FI86887C - Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning - Google Patents
Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning Download PDFInfo
- Publication number
- FI86887C FI86887C FI863041A FI863041A FI86887C FI 86887 C FI86887 C FI 86887C FI 863041 A FI863041 A FI 863041A FI 863041 A FI863041 A FI 863041A FI 86887 C FI86887 C FI 86887C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- sequence
- amino acids
- fusion protein
- plasmid
- dna
- Prior art date
Links
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 83
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 32
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims description 4
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 4
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 claims 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 10
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 5
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- -1 succinoyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical group OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- MKVKKORBPTUSNX-LPEHRKFASA-N Cys-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N MKVKKORBPTUSNX-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N Leu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O KSZCCRIGNVSHFH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- PCTFVQATEGYHJU-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PCTFVQATEGYHJU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- AKFLVKKWVZMFOT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AKFLVKKWVZMFOT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMRIDJQAEZFTSC-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydro-1h-tetrazole Chemical compound N1NC=NN1 YMRIDJQAEZFTSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 4-methylbenzenethiol Chemical compound CC1=CC=C(S)C=C1 WLHCBQAPPJAULW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100439299 Caenorhabditis elegans cgt-3 gene Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N Cys-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108010038281 D1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- WSDOHRLQDGAOGU-BQBZGAKWSA-N His-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 WSDOHRLQDGAOGU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DYKZGTLPSNOFHU-DEQVHRJGSA-N His-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N DYKZGTLPSNOFHU-DEQVHRJGSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- DDVHDMSBLRAKNV-IHRRRGAJSA-N Leu-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DDVHDMSBLRAKNV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C([O-])=O KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100205180 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N Pro-Gly-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- LNOWDSPAYBWJOR-PEDHHIEDSA-N Pro-Ile-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LNOWDSPAYBWJOR-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- ZJXXCGZFYQQETF-CYDGBPFRSA-N Pro-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZJXXCGZFYQQETF-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N Ser-Asn-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- DVIIYMVCSUQOJG-QEJZJMRPSA-N Trp-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DVIIYMVCSUQOJG-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N anhydrous collidine Natural products CC1=CC=NC(C)=C1C HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N collidine Natural products CC1=CC=C(C)C(C)=N1 UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 1
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical group CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N methyl dihydrogen phosphate Chemical group COP(O)(O)=O CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N sym-collidine Natural products CC1=CN=C(C)C(C)=C1 GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150100816 trpD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150079930 trpGD gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
, 86887
Fuusioproteiineja, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö
Valmistettaessa geeniteknisin menetelmin pienehköjä 5 eukarioottisia proteiineja, joiden molekyylipaino on korkeintaan noin 15 000 daltonia, saadaan bakteereissa tuotetuksi usein vain pieni saanto. Isännän omat proteaasit pilkkovat otaksuttavasti nopeasti muodostuneita proteiineja. Mainitun kaltaiset on siksi usein tarkoituksenmukaista val-10 mistaa fuusioproteiineina, erityisesti sellaisina, jotka sisältävät myöhemmin poistettavan isännälle ominaisen pro-teiiniosan.
Nyt on havaittu, että E.colin trp-operonia vastaavan D-proteiinin osa, joka koostuu vain noin 70 aminohaposta, 15 soveltuu erityisen hyvin fuusioproteiinien muodostamiseen; tämä osa on aminohapposekvenssin alueella 23-93 /C. Yanofsky et ai.. Nucleic Acids Res. 9 (1981) 66477 ja siitä käytetään jäljempänä myös nimitystä "D-peptidi". Tämän peptidin karboksyylipään ja halutun eukaryoottisen proteiinin 20 aminohapposekvenssin välissä on yhdestä tai useammasta geneettisesti kooditettavissa olevasta aminohaposta koostuva jakso, joka mahdollistaa halutun proteiinin kemiallisen tai entsymaattisen lohkaisun. Tämän keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa aminopäähän liittyy lyhyt aminohapposek-25 venssi, joka koostuu jaksosta Lys-Ala, joita seuraa mahdollisesti jakso, joka koostuu 1-10, erityisesti 1-3 muusta geneettisesti koodattavissa olevasta aminohaposta, edullisesti kahdesta aminohaposta ja erityisesti jaksosta Lys-Gly.
30 Keksintö koskee siten fuusioproteiinia, jolla on yleinen kaava
Met-X-D1 -Y-Z, n ' 35 jossa n on 0 tai 1; x on 1-12 geneettisesti kooditettavis- 86887 2 sa olevasta aminohaposta koostuva jakso, edullisesti Lys-Ala; D' on E. colin trp-operonia vastaavan D-pepti-din aminohapposekvenssin 23-93 alueella oleva, noin 70 aminohaposta koostuva jakso; Y on yhdestä tai useammasta 5 geneettisesti kooditettavissa olevasta aminohaposta koostuva jakso, joka mahdollistaa itseään seuraavan aminohappo-sekvenssin Z lohkeamisen ja Z on geneettisesti kooditettavissa olevista aminohapoista koostuva jakso.
Keksinnön muita puolia ja edullisia suoritusmuotoja Lo kuvataan seuraavassa ja ne määritellään patenttivaatimuksissa .
On luonnollisesti edullista, että fuusioproteiinin epätoivottava (isännälle ominainen) osa on mahdollisimman pieni, sillä tällöin solu tuottaa vain vähän "painolastia" L5 ja halutun proteiinin saanto on siten suuri. Lisäksi tällöin syntyy epätoivottavan osan lohkaisun yhteydessä vähemmän sivutuotteita, mikä helpottaa tuotteen käsittelyä. Edellä mainittua vastaan toimii se, että epätoivottavan osuuden (otaksuttu) suojausvaikutus on odotettavissa vasta 20 tietystä koosta alkaen. Yllättävästi on nyt käynyt ilmi, että keksinnön mukaisesti valittu D-proteiinin segmentti täyttää tämän tehtävän, vaikka siinä on vain noin 70 aminohappoa .
Useissa tapauksissa, ennen kaikkea sen edullisen 25 suoritusmuodon yhteydessä, jossa X on Lys-Ala tai sisältää N-päässään tämän jakson, muodostuu liukenematon fuu-sioproteiini. Tämä on helposti erotettavissa liukenevista proteiineista, mikä helpottaa suuresti käsittelyä ja suurentaa saantoa. Liukenemattoman fuusioproteiinin muodos-30 tuminen on yllättävää, sillä bakteerille ominainen osa, noin 70 aminohappoa, on sangen pieni ja on toisaalta rakenneosana isäntäsolussa liuenneena olevassa proteiinissa.
"Noin 70 aminohappoa D-peptidin aminohapposekvenssin alueella 23-93" tarkoittaa sitä, että variaatiot ovat 35 sinänsä tunnetulla tavalla mahdollisia, ts voidaan jättää 3 86887 pois tai vaihtaa yksittäisiä aminohappoja keksinnön mukaisten fuusioproteiinien ominaisuuksien muuttumatta merkitsevästi. Tällaiset variaatiot kuuluvat myös keksinnön piiriin.
5 Haluttu eukaryoottinen proteiini on edullisesti biologisesti aktiivinen proteiini, kuten hirudiini, tai tällaisen proteiinin esiaste, kuten ihmisen proinsuliini.
Fuusioproteiinia tuotetaan edullisesti sopivassa systeemissä tapahtuvan ilmentymisen kautta, ja eristetään 10 erityisen edullisessa suoritusmuodossa isäntäsolujen rikkomisen jälkeen sakasta, johon se rikastuu niukkaliukoisuu-tensa vuoksi. Siten on mahdollista tehdä helposti erottaminen solun liukenevista aineosista.
