のブロックにおいて高い効力（ＩＣ５０＜２７０ｐＭ）を保持していた：
［Ａｌａ１５，Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−アミド（配列番号１８６）；
［Ｇｌｕ４，Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−アミド（配列番号１８８）；
［Ｌｙｓ１６，Ｇｌｕ３０］ＳｈＫ−アミド（配列番号１９０）；
［Ｌｙｓ１６，Ｇｌｕ１８］ＳｈＫ−アミド（配列番号１９５）；
［Ｇｌｕ９，Ｌｙｓ１６，Ｎｌｅ２１］ＳｈＫ−アミド（配列番号２２２）；
［Ｌｙｓ１６，２９；Ａｌａ３０］ＳｈＫ−アミド（配列番号２１０）；
［Ｌｙｓ１６，２９；Ｔｒｐ２７］ＳｈＫ−アミド（配列番号２０２）；
［Ｇｌｕ４；Ｌｙｓ１６，２９；Ａｒｇ３０］ＳｈＫ−アミド（配列番号２０１）；
［Ｇｌｕ４；Ｌｙｓ１６，２９；Ａｒｇ１８，３０］ＳｈＫ−アミド（配列番号２１２）；
［Ｇｌｕ４，９；Ｌｙｓ１６，２９；Ａｒｇ１８，３０］ＳｈＫ−アミド（配列番号１９８）；
［Ｇｌｕ４，１０；Ｌｙｓ１６，２９；Ａｒｇ１８，３０］ＳｈＫ−アミド（配列番号１９９）；および
［Ｇｌｕ４，９，１０；Ｌｙｓ１６，２９；Ａｒｇ１８，３０］ＳｈＫ−アミド（配列番号２００）。

Ｃ末端システイニルカルボキシラートペプチドに関する潜在的問題点を解決するために、本発明者らは、追加の残基によるＣ末端伸長を調査した。意外なことに、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）のＣ末端Ｃｙｓ３５残基の後に単一のアラニン残基を追加することにより、Ｋｖ１．１を上回るＫｖ１．３特異性におけるさらなる向上が生じた。表１５および表１６に示されるように、非Ｃｙｓ残基の追加によるＳｈＫのＣ末端伸長により、本来のＣ末端負電荷の再導入が可能となり、効力が増加する可能性がある。特に興味深いのは、Ｃ末端Ｃｙｓ３５残基の後にＡｌａ残基が追加されたＳｈＫのＬｙｓ１６類似体（配列番号２３５、表４Ｈおよび表１５）は、Ｋｖ１．３活性を保持し、劇的に２６２倍向上した、Ｋｖ１．３に対するニューロンＫｖ１．１を上回る選択性（ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（ＰＸ）電気生理による）（表４Ｈ）および１５８倍の向上した選択性（ＩｏｎＷｏｒｋｓ（ＩＷＱ）電気生理による）（表１５）を示した。この［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号２３５）毒素ペプチド類似体は、ヒト全血からのＩＬ−２分泌の強力なブロックをもたらした（ＩＣ５０＝１３８ｐＭ、表４Ｈ）が、これは、本発明者らが同定した最もＫｖ１．３選択的（Ｋｖ１．１を上回る）なＳｈＫの２アミノ酸改変類似体の１つである。Ｃ末端伸長を有する他のＳｈＫアミノ酸類似体で、全血アッセイにおいて効力が高く（ＩＬ−２分泌のブロックにおいてＩＣ５０＜５００ｐＭ）、２００倍を超えるＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を有するものとしては以下のものが挙げられる（表１５を参照されたい）：
［Ｌｙｓ１６，Ｎｌｅ２１］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号２３６）；
［Ｇｌｕ４，Ｌｙｓ１６，Ｎｖａ２１］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号２４２），
［Ｇｌｕ４，Ｌｙｓ１６，Ｎｌｅ２１］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号２４３）；
［Ｌｙｓ１６，Ｎｌｅ２１］ＳｈＫ−Ｇｌｕ（配列番号２４４）；および
［Ｌｙｓ１６，Ｎｌｅ２１］ＳｈＫ−Ｔｙｒ（配列番号２４５）．

実施例４
ペプチドならびにＮα−（２０ｋＤａ ＰＥＧ）−ＳｈＫ（配列番号８）、Ｎα−（２０ｋＤａ ＰＥＧ）−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）、Ｎα−（２０ｋＤａ ＰＥＧ）−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号３１６）およびＮα−ｂｒＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３１５）を含めたペグ化ペプチドの調製
ペプチド合成
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ側鎖保護アミノ酸およびＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２Ｃｌ−ＴｒｔレジンをＮｏｖａｂＩｏｃｈｅｍ社、Ｂａｃｈｅｍ社またはＳＩｇｍａ ＡｌｄｒＩｃｈ社から購入した。以下の側鎖保護ストラテジーを用いた：Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、ＨＩｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）およびＴｙｒ（ＯｔＢｕ）。ＳｈＫ（配列番号１）、ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号１３）または他の毒素ペプチド類似体アミノ酸配列を、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２Ｃｌ−Ｔｒｔレジン（０．２ｍｍｏｌ、０．３２ｍｍｏｌ／ｇ負荷）を用いた０．２ｍｍｏｌ当量基準のＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリング化学を用いたＳＰＰＳにより、ＣＳ ＢＩｏペプチド合成装置で段階的に合成した。各カップリングサイクルに対して、１ｍｍｏｌ Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−アミノ酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、２．５ｍＬの０．４ Ｍ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）に溶解させた。この溶液に、ＤＭＦ中１．０ｍＬの１．０Ｍ Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を加えた。溶液を窒素バブリングにより１５分間撹拌して予備活性化を行い、次いで、レジンを加えた。混合物を２時間振盪した。レジンをろ過し、ＤＭＦで３回、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で２回およびＤＭＦで３回洗浄した。ＤＭＦ中２０％ピペルジン（ｐＩｐｅｒｄＩｎｅ）による処置（５ｍＬ、２×１５分）によりＦｍｏｃ脱保護を行った。最初の２３残基を、上記Ｆｍｏｃ−アミノ酸カップリングおよびＦｍｏｃ除去段階を繰り返して単一カップリングした。残りの残基を、Ｆｍｏｃ除去を進める前にカップリング段階を２回行うことにより二重カップリングした。

合成後に、今度はレジンを排出し、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭで順次洗浄し、次いで減圧下で乾燥させた。ペプチド−レジンを２５０ｍＬのプラスチック丸底フラスコに移した。トリイソプロピルシラン（１．５ｍＬ）、３，６−ジオキサ−１，８−オクタン−ジチオール（ＤＯＤＴ、１．５ｍＬ）、水（１．５ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、２０ｍＬ）での処理により、ペプチドを脱保護してレジンから切り離し、撹拌子と混合物を３時間撹拌した。混合物を１５０ｍＬの焼結ガラス漏斗を通して２５０ｍＬのプラスチック丸底フラスコ内にろ過した。混合物を１５０ｍＬの焼結ガラス漏斗を通して２５０ｍＬのプラスチック丸底フラスコ内にろ過し、ろ液を減圧中で濃縮した。粗ペプチドを冷ジエチルエーテルの添加により沈殿させ、減圧下で乾燥させた。

ペプチドのフォールディング
乾燥粗直鎖状ペプチド（約６００ｍｇ）、例えば［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド（配列番号１３）または［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ（［Ｌｙｓ１６，Ａｌａ３６］−ＳｈＫとしても知られる；配列番号２３５）を、１６ｍＬの酢酸、６４ｍＬの水および４０ｍＬのアセトニトリル中に溶解した。混合物を１５分間急速に撹拌して完全に溶解させた。ペプチド溶液を、１７００ｍＬの水および大型の撹拌子の入った２Ｌのプラスティックボトルに加えた。こうして希釈した溶液に、２０ｍＬの濃縮水酸化アンモニウムを加えて溶液のｐＨを９．５に上げた。必要に応じて、少量の酢酸またはＮＨ_４ＯＨでｐＨを調節した。溶液を８０ｒｐｍで一晩撹拌し、ＬＣ−ＭＳによりモニターした。通常、２４〜４８時間でフォールディング完了と判断し、溶液を酢酸およびＴＦＡ（ｐＨ＝２．５）の添加により反応停止させた。水溶液をろ過した（０．４５μｍセルロース膜）。

逆相ＨＰＬＣ精製
逆相高速液体クロマトグラフィーを分析用（Ｃ１８、５μｍ、０．４６ｃｍ×２５ｃｍ）または調製用（Ｃ１８、１０μｍ、２．２ｃｍ×２５ｃｍ）カラムで行った。クロマトグラフィーによる分離は通常、解析的分析ではＡ中の緩衝液Ｂ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ水溶液；Ｂ＝０．０９％ＴＦＡを含む９０％ＡＣＮ水溶液）の５〜９５％の直線濃度勾配を用いて、流速１ｍＬ／分で３５分にわたり、調製用の分離では、５〜６５％で、流速２０ｍＬ／分で９０分にわたり行った。分析用および調製用ＨＰＬＣ画分をＥＳＭＳおよびフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）ＨＰＬＣにより特徴付け、一緒にして凍結乾燥させた。

質量分析
イオンスプレー大気圧イオン化源を装備した単一四重極質量分析器で質量スペクトルを得た。フューズドシリカキャピラリー接続部分（内径５０μｍ）を介して直接イオン化源と接続した移動溶媒（１０μＬ／分；０．０５％ＴＦＡを含む３０：５０：２０ＡＣＮ／ＭｅＯＨ）内に試料（２５μＬ）を注入した。試料液滴を５ｋＶの正電位でイオン化し、境界プレート、次いで開口部（直径１００〜１２０μｍ）を通して、６０Ｖの電位で分析器に入れた。０．１Ｄａのスキャンステップサイズで質量範囲４００〜２２００Ｄａにわたりフルスキャン質量スペクトルを得た。観察されたｍ／Ｚ値から分子量を導き出した。

ＰＥＧ化、精製および解析
ペプチド、例えば［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）または［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号２３５）を、活性化された直鎖状または分岐ＰＥＧを用いて、そのＮ末端で還元的アルキル化により選択的にペグ化した。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび２モルの過剰２０ｋＤａモノメトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ，Ｊａｐａｎ）を含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ４．５の反応緩衝液中、２ｍｇ／ｍｌでコンジュゲーションを行った。コンジュゲーション反応物を約５時間、室温で撹拌し、その進行をＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。完了した反応物を、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）による４倍希釈により反応停止させ、４℃まで冷却した。次いで、ＰＥＧ−ペプチドを４０℃でクロマトグラフィーにより精製したが、ここではＳＰセファロースＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＰＩｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用し、２０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中０〜１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。溶出したピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより解析し、プーリングを純度＞９７％で決定した。観察された主要な夾雑物はジ−ペグ化毒素ペプチド類似体であった。選択されたプールを３ｋＤａ ＭＷＣＯ膜に対する遠心ろ過により２〜５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、５％ソルビトールを含む１０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中に透析した。次いで、透析したプールを０．２ミクロンのフィルターにより無菌ろ過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ）およびＲＰ−ＨＰＬＣ（図５Ｂ、図５Ｄおよび図５Ｆ）により純度が＞９７％であることを判定した。ＡｇＩｌｅｎｔ１１００モデルＨＰＬＣで、０．１％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ中、１ｍｌ／分でＺｏｒｂａｘ（登録商標）５μｍ ３００ＳＢ−Ｃ８ ４．６×５０ｍｍカラム（ＡｇＩｌｅｎｔ）に流し、カラム温度を４０℃に維持して、逆相ＨＰＬＣを行った。ＰＥＧ−ペプチド（２０μｇ）試料を注入し、波長２１５ｎＭをモニターしながら、６〜６０％の直線濃度勾配で溶出した。

実施例５
Ｎ−２０ ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）およびその他のペグ化毒素ペプチド類似体；哺乳動物種における薬物動態；安全性薬理試験；および単離ウサギ心臓アッセイ
２０ｋＤａ ＰＥＧのコンジュゲーションは、ＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）とＮα−（２０ｋＤａ ＰＥＧ）−ＳｈＫ（配列番号８）の薬物動態（ＰＫ）の比較により示されるように、インビボでの毒素ペプチドの曝露量を大幅に増加させた。（図４を参照されたい）。ＳｈＫ−Ｌ５は以前の刊行物に記載されているＫｖ１．３の強力なペプチド阻害剤である。（Ｂｅｅｔｏｎら，ＴａｒｇｅｔＩｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗＩｔｈ ａ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｎｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏＩｍｍｕｎｅ ｄＩｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；Ｃｈａｎｄｙら，Ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ＳｈＫ ｔｏｘＩｎ ａｎｄ ｔｈｅＩｒ ｕｓｅｓ Ｉｎ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ＩｎｈＩｂＩｔＩｏｎ ｏｆ Ｋｖ１．３ ｐｏｔａｓｓＩｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ，国際公開第２００６／０４２１５１Ａ２号；ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，ＥｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ｂｌｏｃｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｅｌ Ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｆａｓｔ Ｆｏｒｗａｒｄ，ｄｏＩ：１０．１１２４／ｍｏｌ．１０８．０５２７０４（２００９）として２００９年１月２日に公開）。ＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）は、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（ＡＥＥＡ）リンカーを介してＳｈＫと結合したＮ末端リン酸化チロシン部分を含む。この分子は、向上したマウスＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を有するという報告にもかかわらず、本発明者らの方法において、ＳｈＫ−Ｌ５分子がほぼ等しい効力でヒトＫｖ１．３およびＫｖ１．１をブロックすることを本発明者らは見出した（表４Ｈ、表５および図６Ｃ〜６Ｄ）。本発明者らの知見と公開されている知見における違いが、使用されたチャネルの種（マウスとヒト）の違いまたは細胞系の違いに起因するのか否かは不明である。ごく最近では、Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎらが、Ｋｖ１．３チャネルの安定かつ選択的なペプチドブロッカーとしてＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）を記載し；温度上昇により悪化するｐＨに関連した加水分解および酸化副生成物を示すＳｈＫ−Ｌ５よりも安定な類似体として、ＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）がＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎらにより同定された。（ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎら，ＥｎｇＩｎｅｅｒＩｎｇ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔＩｖｅ ｐｅｐｔＩｄｅ ｂｌｏｃｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｖ１．３ ｃｈａｎｎｅｌ Ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５（４）：７６２−７３（２００９））。この報告に基づき、本発明者らはＳｈＫ−１９２を合成し、ヒトＫｖ１．３およびヒトＫｖ１．１に対する活性に関して試験した。ＳｈＫ−Ｌ５分子に関する本発明者らの研究が、Ｋｖ１．３に対するＫｖ１．１を上回る選択性を示さなかった（図６Ｃおよび６Ｄ）のに対し、より新しいＳｈＫ−１９２類似体は、Ｋｖ１．１（図２９Ｂ）に比べて向上したＫｖ１．３選択性（図２９Ａ）を示した。ＳｈＫ−１９２は０．０３９±０．００５ｎＭのＩＣ５０でヒトＫｖ１．３を阻害し、これは、ヒトＫｖ１．１（３．３９±１．６１ｎＭ）に対するそのＩＣ５０よりも約８７倍強力である。ＳｈＫ−Ｌ５に比べて向上したＳｈＫ−１９２のＫｖ１．３選択性が、その安定性の向上に起因するのか、または他の理由に起因するのかは不明である。

それでも本発明者らは、Ｎ末端２０ｋＤａＰＥＧ部分（配列番号８）とコンジュゲートされたＳｈＫ（配列番号８）が、非常に強力でかつ延長されたインビボ半減期を有するにもかかわらず、Ｋｖ１．３非選択的であり、ニューロンＫｖ１．１に対してほぼ等しい効力を有することも見出した（表５）。これに対し、Ｎ末端２０ｋＤａＰＥＧ部分を含む［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ毒素ペプチド類似体（配列番号１６）は、大幅に向上したＫｖ１．３選択性（表５および図６Ａ〜６Ｂ）を有し、Ｋｖ１．３に対してＫｖ１．１よりも１０６０倍高い活性を示した（表４Ｈ）。さらに、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫコンジュゲート（配列番号１６）は、Ｔ細胞炎症のヒト全血アッセイにおいて高い効力（サブｎＭのＩＣ５０）を保持していた。図３０Ａ〜３０Ｂは、ＩＬ−２（図３０Ａ）およびＩＦＮγ（図３０Ｂ）分泌阻害に関して３つのロットの２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）から得られた、代表的な投与量反応曲線を示す。複数の供与者から採取したヒト全血中におけるタプシガルギン刺激Ｔ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮγ分泌の阻害に関する２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（試験した全ロット）の平均ＩＣ５０は、それぞれ０．１０９±０．０８１ｎＭ（ｎ＝３４）および０．２４０±０．１６３ｎＭ（ｎ＝３４）であった。シクロスポリンＡは約２０００〜３０００活性が低く、ＩＬ−２およびＩＦＮγ産生をそれぞれ３３４．８±１７２．２ｎＭ（ｎ＝６４）および４９５．２±３０７．８ｎＭのＩＣ５０値で阻害した。ヒト全血中でのＴ細胞応答ブロックにおけるその強力な活性以外にも、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫは、タプシガルギンで刺激したカニクイザル全血からのＴ細胞ＩＬ−１７分泌も強力に阻害し（図３１、実施例８）、７匹の異なるサルから採取した血液を用いた実験では、０．０９ｎＭの平均ＩＣ５０を示した。ラットＴエフェクター記憶細胞系であるＰＡＳのミエリン特異的増殖も２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子により強力に（ＩＣ５０＝０．１７ｎＭ）ブロックされた（図３２、実施例９）。したがって、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫは、３つの異なる種：ヒト、サルおよびラットのＴ細胞応答の阻害において等しく効果的であった。［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ毒素ペプチド類似体単独（配列番号１３）では中程度のＫｖ１．３選択性（Ｋｖ１．１／Ｋｖ１．３ＩＣ_５０比＝１５倍）が示されたのに対し、このペプチドと２０ｋＤａ ＰＥＧ部分とのＮ末端コンジュゲーションではその選択性がさらに増強され、コンジュゲートは、Ｋｖ１．３に対してニューロンＫｖ１．１を約１０００倍上回るの選択性を有していた。さらに、イオンチャネルカウンタースクリーンにより、新規２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫコンジュゲートが、Ｋｖ１．２の６８０倍の選択性、Ｋｖ１．６の約５００倍の選択性、ならびにＫｖ１．４、Ｋｖ１．５およびＫｖ１．７の１００００倍を超える選択性であることが明らかとなった（表４Ａ）。このコンジュゲートが、ヒト心臓活動電位において役割を果たすことが知られているイオンチャネルには影響を与えずに、Ｎａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｋｖ４．３、ＫｖＬＱＴ１／ｍＩｎＫおよびｈＥＲＧの１００００倍を超える選択性を示したことは重要である（表４Ａ、実施例６を参照されたい）。またコンジュゲート毒素ペプチド類似体２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は、カルシウム依存性Ｋ^＋チャネルであるＫＣａ３．１（ＩＫＣａ１）およびＢＫＣａに対する影響を全く示さなかった。

コンジュゲートの薬理をさらに特徴付けるために、その血漿中でのエキソビボ安定性およびインビボ薬物動態を試験した。２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫコンジュゲートは、ラット、カニクイザルおよびヒト血漿中において３７℃で４８時間、安定であった（図１０Ａ〜１０Ｄ）；実施例７を参照されたい）。マウス、ラット、イヌおよびカニクイザルでの薬物動態実験（図１１Ａ〜１１Ｂ、実施例８を参照されたい）は、コンジュゲートがインビボで安定であり、延長された半減期を有することを示していた。図１１Ｃに示されるように、カニクイザルに０．５ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与として投与された２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は、延長された半減期を示し、８時間でのＣｍａｘが２５４ｎＭ（１０３１ｎｇ／ｍｌ）、および７日目の血清レベルが２８．４ｎＭ（１１５ｎｇ／ｍｌ）に達した。この単回投与後の７日目の血清濃度は、ヒト全血における炎症ブロックでのコンジュゲートのＩＣ_９５（１．０ｎＭ）のよりも約２８倍、およびこのアッセイ（実施例２に記載の通りに行った）におけるコンジュゲートのＩＣ_５０（０．０９ｎＭ）よりも約３１５倍高かった。したがって、カニクイザルにおけるＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの薬物動態は、ヒトにおける週１回投与が可能であり、炎症をブロックするためには非常に少ない投与量が必要であろうということを示している。皮下投与した２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の薬物動態に関するさらなる詳細を、以下ならびに下の表４Ｂ、表４Ｃ、表４Ｄおよび表４Ｄ（ａ）に記載する。

多発性硬化症の動物モデルにおける２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）分子の有効性を、実施例９に記載のように養子移植（ＡＴ）−ＥＡＥモデルを用いて判定した。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫは疾患発症を遅延させ、かつ投与量依存的に疾患重症度を低下させた（図７および図８Ａ〜８Ｄ）。この分子は、このモデルにおいて非常に強力であり、７日目のＥＡＥスコアに基づき、４．４μｇ／（ｋｇ・日）のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）が疾患重症度の５０％低下をもたらす有効量（ＥＤ５０）として推定された。

インビボでの２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号１６）の薬理および安全性をさらに評価するために、１２週間の薬理学実験をカニクイザルで行った（実施例１０）。１２週間の実験は、２週間にわたる３つの予備投与ベースライン測定、１ヶ月間の週１回０．５ｍｇ／ｋｇの皮下投与および６週間のフォローアップ解析を含んでいた。この実験のさらなる詳細を、下の実施例１０および表４Ｆに記載する。２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）分子に関する以前の薬物動態実験に基づき、０．５ｍｇ／ｋｇでの週１回投与により、ＣｍＩｎにおけるＩＣ_９５の２８倍からＣｍａｘにおけるＩＣ_９５の２４９倍までの範囲の過剰な標的有効範囲が得られると考えられた。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫコンジュゲート（配列番号１６）は十分に許容性があった。実験を通して個体の体重が増加し（図９Ｄ）、かつ予備投与ベースライン測定に比べて、ＣＢＣおよび血液の化学的性質に変化が見られなかった（表４Ｇ、実施例１０）。実施例８に記載のカニクイザル全血薬力学アッセイを用いて、１ヶ月の全投与期間の間、Ｔ細胞炎症が抑制され、かつ経時的な変化は検出されなかった（図９Ａ〜９Ｂ）。反復投与では、１ヶ月の投与期間にわたり、予測された血清薬物トラフレベルと観察された血清薬物トラフレベルの間に十分な相関関係があった（図９Ｃ）。外来ペプチドまたはタンパク質は時には、免疫原性となって、血清薬物レベルおよび／または薬力学的有効範囲を変化させ得る抗体の排除または中和を引き起こし得る。２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）による反復投与後のカニクイザルにおいてこのような変化は観察されなかったことから、これらのデータは、このＰＥＧコンジュゲートはサルにおいて抗体の中和または排除を引き起こさなかったことを示している。

ペプチドのインビボ半減期が短い理由としては通常、標的仲介性のクリアランス、迅速なタンパク質分解または迅速な腎クリアランスの３つが挙げられる。所与のクラスのペプチドに関しては、短い半減期の理由が明らかでない場合が多い。腎クリアランスを減少させるための確立された方法（例えば、ＰＥＧ化、Ｆｃ融合）があるが、こうした方法は、問題のペプチドがタンパク質分解を受けやすい（迅速に加水分解される）か、または標的仲介性のクリアランスもしくは非特異的（電荷による）結合により迅速に排除される場合、役に立たないであろう。さらに、大きなＰＥＧまたはＦｃ融合体のみが腎クリアランスを減少させるため、所与のクラスのペプチドがコンジュゲーション後に効力を保持するか否かは、実験的に判定する必要がある。効力の著しい低下を示すコンジュゲートは、向上したインビボ半減期により得られるいかなる利益も帳消しにするが、これは動物における標的有効範囲のレベルが、分子のインビボでの効力および安定性の両方に直接依存するためである。新規なクラスのペプチドに関しては、大きなＰＥＧまたはＦｃ部分とのコンジュゲートを形成し、かつ活性を維持することに成功し得るかは明らかではない。異なるクラスのペプチドは異なる一次および三次構造を有し、その生物物理学的安定性はコンジュゲーションにより著しく変化し得るというのがその理由である。著しい安定性（インビトロまたはインビボ）の低下はいずれも分子の活性を減少させ、治療剤としてのその有用性を失わせる。

天然ＳｈＫペプチド（配列番号１）は、インビボ半減期が短い強力なＫｖ１．３／Ｋｖ１．１阻害剤である（Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＩ．９８，１３９４２−１３９４７）。ＳｈＫの乏しいインビボ安定性の主な原因は不明であり、Ｎｏｒｔｏｎら（Ｃｕｒｒｅｎｔ ＭｅｄＩｃＩｎａｌ ＣｈｅｍＩｓｔｒｙ １１，３０４１−３０５２，２００４）は、その原因を特定するためには、その吸収、分布、代謝および排出のより詳細な分析が必要であることを示した。タンパク質分解が主な原因であるか否かを評価するために、Ｂｅｅｔｏｎら（Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９８８−９９７，２００８）は、タンパク質分解を制限して循環血中半減期を向上させるためにＤ−アミノ酸を含むＳｈＫのＤ−ジアステレオ異性体類似体を作製するための広範な試みについて記載した。Ｄ−アロ−ＳｈＫ分子は、Ｋｖ１．３標的のブロックにおいて、天然ＳｈＫよりも約２８００倍活性が低かった。著者らは、ＳｈＫのＤ−アロ類似体がそのインビボ半減期を向上させなかったことを報告しており、このことは、タンパク質分解がＳｈＫの短い半減期を説明しないことを示している。ＳｈＫの治療上の可能性を向上させるために、本発明者らは、ＳｈＫの新規なＰＥＧおよびＦｃコンジュゲートを作製し、それらが延長されたインビボ半減期を有し（実施例８）、かつ重要なことに、高いＫｖ１．３効力を保持していることを示した。本発明者らの分子は、Ｋｖ１．３に対して非常に効力が高く、かつ延長された半減期を有することから、本発明者らのデータは、Ｋｖ１．３標的仲介性のクリアランスがＳｈＫペプチドの短い半減期を説明しないことを示している。さらに、本発明者らのコンジュゲートがタンパク質分解に対して防御する可能性は低いため、本発明者らの知見は、タンパク質分解がＳｈＫの短いインビボ半減期において役割を果たし得ないことを示している。腎クリアランスの減少は、本発明者らのＳｈＫコンジュゲートが延長されたインビボ半減期を有する鍵となる理由であり得るが、このことを明確に断定するためには、コンジュゲートの吸収、分布、代謝および排出を評価するさらなる実験が必要であろう。

治療上の可能性が向上したＫｖ１．３阻害剤を同定するための本発明者らの試みにおいて、本発明者らは、ＳｈＫの体系的なマルチパス類似体化を行ってＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性が向上した類似体を同定し、類似体のＰＥＧまたはＦｃコンジュゲートを形成し、それぞれのインビボでの効力、選択性および安定性を試験した。上記［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ類似体（ＳｈＫのＧｌｎ１６からＬｙｓ１６への単一アミノ酸変化）は非常に強力であり、かつ向上した選択性を示し、これは意外にも、ＰＥＧとのコンジュゲーションによりさらに増強されていた。特に重要なのは、このコンジュゲートが高い効力を保持し、ピコモル範囲のＩＣ５０でＫｖ１．３およびＴ細胞炎症をブロックしたことである。この成功にもかかわらず、Ｋｖ１．３選択性の向上が確認されたＳｈＫ類似体の一部は、２０ｋＤａ ＰＥＧ部分とのコンジュゲーション後に、治療的に有用でなくなる程度の大幅な効力低下を示した。いくつかの例としては、ＳｈＫの１−Ｎａｌ１６（配列番号１１）および１−Ｎａｌ２７（配列番号９５）類似体が挙げられ、これらは、遊離ペプチドとしてはＫｖ１．３ブロックにおいてサブｎＭの効力を示し、向上したＫｖ１．３／Ｋｖ１．１選択性を有していた（表８）が、ＰＥＧコンジュゲートとしては約５７倍低い活性を示した（それぞれ配列番号１５９および配列番号１６０；表１２）。一方、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ毒素ペプチド類似体（配列番号２３５；実施例３を参照されたい）は２０ｋＤａ ＰＥＧ部分とＮ末端でコンジュゲートされていた。Ｎα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａコンジュゲート（配列番号３１６）は、高い効力を保持し、サブｎＭのＩＣ５０でＫｖ１．３およびＴ細胞炎症をブロックし、Ｋｖ１．３に対してニューロンＫｖ１．１の３５００倍を超える選択性を示した（表４Ｈ）。このコンジュゲートはＮ末端２０ｋＤａ−ＰＥＧ部分およびＣ末端アラニンの追加を有し、これまでに同定されたもっと強力かつ選択的なコンジュゲートの代表的な１つである。

ペプチドまたはタンパク質と、異なる大きさ（分子量）および形態のＰＥＧ分子とのコンジュゲーションは、その分子の生物活性、薬物動態、分布および代謝に著しく影響し得る。Ｎα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ以外の別のＰＥＧ型の影響を調べるために、Ｋｖ１．３のペプチド阻害剤であるＫｖ１．３選択的［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）を、３０ｋＤａ ＰＥＧ部分（配列番号１５８）または２つの１０ｋＤａ ＰＥＧ単位からなる分岐ＰＥＧ部分（Ｎα−ｂｒＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ；配列番号３１５）のいずれかとＮ末端でコンジュゲートした。精製ｂｒＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号３１５）は、全血からのＴ細胞サイトカイン分泌の強力なブロッカー（ＩＬ−２のブロックではＩＣ５０＝１９８ｐＭ）であり、リンパ球Ｋｖ１．３に対してニューロンＫｖ１．１の約７５０倍の選択性を示した（表４Ｈ）。Ｎα−３０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号１５８）はまた、タプシガルギン刺激によるヒト全血からのＩＬ−２分泌のブロックにおけるＩＣ５０が２８２ｐＭで、非常に活性であった（表１２）。Ｎα−２０ｋＤａ ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）ペプチドコンジュゲートが、この同じアッセイにおいて約１００ｐＭのＩＣ５０であったことを考えれば、これらのデータは、Ｋｖ１．３選択的［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ毒素ペプチド類似体（配列番号１３）は許容性があり、かつ様々な異なる大きさおよび形状のＰＥＧ部分とのＮ末端コンジュゲーションでも活性を保持することを示している。

哺乳動物種間でのＰＫ特性の比較
マウス、ラット、カニクイザルおよびイヌで行ったＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の前臨床薬物動態は、全般的にヒトにおける週１回の投与レジメンを支持するものであった。皮下投与された２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の薬物動態に関する詳細を、下の表４Ｂ、表４Ｃおよび表４Ｄに記載する。曝露量、半減期およびバイオアベイラビリティのようなパラメーターを考慮すると、前臨床薬物動態は全般的に、げっ歯類において非げっ歯類よりも好ましくなかった。ラット薬物動態は試験した４種の中でもっとも好ましくなく、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の一貫したまたは長期間の曝露を必要とする実験（例えば、薬理学または毒物学）でのこの種の効果的な使用に対する目下の課題を示しているはずである。また、ラットが、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の投与により引き起こされるマスト細胞脱顆粒に対して種特異的な感受性を示すという証拠も相次いでいる（実施例１０を参照されたい）。マスト細胞脱顆粒は、薬物吸着、分布およびクリアランスを含めたラット薬物動態に作用し得る、一連の物理的変化を伴う。（実施例１０）。

静脈内投与されたＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）に関する前臨床薬物動態パラメーターを下の表４Ｄ（ａ）に示す。静脈内（ＩＶ）実験の投与量はすべての種で０．２ｍｇ／ｋｇであったのに対し、皮下投与（ＳＣ）は０．５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのいずれかで行った。全般的に、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の薬物動態特性は、げっ歯類種に比べてイヌおよびカニクイザルにおける方が良好であった。定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）は、マウス、カニクイザルおよびイヌの場合に小さかった。ラットは、他の３種よりも単位重量当たり約３〜４倍大きいそのＶｓｓを考慮すれば、外れ値であった。ＩＶおよびＳＣによるＰＫ実験は共に、ラットにおける曝露は、他の種ではあまり顕著ではなかった、大きな初期分布相によってもたらされたことを示していた。ＩＶ投与後に測定された終末消失相半減期は、ラット、マウス、カニクイザルおよびイヌでそれぞれ、１２．０時間、１６．１時間、２１．０時間および２８．３時間であったが、これは、終末相半減期に関して、げっ歯類と非げっ歯類との間の明確な違いを示している。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は、皮下投与において種間で変化する吸収を示すことが観察された。マウスは他の種よりも皮下吸収が速く、他の種では平均Ｔ_ｍａｘ値が８時間〜４０時間であるのに比べて、Ｔ_ｍａｘが４時間後に得られた。皮下注射後の皮下吸収速度定数（Ｋａ）の相対順位は、マウス（０．２４４ｈ^−１）＞カニクイザル（０．１９７ｈ^−１）＞イヌ（０．１９１ｈ^−１）＞ラット（０．０６５ｈ^−１）であった。

