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ES2748158T3 - Formulación líquida de conjugado de proteínas que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina - Google Patents

Formulación líquida de conjugado de proteínas que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina Download PDF

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ES2748158T3
ES2748158T3 ES13853118T ES13853118T ES2748158T3 ES 2748158 T3 ES2748158 T3 ES 2748158T3 ES 13853118 T ES13853118 T ES 13853118T ES 13853118 T ES13853118 T ES 13853118T ES 2748158 T3 ES2748158 T3 ES 2748158T3
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oxynthomodulin
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Hyun Uk Kim
Hyung Kyu Lim
Myung Hyun Jang
Sang Yun Kim
Sung Min Bae
Se Chang Kwon
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Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
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Abstract

Una formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, que comprende una cantidad farmacológicamente activa de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en la que el conjugado derivado de oxintomodulina comprende un derivado de oxintomodulina, que es un péptido fisiológicamente activo, que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26; una región Fc de inmunoglobulina; y un polímero no peptidílico, en la que el polímero no peptidílico une covalentemente el derivado de oxintomodulina y la región Fc de inmunoglobulina, y un estabilizador sin albúmina, en la que el estabilizador contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados de manitol y sorbitol y polisorbato 20.

Description

DESCRIPCIÓN
Formulación líquida de conjugado de proteínas que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina
Campo técnico
La presente invención se refiere a una formulación líquida sin albúmina que comprende un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en la que un péptido de oxintomodulina que comprende un derivado, variante, precursor o fragmento de oxintomodulina está unido a una región Fc de inmunoglobulina, que puede aumentar la duración de la actividad fisiológica del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración y mantener la estabilidad in vivo del mismo durante un período de tiempo prolongado, en comparación con la oxintomodulina natural. La presente invención también se refiere a un procedimiento de preparación de la formulación líquida.
Técnica antecedente
La obesidad se define como una afección de acumulación de grasa anormal o excesiva que puede afectar la salud y es el resultado de un desequilibrio de energía en el que la ingesta de energía excede el gasto de energía. La obesidad no era un problema de salud grave en el pasado, pero con el crecimiento económico, la población obesa está aumentando con la creciente riqueza económica, y también está aumentando el número de diversas enfermedades relacionadas con la obesidad. De acuerdo con el informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS), más de 1,5 billones de adultos en todo el mundo tienen sobrepeso, más de 500 millones de ellos son obesos y la población con obesidad aumentó aproximadamente dos veces entre 1980 y 2008 (Organización Mundial de la Salud, Fact sheet on obesity and overweight, 2011). No solo en países de altos ingresos, sino también en países de bajos ingresos, el porcentaje de personas obesas está aumentando actualmente. El sobrepeso y la obesidad son responsables del aumento de la presión arterial y los niveles de colesterol y causan o empeoran diversas enfermedades. Además, el problema de la obesidad es más grave en niños o adolescentes, aumenta la incidencia de diabetes, enfermedades cardíacas, hipertensión o hiperlipidemia, y también puede causar muertes o discapacidades.
Como se describe anteriormente, la obesidad es una enfermedad global y un problema social, pero en el pasado, se creía que la obesidad podría superarse mediante esfuerzos individuales, y por lo tanto no se hizo especial hincapié en el tratamiento de la obesidad. Sin embargo, la obesidad no es fácil de tratar, porque es una enfermedad compleja asociada con los mecanismos de control del apetito y el metabolismo energético. En consecuencia, el tratamiento de la obesidad requiere no solo los propios esfuerzos del paciente, sino también un procedimiento capaz de tratar los mecanismos anormales asociados con el control del apetito y el metabolismo energético. Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para desarrollar fármacos para tratar la obesidad.
Como resultado de tales esfuerzos, se desarrollaron fármacos, incluidos Rimonabant (Sanofi-Aventis), Sibutramina (Abbott), Contrave (Takeda), Orlistat (Roche) y similares, pero estos fármacos tienen deficiencias porque muestran efectos secundarios fatales o tienen un efecto insuficiente en el tratamiento de la obesidad. Se informó que Rimonabant (Sanofi-Aventis) mostró trastornos del sistema nervioso central, Sibutramina (Abbott) y Contrave (Takeda) mostraron efectos secundarios cardiovasculares, y Orlistat (Roche) mostró un efecto de reducción de peso de solo unos 4 kg cuando se administró durante 1 año. Por lo tanto, actualmente hay pocos o ningún agente terapéutico para la obesidad que se pueda recetar de manera segura a los pacientes con obesidad.
Recientemente, los derivados de glucagón han recibido mucha atención. El páncreas produce glucagón cuando los niveles de glucosa en sangre comienzan a disminuir debido a medicamentos, enfermedades, deficiencias hormonales o enzimáticas, o similares. El glucagón funciona para estimular a las células del hígado a descomponer el glucógeno almacenado en glucosa que se libera después en la sangre para elevar el nivel de glucosa en sangre a un nivel normal. Además del efecto de aumentar el nivel de glucosa en sangre, se informó que el glucagón suprime el apetito y activa la lipasa sensible a hormonas (HSL) de los adipocitos para facilitar la lipólisis, mostrando así efectos contra la obesidad. Entre los derivados de glucagón, se está desarrollando como agente terapéutico el péptido 1 tipo glucagón (GLP-1) para reducir la hiperglucemia en pacientes diabéticos y funciona para estimular la síntesis y secreción de insulina, inhibir la secreción de glucagón, suprimir el vaciado gástrico, aumentar la utilización de glucosa e inhibir la ingesta de alimentos. Se sabe que la exendina-4 que se aísla del veneno de lagarto tiene una homología de aminoácidos de aproximadamente el 50 % con GLP-1 y activa el receptor de GLP-1 para reducir la hiperglucemia en pacientes diabéticos. Sin embargo, se informó que los fármacos terapéuticos para la obesidad, incluyendo GLP-1, causan efectos secundarios tales como vómitos y náuseas.
Por lo tanto, como alternativa a GLP-1, está recibiendo atención la oxintomodulina capaz de unirse a ambos receptores para los dos péptidos (GLP-1 y glucagón). La oxintomodulina es un péptido hecho de preglucagón, un precursor del glucagón, y es un potente agente contra la obesidad, porque inhibe la ingesta de alimentos, como GLP-1, promueve la saciedad y muestra actividad lipolítica, como el glucagón.
En base a la doble función del péptido de oxintomodulina, se han realizado activamente estudios sobre el desarrollo de fármacos para el tratamiento de la obesidad. Por ejemplo, el Registro de Patente Coreana N.° 925017 divulga una composición oral, parenteral, mucosa, rectal, subcutánea o transdérmica para tratar la obesidad humana, que comprende oxintomodulina como principio activo. Sin embargo, se informó que los agentes terapéuticos para la obesidad que comprenden oxintomodulina tienen una semivida in vivo corta y muestran un bajo efecto en el tratamiento de la obesidad, incluso cuando se administran en dosis altas tres veces al día. Por lo tanto, se han realizado esfuerzos para aumentar la semivida in vivo o el efecto de tratamiento de la obesidad de la oxintomodulina modificando la oxintomodulina.
Por ejemplo, la oxintomodulina agonista dual (Merck) se obtiene sustituyendo L-serina con D-serina en el aminoácido 2 de oxintomodulina para aumentar la resistencia a la dipeptidil peptidasa-IV (DPP-IV) y uniendo un resto de colesterol al extremo C para aumentar la semivida en sangre. ZP2929 (Zealand) se obtiene sustituyendo L-serina con D-serina en el aminoácido 2 de oxintomodulina para aumentar la resistencia a DPP-IV, sustituyendo arginina con alanina en el aminoácido 17 para aumentar la resistencia a proteasa, sustituyendo metionina con lisina en el aminoácido 27 para aumentar la estabilidad oxidativa, y sustituyendo glutaminas en los aminoácidos 20 y 24 y asparagina en el aminoácido 28 con ácido aspártico, alanina y serina, respectivamente, para aumentar la estabilidad de la desamidación. La oxintomodulina agonista dual (Merck) tiene una semivida in vivo aumentada de 1,7 horas, que es más larga que la semivida (8-12 minutos) de la oxintomodulina natural, pero aún tiene una semivida in vivo muy corta y se administra a una dosis muy alta de varios mg/kg. Por lo tanto, la oxintomodulina o sus derivados tienen dos grandes desventajas, es decir, una semivida corta y bajos efectos medicinales. Debido a estas desventajas, deben administrarse diariamente a dosis altas. Para superar estas desventajas, se estudió un procedimiento para aumentar la semivida en sangre de la oxintomodulina mientras se mantiene la actividad in vivo de la misma, y como resultado, se desarrolló un derivado de oxintomodulina. Además, usando esta tecnología, se preparó un polímero no peptidílico conjugando un vehículo con el derivado de oxintomodulina, y se descubrió que el conjugado de proteínas puede mostrar un mejor efecto antiobesidad como resultado de aumentar la semivida en sangre del mismo mientras se mantiene la actividad in vivo (Solicitud de Patente Coreana N.° 10-2012-0064110). El documento CN 102010473 divulga formulaciones conjugadas de oxintomodulina de larga duración que comprenden tampón y manitol.