Isäntäsoluina tulevat kyseeseen lähinnä bakteeri-15 isäntäsysteemit, edullisesti E. coli, sillä onhan fuusio-proteiinin bakteeriperäinen osa E. colille ominainen proteiini.
DNA-sekvenssi, joka kcodaa keksinnön mukaista fuusioproteiinia, sisällytetään tunnetulla tavalla vektoriin, 20 joka ilmentyy hyvin valitussa iimentymissysteemissä.
Bakteeri-isännässä käytettävät promoottori ja operaattori on edullisesti ^-faagin Lac, Tae, PL tai PR, hsp, omp tai synteettinen promoottori, joita kuvataan esi-merkiksi DE-hakemusjulkaisussa 3 430 683 (EP-hakemusjulkai-.··. 25 su 0 173 149) .
Erityisen edullinen on vektori, joka sisältää E.
I colin trp-operonista seuraavat elementit: promoottorin, operaattorin ja L-peptidir, ribosomisitoutumiskohdan. Koo-'*·' daavaan alueeseen liittyy erityisen tarkoituksenmukaisesti 30 tämän L-peptidin kolme ensimmäistä aminohappoa, minkä jäl- keen seuraavat lyhyen aminohapposekvenssin jälkeen D-pro-: teiinin aminohapot 23-93.
: .·. Välisekvenssi Y, joka mahdollistaa halutun polypep- tidin lohkeamisen, määräytyy tämän halutun peptidin koos- 4 86837 tumuksen mukaan. Kun tämä ei esimerkiksi sisällä metio-niinia, voi Y olla Met, jonka kohdalta voidaan tehdä kemiallinen lohkaisu bromisyaanilla. Jos liittävän osan Y karboksyylipäässä on kysteiini tai Y on Cys, voidaan teh-5 dä entsymaattinen kysteiinispesifinen lohkaisu tai kemiallinen lohkaisu esimerkiksi spesifisen S-syanuloinnin jälkeen. Jos siltaosan Y karboksyylipäässä on tryptofaani tai Y on Trp, voidaan tehdä kemiallinen lohkaisu N-bromi-sukkinimidillä. Jos Y on Asp-Pro, voidaan tehdä sinänsä 10 tunnetulla tavalla /6. Piszkiewics et ai.. Biochemical ja Biophysical Research Communications 40 (1970) 1173-1178/7 proteolyyttinen lohkaisu. Asp-Pro-sidoksesta voidaan, kuten on havaittu, tehdä vielä herkempi hapoilla, kun Y on (AspJ^-Pro tai Glu-(AspJ^-Pro, jolloin m on 1, 2 tai 3.
15 Tällöin saadaan lohkeamistuotteitä, jotka alkavat N-pääs-tään Pro-ryhmällä tai päättyvät C-päästään Asp-ryhmään.
Tunnetaan myös esimerkkejä entsymaattisista lohkai-suista, joissa voidaan käyttää myös muunnettuja entsyymejä, joilla on parannettu spesifisyys /vert C.S. Craik et ai., 20 Science 228 (1985) 291-297/. Jos haluttu eukaryoottinen entsyymi on ihmisen proinsuliini, voidaan valita jaksoksi Y peptidisekvenssi, jossa trypsiinillä lohkaistavissa oleva aminohappo (Arg, Lys) on sitoutunut proinsuliinin N-terminaaliseen aminohappoon (Phe), esimerkiksi Ala-Ser-Met-Thr-25 Arg, sillä tällöin voidaan tehdä arginiinispesifinen lohkaisu trypsiiniproteaasilla. Ellei haluttu proteiini sisällä aminohappojaksoa Ile-Glu-Gly-Arg, on mahdollinen myös lohkaisu tekijä Xa:lla (EP-hakemusjulkaisu 0 161 937).
Jakson Y muodostuksessa on mahdollista käyttää hyväk-30 si myös synteettisiä mahdollisuuksia ja rakentaa soveltuvia restriktioentsyymipilkkomiskohtia. Aminohapposekvenssiä Y vastaava DNA-sekvenssi voi siten toimia myös kytkijä-tai adapteri-jaksona.
Ilmentyminen keksinnön mukaisena fuusioproteiinina 35 tapahtuu edullisesti E.colin trp-operonin ohjauksessa, trp- 5 86887 operonin promoottorin ja operaattorin sisältävä DNA-jakso on kaupallisesti saatava, trp-operonin ohjauksessa tapahtuvaa proteiineina ilmentymistä on kuvattu runsaasti kirjallisuudessa, esimerkiksi EP-hakemusjulkaisussa nro 5 0 036 776 (A2). trp-operonin indusointi voidaan saada aikaan L-tryptofaanin poissaololla alustasta ja/tai indo-lyyli-3-akryylihapon läsnäololla alustassa.
trp-operonin ohjauksen alaisena tapahtuu ensin L-peptidin, joka koostuu 14 aminohaposta, transkriptio.
10 Tämä L-peptidi sisältää kulloinkin asemissa 10 ja 11 L- tryptofäänin. L-peptidin proteiinisynteesin nopeus määrää sen, tapahtuuko samalla seuraavan rakennegeenin translaatio vai katkeaako proteiinisynteesi. Kun L-tryptofaanista on puutetta, tapahtuu L-peptidin hidas synteesi L-trypto-15 faania vastaavan tRNA:n pienen pitoisuuden vuoksi, ja sen jälkeen tapahtuu seuraavan proteiinin synteesi. L-trypto-faanipitoisuuden ollessa suuri tulee vastaava mRNA-jakso sitä vastoin nopeasti luetuksi, ja tapahtuu proteiinibio-synteesin katkeaminen, koska mRNArlla on terminaattorin 20 kaltainen rakenne /C. Yanofsky et ai., loc. sit^.
mRNA:n translaatiotiheyteen vaikuttaa voimakkaasti aloituskodonin lähellä olevien nukleotidien laatu, trp-operonin avulla tapahtuvan fuusioproteiini-ilmentymi-sen yhteydessä on siksi edullista käyttää L-peptidin en-25 simmäisiä aminohappoja vastaavia nukleotideja fuusiopro- teiinin rakennegeenin alkuna. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa valittiin trp-systeemin yhteydessä L-peptidin kolmea ensimmäistä aminohappoa (tästedes L'-peptidi) vastaavat nukleotidit fuusioproteiinin N-terminaalisia amino-30 happoja vastaaviksi kodoneiksi.
Keksintö koskee siksi myös fuusioproteiinien ilmen-tymisvektoreita, edullisesti plasmideja, joissa vektorin DNA sisältää 5'-päästä lukien seuraavat tunnusmerkilliset osat (soveltuvassa järjestyksessä ja faasissa): pro-35 moottorin, operaattorin, ribosomisitoutumiskohdan ja fuu- 6 86887 sioproteiinin rakennegeenin, jolloin viimeksi mainittu sisältää aminohapposekvenssin I (liite) ennen halutun proteiinin sekvenssiä. Rakennegeenin edessä tai sen ensimmäisenä triplettinä on aloituskodoni (ATG) ja mahdolli-5 sesti muita aminohappoja vastaavia lisäkodoneja, jotka sijaitsevat aloituskodonin ja D‘-sekvenssin tai D'-sekvenssin ja haluttua proteiinia vastaavan geenin välissä. Halutun proteiinin aminohappokoostumuksen mukaan valitaan sellainen rakennegeeniä edeltävä DNA-jakso, joka mahdollistaa pg halutun proteiinin lohkeamisen fuusioproteiinista.
Keksinnön mukaisena fuusioproteiinina tapahtuvan ilmentymisen yhteydessä voi osoittautua tarkoituksenmukaiseksi muuttaa ATC-aloituskodonin jälkeisiä, ensimmäisiä aminohappoja vastaavia yksittäisiä triplettejä mahdollisen 15 mRNA-tasolla tapahtuvan emäspariutumisen estämiseksi. Tällaiset muutokset, samoin kuin D'-proteiinin yksittäisten aminohappojen muutokset, deleetiot ja lisäykset ovat alan ammattimiehelle tuttuja ja kuuluvat samoin keksinnön piiriin.