さらに詳細には、ＩＶ投与（０．２ｍｇ／ｋｇ）後に測定されたＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）のクリアランス値は、ラット、マウス、カニクイザルおよびイヌでそれぞれ、４３．９、８．２、５．９４および２．６８ｍＬ／（時・ｋｇ）であった。これらのクリアランス値は、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）に対して、それぞれ１２．０、１６．１、２１．０および２８．３時間の終末消失相半減期となった。クリアランスは、上記種における糸球体ろ過量にほぼ比例し、腎ろ過がＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の主な排出経路であるという予想をさらに指示するものであった。ＩＶ投与（０．２ｍｇ／ｋｇ）後に測定された定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）は、ラット、マウス、カニクイザルおよびイヌでそれぞれ、８７．３、２８９、６８．４および７７．０ｍＬ／ｋｇであった（表４Ｄ（ａ））。ラットは、続く種よりも分布容積が３倍大きく、これに関しては外れ値になっていた。

行った様々な皮下ＰＫ実験におけるバイオアベイラビリティは１５％〜１００％の範囲であった。ラットでは、投与量の増加に伴ってバイオアベイラビリティが増加することが観察された。皮下投与における曝露量は種に依存的であり、げっ歯類と非げっ歯類との間にはいくらかの明確な違いが見られた。この例として、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の０．５ｍｇ／ｋｇ皮下投与後のラットにおける曝露量は、カニクイザルおよびイヌにおいて観察された曝露量の４％未満であった（ＡＵＣ_{０−Ｉｎｆ}はラット、カニクイザルおよびイヌでそれぞれ、３，２２０、１３７，０００および１０３，０００ｎｇ・時／ｍＬ）。曝露量の違いは、非げっ歯類に比べて、ラットではバイオアベイラビリティが低いこと、分布容積が高いことおよび消失が高いことの組合せに起因する。全般的には、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける皮下曝露量は特に、ＰＫを測定した様々な実験全体を通しては、低いかまたは一貫性に欠けるものとして特徴付けることができたが、個々のラットの実験内では通常、それは一貫性があった。

ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける投与量比例性に関して、０．１、０．５、２．０および５．０ｍｇ／ｋｇの皮下投与量を用いて試験した。曝露量は、ラットでの以前の皮下実験から予測されたものの２倍であり、投与量比例よりも大きな速度で増加したが、これは恐らく、投与量増加に伴うバイオアベイラビリティの増加によるものであろう。また、１個体当り０．１、０．３、０．６および２．５ｍｇ／ｋｇの皮下投与量を用いて、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける投与量比例性に関してもＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を試験した。この種においても、投与量に伴う投与量比例よりも大きな増加という同様の傾向が見られ、加えて、続く低容量から予測されたであろうＡＵＣよりもさらに２０〜３５％大きいＡＵＣであった。この実験により、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いた毒物学実験で以前観察された高い曝露量という結果が確認され、さらに、同様の投与量を投与した場合、雌Ｃ５７ＢＬ／６において雄ＣＤ−１マウスの６〜８倍の曝露量増加が見られることも確認された。

安全性薬理試験
安全性薬理学実験では、生命維持に不可欠な重要な器官または系に対する、化学物質または医薬化合物の潜在的な望ましくない薬力学作用を調べる。国際ハーモナイゼーション会議（ＩＣＨ）安全性専門家作業部会は、生命維持機能に関して器官系の序列を作成した。最も重要な機能は心血管系、呼吸器系または中枢神経系の機能である。物質を最初にヒトへ投与する前に、これらの系に対する薬物による作用を調べなければならない。他の器官系（例えば、腎臓または消化器系）は、その機能は有害な薬力学作用により一時的に妨害され得るが、回復不能な損傷は起こらないため、それほど急を要する調査事項ではない（Ｓ．ＷｈＩｔｅｂｒｅａｄら，ＤＤＴ，１０：１４２１−１４３３（２００５）；Ｒ．Ｐｏｒｓｏｌｔら，Ｄｒｕｇ．Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，６４：８３−８９（２００５））。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）をＣｅｒｅｐ安全性薬理試験において１０μＭで試験し、受容体、酵素およびイオンチャネルなどの様々なヒト標的との結合能を評価した。１５１個の標的のうち９個のヒット（＞５０％の阻害；表４Ｄ（ｂ））があり、うち５個はイオンチャネルであった。各ヒットに関してＩＣ５０値を決定し、ニューロペプチドＹ１に関して機能アッセイを行った。Ｋチャネル（予想される標的）に対するＩＣ５０値に比べ、他のヒットに対するＩＣ５０値は>２５倍よりも高かった。さらに、機能アッセイにおいて、ニューロペプチドＹ１に対する影響は見られなかった。これらのデータは、上記オフターゲット結合事象が予想外の中毒を引き起こす可能性が低いことを示している。

単離ウサギ心臓アッセイ
１μＭのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の潜在的な心血管作用を、単離ウサギ心臓アッセイにおいて評価した。この準備では、被検試料を冠循環中に灌流させ、灌流の２０分後に心電図（ＥＣＧ）、力学（左心室の収縮力）および血行動態（冠血流）を評価した。単離心臓モデルにおいて、ＥＣＧ、収縮力または血行動態パラメーターに対するＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の作用は見られず、このことは、心臓のイオンチャネル機能にいかなる作用もなかったことを示している。

実施例６
イオンチャネルカウンタースクリーン
Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．６およびＫｖ１．７、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）、平面パッチクランプ電気生理
上の実施例１に記載の方法および細胞を使用して、イオンチャネル電流をＭＤＣのＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）７０００Ａ電気生理システムを用いて室温で記録した。各チャネルに対する電圧プロトコールを下の表４Ｅに示す。

心臓イオンチャネルカウンタースクリーン（ｈＥＲＧ、ｈＫｖＬＱｔ１／ｈｍＩｎＫ、ｈＮａｖ１．５、ｈＫｖ１．５、ｈＣａｖ１．２、ｈＫｖ４．３）
細胞系
ｈＫｖＬＱＴ１／ｈｍＩｎＫおよびｈＥＲＧで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、Ａｍｇｅｎ社またはＣｙｔｏｍｙｘ社のものであった。ヒトｈＮａｖ１．５で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、Ｃｙｔｏｍｙｘ社から購入した。ｈＫｖ４．３を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞およびｈＫｖ１．５を安定に発現するＣＨＯ細胞は、ＣｈａｎＴｅｓｔ社のものであった。ヒトＬ型カルシウムチャネルＣａｖ１．２を安定に発現するＣＨＯ細胞はＣｈａｎＴｅｓｔ社のものであり、ｈＣａｖ１．２をコードするヒトＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子を含み、ヒトＣＡＣＮＢ２によりコードされるベータ２サブユニットおよびＣＡＣＮＡ２Ｄ１遺伝子によりコードされるアルファ２デルタ１を共発現した。

室温でのＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（モデル７０００Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ，ＵｎＩｏｎ ＣＩｔｙ，ＣＡ）電気生理を含めたＦＡＳＴＰａｔｃｈ（登録商標）実験をＣｈａｎＴｅｓｔ社で行って、クローン化ヒトＬ型カルシウムチャネルＣａｖ１．２、クローン化ｈＫｖ４．３およびクローン化ｈＫｖ１．５に対するペプチドおよびコンジュゲートの影響を調べた。細胞外記録溶液（ＨＢ−ＰＳ）は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよびグルコースを含有し、ＮａＯＨによりｐＨ７．４０に調整された。ｈＫｖ４．３およびｈＫｖ１．５用の細胞内記録溶液は、１３０ｍＭアスパラギン酸カリウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳをを含有し、ＮａＯＨによりｐＨ７．２に調整された。ｈＣａｖ１．２用の細胞内溶液は、１３０ｍＭアスパラギン酸セシウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１ｍＭ ＧＴＰおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有し、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンによりｐＨ７．２に調整された。記録の準備では、細胞内溶液をＳｅａｌｃｈＩｐ_１６平面電極の細胞内コンパートメント内に流し込んだ。細胞懸濁液をピペットで吸い取って、ＳｅａｌｃｈＩｐ_１６平面電極の細胞外コンパートメント内に移した。全細胞の配置を定めた後、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）システムのデュアルチャネルパッチクランプ増幅器を用いて膜電流を記録した。デジタル処理の前に、電流にサンプリング周波数の５分の１で低域フィルタリングを行った。１％ＢＳＡを含むＨＢ−ＰＳ中に希釈した３つの濃度のペプチドコンジュゲート（被検試料）を、未処置細胞に５分間隔で加える。溶液交換を４回１組で行い、各被検試料濃度に対する曝露持続時間は５分であった。媒体対照も未処置細胞に加え、溶液交換後に陽性対照を加えて、イオンチャネルブロックに対する感受性を確認した。すべての陽性対照は０．３％ＤＭＳＯを含むＨＢ−ＰＳ中に希釈した。チャネルブロックの陽性対照には、約７５％のｈＣａｖ１．２電流ブロックを生じるニフェジピン（０．０１μＭ）、約７５％のｈＫｖ４．３電流阻害を生じるフレカイニド（０．１ｍＭ）およびｈＫｖ１．５電流を約８０％ブロックする４−アミノピリジン（２ｍＭ）が含まれていた。有効な全細胞記録は、以下の基準を満たさなければならない：（１）膜抵抗（Ｒｍ）≧２００ＭΩ、（２）リーク電流≦２５％チャネル電流。ｈＣａｖ１．２、ｈＫｖ４．３およびｈＫｖ１．５の試験手順は以下の通りであった：
ａ．）ｈＣａｖ１．２試験手順
−４０ｍＶの保持電位から１０秒間隔での脱分極試験パルス（持続時間、２００ミリ秒；振幅、１０ｍＶ）からなる刺激電圧パターンを用いて、ｈＣａｖ１．２／β２／α２δチャネルの開始および定常状態ブロックを測定した。被検試料濃度は、適用間のウォッシュアウトなしで低い順に累積的に適用し得る。１０ｍＶまでの段階の間にピーク電流を測定した。ｈＣａｖ１．２電流をブロックする各実験の最後に飽和濃度のニフェジピン（１０μＭ）を加える。総膜電流記録からリーク電流をデジタル減算した。
ｂ．）ｈＫｖ４．３試験手順
−８０ｍＶの保持電位から１０秒間隔で反復される一定振幅のパルスパターン（脱分極：０ｍＶで３００ミリ秒間）を用いて、ｈＫｖ４．３電流の開始および定常状態ブロックを測定した。ピークおよび持続試験パルス電流の振幅を０ｍＶまでの段階の間に測定した。
ｃ．）ｈＫｖ１．５試験手順
−８０ｍＶの保持電位から１０秒間隔で反復される一定振幅のパルスパターン（脱分極：＋２０の振幅、３００ミリ秒の持続時間）を用いて、ｈＫｖ１．５電流の開始および定常状態ブロックを測定した。＋２０ｍＶまでの段階の終わりに電流振幅を測定した。

ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）システムを用いたクローン化Ｎａｖ１．５ナトリウムチャネルに対するカウンタースクリーン
細胞外（ＨＢ−ＰＳ２）記録溶液は、７０ｍＭ ＮａＣｌ、６７ｍＭ Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコースを含有し、ＨＣｌによりｐＨ７．４に調整された。内部記録溶液は、１３０ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有し、ＣｓＯＨによりｐＨ７．２０に調整された。参照標準物質または被検試料のストック溶液を、適用前にＨＢ−ＰＳ２中に希釈した。被検試料には、本発明に記載のペプチドまたはペプチドコンジュゲートのいずれかが含まれていた。リドカイン（１〜３０μＭ）が参照標準物質であった。標準化した段階プロトコールを用いて、ｈＮａｖ１．５ナトリウムチャネルを介したイオン電流を誘発する。細胞を−８０ｍＶに保持する。１０秒間隔で反復される一定振幅のパルスパターン（調整プレパルス：−１２０ｍＶで５０ミリ秒間；−３０ｍＶまでの脱分極試験段階を２０ミリ秒間）を用いて、被検試料によるｈＮａｖ１．５ナトリウム電流の開始および定常状態ブロックを測定した。間欠モードで、電流を３ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚで得た。良好な記録が確立されたとき、細胞を２分間洗浄し、次いで対照媒体を５分間適用した。次いで、対照および各濃度の被検試料を５分間適用した。各濃度を１分間隔で３回加えた。投薬速度は、吸引作動状態で４０μＬ／秒であった。ＩＣ_５０を決定するために、１μＭ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭの被検試料を、細胞（ｎ＝３細胞）に累積的に（被検試料濃度間のウォッシュアウトなしで）低い順に、各細胞（ｎ＝３、ｎは細胞数）に適用した。各濃度の被検試料は５分間適用した。各濃度は１分間隔で３回加えた。電気生理データの取得はＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ Ｃｏｍｍａｎｄｅｒｖ１．４（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵｎＩｏｎ ＣＩｔｙ，ＣＡ）を用いて行い、解析はＤａｔａＸｐｒｅｓｓｖ１．４（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵｎＩｏｎ ＣＩｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。被検試料適用の前後の５つのピーク電流を用いて、各濃度における電流阻害のパーセントを計算した。良好な記録の採用基準は以下のものを含む：（１）シール抵抗＞２００ＭΩ、（２）アクセス抵抗＜１０ＭΩ、（３）ピークテール電流＞２００ｐＡ、（４）リーク電流＜ピークテール電流の２５％、（５）ランダウン＜対照媒体中、２．５％／分。

ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）システムを用いたヒトＩＫｓ（ｈＫｖＬＱＴ１＋ｈｍＩｎＫ）カリウムチャネルに対するカウンタースクリーン
細胞外記録溶液はＨＢ−ＰＳであった。内部記録溶液は、２０ｍＭ ＫＦ、９０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ Ｋ_２ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨによりｐＨ７．２０に調整された。参照標準物質または被検試料のストック溶液を、適用前にＨＢ−ＰＳ中に希釈した。被検試料には、本発明に記載のペプチドまたはペプチドコンジュゲートのいずれかが含まれていた。クロマノール２９３Ｂ（０．３〜１０μＭ）が参照標準物質であった。標準化した段階プロトコールを用いて、ＩＫｓカリウムチャネルを介したイオン電流を誘発した。細胞を−８０ｍＶに保持した。１０秒間隔で反復される一定振幅のパルスパターン（+５０ｍＶまでの脱分極試験段階を５秒間）を用いて、被検試料によるＩＫｓカリウム電流の開始および定常状態ブロックを測定した。間欠モードで、電流を３ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚで得た。良好な記録が確立されたとき、細胞を２分間洗浄し、次いで対照媒体を５分間適用した。次いで、対照および各濃度の被検試料を５分間適用した。次いで、対照および各濃度の被検試料を５分間適用した。各濃度を１分間隔で３回加えた。投薬速度は、吸引作動状態で４０μＬ／秒であった。１μＭ、３μＭ、１０μＭおよび３０μＭの被検試料を、細胞（ｎ＝３細胞）に累積的に（被検試料濃度間のウォッシュアウトなしで）低い順に、各細胞（ｎ＝３、ｎは細胞数）に適用した。各濃度の被検試料は５分間適用した。各濃度は１分間隔で３回加えた。電気生理データの取得はＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ Ｃｏｍｍａｎｄｅｒｖ１．４（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵｎＩｏｎ ＣＩｔｙ，ＣＡ）を用いて行い、解析はＤａｔａＸｐｒｅｓｓｖ１．４（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵｎＩｏｎ ＣＩｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。被検試料適用の前後の５つのピーク電流を用いて、各濃度における電流阻害のパーセントを計算した。良好な記録の採用基準は以下のものを含む：（１）シール抵抗＞２００ＭΩ、（２）アクセス抵抗＜１０ＭΩ、（３）ピークテール電流＞２００ｐＡ、（４）リーク電流＜ピークテール電流の２５％、（５）ランダウン＜対照媒体中、２．５％／分。

従来の全細胞パッチクランプ電気生理によるヒトＩＫｒ（ｈＥＲＧまたはｈＫｖ１１．１）カリウムチャネルに対するカウンタースクリーン
１〜２滴の細胞懸濁液を３５ｍｍポリ−ｄ−リジンコートカバーガラスに加え、電気生理実験前に一晩インキュベーションした。厳密なＧΩシール設定のパッチクランプ技術を用いて、単一細胞から全細胞電流を記録した。３５ｍｍカバーガラスを洗浄後に記録ステージに移し、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５ｍＭグルコースを含有する細胞外記録緩衝液（ＮａＯＨによりｐＨを７．４０に調整し、モル浸透圧濃度を３００ｍＯｓｍに設定した）で培養液を置き換えた。ガラス毛管を直接、記録細胞の上部に置く電動ロッドに取り付けられ、並行に配置されたガラス毛管の１つを介して、細胞を細胞外記録緩衝液で継続的に灌流した。ｈＥＲＧプロファイリング用に、記録ピペット溶液は、１３０ｍＭ ＫＦ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨによりｐＨ７．４０に調整され、モル浸透圧濃度は２８０ｍＯｓｍに設定された。実験は室温で行い、ＭｕｌｔＩｃｌａｍｐ７００Ａ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて記録した。ピペット抵抗は通常、２〜３ＭΩであった。細胞を−８０ｍＶの電位に保持した。ピーク外側テールの電流のベースラインまたは参照ポイントを得るために、５００ミリ秒間の−５０ｍＶまでの段階を用いた。この後に、２秒間の＋２０ｍＶまでの脱分極段階を行い、チャネルを不活性状態にした。−５０ｍＶに戻す２秒間の段階により不活性化を解除し、ピークｈＥＲＧ電流の測定を可能にした。パルスは１０秒ごとに１回繰り返した。総ｈＥＲＧ電流を、脱分極の−５０ｍＶ段階と−５０ｍＶでのベースライン電流との間の差として測定した。本明細書に記載のペプチドまたはペプチドコンジュゲートを含む被検試料（１０μＭ以下）を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する細胞外記録緩衝液中に混合し、次いで、ガラス灌流リザーバーに移した。リザーバーから記録細胞への被検試料の流れは、電子ピンチバルブにより制御した。ＸＬｆＩｔソフトウェアの４つのパラメーターロジスティックフィットを用いて、ＩＣ５０値および曲線フィットを推定した。ｈＥＲＧチャネル阻害剤であるシサプリドを用いて、アッセイの有効性を確認した。

カルシウム依存性カリウムチャネルであるヒトＩＫＣａ１およびＢＫＣａに対する、従来の全細胞パッチクランプ電気生理によるカウンタースクリーン
ＣＨＯ ＩＫＣａおよびＢＫＣａ細胞系をＢＩｏＦｏｃｕｓ ＤＰＩ（Ｇａｌａｐａｇｏｓ社の１つ）から入手した。１〜２滴のｈＩＫＣａ１またはＢＫＣａ細胞懸濁液を３５ｍｍポリ−ｄ−リジンコートカバーガラスに加え、電気生理実験前に一晩インキュベーションした。厳密なＧΩシール設定のパッチクランプ技術を用いて、単一細胞から全細胞電流を記録した。３５ｍｍカバーガラスを洗浄後に記録ステージに移し、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５ｍＭグルコースを含有する細胞外記録緩衝液（ＮａＯＨによりｐＨを７．４０に調整し、モル浸透圧濃度を３００ｍＯｓｍに設定した）で培養液を置き換えた。ガラス毛管を直接、記録細胞の上部に置く電動ロッドに取り付けられ、並行に配置されたガラス毛管の１つを介して、細胞を細胞外記録緩衝液で継続的に灌流した。記録ピペット溶液は、１３０ｍＭ アスパラギン酸カリウム、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．２６ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有し、ＫＯＨによりｐＨ７．４０に調整され、モル浸透圧濃度は２８０ｍＯｓｍに設定された。実験は室温で行い、ＭｕｌｔＩｃｌａｍｐ７００Ａ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて記録した。細胞を−８０ｍＶの電位に保持した。カルシウムイオンが記録ピペット溶液から細胞内に拡散するにつれて、ＢＫおよびＩＫ電流は共に活性化された。カルシウム拡散によるカルシウム依存性の外向きカリウム電流の活性化は一般に、完全活性化に３〜５分かかる。薬物曝露の前および間に、＋５０ｍＶの保持電位で外向き電流を継続的にモニターした。あるいは、−１２０〜＋６０ｍＶまでの４００ミリ秒の電圧勾配を１０秒ごとに１回繰り返し、薬物曝露の前および間の両チャネルの電流電圧関係を特徴付けた。本明細書に記載のペプチドまたはペプチドコンジュゲートを含む被検試料（１０μＭ以下）を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する細胞外記録緩衝液中に混合し、次いで、ガラス灌流リザーバーに移した。リザーバーから記録細胞への被検試料の流れは、電子ピンチバルブにより制御した。ピペット抵抗は通常、２〜３ＭΩであった。ＸＬｆＩｔソフトウェアの４つのパラメーターロジスティックフィットを用いて、ＩＣ５０値および曲線フィットを推定した。アッセイの薬理学的有効性の確認のために、ＩＫＣａおよびＢＫのペプチド阻害剤であるカリブドトキシン（１００ｎＭ）をアッセイ手順の終わりに適用した。

実施例７
血漿安定性実験
１００％血漿中にペプチドコンジュゲートを２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるまで加え、３７℃で様々な時間の間インキュベートすることにより、ラット、カニクイザルおよびヒト血漿中での２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の安定性を試験した。各インキュベーション期間の終わりに、試料を解析まで凍結させた。対照として、コンジュゲートストック溶液のアリコートを血漿中に希釈して直ちに凍結させ、ゼロ時間の未処置対照を作成した。安定性の解析には、ＳｈＫの免疫反応性の保持を確認するための薬物レベルのＥＬＩＳＡ解析（実施例８、「プロトコール１」を参照されたい）およびＴ細胞応答ブロックにおけるその生物活性の保持を確認するための全血効力アッセイが含まれていた。生物活性を評価するために、タプシガルギン刺激後のＴ細胞のＩＬ−２およびＩＦＮ−ｇ産生を測定する実施例２に記載のヒト全血バイオアッセイにおいて、各安定性試料の連続希釈物を試験した。簡潔には、タプシガルギンを添加してサイトカイン分泌を誘導する前に、安定性試料または標準物質を全血と共に３０〜６０分間プレインキュベートした。４８時間後に上清を取り出し、サイトカイン分泌レベルを測定した。このアッセイでは、Ｋｖ１．３阻害剤はサイトカイン分泌を阻害するため、サイトカイン抑制レベルは、ペプチドコンジュゲートの生物活性の直接的な尺度である。阻害剤の非存在下での完全なＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を明確に定めるための対照として、各プレートは、タプシガルギン単独処置または未処置の全血試料を含んでいた。タプシガルギン誘導性のサイトカイン応答を３０％〜７０％阻害する血漿安定性実験試料の希釈物を、安定性解析で使用した。図１０Ａ〜１０Ｄは、ラット、カニクイザルおよびヒト血漿中、３７℃で４８時間までの間インキュベートした場合、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は安定であり、生物活性および免疫反応性を保持することを示している。図１０Ａは、下の実施例８に記載のＥＬＩＳＡ解析により定量化した免疫学的エピトープの保持により示されるように、配列番号１６の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）構造部分が血漿中で経時的に安定であることを示している。回収％は、予想されたまたは最初の濃度２００ｎｇ／ｍｌと比較した、ＥＬＩＳＡ測定による血漿安定性試料中のＥ２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）レベルのことである。例として、１６０ｎｇ／ｍｌであると測定された血漿安定性試料であれば、回収％は８０と報告される。図１０Ｂ〜１０Ｄは、タプシガルギン全血アッセイに添加して、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）分子の生物活性の尺度としてサイトカイン阻害の程度を測定した、血漿安定性試料の様々な希釈物の生物活性を示す。これらの試料の最終希釈係数が図１０Ｂおよび図１０Ｄの右に記載されている。ＩＬ−２サイトカイン応答（比較的少ない単位、ＲＬＵで測定）のおよそ半分が０．９３〜２．７８％の血漿安定性試料により抑制され、かつ３７℃での経時的な応答レベル（ＲＬＵ単位）において著しい変化は見られなかったが、このことは、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）分子が生物活性を保持し、かつ血漿中で安定であったことを示している。

実施例８
薬物動態および薬力学実験
ＳｈＫに対する抗体
ＳｈＫに対するウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗体を、Ｆｃ−ＳｈＫぺプチボディコンジュゲートで動物を免疫化することにより作製した。抗ＳｈＫ特異的ポリクローナル抗体を抗血清からアフィニティー精製して、コンジュゲートのＳｈＫ部分に対して特異的な抗体のみを単離した。融合およびスクリーニングの後、ＳｈＫに対して特異的なハイブリドーマを選択し単離した。クローンの馴化培地からマウス抗ＳｈＫ特異的モノクローナル抗体を精製した。ＥＬＩＳＡ解析では、精製抗ＳｈＫポリクローナルおよびモノクローナル抗体はＳｈＫペプチドに対してのみ反応し、Ｆｃとは交差反応しなかった。

マウス、ラット、ビーグルおよびサルにおける２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ（配列番号８）および２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）ペプチドコンジュゲーに関する薬物動態（ＰＫ）実験
動物に単回皮下投与を行い、注射後の様々な時点で血清を採取した。ラット、イヌ（ビーグル）およびカニクイザルにおける実験では、１投与群当たり２〜３個体が含まれ、実験の間の様々な時点で血液および血清を採取した。雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（約０．３ｋｇ）、雄ビーグル（約１０ｋｇ）および雄カニクイザル（約４ｋｇ）を本明細書に記載の実験で使用した（１投与群当たりｎ＝３個体）。本発明者らのマウス薬物動態実験における１つの投与および時点当たり、約５匹の雄ＣＤ−１マウスを使用した。血清試料を、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）での解析まで−８０℃で凍結保存した。

ＰＥＧ−ＳｈＫおよびＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの血清レベル検出のためのＥＬＩＳＡプロトコールを以下に簡潔に記載する：
（１）以下（ａ）〜（ｇ）のプロトコール１では、ＰＥＧ−ＳｈＫおよびＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ、ならびに単独のＳｈＫおよび［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドを検出する：
（ａ）ストレプトアビジンマイクロタイタープレートを、４℃でＩブロック緩衝液［１リットル当たり：１０００ｍＬのＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２を含まない１×ＰＢＳ、５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃＩｅｎｔＩｆＩｃ）、２ｇのＩブロック試薬（ＴｒｏｐＩｘ）］中、２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化抗ＳｈＫマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ２．１０，Ａｍｇｅｎ）でコーティングし、振盪せずに一晩インキュベートした。
（ｂ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液（ＫＩｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｅｓ）で３回洗浄した。
（ｃ）標準物質（ＳＴＤ）、品質保持剤（ＱＣ）および試料希釈物を１００％プール血清で調製し、次いでＩブロック緩衝液中で１／５に希釈した（前処理）。前処理したＳＴＤ、ＱＣおよび試料を、洗浄したプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。（ＳＴＤ、ＱＣの連続希釈物を１００％プール血清で調製した。希釈を必要とする試料も１００％プール血清で調製した。基質効果を最小限にするために、前処理をＳＴＤ、ＱＣおよび試料のいずれに対しても行った。）
（ｄ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（ｅ）Ｉブロック緩衝液中２５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＰ標識ウサギ抗ＳｈＫポリクローナルＡｂを添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
（ｆ）プレートを再びＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、Ｆｅｍｔｏ［Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃＩｅｎｔＩｆＩｃ］基質を添加した。
（ｇ）プレートをＬｍａｘＩＩ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ）ルミノメーターで読み取った。

雄ＳＤラットにおいて、ＳｈＫおよび［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＦｃ−、Ｉｇ−またはＡｂコンジュゲートに関する薬物動態（ＰＫ）実験を行った。動物に単回皮下投与を行い、注射後の様々な時点で血清を採取した。１投与群当たり３個体を使用し、実験の間の様々な時点で血液および血清を採取した。血清試料は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）での解析まで−８０℃で凍結保存した。ＳｈＫおよび［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＦｃ−、Ｉｇ−またはＡｂコンジュゲートの血清レベルを検出するためのＥＬＩＳＡプロトコールを以下に簡単に説明する。下のプロトコール２では、分子のヒトＩｇ、ＦｃまたはＡｂ部分およびＳｈＫペプチド部分の両方を検出する。下のプロトコール３は、ヒトＦｃ領域のみを検出する初期アッセイであり、げっ歯類薬物動態実験におけるＦｃ−ＳｈＫぺプチボディ血清レベルの初期評価に使用した。これらのＥＬＩＳＡプロトコールの簡単な説明を記載する：
（２）以下（ａ）〜（ｇ）のプロトコール２では、分子のヒトＩｇ、ＦｃまたはＡｂ部分およびＳｈＫペプチド部分の両方を検出する：
（ａ）ストレプトアビジンマイクロタイタープレートを、４℃でＩブロック緩衝液［１リットル当たり：１０００ｍＬのＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２を含まない１×ＰＢＳ、５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃＩｅｎｔＩｆＩｃ）、２ｇのＩブロック試薬（ＴｒｏｐＩｘ）］中、２５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化抗ＳｈＫマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ２．１０，Ａｍｇｅｎ）でコーティングし、振盪せずに一晩インキュベートした；
（ｂ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液（ＫＩｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｅｓ）で３回洗浄した；
（ｃ）標準物質（ＳＴＤ）、品質保持剤（ＱＣ）および試料希釈物を１００％プール血清で調製し、次いでＩブロック緩衝液中で１／５に希釈した（前処理）。前処理したＳＴＤ、ＱＣおよび試料を、洗浄したプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。（ＳＴＤ、ＱＣの連続希釈物を１００％プール血清で調製した。希釈を必要とする試料も１００％プール血清で調製した。基質効果を最小限にするために、前処理をＳＴＤ、ＱＣおよび試料のいずれに対しても行った。）；
（ｄ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した；
（ｅ）Ｉブロック緩衝液中１５０ｎｇ／ｍｌのＨＲＰ標識Ａｂ３５（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ）を添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした；
（ｆ）プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、Ｆｅｍｔｏ［Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃＩｅｎｔＩｆＩｃ］基質を添加した；
（ｇ）プレートをＬｍａｘＩＩ３８４［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ］ルミノメーターで読み取った。
（３）以下の（ａ）〜（ｈ）のプロトコール３は、ヒトＦｃ領域のみを検出する初期アッセイであり、げっ歯類薬物動態実験におけるＦｃ−ＳｈＫぺプチボディ血清レベルの初期評価に使用した：
（ａ）Ｃｏｓｔａｒ３５９０ ９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートを、１×コーティング緩衝液（１０×コーティング緩衝液：Ｈ_２Ｏ１００ｍｌ中、１．５９ｇのＮａ_２ＣＯ_３、２．９３ｇのＮａＨＣＯ_３）中に希釈した２μｇ／ｍＬヤギ抗ＨｕＦｃ、Ｆ（ａｂ’）_２（ＳＩｇｍａ Ｉ−３３９１）０．１ｍＬ／ウェルでコーティングした。プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした；
（ｂ）プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、各ウェルにｂｌｏｔｔｏ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％脱脂粉乳）を０．３ｍｌ添加することによりブロックして、振盪しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした；
（ｃ）プレートをＫＰ Ｗａｓｈ ＳｏｌｕｔＩｏｎ（カタログ番号５０−６３−００，ＫＰＬ，ＧａＩｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で洗浄した；
（ｄ）必要であれば、希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で希釈した血清試料および対照／標準物質にラット血清を加えて、最終１０％ラット血清にし、１ウェル当たり０．１ｍｌの試料を添加した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした；
（ｅ）プレートをＫＰ Ｗａｓｈ ＳｏｌｕｔＩｏｎ（カタログ番号５０−６３−００，ＫＰＬ，ＧａＩｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で洗浄した；
（ｆ）ＨＲＰ標識二次抗体（（ＰＩｅｒｃｅ ＃３１４１６−ＨＲＰヤギα−Ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃ）をＰＢＳＴ中、１：５０００に希釈し、次いで１００μｌ／ウェルを添加し、振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした；
（ｇ）プレートをＫＰ Ｗａｓｈ ＳｏｌｕｔＩｏｎ（カタログ番号５０−６３−００，ＫＰＬ，ＧａＩｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で洗浄し、１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ基質（ＡＢＴＳ ＭＩｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，カタログ番号５０−６６−０１８，ＫＰＬ）を添加した；
（ｈ）基質添加および振盪後の適当な時間に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ］プレートリーダーでプレートを読み取った。

