CZ303574B6 - Sekvence nukleové kyseliny, zpusob zvýšení nebo snížení aktivity ß-amylázy v rostline, zpusob smerování proteinu nebo enzymu do rostlinného plastidu, zpusob zvýšení nebo snížení množství škrobu produkovaného transgenní rostlinou, chimérický gen obsah - Google Patents

Abstract

Rešení poskytuje sekvenci nukleové kyseliny, odvozenou od genu pro .beta.-amylázu, která kóduje sekvenci schopnou smerovat protein do rostlinného plastidu. Dále je popsán zpusob zvýšení nebo snížení aktivity .beta.-amylázy v rostline, zpusob smerování proteinu nebo enzymu do rostlinného plastidu a zpusob zvýšení nebo snížení množství škrobu produkovaného transgenní rostlinou, které využívají uvedenou smerovací sekvenci. Rešení poskytuje také chimerický gen obsahující uvedenou sekvenci, rostlinnou bunku a semeno transformované uvedenou sekvencí a rostlinu obsahující uvedenou rostlinnou bunku.

Description

Oblast techniky io Vynález se týká nové sekvence β-amylázy směrované do chloroplastu (ct β-amylázu), nové sekvence nukleové kyseliny pro směrování do chloroplastu a nové sekvence β-amylázy. Vynález dále poskytuje indukovatelný promotor, který je nezávisle indukován slítnuly v podobě světla a cukru. Popisují se zde metody transformace rostlin užitím těchto nových sekvencí, a také transformované rostlinné buňky, rostliny a semena rostlin, a také chimérické geny obsahující uvedené ís sekvence. Dále jsou popsány způsoby modifikace obsahu škrobu v rostlinách, a také směrování genů účastnících se biosyntézy nebo degradace škrobu, nebo genů rezistence ke škůdcům, a nebo variací genové exprese, kterých lze podle vynálezu dosáhnout.

Dosavadní stav techniky

Přesný mechanismus, jakým je syntetizován a degradován škrob v rostlinách není dosud znám, přestože byla izolována a charakterizována řada enzymů, které se zřejmě na těchto procesech podílejí.

Škrob je akumulován v chloroplastech v listech v průběhu dne a je užít k zásobování rostliny energií a bio syntetických drah v průběhu noci. Způsob, jakým je tzv. přechodný (tranzistentní) škrob mobilizován není plně poznán, ale musí zahrnovat koordinovanou regulaci syntetických a degradačních enzymatických aktivit. V listovém pletivu hlavní degradační metabolická dráha zahrnuje fosforolyrické a hydrolytické aktivita, zejména α-glukosidázu (E. C. 3.2.1.3) (Nielson a Stitt, 1997).

Škrob je také akumulován v amyloplastech zásobních orgánů jako jsou např. semena, plody a hlízy. V takovém případě je škrob skladován dlouhodobě ajeho mobilizace je doprovázena dege35 nerací pletiva zásobních orgánů a zvýšením amylolytické a fosforo lyt i cké aktivity. Ale existují důkazy, že k metabolickému obratu škrobu dochází i v amyloplastech zásobních orgánů (Sweetlove a kol. 1996). To opět vyžaduje koordinovanou regulaci syntetických a degradujících enzymatických aktivit.

Jak chloroplasty tak amyloplasty pocházejí z proplastidů a tudíž mají mnoho společných vlastností, a kromě toho že jsou obě organely místem syntézy škrobu v listech (chloroplasty) a v zásobních orgánech (amyloplasty), chloroplasty se mohou přeměnit na amyloplasty a jiné typy plastidu (Thomson a Whatley 1980).

Škrob je směs dvou polysacharidů, a sice amylózy, což je lineární řetězec glukosylových jednotek spojených a-l,4-glykosidickými vazbami, a amylopektinu, který je tvořen mnoha lineárními řetězci a-l,4-polyglukanů, kteréjsou navzájem spojeny ct-l,6-glykosidickými vazbami.

Enzymy účastnící se syntézy škrobu jsou ADPG pyrofosforyláza (E.C. 2.7.7.21), syntáza škrobu (E.C. 2.4.1.21) a tzv. větvicí enzym (E.C. 2.4.1.18). ADPG pyrofosforyláza je odpovědná za dodávání substrátu ADPG, který slouží jako donor glukózo vých monomerů, které jsou pak navzájem pospojovány souhrou syntázy škrobu (a-1,4 vazby) a větvícího enzymu (ct-1,6vazby).

- 1 CZ 303574 B6

Má se zato, že nerozpustná krystalická struktura Škrobových zrn je tvořena těsným nahloučením prodloužených Šroubovicových rozvětvených molekul amylopektinu, kde lineární molekuly amylózy vyplňují volný prostor.

Byla popsána řada enzymových aktivit degradujících škrob jako je např. α-amyláza (E.C. 3.2.1.1), isoamyláza (E.C. 3.2.1.68), β-amyláza (E.C, 3.2.1.2), α-glukosidáza (E.C. 3.2.1.3), fosforyláza škrobu (E.C. 2.4.1.1) a tzv. disproporcionační enzym (E.C. 2.4.1.25). Mnohé z těchto enzymů existují v rostlině v několika formách a některé se podílejí na syntéze škrobu. Pravděpodobně se všechny, v určitém rozsahu, podílejí na mobilizaci škrobu, ačkoliv jejich přesné role io a možné interakce nejsou dosud známy. Potíže v přiřazení role různým enzymům jsou dobře patrné na příkladu dvou enzymů, které jsou povazovány za hlavní účastníky rozkladu škrobu v rostlinách, a sice fosforylázy škrobu a amylázy.

Fosforyláza škrobu katalyzuje reverzibilní uvolňování glukóza-l,6-fosfátu z a-l,4-glukanů. i5 V rostlinných pletivech se vyskytují dvě formy fosforylázy škrobu: Phol, nebo-li L-typ, lokalizovaná uvnitř plastidů a s vysokou afinitou k maltodextrinům, Pho2, nebo-li H-typ, lokalizovaná v cytosolu a mající vysokou afinitu k velkým, silně rozvětveným polyglukanům jako je glykogen.

Ačkoliv plastidový enzym Phol je pravděpodobným kandidátem na enzym účastnící se mobilizace škrobu, antisense inhibice této enzymové aktivity v listu neměla žádný vliv na akumulaci škrobu v listu u rostlin transgenního bramboru (Sonnewald a kol., 1995). V jiné studii, antisense inhibice cytoplasmatické Pho2 měla vliv na klíčení hlíz transgenního bramboru, ale neměla žádný vliv na akumulaci a degradaci škrobu (Duwenig a kol. 1997).

Existují dvě hlavní skupiny amyláz hydro lyžuj ících a-l,4-glykosidické vazby amylózy a amylo25 pektinu: ct-amyláza působí náhodně na jiných než koncových vazbách, zatímco β-amyláza působí tak, že uvolňuje maltózové jednotky počínaje od neredukujícího konce polyglukanového řetězce. Má se zato, že subcelulámí lokalizace α-amylázy v apoplastickém prostoru rostlinných buněk odráží tu skutečnost, že enzym je normálně secemován. Avšak u řady rostlin jako je např. rýže (Chen a kol., 1994) a cukrová řepa (Li a kol., 1992) je enzym lokalizován také uvnitř chlo30 roplastů a amyloplastů, přestože bylo zjištěno, že signální sekvence na aminokonci řady a-amylázových proteinů jsou charakteristické pro translokaci proteinu přes membránu ER spíše než plastidovou membránu (Chen. a kol., 1994). Ve studii, kde promotor a signální sekvence genu ctamylázy rýže byly fúzovány s bakteriálním genem GLÍS a vneseny do rýže, tabáku a bramboru pomocí transformace zprostředkované Agrobacterium (Chen a kol., 1994), bylo ukázáno, že exprimovaný fúzní protein GUS byl nejdříve transportován do endoplasmatického retikula a teprve potom do kultivačního média suspenzní kultury připravené z transgenních buněk. Bylo také ukázáno v řadě studií, že ct-amyláza degraduje nativní molekuly škrobu.

Naproti tomu in vitro studie ukázaly, že β-amyláza nedegraduje nativní škrobová zrna, aniž by předtím nebyla naštěpena jinými enzymy. Mutanty rýže (Daussant a kol., 1981) a sóji (Hildebrand a Hymowitz 1981) postrádající aktivní β-amylázu nebo obsahující pouze stopovou aktivitu zjevně projevují normální růst a vývoj. Kromě toho transgenní rostliny Arabidopsis se silně redukovanou hladinou β-amylázy neprojevují významné růstové defekty (Mita a kol. 1997). Pokusy definovat přesně fyziologickou úlohu β-amylázy byly zmařeny nejednoznačnými day týkajícími se subcelulámí lokalizace. Ačkoliv jedna studie (Kafekuda a kol. 1986) popsala přítomnost dvou β-amyláz v chloroplastech hrachu, většina studií zahrnujících druhy jako je Vicia faba, ječmen, pšenice, sója, topinambur a hrách, vedla k závěru, že většina, pokud ne všechna, βamylázové aktivity je extrachloroplastová (Nakamura a kol. 1991). Tento názor je podpořen skutečností, že dosud klonované geny β-amylázy kódují proteiny, které postrádají aminokonco50 vou sekvenci chloroplastového tranzitního peptidu.

U obilnin byly popsány tři typy β-amylázy: forma specifická pro endosperm, která se akumuluje v průběhu dozrávání obilky, forma syntetizovaná de novo v aleuronových buňkách rýže a kukuřice v průběhu klíčení (Wang a kol. 1996, 1997) a β-amyláza, která je všudypřítomná ve vegeta- 9 tivních orgánech. U Arabidopsis tato všudypřítomná forma představuje přibližně 80 % celkové aktivity degradující škrob u listů v růžici. Společně se všemi ostatními dodnes klonovanými geny β-amylázy ani gen pro všudypřítomnou formu z Arabidopsis nekóduje protein se subcelulámím směrovacím signálem, takže enzym je pravděpodobně lokalizován v cytosolu.

s

Zjištění řady studií, že degradativní aktivity mohou být odstraněny bez škodlivých následků pro životaschopnost rostliny, a navíc subcelulámí lokalizace enzymů degradujících škrob mimo plastid, jsou velmi překvapující. Zjevná nepřítomnost β-amylázové aktivity lokalizované v plastidu je zejména překvapující ve světle toho, že očekávaný hlavní koncový produkt β-amylázové aktiio vity, zejména maltóza, byl identifikován jako produkt degradace škrobu v izolovaných chloroplastech (Peavey a kol., 1977). Nedávno bylo ukázáno, že jak maltóza tak glukóza jsou exportovány z izolovaných amyloplastů pupenů květáku v průběhu mobilizace škrobu (Neuhaus a kol.,

1995).

