ES2962571T3

ES2962571T3 - Métodos para modificar células T alogénicas y resistentes a la inmunosupresión para inmunoterapia

Info

Publication number: ES2962571T3
Application number: ES13731522T
Authority: ES
Inventors: Roman Galetto; Agnes Gouble; Stephanie Grosse; Cecile Mannioui; Laurent Poirot; Andrew Scharenberg; Julianne Smith
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: US20210060080A1; US20200281979A1; EP3276000A3; KR20210050590A; ES3015120T3; DK2855667T3; JP2015523064A; KR102437522B1; US20140134142A1; EP3276000A2; MA37681B2; US10363270B2; PT2855667T; AU2018236867B2; CN104718284A; US20170360835A1; JP2015525065A; BR112014029417B1; US11891614B2; BR112014029417A2

Abstract

Métodos para desarrollar células T diseñadas para inmunoterapia que no sean aloreactivas y sean resistentes a los fármacos inmunosupresores. La presente invención se refiere a métodos para modificar células T inactivando tanto genes que codifican una diana para un agente inmunosupresor como un receptor de células T, en particular genes que codifican CD52 y TCR. Este método implica el uso de endonucleasas de corte raras específicas, en particular nucleasas TALE (endonucleasa efectora TAL) y polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, para atacar con precisión una selección de genes clave en las células T, que están disponibles de donantes o de cultivos de células T primarias. células. La invención abre el camino a estrategias de inmunoterapia adoptiva estándar y asequibles para tratar el cáncer y las infecciones virales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para modificar células T alogénicas y resistentes a la inmunosupresión para inmunoterapia

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para desarrollar células T modificadas para inmunoterapia que no sean alorreactivas y sean resistentes a fármacos inmunosupresores. La presente invención se refiere a métodos para modificar células T inactivando ambos genes que codifican una diana para un agente inmunosupresor y un receptor de células T Este método implica el uso de endonucleasas específicas de corte poco común, en particular nucleasas TALE (endonucleasa efectora TAL) y polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, para atacar con precisión una selección de genes clave en las células T, que están disponibles de donantes o de cultivos de células T primarias. La invención también se refiere al receptor de antígeno quimérico (CAR), de múltiples cadenas (CAR) y su uso para mejorar la eficacia de la inmunoterapia. La invención abre el camino a estrategias de inmunoterapia adoptiva estándar y asequibles para tratar el cáncer y las infecciones virales.

Antecedentes de la invención

Inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T autólogas específicas de antígeno generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T utilizadas para la inmunoterapia adoptiva pueden generarse mediante expansión de células T específicas de antígeno o redirección de células T mediante ingeniería genética (Park, Rosenberg et al., 2011). La transferencia de células T específicas de antígeno viral es un procedimiento bien establecido que se utiliza para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y neoplasias malignas raras relacionadas con virus. De manera similar, se ha demostrado que el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumores tienen éxito en el tratamiento del melanoma.

Se han generado con éxito nuevas especificidades en las células T mediante la transferencia genética de receptores de células T transgénicas o receptores de antígenos quiméricos (CAR) (Jena, Dotti et al., 2010). Los CAR son receptores sintéticos que constan de una fracción diana asociada con uno o más dominios de señalización en una única molécula de fusión. En general, la fracción de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un conector flexible. También se han utilizado con éxito fracciones de unión basados en dominios de receptor o ligando. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación se derivan de la región citoplasmática del CD3zeta o de las cadenas gamma del receptor Fc. Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de las células T; sin embargo, no lograron proporcionar una expansión prolongada ni actividad antitumoral in vivo. Se han agregado dominios de señalización de moléculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137) solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T modificadas con CAR. Los CAR han permitido con éxito que las células T sean redirigidas contra antígenos expresados en la superficie de células tumorales de diversas neoplasias malignas, incluidos linfomas y tumores sólidos (Jena, Dotti et al., 2010).

Las arquitecturas de CAR actuales se basan en un diseño en donde todos los dominios relevantes están contenidos en un único polipéptido. Este diseño requiere la adición en serie de dominios de señalización, por lo que es necesario mover algunos dominios desde sus posiciones naturales de yuxtamembrana. Por lo tanto, las arquitecturas en donde los ligandos y los dominios de señalización están separados pueden permitir una función mejorada de los dominios coestimuladores ubicados en diferentes cadenas en sus posiciones normales de yuxtamembrana, en lugar de unirse con algunos dominios ubicados distalmente de la membrana plasmática. Un receptor natural, el receptor de alta afinidad para IgE (FceRI), proporcionaría dicha arquitectura. El FceRI presente en mastocitos y basófilos se une a la IgE con alta afinidad. F<ce>RI es un complejo receptor tetramérico que consta de una subunidad alfa de unión a ligando, una subunidad beta y un homodímero de dos subunidades gamma transductoras de señales (Metzger, Alcaraz et al.

1986). El dominio alfa FceRI consta de un dominio extracelular que contiene dos dominios similares a lg que se unen a IgE, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta. La subunidad beta contiene cuatro segmentos transmembrana que separan las colas citoplasmáticas del terminal amino y carboxilo. La cadena gamma consiste esencialmente en una región transmembrana y una cola citoplasmática que contiene un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) (Cambier 1995). La cadena zeta del complejo TCR está estrechamente relacionada con la cadena gamma y puede sustituir a la cadena gamma de F<ce>RI (Howard, Rodewald et al., 1990).

El protocolo actual para el tratamiento de pacientes que utilizan inmunoterapia adoptiva se basa en la transferencia de células autólogas. En este enfoque, los linfocitos T se recuperan de pacientes, se modifican genéticamente o se seleccionan ex-vivo, se cultivan in vitro para amplificar el número de células si es necesario y finalmente se infunde en el paciente. Además de la infusión de linfocitos, el huésped puede manipularse de otras maneras que favorezcan el injerto de células T o su participación en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, el preacondicionamiento (con radiación o quimioterapia) y la administración de factores de crecimiento de linfocitos (como lL-2). Cada paciente recibe un tratamiento elaborado individualmente, utilizando los propios linfocitos del paciente (es decir, una terapia autóloga). Las terapias autólogas enfrentan importantes obstáculos técnicos y logísticos para su aplicación práctica, su generación requiere costosas instalaciones dedicadas y personal experto, deben generarse en un corto período de tiempo después del diagnóstico del paciente y, en muchos casos, el tratamiento previo del paciente ha resultado en una función inmune degradada, de modo que los linfocitos del paciente pueden tener un funcionamiento deficiente y estar presentes en cantidades muy bajas. Debido a estos obstáculos, la preparación de células autólogas de cada paciente es efectivamente un producto nuevo, lo que genera variaciones sustanciales en eficacia y seguridad. Lo ideal sería utilizar una terapia estandarizada en donde las células terapéuticas alogénicas pudieran prefabricarse, caracterizarse en detalle y estar disponibles para su administración inmediata a los pacientes. Por alogénico se entiende que las células se obtienen de individuos que pertenecen a la misma especie pero que son genéticamente diferentes. Sin embargo, el uso de células alogénicas tiene actualmente muchos inconvenientes. En huéspedes inmunocompetentes, las células alogénicas se rechazan rápidamente, un proceso denominado rechazo de injerto contra huésped (HvG), y esto limita sustancialmente la eficacia de las células transferidas. En huéspedes inmunocompetentes, las células alogénicas pueden injertarse, pero sus especificidades endógenas de TCR reconocen el tejido del huésped como extraño, lo que resulta en la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), que puede provocar daños tisulares graves y la muerte. Para utilizar eficazmente las células alogénicas, se deben superar ambos problemas.

En huéspedes inmunocompetentes, el sistema inmunológico del huésped rechaza rápidamente las células alogénicas. Se ha demostrado que los leucocitos alogénicos presentes en los productos sanguíneos no irradiados persistirán durante no más de 5 a 6 días (Boni, Muranski et al. 2008). Por lo tanto, para evitar el rechazo de las células alogénicas, se debe suprimir eficazmente el sistema inmunológico del huésped. Los glucocorticoides se utilizan ampliamente terapéuticamente para la inmunosupresión (Coutinho y Chapman 2011). Esta clase de hormonas esteroides se une al receptor de glucocorticoides (GR) presente en el citosol de las células T, lo que da como resultado la translocación al núcleo y la unión de motivos de<a>D<n>específicos que regulan la expresión de varios genes implicados en el proceso inmunológico. El tratamiento de las células T con esteroides glucocorticoides da como resultado niveles reducidos de producción de citocinas, lo que provoca anergia de las células T e interfiere en la activación de las células T Alemtuzumab, también conocido como CAMPATH1-H, es un anticuerpo monoclonal humanizado específico para CD52, una glicoproteína unida a glicosilfosfatidil-inositol (GPI) de 12 aminoácidos (Waldmann y Hale 2005). CD52 se expresa en niveles elevados en los linfocitos T y B y en niveles más bajos en los monocitos, mientras que está ausente en los granulocitos y los precursores de la médula ósea. Se ha demostrado que el tratamiento con alemtuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado específico para CD52, induce un rápido agotamiento de los linfocitos y monocitos circulantes. Se utiliza con frecuencia en el tratamiento de linfomas de células T y, en determinados casos, como parte de un régimen de acondicionamiento para el trasplante. Sin embargo, en el caso de la inmunoterapia adoptiva, el uso de fármacos inmunosupresores también tendrá un efecto perjudicial sobre las células T terapéuticas introducidas. Por lo tanto, para utilizar eficazmente un enfoque de inmunoterapia adoptiva en estas condiciones, las células introducidas tendrían que ser resistentes al tratamiento inmunosupresor.

Por otro lado, los receptores de células T (TCR) son receptores de superficie celular que participan en la activación de las células T en respuesta a la presentación de antígeno. El TCR generalmente está formado por dos cadenas, alfa y beta, que se ensamblan para formar un heterodímero y se asocian con las subunidades transductoras de CD3 para formar el complejo receptor de células T presente en la superficie celular. Cada cadena alfa y beta del TCR consta de una región variable (V) y constante (C) del terminal N similar a una inmunoglobulina, un dominio transmembrana hidrofóbico y una región citoplasmática corta. En cuanto a las moléculas de inmunoglobulina, la región variable de las cadenas alfa y beta se genera mediante recombinación V(D)J, creando una gran diversidad de especificidades antigénicas dentro de la población de células T. Sin embargo, a diferencia de las inmunoglobulinas que reconocen antígenos intactos, las células T se activan mediante fragmentos peptídicos procesados en asociación con una molécula de MHC, lo que introduce una dimensión adicional al reconocimiento de antígenos por parte de las células T, conocida como restricción del MHC. El reconocimiento de las disparidades del MHC entre el donante y el receptor a través del receptor de células T conduce a la proliferación de células T y al posible desarrollo de GVHD. Se ha demostrado que la expresión superficial normal del TCR depende de la síntesis y ensamblaje coordinados de los siete componentes del complejo (Ashwell y Klusner 1990). La inactivación de TCR alfa o t Cr beta puede dar como resultado la eliminación del TCR de la superficie de las células T, impidiendo el reconocimiento del aloantígeno y, por lo tanto, de la GVHD. Sin embargo, la alteración del TCR da como resultado la eliminación del componente de señalización CD3 y altera los medios para una mayor expansión de las células T.

En las células T normales, los receptores de células T emanan de los receptores de células pre-T (pTCR), que se expresan en timocitos inmaduros y son cruciales para el desarrollo de células T desde las etapas de doble negativo (CD4- CD8-) hasta el doble positivo (CD4+ CD8+). Las células pre-T que logran reordenamientos productivos del locus TCR beta expresan una cadena TCR beta funcional que se empareja con una cadena preTalfa invariante y componentes de señalización CD3 para formar el complejo pre-TCR. La expresión del pre-TCR en la superficie celular es necesaria para desencadenar la selección beta, un proceso que induce la expansión de las células T en desarrollo, refuerza la exclusión alélica del locus TCR beta y da como resultado la inducción de reordenamientos en el locus TCR alfa (von Boehmer 2005). Después de reordenamientos productivos de TCR alfa y la sustitución de pTalfa por TCR alfa para formar un TCR maduro, los timocitos se someten a una segunda etapa de selección, denominada selección positiva o TCR alfa/beta tras la unión de complejos MHC autopeptídicos expresados en células epiteliales del timo. Por lo tanto, las células T maduras reconocen y responden al complejo antígeno/MHC a través de su TCR. La consecuencia más inmediata de la activación de TCR es el inicio de vías de señalización a través de las subunidades CD3 asociadas que dan como resultado múltiples eventos que incluyen la expansión clonal de las células T, la sobrerregulación de los marcadores de activación en la superficie celular y la inducción de citotoxicidad o secreción de citoquinas.

Debido a la naturaleza de la selección de las cadenas TCR beta mediante el emparejamiento con preTalfa durante el desarrollo tímico, en las células T en donde se ha inactivado TCR alfa, la introducción heteróloga del transgén pTalfa puede dar como resultado la formación de un preTCR. Este pTCR puede servir como medio de activación o estimulación de células T de una manera que no depende del MHC, permitiendo así, por ejemplo, la expansión continua de células T alfa/beta después de la inactivación de TCR alfa. Es importante destacar que el complejo pTCR muestra una composición bioquímica similar a la del TCR en términos de subunidades CD3 asociadas (Carrasco, Ramiro et al. 2001). Además, a diferencia del TCR, la señalización pre-TCR puede ocurrir en parte por un evento independiente del ligando. La estructura cristalina del dominio extracelular de pTCR ha proporcionado una base estructural para la posible independencia del ligando de la señalización de pTCR. Se ha demostrado que el pTCR forma un dímero de cabeza a cola donde se asocian dos heterodímeros pTalfa-TCR beta (Pang, Berry et al. 2010).

En la presente invención, los inventores han logrado la producción de células T genéticamente modificadas, que superan las limitaciones de las estrategias de inmunoterapia actuales, permitiéndoles ser no alorreactivas y resistentes a los agentes inmunosupresores. Esto fue posible mediante la inactivación de genes utilizando nucleasas TALE específicas dirigidas contra TCR alfa o TCR beta, junto con la inactivación de genes que codifican dianas para diferentes agentes inmunosupresores, en particular CD52 y GR.

En particular, la inactivación de TCR alfa o TCR beta junto con la inactivación de CD52 o del receptor de glucocorticoides en los linfocitos T derivados de un donante alogénico reduce significativamente el riesgo de GVHD, al eliminar el TCR, responsable del reconocimiento de las disparidades del MHC, al tiempo que permite la proliferación y la actividad de los linfocitos introducidos en presencia de fármacos inmunosupresores, tales como Alemtuzumab o esteroides glucocorticoides, que previenen el rechazo de estas células. Por lo tanto, se espera que estas células T alogénicas modificadas se expandan de manera más eficiente en la sangre del paciente, donde pueden atacar células tumorales o células infectadas.

Además de la concepción anterior de células T genéticamente modificadas, que pueden ser no alorreactivas y resistentes inmunosupresoras, los inventores, mediante el uso y diseño de nucleasas TALE específicas, han inactivado concomitantemente estos diferentes genes en células T, obteniendo así doble mutantes. De hecho, hasta ahora no se ha logrado la selección de genes dobles por parte de DSB en las células T debido a la dificultad de producir y mantener células T en cultivo a lo largo del tiempo, a sus bajas tasas de transformación y a la pérdida durante los procedimientos de selección. Estas dificultades dan como resultado una baja probabilidad de éxito en la obtención de dichas células.

Por lo tanto, una parte importante de la invención es haber diseñado nucleasas TALE específicas, que permitan tasas más altas de eventos<d>Sdentro de las células T, que sean bien toleradas por las células (especialmente tras la cotransfección), capaces de apuntar a la selección de genes de acuerdo con la invención. Mediante el uso de endonucleasas de corte poco común, como las nucleasas TALE descritas allí, se incrementó significativamente la probabilidad de obtener una doble inactivación de los genes en las células T transfectadas, de modo que ahora parece posible producir células T modificadas disponibles de donantes en forma regular, utilizando procedimientos estándar.

Además, la presente invención propone una realización en donde las células T se modifican para permitir la proliferación cuando TCR alfa está inactivado. Un problema importante con las células T que han sufrido la inactivación de la subunidad TCR es que las células ya no pueden expandirse a través del complejo CD3. Para superar este problema, los inventores proporcionan medios para expandir las células T en donde el TCR alfa ha sido inactivado a través del complejo CD3, mediante la expresión de preTalfa en las células, restaurando así un complejo CD3 funcional en ausencia de un TCR alfa/beta funcional.

Finalmente, las células T se transforman aún más con CAR para redirigir la especificidad de las células alogénicas hacia antígenos asociados a tumores independientes del m Hc . En particular, la invención se refiere a un CAR de múltiples cadenas, en donde los dominios coestimuladores se colocan en sus posiciones normales de yuxtamembrana para mejorar sus funciones y así mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T modificadas. Como resultado, la invención proporciona métodos, polipéptidos y polinucleótidos que permiten la transformación efectiva de células T alogénicas para inmunoterapia adoptiva, y su fácil expansión a través del complejo CD3.

