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DE4013144A1 - Neue plasmide, enthaltend dna-sequenzen, die veraenderungen der karbohydrat- und proteinkonzentration und der karbohydrat- und proteinzusammensetzung in kartoffelknollen hervorrufen, sowie zellen einer kartoffelpflanze, enthaltend diese plasmide - Google Patents

Neue plasmide, enthaltend dna-sequenzen, die veraenderungen der karbohydrat- und proteinkonzentration und der karbohydrat- und proteinzusammensetzung in kartoffelknollen hervorrufen, sowie zellen einer kartoffelpflanze, enthaltend diese plasmide

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Publication number
DE4013144A1
DE4013144A1 DE4013144A DE4013144A DE4013144A1 DE 4013144 A1 DE4013144 A1 DE 4013144A1 DE 4013144 A DE4013144 A DE 4013144A DE 4013144 A DE4013144 A DE 4013144A DE 4013144 A1 DE4013144 A1 DE 4013144A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
adp
plasmid
potato
protein
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE4013144A
Other languages
English (en)
Inventor
Uwe Dr Sonnewald
Rainer Dr Hoefgen
Jens Kossmann
Bernd Mueller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH filed Critical Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
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Priority to IL97803A priority patent/IL97803A0/xx
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Priority to EP91250105A priority patent/EP0455316B1/de
Priority to DE69133347T priority patent/DE69133347T2/de
Priority to ES91250105T priority patent/ES2208632T3/es
Priority to DK91250105T priority patent/DK0455316T3/da
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Priority to CA002401776A priority patent/CA2401776A1/en
Priority to AU75098/91A priority patent/AU645302B2/en
Priority to HU9900537A priority patent/HU9900537D0/hu
Priority to HU310/91A priority patent/HU217221B/hu
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Priority to IE131491A priority patent/IE911314A1/en
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Priority to US08/177,719 priority patent/US6057493A/en
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Plasmide, deren DNA-Sequenzen nach Einführung in das pflanzliche Genom einer Kartoffelpflanze Veränderungen der Karbohydrat- und Proteinkonzentration und der Karbohydrat- und Protein­ zusammensetzung in den Kartoffelknollen regenerierter Pflanzen hervorrufen, sowie Zellen einer Kartoffelpflanze, enthaltend diese Plasmide.
Bedingt durch den kontinuierlich steigenden Nahrungsmittel- und Rohstoffbedarf, der aus der ständig wachsenden Weltbevölkerung resultiert, ist eine der Aufgaben der biotechnischen Forschung, sich um eine Veränderung der Inhaltsstoffe sowie des Ertrages von Nutzpflanzen zu bemühen. Dazu muß der Metabolismus der Pflanzen verändert werden.
Ein besonderes Interesse gilt dabei der Möglichkeit, pflanzliche Inhalts­ stoffe als erneuerbare Rohstoffquellen für z. B. die chemische Industrie zu verwenden. Dies ist aus zwei Gründen von besonders großer Bedeutung. Zum einen stellen Erdöl- oder Kohlevorkommen die bisher von der petrochemischen Industrie im wesentlichen verwendeten Rohstoffquellen dar. Diese Vorräte aber sind endlich und es ist absehbar, daß alternative, erneuerbare Roh­ stoffquellen, d. h. nachwachsende Rohstoffe geschaffen werden müssen. Zum anderen ist die gegenwärtige Situation in der Landwirtschaft die, daß im europäischen sowie nordamerikanischen Raum die klassischen, auf den Ernährungssektor zielenden landwirtschaftlichen Produkte im Überschuß vorliegen. Dies führt zu offensichtlichen finanziellen und politischen Problemen in der Landwirtschaft. Alternative Produkte, für die ein großer mengenmäßiger Bedarf besteht, könnten eine Lösung dieses Problems darstellen.
Nachwachsende Rohstoffe lassen sich prinzipiell in Fette und Öle, Proteine sowie Carbohydratverbindungen wie Mono- und Polysaccharide unterteilen. Bei den Polysacchariden sind die Stärke und die Cellulose die mit Abstand wichtigsten Komponenten. Im Bereich der EG verteilte sich die Gesamtstärke­ erzeugung des Jahres 1987/1988 auf die Pflanzen Mais (60%), Weizen (19%) und Kartoffel (21%).
Die Kartoffelstärke ist gegenüber der Getreidestärke eine sehr wettbewerbsfähige Form und weist in vielen Bereichen Vorzüge gegenüber den Getreidestärken auf. Ein weiterer Ausbau der Verwendung der Kartoffelstärke als industrieller Rohstoff wird im wesentlichen durch zwei Faktoren limitiert:
  • a) Die Qualität der Kartoffelstärke sollte den Anforderungen der verarbeitenden Industrie stärker entgegenkommen. Hier sind im wesentlichen das Amylose zu Amylopektin Verhältnis sowie die Kettenlänge und der Ver­ zweigungsgrad beim Amylopektin zu nennen.