本発明者らの新規毒素コンジュゲートのラット薬物動態と、公開されている小型のＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）ペプチドの薬物動態プロファイルとの比較
ラットにおけるＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）の０．２ｍｇ／ｋｇ単回皮下投与の薬物動態が、Ｂｅｅｔｏｎら（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７，１３６９−１３８１，２００５）により報告された。ＳｈＫ−Ｌ５は、約５０分と推定される循環血中半減期を有することが報告された。Ｂｅｅｔｏｎら（同上）は、０．２ｍｇ／ｋｇ単回皮下注射後の血清ＳｈＫ−Ｌ５濃度（ｎＭ）対時間を示す２つ図を掲載している。これらの図のデータに基づき、ＳｈＫ−Ｌ５の０．２ｍｇ／ｋｇ単回投与が、皮下注射後の分での分単位時間当たりに以下のｎｇ／ｍｌ血清濃度：１０（５）、２３（１０）、２８（２０）、５０（３０）、３４（６０）、１９（１２０）、１０（１８０）、２（４２０）をもたらすことが推定され、ここでは、丸括弧内の数値は分単位時間であり、ＳｈＫ−Ｌ５分子量（ＭＷ）は約４０５０Ｄａに設定された。図４は、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ（配列番号８）分子がラットにおいて延長された半減期を有し、ＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）分子よりもはるかに高い露出をもたらすことを示している。ｍｇ／ｍＬストック濃度の計算には２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ（配列番号８）のペプチド部分のみを使用し、かつこのＳｈＫペプチド部分（４０５５Ｄａ）はＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）と同様のＭＷであるため、これら２つの分子の等しいｍｇ／ｋｇ投与量で、ほぼ等しいｍｏｌ／ｋｇ投与量が得られた。ＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）および２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ（配列番号８）分子のこの解析から計算された薬物動態値を表４Ｂに記載する。ラットにおけるＰＥＧ−ＳｈＫ（配列番号８）クリアランス（ＣＬ／Ｆ）は、ＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）よりも約４０倍遅く、ＰＥＧ−ＳｈＫの平均滞留時間（ＭＲＴ）は１３〜１８倍長い。実施例１２および表４Ｉ〜４Ｋでは、これらが延長されたインビボ半減期および向上した治療上の可能性を有することを示す、典型的なＦｃ、ＩｇおよびＡｂ−ＳｈＫ毒素ペプチド類似体コンジュゲートの実施形態に関するラット薬物動態実験の結果が記載されている。抗ＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ Ａｂ分子は、二価および一価（それぞれ、図１２Ｇおよび図１２Ｆに模式的に示されている）の両形態で、ＳｈＫ−Ｌ５に関してＢｅｅｔｏｎら（２００５，同上）により報告されたものの約３２〜６０倍の長さの延長されたインビボ半減期を示す。（実施例１２、図２１を参照されたい）。抗ＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ Ａｂ分子はＭＷが約１５０ｋＤａであるため、ｎｍｏｌ／ｋｇベースでのこれらの分子の６ｍｇ／ｋｇ投与は、より小型（４ｋＤａ）のＳｈＫ（配列番号１）またはＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）ペプチドの０．１６ｍｇ／ｋｇに相当するであろう。したがって、ＳｈＫ−Ｌ５に関する０．２ｍｇ／ｋｇのＰＫ実験では、より大型の抗ＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ Ａｂ分子の６ｍｇ／ｋｇ投与量で得られるものと非常に近い（２５％以内）ｎｍｏｌ／ｋｇ投与量が得られる。本発明者らの一価の抗ＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子は、ラットにおいて非常に遅いクリアランス（ＣＬ／Ｆ＝１０．９ｍＬ・ｈｒ^−１・ｋｇ^−１）示し、これはＳｈＫ−Ｌ５（ＣＬ／Ｆ＝２０５２ｍＬ・^−１・ｋｇ^−１）よりも約１８８倍遅い速度であった。一価のＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子はラットにおいて、小型のＳｈＫ−Ｌ５ペプチド（ＡＵＣ０−Ｉｎｆ＝９７ｎｇ・ｈｒ・ｍＬ^−１）に比べて約６１００倍高い薬物曝露量（ＡＵＣ０−Ｉｎｆ＝５９４０００ｎｇ・ｈｒ・ｍＬ^−１）をもたらした（表４Ｂおよび表４Ｊを参照されたい）。これら２つの分子間のＭＷの差（１５０ｋＤａ／４ｋＤａ）を正規化すれば、一価のＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子は、小型のＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７）分子よりも約１６３倍高い曝露量（ＡＵＣ０−Ｉｎｆベース）をもたらしたことになる。実施例１１および実施例１２に詳細に記載されている一価のａＫＬＨ−ＡｂＬｏｏｐ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ Ａｂ分子は、本発明者らが調べたすべての新規毒素コンジュゲートの中で、ラットにおける最も遅いクリアランスを示した（図２２および表４Ｌ）。この分子のクリアランス（ＣＬ／Ｆ＝３．１１ｍＬ・ｈｒ^−１・ｋｇ^−１）は、ＳｈＫ−Ｌ５よりも約６６０倍遅かった。

２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのインビボでの効力およびその薬力学的有効範囲のレベルを測定するためのカニクイザルエキソビボ全血アッセイ
カニクイザルＴ細胞応答での効力および有効範囲のレベルを、エキソビボ全血アッセイによりタプシガルギン誘導性のＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１７を測定して判定した。ペプチドおよびペプチドコンジュゲートの効力を判定するために、カニクイザル全血を、健康な、未投薬の雄ザルからヘパリンバキュテナー中に採取した。ＤＭＥＭ完全培地は、０．１％ヒトアルブミン（ＧｅｍＩｎＩ ＢＩｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，＃８００−１２０）、５５μＭ ２−メルカプトエタノール（ＧＩｂｃｏ）および１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎ（ＰＳＧ，ＧＩｂｃｏ，カタログ番号１０３７８−０１６）を含有するＩｓｃｏｖｅ ＤＭＥＭ（Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液を含む）であった。タプシガルギンはＡｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。カルシウム動員のための４×タプシガルギン刺激を与えるために、タプシガルギンの１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液をＤＭＥＭ完全培地で希釈して４０μＭ、４×溶液とした。Ｋｖ１．３阻害ペプチドＳｈＫ（（スティコダシトラ・ヘリアンサス（ＳｔＩｃｈｏｄａｃｙｔｌａ ｈｅｌＩａｎｔｈｕｓ）毒素，カタログ番号Ｈ２３５８）およびＢＫＣａ１阻害ペプチドＩｂＴｘ（イベリオトキシン，カタログ番号Ｈ９９４０）をＢａｃｈｅｍ ＢＩｏｓｃＩｅｎｃｅｓ社から購入し、一方、Ｋｖ１．１阻害ペプチドＤＴＸ−ｋ（デンドロトキシン−Ｋ）はＡｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ社（Ｉｓｒａｅｌ）のものであった。カルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、様々な業者から購入可能である。ＢＫＣａ阻害剤ＩｂＴｘおよびＫｖ１．１阻害剤ＤＴＸ−ｋがサイトカイン応答を阻害しないのに対し、Ｋｖ１．３阻害剤ＳｈＫおよびカルシニューリン阻害剤ＣｓＡはサイトカイン応答を阻害し、標準物質または陽性対照として日常的に使用される。標準物質、ＳｈＫ類似体またはＳｈＫコンジュゲートの３倍連続希釈物１０個を、４×最終濃度のＤＭＥＭ完全培地中で調製し、それぞれ５０μｌを、９６ウェルＦａｌｃｏｎ３０７５平底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。マイクロタイタープレートの列１〜５および７〜１１は阻害剤を含み（各行は別々の阻害剤希釈系列を含む）、列６の８ウェルにはＤＭＥＭ完全培地のみを５０μｌ添加し、列１２の８ウェルにはＤＭＥＭ完全培地のみを１００μｌ添加した。実験を開始するために、全血１００μｌをマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。１時間後、プレートを取り出し、５０μＬ／ウェルの４×タプシガルギン刺激（４０μＭ）を、プレートの列１２の８ウェル以外のすべてのウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２に戻して４８時間置いた。全血中に分泌されたＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１７量を測定するために、９６ウェルプレートの各ウェルから上清（馴化培地）１００μＬを保存プレートに移した。サイトカイン産生のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤＩｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光分析では、ＭＳＤ ＭｕｌｔＩ−Ｓｐｏｔ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｏａｔｅｄプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤＩｓｃｏｖｅｒｙ，ＧａＩｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて上清（馴化培地）を試験した。上記プレート上の作動電極を予め７種の捕捉抗体（ｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦａ、ｈＩＦＮｇおよびｈＩＬ−１７）でコーティングした。ＭＳＤヒト血清サイトカインアッセイ希釈液でプレートをブロックした後、０．０５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、２５μＬ／ウェルの馴化培地をＭＳＤプレートのウェルに添加した。プレートにカバーを被せ、振盪プラットフォーム上に１時間置いた。次に、ＭＳＤ抗体希釈液中の検出抗体カクテル２５μＬを各ウェルに添加した。このカクテルは７種の検出抗体（ｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦａ、ｈＩＦＮｇおよびｈＩＬ−１７）を、それぞれ１μｇ／ｍＬで含有していた。プレートにカバーを被せ、振盪プラットフォーム上に一晩（暗所で）置いた。翌朝、プレートをＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。１５０μｌの２×ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔをプレートのウェルに添加した後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒで読み取った。各プレートの列６の８ウェルはタプシガルギン刺激のみが加えられ、阻害剤は添加されなかったため、平均ＭＳＤ応答を用いてプレートの「高」値を計算した。プレートの「低」値の計算値は、タプシガルギン刺激および阻害剤を含まない列１２の８ウェルの平均ＭＳＤ応答から導き出した。対照パーセント（ＰＯＣ）は、未刺激対刺激対照の相対的な応答の尺度であり、ここでは、１００ＰＯＣはタプシガルギン刺激のみの平均応答または「高」値に等しい。したがって、１００ＰＯＣは０％の応答阻害を表す。これに対し、０ＰＯＣは１００％の応答阻害を表し、刺激を与えない応答または「低」値と等しくなる。対照パーセント（ＰＯＣ）を計算するために以下の式を使用する：［（ウェルのＭＳＤ応答）−（「低」）］／［（「高」）−（「低」）］×１００。阻害曲線（ＩＣ）から曲線フィットを得た後、全血中での分子の効力を計算し、標準的な曲線フィッティングソフトウェアを用いてＩＣ５０を導き出した。ここでは本発明者らは、ハイスループットなＭＳＤ電気化学発光を用いたサイトカイン産生測定を記載するが、より低スループットなＥＬＩＳＡアッセイをサイトカイン産生測定に同様に適用できることを、当業者は容易に想定することができる。

個体投与後のインビボでのＴ細胞Ｋｖ１．３の有効範囲レベル測定のためのエキソビボカニクイザル薬力学（ＰＤ）アッセイ
Ｋｖ１．３阻害剤である２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）投与前後でのサルにおける標的有効範囲のレベルを判定するために、全血を採取し、タプシガルギン刺激後のＴ細胞サイトカイン分泌レベルを試験した。実施例１０では、１ヶ月間の２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）週１回投与を含む、カニクイザルでの１２週間の実験において有効範囲レベルのこのアッセイを用いた結果を記載する。タプシガルギン添加前の個体における抑制レベルを測定するために、各全血試料を２つのアリコートに分け、１つのアリコートは個体中の薬物レベルを測定するために未処置とし、２つめのアリコートには、完全抑制の対照として過剰な２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６；１００ｎＭ）を加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で１時間のプレインキュベーション後に、タプシガルギンを血液に加えてサイトカイン分泌を刺激し、４８時間後に馴化培地を回収した。手順の詳細な説明は以下の通りである。カニクイザル全血を、未処置のまたは２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ処置した健康な、未投薬の雄カニクイザルからアームプル（ａｒｍ−ｐｕｌｌ）によりヘパリンバキュテナー中に採取した。サルはブドウの報酬のために自発的に腕を差し出したため、鎮静剤またはストレスの非存在下で注射および血液吸引が可能であった。ＤＭＥＭ完全培地は、０．１％ヒトアルブミン（ＧｅｍＩｎＩ ＢＩｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，＃８００−１２０）、５５μＭ ２−メルカプトエタノール（ＧＩｂｃｏ）および１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎ（ＰＳＧ，ＧＩｂｃｏ，カタログ番号１０３７８−０１６）を含有するＩｓｃｏｖｅ ＤＭＥＭ（Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液を含む）であった。タプシガルギンはＡｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。カルシウム動員のための４×タプシガルギン刺激を与えるために、タプシガルギンの１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液をＤＭＥＭ完全培地で希釈して４０μＭ、４×溶液とした。Ｋｖ１．３のＰＥＧペプチド阻害剤である２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を、ＤＭＥＭ完全培地中、４００ｎＭ、４×最終濃度になるまで調製した。アッセイは９６ウェルＦａｌｃｏｎ３０７５平底マイクロタイタープレートで設定した。ネガティブ対照として１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭ完全培地を列１および２に添加した。列３〜７には５０μｌ／ウェルのＤＭＥＭ完全培地を加えたが、列８〜１２には、ＤＭＥＭ完全培地中の４×２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ阻害剤（４００ｎＭ）を５０μｌ／ウェル加えた。実験を開始するために、１匹のサル由来の全血１００μＬを、マイクロタイタープレートの１つの行の各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。１時間後、プレートを取り出し、５０μｌの４×タプシガルギン刺激（４０μＭ）を列３〜１２のウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２に戻して４８時間置いた。全血中に分泌されたＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１７量を測定するために、９６ウェルプレートの各ウェルから上清（馴化培地）１００μＬを保存プレートに移した。サイトカイン産生のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤＩｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光分析では、ＭＳＤ ＭｕｌｔＩ−Ｓｐｏｔ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｏａｔｅｄプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤＩｓｃｏｖｅｒｙ，ＧａＩｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）上で上清（馴化培地）を試験した。上記プレート上の作動電極を予め７種の捕捉抗体（ｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦａ、ｈＩＦＮｇおよびｈＩＬ−１７）でコーティングした。ＭＳＤヒト血清サイトカインアッセイ希釈液でプレートをブロックした後、０．０５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、２５μｌの訓化培地をＭＳＤプレートに添加した。プレートにカバーを被せ、振盪プラットフォーム上に１時間置いた。次に、ＭＳＤ抗体希釈液中の検出抗体カクテル２５μＬ／ウェルを各ウェルに添加した。このカクテルは７種の検出抗体（ｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−１０、ｈＴＮＦａ、ｈＩＦＮｇおよびｈＩＬ−１７）を、それぞれ１μｇ／ｍＬで含有していた。プレートにカバーを被せ、振盪プラットフォーム上に一晩（暗所で）置いた。翌朝、プレートをＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。１５０μｌの２×ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔをプレートのウェルに添加した後、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒで読み取った。各プレートの列３〜７のウェルはタプシガルギン刺激のみが加えられ、過剰の阻害剤は添加されなかったため、平均ＭＳＤ応答を用いて各個体の行の「試験」値を計算し、各個体中に存在する薬物のインビボレベルを検出した。各個体に対する「陰性対照」の計算値は、タプシガルギンも阻害剤も添加されなかった、各行の列１〜２での平均ＭＳＤ応答から計算した。個体に対する「陽性対照」値は、タプシガルギン刺激および外からの阻害剤添加を含んだ列８〜１２の５ウェルの平均ＭＳＤ応答から導き出した。阻害パーセント（ＰＯＩ）は、外から阻害剤を添加されたか、または未処置である同じ血液試料の相対的なタプシガルギン誘導性のサイトカイン応答の尺度であり、ここでは、１００ＰＯＩは、タプシガルギン刺激および外からの阻害剤添加の平均応答に相当する。したがって、１００ＰＯＩは１００％の応答阻害を表す。これに対し、０ＰＯＩは０％の応答阻害を表す。阻害パーセント（ＰＯＩ）を計算するために以下の式を使用する：［（「陽性対照」）ＥＣＬカウント）−（「陰性対照」ＥＣＬカウント）］／［「試験」ＥＣＬカウント）−（「陰性対照」ＥＣＬカウント）］×１００。対照パーセント（ＰＯＣ）は、式ＰＯＣ＝（１００−ＰＯＩ）を用いて計算する。ここでは本発明者らは、ハイスループットなＭＳＤ電気化学発光アッセイを用いたサイトカイン産生測定を記載するが、より低スループットなＥＬＩＳＡアッセイをサイトカイン産生測定に同様に適用できることを、当業者は容易に想定することができる。

実施例９
有効性の養子移植ＥＡＥモデル
以前に記載されたラットにおける多発性硬化症の養子移植実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）モデル［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，９３６］を用いて、本発明者らは、本発明者らのＫｖ１．３選択的２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）のインビボ活性を調べ、その有効性を、それより選択性の低い２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫ分子（配列番号８）と比較した。毎日１０、１００および１０００μｇ／ｋｇ（−１日目〜７日目）で皮下に（ＳＣ）投与された２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子が、有意に疾患重症度を低下させ、生存率を増加させたのに対し、媒体で処置したラットは疾患が重症化し死亡した（図７および図８Ａ〜８Ｄ）。毎日０．０４μｇ／ｋｇの２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫで処置したラットも有意な疾患改善を示した。

ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的な脳脊髄性ＣＤ４＋ラットＴ細胞系であるＰＡＳは、Ｅｖｅｌｙｎｅ Ｂｅｒａｕｄ博士の厚意により提供された。この細胞のインビトロでの維持およびＡＴ−ＥＡＥモデルにおけるその使用は、以前に記載されている［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら（２００１）ＰＮＡＳ ９８，１３９４２］。ＭＢＰおよび放射線照射胸腺細胞による抗原刺激または活性化（２日間）、ならびにＴ細胞増殖因子による増殖（５日間）の交互のラウンドにより、ＰＡＳ Ｔ細胞をインビトロで維持した。ＰＡＳ Ｔ細胞（３×１０^５／ｍｌ）の活性化には、１０μｇ／ｍｌのＭＢＰおよび１５×１０^６／ｍｌの同系の放射線照射（３５００ｒａｄ）胸腺細胞との２日間のインキュベーションが含まれていた。インビトロ活性化の２日後に、１０〜１５×１０^６個の生存ＰＡＳ Ｔ細胞を６〜１２週齢の雌ＬｅｗＩｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ ＲＩｖｅｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｅｓ）に尾部ＩＶにより注射した。−１日目から７日目まで媒体（ＰＢＳ中２％のＬｅｗＩｓラット血清）、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫまたは２０ｋＤａ−ＰＥＧ−ＳｈＫを毎日、皮下注射した（図７および図８Ａ〜８Ｄ）が、ここでは、−１日目はＰＡＳ Ｔ細胞の注射（図７の０日目）の１日前を表す。阻害剤レベルの解析のために、４日目に後眼窩放血により、８日目（実験の終わり）に心臓穿刺により、血清を採取した。−日目および４〜８日目にラットの体重を測定した。細胞移入の日（０日目）から３日目までは１日１回、４日目から８日目までは１日２回、盲検による個体のスコア化を行った。臨床兆候を各肢および尾の不全麻痺の程度の総スコアとして評価した。臨床スコアリング（図７および図８Ａ〜８Ｄの「ＥＡＥスコア」）：０＝無徴候、０．５＝遠位跛行尾部（ｄＩｓｔａｌ ｌＩｍｐ ｔａＩｌ）、１．０＝跛行尾部（ｌＩｍｐ ｔａＩｌ）、２．０＝軽度不全対麻痺、運動失調、３．０＝中度不全対麻痺、３．５＝片後肢麻痺、４．０＝後肢完全麻痺、５．０＝後肢完全麻痺および失禁、５．５＝四肢麻痺、６．０＝瀕死状態または死亡。スコア５．５に達したラットは安楽死させた。このモデルにおける他のコンジュゲートのインビボ活性は、本明細書に開示される実施例内に記載されている。状況によっては、インビボ有効性に関してペプチドコンジュゲートを試験する前に、コンジュゲートをラットＴエフェクター記憶細胞系であるＰＡＳの抗原（ミエリン）依存性増殖（^３Ｈ−チミジン取込み）阻害におけるその活性に関してインビトロで試験した。ここで用いた方法は、Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら，ＰＮＡＳ ９８，１３９４２（２００１）に記載のものと同様であり、当業者に公知である。

ＥＡＥ発症前に、Ｋｖ１．３ブロッカーである２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）によりラットを処置すると、投与量依存的に、疾患発症の遅延が生じ、疾患進行が阻害され、かつ死亡が阻止された（図７）。媒体のみにより処置したラットでの疾患発症が４．０日目に生じたのに対し、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）で処置した個体では、発症が４．５日目〜５．０日目まで遅延された。発症遅延に加え、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）での処置により、疾患重症度が投与量依存的に低下した。６日目の媒体処置ラットが重症の疾患を有し（ＥＡＥスコア６）、屠殺されたのに対し、２つの最高投与量の２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）で処置した個体は、軽度の疾患のみを有し、ＥＡＥスコアが約１であった。２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）分子は実験的自己免疫性脳脊髄炎を強力にブロックし、７日目午後のデータ（図８Ｃ）の投与量反応評価に基づくＥＤ５０の計算値が約４．４μｇ／ｋｇであった。

実施例１０
カニクイザルにおける薬理学実験；脳脊髄液中のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の測定；毒物学的調査およびマスト細胞脱顆粒実験
非ヒト霊長類における２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号１６）の長期的効果を調べるために、反復投与薬理学実験を計画し実行した。実験開始前に、経時的なエンドポイント安定性の評価および実験用の６匹のカニクイザルの選択ができるように、３〜１０週間の間、６〜１０匹の雄カニクイザルのプロファイルを作成した。測定されたエンドポイントには、全血球計算（ＣＢＣ）、血液化学、リンパ球サブセットのＦＡＣＳ解析、ならびに実施例８に記載のサイトカイン応答および標的有効範囲を測定するエキソビボ全血ＰＤアッセイが含まれていた。ＦＡＣＳにより解析されたサブセットには、リンパ球、ＣＤ４^＋、ナイーブＣＤ４^＋、ＣＤ４^＋Ｔ_ＣＭ、ＣＤ４^＋Ｔ_ＥＭ、ＣＤ４^＋ＣＤ２８⁻ＣＤ９５⁻、ＣＤ８^＋、ナイーブＣＤ８^＋、ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭ、ＣＤ８^＋Ｔ_ＥＭ、ＣＤ８^＋ＣＤ２８⁻ＣＤ９５⁻、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞が含まれていた。最高レベルのＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞を有するサルを選択した。カニクイザル全血ＰＤアッセイを用いると、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫは、ＩＬ−１７応答のブロックに関して０．０９±０．０８ｎＭのＩＣ_５０およびＩＬ−４応答のブロックに関して０．１７±０．１３ｎＭのＩＣ_５０を有していた（ｎ＝７匹のサル）。１ヶ月の期間、過剰な標的有効範囲をもたらすと思われる０．５ｍｇ／ｋｇの２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ週１回投与を選択した。前の薬物動態実験（実施例４を参照されたい）に基づくこの投与量は、ヒト全血における２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＩＣ_９５（１．０ｎＭ）の約２８倍の有効範囲（２８ｎＭ）をもたらすことが推定された。表４Ｆは、１２週間のカニクイザル薬理学実験の計画を示す。

未投薬（これまでに薬物に曝露されていない）の雄の中国カニクイザルをこの実験に使用した。必要以上のストレスを避けるよう注意した。注射および血液吸引はすべてアームプル（ａｒｍ−ｐｕｌｌ）で行い、サルはブドウの報酬のために自発的に腕を差し出した。実験には、２週間のベースライン測定（３つの投与前試料）、１ヶ月のＫｖ１．３ブロック（２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ［配列番号１６］のｑｗ投与）および６週間のフォローアップ解析が含まれていた。

２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫによる１ヶ月間のＫｖ１．３標的の過剰な有効範囲は十分に許容された。血液学および血液化学の臨床病理学的測定は、１ヶ月の期間全体にわたり、ベースライン測定（表４Ｇ）に対する変化を示さなかった。実験を通して動物の体重が徐々に増加したが、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫは体重増加に全く影響しなかった（図９Ｄ）。ＩＬ−４およびＩＬ−１７血清濃度により測定された有効範囲のＰＤアッセイ（図９Ａ〜９Ｂ）は、１ヶ月間の全投与期間（３週目〜６週目）にわたって対象が十分に抑制され、経時的な有効範囲の減少の証拠はないことを示していた。この知見に基づき、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫコンジュゲートまたは代償イオンチャネルに対する抗体排除反応の証拠はなかったが、これは、これらの応答が共に、経時的にＰＤ抑制の解除を生じると予想されたからである。さらに、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の予測された血清薬物レベルと観察された薬物レベルは厳密に一致していた（図９Ｃ）ことから、上記データは、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）コンジュゲートが、１ヶ月の投与期間にわたり、抗体排除を引き起こす免疫原性応答を生じなかったことも示している。ペプチドおよびタンパク質のＰＥＧ化が免疫原性を減少させ、免疫応答からのペプチドおよびタンパク質の防御または保護において有益な作用を有することが他にも示されている（Ｆ．Ｍ．ＶｅｒｏｎｅｓｅおよびＡ．Ｍｅｒｏ，ＢＩｏｄｒｕｇｓ ２２：３１５（２００８））。ＳｈＫ（配列番号１）および［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）はカニクイザルにとって異物であるため、ペグ化毒素ペプチド（または毒素ペプチド類似体）コンジュゲートは、遊離ペプチドのみの非コンジュゲートよりも保護を増強し得る。あるいは、ＳｈＫ（配列番号１）および［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）は、これらのペプチドが非常に小型の構造を有するため、本来的に免疫原性が低いのかもしれないと考えられた。投与中止後に、サイトカイン応答、血液化学および細胞プロファイリングに基づく「リバウンド」作用の証拠はなかった。ベースライン測定の投与前と比べて、投与およびフォローアップ解析の間にＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞サブセット、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＢ細胞における変化は見られなかった。結論として、２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は、カニクイザルにおけるＴ細胞応答を強力にブロックし、かつ長期間にわたる過剰な標的有効範囲をもたらす投与量においても十分に許容性があった。

ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）に関する１２週間の薬理学実験は、１ヶ月間の週１回投与により有効範囲の保持および期待される薬物レベルがもたらされることを示していたが、この実験のさらなる血清試料解析により、６匹のサルのうち４匹が、投与の第３週目の間に現れ（５週、表４Ｆ）、９週目でピークに達する抗薬物抗体を有することを示していた。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の免疫原性をさらに調べるために、１年以上前にＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を投与された６匹のカニクイザルのうちの５匹が使用可能であったので、薬物により再抗原刺激した。実験には、２週間のベースライン測定、７週間の０．５ｍｇ／ｋｇＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）週１回投与および４週間のフォローアップ解析が含まれていた。投与の第１週および６週の後に薬物動態を測定し、実験を通して週に１回、血清および血液を採取して、薬物曝露量、ＣＢＣおよび血液化学、抗薬物抗体レベルならびに標的有効範囲の薬力学レベルを測定した。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は再抗原刺激に対して十分な許容性があった。実験を通してすべてのサルの体重が増加したが、ＣＢＣまたは血液化学における変化はかなった。再抗原刺激の際に、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドに対する結合特異性を有する５個体のうち、３個体で抗体応答が検出され、２匹のサルでは、薬物に対する１０μｇ／ｍｌを超える抗抗濃度が観察された。この２個体は、バイオアッセイにおいて中和抗体に対しても陽性であった。再抗原刺激の実験において、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）（０．５ｍｇ／ｋｇ、週１回）の６回目の投与後、濃度曲線下面積（ＡＵＣ_{０−９６ｈ}）により測定された曝露量が、５匹のサルにおいて１．８、２．０、３．０、８．８および９．２倍増加することが、総薬物レベルを検出するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて観察された。複数回投与に対するＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）のＡＵＣの変化は、Ｃｍａｘおよび見かけの半減期における増加も伴っていた。すべての個体において予想よりも高い滞留が生じたが、最も高いＡＵＣ増加（８．８および９．２倍）は、最も抗体濃度の高い個体で観察された。同じ２匹のサルは、薬物中止後に全血薬力学（ＰＤ）有効範囲の拡大を示したが、これはＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）への高い曝露量と一致していた。上記２個体における抗薬物抗体の発達は、薬物の過剰な滞留およびこれらの個体におけるＰＤの影響の拡大に関連していた可能性があると結論できる。抗薬物抗体を示すこの２個体において、より狭いではなく、より広い薬力学的有効範囲が観察されたため、Ｋｖ１．３依存性全血ＰＤ応答の延長された抑制が、薬物レベルの上昇、および抗体に対するＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］（配列番号１６）の親和性よりも高い、Ｔ−細胞Ｋｖ１．３に対するＰＥＧ−ＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］（配列番号１６）の親和性の両方により引き起こされる可能性がある。このことを明らかにするためには、さらなる実験が必要である。

サルにおいて抗薬物抗体が生じたにもかかわらず、前臨床免疫原性はヒト免疫原性を予測するものではない（Ｐｏｎｃｅら，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＴｏｘＩｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５４，１６４−１８２（２００９））ため、同様の反応がヒトにおいて生じるか否かは不明である。エクセナチドは、ヒトにおいて抗薬物抗体を示す、２型糖尿病治療の承認薬の代表例であるが、依然として安全かつ有効である。（ＦａｌｕｄＩら，ＰｅｐｔＩｄｅｓ ３０，１７７１−１７７４（２００９）；Ｍａｌｏｎｅら，Ｅｘｐｅｒｔ ＯｐＩｎ．ＩｎｖｅｓｔＩｇ．Ｄｒｕｇｓ １８，３５９−３６７（２００９）；Ｓｃｈｎａｂｅｌら，ＰｅｐｔＩｄｅｓ ２７，１９０２−１９１０（２００６））。

脳脊髄液中のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の測定
ＳｈＫペプチドベースの阻害剤がＫｖ１．１（脳内のニューロン活動調節において重要であることが示されているカリウムチャネル）を非特異的に標的化する傾向をいくらか有するという懸念に対処するために、本発明者らは、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）が脳脊髄液（ＣＳＦ）内に入る能力を評価した。カニクイザルおよびＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットのＣＳＦ中のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）濃度を評価した。１つの実験では、皮下投与後の２４時間および４８時間後のサルＣＳＦ中におけるＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を測定した。これらのデータを下の表４Ｇ（ａ）に示す。サルおよびラットの両方で、ＣＳＦ濃度は血清濃度に比べて低かった。表４Ｇ（ａ）に示されるように、サルＣＳＦで測定されたＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の最高濃度は、７．６２ｎｇ／ｍｌであった。この試料は、血液で汚染されていることが視覚的に観察された。汚染されていない試料で測定された最高濃度は３．８３ｎｇ／ｍｌであり、これは、ＣＳＦ（ｎｇ／ｍＬ）に対する血清（ｎｇ／ｍＬ）の比が２９２であることを示している。表４Ｇ（ｂ）は、ラットで測定されたＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）のＣＳＦ濃度を示している。最高濃度は４３ｎｇ／ｍｌおよび１２．７ｎｇ／ｍｌであり、ＣＳＦ（ｎｇ／ｍＬ）に対する血清（ｎｇ／ｍＬ）の比がそれぞれ４６．５および４７０であることを示している。これらの試料は共に、実験の初期（６時間）に屠殺されたラットから採取されたものである。実験の終わり（４８時間）まで生存したラットのうち、１匹だけが、アッセイの定量限界（１ｎｇ／ｍｌ）を超える検出可能なＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）濃度であった。このＣＳＦ試料の濃度は５．７０ｎｇ／ｍｌであり、これは測定された血清濃度とほぼ同じで、他の試料と比べて外れ値となっているが、それはこの試料もサンプリングの間に血清により汚染されたという結論を支持している。