Sumario de la invención

La presente invención divulga métodos para modificar células T, en particular células T alogénicas que se pueden obtener de donantes, para hacerlas adecuadas para fines de inmunoterapia. Los métodos de la presente invención permiten más particularmente la modificación precisa del genoma de células relevantes para la inmunoterapia inactivando o reemplazando genes implicados en el reconocimiento del MHC y/o dianas de fármacos inmunosupresores para el tratamiento del cáncer y/o infecciones virales. En determinadas realizaciones, las células modificadas relevantes para la inmunoterapia comprenden además polinucleótidos recombinantes exógenos que codifican CAR para el reconocimiento celular específico. Los CAR actuales son moléculas de fusión únicas que requieren la adición en serie de dominios de señalización. Mover los dominios de señalización desde su posición yuxtamembrana natural puede interferir con su función. Por lo tanto, para superar este inconveniente, los inventores diseñan un CAR de múltiples cadenas derivado de FceRI para permitir la posición yuxtamembrana normal de todos los dominios de señalización relevantes. El dominio de unión a IgE de alta afinidad de la cadena alfa de F<ce>RI se reemplaza por un dominio de unión a ligando extracelular como scFv para redirigir la especificidad de las células T a dianas celulares y las colas de los terminales N y/o C de la cadena beta de FceRI se usan para colocar señales coestimuladoras en posiciones yuxtamembrana normales.

Para promover la activación o estimulación de las células T en donde se ha inactivado TCR alfa, se puede introducir pTalfa o una variante funcional del mismo en las células T modificadas. El pTalfa o variante funcional del mismo usado puede ser pTalfa de longitud completa, una variante de empalme (Saint-Ruf, Lechner et al., 1998), una versión truncada del terminal C que se ha demostrado que aumenta la expresión en la superficie celular de preTCR (Carrasco, Ramiro et al., 2001). Podrían utilizarse otros truncamientos adicionales, ya sean menores o mayores que los descritos. Diferentes versiones de preTalfa pueden comprender además fracciones de señalización de otras moléculas (CD28, CD137, CD8, TCR alfa, etc.) para promover la proliferación y la supervivencia o comprender mutaciones que afectan su capacidad para dimerizar, como las mutaciones D22A, R24A, R102A o R117A previamente descritas en ratones (Yamasaki, Ishikawa et al. 2006) o la mutación W46R descrita en humanos (Pang, Berry et al. 2010) para disminuir el potencial de proliferación. La porción scFv del CAR también puede fusionarse con el dominio extracelular de un pTalfa o una variante funcional del mismo, acoplando así la especificidad hacia los antígenos diana directamente con la actividad proliferativa del preTCR.

En otro aspecto, la presente invención utiliza polipéptidos y polinucleótidos, que codifican las endonucleasas de corte poco común, para apuntar con precisión a los genes de interés anteriores, en particular TCR alfa, TCR beta, GR y CD52, permitiendo así la modificación genética de las células T para inmunoterapia. La presente invención proporciona secuencias diana más particularmente específicas dentro de estos genes y nucleasas TALE diseñadas para dirigirse respectivamente a esos genes.

La presente invención también se refiere a células o líneas celulares aisladas que comprenden cualquiera de las proteínas, polipéptidos o vectores descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, las células T de la presente invención comprenden genes de TCR alfa, TCR beta, GR o CD52 inactivados para su uso en inmunoterapia. Las células aisladas de la presente invención o líneas celulares comprenden además polinucleótidos recombinantes exógenos, en particular polinucleótidos que codifican pTalfa o una variante funcional del mismo, CAR o CAR de múltiples cadenas.

Las células T modificadas se pueden utilizar como producto terapéutico, idealmente como producto "listo para usar".

La presente invención es útil para tratar o prevenir cáncer o infecciones en el paciente mediante la administración de una célula T modificada que se puede obtener mediante los métodos anteriores.

Breve descripción de las Figuras y Tablas.

Figura 1: Representación esquemática de la relación normal entre las células T y las células presentadoras de antígenos.

Figura 2: Representación esquemática de las células T terapéuticas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención y las células tumorales del paciente.

Figura 3: Representación esquemática de un CAR de múltiples cadenas.

Figura 4: Esquema de diferentes versiones de CAR de múltiples cadenas. A. Esquema del receptor F<ce>RI. B-C Diferentes versiones de CAR de múltiples cadenas (csm1 a csm10) que comprenden un scFv y una región del tallo CD8 fusionada al dominio transmembrana de la cadena alfa de FceRI. Al menos un dominio zeta 41BB, CD28 y/o CD3 puede fusionarse a una cadena alfa, beta y/o gamma de F<ce>RI.

Figura 5: Representación esquemática de un ejemplo del método de modificación de células alogénicas humanas para inmunoterapia.

Figura 6: Concentración en células por mililitro de células vivas positivas para CD52 o negativas para CD52 después del tratamiento con anticuerpo anti-CD52 (CAMPATH1-H) con complemento o controles.

Figura 7: Comparación de la distribución de dispersión lateral delantera (FSC), un indicador del tamaño celular, entre células positivas para TCR y negativas para TCR, o entre células positivas para CD52 y negativas para CD52, y células no activadas como control.

Figura 8: Análisis por citometría de flujo de la expresión de CD107a (marcador de desgranulación) en células T inactivadas con CD52 y TCR alfa específicas. La expresión de CD107 se analiza en células CD52+TCRap+ (primera columna), células CD52-TCRap- (segunda columna), células CD52-TCRap+ (tercera columna) y células CD52+ TCRap- (cuarta columna) antes (A) y después de la incubación con células Daudi (B); C) representa el análisis de citometría de flujo de células T transfectadas adicionalmente con un CAR e incubadas con células Daudi; D) representa el análisis de citometría de flujo de células T transfectadas con un CAR pero no incubadas con células Daudi y E) representa el análisis de citometría de flujo de células T transfectadas con un CAR y tratadas con PMA/ionomicina (control positivo).

Figura 9: Análisis de secuenciación profunda de posibles dianas externas de las nucleasas CD52 y TRAC TALE.

Figura 10: Análisis del locus genómico PDCD1 y CTLA-4 mediante ensayo de endonucleasa T7. Las flechas apuntan a los productos de PCR digeridos.

Figura 11: Representación esquemática de algunos ejemplos de construcciones de preTalfa.

Figura 12: Análisis por citometría de flujo de la eficiencia de transducción (% de células BFP+) y la actividad de las construcciones de pTalfa FL, A18, A48 (% de expresión en la superficie de CD3) en células Jurkat inactivadas con TCR alfa.

Figura 13: Representación esquemática de una construcción lentiviral que codifica la proteína pTalfa (preTCRa).

Figura 14: A. Representación del protocolo experimental. B. Análisis por citometría de flujo de TCR alfa/beta, expresión de CD3 y expresión de BFP en células T inactivadas (KO) con TCR alfatransducidas con BFP-2A-pTalfaA48 (KO/A48) o vector lentiviral BFP de control (KOBFP) antes y después de la purificación. C. Análisis por citometría de flujo de la expresión de TCR alfa/beta y CD3 en células purificadas inactivadas con TCR alfa transducidas (BFPpos) o no (BFPneg) con el vector lentiviral BFP-2A-pTalfaA48. NEP representa células no electroporadas con nucleasas TALE TRAC.

Figura 15: A-B. Análisis por citometría de flujo de la expresión del marcador de activación temprana CD69 (A), del marcador de activación tardía CD25 (B) 24 y 48 horas después de la reactivación con perlas anti-CD3/CD28 respectivamente en células no electroporadas (NEP) y células inactivadas (KO) con TCR alfa transducidas con el vector lentiviral BFP-2A-pTa-A48 (pTa-A48), el vector lentiviral BFP-2A-pTa-A48.41BB (pTa-A48.BB) o el vector BFP de control (BFP). Los histogramas de pTa-A48 corresponden a la señal detectada en células inactivadas con TCR que expresan pTa-A48 (células BFP+), mientras que los histogramas de KO corresponden a células inactivadas con TCR alfa que no expresan pTa-A48 (células BFP-). Los histogramas de pTa-A48.BB corresponden a la señal detectada en células inactivadas con TCR que expresan pTa-A48.41BB (células BFP+), mientras que los histogramas de KO corresponden a células inactivadas con TCR alfa que no expresan pTa-A48.41BB (células BFP-). Los histogramas de NEP (no electroporadas) corresponden a señales detectadas en células no modificadas. C. Análisis por citometría de flujo del tamaño de las células 72 horas después de la reactivación con perlas anti-CD3/CD28 en células no electroporadas (NEP) y células inactivadas (KO) con TCR alfa transducidas con el vector lentiviral BFP-2A-pTa-A48 (pTa -A48), vector lentiviral BFP-2A-pTa-A48.41BB (pTa-A48.BB) o vector BFP de control (BFP). Los valores indicados en la parte superior de cada gráfico corresponden a la media geométrica de la fluorescencia de cada población.

Figura 16: Análisis del crecimiento celular de células inactivadas (KO) con TCR alfa transducidas con pTalfa-A48 (pTaA48) o vector BFP de control (BFP) mantenidas en IL2 o en IL2 con perlas anti-CD3/CD28 en diferentes puntos de tiempo (eje x). El número de células BFP+ se estima en diferentes puntos de tiempo para cada condición y las veces que se inducen estas células (eje y) se estima con respecto al valor obtenido el día 2 después de la reactivación. Los resultados se obtienen de dos donantes independientes. Para el segundo donante, también se determinó el crecimiento celular de las células transducidas con pTalfa-A48.41BB (pTa-A48.BB) y pTalfa- de longitud completa (pTa-FL).

Figura 17: Análisis por citometría de flujo de células positivas para GFP en PBMC electroporadas con los cinco programas CytoPulse diferentes. La línea superior corresponde a la transfección de 6*10® células por cubeta, mientras que la línea inferior corresponde a la transfección de 3*10® células por cubeta.

Figura 18: Análisis por citometría de flujo de la mortalidad de células T purificadas utilizando colorante de viabilidad (eFluor-450) y de células positivas para GFP entre la población viable después de la electroporación con ARNm de GFP, ADN de GFP y ADN de pUC de control. NEP corresponde a células que se mantuvieron en tampón de electroporación, pero no se electroporaron y NT corresponde a células no electroporadas mantenidas en medio de cultivo.

Figura 19: Análisis por citometría de flujo de la expresión de TCR alfa/beta y CD3 en células T primarias humanas después de la electroporación de ARNm de nucleasa TALE de TRAC (arriba). Análisis de secuenciación profunda de ADN genómico extraído de células T primarias humanas después de electroporación de ARNm de nucleasa TALE de TRAC (abajo).

Figura 20: A. Análisis por citometría de flujo de la expresión de CAR (anti F(ab')2) después de la electroporación de células T con o sin ARNm que codifica un CAR de cadena sencilla. B. Análisis por citometría de flujo de la expresión de CD107a (marcador de desgranulación) en células T electroporadas cocultivadas con células Daudi.

Figura 21: A. Representación de ARNm que codifica un CAR de múltiples cadenas. B. Análisis por citometría de flujo de la expresión de CAR (anti F(ab')2) en células T viables electroporadas con o sin un ARNm policistrónico que codifica un CAR de múltiples cadenas. C. Análisis por citometría de flujo de la expresión de CD107a (marcador de desgranulación) en células T electroporadas cocultivadas con células Daudi.

Tabla 1: Descripción de las nucleasas TALE GR y secuencias de los sitios diana de las nucleasas TALE en el gen GR humano.

Tabla 2: Actividad de escisión de las nucleasas TALE GR en levaduras. Los valores están comprendidos entre 0 y 1. El valor máximo es 1.

Tabla 3: Porcentaje de mutagénesis dirigida en sitios diana de nucleasa TALE endógena en células 293.

Tabla 4: Porcentaje de mutagénesis dirigida en sitios diana de nucleasa TALE endógena en linfocitos T primarios. Tabla 5: Descripción de las nucleasas TALE CD52, TRAC y TRBC y secuencias de los sitios diana de las nucleasas TALE en los genes humanos correspondientes.

Tabla 6: Secuencias diana adicionales para las nucleasas TALE TRAC y CD52.

Tabla 7: Porcentaje de indeles para nucleasa TALE dirigida a las dianas CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 y TRBC_T02.

Tabla 8: Porcentajes de linfocitos T negativos para CD52-, negativos para TCR y doble negativos para CD52/TCR después de la transfección de los correspondientes polinucleótidos que expresan nucleasa TALE.

Tabla 9: Porcentajes de linfocitos T negativos para TCR después de la transfección de polinucleótidos que expresan nucleasa TALE t Rb C.

Tabla 10: Descripción de las nucleasas TALE CTLA4 y PDCD1 y secuencias de los sitios diana de las nucleasas TALE en los genes humanos correspondientes.

Tabla 11: Descripción de un subconjunto de construcciones de pTalfa.

Tabla 12: Actividad de las diferentes construcciones de pTalfa en células Jurkat inactivadas con TCR alfa. La actividad se midió mediante análisis por citometría de flujo de la expresión de CD3 en células Jurkat inactivadas con TCR alfa transfectadas con las diferentes construcciones de preTalfa.

Tabla 13: Se utilizaron diferentes programas de CytoPulse para determinar el voltaje mínimo requerido para la electroporación en células T derivadas de PBMC.

Tabla 14: Programa CytoPulse utilizado para electroporar células T purificadas.

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en los campos de la terapia génica, la bioquímica, la genética y la biología molecular.

Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, describiéndose en el presente documento métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes, a menos que se especifique lo contrario.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLo Gy (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), específicamente, los volúmenes 154 y 155 (Wu et al. eds.) y el volumen 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1986).

En un aspecto general, la presente invención se encuentra en el campo de nuevas estrategias de inmunoterapia adoptiva en el tratamiento del cáncer y las infecciones.

Células T no alorreactivas y resistentes a inmunosupresores:

En un aspecto particular, la presente invención se refiere a un método de modificación de células T, especialmente para inmunoterapia. En particular, este método comprende:

(a) modificar las células T inactivando al menos:

- Un primer gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor, y

- Un segundo gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR)

(b) expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.

Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la función inmune mediante uno de varios mecanismos de acción. En otras palabras, un agente inmunosupresor es una función desempeñada por un compuesto que presenta una capacidad para disminuir el alcance y/o la voracidad de una respuesta inmune. Como ejemplo no limitante, un agente inmunosupresor puede ser un inhibidor de la calcineurina, una diana de la rapamicina, un bloqueador de la cadena a de interleucina 2, un inhibidor de la inosina monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la ácido dihidrofólico reductasa, un corticosteroide o un antimetabolito inmunosupresor. Los inmunosupresores citotóxicos clásicos actúan inhibiendo la síntesis de ADN. Otros pueden actuar mediante la activación de células T o inhibiendo la activación de células auxiliares. El método de acuerdo con la invención permite conferir resistencia inmunosupresora a las células T para inmunoterapia inactivando la diana del agente inmunosupresor en las células T Como ejemplos no limitantes, las dianas para el agente inmunosupresor pueden ser un receptor para un agente inmunosupresor tal como: CD52, receptor de glucocorticoides (GR), un miembro del gen de la familia FKBP y un miembro del gen de la familia de las ciclofilinas.

La etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de un gen seleccionado del grupo formado por c D52, GR, TCR alfa y TCR beta. La etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de dos genes seleccionados del grupo que consiste en CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, TCR alfa y TCR beta. En una realización, la etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de más de dos genes. La modificación genética se opera ex vivo.

Mediante la inactivación de un gen se pretende que el gen de interés no se exprese en una forma de proteína funcional. La modificación genética puede depender de la expresión, en células proporcionadas para modificación, de una endonucleasa de corte poco común de modo que dicha endonucleasa de corte poco común catalice específicamente la escisión en un gen diana, inactivando así dicho gen diana. Las roturas de la cadena de ácido nucleico causadas por la endonucleasa de corte poco común ordinariamente se reparan mediante distintos mecanismos de recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ). Sin embargo, NHEJ es un proceso de reparación imperfecto que a menudo resulta en cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escisión. Los mecanismos implican la reinserción de lo que queda de los dos extremos del ADN mediante religación directa (Critchlow y Jackson 1998) o mediante la llamada unión de extremos mediada por microhomología (Ma, Kim et al. 2003). La reparación mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) a menudo da como resultado pequeñas inserciones o eliminaciones y puede usarse para la creación de eliminaciones de genes específicos. Dicha modificación puede ser una sustitución, eliminación o adición de al menos un nucleótido. Las células en donde ha ocurrido un evento de mutagénesis inducida por escisión, es decir, un evento de mutagénesis consecutivo a un evento NHEJ, pueden identificarse y/o seleccionarse mediante un método bien conocido en la técnica. Un método para modificar células puede comprender al menos una de las siguientes etapas:

(a) Proporcionar una célula T, preferiblemente de un cultivo celular o de una muestra de sangre;

(b) seleccionar un gen en dicha célula T que expresa una diana para un agente inmunosupresor;

(c) Introducir en dicha célula T una endonucleasa de corte poco común capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN, preferiblemente mediante rotura de doble cadena, respectivamente:

- dicho gen codifica una diana para dicho agente inmunosupresor, y

- al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR).

(d) expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.

El método también puede comprender:

(c) Transformar dicha célula T con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de corte poco común capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN, preferiblemente mediante rotura de doble cadena, respectivamente:

- dicho gen codifica una diana para dicho agente inmunosupresor, y

- al menos un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR);

(d) expresar dichas endonucleasas de corte poco común en dichas células T;

(e) Clasificar las células T transformadas, que no expresan TCR en su superficie celular;

(f) Expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.

En una realización particular, dicha endonucleasa de corte poco común se dirige específicamente a un gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y t Cr beta. En otra realización, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas para modificación de dos endonucleasas de corte poco común de manera que dichas dos endonucleasas de corte poco común catalizan específica y respectivamente la escisión en cada uno de los pares de genes seleccionados del grupo que consiste en CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, TCR alfa y T<c>R beta, inactivando así dichos genes diana. En otra realización, se pueden expresar más de dos endonucleasas de corte poco común en células para modificación con el fin de dirigirse a y/o inactivar más de dos genes.

En otra realización, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es CD52 y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende un anticuerpo humanizado específico para el antígeno CD52.

En otra realización, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es un receptor de glucocorticoides (GR) y el tratamiento inmunosupresor de la etapa d) o (e) comprende un corticosteroide tal como dexametasona.

