FI93734B - Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita - Google Patents

Description

93734

Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuu-sioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita 5 Keksintö koskee menetelmää fuusioproreiinin valmis tamiseksi, geenirakennetta, joka koodaa tällaista fuusio-proteiinia, sekä plasmideja, jotka ovat käyttökelpoisia fuusioproteiinien valmistuksessa.

Aiemmin on jo ehdotettu fuusioproteiineja, joille 10 on tunnusmerkillistä C- tai N-terminaalinen osa, joka vastaa suurin piirtein 100 ensimmäistä interleukiini-2:n aminohappoa (DE-patenttihakemus P35 41 856.7). Interleu-kiini-2-osa voi olla peräisin nisäkäsinterleukiini-2:sta, esimerkiksi hiiri- tai rottainterleukiini-2:sta, joita 15 kuvataan EP-hakemuksessa, jonka julkaisunumero on 0 091 539 (jatkossa "EP-hakemusjulkaisu"), edullisesti ihmisinterleukiini-2:sta. Nämä fuusioproteiinit ovat yllättävän stabiileja isäntäsolussa, ja ne voidaan pienen liukoisuutensa ansiosta erottaa yksinkertaisesti isännän 20 omista proteiineista.

Kehitettäessä edelleen tätä keksintöäjatusta havaittiin yllättävästi, että myös oleellisesti pienemmät interleukiini-2-molekyylin osat soveltuvat tällaisten fuusioproteiinien "painolasti"-osaksi.

25 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää fuusiopro teiinien valmistamiseksi, joissa on C- tai N-pään osa, joka vastaa interleukiini-2 (IL-2) -molekyyliä, edullisesti ihmisen IL-2-molekyyliä, mutta joka sisältää vähemmän kuin 100 aminohappoa, lukuunottamatta niitä osia, jotka 30 sisältävät 96 - 99 aminohappoa, saattamalla fuusioproteii- nia koodaava geeni ilmentymään isäntäsolussa. Keksintö määritellään tarkemmin patenttivaatimuksissa. Edullisia suoritusmuotoja valaistaan tarkemmin seuraavassa.

Erityisen edullisesti käytetään lähtöaineena ihmis-35 interleukiini-2:ta (tästedes "IL-2") vastaavaa synteettis- 2 93734 tä geeniä, jota kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 163 249 ja joka esitetään liitteessä. Tämä synteettinen geeni sisältää joukon ainutkertaisia restriktiopilkkoutumiskohtia, jotka mahdollistavat IL-2:ta koodaavan DNA:n pilkkomisen 5 "käteviksi” segmenteiksi. Näistä segmenteistä voidaan rakennuspa 1 ikkaperiaattee11a rakentaa mittatilaustyönä fuu-sioproteiineille painolastiosa, jolloin saadaan segmentti-yhdistelmän ja halutun proteiinin ominaisuuksien mukaan helppo- - niukkaliukoisia fuusioproteiineja.

10 Keksintö antaa myös mahdollisuuden pyrkiä tuotteen mahdollisen tai halutun jatkokäsittelyn mukaisesti edullisimpaan liukoisuuteen, siis hyvään liukoisuuteen, jos tuote on määrä puhdistaa kromatografisesti, esimerkiksi vas-ta-ainepylvään avulla, tai pieneen liukoisuuteen, kun esi-15 puhdistuksen aikaansaamiseksi on määrä erottaa isännän omat liukoiset proteiinit esimerkiksi sentrifugoimalla.

Keksinnön erityisenä etuna on se, että voidaan valmistaa fuusioproteiineja, joilla on sangen pieni "painolastiosa", sillä halutun proteiinin suhteellinen saanto 20 paranee tällöin huomattavasti.

Keksinnön lisäetuna on se, että "painolastiosa" voidaan konstruoida sillä tavalla, että halutun proteiinin kolmiulotteista rakennetta estetään mahdollisimman vähän eikä siten esimerkiksi estetä sen laskostumista.

• 25 Fuusioproteiinin pilkkomisen yhteydessä saadaan ha lutun proteiinin lisäksi "painolastiosa", siis IL-2-johdannainen. Tällä voi olla IL-2-aktiivisuutta (T-solujen proliferaatiokoe) tai se voi sitoutua IL-2-reseptoreihin. Keksinnön mukaisen "rakennuspalikkaperiaatteen" avulla 30 voidaan myös saada "sivutuotteina" aikaan IL-2-johdannai sia, joissa IL-2:n biologiset toiminnot ovat enemmän tai vähemmän korostuneita.

Keksinnön erityisen tarkoituksenmukaisia suoritusmuotoja valaistaan seuraavassa käyttäen synteettistä gee-35 niä, jota kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 163 249. Tämä 3 93734 geeni pilkotaan 5'-päästä restriktioendonukelaasilla EcoRI ja 3'-päästä Sällillä. Kolmen ainutkertaisen, entsyymien PstI, Xbal ja Sacl tunnistaman restriktiopilkkoutumiskoh-dan lisäksi, joita käytettiin tämän geenin konstruointiin, 5 ovat myös ainutkertaiset MluI- ja Pvul-pilkkoutumiskohdat edullisissa asemissa. Jos näiden pilkkoutumiskohtien välissä olevia sekvenssejä merkitään kirjaimilla A - F, voidaan synteettinen geeni esittää systemaattisesti seuraavasti : 10 (EcoRI)-A-Pstl-B-Mlul-C-Xbal-D-Sacl-E-Pvul-F-(Sali).