Možnost ovlivnit množství škrobu v plastidech listů nebo zásobních orgánů by byla velmi přínosná pro různé průmyslové procesy, ve kterých se užívá rostlinný škrob. Tak např. při pokusu zvýšit obsah škrobu v bramborových hlízách bylo již dříve ukázáno, že když byia ADPG PPáza glgCló z A. coli nadměrně exprimována v transgenních bramborových hlízách, byl zvýšen tok uhlíku do škrobu, avšak zvýšení čisté akumulace škrobu bylo jen velmi malé (Sweetlove a kok,

1997). Analýza enzymových aktivit u „overexprimujících“ linií ukázala, že kromě změny v ADPG PPáze byla změněna také aktivita amylázy, konkrétně β-amylázy. Tyto údaje nasvědčují tomu, že akumulaci škrobu v hlízách „overexprimujících“ protein glgCló je zabráněno rozpadem nově syntetizovaného škrobu, tj. dochází k metabolickému obratu škrobu.

V jiném příkladu dostupnost škrobu v průběhu přípravy sladu velmi těsně korelovala s typem a množstvím degradačních enzymových aktivit v rostlině, zejména v zásobních orgánech. Zvýšení degradativní kapacity v plodině by učinilo proces přípravy sladu ze zraní obilnin nebo přeměnu škrobu z hlíz nebo jiných orgánů na alkohol mnohem účinnější.

Typ škrobu přítomného v zásobních orgánech závisí na formách a aktivitách ADPG pyrofosforylázy, syntázy škrobu, větvícího enzymu a degradačních enzymů, které jsou přítomny. Interakce mezi různými enzymy je také důležitá.

Existuje značný zájem o vytvoření nových druhů škrobu in planta, neboť by to snížilo náklady na jejich další zpracování a modifikaci před použitím v různých oblastech průmyslu jako např. v průmyslu potravinářském, papírenském, farmaceutickém, textilním a při výrobě lepidel a olejů. Následující příklady ukazují, jak aktivita hydrolyzující škrob může být důležitá pro změnu struktury škrobu in vivo.

Bylo ukázáno, že v zrnech kukuřice, mutace „sugaryl“ způsobuje absenci enzymu rušícího větvení, který hydrolyzuje ot-l,6-glykosylové vazby škrobu (James a kol., 1995). Mutace vede ke snížené koncentraci amylopektinu a akumulaci vysoce rozvětvených glukopolysacharidů, fytoglykogenu.

Bylo ukázáno u hrachu, že krátké oligosacharidové molekuly, počínaje maltózou a přidáváním další glukózy až po maltoheptózu, specificky stimulují aktivitu syntázy škrobu I vázané na škrobová zrna (GBSII) (Denyer a kol., 1996), kterýžto enzym je obecně považován za hlavní enzym zodpovědný za syntézu amylózy (např. van der Leíj a kol., 1991, Hylton a kol., 1995, Ainsworth a kol., 1993). Manipulace aktivity GBSSI řízením dodávky malto-oligosacharidů je předmětem patentové přihlášky (WO 97/16554), která navrhuje, že zvýšení koncentrace malto-oligosacharidů, a tudíž zvýšení poměru amylózy k amylopektinu ve škrobu, lze dosáhnout vnesením degradačních enzymů, zejména a-amylázy, β-amylázy, disproporcionačního enzymu, enzymu rušícího rozvětvení a fosforytázy škrobu. Patentová přihláška WO 97/16554 dále tvrdí, že geny pro plastidové isoformy těchto enzymů byly klonovány. Avšak, jak bylo již diskutováno výše, žádný

dosud izolovaný gen pro β-amylázu nekóduje enzym β-amylázu s proteinovou směrovací sekvencí a navíc, není žádné pochyby o tom, že β-amylázy jsou původně směrovány do plastidů (Chen a kol., 1994, Chán a kol., 1994). V patentové přihlášce WO 97/16554 je také odkaz na genetickou úpravu vhodné cDNA sekvence β-amylázy doplněním plastidové směrovací sekven5 ce.

Kromě průmyslového využití škrobu ze zásobních orgánů, množství škrobu v listech má značný význam pro agronomii plodin. Škrob je syntetizován v listech v průběhu dne z oxidu uhličitého fixovaného ve fotosyntéze. Škrob se ukládá v chloroplastech a rozkládá se v noci, kdy se stává io zdrojem energie a meziproduktů pro metabolismus rostliny. Jakým mechanismem je v rostlině řízen vztah zdroje a spotřeby není dosud známo, avšak je jasné, že ovlivnění množství a dostupnosti škrobu v listových plastidech má význačný vliv na produktivitu rostlin (biomasa a výnos).

Množství škrobu v listu je také významné u těch plodin, kde list je hlavní komoditou, např. u i? tabáku. Je známo, že obsah škrobu má vliv na vůni tabáku při kouření. Prostředky k ovlivnění hladiny škrobu u tabákových listů by tedy byly zajímavé pro tabákový průmysl.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je sekvence nukleové kyseliny, uvedená zde jako sekvence id. č. 1, s nukleotidy 1 až 294, která kóduje sekvenci schopnou směrovat protein do rostlinného plastidů, nebo sekvence, která má alespoň 6% nebo větší homologii se sekvencí id. č. 1 a která kóduje sekvenci maj ící stejnou směrovací schopnost.

Výhodně uvedená sekvence nukleové kyseliny kóduje 85 aminokyselinových zbytků.

Předmětem vynálezu je rovněž sekvence nukleové kyseliny, uvedená zde jako sekvence id. č. 3, s nukleotidy 1 až 1953, která kóduje do chloroplastu směrovanou β-amylázu, nebo sekvence, která má alespoň 65% nebo větší homologii se sekvencí id. č. 3 a která kóduje do chloroplastu směrovanou β-amylázu.

Výhodně jsou uvedenými sekvencemi nukleové kyseliny sekvence mRNA, cDNA nebo genomová DNA.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob zvýšení nebo snížení aktivity β-amylázy v rostlině, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje kroky, kdy se do rostlinného genomu stabilně vloží chimérický gen, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci a kódující sekvenci pro β-amylázu, a regeneruje se rostlina se změněným genomem, přičemž sekvence kódující plastidovou směrovací sekvenci obsahuje výše uvedenou sekvenci id. č. 1. Výhodně je kódující sekvencí sekvence nukleové kyseliny id. č. 2, která je kódující sekvencí pro β-amylázu. Výhodně je sekvencí nukleové kyseliny sekvence nukleové kyseliny id. č. 3.. Výhodně je enzymem neplastidová β-amyláza. Výhodně chimérický gen dále obsahuje kódující sekvenci pro enzym ze souboru zahrnujícího sacharózasyntázu, ADPG pyrofosforylázu, syntázu škrobu, větvící enzym, α-amylázu, isoamylázu, neplastidovou β-amylázu, α-glykosidázu, fosfory lázu škrobu a disproporcionační enzym. Výhodně chimérický gen dále obsahuje promotor, přičemž promotorem je sekvence nukleové kyseliny, která je zde uvedená jako sekvence id. č. 8, nebo která má alespoň 6% homologii se sekvencí id. č. 8 a má stejnou funkci, přičemž sekvence nukleové kyseliny odpovídá na stimul a hladina exprese produktu je proměnná podle odezvy na stimul aplikovaný na sekvenci nukleové kyseliny.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob směrování proteinů nebo enzymů do rostlinného plastidů, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje kroky, kdy se do rostlinného genomu stabilně vloží chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci a kódující sekvenci pro protein nebo enzym a regeneruje se rostlina se změněným genomem, přičemž proteinem nebo enzymem je jeden nebo více proteinů nebo enzymů působících v metabo-4 CZ 303574 B6 lické dráze zvolené ze souboru zahrnujícího syntézu lipidů, fotosyntézu, metabolizmus aminokyselin, fixaci dusíku, fixaci uhlíku nebo syntézu sacharidových polymerů, nebo protein nebo enzym udělující rostlině určitý charakteristický znak, přičemž plastidová směrovací sekvence je kódována sekvencí nukleové kyseliny id. č. 1.

V JliMUllV JV VilUl Uauvi ulivixj lak zvolen ze souboru znaků nahrnujícího rezistenci vůči herbicidům a rezistenci vůči škůdcům.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob zvýšení nebo snížení množství škrobu produkovaného transgenní rostlinou, kterážto rostlina již vykazuje zvýšení nebo snížení enzymové aktivity v metabolické dráze biosyntézy škrobu v důsledku genetické transformace, jehož podstata spočívá v tom, že se rostlina transformuje nukleovou kyselinou, která obsahuje sekvenci id ě. 1 a kóduje do plastidu směrovanou β-amylázu.

Výhodně je do plastidu směrovaná β-amyláza kódována sekvencí nukleové kyseliny obsahující sekvenci id. č. 2. Výhodně je transformovanou rostlinou rostlina transgenního bramboru trans15 formovaná genem pro adenosindifosfoglukózapyrofosforylázu. Výhodně chimérický gen dále obsahuje promotor zvolený zc souboru zahrnujícího zkrácený nebo úplný promotor 35S z viru mozaiky květáku, promotor z rubisco, promotor plastocyaninu z hrachu, promotor nopaiinsyuíázy, promotor chlorofyl a/b vazebného proteinu, promotor gluteninu s vysokou molekulovou hmotností, promotor α,β-gtiadinu, promotor hordeinu a promotor patatinu. Výhodně kódující sekvence enzymu v chimérickém genu vede ke stimulaci nebo utlumení aktivity enzymu. Výhodně je stimulem přítomnost nebo nepřítomnost světla a/nebo proměnlivá hladina cukru. Výhodně je stimulem vývojově řízený stimul. Výhodně je cukrem jeden nebo více cukrů zvolených ze souboru zahrnujícího glukózu a sacharózu. Výhodně je cukrem sacharóza,

Předmětem vynálezu je rovněž chimérický gen obsahující sekvenci id. č. 1.

Výhodně uvedeným chimérickým genem gen, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující sekvenci enzymu zapojeného v metabolické dráze degradace Škrobu, přičemž enzym je kódován sekvencí id. ě. 2.

Předmětem vynálezu je rovněž rostlinná buňka transformovaná sekvencí nukleové kyseliny id. č. 1 nebo id č. 3.