Por lo general, las proteínas y los péptidos tienen una semivida muy corta y sufren desnaturalización, tal como precipitación por agregación de monómeros y adsorción en las superficies de los vasos, tras la exposición a diversos factores como temperaturas desfavorables, interfaz agua-aire, alta presión, estrés físico/mecánico, disolventes orgánicos y contaminación microbiana. Esta desnaturalización es irreversible y, por lo tanto, las proteínas y péptidos desnaturalizados pierden propiedades fisicoquímicas intrínsecas y efectos fisiológicamente activos. Además, las proteínas y los péptidos son inestables y susceptibles a factores extrínsecos tales como la temperatura, la humedad, el oxígeno, los rayos UV o similares para sufrir cambios físicos o químicos que incluyen asociación, polimerización u oxidación, dando como resultado una pérdida sustancial de actividad (Registro de Patente Coreana N^ 10­ 0389726).
Además, las proteínas y péptidos adsorbidos se agregan fácilmente mediante el proceso de desnaturalización, y las proteínas y péptidos desnaturalizados, cuando se administran al cuerpo humano, actúan como la causa de la formación de anticuerpos en el cuerpo humano, y por esta razón, las proteínas y péptidos deben administrarse en una forma suficientemente estable. En consecuencia, se han estudiado varios procedimientos para prevenir la desnaturalización de proteínas y péptidos en solución (John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43, N^ 5, 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech. Octubre, 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185, 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25, 267-340, 1986; Michelle et al., Int. J. Pharm. 120, 179-188, 1995).
La liofilización se aplica a algunas proteínas y péptidos para lograr el objetivo de estabilidad. Sin embargo, los productos liofilizados son inconvenientes porque deben volver a disolverse en agua de inyección para su uso. Además, en el caso de la liofilización, se requiere una inversión masiva en liofilizadores de gran capacidad o similares, porque el proceso de liofilización se incluye en los procesos de producción. Además, también se está utilizando un procedimiento para producir proteínas y péptidos en polvo utilizando un secador por pulverización, pero en este caso, la eficacia económica disminuye debido a un bajo rendimiento y la exposición a altas temperaturas puede afectar negativamente la estabilidad de las proteínas.
Para superar dichas limitaciones, se han realizado estudios en los que se añadieron estabilizadores a proteínas y péptidos en solución para suprimir los cambios fisicoquímicos de las proteínas y péptidos mientras se mantiene la eficacia in vivo de los mismos incluso durante el almacenamiento a largo plazo. La albúmina sérica humana, un tipo de proteína, se ha utilizado ampliamente como estabilizador para varios fármacos proteicos, y se ha demostrado su rendimiento (Edward Tarelli et al., Biologicals (1998) 26, 331-346).
Un proceso para purificar la albúmina sérica humana incluye la inactivación de contaminantes biológicos tales como micoplasma, priones, bacterias y virus, y la evaluación o examen de uno o más contaminantes biológicos o patógenos. Sin embargo, siempre existe el riesgo de que los pacientes estén expuestos a los contaminantes biológicos que no se eliminan o inactivan por completo. Por ejemplo, el proceso de evaluación incluye examinar si la sangre humana de los donantes contiene determinado virus, pero este proceso no siempre es confiable. En particular, puede no detectarse un virus específico existente en un número muy pequeño de donantes.
Las diferentes proteínas pueden inactivarse gradualmente a diferentes velocidades en diferentes condiciones durante el almacenamiento, debido a sus diferencias químicas. Es decir, la extensión del plazo de almacenamiento por un estabilizador no es idéntica para diferentes proteínas. Por este motivo, la proporción, la concentración y el tipo de estabilizador adecuados que se utiliza para proporcionar estabilidad al almacenamiento varían dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de la proteína diana. Cuando los estabilizadores se usan en combinación, pueden causar efectos adversos diferentes de los efectos deseados debido a la competencia e interacción entre ellos. Además, debido a que la naturaleza o la concentración de las proteínas pueden cambiar durante el almacenamiento, los estabilizadores utilizados pueden mostrar efectos diferentes de los previstos. Por lo tanto, se requiere una gran cantidad de esfuerzo y precauciones para estabilizar las proteínas en solución.
En particular, un conjugado de oxintomodulina y Fc de inmunoglobulina es un conjugado en el que la oxintomodulina que es un péptido fisiológicamente activo, se encuentra unido a una región Fc de inmunoglobulina. Por lo tanto, debido a que el peso molecular y el volumen del conjugado ciertamente difieren de los de la oxintomodulina natural, se requiere una composición especial para estabilizar la proteína.
Además, debido a que la oxintomodulina (que es un péptido fisiológicamente activo) y la región Fc de inmunoglobulina son péptidos o proteínas que tienen diferentes propiedades fisicoquímicas, deben estabilizarse de forma simultánea. Sin embargo, como se describe anteriormente, diferentes proteínas o proteínas pueden inactivarse gradualmente a diferentes velocidades en diferentes condiciones durante el almacenamiento, debido a sus diferencias químicas, y cuando se usan en combinación los estabilizadores adecuados para proteínas o péptidos, pueden causar efectos adversos diferentes de los efectos deseados debido a la competencia e interacción entre ellos. Por lo tanto, en el caso de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, existe mucha dificultad en encontrar una composición para estabilizar simultáneamente la oxintomodulina, que es un péptido fisiológicamente activo, y la región Fc de inmunoglobulina.
En estas circunstancias, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para proporcionar una formulación líquida estable que pueda almacenarse durante un largo período de tiempo sin preocuparse por la contaminación vírica, y como resultado, han encontrado que un estabilizador, que incluye un tampón, un alcohol de azúcar y un el tensioactivo no iónico y puede incluir además un aditivo, tal como un agente isotónico o un aminoácido, y un conservante para uso repetido, puede aumentar la estabilidad de un derivado de oxintomodulina de larga duración, y se puede preparar una formulación líquida rentable y estable usando el estabilizador, completando de esta forma la presente invención.
Divulgación de la invención
Problema técnico
Es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, que comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en la que una oxintomodulina que es un péptido fisiológicamente activo, está unida a una región Fc de inmunoglobulina; y a un estabilizador sin albúmina.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de preparación de la formulación líquida anterior.
Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para prevenir o tratar obesidad o diabetes, que comprende una formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina que comprende oxintomodulina peptídica fisiológicamente activa unida a una región Fc de inmunoglobulina.
Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para prevenir o tratar obesidad o diabetes, que comprende administrar la formulación líquida anterior a un sujeto.
Solución al Problema
Para alcanzar los objetivos anteriores, en un aspecto, la presente invención proporciona una formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, que comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en el que una oxintomodulina que es un péptido fisiológicamente activo que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26; una región Fc de inmunoglobulina; un polímero no peptidílico, en el que el polímero no peptidílico une covalentemente el derivado de oxintomodulina y la región Fc de inmunoglobulina, y un estabilizador sin albúmina, en el que el estabilizador contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados de manitol y sorbitol y polisorbato 20. Como se usa en el presente documento, la expresión "formulación líquida" se refiere a una formulación de fármaco procesada en una forma líquida y está destinada a incluir todas las formulaciones líquidas para uso interno y formulaciones para uso externo. En la técnica anterior, no se informó la formulación líquida de la invención adecuada para una cantidad farmacológicamente eficaz del conjugado derivado de oxintomodulina que comprende oxintomodulina unida al dominio Fc de inmunoglobulina. Por lo tanto, la formulación líquida de la presente invención comprende una cantidad farmacológicamente eficaz del conjugado derivado de oxintomodulina que comprende un derivado de oxintomodulina, que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26, un dominio Fc de inmunoglobulina, un polímero no peptidílico, en el que el polímero no peptidílico une covalentemente el derivado de oxintomodulina y la región Fc de inmunoglobulina y un estabilizador sin albúmina, en el que el estabilizador contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes seleccionados de manitol y sorbitol y polisorbato 20. Además, la formulación líquida de la presente invención puede comprender además un conservante.