Segmentit A - F ovat siten erityisen edullisia "rakennuspalikoita” rakennuspalikkajärjestelmään. Tässä esityksessä vastaa siis DE-patenttihakemuksen P 35 41 856.7 mukaisten fuusioproteiinien "painolastiosa" segmenttejä A 15 - E ja samassa hakemuksessa mainitun bifunktionaalisen proteiinin, joka sisältää koko IL-2-geenin, "painolasti-osa" segmenttejä A - F. Keksinnön mukaisissa geeniraken-teissa on sitä vastoin kyse muista segmenttien A - F yhdistelmistä, edullisesti sellaisista, joissa on vähemmän 20 kuin neljä näistä segmenteistä, jolloin segmentti A koodaa fuusioproteiinin N-päätä. Muiden segmenttien järjestys on valinnanvarainen, jolloin käytetään mahdollisesti asianmukaisia adaptoreita tai kytkijöitä. Myös painolastiosan C-päähän voidaan lisätä asianmukaisia adaptori- tai kytkijä-25 sekvenssejä, jotka tässä tapauksessa voivat koodata myös aminohappoja tai lyhyitä aminohapposekvenssejä, jotka mahdollistavat "painolastiosan" entsymaattisen tai kemiallisen irrottamisen halutusta proteiinista tai helpottavat sitä. Adaptori- tai kytkijäsekvenssejä voidaan luonnolli-30 sesti käyttää myös "painolastiosan" valmistamiseen mittatilaustyönä tietylle fuusioproteiinille, esimerkiksi halutun liukoisuuden aikaansaamiseksi. On nimittäin osoittautunut yllättävästi, että fuusioproteiinin liukoisuus ei riipu molekyylikoosta, vaan myös suhteellisen pienilläkin 35 molekyyleillä voi olla pieni liukoisuus. Tuntiessaan nämä 4 93734 seikat, joita valaistaan yksityiskohtaisesti esimerkeissä, voi ammattimies ilman työläitä kokeita siten valmistaa keksinnön mukaisia fuusioproteiineja, joilla on tietyt halutut ominaisuudet.

5 Kun haluttu proteiini on eukaryoottinen proteiini, saadaan siis keksinnön mukaisesti fuusioproteiineja, jotka kokonaan tai käytännöllisesti katsoen kokonaan koostuvat eukaryoottisista proteiinisekvensseistä. Prokaryoottiset isäntäsolut eivät kuitenkaan yllättävästi tunnista näitä 10 fuusioproteiineja vieraiksi proteiineiksi, eivätkä isännän proteaasit hajota niitä nopeasti. Tällaista hajoamista tapahtuu erityisen usein cDNA-sekvenssien koodaamille, isännälle vieraille proteiineille, joita on määrä tuottaa bakteereissa. Nyt on osoittautunut, että cDNA-sekvenssit 15 voidaan saattaa ilmentymään sangen tehokkaasti, kun ne "sisäänrakennetaan" keksinnön mukaisesti segmentteihin. Tätä varten voidaan konstruoida erityisiä vektoreita, jotka sisältävät sekvenssien välissä polykytkijäsekvenssin, jossa on useita cDNA-sekvenssien kloonauskohtia. Mikäli 20 kloonattu cDNA ei sisällä lopetuskodonia, cDNA-sekvenssin suojana on lisäksi polypeptidi, jota C-terminaalinen segmentti koodaa.

Fuusioproteiinin pilkkominen voidaan tehdä sinänsä tunnetulla tavalla kemiallisesti tai entsymaattisesti.

‘25 Soveltuvan menetelmän valinta määräytyy ennen kaikkea ha lutun proteiinin aminohapposekvenssin mukaan. Kun tämä ei esimerkiksi sisällä metioniinia, voi sitovana osana olla Met, jonka kohdalla tehdään kemiallinen lohkaisu kloori-tai bromisyaanilla. Jos sitovan osan karboksipäässä on 30 kysteiini tai sitova osa on Cys, voidaan tehdä entsymaat-tinen, kysteiinispesifinen pilkkominen tai kemiallinen pilkkominen, esimerkiksi spesifisen S-syanyloinnin jälkeen. Jos sitovan osan karboksipäässä on tryptofaani tai sitova osa on Trp, voidaan tehdä kemiallinen pilkkominen 35 N-bromisukkimidillä.

93734 5

Halutut proteiinit, jotka eivät sisällä aminohappo-sekvenssissään paria Asp-Pro ja ovat kyllin haponkestäviä, voidaan tämän sitovan osan sisältävinä fuusioproteiineina lohkaista sinänsä tunnetulla tavalla proteolyyttisesti.

5 Tällä tavalla saadaan proteiineja, jotka sisältävät N-ter-minaalisen proliinin tai C-terminaalisen aspragiinihapon. Tällä tavalla voidaan siis syntetisoida myös muunnettuja proteiineja.

Asp-Pro-sidoksesta voidaan tehdä vielä herkempi ha-10 poille, kun tämä sitova osa on (Asp)„-Pro tai Glu-(Asp)„-Pro, jolloin n on 1 - 3.

Esimerkit entsymaattisista pilkkomisista ovat samoin tunnettuja, jolloin voidaan käyttää myös muunnettuja, spesifisyydeltään parannettuja entsyymejä [vertaa C. S. 15 Craik et ai., Science 228 (1985) 291 - 297). Jos haluttu eukaryoottinen peptidi on proisuliini, on tarkoituksenmukaista valita sekvenssiksi Y peptidisekvenssi, jossa tryp-siinillä lohkaistavissa oleva aminohappo (Arg, Lys) on sitoutuneena proinsuliinin N-terminaaliseen aminohappoon 20 (Phe), esimerkiksi Ala-Ser-Met-Thr-Arg, sillä tällöin voidaan tehdä arginiinispesifinen lohkaisu trypsiiniproteaa-silla.