マスト細胞脱顆粒実験
天然のペプチドＳｈＫはＫｖ１．３およびニューロンＫｖ１．１に影響を与えることから、血液脳関門を通過する薬物の小片がニューロンＫｖ１．１に対するオフターゲット効果および麻痺を引き起こし得るという懸念が表されている（Ｋａｌｍａｎら，Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２６９７−３２７０７（１９９８））。Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＳｈＫ、ＰＥＧ−ＳｈＫおよびＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の薬物動態実験では、本発明者らは、大量のＩＶボーラス投与直後に深刻な有害事象を認めた。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の２．０ｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇボーラスＩＶ投与では、全血中でのＴ細胞サイトカイン産生ブロックにおける分子ＩＣ_５０（０．１ｎＭ）の２５，０００倍よりも大きい、１０，０００ｎｇ／ｍｌを超える血清Ｃ_０／Ｃ_ｍａｘ（＞２５００ｎＭ）を生じたが、その直後に、ラットはゲージの底で瀕死状態になった。５ｍｇ／ｋｇの高投与量群で３個体のうち２個体が死亡したのに対し、２ｍｇ／ｋｇの投与量を投与された個体はすべて生き延びた。他にも皮膚の変色（青色の肢、耳）および高粘度の血液が観察された。最初、これらの一時的な作用はニューロンＫｖ１．１に対する影響に起因していたが、処置ラットは発作を示さず、ＣＮＳへの影響（例えば、高粘度の血液）と一致しない他の症状を表し、かつＫｖ１．３選択的ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫコンジュゲート（配列番号１６）が、Ｋｖ１．１に対して１０００倍効力が低いにもかかわらず同様の作用を引き起こした。ラットにおける単回皮下投与の薬物動態実験では、低投与量（０．１および０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与された個体が見かけ上正常で、体重が増加したのに対し、５．０ｍｇ／ｋｇで処置した３個体のうち２個体は、投与後２４時間で不活発となり、体重が減少し、前肢および後肢の軽度の腫脹を示した。投与後２４時間での発症はＣｍａｘと相関があり、時間の経過とともにその個体は回復し、体重が増加した。興味深いことに、これらの作用は、同じかまたはそれより高い曝露量にもかかわらず、マウス、カニクイザルまたはイヌの薬物動態実験では観察されなかった。ラットにおけるこの独自の所見を理解する試みとして、関連症状を生じ、種選択性を示す分子を記載した実験に関する文献を再調査した。マスト細胞脱顆粒ペプチド（ＭＣＤＰ）のような塩基性分泌促進物質は、異なる種由来のマスト細胞に対して異なる影響を示し、ラットはいくつかの陽イオン分子に対して感受性の増加を示すことが報告された（ＢａｒｒｅｔｔおよびＰｅａｒｃｅ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎ．７２，２３４−２３８（１９８３）；Ｍ．ＭｏｕｓｌＩら，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２７，１−１１（１９９４）；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３４，１３９−１４４（１９６８）；ＬｅｕｎｇおよびＰｅａｒｃｅ，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．８１，６９３−７０１（１９８４））。ＳｈＫはＭＣＤＰと同様に塩基性ペプチドであり、マスト細胞脱顆粒が腫脹、皮膚の変色および血管虚脱を引き起こし得ることから、本発明者らは、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの大量ボーラス投与後のラットにおける有害事象がマスト細胞脱顆粒およびアナフィラキシー様応答に起因するという仮説を検証するための実験に着手した。２５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫボーラスＩＶまたは皮下注射を行ったラット由来の血清を、ヒスタミンレベルに関して試験した。図３７に示されるように、ヒスタミンレベルは、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのボーラスＩＶ後、５分および１５分で大幅に上昇して２，０００ｎｇ／ｍｌを超えるレベルに達し、時間とともに急速に低下した。このレベルのヒスタミンは、アナフィラキシー様ショックおよび血管虚脱を引き起こすことが予想されるであろう。０．１、０．５、２．０および５．０ｍｇ／ｋｇの投与量でのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ皮下投与では、投与後２４時間のＣ_ｍａｘ薬物レベル５２ｎｇ／ｍｌ（１３ｎＭ）、２３３ｎｇ／ｍｌ（５８ｎＭ）、９８８ｎｇ／ｍｌ（２４７ｎＭ）および２５７０ｎｇ／ｍｌ（６４２ｎＭ）を生じたが、これは標的有効範囲の全血薬力学アッセイにおける分子ＩＣ_５０（０．１ｎＭ）よりも１３０〜６４２０倍高い薬物レベルに対応する。図３８に示されるように、２．０および５．０ｍｇ／ｋｇ投与量のグループでは、投与後２４〜４８時間で、血清ヒスタミンのわずかな上昇が観察された。５ｍｇ／ｋｇの最高投与量のグループでは、軽度の肢の腫脹を有する２個体（ラット＃１０および＃１２）が血清ヒスタミンの増加を示したのに対し、上記症状を有さない個体（ラット＃１１）は有意なヒスタミン上昇を示さなかった。

ラットにおけるＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの影響をさらに調べるために、さらなる毒物学実験に取り組んだ。さらに、第二の種であるカニクイザルにおいて毒性を評価した。マスト細胞に対するＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの作用を直接評価するために、インビトロ実験も行った。これらの実験に関するさらなる詳細を以下の章に記載する。

１つの毒物学実験では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を０．０４、０．１２、０．２、０．４、１．３６および４．０ｍｇ／ｋｇの単回投与量で、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内注入（３０分間にわたる）により投与した（ｎ＝１〜３／投与群）。４．０ｍｇ／ｋｇにおいて、１個体が死亡し、他の個体は、活動低下／嗜眠、横臥、皮膚の変色（青色の肢、尾および／または耳）および触れたときの冷感の臨床兆候のため安楽死させた。活動低下および横臥は０．４ｍｇ／ｋｇにおいても観察された。１．３６ｍｇ／ｋｇを投与した１個体は、腫脹および皮膚変色の臨床兆候のため安楽死させた。腫脹は、０．１２ｍｇ／ｋｇで投与された１個体以外のすべての被検試料処置個体で観察された。腫脹の重症度は投与量依存的ではなく、その予定の安楽死まで生存した全群で認められた臨床観察はすべて、投与後約２４時間までに消散した。４．０ｍｇ／ｋｇおよび１．３６ｍｇ／ｋｇでは、被検試料に関連した作用として、腎尿細管上皮の変性／壊死、胸腺リンパ球の壊死／枯渇、炎症（好中球および単球の増加）ならびに体液恒常性の変化（脱水症状、ナトリウムと塩素イオンの減少およびアルブミンとグロブリンの減少）が含まれていた。０．４ｍｇ／ｋｇおよび４．０ｍｇ／ｋｇを投与した個体では、ペグ化生体分子の投与後に記載されているものと同様に、腎尿細管上皮に空胞が見られた（Ｂｅｎｄｅｌｅら，Ｓｈｏｒｔ ＣｏｍｍｕｎＩｃａｔＩｏｎ：Ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｖａｃｕｏｌａｔＩｏｎ Ｉｎ ａｎＩｍａｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗＩｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，Ｔｏｘ ＳｃＩ．４２：１５２−１５７（１９９８））。低投与量で認められたその他の変化は、０．４ｍｇ／ｋｇでのリンパ球およびトリグリセリドの減少に限られていた。

別の毒物学実験では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝５／投与群）に、週１回、０．１、０．５または２．０ｍｇ／（ｋｇ・投与）で１４日間（２回投与）皮下注射により投与した。０．５ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇの投与レベルでは、すべての個体が、皮膚の変色（赤色）の臨床兆候を示し、これは高投与量群でより重症であった。さらに、２．０ｍｇ／ｋｇで投与した個体において色素鼻漏（ｃｈｒｏｍｏｒｈＩｎｏｒｒｈｅａ）が認められた。すべての臨床兆候は１１日目までに消散した。２つのｍｇ／ｋｇの投与群において、両投与の４８後に体重減少が認められ、対照群と比べて、２．０ｍｇ／ｋｇにおいて体重増加の減少（１日目〜１４日目）が認められた。０．５ｍｇ／（ｋｇ・日）以上を投与した個体における血液学的作用は、赤血球ターンオーバーの増加と一致し、かつ脾臓重量増加および脾臓造血の増加と相関していた。すべての被検試料処置個体において好中球および好酸球の増加が認められた。骨髄好酸球造血および脾臓造血の増加が、すべてのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）投与量において組織学的に認められた。

別の毒物学実験では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝５／投与群）に、７２時間毎に１回、０．１、０．３、０．７、２．５または５．０ｍｇ／（ｋｇ・投与）で１２日間、皮下注射により投与した（４回投与）。曝露量は、２．５ｍｇ／ｋｇまでは投与量の増加に伴いが増加したが、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５．０ｍｇ／ｋｇを投与したラットにおいては、曝露量は同様であった。すべての個体が１２日間の処置期間を生き延びた。０．３、０．７、２．５および５．０ｍｇ／（ｋｇ・投与）群での各投与の２４時間後に、すべての個体において耳および肢の発赤が観察された。０．１ｍｇ／（ｋｇ・投与）群では、５個体のうち１個体が発赤を示したが、２回目の投与後のみであった。２．５および５．０ｍｇ／ｋｇの投与量群において、体重減少および体重増加が認められた。２．５ｍｇ／（ｋｇ・日）以上の投与量で血液学的作用が認められ、赤血球ターンーオーバーの増加と一致していた。０．７ｍｇ／（ｋｇ・投与）以上の投与量で血小板産生の増加が認められた。腎臓においては、５ｍｇ／（ｋｇ・日）を投与したラットの近位曲尿細管で空胞が認められた。０．５ｍｇ／（ｋｇ・日）または２．０ｍｇ／（ｋｇ・日）では、群当たり少数の個体において尿化学値が増加したが、これらの変化は個体間および個体内で一貫し、処置に関連する可能性は低いと考えられた。腎損傷のバイオマーカー（ベータ−２ミクログロブリン、カルビンジン、クラスタリン、シスタチンＣ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ、腎損傷分子−１、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、オステオポンチン、組織メタロプロテアーゼ阻害物質−１および血管内皮増殖因子）に対する被検試料関連作用は見られなかった。処置ラットの骨髄、脾臓、肝臓および腸間膜リンパ節での造血の頻度／程度において投与量依存的増加が見られた。この変化は、肝臓および腸間膜リンパ節に比べて、脾臓および骨髄においてより顕著であった。脾臓では、造血増加は、赤血球、ミエロイドおよび血小板前駆細胞からなっていたのに対し、骨髄では、それは主としてミエロイド前駆細胞からなっていた。脾臓および骨髄におけるミエロイド前駆細胞の大部分は、好酸球前駆細胞と関連していた。肝臓および腸間膜リンパ節では、造血は赤血球および好酸球前駆細胞の散在群からなっていた。脛骨および／または大腿骨では、髄管における造骨性の新骨形成が見られ、これは主として線維性骨からなっていた。さらに、線維性骨のわずかな増加を伴う皮質骨の空隙率増加が見られた。ほとんどの処置ラットの副腎では、皮質のわずかな肥大が見られた。５．０ｍｇ／（ｋｇ・投与）を投与した１ラットでは、腺上皮のびらんが見られた。腎臓では、５ｍｇ／（ｋｇ・投与）を投与したラットの近位曲尿細管に空胞が認められた。この空胞は、ＰＥＧ関連の腎空胞と一致し、他のどの腎尿細管変化とも関連がなかった（Ｂｅｎｄｅｌｅら，Ｓｈｏｒｔ ＣｏｍｍｕｎＩｃａｔＩｏｎ：Ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｖａｃｕｏｌａｔＩｏｎ Ｉｎ ａｎＩｍａｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗＩｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｒｏｔｅＩｎｓ，Ｔｏｘ ＳｃＩ．４２：１５２−１５７（１９９８））。

別の毒物学実験では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）（Ａ４ＳおよびＤＰＢＳ媒体中１ｍｇ／ｋｇ）、比較的Ｋｖ１．３不活性なＰＥＧ−［１−Ｎａｌ １６］ＳｈＫ（配列番号１５９）（１ｍｇ／ｋｇ）、抗ＫＬＨ Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３３８、３３９、３３８、３４２のヘテロ四量体）（３７ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｃ／Ｆｃ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３３７、３４８のヘテロ二量体）（１４ｍｇ／ｋｇ）またはＰＥＧ（５ｍｇ／ｋｇ）を、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３／投与量群）に単回皮下投与を行った。被検試料処置ラットにおいて、死亡も体重に対する作用も見られなかった。各群に投与された投与量は、ＳｈＫペプチドと等モルまたはＰＥＧと等負荷が得られるようにした。モル濃度に基づき、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）（Ａ４ＳおよびＤＰＢＳ中）および抗ＫＬＨ Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫを投与した群で測定されたＡＵＣ曝露量はほぼ等しかった。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）（Ａ４ＳおよびＤＰＢＳ中）および抗ＫＬＨ Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３３８、３３９、３３８、３４２のヘテロ四量体）に比べ、ＰＥＧ−［１−Ｎａｌ １６］ＳｈＫ（配列番号１５９）およびＦｃ／Ｆｃ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３３７、３４８のヘテロ二量体）を投与した群のモル濃度ＡＵＣ曝露量は、それぞれ約６〜８倍および約０．５倍であった。Ａ４ＳおよびＤＰＢＳ中ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を投与されたラットは共に耳／肢が発赤したのに対し、ＰＥＧのみを投与したラットでは発赤しなかった。ＳｈＫ構築物を投与した全処置群のラットは、同様の病理所見を有していた。骨髄では、ミエロイド系の細胞数増加（ミエロイド：赤血球比の増加）が見られ、その多くが好酸球であった。脾臓では、赤血球およびミエロイド細胞群の等しい造血増加が見られた。ＳｈＫ構築物を投与した全群で血清ヒスタミンレベルの増加が認められた。この実験により、活性または不活性なＳｈＫ部分を使用した異なる構築物（ＰＥＧ、Ｆｃ／Ｆｃ、抗ＫＬＨ）が、ラットにおいて同様の変化を引き起こし得ることが示された。さらに、これらの変化は使用された媒体とは無関係であり、かつＰＥＧのみでは引き起こされない。

別の実験では、５ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を、雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、ＬｅｗＩｓ、ＷＩｓｔａｒまたはＦＩｓｃｈｅｒラット（ｎ＝３／投与量グループ／系統）に単回皮下注射として投与し、前の実験での変化がラット系統に特異的か否かを判定した。死亡または体重への被検試料関連作用は見られなかった。４つラット系統すべてが色素鼻漏（ｃｈｒｏｍｏｒｈＩｎｏｒｒｈｅａ）、色素涙および／または皮膚の変色（赤色）を示し、それらの各媒体対照群に比べて、血漿ヒスタミンレベルが統計的に有意に増加した。系統間に平均曝露量（ＡＵＣ_０−４８）およびＣ_ｍａｘの小さな違いがいくつか見られたが、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の血清濃度プロファイルは、４つの全ラット系統で全般的に類似していた。血漿フィブリノーゲンは、全系統で一貫して同程度に増加し、通常は、好中球とグロブリンの増加およびアルブミンの減少を含めた、他の炎症指標を伴っていた。１匹のＦＩｓｃｈｅｒラットでは、副腎壊死および心臓乳頭筋の限局性の変性／壊死が見られた。２匹のＷＩｓｔａｒラットの副腎における同様であるが軽度である変化は、個々の皮質細胞のわずかな多病巣性壊死であった。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、ＬｅｗＩｓおよびＷＩｓｔａｒ系統では、副腎皮質および／または髄質において細胞浸潤が見られた。この浸潤は、副腎皮質壊死に対する炎症性応答、髄外造血または炎症と造血の組合せのいずれかであった。副腎皮質肥大がＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙおよびＷＩｓｔａｒ系統において認められたが、これは、生理的ストレス、ならびに／またはＡＣＴＨおよびコルチコステロン分泌に対する、マスト細胞脱顆粒およびヒスタミン放出によるものであろう（ＢｕｇａｊｓｋＩら，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｈＩｓｔａｍＩｎｅｒｇＩｃ ｓｔＩｍｕｌａｔＩｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍＩｃ−ｐＩｔｕＩｔａｒｙ−ａｄｒｅｎａｌ ａｘＩｓ，Ｊ Ｐｈｙｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍ．５４（４）：６４３−６５２（２００３））。胸腺皮質、脾臓の細動脈周囲リンパ鞘および腸間膜リンパ節の傍皮質においてリンパ系枯渇が見られた。リンパ枯渇がＦＩｓｃｈｅｒラットの胸腺でもっとも顕著であったのに対し、脾臓およびリンパ節のリンパ枯渇はＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、ＬｅｗＩｓおよびＷＩｓｔａｒ系統で生じた。脾臓におけるさらなる変化には、赤血球およびミエロイド系の両方を含み、全般的にＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、ＬｅｗＩｓおよびＷＩｓｔａｒ系統での脾臓重量増加と関連する、造血増加、ならびにＣＢＣにおける好中球増加と関連する副鼻腔での好中球増加が含まれていた。骨髄において細胞充実度の増加が見られたが、これは主として、初期ミエロイド前駆細胞の増加に起因するものであった。Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙおよびＷＩｓｔａｒ系統の肝臓中のクッパー細胞が顕著であったが、これは、活性の増加（例えば、食作用、サイトカイン放出）に起因し得る。すべての処置ラットの耳介において、表皮の小静脈がうっ血し、内皮の内側が辺縁に移動した好中球により覆われていたが、この変化は、発赤した皮膚の臨床観察と関連する。処置ラットの注射部位の深部真皮／皮下組織では、リンパ球および好中球が少なく主としてマクロファージからる、炎症性浸潤が見られた。炎症性浸潤の性質は、皮下組織内への異物注射と一致する。より軽度の炎症性浸潤が対照群で見られ、これは主としてリンパ球からなっていた。腎臓では、このＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）５ｍｇ／ｋｇ投与量の全処置ラットの近位曲尿細管で空胞が認められた。この空胞はＰＥＧに関連する腎空胞であり、他のどの腎尿細管の変化とも関連がなかった（Ｂｅｎｄｅｌｅ，同上）。

膨疹および発赤の陽性反応の評価では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を、５０μｌの注射量中、０．４〜４０，０００ｐｍｏｌの範囲の様々な投与量レベルで、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに真皮内注射により投与した。投与後３０分における陽性膨疹反応の出現率を判定するために、合計８匹のラットに、ＰＢＳネガティブ対照および０．４〜４，０００ｐｍｏｌの範囲の一連の投与量を２つ異なる日に投与した。真皮内注射が全身応答を誘発するか否かを判定するために、３匹のラットからなるグループに、４０、４００、４，０００または４０，０００ｐｍｏｌの単回投与量を投与した。平均曝露量（ＡＵＣ_０−２４）は、４００〜４０，０００ｐｍｏｌまでのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の投与量にほぼ比例していたが、４０ｐｍｏｌでは全身曝露は測定されなかった。実験中の死亡は見られなかった。真皮内注射の３０分後に顕著な膨疹反応（浮腫）が見られたが、その大きさは投与量依存的であった。３０分後に認められた発赤反応（血管うっ血による発赤）はなかったが、投与後８時間および２４時間に注射部位での発赤が認められ、組織学的に認められる炎症と関連していた。０．４ｐｍｏｌ以上の投与量の各個体において陽性膨疹反応が認められた。陽性膨疹反応の出現率は投与量依存的であり、かつ４００ｐｍｏｌでプラトー（１００％の出現率）に達した。膨疹面積および膨疹の厚さの増加も投与量依存的であった。マスト細胞顆粒の分散および血管の辺縁趨向／うっ血が、投与後３０分に４０、４００および４，０００ｐｍｏｌの投与量レベルで組織学的に認められた。投与後２４時間では、４０，０００ｐｍｏｌを投与した３個体のうち２個体で、真皮および表皮の凝固性壊死が認められた。さらに、４００、４，０００および４０，０００の投与量により被検試料関連の炎症が生じ、かつマスト細胞はトルイジンブルー染色切片においてもう見られなかった。２４時間で認められた炎症に対して、７２時間では炎症の顕著な減少が見られ、１６８時間では炎症は見られなかった。４０，０００ｐｍｏｌで投与したラットにおけるフィブリノーゲンおよびヒスタミンレベルの増加は、この群における全身曝露が全身反応を誘発したことを示していた。全身反応のＮＯＥＬは４，０００ｐｍｏｌであった。この実験では、膨疹反応と全身反応の間には大きな差があることが示され、このことは、当該真皮内投与量が、望ましくない全身反応の低いリスクでヒトに投与され得ることを示している。

さらなるラット実験では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を０．７および２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で、遠隔測定の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３／投与量群）に皮下注射により投与し、平均動脈圧および心拍数を２４時間継続的にモニターした。投与後２４時間の時点で、媒体処置ラットに比べ、投与量依存性の平均動脈圧の低下および心拍数（反射性）の増加が見られた（表４Ｇ（ｃ））。さらに、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は発赤、腫脹および耳介炎症の臨床観察を示したが、これはヒスタミン放出と一致すると考えられた。

別の実験では、２．５ｍｇ／ｋｇの投与量のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を遠隔測定の雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝５／投与量群）に、マスト細胞脱顆粒および顆粒内容物枯渇を引き起こすことが知られている化合物４８／８０（Ｂｌｏｍら， Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍＩｎＩｎｇ ｗｈｅｔｈｅｒ ｈｙｐｏｔｅｎｓＩｏｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｉｎ ｐｒｅｃｌＩｎＩｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｈＩｓｔａｍＩｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｊ Ｐｈａｒｍ ａｎｄ ＴｏｘＩｃｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９：３１−３７（２００４））による前処置の後に、皮下注射により投与した。化合物４８／８０での前処置により、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）誘導性の低血圧が完全に阻害された。平均動脈圧低下の原因はマスト細胞脱顆粒に起因し、心拍数の増加は反射応答に起因するものであった。

要約すれば、インビボラット毒物学実験における高投与量での副作用観察は、マスト細胞活性化／脱顆粒ならびに様々な予め形成されたおよび／または合成された炎症性メディエーターの放出の生物学的影響と一致した。ヒスタミンレベルはマスト細胞脱顆粒の信頼できるマーカーであり、被検試料で処置した一部の個体において上昇した。ヒスタミンは、血流量および血管拡張の増加をもたらす強力な血管作動性メディエーターであり、多くの臨床観察および遠隔測定実験の結果を説明する。ヒスタミンはまた、ラットにおいて胃潰瘍を生じさせ（Ｈａｓｅら，ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄＩｎ Ｅ２ ａｇｇｒａｖａｔｅｓ ｇａｓｔｒＩｃ ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｎｊｕｒｙ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈＩｓｔａｍＩｎｅ Ｉｎ ｒａｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＰ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＬＩｆｅ ＳｃＩ．７４：６２９−６４１（２００３））、かつＡＣＴＨおよびコルチコステロン分泌を増加させるが、後者が副腎肥大を引き起こした可能性がある（ＢｕｇａｊｓｋＩら，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ＩｎｈＩｂＩｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｈＩｓｔａｍＩｎｅｒｇＩｃ ｓｔＩｍｕｌａｔＩｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍＩｃ−ｐＩｔｕＩｔａｒｙ−ａｄｒｅｎａｌ ａｘＩｓ，Ｊ Ｐｈｙｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍ．５４（４）：６４３−６５２（２００３））。ヒスタミンは、骨代謝において役割を果たしている可能性があり、破骨細胞形成を調節することが示されているが、これが反復投与後の骨の変化を引き起こした可能性がある（ＢＩｏｓｓｅ−Ｄｕｐｌａｎら，ＨＩｓｔａｍＩｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓＩｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｄＩｆｆｅｒｅｎｔＩａｌ ｅｘｐｒｅｓｓＩｏｎ ｏｆ ｈＩｓｔａｍＩｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１７４：１４２６−１４３４（２００９））。ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦのような他のマスト細胞由来サイトカインは、好酸球の成熟および走化性において重要であり、組織内での好酸球新生を促進し得るが、このことはいくつかの実験で認められた（Ｓｈａｋｏｏｒｙら，Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒＩｖｅｄ ｃｙｔｏｋＩｎｅｓ Ｉｎ ｅｏｓＩｎｏｐｈＩｌ ｂＩｏｌｏｇｙ，Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ＣｙｔｏｋＩｎｅ Ｒｅｓ．２４：２７１−２８１（２００４））。

興味深いことに、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＬｅｗＩｓ、ＷＩｓｔａｒおよびＦＩｓｃｈｅｒラット系統で観察された、推定上のマスト細胞関連作用は、マウス、カニクイザルまたはイヌの実験では、ラットと同じかまたはそれより高い曝露量にもかかわらず観察されなかった。

例えば、マウスでの実験では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を０．６、２．５または５ｍｇ／（ｋｇ・日）の投与量で、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／投与量群）に１４日間、皮下注射により毎日投与した。１４日目の終わりでのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）曝露量は、０．６、２．５および５．０ｍｇ／ｋｇの投与量を毎日投与されたマウスで、それぞれ８３３±１８５ｎｇ／ｍｌ（２０８±４６ｎＭ）、１００６６±２２１９ｎｇ／ｍｌ（２５１６±５５５ｎＭ）および３１３３４±５８００ｎｇ／ｍｌ（７８３４±１４５０ｎＭ）であった。すべてのマウスが投与期間を生き延びた。被検試料関連の臨床観察または体重変化は、どの個体においても認められなかった。腎尿細管上皮において投与量依存性の空胞形成が見られたが、肝臓類洞マクロファージまたは腸間膜リンパ節および脾臓の常在マクロファージ内での空胞形成は見られなかった。

カニクイザルにおける別の実験では、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を０．７ｍｇ／ｋｇで３日毎に、または週１回０．１、０．５または２．０ｍｇ／ｋｇで２週間、雄カニクイザルに皮下注射により投与した。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を投与したカニクイザルにおいて副作用は見られなかった。体重に対する処置関連の作用は見られなかった。被検試料に関連に器官の重量変化、または肉眼的もしくは顕微鏡的所見は見られなかった。さらに、いかなる質的または量的な心電図（ＥＣＧ）の異常も０．１、０．５または２．０ｍｇ／（ｋｇ・投与）の投与量でのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）投与によるものではなかった。恐らく被検試料に関連すると考えられる唯一の所見は、３日毎に０．７ｍｇ／ｋｇを投与した個体での血清尿素窒素および血清クレアチニンのわずかな増加であった。臨床病理変化との病理組織学的関連は観察されなかった。腎空胞は観察されず、腎損傷の尿中バイオマーカー（アルファ−１ミクログロブリン、ベータ−２ミクログロブリン、カルビンジン、クラスタリン、結合組織増殖因子、クレアチニン、シスタチンＣ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ、腎損傷分子−１、微量アルブミン、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、オステオポンチン、タム−ホースフォールタンパク質、組織メタロプロテアーゼ阻害物質−１、トレフォイル因子３および血管内皮増殖因子）における変化は見られなかった。したがって、カニクイザルにおける無毒性量は＞２ｍｇ／ｋｇである。この実験では、２ｍｇ／ｋｇ投与量群が５８４，０００ｎｇ×時間／ｍＬの平均ＡＵＣ値を有していた。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）処置個体の１７％（２／１２）でＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）に対する結合抗体が検出された。抗体陽性個体はいずれも０．５ｍｇ／ｋｇ投与量群であった。検出された抗体は、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）およびＳｈＫペプチド（配列番号１）の両方と結合することができた。低投与量または高投与量群において抗体は検出されなかった。

腎尿細管の空胞形成は、ペグ化化合物の投与の結果であることはよく知られている。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）が、マウスおよびラットにおいては腎空胞を引き起こした（ＮＯＥＬ＝約２０倍）が、カニクイザルにおいては引き起こさなかった（ＮＯＥＬ＞約１５０倍）ことは注目に値する。さらに、腎毒性の高感度バイオマーカーの評価を含めた明白な腎毒性の証拠は、どの種においても見られなかった。

さらなる膨疹および発赤反応の実験において、カニクイザル（ｎ＝３）に、１投与部位当たり０．０１、０．１、１．０および１０μｇの化合物４８／８０（マスト細胞脱顆粒の陽性対照）ならびに０．４、４、４０、４００、４０００、４００００ｐｍｏｌのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の真皮内注射を行った。２つの化合物を少なくとも７日間隔で投与し、各個体には１日に全種類の投与量を投与した。３個体すべてにおいて、投与後３０分で、１０μｇの化合物４８／８０および４０，０００ｐｍｏｌのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を投与した投与部位に陽性膨疹反応が認められた。４０，０００ｐｍｏｌのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）投与部位も投与後４時間で陽性であった。４，０００ｐｍｏｌのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を投与した３つの投与部位の１つは、投与後３０分でのみ陽性反応があった。０．４〜４００ｐｍｏｌのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を投与した投与部位では、膨疹反応は観察されなかった。化合物４８／８０による膨疹反応は、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）による膨疹反応よりも大きかったが、持続時間は短かった。組織学的には、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）関連の所見は見られなかった。これに対し、化合物４８／８０は、１０μｇを投与した部位でわずかな炎症を引き起こし、０．１μｇ以上を投与した部位では、トルイジンブルー陽性マスト細胞の減少が見られた。ラットでの陽性膨疹反応に比べて、カニクイザルでの陽性膨疹反応は小さく、生物学的作用の組織学的証拠を伴わなかった。この実験のデータによれば、カニクイザルでのＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）による膨疹反応が、マスト細胞脱顆粒に続く浮腫によるものなのか、または高濃度のペグ化ペプチドの注射によるものなのかは定かではない。

遠隔測定の雄カニクイザルを用いて、平均動脈圧、心拍数および心拍間隔に対するＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の影響を評価した。被検試料投与の数週間前に、各個体を媒体（５ｍｌ／ｋｇ）または化合物４８／８０（０．３もしくは３ｍｇ／ｋｇ ＳＣ）で処置し、動物モデルの有効性を確認した。３ｍｇ／ｋｇの化合物４８／８０の皮下注射は、カニクイザルにおいて収縮期および平均動脈圧の低下を引き起こしたのに対し、媒体はこれらのパラメーターに全く影響しなかった。動物モデルの有効性確認の後、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）を０．５または２．０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、７２時間継続的にモニターした。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は、媒体対照処置に比べて、血行動態または心拍間隔に対していかなる作用も有さなかった。

ラットにおいて、全身応答を引き起こすマスト細胞脱顆粒が、低曝露量のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）で生じた。これに対し、カニクイザルにおける非常に高い曝露量は、副作用およびマスト細胞脱顆粒の生物学的影響の具体的証拠を示さなかった。ヒトがＳｈＫによるマスト細胞脱顆粒に感受性であるか否かは不明であるが、真皮内での実験では、投与されたヒトにおける全身応答の低いリスクでこれを調査する機会が示された。

マスト細胞に対するＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の影響をさらに調べるために、ラットおよびマウス由来の単離腹腔マスト細胞、ならびにヒトＣＤ３４由来マスト細胞を試験し、インビトロでのマスト細胞脱顆粒およびヒスタミン放出を評価した。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂおよび一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）は、陽性対照の塩基性分泌促進物質ＭＣＤＰ、化合物４８／８０およびＰ物質と同様に、ラット腹腔マスト細胞の脱顆粒を引き起こした（図３９）。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）および一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）がヒトマスト細胞の脱顆粒をほとんどまたは全く引き起こさなかった（図４０）のに対し、塩基性分泌促進物質ＭＣＤＰ、化合物４８／８０およびＰ物質は非常に活性であったことは重要である。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫによるマスト細胞脱顆粒の種特異性をさらに評価するために、マウス腹腔マスト細胞および第二の系統のラット由来のマスト細胞に対する活性も試験した。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は、両系統のラット由来の腹腔マスト細胞の脱顆粒を引き起こしたが、マウス腹腔マスト細胞およびヒトマスト細胞に対しては不活性であった（図４１）。ラット腹腔マスト細胞のＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ脱顆粒がオフターゲット作用の結果であり、Ｋｖ１．３または別のＳｈＫ感受性カリウムチャネルに起因するものではないことを確認するために、ラット腹腔マスト細胞に関して電気生理学実験を行った。図５４Ａ〜５４Ｂに示されるように、ラット腹腔マスト細胞はＫｖ１．３に似た外向き電流を示さず、観察された電流は、高濃度の強力なＫｖ１．３阻害剤ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫおよびカリブドトキシン（ＣｈＴｘ）に対して非感受性であった。選択的Ｋｖ１．３阻害剤である、ＳｈＫ類似体のＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）（ＰｅｎｎＩｎｇｔｏｎらＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７５，７６２−７７３（２００９））もこのオフターゲット経路を介してラットマスト細胞の脱顆粒を引き起こしたが、マウスまたはヒトマスト細胞は脱顆粒させなかった。ＳｈＫ−１９２（配列番号４３８）は、ラットマスト細胞脱顆粒の誘導において、より大きな２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）分子（ＥＣ_５０約１．６３ｕＭ）よりも大きな効力（ＥＣ_５０約０．２５ｕＭ）を示したが、いずれの分子もヒトまたはマウスマスト細胞の脱顆粒をほとんど示さなかった。ラット腹腔マスト細胞の脱顆粒に対するＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）のマイクロモル濃度のＥＣ_５０は、５０％以上のマスト細胞をインビボで脱顆粒させるためには、高濃度の薬物が必要であり得ることを示している。ラットでの薬物動態実験によれば、このレベルの薬物は大量ボーラス投与後にのみ生じ得る。実際、重症の明白なアナフィラキシー様ショックおよび血管虚脱は、高血清中薬物濃度に達した場合にのみ観察された。ヒトマスト細胞はラットよりも桁違いに感受性が低いと思われ、ヒトにおいてはさらに高い薬物レベルが必要とされる可能性があるため、このことが生じる可能性は低い。それにもかかわらず、Ｋｖ１．３依存性ヒトＴ細胞応答のブロックにおけるＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）の０．１ｎＭというＩＣ_５０は、ラットマスト細胞の活性化におけるそのＥＣ_５０（１０００〜２０００ｎＭ）よりも少なくとも１０，０００低いことから、ヒトのような低感受性の種由来のマスト細胞に対して十分な安全域が存在するであろうと考えられる。