20 Koska pienehköillä plasmideilla on monia etuja, keksinnön edullisessa muodossa poistetaan plasmideista, jotka ovat pBR322-pohjaisia, tetrasykliiniresistenssira-kennegeenin sisältävä DNA-jakso. Edullisesti poistetaan segmentti, joka ulottuu asemassa 29 olevasta HindIII-kat-25 keamiskohdasta asemassa 2066 olevaan PvuII-katkeamiskoh-taan. Keksinnön mukaisten plasmidien yhteydessä on erityisen tarkoituksenmukaista poistaa vielä vähän suurempi DNA-jakso, jolloin käytetään hyväksi trp-operonin alussa (luentasuunnassa) olevaa PvuII-katkeamiskohtaa (joka si-30 jaitsee ei-välttämättömässä osassa). Siten voidaan muodostunut suuri fragmentti, jonka molemmissa päissä on PvuII-katkeamiskohta, ligatoida suoraan. Saatu, noin 2 keP:n (kiloemäsparin) verran lyhentynyt plasmidi saa aikaan ilmentymisen voimistumisen, joka johtaa mahdollises-35 ti myös kopiolukumäärän kasvuun isäntäsolussa.
7 86887
Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavissa esimerkeissä.
Esimerkki 1 a) Kromosomaalinen E.coli-DNA pilkotaan Hinfl:llä, 5 ja eristetään 492 emäsparin fragmentti, joka sisältää trp-operonista promoottorin, operaattorin, L-peptidin ra-kennegeenin, attenuaattorin ja trp-E-rakennegeenin kuutta ensimmäistä aminohappoa vastaavat kodonit. Tämä fragmentti täydennetään Klenow-polymeraasin avulla deoksinukleotidi-10 trifosfaateilla, liitetään molemmista päistään öligonukleo-tidiin, joka sisältää Hindlll-tunnistuskohdan ja pilkotaan uudelleen HindIII:lla. Siten saatu HindIII-fragmentti li-gatoidaan pBR322:n Hindlll-katkeamiskohtaan. Siten saadaan plasmidi ptrpE2-l /j.C. Edmann et ai., Nature 291 (1981) 15 503-506.7· Tämä muutetaan kirjallisuudessa kuvatulla taval la plasmidiksi ptrpLl.
Synteettisten oligonukleotidien (Nl) ja N2) 5’ CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3' (Nl) 5' CCT TTG CTT TCA TTG T 3' (N2) 20 avulla, jotka komplementoituvat kaksisäikeiseksi oligo-nulkeotidiksi (N3) 5' CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3' /kto.
(N3) 3' T GTT ACT TTC GTT TCC 5' muodostetaan plasmidin ptrpLl Clal-kohtaan L-peptidin 25 kolmea ensimmäistä aminohappoa vastaava DNA-sekvenssi samoin kuin restriktiokohta (Stul) muun DNA:n insertiota varten (kuva 1). Plasmidin ptrpLl annetaan reagoida valmistajan ohjeiden mukaisesti Clal-entsyymin kanssa, uutetaan seos fenolilla, ja saostetaan DNA etanolilla. Avatun plas-30 midin annetaan reagoida alkalisen fosfataasin kanssa fos-faattiryhmien poistamiseksi 5’-päistä. Synteettiset nukleotidit fosforyloidaan 5’-päistään ja liitetään T4-DNA-ligaasin avulla fosfataasilla käsiteltyyn, avattuun plas-midiin. Ligantointireaktion mentyä loppuun seuraa E.coli 35 294:n transformointi ja transformanttien valikointi Amp- 86887 8 resistenssin ja Stul-restriktiokohdan läsnäolon perusteella.
Noin 80 %:ssa saaduista klooneista oli odotettu restriktiokohta; kuvassa 1 annettu nukleotidisekvenssi määritettiin sekvenssianalyysillä. Saadaan plasmidi pH120/14, 5 joka sisältää L-peptidin ribosomisitoutumiskohdan jälkeen L-peptidin kolmea ensimmäistä aminohappoa vastaavat nuk-leotiditripletit (L'-peptidi) ja niiden jälkeen Stul-koh-dan, joka puolestaan mahdollistaa lisä-DNA:n insertoinnin ja siten fuusioproteiinien muodostamisen L-peptidin kol-10 men ensimmäisen aminohapon kanssa.
b) Seuraavassa valaistaan käyttäen esimerkkinä edellä käytettyä oligonukleotidia (Nl) tällaisen oligo-nukleotidin kemiallista synteesiä: M.J. Gaitin et ai. menetelmällä /Nucleic Acids 15 Research 8 (1980) 1081-1096/ sidotaan 3'-päässä oleva nuk-leosidi, tässä tapauksessa siis guanosiini, kovalentti-sesti lasihelmikantajalle /CPG (= kontrolloitu huokoslasi, controlled pore glass) LCAA (= pitkäketjuinen alkyyliamii-ni, long chain alkyl amine), valmistaja Pierce/ 3'-pään 20 funktionaalisen hydroksyyliryhmän kautta. Tällöin annetaan guanosiinin reagoida N-2-isobutyroyyli-3'-O-sukkino-yy1i-5'-dimetoksitrityylieetterinä N,N 1-disykloheksyyli-karbodi-imidin ja 4-dimetyyliaminopyridiinin läsnäollessa muunnetun kantajan kanssa, jolloin sukkinoyyliryhmän va-25 paa karboksyyliryhmä asyloi kantajalla olevan pitkäketjui-sen amiinin aminoryhmän.
Seuraavissa synteesivaiheissa käytetään emäskompo-nentteja 51-O-dimetoksitrityylinukleosidi-3'-fosforihappo-monometyyliesteridialkyyliamidin tai -kloridin muodossa, 30 jolloin adeniini on N6-bentsoyyliyhdisteenä, sytosiini N4-bentsoyyliyhdisteenä, guaniini N2-isobutyryyliyhdisteenä ja aminoryhmiä sisältämätön tyrniini suojaamattomana.
40 mg kantajaa, johon on sidottuna l^umol guano-siinia, käsitellään peräkkäin seuraavilla aineilla: 35 a) metyleenikloridi, b) 10 % trikloorietikkahappoa metyleenikloridissa, 9 86887 c) metanoli, d) tetrahydrofuraani, e) asetonitriili, f) 15^umol vastaavaa nukleosidifosfiittia ja 70^,umol 5 tetratsolia 0,3 ml:ssa vedetöntä asetonitriiliä (5 min), g) 20 % etikkahappoanhydridiä tetrahydrofuraanissa, joka sisältää 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniä (2 min), h) tetrahydrofuraani, 10 i) tetrahydrofuraani, joka sisältää 20 % vettä ja 40 % lutidiinia, j) 3 % jodia seoksessa, joka sisältää kollidiinia, vettä ja tetrahydrofuraania tilavuussuhteessa 5:4:1, k) tetrahydrofuraani ja 15 1) metanoli.
"Fosfiitilla" tarkoitetaan tässä yhteydessä deoksi-riboosi-3'-monofosforihappomonometyyliesteriä, jossa kolmas valenssi on tyydytetty kloorilla tai tertiaarisella aminoryhmällä, esimerkiksi di-isopropyyliamiiniryhmällä.
20 Yksittäisten synteesivaiheiden saanto voidaan kulloinkin määrittää detritylointireaktion b) jälkeen spektrofotomet-risesti mittaamalla dimetoksitrityylikationin absorptio aallonpituudella 496 nm.