En la presente invención, el estabilizador puede comprender además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en agentes isotónicos, azúcares, alcoholes polihídricos y aminoácidos. El alcohol de azúcar puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en manitol, sorbitol y glicerol, y la concentración del alcohol de azúcar en la formulación líquida puede ser 2-15 % (p/v). Además, el tampón puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en tampones de citrato, acetato, histidina y fosfato. En el presente documento, se divulga adicionalmente un tampón que puede tener un pH que varía de 4,5 a 7,0. El agente isotónico puede ser cloruro de sodio, y el tensioactivo no iónico puede ser polisorbato o poloxámero y estar presente en una concentración de 0,001-0,1 % (p/v). El aminoácido puede ser metionina. Por lo tanto, la formulación líquida de la presente invención comprende un estabilizador sin albúmina que contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados del grupo que consiste en manitol y sorbitol y polisorbato 20.
Además, la formulación líquida de la presente invención puede comprender además uno o más conservantes seleccionados del grupo que consiste en m-cresol, fenol y alcohol bencílico. La concentración del conservante en la formulación líquida puede ser 0,001-1 % (p/v).
En particular, la formulación líquida de la presente invención puede comprender una cantidad farmacológicamente eficaz del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, histidina 5-50 mM, 2-15 % (p/v) de manitol, 0,01­ 1 mg/ml de metionina y 0,001-0,1 % (p/v) de polisorbato 20. Además de estos componentes, la formulación líquida puede comprender además 0,001-1 % (p/v) de m-cresol.
Como se usa en el presente documento, el término "estabilizador" se refiere a una sustancia que mantiene de manera estable ingredientes tales como principios activos durante un período de tiempo específico. Para el fin de la presente invención, el término se refiere a una sustancia que permite que el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacene de manera estable. La estabilidad durante el almacenamiento de proteínas tal como el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración es importante no solo para garantizar una dosis precisa, sino también para inhibir la posible producción de una sustancia antigénica para el conjugado derivado de oxintomodulina.
El estabilizador en la presente invención contiene un tampón, un alcohol de azúcar y un tensioactivo no iónico para impartir estabilidad al conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Además, el estabilizador puede comprender además preferentemente uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en agentes isotónicos, azúcares, alcoholes polihídricos y aminoácidos.
El tampón funciona para mantener el pH de la formulación líquida de modo que el pH de la formulación líquida no cambie rápidamente para estabilizar el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Ejemplos del tampón pueden incluir tampones de pH farmacéuticamente aceptables, que incluyen una sal alcalina (fosfato de sodio, fosfato de potasio o una sal de hidrógeno o dihidrógeno del mismo), citrato de sodio, ácido cítrico, acetato de sodio, ácido acético e histidina, o también se puede utilizar una mezcla de estos tampones. El tampón es preferentemente un tampón citrato o histidina, y más preferentemente un tampón histidina. La concentración del tampón es preferentemente 5-100 mM, y más preferentemente 5-50 mM. El pH del tampón es 4,8 a 6,0, preferentemente 5,0-6,0. Además, en el presente documento, se divulga un tampón que tiene un pH que varía de 4,0-8,0, más preferentemente 4,5-7,0.
En un ejemplo de la presente invención, se midió la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH del tampón de la formulación líquida. Es decir, después de que el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenara a 25 °C durante 0-4 semanas mientras se cambiaba el pH del tampón, se analizó la cantidad restante del conjugado y, como resultado, se demostró que el conjugado derivado de oxintomodulina era más estable a pH 5,6, pH 5,8 y pH 6,0 (Ejemplo 3, Tablas 2 a 5, Ejemplo 7, Tablas 18 a 21, Ejemplo 8 y Tablas 22 a 25). Por lo tanto, se encontró que el pH del tampón más estable en la presente invención varía de 5,0 a 6,0. En un ejemplo de la presente invención, se midió la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el tipo de tampón de la formulación líquida. Específicamente, después de que el conjugado derivado de oxintomodulina se almacenara con polisorbato 20 al 0,02 %, 0,1 mg/ml de metionina y manitol al 5 % a 25 °C durante 0-4 semanas, se analizó la cantidad restante del conjugado. Los resultados del análisis de SE-HPLC indicaron que la cantidad restante del conjugado no difería mucho entre los tampones al mismo pH. Los resultados del análisis IE-HPLC o RP-HPLC indicaron que la histidina era más estable al mismo pH (Ejemplo 8 y Tablas 22 a 25).
El alcohol de azúcar funciona para aumentar la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. En la presente invención, el alcohol de azúcar puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en manitol y sorbitol. Preferentemente, el alcohol de azúcar puede ser manitol. La concentración del alcohol de azúcar en la formulación líquida es preferentemente 1-20 % (p/v), y más preferentemente 2-15 % (p/v).
En un ejemplo de la presente invención, se analizó la influencia del tipo de alcohol de azúcar como estabilizador sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, el conjugado derivado de oxintomodulina se almacenó en tampón citrato (pH 5,6) a 25 °C durante 0-4 semanas, y a continuación se analizó por IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. Como resultado, el conjugado era más estable en presencia de manitol o sorbitol que en presencia de glicerol a la misma concentración. Los resultados del análisis RP-HPLC indicaron que el conjugado era un poco más estable en presencia de manitol en comparación con la presencia de sorbitol (Ejemplo 4 y Tablas 6 a 9). En otras palabras, se demostró que la adición de manitol o sorbitol mostraba una excelente estabilidad, pero el conjugado era más estable en presencia de manitol.
En un ejemplo de la presente invención, se analizó la influencia de la concentración del alcohol de azúcar como estabilizador sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, el conjugado derivado de oxintomodulina se almacenó a 25 °C durante 0-4 semanas, y a continuación se analizó por IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. Como resultado, en presencia de manitol al 2 % o manitol al 15 %, se produjo un precipitado de proteína, y en presencia de manitol al 5 % o manitol al 10 %, el conjugado era estable (Ejemplo 5, Tablas 10 a 13, Ejemplo 7 y Tablas 18 a 21).
El tensioactivo no iónico funciona para reducir la tensión superficial de la solución de proteína para evitar que la proteína se adsorba en una superficie hidrófoba o se agregue. Ejemplos preferidos de un tensioactivo no iónico que puede usarse en la presente invención incluyen tensioactivos no iónicos basados en polisorbato y tensioactivos no iónicos basados en poloxámero, que pueden usarse solos o en combinación de dos o más. No es apropiado que el tensioactivo no iónico se use a altas concentraciones en la formulación líquida. La formulación líquida de la presente invención contiene el tensioactivo no iónico a una concentración de 0,2 % (p/v) o menos, y preferentemente 0,001­ 0,1 % (p/v).
El estabilizador de la presente invención puede contener un aminoácido tal como metionina. La metionina funciona para estabilizar adicionalmente la proteína al inhibir la producción de impurezas que pueden estar causadas, por ejemplo, por la reacción oxidativa de la proteína.
En un ejemplo de la presente invención, se probó la influencia de la concentración del tensioactivo no iónico como estabilizador y la presencia o ausencia de un aminoácido sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, el conjugado derivado de oxintomodulina se almacenó en tampón citrato (pH 5,6) y manitol al 10 % a 25 °C durante 0-4 semanas, y a continuación se analizó por IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. Como resultado, el conjugado derivado de oxintomodulina era más estable en presencia de polisorbato 20 al 0,02 % y 0,1 mg/ml de metionina (Ejemplo 6 y Tablas 14 a 17).
El agente isotónico funciona para mantener la presión osmótica a un nivel adecuado cuando se administra el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en solución in vivo y además puede funcionar para estabilizar adicionalmente el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en solución. Ejemplos típicos del agente isotónico incluyen sales inorgánicas solubles en agua, tales como cloruro de sodio, sulfato de sodio, citrato de sodio. La concentración del agente isotónico es preferentemente de 0-200 mM, y su contenido puede controlarse adecuadamente.
El estabilizador de la presente invención no contiene albúmina. La albúmina sérica humana que se puede usar como estabilizador de proteínas se prepara a partir de sangre humana y, por lo tanto, se puede contaminar con el virus patógeno humano, y la gelatina o la albúmina sérica bovina pueden causar enfermedades o causar reacciones alérgicas en algunos pacientes. El estabilizador sin albúmina de la presente invención no contiene una proteína extraña tal como albúmina sérica humana o animal o gelatina purificada, y por lo tanto no es susceptible a la infección viral.