Ｍａｓ関連遺伝子受容体（Ｍｒｇ）は、感覚および疼痛調節において役割を果たすと思われる侵害受容性感覚ニューロンの特定のサブセットにおいて発現されるオーファンＧＰＣＲファミリーとして最初に同定された（Ｄｏｎｇら，Ｃｅｌｌ １０６，６１９−６３２（２００１））。近年、ラットおよびヒトマスト細胞も、ペプチド作動性経路を介して、塩基性分泌促進物質により非ＩｇＥ仲介性のシグナル伝達を可能にする、Ｍａｓ関連ＧＰＣＲファミリーのメンバーを発現することが報告された（Ｔａｔｅｍｏｔｏら，ＢＩｏｃｈｅｍ．ＢＩｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９，１３２２−１３２８（２００６））。ラットマスト細胞が、マスト細胞脱顆粒を誘発するファミリーメンバーＭｒｇＢ３を発現したのに対し、ヒトマスト細胞はファミリーメンバーＭｒｇＸ２を発現した。塩基性分泌促進物質ＭＣＤＰおよびＰ物質は、ヒトおよびラットマスト細胞脱顆粒を誘導するだけでなく、ヒトＭｒｇＸ２およびラットＭｒｇＢ３でトランスフェクトされた細胞を活性化することも示された。塩基性分泌促進物質がマスト細胞の百日咳毒素（ＰＴＸ）感受性経路を介してシグナルを伝達するという以前の観察と一致して、ヒトＭｒｇＸ２を発現する細胞系のＰ物質活性化もＰＴＸ感受性であることが示された。本発明者らは、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）仲介性のラット腹腔マスト細胞脱顆粒がＰＴＸ感受性であることを同様に見出した。したがって、Ｍａｓ関連ＧＰＣＲ（Ｍｒｇ）のファミリーが、ラットマスト細胞に対するＳｈＫおよびＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの種特異的作用に関与するオフターゲットを表すのかもしれない。実際、Ｍａｓ関連ＧＰＣＲファミリーメンバーのメンバーは、種間での低い保存性を示す。ヒトが４つのメンバー（ＭｒｇＸ１、ＭｒｇＸ２、ＭｒｇＸ３、ＭｒｇＸ４）のみを発現するのに対し、ラットはＭｒｇＡ、ＭｒｇＣおよびＭｒｇＤ遺伝子を各１つずつ、ならびに１０のＭｒｇＢ遺伝子を発現する（Ｔａｔｅｍｏｔｏら（同上）；Ｄｏｎｇ（同上）；Ｚｙｌｋａら，ＰＮＡＳ １００，１００４３−１００４８（２００３））。ＭｒｇＢ３が最初、偽遺伝子としてに記載されていた（Ｚｙｌｋａら，（同上））にもかかわらず、Ｔａｔｅｍｏｔｏら（同上）は、この遺伝子が発現されることを見出す。ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）のラットマスト細胞に対する影響およびヒトマスト細胞に対する作用の明らかな欠如は、ラットマスト細胞における独自のＭｒｇ発現パターン、およびヒトゲノムがラットＭｒｇＢ３のホモログを欠くという事実を反映しているのかもしれない。しかし、サルはヒトと同じ４つのＭｒｇＸファミリーメンバーを発現する（ＢｕｒｓｔｅＩｎらＢｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４７，７３−８２（２００６）；Ｚｈａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｒａＩｎ Ｒｅｓ．１３３，１８７−１９７（２００５））ため、ヒトとより関連性のある種である。重要なのは、カニクイザルでの毒物学実験が、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）は、予測されるヒトでの有効投与量の５４〜１９７倍の有効範囲の限界をもたらす投与量で十分に許容性があることを示しているということである（データ不掲載）。

マスト細胞脱顆粒実験のための材料および方法
試薬
ＭＣＤＰをＡｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ社（Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。化合物４８／８０、Ｐ物質、Ａ２３１８７をＳＩｇｍａ社（Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。ＳＴＥＭＰＲＯ−３４ ＳＦＭ完全培地をＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。組換えヒトＳＣＦを社内で調製した。ヒトＩＬ−６をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ＭＩｎｎｅａｐｏｌＩｓ，ＭＮ）から入手した。ヒトＩＬ−３をＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。ヒスタミンＥｌＩｓａキットをＮＥＯＧＥＮ社（ＬｅｘＩｎｇｔｏｎ，ＫＹ）から入手した。Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭグルコース、０．１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を社内で作製した。ＤＩｆｆ ＱｕＩｃｋ ＳｔａＩｎをＤａｄｅ ＢｅｈｒＩｎｇ社（ＮＥＷＡＲＫ，ＤＥ）から入手した。

細胞
末梢血前駆体ＣＤ３４＋細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ、４０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６および３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３を含有するＳＴＥＭＰＲＯ−３４無血清培地中、インビトロで１週間、長期培養することによりヒト末梢血ＣＤ３４＋由来マスト細胞を入手し、次いで１００ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦおよび４０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６のみを含有する同じ無血清培地で約４週間、最終分化させた。最終分化させたマスト細胞を、表面ｃ−ＫＩｔ発現（９５％を超える細胞がｃ−ＫＩｔを発現した、データ不掲載）およびＩｇＥ／抗ＩｇＥ誘導性ヒスタミン放出（総ヒスタミン含有量の約４０％の放出されたヒスタミン、データ不掲載）に関して、フローサイトメトリー解析により判定した。

８週齢の雌Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙまたはＬｅｗＩｓラットから、ラット腹水をＴｙｒｏｄｅ緩衝液中に採取した（ＧＩｌｌｅｓｐＩｅら，ＨＩｓｔａｍＩｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｐｅｒＩｔｏｎｅａｌ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ：ＩｎｈＩｂＩｔＩｏｎ ｂｙ ｃｏｌｃｈＩｃＩｎｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔＩａｔＩｏｎ，１９６８；１５４−１）。８週齢の雌Ｃ５７Ｂ６マウスから、マウス腹水をＴｙｒｏｄｅ緩衝液中に採取した。ＤＩｆｆ ＱｕＩｃｋ ＳｔａＩｎでの染色によりラットおよびマウス腹腔マスト細胞のパーセントを判定した。

ラット血清ヒスタミンの測定
静脈内単回投与または皮下単回投与の雄Ｓｐｒａｇｅ Ｄａｗｌｅｙラット血清試料をＴｙｒｏｄｅ緩衝液中に希釈し、９６ウェルプレート上に播いた。ヒスタミンをＥＬＩＳＡにより定量化した（製造者の説明書に従った）。マイクロプレートリーダーで４５０ｎＭおよび６５０ｎＭにおける吸光度を測定した。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖＩｃｅｓ，ＳＰＥＣＴＲＡ ｍａｃ３４０ｐｃ）。（図３７および図３８）。

マスト細胞脱顆粒の測定
Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液中に採取したラットもしくはマウス腹水、または２００ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦおよび８０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６を含有するＴｙｒｏｄｅ緩衝液中のヒトマスト細胞を、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液中の半対数希釈の対照分子（ＭＣＤＰ、化合物４８／８０、Ｐ物質およびＡ２３１８７）ならびに試験ペプチド（２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１６）、一価ａＫＬＨ Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３３８、３３９、３３８、３４２の四量体）および一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３３７、３４８のヘテロ二量体））と共に、３７℃で１時間、９６ウェルプレート上に播いた（ラットまたはマウス腹腔マスト細胞、４０００〜５０００細胞／ウェル；ヒトマスト細胞、２０，０００細胞／ウェル）。細胞を８００ｒｐｍ、４℃で１５分間、遠心分離した。上清を採取して、放出されたヒスタミンをＥＬＩＳＡにより定量化した。マイクロプレートリーダーで４５０ｎＭおよび６５０ｎＭにおける吸光度を測定した。細胞の総ヒスタミン含有量（０．１％ＴｒＩｔｏｎ Ｘ−１００）および自然放出も測定し、ヒスタミン放出のパーセントを判定した（図３９〜４１）。パーセントヒスタミン放出は、以下の式（ＩＩＩ）：
％ヒスタミン放出＝（被検試料によるヒスタミン放出（ｎｇ／ｍｌ）−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液中でのヒスタミン自然放出（ｎｇ／ｍｌ））／（０．１％ＴｒＩｔｏｎ Ｘ−１００中に溶解した細胞の総ヒスタミン含有量（ｎｇ／ｍｌ）−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液中でのヒスタミン自然放出（ｎｇ／ｍｌ））×１００ （ＩＩＩ）
により計算した。

実施例１１
免疫グロブリン−および／またはＦｃドメイン−毒素ペプチド類似体融合体の発現および精製
一式の二価および一価構造を、本発明の典型的な実施形態のように発現させ、精製した。これには、ＩｇＧ２Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫバリアント（図１２Ａを参照されたい）、ａＫＬＨ ＩｇＧ２／Ｆｃ−ＳｈＫバリアント（図１２Ｅを参照されたい）および抗ＫＬＨ ＩｇＧ２−ＳｈＫバリアント（図１２Ｆ〜１２Ｌを参照されたい）が含まれていた。例えば、その内容全体が参照により組み込まれるＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２および特に、実施例１、２および５６に記載のような、または本明細書で改変されたような組換え法により、二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］、二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］、一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］融合体を作製した。同様の組換え法により、および本明細書でさらに改変されたように、一価の抗キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）免疫グロブリン重鎖−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合抗体（「ａＫＬＨ ＨＣ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ Ａｂ」と命名；図１２Ｆを参照されたい）および一価の抗ＫＬＨ免疫グロブリン軽鎖−［ｌｙｓ１６］ＳｈＫ抗体融合体（「ａＫＬＨ ＬＣ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ Ａｂ」と命名；図１２Ｊを参照されたい）を作製した。

毒素ペプチド類似体−Ｆｃ融合体（「ぺプチボディ」）または他の免疫グロブリン融合体の実施形態を作製するために使用する一過性発現系
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を、３ＬのＦｅｒｎｂａｃｈ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内で、Ｌ−グルタミン（６ｍＭ）およびジェネテシン（２５μｇ／ｍｌ）を添加したＦ１７培地中、３７℃、５％ＣＯ_２で２ｅ５〜１．２ｅ６細胞／ｍｌの間で維持し、６５ＲＰＭで振盪した。トランスフェクション時に、最終培養体積の９０％の上記Ｆ１７培地中、細胞を１．１×１０^６細胞／ｍＬまで希釈した。ＤＮＡ複合体を、最終培養体積の１０％のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地中で調製した。ＤＮＡ複合体には、培養物１リットル当たり５００ｕｇの総ＤＮＡおよび培養物１リットル当たり１．５ｍｌのＰＥＩｍａｘが含まれる。成分を加えたら、ＤＮＡ複合体を短時間振盪し、室温で１０〜２０分間インキュベートした後、細胞培養物に添加して、恒温器内に戻す。トランスフェクションの翌日、トリプトンＮ１（５ｇ／Ｌ）を液体２０％ストックから培養物に添加した。トランスフェクションの６日後、培養物を４，０００ＲＰＭで４０分間遠心分離して細胞をペレット化し、その培養培地を０．４５ｕｍフィルターを通して回収した。

ＤＮＡ複合体調製の際に、プラスミドの比は、意図する生成物を生成するのに必要なペプチドの所望のモル濃度比に比例していた。ＩｇＧ２Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫの構成要素として、ＩｇＧ２ＦｃとＩｇＧ２Ｆｃ−ＳｈＫが１：１の比で含まれる。発現の間に、これらが会合してＩｇＧ２Ｆｃホモ二量体、ＩｇＧ２Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫヘテロ二量体およびＩｇＧ２Ｆｃ−ＳｈＫホモ二量体となる。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製の間に、ＩｇＧ２Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫヘテロ二量体（一価型）が単離された。

ＩｇＧ２Ｆｃ−ＳｈＫ［２−３５］；ＩｇＧ２Ｆｃ Ｓｈｋ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］；ＩｇＧ２Ｆｃ−Ｓｈｋ［１−３５］；ＩｇＧ２Ｆｃ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］の哺乳動物での発現
Ｋｖ１．３阻害ペプチドＳｈＫ［２−３５］または変異ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］の単量体とインフレームで融合されたヒトＩｇＧ２の免疫グロブリンＦｃドメイン：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号３３７）
をコードするＤＮＡ配列を、標準的なＰＣＲ技術を用いて構築した。分子のＳｈＫ［２−３５］またはＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］および１０アミノ酸リンカー部分を、鋳型としてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩ中の原型Ｆｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［１−３５］を用いてＰＣＲ反応において生成した（ＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号，実施例２，図１５Ａ〜１５Ｂを参照されたい）。ＳｈＫ［１−３５］を、鋳型としてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩ中の原型Ｆｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［１−３５］を用いてＰＣＲ反応において生成した（ＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号，実施例２，図１４Ａ〜１４Ｂ）。これらのＳｈＫ構築物は、以下のオリゴ：
５’−ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＧＧ−３’（配列番号３１９）；および
５’−ＣＡ ＣＧＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＣＣ−３’（配列番号３２０）
を有するｐＳｅｌｅｘＩｓ−Ｖｈ２１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ鋳型から生成された、以下の改変ＶＨ２１シグナルペプチドアミノ酸配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ／／配列番号３１８を有する。

Ｎ末端リンカー伸長を有する野生型ＳｈＫ［２−３５］（アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号３２２）は、以下のＤＮＡ配列：
ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣ／／（配列番号３２１）
によりコードされていた。このコード配列（配列番号３２１）を含むフラグメントを、下のオリゴ（配列番号３２３および配列番号３２４）ならびに鋳型としてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩ中の原型Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を用いて生成した（参照により組み込まれる、ＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号，実施例２，図１５Ａ〜１５Ｂ）：
５’−ＧＴＣ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＣ Ｃ−３’（配列番号３２３）；および
５’−ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＡＧ−３’／／（配列番号３２４）。

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕＩｋＣｈａｎｇｅ ＭｕｌｔＩ ｓＩｔｅ−ＤＩｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓＩｓキット（カタログ番号２００５３１）を製造者の説明書に従い使用して、変異体ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］を生成した。突然変異誘発を生じさせるために使用したオリゴは：
５’−ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＧ ＣＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣ ３’（配列番号３２５）；および
５’−ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＣ−３’（配列番号３２６）；
であり、鋳型としてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩ中の原型Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を用いて（ＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号，実施例２，図１５Ａ〜１５Ｂ）、アミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号３２８）
をコードするＤＮＡコード配列
ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣ／／（配列番号３２７）
を得た。

ＳｈＫ［１−３５］ＷＴフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩ中の原型Ｆｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［１−３５］（ＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号，実施例1，図１４Ａ〜１４Ｂ）を鋳型として、ならびに以下のオリゴ：
５’−ＧＴＣ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＣ Ｃ−３’（配列番号３２３）；および
５’−ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＡＧ−３’（配列番号３２４）
を用いて生成した。

ＩｇＧ２Ｆｃ領域を以下のオリゴ：
５’−ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＡ Ｇ−３’（配列番号３２９）；および
５’−ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＡＧ ＣＡＧ ＧＴＧ−３’（配列番号３３０）
ならびにアミノ酸配列
ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３３２）
をコードする以下のＤＮＡコード配列：
ＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ／／配列番号３３１
を含むフラグメントを生じるｐＳｅｌｅｘＩｓ Ｖｈ２１−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ鋳型を用いて生成した。

ＰＣＲフラグメントを生成し、産物をゲル上で泳動させた。ゲル精製の後、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲチューブにまとめて入れ、外側プライマー：
５’−ＣＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＧＧ−３’（配列番号３１９）；および
５’−ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＡＧ ＣＡＧ ＧＴＧ−３’（配列番号３３０）
で繋ぎ合わせた。

ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、ゲル精製キットによりアガロースゲル精製した。同時に、ｐＴＴ１４（ＣＭＶプロモーター、ポリＡテールおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎ社のベクター）をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、大フラグメントをゲル精製キットにより精製した。各精製ＰＣＲ産物を大フラグメントに連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には各構築物の１クローンのみを選択した。最終的なｐＴＴ１４−ＶＨ１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ構築物は、以下の配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３４５）
を有するＩｇＧ２−Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）融合ポリペプチドをコードしていた。

ｐＴＴ１４−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ−ＳｈＫ２−３５Ｑ１６Ｋ構築物は、ＩｇＧ２−Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５，Ｑ１６Ｋ）融合ポリペプチド配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／配列番号３４６
をコードし；
ｐＴＴ１４−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ ＳｈＫ１−３５構築物は、以下の配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３３４）
を有するＩｇＧ２Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）融合ポリペプチドのコード配列を含んでいた。

ｐＹＤ１６（ＣＭＶプロモーター、ポリＡテールおよびヒグロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎ社のベクター）中でのＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃのみの構築物生成は、以下のように行った：ＶＨ２１シグナルペプチドを以下のオリゴ：
５’−ＣＡＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＧＣ ＴＧＧ−３’（配列番号３３５）；および
５’−ＣＡ ＣＧＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＣＣ−３’（配列番号３２０）
用いて、ならびに上記のｐＳｅｌｅｘＩｓ鋳型を用いて生成した。

Ｆｃ領域を、上記のｐＳｅｌｅｘＩｓ鋳型ならびに以下のオリゴ：
５’−ＧＴＣ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＣ Ｃ−３’（配列番号３２３）；および
５’−ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ−３’（配列番号３３６）
を用いて生成した。

ＰＣＲフラグメントをゲル精製し、外側プライマー配列番号３３５および配列番号３３６を用いた１回のＰＣＲ反応で繋ぎ合わせた。得られたＰＣＲフラグメントをゲル精製し、ＨＩｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより消化した。同時に、ｐＹＤ１６ベクター（ＣＭＶプロモーター、ポリＡテールおよびヒグロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎ社のベクター）もＨＩｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩにより切断し、大ベクターフラグメントをＱＩａｇｅｎ社のゲル精製キットにより精製した。精製ＰＣＲ産物を大フラグメントに連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＨＩｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には各構築物の１クローンのみを選択した。最終的なｐＹＤ１６−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ構築物は、ヒトＩｇＧ２−Ｆｃ（上記配列番号３３７）をコードしていた。

免疫化
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスを、４週間の期間にわたりＤＮＰ−ＫＬＨで免疫化することにより、およびＤＮＰ−リジンと結合する抗体に関してスクリーニングすることにより、抗ＤＮＰ抗体を作製した。より具体的には、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＸＭＧ２系統のマウスを、概略的には既に記載されているように作製し（その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（１９９７）；公開されている国際特許出願第９８／２４８９３号および第００／７６３１０号）、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の最初の免疫化では、その開示がすべて参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第９８／２４８９３号および第００／７６３１０号に開示されている方法に従って、ＴＩｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント（ＳＩｇｍａ−ＡｌｄｒＩｃｈ，ＯａｋｖＩｌｌｅ，ＯｎｔａｒＩｏ）中に乳化した１０〜３０μｇ／マウスの範囲の免疫原を用いて、２，４−ジニトロフェニル−キーホールリンペットヘモシアニン（ＤＮＰ−ＫＬＨコンジュゲート；ＢＩｏＳｅａｒｃｈ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＩｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で免疫化した。最初の免疫化の後、それに続く追加免疫の免疫原（５〜２０μｇ／マウス）を、定期的に、かつマウスにおいて適当な抗ＤＮＰ力価をもたらすのに必要な期間の間、投与した。固定化ＤＮＰ−ＢＳＡ（ＢＩｏＳｅａｒｃｈ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＩｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を用いた酵素免疫測定により力価を判定し、最終的なＤＮＰ：ＢＳＡモル濃度比が３０：１になるように、このコンジュゲートを調製した。

抗ＫＬＨ抗体を産生させるための免疫化を、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）ＭａｒＩｃｕｌｔｕｒｅ Ｋｅｙｈｏｌｅ ＬＩｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎＩｎ（ｍｃＫＬＨ；ＰＩｅｒｃｅ ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；カタログ番号７７６００，ロット番号Ｂ１４４０９５Ｂ）を用いて、４週間にわたり行った。免疫化は、マウス１匹当たり、リン酸アルミニウムゲルアジュバント（ＨＣＩ ＢＩｏｓｅｃｔｏｒ，ＦｒｅｄｅｒＩｋｓｓｕｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ；カタログ番号１４５２−２５０）中１０μｇのＫＬＨを用いて行い、足蹠注射により投与した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＸＭＧ１Ｋ系統の最初の免疫化は、既に開示されている方法（その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６（１９９７）；公開されている国際特許出願第９８／２４８９３号および第００／７６３１０号）に従った。最初の免疫化の後、それに続く追加免疫の免疫原（５〜１０μｇ／マウス）を、定期的に、かつマウスにおいて適当な抗ＫＬＨ力価をもたらすのに必要な期間の間、投与した。固定化ＫＬＨ（ＰＩｅｒｃｅ ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いた酵素免疫測定により力価を判定した。

モノクローナル抗体の調製
適当な力価を示すマウスを特定し、流入領域リンパ節および脾臓からリンパ球および脾細胞を採取し、次いで、各コホート用にプールした。適当な培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地；ＤＭＥＭ；ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で粉砕することにより、Ｂ細胞を組織から解離させて、細胞を組織から遊離させ、ＤＭＥＭ中に懸濁させた。Ｂ細胞を標準的な方法を用いて選択および／または拡大し、当該技術分野で公知の技術を用いて適当な融合パートナー、例えば、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡｍｅｒＩｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔＩｏｎ ＣＲＬ１５８０；Ｋｅａｒｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−１５５０（１９７９））と融合した。

Ｂ細胞を融合パートナー細胞と１：４の比で混合した。細胞混合物を４００×ｇで４分間、遠心分離により穏やかにペレット化して、上清をデカントし、細胞混合物を１ｍｌピペットを用いて穏やかにかき混ぜた。融合をＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド；ＳＩｇｍａ−ＡｌｄｒＩｃｈ社，Ｓｔ．ＬｏｕＩｓ ＭＯから入手；リンパ球１００万個当たり１ｍｌ）で誘導した。ＰＥＧ／ＤＭＳＯを、穏やかに撹拌しながら１分間かけてゆっくりと加えた後、１分間かき混ぜた。次いで、ＩＤＭＥＭ（グルタミンを含まないＤＭＥＭ；Ｂ細胞１００万個当たり２ｍｌ）を、穏やかに撹拌しながら２分間かけて加えた後、追加のＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当たり８ｍｌ）を３分間かけて加えた。

融合細胞を穏やかにペレット化し（４００×ｇ、６分）、Ｂ細胞１００万個当たり２０ｍｌの選択培地（例えば、アザセリンおよびヒポキサンチン［ＨＡ］および他の補助物質を必要に応じて含有するＤＭＥＭ）中に再懸濁させた。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、次いで、２００ｍｌの選択培地中に再懸濁させ、Ｔ１７５フラスコ内で３〜４日間培養した後、９６ウェルに播いた。

標準的技術を用いて細胞を９６ウェルプレート内に分配し、得られるコロニーのクローン性を最大化した。培養の数日後、ハイブリドーマ上清を回収し、それぞれＫＬＨまたはＤＮＰとの結合確認を含めた、下の実施例に詳述されているようなスクリーニングアッセイに供した。陽性細胞をさらに選択し、標準的なクローニングおよびサブクローニング技術に供した。クローン系をインビトロで拡大し、分泌されたヒト抗体を解析用に採取した。ＤＮＰ−特異的抗体を分泌するいくつかの細胞系が得られ、抗体をさらに特徴付けた。それらの配列を本明細書および配列表に記載し、これらの抗体を用いた様々な試験の結果を記載する。

組換えモノクローナル抗体作製のための一過性発現
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において一過性トランスフェクションを以下のように行った。エプスタイン・バーウイルス核抗原−１を安定に発現するヒト胎児腎２９３細胞系を国家研究会議（ＮａｔＩｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃＩｌ）（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。細胞を、６ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１．１％Ｆ−６８プルロニック（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および２５０μｇ／ｕｌジェネテシン（ＩｎｖＩｔｒＩｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加したＦ１７培地（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、無血清懸濁培養物として維持した。懸濁細胞培養物をＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコ培養で維持した。培養フラスコは、加湿した、５％ＣＯ_２の雰囲気中、３７℃、６５ｒｐｍで振盪した。２５−ｋＤａの直線状ＰＥＩ（ＰｏｌｙｓｃＩｅｎｃｅｓ，ＷａｒｒＩｎｇｔｏｎ，ＰＡ）のストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を水中で調製し、溶解するまでＨＣｌでｐＨ２．０に酸性化し、次いで、ＮａＯＨで中和し、ろ過（０．２μｍ）により滅菌し、分注して、使用するまで−２０℃で保管した。トリプトンＮ１をＯｒｇａｎｏＴｅｃｈｎＩ Ｓ．Ａ．社（ＴｅｋｎＩＳｃＩｅｎｃｅ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。ストック溶液（２０％，ｗ／ｖ）をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｍ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で調製し、０．２μｍフィルターによるろ過で滅菌し、使用するまで４℃で保管した。通常、トランスフェクションは１Ｌのスケールで行った。細胞（２９３−６Ｅ）を１．１×１０６の生細胞密度まで増殖させ、次いで、トランスフェクション複合体を最終培養体積の１／１０の体積で調製した。１Ｌのトランスフェクション培養物用に、トランスフェクション複合体を１００ｍｌのＦ１７基本培地中で調製し、５００μｇのプラスミドＤＮＡ（重鎖および軽鎖ＤＮＡ、１：１の比）を最初に１００ｍｌのＦ１７培地中に希釈した。５分間の室温でのインキュベーション後、１．５ｍｌのＰＥＩ溶液を加えた。複合体を穏やかにボルテックスし、次いで、室温で１５分間インキュベートした。振盪フラスコ培養中の細胞にトランスフェクション複合体を添加することにより、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、トリプトンＮ１をトランスフェクトされた培養物に０．５％の最終濃度になるまで加え、トランスフェクトされた培養物を、加湿した、５％ＣＯ_２の雰囲気中、３７℃、６５ｒｐｍの振盪器上で５日間維持した後、それらを回収した。訓化培地を４０００ｒｐｍでの遠心分離により回収し、次いで、０．２μｍフィルター（ＣｏｒｎＩｎｇ Ｉｎｃ．）によるろ過で滅菌した。

ＣＨＯ ｄ−宿主細胞を標準的なエレクトロポレーション法を用いて、発現プラスミドｐＤＣ３２３抗ＫＬＨ１２０．６カッパＬＣおよびｐＤＣ３２４抗ＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２ＨＣでトランスフェクトすることにより、安定に発現されるａＫＬＨ１２０．６対照抗体プールを作出した。トランスフェクション後に、細胞を無血清ＧＨＴ選択増殖培地中のプールとして増殖させ、プラスミド含有細胞の選択および回収を可能にした。ＧＨＴ選択培地で増殖させた細胞プールを、それらが８５％を超える生存率に達するまで培養した。選択された細胞プールを１５０ｎＭおよび３００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で増幅した。８５％を超える生存率に達したら、１５０ｎＭのプールをさらに５００ｎＭのＭＴＸ中で再増幅した。ＭＴＸ増幅プールの生存率が８５％を超える生存率に達したとき、補強した産生培地で、簡略化した６日間のバッチ産生アッセイを用いてプールをスクリーニングし、発現を評価した。増幅プールの発現は、１２０〜４００μｇ／ｍＬの範囲であった。最良のプールを６日間のアッセイに基づいて選択し、１０日間のフェドバッチ法を用いてスケールアップした。馴化培地を回収して精製し、解析用のタンパク質を得た。

ＣＨＯ ｄ−宿主細胞を標準的なエレクトロポレーション法を用いて、発現プラスミドｐＤＣ３２３抗ＫＬＨ１２０．６カッパＬＣおよびｐＤＣ３２４抗ＫＬＨ１２０．６−ＩｇＧ２ＨＣでトランスフェクトすることにより、安定に発現されるａＫＬＨ１２０．６抗体プールを作出した。トランスフェクション後に、細胞を無血清ＧＨＴ選択増殖培地中のプールとして増殖させ、プラスミド含有細胞の選択および回収を可能にした。ＧＨＴ選択培地で増殖させた細胞プールを、それらが８５％を超える生存率に達するまで培養した。選択された細胞プールを１５０ｎＭおよび３００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で増幅した。８５％を超える生存率に達したら、１５０ｎＭのプールをさらに５００ｎＭのＭＴＸ中で再増幅した。ＭＴＸ増幅プールの生存率が８５％を超える生存率に達したとき、補強した産生培地で、簡略化した６日間のバッチ産生アッセイを用いてプールをスクリーニングし、発現を評価した。増幅プールの発現は、１２０〜４００μｇ／ｍＬの範囲であった。最良のプールを６日間のアッセイに基づいて選択し、１０日間のフェドバッチ法を用いてスケールアップした。馴化培地を回収して精製し、解析用のタンパク質を得た。

ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）宿主細胞を標準的なエレクトロポレーション法を用いて、対応する重鎖および軽鎖発現プラスミドのセットでトランスフェクトすることにより、ａＤＮＰ３Ａ４抗体安定発現プールを作出した。各抗体分子当たり、３〜４つの異なるトランスフェクションを行い、複数のプールを作製した。トランスフェクション後に、細胞を無血清ＧＨＴ選択増殖培地中のプールとして増殖させ、プラスミド含有細胞の選択および回収を可能にした。ＧＨＴ選択培地で増殖させた細胞プールを、それらが８５％を超える生存率に達するまで培養した。選択された細胞プールを１５０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で増幅した。メトトレキサート増幅プールの生存率が８５％を超える生存率に達したとき、補強した産生培地で、簡略化した６日間のバッチ産生アッセイを用いてプールをスクリーニングし、発現を評価した。６日間のアッセイ力価および正確な質量確認に基づき、最良のプールを選択した。

抗体の精製および選択
Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅクロマトグラフィー（ＧＥ ＬＩｆｅ ＳｃＩｅｎｃｅｓ）により、洗浄緩衝液として二価陽イオンを含まない８カラム体積のＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ、および溶出緩衝液として７℃の１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）を用いて、抗体を精製した。クロマトグラムに基づいて溶出ピークをプールし、２Ｍ ＴｒＩｓ塩基を用いてｐＨを約５．０まで上げた。次いで、プールを少なくとも３倍体積の水で希釈し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターによりろ過し、次いで、ＳＰ−ＨＰセファロースカラム（ＧＥ ＬＩｆｅ ＳｃＩｅｎｃｅｓ）上に負荷し、１０カラム体積のＳ−緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で洗浄した後、２０カラム体積の、５０％までの勾配の７℃のＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を用いて溶出した。クロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に基づきプールを作製し、次いで、材料を約７倍に濃縮し、３０ｋＤａ膜を有するＶＩｖａＦｌｏｗ ＴＦＦカセットを用いて、約５倍体積の１０ｍＭ酢酸、９％スクロース、ｐＨ５．０に対して透析ろ過した。次いで、透析した材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターによりろ過し、２８０ｎＭでの吸光度により濃度を判定した。