Předmětem vynálezu je rovněž semeno rostliny transformované jednou nebo více sekvencemi nukleových kyselin id. č, 1 nebo id. ě, 3.

Předmětem vynálezu je rovněž rostlina obsahující uvedenou rostlinnou buňku. Výhodně je uvedená rostlina zvolená ze souboru zahrnujícího brambor, pšenici, kukuřici, ječmen, rajče, rýži, hrách, sóju, podzemnici olejnou, maniok, yam, banán a tabák.

Podle prvního aspektu vynálezu se způsob podle vynálezu užívá ke změně metabolismu listu, aby vněm byl akumulován škrob nebo aby z něho byl škrob mobilizován, takže tento způsob mění relaci zdroj-místo spotřeby v rostlině jako celku. Toho lze dosáhnout poskytnutím směrovací sekvence a sekvence nukleové kyseliny kódující enzym metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu, řízené vhodným promotorem. Vhodný výběr promotoru poskytne rostliny se zvýšenou nebo sníženou hladinou škrobu v listech, což může být užitečné např. pro tabákový průmysl, nebo alternativně povede ke změnám výnosu škrobu v různých jiných rostlinných pletivech jako jsou hlízy, plody a kořeny, po modifikaci vztahu source-sink v rostlině.

V tomto provedení vynálezu vhodný promotor řídí expresi plastidové směrovací sekvence a kódující sekvence enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu v celé rostlině, jde o tzv. konstitutivní expresi, a nebo specificky jen v listech. Takové změny mají výrazný účinek, takže se mění obsah škrobu a/nebo výnos orgánů rostliny.

Výhodný promotor schopný řídit expresi ve všech rostlinných pletivech je promotor z genu 35S viru mozaiky květáku. Pro expresi v listech je výhodný promotor z genu pro malou podjednotku

-T-’ ribulózabisfosfátkarboxylázy nebo genu pro plastokyanin z hrachu. Odborníkovi jsou známy další vhodné promotory pro konstitutivní expresi nebo pro specifickou expresi v listech jako je např. promotor nopalinsyntázy nebo promotor genu pro protein vázající chlorofyl a/b.

Kódující sekvence, nebo její část, enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu je uspořádána ve směru shodném s normálním čtecím rámcem, tzn. v uspořádání „sense“, nebo ve směru opačném k normálnímu čtecímu rámci, tzn. v uspořádání „antisense“. Zesilování nebo zeslabování enzymové aktivity pomocí techniky „sense“, „antisense“ nebo tzv. kosuprese (tato technika byla popsána DNAP v Evropských patentech 0465572 a 0647715).

Ve druhém aspektu vynálezu se způsob podle vynálezu užívá ke změně metabolismu škrobu v zásobních orgánech tak, aby se obsah škrobu zvýšil a/nebo se získal škrob ve vhodné formě, která je požadována pro určitý průmyslový proces. K takovým průmyslovým procesům patří např. výroba papíru, léčiv, textilií, barviv a stavebních hmot, dále výroba pečivá, mléčných produktů a občerstvení, výroba konzervovaných, sušených nebo instantních potravin, výroba sladu a také výroba sirupů a alkoholu.

V prvním nebo druhém aspektu vynálezu je výhodným enzymem pro použití v chimérickém genu podle vynálezu jeden z enzymů metabolické dráhy degradace škrobu, tj. enzym degradující škrob. Výhodně chimérický gen obsahuje β-amylázu směrovanou do chloroplastu (dále označovanou jako ct β-amylázu) a výhodněji obsahuje β-amylázu pocházející zArabidopsis thaliana (dále označovanou jako At ct β-amylázu), viz také sekvence id. č. 3. Sekvence homologní se sekvencí At ct β-amylázy, které jsou získatelné z rostlin jako je brambor, tabák, pšenice, kukuřice a ječmen, se mohou také použít. Standardní postupy klonování hybridizaci nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) se mohou užít k izolaci požadovaných sekvencí z těchto rostlin, metody klonování molekul byly popsány např. v příručce Sambrook a kol. 1990, a metody PCR byly popsány např. v publikaci Innes a kol., 1990. K dalším enzymům degradujícím škrob, jejichž jedna nebo více kódujících sekvencí by byly vhodné pro použití splastidovou směrovací sekvencí, patří α-amyláza, disproporcionační enzym, enzym rušící větvení, fosforyláza škrobu, α-glukosidáza a neplastidová β-amyláza.

Ve druhém aspektu vynálezu je výhodný promotor, který řídí expresi specificky v zásobních orgánech rostlin, vybrán ze skupiny genů obsahující gen pro gluteniny s vysokou molekulovou hmotností zendospermu pšenice, gen pro α,β-gliadin zendospermu pšenice, gen pro hordein z endospermu ječmene, gen pro patatin z hlíz bramboru. Odborníkovi jsou známy i další vhodné promotory.

V obou aspektech vynálezu je možné dosáhnout toho, aby změny metabolismu v pletivu nebo změna typu nebo vlastností škrobu byly reakcí na stimul, tj. indukovatelné, a sice tím, že se použije indukovatelný promotor zde popsaný jako sekvence id. č. 8. Tak např. indukovatelnost promotoru světlem může být využita k manipulaci semen indukcí genů jako je bamáza (příkladem je WO 98/10081) k ovlivnění vývoje pylu, nebo k ovlivnění genů, které nereagují na světlo, v procesech, které jsou jinak na světle závislé, jako je zráni plodů nebo klíčení semen. Světlem indukovatelný promotor může být užit také k zapínání genů, které ovlivňují produkci sekundárních metabolitů v listech, např. produkci alkaloidů. Světlem indukovatelný promotor může být dále užit k manipulaci genů enzymů biosyntézy škrobu v listech nebo jiných fotosyntetických pletivech, nebo např. k zapínání genů po odstranění hlíz, např. pro skladování v temnu. Indukovatelnost promotoru cukrem může být využita např. k regulaci genů vyvíjejících se hlíz nebo jiných nefotosyntetických pletiv, např. genů rezistence ke škůdcům a/nebo genů, které ovlivňují posklizňovou kvalitu úrody. Tak např. u bramboru by byly velmi výhodné geny rezistence k plísním a hnilobám, které by byly výhodně klonovány s promotorem indukovatelným cukrem. Alternativně indukovatelnost promotoru cukrem může být využita k řízení exprese genů pro selekční markéry ve tkáňových kulturách.

-6 CZ 303574 136

Odborník snadno najde v sekvenci id. ě. 8 element reagující na cukr a/nebo světlem indukovatelný element, a sice užitím známých metod, např. deleční studie. Tak např. Pwee a Gray (1993) popsali deleční studii genu plastokyaninu hrachu užitím markerového genu, ve které stanovili operativní úseky promotoru.

c

Metody zde popsané nebo popsané např. v laboratorní příručce Sambrook a kol. (1989) nebo Gelin a Stanton (1995) pro klonování genových sekvencí a jejich vkládání do vhodných nosičů (vektorů, plazmidů apod.)jsou odborníkovi dostatečně známy, aby je mohl prakticky realizovat.

io Chimérické geny nebo geny výše popsané se mohou vnést samotné nebo společně s dalšími chimérickými geny popsanými výše. V případě výše popsaných příkladů provedení vynálezu, kdy se užívá první chimérický gen kódující enzym metabolické dráhy degradace škrobu, druhý chimérický gen může obsahovat např. sekvenci nukleové kyseliny kódující enzym metabolické dráhy biosyntézy Škrobu, taktéž řízenou vhodným promotorem a vhodným terminátorem. Pro15 motor a/nebo terminátor druhého chimérického genu může být stejný nebo odlišný od promotoru a/nebo terminátoru prvního chimérického genu. Vhodné sekvence kódující enzymy metabolické dráhy biosyntézy škrobu jsou sekvence nukleové kyseliny kódující sacharózasyntázu, ADPG pyrofosfoiylázu, syntázu škrobu, případně k nim patří i větvicí enzym, a-amyláza, isoamyláza, neplastidová β-amyláza, α-glukosidáza, fosforyláza škrobu a disproporcionační enzym.

Metody po vnášení jednoho nebo více chimérických genů do rostliny byly popsány a obsahují konstrukci binárního vektoru s chimérickými geny navzájem spojenými v jedné molekule nukleové kyseliny, kotransformaci užitím dvou nebo více odlišných buněk Agrobacterium, např. s odlišnými binárními vektory obsahujícími odlišné chimérické geny, nebo transformací rostliny, která již obsahuje chimérický gen, druhým odlišným chimérickým genem, tzv. retransformaci. V tomto druhém případě způsob selekce transgenních rostlin po vnesení druhého chimérického genu musí být odlišný od způsobu selekce použitého po vnesení prvního chimérického genu. K vhodným selekčním markérům patří geny rezistence k hygromycinu, kanamycinu, sulfonamidu a herbicidu Basta, Lze také užít biologického postupu, a sice křížení dvou rostlin, z nichž každá obsahuje jeden chimérický gen.

Použití dvou konstruktů chimérických genů je vhodné ke změně obsahu škrobu již transformované rostliny, která vykazuje významné zvýšení aktivity prvního enzymu a následnou změnu v syntéze škrobu.

Tudíž předkládaný vynález dále poskytuje způsob změny, v transgenních rostlinách sjiž zvýšenou nebo sníženou enzymovou aktivitou v důsledku genetické transformace, dalšího enzymu, aby byl tento enzym aktivován nebo tlumen, a tudíž by bylo zvýšeno nebo sníženou množství škrobu produkovaného v retransformované rostlině.

Výhodně první transformovaná rostlina je rostlina mající zvýšenou aktivitu enzymu v metabolické dráze biosyntézy škrobu. Příkladem pokusu o zvýšení obsahu škrobu v rostlině je transgenní brambor transformovaný genem pro ADPG-PPázu, např. glgCló (víz např. WO 91/19806). Zvýšení obsahu škrobu v těchto rostlinách bylo relativně malé. Tato první transformovaná rost45 lina byla vhodně retransformována chimérickým genem pro degradaci škrobu, obsahujícím např. At ct β-amylázu. Protein glgCló je exprimovaný v hlízách první transformované rostliny a vede ke zvýšení aktivity ADPG-PPázy a tudíž ke zvýšení toku uhlíku do škrobu. Výhodně exprese chimérického genu At ct β-amylázy nebo jeho části v retransformováných hlízách vede k utlumení aktivity At ct β-amylázy, buďto kosupresí nebo „antisense“ technologií, a tudíž ke zvýšení akumulace škrobu.