Kun oligonukleotidisynteesi on saatettu loppuun, 25 poistetaan oligomeerin metyylifosfaattisuojausryhmät p-tio-kresolin ja trietyyliamiinin avulla.
Sen jälkeen oligonukleotidi irrotetaan kiinteältä kantajalta käsittelemällä 3 tuntia ammoniakilla. Oligo-meerien 2-3 vrk kestävä käsitteleminen väkevällä ammo-30 niakilla poistaa kvantitatiivisesti emästen aminosuojaus-ryhmät. Siten saatu raakatuote puhdistetaan suurpainenes-tekromatografiän (HPLC) tai polyakryyliamidigeelielektro-foreesin avulla.
Muut oligonukleotidit syntetisoidaan aivan vastaa-35 valla tavalla.
86887 10 c) Plasmidin ptrpE5-l /R.A. Hallewell et al.f Gene 9 (1980) 27-477 annetaan reagoida restriktioentsyy-mien Hindlll ja Sali kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja poistetaan noin 620 emäsparin pituinen DNA-5 fragmentti. Synteettiset oligonukleotidit (N4) ja (N5) 5' AGC TTC CAT GAC GCG T 3' (N4) 5' ACG CGT CAT GGA 3' (N5) fosforyloidaan, inkuboidaan yhdessä 37°C:ssa ja liitetään DNA-ligaasin avulla proinsuliinia vastaavaan tylppäpäiseen 10 DNA-jaksoon /W. Wetwkam et ai., Gene 19 (1982) 179-1837. HindIII:n ja Sali:n kanssa tapahtuneiden reaktioiden jälkeen liitetään täten pidentynyt proinsuliini-DNA T4-DNA-ligaasientsyymin avulla kovalenttisesti plasmidiin, joka on avattu, jolloin saadaan plasmidi pH106/4 (kuva 2).
15 Plasmidin pHl06/4 annetaan seuraavaksi reagoida vielä kerran Sali:n kanssa, täydennetään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla tylpiksi päiksi, ja inkuboidaan sitten entsyymin MstI kanssa. Eristetään noin 500 emäsparin DNA-fragmentti, joka sisältää koko proinsulii-20 nia koodittavan osan sekä E.colin trp-operonista noin 210 emäsparin D-proteiinia koodittavan jakson. Tämä DNA-fragmentti on tylppäpäinen, ja se insertoidaan plasmidin pH12Q/14 Stul-kohtaan, jolloin saadaan plasmidi pH154/25 (kuva 3). Tämä soveltuu trp-operonin ohjauksessa tapah-25 tuvaan fuusioproteiini-ilmentymiseen,jossa proteiinissa L'- ja D1-peptidiä seuraa aminohapposekvenssi Ala-Ser-Met-Thr-Arg, johon liittyy proinsuliinin aminohapposekvenssi .
Esimerkki 2 30 Plasmidin pH154/25 (kuva 3) annetaan reagoida rest- riktioentsyymien BamHI ja Xmalll kanssa. Yksisäikeiset päät täydennetään Klenow-polymeraasin avulla ja liitetään T4-DNA-ligaasia käyttäen. Saadaan plasmidi pH254 (kuva 4), joka soveltuu aminohapposekvenssin L',D'-proinsuliinia 35 sisältävän fuusioproteiinin tuottamiseen trp-promootto- 11 86887 rin ohjauksessa. Plasmidi on jonkin verran pienempi kuin pH154/25, mikä saattaa olla edullista.
Esimerkki 3
Inkuboimalla plasmidia pH254 (esimerkki 2, kuva 4) 5 restriktioentsyymien MluI ja Sali kanssa irrotetaan 280 emäsparin DNA-jakso, joka poistetaan. Loppuosa plasmidista muutetaan tylppäpäiseksi Klenow-polymeraasin avulla ja syklisoidaan kovalenttisesti takaisin DNA-ligaasia käyttäen. Täten saadaan plasmidi pH255 (kuva 4), johon voidaan 1Q sijoittaa rakennegeeni johonkin restriktiokohdista MluI,
Sali ja EcoRI. Induktio-olosuhteissa tapahtuu L*-D'-proteiini jakson sisältävän fuusioproteiinin muodostuminen. Plasmidiin pH255 voidaan luonnollisesti lisätä muita rest-riktiokohtia soveltuvien kytkijöiden avulla.
15 Esimerkki 4
Plasmidia pHl54/25 (kuva 3) inkuboidaan entsyymien MluI ja EcoRI kanssa, ja poistetaan vapautunut DNA-fragmentti (noin 3Q0 emäsparia). Loppuosa plasmidista täydennetään Klenow-polymeraasilla. Renkaan sulkeminen tehdään DNA-ligaasin 20 avulla. Muodostuneeseen plasmidiin pH256 (kuva 5) voidaan sijoittaa rakennegeeni EcoRI-kohtaan.
Esimerkki 5
Poistamalla 600 emäsparin fragmentti plasmidista pH256 (esimerkki 4, kuva 5) restriktioentsyymien BamHI ja 25 NruI avulla saadaan plasmidi pH257 (kuva 5). Tämä tehdään inkuboimalla pH256:a ensin BamHI:n kanssa ja muodostamalla tylpät päät Klenow-polymeraasin avulla. Kun plasmidia on inkuboitu NruI:n kanssa ja poistettu 600 emäsparin fragmentti, muodostetaan pH257 inkuboimalla DNA-ligaasin kanssa.
30 Esimerkki 6 . . Sijoittamalla lac-repressori /P.J. Farabaugh, Natu re 274 (1978) 765-7697 plasmidiin pKK 177-3 /Amann et ai., Gene 25 (1983) 1677 saadaan plasmidi pJF118. Tämän annetaan reagoida EcoRI:n ja Sali:n kanssa, ja eristetään loppu-35 osa plasmidista.
12 8 6 8 S 7
Plasmidista pHl06/4 (kuva 2) erotetaan Sallin avulla ja inkuboimalla Mstlin kanssa noin 495 emäsparin fragmentti.
Synteettisesti valmistetut oligonukleotidit (N6) 5 ja (N7) 5' ACG AAT TCA TGA AAG CAA AGG 3' (N6) 5' CCT TTG CTT TCA TGA ATT CGT 3' (N7) fosforyloidaan ja liitetään DNA-ligaasin avulla tylppäpäiseen DNA-fragmenttiin. Antamalla reagoida EcoRIin ja Sallin 10 kanssa vapautetaan komplementaariset päät, jotka mahdollistavat ligatoinnin avattuun plasmidiin pJFH8.
Kun on tehty E.Colin transformointi siten saadulla hybridiplasmidilla, valikoidaan oikeat kloonit restriktio-fragmenttien koon perusteella. Tästä plasmidista käytetään 15 merkintää pJ120 (kuva 6).
Fuusioproteiinien tuotanto toteutetaan ravistuspul-loissa seuraavastii Kun E.coli-transformantteja, jotka sisältävät plasmidia pJ120, on viljelty yön yli LB-alustassa (J.H. Miller, Experiments on Molecular Genetics, Cold Spring 20 Harbor Laboratory, 1972) , johon on lisätty 50^ug/ml ampi-silliinia, laimennetaan viljelmä suunnilleen suhteessa li 100, ja seurataan kasvua mittaamalla optista tiheyttä.
Kun optinen tiheys (OD) on 0,5, lisätään isopropyyli- -D-galaktopyranosidia (IPTG) pitoisuudeksi 1 mM, ja erote-25 taan bakteerit 150-180 minin kuluttua sentrifugoimalla.