  • b) Bei der Isolierung der Stärke aus der Kartoffelknolle fallen sehr große Mengen Fruchtwasser an (ca. 80% des Frischgewichts der Kartoffelknolle sind Wasser), das u. a. aufgrund eines hohen Gehalts an reduziertem Stickstoff zu ökologischen Problemen führt. Gegenwärtige Lösungen des Fruchtwasserproblems, wie z. B. Verringerung des Volumens durch Eindampfen, sind sehr kostenintensiv und mit einem hohen Energieaufwand verbunden. Der hohe Anteil an reduziertem Stickstoff in der Knolle ist im wesentlichen auf den hohen Proteingehalt der Knolle zurückzuführen.
  • c) Die Verringerung der in der Knolle enthaltenden Menge an reduziertem Stickstoff sollte weiterhin vorteilhaft für die Prozessierung der Kartoffel in der lebensmittelverarbeitenden Industrie sein.
Die wesentlichen biochemischen Synthesewege zum Aufbau der Stärke in höheren Pflanzen sind bekannt. Ebenfalls sind einige der Hauptproteine der Kartoffelknolle gut biochemisch untersucht. Neue biotechnologische Verfahren zur genetischen Veränderung dikotyler und monokotyler Pflanzen mittels des Transferns und stabilen Einbaus einzelner isolierter Gene oder Gruppen von Genen sind bekannt (Gasser und Fraley, Science 244, 1293-1299). Möglichkeiten zur spezifischen Expression von mittels gentechnologischen Verfahren in die Kartoffel eingeführten fremden Genen, primär in der Knolle, sind ebenfalls bekannt (Rocha-Sosa et al., (1989), EMBO J. 8, 23-29; und Patentanmeldung P 38 43 627 2).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Plasmide bereitzustellen, deren DNA-Sequenzen nach Einführung in das pflanzliche Genom einer Kartoffel­ pflanze Veränderungen der Karbohydrat- und Proteinkonzentration und der Karbohydrat- und Proteinzusammensetzung in den Kartoffelknollen regenerierter Pflanzen hervorrufen. Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzenzellen der Kartoffel, die diese Plasmide enthalten, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, das Plasmide bereit­ gestellt werden, deren DNA-Sequenzen nach Einführung in das pflanzliche Genom einer Kartoffelpflanze in die Stärkebiosynthese eingreifen, sowie die Menge und die Zusammensetzung des in der Kartoffelknolle enthaltenen Proteins verändern.
Begriffe und Abkürzungen
Abkürzungen
bp, Kp = Basenpaare, Kilobasen
D, kDa = Dalton, Kilodalton
DNA = Desoxyribonukleinsäure, Träger der genetischen Information
RNA = Ribonukleinsäure
SDS = Natriumdodecylsulfat
Tris = Tris(2-aminoäthyl)-amin
EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure
Begriffe
Elektrophorese = biochemisches Trennverfahren zur Trennung von Proteinen und Nukleinsäuren nach Größe und Ladung.
Expression = Aktivität eines Gens
Gen = Erbfaktor; eine Einheit des Erbguts, Träger der Teilinformation für ein bestimmtes Merkmal. Gene bestehen aus Nukleinsäuren (z. B. DNA, RNA).
Genom = Gesamtzahl der auf den Chromosomen der Zelle lokalisierten Gene.
Klenow-Fragment-Polymerase = durch Spaltung mit Subtilisin erhaltenes 76 000 d großes Fragment der DNA-Polymerase I. Besitzt 5′-3′-Polymerase- und 3′-5′-Exonuklease- Aktivität, aber nicht die 5′-3′-Exonuklease- Aktivität des Holoenzyms.
Klon = Zellpopulation, die von einer einzigen Mutter stammt.
Die Nachkommen sind genotypisch gleich. Durch Klonierung kann die Einheitlichkeit von Zellinien noch gesteuert werden.
Linker, Polylinker = synthetische DNA-Sequenz, die eine oder mehrere (Polylinker) Restriktionsschnittstellen in unmittelbarer Reihenfolge enthält.
Nopalin = Derivat der Aminosäure Arginin
Northern Blot, Southern Blot = Transfer und Fixierung elektrophoretisch aufgetrennter RNA oder DNA auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmenbran
Patatin = Trivalname für das Hauptspeicherprotein der Kartoffelknolle, ein Glycoprotein von 40 Kd Molekulargewicht.
Plasmid = zusätzlicher, extrachromosomaler DNA-Erbträger in Bakterienzellen (evtl. auch in Eukaryonten), der sich unabhängig vom Bakterienchromosom redupliziert. Das Plasmid kann in andere Wirts-DNA-Integriert werden.
Promotor = Kontrollsequenz der DNA-Expression, die die Transkription homologer und heterologer DNA-Gen-Sequenzen gewährleistet.
Restriktionsenzyme = Restriktionsendonukleasen, die eine Untergruppe der Endodesoxyribonukleasen sind (z. B. EcoRI (Spezifität
zeichnen sich durch eine hohe Spezifität der Sustraterkennung aus (↓=Spaltstelle).
Restriktionsstellen = Spalten, die spezifisch durch Restrik­ tionsenzyme erzeugt werden.
Transformation = Einfügung exogener DNA eines Bakterienstammes in eine Empfängerzelle.
Vektoren = wirtschaftliche, replizierfähige Strukturen, die Gene aufnehmen und diese auf ander Zellen übertragen. Plasmide können als Vektoren benutzt werden.