Výhodně je exprese druhého enzymu specificky řízena v hlízách. Vhodným promotorem pro expresi chimérického genu At cc β-amylázy specifickou pro hlízy je promotor z genu pro patalin.

První transformovaná rostlina bramboru exprimující glgCló je rezistentní ke kanamycinu, tudíž konstrukt binárního vektoru pro chimérický gen At ct [3-amylázy nese odlišný gen rezistence, např. výhodně gen rezistence k sulfonamidu. Zvýšená tvorba škrobu v hlízách bramboru by byla prospěšná např. pro výrobce bramborových lupínků, kdy 1 % nárůst sušiny bramboru představuje 4% nárůst výrobku.

Výroba bramborových lupínků může posloužit i k ilustraci dalšího přínosu vynálezu. Když jsou bramborové hlízy skladovány při teplotě nižší než 8 °C, akumulují se redukující cukry, glukóza a fruktóza, vznikající redukující cukry reagují s aminokyselinami v MaiNardově reakci, ěímž vzniká hnědé zabarvení a nežádoucí pachuť produktu. Vnesení takového chimérického genu do bramboru, který by zastavil rozklad škrobu a tudíž akumulaci redukujících cukrů, by bylo prospěšné pro výrobce pochutin,. Výhodně takový chimérický gen obsahuje kódující sekvenci, nebo její část, ct β-amylázy v konstruktu pro kosupresi nebo „antisense“ inhibici, řízenou vhodným promotorem a terminátorem. Vhodným promotorem je promotor z patatinového genu z hlíz bramboru. Výhodně může být místo ct β-amylázy užit kterýkoliv zvýše zmíněných genů pro enzym degradující škrob.

Indukovatelný promotor v sekvenci id. č. 8 může být také v konstruktu použit, jestliže je požadována koordinovaná exprese ve vyvíjejícím se listu a vyvíjející se hlíze, jelikož patatinový promotor je také indukovatelný cukrem (Rocha-Sosa eta 1„ 1989). Podobně sekvence pro chloroplastový směrovací polypeptid, tj. sekvence id. č. 1., může být také užita s jakýmkoliv jiným genem, který postrádá svou vlastní směrovací sekvenci a u kterého je požadována plastidová lokalizace.

Výše uvedené příklady slouží k ilustraci možných přínosů užití předkládaného vynálezu. Odborníkovi je zřejmé, že existuje značné množství kombinací genů a rostlin, na kterých je možné vynález uplatnit,

K výhodným genovým kombinacím patří ct β-amyláza s jedním nebo více geny po sacharózosyntázu, ADPG pyrofosforylázu, syntázu škrobu, větvicí enzym, α-amylázu, isoamylázu, neplastidovou β-amylázu, α-glukosidázu, fosfory lázu škrobu a disproporcionační enzym, jejichž sekvence jsou odborníkovi známy. Alternativně může být užita směrovací sekvence ct β-amylázy s jedním nebo několika z výše uvedených genů.

K rostlinám, které mohou být takto transformovány, výhodně patří brambor, pšenice, kukuřice, ječmen, rajče, rýže, hrách, sója, podzemnice olejna, maniok, yam, banánovník a tabák.

V další části je předkládaný vynález popsán formou příkladů, a sice vzhledem k výhodným provedením izolace cDNA pro β-amylázu zArabidopsis thaliana a inkorporace této DNA do rostlin tabáku a bramboru. V příkladech jsou také ukázána výhodná provedení promotoru reagujícího na stimul ajeho aktivity v transgenní rostlině.

Pro lepší vysvětlení a snadnější realizaci vynálezu budou dále uváděny odkazy na následující obrázky ilustrující výhodná provedení vynálezu.

Popis výkresů

Obr. 1.: Ukazuje výsledky radioaktivního in vitro značení importu translačních produktů na SDS-PAGE gelu a následované fluorografíí. Legenda: markér (Standard) molekulové hmotnost dráha M, translační produkty - dráha Ir, chloroplasty reizolované a ošetřené termolysínem po inkubaci - dráha C, stromatální frakce - dráha S, promyté thylakoidy - dráha T, termolysínem

-8CZ 303574 B6 ošetřené thylakoidy - dráha tT, frakce vnitrní membrány - dráha I, frakce vnější membrány dráha O. Domnělý prekurzor - P, intermediát -1 a zralá forma β-amylázy - M. Kilodaltony - K.

Obr. 2.: Ukazuje účinek světla a účinek světla a cukru na expresi transkriptů ct β-amylázy v semenáčcích Arabidopsis ihuiiuriu. Obr. 2a ukazuje analýzu Northemovým přenosem (Northnem blot) celkové RNA z 5 týdnů starých rostlinek Arabidopsis thaliana pěstovaných v půdě a vystavených 2 dnům souvislého osvětlení - L, 2 dnům souvislé tmy - D, 2 dnům světla následovaným dalšími 3 dny světla - LL, a nebo 2 dnům tmy následovaným 3 dny světla -DL. Obr. 2b ukazuje Northnerovou analýzu celkové RNA z 5 týdnů starých rostlinek Arabidopsis thaliana pěstovaných in vitro, které byty přeneseny buďto do vody a vystaveny po 3 dny souvislému osvětlení - WL? nebo byly přeneseny do 5% sacharózy a vystaveny po 3 dny nepřerušené tmě SD nebo 3 dny nepřerušenému světlu - SL, nebo byly přeneseny do 5% glukózy a vystaveny po 3 dny nepřerušené tmě - GD nebo 3 dny nepřerušenému světlu - GL. Northern bloty byly hybridizovány s radioaktivně značeným inzertem ct-B/wy cDNA a pak podrobeny autoradiografn (horní panely, odpovídající formaldehydové agarózové gely obarvené ethidiumbromidem jsou ukázány na dolních panelech).

Obr. 3 ukazuje schématické znázornění T-DNA chimérického genu ct β-amylázy promotor GUS zkonstruovaného v příkladu 3, kde NosP představuje promotor nopalinsyntázy, NosT terminátor nopalinsyntázy, BR je invertovaná repetice pravé hranice a BL je invertovaná repetice levé hranice T-DNA z ρΒΙΙΟΙ, ΝΡΤΪΙ je kódující sekvence neomycinfosfotransferázy II, GUS je kódující sekvence β-glukuronidázy, fragmenty promotoru ct β-amylázy jsou ukázány jako čárkované obdélníčky, přemosťující fragmenty Xhol - BamHI amplifikované PCR jsou uvedeny černě.

Obr. 4 ukazuje účinek světla a sacharózy na aktivitu GUS exprimovanou z chimérického genu „ct Brny - GUS promotor“ v semenáčcích tabáku.

Obr. 5 ukazuje plazmidovou mapu donorového vektoru pDV35S(SK)V.

Obr. 6 ukazuje plazmidovou mapu donorového vektoru pDV02000.

Obr. 7 ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP 10431, kde 35S představuje 35S promotor z CaMV, ct bamy představuje úplnou cDNA ct β-amylázy, 35S představuje 35S terminátor z CaMV, RB je pravá hranice binárního vektoru pBibPlus, colElori je bakteriální počátek replikace colEl z plazmidu RK2, nptll je gen neomycinfosfotransferázy pro bakteriální rezistenci ke kanamycinu, LB je levá hranice binárního vektoru, kan je rekombinantní gen rostlinné neomycinfosfotransferázy nutný pro rezistenci rostlin ke kanamycinu.

Obr. 8 ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP10432, kde byly užity shodné zkratky jako na obr. 7.

Obr. 9 ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP02431, kde byly užity shodné zkratky jako na obr. 7, až na patp představující promotor patatinu třídy I z vektoru pDV02000 podle obr. 6 a nost je terminátor nopalinsyntázy.

Obr. 10 ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP02432, kde byly užity shodné zkratky jako na obr. 9.

Přehled sekvencí uvedených v seznamu sekvencí:

Sekvence id. č. 1 je sekvence nukleové kyseliny schopné směrovat kódující sekvenci do rostlinného plastidu, zejména chloroplastu.

Sekvence id. č. 2 je nukleová kyselina kódující β-amylázu.

Sekvence id. č. 3 je úplná sekvence β-amylázy směrované do chloroplastu (ct (3-amylázy). Sekvence id. Č. 4 a 5 jsou oligonukleotidové primery použité k amplifikaci v příkladu 3. Sekvence id. č. 6 a 7 jsou oligonukleotidové primery použité k amplifikaci v příkladu 4. Sekvence id. č. 8 je nukleová kyselina reagující na stimul, konkrétně na světlo a/nebo cukr.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Izolace a charakterizace chloroplastové (3-amylázy Arabidopsis thaliana

Sekvencování inzertu cDNA v pBmy81

Prohledávání databáze nukleotidových sekvencí DNA fragmentu velikosti 37 kb z chromozómu IV Arabidopsis thaliana v kosmidu G16599 (Bevan a kol., 1998) pomocí programu BLASTIN odhalilo přítomnost genu sdílejícího významnou homologii s extrachloroplastovou β-amylázou z Arabidopsis, ječmene, kukuřice, sóji a rýže. Průzkum také identifikoval několik 3'-koncových EST sekvencí, z nichž jedna, EST 81E10T7 (Newman a kol., 1995), dále nazývaná pBmySl, byla identická asi v úseku 300 nukleotidů. Klon EST 81E10T7 byl získán z Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) DNA Stock Center (Ohio University, USA). „Nested“ sada Bal31 delečních subklonů, zahrnující cDNA inzert v pBmy81, byla užita jako templát v dvojřetězcové sekvenační PCR s univerzálními fluorescenčně značenými primery. SekvenaČní reakce byla analyzována na automatickém sekvenačním zařízení Applied Biosystems Model 373A. Nukleotidová sekvence cDNA inzertu v klonu pBmy81 je zde uvedena jako sekvence id. č. 3. Konstrukt pBmy81 byl firmou Advanced Technologies (Cambridge) Limited, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 4WA, uložen dne 4. Srpna 1998 v souladu s Budapešťskou dohodou v Národní sbírce mikroorganismů, National Collection of Industrial and Marině Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Skotsko, a sice jako vzorek č. NCIMB 40964.