ＩｇＧ２−Ｆｃ ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］の哺乳動物での発現
ＤＮＡ ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］構築物を用いて、ＤＮＡコード配列
ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣ／／（配列番号４３６）
を含むフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩを用いて切断した。このコード配列（配列番号４３６）は、Ｎ末端リンカー配列を有するＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）：
ＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４３７）
をコードする。

同時に、ｐＴＴ１４−ｈＩｇＧ２−Ｆｃ−ＳｈＫ［１−３５］ＷＴ構築物もＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩで消化することにより、Ｓｈｋ［１−３５］コード領域を除去し、アミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧ／／（配列番号３９２）
をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ／／（配列番号３９１）
を得た。

ＳｈＫを除去したｐＴＴ１４−ｈＩｇＧ２−Ｆｃベクターを、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５’リン酸基を除去し、フェノール／クロロホルム抽出を行って、ベクターのそれ自体との再連結を防止した。挿入ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］フラグメントをそのベクターからゲル精製により取り出し、ＱＩａｇｅｎ社のゲル精製キットでクリーンアップした。精製挿入物を大ベクターフラグメントに連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＢａｍＨＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には１クローンのみを選択した。最終的なｐＴＴ１４−ＩｇＧ２−Ｆｃ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］構築物は、以下のＩｇＧ２Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）融合タンパク質配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３４８）
をコードしていた。

抗ＫＬＨ免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）毒素ペプチド（および毒素ペプチド類似体）融合体の哺乳動物での発現
ａＫＬＨ ＩｇＧ２／Ｆｃ−ＳｈＫ（図１２Ｅで模式的に表される）の構成要素には、以下のものが含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号３３８）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号３３９；および
（ｃ）ＩｇＧ２Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３４０）。

所望のａＫＬＨ ＩｇＧ２／Ｆｃ−ＳｈＫ産物は、図１２Ｅにおいて構成されるように、すぐ上の各構成要素（ａ）〜（ｃ）の１コピーを含んでいた。このため、その比は１：１：１であった。この産物は、Ｆｃドメインで結合された半抗体と半Ｆｃの融合体（「ヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）」）と言い表すことができる。培養物から除去しなければならない、さらなるペプチド集合体は、ａＫＬＨ ＡｂおよびＦｃ−ＳｈＫホモ二量体であった。

ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ融合抗体（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下のものが含まれる：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８、上記）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９、上記）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３４１）。

ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下のものが含まれる：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８、上記）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９、上記）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３４２）。

一価ａＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合抗体（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれる：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｃ）以下のアミノ酸配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳＣＡＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４６２）。

所望の一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ類似体産物は、１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体および二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体である。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−毒素ペプチド融合体を含有する抗体を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

一価ａＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合抗体（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＥＴＣＧＴＣ／／（配列番号４６３）。

所望の一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ類似体Ａｂ産物は、１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体および二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体である。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−毒素ペプチド融合体を含有する抗体タンパク質を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

一価ａＫＬＨ１２０．６ＨＣ（ＩｇＧ２）−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれる：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｃ）以下のアミノ酸配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＨＣ ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＳＣＡＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４６４）。

所望の一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ類似体産物は、１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫペプチド類似体の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂおよび二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂである。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−毒素ペプチド融合体を含有するＡｂタンパク質を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

一価ａＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合Ａｂ（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＥＴＣＧＴＣ／／（配列番号４６５）。

所望の一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ類似体Ａｂ産物は、１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫペプチド類似体の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂおよび二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂである。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−毒素ペプチド融合体を含有するＡｂタンパク質を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

一価ａＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＨＣ（ＩｇＧ２）−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＳＣＡＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４６６）。

所望の一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ類似体Ａｂ産物は、１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫペプチド類似体の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂおよび二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂである。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−毒素ペプチドド融合体を含有するＡｂタンパク質を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

一価ａＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合Ａｂ（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｃ）以下のアミノ酸配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＥＴＣＧＴＣ／／（配列番号４６７）。

所望の一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫ類似体Ａｂ産物は、１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫペプチド類似体の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２抗体、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂおよび二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−ＳｈＫペプチド類似体Ａｂである。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−毒素ペプチド融合体を含有するＡｂタンパク質を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｆに模式的に表される）の構成要素には、以下のものが含まれる：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８、上記）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９、上記）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３８７）。

所望のａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ Ａｂ産物は、図１２Ｆのように構成される、１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫペプチド類似体の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ Ａｂおよび二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−ＳｈＫ Ａｂである。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２−毒素ペプチド（または毒素ペプチド類似体）融合体を含有するＡｂを、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

ａＫＬＨ ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ Ａｂも１つの重鎖内に挿入されたＳｈＫペプチド配列の単一コピーを有していたが、この場合それはＣ末端においてではなく、Ｆｃドメイン内の内部コンジュゲーション部位内に挿入されていた。（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｇｇら，米国特許第７，４４２，７７８号；米国特許第７，６５５，７６５号；米国特許第７，６５５，７６４号；米国特許第７，６６２，９３１号；米国特許第７，６４５，８６１号；公開されている米国特許出願公開第２００９／０２８１２８６号；および同第２００９／０２８６９６４号を参照されたい）。ａＫＬＨ ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ Ａｂの構成要素には、以下のものが含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８、上記）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１ＨＣ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号３４３）；および
（ｃ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＧＧＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号３４４）。

２つの異なる重鎖が１つの軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖：重鎖−ＳｈＫの比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１、一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ Ａｂおよび二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ Ａｂである。一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ１−ループ−ＳｈＫ Ａｂ（図１２Ｎにより模式的に表される）を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

一価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体
一価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｊに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４３９）。
一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ産物のこの実施形態は、図１２Ｊに示されるように、１つの軽鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる軽鎖が１種類の重鎖を共有しているため、軽鎖：重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２、一価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂおよび二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂである。一価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−毒素ペプチド融合体を含有するＡｂを、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

一価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体
一価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｊに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ（配列番号３３８）；および
（ｃ）以下の配列を有するａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４４０）。
一価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ産物のこの実施形態は、図１２Ｊに示されるように、１つの軽鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる軽鎖が１種類の重鎖を共有しているため、軽鎖：重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２、一価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂおよび二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂである。一価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−毒素ペプチド融合体を含有するＡｂを、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

二価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体
二価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｋに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体（配列番号４３９）、上記。
二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ産物のこの実施形態は、図１２Ｋに示されるように、両方の軽鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］の比は１：１であった。予想される発現産物は、二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂである。二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］ペプチド融合体を含有するＡｂを、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

二価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体
二価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｋに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；および
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体（配列番号４４０）、上記。
二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ産物のこの実施形態は、図１２Ｋに示されるように、両方の軽鎖のＣ末端と融合したＳｈＫペプチドを有する完全抗体であった。重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］の比は１：１であった。予想される発現産物は、二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂである。二価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］ペプチド融合体を含有するＡｂを、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

三価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体
三価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｌに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９、上記）；
（ｂ）配列番号３４２のアミノ酸を有するａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体、上記；および
（ｃ）配列番号４３９のアミノ酸配列を有するａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体、上記。
三価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ Ａｂ産物のこの実施形態は、図１２Ｌに示されるように、両方の軽鎖および１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］ペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］：重鎖−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ、三価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂおよび四価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂであった。三価ＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−毒素ペプチド融合体を含有するＡｂを、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

三価ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体
三価ＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合Ａｂ（図１２Ｌに模式的に表される）の構成要素には、以下の単量体が含まれていた：
（ａ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ（配列番号３３９）；
（ｂ）ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＨＣ−Ｓｈｋ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体（配列番号３８７）、上記；および
（ｃ）ａＫＬＨ１２０．６カッパＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合体（配列番号４４０）、上記。
三価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ産物のこの実施形態は、図１２Ｌに示されるように、両方の軽鎖および１つの重鎖のＣ末端と融合したＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］ペプチドを有する完全抗体であった。２つの異なる重鎖が１種類の軽鎖を共有しているため、重鎖：軽鎖−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］：重鎖−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］の比は１：２：１であった。予想される発現産物は、二価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂ、三価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂおよび四価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］Ａｂであった。三価ａＫＬＨ１２０．６ＩｇＧ２ＬＣ−毒素ペプチド融合体を含有するＡｂタンパク質を、本明細書に記載のように、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて混合物から単離した。

抗ＫＬＨ１２０．６抗体軽鎖の哺乳動物での発現
ａＫＬＨモノクローナル抗体１２０．６を発現するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ハイブリドーマを供給源として使用し、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。伸長アダプターである５’−ＧＧＣ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＡＮ ＮＮＮ ＮＮＴ−３’（配列番号３４９）を有するランダムプライマープライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）を用いて５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を行った。軽鎖配列決定用には、順方向プライマーが５’−ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＴＣＣ−３’（配列番号３５０）であり、逆方向プライマーが５’−ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡ−３’（配列番号３５１）であった。ＲＡＣＥ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、配列を決定した。コンセンサス配列を用いて、可能性のあるフレームワークおよびシグナルペプチド配列を決定し、完全長抗体鎖のＰＣＲ増幅用のプライマーを設計した。

抗ＫＬＨ１２０．６カッパ軽鎖の発現クローンをＰＣＲにより調製した。５’ＰＣＲプライマーは、シグナル配列のアミノ末端、ＳａｌＩ制限酵素部位および最適化Ｋｏｚａｋ配列５’−AＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号３５２）をコードしていた。３’プライマーは、カルボキシル末端および終止コドン、ならびにＮｏｔＩ制限部位５’−ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡ−３’（配列番号３５１）をコードしていた。得られた産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、配列を決定した。挿入を確認した後、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ産物をＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断し、挿入物をゲルで単離してＱＩａｇｅｎで精製し、次いで哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５内に連結した。

ＰＣＲを行って、ハイブリドーマに由来する天然ペプチド由来のシグナルペプチドをＶＫ１／Ｏ１２ペプチドに変化させた。ＶＫ１／Ｏ１２フラグメント用に使用したプライマーは、５’−ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ−３’（配列番号３５３）および５’−ＴＣＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＧＴ ＣＡＣ ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ Ｃ−３’（配列番号３５４）であった。成熟軽鎖ペプチド用に使用したプライマーは、５−ＧＧＴ ＧＣＣ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＴＧ Ａ−３’（配列番号３５５）および（配列番号３５１）であった。得られたフラグメントを、配列番号３５３および配列番号３５１のプライマーを用いたオーバーラップＰＣＲにより結合した。得られたクローンの配列は、以下の免疫グロブリンカッパＬＣ配列をコードする：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号３３８）。

抗ＫＬＨ１２０．６抗体軽鎖−ＳｈＫペプチド類似体の哺乳動物での発現
上記の（配列番号３４８）をコードするｐＴＴ１４−ｈｕＩｇＧ２−Ｆｃ ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］を鋳型として、ならびに以下のオリゴ：
５’−ＡＡＣ ＡＧＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＡ Ｇ−３’（配列番号４４１）；および
５’−ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＡＧ ＣＡＧ Ｇ−３’（配列番号４４２）を用いて、ＰＣＲによりＳｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］フラグメントを生成した。

次いで、軽鎖フラグメントおよびＳｈＫのＰＣＲ産物を、外側プライマー配列番号：ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ／／（配列番号４８２）および配列番号４４２を用いてＰＣＲにより増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより消化し、ＰＣＲクリーンアップキット（ＱＩａｇｅｎ）で精製した。同時に、ｐＹＤ１６をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＹＤ１６ベクターを１％アガロースゲル上で泳動し、大きい方のフラグメントを切り出して、ＱＩａｇｅｎ社のゲル精製キットでゲル精製した。精製ＰＣＲ産物を大ベクターフラグメントと連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には１クローンのみを選択した。最終的なｐＹＤ１６−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］構築物は、ａＫＬＨ１２０．６ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号４３９）をコードしていた。

ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６ＨＣ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］を鋳型として、ならびに配列番号４４１および配列番号４４２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｓｈｋ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］フラグメントを上記のように生成した。

軽鎖およびＳｈＫのＰＣＲ産物を、配列番号４８２および配列番号４４２の外側プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより消化し、ＰＣＲクリーンアップキット（ＱＩａｇｅｎ）で精製した。同時に、ｐＹＤ１６をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＹＤ１６ベクターを１％アガロースゲル上で泳動し、大きい方のフラグメントを切り出して、ＱＩａｇｅｎ社のゲル精製キットでゲル精製した。精製ＰＣＲ産物を大ベクターフラグメントと連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には１クローンのみを選択した。最終的なｐＹＤ１６−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］構築物は、ａＫＬＨ ＬＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号４４０）をコードしていた。

ＫＬＨ−ＩｇＧ２重鎖−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］およびａＫＬＨ−ＩｇＧ２重鎖−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］の哺乳動物での発現
ａ−ＫＬＨ−ＩｇＧ２重鎖領域を、オリゴ
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ−３’（配列番号３９３）；および
５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＡＧ Ｇ−３’（配列番号３５８）
を用いて、ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２重鎖（配列番号３５７；下記）をコードするコード配列（配列番号３５６；；下記）を含むｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２重鎖（ＨＣ）構築物からＰＣＲにより増幅した：
アミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号３５７）
をコードする
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ／／（配列番号３５６）。

ＳｈＫ［１−３５］ＷＴフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩ中の原型Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］を鋳型として（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＳｕｌｌＩｖａｎら，ＴｏｘＩｎ ＰｅｐｔＩｄｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔＩｃ Ａｇｅｎｔｓ，国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２２８３１号の実施例１、図１４Ａ〜１４Ｂに記載）、ならびに以下のオリゴ：
５’−ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＡ Ｇ−３’（配列番号３５９）；および
５’−ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＡＧ ＣＡＧ ＧＴＧ−３’（配列番号３３０）
を用いて生成した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動した。バンドをアガロースプラグ用に切り取り、このプラグを新たなＰＣＲ反応チューブに入れた。次いで、配列番号３５７および配列番号３３０の外側プライマーを用いて、ＰＣＲによりアガロースプラグを増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより消化し、ＰＣＲクリーンアップキット（ＱＩａｇｅｎ）で精製した。同時に、ｐＴＴ５ベクター（ＣＭＶプロモーターおよびポリＡテールを含むＡｍｇｅｎ社のベクター）をＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断した。ｐＴＴ５ベクターを１％アガロースゲル上で泳動し、大きい方のフラグメントを切り出して、ＱＩａｇｅｎ社のゲル精製キットでゲル精製した。精製ＰＣＲ産物を大ベクターフラグメントと連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には１クローンのみを選択した。最終的なｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］構築物は、アミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３９４）
を有するＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］融合ポリペプチドをコードしていた。

この構築物のＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］変異体型を生成するために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕＩｋＣｈａｎｇｅ ＭｕｌｔＩ ｓＩｔｅ−ＤＩｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓＩｓキット（カタログ番号２００５３１）を製造者の説明書に従って、ならびにオリゴ：
５’−ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＧ ＣＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣ−３’（配列番号３２５）；および
５’−ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＣ−３’（配列番号３２６）
を用いて、部位特異的変異誘発を行った。最終的な構築物ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］は、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３３３）
を有するＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチドをコードしていた。

ａＫＬＨ−ＩｇＧ２重鎖−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］の哺乳動物での発現
ＤＮＡ構築物ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］をベクターして使用し、ＳｈＫ［１−３５］をＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩを用いて切り出した。ＳｈＫ［１−３５］を含まないｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ由来のベクターフラグメントは、
アミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧ／／（配列番号４００）
をコードするコード配列：
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡ／／（配列番号３９９）
を含んでいた。次いで、ベクターフラグメントを、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５’リン酸基を除去し、フェノール／クロロホルム抽出を行って、ベクターのそれ自体との再連結を防止した。挿入物は、ＩｇＧ２Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５，Ｑ１６Ｋ）：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＲＫＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３４６）
をコードするｐＴＴ１４−ＶＨ２１ＳＰ−ＩｇＧ２−Ｆｃ−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］由来であり、この挿入物もＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩを用いた消化により切り出した。挿入ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］フラグメントをそのベクターからゲル精製により取り出し、ＱＩａｇｅｎ社のゲル精製キットでクリーンアップした。アミノ酸配列
ＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（配列番号３９８）
をコードするコード配列
ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＡＡ ＴＧＡ ／／（配列番号３９７）
を含む精製ＤＮＡ挿入物を大ベクターフラグメントと連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＢａｍＨＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には１クローンのみを選択した。最終的な構築物ｐＴＴ５−ａＫＬＨ−ＩｇＧ２ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］は、ＩｇＧ２ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５，Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４０１）
をコードしていた。

Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］フラグメントを、ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｑ１６Ｋ］を鋳型として、ならびにオリゴ：
５’− ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＣＣ Ｃ−３’／／（配列番号４６８）；および
５’−ＧＧＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＧＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ Ｔ−３’／／（配列番号４６９）
を用いて生成した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕＩｋＣｈａｎｇｅ ＭｕｌｔＩ ｓＩｔｅ−ＤＩｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓＩｓキットを製造者の説明書に従って用い、部位特異的変異誘発を行った。最終的なｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］構築物は、ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号４６２）をコードしていた。

Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］フラグメントを、以下の４つのオリゴ：
５’− ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＣＧ ＣＣＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＴＣＧ ＡＣＡ−３’／／（配列番号４７０）；
５’−ＧＡＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＡＣ−３’／／（配列番号４７１）；
５’−ＣＧＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＧＧ ＣＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ−３’／／（配列番号４７２）；および
５’−ＧＴＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＣ−３’／／（配列番号４７３）
を用いて、上記のように生成した。最終的なｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｒ１Ａ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］構築物は、ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ａ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合ポリペプチド（配列番号４６３）をコードしていた。

ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］フラグメントを、ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｑ１６Ｋ］を鋳型として、ならびにオリゴ：
５’−ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＣＣ−３’／／（配列番号４７４）；および
５’−ＧＧＧ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ−３’／／（配列番号４７５）
を用いて生成した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕＩｋＣｈａｎｇｅ ＭｕｌｔＩ ｓＩｔｅ−ＤＩｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓＩｓキット（カタログ番号２００５３１）を製造者の説明書に従って用い、部位特異的変異誘発を行った。最終的なｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｒ１Ｈ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］構築物は、ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号４６４）をコードしていた。

Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］フラグメントを、以下の４つのオリゴ：
５’−ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＧＡＣ−３’／／（配列番号４７６）および配列番号４７1；
５’−ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ−３’／／（配列番号４７７）および配列番号４７３を用いて、上記のように生成した。最終的なｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｒ１Ｈ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］構築物は、ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｈ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合ポリペプチド（配列番号４６５）をコードしていた。

Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］フラグメントを、ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｑ１６Ｋ］を鋳型として、ならびにオリゴ：
５’−ＣＣＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＣＴ ＧＣＧ ＣＣＧ ＡＣＡ ＣＣＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＡＧＡ−３’／／（配列番号４７８）；および
５’−ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＴ ＣＧＧ ＣＧＣ ＡＧＣ ＴＣＴ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＧＧ−３’／／（配列番号４７９）
を用いて生成した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕＩｋＣｈａｎｇｅ ＭｕｌｔＩ ｓＩｔｅ−ＤＩｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓＩｓキット（カタログ番号２００５３１）を製造者の説明書に従って用い、部位特異的変異誘発を行った。最終的なｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｒ１Ｋ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］構築物は、ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｉ４Ａ，Ｑ１６Ｋ］融合ポリペプチド（配列番号４６６）をコードしていた。

Ｓｈｋ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］フラグメントを、以下の４つのオリゴ：
５’−ＣＧＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＡＡ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＧＡ ＣＡＣ ＣＡ−３’／／（配列番号４８０）および配列番号４７１；
５’−ＴＧＧ ＴＧＴ ＣＧＡ ＴＧＣ ＡＧＣ ＴＣＴ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＧ−３’／／（配列番号４８１）および配列番号４７３を用いて、上記のように生成した。最終的なｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＶＫ１ＳＰ−ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５ Ｒ１Ｈ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］構築物は、ＩｇＧ２−ＨＣ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５，Ｒ１Ｋ，Ｑ１６Ｋ，Ｋ３０Ｅ］融合ポリペプチド（配列番号４６７）をコードしていた。

一価Ａｂ ＨＣ−ならびに一価、二価および三価Ａｂ ＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体の単離方法
プロテインＡセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティー高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）でのＦｃ領域の捕捉により、馴化培地の最初の精製を行った後、二価陽イオンを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）でのカラム洗浄および流速２．５ｃｍ／分での１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）による段階的溶出を行った。タンパク質含有画分をプールし、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを５．０に調整し、さらに５倍体積の水で希釈した。材料を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（ＣｏｒｎＩｎｇ）によりろ過し、陽イオン交換ＦＰＬＣ（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＩｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製した。１００％緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で平衡化したカラム上に試料を負荷し、３０カラム体積を超える０〜８０％の勾配の緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）により、流速１．５ｃｍ／分で溶出した。標的種を含有するピークをプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．０中に調合した。一価、二価および三価免疫グロブリン−毒素ペプチド類似体融合タンパク質の典型的な精製を、図４２〜４４Ａ〜４４Ｂ、図４５〜４７Ａ〜４７Ｂ、図４８〜５０Ａ〜５０Ｂおよび図５１〜５３に示す。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図４２、４６、４８および５１）は、完全に構築された抗体が形成され得ることを示しており、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、所望の構成要素が存在することを示している。サイズ排除クロマトグラム（図４３、４６、４９および５２）は、精製産物の大部分が所望の非凝集状態にあることを示している。最後に、質量スペクトル分析（図４４Ａ〜４４Ｂ、４７Ａ〜４７Ｂ、５０Ａ〜５０Ｂおよび５３）は、所望の融合産物が存在することを示している。これらの実施例をまとめると、ａＫＬＨ１２０．６抗体は、偶数または奇数の価数である少なくとも１〜８個の薬理学的に活性なポリペプチド部分を含有する種を含めた、多種多様な構成の融合体を許容し得ることが示されている。

ＶＨ２１ＳＰ−Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５］野生型−ＩｇＧ１−Ｆｃの哺乳動物での発現
ヒトＩｇＧ１のＮ末端Ｆｃ領域とインフレームで融合したＫｖ１．３阻害ペプチドＳｈＫ［１−３５］の単量体をコードするＤＮＡ配列を、以下に記載のように構築した。

ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１Ｆｃ発現ベクター構築のために、ＰＣＲ法を用いて、ＨＩｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に隣接する４グリシンおよび１セリンアミノ酸と連結したＶＨ２１シグナルペプチドＳｈＫ（１−３５）遺伝子を生成し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位に隣接するＩｇＧ１Ｆｃフラグメントと連結した４グリシンおよび１セリンアミノ酸を、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１Ｉｎ ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩを鋳型として用いたＰＣＲ反応（参照により組み込まれる、ＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例４１および図４２Ａ〜４２Ｂに記載）で生成した。

ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｇ_４Ｓを生成するために、ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた、９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７５℃−４５秒で３５サイクルのＰＣＲ反応において、下に示す配列の２つのオリゴを使用した（ＨＩｎｄＩＩＩ（ａａｇｃｔｔ）およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）制限部位に下線が施してある）：
順方向プライマー：
ＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴ／／（配列番号３６１）；および
逆方向プライマー：
ＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＣＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＧＡＴ／／（配列番号３６２）。

得られたＰＣＲ産物は、２パーセントのアガロースゲル上で２０２ｂｐのバンドとして分離された。２０２ｂｐのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（ＱＩａｇｅｎ）を用いて精製し、次いで、ＨＩｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、アガロースゲルをゲル抽出キット（ＱＩａｇｅｎ）で精製した。

Ｇ_４Ｓ−ＩｇＧ１Ｆｃを生成するために、ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた、９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７５℃−１分で３０サイクルのＰＣＲ反応において、下に示す配列の２つのオリゴを使用した（ＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）およびＮｏｔＩ（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）制限部位に下線が施してある）：
順方向プライマー：
ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣ／／（配列番号３６３）；および
逆方向プライマー：
ＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ／／（配列番号３６４）。

得られたＰＣＲ産物は、１パーセントのアガロースゲル上で７２１ｂｐのバンドとして分離された。７２１ｂｐのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製キット（ＱＩａｇｅｎ）を用いて精製し、次いで、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、アガロースゲルをゲル抽出キット（ＱＩａｇｅｎ）で精製した。

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶＩ−Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１ベクターをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、大フラグメントをゲル抽出キットにより精製した。ゲル精製した４ＧＳ−ＩｇＧ１Ｆｃフラグメントを精製大フラグメントと連結し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換して、ｐＣＭＶＩ−Ｆｃ−Ｌ１０−ＩｇＧ１Ｆｃベクターを作出した。次いで、ｐＣＭＶＩ−Ｆｃ−Ｌ１０−ＩｇＧ１ＦｃベクターをＨＩｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、大フラグメントをゲル抽出キットにより精製した。ゲル精製したＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−４ＧＳフラグメントを精製大フラグメントに連結し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換して、ｐＣＭＶＩ−ＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１Ｆｃ構築物を得た。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には各遺伝子由来の１クローンのみを選択した。ｐＣＭＶＩベクター中のＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１Ｆｃ由来のＤＮＡを再配列決定してＦｃおよびリンカー領域を確認し、配列は上記配列と１００％一致していた。フラグメントＶＨ２１ＳＰ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−ＩｇＧ１Ｆｃは、
アミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号３６６）
をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡ／／（配列番号３６５）
を含んでいた。

Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］−ａＫＬＨ ＨＣ；およびＮ末端ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−ａＫＬＨ ＬＣの哺乳動物での発現
Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５］野生型−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃをコードする構築物を用い、以下のオリゴ：
５’−ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＧ ＣＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＣＡ ＧＣ−３’／／（配列番号３２５）；および
５’−ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＣ−３’（配列番号３２６）
を使用して部位特異的変異誘発を行い、ＳｈＫ領域におけるＱ１６Ｋ変異を生じさせた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕＩｋＣｈａｎｇｅ ＭｕｌｔＩ ＳＩｔｅ ＤＩｒｅｃｔｅｄ ＭｕｔａｇｅｎｅｓＩｓキットを製造者の説明書に従って使用した。ｐＣＭＶＩ−Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃの最終構築物は、以下のシグナルペプチド−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合ポリペプチド：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号４０２）
をコードしていた。

Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］−ａＫＬＨ ＨＣ構築物を生成するために、シグナルペプチド−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０リンカーを含むＰＣＲ産物を、以下のオリゴ：
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＧ−３’（配列番号３６７）；
５’−ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＧ−３’（配列番号３６８）；および
鋳型ｐＣＭＶＩ−Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃを用いて作製し、
アミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ／／（配列番号３７０）
をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ／／（配列番号３６９）
を含むフラグメントを得た。

ａＫＬＨ−ＨＣフラグメントを生成するために、オリゴ：
５’−ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ−３’（配列番号３７１）；
５’−ＣＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣ−３’（配列番号３７２）；および
鋳型ｐＴＴ５−ａＫＬＨ１２０．６−ＨＣを用いてＰＣＲ産物を作出し、アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号３７４）
をコードするコード配列
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ／／（配列番号３７３）
を含むＤＮＡフラグメントを得た。

２つのＰＣＲ産物をゲル上で泳動し、適当なサイズのバンドをアガロースプラグ用に切り取った。アガロースプラグを新たな単一のＰＣＲ反応に供し、最外プライマー（配列番号３６７）および（配列番号３７２）を用いてフラグメントを繋ぎ合わせた。ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いてＰＣＲフラグメントを切断し、ＱＩａｇｅｎ社のＰＣＲクリーンアップキットでクリーンアップした。同時に、ｐＴＴ５ベクターもＸｂａＩおよびＮｏｔＩにより切断し、ゲル精製した。精製挿入物を大ベクターフラグメントに連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。いくつかのクローン配列の解析で上記配列と１００％のマッチが得られたが、大規模なプラスミド精製には１クローンのみを選択した。最終構築物のｐＴＴ５−Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ａＫＬＨ１２０．６−ＨＣは、ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ａＫＬＨ１２０．６−ＨＣ融合ポリペプチド：

ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＳＹＹＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／（配列番号４０３）
をコードしていた。

最後に、Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ａＫＬＨ１２０．６軽鎖（ＬＣ）を上と同じ方法で生成した。シグナルペプチド−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０を含むＰＣＲ産物を、オリゴ：
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＧ−３’（配列番号３６７）；および
５’−ＣＡＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＧ−３’（配列番号３７５）
ならびに鋳型ｐＣＭＶＩ−Ｎ末端−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ＩｇＧ１−Ｆｃを用いて作出し、シグナルペプチド（ＶＨ２１ＳＰ）−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−Ｌ１０リンカーのアミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ／／（配列番号３７０）
をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ／／（配列番号３６９）
を含むＤＮＡフラグメントを得た。鋳型およびオリゴ：
５’−ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣ−３’（配列番号３７８）；および
５’−ＣＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＡＣ−３’（配列番号３７９）の使用。得られたクローンＰＣＲフラグメントは、Ｎ末端シグナルペプチドを有するＮ末端−ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ａＫＬＨ１２０．６軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列：
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号３８１）
をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡ／／（配列番号３８０）
を含んでいた。

両方のＰＣＲフラグメント（配列番号３６９のコード配列を含むＤＮＡフラグメントおよび配列番号３８０のコード配列を含むａＫＬＨ１２０．６軽鎖ＬＣフラグメント）をゲル上で泳動し、適当なサイズのバンドをアガロースプラグ用に切り取った。アガロースプラグを新たな単一のＰＣＲ反応に供し、最外プライマー（配列番号３６７）および（配列番号３７９）を用いてフラグメントを繋ぎ合わせた。得られたＰＣＲフラグメントをＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いて切断し、ＱＩａｇｅｎ社のＰＣＲクリーンアップキットでクリーンアップした。

同時に、ｐＴＴ１４ベクター（ＣＭＶプロモーター、ポリＡテールおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含むＡｍｇｅｎ社のベクター）もＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で切断し、ゲル精製した。精製挿入物を大ベクターフラグメントに連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細菌中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。シグナルペプチド−ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ａＫＬＨ１２０．６−ＬＣ融合ポリペプチド配列（すなわち、配列番号３８１）をコードする最終構築物のｐＴＴ１４−Ｎ末端ＳｈＫ［１−３５Ｑ１６Ｋ］−Ｌ１０−ａＫＬＨ１２０．６−ＬＣ。

ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５］の哺乳動物での発現
プラスミドｐＴＴ５−ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５Ｑ１６Ｋ］の作製：
Ｋｖ１．３阻害剤毒素ペプチド類似体ＳｈＫ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］（配列番号１３）の単量体とインフレームで融合したヒト抗２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）抗体の重鎖をコードするＤＮＡ配列を、標準的なクローニング技術を用いて構築した。ｐＴＴ５ベクターをアミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＮＦＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ／／（配列番号４０５）
を有する抗ＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２重鎖（ｐＤＣ３２４：ａＤＮＰ３Ａ４ＨＣ（Ｗ１０１Ｆ））；およびＩｇＧ２Ｆｃ−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］由来の部分と３方向で連結することにより、プラスミドｐＴＴ５−ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５Ｑ１６Ｋ］を作製した。ｐＴＴ５ベクターをＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切断して多重クローニング部位を分離した。次いで、ベクターを仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、バックグラウンドを減少させた。ＳａｌＩ／ＳｔｕＩで切断することによりｐＤＣ３２４：ａＤＮＰ３Ａ４ＨＣ（Ｗ１０１Ｆ）から第一の挿入物が得られ、アミノ酸配列
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＮＦＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧ／／（配列番号３８４）
をコードするコード配列
ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣ／／（配列番号３８３）
を含むＤＮＡフラグメントを生じた。ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩを用いた消化により第二の挿入物が切り出され、以下の切断されたＩｇＧ２Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）アミノ酸配列
ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号３９６）
をコードするコード配列
ＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡ／／（配列番号３９５）
を含んでいた。

ベクターおよび挿入フラグメントをゲル精製し、ＱＩａｇｅｎ社のゲル精製キットでクリーンアップした。精製挿入物を大ベクターフラグメントに連結し、ＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。形質転換細菌コロニー由来のＤＮＡを単離して、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限酵素消化を施し、１パーセントのアガロースゲル上で分離した。期待されたパターンを生じたＤＮＡを塩基配列決定に供した。上記配列と１００％のマッチが得られた１クローンを、大規模なプラスミド精製用に選択した。最終的なｐＴＴ５−ａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］構築物は、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＮＦＮＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ／／（配列番号４０６）
を有するａＤＮＰ３Ａ４（Ｗ１０１Ｆ）ＩｇＧ２−Ｌ１０−Ｓｈｋ［１−３５，Ｑ１６Ｋ］をコードしていた。