Bakteereja keitetään 5 min puskuriseoksessa (7 mol/1 ureaa, 0,1 % SDSia, 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 7,0), ja siirretään näytteet SDS-geelielektroforeesilevyille. Elektroforeesissa saadaan bakteereista, jotka sisältävät plas-30 midia pJ120, proteiinivyöhyke, jonka koko vastaa odotettua fuusioproteiinia ja reagoi insuliinin vasta-aineiden kanssa. Kun fuusioproteiini on eristetty, voidaan haluttu pro-insuliinijohdos vapauttaa bromisyaanilohkaisulla. Kun bakteerit on rikottu (French-puristin; Dyno-Miihle) ja 35 sentrifugoitu, on L1-D'-proinsuliinifuusioproteiini sakassa, 13 86887 niin että jo supernatanttiin voidaan erottaa huomattavia määriä muita proteiineja.
Annetut induktio-olosuhteet pätevät ravistusviljel-mille; suurempien fermentointien ollessa kyseessä ovat 5 vastaavasti muutetut OD-arvot ja mahdollisesti hieman muutetut IPTG-pitoisuudet tarkoituksenmukaisia.
Esimerkki 7 E.coli-transformantteja, jotka sisältävät plasmidia pH154/25 (kuva 3), viljellään yön yli LB-alustassa, joka 10 sisältää 5Cyjg/ml ampisilliinia, ja laimennetaan viljelmä seuraayana aamuna suunnilleen suhteessa 1:100 M9-alustalla (J.H. Miller, loc.cit.), joka sisältää 2000^,ug/ml kasamino-happoja ja l^ug/ml tiamiinia. OD-arvon ollessa 0,5 lisätään indolyyli-3-akryylihappoa loppupitoisuudeksi15yUg/ml. 2-3 15 tunnin inkuboinnin jälkeen bakteerit erotetaan sentrifugoi-malla. SDS-elektroforeesissa näkyy fuusioproteiinille odotetussa kohdassa sangen selvä proteiinivyöhyke, joka reagoi insuliinin vasta-aineiden kanssa. Bakteerien rikkomisen ja sentrifugoinnin jälkeen L',D'-proinsuliinifuusioprote-20 iini on sakassa, niin että tälläkin kertaa supernatanttiin jää huomattavia määriä muita proteiineja.
Myös tässä tapauksessa pätevät annetut indusointi-olosuhteet ravistusviljelmille. Suurempitilavuuksiset fer-mentoinnin vaativat muutettuja kasaminihappopitoisuuksia 25 tai L-tryptofäänin lisäämistä.
Esimerkki 8
Plasmidi pH154/25 (kuva 3) avataan EcoRIrllä, ja täydennetään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla. Siten saatua DNA:ta inkuboidaan Mlul-entsyymin kanssa, ja 30 irrotetaan insuliinia koodittava DNA plasmidista. Tekemällä elektroforeettinen käsittely erotetaan tämä fragmentti plas-midin loppuosasta, ja eristetään tämä loppuosa.
DE-hakemusjulkaisun 3 249 430 /EP-hakemusjulkaisun 0 171 024.7 kuvan 3 mukaisen plasmidin annetaan reagoida 35 restriktioentsyymien Accl ja Sali kanssa, ja erotetaan hiru- 86887 14 diinisekvenssin sisältävä DNA-fragmentti. Kun Sall-kat- kaisukohtien yksisäikeiset päät on täydennetty Klenow-poly- meraasin avulla, ligatoidaan DNA-segmentti synteettiseen DNA:han, jolla on kaava (N8).
5 Met Thr 5' CCC ACG CGT ATG ACG T 3' „.Ttn (No) 3' GGG TGC GCA TAC TGC ATA 5'
Ligaatiotuotetta inkuboidaan Mlul:n kanssa. Kun entsyymi on inaktivoitu 65°C:ssa, käsitellään DNA-seosta alkalisella 10 naudan fosfataasilla tunnin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen fos-fataasi ja restriktioentsyymi poistetaan seoksesta fenolilla uuttamalla, ja puhdistetaan DNA saostamalla etanolilla. Siten käsitelty DNA sijoitetaan avattuun loppuosaan plas-midista pHl54/25 T4-ligaasin avulla, jolloin saadaan plas-15 midi pK150, joka karakterisoitiin restriktioanalyysillä ja Maxam-Gilbert-menetelmällä tehdyllä DNA-sekventoinnilla (kuva 7).
Esimerkki 9 E.coli 294-bakteereja, jotka sisältävät plasraidia 20 pK15Q (kuva 7), kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää ?Q-5Qy.ug/ml ampisilliinia, yön yli 37°C:ssa. Viljelmä laimennetaan suhteessa 1:100 M9-alustalla, joka sisältää 2Q00^ug/tnl kasciminohappoja l^ug/mltiamiinia, ja inkuboidaan 37°C:ssa koko ajan sekoittaen. Kun OD600-arvO on 0,5 25 tai 1, lisätään indolyyli-3-akryylihappoa loppupitoisuu- deksi 15^ug/m] ja inkuboidaan 2-3 tai 16 tuntia. Sen jälkeen erotetaan bakteerit sentrifugoimalla ja rikotaan ne 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa (pH 6,5) paineella. Niukkaliu-koiset proteiinit erotetaan sentrifugoimalla, ja analysoi-30 daan SDS-polyakryyliamidielektroforeesilla. Osoittautuu, että solut, joiden trp-operoni on indusoitu, sisältävät uuden proteiinin, joka on pienempi kuin 20 000 mutta suurempi kuin 14 000 daltonia ja jota ei ollut indusoimatto-missa soluissa. Eristämällä fuusioproteiini ja antamalla 35 sen reagoida bromisyaanin kanssa vapautuu hirudiinia.
15 8 68 57
Esimerkki 10
Seuraavassa kuvataan rakenteita, jotka tekevät mahdolliseksi sijoittaa trp-D-sekvenssin 5·-pään eteen DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät mahdollisimman runsaasti eri-5 laisten restriktioentsyymien tunnistuskohtia, jotta voitaisiin sijoittaa trp-D-sekvenssi mahdollisimman yleisesti mitä erilaisimpiin prokaryoottisiin ilmentymissysteemeihin.
Plasmidit pUC12 ja pUC13 (Pharmacia P-L Biohemicals, 54Q1 St. Goar: The Molecular Biology Catalogue 1983, liite IQ s 89) sisältävät poly-kytkijäsekvenssin, jolloin plasmi-diin pUC13 voidaan sijoittaa restriktiokohtien Xmal ja Sacl väliin plasmidista pl06/4 (kuva 2) saatava Mstl-Hind- III-trp-fragmentti, joka on fuusioitu plasmidista pK150 (kuva 7) saatavan Hindlll-hirudiini-SacI-fragmentin kanssa. 15 Tämä tehdään käsittelemällä plasmidin pUC13 DNA en sin restriktioentsyymillM Xmal. Linearisoidun plasmidin päät täydennetään Klenow-polymeraasin avulla. Kun DNA on saostettu etanolilla, se käsitellään Sacl-entsyymillä ja saostetaan uudelleen reaktioseoksesta etanolin avulla.
20 DNA:n annetaan sitten reagoida vesipitoisessa ligaatioseok-sessa plasmidista pHl06/4 eristetyn Mst-HindIII-trp-D-frag-mentin ja plasmidista pK150 eristetyn Hindlll-SacI-hirudii-nifragmentin kanssa T4-DNA-ligaasin läsnäollessa.
Siten saatu plasmidi pK160 sisältää nyt välittömäs-25 ti ennen trp-D-sekvenssin alkua moninkertaisen restriktio-entsyymitunnistussekvenssin, jossa on katkaisukohdat entsyymeille Xmal, Smal, BamHI, Xbal, Hindi, Sali, Accl,
PstI ja Hindlll. Tällä konstruktiolla saadaan aikaan lisäksi hirudiinisekvenssin 3'-pään taakse EcoRI-katkeamis-30 kohta (kuva 8).