Otro gen diana específico para un tratamiento inmunosupresor es un miembro del gen de la familia FKBP o una variante del mismo, que es una diana de un tratamiento inmunosupresor que comprende FK506, también conocido como tacrolimus o fujimicina. Dicho miembro del gen de la familia FKBP es FKBP12 o una variante del mismo.

Otro gen específico para un tratamiento inmunosupresor es un miembro del gen de la familia de las ciclofilinas o una variante del mismo, que es una diana de un tratamiento inmunosupresor que comprende ciclosporina.

La endonucleasa de corte poco común puede ser una meganucleasa, una nucleasa con dedos de zinc o una nucleasa TALE. En una realización preferida, dicha endonucleasa de corte poco común es una nucleasa TALE. Por nucleasa TALE se entiende una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ADN derivado de un efector similar a un activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico (Boch, Scholze et al., 2009; Moscou and Bogdanove 2009)(Deng, Yan et al., 2012; Mak, Bradley et al., 2012)(Christian, Cermak et al., 2010; Cermak, Doyle et al., 2011; Geissler, Scholze et al., 2011; Huang, Xiao et al., 2011; Li, Huang et al., 2011; Mahfouz, Li et al., 2011; Miller, Tan et al., 2011; Morbitzer, Romer et al., 2011; Mussolino, Morbitzer et al., 2011; Sander, Cade et al., 2011; Tesson, Usal et al., 2011; Weber, Gruetzner et al., 2011; Zhang, Cong et al., 2011; Li, Piatek et al., 2012; Mahfouz, Li et al., 2012). En la presente invención se han diseñado nuevas nucleasas TALE para apuntar con precisión a genes relevantes para estrategias de inmunoterapia adoptiva.

Las nucleasas TALE preferidas de acuerdo con la invención son aquellas que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en:

-SEQ ID NO: 1 a 6 (GR),

- SEQ ID NO: 37, 57 a 60 (TCR alfa),

- SEQ ID NO: 38 o 39 (TCR beta), y

- SEQ ID NO: 40, 61 a 65 (CD52)

Las nucleasas TALE pueden comprender una secuencia polipeptídica seleccionada de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 41 a la SEQ ID NO: 48, con el fin de escindir las respectivas secuencias diana SEQ ID NO: 1 a 6 y SEQ ID NO: 37 a 40.

Se puede introducir adicionalmente un dominio catalítico adicional en la célula con dicha endonucleasa de corte poco común para aumentar la mutagénesis con el fin de mejorar su capacidad para inactivar genes específicos. En particular, el dominio catalítico adicional puede ser una enzima procesadora de extremos de ADN. Ejemplos de enzimas de procesamiento de extremos de ADN incluyen exonucleasas 5-3', exonucleasas 3-5', exonucleasas alcalinas 5-3', endonucleasas de solapa 5', helicasas, fosfatasa, hidrolasas y ADN polimerasas independientes de molde. Los ejemplos de dicho dominio catalítico comprenden un dominio proteico o un derivado catalíticamente activo del dominio proteico seleccionado del grupo que consiste en hExol (EXO1_HUMANO), Exol (EXO1_LEVADURA), ExoI de E. coli, TREX2 humano, TREX1 de ratón, TREX1 humano, TREX1 Bovino, TREX1 de rata, TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal) ADN2 humano, ADN2 de levadura (ADN2_LEVADURA). El dominio catalítico adicional puede tener una actividad de exonucleasa 3'-5', y el dominio catalítico adicional puede ser TREX, por ejemplo, el dominio catalítico TREX2 (WO2012/058458). El dominio catalítico puede estar codificado por un polipéptido TREX de cadena sencilla. Dicho dominio catalítico adicional puede fusionarse con una proteína de fusión de nucleasa o una proteína quimérica opcionalmente mediante un conector peptídico.

Se sabe que las roturas endonucleolíticas estimulan la tasa de recombinación homóloga. Por lo tanto, la etapa de modificación genética del método puede comprender además una etapa de introducción en las células de un ácido nucleico exógeno que comprende al menos una secuencia homóloga a una porción de la secuencia de ácido nucleico diana, de manera que se produce una recombinación homóloga entre la secuencia de ácido nucleico diana y el ácido nucleico exógeno. El ácido nucleico exógeno puede comprender una primera y una segunda porciones que son homólogas a las regiones 5' y 3' de la secuencia de ácido nucleico diana, respectivamente. El ácido nucleico exógeno también puede comprender una tercera porción situada entre la primera y la segunda porción que no puede comprender ninguna homología con las regiones 5' y 3' de la secuencia de ácido nucleico diana. Después de la escisión de la secuencia de ácido nucleico diana, se estimula un evento de recombinación homóloga entre la secuencia de ácido nucleico diana y el ácido nucleico exógeno. Dentro de dicha matriz donante se pueden usar secuencias homólogas de al menos 50 pb, preferiblemente más de 100 pb y más preferiblemente más de 200 pb. El ácido nucleico exógeno puede tener de 200 pb a 6000 pb, por ejemplo, de 1000 pb a 2000 pb. De hecho, las homologías de ácidos nucleicos compartidas están situadas en regiones que flanquean secuencia arriba y secuencia abajo del sitio de la ruptura y la secuencia de ácido nucleico que se va a introducir debe estar situada entre los dos brazos.

En particular, el ácido nucleico exógeno puede comprender sucesivamente una primera región de homología con secuencias más arriba de dicha escisión, una secuencia para inactivar un gen diana seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta y una segunda región de homología con secuencias más abajo de la escisión. Dicha etapa de introducción de polinucleótidos puede ser simultánea, antes o después de la introducción o expresión de dicha endonucleasa de corte poco común. Dependiendo de la ubicación de la secuencia de ácido nucleico diana en donde se ha producido el evento de ruptura, dicho ácido nucleico exógeno puede usarse para desactivar un gen, por ejemplo, cuando el ácido nucleico exógeno se localiza dentro del marco de lectura abierto de dicho gen, o para introducir nuevas secuencias o genes de interés. Las inserciones de secuencia mediante el uso de dicho ácido nucleico exógeno se pueden usar para modificar un gen diana existente, mediante corrección o reemplazo de dicho gen (intercambio de alelo, por ejemplo), o para sobrerregular o subregular la expresión del gen diana (intercambio de promotor, por ejemplo), dicha corrección o reemplazo del gen diana. La inactivación de genes del grupo que consiste en CD52, g R, TCR alfa y TCR beta se puede realizar en una ubicación genómica precisa dirigida por una nucleasa TALE específica, en donde dicha nucleasa TALE específica cataliza una escisión y en donde dicho ácido nucleico exógeno comprende sucesivamente al menos una región de homología y una secuencia para inactivar un gen diana seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta que está integrado mediante recombinación homóloga. Se pueden inactivar varios genes, sucesivamente o al mismo tiempo, usando varias nucleasas TALE respectivamente y dirigiéndose específicamente a un gen definido y varios polinucleótidos específicos para la inactivación de genes específicos.

Por etapa de modificación genómica adicional también se puede entender la inactivación de otro gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta. Como se mencionó anteriormente, dicha etapa de modificación genómica adicional puede ser una etapa de inactivación que comprende:

(a) introducir en dichas células al menos una endonucleasa de corte poco común de modo que dicha endonucleasa de corte poco común catalice específicamente la escisión en una secuencia diana del genoma de dicha célula.

(b) introducir opcionalmente en dichas células un ácido nucleico exógeno que comprende sucesivamente una primera región de homología con secuencias más arriba de dicha escisión, una secuencia que se insertará en el genoma de dicha célula y una segunda región de homología con secuencias más abajo de dicha escisión,

en donde dicho ácido nucleico exógeno introducido inactiva un gen e integra al menos una secuencia de polinucleótidos exógena que codifica al menos una proteína recombinante de interés. La secuencia de polinucleótidos exógena está integrada dentro de un gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta.

El método para modificar una célula puede comprender además una etapa de modificación genómica adicional. Por etapa de modificación genómica adicional, se puede pretender la introducción en células para modificar una proteína de interés. Dicha proteína de interés puede ser, por ejemplo, pTalfa o variante funcional de la misma, un receptor de antígeno quimérico (CAR), un CAR de múltiples cadenas, un anticuerpo biespecífico o una endonucleasa de corte poco común dirigida a PDCD1 o CTLA-4 como se describe en la presente divulgación.

El método de la invención puede hacer uso de nucleasas TALE. De acuerdo con una realización, el método de la invención utiliza una nucleasa TALE que comprende:

(a) Un dominio de unión al ADN efector similar al activador de la transcripción (TALE) que ha sido modificado para unirse a una secuencia diana dentro de genes seleccionados del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta;

(b) Un dominio de escisión o un medio dominio de escisión.

Las nucleasas TALE que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen aquellas que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 1 a 6 (GR),

SEQ ID NO: 37, 57 a 60 (TCR alfa),

SEQ ID NO: 38 o 39 (TCR beta), y

SEQ ID NO: 40, 61 a 65 (CD52)

Dichas nucleasas TALE pueden comprender una secuencia polipeptídica seleccionada de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 18 y de la SEQ iD NO: 41 a la SEQ ID NO: 48, con el fin de escindir las respectivas secuencias diana SEQ ID NO: 1 a 6 y SEQ ID NO: 37 a 40.

Debido a que puede surgir cierta variabilidad a partir de los datos genómicos de los que derivan estos polipéptidos, y también para tener en cuenta la posibilidad de sustituir algunos de los aminoácidos presentes en estos polipéptidos sin una pérdida significativa de actividad (variantes funcionales), se pueden utilizar variantes polipeptídicas de los polipéptidos anteriores que comparten al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 % e incluso más preferentemente al menos el 95 % de identidad con las secuencias al realizar la invención.

La presente invención puede así realizarse con polipéptidos que comprenden una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, un 95 % un 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 18 y de la SEQ ID NO: 41 a la SEQ ID NO: 48.

Al realizar la invención también se pueden utilizar polinucleótidos, vectores que codifican las endonucleasas de corte poco común descritas anteriormente.

En el alcance de la presente invención también se incluyen células aisladas o líneas celulares susceptibles de obtenerse mediante dicho método para modificar células, en particular células T, en donde al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta ha sido desactivado. Preferiblemente, se han inactivado dos genes seleccionados del grupo formado por CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, TCR alfa y TCR beta.

De acuerdo con la invención, estos genes se inactivan preferentemente mediante al menos una endonucleasa de corte poco común. Los inventores han demostrado que el uso de nucleasas TALE era particularmente ventajoso para lograr una doble inactivación en las células T. La invención abarca una célula T aislada que comprende al menos dos polinucleótidos, codificando dichos polinucleótidos al menos una primera y una segunda nucleasa TALE, preferentemente la primera nucleasa TALE dirigida contra un gen que codifica TCR y la segunda dirigida contra un gen que codifica un receptor de un agente inmunosupresor, tal como CD52 o GR.

Dicha célula aislada puede comprender además una modificación genómica adicional. La modificación genómica adicional puede ser la integración de al menos una secuencia de polinucleótidos exógena. La secuencia exógena se puede integrar en un gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta.

PreTalfa

En otro aspecto no mencionado en las reivindicaciones de esta patente, pero que aún no es incompatible con el objeto reivindicado, el presente texto proporciona un método para expandir células T deficientes en TCR alfa que comprende introducir en dicha célula T pTalfa (también denominado preTCRa) o una variante funcional del mismo y expandir dichas células, opcionalmente mediante estimulación del complejo CD3. Un método de este tipo puede comprender: a) Transformar dichas células con ácido nucleico que codifica al menos un fragmento de pTalfa para soportar la expresión de CD3 en la superficie.

b) Expresar dicho pTalfa en dichas células

c) Expandir dichas células opcionalmente, opcionalmente mediante estimulación del complejo CD3.

Un método de preparación de células T para inmunoterapia puede comprender etapas del método de expansión de células T.

La secuencia de polinucleótidos de pTalfa puede introducirse aleatoriamente o también mediante recombinación homóloga, en particular la inserción podría estar asociada a la inactivación del gen de TCR alfa.

Se pueden utilizar diferentes variantes funcionales de pTalfa. Una "variante funcional" del péptido se refiere a una molécula sustancialmente similar al péptido completo o a un fragmento del mismo. Un "fragmento" del pTalfa o variante funcional del mismo se refiere a cualquier subconjunto de la molécula, es decir, un péptido más corto. PTalfa o variantes funcionales pueden ser pTalfa de longitud completa o una versión de pTalfa truncada en el extremo terminal C. El pTalfa truncado en el extremo terminal C carece de uno o más residuos en el extremo terminal C. Por ejemplo, la versión de pTalfa truncada en el extremo terminal C carece de 18, 48, 62, 78, 92, 110 o 114 residuos del extremo terminal C de la proteína (SEQ ID NO: 107 a SEQ ID NO: 114). Además, se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos del péptido mediante mutaciones en el ADN que codifica el péptido. Dichas variantes funcionales incluyen, por ejemplo, eliminaciones o inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. También se puede realizar cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea la actividad deseada, en particular la restauración de un complejo CD3 funcional. Se puede introducir al menos una mutación en las diferentes versiones de pTalfa como se describió anteriormente para afectar la dimerización. Por ejemplo, el residuo mutado puede ser al menos W46R, D22A, K24A, R102A o R117A de la proteína pTalfa humana o posiciones alineadas usando el método CLUSTALW en la familia de pTalfa o en un miembro homólogo. Preferiblemente, pTalfa o una variante del mismo como se describió anteriormente comprende el residuo mutado W46R (SEQ ID NO: 123) o los residuos mutados D22A, K24A, R102A y R117A (SEQ ID NO: 124). El pTalfa o sus variantes también pueden fusionarse a un dominio transductor de señales tal como CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) y CD8, por ejemplo (SEQ ID NO: 115 a SEQ ID NO: 120). El dominio extracelular de pTalfa o variantes como se describió anteriormente se pueden fusionar con un fragmento de la proteína TCR alfa, particularmente el dominio transmembrana e intracelular de TCR alfa (SEQ ID NO: 122). Las variantes de pTalfa también pueden fusionarse con el dominio intracelular de TCR alfa (SEQ ID NO:121).

Las versiones de pTalfa se pueden fusionar a un dominio de unión a ligando extracelular y más preferiblemente pTalfa o variante funcional del mismo se fusiona a un fragmento de anticuerpo de cadena única (scFV) que comprende el fragmento variable ligero (V<l>) y el pesado (V<h>) de un anticuerpo monoclonal específico del antígeno diana unido mediante un conector flexible. La secuencia de aminoácidos de pTalfa o variante funcional de la misma se puede seleccionar del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 107 a la Se Q ID NO: 124.

Debido a que puede surgir cierta variabilidad a partir de los datos genómicos de los que se derivan estos polipéptidos, y también para tener en cuenta la posibilidad de sustituir algunos de los aminoácidos presentes en estos polipéptidos sin una pérdida significativa de actividad (variantes funcionales), el presente texto proporciona variantes de polipéptidos de los polipéptidos anteriores que comparten al menos el 70 %, preferiblemente al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 90 % e incluso más preferiblemente al menos el 95 % de identidad con las secuencias proporcionadas en esta solicitud de patente.

También se describen en el presente documento polipéptidos que comprenden una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, un 95 %, un 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 107 a la SEQ ID NO: 124.

Por célula T deficiente en TCR alfa se entiende una célula T aislada que carece de expresión de una cadena TCR alfa funcional. Esto se puede lograr por diferentes medios, como ejemplos no limitantes, modificando una célula T de manera que no exprese ningún TCR alfa funcional en su superficie celular o modificando una célula T de manera que produzca muy poca cadena TCR alfa funcional en su superficie o modificando una célula T para expresar la forma mutada o truncada de la cadena TCR alfa.

Las células deficientes en TCR alfa ya no pueden expandirse a través del complejo CD3. Por lo tanto, para superar este problema y permitir la proliferación de células deficientes en TCR alfa, se introduce pTalfa o una variante funcional del mismo en dichas células, restaurando así un complejo CD3 funcional. En una realización preferida, el método comprende además introducir en dichas células T endonucleasas de corte poco común capaces de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN un gen que codifica un componente del receptor de células T (TCR). En una realización particular, dicha endonucleasa de corte poco común es una nucleasa TALE. Como ejemplos no limitantes, la nucleasa TALE está dirigida contra una de las secuencias diana del gen de TCR alfa seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 37 y la SEQ ID NO: 57 a 60. Preferiblemente, las nucleasas TALE se seleccionan del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 42.

Dicho método para la expansión de células T deficientes en TCR alfa puede comprender una etapa de modificación genómica adicional. Por etapa de modificación genómica adicional, se puede pretender la introducción en células para modificar una proteína de interés. Dicha proteína de interés puede ser, como ejemplos no limitantes, un receptor de antígeno quimérico (CAR), particularmente un CAR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73, un<c>A<r>de múltiples cadenas, particularmente CAR de múltiples cadenas que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 125 un anticuerpo biespecífico, endonucleasas de corte poco común dirigidas a PDCD1 o CTLA-4, particularmente dirigidas a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 74 a la SEQ ID NO: 78 o una endonucleasa de corte poco común dirigida a una diana para un agente inmunosupresor como se describe en la presente divulgación.

También se describen en el presente texto polipéptidos que codifican pTalfa, particularmente variantes funcionales descritas anteriormente. También se describen en el presente documento un pTalfa o una variante funcional del mismo fusionado a un dominio transductor de señales tal como CD28, OX40, ICOS, CD137 y CD8. Más particularmente, la solicitud de patente describe una variante funcional de pTalfa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 107 a la SEQ ID NO: 124. También se describen en el presente documento polinucleótidos, vectores que codifican pTalfa o variantes funcionales de los mismos descritos anteriormente.