抗ＤＮＰ３Ａ４抗体軽鎖の哺乳動物での発現
ａＤＮＰモノクローナル抗体３Ａ４を発現するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ハイブリドーマを供給源として用いて、全ＲＮＡを単離した。多重遺伝子特異的プライマーによる１段階ＲＴ−ＰＣＲを行って、可変領域産物を得た。この産物を、５’ＢｓｓＨＩＩ制限部位である５’−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＧＣ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＣＡ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＡＧＴ Ｃ−３’（配列番号３８５）を付加するための順方向プライマーおよび３’ＢｓＩＷＩ制限部位である５’−ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＡＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＧＴ ＣＣ−３’（配列番号３８６）を付加するための逆方向プライマーにより再増幅した。得られたＰＣＲ産物をＱＩａｇｅｎ社のＰＣＲクリーンアップによりクリーンアップし、ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓＩＷＩ制限酵素により消化し、ＱＩａｇｅｎ社のヌクレオチド除去によりクリーンアップし、５’ＶＫ１／Ｏ１２シグナルペプチドおよび３’ヒトカッパ定常領域を含む哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５内に連結した。得られた抗ＤＮＰ３Ａ４抗体軽鎖のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＲＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ／／（配列番号４０７）。

一価Ｆｃ−毒素ペプチド類似体およびＡｂ ＨＣ−またはＡｂ ＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体の単離方法
プロテインＡセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティー高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）でのＦｃ領域の捕捉により、馴化培地の最初の精製を行った後、二価陽イオンを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ）でのカラム洗浄および流速２．５ｃｍ／分での１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）による段階的溶出を行った。タンパク質含有画分をプールし、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを５．０に調整し、さらに５倍体積の水で希釈した。材料を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（ＣｏｒｎＩｎｇ）によりろ過し、陽イオン交換ＦＰＬＣ（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＩｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製した。１００％緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で平衡化したカラム上に試料を負荷し、３０カラム体積を超える０〜８０％の勾配の緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）により、流速１．５ｃｍ／分で溶出した。一価種を含有するピークをプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．０中に調合した。一価Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合タンパク質および免疫グロブリン−毒素ペプチド類似体融合タンパク質の典型的な精製を、図１３Ａ〜１３Ｃ、図１５Ａ〜１５Ｃ、図１６Ａ〜１６Ｃおよび図１８Ａ〜１８Ｃに示す。

二価Ｆｃ−ＳｈＫおよびＡｂ ＨＣ−またはＬＣ−毒素ペプチド類似体融合体の単離方法
高分子量のタンパク質凝集物を除去するための最終ポリッシュ段階を加えて、一価分子と同様に、二価分子を精製した。陽イオン交換ＦＰＬＣの後、二価種を含有するピークをゲルろ過ＦＰＬＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりポリッシュした。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、９％スクロース、ｐＨ５．０で平衡化したカラム（２．６×５６．５ｃｍ）上に試料を負荷し、流速０．４ｃｍ／分で均一濃度勾配の緩衝液により溶出した。二価種を含有するピークをプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．０中に調合した。二価Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合タンパク質および免疫グロブリン−毒素ペプチド類似体融合タンパク質の典型的な精製を、図１４Ａ〜１４Ｃおよび図１７Ａ〜１７Ｃに示す。

実施例１２
一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］ヘテロ二量体および一価また二価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）（ＩｇＧ２）ヘテロ二量体およびその他の免疫グロブリン融合タンパク質

表４Ｈに記載の一価または二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］、一価または二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］、一価または二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）、一価または二価抗ＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ、一価または二価抗ＫＬＨ Ａｂループ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合Ａｂタンパク質、一価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）／ＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体およびその他の典型的な実施形態を、実施例１１に記載の方法により発現させ、単離し、精製した。

概略的には、図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ一価および二価Ｆｃ−毒素ペプチド（または毒素ペプチド類似体）融合タンパク質（または「ぺプチボディ」）の略図を示す。二価Ｆｃ−ＳｈＫ分子は、２つのＦｃ−ＳｈＫ鎖を含むホモ二量体である。一価Ｆｃ−ＳｈＫ毒素ペプチド（または毒素ペプチド類似体）分子は、１つのＦｃ鎖および１つのＦｃ−ＳｈＫ（または類似体）鎖を含むヘテロ二量体である。一価Ｆｃ−ＳｈＫ分子は１つの二量体当たりＳｈＫペプチドを１つのみ含むため、一価であると見なされる。Ｆｃ−（毒素ペプチド類似体）と呼ばれる構築物または鎖は、Ｎ末端Ｆｃ領域、および任意で、Ｎ末端からＣ末端への配向がＦｃ−リンカー−毒素ペプチドまたは毒素ペプチド類似体となるように、毒素ペプチドまたは毒素ペプチド類似体と共有結合した柔軟なリンカー配列（例えば、Ｌ１０ペプチジルリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２９２）を含む。

ＳｕｌｌＩｖａｎら，国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例１および２において、本発明者らは以前に、哺乳動物細胞から発現された二価Ｆｃ−ＳｈＫぺプチボディであるＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）を記載した。国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号の実施例１では、本発明者らは、発現の間に小さな副産物として形成される一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）分子の単離についても記載した。二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）コンジュゲートは、Ｋｖ１．３およびヒト全血におけるＴ細胞サイトカイン分泌の強力なブロックをもたらした（表４Ｈを参照されたい）。全細胞パッチクランプ電気生理により、二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）分子は、ＳｈＫのＡｒｇ１を欠く二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）分子に比べて、約８倍高いＫｖ１．３活性を有していた。天然ＳｈＫのＮ末端ＰＥＧコンジュゲートのように（実施例５を参照されたい）、両方の二価Ｆｃ−ＳｈＫコンジュゲートは、Ｋｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性をほとんど示さなかった。したがって、天然ＳｈＫのＮ末端コンジュゲーションのみ（ＰＥＧまたはＦｃ−リンカーのいずれによるものでも）では、そのＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性をあまり向上させない。二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ぺプチボディに関する薬物動態（ＰＫ）実験をラットにおいて行い、そのインビボでの安定性および半減期を調べた。対照として、ＣＨＯ由来組換えヒトＦｃ（ＩｇＧ１）に関してもＰＫを行った。分子はすべて、単回の静脈内ボーラス投与として投与した。ヒトＦｃ領域に特異的なＥＬＩＳＡを用いて（実施例８、「プロトコール３」）、ＣＨＯ−Ｆｃと同様に、ラットにおいて二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ぺプチボディは長い終末相半減期および遅い消失速度を示した（図１９Ａ）。遅い消失速度を示しているにもかかわらず、二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ぺプチボディは、ＣＨＯ−Ｆｃ分子よりも有意に高い、大きな分布相を示した。同様の結果が、以前に記載されている２つのぺプチボディである二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）および二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］（国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２の実施例１よび実施例４１）に関するＩＶ単回投与のラットＰＫ実験から得られた。二価ぺプチボディのインビボでの広範な分布を引き起こしている可能性のあるものをより十分に理解するために、本発明者らは、固体表面アフィニティー捕捉／ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット法を開発し、これにより、それらの分子量および完全性の効率的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよぶウエスタンブロット解析のために、血清タンパク質からぺプチボディを単離することが可能となった。静脈内単回投与のラットＰＫ実験の血清試料を、アフィニティー捕捉を可能にする抗ヒトＦｃ抗体でコートしたマイクロタイタープレートに添加した。次いで、プレートを洗浄し、ＳＤＳ／ＬａｅｍａｌｌＩ試料緩衝液の添加により捕捉試料を解離させ、ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。膜へウエスタンブロットした後、抗ヒトＦｃ特異的抗体、二次ＨＲＰコンジュゲートおよび発光基質を用いた標準的なイムノブロット技術により試料を可視化した。図１９Bは、広範な分布相の間に、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）のＩＶ投与の０．２５時間後において、ぺプチボディはインタクトである。静注後１〜４８時間の緩やかな消失相の間に、２つのバンドが観察され、一番上またはより大きな分子量のバンドは完全長Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］と一致し、小さなバンドは単独のＦｃと一致する。大きく広範な分布相の間、ぺプチボディはインタクトであることから、このことは、二価ぺプチボディが動物内でタンパク質分解されず、隔離されたことを示している。これを支持するように、Ｆｃ−ＳｈＫのＳｈＫペプチド部分が迅速に切断されたならば生じるであろうと予想される高い血中量の単独Ｆｃが見られない。したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットのデータ（図１９Ｂ）は、迅速な分布の間に、ぺプチボディはインタクトであり、タンパク質分解されないが、緩やかな消失相の間は、それは１つのＦｃ−ＳｈＫ［２−３５］鎖および１つのＦｃ鎖を含む一価ヘテロ二量体であったことを示している。同様の知見が、二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］および二価Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］に関するラットＰＫ実験（静脈内）の血清試料のｈｕＦｃアフィニティー捕捉、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット解析から観察された（図１９Ｃ）。ラットにおける二価Ｋｖ１．３ぺプチボディの迅速かつ広範な分布相の正確な理由は不明であるが、２つの毒素単位を含む二価ぺプチボディの結合力は、一価ぺプチボディのそれよりも、はるかに大きいであろう。これがＫｖ１．３標的に特異的または非特異的であるか否かは不明である。ＳｈＫおよびＯＳＫ１のような毒素ペプチドは、非常に塩基性であり、非特異的な方法で反応し得るということを覚えておくべきである。原因とは関係なく、一価のぺプチボディは遅い終末相において存在したため、本発明者らは、一価ぺプチボディの直接的な静注が、ラットにおいてより小さい分布を示すか否かを調べた。これに取り組むために、本発明者らは最初に、二価分子を発現する馴化培地から副産物として単離された精製一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）分子（実施例１、国際公開第２００８／０８８４２２Ａ２号）をラットＩＶ ＰＫ実験において試験した。図１９Ｄでは、一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）ぺプチボディがはるかに狭い分布相を示し、遅い消失速度を有していたことが、Ｆｃアフィニティー捕捉／ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットにより示されている。したがって、二価および一価ぺプチボディが共に遅い消失速度を示すのにもかかわらず、一価ヘテロ二量体ぺプチボディはラットにおいて、二価ホモ二量体型に比べて有意に小さい分布を示した。

元の一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）分子は、二価分子の哺乳動物発現の間の小さな副産物として単離されたのに対し、本明細書の実施例１１では、一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］ヘテロ二量体のクローニングおよび哺乳動物での発現についても記載する。簡潔には、組換え一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を作製するために、ヒトＦｃ（ＩｇＧ１）鎖およびＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］鎖（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域も含む）である２つの組換えポリペプチドを同じ細胞内で共発現させる。こうした条件下で、Ｆｃ／Ｆｃホモ二量体、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ホモ二量体およびＦｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ヘテロ二量体を含む３つの異なる二量体を形成することが可能である。発現条件を最適化することにより、一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）ヘテロ二量体（単に一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）とも呼ぶ）が効率的に産生され、均一なものへと容易に精製された（実施例１１）。一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）分子は、ヒト全血からのＩＬ−２分泌のブロックにおいてＩＣ５０が２．１ｎＭ（表４Ｈ）であった。一価Ｆｃ−ＳｈＫ／Ｆｃヘテロ二量体は、延長されたインビボ半減期を有し、二価ホモ二量体ＳｈＫ−Ｆｃ／ＳｈＫ−Ｆｃ（図２３）およびＦｃ−ＳｈＫ／Ｆｃ−ＳｈＫよりもかなり高い曝露量を示した。この構築物の効力は、ＰＥＧ−ＳｈＫコンジュゲートよりも約１０倍低く、天然ＳｈＫのコンジュゲートはＫｖ１．３／Ｋｖ１．１選択性が弱かったため、本発明者らは、さらなる一価のぺプチボディを開発し、向上したＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を有することが確認されたＳｈＫ毒素ペプチド類似体のコンジュゲートを形成した。以下の実施例では、向上した選択性およびインビボ薬理を有する一価ぺプチボディのさらなる詳細を記載する。これらの実験の結果は、一価ＳｈＫ毒素ペプチド類似体分子がラットにおいて、二価型の同じ分子に比べてより高い血清レベルおよび曝露量を示すが、それでも元の二価ぺプチボディで観察される遅い消失速度を保持していることを示していた。

一価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体（ＩｇＧ２）
本明細書の実施例３では、向上したニューロンＫｖ１．１を上回るＫｖ１．３選択性を示すＳｈＫ［Ｌｙｓ１６］毒素ペプチド類似体（配列番号１３）の同定について記載されている。この毒素ペプチド類似体のインビボでの安定性を増加させるために、本発明者らは、Ｎ末端からＣ末端へ向かってヒトＦｃ（ＩｇＧ２）−Ｌ１０リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を含む、一価Ｆｃ融合構築物を生成し、これは、単独のヒトＦｃ（ＩｇＧ２）鎖と共発現されて、一価ヘテロ二量体を生成した（実施例１１を参照されたい）。この一価構築物の略図を図１２Ａに示す。一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体［互換的に、一価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）または一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）とも呼ぶ；（配列番号３３７；３４８）］は、全血におけるＴ細胞炎症を強力にブロックし、０．１６ｎＭのＩＣ５０でＩＬ−２分泌を抑制した（表４Ｈ）。また一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）分子は、図３２および実施例９に記載のように、０．２４４ｎＭのＩＣ５０でラットミエリン−特異的Ｔエフェクター記憶細胞系であるＰＡＳの増殖も強力にブロックした。意外なことに、分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を調べるための実験で、一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）コンジュゲートが単独の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドよりもかなり優れたＫｖ１．３選択性を有することが明らかとなった。ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）電気生理により判定されたように、単独の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）ペプチドがＫｖ１．１に比べて約１８倍のＫｖ１．３選択性を示した（表４Ｈ）のに対し、一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体は、Ｋｖ１．３のブロックにおいて、Ｋｖ１．１に比べて約１２２５倍高い活性であった。したがって、コンジュゲートされた場合の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドは、増強された選択性という独自の薬理を示す。Ｎα−２０ｋＤａ−ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫコンジュゲート（配列番号１６）もペプチド単独に比べて増強されたＫｖ１．３選択性を示した（実施例５、表４Ｈ）ことから、総合したデータは、［Ｌｙｓ１６］−ＳｈＫ（配列番号１３）ペプチドが、そのＮ末端でＰＥＧまたはＦｃ−リンカーのいずれかにより融合された場合、向上したＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性という明確な薬理を示すということを示唆している。

一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）分子（配列番号３３７；３４８）のＫｖ１．３選択性の本発明者らの解析を拡張するために、Ｋｖ１ファミリーの残りの５つのメンバーに対するその活性を試験した。ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）電気生理により判定されたように、一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）分子は、Ｋｖ１よりも１２２５倍、Ｋｖ１．２よりも約１０００倍、Ｋｖ１．４よりも３６６３倍超、Ｋｖ１．５よりも３６６３倍超、Ｋｖ１．６よりも約１６４倍およびＫｖ１．７よりも３６６３超、Ｋｖ１．３を良好にブロックした（表４Ｈ（ｂ））。全細胞パッチクランプＫｖ１．３電気生理およびＴ細胞炎症の全血アッセイが、Ｋｖ１．３に対する一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）の真の活性はＫｖ１．３ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）解析により判定されるよりも８〜１０倍さらに高いかもしれないということを示しているため、他のＫｖ１ファミリーメンバーを上回るそのＫｖ１．３選択性の倍数は、さらに大きなものであり得る。

分子のインビボでの薬物動態および安定性を評価するために、ラットにおいて単回投与ＰＫ実験を行った。６ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与の後、一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体は、延長されたインビボ半減期を示した（図２０）。分子の血清レベルを測定するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法（実施例８、「プロトコール２」）は、一方がヒトＦｃ領域に特異的な抗体であり、他方が［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）を認識する抗体である、２つの抗体の結合を必要するため、ここでのデータは、コンジュゲートが延長された半減期を有し、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）融合タンパク質としてインビボでインタクトのままであったことを示している（図２０、白四角；下の表４Ｉ）。一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）分子は、約５６時間の延長された半減期を示したが、これは、半減期が２０〜３０分であることが報告されている単独のＳｈＫ（配列番号１）ペプチド（Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎら，ＰＮＡＳ ９８：１３９４２（２００１））よりも約１１２倍長かった。

多発性硬化症の動物モデルにおける一価Ｆｃ／Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）分子（配列番号３３７；３４８）の有効性を、実施例９に記載のように、養子移植（ＡＴ）−ＥＡＥモデルを用いて判定した。一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）は疾患発症を遅延させ、疾患重症度の投与量依存的な低下をもたらした（図３５および図３６Ａ〜Ｄ）。この分子はこのモデルにおいて非常に強力であり、ＥＡＥスコアの曲線下面積に基づく、疾患重症度の５０％低下をもたらす一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）の推定有効量（ＥＤ５０）は、２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ未満または１３８μｇ／ｋｇ未満の投与量であった。より大きな一価Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）分子の２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与量は、μｇ／ｋｇの投与量および投与溶液がペプチド部分のみの分子量に基づく、より小さなＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子の１０μｇ／ｋｇ投与量に対応するため、このＥＤ５０は、このモデルにおけるＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫの活性に良好に匹敵する。

二価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）ホモ二量体（ＩｇＧ２）
二価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）ホモ二量体は、Ｎ末端からＣ末端へ向かってヒトＦｃ（ＩｇＧ２）−Ｌ１０リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号３４８）を含む。この二価構築物の略図を図１２Ｂに示す。分子（配列番号３４８のホモ二量体）を、実施例１１に記載のように、クローニングし、発現させ、精製した。精製分子を炎症のヒト全血アッセイにおける活性について試験し、ＩＬ−２分泌のブロックにおけるＩＣ５０が１．８５０ｎＭであることが見出された（表４Ｈ）。この二価型の活性は、この同じアッセイにおけるＩＣ５０が０．１６ｎＭであった一価型（上記）の約１２倍低かった。二価型が一価よりも活性が低かった理由は不明である。その末端に２つの正荷電［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）ペプチドを含む二価分子は、より不安定である、および／またはＫｖ１．３チャネル結合をある程度阻害するという可能性がある。

一価および二価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ
一価抗ＫＬＨ重鎖（ＨＣ）融合抗体（Ａｂ）構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ向かってヒト抗ＫＬＨ Ａｂ重鎖−ペプチジルリンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号３４２）を含んでいたが、これは、単独のヒトａＫＬＨ重鎖（配列番号３３９）およびヒトａＫＬＨ軽鎖（配列番号３３８）と共発現されて、一価ａＫＬＨ Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号３３８；配列番号３３９；配列番号３３８；および配列番号３４２のヘテロ四量体）を形成した。この一価構築物の略図を図１２Ｆに示す。一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号３３８；配列番号３３９；配列番号３３８；および配列番号３４２のヘテロ四量体）は、全血におけるＴ細胞炎症を強力にブロックし、０．２７４ｎＭのＩＣ５０でＩＬ−２分泌を抑制した（表４Ｈ）。また一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子は、図３２および実施例９に記載のように、０．８３９ｎＭのＩＣ５０でラットミエリン−特異的Ｔエフェクター記憶細胞系であるＰＡＳの増殖も強力にブロックした。意外なことに、分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を調べるための実験で、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号３３８；配列番号３３９；配列番号３３８；および配列番号３４２のヘテロ四量体）が単独の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）ペプチドよりもかなり優れたＫｖ１．３選択性を有することが明らかとなった。ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）電気生理により判定されたように、一価Ａｂ−ＳｈＫコンジュゲートは、Ｋｖ１．３のブロックにおいてＫｖ１．１の約１４５８倍高い活性であった（表４Ｈおよび図６Ｅ〜６Ｆ）。一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子のＫｖ１．３選択性の本発明者らの解析を拡張するために、Ｋｖ１ファミリーの残りの５つのメンバーに対するその活性を試験した。ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）電気生理により判定されたように、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂは、Ｋｖ１よりも１４５８倍、Ｋｖ１．２よりも２０１３倍、Ｋｖ１．４よりも２５２５倍超、Ｋｖ１．５よりも２５２５倍超、Ｋｖ１．６よりも約１５６倍およびＫｖ１．７よりも２５２５超、Ｋｖ１．３を良好にブロックした（表４Ｈ（ａ））。全細胞パッチクランプＫｖ１．３電気生理およびＴ細胞炎症の全血アッセイが、Ｋｖ１．３に対する一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号３３８；配列番号３３９；配列番号３３８；および配列番号３４２のヘテロ四量体）の真の活性はＫｖ１．３ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（登録商標）解析により判定されるよりも１１〜１３倍さらに高い可能性があるということを示しているため、他のＫｖ１ファミリーメンバーを上回るそのＫｖ１．３選択性の倍数は、さらに大きなものであり得る。

多発性硬化症の動物モデルにおける一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子（配列番号３３８；配列番号３３９；配列番号３３８；および配列番号３４２のヘテロ四量体）の有効性を、実施例９に記載のように、養子移植（ＡＴ）−ＥＡＥモデルを用いて判定した。一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂは疾患発症を遅延させ、疾患重症度の投与量依存的な低下をもたらした（図３３および図３４Ａ〜３４Ｄ）。この分子はこのモデルにおいて非常に強力であり、ＥＡＥスコアの曲線下面積に基づく、疾患重症度の５０％低下をもたらす一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂの推定有効量（ＥＤ５０）は、２．４ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３６０μｇ／ｋｇの投与量であった。より大きな一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂの２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ投与量は、μｇ／ｋｇの投与量および投与溶液がペプチド部分のみの分子量に基づく、１０μｇ／ｋｇ（２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のより小さなＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（図３３）分子と同様の疾患改善をもたらしたため、疾患重症度の低下における一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂの有効性は、ＰＥＧ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのそれに良好に匹敵した。

分子のインビボでの薬物動態および安定性を評価するために、ラットにおいて単回投与ＰＫ実験を行った。６ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与の後、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂコンジュゲートは、延長されたインビボ半減期を示した（図２０、黒丸）。分子の血清レベルを測定するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法（実施例８、「プロトコール２」）は、一方がヒトＩｇ領域に特異的な抗体であり、他方が［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ（配列番号１３）を認識する抗体である、２つの抗体の結合を必要するため、ここでのデータは、コンジュゲートが延長された半減期を有し、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ融合タンパク質としてインビボでインタクトのままであることを示している（図２０、図２１および表４Ｊ）。同じ６ｍｇ／ｋｇの投与量で投与された二価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子（図１２Ｇにより模式的に表される）は、同様に遅い消失速度を示した（図２１）が、曝露量（ＡＵＣ_０−ｔとして測定、表４Ｊ）は一価分子に比べて約３７倍低かった（図２１）。強力かつ選択的な一価抗ＫＬＨ−Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子は、ラットにおいて非常に遅いクリアランスを示し（ＣＬ／Ｆ＝１０．９ｍＬｈ^−１ｋｇ^−１）（表４Ｊ）、この速度はＳｈＫ−Ｌ５（配列番号１７；ＣＬ／Ｆ＝２０５２ｍＬｈ^−１ｋｇ^−１）よりも約１８８倍遅かった。

一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（２−３５ Ｑ１６Ｋ）Ａｂ
この一価ａＫＬＨ重鎖（ＨＣ）融合抗体（Ａｂ）構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ向かってヒト抗ＫＬＨ Ａｂ重鎖−リンカー−［ｄｅｓＡｒｇ１，Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号３87）を含んでいたが、これは、ヒトａＫＬＨ重鎖（配列番号３３９）およびヒトａＫＬＨ軽鎖（配列番号３３８）と共発現されて、一価ａＫＬＨ Ａｂ−［ｄｅｓＡｒｇ１，Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を形成した。この一価構築物の略図を図１２Ｆに示す。一価ａＫＬＨ ＨＣ−ＳｈＫ（２−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ（配列番号３３８；配列番号３３９；配列番号３３８；および配列番号３８７のヘテロ四量体）は、全血におけるＴ細胞炎症を強力にブロックし、０．５７０ｎＭのＩＣ５０でＩＬ−２分泌を抑制し（表４Ｈ）、かつ意外なことに、Ｔ−細胞カリウムチャネルＫｖ１．３のブロックにおいて、ニューロンチャネルＫｖ１．１よりも１５７６倍強力であった。

一価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５ Ｑ１６Ｋ）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体
一価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体またはヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）は、Ｎ末端からＣ末端へ向かってヒトＦｃ（ＩｇＧ２）−Ｌ１０リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子（配列番号３４８）を含んでいたが、これは、ヒトａＫＬＨ重鎖（ＩｇＧ２）（配列番号３３９）およびヒトａＫＬＨ軽鎖（配列番号３３８）と共発現された。この一価構築物の略図を図１２Ｅに示す。一価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体（配列番号３３８；配列番号３３９；配列番号３４８）は、全血におけるＴ細胞炎症を強力にブロックし、０．２４５ｎＭのＩＣ５０でＩＬ−２分泌を抑制した（表４Ｈ）。驚くべきことに、分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を調べるための実験で、一価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体が単独の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド（配列番号１３）よりもかなり優れたＫｖ１．３選択性を有することが明らかとなった。この一価ヘテロ三量体は、Ｋｖ１．３のブロックにおいて、Ｋｖ１．１に比べて約1935倍高い活性であった（表４Ｈ）。

本発明者らは、Ｋｖ１．３選択的一価Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体またはヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）の薬物動態（ＰＫ）を調べていないが、本発明者らは、Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体である同様のヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）のＰＫプロファイルを調べた。この分子の構造の模式図を図１２Ｅに示すが、この分子はＮ末端からＣ末端へ向かってＦｃ（ＩｇＧ２）−ＳｈＫ（２−３５）を含んでおり、これは、ヒトａＫＬＨ重鎖および軽鎖と共発現される。２ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与の後、一価Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体（一価Ｆｃ−ＳｈＫ／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体とも呼ぶ）は、ラットにおいて延長されたインビボ半減期を示した（図２３）。分子の血清レベルを測定するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法（実施例８、「プロトコール２」）は、一方がヒトＩｇ領域に特異的な抗体であり、他方がＳｈＫ（２−３５）を認識する抗体である、２つの抗体の結合を必要するため、ここでのデータは、コンジュゲートが延長された半減期を有し、インビボでインタクトのままであることを示している（図２３、表４Ｋ）。約１０３ｋＤａの大きな一価Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体またはヘミボディ（ｈｅｍＩｂｏｄｙ）は、約５６ｋＤａの一価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫヘテロ二量体よりも、高い曝露量および約２倍低いクリアランスを示した（図２３、表４Ｋ）。約４ｋＤａの非常に小さいＳｈＫ−Ｌ５ペプチドは、さらにより迅速に排除され、一価Ｆｃ−ＳｈＫ（２−３５）／ａＫＬＨ Ａｂヘテロ三量体（ＣＬ／Ｆ＝２２．６ｍＬｈ^−１ｋｇ^−１）分子よりも約９１倍速い、ラットにおけるクリアランス値（ＣＬ／Ｆ＝２０５２ｍＬｈ^−１ｋｇ^−１、実施例５）を有していた。

一価および二価抗ＫＬＨ ＡｂＬｏｏｐ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合タンパク質
組換え一価および二価抗ＫＬＨ ＡｂＬｏｏｐ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合タンパク質を、実施例１１および米国特許第７，４４２，７７８Ｂ２号に記載のように構築して、一方（一価）または両方（二価）のＨＣ単量体のＦｃドメインのループ領域内に［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ毒素ペプチド類似体が挿入された完全抗体を作製した。一価ａＫＬＨ ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂは、３つの鎖：ヒトａＫＬＨ Ａｂ重鎖、ヒトａＫＬＨ Ａｂ軽鎖、および重鎖Ｆｃ領域内のループ内に［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドが挿入されたヒトａＫＬＨ Ａｂ重鎖を含んでいた。Ｆｃループ内の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドは、独立したフォールディングおよびループからの伸長を可能にする、そのＮ末端およびＣ末端と結合した柔軟なリンカー配列を含んでいた。この分子の略図を図１２Ｎに示す。アミノ酸組成および長さの異なるリンカー配列を調べた。一価抗ＫＬＨ ＡｂＬｏｏｐ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ融合Ａｂタンパク質は、Ｋｖ１．３活性の選択的阻害剤であった（Ｋｖ１．１を上回る；１２１倍よりも高いＫｖ１．３選択性；表４Ｈおよび図６Ｅ〜６Ｆ）。一価ａＫＬＨ−ＡｂＬｏｏｐ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子は、ラットにおいて、本発明者らが調べたすべての新規毒素−コンジュゲートの中で最も遅いクリアランスを示した（図２０および図２２および表４Ｌ）。

二価ａＫＬＨ ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂは、２つの鎖：ヒトａＫＬＨ Ａｂ軽鎖、および重鎖Ｆｃ領域内のループ内に［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドが挿入されたヒトａＫＬＨ Ａｂ重鎖を含んでいた。この分子の略図を図１２Ｍに示す。この二価分子のインビボでの薬物動態および安定性を一価型と比較するために、各分子の６ｍｇ／ｋｇ単回皮下投与量をラットに投与した。遅い消失速度を示していたにもかかわらず、二価ａＫＬＨ ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂは、同じ分子の一価型（一価ａＫＬＨ ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６）Ａｂ）よりもラットにおける曝露量が非常に低かった（図２２を参照されたい）。ＡＵＣ０−ｔにより測定された曝露量は、一価ａＫＬＨ ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子に比べて、二価ａＫＬＨ ＨＣ−ループ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ分子では約１６１倍低かった（表４Ｌ）。したがって、本発明者らの新規な一価形態は、同じ分子の典型的な二価型に比べて、予想外でかつ非常に良好なインビボ薬物動態プロファイルを示す。

一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃ／Ｆｃヘテロ二量体
一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃ／Ｆｃヘテロ二量体は２つの鎖を含み、一方はヒトＦｃ（ＩｇＧ２）であり、他方は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ｌ１０リンカー−ヒトＦｃ（ＩｇＧ２）を含む、Ｆｃと融合したＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）ペプチドである。このペプチド融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、３５アミノ酸［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチド、１０アミノ酸ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９２）Ｌ１０リンカー配列およびヒトＦｃ（ＩｇＧ２）配列を含んでいた。したがって、リンカー−Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ３５の後に［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣ末端と結合していた。この分子は一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃヘテロ二量体とも呼ばれる。この一価構築物の略図を図１２Ｃに示す。この分子を、実施例１１に記載のようにクローニングし、発現させ、精製した。精製分子は非常に強力であり、炎症のヒト全血アッセイでのＩＬ−２分泌ブロックにおけるＩＣ５０は０．１１ｎＭであった（表４Ｈ）。その優れた効力にもかかわらず、一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−Ｆｃ／Ｆｃヘテロ二量体は、Ｋｖ１．１に比べて、わずか約１０倍のＫｖ１．３の選択性であった（表４Ｈ）。したがって、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣ末端に結合したこのリンカー−Ｆｃ融合パートナーは、Ｋｖ１．３選択性のさらなる増強をもたらさないと思われる。このことは、約１２２５倍の選択性を示し、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＮ末端Ａｒｇ１残基と結合したＦｃ−リンカー配列を有していた一価Ｆｃ／Ｆｃ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）ヘテロ二量体（表４Ｈ）のような、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫとのＮ末端融合とは対照的である。しかし、重要でありかつ注目すべき例外は、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣｙｓ３５の後に単一のＣ末端Ａｌａ残基付加を含む［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａペプチド（配列番号２３５、実施例３）である。この分子は、Ｋｖ１．１に比べて、２６２倍増強された、向上したＫｖ１．３選択性を示した（表４Ｈ）。したがって、本発明者らは、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣ末端においてＣｙｓ３５の後に付加された特定のアミノ酸残基が、融合タンパク質の選択性プロファイルを変化させ得ると考える。例えば、この実施例に記載されている一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−Ｌ１０−Ｆｃ分子は、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣｙｓ３５の後に付加されたリンカーＧｌｙ残基を含んでいる。もし、代わりにＡｌａ残基がＣｙｓ３５の後に付加されれば、増強されたＫｖ１．３選択性が観察されるであろう。実際、［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａペプチドによる２６２倍向上したＫｖ１．３選択性が見られる。したがって、本発明者らは、融合接合部における特定のアミノ酸残基が選択性プロファイルを変化させるであろうと予想する。リンカー配列内にこれらの残基を［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドとヒトＦｃとの間に組み込んで、コンジュゲートのＫｖ１．３選択性を向上させことは容易であり得る。