Esimerkki 11
Plasmidi pHl31/5 valmistetaan seuraavasti DE-patent-tihakemuksen 35 14 113 esimerkin 1 kuvan 1 mukaisesti): • Plasmidi ptrpLl £).C. Edman et ai., Nature 291 (1981) 35 503-5067 avataan Clalrllä ja ligatoidaan synteettisesti 86887 16 valmistettuun itsekomplementaariseen oligonukleotidiin (N9) 5' pCGACCATGGT 3' (N9)
Siten saatu plasmidi pH131/5 (kuva 9) avataan muo-5 dostuneesta Ncol-restriktiokohdasta, ja täydennetään muodostuneet yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla. Linearisoitu tasapäinen DNA pilkotaan sitten EcoRI-entsyy-millä, ja erotetaan suurempi muodostuneista DNA-sekvens-seistä pienemmästä saostamalla etanolilla. Siten saatu 2o plasmidin pH131/5 jäljelle jäänyt DNA ligatoidaan sitten pK160:sta saatuun trp-D'-hirudiinia koodittavaan fragmenttiin T4-ligaasin avulla. Tämä fragmentti eristettiin plas-midista pKl60 avaamalla se Hindi- ja EcoRI-entsyymeillä. Fragmentti erotetaan geelielektroforeesin avulla loppu-25 osasta plasmidia ja eluoidaan sitten geeliltä. Ligaatio- tuotteella transformoidaan E.coli K12. Plasmidi-DNA:ta sisältävät kloonit eristetään ja karakterisoidaan restriktio-analyysillä ja DNA-sekventoinnilla. Siten saatu plasmidi pK170 sisältää trp-operoniin fuusioituneena DNA-sekvenssin, 20 joka koodaa jaksoa Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-trp-D'-(hirudiini) (kuva 9).
Esimerkki 12
Plasmidi pJF118 (esimerkki 6) avataan EcoRI:llä, ja muutetaan muodostuneet yksisäikeiset DNA-päät tylppä-25 päisiksi Klenow-polymeraasin avulla. Siten käsitelty DNA
pilkotaan sitten Sali-entsyymillä ja erotetaan geelielektro-foreettisesti lyhyestä EcoRI-Sall-fragmentista.
Plasmidi pK170 (esimerkki 11) pilkotaan NcoI:llä, ja täydennetään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin 30 avulla. Plasmidi-DNA erotetaan reaktioseoksesta etanolilla saostamalla ja käsitellään Hindlll- ja BamHI-entsyy-meillä. Muodostuneista fragmenteista eristetään kaksi, nimittäin NcoI(päät täydennetty)-trpD'-Hindlll-fragmentti ja Hindlll-hirudiini-BamHI-fragmentti (DE-hakemusjulkaisu 35 3 429 430). Molemmat fragmentit eristetään geelielektrofo- reettisesti.
86887 17
Lisäksi eristetään DE-hakemusjulkaisun 3 429 430 kuvan 2 mukainen BamHI-Säll-hirudiinill-fragmentti. Sitten annetaan näiden neljän fragmentin, ts loppuosan pJF118-plasmidista, NcoI-trpD'-HindIII-fragmentin, Hindlll-hiru-5 diini-BamHI-fragmentin ja hirudiinill-fragmentin, liga-toitua toisiinsa, ja transformoidaan saadulla plasmidilla pKl80 (kuva 10) E.coli K12-W 3110. Oikeat plasmidit tunnistetaan siitä, että plasmidi-DNAtssa on havaittavissa EcoRI-trpD'-hirudiini-Sall-fragmentti. trpD'-hirudiini-sekvenssi 10 liittyy nyt tac-promoottoriin. Fuusioproteiinia tuotetaan esimerkin 6 mukaisesti.
Es imerkki 13
Plasmideissa, jotka ovat peräisin pBR322:sta, kuten pH120/14:ssä (esimerkki 1, kuva 1), pH154/25:ssä (esimerkki 15 1, kuva 3), pH256:ssa (esimerkki 4, kuva 5), pK150:ssä (esimerkki 8, kuva 7) ja pK 170:ssä (esimerkki 11, kuva 9) on - kuvissa myötäpäivään katsottuna - fuusioproteiinin aloituskodonin ja seuraavan Hindlll-kohdan (joka vastaa pBR322:n asemassa 29 olevaa Hindlll-kohtaa) välissä yli-20 määräinen PvuII-kohta sen fragmentin alueella, joka sisältää trp-promoottorin ja -operaattorin, mutta kuitenkin promoottorialueen ulkopuolella.
Nyt on todettu, että poistamalla se DNA-jakso, jota rajoittavat edellä kuvattu PvuII-kohta ja PvuII-kohta, 25 joka vastaa pBR322:ssa asemaa 2066, suurenee kloonatun proteiinin (eli fuusioproteiinin) saanto selvästi.
Seuraavassa kuvataan esimerkinomaisesti plasmidin pHl54/25 lyhentämistä plasmidiksi pHl54/25x, joka toimenpide voidaan tehdä vastaavalla tavalla muille edellä mai-30 nituille plasmideille (jolloin lyhennettyjen plasmidien tunnuksena käytetään samalla tavalla tähteä): pH154/25:n annetaan reagoida (valmistajan ohjeiden mukaisesti) PvuIIrn kanssa, jolloin muodostuu kolme fragmenttia: 35 Fragmentti 1:
Proinsuliinin PvuII-restriktiokohdasta pBR322:n 86 8 87 18 asemaa 2066 vastaavaan PvuII-restriktiokohtaan,
Fragmentti 2: trp-promoottorin lähellä olevasta PvuII-restriktio-kohdasta proinsuliinin PvuII-kohtaan ja 5 Fragmentti 3: trp-promoottorifragmentin lähellä olevasta PvuII-kohdasta pBR322:n asemaa 2066 vastaavaan PvuII-kohtaan.
Fragmentit voidaan erottaa agaroosilla elektroforeettisesti ja eristää sitten (Maniatis et ai., Molecular Cloning Cold Spring Harbor 1.982). 10 Fragmentit 1 ja 2 liitetään toisiinsa "tylppä pää"- olosuhteissa T4-DNA-ligaasientsyymin avulla. Kun on tehty E.coli 294:n transformointi, todetaan, missä kolonneissa on täydellisen proinsuliinisekvenssin sisältävä plasmidi ja fragmentit siten halutussa järjestyksessä. Kuva 11 15 esittää plasmidia pH154/25x.
Tehtäessä ilmentäminen, joka tapahtuu edellä olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla, havaitaan fuusiopro-teiinin osuuden selvä kohoaminen.
Esimerkki 14 20 Plasmidi pH154/25x (esimerkki 13, kuva 11) käsitel lään HindIII:lla ja Sall:llä, ja erotetaan pieni fragmentti (joka sisältää proinsuliinisekvenssin) geelielektro-foreettisesti. Suuri fragmentti eristetään ja ligantoi-daan synteettiseen DNA:han (N10).
25 (Ala)Trp Glu Asp Pro Met Ile Glu (Gly) (Arg) A GCT TGG GAG GAT CCT ATG ATC GAG GG (N10) ACC CTC CTA GGA TAC TAG CTC CCA GCT Saadaan plasmidi plntl3 (kuva 13).
DNA (N10) koodittaa aminohapposekvenssiä, joka si-30 sältää useita kemialliseen pilkkomiseen soveltuvia katkea-miskohtia: a) Met bromisyaanille, b) Trp N-bromisukkinimidi1le (NBS eli BSI) c) Asp-Pro proteolyyttiseen katkaisuun, jolloin edellä 35 oleva Glu lisää vielä Asp-Pro-sidoksen herkkyyttä happojen vaikutukselle.
i9 868 87 Tämä Hindlll-Sall-kytkijän (N10) sijoittaminen koo-ditetun polypeptidin lukukehykseen antaa siis edellä mainitun mahdollisuuden tehdä kemiallinen lohkaisu, halutun proteiinin aminohapposekvenssin tai sen lohkaisureagenssi-5 herkkyyden mukaan.