En el alcance de la presente divulgación también se incluyen células aisladas o líneas celulares susceptibles de ser obtenidas mediante dicho método. En particular, dichas células o líneas celulares aisladas se obtienen introduciendo en dichas células un pTalfa o una variante funcional del mismo para soportar la expresión de CD3 en la superficie. En una realización preferida, dicha célula o línea celular aislada se modifica genéticamente adicionalmente inactivando el gen de TCR alfa. Preferiblemente, este gen es inactivado por al menos una endonucleasa de corte poco común. En una realización preferida, dicha endonucleasa de corte poco común es la nucleasa TALE.

Receptor de antígeno quimérico de múltiples cadenas (CAR)

En una realización, la invención hace uso de un receptor de antígeno quimérico (CAR) de múltiples cadenas particularmente adaptado a la producción y expansión de células T modificadas de la presente invención. El CAR de múltiples cadenas que comprende al menos dos de los siguientes componentes:

a) un polipéptido que comprende el dominio transmembrana de la cadena alfa de F<ce>RI y un dominio de unión a ligando extracelular,

b) un polipéptido que comprende una parte de la cola citoplasmática del extremo terminal N y C y el dominio transmembrana de la cadena beta de FceRI y/o

c) dos polipéptidos que comprenden cada uno una parte de la cola intracitoplasmática y el dominio transmembrana de la cadena gamma de FceRI, por lo que diferentes polipéptidos se multimerizan juntos espontáneamente para formar CAR dimérico, trimérico o tetramérico.

En la Figura 3 se ilustra un ejemplo de CAR tetramérico. En la Figura 4 se representan diferentes versiones de CAR de múltiples cadenas. Un ejemplo de CAR de múltiples cadenas comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 125. El término "una parte de" utilizado en el presente documento se refiere a cualquier subconjunto de la molécula, es decir, un péptido más corto. Alternativamente, se pueden preparar variantes funcionales de secuencia de aminoácidos del polipéptido mediante mutaciones en el a Dn que codifica el polipéptido.

Dichas variantes funcionales incluyen, por ejemplo, eliminaciones o inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. También se puede realizar cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea la actividad deseada, especialmente para exhibir una actividad inmune específica anti-celular diana.

Dicho dominio de unión a ligando extracelular puede ser un scFv. También se pueden utilizar otros dominios de unión además de scFv para dirigirse en forma predefinida a linfocitos, tales como fragmentos de anticuerpos de dominio único de camélidos o ligandos de receptores como un polipéptido del factor de crecimiento endotelial vascular, un péptido de unión a integrinas, heregulina o una muteína de IL-13, dominios de unión de anticuerpos, bucles hipervariables de anticuerpos o CDR, por ejemplo.

Dicho polipéptido de a) puede comprender además una región de tallo entre dicho dominio de unión a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. El término "región del tallo" utilizado en el presente documento generalmente significa cualquier oligo o polipéptido que funcione para unir el dominio transmembrana al dominio de unión al ligando extracelular. En particular, la región del tallo se utiliza para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad al dominio de unión al ligando extracelular. Una región del tallo puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos y lo más preferiblemente de 25 a 50 aminoácidos. La región del tallo puede derivarse de todo o parte de moléculas de origen natural, tales como de todo o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de todo o parte de una región constante de anticuerpo. Alternativamente, la región del tallo puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia del tallo de origen natural, o puede ser una secuencia del tallo completamente sintética.

Dicho polipéptido de a), b) y/o c) puede comprender además al menos un dominio transductor de señales. Dicho dominio transductor de señales se puede seleccionar del grupo formado por CD28, OX40, ICOS, CD137 y CD8.

Dicha cola citoplásmica del extremo terminal C del fragmento de cadena alfa, beta y/o gamma de F<ce>RI puede comprender además motivos de unión al Factor 2 asociado a TNFR (TRAF2). Dicha cola citoplásmica del extremo terminal C de la cadena alfa, beta y/o gamma de FceRI puede reemplazarse por la cola intracitoplasmática de la familia de miembros coestimuladores de TNFR. La cola citoplásmica del miembro coestimulador de la familia TNFR contiene motivos de unión a TRAF2 que consisten en el motivo conservado principal (P/S/A)X(Q/E)E) o el motivo menor (PXQXXD), en donde X es cualquier aminoácido. Las proteínas TRAf se reclutan en las colas intracelulares de muchos TNFR en respuesta a la trimerización del receptor.

Dicho dominio intracitoplasmático de la cadena alfa, beta y/o gamma de FceRI también puede reemplazarse por el dominio intracitoplasmático de la cadena zeta de t Cr (también denominado CD3 zeta). Dicho dominio intracitoplasmático de la cadena alfa, beta y/o gamma de F<ce>RI también puede comprender al menos un motivo adicional de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM). Los ITAM son motivos de señalización bien definidos que se encuentran en la cola intracitoplasmática de una variedad de receptores que sirven como sitios de unión para las tirosina quinasas de clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM que se pueden usar en la invención incluyen aquellos derivados de TCRzeta, FCRgamma, FCRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.

Por ejemplo, en la Figura 4 se ilustran diferentes versiones de CAR de múltiples cadenas.

El CAR de múltiples cadenas puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 125. La presente solicitud de patente proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 125.

También se proporcionan en el presente documento polinucleótidos, vectores que codifican el CAR de múltiples cadenas descrito anteriormente de acuerdo con la invención.

También se proporciona en el presente documento un método para preparar células T para inmunoterapia que comprende introducir en dichas células T los diferentes polipéptidos que componen dicho CAR de múltiples cadenas y expandir dichas células.

Dicho método puede comprender además una etapa de modificación genética de dichas células inactivando al menos un gen que expresa un componente del TCR y/o una diana para un agente inmunosupresor. Dicho gen puede seleccionarse del grupo formado por TCR alfa, TCR beta, CD52 y GR. Dicho método puede comprender además introducir en dichas células T una endonucleasa de corte poco común capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN dichos genes. Dicha endonucleasa de corte poco común puede ser nucleasa TALE. Las nucleasas TALE preferidas de acuerdo con la invención son aquellas que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 a 6 (GR), SEQ ID NO: 37, 57 a 60 (TCR alfa), SEQ ID NO: 38 o 39 (TCR beta), y SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 65 (CD52).

Dicho método puede comprender además una etapa de modificación genómica adicional. Por etapa de modificación genómica adicional, se puede pretender la introducción en células para modificar una proteína de interés. Dicha proteína de interés puede ser, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, una endonucleasa de corte poco común dirigida a PDCD1 o CTLA-4, un pTalfa o una variante funcional del mismo como se describe en la presente divulgación.

La presente invención también se refiere a células aisladas o líneas celulares susceptibles de obtenerse mediante dicho método para modificar células. En particular, dicha célula aislada comprende secuencias de polinucleótidos exógenas que codifican polipéptidos que componen dicho CAR de múltiples cadenas.

Células T PDCD1 o CTLA4 inactivadas

Otro enfoque para activar la inmunidad antitumoral terapéutica es el bloqueo de los puntos de control inmunológico. Este enfoque no se reivindica en la presente patente, pero no es incompatible con el objeto reivindicado. La respuesta inmune está regulada por el contrapeso de las señales estimulantes e inhibidoras. La expresión de proteínas de puntos de control inmunológico puede verse desregulada por los tumores y puede ser un importante mecanismo de resistencia inmunológica. Los reguladores negativos de la función de las células T incluyen moléculas tales como CTLA-4, una molécula reguladora negativa clave que subregula las vías de activación de las células T y muerte programada-1 (PD1), también conocida como PDCD1, un receptor transmembrana sobrerregulado en células T activadas que cuando se unen a su ligando (ligando 1 de muerte programada, PD-L1) conducen a una disminución de la producción de citoquinas y a la proliferación de células T (Pardoll 2012). Por lo tanto, los antagonistas de la señal inhibidora dan como resultado la amplificación de la respuesta de las células T específicas de antígeno.

Por lo tanto, un método de modificación de células T, especialmente para inmunoterapia, puede comprender modificar genéticamente células T inactivando al menos una proteína implicada en el punto de control inmunológico, en particular PDCD1 y/o CTLA-4.

Un método de este tipo puede comprender una de las siguientes etapas:

(a) proporcionar una célula T,

(b) introducir en dicha célula T una endonucleasa de corte poco común capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN el gen PDCD1 o el gen CTLA-4; y

(c) expandir dichas células.

Dicha endonucleasa de corte poco común puede ser una nucleasa TALE. Se han diseñado nuevas nucleasas TALE para atacar con precisión genes relevantes para estrategias de inmunoterapia adoptiva. Tales nucleasas TALE son aquellas que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 77 y la SEQ ID NO: 78 (PDCD-1), SEQ ID NO: 74 a SEQ ID NO: 76 (CTLA-4). Dichos polipéptidos de nucleasas TALE pueden comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 79 a la SEQ ID NO: 88.

Polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, un 95 %, un 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 79 a la SEQ ID NO: 88 también se describen en el presente documento, así como polinucleótidos y vectores que codifican las endonucleasas de corte poco común descritas anteriormente. Este método puede asociarse con cualquiera de los diferentes métodos descritos en la presente divulgación.

Anticuerpos biespecíficos

Las células T modificadas genéticamente obtenidas mediante los diferentes métodos descritos anteriormente se pueden exponer aún más con anticuerpos biespecíficos. Este aspecto no se reivindica en la presente patente pero no es incompatible con el objeto reivindicado. Dichas células T podrían estar expuestas a anticuerpos biespecíficos ex vivo antes de la administración a un paciente o in vivo después de la administración a un paciente. Dichos anticuerpos biespecíficos comprenden dos regiones variables con propiedades antigénicas distintas que permiten acercar las células modificadas a un antígeno diana. Por ejemplo, dicho anticuerpo biespecífico puede dirigirse contra un marcador tumoral y un antígeno linfocitario tal como c D3 y tiene el potencial de redirigir y activar cualquier célula T circulante contra tumores.

Métodos de suministro

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican introducir pTalfa o variantes funcionales del mismo, endonucleasa de corte poco común, nucleasa TALE, CAR o CAR de múltiples cadenas opcionalmente con enzima procesadora del extremo del ADN o ácido nucleico exógeno en una célula.

Por ejemplo, dicho pTalfa o variante funcional del mismo, endonucleasas de corte poco común, nucleasas TALE, CAR o CAR de múltiples cadenas opcionalmente con enzima de procesamiento del extremo del ADN o ácido nucleico exógeno se pueden introducir como transgenes codificados por uno o como diferentes vectores plasmídicos. Se pueden incluir diferentes transgenes en un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de salto ribosomal tal como una secuencia que codifica un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo de aftovirus de picornavirus, provocan un "salto" ribosómico de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase, Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. and Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)). Por "codón" se entiende tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena sentido de una molécula de ADN) que son traducidos por un ribosoma en un residuo de aminoácido. Por lo tanto, se pueden sintetizar dos polipéptidos a partir de un único marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNm cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptidos 2A que está en marco. Dichos mecanismos de salto ribosómico son bien conocidos en la técnica y se sabe que son utilizados por varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un único ARN mensajero. Por ejemplo, se han utilizado péptidos 2A para expresar en la célula la endonucleasa de corte poco común y una enzima de procesamiento del extremo del ADN o los diferentes polipéptidos del CAR de múltiples cadenas.

Dicho vector plasmídico puede contener un marcador de selección que proporciona la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.

Se pueden sintetizar polipéptidos in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos en la célula. Alternativamente, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y luego introducirse en la misma. Los métodos para introducir una construcción de polinucleótido en células animales se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos de transformación estable en los que la construcción de polinucleótido se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que la construcción de polinucleótido no se integra en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, para expresarse en células.

- Electroporación

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos divulgados en el presente documento pueden ser ARNm que se introduce directamente en las células, por ejemplo, mediante electroporación. Los inventores determinaron las condiciones óptimas para la electroporación de ARNm en células T

El inventor utilizó la tecnología cytoPulse que permite, mediante el uso de campos eléctricos pulsados, permeabilizar transitoriamente las células vivas para el suministro de material al interior de las células. La tecnología, basada en el uso de formas de onda de electroporación PulseAgile (propiedad de Cellectis), garantiza un control preciso de la duración, la intensidad y el intervalo entre pulsos (patente de los Estados Unidos No. 6,010,613 y la solicitud internacional PCT WO2004083379). Todos estos parámetros se pueden modificar para alcanzar las mejores condiciones para una alta eficiencia de transfección con una mortalidad mínima. Básicamente, los primeros pulsos de campo eléctrico alto permiten la formación de poros, mientras que los pulsos de campo eléctrico más bajos posteriores permiten mover el polinucleótido hacia el interior de la célula. El inventor describe en el presente documento las etapas que condujeron al logro de >95 % de eficiencia de transfección de ARNm en células T y el uso del protocolo de electroporación para expresar transitoriamente diferentes tipos de proteínas en células T En particular, la invención se puede realizar usando un método para transformar células T que comprende poner en contacto dicha célula T con ARN y aplicar a la célula T una secuencia de pulsos ágil que consiste en

(a) un pulso eléctrico con un intervalo de voltaje de 2250 a 3000 V por centímetro, un ancho de pulso de 0.1 ms y un intervalo de pulso de 0.2 a 10 ms entre los pulsos eléctricos de las etapas (a) y (b);

(b) un pulso eléctrico con un intervalo de voltaje de 2250 a 3000 V con un ancho de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso eléctrico de la etapa (b) y el primer pulso eléctrico de la etapa (c); y

(c) 4 pulsos eléctricos con un voltaje de 325 V con un ancho de pulso de 0.2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de los 4 pulsos eléctricos.

El método de transformación de células T puede comprender poner en contacto dicha célula T con ARN y aplicar a la célula T una secuencia de pulsos ágiles que consiste en:

(a) un pulso eléctrico con un voltaje de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 V por centímetro, un ancho de pulso de 0.1 ms y un intervalo de pulso de 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ms entre los pulsos eléctricos de las etapas (a) y (b);

(b) un pulso eléctrico con un intervalo de voltaje de 2250, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 V con un ancho de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso eléctrico de la etapa (b) y el primer pulso eléctrico de la etapa (c); y

Cualquier valor incluido en el intervalo de valores descrito anteriormente se divulga en la presente solicitud. El medio de electroporación puede ser cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Preferiblemente, el medio de electroporación tiene una conductividad en un intervalo que abarca de 0.01 a 1.0 miliSiemens. Por ejemplo, dicho ARN puede codificar una endonucleasa de corte poco común, un monómero de la endonucleasa de corte poco común tal como nucleasa Half-TALE, un receptor de antígeno quimérico, al menos un componente del receptor de antígeno quimérico de múltiples cadenas, un pTalfa o variante funcional del mismo, un ácido nucleico exógeno, un dominio catalítico adicional.

Activación y expansión de células T.

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T, las células T pueden activarse y expandirse generalmente usando métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la publicación de solicitud de patente de los estados Unidos No. 20060121005. Las células T se pueden expandir in vitro o in vivo.

Generalmente, las células T de la invención se expanden por contacto con una superficie que tiene unido a la misma un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3 TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T.

En particular, las poblaciones de células T pueden ser estimuladas in vitro tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, se puede poner en contacto una población de células T con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T<c>D8+, se utiliza un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Como podrán apreciar fácilmente los expertos en la técnica, la proporción de partículas a células puede depender del tamaño de las partículas con respecto a la célula diana. Las células, tales como células T, se pueden combinar con perlas recubiertas de agente, las perlas y las células se separan posteriormente y luego se cultivan las células. Alternativamente, antes del cultivo, las células y perlas recubiertas con el agente no se separan sino que se cultivan juntas. Las proteínas en la superficie de la célula pueden ligarse permitiendo que perlas paramagnéticas a las que están unidos anti-CD3 y anti-CD28 (3x28 perlas) entren en contacto con las células T En una realización, las células (por ejemplo, de 4 a 10 células T) y las perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T en una proporción de 1:1) se combinan en un tampón, preferiblemente PBS (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). Nuevamente, los expertos en la técnica podrán apreciar fácilmente que se puede usar cualquier concentración celular. La mezcla se puede cultivar durante varias horas (aproximadamente 3 horas) hasta aproximadamente 14 días o cualquier valor entero horario en el medio. La mezcla puede cultivarse durante 21 días. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (p. ej., medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluido suero (p. ej., suero fetal bovino o humano), interleucina 2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocidas por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, entre otros, tensioactivos, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o suplementado con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina o citoquinas suficiente para el crecimiento y expansión de las células T Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen sólo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y una atmósfera (por ejemplo, aire más 5 % de CO2) apropiadas. Las células T que han sido expuestas a distintos tiempos de estimulación pueden presentar características diferentes

Dichas células se pueden expandir mediante cocultivo con tejido o células. Dichas células también se pueden expandir in vivo, por ejemplo, en la sangre del sujeto después de administrar dicha célula al sujeto.

Células T modificadas

En el alcance de la presente invención también se incluye una célula T aislada obtenida de acuerdo con uno de los métodos previamente descritos y reivindicados en la presente patente. Dicha célula T de acuerdo con la presente invención puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias, en particular células madre no humanas, células madre de la sangre del cordón umbilical, células progenitoras, células madre de la médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes no humanas o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son las células CD34+. Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula NK, una célula B o una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T colaboradores. Dicha célula puede derivarse del grupo formado por linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, se puede obtener una fuente de células de un sujeto mediante una variedad de métodos no limitantes. Las células T se pueden obtener de varias fuentes no limitantes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Puede usarse cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En una realización, dicha célula puede derivarse de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. Dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente invención también se incluye una línea celular obtenida a partir de una célula T transformada de acuerdo con el método descrito previamente. Se engloban en el alcance de la presente invención las células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de ser obtenidas mediante el método anterior.

