[go: up one dir, main page]

FI119939B - Entsyymien tuotto transgeenisten kasvien siemenissä ja saatujen siementen käyttö - Google Patents

Entsyymien tuotto transgeenisten kasvien siemenissä ja saatujen siementen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI119939B
FI119939B FI915478A FI915478A FI119939B FI 119939 B FI119939 B FI 119939B FI 915478 A FI915478 A FI 915478A FI 915478 A FI915478 A FI 915478A FI 119939 B FI119939 B FI 119939B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
seeds
enzyme
plant
transgenic
plasmid
Prior art date
Application number
FI915478A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI915478A0 (fi
Inventor
Wilhelmus Johannes Quax
Jan Pen
Andreas Hoekema
Peter Christiaan Sijmons
Ooyen Albert Johannes Joseph Van
Krijn Rietveld
Teunis Cornelis Verwoerd
Original Assignee
Gist Brocades Nv
Syngenta Mogen Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gist Brocades Nv, Syngenta Mogen Bv filed Critical Gist Brocades Nv
Publication of FI915478A0 publication Critical patent/FI915478A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI119939B publication Critical patent/FI119939B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03026—4-Phytase (3.1.3.26), i.e. 6-phytase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Entsyymien tuotto transgeenisten kasvien siemenissä ja saatu jen siementen käyttö -Producering av enzymer i frön av trans- gena växter och användning av erhällna frön 5 Tämä keksintö koskee kiinnostuksen kohteena olevien entsyymien tuottamista transgeenisten kasvien siemenissä ja siten tuotettujen siementen käyttämistä teollisissa prosesseissa, tarvitsematta uuttaa ja/tai eristää entsyymiä.
10 Muutamat teollisuudenalat käyttävät entsyymejä prosesseihinsa. Näihin lukeutuvat pesuaine-, tekstiili-, meijeri-, elintarvike- ja juoma- sekä rehuteollisuus, ja muut teollisuudet.
Tällä hetkellä entsyymejä tuotetaan teollisessa mitassa fer-15 mentointiprosesseilla tai eristetään kasvi- tai eläin-lähteistä. Mikrobien avulla tuotettuihin entsyymeihin lukeutuvat proteaasit, amylaasit, sellulaasit, pektinaasit, fytaasit ja muut entsyymit. Entsyymituotanto fermentointi-prosessin avulla on erittäin tehokasta, ja yli 10 g kasvu-20 alustalitraa kohti olevia tuotantomääriä voidaan saavuttaa.
Transgeenisten kasvien käytön mahdollisuutta arvokkaiden proteiinien tuotantosysteemiksi on esitetty. Esimerkkejä tähän mennessä ovat interferonin tuotanto tupakassa (Goodman et ai., 25 1987), enkefaliinien tuotanto tupakassa, Brassica napuksessa ja Arabidopsis thalianassa (Vandekerckhove et ai., 1989), vasta-ainetuotanto tupakassa (Hiatt et ai., 1990) ja ihmisen seerumin albumiinin tuotanto tupakassa ja perunassa (Sijmons et ai., 1990) .
30 Käytännössä yhä useampien kasvilajien transformoinnista, erityisesti kaksisirkkaisten lajien (esim. tupakan, perunan, tomaatin, Petunian, Brassican), on tullut rutiinimenetelmä alaa tuntevien tutkijoiden keskuudessa (Klee et ai., 1987; 35 Gasser & Fraley, 1989). Vieraiden geenien ilmentämisstrategiat kasveissa ovat tulleet hyvin osoitetuiksi (Gasser & Fraley, 1989) . Kasvigeenien säätelysekvenssejä on identifioitu, joita 2 käytetään kimeeristen geenien konstruointiin, joita voidaan ilmentää toiminnallisesti kasveissa ja kasvisoluissa.
Geenirakenteiden siirtämiseksi kasvisoluihin on käytettävissä 5 useita tekniikoita, kuten esimerkiksi transformaatio Agrobac-terium tumefaciensin tai Agrobacterium rhizogenesin avulla. Tätä lähestymistapaa käyttämällä on hyödynnetty useita eri kasvisolukkoja, valinnan ollessa suuresti riippuvainen kasvilajista ja sen mukautumisesta solukkoviljelyyn. Onnistuneita 10 esimerkkejä ovat protoplastien, mikrosporien tai siitepölyn, ja irrotettujen kasvinosien kuten lehtien, varsien, juurien, hypokotyylien (alkeisvarsien) ja kotyylien transformointi. Menetelmiä, joissa DNA:ta siirretään suoraan protoplasteihin ja kasvisoluihin tai solukoihin, käytetään sen lisäksi, kuten 15 esimerkiksi mikroruiskutusta, elektroporaatiota, partikkeli-pommitusta ja DNA:n suoraa sisäänottoa (Gasser ja Fraley, 1989) .
Proteiineja voidaan tuottaa kasvien siemenissä käyttämällä 20 useita erilaisia ekspressiosysteeme jä. Esimerkiksi, konstitutiivisen promoottorin käyttö, kuten esimerkiksi kukkakaalin mosaiikkiviruksen (CaMV) (Guilley et ai., 1982) 35S- promoottorin, johtaa ilmentyneen proteiinin kertymiseen muun muassa transgeenisen kasvin siemeniin. Vaihtoehtoisesti voi-25 daan käyttää hyväksi promoottoreja siemenen varastoproteiineja koodittavista geeneistä. Siemenen varastoproteiineja ilmennetään hyvin solukkospesifisellä ja tilaspesifisellä tavalla (Higgins, 1984; Shotwell & Larkins, 1989), so., geenit ilmennetään vain siemenessä ja vain siemenen kehitysvaiheen aikana. 30
Siemenen varastoproteiini (katsaus julkaisussa Higgins, 1984; Shotwell & Larkins, 1989) määritellään miksi tahansa proteiiniksi, jota kertyy merkittäviä määriä (jopa 90 % siemenen kokonaisproteiinista) kehittyvään siemeneen, ja joka itämisen 35 yhteydessä hydrolysoituu, jotta saataisiin käyttöön ravinne-lähde taimen kasvun varhaisvaiheisiin. Proteiinit sijoittuvat intrasellulaariseen osastoon, jota nimitetään proteiinijyväseksi tai varastovakuoliksi. Tämä proteiinijyvänen sisältää 3 proteaasin inhibiittoreita ja muodostaa proteaasivapaan ympäristön. Varastoproteiineja hajottavat proteaasit aktivoituvat 3-6 päivää itämisen jälkeen (Larkins, 1981) .
5 Monia siemenen varastoproteiinigeenejä on eristetty ja karakterisoitu, samoin niiden 5'- ja 3'-päiden puoleiset geenin viereiset alueet (Casey & Domoney, 1987, katsaus). Esimerkkejä koskien globuliineja ja albumiineja ovat soijapavun glysinii-ni- ja konglysiniinigeenit (Fischer & Goldberg, 1982; Harada 10 et ai., 1989), legumiini- ja visiliinigeenit herneestä (Lycett et ai., 1984; Higgins et ai., 1988), härkäpavun HS-geeni (Baumlein et ai., 1986), 7S- faseoliinigeeni Phaseoluksesta (Doyle et ai., 1986), krusiferiini- ja napiinigeenit Brassi-casta (Ryan et ai., 1989; Scofield & Crough, 1987; Radke et 15 ai., 1988), heliantiinigeeni auringonkukasta (Vonder Haar et ai., 1988; Jordano et ai., 1989) ja 2S-albumiini- ja krusife-riinigeenit Arabidopsis thalianasta (Vandekerckhove et ai., 1989; Pang et ai., 1988). Muita esimerkkejä voi löytää geeneistä, jotka koodittavat prolamiineja ja gluteliinejä (Casey 20 & Domoney, 1987). Varastoproteiineja koodittavat yleensä monigeeniperheet.
Siementen varastoproteiinigeenejä on siirretty tupakkaan, petuniaan ja rapsiin (Okamura et ai., 1986; Beachy et ai., 25 1984; Sengupta-Gopalan et ai., 1985; Higgins et ai., 1988;
Ellis et ai., 1988; Barker et ai., 1988; Vandekerckhove et ai., 1989; Altenbach et ad., 1989). Beeta-faseoliinin geenin 5'-yläpuolista säätelyaluetta herneestä käytettiin ohjaamaan beeta-glukuronidaasin, (Bustos et ai., 1989), fytohem-30 agglutiniinin (Voelker et ai., 1989), lusiferaasin (Riggs et ai., 1989) ja zeiinin ilmenemistä (Hoffman et ai., 1987) tupakassa. Arabidopsis thalianan 2S-albumiinigeenin promoottoria käytettiin ohjaamaan saman lajin modifioidun 2S-albumiinin ilmenemistä tupakassa, Brassica napuksessa ja 35 Arabidopsis thalianassa (Vandekerckhove et ai., 1989). Edellä mainitut geenit ilmennettiin solukkospesifisesti ja kehityksellisesti säädellyllä tavalla, so. siemenessä siemenen kehityksen aikana. Ilmenemistasot kaikissa näissä raporteissa 4 vaihtelivat, mutta ne yltivät niinkin korkeille tasoille kuin 1,7 % siemenen kokonaisproteiinista (Voelker et ai., 1989). On todettu, että cDNA voi korvata genomisen DNA:n, joka sisältää introneita perustana toiminnallisen ja pysyvän mRNA:n saami-5 seksi heterologisessa ilmentämisessä (Chee et ai., 1986). Nämä tulokset osoittavat, että kasvien molekyylibiologian alaa tunteva henkilö voi suunnitella lähestymistapoja tietyn geenin siemenspesifiselle ilmentämiselle kohdekasvilajissa, joka on sopeutuvainen transformaatiotekniikkaan.
10
Kaksisirkkaisten kasvien siementen kehityksen aikana suuri osa koko proteiinisynteesistä ohjataan suurten parenkyymisolujen vakuoliin tai proteiinijyväsiin. Tämän prosessin säätelemiseksi, proteiinit syntetisoidaan yleensä prekursoreina. Prekurso-15 riproteiineihin on liittyneenä hydrofobisia signaalipeptidejä, tavallisesti N-päässä, jotka katkaistaan irti tietyissä vaiheissa. Useita varastoproteiinien signaalipeptidejä on kuvailtu (Doyle et ai., 1986; Pang et ai., 1988; Vonder Haar et ai., 1988; Iturriaga et ai., 1989; Dorel et ai., 1989; Voelker et 20 ai., 1989; Hattori et ai., 1985; Lycett et ai., 1983; Smith & Raikhel, 1989) .
Signaalipeptidien yleinen käytettävyys heterologisissa eks-pressiosysteemeissä (esim., Sijmons et ai., 1990; Vitale & 25 Bollini, 1986; Slightom et ai., 1986; Della-Cioppa et ai., 1987) näyttää tukevan ajatusta, että signaalipeptidin liittymistä heterologiseen "matkustajaproteiiniin" voidaan käyttää "matkustajaproteiinin" kuljettamiseen ja prosessointiin.
Viitteissä esitetään, että useat eri potentiaaliset "matkusta-30 japroteiinit" ovat ehdolla sellaiseen ekspressiosysteemiin.
Huolimatta kuitenkin houkuttelevuudesta ja elinkelpoisuudesta, joka liittyy kasvien käyttämiseksi bioreaktoreina, systeemi ei vielä ole vailla ongelmia. Koskien edellä kuvailtuja esimerk-35 kejä, kasvia käytetään bioreaktorina, ja kiinnostuksen kohteena oleva proteiini eristetään sen jälkeen transgeenisestä kasvimateriaalista, so., solukoista, jotka sisältävät eniten kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia. Kiinnostuksen koh- 5 teenä olevan proteiinin eristäminen siemenistä, joissa sitä tuotetaan, aiheuttaa luonnostaan hankaluuksia sekä lisääntyneitä kustannuksia (Krebbers & Vandekerckhove, 1990).
5 Mahdollinen ratkaisu tähän ongelmaan voi olla se, että vältetään tarvetta uuttaa ilmentynyt proteiini kasviaineksesta. Itäsaksalaisessa patentissa DD 275 704 tuodaan esille rakenne lämpökestoisen beeta-glukanaasin ilmentämiseksi transformoitujen ohrakasvien itämättömissä siemenissä, ja siementen käyttö 10 panimoprosesseissa. Jatkuvana ongelmana pienijyväisten viljakasvien manipuloinnissa ei kuitenkaan ole ainoastaan ollut viljakasvien protoplastien transformointi, vaan myös transformoitujen kasvien regeneraatio, joita ei ole selvitetty patentin selityksessä. Ei siis olisi mahdollista saada aikaan 15 entsyymejä sisältäviä siemeniä, käyttämällä julkaisussa kuvailtua prosessia.
Tämä keksintö koskee transgeenisiä, siemeniä tuottavia Brassi-ca- ja Nicotiana-kasveja, joiden siemenet sisältävät vähintään 20 yhtä kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä, joita voidaan käyttää erilaisissa teollisissa prosesseissa tai elintarvikkeissa ja rehuissa katalysaattoreina sulatusreaktioissa tarvitsematta ensin uuttaa ja/tai eristää mainittuja entsyymejä.
25
Keksintö koskee ekspressiorakenteita Brassica- ja Nicotiana-kasvien transformoimiseksi, jotka vuorostaan kykenevät ilmentämään useita erilaisia kiinnostuksen kohteena olevia entsyymejä siemenissä. Rakenteissa käytetään signaalisekvenssejä, 30 jotka on toimivasti kytketty DNA-sekvenssiin, joka koodittaa haluttua ilmennettävää entsyymiä. Sellaiset rakenteet ovat säätelysekvenssien ohjauksessa, jotka kykenevät ohjaamaan haluttujen entsyymien ilmentymistä siemenissä.
35 Tämän keksinnön mukaisten transgeenisten kasvien siemeniä voidaan käyttää entsyymien pysyvänä ja helposti käsiteltävänä varastointimuotona. Entsyymejä säilytetään kuivassa ympäris β tössä, jonka proteaasiaktiivisuus on alhainen, ja suojataan siten hajotusta vastaan.
Siementen käyttö entsyymien varastona on sen lisäksi pysyvä 5 säilytysmuoto, joka on helppo pakata ja kuljettaa, ja jota on helppo käsitellä varsinaisen käytön aikana.
Tällä keksinnöllä saadaan lisäksi aikaan toteuttamiskelpoinen ratkaisu kiinnostavien entsyymien kalliiseen ja ongelmalliseen 10 uuttoprosessiin siemenistä, joissa niitä tuotetaan. Entsyymit pysyvät pysyvinä siemenen sisällä, ja niitä voidaan käyttää sellaisenaan puhtaan entsyymin sijasta. Tämä hyöty, yhdistettynä siemeniä tuottavien kasvien kasvatuksen alhaisiin kustannuksiin, antaa käyttöön sellaisten entsyymien taloudellisen 15 lähteen. Tämä keksintö mahdollistaa siten kustannusten alentamisen, jotka liittyvät usean eri entsyymin tuotantoon, varastointiin ja käyttöön.
Erityisesti keksinnön kohteena on menetelmä in vitro -reak-20 tioiden katalysoimiseksi, jossa menetelmässä transformoidaan kasvi ekspressiorakenteella, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin mainittu entsyymi ilmentyy transgeenisen kasvin siemenissä. Mainitusta transgeenisestä kasvista saatuja siemeniä, jotka si-25 sältävät lisääntyneen määrän mainittua entsyymiä, lisätään reaktioseokseen, joka sisältää katalysoitavan substraatin tai katalysoitavia substraatteja, jossa yhteydessä mainittu entsyymi kykenee katalysoimaan substraatin tai substraattien reaktiota reaktioseoksessa.
30
Kuvio 1. Fytaasi-cDNA:n kloonausstrategia.
Kuvio 2. Kaksoisvektori pMOG23.
35 Kuvio 3. Genominen sekvenssi siemenen varastoproteiini-krusiferiinin geenistä Brassica napuksesta.
7
Kuvio 4. Eri rakenteisiin käytettyjä synteettisiä oligonuk-leotididuplekseja.
Kuvio 5. Plasmidi pMOG429. Kaksoisvektori pMOG23, joka sisäl-5 tää fytaasin cDNA-osan, joka koodittaa valmista entsyymiä, krusiferiinin signaalipeptidiä koodittavan DNA-sekvenssin alapuolella.
Kuvio 6. Fytaasia sisältävien jauhettujen siementen lisäämisen 10 vaikutukset epäorgaanisen fosfaatin vapautumiseen fytaatista.
Kuvio 7. Bacillus licheniformiksen α-amylaasigeenin genominen sekvenssi vektorissa pPROM54.
15 Kuvio 8. Plasmidi pMOG29. Plasmidi pUC18, joka sisältää eks-pressiokasetin konstitutiivistä ilmentämistä varten kasveissa ja sekvenssi, joka koodittaa tupakan signaalipeptidiä.
Kuvio 9. Plasmidi pMOG227. Kaksoisvektori, joka sisältää sen 20 osan α-amylaasigeenistä, joka koodittaa valmista entsyymiä, tupakan sekvenssin alapuolella, joka koodittaa signaalipeptidiä ekspressiokasetissa konstitutiivista ilmentämistä varten.
Kuvio 10. Aspergillus-fytaasin annosvasteyhteys in vitro -25 sulatusmallissa.
Kuvio 11. Aspergillus-fytaasin ja tupakan siemenen fytaasin annosvasteyhteys in vitro -sulatusmallissa.
30 Kuvio 12. Oligosakkaridipiikkikuvioiden vertailu, saatuna perunatärkkelyksen hydrolyysistä käyttäen A) tupakan siemeniä, jotka on transformoitu geenillä, joka koodittaa Bacillus licheniformiksen α-amylaasia, B) Bacillus licheniformiksen a-amylaasia ja C) Bacillus amyloliguefaciensin a-amylaasia.
35
Kuvio 13. Oligosakkaridipiikkikuvioiden vertailu, saatuna maissitärkkelyksen hydrolyysistä käyttäen A) tupakan siemeniä, jotka on transformoitu geenillä, joka koodittaa Bacillus 8 licheniformiksen α-amylaasia, B) Bacillus licheniformiksen a-amylaasia ja C) Bacillus amyloliquefaciensin a-amylaasia.