Kuvat eivät ole oikeassa mittasuhteessa.
20 86887
Aminohapposekvenssi_I
2 3
Ser Asn Orly His Asn Vai Val lie l o
Tyr Arg Asn His lie Pro Ala Gin 20
Thr Leu lie Glu Arg Leu Ala Thr 3 o
Met Ser Asn Pro Val Leu Met Leu 4 o
Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser
Glu Ala Gly Cys Met Pro Glu Leu 5 o
Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu 6 0
Pro lie lie Gly lie Cys Leu Gly / o ^ 9 3
His Gin Ala He Val Glu Ala 21 868 87
DNA-sekvenssi I
Ser Asn Gly His Asn Vai Vai Ile
AGC AAT GGG CAT AAC GTG GTG ATT
. ·
1 O
Tyr Arg Asn His Ile Pro Ala Gin
TAC CGC AAC CAT ATA CCG GCG CAA
• · 20
Thr Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr
ACC TTA ATT GAA CGC TTG GCG ACC
5 0 # ♦ • 30
Met Ser Asn Pro Vai Leu Met Leu
ATG AGT AAT CCG GTG CTG ATG CTT
• # 40
Ser Pro Gly Pro Gly Vai Pro Ser
TCT CCT GGC CCC GGT GTG CCG AGC
100 *
Glu Ala Gly Cys Met Pro Glu Leu
GAA GCC GGT TGT ATG CCG GAA CTC
• · 50
Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu
CTC ACC CGC TTG CGT GGC AAG CTG
150 e 60
Pro Ile Ile Gly Ile Cys Leu Gly
CCC ATT ATT GGC ATT TGC CTC GGA
• » · 70
His Gin Ala Ile Vai Glu Ala
Cat CAG GCG ATT GTC GAA GCT
20 0
Claims (12)
1. Fuusioproteiini, tunnettu siitä, että sillä on yleinen kaava 5 Met-Xn-D' -Y-Z, jossa n on nolla tai 1; X on 1 - 12 geneettisesti koostettavissa olevasta aminohaposta koostuva sekvenssi; D' 10 on E. colin trp-operonia vastaavan D-peptidin aminohappo-sekvenssin 23 - 93 alueella oleva, noin 70 aminohaposta koostuva jakso; Y on yhdestä tai useammasta geneettisesti kooditettavissa olevasta aminohaposta koostuva jakso, joka mahdollistaa itseään seuraavan aminohapposekvenssin Z 15 lohkeamisen ja Z on geneettisesti kooditettavissa olevista aminohapoista koostuva jakso.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että n on 1 ja X käsittää korkeintaan 5 aminohappoa, jolloin jaksossa X on edullisesti
20 N-terminaalinen jakso Lys-Ala.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että Y sisältää C-termi-naalisen ryhmän Met, Cys, Trp, Arg, Lys tai jonkin ryhmistä (Asp^-Pro, Glu-(Asp)m-Pro tai Ile-Glu-Gly-Arg, 25 jolloin m on 1,2 tai 3, tai koostuu näistä aminohapoista tai jostakin näistä ryhmistä.
4. Yhden tai useamman edeltävän patenttivaatimuksen mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että Z on ihmisen proinsuliinin tai hirudiinin aminohappo- 30 sekvenssi.
5. Menetelmä yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen fuusioproteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tätä fuusioproteiinia koodaava geenirakenne saatetaan ilmentymään bakteeri-isäntäsolus- 35 sa, edullisesti E.colissa ja erotetaan fuusioproteiini. 23 8 6 8 8 7
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geenirakenteessa koodittaa jaksoa (Dr) DNA-sekvenssi I (liite) ja/tai geenirakenteessa koodittaa jaksoa X DNA-sekvenssi (koodittava säie) 5 5' AAA GCA AAG GGC 3f, ja/tai geenirakenne valitaan siten, että fuusioproteiini on liukenematon ja/tai geenirakenne on faasissa vektorissa, joka sisältää E. colln trp-operonista promoottorin, operaattorin ja L-peptidin ribosomisitoutumiskohdan.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on pBR322-johdos, jossa pBR322-DNA:sta on poistettu jakso, joka ulottuu asemassa 29 olevasta HindiII-kohdasta asemassa 2066 olevaan PvuII-kohtaan.
8. Geenirakenne, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimusten 1-4 mukaisia fuusiopro-teiineja.
9. Vektori, edullisesti plasmidin pBR322 johdos, jossa pBR322-DNA:sta on poistettu jakso, joka ulottuu 20 asemassa 29 olevasta HindiII-kohdasta asemassa 2066 olevaan PvuII-kohtaan, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen genirakenteen.
10. Bakteeri-isäntäsolujen ilmentymissysteemi, edullisesti E. coli-systeemi, tunnettu siitä, et- 25 tä se sisältää patenttivaatimuksen 9 mukaisen vektorin.
11. Menetelmä eukaryoottisen proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1-4 mukaisesta fuusioproteiinista lohkaistaan aminohapposekvenssi Z kemiallisesti tai entsymaattisesti.
12. Plasmidi, tunnettu siitä, että se on pH154/25 (kuva 3), pH254 (kuva 4), pH255 (kuva 4), pH256 (kuva 5), pH257 (kuva 5), pH120/14 (kuva 1), pK150 (kuva 7), pK160 (kuva 8), pKl70 (kuva 9), pK180 (kuva 10), pH154/25* (kuva 11), pH256*, joka vastaa kuvassa 5 esi- 35 tettyä pH256, josta PvuII:11a saatu fragmentti on pois- 24 8 6 8 S 7 tettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, pH120/14*, joka vastaa kuvassa 1 esitettyä pHl20/14, josta PvuII:lla saatu fragmentti on poistettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, pKl50*, joka vastaa kuvassa 7 esitettyä pK 150, josta 5 PvuIIilla saatu fragmentti on poistettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, pK170* joka vastaa kuvassa 9 esitettyä pK170, josta Pvu-II:lla saatu fragmentti on poistettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, tai plntl3 (kuva 12). 25 8 6 8 S 7
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3526995 | 1985-07-27 | ||
| DE19853526995 DE3526995A1 (de) | 1985-07-27 | 1985-07-27 | Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863041A0 FI863041A0 (fi) | 1986-07-24 |
| FI863041L FI863041L (fi) | 1987-01-28 |
| FI86887B FI86887B (fi) | 1992-07-15 |
| FI86887C true FI86887C (fi) | 1992-10-26 |
Family
ID=6276985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863041A FI86887C (fi) | 1985-07-27 | 1986-07-24 | Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0211299B1 (fi) |
| JP (1) | JPH07113040B2 (fi) |
| KR (1) | KR950000299B1 (fi) |
| AT (1) | ATE50596T1 (fi) |
| AU (1) | AU595221B2 (fi) |
| CA (1) | CA1336329C (fi) |
| DE (2) | DE3526995A1 (fi) |
| DK (1) | DK172618B1 (fi) |
| ES (1) | ES2000278A6 (fi) |
| FI (1) | FI86887C (fi) |
| GR (1) | GR861957B (fi) |
| HU (1) | HU197356B (fi) |
| IE (1) | IE59127B1 (fi) |
| IL (1) | IL79522A (fi) |
| NO (1) | NO175640C (fi) |
| NZ (1) | NZ216967A (fi) |
| PT (1) | PT83065B (fi) |
| ZA (1) | ZA865556B (fi) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE3781819T2 (de) * | 1986-03-12 | 1993-01-07 | Imcera Group Inc | Hybride expressionsvektoren, deren herstellung und verwendungen. |
| WO1988010299A1 (en) * | 1987-06-24 | 1988-12-29 | Novo-Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| IL95495A (en) * | 1989-08-29 | 1996-10-16 | Hoechst Ag | Fusion proteins their preparation and use |
| US5358857A (en) * | 1989-08-29 | 1994-10-25 | The General Hospital Corp. | Method of preparing fusion proteins |
| US5227293A (en) * | 1989-08-29 | 1993-07-13 | The General Hospital Corporation | Fusion proteins, their preparation and use |
| GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| DE3942580A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von hirudin |