Dicha célula aislada de acuerdo con la presente invención comprende un gen inactivado seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta y expresa un<c>A<r>o un CAR de múltiples cadenas. Puede expresar además un transgén pTalfa. Dicha célula aislada de acuerdo con la presente invención comprende dos genes inactivados seleccionados del grupo que consiste en CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, y expresa un CAR o un CAR de múltiples cadenas, y posiblemente exprese un transgén pTalfa.

El TCR se vuelve no funcional en las células de acuerdo con la invención mediante la inactivación del gen de TCR alfa y/o del gen o genes de TCR beta. Las estrategias anteriores se utilizan más particularmente para evitar GvHD. En un aspecto particular se encuentra un método para obtener células modificadas derivadas de un individuo, en donde dichas células pueden proliferar independientemente de la vía de señalización del complejo principal de histocompatibilidad. Dicho método comprende las siguientes etapas:

(a) Recuperar células de dicho individuo;

(b) Modificar genéticamente dichas células ex vivo inactivando los genes de TCR alfa o TCR beta;

(c) Cultivar células T genéticamente modificadas in vitro en condiciones apropiadas para amplificar dichas células.

Las células modificadas, que pueden proliferar independientemente de la vía de señalización del complejo principal de histocompatibilidad, susceptibles de ser obtenidas mediante este método, están incluidas en el alcance de la presente invención. Dichas células modificadas se pueden usar para tratar a pacientes que las necesiten contra el rechazo de huésped contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD); por lo tanto, un método para tratar a pacientes que lo necesitan contra el rechazo de huésped contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) puede comprender tratar a dicho paciente administrándole a dicho paciente una cantidad eficaz de células modificadas que comprenden genes de TCR alfa y/o TCR beta inactivados.

Aplicaciones terapéuticas

Las células aisladas obtenidas mediante diferentes métodos o líneas celulares derivadas de dicha célula aislada como se describió anteriormente se pueden usar como medicamento. Dicho medicamento se puede utilizar para tratar cáncer o infecciones en un paciente que lo necesite. Dicha célula aislada de acuerdo con la invención o línea celular derivada de dicha célula aislada se puede utilizar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o una infección viral en un paciente que lo necesite.

Los métodos para tratar a pacientes que lo necesiten pueden comprender al menos uno de las siguientes etapas:

(a) Proporcionar una célula T obtenible mediante cualquiera de los métodos descritos previamente;

(b) Administrar dichas células T transformadas a dicho paciente,

Las células T de la invención pueden sufrir una expansión robusta de células T in vivo y puede persistir durante un período prolongado de tiempo.

Dicho tratamiento puede ser mejorador, curativo o profiláctico. Puede ser parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogo se entiende que las células, línea celular o población de células utilizadas para tratar a pacientes se originan a partir de dicho paciente o de un donante compatible con el antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénico se entiende que las células o población de células utilizadas para tratar a los pacientes no se originan en dicho paciente sino en un donante.

La invención es particularmente adecuada para la inmunoterapia alogénica, en la medida en que permite la transformación de células T, normalmente obtenidas de donantes, en células no alorreactivas. Esto puede realizarse de acuerdo con protocolos estándar y reproducirse tantas veces como sea necesario. Las células T modificadas resultantes pueden combinarse y administrarse a uno o varios pacientes, estando disponibles como un producto terapéutico "disponible en el mercado".

Las células que se pueden utilizar con los métodos divulgados se describen en la sección anterior. Dicho tratamiento se puede utilizar para tratar pacientes diagnosticados con cáncer, infección viral, trastornos autoinmunes o enfermedad de injerto contra huésped (GvHD). Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o que aún no están sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres que se van a tratar con CAR incluyen, entre otros, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos y neoplasias, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen tumores/cánceres en adultos y tumores/cánceres pediátricos.

Puede ser un tratamiento en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citoquinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, dicho tratamiento se puede administrar a pacientes sometidos a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención se basa preferiblemente en células o población de células que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para dicho agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería ayudar a la selección y expansión de las células T de acuerdo con la invención dentro del paciente.

La administración de las células o población de células de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa o intralinfática, o intraperitonealmente. Las composiciones celulares se pueden administrar preferiblemente mediante inyección intravenosa.

La administración de las células o población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferiblemente 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros de números de células dentro de esos intervalos. Las células o población de células se pueden administrar en una o más dosis. Dicha cantidad eficaz de células se puede administrar como una dosis única. Dicha cantidad eficaz de células se puede administrar como más de una dosis durante un período de tiempo. El momento de la administración queda a criterio del médico tratante y depende de la condición clínica del paciente. Las células o población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades efectivas de un tipo de célula dado para una enfermedad o afecciones particulares está dentro de los conocimientos de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

Dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende esas células se puede administrar por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración se puede realizar directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En ciertas realizaciones de la presente invención, las células se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, entre otras, tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina 2, tratamiento con citarabina (también conocida como ARA-C) o nataliziimab para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. En realizaciones adicionales, las células T de la invención se pueden usar en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos medicamentos inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente del calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). Las composiciones celulares de la presente invención se pueden administrar a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T usando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. Las composiciones celulares de la presente invención se pueden administrar después de una terapia ablativa de células B, tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con dosis altas de quimioterapia seguida de un trasplante de células madre de sangre periférica. Por ejemplo, después del trasplante, los sujetos pueden recibir una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. Las células expandidas se pueden administrar antes o después de la cirugía. Dichas células modificadas obtenidas mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento se pueden usar en un aspecto particular de la invención para tratar a pacientes que lo necesitan contra el rechazo de huésped contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD); por lo tanto, en el alcance de la presente invención está un método para tratar a pacientes que lo necesitan contra el rechazo de huésped contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) que comprende tratar a dicho paciente mediante la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de células modificadas que comprenden genes de TCR alfa y/o TCR beta inactivados.

Ejemplo de método para modificar células alogénicas humanas para inmunoterapia

Para una mejor comprensión de la invención, en la Figura 5 se ilustra un ejemplo de método para modificar células alogénicas humanas para inmunoterapia. El método comprende una combinación de una o varias de las siguientes etapas:

1. Proporcionar células T de un cultivo celular o de una muestra de sangre de un paciente individual o de un banco de sangre y activar dichas células T usando perlas activadoras anti-CD3/C28. Las perlas proporcionan señales primarias y coestimuladoras necesarias para la activación y expansión de las células T

2.

a) Transducir dichas células con pTalfa o una variante funcional del transgén para soportar la expresión de CD3 en la superficie y permitir la expansión celular mediante la estimulación del complejo CD3. Se espera que la alteración del TCR elimine el complejo TCR y elimine la alorreactividad (GvHD), pero puede alterar la expansión de las células alogénicas debido a la pérdida del componente de señalización CD3. Se espera que las células transducidas expresen la cadena pTalfa o una variante funcional de la misma. Esta cadena pTalfa se empareja con la cadena TCR beta y los componentes de señalización CD3 para formar el complejo preTCR y, así, restaurar un complejo CD3 funcional y apoyar la activación o estimulación de células TCR alfa inactivadas. La transducción de células T con el vector lentiviral pTalfa se puede realizar antes o después de la inactivación de TCR alfa.

b) La transducción de dichas células con CAR de múltiples cadenas permite redirigir las células T contra antígenos expresados en la superficie de las células diana de diversas neoplasias malignas, incluidos linfomas y tumores sólidos. Para mejorar la función del dominio coestimulador, los inventores han diseñado un CAR de múltiples cadenas derivado de FceRI como se describió anteriormente. La transducción puede realizarse antes o después de la inactivación de los genes de TCR alfa y CD52.

3. Modificación de células T resistentes no alorreactivas e inmunosupresoras:

a) Es posible inactivar el TCR alfa en dichas células para eliminar el TCR de la superficie de la célula y evitar el reconocimiento del tejido huésped como extraño por el TCR alogénico y así evitar la GvHD.

b) También es posible inactivar un gen que codifica una diana para un agente inmunosupresor para hacer que dichas células sean resistentes al tratamiento inmunosupresor para prevenir el rechazo del injerto sin afectar a las células T trasplantadas. En este ejemplo, la diana de los agentes inmunosupresores es CD52 y el agente inmunosupresor es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD52.

Los inventores han demostrado que el uso de nucleasa TALE al permitir tasas más altas de eventos DSB dentro de las células T era particularmente ventajoso para lograr la doble inactivación anterior en las células T Preferiblemente, los genes de TCR alfa y CD52 se inactivan mediante electroporación de células T con ARNm que codifica la nucleasa TALE dirigida a dichos genes. Los inventores descubrieron que el uso de ARNm daba como resultado una alta tasa de transformación, era menos dañino para las células T y, por lo tanto, era fundamental en el proceso de modificación de células T. Luego, las células T inactivadas se clasifican utilizando perlas magnéticas. Por ejemplo, las células T que expresan CD52 se eliminan mediante fijación en una superficie sólida y las células inactivadas no quedan expuestas al estrés de pasar a través de una columna. Este método suave aumenta la concentración de células T modificadas adecuadamente.

4. Expansión in vitro de células T modificadas antes de su administración a un paciente o in vivo después de la administración a un paciente mediante estimulación del complejo CD3. Antes de la etapa de administración, los pacientes se someten a un tratamiento inmunosupresor como CAMPATH1-H, un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD52.

5. Opcionalmente se exponen dichas células con anticuerpos biespecíficos ex vivo antes de la administración a un paciente o in vivo después de la administración a un paciente para acercar las células modificadas a un antígeno diana.

Otras definiciones

- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica se designan en el presente documento de acuerdo con el código de una letra, en donde, por ejemplo, Q significa Gln o residuo de glutamina, R significa Arg o residuo de arginina y D significa Asp o residuo de ácido aspártico.

- La sustitución de aminoácidos significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro; por ejemplo, la sustitución de un residuo de arginina por un residuo de glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácidos.

- Los nucleótidos se designan de la siguiente manera: se utiliza un código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

- Tal como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" o "polinucleótidos" se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de las acciones de ligación, escisión, endonucleasa y exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos naturales (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos naturales (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos naturales), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en fracciones de azúcar y/o en fracciones base de pirimidina o de purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, la sustitución de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, toda la fracción de azúcar se puede reemplazar con estructuras estérica y electrónicamente similares, tal como azúcares aza y análogos de azúcares carbocíclicos. Ejemplos de modificaciones en una fracción base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar unidos mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

- Por "polinucleótido que comprende sucesivamente una primera región de homología con secuencias más arriba de dicha rotura bicatenaria, una secuencia que se va a insertar en el genoma de dicha célula y una segunda región de homología con secuencias más abajo de dicha rotura bicatenaria" pretende referirse a una construcción de ADN o una matriz que comprende una primera y una segunda porción que son homólogas a las regiones 5' y 3' de una diana de ADN in situ. La construcción de ADN también comprende una tercera porción situada entre la primera y la segunda porción que comprende cierta homología con la secuencia de ADN correspondiente in situ o alternativamente no comprenden homología con las regiones 5' y 3' del ADN diana in situ. Después de la escisión del ADN diana, se estimula un evento de recombinación homóloga entre el genoma que contiene el gen diana comprendido en el locus de interés y esta matriz, en donde la secuencia genómica que contiene el ADN diana se reemplaza por la tercera porción de la matriz y una parte variable de la primera y segunda porciones de dicha matriz.

- Por "diana de ADN", "secuencia diana de ADN", "secuencia de ADN diana", "secuencia diana de ácido nucleico", "secuencia diana" o "sitio de procesamiento" se entiende una secuencia de polinucleótidos que puede ser dirigida y procesada por una endonucleasa de corte poco común de acuerdo con la presente invención. Estos términos se refieren a una ubicación específica del ADN, preferiblemente una ubicación genómica en una célula, pero también a una porción de material genético que puede existir independientemente del cuerpo principal de material genético, tal como plásmidos, episomas, virus, transposones o en orgánulos como las mitocondrias como ejemplo no limitativo. Como ejemplos no limitantes de dianas de nucleasa TALE, las secuencias genómicas diana generalmente consisten en dos secuencias de 17 pb de largo (llamadas medias dianas) separadas por un espaciador de 15 pb. Cada media diana es reconocida por repeticiones de nucleasas TALE enumeradas en las tablas 1, 5, 6 y 10 como ejemplos no limitantes, codificadas en plásmidos, bajo el control del promotor EF1-alfa o del promotor T7. La secuencia diana del ácido nucleico está definida por la secuencia 5' a 3' de una cadena de dicha diana, como se indica en las Tablas 1, 5, 6 y 10.

- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) se entiende moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular que activa el receptor de células T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmune específica anti-célula diana. Generalmente, el CAR consiste en un anticuerpo extracelular de cadena sencilla (scFvFc) fusionado al dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo del receptor de antígeno de células T (scFvFc:Z) y tiene la capacidad, cuando se expresa en células T, de redirigir el reconocimiento del antígeno basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal. Un ejemplo de CAR utilizado en la presente invención es un CAR que se dirige contra el antígeno CD19 y puede comprender como ejemplo no limitante la secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 73

- Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" se entiende cualquier vector de suministro que pueda usarse en la presente invención para poner en contacto células (es decir, "poner en contacto") o suministrar dentro de células o compartimentos subcelulares (es decir, "introducir") agentes/productos químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, entre otros, vectores de suministro liposomales, vectores de suministro viral, vectores de suministro de fármacos, vehículos químicos, vehículos poliméricos, lipoplexos, poliplexos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonidos), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de suministro permiten el suministro de moléculas, productos químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de suministro son portadores de moléculas. Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" también se entiende métodos de suministro para realizar la transfección.

- Los términos "vector" o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un "vector" en la presente invención incluye, entre otros, un vector viral, un plásmido, un vector de<a>R<n>o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (p. ej., virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tal como ortomixovirus (p. ej., virus de la influenza), rabdovirus (p. ej., virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (p. ej., sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de doble cadena que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus tipo C de mamíferos, virus tipo B, virus tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, JM, Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, tercera edición, BN Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por "vector lentiviral" se entiende vectores lentivirales basados en VIH que son muy prometedores para el suministro de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficiencia una amplia gama de tipos de células diferentes. Los vectores lentivirales generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetado, envoltura y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Al igual que el VIH, los vectores lentivirales ingresan a la célula diana mediante la interacción de glicoproteínas de la superficie viral con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN viral sufre una transcripción inversa, que está mediada por el complejo viral de transcriptasa inversa. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal de doble cadena, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas. Por "vectores lentivirales integrativos (o LV)", se entiende dichos vectores, como ejemplo no limitante, que son capaces de integrar el genoma de una célula diana. Por el contrario, por "vectores lentivirales no integrativos (o NN,V)" se entiende vectores de suministro de genes eficientes que no integran el genoma de una célula diana mediante la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores y vectores de suministro pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Por célula o células se entiende cualquier célula viva eucariótica, células primarias y líneas celulares derivadas de estos organismos para cultivos in vitro.

- Por "célula primaria" o "células primarias" se entiende células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para su crecimiento in vitro, que han experimentado muy pocas duplicaciones de población y, por lo tanto, son más representativas de los principales componentes funcionales y características de tejidos de los que se derivan, en comparación con líneas celulares tumorigénicas continuas o inmortalizadas artificialmente.

Como ejemplos no limitantes, se pueden seleccionar líneas celulares del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células INM90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células HuVEC; células Molt4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también se pueden usar para seleccionar moléculas biológicamente activas de interés en investigación y producción y en diversos campos tales como el químico, el de biocombustibles, el terapéutico y el de agronomía como ejemplos no limitantes.

- Por "mutación" se entiende la sustitución, eliminación, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar la estructura de la secuencia genómica o la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

- Por "variante o variantes", se entiende una variante repetida, una variante, una variante de unión a ADN, una variante de nucleasa TALE, una variante polipeptídica obtenida por mutación o sustitución de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula original.

- Por "variante funcional" se entiende un mutante catalíticamente activa de una proteína o un dominio proteico; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína original o dominio proteico o propiedades adicionales, mayor o menor actividad.

- Por "gen" se entiende la unidad básica de la herencia, que consiste en un segmento de ADN dispuesto de forma lineal a lo largo de un cromosoma, que codifica una proteína o un segmento de proteína específico. Un gen normalmente incluye un promotor, una región 5' no traducida, una o más secuencias codificantes (exones), opcionalmente intrones, una región 3' no traducida. El gen puede comprender además un terminador, potenciadores y/o silenciadores.

- Tal como se utiliza en el presente documento, el término "locus" es la ubicación física específica de una secuencia de ADN (por ejemplo, de un gen) en un cromosoma. El término "locus" puede referirse a la ubicación física específica de una secuencia diana de endonucleasa de corte poco común en un cromosoma. Un locus de este tipo puede comprender una secuencia diana que es reconocida y/o escindida por una endonucleasa de corte poco común de acuerdo con la invención. Se entiende que el locus de interés de la presente invención no sólo puede calificar una secuencia de ácido nucleico que existe en el cuerpo principal de material genético (es decir, en un cromosoma) de una célula sino también una porción de material genético que puede existir independientemente a dicho cuerpo principal de material genético tal como plásmidos, episomas, virus, transposones o en orgánulos como mitocondrias como ejemplos no limitantes.