Kiinnostaviin entsyymeihin, joita voidaan tuottaa tämän kek-5 sinnön avulla, lukeutuvat kaikki entsyymit, joita kyetään käyttämään teollisuusprosessissa.
Kiinnostuksen kohteena oleviin entsyymeihin lukeutuvat entsyymit, jotka ovat heterologisia kasville (so. eivät natiiveja 10 kasvilajille), jossa niitä tuotetaan. Keksintö koskee myös entsyymejä, jotka ovat homologisia kasveille (so. natiiveja kasvilajeille) , joissa niitä tuotetaan, joita yli-ilmennetään yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla.
15 Sellaisia entsyymejä ovat hydrolaasit, kuten esimerkiksi proteaasit, sellulaasit, hemisellulaasit, fosfataasit, lipaa-sit, pektinaasit, amylaasit, lysotsyymit, pullulanaasit ja kitinaasit; lyaasit, kuten esimerkiksi pektiinilyaasi; ja isomeraasit kuten glukoosi-isomeraasi.
20
Edullisia entsyymejä ovat fytaasi, a-amylaasi, sellobiohyd-rolaasi, endo-glukanaasi, endo-ksylanaasi, endo-galaktanaasi, α-galaktosidaasi, arabinanaasi, seriiniproteaasit, kymosiini, papaiini, mahalipaasit, pektiinilyaasi ja glukoosi-isomeraasi.
25
Teollisilla prosesseilla tarkoitetaan prosesseja, joiden reaktioseokseen tavallisesti sisällytetään uutettuja ja/tai eristettyjä entsyymejä, joko in vivo tai in vitro, joka reak-tioseos sisältää vähintään yhden substraatin, jossa yhteydessä 30 entsyymit kykenevät katalysoimaan sellaista substraatin (substraattien) reaktiota niin, että muodostuu tavoiteltuja vaikutuksia tai tuotteita.
Esimerkkejä sellaisista teollisista prosesseista ovat, niihin 35 rajoittumatta, in vitro -prosessit, kuten esimerkiksi fytaasi-en käyttäminen soijan prosessoinnissa tai teollisessa prosessissa kuten märkäjauhatuksessa tai inositolin tai inositoli-fosfaattien tuottamiseksi fytaatista. Hemisellulaaseja ja 9 sellulaaseja voidaan myös käyttää yleisesti soluseinää hajottavina entsyymeinä. Vastaavalla tavalla α-amylaaseja voidaan käyttää leipomoteollisuudessa leivottujen tuotteiden konsis-tenssin parantamiseksi; a-amylaasia, amyloglukosidaasia, 5 ksylanaaseja ja/tai glukoosi-isomeraasia voidaan käyttää tärkkelyksen nesteytyksessä; ligninaaseja ja/tai ksylanaaseja voidaan käyttää paperiteollisuudessa; glukanaaseja, pek-tinaaseja ja/tai sellulaaseja voidaan käyttää elintarvike- ja juomateollisuudessa, esim. fermentaatio- tai panimoprosesseis-10 sa.
Tämän keksinnön mukaisesti haluttua entsyymiä tuotetaan trans-geenisten kasvien siemenissä. Siten tuotettuja siemeniä käytetään vuorostaan teollisessa prosessissa, jossa tarvitaan 15 niiden sisältämää entsyymiä, tarvitsematta ensin uuttaa ja/tai eristää entsyymiä.
Alaa tuntevien henkilöiden tulisi ymmärtää, että siemeniä, jotka sisältävät teolliseen käyttöön tarkoitettuja entsyymejä, 20 voidaan käyttää suoraan sellaisissa prosesseissa, tai niitä voidaan ensin käsitellä sellaista käyttöä varten jauhamalla haluttuun konsistenssiin. Kummassakin tapauksessa, kokonaisia tai jauhettuja siemeniä voidaan syöttää sellaisenaan haluttuun prosessiin, tarvitsematta enää uuttaa ja/tai eristää entsyy-25 miä, ja myös pudottamatta entsyymin aktiivisuutta.
Tämän keksinnön yhteydessä määriteltyjä transgeenisiä kasveja ovat kasvit ja niiden jälkeläiset, joita on modifioitu geneettisesti vähintään yhden kiinnostuksen kohteena olevan entsyy-30 min tuotannon aikaansaamiseksi tai tehostamiseksi niiden siemenissä. Kiinnostuksen kohteena olevien entsyymien tuotanto on siten lisääntynyt yli sen määrän, joka todetaan villityypin kasvimuodolla.
35 Tämän keksinnön yhteydessä, ilmaisu "lisääntyneen entsyymi-määrän sisältäviä siemeniä" tarkoittaa erityisesti tilastollisesti merkitsevää siemenmäärää, joka sisältää tilastollisesti keskimäärin suuremman entsyymimäärän, verrattuna 10 keskimääräiseen entsyymimäärään vastaavassa määrässä modi-fioimattomia siemeniä.
Kasvisukuihin, jotka kykenevät tuottamaan kiinnostuksen koh-5 teenä olevaa entsyymiä siemenissään tämän keksinnön mukaisen toiminnan avulla, lukeutuvat erityisesti Nicotiana (esim., tabacum) ja Brassica (esim., napus ja oleracea). Kasvisukuja Arabidopsis, Glycine (esim., max), Zea (esim., mays), Amarant-hus, Hordeum (esim., vulgarum), ja Pisum (esim., sativum), 10 Juglans (esim., regia), Arachis (esim., hypogeae), Medicago (esim., sativa), Phaseolus (esim., vulgaris), Pisum (esim., sativum), Triticum (esim., aestivum), Panicum L., Helianthus (esim., annus), Avena (esim., sativa) ja Oryza (esim., sativa) on myös mahdollista transformoida nykymenetelmillä.
15
Valitulla lajilla on edullisesti oltava suuri siementuotanto kasvia kohti vuodessa, ja siemenen kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien tulisi olla yhteen sopivia teollisuusprosessin kanssa, jota varten entsyymiä tuotetaan. Joissa-20 kin tapauksissa esimerkiksi, kun näitä siemeniä (emokasvin transformoinnin jälkeen) on tarkoitus sisällyttää elintarvikkeisiin, voidaan valita kasvilaji, joka tuottaa siemeniä, joissa on vähän tanniineja tai muita ravinnearvoa vailla olevia tekijöitä. Muissa tapauksissa, mahdollisuus jauhaa 25 transgeenisiä siemeniä haluttuun konsistenssiin, voi olla valintaperusteena, kun siemeniä käytetään lisäaineina, esim., jauhoissa. Vielä toisessa suoritusmuodossa, kiinnostuksen kohteena olevia entsyymejä sisältäviä siemeniä voidaan käyttää suoraan haluttuun prosessiin (esim. rehuissa), sinänsä, jota 30 valinnaisesti edeltää kuorenpoisto ja/tai kuivaus talteenoton jälkeen.
Sopivimman kasvilajin valinta voi perustua rekonstituutio-kokeisiin. Kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä voidaan 35 lisätä yhdessä villityypin siementen kanssa teolliseen prosessiin, jota varten transgeenisiä siemeniä mahdollisesti tullaan tuottamaan.
11
Edellä kuvailtujen siemeniä tuottavien kasvien geneettinen modifiointi tarkoittaa sitä, että kohdekasviin viedään eks-pressiorakenne, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodittavan geenin. Tämä ekspressiorakenne voi 5 sisältää geenin, joka on heterologinen kasvin suhteen, joka geeni on promoottori- ja terminaattorialueiden ohjauksessa, jotka kykenevät säätelemään kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodittavan geenin ilmenemistä kasvin siemenissä. Keksinnön piiriin on tarkoitettu myös geeni, joka on homologi-10 nen kasvin suhteen, joka geeni on säätelyalueen ohjauksessa, joka kykenee aikaansaamaan kiinnostuksen kohteena olevan entsyymin liikatuotannon. Liikatuotannolla tarkoitetaan kiinnostuksen kohteena olevan entsyymin tuotantoa, jonka määrä on suurempi kuin villityypillä todettu määrä.
15
Useita menetelmiä on saatavilla kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodittavan DNA-sekvenssin sisältävän ekspressiora-kenteen siirtämiseksi kohdekasviin. Sellaisia menetelmiä ovat, niihin rajoittumatta, protoplastien transformointi käyttäen 20 kalsium/polyetyleeniglykolimenetelmää, elektroporaatio ja mikroruiskutus tai (päällystetyn) partikkelin ammunta (Potry-kus, 1990).
Näiden niin sanottujen DNA:n suorien transformaatiomenetelmien 25 lisäksi, käytettävissä on laajasti transformaatiosysteemejä, jotka käsittävät vektoreita, kuten esimerkiksi virusvektorit (esim. kukkakaalin mosaiikkiviruksesta (CaMV:stä) ja bakteeri-vektorit (esim. Agrobacterium-suvusta) (Potrykus, 1990). Protoplastit, solut tai kasviosat, jotka on transformoitu, 30 voidaan valikoinnin ja/tai seulonnan jälkeen regeneroida kokonaisiksi kasveiksi, käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä (Horsch, R.B., et ai). Transformaatio- ja/tai regene-raatiomenetelmän valinta ei ole ratkaiseva tämän keksinnön kannalta.
35
Koskien kaksisirkkaisia kasveja, tämän keksinnön mukaisessa edullisessa suoritusmuodossa käytetään kaksoisvektorisysteemin toimintaperiaatetta (Hoekema, A., et ai., 1983; Schilperoort 12 et ai., 1984), jossa käytetään Agrobacterium-kantoja, jotka sisältävät vir-plasmidin, joka sisältää virulenssigeenit, ja yhteen sopivan plasmidin, joka sisältää siirrettävän geenira-kenteen. Tämä vektori voi replikoitua sekä E. colissa että 5 Agrobacterjumissa, ja se saadaan kaksoisvektorista Binl9 (Bevan, 1984), jota muutetaan yksityiskohdissa, jotka eivät ole merkityksellisiä tämän keksinnön kannalta. Tämän esimerkin mukaisesti käytetyt kaksoisvektorit sisältävät T-DNA:n vasemmanpuoleisten ja oikeanpuoleisten rajasekvenssien välissä 10 identtisen NPTII-geenin, joka koodittaa kanamysiiniresis-tenssiä (Bevan, 1984), ja monikloonauskohdan tarvittavien geenirakenteiden kloonaamiseksi.
Yksisirkkaisten viljakasvien transformaatio ja regeneraatio 15 eivät ole vakiomenetelmiä. Viimeaikainen tieteellinen kehitys osoittaa kuitenkin, että yksisirkkaiset ovat pääasiallisesti mukautuvaisia transformaatioon, ja että hedelmällisiä trans-geenisiä kasveja voidaan regeneroida transformoiduista soluista. Lisääntymiskelpoisten solukkoviljelysysteemien kehittämi-20 nen näille viljakasveille, yhdessä vaikuttavien menetelmien kanssa geneettisen aineksen siirtämiseksi kasvisoluihin, on helpottanut transformointia. Tällä hetkellä yksisirkkaisten transformointiin valinnanvaraisia menetelmiä ovat irrallisten kasviosien tai suspensiossa olevien solujen mikroammusammunta, 25 ja protoplastien suora DNA:n sisäänotto tai elektroporaatio. Transgeenisiä riisikasveja esimerkiksi on onnistuneesti saatu käyttäen bakteerista hph-geeniä, joka koodittaa hygromysiini-resistenssiä, valintamarkkerina. Geeni siirrettiin elektropo-raation avulla (Shimamoto, et ai., 1989). Transgeenisiä mais-30 sikasveja on saatu siirtämällä Streptomyces hygroscopious bar-geeni, joka koodittaa fosfiinitrisiiniasetyylitransferaasia (entsyymiä, joka inaktivoi fosfiinitrisiini-herbisidin), maissin suspensioviljelmän alkioasteen soluihin mikroammusammunnan avulla (Gordon-Kamm, et ai.,1990). Geneettisen aineksen siir-35 rosta muiden yksisirkkaisten viljakasvien, kuten vehnän ja ohran, aleuroniprotoplasteihin on raportoitu (Lee et ai., 1989). Vehnäkasveja on regeneroitu alkioasteisesta suspensiovil jelmästä valikoimalla vain vanhoja tiiviitä ja soi- 13 mukkeisia alkioasteisia kallussolukkoja alkioasteisten suspen-sioviljelmien aikaansaamiseksi (Vasil et ad., 1990). Yhdistäminen näiden viljakasvien transformaatiosysteemien kanssa tekee mahdolliseksi tämän keksinnön soveltamisen yksisirkkai-5 siin kasveihin. Näitä menetelmiä voidaan käyttää myös kak-sisirkkaisten transformointiin ja regenerointiin.
Yhdistelmägeenien ilmentäminen kasveissa käsittää sellaisia yksityiskohtia kuin geenin kopiointi kasvipolymeraaseilla, 10 mRNArn luenta, jne., jotka ovat tuttuja yhdistelmä-DNA-tekniikkaa tunteville henkilöille. Jäljempänä käsitellään vain yksityiskohtia, joilla on merkitystä tämän keksinnön ymmärtämiseksi oikein.
15 Tässä keksinnössä voidaan käyttää säätelysekvenssejä, joiden tiedetään tai todetaan saavan aikaan riittävän korkean yhdis-telmä-DNA:n ilmenemisen (spesifistä käyttösovellutusta varten, kuten jäljemänä käsitellään) siemenissä. Sellaisia säätelyse-kvenssejä voidaan saada kasveista tai kasviviruksista tai 20 kemiallisesti syntetisoimalla. Sellaiset säätelysekvenssit ovat promoottoreja, jotka ovat aktiivisia kopioinnin ohjauksessa siemenissä. Näitä ovat, niihin rajoittumatta, promoottorit siemenspesifisistä geeneistä, erityisesti varastoprote-iinigeenien promoottorit, kuten esimerkiksi Brassica napuksen 25 cruA-promoottori (Ryan et ai., 1989), tai konstitutiivisesti ilmenevien geenien promoottorit kuten CaMV:n (kukkakaalin mosaiikkiviruksen) 35S-promoottori (Guilley el: ai., 1982).
Muita säätelysekvenssejä ovat terminaattorisekvenssit ja polyadenylaatiosignaalit, mukaanlukien kaikki sekvenssit, 30 jotka toimivat sellaisenaan kasveissa; esimerkkejä ovat Agro-bacterium tumefaciensin nopaliinisyntetaasigeenin 3'-viereinen alue tai Brassica napuksen cruA-geenin 3'-viereinen alue. Säätelysekvensseihin voi kuulua myös enhansserisekvenssejä (tehostavia sekvenssejä), sellaisia, joita on todettu CaMV:n 35 35S-promoottorissa, ja mRNArta stabiloivia sekvenssejä kuten sinimailasen mosaiikkiviruksen (A1MV) RNA4:n ohjaussekvenssi (Brederobe et ai., 1980), tai mitä tahansa sellaisenaan toimivia sekvenssejä.
14
Kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin tulisi sijaita ympäristössä, joka mahdollistaa proteiinin optimaalisen pysyvyyden siemenen kehittymisen aikana. Solunsisäisen osan valintaa, 5 kuten esimerkiksi sytosolin, solulimakalvoston (endoplasmaver-koston), vakuolin, proteiinijyväsen tai periplasmisen tilan, voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti sellaisen pysyvän ympäristön aikaansaamiseksi, riippuen kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin biofysikaalisista parametreistä. Sellaisia 10 parametrejä ovat, niihin rajoittumatta, pH-optimi, herkkyys proteaaseille tai herkkyys edullisen soluosan molaarisuudelle. Vaikka homologiset signaalisekvenssit ovat edullisia, myös heterologisia signaalisekvenssejä voidaan käyttää. Erityisen edullisia ovat siemenen varastoproteiineista saatavat signaa-15 lisekvenssit.
Siemenen varastoproteiinit voidaan jakaa neljään pääryhmään, perustuen 1iukoisuusominaisuuksiin: 20 1. Albumiinit -- veteen liukenevia ja jaettu edelleen kahteen pääryhmään (12S ja 2S). 12S-ryhmä sisältää lektiinejä, jotka on eristetty herneestä ja erilaisista pavuista, esim., 2S-albumiineja saadaan Brassica napuksesta, Arabidopsis thalia-nasta, Ricinus communiksesta (risiinin siemen), Bertholletia 25 excelsasta (parapähkinä), herneestä, retiisistä ja auringonkukasta . 1 2
Globuliinit — suolaliuoksiin liukenevia, ja voivat kuulua joko 7-8S-ryhmään kuten faseoliinit Phaseoluksesta, visiliinit 30 herneestä, konglysiniinit soijapavusta, kauravisiliinit kaurasta ja 7S-globuliinit muista lajeista, tai ll-14S-ryhmään kuten legumiinit herneestä, glysiniinit soijapavusta, helian-tiinit auringonkukasta, krusiferiinit rapsista tai 11-14S-proteiinit muista lajeista kuten Arabidopsiksesta ja pavusta. 35 2
Prolamiinit — alkoholin vesiliuokseen liukenevia, esim. zeinit maissista, hordeniinit ohrasta, gliadiinit eristettyinä vehnästä ja kafiriinit durrasta.
15 4. Gluteliinit — happamiin tai emäksisiin liuoksiin liukenevia, ja voidaan eristää vehnästä.
5 Vaikka on olemassa poikkeuksia, pääasialliset kaksisirkkaisten kasvien varastoproteiinit ovat globuliineja, ja vastaavasti yksisirkkaisilla kasveilla prolamiineja ja gluteliineja.
Kaikkia tässä kuvattujen DNA-rakenteiden (promoottorien; 10 säätely-, stabilointi-, signaali- tai terminaattorisekvenssi-en) osia voidaan haluttaessa modifioida, niiden ohjausominai-suuksiin vaikuttamiseksi, käyttäen alaa tunteville henkilöille tuttuja menetelmiä. Siemenessä tarvittavan yhdistelmäproteii-nin määrän ("ilmentymistason") tulisi olla riittävän korkea, 15 transgeenisen siemenen käyttämiseksi pieninä määrinä esiintyvänä lisäaineena (perustuen tilavuuteen, painoon tai kustannuksiin) kaikissa tämän keksinnön mukaisissa edullisissa suoritusmuodoissa.