| ES2218622T3 (es) | 1996-07-26 | 2004-11-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada. |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| US8507221B2 (en) | 2007-09-21 | 2013-08-13 | Cadila Healthcare Limited | Process for the expression of peptides of interest using GCSF as a fusion partner |
| DK2349324T3 (en) | 2008-10-17 | 2017-12-11 | Sanofi Aventis Deutschland | COMBINATION OF AN INSULIN AND A GLP-1 AGONIST |
| KR101836070B1 (ko) | 2009-11-13 | 2018-03-09 | 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 | Ｇｌｐ－１ 작용제, 인슐린 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 조성물 |
| ES2965209T3 (es) | 2009-11-13 | 2024-04-11 | Sanofi Aventis Deutschland | Composición farmacéutica que comprende desPro36exendina-4(1-39)-Lys6-NH2 y metionina |
| CN103179978A (zh) | 2010-08-30 | 2013-06-26 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | Ave0010用于制造供治疗2型糖尿病用的药物的用途 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| ES2550357T3 (es) | 2011-08-29 | 2015-11-06 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Combinación farmacéutica para su uso en el control glucémico en pacientes de diabetes de tipo 2 |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| HRP20230470T1 (hr) | 2014-12-12 | 2023-07-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Formulacija fiksnog omjera inzulin glargin/liksisenatid |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| KR20200080748A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법 |
| KR20200080747A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| JPS62502586A (ja) * | 1985-03-18 | 1987-10-08 | ジ−ン ラブズ，インコ−ポレイテツド | ハイブリツド遺伝子カセツトベクタ− |
| GB8507666D0 (en) * | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Wellcome Found | Epidermal growth factor production |
| EP0220234B1 (en) * | 1985-04-08 | 1994-08-03 | Genetic Systems Corporation | EXPRESSION AND DIAGNOSTIC USE OF gag ENCODED PEPTIDES WHICH ARE IMMUNOLOGICALLY REACTIVE WITH ANTIBODIES TO LAV |
-
1985
- 1985-07-27 DE DE19853526995 patent/DE3526995A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-19 DE DE8686109945T patent/DE3669175D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-19 EP EP86109945A patent/EP0211299B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-19 AT AT86109945T patent/ATE50596T1/de active
- 1986-07-24 FI FI863041A patent/FI86887C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-24 ES ES8600544A patent/ES2000278A6/es not_active Expired
- 1986-07-25 NZ NZ216967A patent/NZ216967A/xx unknown
- 1986-07-25 IL IL79522A patent/IL79522A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 NO NO863000A patent/NO175640C/no unknown
- 1986-07-25 CA CA000514682A patent/CA1336329C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-25 GR GR861957A patent/GR861957B/el unknown
- 1986-07-25 IE IE197786A patent/IE59127B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 ZA ZA865556A patent/ZA865556B/xx unknown
- 1986-07-25 AU AU60565/86A patent/AU595221B2/en not_active Expired
- 1986-07-25 HU HU863100A patent/HU197356B/hu unknown
- 1986-07-25 DK DK198603554A patent/DK172618B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 PT PT83065A patent/PT83065B/pt unknown
- 1986-07-26 JP JP61176558A patent/JPH07113040B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-26 KR KR1019860006142A patent/KR950000299B1/ko not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0211299A3 (en) | 1988-06-01 |
| DK355486D0 (da) | 1986-07-25 |
| DK172618B1 (da) | 1999-03-01 |
| EP0211299B1 (de) | 1990-02-28 |
| HUT43629A (en) | 1987-11-30 |
| KR950000299B1 (ko) | 1995-01-13 |
| FI863041A0 (fi) | 1986-07-24 |
| JPH07113040B2 (ja) | 1995-12-06 |
| NZ216967A (en) | 1988-08-30 |
| JPS6229600A (ja) | 1987-02-07 |
| PT83065B (pt) | 1989-02-28 |
| FI86887B (fi) | 1992-07-15 |
| CA1336329C (en) | 1995-07-18 |
| DE3526995A1 (de) | 1987-02-05 |
| IL79522A0 (en) | 1986-10-31 |
| IE59127B1 (en) | 1994-01-12 |
| DK355486A (da) | 1987-01-28 |
| IE861977L (en) | 1987-01-27 |
| ES2000278A6 (es) | 1988-02-01 |
| ATE50596T1 (de) | 1990-03-15 |
| AU595221B2 (en) | 1990-03-29 |
| PT83065A (de) | 1986-08-01 |
| IL79522A (en) | 1991-08-16 |
| AU6056586A (en) | 1987-01-29 |
| EP0211299A2 (de) | 1987-02-25 |
| FI863041L (fi) | 1987-01-28 |
| NO863000D0 (no) | 1986-07-25 |
| ZA865556B (en) | 1987-03-25 |
| DE3669175D1 (de) | 1990-04-05 |
| NO175640C (no) | 1994-11-09 |
| KR870001312A (ko) | 1987-03-13 |
| NO863000L (no) | 1987-01-28 |
| GR861957B (en) | 1986-11-25 |
| NO175640B (fi) | 1994-08-01 |
| HU197356B (en) | 1989-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI86887C (fi) | Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning | |
| IL95495A (en) | Fusion proteins their preparation and use | |
| JP2694840B2 (ja) | ポリペプチドを微生物により発現させる方法 | |
| EP0234888B1 (en) | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof | |
| US4366246A (en) | Method for microbial polypeptide expression | |
| US5648244A (en) | Production, purification, cleavage and use of fusion peptides | |
| DK172210B1 (da) | Hirudinderivater | |
| US4356270A (en) | Recombinant DNA cloning vehicle | |
| CA1297813C (en) | Process for production of insulin-like growth factor i | |
| US6051399A (en) | Production of C-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs | |
| FI93734B (fi) | Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita | |
| Sung et al. | Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequences enhance accumulation of human proinsulin synthesized in Escherichia coli. | |
| IE57664B1 (en) | The preparation of polypeptides having an amide carboxyl terminal end | |
| Kempe et al. | Production and characterization of growth hormone releasing factor analogs through recombinant DNA and chemical techniques | |
| US4711847A (en) | Preparation of secretin | |
| US5545564A (en) | Vector for expression and secretion of polypeptide microorganism transformed by the vector and production of polypeptide with the same microorganism | |
| IE57976B1 (en) | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives | |
| Cravador et al. | Total DNA synthesis and cloning in Escherichia coli of a gene coding for the human growth hormone releasing factor | |
| IE852440L (en) | Signal for protein transport | |
| FI97549C (fi) | Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa | |
| SU1707078A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК рТНУЗ14, кодирующа полипептид со свойствами тимозина @ человека, рекомбинантна плазмидна ДНК рТНУ12 - промежуточный продукт дл ее конструировани и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент полипептида со свойствами тимозина @ человека | |
| FI97239B (fi) | Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi | |
| KR840002090B1 (ko) | 폴리펩티드 헵텐을 함유하는 면역성 물질인 폴리펩티드를 제조하는 방법 | |
| KR840002106B1 (ko) | 세균숙주의 형질전환에 적합한 재조합 클로닝 베히클의 제조방법 | |
| JPS6137099A (ja) | 蛋白質の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| MA | Patent expired |