Ellei haluttu proteiini sisällä aminohappojaksoa Ile-Glu-Gly-Arg, ·' 25 voidaan fuusioproteiini, jossa on asianmukainen sitova osa, pilkkoa tekijä Xa:lla (EP-hakemusjulkaisut 0 025 190 ja 0 161 973).

Fuusioproteiinia tuotetaan sinänsä tunnetulla tavalla soveltuvassa ilmentymissysteemissä tapahtuvan ilmen-30 tymisen kautta. Tähän soveltuvat kaikki tunnetut isäntä-vektorisysteemit, siis esimerkiksi nisäkässolut ja mikro-organismit, esimerkiksi hiivat, ja edullisesti bakteerit, erityisesti E. coli.

DNA-sekvenssi, joka koodaa haluttua proteiinia, 35 sisällytetään tunnetulla tavalla vektoriin, joka saa aikaan hyvän ilmentymisen valitussa ilmentymissysteemissä.

6 93734

Bakteeri-isännissä on promoottorina ja operaattorina tarkoituksenmukaisesti lac, tae, trp, λ-faagin PL tai PR/ hsp, omp tai synteettinen promoottori, jollaisia ehdotetaan esimerkiksi DE-hakemusjulkaisussa 34 30 684 (EP-5 hakemusjulkaisu 0 173 149). Edullinen on promoottori-ope-raattorisekvenssi tae, joka on myös kaupallisesti saatavissa (esimerkiksi ilmentymisvektori pKK223-3, Pharmacia ("Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).

10 Keksinnön mukaisesti fuusioproteiinina tapahtuvan ilmentymisen yhteydessä saattaa osoittautua tarkoituksenmukaiseksi muuttaa yksittäisiä, ATG-aloituskodonia seuraa-via, ensimmäisten aminohappojen triplettejä mRNA-tasolla mahdollisesti tapahtuvan emäspariutumisen estämiseksi. 15 Tällaiset muuttamiset samoin kuin yksittäisten amonohappo-jen muuttamiset, poistamiset tai lisäykset IL-2-proteiini-osassa ovat alan ammattimiehelle tunnettuja ja kuuluvat keksinnön piiriin. Voidaan esimerkiksi toteuttaa kysteii-nin poistaminen tai kysteiinin korvaaminen muilla aminoha-20 poilla epätoivottavien disulfidisiltojen muodostumisen estämiseksi, kuten kuvataan esimerkiksi EP-hakemusjulkaisussa 109 748.

Kuviot 1-13 havainnollistavat juoksukaavioiden tavoin menetelmiä samoilla numeroilla merkittyjen esimerk-25 kien mukaisten synteesien toteuttamiseksi. Yleiskuvan saamisen helpottamiseksi on lähtöaineiden ja välituotteiden valmistusta kuvattu kuvissa A - C. Selvyyden vuoksi aloitettiin kuvissa 1-13 numerointi uudelta kymmenluvulta, siis kuviossa 1 (ll):stä. Lähtöaineiden, jotka eivät ole 30 tämän hakemuksen kohteina, tunnusnumerot loppuvat 0:aan, esimerkiksi kuviossa 2 (20). Kuviot eivät ole oikeassa mittakaavassa, erityisesti polykytkinjäsekvenssien alueella on mittakaavaa venytetty sopivalla tavalla. IL-2-sek-venssejä merkitään paksunnetuilla viivoilla, ja haluttuja 35 proteiineja vastaavat rakennegeenit on osoitettu muulla tavoin.

7 93734

Kuvio A antaa yleiskuvan keksinnön mukaisista segmenteistä A - F ja segmenttiyhdistelmästä A ja B. Lähtöaine on plasmidi pl59/6, jonka valmistusta kuvataan yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 0 0163 249 ja va-5 laistaan mainitun julkaisun kuviossa 5.

Kuvio B esittää ilmentymisplasmidia pEW1000, jonka valmistusta kuvataan DE-patenttihakemuksessa P 3541 856.7 ja valaistaan sen kuviossa 1. Asianmukaisella kaksoispilk-komisella katkaistaan tämä plasmidi polykytkijäsekvenssin 10 alueelta, jolloin saadaan linearisoidut plasmidit (Exl) -(Ex4).

Kuvio C esittää pUC12-johdannaisen pW226 ja ilmen-tymisplasmidin pW226-l valmistusta, jotka molemmat plasmidit sisältävät segmentit A ja F, joita erottaa polykytki-15 jäsekvenssi.

Kuvio 1 esittää pUCl2-johdannaisen pKH40 ja ilmen-tymisplasmidin pK40 valmistusta, jotka plasmidit koodaavat fuusioproteiineja, joissa segmenttiä A vastaavaa proteii-nisekvenssiä, siis IL-2:n 22 ensimmäistä aminohappoa, seu- 20 raa siltaryhmä Thr-Arg, jota seuraa proinsuliinin amino happosekvenssi .

Kuvio 2 esittää plasmidin pSLll ja ilmentymisplas-midin pSL12 konstruoimista, jotka plasmidit koodaavat po-lypeptidejä, joissa segmenttiä A seuraa polykytkinjäsek-* 25 venssejä 2 ja 20a vastaava yhdistävä osa, jota seuraa proinsuliinin aminohapposekvenssi.

Kuvio 3 esittää ilmentymisplasmidin pK50 konstruoimista, joka koodaa polypeptidiä, jossa segmenttejä A ja B, siis IL-2:n 38 ensimmäistä aminohappoa, seuraa välittömäs-30 ti proinsuliinin aminohapposekvenssi.

Kuvio 4 esittää ilmentymisplasmidin pK51 konstruoimista, joka koodaa polypeptidiä, jossa segmenttejä A ja B seuraa sekvenssejä 42 ja 41 vastaava siltaryhmä, jota seuraa proinsuliinin aminohapposekvenssi.