20 Muutamia menetelmiä voidaan käyttää transgeenisten kasvien aikaansaamiseksi, joiden siemenet sisältävät enemmän kuin yhden kiinnostuksen kohteena olevan entsyymin. Näihin menetelmiin lukeutuvat, niihin rajoittumatta: 25 a. Transgeenisten kasvien ristisiitos, jotka ilmentävät yhtä tai useampaa kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä.
b. Kasvitransformointi DNA-fragmentilla tai plasmidilla, joka sisältää multippeleja geenejä, jotka koodittavat kiinnostuksen 30 kohteena olevia entsyymejä, käyttäen tarpeellisia säätelyse-kvenssejä.
c. Kasvitransformointi erilaisilla DNA-fragmenteilla tai plasmideilla samanaikaisesti, joista kukin sisältää geenin 35 kiinnostuksen kohteena olevalle entsyymille, käyttäen tarpeellisia säätelysekvenssejä.
16 d. Kasvien perättäinen transformointi, käyttäen kulloinkin DNA-fragmenttia tai plasmidia, jotka koodittavat eri kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä tarpeellisten sääte-lysekvenssien ohjauksessa.
5 e. Edellä mainittujen menetelmien yhdistelmä.
Varsinainen menetelmä, jota käytetään siementen saamiseksi, jotka sisältävät enemmän kuin yhden kiinnostuksen kohteena 10 olevan entsyymin, ei ole ratkaiseva tämän keksinnön mukaisen päämäärän suhteen.
Keksinnön mukaisesti kiinnitetään huomiota siihen, että siemeniä, jotka sisältävät lisääntyneitä entsyymimääriä, voitai-15 siin saada menetelmien avulla, jotka ovat tuttuja alaa tunteville henkilöille, ja jotka ovat muita kuin edellä mainitut yhdistelmämenetelmät edellyttäen, että kyseiset menetelmät johtavat siihen, että saadaan siemeniä, jotka sisältävät lisääntyneitä entsyymimääriä, verrattuna villityypin sieme-20 niin. Esimerkiksi, voisi olla mahdollista saada sellaisia siemeniä käyttäen somaklonaalista muuntelutekniikkaa. Sellaista tekniikkaa voitaisiin lisäksi käyttää yksin tai yhdessä risteytystekniikoiden kanssa, joissa käytetään käsitteitä sytoplasminen hedesteriilisyys (Cms) tai nukleaarinen hedeste-25 riilisyys (Nms) (Mariani et ai., 1990). Tekniikoita, kuten somoklonaalinen muuntelu ja ristisiitos, joissa käytetään Cms:ää tai Nms:ää, voitaisiin käyttää yhdessä edellä mainittujen yhdistelmätekniikoiden kanssa, tarkoituksena edelleen lisätä siemenissä läsnä olevien entsyymien suhteellisia mää-30 riä. Mitä tulee ei-yhdistelmätekniikoihin, joita voitaisiin käyttää hyväksi entsyymimäärän lisäämiseksi siemenissä, viitataan US-patenttiin 4 378 655, julkaistu 7. huhtikuuta 1983, joka patentti on tässä yhteydessä sisällytetty viitteenä sellaisten tekniikoiden esille tuomiseksi. Huomattakoon, että 35 on olemassa lukuisia risteytystekniikoita kuvailevia julkaisuja, jotka koskevat sytoplasmista hedesteriilisyyttä, jonka LeClercq keksi 1968, ja dominoivia fertiliteetin palauttavia geenejä (Rf), jotka M.L. Kinmar et ai. keksi 1970. Nukleaari- 17 sen hedesteriilisyyden käyttöä on äskettäin kuvaillut Mariani et ai. 1990. Kasvinjalostusta koskevia yleisempiä julkaisuja käsitellään teoksissa James R. Welsh "Fundamentals of Plant Genetics and Breeding", 1981, sekä J.M. Poehlman, "Breeding 5 Field Crops", 1959.
Tämän keksinnön mukaisessa yhdessä suoritusmuodossa fytaasia koodittava kaksijuosteinen cDNA valmistetaan Aspergillus ficuumista eristetystä mRNA:sta (van Gorcom et ai., 1991). 10 DNA-rakenne sijoitetaan Brassica napuksen 12S-varastoproteiini krusiferiinia koodittavan geenin säätelysekvenssien ohjaukseen. Rakenne subkloonataan sen jälkeen esimerkiksi kaksois-vektoriin pMOG23 (E. coli K-12- kannassa DH5a, talletettu the Centraal Bureau voor Schimmelcultures'issa, Baarn, Hollanti, 15 29. tammikuuta, 1990, talletusnumerolla CBS 102.90). Tämä vektori siirretään Agrobacterium tumefaciensiin, joka sisältää leikatun Ti-plasmidin. Tämän rakenteen sisältäviä bakteerisoluja viljellään yhdessä tupakka- tai Brassica-kasvien solukkojen kanssa, ja transformoidut kasvisolut valikoidaan 20 ravintoalustoilla, jotka sisältävät antibiootteja, ja indusoidaan regeneroitumaan erilaistuneiksi kasveiksi sellaisilla alustoilla. Tuloksena olevat kasvit tuottavat siemeniä, jotka sisältävät ja ilmentävät DNA-rakenteen.
25 Tämän keksinnön mukaisessa toisessa suoritusmuodossa fytaasia koodittava DNA-rakenne sijoitetaan kukkakaalin mosaiik-kiviruksen (CaMV) 35S-promoottorin säätelysekvenssien ohjaukseen. Rakenne subkloonataan sen jälkeen kaksoisvektoriin. Tämä vektori siirretään sen jälkeen Agrobacterium tumefacien-30 siin, joka sisältää leikatun Ti-plasmidin. Tämän rakenteen sisältäviä bakteerisoluja viljellään yhdessä tupakka- tai Brassica-kasvien solukkojen kanssa, ja transformoidut kasvisolut valikoidaan ravintoalustoilla, jotka sisältävät antibiootteja, ja indusoidaan regeneroitumaan erilaistuneiksi 35 kasveiksi sellaisilla alustoilla. Tuloksena olevat kasvit sisältävät DNA-rakenteen ja ilmentävät sitä konstitutiivises-ti.
18
Transgeenisten siementen fytaasientsyymin aktiivisuus voidaan määrittää usealla eri menetelmällä, jotka eivät ole ratkaisevia tämän keksinnön kannalta, kuten ELISA-määrityksellä, Western-blottauksella tai suorilla entsyymimäärityksillä 5 käyttäen kolorimetrisiä menetelmiä tai natiivigeeli-määrityksiä.
Siten tuotettua fytaasia sisältäviä siemeniä voidaan käyttää teollisissa prosesseissa kuten rehulisäaineina yksimahaisille, 10 soijan prosessoinnissa tai inositolin tai inositolifosfaattien tuottamisessa fytaatista. Tarvittaessa tai haluttaessa siemenet voidaan ensin jauhaa haluttuun konsistenssiin ennen käyttöä, riippuen teollisen prosessin luonteesta, tarvitsematta fytaasin enempää uuttamista ja/tai eristämistä. Alaa yleisesti 15 tunteva henkilö voi ratkaista, ovatko sellaiset preparatiivi-set vaiheet tarpeellisia.
Siemenissä tuotettua fytaasia voidaan käyttää myös maissin tai durran jyvien pehmitysprosessissa. Siemenet voidaan jauhaa 20 ennen lisäämistä pehmiävään maissiin. Siemenistä vapautunut fytaasi voi vaikuttaa fytiiniin, jota on läsnä monissa maissi-valmisteissa. Fytiinin hajoaminen pehmiävässä maississa on edullista maissin pehmitysnesteen lisääntyneen kaupallisen arvon takia, jota nestettä käytetään eläinten rehuna tai 25 ravinteena mikrobifermentoinneissa. Fytiinin hajoaminen voi sen lisäksi torjua ongelmia, jotka liittyvät saostumien kerääntymiseen suotimissa, putkissa, reaktoriastioissa, jne. maissin liotusnesteen väkevöinnin, kuljetuksen ja varastoinnin aikana (Vaara, et ai., 1989). Fytaasin toiminta voi myös 30 jouduttaa pehmitysprosessia ja erotusprosesseja, jotka liittyvät maissin märkäjauhatukseen.
Vielä toisessa tämän keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa, Bacillus licheniformiksen α-amylaasia koodittava genominen 35 DNA-fragmentti sijoitetaan CaMV 35S-promoottorin ja enhans-serisekvenssien ohjaukseen. RNA4:n mRNA:ta stabiloiva oh-jaussekvenssi AlMV:stä sisällytetään mukaan, samoin kuin Agrobacterium tumefaciensin nopaliinisyntetaasigeenin ter- 19 minaattori ja polyadenylaatiosignaalisekvenssit. Koko rakenne subkloonataan sen jälkeen kaksoisvektoriin. Tämä vektori siirretään Agrobacterium tumefaciensiin, joka sisältää leikatun Ti-plasmidin. Tämän rakenteen sisältäviä bakteerisoluja 5 viljellään sen jälkeen yhdessä tupakkakasvien solukkojen kanssa, ja transformoidut kasvisolut valikoidaan ravintoalustoilla, jotka sisältävät antibiootteja, ja indusoidaan regeneroitumaan erilaistuneiksi kasveiksi sellaisilla alustoilla. Tuloksena olevat kasvit tuottavat siemeniä, jotka sisältä-10 vät ja ilmentävät DNA-rakenteen.
Transgeenisten siementen α-amylaasientsyymiaktiivisuus voidaan määrittää menetelmillä, jotka eivät ole ratkaisevia tämän keksinnön kannalta, kuten esimerkiksi suorilla ent-15 syymimäärityksillä käyttäen kolorimetrisiä menetelmiä tai natiivigeelimäärityksiä.
Siemeniä voidaan käyttää α-amylaasilähteenä, joita voidaan käyttää suoraan teollisissa prosesseissa kuten tärkkelys-20 siirappien valmistuksessa. Siemenet jauhetaan edullisesti ensin, ja koko (jauhettua) seosta voidaan käyttää prosessissa, kuten alaa tavallisesti tunteva henkilö voi määrittää.
Seuraavat esimerkit esitetään, jotta annettaisiin niille, 25 jotka tavallisesti tuntevat alaa, täydellinen esitys ja kuvailu siitä, kuinka keksintöä toteutetaan ja käytetään, eikä niitä ole tarkoitettu rajoittamaan sitä aluetta, jota keksijät pitävät keksintönään. Tarkkuuteen on pyritty, mitä tulee käytettyihin lukuihin (esim. määrät, lämpötila, pH, jne.), 30 mutta joitakin koevirheitä ja poikkeamia saattaa esiintyä. Ellei toisin ole osoitettu, lämpötila on celsius-asteissa, ja paine on ilmakehän paine tai lähellä sitä.
20
Esimerkki 1
Poly A+ -RNA:n eristäminen Aspergillus ficuumista 5 A. ficuum kantaa NRRL 3135 kasvatetaan alustassa, joka sisältää 22,72 g/1 maissijauhoa (amylaasikäsitelty pH 7:ssä 85°C:ssa 15 minuutin aikana), 9,36 g/1 glukoosia, 2,9 g/1 KNCkia, 0,142 g/1 KCl:ää, 0,142 g/1 MgSC>4x7H20:ta ja 56,8 mg/1 FeS04x7H20:ta. Kuuden päivän kuluttua rihmasto kerätään tallo teen.
Kuiva rihmasto (0,5 g) jäädytetään nestetypen kanssa ja jauhetaan. Aines homogenisoidaan sen jälkeen Ultra-turrax'in avulla (täysi nopeus, 1 minuutti) 0°C:ssa 3 M LiCl:ssa, 6 M ureassa, 15 ja säilytetään yli yön 4°C:ssa kuten Auffray ja Rougeon ovat kuvailleet (1980) Eur. J. Biochem. 107, 303. Solun kokonais- RNA saadaan sentrifugoinnin jälkeen nopeudessa 16 000 x g, jota seuraa kaksi perättäistä uuttoa feno li : kloroformi : isoamyylialkoholilla (50:48:2). RNA saostetaan 20 etanolilla ja liuotetaan uudelleen 1 ml:aan 10 mM Tris-HCl:ää (pH 7,4), 0,5 % SDS:ää. Poly A+:n valikoimiseksi, kokonais- RNA-näytettä kuumennetaan 5 minuutin ajan 65°C:ssa, säädetään tasoon 0,5 M NaCl, ja sijoitetaan sen jälkeen oligo(dT)-selluloosakolonniin. Usean pesun jälkeen liuoksella, joka 25 sisältää 10 mM Tris:ia pH 7,0, 1 mM EDTA:aa ja 0,1 mM NaCl:ia, poly A+ -RNA kerätään talteen eluoimalla 10 mM Tris:in pH 7,0 ja 1 mM EDTA:n avulla.
Esimerkki 2 30
Fytaasia koodittavan cDNA:n valmistaminen ja kloonaus cDNA:n ensimmäisen juosteen synteesiä varten, 5 pg poly A+ -RNA:ta, eristettynä esimerkin 1 mukaisesti, liuotetaan 16,5 35 pl:aan H20:ta, ja seuraavat komponentit lisätään: 2,5 μΐ RNasiinia (30 U/μΙ), 10 μΐ puskuria, joka sisältää 50 mM Tris-HCl:ää pH 7,6, 6 mM MgCl2:ta ja 40 mM KCl:ia, 2 μΐ 1 M KCl:ia, 5 μΐ 0,1 M DTT:tä, 0,5 μΐ oligo (dT) 12-is: tä (2,5 mg/ml), 5 μΐ 8 21 mM dNTP-seosta, 5 μΐ BSA:ta (1 mg/1) ja 2,5 μΐ Moloney'n MLV käänteistranskriptaasia (200 U/μΙ). Seosta inkuboidaan 30 minuutin ajan 37°C:ssa, ja reaktio pysäytetään lisäämällä 10 μΐ 0,2 M EDTA:aa ja 50 μΐ H20:ta. Uuttaminen suoritetaan 5 käyttäen 110 μΐ kloroformia, ja sentrifugoinnin jälkeen 5 minuutin ajan, supernatanttiin lisätään 5 M NH4Ac:tä ja 440 μΐ absoluuttista etanolia (-20°C). Saostaminen suoritetaan kuiva-jää/etanoli-liuoksessa 30 minuutin kuluessa. Sentrifugoinnin jälkeen (10 minuuttia 0°C:ssa) cDNA/mRNA-pelletti pestään 70 10 %:isella jääkylmällä etanolilla. Pelletti kuivataan ja liuotetaan 20 pl:aan H20:ta.
Fytaasia koodittavan cDNA:n eristäminen suoritetaan polymeraasiketjureaktion avulla (PCR) kahdessa fragmentissa. Kysei-15 set kaksi fragmenttia yhdistetään käyttäen BamHI-kohtaa geenin alueella täyspitkän cDNA:n synnyttämiseksi. Fytaasin cDNA:n kloonauskaavio esitetään kuviossa 1.
Fytaasigeenin sekvensointi (Van Gorcom et ai., 1991), osoittaa 20 BamHI-kohdan läsnäolon suunnilleen 800 emäsparin päässä aloi-tuskodonista. Fytaasigeenin nukleotidisekvenssiä tämän BamHI-kohdan ympärillä samoin kuin aloituskodonia edeltävää nukleo-tidisekvenssiä ja lopetuskodonin jälkeistä nukleotidisekvens-siä käytetään oligonukleotidien konstruointiin PCR:ää varten. 25
Polymeraasiketjureaktio suoritetaan Tag-polymeraasin toimittajan mukaisesti (Cetus), käyttäen 1,5 μΐ liuosta, joka sisältää ensimmäisen juosteen synteesin reaktiotuotteen ja 0,5 pg kutakin oligonukleotidiä. Monistaminen suoritetaan Perkin 30 Elmer/Cetus'in DNA-monistuslaitteessa. 25 jakson jälkeen, käsittäen 2 minuuttia 94°C:ssa, 2 minuuttia 55°C:ssa ja 3 minuuttia 72°C:ssa, reaktioseoksesta poistetaan proteiini myöhemmin fenoli- ja kloroformiuutoilla. DNA saostetaan, liuotetaan uudelleen puskuriin, joka sisältää 10 mM Tris:ia pH 35 7 ja 0,1 mM EDTAraa ja pilkotaan myöhemmin sopivilla restrik- tioentsyymeillä.
22
Proteiinin N-terminaalista osaa koodittavan fragmentin monistamiseksi, seuraavaa kahta oligonukleotidia käytetään:
Oligo 1: 5' GGGTAGAATTCAAAAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA 3' 5
Oligo 2: 5' AGTGACGAATTCGTGCTGGTGGAGATGGTGTCG 3'
Monistettu fragmentti pilkotaan EcoRI:llä ja kloonataan pTZ18R:n (ostettu Pharmacialta) EcoRI-kohtaan. Restriktio-10 kohtakartoitus ja nukleotidisekvensointi osoittavat fragmentin luotettavuuden. Tuloksena olevaa plasmidia nimitetään koodilla pGB925.
Toisen fragmentin monistamiseen käytetään seuraavaa kahta 15 oligonukleotidia:
Oligo 3: 5' GAGCACCAAGCTGAAGGATCC 3'
Oligo 4: 5' AAACTGCAGGCGTTGAGTGTGATTGTTTAAAGGG 3' 20
Monistettu fragmentti pilkotaan BamHI:llä ja PstI:llä ja kloonataan seuraavaksi pTZ18R:ään, joka on pilkottu BamHI:llä ja PstI:llä. Restriktiokohtakartoitus ja nukleotidisekvensointi osoittavat, että oikea fragmentti eristetään. Tulok-25 sena olevaa plasmidia nimitetään koodilla pGB926.