Identifikace domnělého chloroplastového směrovacího signálu

CDNA inzert pBmy81 obsahuje 36 netranslatovaných nukleotidů na 5'-konci, otevřený čtecí rámec (ORF), který kóduje protein složený z 548 aminokyselin, a 3'-koncový netranslantováný úsek (UTR) velikosti 232 bp. Protein kódovaný inzertem pBmy8l má predikovanou molekulovou hmotnost 61 kDa a sdílí značnou aminokyselinovou podobnost s rostlinnou extrachloroplastovou β-amylázou z kukuřice, rýže, ječmene, sóji a topinamburu. Avšak protein kódovaný pBmy81 se liší od všech dosud popsaných β-amyláz tím, že obsahuje jedinečnou N-koncovou extenzi mající vlastnosti chloroplastového směrovacího signálu, tj. vysoký obsah šeřinu (16 %), threoninu (10 %) a pozitivně nabitých aminokyselinových zbytků (15 %) (Baier a Dietz, 1997). Tři domény, které jsou rozlišující charakteristikou chloroplastových směrovacích signálů (Schatz Dobberstein, 1996), byly identifikovány v signální sekvenci: nenabitá amino-koncová doména, centrální doména bohatá na hydroxylované aminokyseliny, karboxy-koncová doména s potenciálem vytvářet amfifilní β-řetězec.

CDNA inzert v pBmy81 kóduje β-amylázu směrovanou do chloroplastu

- 10CZ 303574 B6

Z 50 až 60 g nadzemní části rostlin hrachu (Pisum sativum L. var. Feltham First) byly izolovány chloroplasty pomocí gradientu Percollu. Rostliny byty pěstovány a izolace chloroplastů byla provedena jak bylo popsáno v Mould a Gray (1997a).

Plazmid pBmySl byl linearizován restrikčním štěpením Not! a pak by! transfekován in vitm užitím T7 RNA polymerázy. Radioaktivně značený prekurzorový protein, obsahující ³⁵S-methionin a ³⁵S-cystein, byl syntetizován v translačním systému z pšeničných klíčků v podstatě shodně s postupem v Mould a Gray (1997b).

io Import radioaktivně značených in vitro translačních produktů byl proveden stejně jak popsali Mould a Gray (1997b). Po inkubaci s importem byly intaktní chloroplasty ošetřeny thermolysinem (0,2 mg/ml výsledná koncentrace v importovém pufru) a současně inkubovány 30 minut na ledu, pak byla proteázová reakce zastavena přidáním EDTA do výsledné koncentrace 50mM v importovaném pufru. Chloroplasty byly re izolovány přes polštář 40% Percollu v importovém pufru a pak opláchnuty v importovém pufru (Mould a Gray, 1997b). Alikvot (1/10) vzorku thermolysinem ošetřených chloroplastů by! odebrán pro analýzu a zbytek byl frakcionován v podstatě postupem, který popsali Schneil a Blobel (1993). Vzorky thermolysinem ošetřených chloroplastů, frakce stromatu, thylakoidů a thermolysinem ošetřených thylakoidů byly kvantifikovány na SDS-PAGE a pak barvením Coomasie modří a vyhodnoceny denzitometrií odpovídajících pro20 teinových pásů (jako standardy byly užity podjednotky ribulózabisfosfátkarboxyláty a proteiny světlosběmého komplexu). Ekvivalentní množství těchto frakcí (přibližně odpovídající 2 % chloroplastů získaných na gradientu Percollu) a 505 frakcí vnitřní a vnější membrány bylo analyzováno elektroforézou na 10% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS, a pak fluorografií. Výsledky (obr. 1) ukázaly, že hlavní translační produkt (dráha Tr) měl velikost přibližně 58 kDa.

Když byly izolované intaktní chloroplasty hrachu inkubovány s radioaktivně značeným proteinem v přítomnosti ATP, byly detekovány polypeptidy velikosti 50 kDa a 48 kDa (dráha C). Rezistence těchto polypeptidu k degradaci exogenně přidaným thermolysinem ukazuje, že jde o produkty importu radioaktivně značeného proteinu. Frakcionace intaktních thermolysinem ošetřených chloroplastů na frakce stromatu, promytých thylakoidů, thermolysinem ošetřených thy30 lakoidů, vnitřní a vnější membrány, ukázala, že dva radioaktivně značené polypeptidy byly lokalizovány v stromatální frakci.

Příklad 2

Indukce genu ct β-amylázy z Arabidopsis thaliana sacharózou a světlem

Pro demonstraci indukce genu ct β-amylázy světlem rostliny Arabidopsis thaliana ekotypu Landsberg byly pěstovány ve skleníku pri režimu 18 hodin světla, 6 hodin tmy, 18 °C. Po 5 týd40 nech byla dvě plata se semenáčky přenesena do úplné tmy a dvě plata byla dále ponechána na kontinuálním světle. Po dvou dnech bylo po jednom platu rostlin adaptovaných na tmu a na světlo použito pro izolaci celkové RNA a druhé plato každé varianty bylo po další 3 dny ponecháno na kontinuálním světle.

Pro kombinovaný pokus sacharóza-světlo-tma byla semena Arabidopsis thaliana ekotypu Landsberg povrchově sterilizována, umístěna na MS agarové médium obsahující 1% sacharózu a pěstována v růstové komoře při režimu 18 hodin světla, 6 hodin tmy. 5 týdnů staré semenáčky byly přeneseny do sterilní vody nebo do 5% rozloku sacharózy nebo glukózy ve vodě. Tyto rostlinky pak byly ponechány po 3 dny buďto na kontinuálním světle nebo v kontinuální tmě.

Z každé pokusné varianty byla připravena celková RNA a analyzována Northemovým přenosem postupem jak popsali Eggermont a kol. (1996). Membrány s přenesenou RNA byly testovány se sondou, kterou byl cDNA inzert zpBmy81 po náhodném značení ³²P-dCTP postupem jak popsali Feinberg a Vogelstein (1983).

-ΤΓCZ 303574 Β6

Výsledky uvedené na obr. 2A ukazují, že transkripty c β-amylázy jsou indukovány ve tmě 5% sacharózou a v menším rozsahu 5% glukózou. Tato indukce je v přítomnosti cukrů navíc zesílena na světle. Tyto výsledky také ukázaly, že účinky světla a cukrů jsou navzájem nezávislé.

Příklad 3

Konstrukce fůze „promotor ct β-amylázy - GUS“

Promotorový fragment byl izolován z genu ct β-amylázy lokalizovaném v kosmidu G16599 (Bevan a kol., 1988) vyštěpením restrikčními enzymy. Vhodná restrikční místa v promotoru byla HindiII v pozici -1662 bp (počínaje 19179 bp minus řetězce sekvence id. č. 8), Sáli v pozici 1127 bp a Pstl v pozici -371 bp a Xhol v pozici +21 bp „downstream“ od iniciačního methioninu byla užita k izolaci tří promotorových fragmentů různých délek a sekvence tranzitního peptidu (A z kodonu ATG iniciace translace je číslován +1).

Fragment velikosti 294 bp (sekvence id. č. 1) genu pro ct β-amylázu lokalizovaného v kosmidu G16599 (Bevan a kol., 1998) byl amplifikován pomocí následujících oligonukleotidových primerů:

Sekvence id. č. 4:

PÍ: 5-ATT TCC TCG AGT TCT CTT ATC-3'

Sekvence id. č. 5:

P2: 5'-cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC-3'

V příměru PÍ podtržené báze odpovídají štěpnému místu Xho v pozici +21 bp, v primeru P2 báze vyznačené malými písmeny odpovídají nukleotidům přidaným pro vytvoření místa BamHI.

Chimérické geny „promotor ct β-amylázy - GUS byly vytvořeny trojitou ligací promotorového fragmentu, přemosťujícího PCR fragmentu naštěpeného Xhol a BamHI a GUS vektoru pBHOl (Jefferson a kol., 1987) naštěpeného HindlII-BamHI, Sall-BamHI nebo Pstl-BamHI (obr. 3). Konstrukty byly nazvány ΗβΟυΞ, 5βθυ5 a Ρβΰυ8.

Konstrukty chimérických genů byly přeneseny do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 triparentální konjugací (Bevan 1984) a pak vneseny do rostlin Nicotiana tabacum var. Samsun metodou transformace listových terčíků (Horsch a kol., 1985).

Příklad 3A

Indukce chimérického genu „promotor ct β-amylázy z Arabidopsis thaliana - GUS sacharózou a světlem v semenáčcích tabáku

Rostliny obsahující konstrukty I^GUS a Ρβΰυ8 exprimovaly vysoké hladiny GUS aktivity a semenáčky potomstva FI byly užity ke zkoumání indukce chimérických genů světlem a sacharózou. FI semena tabáku byla povrchově sterilizována, umístěna na MS agarové médium obsahující 1% sacharózu a pěstována v růstové komoře pří režimu 18 hodin světla, 6 hodin tmy. Dva až tři týdny staré semenáčky byly přeneseny do sterilní vody nebo do 5% roztoku sacharózy a pak byly ponechány po 3 dny buďto na kontinuálním světle nebo v kontinuální tmě. Extrakty celkového proteinu sloučené z 10 až 14 semenáčků byly analyzovány na aktivitu GUS užitím fluorogenního substrátu 4-methylumbelliferylglukuronidu (4-MUG), jak popsali Jefferson a kol. (1987). Pro oba konstrukty hladiny GUS aktivity u semenáčků exponovaných na kontinuálním světle bez přítomnosti sacharózy byla podobná hladině GUS aktivity u semenáčků exponovaných

- 12 CZ 303574 B6 sacharóze bez přítomnosti světla (obr. 4), Avšak expozice semenáčků současně sacharóze a kontinuálnímu světlu zvýšila hladinu GUS aktivity dvakrát až třikrát. Tyto výsledky jsou v dobré shodě s výsledky pokusů se samotným genem ct β-amylázy, které ukázaly, že indukováte 1 nost genu světlem a sacharózou jsou nezávislé procesy.

Histochemické barvení na GUS ukázalo, že aktivita byla detekována v děložních lístkách semenáčků starých dva týdny, ale žádná aktivita nebo velmi nízká byla detekována v prvním pravém listu nebo ve stonku a kořenu. U semenáčků starých čtyři týdny byla GUS aktivita navíc detekována v prvním pravém listu a ve stonku. Barvení na GUS bylo zejména spojeno s buňkami parenio chymu bohatého na chloroplasty (tj. chlorenchymu) lokalizovanými mezi xylémovými paprsky a mezi xylémem a floémovými svazky, které vytvářejí vnitřní floem ve stonku.