Am 18. 04 1990 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid P35 S-pat (DSM 5877)
Plasmid P35 S-anti-pat (DSM 5878)
Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 (DMS 5879)
Plasmid P35-S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880)
Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 (DSM 5881)
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 zeigt die Struktur des 16,7 kb großen Plasmids P35 S-pat. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
  • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl Mosaik Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
  • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 11749-11939.
  • C = Fragment C (6 Kb) umfaßt das Fragment des genomischen Patatinklons B33.
Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
Fig. 2 zeigt die Struktur des 12 kb großen Plasmids P35 S-anti-pat. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
  • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl- Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
  • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 11749-11939.
  • C = Fragment C (1250 bp) enthält das Sal I/Sma I Fragment.
Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
Fig. 3 zeigt die Struktur des 5,0 kb großen Plasmids P35-S-anti- ADP-glc1. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
  • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
  • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Das Fragment umfaßt die Nukleotide 11749-11939.
  • C = Fragment C (1,6 kb) enthält das Eco RI Fragment, welches für die Isoform I der beiden ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Isoformen der Kartoffel kodiert.
Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel 3 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
Fig. 4 zeigt die Struktur des 5,1 kb großen Plasmids P35-S-anti-ADP- glc2. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
  • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
  • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5.
  • C = Fragment C (1,7 kb) beinhaltet das Eco RI Fragment, welches für die Isoform II der beiden ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Iso­ formen der Kartoffel kodiert.
Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel 4 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
Fig. 5 zeigt die Struktur des 6,6 kb großen Plasmids P35-S-ani-ADP glc 1+2. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
  • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
  • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5.
  • C1 = Fragment C1 (1700 bp) beinhaltet das Eco RI Fragment, welches für die cDNA Isoform II der beiden ADP-Glucose-Pyrophosphorylase der Kartoffel kodiert.
  • C2 = Fragment C2 (1500 bp), beinhaltet das I-Xba I Fragment aus P35-S-anti-ADP-glc1, welches für die cDNA der Isoform I der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase der Kartoffel kodiert.
Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel 5 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
Fig. 6 zeigt den in situ Nachweis der Esteraseaktivität in Knollen extrakten von unabhängigen transformierten Kartoffelpflanzen der Sorte D´sir´e.
Gelbereich der Esterase. Die schwarzen Flecken der vierten bis zehnten Spur zeigen die Estereaseaktivität in den Pflanzen H7-(35S-33) 5 bis 11 im Gegensatz zu den Kontrollen C-1 und C-2 (erste und zweite Spur), bei denen es sich um Kontrollen untransformierter Pflanzen handelt. Die Pfeile (→) zeigen den Bereich der Estereaseaktivät an.
Fig. 7 zeigt die durch Autoradiographie sichtbar gemachten Banden der Patatin-RNA. Die Banden sind durch einen Pfeil markiert. Die Intensität der Banden ist ein Maß für die Konzentration der jeweiligen RNA. Die Positionen as1, as3, as4, as5, as6, as7, as9, as10, as11, as13, as14, as15 und as16 enthalten Proben der aus Knollen isolierten RNA. In den Proben as1, as3, as4, as5, as6, as9, as10, as11, as14 und as15 ist eine deutliche Verringerung der Patatin-sense-RNA-Konzentration im Gegensatz zu den Kontrollen C₅ und C₆ untransformierter Zellen zu erkennen.
Fig. 8 zeigt die Verringerung der endogenen Patatinproteinmenge in einer transagenen Kartoffelpflanze, sowie die entsprechenden Densitometriekurven der Proteine.
  • A = Proteinmuster einer umtransformierten Kartoffelknolle der Sorte D´sir´e.
  • B = Proteinmuster einer mit dem Plasmid P35 S-anti-pat trans­ formierten Kartoffelpflanze. Die Intensität der Schwärzung ist ein Maß für die Konzentration.
    ma = Molekulargewichtsstandard
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben:
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18/19 und pUC118 sowie die M13 mP10 Serien (Yanisch-Perron et. al., Gene (1985), 33, 103-119), benutzt.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984), 12, 8711-8720) kloniert.
2. Bakterienstämme
Für die pUC- und M13 mP-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 24, 6342-6346) oder TB1 benutzt.
Für den Vektor BIN19 wurde ausschließlich der E. coli-Stamm TB1 benutzt. TB1 ist ein Rekombinations-negatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et. al., Gene (1985), 33, 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, persönliche Mitteilung): F′ (traD36, proAB, lacI, lacZΔM15), Δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1: Tn10(TcR).
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes KBA4404 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, (1984); BIN19 Derivat) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Bei Bin19-Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et. al., (Mol. Gen. Genet. (1978), 163, 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. (1979), 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.
4. Pflanzentransformation
10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel- Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewaschenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5minütigem, leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zea­ tinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers und Bendich (Plant Mol. Biol. (1985), 5, 69-76.
Für die DNA-Analyse wurden 10-20 µg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersuchenden DNA-Sequenzen analysiert.
6. Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (Analytical Biochem. (1987), 163, 16-20).
Für die Analyse wurden je 50 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.