Täyspitkän cDNA:n eristämiseksi, pGB925 pilkotaan EcoRI:llä ja BamHI:llä, ja fytaasia koodittavaa DNA:ta sisältävä fragmentti eristetään. Tämä fragmentti kloonataan plasmidiin pGB926, joka 30 on pilkottu EcoRI:llä ja BamHI:llä, josta on tuloksena plasmi-di pGB927. Plasmidi pGB927 sisältää fytaasia koodittavan täyspitkän cDNA:n, jonka koko on suunnilleen 1,8 kiloemäsparia (kep).
23
Esimerkki 3
Kaksoisvektori pMOG23:n konstruointi 5 Tässä esimerkissä kuvaillaan kaksoisvektori pMOG23:n konstruointia (E. coli K-12-kannassa DH5cx, talletettu the Centraal Bureau voor Schimmelcultures'iin 29. tammikuuta 1990 talletus-numerolla CBS 102.90).
10 Kaksoisvektori pMOG23 (kuvio 2) on vektorin Binl9 johdannainen (Bevan, M., 1984). pMOG23:n saamiseksi, vektoria Binl9 muute taan tavalla, joka ei ole olennainen tämän keksinnön kannalta, käyttäen menetelmiä, jotka ovat tuttuja molekyylibiologian alaa tunteville.
15
Ensiksi, vasemman reunan ((LB) ja oikean reunan (RB) paikat vaihdetaan, koskien neomysiinifosfotransferaasin geeniä II (NPTII-geeniä). Toiseksi, NPTII-geenin kopiointisuunta käännetään, mikä aiheuttaa kopioitumisen LB-suunnassa. Lopuksi, 20 Binl9-polylinkkeri vaihdetaan polylinkkeriin, jossa on seuraa-vat restriktioentsyymien tunnistuskohdat: EcoRI, Kpnl, Smal,
BamHl, Xbai, Saci, Xhoi ja HinduI.
Esimerkki 4 25
Aspergillus ficuumin fytaasi-cDNA:n kloonaus ekspressiora-kenteeseen konstitutiivista ilmentämistä varten kasveissa.
Aspergillus ficuumin fytaasigeeni räätälöidään ja kloonataan 30 ekspressiorakenteeseen konstitutiivista ilmentämistä varten kukkakaalin mosaiikkiviruksen 35S-promoottorin alapuolelle. Ekspressiorakenne sisältää myös kooditustiedon kasviperäiselle signaalipeptidisekvenssille.
35 Fytaasi-cDNA kloonataan ekspressiorakenteeseen, joka on läsnä plasmidissa pMOG29 (kuvailtu kohdassa a) ) . Seuraavaksi koko rakenne liitetään kaksoisvektoriin pMOG23 ja siirretään Agro-bacterium tumefaciensin kantaan LBA4404.
24 a) Ekspressiovektori pMOG29:n konstruointi
Ekspressiorakenne R0K1 (Baulcombe et ai., 1986) kloonataan 5 EcoRI/HindiII-fragmenttina plasmidiin pUC18. Tämä rakenne sisältää kukkakaalin mosaiikkiviruksen (CaMV) 35S-promoottorin EcoRI/BamHI-fragmentissa, ja nopaliinisyntetaasin (nos) kopioinnin terminaattorin BamHI/HindiII-fragmentissa. Promoottori-fragmentti käsittää CaMV:n 35S-promoottorin sekvenssin välillä 10 -800 - +1 . Paikka +1, joka luetaan mukaan, on kopioinnin aloituskohta (Guilley et ai., 1982). Ncol-kohdan yläpuolinen sekvenssi paikassa -512 poistetaan, ja tämä kohta vaihdetaan EcoRI-kohdaksi. Tämä suoritetaan leikkaamalla pUC18:ssa läsnä oleva ekspressiorakenne Ncol:llä, täyttämällä yksijuosteiset 15 päät Klenow'n polymeraasin avulla ja liittämällä EcoRI-linkkeri. Tuloksena oleva plasmidi katkaistaan EcoRI:llä, josta on tuloksena EcoRI-fragmentin deleetio, joka sisältää 35S-promoottorin sekvenssejä alkuperäisen Ncol-kohdan yläpuolella. BamHI/HindiII-fragmentti, joka sisältää nos-termi-20 naattorin, korvataan synteettisellä DNA-fragmentilla (oli-gonukleotididupleksi A, kuvio 4) , joka sisältää sinimailasen mosaiikkiviruksen (AlMV:n) RNA4:n ohjaussekvenssin (Brederode et ai., 1980). Tämä suoritetaan katkaisemalla BamHI:llä, jota seuraa katkaisu Hindlll:llä ja synteettisen DNA-fragmentin 25 liittäminen. BamHI-kohta ja kolme yläpuolista nukleotidiä poistetaan paikkakohdennetun mutatoinnin avulla. Tuloksena olevaan plasmidiin liitetään uudelleen BamHI/HindiII-fragment-ti, joka sisältää nos-terminaattorisekvenssin. β-glukuro-nidaasia koodittava geeni (lähtöisin plasmidista pRAJ 275; 30 Jefferson, 1987) liitettiin Ncol/BamHI-fragmenttina, josta oli tuloksena plasmidi pM0G14. Kirjallisuudesta tiedetään, että sekvenssin kahdentaminen välillä -343 ja -90 lisää 35S-promoottorin aktiivisuutta (Kay et ad., 1987). Jotta saataisiin promoottorifragmentti, jossa on kaksinkertainen, niin 35 sanottu tehostajasekvenssi (enhancer), seuraavat alaa tuntevien henkilöiden tiedossa olevat vaiheet suoritetaan. Tehostaja-fragmentti eristetään plasmidista pMOG14 AccI/EcoRI-fragmentissa ja tehdään sen jälkeen tasapäiseksi Klenow'n 25 polymeraasin avulla. Saatu fragmentti liitetään pMOG14-plasmidiin, joka on katkaistu EcoRI;llä ja tehty tasapäiseksi, sillä tavalla, että rajakohta tasapäistettyjen EcoRI- ja Accl-kohtien välissä muodostaa uuden EcoRI-kohdan. Tuloksena oleva 5 plasmidi (pM0G18) sisältää 35S-promoottorin, kaksinkertaisen tehostajasekvenssin, AlMV:n RNA4:n ohjaussekvenssin ja nos-terminaattorin ekspressiorakenteessa ollessa vielä läsnä EcoRI /Hindi II -fragmentissa. Lopuksi, NeoI/BamHI-fragmentti, joka koodittaa β-glukuronidaasia, korvataan synteettisellä DNA-10 fragmentti B:llä (kuvio 4), joka on peräisin PROB12-cDNA:sta (Cornelissen et ai., 1986). Tämä fragmentti B koodittaa PR-proteiinin PR-S-signaalipeptidisekvenssiä tupakka Samsun NN:stä. SphI-kohta muodostetaan signaalipeptidiä koodittavaan DNA-sekvenssiin vaihtamalla yksi nukleotidi. Tämä vaihdos ei 15 muuta kooditetun PR-S-signaalipeptidin aminohapposekvenssiä. Tuloksena olevaa plasmidia nimitetään tunnuksella pMOG29 (kuvio 8) .
b) Aspergillus ficuumin fytaasigeenin kloonaus kaksoisvek-20 toriin
Oligonukleotididupleksi C (kuvio 4) kloonataan plasmidiin pMOG29, joka on pilkottu Sphl;llä ja BamHI:llä, josta on tuloksena plasmidi pMOG407. Oligonukleotididupleksi sisältää 25 kooditustiedon signaalipeptidi PR-S:n kahdelle viimeiselle aminohapolle, joita seuraavat valmiin fytaasin kuusi ensimmäistä aminohappoa.
Plasmidi pGB927, joka sisältää täyspitkän fytaasi-cDNA:n, 30 pilkotaan XhoI:llä (osittain) ja PstI:llä. XhoI/PstI-fragmentti, joka sisältää valmista fytaasia koodittavat DNA-sekvenssit aminohaposta 6 eteenpäin, kloonataan XhoI;llä ja PstI:llä linearisoituun plasmidiin pMOG407, josta on tuloksena plasmidi pMOG417. Koko rakenne, joka sisältää kimeerisen 35 fytaasigeenin, liitetään EcoRI/HindiII-fragmenttina kaksois-vektoriin pMOG23, joka on tehty lineaariseksi EcoRI:llä ja Hindin:11a. Tuloksena oleva kaksoisplasmidi pMOG413 siirretään, triparentaalissa pariutumisessa E. coli K-12-kannan 26 RK2013 kanssa (joka sisältää plasmidin pRK2013) (Ditta et ai., 1980), Agrobacterium tumefaciens -kantaan LBA4404, joka sisältää plasmidin, jossa on T-DNA:n siirtämiseksi kasviin tarvittavat virulenssigeenit.
5
Esimerkki 5
Kimeerisen fytaasigeenin lyhytaikainen ilmentäminen tupakan protopiasteissä 10
Tupakan protoplasteja transformoidaan plasmidi-DNA:11a, joka sisältää kimeerisen fytaasigeenin konstitutiivisen CaMV 35S-promoottorin ohjauksessa. 72 tunnin kuluttua käsitellyistä protoplasteista määritetään siirretyn fytaasigeenin lyhytai-15 kainen ilmentyminen, käyttäen fytaasiaktiivisuusmääritystä.
Protoplasteja valmistetaan akseenisesti kasvatetuista 1-2 kuukautta vanhoista tupakkakasveista (Nicotiana tabacum SRI). Koko menettelyä kuvailevat Rodenburg et ai. (1989). Trans-20 formaatiota varten 5xl05 protoplastia elektroporatoidaan 40 pg:lla plasmidi-DNA:ta (pMOG417). Elektroporaation jälkeen protoplastit resuspendoidaan 3 ml:aan K3G-alustaa. Fytaasiak-tiivisuusmääritystä varten protoplastit sentrifugoidaan, ja 3 ml supernatanttia dialysoidaan yli yön vesiylimäärää vastaan. 25 Dialysaatti jäädytyskuivataan ja resuspendoidaan 300 μΐ:aan 25 mM natriumasetaattia pH 5,5. Määritys suoritetaan sen jälkeen kuten esimerkissä 10 on yksityiskohtaisesti kuvailtu, sillä ainoalla poikkeuksella, että 250 mM glysiini-HCl-puskurin pH
2,5 sijasta käytetään 25 mM natriumasetaattipuskuria pH 5,5.
30 Näissä kokeissa yksi fytaasiyksikkö on määritelmän mukaan 1 pmooli fosfaattia, joka vapautuu 1,5 mM natriumfytaatti-liuoksesta minuutissa 37°C:ssa pH 5,5:ssä.
35 Käsittelemättömissä protoplasteissa ei havaita ilmaistavaa aktiivisuutta. Plasmidilla pMOG417 elektroporatoiduissa protoplasteissa on aktiivisuutta 0,26 PTU (fytaasiyksikköä, katso esimerkki 10) mg:aa kohti proteiinia supernatantissa.
Esimerkki 6 27
Kimeerisen fytaasiqeenin pysyvä ilmentäminen tupakkakasveissa 5 CaMV 35S-promoottorin ohjauksessa.
Tupakka transformoidaan viljelemällä kasvisolukkoa yhdessä Agrobacterium tumefaciens -kannan LBA4404 kanssa, joka sisältää kaksoisvektorin pM0G413, jossa on kimeerinen fytaasigeeni 10 CaMV 35S-promoottorin ohjauksessa. Transformointi suoritetaan käyttäen tupakan (Nicotiana tabacum SRI) lehtilevyjen sekavil-jelyä Horsch'in et ai., (1985), mukaisesti. Transgeenisiä kasveja regeneroidaan versoista, jotka kasvavat valinta-alustalla (100 mg/1 kanamysiiniä), juurrutetaan ja siirretään 15 maahan. Nuorista kasveista määritetään NPTII-aktiivisuus (kanamysiiniresistenssi) , ne kasvatetaan valmiiksi ja niiden annetaan itsehedelmöittyä ja tuottaa siemeniä.
Transgeenisissä siemenissä todetun fytaasiaktiivisuuden mää-20 rittämiseksi, noin 50 mg otetaan ja homogenisoidaan survimen kanssa jääkylmässä huhmaressa 1 ml:ssa 25 mM nat-riumasetaattipuskuria pH 5,5. Sentrifugoinnin jälkeen su-pernatantti määritetään kuten on kuvailtu lyhytaikaisten määritysten kohdalla. 32:ssa toisista riippumatta transfor-25 moidussa tupakkakasvissa havaittiin fytaasille maksimi-il-menemistaso 0,4 % siemenen liukoisesta kokonaisproteiinista. Transformoimattomissa kasveissa ei voitu havaita yhtään fy-taasiaktiivisuutta.
30 Kaksi transgeenistä kasvilinjaa, 413.25 ja 413.32, valittiin niiden fytaasin korkeiden ilmenemistasojen perusteella (suunnilleen 0,4 %) siemenissä.
28
Esimerkki 7
Aspergillus ficuumin fytaasi-cDNA:n kloonaus siemenspesifi-sessä ekspressiorakenteessa 5
Ekspressiorakenne konstruoidaan sillä tavalla, että saavutetaan siemenspesifinen ilmeneminen, käyttäen Brassica napuk-sen 12S varastoproteiini-krusiferiinin (cruA; Ryan et ai., 1989) geenin sekvenssejä. Nämä sekvenssit voidaan korvata 10 samanlaisten siemenspesifisten geenien sekvensseillä saman päämäärän saavuttamiseksi kuin tämän keksinnön tavoitteena on.
Fytaasin cDNA kloonataan ekspressiorakenteeseen. Lopuksi koko rakenne siirretään Agrobacterium tumefaciensiin, jota käyte-15 tään transformaatiossa. Jonkin muun kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin ollessa kysymyksessä, geenin tai cDNA:n kloonaus suoritetaan olennaisesti samalla tavalla kuin tässä on kuvailtu fytaasin cDNA:lle.
20 Kaikissa tämän esimerkin E. coli -transformaatioissa käytetään E. colin K-12-kantaa DH5a.
a) Ekspressiorakenteen konstruointi 25 Ekspressiorakenteen konstruoimiseksi siemenspesifistä ilmentämistä varten, Brassica napuksen Jet Neuf-variantin krusi-feriini A (cruA)-geenin promoottori- ja terminaatto-risekvenssit syntetisoidaan käyttäen PCR-tekniikkaa, eristetty genominen DNA templaattina (Mettler, I.J., (1987). Tämä geeni 30 ilmenee siemenspesifisesti, ja sen kooditus- ja vierussekvens-sit on määritetty (Ryan et. ad., 1989) .
Kaksi oligonukleotidierää syntetisoidaan. Yksi, joka mahdollistaa cruA 5'-puoleisen viereisen alueen ja osan sig-35 naalipeptidiä koodittavasta sekvenssistä monistamisen Eco-RI/NeoI-fragmenttina: 29 5' GTTCGGAATTCGGGTTCCGG 3' ja 5' AAC T G T T GAGC Τ G ΤAGAGC C 3'. Toinen 3'-puoleisen viereisen sekvenssin monistamiseksi BglII/HindiII-fragmenttina: 5 5' CTTAAGATCTTACCCAGTGA 3' ja 5' CGGAGAAGCTTGCATCTCGT 3'.
Oligot suunnitellaan sisältämään sopivat restriktiokohdat päissään, mikä mahdollistaa ekspressiorakenteen suoran kokoamisen fragmenttien pilkkomisen jälkeen restriktioentsyymeillä.
10 cruA-geenin 5'-fragmentti, joka sisältää 54 nukleotidiä sekvenssistä, joka koodittaa signaalipeptidiä, kloonataan vektoriin pMOG445 (oligonukleotididupleksi E (kuvio 4) kloonattuna vektoriin pUC18, linearisoitu SstI:llä ja EcoRI:llä), katkais-15 taan EcoRI:llä ja Ncol:llä, josta on tuloksena vektori pMOG424. Synteettinen oligonukleotididupleksi D (kuvio 4), joka sisältää viisi viimeistä kooditustriplettiä Brassica napuksen krusiferiinin signaalisekvenssille, valmiin fytaasin aminohappoja 1-6 koodittavan sekvenssin ja monikloonauskohdan, 20 kloonataan vektoriin pMOG424, joka on katkaistu Ncol:llä ja HindiII:llä. Tuloksena olevaa vektoria nimitetään koodilla pMOG425. cruA:n 3' PCR-fragmentti kloonataan BglII/HindiII-fragmenttina pMOG425:een, joka on pilkottu Bglll:llä ja Hin-dIII:llä, josta on tuloksena pMOG426.
25 b) Aspergillus ficuumin fytaasigeenin kloonaus kaksoisvek- toriin
Plasmidi pGB927, joka sisältää täyspitkän kooditussekvenssin 30 Aspergillus ficuumin fytaasille, pilkotaan XhoI:llä (osittain) ja PstI:llä. XhoI/Pstl-fragmentti, joka sisältää valmista fytaasia koodittavat DNA-sekvenssit aminohaposta 6 eteenpäin, kloonataan vektoriin pMOG426, joka on katkaistu XhoI:llä ja PstI:llä. Tuloksena olevasta vektorista pMOG428, kokonainen 35 rakenne, joka sisältää kimeerisen fytaasigeenin, liitetään EcoRI/HindiII-fragmenttina kaksoisvektoriin pMOG23, joka on linearisoitu EcoRI:llä ja Hindlll:llä. Tuloksena oleva kak-soisvektori pMOG429 (kuvio 5) siirretään, triparentaalissa 30 pariutumisessa E. coli K-12-kannan RK2013 kanssa (joka sisältää plasmidin pRK2013) (Ditta et ai., edellä), Aqrobacterium-kantaan LBA4404 (Hoekema et ai., 1983, edellä), joka sisältää plasmidin, jossa on T-DNA:n siirtämiseksi kasviin tarvittavat 5 virulenssigeenit.