- El término "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima de tipo silvestre o variante capaz de catalizar la hidrólisis (escisión) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferiblemente una molécula de ADN. Las endonucleasas no escinden la molécula de ADN o ARN independientemente de su secuencia, sino que reconocen y escinden la molécula de ADN o ARN en secuencias de polinucleótidos específicas, denominadas en lo sucesivo "secuencias diana" o "sitios diana". Las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte poco común cuando tienen típicamente un sitio de reconocimiento de polinucleótidos de más de 12 pares de bases (pb) de longitud, más preferiblemente de 14-55 pb. Las endonucleasas de corte poco común aumentan significativamente la HR al inducir roturas de doble cadena del ADN (DSB) en un locus definido (Rouet, Smith et al., 1994, Choulika, Perrin et al., 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte poco común pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa buscadora de dianas (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa quimérica con dedos de zinc (ZFN) resultante de la fusión de dominios con dedos de zinc modificados con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como FokI (Porteus y Carroll 2005) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al., 2006). En las endonucleasas químicas, un escindidor químico o peptídico se conjuga con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia diana específica, dirigiendo así la actividad de escisión a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también incluyen nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula que escinde el ADN, y oligonucleótidos formadores de triplex (TFO), conocidos por unirse a secuencias específicas de ADN (Kalish y Glazer 2005). Dichas endonucleasas químicas están comprendidas en el término "endonucleasa" de acuerdo con la presente invención.

Las endonucleasas de corte poco común también pueden ser, por ejemplo, nucleasas TALE, una nueva clase de nucleasas quiméricas que utilizan un dominio catalítico FokI y un dominio de unión al ADN derivado del efector similar al activador de transcripción (TALE), una familia de proteínas utilizadas en el proceso de infección por patógenos de plantas del género Xanthomonas (Boch, Scholze et al., 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al.

2010; Li, Huang et al.). El diseño funcional de una nucleasa TALE basada en FokI (nucleasa TALE) es esencialmente el de una ZFN, con el dominio de unión al ADN con dedos de zinc reemplazado por el dominio TALE. Como tal, la escisión del ADN por una nucleasa TALE requiere dos regiones de reconocimiento de ADN que flanquean una región central inespecífica. Las endonucleasas de corte poco común abarcadas en la presente invención también pueden derivarse de nucleasas TALE.

La endonucleasa de corte poco común puede ser una endonucleasa buscadora de dianas, también conocida con el nombre de meganucleasa. Estas endonucleasas buscadoras de dianas son bien conocidas en la técnica (Stoddard 2005). Las endonucleasas buscadoras de dianas reconocen una secuencia diana de ADN y generan una rotura de una o dos cadenas. Las endonucleasas buscadoras de dianas son muy específicas y reconocen sitios diana del ADN que varían de 12 a 45 pares de bases (pb) de longitud, generalmente de 14 a 40 pb de longitud. La endonucleasa buscadora de dianas de acuerdo con la invención puede corresponder, por ejemplo, a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa buscadora de dianas preferida de acuerdo con la presente invención puede ser una variante de I-Crel.

- Por "nucleasa TALE" (TALEN) se entiende una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ácido nucleico típicamente derivado de un efector similar a un activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. El dominio catalítico es preferiblemente un dominio de nucleasa y más preferiblemente un dominio que tiene actividad de endonucleasa, como por ejemplo I-TevI, ColE7, NucA y Fok-I. En una realización particular, el dominio TALE se puede fusionar con una meganucleasa como, por ejemplo, I-CreI e I-OnuI o una variante funcional de las mismas. En una realización más preferida, dicha nucleasa es una nucleasa TALE monomérica. Una nucleasa TALE monomérica es una nucleasa TALE que no requiere dimerización para un reconocimiento y escisión específicos, como las fusiones de repeticiones TAL modificadas con el dominio catalítico de I-TevI descritas en el documento WO2012138927. El efector similar a un activador de la transcripción (TALE) son proteínas de especies bacterianas Xanthomonas comprenden una pluralidad de secuencias repetidas, comprendiendo cada repetición residuos dobles en la posición 12 y 13 (RVD) que son específicos de cada base de nucleótidos de la secuencia diana de ácido nucleico. Los dominios de unión con propiedades modulares de unión de ácido nucleico base por base (MBBBD) también pueden derivarse de nuevas proteínas modulares descubiertas recientemente por el solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas proteínas modulares tienen la ventaja de mostrar más variabilidad de secuencia que las repeticiones TAL. Preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, Nk para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A y YG para reconocer T, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y S<w>para reconocer A. En otra realización, los aminoácidos críticos 12 y 13 pueden mutarse hacia otros residuos de aminoácidos para modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G y en particular para potenciar esta especificidad. La nucleasa TALE ya se ha descrito y utilizado para estimular el direccionamiento de genes y las modificaciones de genes (Boch, Scholze et al., 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al., 2010; Li, Huang et al.). Las nucleasas TAL modificadas están disponibles comercialmente con el nombre comercial TALENMC (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 París, Francia).

- El término "escisión" se refiere a la rotura de la cadena principal covalente de un polinucleótido. La escisión puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Son posibles tanto la escisión monocatenaria como la escisión bicatenaria, y la escisión bicatenaria puede ocurrir como resultado de dos eventos distintos de escisión monocatenaria. La escisión de ADN, ARN o híbridos de ADN/ARN de doble cadena puede dar como resultado la producción de extremos romos o escalonados.

- Por "proteína de fusión" se entiende el resultado de un proceso bien conocido en la técnica que consiste en la unión de dos o más genes que originalmente codifican proteínas separadas o parte de ellas, dando como resultado la traducción de dicho "gen de fusión" un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales.

- "Identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos es función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácidos nucleicos. Se pueden usar varios algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin), y se pueden usar con, por ejemplo, la configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos un 70 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que preferiblemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos.

- "Similitud" describe la relación entre las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos. BLASTP también se puede utilizar para identificar una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 97.5 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia utilizando una matriz de similitud tal como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique lo contrario, la puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se utiliza BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de positivos de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades de BLASTP. "Identidades" de BLASTP muestra el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencias de puntuación alta que son idénticos; y "Positivos" de BLASTP muestra el número y la fracción de residuos para los cuales las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad o similitud con las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento son contempladas y abarcadas por esta divulgación. Las secuencias de polinucleótidos de polipéptidos similares se deducen utilizando el código genético y pueden obtenerse por medios convencionales. Por ejemplo, una variante funcional de pTalfa puede tener un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87.5 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 97.5 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107. Un polinucleótido que codifique dicha variante funcional se produciría traduciendo inversamente su secuencia de aminoácidos utilizando el código genético.

- "Dominio transductor de señales" o "ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, media una respuesta de células T, que incluye, entre otras, activación de proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, entre otros, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor beta de linfotoxina, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, entre otros,<c>D27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente a CD83.

Una "molécula coestimuladora" se refiere a la pareja de unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por parte de la célula, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, una molécula del MHC de clase I, BTLA y un receptor del ligando Toll.

Una "señal coestimuladora", como se usa en el presente documento, se refiere a una señal que, en combinación con una señal primaria, tal como la ligadura de TCR/CD3, conduce a la proliferación de células T y/o a una sobrerregulación o subregulación de moléculas clave.

-"Anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de una única molécula de anticuerpo. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden construir otras moléculas además de la estructura canónica del anticuerpo con dos especificidades de unión. Se apreciará además que la unión al antígeno mediante anticuerpos biespecíficos puede ser simultánea o secuencial. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante técnicas químicas (véase, por ejemplo, Kranz et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), mediante técnicas de "polidoma" (véase la patente de los Estados Unidos No. 4,474,893) o mediante técnicas de ADN recombinante, todas ellas ya conocidas. Como ejemplo no limitante, cada dominio de unión comprende al menos una región variable de una cadena pesada de anticuerpo ("región VH o H"), en donde la región VH del primer dominio de unión se une específicamente al marcador de linfocitos tal como CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente al antígeno tumoral.

- El término "dominio de unión a ligando extracelular" como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio será capaz de interactuar con una molécula en la superficie de la célula. Por ejemplo, el dominio de unión al ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. Por lo tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen aquellos asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedades autoinmunitarias y células cancerosas.

El término "sujeto" o "paciente", tal como se utiliza en el presente documento, incluye todos los miembros del reino animal, incluidos los primates no humanos y los humanos.

La descripción escrita anterior de la invención proporciona una manera y un proceso de fabricarla y usarla de tal manera que cualquier persona experta en esta técnica esté capacitada para fabricarla y usarla, esta habilitación se proporciona en particular para el objeto de las reivindicaciones adjuntas, que forman parte de la descripción original. Cuando en el presente documento se establece un límite o intervalo numérico, se incluyen los puntos finales. Además, todos los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.

La descripción anterior se presenta para permitir que un experto en la técnica realice y utilice la invención, y se proporciona en el contexto de una aplicación particular y sus requisitos.

Habiendo descrito en general esta invención, se puede obtener una mayor comprensión haciendo referencia a ciertos ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplos

Ejemplo 1: nucleasas TALE que escinden el gen GR humano

Se modificaron y produjeron seis nucleasas TALE heterodiméricas dirigidas a exones del gen GR humano. La Tabla 1 a continuación indica las secuencias diana escindidas por cada nucleasa TALE. La nucleasa TALE GR estaba compuesta por dos entidades independientes (llamadas medias nucleasas TALE), cada una de las cuales contenía una secuencia repetida modificada para unirse y escindir secuencias diana de GR que constan de dos secuencias de 17 pb de largo (llamadas medias dianas) separadas por un espaciador de 15 pb.

Las secuencias de aminoácidos de los dominios, del extremo terminal C y el extremo terminal N y las repeticiones se basan en TALE AvrBs3 (ref: GenBank: X16130.1). Los dominios del extremo terminal C y terminal N están separados por dos sitios de restricción BsmBI. Las matrices de repetición (SEQ ID NO: 7 a 18), dirigiéndose a las secuencias deseadas (SEQ ID NO: 1 a 6) se sintetizaron utilizando un método de soporte sólido compuesto de etapas consecutivas de restricción/ligación/lavado (solicitud internacional PCT WO2013/017950). En resumen, el primer bloque (que codifica una repetición doble) se inmovilizó sobre un soporte sólido mediante la interacción biotina/estreptavidina, el segundo bloque (repetición triple) se ligó luego al primero y, después de la digestión con SfaNI, se acopló un tercer bloque (repetición triple). El proceso se repitió utilizando bloques de tres o dos repeticiones al obtener la matriz de repetición deseada. Luego, el producto se clonó en un plásmido de clonación pAPG10 clásico para su amplificación en E. coli y se secuenció. Las secuencias de matriz repetida así obtenidas se subclonaron en un vector TALE de expresión de levadura usando enzimas de restricción de tipo IIS BsmBI para el plásmido receptor y BbvI y SfaNI para la secuencia repetida insertada. El ADN que codifica la mitad de la nucleasa TALE, que contiene un dominio de unión al ADN derivado de TALE fusionado al dominio catalítico de la enzima de restricción FokI, se amplificó en E. coli, recuperado mediante técnicas estándar de miniprep y secuenciado para evaluar la integridad del inserto.

Actividad de las nucleasas TALE GR en levadura:

La actividad nucleasa de las seis nucleasas TALE GR se probó a 37 °C y 30 °C en nuestro ensayo SSA de levadura descrito previamente (solicitudes internacionales PCT w O 2004/067736 y en (Epinat, Amould et al., 2003; Chames, Epinat et al., 2005; Arnould, Chames et al., 2006; Smith, Grizot et al., 2006) en dianas que contienen las dos secuencias diana de TALE enfrentadas en la cadena de ADN separadas por un espaciador de 15 pb, lo que da como resultado las SEQ ID NO: 1 a 6. Todos los plásmidos informadores diana de levadura que contienen las secuencias diana de ADN de la nucleasa TALE se construyeron como se describió anteriormente (solicitudes internacionales PCT WO 2004/067736 y en (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006). Los niveles de actividad de escisión de la nucleasa TALE, en levadura, de clones individuales en las dianas se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2: Actividad de escisión de las nucleasas TALE GR en levaduras.

Los valores están comprendidos entre 0 y 1. El valor máximo es 1.

Actividad de las nucleasas TALE GR en células HEK293:

Cada construcción de nucleasa TALE se subclonó usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control de un promotor largo pEF1alfa.

Se sembraron un millón de células HEK293 un día antes de la transfección. Las células se cotransfectaron con 2.5 |jg de cada uno de los dos plásmidos que codifican la mitad izquierda y derecha de nucleasa TALE GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5T1, GRex5T2 o GRex5T3 que reconoce las dos mitades de las secuencias genómicas dianas de interés en el gen GR bajo el control de Promotor EFIalfa utilizando 25 jL de lipofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como control, las células se cotransfectaron con 2.5 jg de cada uno de los dos plásmidos que codifican la mitad izquierda y derecha de las nucleasas TALE que se dirigen al sitio diana de la región de cadena constante alfa del receptor de células T (TRAC_T01) ((nucleasa TALE de TRAC_T01-L y TRAC_T01-R (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, sitio diana de TRAC_T01 (SEQ ID NO: 37)) bajo el control del promotor EFIalfa. La rotura de doble cadena generada por las nucleasas TALE en la secuencia codificante de GR induce la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que es un mecanismo propenso a errores. La actividad de las nucleasas TALE se mide por la frecuencia de inserciones o eliminaciones en el locus genómico diana.

2 o 7 días después de la transfección, se recogieron células y se realizaron PCR específicas de locus en ADN genómico extraído utilizando los siguientes cebadores: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (secuencia adaptadora directa) - 10N (TAG) - secuencia directa específica del locus para el exón 2 de GR: 5 GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 31), para el exón 3 de GR: 5'-GCATTCTGACTATGAAGTGA-3' (SEQ ID NO: 32) y para el exón 5 de GR: 5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3' (SEQ ID NO: 33) y el cebador inverso 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3' (secuencia adaptadora inversa): secuencia inversa específica del locus para el exón 2 de GR: 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (SEQ ID NO: 34), para el exón 3 de GR: 5'-GGGCTTGCATATAATGGAA-3' (SEQ ID NO: 35) y para el exón 5 de GR: 5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3' (SEQ ID NO: 36).

Los productos de PCR se secuenciaron mediante un sistema de secuenciación 454 (454 Life Sciences). Se obtuvieron aproximadamente 10,000 secuencias por producto de PCR y luego se analizaron para detectar la presencia de eventos de inserción o eliminación específicos del sitio. La Tabla 3 indica el porcentaje de secuencias que muestran inserciones o eliminaciones en el sitio diana de la nucleasa TALE entre el número total de secuencias en la muestra. En la Tabla 3 se enumeran para GRex2, GRex3T2 y GRex3T4 los resultados de un experimento representativo.

En todos los casos probados, el % de mutagénesis fue similar en el día 7 en comparación con el de la muestra en el día 2 después de la transfección. También se analizó la naturaleza de los eventos mutagénicos, revelando una mayoría de eliminaciones en todos los casos en comparación con las inserciones.

Tabla 3: Porcentae de muta énesis diri ida en sitios diana de nucleasa TALE endó ena en células HEK293.

Actividad de las nucleasas TALE GR en linfocitos T primarios:

Cada construcción de nucleasa TALE se subclonó usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión bajo el control de un promotor T7.

Se sintetizaron ARNm que codifican nucleasas TALE que escinden secuencias genómicas de GR a partir de cada plásmido que porta las secuencias codificantes más abajo del promotor T7. Se activaron linfocitos T aislados de sangre periférica durante 5 días usando perlas activadoras anti-CD3/CD28 (Life Technologies) y se transfectaron 5 millones de células mediante electroporación con 10 jg de cada uno de los 2 ARNm que codifican ambas mitades de nucleasas TALE usando un instrumento CytoLVT-P (aparato BTX-Harvard). Las células T transfectadas con 10 jg de cada uno de los 2 ARNm que codifican ambas mitades de nucleasas TALE dirigidas al gen CD52 (TALEN CD52_T02-L y CD52_T02-R (SEQ ID NO: 55 y 56), secuencia diana CD52_T02 SEQ ID NO: 40) se utilizan como control.

3 y 7 días después de la transfección, se aisló el ADN genómico de las células transfectadas y se realizaron PCR específicas del locus utilizando los cebadores descritos anteriormente. Los productos de p Cr se secuenciaron mediante un sistema de secuenciación 454 (454 Life Sciences). Se obtuvieron aproximadamente 10,000 secuencias por producto de PCR y luego se analizaron para detectar la presencia de eventos de inserción o eliminación específicos del sitio; los resultados se encuentran en la Tabla 4.

Tabla 4: Porcentaje de mutagénesis dirigida en sitios diana de nucleasa TALE endógena en linfocitos T primarios.

Ejemplo 2: nucleasas TALE que escinden el gen CD52 humano, la cadena constante alfa del receptor de células T humanas (TRAC) y las cadenas constantes beta 1 y 2 del receptor de células T humanas (TRBC)

Como se describe en el ejemplo 1, se modificaron y produjeron nucleasas TALE heterodiméricas dirigidas respectivamente a los genes CD52, TRAC y TRBC. Las secuencias genómicas diana constan de dos secuencias de 17 pb de largo (llamadas medias dianas) separadas por un espaciador de 11 o 15 pb. Cada media diana se reconoce por repeticiones de medias nucleasas TALE enumeradas en la Tabla 5. El genoma humano contiene dos cadenas beta funcionales del receptor de células T (TRBC1 y TRBC2). Durante el desarrollo de los linfocitos T alfa/beta, una de estas dos cadenas constantes se selecciona en cada célula para unirse a la región variable de TCR-beta y formar una cadena beta funcional de longitud completa. Las 2 dianas TRBC se eligieron en secuencias conservadas entre TRBC1 y TRBC2 para que la nucleasa TALE correspondiente escindiera tanto TRBC1 como TRBC2 al mismo tiempo.

�� Se han modificado otras secuencias diana en los genes TRAC y CD52, que se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6: Secuencias diana adicionales ara las nucleasas TALE TRAC CD52.