Ejemplos preferidos de azúcares entre los azúcares y los alcoholes polihídricos que pueden usarse adicionalmente para aumentar la estabilidad de almacenamiento del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración incluyen monosacáridos tales como manosa, glucosa, fucosa y xilosa y polisacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa y dextrano y ejemplos preferidos de alcoholes polihídricos incluyen polipropileno, polietilenglicol de bajo peso molecular, glicerol, polipropilenglicol de bajo peso molecular. Estos azúcares y alcoholes polihídricos pueden usarse individualmente o en combinación de dos o más.
Además del tampón, el agente isotónico, el alcohol de azúcar, el aminoácido y el tensioactivo no iónico descritos anteriormente, la formulación líquida de la presente invención puede comprender además otros componentes o sustancias conocidos en la técnica dentro de un intervalo que no perjudique el efecto del presente invención.
La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de la invención comprende una cantidad farmacológicamente eficaz del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración que comprende un derivado peptídico de oxintomodulina fisiológicamente activo, que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26, una región Fc de inmunoglobulina y un polímero no peptidílico, en el que el polímero no peptidílico une covalentemente el derivado de oxintomodulina y la región Fc de inmunoglobulina y un estabilizador sin albúmina, en el que el estabilizador contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados de manitol y sorbitol, y polisorbato 20. Más específicamente, el estabilizador puede contener un tampón que tiene un pH que varía de 5,0 a 6,0, manitol y polisorbato 20. Además, el estabilizador puede comprender además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en agentes isotónicos, azúcares, alcoholes polihídricos y aminoácidos.
La formulación líquida sin albúmina de la invención que contiene una alta concentración del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, que confiere estabilidad al conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, no es susceptible a la infección vírica, es simple y muestra una excelente estabilidad de almacenamiento, y por lo tanto puede proporcionarse de manera económica en comparación con otros estabilizadores o formulaciones liofilizadas.
Además, debido a que la formulación líquida de la presente invención comprende el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración que tiene actividad fisiológica durante un período de tiempo prolongado en comparación con la oxintomodulina natural, puede mantener la actividad proteica en el cuerpo humano durante un período de tiempo prolongado en comparación con las formulaciones de oxintomodulina convencionales y, por lo tanto, puede usarse como una formulación de fármacos eficaz. Además, la formulación líquida de la presente invención confiere una excelente estabilidad incluso a una alta concentración del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración.
Como se usa en el presente documento, el término "oxintomodulina" se refiere a un péptido producido a partir del preglucagón que es un precursor del glucagón. En la presente invención, la oxintomodulina pretende incluir oxintomodulina natural y su precursor, derivado, fragmento y variante. Preferentemente, la oxintomodulina tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).
Como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de oxintomodulina" pretende incluir un péptido, un derivado de péptido o un mimético de péptido que se obtiene mediante la adición, deleción o sustitución de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina y puede activar los receptores de glucagón y GLP-1 a un nivel más alto que el activado por oxintomodulina natural. Como se divulga en el presente documento, el derivado de oxintomodulina puede tener una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 a 34. El derivado de oxintomodulina de las reivindicaciones tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 a 26. Más preferentemente, puede tener una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento de oxintomodulina" se refiere a un fragmento que tiene uno o más aminoácidos en el extremo amino o carboxilo terminal de la oxintomodulina natural, en el que los aminoácidos añadidos también pueden ser aminoácidos no de origen natural (p. ej., aminoácidos de tipo D). Este fragmento de oxintomodulina tiene la función de regular los niveles de glucosa en sangre in vivo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "variante de oxintomodulina" es un péptido que tiene uno o más restos de aminoácidos diferentes de los de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina natural y posee una función de activación de los receptores de GLP-1 y glucagón. La variante de oxintomodulina puede prepararse por una cualquiera de sustitución, adición, deleción, modificación, o una combinación de las mismas de algunos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina natural.
Los procedimientos de preparación de la variante, el derivado y el fragmento de oxintomodulina pueden usarse solos o en combinación. Por ejemplo, la presente invención también incluye un péptido, que tiene uno o más aminoácidos diferentes de los de la oxintomodulina natural y la desaminación de los restos de aminoácidos N-terminales y tiene la función de activar tanto el receptor de GLP-1 como el receptor de glucagón.
Los aminoácidos mencionados en el presente doc
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, se abrevian de acuerdo con las reglas de nomenclatura de IUPAC-IUB de la siguiente manera:
Alanina A; Arginina R;
Asparagina N; Ácido aspártico D;
Cisteína C; Ácido glutámico E;
Glutamina Q; Glicina G;
Histidina H; Isoleucina I;
Leucina L; Lisina K;
Metionina M; Fenilalanina F
Prolina P; Serina S;
Treonina T; Triptófano W;
Tirosina Y; Valina V.
En el presente documento se divulga que, el derivado de oxintomodulina abarca cualquier péptido, que se prepara mediante la sustitución, adición, deleción o modificación postraduccional (p.ej., metilación, acilación, ubiquitinación o unión covalente intramolecular) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y puede activar los receptores tanto de glucagón como de GLP-1. Para la sustitución o adición de los aminoácidos, no solo se pueden usar los 20 aminoácidos que se encuentran comúnmente en las proteínas humanas, sino también aminoácidos atípicos o de origen no natural. Las fuentes comerciales de aminoácidos atípicos incluyen Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. y Genzyme Pharmaceuticals. Los péptidos, que incluyen estos aminoácidos, y las secuencias de péptidos atípicos pueden sintetizarse y adquirirse de proveedores comerciales, por ejemplo, American Peptide Company o Bachem (EE. UU.) o Anygen (Corea).
En una realización específica como se divulga en el presente documento, el derivado de oxintomodulina es un nuevo péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 1:
Fórmula 1 R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2
en la que
R1 es histidina, desamino-histidilo, dimetil-histidilo (N-dimetil-histidilo), beta-hidroxiimidazopropionilo, 4-imidazoacetilo, beta-carboxiimidazopropionilo o tirosina;
XI es Aib (ácido aminoisobutírico), d-alanina, glicina, Sar (N-metilglicina), serina o d-serina;
X2 es ácido glutámico o glutamina;
X3 es leucina o tirosina;
X4 es serina o alanina;
X5 es lisina o arginina;
X6 es glutamina o tirosina;
X7 es leucina o metionina;
X8 es ácido aspártico o ácido glutámico;
X9 es ácido glutámico, serina o ácido alfa-metilglutámico o está eliminado;
X10 es glutamina, ácido glutámico, lisina, arginina o serina o está eliminado;
X II es alanina, arginina o valina o está eliminado;
X12 es alanina, arginina, serina o valina o está eliminado;
X13 es lisina, glutamina, arginina o ácido alfa-metilglutámico o está eliminado;
X14 es ácido aspártico, ácido glutámico o leucina o está eliminado;
X15 es fenilalanina o está eliminado;
X16 es isoleucina o valina o está eliminado;
X17 es alanina, cisteína, ácido glutámico, lisina, glutamina o ácido alfa-metilglutámico o está eliminado;
X18 es triptófano o está eliminado;
X19 es alanina, isoleucina, leucina, serina o valina o está eliminado;
X20 es alanina, lisina, metionina, glutamina o ácido arginina o está eliminado;
X21 es asparagina o está eliminado;
X22 es alanina, glicina o treonina o está eliminado;
X23 es cisteína o lisina o está eliminado;
X24 es un péptido que tiene de 2 a 10 aminoácidos que consiste en una combinación de alanina, glicina y serina o está eliminado; y R2 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) o está eliminado (con la excepción del caso en el que la secuencia de aminoácidos de fórmula 1 es idéntica a la de la SEQ ID NO: 1).
Además, se divulga en el presente documento, para aumentar la actividad de la oxintomodulina de tipo silvestre para el receptor de glucagón y el receptor GLP-1, el derivado de oxintomodulina de la presente invención puede sustituirse con 4-imidazoacetilo obtenido por deleción del carbono alfa de histidina en la posición 1 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, desamino-histidilo obtenido por deleción del grupo amino N-terminal, dimetilhistidilo (N-dimetil-histidilo) obtenido por modificación del grupo amino N-terminal con dos grupos metilo, beta -hidroxi imidazopropionilo obtenido por sustitución del grupo amino N-terminal con un grupo hidroxilo, o beta-carboxi imidazopropionilo obtenido por sustitución del grupo amino N-terminal con un grupo carboxilo. Además, la región de unión al receptor de GLP-1 puede estar sustituida con aminoácidos que potencian los enlaces iónicos e hidrófobos o una combinación de los mismos. Además, una porción de la secuencia de oxintomodulina puede sustituirse con la secuencia de aminoácidos de GLP-1 o Exendina-4 para aumentar la actividad del receptor de GLP-1.