Proteinextraktion
Zur Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe wurden Gewebestücke in Proteinextraktionspuffer (25 mM Natriumphosphat pH 7,0 2 mM Natrium­ bisulfit, unter Zusatz von 0,1% (w/v) unlöslichem Polyvinylpoly­ pyrrolidon (PVP) homogenisiert.
Nach Filtrieren durch Zellstoff wurden Zelltrümmer für 20 Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute abzentrifugiert und die Proteinkonzentration des Überstandes nach der Methode von Bradford [Anal. Biochem. 1976)/72, 248-254] bestimmt.
8. Nachweis von Fremdproteinen mit Hilfe immulogischer Verfahren (Western-Blot)
Die Proteinextrakte wurden mittels Gelelektrophorose in SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid) Gelen nach Molekulargewicht getrennt. Nach SDS-PAGE wurden Proteingele für 15-30 Minuten in Transfer Puffer für Graphitelektroden (48 g/l Tris, 39 g/l Glycin, 0,0375% SDS, 20% Methanol) äquilibriert und anschließend im Kühlraum auf Nitrozellulose- Filter transferiert und mit 1,3 mA/cm² für 1-2 Stunden getrennt. Der Filter wurde für 30 Minuten mit 3% Gelatine in TBS-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5, 500 mM NaCl) abgesättigt, anschließend wurde der Filter für 2 Stunden mit dem entsprechenden Antiserum in geeigneter Verdünnung (1 : 1000-10 000 in TBS Puffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der Filter jeweils für 15 Minuten mit TBS-, TTBS- (TBS-Puffer mit 0,1% Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonolaurat und TBS-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Filter für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Alkalische-Phosphatase konjugiert Goat-anti-Rabbit (GAR)-Antikörpern (1 : 7500 in TBS) inkubiert. Anschließend wurde der Filter wie obenstehend beschrieben gewaschen und in AP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) äquilibriert. Die Alkalische-Phosphatase Reaktion wurde durch Substratzugabe von 70 µl 4-Nitrotetrazolium (NBT)-Lösung (50 mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid) und 35 µl 5-Brom-4-Chlor-4-3-Indolyl­ phosphat (BCIP) (50 mg/ml BCIP in Dimethylformamid) in 50 ml AP-Puffer gestartet. Nach 5 Minuten konnte in der Regel erste Signale beobachtet werden. Die Reaktion kann durch Überführen des Filters in Stop-Lösung (20 mM Tris/HCl pH 8,0 mit 5 mM EDTA) beendet werden. Die Reaktion wurde im Dunkeln durchgeführt.
9. Esterase-Test
Die Esteraseaktivität des Patatin-Proteins wurde in situ in semi-nativen SDS-Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE) durch Inkubation der Gele in 100 ml Inkubationspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 200 mM Natriumchlorid, 0,1% SDS, dem als Substrate 500 µl 1%ige α-Naphthylacetat-Lösung (1 g α- Naphthylacetat/100 ml Ethanol) und 5 ml 2%ige Fast Blue RR-Lösung zugesetzt wurde, nachgewiesen. Durch die Esteraseaktivität wurde ein braunschwarzer unlöslicher Farbstoff ausgefällt, der spezifisch die Proteinbande der nativen Esterease im Gel anfärbt. Die Auftrennung des nicht hitzedenaturierten Proteingemisches (seminativ) erfolgte in 12%igem SDS-PAGE nach Laemmli (1970, Nature, 227, 680-685).
10. Färbung von Proteinen im Polyacrylamidgel
Nach beendeter Elektrophorese wurde das Gel für 2 Stunden in Fixierlösung (50% Methanol, 10% Eissesig, 40% Wasser) geschüttelt, anschließend für 4 Stunden in Färbelösung (0,05% Coomassie Brilliant Blue R in Fixierlösung) belassen und schließlich mehrfach in Entfärbelösung (5% Methanol, 7% Essigsäure, 88% Wasser) bis zum Erscheinen klarer Proteinbanden entfärbt.
Ausführungsbeispiel 1 Herstellung des Plasmids P35 S-pat und Einführung des Plasmids in das pflanzliche Genom
Zur Erhöhung der Expression des Patatin-Proteins wurde ein Plasmid, bestehend aus dem eine konstitutive Expression bewirkenden Promotor der 35 s RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), dem Polyadenylierungssignal des Octopinsynthase-Gens der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 sowie der kodierenden Sequenz eines Patatin-Gens, vorliegend als genomischer Klon, konstruiert. Dabei wurde die kodierende Sequenz des Patatin-Gens zwischen den Promotor und die Polyadenylierungsstelle gesetzt, wobei der kodierende Strang des Patatin-Gens abgelesen wird.
Das Plasmid p 35s-pat besteht aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumekohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukelotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294) und befindet sich zwischen der Eco RI/KnpI- Schnittstelle. Fragment B beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846). Nukleotide 11749-11939, welches als Pvu II Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Esterella et. al., (1983) Nature 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II Schnittstelle zwischen die Sph I/Hind III Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert worden war.