8 93734

Kuvio 5 esittää ilmentymisplasmidin pK52 konstruoimista, joka plasmidi eroaa pK51:stä lisätyllä MluI-kytkijällä 51, joka koodaa aminohapposekvenssiä, joka mahdollistaa pilkkomisen tekijä Xa:lla. pK52 voidaan valmistaa 5 myös pK50:stä (kuvio 3) pilkkomalla Mlul:llä ja lisäämällä mainittu Mlul-kytkijä.

Kuvio 6 esittää ilmentymisplasmidin pK53 konstruoimista pK51:stä (kuvio 4), mikä tehdään samoin lisäämällä Mlul-kytkijä.

10 Kuvio 7 esittää ilmentymisplasmidin pSL14 konst ruoimista pSL12:sta (kuvio 2) lisäämällä polykytkijään fragmentti C. Täten lisätään segmentti C välittömästi segmentin A jatkoksi. Seuraavana olevassa polykytkijässä vastaavat kaksi ensimmäistä aminohappoa (kumpikin Glu) IL-2:n 15 aminohappoja 60 ja 61. Siten IL-2-osa koostuu aminohapoista 1 - 22 ja 37 - 61. Loppuosa aminohappojaksosta vastaa plasmidin pSL12 (kuvio 2) koodaamaa jaksoa.

Kuvio 8 esittää ilmentymisplasmidin pPH31 konstruoimista, joka plasmidi koodaa fuusioproteiinia, jossa 20 segmenttejä A - C seuraa siltaryhmä, joka on esitetty sekvenssissä 81 ja jota seuraa proinsuliinin aminohapposekvenssi .

Kuvio 9 esittää plasmidin pK192 konstruoimista, joka plasmidi koodaa fuusioproteiinia, jossa segmenttejä A '25 ja B seuraa metioniini ja sen jälkeen hirudiinin aminohappo jakso.

Kuvio 10 esittää plasmidin pW214 konstruoimista, joka plasmidi koodaa fuusioproteiinia, jossa segmenttejä A ja B seuraa aminohapposekvenssi, joka mahdollistaa pilk-30 komisen tekijä Xa:lla ja jota seuraa granylosyyttienmakro-fagien "pesäkkeitä stimuloivan tekijän" (CSF, Colony Stimulating Factor) aminohapposekvenssi.

Kuvio 11 esittää ilmentymisplasmidin pW233 konstruoimista, joka plasmidi koodaa fuusioproteiinia, jossa 35 segmenttejä A ja C (jotka vastaavat IL-2:n aminohappoja 1 9 93734 - 22 ja 37 - 61) seuraa siltajakso Leu-Thr-Ile-Asp-Asp-Pro, jota seuraa CSF:n aminohapposekvenssi.

Kuvio 12 esittää ilmentymisplasmidin pX234 konstruoimista, joka plasmidi koodaa fuusioproteiinia, jolla on 5 seuraava aminohapposekvenssi: segmenttiä A (aminohapot 1 - 22) seuraa siltaryhmä Thr-Arg, sitä segmentti D (IL-2:n aminohapot 59 - 96), toinen siltajakso Thr-Asp-Asp-Pro ja lopuksi CSF.

Kuvio 13 esittää plasmidien pH200 ja pH201 samoin 10 kuin ilmentymisplasmidin pH202 konstruoimista. Näissä plasmideissa on segmenttien A ja F tai A, B ja F välissä polykytkijä, jonka useisiin pilkkoutumiskohtiin voidaan kloonata vierasta DNA:ta. Nämä plasmidit soveltuvat erityisesti cDNA-sekvenssien kloonaamiseen.

15 Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavissa esimer keissä, joiden numerointi vastaa kuvien numerointia. Ellei toisin mainita, on prosenttisuudet laskettu painon mukaan.

Esimerkki A

Lähtöaineplasmidia pl59/6 kuvataan EP-hakemusjul-20 kaisussa 0 163 249 (kuvio 5). Siinä "IL^^si" tai tekstissä "DNA-sekvenssi I:ksi" määritelty sekvenssi on kuviossa A jaettu segmentteihin A - F, joita rajoittavat entsyymien EcoRI, PstI, MluI, Xbal, Sacl, PvuI ja Sali tunnistamat pilkkoutumiskohdat. Tekemällä kaksoispilkkomi-·’ 25 nen asianmukaisilla entsyymeillä saadaan segmentit (A) - (F) tai myös toisissaan kiinni olevia segmenttejä, esimerkiksi EcoRI:llä ja Mlul:llä segmentti (A, B).

Esimerkki B

Ilmentymisplasmidin pEW1000 valmistusta kuvataan . 30 (esijulkaisemattomassa) DE-patenttihakemuksessa P 35 41 856.7 (kuvio 1). Tämä plasmidi on plasmidin ptacll [Amann et ai., Gene 25 (1983) 167 - 178) johdannainen, jossa

EcoRI-tunnistuskohtaan on sijoitettu synteettinen sekvenssi, joka sisältää Sall-pilkkoutumiskohdan. Siten saadaan 35 ilmentymisplasmidi pKK177.3. Insertoimalla tähän lac-rep- 10 93734 ressori [Farabaugh, Nature 274 (1978) 765 - 769] saadaan plasmidi pJF118. Tämä avataan ainutkertaisesta Aval-rest-riktiokohdasta, lyhennetään noin 1000 emäsparin verran tunnetulla tavalla käsittelemällä eksonukleaasilla ja li-5 gatoidaan. Saadaan plasmidi pEW1000. Pilkkomalla tämä plasmidi polykytkijän alueella entsyymeillä EcoRI ja Hindlll, Sali, PstI tai Smal saadaan linearisoidut ilmen-tymisplasmidit (Exl), (Ex2), Ex3) ja (Ex4).