Además, se divulga en el presente documento que una porción de la secuencia de oxintomodulina puede sustituirse con una secuencia que potencia la hélice alfa. Preferentemente, los aminoácidos en las posiciones 10, 14, 16, 20, 24 y 28 de la secuencia de aminoácidos de fórmula 1 pueden sustituirse con aminoácidos o derivados de aminoácidos que consisten en Tyr (4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala (2-tienilo) y Ala (benzotienilo) que son conocidos por estabilizar la hélice alfa, y el tipo y número de aminoácidos o derivados de aminoácidos estabilizadores de la hélice alfa a insertar no están limitados. En la presente invención, los aminoácidos en las posiciones 10 y 14, posiciones 12 y 16, posiciones 16 y 20, posiciones 20 y 24 y posiciones 24 y 28 de la secuencia de aminoácidos se sustituyen con ácido glutámico o lisina para formar anillos, y el número de anillos a insertar no está limitado. En el presente documento también se divulga que, el derivado de oxintomodulina puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las siguientes fórmulas 2 a 6.
Además, se divulga en el presente documento, un derivado de oxintomodulina que es un nuevo péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 2, obtenida por sustitución de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina con la de exendina o GLP-1:
Fórmula 2 R1-A-R3
Además, en el presente documento se divulga otro derivado de oxintomodulina que es un nuevo péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 3, que se prepara uniendo una porción de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina y una porción de la secuencia de aminoácidos de exendina o GLP-1 a través de un enlazador de aminoácidos adecuado:
Fórmula 3 R1-B-C-R4
Además, en el presente documento se divulga otro derivado de oxintomodulina, que es un nuevo péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 4, en la que una porción de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina se sustituye con un aminoácido que potencia la unión hidrófoba al receptor de GLP-1. Por ejemplo, es un péptido en el que Leu en la posición 26 se sustituye con el aminoácido Ile o Val que aumenta la hidrofobicidad. Fórmula 4 R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3
En el presente documento se divulga otro derivado de oxintomodulina que es un nuevo péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula 5, en el que se elimina, añade o sustituye una porción de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina natural, con otros aminoácidos para aumentar las capacidades de la oxintomodulina natural para activar el receptor de GLP-1 y el receptor de glucagón:
Fórmula 5 R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5
En las fórmulas 2 a 5, R1 es como se describe en la fórmula 1;
A se selecciona del grupo que consiste en SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46) y SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47);
B se selecciona del grupo que consiste en SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO: 48) y SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO: 49);
C es un péptido que tiene de 2 a 10 aminoácidos que consiste en una combinación de alanina, glicina y serina; D1 es serina, ácido glutámico o arginina;
D2 es arginina, ácido glutámico o serina;
D3 es arginina, alanina o valina;
D4 es arginina, valina o serina;
D5 es glutamina, arginina o lisina;
D6 es isoleucina, valina o serina;
D7 es metionina, arginina o glutamina;
D8 es treonina, glicina o alanina;
E1 es serina, Aib, Sar, d-alanina o d-serina;
E2 es serina o ácido glutámico;
E3 es arginina o lisina;
E4 es glutamina o lisina;
E5 es ácido aspártico o ácido glutámico;
E6 es glutamina, cisteína o lisina;
E7 es cisteína o lisina o está eliminado;
R3 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) o GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37); R4 es HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) o HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40); y,
R5 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) o GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37) o está eliminado (con la excepción del caso en el que las secuencias de aminoácidos de las fórmulas 2 a 5 sean idénticas a las de la SEQ ID NO: 1).
Preferentemente, el derivado de oxintomodulina de la presente invención puede ser un nuevo péptido de la siguiente fórmula 6:
Fórmula 6 R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2
en la que R1 es histidina;
XI es Aib (ácido aminoisobutírico);
X2 es glutamina;
X3 es tirosina;
X4 es serina;
X5 es lisina;
X6 es tirosina;
X7 es leucina;
X8 es ácido aspártico;
X9 es ácido glutámico;
X10 es lisina;
X II es arginina;
X12 es alanina;
X13 es lisina;
X14 es ácido glutámico;
X15 es fenilalanina;
X16 es valina;
X17 es, glutamina;
X18 es triptófano;
X19 es, leucina;
X20 es metionina;
X21 es asparagina;
X22 es treonina;
X23 es cisteína;
X24 es un péptido que tiene de 2 a 10 aminoácidos que consiste en glicina o está eliminado; y
R2 es KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) o HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) o está eliminado (con la excepción del caso en el que la secuencia de aminoácidos de fórmula 6 es idéntica a la de la SEQ ID NO: 1).
También se divulga en el presente documento, un derivado de oxintomodulina que puede seleccionarse del grupo que consiste en los péptidos de las SEQ ID NO: 2 a 34. También se divulga en el presente documento un derivado de oxintomodulina que puede ser un derivado de oxintomodulina descrito en la Tabla 1 del Ejemplo 1.
La oxintomodulina tiene las actividades de dos péptidos, GLP-1 y glucagón. GLP-1 tiene el efecto de reducir los niveles de glucosa en sangre mediante la secreción de insulina, pero el glucagón tiene el efecto de aumentar los niveles de glucosa en sangre. Además, GLP-1 inhibe la ingesta de alimentos y suprime el vaciado gástrico, y el glucagón tiene el efecto de reducir el peso corporal al facilitar la lipólisis y aumentar el metabolismo energético. Por lo tanto, GLP-1 y glucagón tienen diferentes efectos biológicos. Por lo tanto, en el caso en que los dos péptidos se presenten como un conjugado, si el efecto de uno cualquiera de los dos péptidos es mayor que el del otro, puede producirse un efecto adverso. Por ejemplo, si el efecto del glucagón es mayor que el de GLP-1, los niveles de glucosa en sangre pueden aumentar, y si el efecto del GLP-1 es mayor que el de glucagón, pueden producirse efectos secundarios tales como náuseas y vómitos. Además, el efecto de los dos péptidos puede variar dependiendo de la relación de las actividades de los dos péptidos. Por lo tanto, los derivados de oxintomodulina y sus conjugados no se limitan solamente a los derivados que tienen mayores actividades.
Como se usa en el presente documento, la expresión "conjugado derivado de oxintomodulina" se refiere a un conjugado que comprende oxintomodulina de acuerdo con la reivindicación 1 y otro elemento. El otro elemento puede ser cualquier sustancia que tenga funciones beneficiosas, incluido el aumento de la semivida en sangre de la oxintomodulina o el retraso de la liberación de oxintomodulina en los riñones. El conjugado de la presente invención puede unirse covalentemente a la oxintomodulina o formar microesferas para aumentar la estabilidad sérica de la oxintomodulina o retrasar la liberación de oxintomodulina en los riñones o para cambiar la actividad de unión de la oxintomodulina a su receptor. El vehículo que puede formar un conjugado que comprende oxintomodulina puede seleccionarse del grupo que consiste en albúmina, transferrina, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, elastina, heparina, polisacárido tal como la quitina, fibronectina, que puede unirse a la oxintomodulina para aumentar la estabilidad sérica de la oxintomodulina. Preferentemente, el vehículo es una región Fc de inmunoglobulina.
La Fc de inmunoglobulina que puede usarse en la presente invención puede ser una Fc de inmunoglobulina humana, una Fc de inmunoglobulina que tiene la secuencia de un análogo de la misma, o una Fc de inmunoglobulina derivada de animales, incluyendo vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas. Además, la región Fc de inmunoglobulina puede derivar de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, o una combinación o híbrido de las mismas. Además, cada dominio de la región Fc de inmunoglobulina de la presente invención puede ser un híbrido de dominios procedentes de diferentes inmunoglobulinas seleccionadas del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Como alternativa, la región Fc de inmunoglobulina es un dímero o multímero que consiste en inmunoglobulinas de cadena sencilla compuestas de dominios del mismo origen. Preferentemente, la región Fc de inmunoglobulina es una derivada de IgG o IgM, que es más rica en sangre humana. Lo más preferentemente, es una Fc de inmunoglobulina derivada de IgG que se sabe que aumenta la semivida de las proteínas de unión a ligando. La Fc de inmunoglobulina puede prepararse tratando IgG natural con una proteasa específica o a partir de células transformadas usando la técnica de recombinación. Preferentemente, es una Fc de inmunoglobulina humana recombinante preparada en E. coli.