Die Fragmente A und B wurden durch einen partiellen pUC18 Polylinker (Kpn I bis Sph I) verbunden und als Expressionskassette in die Eco RI und Hind III Schnittstellen des binären Vektors Bin19 (M. Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721) kloniert. Fragment C umfaßt ein 6,0 kb großes Fragment des genomischen Patatinklons B33 (M. Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J., 8, 23-29). Nach partieller Dra I Verdauung wurde das Dra I Eco RI Fragment (Schnittstelle des Dra I bei Position -27 des Patatinklons B33, singuläre Eco RI Schnittstelle im genomischen Klon B33) mit Hilfe von Klenow-Poly­ merase mit stumpfen Enden versehen und in die Sma I Schnittstelle des zwischen Fragment A und B gelegenen Polylinkers kloniert.
Das Plasmid P35 S-pat hat eine Größe von 16,7 kb (siehe Fig. 1). Das Plasmid P35 S-pat wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeniert.
Für die Untersuchung der Knollen regenerierter transgener Pflanzen auf Patatin-Protein wurden 50 µg eines nicht denaturierten Knollenproteinextraktes, der wie unter Punkt 7, Seite 12 beschrieben, präpariert wurde, auf einem 12%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und in situ mit α-Naphthyl­ acetat und Fast Blue RR zum Nachweis der Esteraseaktivität gefärbt. Diese Analyse zeigte, daß die Transformation zum Auftreten einer neuen Patatin­ kodierten Esteraseaktivität in den Pflanzen H7-(35S-33) 5 bis 11 führt.
Die Kontrollen C1 und C2, bei denen es sich um Extraktproben aus Knollen untransformierter D´sir´e-Pflanzen handelt, sowie die Knollenextrakte der Pflanzen H2-(p33-33)-8 bzw. -11, bei denen es sich um Kontrolltransformationen mit einem anderen Plasmid handelt, ließen keine neue Esterease­ aktivität erkennen (siehe Fig. 6).
Es kann somit gezeigt werden, daß der Proteingehalt in der Kartoffelknolle durch Einführung und Expression des Plasmids P35 S-pat erhöht werden kann.
Ausführungsbeispiel 2 Herstellung des Plasmids P35 S-anti-pat und Einführung des Plasmids in das pflanzliche Genom
Das 40 kd große Patatin-Protein macht 20-40% des Gesamtproteins aus. Eine Verringerung des Proteins in dem bei der Stärkeaufarbeitung entstehenden Fruchtwasser ist wünschenswert. Zur Reduktion der Expression des Patatin­ Proteins wurde ein Plasmid, bestehend aus dem eine konstitutive Expression bewirkenden Promotor der 35s RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus, dem Poly­ adenylierungssignal des Octopinsynthase-Gens der T-DNA des Ti-Plasmids pTi ACH5 sowie der kodierenden Sequenz eines Patatin-Gens, vorliegend als cDNA-Klon, konstruiert. Dabei wurde die kodierende Sequenz der Patatin-cDNA so zwischen den Promotor und die Polyadenylierungsstelle gesetzt, daß das 3′-Ende der kodierenden Sequenz direkt dem Promotor benachbart ist, während das 5′-Ende der kodierenden Sequenz direkt der Polyadenylierungsstelle benachbart ist. Die normalerweise vorliegende Anordnung der kodierenden Sequenz in bezug auf den Promotor und das Polyadenylierungssignal wird also invertiert, was in transgenen Kartoffelpflanzen zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA zur in der Knolle normalerweise gebildeten "sense"-Patatin-RNA führt. Die Gegenwart einer "anti-sense" RNA führt zu einer quantitativen Verringerung der Patatin-sense RNA und dadurch zu einer Verringerung an Patatin-Protein.
Das Plasmid P35 S-anti-pat besteht aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumemkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294) und befindet sich zwischen der Eco RI/KnpI- Schnittstelle. Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J., 3, 835-846), Nukleotide 11749-11939), welches als Pvu II Fragment aus dem Plasmid pAGV (Herrera-Esterella et al., (1983) Nature 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph I Hind III Schnittstellen des Polylinkers von pUC 18 kloniert worden war.
Die Fragmente A und B wurden durch einen partiellen pUC18 Polylinker (Knp I bis SpH I) verbunden und als Expressionskassette in die Eco RI und Hind III Schnittstellen des binären Vektors Bin19 (M. Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721) kloniert. Fragment C wurde erhalten, indem das Pst I Fragment des cDNA Klons pcT 58 (Rosahl et al., 1986, Mol. Gen. Genetics 203, 214-220) in die Pst I Schnittstelle des Vektors M13 mp10 kloniert wurden.
Aus diesem Vektor wurde sodann ein 1,25 kb großes Sal I/Sma I Fragment isoliert. wobei die Sal I Schnittstelle in dem Polylinker des Vektors M13 mp10 lokalisiert ist, und die Sma I Schnittstelle im cDNA Insert (vgl. Sequenz des Klons pcT 58 i R. Schmidt, Diplomarbeit, Universität zu Köln, 1985) lokalisiert ist. Das Fragment wurde gerichtet in die Sma I und Sal I Schnittstellen des zwischen den Fragmenten A und B befindlichen Polylinkers ligiert. Das Plasmid P35 S-anti-pat hat eine Größe von 12,0 kb (siehe Fig. 2).