Příklad 4

Konstrukce plazmidů s ct β-amylázou pro transformaci listů tabáku a bramboru

Místně cílená mutageneze byla užita k přeměně místa Kpní lokalizovaného v pozici 2302 bp v plazmidů pBm8l na místo BamHI. Byly připraveny následující oligonukleotidové primery:

Sekvence id. č. 6:

P3: 5- GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC-3' a

Sekvence id. č. 7:

P4: 5'- GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA GC -3' a byly použity se soupravou pro místně cílenou mutagenezí Quick Change (Promega). Postup byl proveden podle protokolu výrobce.

Kódující sekvence ct β-amylázy plné délky byla vystřižena z mutovaného plazmidů pBmy81 štěpením BamHI a pak purifikována užitím soupravy GeneClean (BIO 101). Fragment BamHI byl ligován do místa BamHI donorového vektoru pDV35S(SK)V (viz obr. 5) a pDV02000 (viz obr. 6). Vektor pDV35S(SK)V je složen z plazmidů pBluescript (Stratagene) nesoucím 35S CaMV promotor a 35S terminátor, tyto konstrukty jsou odborníkům známy (viz např. Oděli a kok, 1985). Vektor pDV02000 je složen z plazmidů pBluescript a 1,4 kbp fragmentu patatinový promotor - nopalinsyntázový terminátor. Odborník snadno připraví podobné konstrukty ze známých sekvencí (viz např. Liu a kok, 1990). Plazmidy s kódující sekvencí v obou orientacích, tj. jak sense tak i antisense vzhledem k promotoru, byly izolovány a chimérické geny ct β-amylázy byly subklonovány z donorového vektoru do binárního vektoru pBinPlus (van Engelen a kol., 1995). Mapy těchto plazmidů jsou uvedeny na obr. 7 až 10.

Příklad 5

Transformace nebo re transformace rostlin

Rostliny bramboru byly transformovány metodou kokultivace listových terčíků, jak již popsal Horch (1985). Výše popsané binární vektory byly přeneseny do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 metodou elektroporace a kultury Agrobacterium byly použity k transformaci, kterou byly připraveny rostliny, které po regeneraci nesly chimérické geny popsané v příkladu 4.

Binární plazmid obsahující chimérický gen „patatinový promotor - ct β-atnyláza- nopaiinsyntázový terminátor“ byl použit k transformaci rostlin bramboru již nesoucích chimérický gen ADPG PPázy g/gC 16 z E. coli metodou kokultivace listových terčíků.

Příklad 6

Konstrukce plazmidů se směrovacím peptidem AT ct β-amylázy

Plastidová směrovací sekvence AT ct β-amylázy je obsažena ve fragmentu velikosti 294 bp uvedeném zde jako sekvence id. č. 1. Pro izolaci tohoto fragmentu z plazmidů popsaných v příkladu 3 byla užita PCR nebo restrikční štěpení, ěímž se získal fragment obsahující 35S CaMV promotor a plastidovou směrovací sekvenci nebo patatinový promotor a plastidovou směrovací sekvenci. Chimérické geny byly zkonstruovány ligací sekvencí kódujících proteiny nebo enzymy jakožto translačních fúzí s transitním (směrovacím) peptidem. Trans lato váné proteiny pak byly transportovány do plastidů, kde poskytly buďto nové aktivity nebo ovlivnily stávající metabolické dráhy.

Seznam použité literatury

Ainsworth, C., Clark, J. and Balsdon, J. (1993). Plant. Mol. Biol., 22, 67-82.

Baier, M. and Dietz, K. J., (1997) Plant J. 12, 179-190

Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721

Bevan, M. W. et al. (1988). Nátuře, 391,485-488.

Chán, MT., Chao, YC. and Yu, SM. (1994), J. Biol. Chem., 269, 17635-17641.

Chen, MH., Liu, LF., Chen, YR., Wu, HK. and Yu, SM. (1994).

Plant J., 6, 625-636.

Daussant, J., Zbaszyniak, B., Sadowski, J. and Wiatroszak, I. (1981). Planta, 151, 176-179. Denyer, K., Clarke, B., Hylton, C., Tatge, H. and Smith, A. M. (1996), Plant J., 10, 1 135-1143. Duwening, E., Steup, M., Willmitzer, L. and Kossmann, J. (1997).

Plant J., 12, 323-333.

Eggermont, K., Goderis, I. J. and Broekaert, W. F. (1996).

Plant Mol. Biol. Rep. 14, 273-279.

Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983). Anal. Biochem. 132, 6-13.

Gelvin, S. B. and Schilperoort, R. A. (1995). Plant Molecular Biology Manual. 2^nd edition. Kluwer Academie Publishers, The Netherlands.

Hildebrand, D. F. and Hymowitz, T. (1981). Physiol. Plant, 53, 429-434.

Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffman, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Swaley, R. T. (1985) Science, 227. 1229-1231.

Hylton, C. M., Denyer, K., Keeling, P. L., Chang, MT. and Smith, A. M. (1995). Planta, 198, 230-237.

Innes, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J. (1990). PCR Protocols. Publisher: Academie Press.

James, M. G., Robertson, D. S. and Myers, A. M. (1995), Plant Cell 7, 417-429.

Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. and Bevan, M. W. (1987) EMBO, J. 6. 3901-3907.

Kakefuda, G., Duke, S. H. and Hostak, Μ. H. (1986). Planta, 168, 175-182.

Klosgen, R. B. and Weil, J. H. (1991) Mol. Gen Genet., 225, 297-304

Li, B., Servaítes, J. C. and Geiger, D. R. (1992). Plant Physiol., 98, 1277-1284.

Liu, X. J„ Prát, S., Willmitzer, L. and Frommer, W. B. (1990) Mol. Gen. Genet., 223, 401-406.

Mita, S., Suzuki-Fujii, K. and Nakamura, K. (1995) Plant Physiol. 107, 895-904.

Mita. S., Murano, N., Akaike, M. and Nakamura, K. (1997). Plant J., 11, 841-851.

- 14CZ 303574 B6

Mould, R. M. and Gray, J. C. (1997a). In Cell Biology: A Laboratory Handbook, second edition, Volume 2. (Celíš, J. E. ed). New York: Academie Press, pp. 81-86.

Mould, R. M. and Gray, J. C. (1997b). In Cell Biology: A Laboratory Handbook, second edition, Volume 2. (Cells, J. E. ed). New York: Academie Press, pp, 286-292.

Nakamura, K.., Ohto, M., Yoshida, N. and Nakamura, K. (1991).

Plant Physiol., 96, 902-909.

Neuhaus, Η. E., Henrichs, G. and Schiebe, R. (1995). Planta, 194, 454—460.

Newman, T. et al. (1994). Plant Physiol., 106, 1241-1255.

Nielson, T. H., Deiting, U. and Stitt, M. (1997). Plant Physiol., 113, 503-510.

ío Oděli, J. T. Nagy, F. and Chua, N. H. (1985) Nátuře, 313, 810-812.

Peavey, D. G,, Steup, M. and Gibbs, M. (1977). Plant Physiol., 60, 305-308.

Pwee, K-H. and Gray, J. C. (1993) Plant J. 3, 437-449.

Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J. and Willmitzer, L. (1989) EMBO. 8, 23-29.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. Publisher: Cold Spring Harbour.

Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996). Science, 271, 1519-1526.

Schnell, D. J. and Blobel, G. (1993). J. Cell. Biol., 120, 103-115.

Sonnewald, U., Basner, A., Greve, B. and Steup, M. (1995).

Plant. Mol. Biol., 27, 567-576

Sweetlove, L. J., Burrell, Μ. M. and ap Rees, T. (1996), Biochem. J., 320,493-498.

Thomson, W. W. and Whatley, J. M. (1980) Ann. Rev. Plant. Physiol. 31, 375-394.

van Engelen, F. A., Molthoff, J. W., Conner, A. J., Nap, J-P., Pereira, A. and Stiekema, W. J.

(1995). Transgenic Res. 4,288-290.

van der Leij, F. R., Visser, R. G. F., Ponstein, A. S., Jacobsen, E. and Feenstra, W. J. (1991). Mol. Gen. Genet., 228, 240-248.

Wang, SM., Lue, WL. and Chen, J. (1996). Plant Mol. Biol., 31, 975-982.

Wang, SM., Lue, WL., Huang, HW. and Chen, J. (1997), Plant Physiol., 113, 403^109.

CZ 303574 Bó

Doklad o uložení podle Budapešťské smlouvy

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICRO ORGANISM (PCT Rule 13i£i)

A. The indications made below relate to the microorganism referrcd to in the description on rané 22 . lineš 9/10
B. IDENTIFICATION OK DEPOSIT Funhcr deposit» lít identified on an addidoiud iheet
hune uf deposituy msbtution The National Collccdons for Industrial and Marině Bacteria Limited (NCIMB)
Addreax of dcpoauiy insotubon (indtidingpwtoi eodt and anatíry) 23 SL Maehar Drive Aberdceo AD2 IRY Scotland, United Kingdom
Pate of deposit 4 August 1998	Aeceuiun Number NCIMB 40964
C. ADDmONAL INDICATIONS/Wv* bloni //nor applicable) This mformcon i; cenónucd on addřoonal ihect
Please find enclosed copiés of the Reeeipt of Deposit and eopies of the viabilíty proofs from the Dcpositary Instltutiou. Name and Addresi of Depositor: Advanced Technologies (Cambridge) Limited, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 OWA, United Kingdom. * Chhracterístics: E. Coli XLI Blue MRF1 * Produced by: íosertlng 19S3bp sequence íor ct 0-amylase from Arabi dopsis thaliana ecotype Columbia insericd into a vector type puC type-pZLl (Gibco BRL) whlch is in an E. coli stradu XLI Blue MRF1 * Useíulue»: targeting a particolar B-amylaie to a chloroplast
D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if ihe indieaionterenotfor otldaignattdStates)
E. SEPARATE EURNISHING OK INDICATIONS (ínaf títnk if not eppUcoble)
The BubottoRi luled below will be subianed to the Intcntiborul Bwesu liter (tptdjy tht gtntral náturo of iho indicottam tg., Mmber <jf

For recemng Office use only For ttcetvínf Office use unly

		This shcei was received by the πιετπιαυοιΐ Bureau on;
Atnhonzed oCEtcer		Authonzed offieer

- 16CZ 303574 B6

BUDAPEŠŤ TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FORTHE PURPOSES OFPATENT TROCEDURE

Advanced Technologies (Cambridge) Ltd., 210 Cambridge Science Park.

Cambridge.