Esimerkki C

10 Myynnissä oleva plasmidi pUC12 pilkotaan EcoRI:llä ja Sällillä, ja eristetään linearisoitu plasmidi 1. Liga-toimalla 1 segmenttiin A, synteettiseen kytkijäsekvenssiin 2 ja segmenttiin F saadaan plasmidi pW226 3.

E. coli -kanta 79/02 transformoidaan tunnetulla ta-15 valla ligaatioseoksen plasmidi-DNA:11a. Solut siirroste-taan agarmaljoille, jotka sisältävät isopropyyli-6-D-tio-galaktopyranosidia (IPTG) , 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-β-D-galaktopyranosidia (X-gal) sekä 20 μ/ml ampisilliinia (Ap). Valkeista klooneista otetaan talteen plasmidi-DNA, 20 ja varmistetaan plasmidin 3 muodostuminen restriktioana-lyysillä ja DNA-sekvenssianalyysillä.

Plasmidista 3 lohkaistaan pieni EcoRI-Hindlll-frag-mentti 4 ja eristetään se. Tämä ligatoidaan linearisoituun ilmentymisplasmidiin (Exl) T4-DNA-ligaasireaktiolla. Syn-25 tyvälle plasmidille pW226-l 5 tehdään restriktioanalyysi.

Kompetentit E. coli -kannan Mc 1061 -solut transformoidaan plasmidin pW226-l DNA:11a. Ampisilliiniresis-tentit kloonit eristetään Ap-pitoisilta agarmaljoilta. Plasmidi-DNA eristetään uudelleen Mc 1061 -soluista ja 30 karakterisoidaan uudelleen restriktioanalyysillä. Kompe tentit E. coli -kannan W 3110 -solut transformoidaan E. coli Mc 1061 -soluista eristetyllä plasmidi-DNA:11a. Jatkossa käytetään kaikkiin ilmentämisiin E. coli W 3110 -soluja. Kaikki annetuissa esimerkeissä tehdyt ilmentymis-35 kokeet tehtiin seuraavissa olosuhteissa.

u 11 93734 Yön yli kasvatettu E. coli -soluviljelmä, joka sisältää plasmidia 5, laimennetaan suunnilleen suhteessa 1:100 LB-alustalla (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972), joka si-5 sältää 50 Mg/ml ampisilliinia, ja seurataan kasvua mittaamalla optinen tiheys (OD). Kun OD = 0,5, lisätään viljelmään IPTGrtä pitoisuudeksi 1 mmol/1, ja erotetaan bakteerit 150 - 180 minuutin kuluttua sentrifugoimalla. Bakteereja keitetään 5 minuuttia puskuriseoksessa (7 mol/1 10 ureaa, 0,1 % SDS:a, 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 7,0), ja siirretään näytteet SDS-geelielektroforeesilevylle. Elektroforeesissa saadaan bakteereista, jotka sisältävät plasmidia 5, proteiinivyöhyke, joka vastaa odotetun proteiinin molekyylikokoa (6 kilodaltonia).

15 Annetut indusointiolosuhteet pätevät ravistuspullo- viljelmille; suurimittaisempien fermentointien yhteydessä ovat tarkoituksenmukaisia sopivalla tavalla muutetut OD-arvot ja mahdollisesti hieman muutetut IPTG-pitoisuudet. Saadulla proteiinilla ei ole aktiivisuutta IL-2:sta riip-20 puvalla solulinjalla (CTLL 2) tehdyssä soluproliferaatio-kokeessa.

Esimerkki 1

Plasmidi 3 pilkotaan Mlulillä ja Sällillä, ja erotetaan muodostuneet kaksi fragmenttia toisistaan geeli-25 elektroforeettisesti. Eristetään suurempi fragmentti 11.

Synteettinen oligonukleotidi 12 ligatoidaan tylppäpäiseen, proinsuliinia koodaavaan DNA:hän 13 [Wetekam et ai.. Gene 19 (1982) 179 - 183], jolloin saadaan DNA-sekvenssi 14.

Tämä pilkotaan Mlul:llä ja Sällillä, jolloin saadaan DNA-.. 30 sekvenssi. Tämä ligatoidaan fragmenttiin 11, jolloin muodostuu plasmidi pKH40 (16). Tämä karakterisoidaan tekemällä restriktioanalyysi.

Plasmidi 16 pilkotaan EcoRIillä ja HindIII:lla, ja eristetään pieni fragmentti 17 geelielektroforeesilla. 35 Ligatoimalla tämä linearisoituun ilmentysmiplasmidiin 12 93734 (Exl) saadaan ilmentymisplasmidi pK40 (18). Esimerkin C mukaisella ilmentymisellä saadaan proteiinia, joka on solujen rikkomisen jälkeen liukoisessa soluproteiinifraktiossa. Muuttumaton proinsuliinisekvenssi todetaan "Wes-5 tern Blot" -menetelmällä.

Esimerkki 2 Lähtöaineena on plasmidi pPH30, jota kuvataan (esi-julkaisemattomassa) DE-patenttihakemuksessa P35 41 856.7 kuviossa 3c. Tämän keksinnön yhteydessä on kuviossa 2 esi-10 tetty IL-2-osasekvenssi merkinnällä "A-E" (20). Tämän sekvenssin pää ja siltajakso proinsuliinisekvenssiin asti on esitetty kuviossa 2 20a:na.