Esimerkki 8
Fytaasin pysyvä siemenspesifinen ilmentäminen tupakan sie-10 menissä krusiferiini-promoottorin ohjauksessa
Agrobacterium-kantaa LBA4404, joka sisältää kaksoisvektorin pMOG429, fytaasi-cDNA:n ollessa krusiferiini-promoottorin ohjauksessa, käytetään transformaatiokokeisiin. Tupakan (Nico-15 tiana tabacum SRI) transformointi suoritetaan käyttäen lehti-levyjen yhteisviljelyä Horsch'in et ad., (1985) menetelmän mukaisesti. Transgeeniset kasvit regeneroidaan versoista, jotka kasvavat valinta-alustalla (100 mg/1 kanamysiiniä). Nuorista kasveista määritetään NPTTII-aktiivisuus (kanamysii-20 niresistenssi), ne kasvatetaan valmiiksi, ja niiden annetaan itsehedelmöityä, ja siementää. Yksittäisten transformanttien siemeniä kerätään yhteen, ja osasta siemennäytettä määritetään fytaasin läsnäolo. Klooneista, joiden ilmentymistasot ovat korkeimmat, verrattuna transformoimattomiin kontrollisieme-25 niin, jäljelle jääneet siemenet idätetään kanamysiinin kanssa (200 mg/1) (siten myös transgeenisiä fytaasin osalta) ja valikoidaan, ja käytetään kasvien massalisäämiseen, jotka kasvit kykenevät tuottamaan suurimmat fytaasimäärät siemenissään. Näitä voidaan sitten käyttää esim. sulatuskokeissa.
30
Transgeenisissä siemenissä havaitun fytaasiaktiivisuuden määrittämiseksi, noin 50 mg siemeniä otetaan ja homogenoidaan survimen avulla jääkylmässä huhmaressa 1 ml:ssa 25 mM natrium-asetaattipuskuria pH 5,5. Supernatantti analysoidaan sentrifu-35 goinnin jälkeen kuten lyhytaikaisissa määrityksissä on kuvailtu. 55:ssä itsenäisesti transformoidussa tupakkakasvissa havaittiin suurimmaksi fytaasin ilmenemistasoksi 0,15 % liukoisesta kokonaissiemenproteiinista. Fytaasiaktiivisuutta ei 31 havaittu transgeenisten kasvien varsissa, juurissa eikä lehdissä. Fytaasiaktiivisuutta ei havaittu lainkaan transformoi-mattomista kasveista.
5 Esimerkki 9
Rapsin transformointi Tässä esimerkissä kuvaillaan rapsin transformaatiota vilje-10 lemällä kasvisolukkoa yhdessä Agrobacterium tumefaciensin kanssa, joka sisältää kaksoisvektorin, jossa on kimeerinen fytaasigeeni. Transgeenisiä kasveja voidaan valikoida antibioottiresistenssin perusteella. Transgeenisistä kasveista voidaan analysoida fytaasiaktiivisuus. Runsaasti ilmentävät 15 kasvit voidaan analysoida perusteellisemmin ja käyttää jatko-kokeissa.
Sama kimeerinen fytaasirakenne kaksoisvektorissa (pMOG429) siirretään Agrobacterium tumefaciens -kantaan LBA4404, vastaa-20 valla tavalla kuin esimerkissä 7 on kuvailtu. Tätä kantaa voidaan käyttää rapsin transformointiin (Brassica napus var. Westar). Tätä tarkoitusta varten, pinnalta steriloidut juu-riosaset, jotka on otettu 5-6 viikkoa vanhoista kasveista, juuri ennen kukintaa, esi-inkuboidaan 24 tunnin ajan MS-25 alustalla (Fry et ai., 1987) 1 mg:n kanssa BAP:tä, ja viljel lään sen jälkeen yhdessä 48 tunnin ajan Agrobacterjumin kanssa tuoreilla, samaa alustaa sisältävillä maljoilla. Transgeenisiä kasveja voidaan regeneroida versoista, jotka kasvavat valinta-alustalla (500 mg/1 karbenisilliiniä, 40 mg/1 paromomysiiniä) 30 ja analysoidaan edelleen kuten esimerkissä 8 tupakan kohdalla on kuvailtu.
Esimerkki 10 32
Fytaasiaktiivisuusmääritys 5 Kaikkiaan 25 mg siemeniä Nicotiana tabacum -kasvin linjasta 413.25, joka sisältää kaikkiaan suunnilleen 0,25 PTU:ta, jauhettiin. (PTU = fytaasiyksikköjä). Yksi fytaasiaktiivi-suusyksikkö määritellään siksi määräksi entsyymiä, joka vapauttaa epäorgaanista fosforia 1,5 mM natriumfytaatista nopeu-10 della 1 pmooli/min. 37°C:ssa ja pHrssa 2,5).
Jauhettua siementä inkuboidaan 50 ml: n kokonaistilavuudessa 250 mM glysiini/HCl-puskuria pH 2,5, joka sisälsi 0,86 g natriumfytaattixll H20:ta. Vaikka Aspergillus-fytaasi ilmentää 15 pH-optimin pisteessä pH=2,5 yhtä hyvin kuin pH 5,5:ssä, alempi pH valitaan kasvifytaasiaktiivisuuden pois sulkemiseksi.
Tuloksena olevaa seosta inkuboidaan 15 minuuttia ja 60 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 5 ml inkubointi-20 liuoksesta 5 ml:aan 10 %:ista TCA:ta (trikloorietikkahappo). Sen jälkeen pysäytettyyn entsyymiliuokseen lisätään 10 ml indikaattorireagenssia (3,66 g FeSC>4x7H20:ta 50 ml:ssa ammoni-ummolybdaattiliuosta (2,5 g (NH4) 6Μθ7θ24χ4Η2θ: ta ja 8 ml väkev. H2S04:ää, laimennettuna 250 ml:ksi demivedellä). Sinisen värin 25 intensiteetti mitataan spektrofotometrisesti aallonpituudessa 700 nm.
Hetkellä T = 0 läsnä olevan epäorgaanisen fosfaatin pitoisuus toimii sokeana.
30
Mittaukset osoittavat vapautuneen fosfaatin määrän suhteessa fosfaatin kalibrointikäyrään alueella 0-1 mM.
Esimerkki 11 33
Jauhettujen Nicotiana tabacumin siementen inkubointi rehu-aineiden kanssa 5
Tyypillisessä esimerkissä, 0,25 g liuottimena uutettua soijajauhoa inkuboidaan 25 mg:n kanssa jauhettuja Nicotiana tabacum -siemeniä (kasvilinja 413.25), joka sisältää suunnilleen 0,25 PTU:ta kuten edellä kuvailtiin, lukuunottamatta natriumfy-10 taattilisäystä. Tässä tapauksessa lisätty inkubointiaine sisältää seoksen, joka sisältää 410 ml puskuria ja 90 ml demineralisoitua vettä.
Fosfaatin vapautumista fytaatista liuottimena uutetussa 15 soijajauhossa kuvataan kuviossa 6. Ilman lisättyä jauhettua kasviainesta aktiivisuutta ei havaita.
Käytännöllisesti katsoen identtisessä kokeessa saadaan samanlaisia tuloksia, käytettäessä maissigluteenirehua substraatti-20 na. Tulokset esitetään kuviossa 6.
Aktiivisuutta ei havaita lainkaan jauhettujen siemenien puuttuessa, tai kun jauhettuja siemeniä lisätään, jotka eivät sisällä fytaasiaktiivisuutta.
25
Esimerkki 12
Fytaasia sisältävien transgeenisten siementen in vitro -testaaminen olosuhteissa, jotka jäljittelevät siipikarjan 3 0 ruoansulatuskanavaa
Transgeenisessä tupakan siemenissä tuotetun fytaasin tehokkuuden määrittämiseksi, Aspergilluksen fytaasin aktiivisuus määritetään mallissa, joka jäljittelee olosuhteita, jotka 35 tavataan siipikarjan ruoansulatuskanavassa.
Siipikarjan normaalia rehunäytettä inkuboidaan ensin pitoisuudessa 1 g/15 ml demivettä 60 minuutin aikana 39°C:ssa, 34 eläinten kuvussa esiintyvien olosuhteiden simuloimiseksi. Sen jälkeen lisätään 5 ml pepsiiniliuosta (Merck: 5,28 g/1, pH 3,0 - säädetty HClrllä), pH säädetään HCl:n kanssa pH-arvoon 3,0, ja inkubointia jatketaan vielä 90 minuuttia samassa lämpöti-5 lassa mahassa vallitsevien olosuhteiden jäljittelemiseksi.
Inkubointijakson aikana näytteitä otettiin rehussa läsnä olevasta fytaatista vapautuneen fosfaattimäärän määrittämiseksi .
10
Sienifytaasin vaikutus selviää kuviosta 10. Fytaasiannostuksen lisääminen 250 PTU:sta 1000 PTU:hun/ kg rehua, johtaa fosfaatin vapautumisen lisääntymiseen rehunäytteestä.
15 Kun sienifytaasin asemesta lisätään näyte transgeenisestä tupakan siemenestä (linjat 413.25 ja 413.32; jauhamisen jälkeen huhmaressa), havaitaan samanlaista fosfaatin vapautumisen lisääntymistä (kuvio 11). Fytaasia sisältämätön tupakan kont-rollisiemen testattiin myös. Fosfaatin vapautumista ei havait-20 tu, verrattuna nollakokeeseen.
Tulosten vertailu, jotka saatiin 50 g:11a transgeenistä tupa-kansiementä/kg rehua, tuloksiin, jotka saatiin 500 ja 750 PTU/kg rehua tasolla, osoittaa, että 1 g tupakansiementä 25 vastaa suunnilleen 12 PTU:ta tässä siipikarjan in vitro -sulatusmallissa.
Esimerkki 13 30 Eläintestaus
Kokeita suoritetaan broilereilla, kasvien siemenissä ilmentyneen fytaasin tehon osoittamiseksi, samoin kuin tupakan-siementen negatiivisen vaikutuksen puuttumisen osoittamiseksi 35 eläinteknisiin tuloksiin.
Fytaasia ilmentäviä ja kontrollina toimivia tupakansiemeniä kerätään talteen. Siemenet jauhettiin 100 g:n erissä seulan 35 kanssa (Retch-mylly ZM-1), jossa oli 500 μιη:η aukot, huolehtimalla siementen jäähdytyksestä.
Yhden päivän vanhoja urosbroilerikananpoikia (Hybro) kasva-5 tetaan kaksirivisissä patterihäkeissä (0,45 m2). Vallitseva lämpötila on 32°C kahden ensimmäisen päivän aikana, ja sitä lasketaan 4°C ensimmäisellä viikolla. Jokaisella seuraavalla viikolla lämpötilaa lasketaan 2°C. Broilereita kasvatetaan ohjelmassa, joka käsittää yhden tunnin valossa ja kolme tuntia 10 pimeässä.
Linnut rokotetaan New Castle-tautia vastaan yhden päivän ikäisinä, käyttäen klooni 30-rokotetta. Kokeiden aikana broilereille syötetään koedieettejä kaikki komponentit sekaisin ja 15 riittävässä määrin. Kasvu ja rehu/kasvulisäsuhteet mitataan koejaksojen aikana. Kokonaisfosforin näennäinen käytettävyys mitataan kolmen päivän jaksossa, jonka aikana rehunkulutus mitataan kuiva-aineen sisäänottona, ja ulosteet kerätään kvantitatiivisesti.
20
Fosforin näennäinen käytettävyys määritellään erotuksena sisään otetun fosforin ja ulostetun fosforin välillä.
Seuraavia kontrollidieettejä ilman fytaasilisäystä käytetään: 25
Dieetit Ca (%) kokonais-P (%) fytaatti-P (%) 1 0,60 0,45 0,30 2 0,75 0,60 0,30 30 3 0,90 0,75 0,30
Dieettiin 1 (perusdieetti) ei lisätä lainkaan lajiteltua rehufosfaattilaatua. Kalsium ja fosfori lisätään dieetteihin 2 ja 3 seoksesta, joka sisältää vedetöntä dikalsiumfosfaattia ja 35 monoammoniumfosfaattia (5:1). Kaikki koedieetit saadaan lisäyksillä perusdieettiin (katso taulukko 1) .
Koedieetti 4 sisältää mikrobitytaasia pitoisuudessa 400 PTU/kg rehua, valmistettuna kuten Van Gorcom et ai., (1991) on ku vaillut .
36 5 Koedieetti 5 on kuten dieetti 4, mutta ei-transgeenisen tupakan jauhettuja siemeniä lisätään rehuseokseen, jotta saadaan lopulliseksi suhteeksi 3 kg/90 kg rehua.
Koedieetti 6 on myös kuten dieetti 4, mutta 3 kg transgeenisen 10 tupakan jauhettuja siemeniä (linja 413.25) lisätään 90 kg:n rehuseokseen, jotta saadaan loppupitoisuudeksi 400 PTU/kg rehua.
Koe suoritetaan 176:11a broilerilla 16 patterihäkissä 15 (11/patterihäkki), 24 päivän ikään saakka. Käsittelyt (dieetit) toistetaan kahdesti, ja siirretään sattumanvaraisesti häkkeihin kussakin rivissä.
Fosforin käytettävyys mitataan 21-24 päivän iässä.
20
Tulokset koskien fosforin saatavuutta ja eläinten kasvua, joita oli syötetty dieeteillä 4, 5 ja 6, osoittavat jokainen fytaasilisäyksen positiivisen vaikutuksen (taulukko 2). Dieettien 4, 5 ja 6 vertailu osoittaa myös, että tupakan siementen 25 sisällyttäminen rehuun sopii yhteen mikrobitytaasin toiminnan kanssa farmieläinten kuten broilerien maha-suolikanavassa, eikä osoita mitään negatiivista vaikutusta eläinteknisiin tuloksiin.
37
Taulukko 1. Perusdieetin koostumus broilerikokeissa
Aineosat Pitoisuus (g/kg)
Keltainen maissi 280,0 5 Durra (alhainen tanniini) 200,0
Auringonkukan siemenjauho (liuotinuutettu) 80,0
Soijajauho (liuotinuutettu, 48,8 % proteiinia) 350,0 10 Soijaöljy 58,5
Vitamiinit1 5,0
Mineraalit1 15,0
Kalkki 1,0
Synteettinen metioniini 1,0 15 Cr203 0,5 1001,0 ME (MJ/kg) 13,1 20 Lysiini 12,9
Metioniini + kystiini 9,1
Kalsium 6,0 (6,0-6,6)2
Kokonais-fosfori 4,5 (4,7-4,7)2
Orgaaninen fytaattifosfori 3,0 (3,1-3,1)2 35 ** ( ) Analysoitu kokeissa 1 ja vastaavasti 2.
Lisätty määrä dieettikiloa kohti: 12000 IU vitamiinia A; 2 2000 IU vitamiinia D3; 5 IU vitamiinia E; 1,5 mg vitamiinia K3; 1 mg tiamiinia; 5 mg riboflaviinia; 1 mg pyridoksiinia; 30 mg nikotiinihappoa; 7,5 mg D-pantoteenihappoa; 0,015 mg vita-30 miinia Bi2; 0,5 mg foolihappoa; 350 mg koliinikloridia; 75 mg etoksikinia; 9,5 g CaC03:a; 2,5 g NaCl:ia; 0,26 g FeS04:ia; 0,2 4 g MnS04:ia; 45 mg CuS04:ia; 60 mg ZnS04:ia; 105 mg KJ-seosta.
38
Taulukko 2.
Fytaasin vaikutus kokonais-P:n ja kokonais-Ca:n käytettävyyteen, P-pitoisuuteen lannassa ja broilereiden suorituskykyyn 5 Dieetit Ca/P Lisätty fytaasi Käytettävyys (%) P:n määrä lannassa Kasvu (g/kg) (yksikköä/kg) 21-24 päivää (g) sisäänotto 0-24 p P Ca kuiva-ainekiloa (g) kohti 10 1 6/4,5 0 49,8 47,2 2,7 338 2 7,5/6 0 45,6 48,9 3,8 592 3 9/7,5 0 44,6 46,9 4,9 683 4 kuten 1 400 60,5 58,6 2,1 620 5 kuten 1 0 48,5 48,0 2,7 340 15 6 kuten 1 400 60,2 59,3 2,1 615 39
Esimerkki 14
Bacillus licheniformiksen α-amylaasigeenin kloonaus ekspres-siokasettiin konstitutiivista ilmentämistä varten 5 Tässä esimerkissä Bacillus licheniformiksen a-amylaasigeeni räätälöidään ja kloonataan ekspressiokasettiin konstitutiivista ilmentämistä varten, joka geeni sisältää myös koodi-tustiedon koskien kasvialkuperäistä signaalipeptidisekvenssiä. 10 Viimeisenä vaiheena koko rakenne kloonataan kaksoisvektoriin, siirretään Agrobacterium tumefaciensin kantaan LBA4404, jota käytetään kiinnostuksen kohteena olevan kasvin transformoin-tiin. Mikä tahansa geeni tai cDNA voidaan kloonata samalla tavalla kuin tässä on kuvailtu koskien α-amylaasigeeniä.
15
Kaikki transformaatiot tässä esimerkissä tehdään E. coli K-12 kannassa DH5a.
a) Bacillus lichenif ormiksen ot-amylaasigeenin räätälöinti 20
Bacillus licheniformiksen α-amylaasigeeni (kuvio 7), joka on läsnä Bacillus-vektorissa pPROM54 (talletettu the Centraal Bureau voor Schimmelcultures'iin 5. marraskuuta, 1985, talle-tusnumerolla CBS 696.85), pilkotaan Xbal:llä ja Bell:llä. 25 Xbal/Bell-fragmentti kloonataan plasmidiin pUC18, joka on tehty lineaariseksi Xbal:llä ja BamHI:llä, josta on tuloksena plasmidi pMOG318. Sali/BamHI-fragmentti syntetisoidaan käyttäen PCR-tekniikkaa pMOG318 templaattina, muodostamalla BamHI-kohta käyttäen hyväksi vastinparitonta aluketta (osoitettu 30 kuviossa 7). Sall/BamHI PCR -fragmentti kloonataan plasmidiin pIC-19R (Marsh et ai., 1984), joka on pilkottu Sali:llä ja BamHI:11a, josta on tuloksena plasmidi pMOG319. Sali-fragmentti, joka sisältää 5'-pään a-amylaasigeenin, pMOG318:sta (käyttäen Sali-kohtaa, joka on läsnä pUC18:ssa), 35 kloonataan plasmidiin pMOG319, joka on linearisoitu Sali:llä. Tästä on tuloksena plasmidi pMOG320, joka sisältää koko a-amylaasigeenin.