Actividad de nucleasa TALE CD52, nucleasa TALE de TRAC y nucleasa TALE TRBC en células HEK293

Cada construcción de nucleasa TALE se subclonó usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor largo pEF1alfa. Se sembraron un millón de células HEK293 un día antes de la transfección. Las células se cotransfectaron con 2.5 ^g de cada uno de los dos plásmidos que codifican las nucleasas TALE que reconocen las dos mitades de las dianas en la secuencia genómica de interés en el gen CD52, la región de cadena constante alfa del receptor de células T (TRAC) o la región de cadena constante beta del receptor de células T (TRBC) bajo el control del promotor EF1-alfa o 5 ^g de un vector pUC de control (pCLS0003) usando 25 ^l de lipofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La escisión de doble cadena generada por las nucleasas TALE en las secuencias codificantes de CD52 o TRAC se repara en células vivas mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ), que es un mecanismo propenso a errores. La actividad de las nucleasas TALE en células vivas se mide mediante la frecuencia de inserciones o eliminaciones en el locus genómico diana. 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico de las células transfectadas y se realizaron PCR específicas del locus utilizando los siguientes cebadores: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (secuencia adaptadora directa)-10N (TAG)-secuencia directa específica del locus para CD52: 5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC3' (SEQ ID NO: 66), para TRAC: 5'-ATCACTGGCATTGGACTCCA-3' (SEQ ID NO: 67), para TRBC1: 5'-AGAGCCCTACCAGAACCAGAC-3' (SEQ ID NO: 68), o para TRBC2: 5'-GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3' (SEQ ID NO: 69), y el cebador inverso 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (secuencia adaptadora inversa): secuencia inversa específica del locus endógeno para CD52: 5-CCTGTTGGAGTCCATCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 70), para TRAC: 5-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3' (SEQ ID NO: 71), para TRBC1 y TRBC2: 5'-ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3' (SEQ ID NO: 72). Los productos de PCR se secuenciaron mediante un sistema de secuenciación 454 (454 Life Sciences). Se obtuvieron aproximadamente 10,000 secuencias por producto de PCR y luego se analizaron para detectar la presencia de eventos de inserción o eliminación específicos del sitio; los resultados se encuentran en la Tabla 7.

Tabla 7: Porcentajes de indeles para nucleasa TALE dirigida a las dianas CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 y

TRBC T02.

Actividad de la nucleasa TALE CD52, la nucleasa TALE TRBC y la nucleasa TALE de TRAC en linfocitos T primarios

Cada construcción de nucleasa TALE se subclonó usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor T7.

El ARNm que codifica la secuencia genómica de CD52 TRAC y TRBC que escinde la nucleasa TALE se sintetizó a partir del plásmido que porta las secuencias codificantes más abajo del promotor T7. Se activaron linfocitos T aislados de sangre periférica durante 5 días usando perlas activadoras anti-CD3/CD28 (Life Technologies) y luego se transfectaron 5 millones de células mediante electroporación con 10 |jg de cada uno de los 2 ARNm que codifican ambas mitades de nucleasa TALE (o ARN no codificante como controles) usando un instrumento CytoLVT-P. Como consecuencia de las inserciones y eliminaciones inducidas por NHEJ, la secuencia codificante de CD52 y/o TRAC estará fuera de marco en una fracción de las células, lo que dará como resultado genes no funcionales 5 días después de la electroporación, las células se marcaron con anticuerpo anti-CD52 o anti-TCR conjugado con fluorocromo mediante citometría de flujo para detectar la presencia de CD52 o TCR en su superficie celular. Dado que todos los linfocitos T expandidos desde la sangre periférica normalmente expresan CD52 y TCR, la proporción de células negativas para CD52 o negativas para TCR es una medida directa de la actividad de la nucleasa TALE. En la Tabla 8 se enumeran los resultados de un experimento representativo. La Tabla 9 muestra los resultados de un experimento representativo que prueba la eficacia de las nucleasas TALE TRBC.

Tabla 8: Porcentajes de linfocitos T negativos para CD52, negativos para TCR y doble negativos para CD52/TCR des ués de la transfección de los corres ondientes olinucleótidos ue ex resan nucleasa TALE.

Tabla 9: Porcentajes de linfocitos T negativos para TCR después de la transfección de polinucleótidos que expresan nucleasa Ta Le TRBC.

Análisis funcional de células T con gen CD52 específico

El objetivo de la inactivación del gen CD52 es hacer que los linfocitos T sean resistentes a la inmunosupresión mediada por anticuerpos anti-CD52. Como se describió en el párrafo anterior, los linfocitos T se transfectaron con ARNm que codifica la nucleasa TALE que escinde CD52. 7 días después de la transfección, las células se trataron con 50 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD52 (o IgG de rata como control) con o sin complemento de conejo al 30 % (Cedarlane). Después de 2 horas de incubación a 37°C, las células se marcaron con un anticuerpo anti-CD52 conjugado con fluorocromo junto con un tinte de viabilidad fluorescente (eBioscience) y se analizaron mediante citometría de flujo para medir la frecuencia de células positivas para CD52 y negativas para CD52 entre células vivas. La Figura 6 muestra el resultado de un experimento representativo, que demuestra que las células negativas para CD52 son completamente resistentes a la toxicidad de los anticuerpos anti-CD52 mediada por el complemento.

Análisis funcional de células T con gen TRAC específico

El objetivo de la inactivación del gen TRAC es hacer que los linfocitos T no respondan a la estimulación del receptor de células T Como se describió en el párrafo anterior, los linfocitos T se transfectaron con ARNm que codifica TRAC o CD52 que escinde la nucleasa TALE. 16 días después de la transfección, las células se trataron con hasta 5 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA, Sigma-Aldrich), un mitógeno de células T que actúa a través del receptor de células T. Las células con un receptor de células T funcional deberían aumentar de tamaño después del tratamiento con PHA. Después de tres días de incubación, las células se marcaron con un anticuerpo anti-CD52 o anti-TCR conjugado con fluorocromo y se analizaron mediante citometría de flujo para comparar la distribución del tamaño celular entre células positivas para TCR y negativas para TCR, o entre células positivas para CD52 y negativas para CD52. La Figura 7 muestra que las células positivas para TCR aumentan significativamente de tamaño después del tratamiento con PHA, mientras que las células negativas para TCR tienen el mismo tamaño que las células no tratadas, lo que indica que la inactivación de TRAC las hizo insensibles a la señalización de TCR. Por el contrario, las células positivas para CD52 y negativas para CD52 aumentan de tamaño en la misma medida.

Análisis funcional de células T con genes CD52 y TRAC específicos

Para verificar que la modificación del genoma no afectó la capacidad de las células T para presentar actividad antitumoral cuando se les proporcionó un receptor de antígeno quimérico (CAR), transfectamos células T que habían sido atacadas con nucleasa TALE CD52 y nucleasa TALE de TRAC con 10 pg de ARN que codifica un CAR anti-CD19 (SEQ ID NO: 73). 24 horas más tarde, las células T se incubaron durante 4 horas con células Daudi que expresaban CD19. La sobrerregulación en la superficie de la célula de CD107a, un marcador de liberación de gránulos citotóxicos por los linfocitos T (llamada desgranulación), se midió mediante análisis de citometría de flujo (Betts, Brenchley et al.

2003). Los resultados se incluyen en la Figura 8 y muestran que las células negativas para CD52 / negativas para TCRap y positivas para CD52/positivas para TCRap tienen la misma capacidad de desgranularse en respuesta a PMA/ionomicina (control positivo) o células Daudi CD19+. La sobrerregulación de CD107 depende de la presencia de un CD19+. Estos datos sugieren que la modificación del genoma no tiene ningún impacto negativo en la capacidad de las células T para generar una respuesta antitumoral controlada.

Seguridad genómica de la nucleasa TALE CD52 y la nucleasa TALE de TRAC en linfocitos T primarios

Como nuestras construcciones incluyen subunidades de nucleasa, una pregunta importante es si la transfección múltiple de nucleasa TALE puede provocar genotoxicidad y escisión fuera de la diana en secuencias diana de "coincidencia cercana" o mediante un emparejamiento incorrecto de medias nucleasas TALE. Para estimar el impacto de la nucleasa TALE de TRAC y la nucleasa TALE CD52 en la integridad de los genomas celulares, enumeramos secuencias en el genoma humano que presentaban potencial de escisión fuera del sitio. Para generar esta lista, identificamos todas las secuencias del genoma con hasta 4 sustituciones en comparación con las medias dianas originales y luego identificamos los pares de medias dianas potenciales en una orientación cabeza a cabeza con un espaciador de 9 a 30 pb entre sí. Este análisis incluyó sitios potencialmente específicos para homodímeros de una molécula de media nucleasa TALE o heterodímeros formados por una media nucleasa TALE CD52 y una media nucleasa TALE de TRAC. Calificamos las dianas potenciales fuera del sitio en función de los datos de especificidad teniendo en cuenta el coste de las sustituciones individuales y la posición de las sustituciones (donde los desajustes se toleran mejor para las bases en el extremo 3' de la diana media). Obtuvimos 173 secuencias únicas con una puntuación que refleja una estimación de la probabilidad de escisión. Seleccionamos las 15 puntuaciones más altas y analizamos mediante secuenciación profunda la frecuencia de las mutaciones encontradas en estos loci en células T transfectadas simultáneamente con nucleasa TALE CD52 y TRAC y purificadas mediante separación magnética como negativa para CD52, negativa para TCRap. Los resultados se encuentran en la Figura 9. La frecuencia más alta de inserción/eliminación es 7*10'4. Estos resultados hacen que la supuesta diana externa tenga al menos 600 veces menos probabilidades de sufrir una mutación que las dianas previstas. Por lo tanto, los reactivos de nucleasa TALE utilizados en este estudio parecen extremadamente específicos.

Ejemplo 3: nucleasas TALE que escinden el gen CTLA4 humano y el gen PDCD1 humano

Como se describe en el ejemplo 1, se modificaron y produjeron nucleasas TALE heterodiméricas dirigidas respectivamente a los genes PDCD1 y CTLA4. Las secuencias genómicas diana constan de dos secuencias de 17 pb de largo (llamadas medias dianas) separadas por un espaciador de 11 o 15 pb. Cada media diana se reconoce por repeticiones de medias nucleasas TALE enumeradas en la Tabla 10.

Actividad de nucleasa TALE CTLA4 y nucleasa TALE PDCD1 en células HEK293

Cada construcción de nucleasa TALE se subclonó usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor largo pEF1alfa. Se sembraron un millón de células HEK293 un día antes de la transfección. Las células se cotransfectaron con 2.5 |jg de cada uno de los dos plásmidos que codifican las nucleasas TALE que reconocen las dos medias dianas en la secuencia genómica de interés en el gen PDCD1 y CTLA-4 bajo el control del promotor EF1-alfa o 5 jg de un vector pUC de control (pCLS0003) utilizando 25 j l de lipofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La escisión de doble cadena generada por las nucleasas TALE en las secuencias codificantes de PDCD1 o CTLA-4 se repara en células vivas mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ), que es un mecanismo propenso a errores. La actividad de las nucleasas TALE en células vivas se mide mediante la frecuencia de inserciones o eliminaciones en el locus genómico específico. 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico de las células transfectadas y se realizaron PCR específicas del locus utilizando los siguientes cebadores: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTc Tc CGACTCAG (secuencia del adaptador directo)-10N (TAG) - secuencia directa específica del locus para CTLA4_T01: 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3' (SEQ ID NO: 99), para CTLA4_T03/T04: 5'-ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3' (SEQ ID NO: 100), para PDCD1_T01: 5'-CCACAGAGGGTAGGTGCCGC-3' (SEQ ID NO: 101) o para PDCD1_T03: 5'-GACAGAGATGCCGGTCACCA-3' (SEQ ID NO: 102) y el cebador inverso 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (secuencia del adaptador inverso): secuencia inversa específica del locus endógeno para CTLA4_T01: 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (SEQ ID NO: 103), para CTLA4_T03/T04: 5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3' (SEQ ID NO: 104), para PDCD1_T01: 5'-GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 105) o para PDCD1_T03: 5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (SEQ ID NO: 106).

Los productos de la PCR se analizaron mediante un ensayo de endonucleasa T7: brevemente, después de la desnaturalización y nueva hibridación del producto de la PCR, la endonucleasa T7 digerirá específicamente el ADN no coincidente compuesto de cadenas mutadas y de tipo silvestre. A continuación, el producto de la digestión se resuelve mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La presencia de un producto digerido es indicativa de secuencias mutadas inducidas por la actividad de la nucleasa TALE. Los resultados se muestran en la Figura 10, donde las flechas apuntan a los productos de PCR digeridos. Demuestran que las nucleasas TALE PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1, CTLA4_T3 y CTLA4_T4 exhiben actividad de nucleasa mutagénica en sus sitios diana.

Ejemplo 4: pTalfa permite la expresión de CD3 en la superficie en linfocitos T TCR alfa inactivados:

Descripción de las diferentes versiones de preTalfa:

El gen de pTalfa humano codifica una glicoproteína transmembrana que comprende un dominio extracelular similar a Ig, un dominio transmembrana hidrofóbico y una gran cola intracitoplasmática del extremo terminal C. Se han diseñado diferentes versiones derivadas de la glicoproteína pTalfa humana y se describen en la Tabla 11 y se representan en la Figura 11.

Tabla 11: Descri ción de un subconunto de construcciones Talfa.

Las diferentes construcciones de preTalfa probadas incluyen:

1) Mutantes por eliminación de pTalfa: Se generaron diferentes eliminaciones en la cola citoplasmática intracelular de la proteína pTalfa humana (que comprende 114 aminoácidos) (SEQ ID NO: 107). Las construcciones probadas incluyen la versión de longitud completa de la proteína (FL) y mutantes en los que se eliminaron 18, 48, 62, 78, 92, 110 y 114 aminoácidos del extremo terminal C de la proteína (SEQ ID NO: 108 a SEQ ID NO: 114).

2) Mutantes pTalfa que contienen dominios de activación intracelular: Las variantes FL y A48 se fusionaron con los dominios de activación intracelular CD8, CD28 o 41BB en su extremo terminal C (SEQ ID NO: 115 a SEQ ID NO: 120).

3) Mutantes quiméricos pTalfa/TCRa: En una de las construcciones, el dominio intracelular (IC) de TCRa se fusionó con una versión sin cola (A114) de pTalfa (SEQ ID NO: 121). También se generó una segunda construcción en donde el dominio extracelular de pTalfa se fusionó con los dominios transmembrana (TM) y el IC de TCRa (SEQ ID NO: 122).

4) Mutantes de dimerización de pTalfa: Algunas mutaciones se han descrito en la bibliografía como capaces de alterar la capacidad de oligomerización/dimerización del complejo preTCR. Se propone que estos mutantes permitan la expresión de preTCR en la superficie celular, sin inducir la señalización constitutiva (que se supone que se induce tras la oligomerización de preTCR). Las mutaciones se han introducido en la variante pTalfaA48 y son:

- 1xMUT: W46R (SEQ ID NO: 123)

- 4x MUT: D22A, K24A, R102A, R117A (SEQ ID NO: 124)

Actividad de diferentes construcciones de preTalfa en células Jurkat inactivadas con TRAC:

Para evaluar diferentes variantes de pTalfa por su capacidad para restaurar la expresión de CD3 en la superficie en células inactivadas con TCR alfa, se generó una línea celular en donde se alteró el gen de TCR alfa usando TALEN específico para TRAC. Se transfectaron células Jurkat (una línea celular de leucemia de células T) con plásmidos que codifican el TRAC de escisión de TALEN usando electroporación CytoPulse, y las células KO (TCRo/pNEG; CD3NEG) donde luego se purificó mediante selección negativa usando perlas magnéticas CD3. La población KO (células JKT_KOx3) se amplificó y se utilizó para la detección de las diferentes variantes de pTalfa. La selección se realizó mediante transfección de un millón de células JKT_KOx3 con 15 pg de plásmido que codifica las diferentes variantes de pTalfa bajo el control del promotor EF1a, seguido del análisis mediante citometría de flujo de la expresión en la superficie de las células de CD3 48 h después de la transfección. La Figura 12 es un ejemplo representativo de las eficiencias de transfección (% de célulasF+) y la actividad de las construcciones de pTalfa FL, A18 y A48 en células JKT_KOx3, en base al % de células CD3+, determinado mediante citometría de flujo. Los resultados de las diferentes construcciones se agrupan en la Tabla 12.

Actividad de pTalfa-FL y pTalfa-A48 en linfocitos T primarios inactivados con TCR alfa:

Para probar la capacidad de las versiones pTalfa-FL y pTalfa-A48 para inducir la expresión de CD3 en la superficie en linfocitos T inactivados con TCR alfa, se clonaron secuencias codificantes de pTalfa-FL y pTalfa-A48 en un vector lentiviral pLV-SFFV-BFP-2A PCTRA autoinactivante que codifica la proteína azul fluorescente (BFP) bajo el promotor SFFV seguido del péptido T2A autoescindible (Figura 13).

Se activaron linfocitos T aislados de sangre periférica durante 72 horas utilizando perlas activadoras anti-CD3/CD28 (Life Technologies) y se transfectaron 4.5 millones de células mediante electroporación con 10 |jg de ARNm que codifica la nucleasa TALE dirigida a la región de cadena constante TCR alfa (TRAC) utilizando un instrumento CytoLVT-S (BTX-Harvard Harbour). Dos días después de la electroporación, las células T se transdujeron con los vectores lentivirales de control LV-SFFV-BFP-2A-pTalfaA48 o LV-SFFV-BFP-2A. Luego se purificaron células T negativas para CD3 y CD3bajo usando perlas magnéticas anti-CD3 (Miltenyi Biotech). Este protocolo experimental está representado en la Figura 14A.