Plasmidi 20 pilkotaan Pvul:llä ja HindIII:lla, ja eristetään pieni fragmentti 22. Lisäksi pilkotaan plasmidi 15 3 EcoRIrllä ja Pvulillä, ja eristetään pieni fragmentti (23). Lisäksi pilkotaan vektori pUC12 EcoRI:llä ja Hindlllrlla, ja eristetään suuri fragmentti 21. Ligatoi-malla fragmentit 21, 23 ja 22 saadaan plasmidi pSLll (24). Plasmidi 24 pilkotaan HindIII:lla ja osittain EcoRIrllä, 20 ja eristetään fragmentti 25, joka sisältää segmentin A ja proinsuliinigeenin. Ligatoimalla 25 linearisoituun ilmen-tymisplasmidiin (Exl) saadaan ilmentymisplasmidi pSL12 (26).

Esimerkin C mukaisella ilmentämisellä ja sitä seu-25 rasvalla käsittelyllä saadaan liukoinen fuusioproteiini. Insuliinivasta-aineilla tehty "Western Blot" -analyysi osoittaa, että tämä proteiini sisältää koko insuliinisek-venssin.

Esimerkki 3 .. 30 Proinsuliinigeenin amplifiointi tehdään plasmidin ptrpED5-l avulla [Hallewell et ai., Gene 9 (1980) 27 -47]. Tämä pilkotaan HindIII:lla ja Sällillä, ja eristetään suuri fragmentti 31. Fragmentti 31 ligatoidaan DNA-sek-venssiin 14, jolloin saadaan plasmidi pH106/4 (32).

13 93734

Plasmidi 32 pilkotaan Sallrllä ja Mlulillä, ja eristetään pieni fragmentti 15. Linearisoitu ilmentymisplasmidi (Ex2) , segmentti (A, B) ja fragmentti 15 ligatoi-daan, jolloin saadaan ilmentymisplasmidi pK50 (33).

5 Koodattuun fuusioproteiiniin johtava ilmentyminen tehdään esimerkin C mukaisesti. Solut erotetaan sitten kasvatusliemestä sentrifugoimalla ja rikotaan "French Press" -laitteessa. Proteiinisuspensio jaetaan sentrifugoimalla liukoiseen ja liukenemattomaan osaan. Kumpikin 10 fraktio analysoidaan tunnetulla tavalla geelielektrofo-reettisesti 17,5-%:isella SDS-polyakryyliamidigeelillä ja värjäämällä proteiini sen jälkeen Coomassie Blue -väriaineella. Yllättävästi havaitaan, että fuusioproteiini on liukenemattomassa osassa. Insuliinivasta-aineilla tehty 15 "Western Blot" -analyysi osoittaa, että fuusioproteiini sisältää koko proinsuliinijakson.

"French Press" -rikkomisella saatua sedimenttiä voidaan käyttää suoraan proinsuliinin eristämiseen.

Esimerkki 4 20 Lähtöaineena on plasmidi pPH20 (40), jota kuvataan DE-patenttihakemuksen P 35 41 856.7 kuviossa 3c. Pilkkomalla tämä plasmidi EcoRIrllä, täydentämällä yksisäikeiset päät ja pilkkomalla Hindlllrlla saadaan fragmentti 41, jossa on havaittavissa tässä yhteydessä kiintoisan 40:n i 25 osan DNA-sekvenssi.

Ligatoimalla linearisoitu ilmentymisplasmidi (Ex4) segmenttiin (A, B), synteettiseen oligonukleotidiin 42 ja fragmenttiin 41 saadaan plasmidi pK5i (43).

Esimerkki 5 .. 30 Ligatoimalla linearisoitu ilmentymispalsmidi (Ex2) segmenttiin (A, B), synteettiseen oligonukleotidiin 51 ja DNA-sekvenssiin 15 saadaan plasmidi pK52 (52). Oligonuk-leotidin 51 oikea orientaatio tarkistetaan sekvenssianalyysillä. Plasmidi koodaa fuusioproteiinia, joka sisältää 35 oligonukleotidia 51 vastaavan aminohapposekvenssin ja on siten pilkottavissa aktivoidulla tekijä Xa:lla.

14 93734

Plasmidi 52 on valmistettavissa myös seuraavasti: Plasmidi 33 pilkotaan osoittain Mlul:llä ja ligatoidaan saatu avattu plasmidi 53 DNA-sekvenssiin 51, jolloin tuloksena on plasmidi pK52.

5 Esimerkki 6

Kun plasmidi 43 pilkotaan osittain Mlul:llä ja ligatoidaan saatu linearisoitu plasmidi 61 synteettiseen DNA-sekvenssiin 51, saadaan plasmidi pK53 (62). Tämä koo-daa samoin fuusioproteiinia, joka on pilkottavissa akti-10 voidulla tekijä Xa:lla. Sekvenssin 51 oikea orientaatio varmistetaan kuten esimerkissä 5 DNA-sekvenssianalyysillä.

Esimerkki 7

Plasmidi 26 pilkotaan Xbal:llä ja osittain

Mlulrllä, ja eristetään suuri fragmentti 71. Ligatoimalla 15 segmenttiin (C) saadaan plasmidi pSL14 (72). Fuusioprote-iini on ilmentymisen ja solujen rikkomisen jälkeen liukoisessa soluproteiinifraktiossa.

Esimerkki 8

Plasmidi 20 pilkotaan Xbal:llä ja osittain 20 EcoRI:llä, ja täydennetään yksisäikeiset päät, jolloin saadaan DNA-sekvenssi 81. Ligatoimalla "tylppä pää" -olosuhteissa saadaan plasmidi pPH3l (82). Fuusioproteiini on liukenemattomassa soluproteiinifraktiossa.

Esimerkki 9 25 Lähtöaineena käytetään plasmidia 90, jotka kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 171 024 (kuvio 3) . Tämä plasmidi pilkotaan Sall:llä ja sitten Accl:llä, ja eristetään pieni fragmentti 91. Tämä ligatoidaan synteettiseen oligonukleo-tidiin 92, jolloin saadaan DNA-sekvenssi 93. Tämä pilko-.30 taan Mlul:llä, jolloin tuloksena on DNA-fragmentti 94.