一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−ＨＣ ａＫＬＨ Ａｂ
一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−ＨＣ ａＫＬＨ Ａｂは３つの鎖を含み、１つはヒトａＫＬＨ Ａｂ軽鎖、もう１つはヒトａＫＬＨ Ａｂ重鎖、そして３つ目は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ｌ１０リンカー−ヒトａＫＬＨ重鎖を含んでいたペプチド−ａＫＬＨ Ａｂ重鎖融合体である。したがって、この融合体は、Ｃｙｓ３５の後に［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫのＣ末端と結合したリンカー−重鎖領域を含んでいた。一価ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）−ＨＣ ａＫＬＨ Ａｂ分子の略図を図１２Ｉに示す。精製分子は非常に強力であり、炎症のヒト全血アッセイでのＩＬ−２分泌ブロックにおけるＩＣ５０は０．２１４ｎＭであった（表４Ｈ）。サイズが非常に大きく、ヒトＩｇ重鎖と融合しているにもかかわらず、一価［Ｌｙｓ１６］−ａＫＬＨ Ａｂ分子は、Ｔ細胞応答のブロックにおいて高い効力を保持していた。

一価ａＤＮＰ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂ
一価ａＤＮＰ重鎖（ＨＣ）融合抗体（Ａｂ）構築物は、Ｎ末端からＣ末端へ向かってヒト抗ＤＮＰ Ａｂ重鎖−リンカー−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を含み、これは、ヒトａＤＮＰ重鎖およびヒトａＤＮＰ軽鎖と共発現されて、一価ａＤＮＰ Ａｂ−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ分子を形成した。この一価構築物の略図を図１２Ｆに示す。一価ａＤＮＰ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂは、全血におけるＴ細胞炎症を強力にブロックし、０．２７８ｎＭのＩＣ５０でＩＬ−２分泌を抑制した（表４Ｈ）。分子のＫｖ１．３対Ｋｖ１．１選択性を調べるための実験では、意外なことに、一価ａＤＮＰ ＨＣ−ＳｈＫ（１−３５，Ｑ１６Ｋ）Ａｂコンジュゲートが単独の［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫペプチドよりもかなり優れたＫｖ１．３選択性を有することが明らかとなった。この一価Ａｂ−ＳｈＫコンジュゲートは、Ｋｖ１．３のブロックにおいて、Ｋｖ１．１に比べ５８０６倍を超える高い活性であった（表４Ｈ）。

実施例１３
一本鎖（ｓｃ）Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合タンパク質
免疫グロブリンＦｃドメインの治療用タンパク質との融合は、汎用性のある効果的な薬物送達プラットフォームであることが分かっている。従来的には、このプラットフォームにより、治療用ペプチドおよびタンパク質の、免疫グロブリンＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかとの組換え融合が可能である。この技術の拡張には、選択された治療用ポリペプチドの、Ｆｃ配列内の内部配列としての融合が含まれる（米国特許第７，４４２，７７８Ｂ２号）。これらの挿入物は、それらがループドメインであると予測される二次構造の要素を標的とすることから、Ｆｃループ構築物と呼ばれる。インビボでは、こうしたＦｃ融合タンパク質は通常、非常に効果的な治療薬をもたらす、Ｆｃ再利用経路により延長された薬物動態半減期を示す。しかし、Ｆｃ融合タンパク質は、それがＮもしくはＣ末端またはＦｃループ融合体のいずれであるかにかかわらず、Ｆｃの二量体性により通常は二価である（実施例１２を参照されたい）。

実施例１２に記載されているように、場合によっては、Ｆｃ融合体が弾頭部分、すなわち毒素ペプチド類似体部分に関して一価であることが有用である。Ｓｈｋ毒素ペプチド類似体融合体の場合、二価型のＦｃ−Ｓｈｋまたは抗体Ｆｃループ−Ｓｈｋが、インビボにおいてその一価の対応物よりもはるかに迅速に排除されることが観察された（表４Ｈ、表４Ｉ、表４Ｊ、表４Ｋおよび表４Ｌを参照されたい）。この例は、Ｆｃループ挿入またはＣ末端融合のいずれかを用いて、単一コピーのＳｈｋ毒素ペプチド類似体を、一方のＦｃサブユニットのＣ末端を他方のＦｃサブユニットのＮ末端と連結させるのに的確な組成および長さのポリペプチドリンカーと共に組換えにより発現され得るＦｃドメインと結合させることにより、一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）を作出する、一本鎖Ｆｃ−Ｓｈｋ分子の設計、精製および有効性を示している。最初のリンカー設計は、ｈｕＦｃドメインの結晶構造を調べ、Ｎ末端とＣ末端の間のおよその距離を決定することにより、コンピュータで行う。次に、図２４に模式的に示すように、Ｆｃの第一または第二の連続する単量体サブユニットにおいて、２０または２５アミノ酸のいずれかおよびＦｃループ−Ｓｈｋの挿入を用いた、異なる長さのリンカーを有するＦｃループ−Ｓｈｋ融合体を構築した。分子のＦｃ単量体部分の間の２０アミノ酸リンカーおよびＳｈＫ部分の前に別の１０アミノ酸リンカーを有するｓｃＦｃのＣ末端融合体も示す。図２５Ａ〜２５Ｃは、これら３つの構築物のポリペプチド配列を示す。これらの構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌＩ）内で発現され、リフォールディングされ、精製された（図２６Ａ〜２６Ｂ）。最後に、精製分子をインビトロ活性に関して試験し、有効であることが見出された（下の表４Ｍ）。

ｓｃＦｃ−Ｓｈｋの調製
ｓｃＦｃ−Ｓｈｋのクローニングおよび発現：
ヒトＦｃをコードする２つの異なるヌクレオチド配列（７９％一致）を用いてｓｃＦｃを作出した。稀なコドンを除去し、ｍＲＮＡの５’末端近くの二次構造を最小化するために、最初の配列は野生型Ｆｃ配列からの改変を小さくした。二番目は、Ｖｅｒｄｅｚｙｎｅ社（Ｌａｇｕｎａ ＨＩｌｌｓ，ＣＡ）により細菌内での発現に完全に最適化された。２つのＦｃ配列は最初、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｇ_４Ｓ；配列番号２９１）リンカーの３回反復をコードする４５ヌクレオチドにより分離されていた。後の構築物が、リンカーに１つまたは２つの追加の５残基反復を加えることになる。

発現構築物の形成は多種多様であった。発現ベクター（ｐＥＴ３０，Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ ＢＩｏｓｃＩｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ ＤＩｅｇｏ，ＣＡ）および第一Ｆｃドメインコード配列をリンカーの２０ヌクレオチドと共に、プライマー
５’−ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４２０）および
５’−ＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴ−３’（配列番号４２１）
を用いて、予め存在する発現構築物から増幅した。このＰＣＲおよびこの章の他のすべての増幅では、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用した。タッチダウンＰＣＲプロファイルを全体にわたって使用し、アニーリング温度を１０サイクルにわたって６０℃から５１℃まで下げ、次いで５５℃で２０サイクル行った。第二の反応では：第一の反応物の３’末端に相同なリンカーの１５ヌクレオチド；リンカーの残りの２５ヌクレオチド；第二Ｆｃ；および停止コドンも含む第一反応物の５’末端に相同な別の１６ヌクレオチドを、プライマー５’−ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴ−３’（配列番号４２２）および
５’−ＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４２３）
を用いて増幅した。２つのＰＣＲ産物を、プライマー
５’−ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴ−３’（配列番号４２２）および
５’−ＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴ−３’（配列番号４２１）
を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応「ＳｐｌＩｃＩｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ ＥｘｔｅｎｓＩｏｎ」（ＳＯＥ）反応により１５−ヌクレオチド相同リンカー領域で連結した。次いで、この最終ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢＩｏｌａｂｓ，ＮＥＢ，ＩｐｓｗＩｃｈ ＭＡ）で処理し、コンピテント細胞中に形質転換した。停止コドンを含む１６−ヌクレオチド相同領域は、ベクターのインビボでの再環状化のための部位として働いた。

別のＧ_４Ｓをコードする１５ヌクレオチドを上記３回反復の直前に挿入するように設計された２つのプライマー：
５’−ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号４２４）および
５’−ＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴ−３’（配列番号４２５）
で全構築物を増幅することにより、リンカー長を１５残基から２０残基まで伸長した。このＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（ＮＥＢ）で処理し、コンピテント細胞中に形質転換した。スクリーニング工程の間に、１クローンの配列を決定して、この新たに挿入された１５−ヌクレオチド領域の反復を明らかにし、２５−残基リンカー配列を得た。

Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチドリンカーに隣接したＳｈＫ（配列番号１）を、元のｓｃＦｃ作出に使用したものと同様の方法により、Ｆｃ−Ｌ２５−Ｆｃ鎖の第一Ｆｃドメイン内にクローニングした。１つのＰＣＲで、プライマー
５’−ＧＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡ−３’（配列番号４２６）および
５’−ＡＣＣＧＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡ−３’（配列番号４２７）
を用いて、隣接Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチドリンカーをコードする６ヌクレオチドを５’末端および３’末端で付加して全ベクターを増幅した。別の反応では、プライマー
５’−ＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＴＣＧＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＧＡＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴ−３’（配列番号４２８）および
５’−ＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＧＴＴＴＴＡＣＧＡ−３’（配列番号４２９）
を用いて、隣接Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチドリンカー、ならびに第一反応物の対応する末端に相同な、その５’末端に１８ヌクレオチドおよびその３’末端に２０ヌクレオチドを合計で有する、Ｓｈｋ（配列番号１）を増幅した。プライマー
５’−ＧＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡ−３’（配列番号４２６）および
５’−ＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＧＴＴＴＴＡＣＧＡ−３’（配列番号４２９）
を用いたＰＣＲ ＳＯＥ反応により産物を得、これをＤｐｎＩ（ＮＥＢ）による処理後にコンピテント細胞中に形質転換した。残念ながら、１クローンだけ、プライマー
５’−ＣＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴ−３’（配列番号４３０）および
５’−ＧＴＡＴＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＧＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＣＡ−３’（配列番号４３１）
を用いて突然変異誘発の次のラウンドにより除去する必要がある変異を有していることがわかった。

Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＳｈＫ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３６０）をコードする同じＤＮＡ配列を、以下のアミノ酸配列：
ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ
ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号４１３
のＦｃ−Ｌ２５−Ｆｃポリペプチド鎖をコードするＤＮＡの第二Ｆｃドメイン内に、２ラウンドのＰＣＲにより挿入した。３つの重複するプラス鎖プライマーおよび３つの重複するマイナス鎖プライマーがこの領域をカバーした。第一プライマー対：
５’−ＡＡＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡ−３’（配列番号４１４）；および５’−ＴＡＴＣＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＡＣＧＡＧＡＣＧＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号４１５）
を反応１．１に加え；この第一プライマー対および第二プライマー対：
５’−ＡＡＡＴＡＣＣＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号４１６）；および５’−ＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＡＴＴＧＴＡＴＣＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＧＡＣＣＧＣ−３’（配列番号４１７）
の両方を反応１．２に加え；そして、プライマー対１（配列番号４１４および配列番号４１５）ならびにプライマー対２（配列番号４１６および配列番号４１７）ならびに第三のプライマー対：
５’−ＣＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＡＡＡ−３’（配列番号４１８）；および
５’−ＴＧＡＧＴＧＴＴＴＧＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＧＧＧＡＴＴ−３’（配列番号４１９）
をすべて反応１．３に加えた。第二ラウンドのＰＣＲでは、第一ラウンドの産物を鋳型として使用した。反応２．１では、第二プライマー対（配列番号４１６および配列番号４１７）を反応１．１の産物に加えた。反応２．２では、第二および第三プライマー対（それぞれ、配列番号４１６および配列番号４１７；配列番号４１８および配列番号４１９）も反応１．１の産物に加えた。反応２．３および２．４は、反応１．２および１．３の産物に加えられた第三プライマー対（配列番号４１８および配列番号４１９）がを有していた。次いで、これら第二ラウンドの４つの反応産物をすべて混合し、コンピテント細胞を形質転換するために使用した。１クローンだけが的確な挿入を有することがわかったが、２５−残基リンカーがＧ_４Ｓ反復を１つ失っていたことがわかった。

Ｆｃ−Ｌ２０−Ｆｃ−Ｌ１０−［Ｌｙｓ１６］Ｓｈｋ−Ａｌａ（アミノ酸配列を図２５Ｃに示す；配列番号４１０）を作出するための鋳型として、以下をコードするＦｃ−Ｌ２０−ＦｃＤＮＡ構築物：
（ａ）Ｆｃ−Ｌ２０−Ｆｃアミノ酸配列：
ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ
ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ／／配列番号４０８
ならびに
（ｂ）Ｌ１０リンカー（配列番号２９２；下線部）および［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａ（配列番号２３５；太字部分）を含むアミノ酸配列：
ＭＫＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＫＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣＡ／／配列番号４０９
をコードするＣＨ２．Ｌ１０．［Ｌｙｓ１６］Ｓｈｋ−Ａｌａ ＤＮＡ構築物を使用した。１つのＰＣＲで、プライマー：
５’−ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴ−３’９配列番号４３２）および
５’−ＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号４３３）
を用いてＦｃ−Ｌ２０−Ｆｃベクターを増幅する一方、もう１つのＰＣＲでは、プライマー：
５’−ＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号４３４）および
５’−ＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＧＴＴ−３’（配列番号４３５）
を用いて、第一アンプリコンの３’末端に相同な１５ヌクレオチド、Ｌ１０−［Ｌｙｓ１６］ＳｈＫ−Ａｌａおよび第一アンプリコンの５’末端に相同な１５ヌクレオチドを増幅した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（Ｔａｋａｒａ社，ＳｈＩｇａ，Ｊａｐａｎ）のＩｎ−ＦｕｓＩｏｎ（商標）技術を用いて相同領域を融合した。

すべての発現構築物を、化学的にコンピテントなＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＩｎｖＩｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣａｌＩｆｏｒｎＩａ）中に形質転換した。自己誘導（ＡＩ）培地を接種し、３７℃で一晩増殖させた。回収は一般に、接種の１６〜２４時間後であった。２０ｍＬの５０×ＭＩｘ（グルコース１０ｇ；グリセロール５００ｍＬ；ラクトース１００ｇ；アスパラギン酸５ｇ；１００ｍＭ ＭｇＳＯ_４；ｄＨ_２Ｏで１Ｌにしたもの）を１Ｌ ＴＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ）に添加することにより、ＡＩ培地を調製した。

ｓｃＦｃ−Ｓｈｋの精製：
発現されたｓｃＦｃ−Ｓｈｋ構築物を含有する細胞ペーストを０．１ｇ／ｍＬで水に再懸濁させ、マイクロ流動化装置に３回通過させることにより溶解させた。溶解物を遠心分離して封入体をペレット化し、次いで、これを１％デオキシコール酸で１回洗浄した後、２回目に水洗を行った。次いで、洗浄した封入体を、７．２Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ８．５中に０．１ｇ／ｍＬで可溶化した。次いで、可溶化した封入体を、２Ｍ尿素、１５０ｍＭアルギニン、５０ｍＭ ＴｒＩｓ、３ｍＭシステインおよび１ｍＭシスタミンを含有するｐＨ８．５のリフォールディング緩衝液中に４℃で１：２５で希釈することによりリフォールディングした。希釈したリフォールド反応物を４℃で約４８時間、穏やかに攪拌し、次いで、遠心分離により清澄化した後、ろ過した。リフォールドしたｓｃＦｃ−Ｓｈｋ融合体を、ＰＢＳ中プロテインＡセファロースレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、０．１Ｎ酢酸、ｐＨ３．５で溶出した。溶出ピークを中和し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中に透析した。プロテインＡ精製したｓｃＦｃ−Ｓｈｋ構築物を、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中ＳＰセファロースＨＰレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、５０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配を用いてさらに精製した。溶出ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、サイズに基づきプールした。ｓｃＦｃ−Ｓｈｋ構築物に、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中フェニルセファロースＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での疎水相互作用クロマトグラフィーを用いた最終精製段階を行い、直線的な１Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で溶出し、溶出ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに評価した。最終プールを濃縮し、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５中に透析し、無菌ろ過した。最終生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２６Ａ）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（図２６Ｂ）により特徴付けし、実施例２に記載のように、インビトロの全血活性アッセイを行った（表４Ｍ）。

略号
本明細書を通して使用される略号は、特定の状況において別途定義されない限り、以下のように定義される。
Ａｃ アセチル（アセチル化残基を指すために使用）
ＡｃＢｐａ アセチル化ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞傷害
ＡＩｂ アミノイソ酪酸
ｂＡ ベータ−アラニン
Ｂｐａ ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡｃ ブロモアセチル（ＢｒＣＨ_２Ｃ（Ｏ））
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ ベンジル
Ｃａｐ カプロン酸
ＣＢＣ 全血球計算
ＣＯＰＤ 慢性閉塞性肺疾患
ＣＴＬ 細胞傷害性Ｔリンパ球
ＤＣＣ ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）エチル
ＤＮＰ ２，４−ジニトロフェノール
ＤＯＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン
ＤＯＰＥ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＰＰＣ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン
ＤＳＰＣ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン
ＤＴＴ ジチオスレイトール
ＥＡＥ 実験的自己免疫性脳脊髄炎
ＥＣＬ 増強化学発光
ＥＳＩ−ＭＳ 電子スプレーイオン化質量分析
ＦＡＣＳ 蛍光標示式細胞分取
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＬ ホモセリンラクトン
ＩＢ 封入体
ＫＣａ カルシウム依存性カリウムチャネル（ＩＫＣａ、ＢＫＣａ、ＳＫＣａを含む）
ＫＬＨ キーホールリンペットヘモシアニン
Ｋｖ 電位依存性カリウムチャネル
Ｌａｕ ラウリン酸
ＬＰＳ リポ多糖
ＬＹＭＰＨ リンパ球
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析
Ｍｅ メチル
ＭｅＯ メトキシ
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＨＣ 主要組織適合複合体
ＭＭＰ マトリックスメタロプロテイナーゼ
ＭＷ 分子量
ＭＷＣＯ 分子量カットオフ
１−Ｎａｐ １−ナフチルアラニン（ｎａｐｔｈｙｌａｌａｎＩｎｅ）
ＮＥＵＴ 好中球
Ｎｌｅ ノルロイシン
ＮＭＰ Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＯＡｃ 酢酸塩
ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｂｆ ２，２，４，６，７−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン（ｐｅｎｄａｍｅｔｈｙｌｄＩｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）−５−スルホニル
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ 薬力学
Ｐｅｃ ピペコリン酸
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
ｐＧｌｕ ピログルタミン酸
ＰＩｃ ピコリン酸
ＰＫ 薬物動態
ｐＹ リン酸化チロシン
ＲＢＳ リボソーム結合部位
ＲＴ 室温（２５℃）
Ｓａｒ サルコシン
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ セリン−スレオニンキナーゼ
ｔ−Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＣＲ Ｔ細胞受容体
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ 胸腺液性因子
Ｔｒｔ トリチル

Claims (47)

1. 式：
   Ｘ_ａａ ^１Ｘ_ａａ ^２Ｃｙｓ^３Ｘ_ａａ ^４Ａｓｐ^５Ｘ_ａａ ^６Ｘ_ａａ ^７Ｘ_ａａ ^８Ｘ_ａａ ^９Ｘ_ａａ ^１０Ｘ_ａａ ^１１Ｃｙｓ^１２Ｘ_ａａ ^１３Ｘ_ａａ ^１４Ｘ_ａａ ^１５Ｘ_ａａ ^１６Ｃｙｓ^１７Ｘ_ａａ ^１８Ｘ_ａａ ^１９Ｘ_ａａ ^２０Ｘ_ａａ ^２１Ｘ_ａａ ^２２Ｘ_ａａ ^２３Ｘ_ａａ ^２４Ｘ_ａａ ^２５Ｘ_ａａ ^２６Ｘ_ａａ ^２７Ｃｙｓ^２８Ｘ_ａａ ^２９Ｘ_ａａ ^３０Ｘ_ａａ ^３１Ｃｙｓ^３２Ｘ_ａａ ^３３Ｘ_ａａ ^３４Ｃｙｓ^３５Ｘ_ａａ ^３６Ｘ_ａａ ^３７Ｘ_ａａ ^３８／／配列番号４
   のアミノ酸配列を含む組成物またはその薬学的に許容される塩であって：
   Ｘ_ａａ ^１Ｘ_ａａ ^２が存在しない；またはＸ_ａａ ^１が存在せず、かつＸ_ａａ ^２がＧｌｕ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＴｈｒである；またはＸ_ａａ ^１がＡｒｇもしくはＡｌａであり、かつＸ_ａａ ^２がＧｌｕ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＴｈｒであり；
   Ｘ_ａａ ^４がアルキル、塩基性もしくは酸性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^６がＴｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｌａもしくはＬｅｕであり；
   Ｘ_ａａ ^７がＬｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａもしくはＬｙｓであり；
   Ｘ_ａａ ^８がＰｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、１−ＮａｌもしくはＧｌｕであり；
   Ｘ_ａａ ^９がＬｙｓ、Ａｌａ、Ｖａｌもしくは酸性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^１０がＳｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｒｇもしくはＡｌａであり；
   Ｘ_ａａ ^１１がＡｒｇ、ＧｌｕもしくはＡｌａであり；
   Ｘ_ａａ ^１３がＴｈｒ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、１−ＮａｌもしくはＧｌｕであり；
   Ｘ_ａａ ^１４がＧｌｎ、Ａｌａもしくは酸性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^１５がアルキルもしくは芳香族アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^１６が、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＧｌｕもしくはＡｒｇ以外の塩基性、アルキルもしくは芳香族アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^１８がＡｌａまたは酸性もしくは塩基性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^１９がＴｈｒ、Ａｌａもしくは塩基性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^２０がＳｅｒ、Ａｌａもしくは塩基性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^２１が、ＡｌａもしくはＭｅｔ以外のアルキルもしくは芳香族アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^２２がＬｙｓもしくはＡｌａであり；
   Ｘ_ａａ ^２３がＴｙｒもしくはＡｌａであり；
   Ｘ_ａａ ^２４がＡｒｇ、ＬｙｓもしくはＡｌａであり；
   Ｘ_ａａ ^２５がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｌａであり；
   Ｘ_ａａ ^２６がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａもしくは芳香族アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^２７がＬｅｕ、Ａｌａ、Ａｓｎもしくは芳香族アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^２９が１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ａｌａもしくは塩基性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^３０がＡｌａまたは酸性もしくは塩基性アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^３１がＴｈｒ、Ａｌａもしくは芳香族アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^３３がＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、１−ＮａｌもしくはＧｌｕであり；
   Ｘ_ａａ ^３４がＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓもしくは芳香族アミノ酸残基であり；
   Ｘ_ａａ ^３６、Ｘ_ａａ ^３７およびＸ_ａａ ^３８がそれぞれ、独立して存在しないか、または独立して中性、塩基性、酸性もしくはＮ−アルキル化アミノ酸残基であり；
   かつ：
   残基Ｃｙｓ^３と残基Ｃｙｓ^３５の間にジスルフィド結合が存在し；
   残基Ｃｙｓ^１２と残基Ｃｙｓ^２８の間にジスルフィド結合が存在し；
   残基Ｃｙｓ^１７と残基Ｃｙｓ^３２の間にジスルフィド結合が存在し；かつ
   カルボキシ末端残基が任意にアミド化されている、
   前記組成物またはその薬学的に許容される塩。
2. Ｘ_ａａ ^４が、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｉｔ、ホモシトルリン、Ｏｉｃ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、Ｔｉｃ、Ｄ−Ｔｉｃ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｇｕｆ、および４−アミノ−Ｐｈｅ、Ｔｈｚ、Ａｉｂ、Ｓａｒ、Ｐｉｐ、Ｂｉｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｎ^αメチル−Ａｒｇ；ホモアルギニン、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、α−アミノアジピン酸、およびパラ−カルボキシル−フェニルアラニンから選択される、請求項１の組成物。
3. Ｘ_ａａ ^４が、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＧｌｕおよびＡｓｐから選択される、請求項１の組成物。
4. Ｘ_ａａ ^９およびＸ_ａａ ^１４の酸性アミノ酸残基がそれぞれ独立して、Ｇｌｕ、Ａｓｐおよびα−アミノアジピン酸から選択される、請求項１の組成物。
5. Ｘ_ａａ ^１５のアルキルまたは芳香族アミノ酸残基が、Ａｌａ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕから選択される、請求項１の組成物。
6. Ｘ_ａａ ^１５のアルキルまたは芳香族アミノ酸残基が、Ｐｈｅ、ＡｌａおよびＩｌｅから選択される、請求項１の組成物。
7. Ｘ_ａａ ^１６が、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ １−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｐｉｐ、２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、アルファ−メチル−リジン、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）_２、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）_３、パラ−メチル−Ｐｈｅ、ＡＭｅＦおよびホモＰｈｅから選択される、請求項１の組成物。
8. Ｘ_ａａ ^１８およびＸ_ａａ ^３０の塩基性または酸性アミノ酸残基がそれぞれ独立して、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＴｒｐおよびＰａｃから選択される、請求項１の組成物。
9. Ｘ_ａａ ^１９、Ｘ_ａａ ^２０およびＸ_ａａ ^２９の塩基性アミノ酸残基がそれぞれ独立して、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、１Ｐｉｐ、２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎαメチル−Ａｒｇ；ホモアルギニン、Ｃｉｔ、Ｎα−メチル−Ｃｉｔ、ホモシトルリン、Ｇｕｆおよび、および４−アミノ−Ｐｈｅ、およびＮ−Ｍｅ−Ｏｒｎから選択される、請求項１の組成物。
10. Ｘ_ａａ ^２１が、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ［Ｏ］、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ［Ｏ_２］、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、パラ−メチル−Ｐｈｅ、アルファ−メチル−ＰｈｅおよびホモＰｈｅから選択される、請求項１の組成物。
11. Ｘ_ａａ ^２６、Ｘ_ａａ ^２７、Ｘ_ａａ ^３１およびＸ_ａａ ^３４の芳香族アミノ酸残基がそれぞれ独立して、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択される、請求項１の組成物。
12. Ｘ_ａａ ^３６、Ｘ_ａａ ^３７およびＸ_ａａ ^３８が、存在すれば、それぞれ独立してＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ−アミド、Ａｉｂ−アミド、Ｓｅｒ−アミド、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ−アミド、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−アミド、ベータ−ＡｌａおよびＮ−Ｍｅ−Ａｌａから選択される、請求項１の組成物。
13. カルボキシ末端残基がアミド化されている、請求項１の組成物。
14. Ｘ_ａａ ^３６が存在する、請求項１の組成物。
15. 配列番号１０、１５、１５５、１５７、１６４、１６５、１６７から１７２、１７９、１９４、１９６、２０３から２０６、２１１、２１４から２２５、２３１、２３２、２３３、２３６、２３８、２３９、２４２から２５４、２６０、２６３および２６５から２７３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１の組成物。
16. Ｘ_ａａ ^４がＡｌａ、Ｉｌｅ、ＬｙｓまたはＧｌｕであり；かつ
    Ｘ_ａａ ^１６がＬｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ １−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｐｉｐ、２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、またはＮ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、アルファ−メチル−リジン、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）_２、Ｌｙｓ（Ｎ^ε−Ｍｅ）_３、パラ−メチル−Ｐｈｅ、アルファ−メチル−Ｐｈｅ、またはホモＰｈｅである、
    請求項１の組成物。
17. Ｘ_ａａ ^１８が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰａｃまたはＡｌａである、請求項１６の組成物。
18. Ｘ_ａａ ^２０が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、１Ｐｉｐ、２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、Ｎ−Ｍｅ−ＬｙｓまたはＮ−Ｍｅ−Ｏｒｎである、請求項１７の組成物。
19. Ｘ_ａａ ^２９が、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、１Ｐｉｐ、２Ｐａｌ、３Ｐａｌ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎである、請求項１８の組成物。
20. Ｘ_ａａ ^３０が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＰａｃから選択される、請求項１９の組成物。
21. 任意でのリンカー部分と、薬学的に許容される、共有結合した半減期延長部分とをさらに含む、請求項１または１３から２０のいずれかの組成物。
22. 半減期延長部分が、分子量約１０００Ｄａから約１０００００Ｄａのポリエチレングリコール、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、トランスサイレチンまたはヒト血清アルブミンである、請求項２１の組成物。
23. 半減期延長部分が、ヒト免疫グロブリンもしくはヒト免疫グロブリンＦｃドメインまたはその両方を含む、請求項２１の組成物。
24. 図１２Ａから図１２Ｎのいずれかに記載の構造を有する、請求項２３の組成物。
25. 一価ヘテロ二量体Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合体を含む、請求項２３の組成物。
26. 請求項１または１３から２０のいずれかの組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
27. 請求項２１の組成物と、薬学的に許容される担休とを含む、医薬組成物。
28. ３３から約１００アミノ酸残基長の毒素ペプチド類似体を含む、請求項１または１３から２０のいずれかの組成物。
29. ３３から約１００アミノ酸残基長の毒素ペプチド類似体を含む、請求項２１の組成物。
30. 多発性硬化症の少なくとも１つの症状の再発を予防または軽減する方法であって、予防有効量の請求項１または１３から２０のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
31. 治療有効量の請求項１または１３から２０のいずれかの組成物を投与することを含む、自己免疫障害の治療方法。
32. 自己免疫障害が、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、レスチノシス（ｒｅｓｔｉｎｏｓｉｓ）、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶反応、移植片対宿主病および狼瘡からなる群より選択される、請求項３１の治療方法。
33. 予防有効量の請求項２１の組成物を投与することを含む、多発性硬化症の症状の再発を予防または軽減する方法。
34. 治療有効量の請求項２１の組成物を投与することを含む、自己免疫障害の治療方法。
35. 自己免疫障害が、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、レスチノシス（ｒｅｓｔＩｎｏｓＩｓ）、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶反応、移植片対宿主病および狼瘡からなる群より選択される、請求項３４の方法。
36. 配列番号１３のアミノ酸配列を含む長さ約１００アミノ酸残基以下の毒素ペプチド類似体を含む組成物であって、
    配列番号１３の残基Ｃｙｓ^３と残基Ｃｙｓ^３５の間にジスルフィド結合が存在し；
    配列番号１３の残基Ｃｙｓ^１２と残基Ｃｙｓ^２８の間にジスルフィド結合が存在し；
    配列番号１３の残基Ｃｙｓ^１７と残基Ｃｙｓ^３２の間にジスルフィド結合が存在し；かつ
    カルボキシ末端残基が任意にアミド化されている前記組成物。
37. 任意でのリンカー部分と、薬学的に許容される、共有結合した半減期延長部分とをさらに含む、請求項３６の組成物。
38. 半減期延長部分が、分子量約１０００Ｄａから約１０００００Ｄａのポリエチレングリコール、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、トランスサイレチンまたはヒト血清アルブミンである、請求項３７の組成物。
39. 半減期延長部分が、ヒト免疫グロブリンもしくはヒト免疫グロブリンＦｃドメインまたはその両方を含む、請求項３７の組成物。
40. 図１２Ａから図１２Ｎのいずれかに記載の構造を有する、請求項３９の組成物。
41. 一価ヘテロ二量体Ｆｃ−毒素ペプチド類似体融合体を含む、請求項３９の組成物。
42. 請求項３６の組成物であって、その一次配列内に、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ−アミド、ＡＩｂ−アミド、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ−アミド、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−アミド、ベータ−ＡｌａおよびＮ−Ｍｅ−Ａｌａから選択される追加のアミノ酸残基を、配列番号１３のカルボキシ末端においてさらに含む前記組成物。
43. カルボキシ末端残基がアミド化されている、請求項３６の組成物。
44. 請求項３６から４３のいずれかの組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
45. 治療有効量の請求項３６から４３のいずれかの組成物を投与することを含む、自己免疫障害の治療方法。
46. 自己免疫障害が、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、レスチノシス（ｒｅｓｔＩｎｏｓＩｓ）、全身性硬化症、線維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶反応、移植片対宿主病および狼瘡からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
47. 予防有効量の請求項３６から４３のいずれかの組成物を投与することを含む、多発性硬化症の症状再発を予防または軽減する方法。

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