Entre tanto, IgG también puede subclasificarse en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y en la presente invención, también es posible una combinación o híbrido de estas subclases. Preferentemente, IgG es la subclase de IgG2 e IgG4, y lo más preferentemente, es la región Fc de IgG4 que carece sustancialmente de funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En otras palabras, la región Fc de inmunoglobulina más preferida que se usa como vehículo farmacológico en la presente invención es una región Fc no glicosilada derivada de IgG4 humana. Una región Fc derivada del ser humano es más preferente que una región Fc no derivada del ser humano, que puede actuar como un antígeno en el cuerpo humano y causar respuestas inmunitarias indeseables, tal como la producción de un nuevo anticuerpo contra el antígeno.
En la presente invención, el conjugado derivado de oxintomodulina puede prepararse usando un polímero no peptidílico o mediante una técnica de recombinación génica. El conjugado se prepara uniendo oxintomodulina a la región Fc de inmunoglobulina mediante un polímero no peptidílico.
El polímero no peptidílico está unido a cada una de oxintomodulina y región Fc de inmunoglobulina. Cada extremo del polímero no peptidílico puede estar unido a la región Fc de inmunoglobulina y al grupo amino o tiol del derivado de oxintomodulina, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "conjugado derivado de oxintomodulina" se refiere a uno que tiene un efecto duradero aumentado en comparación con la oxintomodulina natural. Ejemplos del conjugado de larga duración incluyen, pero sin limitación, un conjugado en el que un derivado de oxintomodulina resultante de la modificación, sustitución, adición o deleción de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina natural se une a un polímero biodegradable tal como polietilenglicol (PEG), un conjugado en el que una proteína que tiene propiedades de larga duración excelentes, tal como la albúmina o inmunoglobulina, está unidas a la oxintomodulina, un conjugado en el que un ácido graso que tiene la capacidad de unirse a la albúmina in vivo está unido a la oxintomodulina, o un conjugado en el que la oxintomodulina está encapsulada en nanopartículas biodegradables.
Como se usa en el presente documento, la expresión "polímero no peptidílico" se refiere a un polímero biocompatible que incluye dos o más unidades repetidas unidas entre sí por cualquier enlace covalente en lugar de un enlace peptídico. En la presente invención, el polímero no peptidílico puede usarse indistintamente con el enlazador no peptidílico.
Un enlazador peptídico que se usa en una proteína de fusión obtenida por un procedimiento de fusión en marco convencional tiene los inconvenientes de que es fácilmente escindido por proteinasa in vivo, y por lo tanto no se puede obtener el efecto deseado de aumentar la semivida en suero del fármaco activo por un vehículo. Sin embargo, en la presente invención, el polímero que tiene resistencia a la proteinasa se puede usar para mantener la semivida en suero del péptido, similar al vehículo. Por lo tanto, cualquier polímero no peptidílico puede usarse sin limitación en la presente invención, siempre que sea un polímero que tenga la función mencionada anteriormente, es decir, un polímero que tenga resistencia a proteinasa in vivo. El polímero no peptidílico tiene un peso molecular en el intervalo de 1 a 100 kDa, y preferentemente de 1 a 20 kDa. El polímero no peptidílico de la presente invención, que está unido a la región Fc de inmunoglobulina, puede ser un tipo de polímero o una combinación de diferentes polímeros.
El polímero no peptidílico que se usa en la presente invención puede tener un grupo reactivo capaz de unirse a la región Fc de inmunoglobulina y al fármaco proteico. El grupo reactivo en ambos extremos del polímero no peptidílico preferentemente se selecciona del grupo que consiste en un grupo aldehído reactivo, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida.
El derivado de succinimida puede ser propionato de succinimidilo, hidroxil succinimidilo, succinimidilo carboximetilo o carbonato de succinimidilo. En particular, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo en ambos extremos del mismo, se pueden minimizar las reacciones no específicas, y se pueden unir un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina de manera eficaz a ambos extremos del polímero no peptidílico, respectivamente. Un producto final generado por alquilación reductora con un enlace aldehído es mucho más estable que el unido por un enlace amida. El grupo reactivo aldehído se une selectivamente a un extremo N a un pH bajo y puede formar un enlace covalente con un resto de lisina a un pH alto, tal como pH 9,0.
Los grupos reactivos en ambos extremos del polímero no peptidílico pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, el polímero no peptidílico puede poseer un grupo maleimida en un extremo y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo. Cuando se usa un polietilenglicol que tiene un grupo hidroxilo reactivo en ambos extremos del mismo como el polímero no peptidílico, el grupo hidroxilo puede activarse a varios grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas, o se puede usar un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo modificado disponible comercialmente para preparar el conjugado de acción prolongada de la presente invención.
El conjugado de la presente invención puede ser uno en el que cada extremo del polímero no peptidílico esté unido a la región Fc de inmunoglobulina y al grupo amina o tiol del derivado de oxintomodulina, respectivamente.
Entre tanto, en la presente invención, ambos extremos del polímero no peptidílico incluyen grupos reactivos a los que se puede unir una región Fc de inmunoglobulina y un fármaco proteico. Ejemplos de los grupos reactivos incluyen, pero sin limitación, un grupo aldehído, un grupo propionaldehído, o un grupo butiraldehído, un grupo maleimida, un derivado de succinimida (propionato de succinimidilo, hidroxil succinimidilo, succinimidilo carboximetilo o carbonato de succinimidilo)
Los grupos reactivos en ambos extremos del enlazador que es el polímero no peptidílico pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, el polímero no peptidílico puede tener un grupo maleimida en un extremo y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo. Por ejemplo, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo en un extremo y un grupo maleimida reactivo en el otro extremo, se pueden minimizar las reacciones no específicas, y se pueden unir un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina de manera eficaz a ambos extremos del polímero no peptidílico. El polímero no peptidílico que puede usarse en la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol/propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, polisacáridos, dextrano, polivinil etil éter, polímeros biodegradables tales como p La (ácido poliláctico) y PLGA (ácido polilácticoglicólico), polímeros de lípidos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el polímero no peptidílico es polietilenglicol. Además, se incluyen en el alcance de la presente invención los derivados de los mismos conocidos en la técnica y los derivados que pueden prepararse fácilmente mediante un procedimiento conocido en la técnica.
En un ejemplo de la presente invención, se sintetizó un conjugado uniendo oxintomodulina o su derivado a la región Fc de inmunoglobulina a través de un enlace covalente usando el PEG de polímero no peptidílico que incluye un grupo propionaldehído solo o un grupo maleimida y un grupo aldehído.
El conjugado de la presente invención tiene excelentes actividades del receptor de GLP-1 y del receptor de glucagón en comparación con la oxintomodulina natural. También, se ha unido a una región Fc que aumenta su semivida en sangre in vivo para mantener su actividad in vivo durante un período prolongado de tiempo.
Como se usa en el presente documento, el término "conservante" se refiere a una sustancia que se utiliza para evitar reacciones anormales o la descomposición causada por la contaminación microbiana. La formulación líquida de la presente invención puede comprender además un conservante. Un conservante generalmente se usa en formulaciones de dosis múltiples que es más probable estén contaminadas con microorganismos, pero sin limitación a ellas y también se puede usar en formulaciones liofilizadas o formulaciones de dosis única para prevenir la contaminación microbiana. La formulación líquida de la presente invención puede comprender uno o más conservantes seleccionados de m-cresol, fenol y alcohol bencílico. La concentración del conservante en la formulación líquida puede ser 0,001-1 % (p/v). En particular, el conservante que se incluye en la formulación líquida de la presente invención es preferentemente m-cresol. La formulación líquida de la presente invención puede ser una formulación de dosis múltiples.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración.
Específicamente, en una realización de la presente invención, el procedimiento de preparación de la formulación líquida puede comprender las etapas de: a) preparar un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración; y b) mezclar el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración preparado con un estabilizador que contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados del grupo que consiste en manitol y sorbitol y polisorbato 20.
En otra realización de la presente invención, el procedimiento de preparación de la formulación líquida puede comprender las etapas de: a) preparar un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración; y b) mezclar el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración preparado con un estabilizador, que contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados del grupo que consiste en manitol, sorbitol y polisorbato 20 y un conservante.
Preferentemente, el estabilizador en la etapa b) puede comprender además uno o más seleccionados del grupo que consiste en agentes isotónicos, azúcares, alcoholes polihídricos y aminoácidos.
Además, en el presente documento se divulga, una composición farmacéutica para prevenir o tratar obesidad o diabetes, que comprende la formulación líquida anterior.