CB4 4WA

INTERNATIONAL FORM

RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINÁL DEPOSIT fsitied porsuant to Rule 7.1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Idea Ulied at tbe botton of thls page

NAME AND ADDRESS OF DEPOSITOR

IDENTIFICATION OF THE NflCROORGANISM

Idenltficaiion reference given by ihe DEPOSITOR;

Escherichia coli (XLI Blue MRF pBmyS 1)

Aíxessioú sumber gívtu by tbe INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY;

NCIMB 40964

II. SCIENTIFIC DESCRIFTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DES1GNATION

The microorganlsm idcntiíicd underl above was accompanled by; O ascientific descriptíou @ a proposed taxonomie designation (Maric with a eross wherc applícable)

IIL RECEIPT AND ACCEPTANCE

This International Dcpositary Authority acecpts tbe míowrganism identífied underl above, whieh was mentá by h on 4 August 199$ (dále of lbe originál deposit)!

IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION

The raicroorganism identííted under I above was received by this International Depositaty Aotbority on (dáte of the originál deposit) and a request (o convert tbe originál deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by H oa (dáte of receipt of request for conversíon)

V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY

Name: NCIMB Ltd.,

Address:23 St Macha/ Drive, Abcrdcen,

AB24 3RY, Scotland.

Signaíure(s) of person(s) having lbe power lo rcprescnt the lnternetiooal Deporitary Authority oř of luthoriíed onkial(s): S χ'Τ'Χ 1

Dále: 19 August 1998

T Wherc Rule 6/4 (d) appltcs, such dáte is the dáte on whieh the status of lntemational Dcpositary Authority was acqutrcd.

Fonn BP/4 (sole page)

BUDAPEŠŤ TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORCANISMS FOR THE FURPOSES OF PATENT PROCEDUŘE

Advanced Technologies (Cambridge) Ltd., 210 Cambridge Science Park,

Cambridge.

CB4 4WA

INTERNATIONAL FORM

VIABILITY STATEMENT tssued plínami to Rule 10.2 by tbe

INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Iden lificd on the following page

NAME AND ADDRESS OF THE PARTY TO WHOM THE VIABILITY STATEMENT

ISISSUED

I. DEPOSITOR	11. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM
Namc:	Acecssion numba- givea by the
ASABOVE	INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY:
Addrcss:	NCIMB 40964
	Dáte of the deposit or of the transfer
	4 August 1998
III. VIABILTTY STATEMENT
Tbe YÍability of the microorgasism identified under G abovc was tested on 8 August 1998 2. Oo lhal dáte, the said
microorganism was:
3
0 viable 3
□ no Jongcr viable

lndicale the dáte of the originál deposit oř, where a new deposit or a transfer has becn nudě, the most reeent relevanl dáte (dáte of the new deposit oř dáte of the transfer).

In the cases referrcd to tn Rule I0.2(aXii) and (iii), rtfer to the most reeent Yhbiliry lest

Mark with a cross ihe applicable box.

Form BP/9 (first page)

- 18CZ 303574 B6

IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED*

V.

INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORJTY

Hune: NOMBLld,

Address: 23 St Machar Drive, Aberdcen,

A24 3RY,

Scotland.

Signature(s) of persoo(s) baving the pourcr ta tepresent the Uteraational Depasitaiy Authority or of aatharised ofTiciilO):

Dáte: 19 August 1991 /A

IftA·

Fill in ί Γ the Information has becn requested and ff the lesutu of the test were negative

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 294 párů bází i o (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA 15 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POZICE V GENOMU:

(A)CHROMOZOM/SEGMENT: chromozom IV (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: tranzitní peptid'* (B) POZICE: 37-291 bp

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG

MELTLNSS8

AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC

SSL IKRKDAKSSRNQESSSN28

121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT

NMTFAKM K P PTYQFQAKNSV48

181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA

KEMKFTHE KTFTPEGETLEK68

241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTT

WEKLHVLSYPHSKNDASV 85 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

io (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1662 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POZICE V GENOMU:

(A)CHROMOZOM/SEGMENT. chromozom IV (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: tranzitní peptid (B) POZICE: 1-1393 bp (D) DALŠÍ INFORMACE: zralý peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

-20CZ 303574 B6

GTTCCGGTGTTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAA

VPVFVMLPLDTVTMSGHLNK20 ccacgagccatgaacgctagtttgatggctctgaaaggagctggtgtggaaggtgtgatg

P E Λ Μ N A S L M A L· K G A G V E G V M 40

121 GTGGATGCTTGGTGGGGATTGGTGG AGAAAG ATGG ACCTATGAATTATAACTGGGAAGGC

VDAWWGLVEKDGPMNYNWEG60

181 TATGCCGAGCTTATACAG ATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTC A

YAEL I QMVQKHGLKLQVVMS80

241 TTCCATCAATGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTG

FHQCOGNVGPSCSIPLPPWV 100

301 CTTGAAG AG ATCAGCAAG AACCCTGATCTTGTCTACACAGAC AAATCTGGGAGAAGGAAC

LEE I SKNPDLVYTDKSGRRN 120

361 CCTGAATATATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATC

ΡΕΥ I SLGCDSVPVLRGRTPI 140

421 CAGGTCTACTCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGA

QVYSDFHRSFRERFEGYIGG 160

Τ2ΓΤ

GTTATTGCGGAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATAC

VIAEIQVGMGPCGELRYPSY180

CCTGAAAGCAACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAG PXSNGTWRFPG XGEFQCYDK200

TATATGAAATCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACA YMKSSLQAYAESIGKTNWGT 220

AGCGGACCTCATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAOG SGPHDAGEYKNLPEDTEFFR 240

AGAGACGGAACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAG RDGTWNSEYG KFFMEWYSGK 260

CTGCTAGAACATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGA LLEHGDQLLSSAKGIFQGSG 280

GCAAAGCTATCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCA AKLSGKVAG I HWHYNTRSHA300

GCTGAGCTAACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCT AELTAGYYNTRNHDGYLPIA 320

AAGATGTTCAACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGG KMFNKHGVVLNFTCMEMKDG 360

GAGCAACCTGAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCG EQPEHANCSPEGLVKQVQNA 380

ACAAGGCAGGCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACGATATGACTCGAGC TRQAGTELAG ENALERYDSS 400

GCATTCGGACAAGTGGTAGCAACAAATAGGTCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTT AFGQVVATNR SDSGNGLTAF 420

ACTTACCTAAGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAG TYLRMNKRLFEGQNWQQLVE 440

TTTGTTAAGAACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTCAAAAGAAGACACAACT FVKNMKEGGHGRRLSKEDTT 460

GGAAGTGACCTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCT GSDLYVGFVKGKIAENVEEA 480

GCTTTAGTGTAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTG A L V - 483

TCTG ATAAATAACTAG AGAG ATCAAACC AGT AAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTG CACAA

TTCTGGGTCAGAGTCAGAGCÁAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTAT

CCTATGAGTTTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTT

CTCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC

-22 CZ 303574 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1953 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST81E10T7 (viii) POZICE V GENOMU:

(A)CHROMOZOM/SEGMENT: chromozom IV (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 37-1683 bp (D) DALŠÍ INFORMACE: cílený chloroplast (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG

MELTLNSS8

AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAG AGTTCTAG AAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC

S SL IKRKDAKS SRNQESSSN28

121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT

NMTFAKH KPPTYQFQAKNSV48

181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA

KE M K F T H E KTF T PE G ET L E K 68

241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTTCCGGTG

WEKLHVLSYPHSKNDASVPV68

301 TTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACCACGAGCC

FVMLPLDTVTMSGHLNKPRA 108

361 ATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATGGTGGATGCT

Μ N A S L M A l· K G A G V E G V Μ V D A 128

421 TGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAG

WWGLVEKDGPMNYNWEGYAE 148

-23CZ 303574 B6 cttatacagatggttcaaaagcacggtctcaaactccaggtcgttatgtcattccatcaa

LIQMVQKHGLKLQVVMSFHQ 168

TGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTGCTTGAAGAG CGGNVGDSCS I PLPPWVLEE 188

ATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAACCCTGAATAT ISKNPDLVYTDKSGRRNPEY 208

ATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATCCAGGTCTAC ISLGCDSVPVLRGRTPIQVY 228

TCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGAGTTATTGCG SDFMRSFRERFEGYIGGVIA 248

GAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATACCCTGAAAGC EIQVGMGPCGELRYPSYPES 268

AACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAGTATATGAAA HGTWRFPGIGEFQCYDKYMK 288

TCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACAAGCGGACCT SSLQAYAESIGKTNWGTSGP 308

CATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGGAGAGACGGA HDAGEYKNLPEDTEFFRRDG 328

ACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAGCTGCTAGAA TWNSEYGKFFME.WYSGKLLE 348

CATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGAGCAAAGCTA HGDQLLSSAKGI FQGSGAK*L 368

TCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCAGCTGAGCTA

SGKVAGIHWHYNTRSHAAEL 388

ACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCTAAGATGTTC

T A G Y Y N T RNHDGYLPIAKMF 408

AACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGGGAGCAACCT

NKHGVVLNFTCMEMKDGEQP 428

GAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCGACAAGGCAG

Ε Η A N C S * P E G L V K Q V Q N A T R Q 448

GCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACGATATGACTCGAGCGCATTCGGA

AGTELAGENALERYDSSAFG 468

CAAGTGGTAGCAACAAATAGGŤCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTTACTTACCTA

QVVATNP. S D S G N G LTAFT Y L 488

AGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAGTTTGTTAAG

RMNKRLFEGQNWQQLVEFVK 50Θ

AACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTCAAAAGAAGACACAACTGGAAGTGAC

NMKEGGHGRRLS KEDTTG S D 52 8

-24 CZ 303574 B6

1621 CTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCTGCTTTAGTG

LYVGFVKGKIAENVEEAALV 548

1681 TAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTGTCTGATAAA

1741 TAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAATTCTGGGTC

1801 AG AGTCAGAGCAAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTATCCTATGAGT

1861 TTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTTCTCCAAAAA

1921 AAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

/!V Π, Λ Π Λ Ι/'ΓΓΓ>ΓϋΤΙΙ/ Λ (l) v rmi\ni\ i Uvij i nxrv ji.iv v Ειπ\_·ι_,.