Das Plasmid P35 S-anti-pat wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus trans­ formierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert.
Für den Nachweis von Patatin-RNA und Patatin-Protein in Pflanzen, die das Plasmid P35 S-anti-pat enthielten, wurde eine Northern Blot Analyse trans­ gener Patatin-ani-sense Pflanzen (Pas 58) durchgeführt. Hierzu wurden 50 µg Gesamt-RNA aus Knollen in einem 1,5%igen Formaldehyd-Agarosegel aufgetrennt und auf einen Nylonfilter (Hybond N., Amersham) transferiert. Der Filter wurde mit einem radioaktiven markierten Patatin-Fragment [pcT58 (Rosahl et al., Mol. Gen. Genetics 203, 214-220 (1986))] hybridiert. Die Signale wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Banden (markiert durch einen Pfeil) zeigen spezifisch das Vorhandensein von Patatin-RNA an, und die Schwärzung der Banden ist ein Maß für die Konzentration der jeweiligen RNA (siehe Fig. 7). Die Analyse der Knollen regenerierter transgener Pflanzen auf die Präsenz von Patatin-RNA sowie Patatin- Protein zeigt in 12 von 16 getesteten Fällen (16 unabhängig transformierte Pflanzen) eine drastische Verringerung der Patatin-RNA. Teilweise war keinerlei Patatin-RNA mehr nachweisbar. In Fig. 7 werden 13 von 16 Proben aus transformierten Pflanzen gezeigt.
Ferner wurden aus Knollen isolierte Proteinextrakte nach gelenkelektrophoretischer Auftrennung mittels einer Coomassie-Blau Färbung hinsichtlich des Patatin-Proteingehaltes untersucht. Hierzu wurden jeweils 25 µg denaturiertes Protein aus einer untransformierten Kartoffelknolle der Sorte D´ssir´e und aus einer transgenen Pflanze, die mit dem Plasmid P35 S- anti-pat transformiert wurde, auf ein 12%iges SDS-PAGE-Gel aufgetragen und aufgetrennt. Anschließend wurde die Proteinbande mit Coomassie Blau angefärbt, wobei die im Gel aufgetrennten Proteinbanden sichtbar wurden. Die Intensität der Farbe war ein Maß für die Konzentration (siehe Fig. 8). In allen mit dem Plasmid P35 S-anti-pat transformierten transgenen Pflanzen, die eine stark reduzierte Menge der Patatin-RNA enthielten, konnte auch eine signifikante Verringerung des Patatin-Proteins auf ca. 10% der in einer genetisch nicht veränderten Pflanze enthaltenen Menge nachgewiesen werden (siehe Fig. 8). Es konnte somit gezeigt werden, daß der Proteingehalt in der Kartoffelknolle durch Einführung und Expression des Plasmids P35 S- anti-pat stark verringert wird.
Andere Proteine, z. B. ein Proteinase Inhibitor, wurden in ihrer Konzen­ tration nicht beeinträchtigt. Dies läßt sich durch Densitometriekurven der beiden Proteinspuren demonstrieren (siehe Fig. 8).
Ausführungsbeispiel 3 Herstellung des Plasmids P35-S-anti-ADP-glc1 und Einführung des Plasmids in das pflanzliche Genom
Unter Einsatz einer heterogenen Probe aus Mais wurden aus einer in dem Expressionsvektor λgt11 angelegten cDNA Bank verschiedene Klone identifiziert, die mit dieser Probe kreuzhybridisierten. Diese Klone wurden aus dem Vektor λgt11 in den Vektor pUC18 subkloniert. Eine Bestimmung der Nukleotidsequenz identifizierte diese Klone eindeutig als einen eine der beiden Isoformen (Isoform I) der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase aus Kartoffel kodierenden cDNA Klon.
Diese cDNA wurde mit dem Promotor der 35-s-RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthese der Ti Plasmids pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung des die cDNA der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase kodierenden Segmentes so gewählt, daß der nicht­ kodierende Strang der cDNA abgelesen wird.
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 besteht aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
Fragment A (529 bp) beinhaltet des 35s Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nuleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294) und befindet sich zwischen der Eco RI/KnpI-Schnittstelle. Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846), Nukleotide 11749-11939, welches als Pvu II Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estralla et al., (1983) Nature 303, 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II Schnittstelle zwischen die Sph I/Hind III-Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert wurde.
Fragment C enthält ein 1,6 kb großes Eco RI Fragment, welches für die Isoform I der beiden ADP-Glucose-Pyrophosphorylasen Isoformen der Kartoffel kodiert. Die Orientierung dieses cDNA Klons ist so gewählt, daß der nicht­ kodierende Strang abgelesen wird (vgl. Ausführungsbeispiel 2), was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt. Die Präsenz der antisense RNA führt zu einer Reduktion der von der in der Kartoffel gebildeten "sense"-ADP-Glucose-Pyrophosphorylase I RNA und damit zu einer Inhibierung der Stärkebiosynthese. Das Plasmid P35-S-anti- ADP-glc1 liegt als Eco RI/Hind III Fragment im Polylinker des Vektors pUC18 vor.
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 hat eine Größe von 5,0 kb (siehe Fig. 3).