La Figura 14B representa el análisis de citometría de flujo de TCR alfa/beta, expresión de CD3 en la superficie celular y expresión deFen células T inactivadas (KO) con<t>C<r>alfa transducidas con BFP-2A-pTalfaA48 (KO/A48) o vector lentiviral BFP de control (KOBFP) antes y después de la purificación con perlas CD3. Las células inactivadas con TCR alfa transducidas con el vector BFP-T2A-pTalfa-A48 (células BFP+) muestran niveles más altos de CD3 en comparación con las células no transducidas (células BFP-). No se observan diferencias entre las células transducidas con el vector BFP de control. Estos resultados indican que pTalfa media la restauración de la expresión de CD3 en la superficie celular de las células inactivadas con TCR alfa. Por el contrario, la tinción de TCR alfa/beta permanece, como se esperaba, sin cambios en las células transducidas o no con el vector de expresión pTalfa-A48.

La expresión de CD3 mediada por pTalfa apoya la activación de células T deficientes en TCR:

Para determinar la capacidad de pTalfa para transducir señales de activación celular, se analizó la expresión de marcadores de activación temprana y tardía en células T inactivadas con TCR alfa transducidas con pTalfa-A48 y pTalfa-A48.41BB. Se generaron células T inactivadas con TCR alfa transducidas con pTalfa-A48 y pTalfa-A48.41BB a partir de células T humanas primarias como se describe en la sección anterior y en la Figura 14A.

Para detectar la señalización a través de CD3, las células se reactivaron usando perlas recubiertas con anti-CD3/CD28 3 días después de la purificación de células T inactivadas con TCR alfa con perlas CD3 (Figura 14A). Las células se tiñeron con anti-CD69 (marcador de activación temprana) y anti-CD25 (marcador de activación tardía) conjugados con fluorocromo, 24 y 48 horas después de la reactivación respectivamente y se analizaron mediante citometría de flujo (Figura 15A-B). Como se representa en la Figura 15A-B, las células inactivadas con TCR alfa que expresan pTalfa-A48 (KO/pTa-A48) o pTalfa-A48.41BB (KO/pTa-A48.BB) muestran sobrerregulación de los marcadores de activación, a niveles similares a aquellos observados en células que expresan TCR alfa/beta (NEP: células no electroporadas).

Otro indicador de la activación de las células T es un aumento en el tamaño de las células, lo que a veces se denomina "explosión". La capacidad de los complejos preTCR para inducir "explosión" se midió mediante análisis de citometría de flujo del tamaño celular 72 horas después de la reactivación usando perlas anti-CD3/CD28 (Figura 15C). La estimulación con perlas anti-CD3/CD28 indujo aumentos comparables en el tamaño celular en células que expresan complejos TCR alfa/beta frente a células que expresan pTalfa-A48 o pTalfa-A48.41BB. En conjunto, estos resultados sugieren que los complejos preTCR son competentes para transducir señales que se acoplan eficientemente a los mecanismos que median la sobrerregulación de los marcadores de activación.

La expresión de CD3 mediada por pTalfa apoya la expansión de células T primarias deficientes en TCR utilizando anticuerpos estimulantes anti-CD3/CD28

Para evaluar la capacidad de los complejos preTCR para soportar la proliferación celular a largo plazo, se midió la proliferación de células generadas como se describió anteriormente. Diez días después de la activación inicial, las células se mantuvieron en IL2 (sin reactivación) o en IL2 con perlas anti-CD3/CD28 (reactivación). Para cada condición, las células se contaron y analizaron mediante citometría de flujo en los diferentes momentos para estimar el número de células BFP+. Se comparó el crecimiento de células inactivadas (KO) con TCR alfa transducidas con vectores BFP o BFP-T2A-preTCRa-A48, y se estimó la inducción de estas células con respecto al valor obtenido el día 2 después de la reactivación. La Figura 16 muestra los resultados obtenidos con dos donantes independientes. En ambos casos, las células inactivadas con TCR alfa que expresan pTalfa-A48 mostraron una mayor expansión que las células inactivadas con TCR alfa que expresan solo el vector de control BFP Para el segundo donante, también se incluyeron células inactivadas con TCR alfa que expresaban pTalfa-A48.41BB o pTalfa de longitud completa, mostrando también una mayor expansión que las células inactivadas con TCR alfa que expresaban solo el vector de control BFP

Ejemplo 5: optimización de la transfección de ARNm en células T utilizando la tecnología CytoPulse Determinación del programa de CytoPulse optimizado

Se realizó una primera serie de experimentos en PBMC no activadas para determinar un intervalo de voltaje en donde las células podrían transfectarse. Se probaron cinco programas diferentes como se describe en la Tabla 13.

Se electroporaron 3 o 6 millones de células en una cubeta con un espacio de 0.4 cm (30 o 15 x 106 células/ml) con 20 |jg de plásmidos que codifican GFP y plásmidos de control pUC utilizando los diferentes programas CytoPulse. 24 horas después de la electroporación, se analizó la expresión de GFP en células electroporadas mediante citometría de flujo para determinar la eficacia de la transfección. Los datos mostrados en la Figura 17 indican el voltaje mínimo requerido para la electroporación de plásmidos en células T derivadas de PBMC. Estos resultados demuestran que los programas de CytoPulse 3 y 4 permiten una transformación eficiente de las células T (EP#3 y #4).

Electroporación de ARNm de células T purificadas activadas.

Después de determinar el mejor programa de CytoPulse que permite una electroporación eficiente del ADN de las células T, probamos si este método era aplicable a la electroporación del ARNm.

Se resuspendieron 5*10® células T purificadas previamente activadas 6 días con PHA/IL2 en tampón de citoporación T (aparato BTX-Harvard) y se electroporaron en cubetas de 0.4 cm con 10 jg de ARNm que codifica GFP o 20 jg de plásmidos que codifican GFP o pUC usando el programa de CytoPulse preferido como se determina en la sección anterior (Tabla 14).

48 h después de la transfección, las células se tiñeron con colorante de viabilidad (eFluor-450) y la viabilidad celular y el porcentaje de células GFP+ viables se determinaron mediante análisis de citometría de flujo (Figura 18).

Los datos mostrados en la Figura 18 indican que la electroporación de ARN con la condición óptima determinada en el presente documento no es tóxica y permite la transfección de más del 95 % de las células viables.

En síntesis, todo el conjunto de datos muestra que las células T se pueden transfectar de manera eficiente con ADN o ARN. En particular, la transfección de ARN no tiene impacto sobre la viabilidad celular y permite niveles de expresión uniformes del gen transfectado de interés en la población celular.

Se puede lograr una transfección eficiente poco después de la activación celular, independientemente del método de activación utilizado (perlas recubiertas de PHA/IL-2 o CD3/CD28). Los inventores han logrado transfectar células a partir de las 72 h después de la activación con eficiencias >95 %. Además, también se puede obtener una transfección eficaz de células T después de la descongelación y activación utilizando el mismo protocolo de electroporación.

Electroporación de ARNm en células T humanas primarias para la expresión funcional de la nucleasa TALE

Después de demostrar que la electroporación de ARNm permite la expresión eficiente de GFP en células T humanas primarias, probamos si este método era aplicable a la expresión de otras proteínas de interés. Las nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (nucleasa TALE) son nucleasas específicas de sitio generadas por la fusión de un dominio de unión al ADN de TAL a un dominio de escisión del ADN. Son potentes herramientas de edición del genoma, ya que inducen roturas de doble cadena en prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada. Estas roturas de doble cadena activan la unión de extremos no homólogos (NHEJ), un mecanismo de reparación del ADN propenso a errores, que potencialmente conduce a la inactivación de cualquier gen de interés deseado. Alternativamente, si al mismo tiempo se introduce en las células una plantilla de reparación adecuada, las roturas del ADN inducidas por la nucleasa TALE pueden repararse mediante recombinación homóloga, ofreciendo así la posibilidad de modificar a voluntad la secuencia del gen.

Hemos utilizado la electroporación de ARNm para expresar una nucleasa TALE diseñada para escindir específicamente una secuencia en el gen humano que codifica la cadena alfa del receptor de antígeno de células T (TRAC). Se espera que las mutaciones inducidas en esta secuencia den como resultado la inactivación del gen y la pérdida del complejo TCRap en la superficie de la célula. El ARN de nucleasa TALE de TRAC o el ARN no codificante como control se transfectan en linfocitos T humanos primarios activados utilizando la tecnología CytoPulse. La secuencia de electroporación consistió en 2 pulsos de 1200 V seguidos de cuatro pulsos de 130 V como se describe en la Tabla 14.

Mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de TCR en la superficie 7 días después de la electroporación (Figura 19, panel superior), observamos que el 44 % de las células T perdieron la expresión de TCRap. Analizamos el ADN genómico de las células transfectadas mediante amplificación por PCR del locus TRAC seguida por secuenciación de alto rendimiento con 454. El 33 % de los alelos secuenciados (727 de 2153) contenían inserción o eliminación en el sitio de escisión de la nucleasa TALE. La Figura 19 (panel inferior) muestra ejemplos de los alelos mutados.

Estos datos indican que la electroporación de ARNm utilizando tecnología de CytoPulse da como resultado la expresión funcional de la nucleasa TALE de TRAC.

Electroporación de células T con un ARNm monocistrónico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) de cadena única anti-CD19:

Se resuspendieron 5*10® células T previamente activadas durante varios días (3-5) con perlas recubiertas anti-CD3/CD28 e IL2 en tampón de citoporación T y se electroporaron en cubetas de 0.4 cm sin ARNm o con 10 |jg de ARNm que codifica un CAR de cadena sencilla (SEQ ID NO: 73) utilizando el programa descrito en la Tabla 14.

24 horas después de la electroporación, las células se tiñeron con un tinte de viabilidad fijable eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de IgG anti-ratón de cabra conjugado con PE específico para evaluar la expresión del CAR en la superficie celular en las células vivas. Los datos se muestran en la Figura 20. A indica que la gran mayoría de las células T vivas electroporadas con el ARNm monocitrónico descrito anteriormente expresan el CAR en su superficie.

24 horas después de la electroporación, las células T se cocultivaron con células Daudi (CD19+) durante 6 horas y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la expresión del marcador de desgranulación CD 107a en su superficie (Betts, Brenchley et al., 2003).

Los datos mostrados en la Figura 20 indican que la mayoría de las células sometidas a electroporación con el ARNm monocistrónico descrito anteriormente se desgranulan en presencia de células diana que expresan CD19. Estos resultados demuestran claramente que el CAR expresado en la superficie de las células T electroporadas está activo.

Electroporación de células T con un ARNm policistrónico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) de múltiples subunidades anti-CD19:

Se electroporaron 5*10® células T previamente activadas varios días (3-5) con perlas recubiertas anti CD3/CD28 e IL2 en tampón de citoporación T, y se electroporaron en cubetas de 0.4 cm sin ARNm o con 45 |jg de ARNm que codifica un Ca R de múltiples cadenas (SEQ ID NO: 125, codificada por SEQ ID NO: 126, Figura 21A y Figura 4B (csm4)) usando el programa como se describe en la Tabla 14.

24 horas después de la electroporación, las células se tiñeron con un tinte de viabilidad fijable eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de IgG anti-ratón de cabra conjugado con PE específico para evaluar la expresión de CAR en la superficie celular en las células vivas. Los datos mostrados en la Figura 21 indican que la gran mayoría de las células T vivas electroporadas con el ARNm policistrónico descrito anteriormente expresan el CAR en su superficie.

24 horas después de la electroporación, las células T se cocultivaron con células Daudi (CD19+) durante 6 horas y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la expresión del marcador de desgranulación CD107a en su superficie. Los datos mostrados en la Figura 21 indican que la mayoría de las células sometidas a electroporación con el ARNm policistrónico descrito anteriormente se desgranulan en presencia de células diana que expresan CD19. Estos resultados demuestran claramente que el CAR expresado en la superficie de las células T electroporadas está activo.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Células T genéticamente modificadas para uso en inmunoterapia adoptiva en donde las células se utilizan como células alogénicas caracterizadas porque:

(a) se ha inactivado un primer gen que codifica CD52 o un receptor de glucocorticoides (GR), donde la inactivación de dicho primer gen hace que dichas células T genéticamente modificadas sean resistentes a un agente inmunosupresor específico para CD52 o GR;

(b) se ha inactivado un segundo gen que codifica TCR alfa o TCR beta;

(c) las células se han expandido in vitro, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor; y

(d) dichas células T genéticamente modificadas expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR);

en donde dichas células T genéticamente modificadas se administran a un paciente tratado con el agente inmunosupresor para evitar el rechazo de dichas células alogénicas por parte del sistema inmunológico del paciente.

2. Las células T genéticamente modificadas para el uso de la reivindicación 1, en donde dichas células T son células primarias.

3. Las células T genéticamente modificadas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dichas células T se derivan de un donante.

4. Las células T genéticamente modificadas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas células T son células humanas.

5. Las células T genéticamente modificadas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas células T transformadas se han expandido en presencia de dicho agente inmunosupresor.

6. Las células T genéticamente modificadas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se ha inactivado un gen CD52 y dicho agente inmunosupresor es un anticuerpo específico para el antígeno CD52.

7. Las células T genéticamente modificadas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se ha inactivado un gen del receptor de glucocorticoides (GR) y dicho agente inmunosupresor es un corticosteroide, tal como dexametasona.

8. Las células T genéticamente modificadas para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el primer y segundo genes inactivados se seleccionan del grupo que consiste en CD52 y TCR alfa, CD52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta.

9. Un método in vitro para obtener células T modificadas, en donde dicho método comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una célula T;

(b) seleccionar en dicha célula T un gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor, en donde dicho gen codifica CD52 o un receptor de glucocorticoides (GR);

(c) introducir in vitro en dichas endonucleasas de corte poco común de células T para inactivarlas selectivamente mediante escisión del ADN, respectivamente:

- un primer gen que codifica CD52 o un receptor de glucocorticoides (GR) y

- un segundo gen que codifica TCR alfa o<t>C<r>beta.

(d) expandir in vitro dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor

en donde dichas células T modificadas no son alorreactivas y son resistentes a dicho agente inmunosupresor.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dichas endonucleasas de corte poco común se cotransfectan en la etapa c).

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde dichas endonucleasas de corte poco común están codificadas por ARNm.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dichas endonucleasas de corte poco común se introducen en dicha célula en la etapa (c) mediante electroporación de ARN.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde dichas endonucleasas de corte poco común son endonucleasas efectoras TAL (nucleasas TALE).

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde al menos una de estas nucleasas TALE está dirigida contra una de las secuencias genéticas diana de TCR alfa seleccionadas de la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 57 a la SEQ ID NO: 60.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde al menos una de estas nucleasas TALE está dirigida contra una de las secuencias genéticas diana de TCR beta seleccionadas de la SEQ ID NO: 38 y la SEQ ID NO: 39.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde al menos una de estas nucleasas TALE está dirigida contra una de las secuencias genéticas diana de GR seleccionadas de la SEQ ID NO:1 a la SEQ ID NO:6.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde al menos una de estas nucleasas TALE está dirigida contra una de las secuencias diana del gen CD52 seleccionadas de la SEQ ID NO: 40, la SEQ ID NO: 61 a la SEQ ID NO: 65.

18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, que comprende introducir en dichas células T un receptor de antígeno quimérico (CAR).

19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha secuencia del receptor de antígeno quimérico es la SEQ ID NO: 73.

20. El método de la reivindicación 18, en donde dicho receptor de antígeno quimérico es un receptor de antígeno quimérico de múltiples cadenas.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, que comprende introducir en dicha célula T una nucleasa TALE capaz de inactivar selectivamente mediante escisión del ADN el gen PDCD1 o CTLA-4.

22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 21, en donde dichas células T se derivan de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T colaboradores.

23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, en donde dichas células T en la etapa a) se derivan de linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+.

24. Una población de células T que comprende células T genéticamente modificadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para uso en inmunoterapia adoptiva, en donde las células se usan como células alogénicas y en donde dichas células T genéticamente modificadas se administran a un paciente tratado con el agente inmunosupresor específico para CD52 o GR para evitar el rechazo de dichas células alogénicas por parte del sistema inmunológico del paciente.

25. La población de células T para su uso de acuerdo con la reivindicación 24, en donde dichas células T se derivan de un donante.

26. Las células T para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadas por que se administran a razón de 104-109 células por kg de peso corporal, en particular 105 a 106 células/kg de peso corporal, en donde dichas células T comprenden una secuencia de polinucleótidos exógena que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR).

27. Las células T para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de un cáncer.

28. Las células T para el uso de la reivindicación 27, para su uso en el tratamiento de linfoma o leucemia.

29. Una célula T aislada que comprende al menos dos polinucleótidos, codificando dichos polinucleótidos al menos una primera y una segunda nucleasas TALE, estando dirigida la primera nucleasa TALE contra un gen que codifica TCR alfa o TCR beta y estando dirigida la segunda contra un gen que codifica una diana para un agente inmunosupresor, en donde la inactivación de dicho gen que codifica TCR alfa o TCR beta hace que dicha célula T no sea alorreactiva y la inactivación de dicho gen que codifica una diana para un agente inmunosupresor hace que dicha célula T sea resistente a dicho agente inmunosupresor, y en donde dicha segunda nucleasa TALE está dirigida contra un gen que codifica CD52 o GR.

30. Las células T para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha secuencia del receptor de antígeno quimérico es la SEQ ID NO: 73.

31. Las células T para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho receptor de antígeno quimérico es un receptor de antígeno quimérico de múltiples cadenas.

32. Las células T para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dichas células T en la etapa a) se derivan de linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+.