Como se usa en el presente documento, el término "prevenir" se refiere a todas las acciones que inhiben o retrasan el desarrollo de una enfermedad diana. Como se usa en el presente documento, el término "prevenir" significa administrar el conjugado de la presente invención para inhibir o retrasar el desarrollo de afecciones diabéticas, tales como niveles anormales de glucosa en sangre o secreción anormal de insulina, o afecciones de obesidad tales como un aumento en el peso corporal o la grasa corporal.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" se refiere a todas las acciones que alivian, mejoran o reducen los síntomas de la enfermedad desarrollada. Como se usa en el presente documento, el término "tratar" significa administrar el conjugado de la presente invención para aliviar, mejorar o reducir las afecciones de diabetes u obesidad anteriores para normalizar los niveles de glucosa en sangre y la secreción de insulina y reducir el peso corporal o la grasa corporal.
Como se usa en el presente documento, el término "obesidad" se refiere a una cantidad excesiva de grasa corporal. Se define como obesidad un índice de masa corporal (= peso (kg) dividido por la altura (m)) de 25 o más. La obesidad generalmente es el resultado de un desequilibrio energético en el que la ingesta de energía excede al gasto energético. La obesidad es una enfermedad metabólica que afecta a todo el cuerpo y es muy probable que conduzca a diabetes e hiperlipidemia. Además, la obesidad está relacionada con la disfunción sexual, la artritis y un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, y también está relacionada con el desarrollo de cáncer en algunos casos.
Como se usa en el presente documento, el término "diabetes" es un tipo de enfermedad metabólica en la que la secreción de insulina es insuficiente o no se realizan funciones normales. La diabetes se caracteriza por un aumento en los niveles de glucosa en sangre y causa varios problemas de salud. En el caso de la diabetes, la glucosa se excreta con la orina.
La composición farmacéutica puede comprender además un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa una cantidad que es suficiente para mostrar efectos terapéuticos y no causa efectos secundarios. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente la dosis del principio activo de la composición farmacéutica de la presente invención dependiendo del tipo de enfermedad, la edad del paciente, el peso, el estado de salud, el género y la sensibilidad al fármaco, la vía de administración, el modo de administración, la frecuencia de administración, la duración del tratamiento, los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con la composición de la presente invención y otros factores conocidos en el campo médico.
E el presente documento también se divulga, una procedimiento para prevenir o tratar obesidad o diabetes, que comprende administrar la formulación líquida a un sujeto. El alcance de la invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a los procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del organismo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
En el presente documento, la formulación líquida, obesidad y diabetes son como se describen anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un sujeto sospechoso de tener obesidad o diabetes. Específicamente, el término significa mamíferos, incluyendo seres humanos, ratas y animales domésticos, que tienen o corren el riesgo de desarrollar la enfermedad anterior. Además, el sujeto puede ser cualquier sujeto que pueda tratarse mediante el derivado de formulación líquida de la presente invención.
El procedimiento terapéutico como se divulga en el presente documento puede comprender administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende la formulación líquida. La dosis diaria total de la composición se puede determinar mediante un juicio médico apropiado por parte de un médico, y la composición se puede administrar una o varias veces. Sin embargo, en vista del propósito de la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz específica de la composición para cualquier paciente en particular puede variar dependiendo de varios factores bien conocidos en el campo médico, incluyendo el tipo y grado de respuesta a alcanzar, composiciones concretas de acuerdo con si se usan otros agentes con ella o no, la edad del paciente, el peso corporal, el estado de salud, género y dieta, el tiempo y la vía de administración, la tasa de secreción de la composición, la duración del tratamiento, otros fármacos utilizados en combinación o coincidentes con la composición de la presente invención y otros factores conocidos en el campo médico.
Efectos Ventajosos de la Invención
La formulación líquida de la invención que comprende el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración comprende un tampón, un alcohol de azúcar y un tensioactivo no iónico y no contiene albúmina sérica humana y factores que son potencialmente dañinos para el cuerpo humano, y por lo tanto no es susceptible a la infección vírica. Además, el conjugado derivado de oxintomodulina de la presente invención comprende oxintomodulina unida a una región Fc de inmunoglobulina, y por lo tanto tiene un gran peso molecular, actividad fisiológica prolongada y excelente estabilidad al almacenamiento, en comparación con la oxintomodulina natural.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1a es un gráfico que muestra los resultados obtenidos mediante la purificación de un derivado de oxintomodulina mono-PEGilado (SEQ ID NO: 25) a través de una columna de purificación SOURCE S.
La FIG. 1b es un gráfico que muestra los resultados obtenidos mediante la purificación de un conjugado de un derivado de oxintomodulina mono-PEGilado (SEQ ID NO: 25) y una Fc de inmunoglobulina a través de una columna de purificación SOURCE 15Q.
La FIG. 1c es un gráfico que muestra los resultados obtenidos mediante la purificación de un conjugado de un derivado de oxintomodulina mono-PEGilado (SEQ ID NO: 25) y una inmunoglobulina Fc a través de una columna de purificación SOURCE ISO.
La FIG. 2a es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH por IE-HPLC en el Ejemplo 3 después de 0-2 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en
la FIG. 2a muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 2b es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH por SE-HPLC en el Ejemplo 3 después de 0-2 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 2b muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 2c es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH por RP-HPLC en el Ejemplo 3 después de 0-2 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 2c muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 3a es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el tipo de alcohol de azúcar y la presencia o ausencia de un agente isotónico por IE-HPLC en el Ejemplo 4 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 3a muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 3b es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el tipo de alcohol de azúcar y la presencia o ausencia de un agente isotónico por SE-HPLC en el Ejemplo 4 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 3b muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 3c es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el tipo de alcohol de azúcar y la presencia o ausencia de un agente isotónico por RP-HPLC en el Ejemplo 4 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 3c muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 4a es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de alcohol de azúcar por IE-HPLC en el Ejemplo 5 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 4a muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 4b es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de alcohol de azúcar por SE-HPLC en el Ejemplo 5 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 4b muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 4c es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de alcohol de azúcar por RP-HPLC en el Ejemplo 5 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 4c muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 5a es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de un tensioactivo y la presencia o ausencia de un aminoácido por IE-HPLC en el Ejemplo 6 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 5a muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 5b es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de un tensioactivo y la presencia o ausencia de un aminoácido por SE-HPLC en el Ejemplo 6 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 5b muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 5c es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de un tensioactivo y la presencia o ausencia de un aminoácido por RP-HPLC en el Ejemplo 6 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 5c muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 6a es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y la concentración de alcohol de azúcar por IE-HPLC en el Ejemplo 7 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 6a muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 6b es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y la concentración de alcohol de azúcar por SE-HPLC en el Ejemplo 7 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 6b muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 6c es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y la concentración de alcohol de azúcar por RP-HPLC en el Ejemplo 7 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 6c muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 7a es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y el tipo de alcohol tampón por IE-HPLc en el Ejemplo 8 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 7a muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 7b es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y el tipo de alcohol tampón por SE-HPLC en el Ejemplo 8 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 7b muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 7c es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y el tipo de alcohol tampón por PR-HPLC en el Ejemplo 8 después de 0-4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 7c muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 8a es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la presencia o ausencia de un conservante y la concentración de oxintomodulina de larga duración por IE-HPLC en el Ejemplo 9 después de 0­ 4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 8a muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 8b es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la presencia o ausencia de un conservante y la concentración de oxintomodulina de larga duración por SE-HPLC en el Ejemplo 9 después de 0­ 4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 8b muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
La FIG. 8c es un diagrama gráfico que muestra los resultados obtenidos al evaluar la estabilidad de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la presencia o ausencia de un conservante y la concentración de oxintomodulina de larga duración por RP-HPLC en el Ejemplo 9 después de 0­ 4 semanas de almacenamiento a 25 °C. Cada gráfico en la FIG. 8c muestra el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial.
Modo de la invención
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos son únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1: Síntesis de oxintomodulina y derivados de oxintomodulina
Para medir la estabilidad de los derivados de oxintomodulina y oxintomodulina en la formulación líquida, se sintetizaron derivados de oxintomodulina que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Tabla 1 a continuación. Los derivados de oxintomodulina con las SEQ ID NO: 1 a 23 y 27 a 34 no corresponden a derivados de oxintomodulina de acuerdo con la presente invención.
Tabla 1
Tabla 1
Figure imgf000016_0001
(continuación)
Figure imgf000017_0001
En la Tabla anterior, los restos de aminoácidos indicados con letras en negrita significan aminoácidos que forman anillos y los restos de aminoácidos indicados por X significan ácido alfa-metil-glutámico que es un aminoácido no natural. Además, CA indica 4-imidazoacetilo, dA indica desamino-histidilo y (d)S indica d-serina.