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

AATTCCTCGA GTTCTCTTAT C (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5: CGGGATCCCT GACATTGTTA C ²¹ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

GCTGGTACGC CTGCAGGATC CGGTCCGGAA TTCCC 35

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

GGGAATTCCG GACCGG ATCC TGC AGGCGTA CCAGC 35 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1652 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: EU Arabidopsis Genome Project (B) KLON: Cosmid G16599 (viii) POZICE V GENOMU:

(A)CHROMOZOM: chromozom 4 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 17534-19185 bpzG16599 (D) DALŠÍ INFORMACE: komplementární vlákno (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

-26CZ 303574 B6

1	AAGCTTGTGT	CTATTTCAAA	TTCTTGACCG	TAGATGTCAC	AACATGCATA
51	TATCATTGAA	AACAGAGCAA	CACAGGAAAC	CAAGCATATG	TATCTAGATA
101	TACTTAGCAA	GACATAACTA	TAGTCTTTGA	ATCAACATAG	GGATTAATGA
151	TAGAGAATGA	GGAAGCTCAA	GATTTTATAC	TCAGTTTCTT	ACAAAACAAA
201	TTTCTCTCTA	ACTGCAAAAA	CACCAATTAG	GATTTGAAGA	GCGTACCTGT
251	TTGAGTCAAT	GTCCAATGTC	GTCCCCCCGC	CTTCTACATT	TCTTAGCCTG
301	CTGAATAAAA	GCACAAGCCA	AAATGAGAAG	GTGCCAAAGG	CGATAAGGAT
351	CAATTTCTAC	CATTCAAAAA	ACTAATGGTG	AGAATTAGAA	ACGAGAGAAA
401	ACTACTTGTT	GAGGAAATAG	CCAAAAGCGC	AATCTTCGTC	ACCTGAATAA
451	AGACCAAACC	GTCACTTTCA	ATGAGTCAGC	AAGAAAAAGA	GAGAGAOAGA
501	GAGAGAGATT	CTCTATAACA	TTTGAGTCGA	CATGGATTCT	AATGCATCAA

AAGTCATCTC

AGATCAAAGC

GACACATGTT

CACACACAAC

AACATATTTC

AAGGTTGACA

TAATAACCAG

TAAAAAAAAG

AGAAATTTTC

GATCTGTCAG

CCAAGAAAAA

ACAGAAATAA

AGAGAACTTA

GTGAGAAGCC

ACTAGATTTA

AATAÁTTCAC

CATGTAAATG

GACATTTACA

AAGGTTAAAA

TGGGTCTCCA

AAACAGCATC

AGCTCTATTC

CT

CAATAAACAA

CTTAAGTATT

CTTAAGTAAC

AAGGGCTTAA

ATTTACAAAC

AAAAAATATA

GCAAGAAAAA

TCACAAAGAA

AAAGAAAATA

CTGCTTAGTT

GAAAATAAGC

TTAAATCGTT

ATAATTTTCA

AAAATTATCA

AGAGTTCTCT

CAACAGGAAA

AGAATTTATT

ATTTTTCATT

TAAGCAACCT

AACCACAGCC

TTTCTCTCAA

TCTACCTCAT

ACACTTGAAA

AAGCATTACA

ATAGTATCAA

TGCATCAAAG

AGAATGCAGC

ATCTTGTAAC

AACAGAATAA

TGTGCCACAG

TTAGCATTGT

GGAAAACACA

AAAGTTAATA

GCACTTATCT

GCCACACGAA

GCTTATCTCC

GTAACTAAAA

ACAAAACTCA

AACTAAAACA

TTGAGGTGTA

TTGTGATATT

AATCAATATT

ACACAAACAT

TTCTCATCAT

CTCACATGGC

GACACTACTG

TATCCGTGAA

TCCTGTTATT

ATTCAGGCAG

TCTACATATA

ACAGATCAAT

TGAACAAGAG

TAGAATTTTT

AATCTTACAG

GCCACCACAA

TCTTATTCAA.

CCATGTGTTC

ATTAACAAGG

ACTGCAGGAG

ATTATCTATA

TCTTCCTTTG

AGAACCGTGT

TTCTCTCCAC

CTTTATAAAT

ATCTTCTATC

AACAAAGAGA

TAATAGAACA

GCTAACTTTT

TCACATCGAA

TCCATATAAC

TCCAAATGGA

TGGCAGAATG

GAGTATGATA

GGCCATGAGA

TGGGTCAATG

GAAGGAAAGT

GAAATTTCAT

ACTAAAATCA

AAAGCCAAAG

GAAAAGCAAG

TGAGTAAGTA

GCTGAATACA

TAACTGATGT

GACAAGTGAA

TTTTTGAAAT

ACAAACACAC

AAACACCAAC

GAGAAAAAAA

-28CZ 303574 B6

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY která kóduje sekvenci schopnou směrovat protein do rostlinného plastidu, nebo sekvence, která má alespoň 65% nebo větší homologii se sekvencí id. č. 1 a která kóduje sekvenci mající stejnou směrovací schopnost.
2. 2. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 1, která kóduje 85 aminokyselinových zbytků.
3. 3. Sekvence nukleové kyseliny, uvedená zde jako sekvence id. č. 3, s nukleotidy 1 až 1953.

   která kóduje do chloroplastu směrovanou β-amylázu, nebo sekvence, která má alespoň 65% nebo větší homologii se sekvencí id. č. 3 a která kóduje do chloroplastu směrovanou β-amylázu.
4. 4. Sekvence nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 3, kterou je je sekvence mRNA*, cDNA nebo genomová DNA.
5. 5. Způsob zvýšení nebo snížení aktivity β-amylázy v rostlině, vyznačený tím, že obsahuje kroky, kdy se do rostlinného genomu stabilně vloží chimérický gen, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci a kódující sekvenci pro β— amylázu, a regeneruje se rostlina se změněným genomem, přičemž sekvence kódující plastidovou směrovací sekvenci obsahuje sekvenci podle nároku 1.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že kódující sekvencí je sekvence nukleové kyseliny id. č. 2, která je kódující sekvencí pro β-amylázu.
7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že sekvencí nukleové kyseliny je sekvence nukleové kyseliny podle nároku 3.
8. 8. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že enzymem je neplastidová β-amyláza.
9. 9. Způsob podle některého z nároků 5až8, vyznačený tím, že chimérický gen dále obsahuje kódující sekvenci pro enzym ze souboru zahrnujícího sacharózasyntázu, ADPG pyrO’ fosfory lázu, syntázu škrobu, větvící enzym, α-amylázu, isoamylázu, neplastidovou β-amylázu, α-glykosidázu, fosfory lázu škrobu a disproporcionační enzym.
10. 10. Způsob podle některého z nároků 5 až 9, vyznačený tím, že chimérický gen dále obsahuje promotor, přičemž promotorem je sekvence nukleové kyseliny, která je zde uvedená jako sekvence id. č. 8, nebo která má alespoň 65% homologii se sekvencí id. č. 8 a má stejnou funkci, přičemž sekvence nukleové kyseliny odpovídá na stimul a hladina exprese produktu je proměnná podle odezvy na stimul aplikovaný na sekvenci nukleové kyseliny.
11. 11. Způsob směrování proteinů nebo enzymů do rostlinného plastidu, vyznačený tím, že obsahuje kroky, kdy se do rostlinného genomu stabilně vloží chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci a kódující sekvenci pro protein nebo enzym a regeneruje se rostlina se změněným genomem, přičemž proteinem nebo enzymem je jeden nebo více proteinů nebo enzymů působících v metabolické dráze zvolené ze souboru zahrnujícího syntézu lipidů, fotosyntézu, metabolizmus aminokyselin, fixaci dusíku, fixaci uhlíku nebo syntézu sacharidových polymerů, nebo protein nebo enzym udělující rostlině určitý charakteristický znak, přičemž plastidová směrovací sekvence je kódována sekvencí nukleové kyseliny podle nároku 1.

    -TT
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačený tím, že charakteristický znak je zvolen ze souboru znaků zahrnuj ící ho rezistenci vůči herbicidům a rezistenci vůči Škůdcům.
13. 13. Způsob zvýšení nebo snížení množství škrobu produkovaného transgenní rostlinou, kterážto rostlina již vykazuje zvýšení nebo snížení enzymové aktivity v metabolické dráze biosyntézy škrobu v důsledku genetické transformace, vyznačený tím, že se rostlina transformuje nukleovou kyselinou, která obsahuje sekvenci id č. 1 a kóduje do plastidu směrovanou β-amylázu.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačený tím, že do plastidu směrovaná β-amyláza je kódována sekvencí nukleové kyseliny obsahující sekvenci id. č. 2.
15. 15. Způsob podle nároku 13, vyznačený tím, že transformovanou rostlinou je rostlina transgenního bramboru transformovaná genem pro adenosindifosfoglukózapyrofosforylázu.
16. 16. Způsob podle nároku 5 nebo 11, vyznačený tím, že chimérický gen dále obsahuje promotor zvolený ze souboru zahrnujícího zkrácený nebo úplný promotor 35S z viru mozaiky květáku, promotor z rubisco, promotor plastocyaninu z hrachu, promotor nopalinsyntázy, promotor chlorofyl a/b vazebného proteinu, promotor gluteninu s vysokou molekulovou hmotností, promotor α,β-gliadinu, promotor hordeinu a promotor patatinu.
17. 17. Způsob podle nároku 5 nebo 11, vyznačený tím, že kódující sekvence enzymu v chimérickém genu vede ke stimulaci nebo utlumení aktivity enzymu.
18. 18. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že stimulem je přítomnost nebo nepřítomnost světla a/nebo proměnlivá hladina cukru.
19. 19. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že stimulem je vývojově řízený stimul.
20. 20. Způsob podle nároku 18, vyznačený tím, že cukrem je jeden nebo více cukrů zvolených ze souboru zahrnujícího glukózu a sacharózu,
21. 21. Způsob podle nároku 18, vyznačený tím, že cukrem je sacharóza.
22. 22. Chimérický gen obsahující sekvenci podle nároku 1.
23. 23. Chimérický gen podle nároku 22, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující sekvenci enzymu zapojeného v metabolické dráze degradace škrobu, přičemž enzym je kódován sekvencí id. č.2.
24. 24. Rostlinná buňka transformovaná sekvencí nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo nároku 3.
25. 25. Semeno rostliny transformované jednou nebo více sekvencemi nukleových kyselin podle nároku 1 nebo nároku 3.
26. 26. Rostlina obsahující rostlinnou buňku podle nároku 24.
27. 27. Rostlina podle nároku 26 zvolená ze souboru zahrnujícího brambor, pšenici, kukuřici, ječmen, rajče, rýži, hrách, sóju, podzemnici olejnou, maniok, yam, banán a tabák.

    9 výkresů