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden im Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP Glucose-Pyrophosphorylase glc1 RNA untersucht (vgl. Punkt, Seite 11). Pflanzen, die mit dem Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 transformiert worden sind, weisen eine verringerte Menge der endogenen zellulären RNA dieses Gens auf. Die damit verbundene Verringerung der Stärkekonzentration sowie der ADP Glucose-Pyrophosphorylase Aktivität wird enzymatisch nach Standard­ verfahren (Plaxton, W. L. und Preiss, J. (1987) Plant Physiology 83, 105-112, Lin et. al. (1988) Plant Physiology 86, 1131-1135) bestimmt.
Ausführungsbeispiel 4 Herstellung des Plasmids P35 S-anti-ADP-glc2 und Einführung in das pflanz­ liche Genom
Unter Einsatz einer heterologen Probe aus Mais wurden aus einer in dem Expressionsvektor λgt11 angelegten cDNA Bank verschiedene Klone identifiziert, die mit dieser Probe kreuzhybridisierten. Diese Klone wurden aus dem Vektor λgt11 in den Vektor pUC18 subkloniert. Eine Bestimmung der Nukleo­ tidsequenz identifizierte diesen Klon eindeutig als einen die Isoform II der ADP Glucose-Pyrophosphorylase aus Kartoffel kodierenden cDNA Klon.
Diese cDNA wurde mit dem Promotor der 35 sRNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthase des Ti-Plasmids pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung des die cDNA der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase kodierenden Segmentes so gewählt, daß der nichtkodierende Strang der cDNA abgelesen wird.
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc2 besteht aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nuleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294) und befindet sich zwischen der Eco RI/KnpI- Schnittstelle. Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846), Nukleotide 11749-11939, welches als Pvu II Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estralla et al., (1983) Nature 303, 209-213) isoliert wurde und nach Addition von Sph I Linkern an die PvU II Schnitt­ stellen zwischen die Sph I/Hind III-Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert wurde.
Fragment C enthält ein 1,7 kb großes Eco RI Fragment, welches für die Iso­ form II der beiden ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Isoformen der Kartoffel kodiert. Die Orientierung dieses cDNA Klons wurde so gewählt, daß der nichtkodierende Strang abgelesen wird (siehe Ausführungsbeispiel 2), was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt. Die Präsenz der anti-sense RNA führt zu einer Reduktion der von der in der Kartoffel gebildeten "sense"-ADP-Glucose-Pyrophosphorylase 2 RNA und damit zu einer Inhieberung der Stärkebiosynthese. Das Plasmid P35-S- anti-ADP-glc2 liegt als Eco RI/Hind III Fragment im Polylinker des Vektors pUC18 vor (siehe Fig. 4).
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc2 wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden im Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP Glucose-Pyrophosphorylase glc2 RNA untersucht. Pflanzen, die mit dem Plasmid P35-S-anti-ADP-glc2 transformiert worden sind, weisen eine ver­ ringerte Menge der endogenen zellulären RNA dieses Gens auf. Die damit ver­ bundene Verringerung der Stärkemenge sowie der ADP- Glucose-Pyrophosphorylase- Aktivität wird enzymatisch nach Standardverfahren (siehe Ausführungs­ beispiel 3) bestimmt.
Ausführungsbeispiel 5 Herstellung des Plasmids P35-S-anti-ADP-glc 1+2 und Einführung des Plasmids in das pflanzliche Genom
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 wurde durch Insertion des 1,5 kb großen Xba I Fragments aus dem Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 in die Xba I Stelle des Plasmids P35-S-anti-ADP-glc2 hergestellt. Dabei wurde die Orientierung des Xba I Fragmentes so gewählt, daß der nicht-kodierende Strang des Xba I Fragmentes abgelesen wird, was somit in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA von beiden Isoformen (Isoform, I und II) der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase der Kartoffel führt. Die Präsenz der "anti-sense" RNA′s führt zu einer Reduktion der von den in der Kartoffel gebildeten sense-ADP-Glucosepyrophosphorylase 1 und sense-ADP- Glucosepyrophosphorylase 2-RNA′s und damit zu einer Inhibierung der Stärke­ biosynthese. Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 liegt als Eco RI-HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC 18 vor (siehe Fig. 5).
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 besteht aus den vier Fragmenten A, B, C1 und C2 und wurde wie folgt hergestellt:
Fragment A (529 bp) beinhaltet des 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294) und befindet sich zwischen der Eco RI/KnpI- Schnittstelle. Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846), Nukleotide 11749-11939, welches als Pvu II Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estralla et al., (1983) Nature 303, 209-213) isoliert wurde und nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II Schnitt­ stellen des Polylinkers von pUC18 kloniert wurde.
Fragment C1 enthält ein 1,7 kb großes Eco RI Fragment, welches für die Iso­ form II der beiden ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Isoformen der Kartoffel kodiert. Die Orientierung dieses cDNA Klons wurde so gewählt, daß der nichtkodierende Strang abgelesen wird (siehe Ausführungsbeispiel 2), was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt.
Fragment C2 enthält das 1,5 kg große XbaI-XbaI Fragment aus P35-S-anti-ADP- glc1, welches für die Isoform I der beiden ADP Glucose-pyrophosphorylasen kodiert.