Plasmidi 33 pilkotaan Mlul:llä osittain ja Sällillä, ja eristetään suuri fragmentti. Tämä ligatoidaan DNA-sekvenssiin 94, jolloin saadaan ilmentymisplasmidi pK192 (96). Tämä koodaa fuusioproteiinia, jossa IL-2:n 38 35 ensimmäistä aminohappoa seuraa metioniini ja sitä hirudii- 15 93734 nin aminohapposekvenssi. Fuusioproteiini on liukoisessa soluproteiinifraktiossa.

Esimerkki 10 Lähtöaineena on plasmidi pHG23 (100), jota kuvataan 5 EP-hakemusjulkaisussa 0 183 350 ja joka on yleisesti saa tavissa the American Type Culture Collection -talletuslaitoksesta numerolla ATCC 39000. Tämä plasmidi pilkotaan SfaNI:llä, täydennetään yksisäikeiset päät, annetaan reagoida Pstlrn kanssa, ja eristetään pieni fragmentti 101. 10 Ligatoimalla linearisoitu ilmentymisplasmidi (Ex3) segmenttiin (A, B), synteettiseen oligonukleotidiin 102 ja fragmenttiin 101 saadaan ilmentymisplasmidi pW214 (103). Tämä plasmidi koodaa fuusioproteiinia, jossa IL-2:n 38 ensimmäistä aminohappoa seuraa oligonukleotidin 102 sek-15 venssi, joka mahdollistaa molekyylin pilkkomisen tekijä Xa:lla ja jota seuraa CSF:n aminohapposekvenssi. Fuusio-proteiini on solujen rikkomisen jälkeen liukenemattomassa proteiinifraktiossa.

Esimerkki 11 20 Lähtöaineplasmidia pW216 (110) kuvataan DE-patent- tihakemuksessa P 35 45 568.3 (kuvio 2b). Tässä plasmidissa seuraa segmenttejä A - E (Pvul-pilkkomiskohta) vastaavaa IL-2-sekvenssiä kytkijä, joka koodaa aminohappoja Asp-Asp-Pro ja jota seuraa välittömästi CSF-aminohappojaksoa koo-25 daava sekvenssi. IL-2:n ja CSF:n välissä oleva yhdistävä sekvenssi mahdollistaa fuusioproteiinin proteolyyttisen pilkkomisen.

Plasmidista 110 eristetään Pvul:llä ja HindIII:lla pilkkomalla sekvenssi 111.

30 Plasmidi 3 pilkotaan Mlulrllä ja Xbalrllä, ja eris tetään suuri fragmentti 112. Tämä ligatoidaan segmenttiin (C), jolloin saadaan plasmidi pW227 (113). Tämän plasmidin annetaan reagoida EcoRI:n ja HindIII:n kanssa, ja eristetään lyhyt fragmentti 114. Ligatoimalla tämä fragmentti 35 linearisoituun ilmentymisplasmidiin (Exl) saadaan plasmidi 16 93734 pW227-l (115). Tämä plasmidi koodaa IL-2:n johdannaispro-teiinia, jolla ei ole IL-2-aktiivisuutta.

Plasmidi 113 pilkotaan lisäksi EcoRIrllä ja Pvulrllä, ja eristetään lyhyt fragmentti 116. Ligatoimalla 5 linearisoitu ilmentymisplasmidi (Exl) fragmentteihin 116 ja 111 saadaan ilmentymisplasmidi pW233 (117). Tämä koodaa liukenematonta fuusioproteiinia, joka edellä mainitun kytkijän ansiosta on pilkottavissa proteolyyttisesti.

Esimerkki 12 10 Plasmidi 3 pilkotaan Xbal:llä ja Sacl:llä, ja eris tetään suuri fragmentti 121. Ligatoimalla tämä segmenttiin (D) saadaan plasmidi pW228 (122). Tämä pilkotaan EcoRIrllä ja Hindlllrlla, ja eristetään pieni fragmentti 123. Ligatoimalla linearisoitu ilmentymisplasmidi (Exl) fragment-15 tiin 123 saadaan ilmentymisplasmidi pW228-l (124). Tämä plasmidi koodaa biologisesti inaktiivista IL-2-johdannaista. Tämä plasmidi pilkotaan EcoRIrllä ja Pvulrllä, ja eristetään lyhyt fragmentti 125. Ligatoimalla linearisoitu ilmentymisplasmidi (Exl) fragmentteihin 125 ja 111 saadaan 20 ilmentymisplasmidi pW234 (126). Tämä koodaa niukkaliukois-ta fuusioproteiinia, joka samoin on proteolyyttisesti pilkottavissa.

Esimerkki 13

Plasmidien konstruoimiseksi, jotka soveltuvat eri-25 tyisesti cDNA-sekvenssien ilmentämiseen, syntetisoidaan ensin polykytkijäsekvenssi 131.

Ligatoimalla linearisoitu plasmidi 1 segmentin A, polykytkijäsekvenssiin 131 ja segmenttiin F saadaan plasmidi ph200 (132).

.. 30 Plasmidin 132 annetaan reagoida EcoRIrn ja Mlulrn kanssa, ja eristetään suuri framgmentti 133. Ligatoimalla tämä segmenttiin (A, B) saadaan plasmidi pH201 (134). Plasmidin 134 annetaan reagoida EcoRIrn ja Hindlllrn kanssa, ja eristetään lyhyt fragmentti 135. Ligatoimalla tämä 35 fragmentti linearisoituun ilmentymisplasmidiin (Exl) saa daan ilmentymisplasmidi pH202 (136).