40 b) Vektori pMOG29:n konstruointi
Vektori pMOG29 konstruoitiin kuten esimerkissä 4(a) on kuvailtu .
5 c) Bacillus licheniformiksen α-amylaasin kloonaus kaksois-vektoriin
Plasmidi pMOG320 pilkotaan Hgal:llä ja BamHI:llä. Hgal/BamHI-10 fragmentti, joka koodittaa valmista α-amylaasia aminohaposta 9 eteenpäin, kloonataan kolmitaholigaatiossa synteettisen oligo-nukleotididupleksi-F:n kanssa (kuvio 4) plasmidiin pMOG29, joka on linearisoitu Sphl:llä ja BamHI:llä, josta on tuloksena plasmidi pMOG321. Oligonukleotididupleksi sisältää kooditus-15 tiedon PR-S:n signaalipeptidin kahdelle viimeiselle aminohapolle ja valmiin α-amylaasin yhdeksälle ensimmäiselle aminohapolle. Koko rakenne, joka sisältää kimeerisen a-amylaasigeenin, liitetään EcoRI/HindiII-fragmenttina kaksois-vektoriin pMOG23, joka on linearisoitu EcoRI:llä ja Hin-20 diilillä. Tuloksena oleva kaksoisplasmidi pMOG227 (kuvio 9) siirretään triparentaalin pariutumisen avulla E. coli K-12-kannan RK2013 kanssa (joka sisältää plasmidin pRK2013) (Ditta et ai., 1980), Agrobacterium-kantaan LBA4404, joka sisältää plasmidin virulenssigeeneillä varustettuna, jotka ovat välttä-25 mättömät T-DNA:n siirtämiseksi kasviin.
Esimerkki 15
Bacillus licheniformiksen α-amylaasin pysyvä ilmentäminen 30 tupakassa Tässä esimerkissä tupakka transformoidaan viljelemällä kas-visolukkoa yhdessä Agrobacterium tumefaciensin kanssa, joka sisältää kimeerisen a-amylaasigeenin sisältävän kaksois-35 vektorin. Transgeeniset kasvit valikoidaan antibioottiresistenssin suhteen. Transgeenisten kasvien siemenistä määritetään a-amylaasiaktiivisuus. Hyvät ilmentäjät analysoidaan perusteellisemmin, ja niitä käytetään jatkokokeissa.
41
Agrobacterium-kantaa LBA4404 (pMOG227) käytetään transfor- maatiokokeisiin. Tupakan (Nicotiana tabacum SRI) transfor-mointi suoritetaan käyttäen lehtilevyjen sekaviljelyä Horsch-5 in et ai. (1985) menetelmän mukaisesti. Transgeeniset kasvit regeneroidaan versoista, jotka kasvavat valinta-alustalla (100 mg/1 kanamysiiniä). Nuorista kasveista määritetään NPTII-aktiivisuus, ne kasvatetaan valmiiksi ja niiden annetaan itsehedelmöityä ja siementää. Yksittäisten transformanttien 10 siemenet kerätään yhteen, ja osasta siemennäytettä määritetään cx-amylaasin läsnäolo. Ilmentymistasoiltaan korkeimmista klooneista, verrattuna transformoimattomiin kontrollisiemeniin, jäljelle jääneet siemenet idätetään kanamysiinialustalla (200 mg/1) (siten myös transgeenisiä α-amylaasin suhteen) ja vali-15 koidaan ja käytetään kasvien massalisäämiseen, jotka kykenevät tuottamaan siemeniä, jotka sisältävät suurimmat a-amylaasimäärät. α-amylaasin maksimaaliseksi ilmenemistasoksi havaittiin 0,4 % siementen liukoisesta kokonaisproteiinista. Näitä siemeniä voidaan sitten käyttää esim. sulatuskokeisiin.
20
Esimerkki 16
Siemeniin formuloidun α-amylaasin käyttö tärkkelyksen nesteytykseen 25
Bacillus licheniformiksen a-amylaasia, ilmennettynä tupakan siemenissä, käytettiin tärkkelyksen nesteytykseen seuraavasti: 100 g sekä tupakan α-amylaasia ilmentäviä että kont-rollisiemeniä kerätään talteen. Siemenet jauhettiin seulan 30 kanssa (Retch-mylly ZM1), silmäkoon ollessa 250 pm, huolehtimalla siementen jäähdytyksestä. Siementen a-amylaasipi-toisuuden määrittämiseksi, jauhetut siemenet uutettiin 10 tilavuudella 0,5 M glysiinipuskuria pH 9,0 10 mM CaCl2:n kanssa 30 minuutin aikana 0°C:ssa. Supernatanttia käytettiin 35 α-amylaasimääritykseen Phadebas-menetelmällä (Pharmacia Diagnostics) . Yksikköihin viitataan nimellä TAU (lämpökestoisen a-amylaasin yksiköt).
42
Nesteytyskokeet suoritettiin seuraavasti: tärkkilietettä
(koostumus: 3,3 kg maissi- tai perunatärkkelystä, k.a. (kuiva-ainetta) 88 % (2,904 kg tärkkelystä); 5,45 1 H20:ta; lietteen kuiva-aineeksi tulee 33 %; pH korjattiin tasoon 6,5 IN
5 sulfuronihapon tai 1 N NaOH:n avulla. Joko jauhettuja siemeniä tai mikrobista a-amylaasia lisättiin määräksi, joka vastaa 4,4 TAU/g k.a.) kuumennetaan 100°C:seen niin nopeasti kuin mahdollista, ja tätä lämpötilaa ylläpidetään 10 minuutin ajan. Lietteen lämpötila saatetaan sitten 95°C:seen ja pidetään 10 siinä lämpötilassa 2 tunnin ajan. Näytteet tehtiin happameksi jälkeenpäin H2SC>4:n avulla, jolloin pH:ksi saatiin 3,5, ja asetettiin kiehuvaan vesihauteeseen 10 minuutin ajaksi entsyymiaktiivisuuden lopettamiseksi ennenkuin DE (dekstroosiekviva-lentti) ja hydrolyysikuvio määritettiin HPLC:n avulla. Bio-15 Rad'in HPX-42A-kolonnia käytettiin HPLC-analyysiin, deminera-lisoitu vesi eluenttina.
Oligosakkaridikuvioita, saatuina peruna- ja maissitärkkelyksen hydrolyysistä käyttäen A) transformoituja kasvisiemeniä; B) 20 MaxamylR'iä (Bacillus licheniformiksen a-amylaasi saatuna
Gist-brocades N.V.'ltä, Delft, Hollanti); ja C) DexloRCL'ää (Bacillus amyloliguefaciensin α-amylaasi Gist-brocades'ilta) vertailtiin (kuviot 12 ja 13). Oligosakkaridikuviot, saatuina transformoiduista kasvisiemenistä ja MaxamylR'stä, ovat ident-25 tiset, kummankin kuitenkin poiketessa DexloR,llä saadusta kuviosta, mikä vahvistaa sen, että Bacillus licheniformiksen α-amylaasia muodostuu kasvien siemenissä. Kasvien siemenillä saadut DE-arvot (taulukko 3) ovat kaupallisesti hyväksyttävällä tasolla (DE > 12, edullisesti DE > 16) (Reilly, 1985).
30 43
Taulukko 3
Dekstroosiekvivalenttiarvot (DE), saatuina maissi- ja perunatärkkelyksen hydrolyysistä 5
Perunatärkkelys Maissitärkkelys
_DE_DE
MaxamylR WL7000 18 16 10 Transformoidut tupakan siemenet 16 13
Transformoimattomat tupakan siemenet 0 0 15
DexloR CL 15 18
Vaikka tätä keksintöä on kuvailtu ottaen huomioon sen spesifiset suoritusmuodot, alaa tuntevien tulisi ymmärtää, että 20 erilaisia muutoksia voidaan tehdä, ja vastikkeita voidaan asettaa sijaan poikkeamatta keksinnön mukaisesta aidosta hengestä ja piiristä. Monia modifikaatioita voidaan lisäksi tehdä tietyn tilanteen, aineen, kasvin, siemenen, prosessin, prosessivaiheen tai -vaiheiden sopeuttamiseksi keksinnön 25 mukaiseen tarkoitukseen, henkeen ja piiriin. Kaikkien sellaisten modifikaatioiden katsotaan kuuluvan tähän liitettyjen patenttivaatimusten piiriin.
5 44
Viitejulkaisut
Altenbach, S.B., Pearson, K.W., Meeker, G., Starci, L.C. &
Sun, S.S.M. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 513.
Auffray & Rougeon (1980) Eur. J. Biochem. 10 7, 303-314.
Barker, S.J., Harada, J.J. & Goldberg, R.B. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_5, 458.
10
Baulcombe, D.C., Saunders, G.R., Bevan, M.W., Mayo, M.A. &
Harrison, B.D. (1986) Nature 321, 446.
Bäumlein, H., Wobus, U., Pastell, J., & Kafatos, F.C. (1986) 15 Nucl. Acids Res. b4, 2707.
Beachy, R.N., Chen, Z.-L., Horsch, R.B.,, Rogers, S.G., Hoffmann, N.J. & Fraley, R.T. (1985) EMBO J. 4, 3047.
20 Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res 1_2, 8711.
Brederode, F.T., Koper-Zwaethoff, E.C. & Bol, J.F. (1980)
Nucl. Acids Res. 8_, 2213.
25 Bustos, M.M., Guiltinan, M.J., Jordano, J., Begum, D., Kalkan, F.A. & Hall, T.C. (1989) Plant Cell 1, 839.
Casey, R. & Domoney, C. (1987) Plant Mol. Biol. Reporter _5, 261.
30
Chee, B.B., Klassy, R.C. & Slightom, J.L. (1986) Gene _4jL, 47.
Cornelissen, B.J.C., Hooft van Huijsduijnen, R.A.M. & Bol, J.F. (1986) Nature 321, 531.
Della-Cioppa, G., Kishore, G.M., Beachy, R.N. & Fraley, R.T. (1987) Plant Physiol. 8_4, 965.
35 45
Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D. & Helinski, D.R. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ΊΊ_, 7347.
Dorel, C., Voelker, T.A., Herman, E.M. & Chrispeels, M.J· 5 (1989) J. Cell Biol. 108, 327.
Doyle, J.J., Schuler, M.A., Godette, W.D., Zenger, V., Beachy, R.N. & Slightom, J.L. (1986) J. Biol. Chem. 261, 9228.
10 Ellis, J.R., Shirsat, A.H., Hepher, A., Yarwood, J.N., Gateh ouse, J.A., Croy, R.R.D. & Boulter, D. (1988) Plant Mol. Biol- 10, 203.
Fischer, R.L. & Goldberg, R.B. (1982) Cell 2_9, 651.
15
Fry, J. & Barnason, A. & Horsch, R.B. (1987) Plant Cell Reports 6, 321.
Gasser, C.S. & Fraley, R.T. (1989) Science 244, 1293.
20
Goodman, R.M., Knauf, V.C., Houck, C.M. & Comai, L. (1987) PCT/WO 87/00865.
Gordon-Kamm, W.J., Spencer, T.M., Mangano, M.L., Adams, T.R., 25 Daines, R.J., Start, W.G., O'Brien, J.V., Chambers, S.A.,
Adams Jr., W.R., Willets, N.G., Rice, T.B., Mackey, C.J., Krueger, R.W., Kausch, A.P. & Lemaux, P.G. (1990) The Plant Cell 2, 603.
30 Guilley, H., Dudley, R.K., Jonard, G., Balazs, E. & Richarsds, K.E. (1982) Cell 30, 763.
Harada, J.J., Barker, S.J. & Goldberg, R.B. (1989) Plant Cell 1, 415.
Hattori, T., Nakagawa, T., Maeshima, M., Nakamura, K., &
Asahi, T. (1985) Plant Mol. Biol. _5, 313.
35 46
Hiatt, A., Cafferkey, R. & Boedish, K. (1989) Nature 342, 76.
Higgins, T.J.V., (1984) Annu. Rev. Plant Physiol. 3_5, 191.
5 Higgins, T.J.V., Newbigin, E.J., Spencer, D., Llewellyn, D.J. & Craig, S. (1988) Plant Mol. Biol. 1_1, 683.
Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. & Schilperoort, R.A. (1983) Nature 303_, 179.
10
Hoffman, L.M., Donaldson, D.D., Bookland, R., Rashna, K. & Herman, E.M. (1987) EMBO J. 6, 3213.
Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rog-15 ers, S.G. & Fraley, R.T. (1985) Science 227, 1229.
Iturriaga, G., Jefferson, R.A. & Bevan, M.W. (1989) Plant Cell 1, 381.
20 Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol. Biol. Reporter _5, 387.
Jordano, J., Almoguera, C. & Thomas, T.L. (1989) Plant Cell 1, 855.
25 Kay, R., Chan, A., Dayly, M. & McPherson, J. (1987) Science 236, 1229.
Klee, H., Horsch, R. & Rogers, S. (1987) Annu Rev. Plant Physiol. 3_8, 467.
30
Krebbers, E. & Vandekerckhove, J. (1990) TIBTECH, 8_, 1.
Larkins, M.A. (1981) : The biochemistry of plants vol. 6 (Academic Press, San Diego: Stumpf, P.K. & Conn, E.E., edit.) 35 Luku 11. s. 471.
Lee, B., Murdoch, K., Topping, J., Kreis, M. & Jones, M.G.K. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 21.
47
Lycett, G.W., Delauney, A.J., Gatehouse, J.A., Gilroy, J., Croy, R.R.D. & Boulter, D. (1983) Nucl. Acids Res. 1_1, 2367.
5 Lycett, G.W., Croy, R.R.D., Shirsat, A.H. & Boulter, D. (1984) Nucl. Acids Res. 1_2, 4493.
Mariani, C., de Beuckeleer, M., Truettner, J., Leemans, J., &
Goldberg, R.B. (1990) Nature 347, 737.
10
Marsh, J.L., Erfle, M. & Wykes, E.J. (1984) Gene 3_2, 481.
Mettler, I.J. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. _5, 346.
15 Okamura, J.K., Jokufu, K.D. & Goldberg, R.B. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8240.
Pang, P.P., Pruitt, R.E. & Meyerowitz, E.M. (1988) Plant Mol. Biol. 1_1, 805.
20
Potrykus, I. (1990) Bio/Technol. 8_, 535.
Radke, S.E., Andrews, B.M., Moloney, M.M., Crough, M.L., Kridl, J.C. & Knauf, V.C. (1988) Theor. Appi. Genet. 75, 685.
25
Reilly, P.J. (1985): Starch Conversion Technology (Marcel Dekker, Inc., New York: Van Beynum, G.M.A. & Roels, J.A., edit.), Luku 5, s. 101.
30 Riggs, C.D., Hunt, D.C., Lin, J. & Chrispeels, M.J. (1989)
Plant Sci. ¢13, 47.
Rodenburg, K.W., DeGroot, M.J.A., Schilperoort, R.A. & Hooy-kaas, P.J.J. (1989) Plant Mol. Biol. 73, 711.
Ryan, A.J., Royal, C.L., Hutchinson, J. & Shaw, C.H. (1989)
Nucl. Acids Res. 1_7, 3584.
35 48
Scofield, S.R. & Crouch, M.L. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12202.
Schilperoort, R.A., Hoekema, A. & Hooykaas, P.J.J. (1984) 5 eurooppalainen patenttihakemus n:o 0 120 516.
Sengupta-Gopalan, C., Reichert, N.A., Barker, R.F., Hall, T.C. & Kemp, J.D. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA _82_, 3320.
10 Shimamoto, K., Terada, R., Izawa, T. & Fujimoto, H. (1989)
Nature 338, 274.
Shotwell, M.A. ja Larkins, B.A. (1989) julkaisussa: The bio chemistry of plants voi. 15 (Academic Press, San Diego: 15 Stumpf, P.K. ja Conn, E.E., edit.). Luku 7. 297).
Sijmons, P.C., Dekker, B.M.M., Schrammeijer, B., Verwoerd, T.C., van den Elzen, P.J.M. & Hoekema, A. (1990) Bio/Technol. 8, 217.
20
Slightom, J.L., Schaber, M.D. & Kramer, R.A. (1986): Molecular biology of seed storage proteins and lectins (Waverley Press, Baltimore: Shannon, L.M. & Chrispeels, M.J., edit.) Am. Soc.
Plant Physiol, s. 183.
25
Smith, J.J. & Raikhel, N.V. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 601.
Vaara, T., Vaara, M., Simell, M., Lehmussaari, A. & Caransa, A. (1989) eurooppalainen patenttihakemus 0 321 004.
30
Vandekerckhove, J., VanDamme, J., VanLijsebettens, M., Botter-man, J., DeBlock, M., DeClerq, A., Leemans, J., VanMontagu, M. & Krebbers, E. (1989) Bio/Technol. 1_, 929.
35 van Gorcom, R.F.M., van Hartingsveldt, W., van Paridon, P.A., Veenstra, A.E., Luiten, R.G.M., Selten, G.C.M. (1991) eurooppalainen patenttihakemus 89202436.5, julkaisu n:o 0 420 358, jätetty 27. syyskuuta, 1989.
49
Vasil, V., Redway, F. & Vasil, I.K. (1990) Bio/Technol. 8_, 429 .
5 Vitale, A. & Bollini, R. (1986): Molecular biology of seed storage proteins and lectins (Waverley Press, Baltimore:
Shannon, L.M. & Chrispeels, M.J., edit.) Am. Soc. Plant Physiol . s. 175.
10 Voelker, T.A., Herman, E.M. & Chrispeels, M.J. (1989) Plant
Cell 1, 95.
Vonder Haar, R.A., Allen, R.D., Cohen, E.A., Nessler, C.L. & Thomas, T.L. (1988) Gene 7_4, 433.