Die Orientierung der Fragment C1 und C2 wurde so gewählt, daß der jeweils nichtkodierende Strang der Fragmente C1 und C2 abgelesen wird, was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anit-sense" RNA von beiden Isoformen (Isoform I und Isoform II) der ADP-Glucose-Phyrophos­ phorylase der Kartoffel führt.
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 liegt als Eco RI/Hind III Fragment im Polylinker des Vektors pUC18 vor.
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden mit Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP Glucose-Pyrophosphorylase I RNA und ADP-Glucose-Pyrophosphorylase II-RNA untersucht (vgl. Punkt 6, Seite 11). Pflanzen, die mit dem Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 transformiert wurden, weisen eine stark verringerte Menge der endogenen zellulären RNA′s beider ADP-Glucose-Pyrophosphorylasen (I und II) auf. Die damit verbundene Verringerung der Stärkekonzentration sowie der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Aktivität wurde enzymatisch nach Standardverfahren (siehe Ausführungsbeispiel 3) bestimmt.

Claims (19)

1. Plasmid P35 S-pat (DSM 5877)
2. Plasmid P35 S-anti-pat [DSM 5878)
3. Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 (DSM 5879)
4. Plasmid P35-S-anti-ADP-glc2 (DSM) 5880)
5. Plasmid P35-S-anti-ADP-glc 1+2 (DSM 5881)
6. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel, enthaltend das Plasmid P35 S-pat, P35 S-anti-pat, P35 S-anti-ADP-glc1, P35 S-anti-ADP-glc2 und/oder P35 S-anti-ADP-glc 1+2 gemäß den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß diese Plasmide eine DNA-Sequenz enthalten, dessen von dieser kodiertes Produkt die Zusammensetzung und/oder die Konzentration der in dieser Zelle enthaltenen Proteine und/oder Karbohydrate verändert.
7. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die DNA-Sequenz die das Patatin-Protein kodierende DNA- Sequenz ist.
8. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die DNA-Sequenz des Patatin-Proteins an die regulatorischen Sequenzen anderer Gene, die eine Expression des Patatin-Proteins in Pflanzen sicherstellen, fusioniert ist.
9. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die DNA-Sequenz des Patatin-Proteins in invertierter Anordnung an die regulatorischen Sequenzen anderer Gene fusioniert ist, wobei das 3′-Ende der kodierenden Sequenz an das 3′-Ende des Promotors und das 5′-Ende der kodierenden Sequenz an das 5′-Ende des Terminationssignals fusioniert ist, wobei eine anti-sense RNA in der Pflanzenzelle vom Patatin-Gen gebildet wird.
10. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die DNA Sequenz die das ADP-Glucose-Pyrophosphorylase- Protein kodierende DNA Sequenz ist.
11. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die DNA-Sequenz des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase- Proteins an die regulatorischen Sequenzen anderer Gene, die eine Ex­ pression des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Protein in Pflanzen sicherstellen, fusioniert ist.
12. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die DNA-Sequenz des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase- Proteins in invertierter Anordnung an die regulatorischen Sequenzen anderer Gene fusioniert ist, wobei das 3′-Ende der kodierenden Sequenz an das 3′-Ende des Promotors und das 5′-Ende der kodierenden Sequenz an das 5′-Ende des Terminationssignals fusioniert ist, wobei eine anti­ sense RNA in der Pflanzenzelle vom ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gen gebildet wird.
13. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 8, 9, 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorischen Sequenzen Promotoren und Terminationssignale von pflanzlichen Genen sind.
14. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 13, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Promotor der Promotor der 35s RNA des Blumenkohl- Mosaik-Virus ist und das Terminationssignal das 3′-Ende des Ocxtopine- Synthese-Gens der T-DNA des Ti-Plasmids pTi ACH5 ist.
15. Eine Pflanzenzelle einer Kartoffel gemäß Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Karbohydrat Stärke ist.
16. Verwendung der Plasmide P35 S-pat, P35 S-anti-pat, P35-S-anti-ADP-glc1, P35-S-anti-ADP-glc2 und P35-S-anti-ADP-glc 1+2 zur Herstellung von in Karbohydrat- und Proteinkonzentration und in Karbohydrat- Protein­ zusammensetzung veränderten transgenen Pflanzen.
17. Verwendung von Pflanzenzellen einer Kartoffel, enthaltend das Plasmid P35 S-pat, P35 S-anti-pat, P35-S-anti-ADP-glc1, P35-S-anti-APD-glc2 und/oder P35-S-anti-ADP-glc 1+2 zur Regenerierung von Pflanzen.
18. Verwendung der Plasmide gemäß Anpruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Karbohydraten um Stärke handelt.
19. Verwendung der Plasmide gemäß Anspruch 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen Kartoffeln sind.
DE4013144A 1990-04-20 1990-04-20 Neue plasmide, enthaltend dna-sequenzen, die veraenderungen der karbohydrat- und proteinkonzentration und der karbohydrat- und proteinzusammensetzung in kartoffelknollen hervorrufen, sowie zellen einer kartoffelpflanze, enthaltend diese plasmide Withdrawn DE4013144A1 (de)

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