17 93734

Plasmidi 136 avataan BamHI:llä, ja liitetään li-nearisoituun plasmidiin ilmennettävä cDNA kaupallisesti saatavissa olevan BamHI-adaptorin avulla. cDNA:n orientaation mukaan on joka kolmas sekvenssi samassa lukukehykses-5 sä (A, B):n kanssa. Ellei cDNA-sekvenssi sisällä lopetus-kodonia, on sen koodaama polypeptidisekvenssi lisäksi segmenttiä F vastaavan aminohapposekvenssin suojaama.

Ellei cDNA ole oikeassa lukukehyksessä, siirretään lukukehystä esimerkiksi pilkkomalla cDNA-pitoiset (alku-10 peräiset tai lisääntyneet) plasmidit Mlul:llä tai Xbalrllä (ellei cDNA:ssa ole näitä entsyymejä vastaavia pilkkoutu-miskohtia) ja täyttämällä yksisäikeiset päät Klenow-poly-meraasireaktiolla.

18 93734

DNA-sekvenssi I

Tripletti nro 0 1 2

Aminohappo Met Ala Pro

Nukleotidi nro J_ 10

5 Koodaava säie 5' AA TTC ATG GCG CCG

Koodaamaton säie___3J_G TAC CGC GGC

(EcoRl) 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12

Thr Ser Ser Ser Thr lys Lys Thr Gin Leu 10 20 30 40

ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG

TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 15 Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 50 60 70_

CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG

GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC

PstI

20 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100

ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA

TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT

- 25 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Asn Pro Lys Leu Thr Are Met Leu Thr Phe 110 120 130

AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC

30 TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG

MluI

II

19 93734 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160

AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA

5 TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT

53 54 55 56 57 58 59 60 61 62

Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 _ 190

10 CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG

GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC

Xbal 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 15 200 210 220

CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG

GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC

73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 20 Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Are Pro 230 240 250

GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG

CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC

25 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92

Are Asp Leu lie Ser Asn lie Asn Val lie 260 270 280

CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC

GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG

' 30 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310

GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG

35 CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC

SacI

20 93734 103 104 105 106 107 10B 109 110 111 112

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340

TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG

5 AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC

113 114 115 116 117 118 119 120 121 122

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Are Trp lie _350 360 370

10 ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC

TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG

Pvul 123 124 125 126 127 12Θ 129 130 131 132

Thr Phe Cys Gin Ser lie lie Ser Thr Leu 15 380 390 400

ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG

TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC

133 134 135 20 Thr 410__ ACC TGA TAG 3’ TGG ACT ATC AGC T 5’ (Sail) tt

Claims (9)

93734

1. Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi, joissa on C- tai N-pään osa, joka vastaa interleukiini-2 5 (IL-2) -molekyyliä, edullisesti ihmisen IL-2-molekyyliä, mutta joka sisältää vähemmän kuin 100 aminohappoa, lukuunottamatta niitä osia, jotka sisältävät 96 - 99 aminohappoa, tunnettu siitä, että fuusioproteiinia koodaava geeni saatetaan ilmentymään isäntäsolussa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IL-2-osaa koodaava geeni käsittää osan DNA-sekvenssistä I (liite).

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IL-2-osaa koodaava geeni 15 koostuu IL-2-geenin (EcoRI )-A-PstI-B-MluI-C-XbaI-D-SacI-E-PvuI-F-(SalI) yhdestä, kahdesta tai kolmesta segmentistä A - F, jotka ovat valinnanvaraisessa järjestyksessä ja mahdollisesti adaptori- tai kytkijäsekvensseillä yhteenliitettyjä.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että IL-2-sekvenssin ja halutun proteiinin aminohapposekvenssin välissä on aminohappo tai aminohappojakso, joka mahdollistaa halutun proteiinin kemiallisen tai entsymaattisen irrottamiseen IL-2- 25 osasta, edullisesti aminohappo Met, Cys, Trp, Lys tai Arg tai aminohappojakso, joka sisältää näitä aminohappoja C-päässään.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappojakso on Asp-Pro ... 30 tai Ile-Glu-Gly-Arg tai sisältää C-päässään tällaisen aminohappo jakson.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioproteiinia koodaava geeni saatetaan ilmentymään bakteerisolussa, 35 edullisesti E. colissa. 93734

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisesti saatavissa olevien fuusioproteiinien käyttö haluttujen proteiinien valmistamiseen.

8. Geenirakenne, tunnettu siitä, että se 5 koodaa jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisesti saatavissa olevaa fuusioproteiinia.

9. pUC-johdannaiset pW226 (kuvio C) , pW227 (kuvio 11), pW228 (kuvio 12), pH 200 ja pH 201 (kuvio 13); ilmen-tymisplasmidit pW226-l (kuvio C) , pW227-l (kuvio 11) , 10 pW228-l (kuvio 12) ja pH 202 (kuvio 13) ; ilmentymisplasmi- dit, jotka koodaavat patenttivaatimuksessa 1 esitetyn IL-2-osan, siltajäsenen ja proinsuliinia sisältävää fuusio-proteiinia: pK40 (kuvio 1), pSL12 (kuvio 2), pK50 (kuvio 3), pK51 (kuvio 4), pK52 (kuvio 5), pK53 (kuvio 6), pSL14 15 (kuvio 7), pPH31 (kuvio 8); ilmentymisplasmidi, joka koodaa patenttivaatimuksessa 1 esitetyn IL-2-osan, siltajäsenen ja hirudiinia sisältävää fuusioproteiinia: pK 192 (kuvio 9); ilmentymisplasmidit, jotka koodaavat patenttivaatimuksessa 1 esitetyn IL-2-osan, siltajäsenen ja GM-CSF 20 sisältävää fuusioproteiinia: pW214 (kuvio 10), pW233 (kuvio 11), pW234 (kuvio 12). Il 93734