15

Claims (14)

50
1. Menetelmä in vitro -reaktioiden katalysoimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä 5. transformoidaan kasvi ekspressiorakenteella, joka si sältää kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin mainittu entsyymi ilmentyy transgeenisen kasvin siemenissä, - lisätään mainitusta transgeenisestä kasvista saatuja 10 siemeniä, jotka siemenet sisältävät lisääntyneen määrän mainittua entsyymiä, reaktioseokseen, joka sisältää katalysoitavan substraatin tai katalysoitavia substraatteja, jossa yhteydessä mainittu entsyymi kykenee katalysoimaan substraatin tai substraattien reaktiota reaktio-15 seoksessa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että entsyymi on ei-transgeenisen, villi-tyypin kasvimuodon suhteen heterologinen entsyymi. 20
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että siemenet jauhetaan ennen niiden lisäämistä reaktioseokseen.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että siemenet jauhetaan kun ne on lisätty reaktioseokseen.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 30 lisäksi siitä, että entsyymi on amylaasi.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että entsyymi on fytaasi.
7. Menetelmä eläimen ravinnonoton parantamiseksi tietys tä elintarvikkeesta tai rehusta, tunnettu siitä, että 51 - transformoidaan kasvi ekspressiorakenteella, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin mainittu entsyymi ilmentyy transgeenisen kasvin siemenissä, 5. yhdistetään mainitusta transgeenisestä kasvista saatu ja siemeniä, jotka siemenet sisältävät lisääntyneen määrän mainittua entsyymiä, elintarvikkeen tai rehun kanssa, jossa yhteydessä kiinnostuksen kohteena oleva entsyymi kykenee katalysoimaan sulatusreaktiota elintarvik-10 keessa tai rehussa, joka sulatusreaktio johtaa niiden ravintokomponenttien lisääntymiseen elintarvikkeessa, jotka ovat saatavilla elintarviketta tai rehua nauttivalle eläimelle.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että entsyymi on jokin fytaasi tai amy-laasi.
9. Ei-terapeuttisesti käytettävä koostumus, tunnettu 20 siitä, että koostumus sisältää transgeenisestä Brassica-tai AkLCotiana-kasvista saatuja siemeniä, joka kasvi on transformoitu ekspressiorakenteella, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin, jolloin mainittu entsyymi ilmentyy transgeeni-25 sen kasvin siemenissä, ja jotka siemenet sisältävät lisääntyneen määrän kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä .
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, tunnettu 30 lisäksi siitä, että koostumuksen sisältämät siemenet ovat jauhettuja.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukaisen koostumuksen käyttö elintarvikkeena tai rehuna, tunnettu siitä, että kiin- 35 nostuksen kohteena olevaa entsyymiä ei uuteta eikä puhdisteta . 52
12. Transgeeninen, siemeniä tuottava Brassica- tai Nico-tiana-kasvi, tunnettu siitä, että se on transformoitu ekspressiorakenteella, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä koodaavan DNA-sekvenssin, ja että 5 se ilmentää toiminnallisesti lisääntyneen määrän kiinnostuksen kohteena olevaa entsyymiä siemenissään, käytettäväksi suoraan teollisessa prosessissa.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen transgeeninen, sie-10 meniä tuottava kasvi, tunnettu lisäksi siitä, että kasvi transformoidaan plasmidilla pMOG413, jonka rakentaminen on esitetty esimerkissä 4, plasmidilla pMOG429, jonka rakenne on esitetty kuviossa 5 tai plasmidilla pMOG227, jonka rakenne on esitetty kuviossa 9. 15
14. Plasmidi pMOG413, jonka rakentaminen on esitetty esimerkissä 4, plasmidi pMOG429, jonka rakenne on esitetty kuviossa 5 tai plasmidi pMOG227, jonka rakenne on esitetty kuviossa 9. 20 53
FI915478A 1990-03-23 1991-11-20 Entsyymien tuotto transgeenisten kasvien siemenissä ja saatujen siementen käyttö FI119939B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US49856190A 1990-03-23 1990-03-23
US49856190 1990-03-23
NL9100048 1991-03-25
PCT/NL1991/000048 WO1991014772A1 (en) 1990-03-23 1991-03-25 Production of enzymes in seeds and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI915478A0 FI915478A0 (fi) 1991-11-20
FI119939B true FI119939B (fi) 2009-05-15

Family

ID=23981572

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI915478A FI119939B (fi) 1990-03-23 1991-11-20 Entsyymien tuotto transgeenisten kasvien siemenissä ja saatujen siementen käyttö

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0449376B1 (fi)
JP (1) JP3938401B2 (fi)
KR (1) KR100211308B1 (fi)
AT (1) ATE201232T1 (fi)
AU (1) AU649447B2 (fi)
CA (1) CA2054762C (fi)
DE (1) DE69132605T2 (fi)
DK (1) DK0449376T3 (fi)
ES (1) ES2160095T3 (fi)
FI (1) FI119939B (fi)
GR (1) GR3036358T3 (fi)
HU (1) HU215260B (fi)
IL (1) IL97645A (fi)
NZ (1) NZ237549A (fi)
PT (1) PT97110B (fi)
RU (1) RU2129609C1 (fi)
WO (1) WO1991014772A1 (fi)

Families Citing this family (262)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4013144A1 (de) * 1990-04-20 1991-10-24 Inst Genbiologische Forschung Neue plasmide, enthaltend dna-sequenzen, die veraenderungen der karbohydrat- und proteinkonzentration und der karbohydrat- und proteinzusammensetzung in kartoffelknollen hervorrufen, sowie zellen einer kartoffelpflanze, enthaltend diese plasmide
US5705375A (en) * 1990-09-13 1998-01-06 Mogen International, N.V. Transgenic plants having a modified carbohydrate content
IE913215A1 (en) * 1990-09-13 1992-02-25 Gist Brocades Nv Transgenic plants having a modified carbohydrate content
US7091401B2 (en) 1991-02-22 2006-08-15 Sembiosys Genetics Inc. Expression of epidermal growth factor in plant seeds
US5650554A (en) * 1991-02-22 1997-07-22 Sembiosys Genetics Inc. Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
FR2722798B1 (fr) * 1994-07-25 1996-09-13 Toulouse Inst Nat Polytech 1procede de production d'acides gras2plantes oleagineuses
US6080560A (en) * 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US6140075A (en) * 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
FR2733249B1 (fr) * 1995-04-20 1997-06-06 Biocem Lipase gastrique de chien recombinante et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
EP0743017B1 (en) * 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
NL1003096C2 (nl) 1995-05-15 1996-11-19 Gist Brocades Bv Application of phospholipases in animal feed.
US6084155A (en) * 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
US6406723B1 (en) 1997-04-09 2002-06-18 Danisco A/S Method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase and lipase
EE9700152A (et) * 1995-11-07 1997-12-15 Gist-Brocades B.V. Transgeenset taimset materjali sisaldavad stabiilsed kompositsioonid
ZA971885B (en) * 1996-03-05 1997-10-16 Weissheimer Friedr Malzfab Production of products from transgenic plant material.
AU6387696A (en) * 1996-06-19 1998-01-07 Human Gene Therapy Research Institute Method of treating lactose intolerance
CN1230225A (zh) 1996-08-05 1999-09-29 莫根国际股份有限公司 使用转基因麦芽种生产酒精性饮料的改进工艺
EP1574580A3 (en) * 1996-09-12 2009-07-01 Syngenta Participations AG Transgenic plants expressing cellulolytic enzymes
CA2263726C (en) * 1996-09-12 2009-12-29 Novartis Ag Transgenic plants expressing cellulolytic enzymes
US5981835A (en) * 1996-10-17 1999-11-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes
FR2754827B1 (fr) * 1996-10-17 1998-12-24 Biocem Lipases pancreatiques et/ou colipases recombinantes et polypeptides dervies produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
EP0946106B1 (en) 1996-12-23 2002-05-29 Dsm N.V. Method for producing a protein hydrolysate
US6818803B1 (en) 1997-06-26 2004-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes
US6451572B1 (en) 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
US6940002B1 (en) * 1998-11-12 2005-09-06 Novozymes A/S Transgenic plant expressing maltogenic alpha-amylase
WO2000029591A1 (en) * 1998-11-12 2000-05-25 Novozymes A/S Transgenic plant expressing maltogenic alpha-amylase
ATE441704T1 (de) 1998-11-27 2009-09-15 Novozymes As Varianten eines lipolytischen enzyms
MXPA01009809A (es) 1999-03-31 2002-07-30 Cornell Res Foundation Inc Fosfatasas con actividad de fitasa mejorada.
AU6082600A (en) * 1999-07-12 2001-01-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant inositol polyphosphate phosphatase homologs
EP2336331A1 (en) 1999-08-31 2011-06-22 Novozymes A/S Novel proteases and variants thereof
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
WO2001059141A2 (en) * 2000-02-10 2001-08-16 Washington State University Research Foundation Methods and compositions that utilize barley as a foodstuff for animals
RU2188664C2 (ru) * 2000-10-11 2002-09-10 Пермская государственная медицинская академия Способ получения средства для диагностики целиакии
WO2002063975A2 (en) * 2001-02-14 2002-08-22 Ventria Bioscience Feed additive compositions and methods
BR0209154A (pt) 2001-05-18 2004-07-20 Danisco Processo de preparação de uma massa com uma enzima
EP1421224B1 (en) 2001-06-26 2012-10-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase i activity and polynucleotides encoding same
RS18304A (sr) 2001-08-27 2006-10-27 Syngenta Participations Ag. Biljke i delovi biljaka sa sposobnošću samoprerađivanja
EP2335501B8 (en) 2001-10-31 2016-09-21 Huvepharma Eood Phytase-containing animal food and method
CN101177675B (zh) 2002-02-08 2014-05-21 诺维信公司 肌醇六磷酸酶变体
DE60335497D1 (de) 2002-09-13 2011-02-03 Cornell Res Foundation Inc Ergillus-phytasen
DE60335640D1 (de) 2002-10-01 2011-02-17 Novozymes As Polypeptide der gh-61-familie
DE60328715D1 (de) 2002-12-20 2009-09-17 Novozymes As Polypeptide mit cellobiohydrolase ii-aktivität und dafür kodierende polynucleotide
MXPA05007653A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
DE602004027723D1 (de) 2003-05-02 2010-07-29 Novozymes Inc Varianten von beta-glukosidasen
EP1633878A1 (en) 2003-05-30 2006-03-15 Novozymes A/S Alcohol product processes
DK1639106T3 (da) 2003-06-19 2010-09-27 Novozymes As Proteaser
ATE510925T1 (de) 2003-06-25 2011-06-15 Novozymes As Stärkehydrolyseverfahren
DK2377931T3 (da) 2003-08-25 2013-07-08 Novozymes Inc Varianter af glycosidhydrolase
EP2284259A3 (en) 2003-10-10 2011-06-15 Novozymes A/S Protease variants
EP1682656B1 (en) 2003-10-28 2013-09-18 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2005066339A2 (en) 2004-01-06 2005-07-21 Novozymes A/S Polypeptides of alicyclobacillus sp.
EP2287179A3 (en) 2004-01-09 2011-05-18 Novozymes A/S Increased bacillus YweA expression
ES2472669T3 (es) 2004-01-30 2014-07-02 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que los codifican
CN101389645B (zh) 2004-02-12 2016-08-03 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
US7148404B2 (en) 2004-05-04 2006-12-12 Novozymes A/S Antimicrobial polypeptides
EP1766002B1 (en) 2004-06-21 2015-11-18 Novozymes A/S Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation
ATE541034T1 (de) 2004-06-21 2012-01-15 Novozymes As Nocardiopsis-proteasen
EP1769070A4 (en) 2004-06-29 2007-12-12 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH ALPHA-GLUCOSIDASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES THAT CODE
CA2571694C (en) 2004-07-16 2014-09-02 Danisco A/S Enzymatic oil-degumming method
ATE503009T1 (de) 2004-09-30 2011-04-15 Novozymes Inc Polypeptide mit lipase-aktivität und diese kodierende polynukleotide
BRPI0517539A (pt) 2004-10-04 2008-10-14 Novozymes As polipeptìdeo isolado, polinucleotìdeo isolado, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, e para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, célula de planta, parte de planta ou planta transgênica, animal não-humano, transgênico, ou produtos, ou elementos do mesmo, uso de pelo menos um polipeptìdeo, aditivo de ração animal, e, composição de ração animal
AR050895A1 (es) 2004-10-04 2006-11-29 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de fitasa y polinucleotidos que los codifican
WO2006053565A2 (en) 2004-11-19 2006-05-26 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding same
WO2006066596A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Novozymes A/S Hybrid enzymes consisting of an endo-amylase first amino acid sequence and a carbohydrate -binding module as second amino acid sequence
ES2552635T3 (es) 2004-12-22 2015-12-01 Novozymes A/S Polipéptidos con actividad de glucoamilasa y codificación de polinucleótidos
AR053066A1 (es) 2005-04-26 2007-04-18 Novozymes As Arabinofuranosidasas
ATE447013T1 (de) 2005-04-27 2009-11-15 Novozymes Inc Polypeptide mit endoglucanase-aktivtät und dafür codierende polynukleotide
DE602006020923D1 (de) 2005-08-16 2011-05-05 Novozymes As Polypeptide von Stammbakterien SP P203
US20080280328A1 (en) 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
CN103740674A (zh) 2006-03-20 2014-04-23 诺维信股份有限公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
BRPI0710217A2 (pt) 2006-03-30 2011-08-02 Novozymes Inc polipeptìdeo, polinucleotìdeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, para produzir um mutante a partir de uma célula precursora, para produzir uma proteìna, para produzir um polinucleotìdeo, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir uma substáncia e para inibir a expressão de um polinucleotìdeo em uma célula, célula mutante, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna de filamento duplo
MX2008012632A (es) 2006-04-04 2008-10-13 Novozymes As Variantes de fitasa.
WO2008017066A2 (en) 2006-08-03 2008-02-07 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
DE102006046719A1 (de) 2006-10-02 2008-04-03 Ab Enzymes Gmbh Klonierung, Expression und Verwendung saurer Phospholipasen
WO2008066931A2 (en) 2006-11-29 2008-06-05 Novozymes, Inc. Bacillus licheniformis chromosome
WO2008067840A1 (en) 2006-12-08 2008-06-12 Swetree Technologies Ab Plants having improved growth characteristics and method for making the same
US7923232B2 (en) 2007-03-26 2011-04-12 Novozymes A/S Hafnia phytase
DE102007016139A1 (de) 2007-03-30 2008-10-02 Jenabios Gmbh Verfahren zur regioselektiven Oxygenierung von N-Heterozyklen
US7727726B2 (en) 2007-06-01 2010-06-01 Syngenta Participations Ag Process for starch liquefaction and fermentation
US7915020B2 (en) 2007-06-01 2011-03-29 Syngenta Participations Ag Process for starch liquefaction and fermentation
US7914993B2 (en) 2007-06-01 2011-03-29 Syngenta Participations Ag. Process for starch liquefaction and fermentation
US8192734B2 (en) 2007-07-09 2012-06-05 Cornell University Compositions and methods for bone strengthening
DK2215224T3 (da) 2007-11-27 2014-01-27 Novozymes As Polypeptider med alfa-glucuronidaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
BRPI0820615B1 (pt) 2007-12-06 2020-05-12 Novozymes A/S Célula microbiana hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de acetil-xilano esterase, método para produzir uma proteína e método de degradar um material contendo xilano
AU2008343105A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
NZ586643A (en) 2007-12-28 2012-10-26 Swetree Technologies Ab Woody plants having improved growth characteristics and method for making the same using transcription factors
DK2650364T3 (en) 2008-09-26 2015-06-08 Novozymes As Hafniaphytase variants
WO2010062240A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Swetree Technologies Ab Vegetabile material, plants and a method of producing a plant having altered lignin properties
EP2358878B1 (en) 2008-11-20 2014-10-15 Novozymes Inc. Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2373788A1 (en) 2008-12-04 2011-10-12 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20110296557A1 (en) 2008-12-12 2011-12-01 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Lipase Activity And Polynucleotides Encoding Same
WO2010068800A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having aspartic endopeptidase activity and polynucleotides encoding same
US20110269206A1 (en) 2008-12-15 2011-11-03 Novozymes, Inc Polypeptides Having Catalase Activity And Polynucleotides Encoding Same
EP2379716A1 (en) 2008-12-16 2011-10-26 Novozymes Inc. Polypeptides having alpha-mannosidase activity and polynucleotides encoding same
US8633030B2 (en) 2008-12-16 2014-01-21 Novozymes, Inc. Polypeptides having carboxypeptidase activity and polynucleotides encoding same
EP2389437B1 (en) 2009-01-21 2015-10-21 Novozymes A/S Polypeptides having esterase activity and nucleic acids encoding the same
WO2010088387A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2010088447A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
US8629324B2 (en) 2009-01-30 2014-01-14 Novozymes, Inc. Polypeptides having expansin activity and polynucleotides encoding same
WO2010091221A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
CN102365360A (zh) 2009-03-24 2012-02-29 诺维信公司 具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2010141325A1 (en) 2009-06-02 2010-12-09 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
EP2451957B1 (en) 2009-07-07 2017-11-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
MX2012001060A (es) 2009-07-24 2012-03-14 Novozymes As Carbohidrato-oxidasas.
WO2011014458A1 (en) 2009-07-28 2011-02-03 Novozymes, Inc. Polypeptides having phytase activity and polynucleotides encoding same
MX2012002095A (es) 2009-08-21 2012-04-10 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de isoamilasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
US8569581B2 (en) 2009-09-17 2013-10-29 Novozymes, Inc Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN102712916B (zh) 2009-09-18 2015-11-25 诺维信股份有限公司 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
ES2560805T3 (es) 2009-09-29 2016-02-22 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad mejoradora celulolítica y polinucleótidos que los codifican
CA2775347A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
WO2011041504A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novozymes, Inc. Polypeptides derived from thermoascus crustaceus having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2483402A1 (en) 2009-09-30 2012-08-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2011050037A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
DE102009051013A1 (de) 2009-10-28 2011-06-09 Ab Enzymes Gmbh Klonierung, Expression und Verwendung saurer Phospholipasen
BR112012006847A2 (pt) 2009-10-29 2015-09-08 Novozymes As polipeptídeo polinucleotídeo, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptídeo para produzir um mutante de uma célula parental, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para produzir um produto de fermentação e pra fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte da planta ou célula da planta, molécula de rna inibitória de filamento duplo, e, composição.
DK2496693T3 (en) 2009-11-06 2018-01-22 Novozymes Inc Polypeptides with cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding them
EP2496692B1 (en) 2009-11-06 2016-03-16 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
MX2012006095A (es) 2009-11-30 2012-07-03 Novozymes North America Inc Polipeptidos que tienen actividad glucoamilasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
ES2534098T3 (es) 2009-11-30 2015-04-17 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos
CN111593035B (zh) 2009-12-01 2024-06-11 诺维信公司 具有葡糖淀粉酶活性的多肽及其编码多核苷酸
CN104774823B (zh) 2009-12-11 2020-04-10 诺维信公司 蛋白酶变体
US8435577B2 (en) 2010-01-04 2013-05-07 Novozymes A/S Alpha-amylases
WO2011104284A1 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity
CN102884182A (zh) 2010-03-03 2013-01-16 诺维信股份有限公司 木聚糖酶变体及编码其的多核苷酸
WO2011117397A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Novozymes A/S Thermostable phytase variants
DK2553093T3 (en) 2010-03-31 2017-09-18 Novozymes Inc Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding them
CA2795806C (en) 2010-04-14 2019-01-08 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
US8835604B2 (en) 2010-06-12 2014-09-16 Adenium Biotech Aos Antimicrobial peptide variants and polynucleotides encoding same
EP2769985B1 (en) 2010-06-21 2017-12-06 Novozymes, Inc. Aspergillus aculeatus derived polypeptides having C4-dicarboxylic acid transporter activity and polynucleotides encoding same
WO2012003379A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
CN103140586A (zh) 2010-08-02 2013-06-05 诺维信北美公司 产生发酵产物的方法
DK2735611T3 (en) 2010-08-30 2019-01-28 Novozymes As POLYPEPTIDES WITH CELLULOLYSE INCREASING ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030849A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
US8629325B2 (en) 2010-08-30 2014-01-14 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
US20130212746A1 (en) 2010-08-30 2013-08-15 Novoyzmes A/S Polypeptides Having Hemicellulolytic Activity And Polynucleotides Encoding Same
WO2012030844A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US20130266554A1 (en) 2010-09-16 2013-10-10 Novozymes A/S Lysozymes
MX2013003237A (es) 2010-09-30 2013-05-30 Novozymes Inc Variantes de polipeptidos que tienen actividad potenciadora celulolitica y polinucleotidos que codifican a los mismos.
WO2012044835A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Novozymes, Inc. Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN105886485B (zh) 2010-10-01 2019-09-24 诺维信股份有限公司 β-葡糖苷酶变体及其编码多核苷酸
US9458446B2 (en) 2010-10-01 2016-10-04 Novozymes A/S Polypeptides having endopeptidase activity and polynucleotides encoding same
US8728804B2 (en) 2010-10-29 2014-05-20 Novozymes A/S Polypeptides having succinyl-CoA: acetoacetate transferase activity and polynucleotides encoding same
DK2635594T3 (en) 2010-11-04 2017-04-03 Novozymes Inc Polypeptides with cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding them
CA2815804A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
DK2637515T3 (da) 2010-11-08 2017-11-27 Novozymes As Polypeptider med glucoamylaseaktivitet og polynukleotider, som koder for dem
BR112013009026A2 (pt) 2010-11-12 2016-07-12 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína, e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e método para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, molécula de rna inibidora de filamento duplo, polinucleotídeo isolado, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de célula
WO2012062817A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Novozymes A/S Polypeptides having phospholipase c activity and polynucleotides encoding same
CN103339252A (zh) 2010-11-18 2013-10-02 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的嵌合多肽及其编码多核苷酸
JP5717433B2 (ja) * 2010-12-16 2015-05-13 株式会社日清製粉グループ本社 胆汁酸吸着用組成物
WO2012103293A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
EP2668270B1 (en) 2011-01-26 2018-11-21 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN103534348B (zh) 2011-01-26 2018-04-10 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2012103322A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
MX2013007720A (es) 2011-01-26 2013-08-09 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
DK2678352T3 (en) 2011-02-23 2018-03-05 Novozymes Inc Polypeptides with cellulolysis enhancing activity and polynucleotides encoding them
WO2012122477A1 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20140080182A1 (en) 2011-03-31 2014-03-20 Novozymes, Inc. Cellulose Binding Domain Variants and Polynucleotides Encoding Same
EP2702153B1 (en) 2011-04-28 2018-12-12 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
ES2729385T3 (es) 2011-07-06 2019-11-04 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican las mismas
EP2732033A1 (en) 2011-07-15 2014-05-21 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
DK2739728T3 (en) 2011-08-04 2017-10-16 Novozymes As Polypeptides with endoglucanase activity and polynucleotides encoding them
DK3091073T4 (da) 2011-08-04 2023-06-06 Novozymes Inc Polypeptider med xylanaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
EP2742130B1 (en) 2011-08-10 2017-11-01 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021062A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021064A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021065A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
EP2742060B1 (en) 2011-08-10 2017-03-01 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
WO2013021059A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
EP2742129B1 (en) 2011-08-10 2017-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
JP2014531895A (ja) 2011-08-15 2014-12-04 ノボザイムス アクティーゼルスカブ セルラーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド
CN103764822B (zh) 2011-08-19 2016-11-23 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽
WO2013029496A1 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
WO2013043910A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN104204200B (zh) 2011-09-22 2017-06-09 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
AU2012316246B2 (en) 2011-09-30 2017-10-26 Novozymes A/S Dehydrogenase variants and polynucleotides encoding same
BR112014007651A2 (pt) 2011-09-30 2017-04-11 Novozymes Inc polipeptídeo quimérico isolado, polinucleotídeo isolado, métodos para produzir um polipeptídeo quimérico e um produto de fermentação, para degradar ou converter um material celulósico, e para fermentar um material celulósico, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, e, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células
US10308921B2 (en) 2011-10-31 2019-06-04 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP3382017A1 (en) 2011-11-18 2018-10-03 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
EP2802651B1 (en) 2011-11-21 2017-03-08 Novozymes, Inc. Gh61 polypeptide variants and polynucleotides encoding same
BR112014011387A2 (pt) 2011-11-22 2017-05-02 Novozymes Inc polipeptídeo e polinucleotídeo isolados, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, e uma proteína, e para inibir a expressão de um polipeptídeo, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, molécula de rna, processos para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, para sintetizar um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico ou contendo xilano, e, formulação de caldo completo ou composição de cultura de célula
AR088976A1 (es) 2011-11-25 2014-07-23 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotidos que los codifican
EP2785732B1 (en) 2011-12-01 2017-04-12 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US9404093B2 (en) 2011-12-02 2016-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
US9169469B2 (en) 2011-12-02 2015-10-27 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity and polynucleotides encoding same
EP2791330B1 (en) 2011-12-16 2017-07-26 Novozymes, Inc. Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same
WO2013091547A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having catalase activity and polynucleotides encoding same
WO2013096603A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
CN104024408B (zh) 2011-12-28 2019-04-19 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽
EP2807254B1 (en) 2012-01-26 2017-08-02 Novozymes A/S Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents
EP2809779B1 (en) 2012-02-03 2017-09-13 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
BR112014018876A2 (pt) 2012-02-20 2017-07-04 Novozymes As polipeptídeo isolado com atividade endoglicanase, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, método de produção de um polipeptídeo
US9909109B2 (en) 2012-04-02 2018-03-06 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN104245930A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 诺维信公司 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸
WO2013160248A2 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-glucuronidase activity and polynucleotides encoding same
BR112014026625A2 (pt) 2012-04-27 2017-07-18 Novozymes Inc E Novozymes As variante do polipeptídeo, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de uma variante do polipeptídeo e para obtenção de uma variante do polipeptídeo, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação e para fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação ou composição de cultura celular de caldo inteiro
CN109234250A (zh) 2012-05-31 2019-01-18 诺维信公司 具有有机磷水解酶活性的多肽
US20150140165A1 (en) 2012-06-20 2015-05-21 Novozymes A/S Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents
US10246692B2 (en) 2012-07-12 2019-04-02 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
US9828595B2 (en) 2012-08-17 2017-11-28 Novozymes A/S Thermostable asparaginase variants and polynucleotides encoding same
US9771570B2 (en) 2012-09-05 2017-09-26 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity
US10035996B2 (en) 2012-10-08 2018-07-31 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2906687B1 (en) 2012-10-12 2018-08-15 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
WO2014056920A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
US9611459B2 (en) 2012-10-12 2017-04-04 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
EP2906686B1 (en) 2012-10-12 2018-08-29 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
WO2014056916A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
US9719072B2 (en) 2012-10-12 2017-08-01 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
CN104704115B (zh) 2012-10-12 2018-11-02 诺维信公司 具有过氧合酶活性的多肽
WO2014066141A2 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BR112015013421A2 (pt) 2012-12-14 2017-11-14 Novozymes As E Novozymes Inc célula hospedeira microbiana transgênica, polipeptídeo isolado, métodos de produção de um polipeptídeo e de uma proteína, processos de degradação de um material celulósico, de produção de um produto de fermentação e de fermentação de um material celulósico, construção de ácido nucleico ou vetor de expressão, polipeptídeo isolado, e polinucleotídeo isolado
ES2772032T3 (es) 2012-12-17 2020-07-07 Novozymes As Alfa-amilasas y polinucleótidos que las codifican
US20150337280A1 (en) 2012-12-19 2015-11-26 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
BR112015014396B1 (pt) 2012-12-21 2021-02-02 Novozymes A/S Composição, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, microorganismo recombinante, métodos de melhoria do valor nutricional de uma ração animal, aditivo de ração animal, e, uso de uma ou mais proteases
EP2938628A4 (en) 2012-12-24 2016-10-19 Novozymes As POLYPEPTIDES WITH ENDOGLUCANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES FOR CODING THEREOF
AU2014214032A1 (en) 2013-02-06 2015-07-09 Novozymes A/S Use of polypeptides having protease activity in animal feed
CN110628749A (zh) 2013-03-08 2019-12-31 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
CN105051174B (zh) 2013-03-21 2018-04-03 诺维信公司 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
DK2986701T3 (en) 2013-04-18 2019-01-14 Novozymes As Polypeptides with protease activity and polynucleotides encoding them
BR112015028666B8 (pt) 2013-05-14 2022-08-09 Novozymes As Composição detergente, método para produzir a mesma, método para a limpeza de um objeto e usos da composição
CN105339492A (zh) 2013-07-09 2016-02-17 诺维信公司 具有脂肪酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
EP3033420B1 (en) 2013-08-15 2018-02-21 Novozymes A/S Polypeptides having beta-1,3-galactanase activity and polynucleotides encoding same
WO2015079064A2 (en) 2013-11-29 2015-06-04 Novozymes A/S Peroxygenase variants
US10385326B2 (en) 2014-05-30 2019-08-20 Novozymes A/S Variants of GH family 11 xylanase and polynucleotides encoding same
US11390898B2 (en) 2014-09-05 2022-07-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
EP4067485A3 (en) 2014-12-05 2023-01-04 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2016138167A2 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
NZ774145A (en) 2015-04-10 2024-11-29 Syngenta Crop Protection Ag Animal feed compositions and methods of use
EP3303578B1 (en) 2015-05-27 2020-07-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2017019491A1 (en) 2015-07-24 2017-02-02 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2017019490A1 (en) 2015-07-24 2017-02-02 Novozymes Inc. Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
WO2017129754A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Novozymes A/S Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same
WO2017140807A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Monaghan Mushrooms Group Fungal polypeptides having lysozyme activity
FI3423577T3 (fi) 2016-03-02 2024-08-07 Novozymes As Sellobiohydrolaasimuunnoksia ja niitä koodaavia polynukleotideja
EP3433358B1 (en) 2016-03-24 2022-07-06 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
MX2019003250A (es) * 2016-09-23 2019-08-29 Dupont Nutrition Biosci Aps Uso de alfa-1,4/1,6-glucosido hidrolasas activas a ph bajo como aditivo alimentario para rumiantes para mejorar la digestion de almidon.
ES3038027T3 (en) 2017-08-31 2025-10-09 Novozymes As Polypeptides having d-psicose 3-epimerase activity and polynucleotides encoding same
BR112020006224A2 (pt) 2017-09-27 2020-10-13 Novozymes A/S variantes de lipase e composições de microcápsulas compreendendo tais variantes de lipase
CA3076665C (en) 2017-10-12 2024-02-20 Syngenta Participations Ag Improved animal feed compositions and methods of use
CN111670248A (zh) 2017-12-04 2020-09-15 诺维信公司 脂肪酶变体以及编码其的多核苷酸
EP3781680A1 (en) 2018-04-19 2021-02-24 Novozymes A/S Stabilized cellulase variants
CN112272701B (zh) 2018-04-19 2024-05-14 诺维信公司 稳定化的纤维素酶变体
WO2020123463A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
US12371722B2 (en) 2019-01-11 2025-07-29 River Stone Biotech Aps Recombinant host cells with improved production of L-DOPA, dopamine, S-noroclaurine or derivatives thereof
US20220290200A1 (en) 2019-05-27 2022-09-15 Octarine Bio Ivs Genetically modified host cells producing glycosylated cannabinoids
EP4103703A2 (en) 2020-02-10 2022-12-21 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CA3189083A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Novozymes A/S Phytase variants and polynucleotides encoding same
EP4237552A2 (en) 2020-10-29 2023-09-06 Novozymes A/S Lipase variants and compositions comprising such lipase variants
WO2023288294A1 (en) 2021-07-16 2023-01-19 Novozymes A/S Compositions and methods for improving the rainfastness of proteins on plant surfaces
CA3216380A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Jens Houghton-Larsen Glycosylated opioids
WO2023152220A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Novozymes A/S Improved expression of recombinant proteins
CA3257053A1 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION, TREATMENT, SUPPRESSION AND/OR ELIMINATION OF PHYTOPATHOGENIC INFESTATIONS AND INFECTIONS
EP4615963A1 (en) 2022-11-08 2025-09-17 River Stone Biotech ApS Genetically modified benzylisoquinoline alkaloid-producing host cells with modified efflux transporter gene expression
EP4273249A3 (en) 2023-07-07 2024-05-22 Novozymes A/S Improved expression of recombinant proteins
WO2025217017A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 Novozymes A/S Compositions and methods for increasing phosphorous availability

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3297548A (en) * 1964-07-28 1967-01-10 Int Minerals & Chem Corp Preparation of acid phytase
GB1446965A (en) * 1974-02-14 1976-08-18 Agricultural Vegetable Prod Preparation of food products
US4116770A (en) * 1975-02-27 1978-09-26 Research Corporation Waxy barley starch with unique self-liquefying properties
JPS57206389A (en) * 1981-06-11 1982-12-17 Morita Kagaku Kogyo Kk Activating and growth promoting method of alpha-amylase
US4956282A (en) * 1985-07-29 1990-09-11 Calgene, Inc. Mammalian peptide expression in plant cells
WO1990001551A1 (en) * 1988-07-29 1990-02-22 Washington University School Of Medicine Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
DE68929405T2 (de) * 1988-09-06 2003-02-06 Washington University, St. Louis Orale-immunisierung durch verwendung von transgenen pflanzen
DD275704A1 (de) * 1988-09-23 1990-01-31 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von gerstenpflanzen
CA2050468C (en) * 1989-02-16 1996-07-09 Rainer Borriss A thermostable (1,3-1,4)-.beta.-glucanase

Also Published As

Publication number Publication date
IL97645A (en) 1997-03-18
DE69132605D1 (de) 2001-06-21
GR3036358T3 (en) 2001-11-30
CA2054762A1 (en) 1991-09-24
DE69132605T2 (de) 2001-10-25
HU215260B (hu) 1998-11-30
JP3938401B2 (ja) 2007-06-27
PT97110B (pt) 1998-11-30
PT97110A (pt) 1991-11-29
EP0449376A3 (en) 1991-11-06
NZ237549A (en) 1993-06-25
HUT60767A (en) 1992-10-28
HU914087D0 (en) 1992-07-28
ATE201232T1 (de) 2001-06-15
AU7765691A (en) 1991-10-21
AU649447B2 (en) 1994-05-26
DK0449376T3 (da) 2001-08-06
IL97645A0 (en) 1992-06-21
KR100211308B1 (ko) 1999-08-02
ES2160095T3 (es) 2001-11-01
EP0449376A2 (en) 1991-10-02
EP0449376B1 (en) 2001-05-16
JPH06502296A (ja) 1994-03-17
KR920702413A (ko) 1992-09-04
FI915478A0 (fi) 1991-11-20
RU2129609C1 (ru) 1999-04-27
WO1991014772A1 (en) 1991-10-03
CA2054762C (en) 2008-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI119939B (fi) Entsyymien tuotto transgeenisten kasvien siemenissä ja saatujen siementen käyttö
US5543576A (en) Production of enzymes in seeds and their use
KR100225087B1 (ko) 피타아제의 식물내 발현
US5593963A (en) Expression of phytase in plants
US5693506A (en) Process for protein production in plants
Hong et al. Production of two highly active bacterial phytases with broad pH optima in germinated transgenic rice seeds
CN101792749B (zh) 大肠杆菌AppA肌醇六磷酸酶突变体
US6022846A (en) Expression of phytase in plants
CZ303574B6 (cs) Sekvence nukleové kyseliny, zpusob zvýšení nebo snížení aktivity ß-amylázy v rostline, zpusob smerování proteinu nebo enzymu do rostlinného plastidu, zpusob zvýšení nebo snížení množství škrobu produkovaného transgenní rostlinou, chimérický gen obsah
US7033627B2 (en) Production of enzymes in seeds and their use
Pen et al. Efficient production of active industrial enzymes in plants
JP3600614B6 (ja) 植物におけるフィターゼの発現
EP1164194A2 (en) Protein production in transgenic plant seeds
JP2005006657A (ja) 植物におけるフィターゼの発現
JOSHI GENETIC ENGINEERING OF MAIZE FOR EXPRESSION OF PHYTASE
CA2309342A1 (en) Protein production in transgenic plant seeds

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119939

Country of ref document: FI