Ejemplo 2: Preparación de conjugado que comprende derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y Fc de inmunoglobulina (derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) unido a la región Fc de inmunoglobulina)
Primero, para PEGilar MEG-10K-ALD PEG en un resto de cisteína en la posición de aminoácido 30 de un derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25), se permitió que reaccionaran entre sí el derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y MAL-10K-ALD PEG en una relación molar de 1:3 y una concentración de proteína de 3 mg/ml a temperatura ambiente durante 3 horas. En el presente documento, la reacción se realizó en tampón Tris 50 mM (pH 8,0) en presencia de guanidina 1M. Después de finalizar la reacción, la solución de reacción se aplicó a una columna SOURCE S para purificar un derivado de oxintomodulina mono-PEGilado en la cisteína (columna: SOURCE S, caudal: 2,0 ml/min, gradiente: A 0 ^100 % 50 min B (A: Citrato de Na 20 mM, pH 3,0 45 % de etanol, B: A KCl 1 M)) (FIG. 1a). La FIG. 1a es un gráfico que muestra los resultados obtenidos mediante la purificación del derivado de oxintomodulina mono-PEGilado (SEQ ID NO: 25) a través de la columna de purificación SOURCE S.
A continuación, se hizo reaccionar entre sí el derivado de oxintomodulina mono-PEGilado purificado (SEQ ID NO: 25) y una Fc de inmunoglobulina a una relación molar de 1:5 y una concentración de proteína de 20 mg/ml a 4 °C durante 16 horas. La reacción se realizó en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0) en presencia de SCB 20 mM como agente reductor. Después de finalizar la reacción, la reacción se aplicó a una columna de purificación SOURCE 15Q (columna: SOUrCe 15Q, caudal: 2,0ml/min, gradiente: A 0 ^ 4 % 1 min B ^ 20 % 80 min B (A: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, B: A NaCl 1M)) (FIG. 1b) y una columna de purificación Source ISO (columna: SOUrCe ISO, caudal: 2,0 ml/min, gradiente: B 0 ^ 100 % 100 min A (A: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, B: A AS 1,1 M)) (Figura 1c) para purificar un conjugado que comprende el derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y la Fc de inmunoglobulina. La FIG. 1b es un gráfico que muestra los resultados obtenidos mediante la purificación del conjugado, que comprende el derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y la Fc de inmunoglobulina, a través de la columna de purificación SOURCE 15Q y la FIG. 1c es un gráfico que muestra los resultados obtenidos la purificación del conjugado, que comprende el derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) y la Fc de inmunoglobulina, a través de la columna de purificación Source ISO.
El conjugado derivado de oxintomodulina preparado como se describe anteriormente se desarrolló para aumentar la semivida en sangre de oxintomodulina. Comprende la región Fc de inmunoglobulina, el polímero no peptidílico y la oxintomodulina, unidos covalentemente entre sí de una manera específica de sitio y tiene una semivida en sangre significativamente mayor.
Ejemplo 3: Evaluación de la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH
Con el fin de evaluar la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración (preparado en el Ejemplo 2) en formulaciones líquidas, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenó en las composiciones que se muestran en la Tabla 2 a 25 °C durante 0-2 semanas, y a continuación se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio iónico (IE-HPLC), cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). Para el almacenamiento del conjugado derivado de oxintomodulina, se usaron tampón citrato como tampón, manitol como alcohol de azúcar y polisorbato 20 como un tensioactivo no iónico. En las Tablas 3, 4 y 5 a continuación, IE-HPLC (%), SE-h PlC (%) y RP-HPLC (%) indican % de área/% de área inicial, que indica el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial. La Tabla 3 muestra el área de IE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento, la Tabla 4 muestra el área de s E-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento y la Tabla 5 muestra el área de RP-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento.
Tabla 2
T l 21
Figure imgf000018_0001
Tabla 3
T l 1
Figure imgf000018_0002
Tabla 4
T l 41
Figure imgf000018_0003
Tabla 5
T l 1
Figure imgf000018_0004
Como puede observarse a partir de los resultados de IE-HPLC (%) en la Tabla 3 anterior, el conjugado derivado de oxintomodulina era más estable a pH más bajo. En los resultados de SE-HPLC en la Tabla 4, el conjugado derivado de oxintomodulina era más estable a un pH de 5,2, y en los resultados de RP-HPLC en la Tabla 5, el conjugado derivado de oxintomodulina era más estable a un pH de 5,6. Aunque la estabilidad al pH difirió entre los procedimientos de análisis, la diferencia en la retención entre los pH era la mayor en el procedimiento de análisis RP-HPLC. Esto sugiere que el conjugado derivado de oxintomodulina era más estable a un pH de 5,6.
Ejemplo 4: Evaluación de la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el tipo de alcohol de azúcar y la presencia o ausencia de agente isotónico
Los presentes inventores probaron las influencias del tipo de alcohol de azúcar como estabilizador y la presencia o ausencia de cloruro de sodio como agente isotónico sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, usando el tampón citrato (pH 5,6) seleccionado en el Ejemplo 3, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenó en las composiciones que se muestran en la Tabla 6 a continuación a 25 °C durante 0-4 semanas y a continuación se analizó por IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. En las Tablas 7, 8 y 9 a continuación, IE-HPLC (%), SE-HPLC (%) y RP-HPLC (%) indican % de área/% de área inicial, que indica el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial. La Tabla 7 muestra el área de IE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento, la Tabla 8 muestra el área de SE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento y la Tabla 9 muestra el área de RP-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento.
Tabla 6
T l 1
Figure imgf000019_0001
Tabla 7
T l 71
Figure imgf000019_0002
Tabla 8
T l 1
Figure imgf000019_0003
Tabla 9
T l 1
Figure imgf000019_0004
Como se puede ver en las Tabla 6 a 9 anteriores, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era más estable en manitol o sorbitol que en glicerol a la misma concentración. Los resultados de RP-HPLC indicaron que el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era un poco estable en manitol que en sorbitol. Además, la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración no difirió significativamente entre la presencia y ausencia de cloruro de sodio como agente isotónico.
Ejemplo 5: Evaluación de la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de alcohol de azúcar
Los presentes inventores probaron la influencia de la concentración de alcohol de azúcar como estabilizador sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, usando el tampón citrato (pH 5,6) y manitol seleccionados en los Ejemplos anteriores, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenó en las composiciones que se muestran en la Tabla 10 a continuación a 25 °C durante 0-4 semanas y a continuación se analizó por IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. En las Tablas 11, 12 y 13 a continuación, IE-HPLC (%), SE-HPLC (%) y RP-HPLC (%) indican % de área/% de área inicial, que indica el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial. La Tabla 11 muestra el área de IE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento, la Tabla 12 muestra el área de SE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento y la Tabla 13 muestra el área de RP-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento.
Tabla 10
T l 11
Figure imgf000020_0001
Tabla 11
T l 111
Figure imgf000020_0002
Tabla 12
T l 121
Figure imgf000020_0003
Tabla 13
T l 11
Figure imgf000020_0004
Como se puede observar en las Tabla 10 a 13, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era estable en presencia de manitol al 5 % o manitol al 10 %. Sin embargo, se formó un precipitado de proteína en presencia de manitol al 2 % o manitol al 15 %. Los resultados de IE-HPLC o SE-HPLC indicaron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era similar entre manitol al 10 % y manitol al 5 %. Los resultados de RP-HPLC indicaron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era más estable en manitol al 10 % que en manitol al 5 %.
Ejemplo 6: Evaluación de la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la concentración de tensoactivo y la presencia o ausencia de aminoácido
Los presentes inventores probaron las influencias de la concentración de un tensioactivo como estabilizador y la presencia o ausencia de un aminoácido sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Usando el tampón citrato (pH 5,6) y tampón citrato y manitol al 10 % seleccionados en los Ejemplos anteriores, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenó en las composiciones que se muestran en la Tabla 14 a continuación a 25 °C durante 0-4 semanas y a continuación se analizó por IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. En las Tablas 15, 16 y 17 a continuación, IE-HPLC (%), SE-HPLC (%) y RP-HPLC (%) indican % de área/% de área inicial, que indica el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial. La Tabla 15 muestra el área de IE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento, la Tabla 16 muestra el área de SE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento y la Tabla 17 muestra el área de RP-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento.
Tabla 14
T l 141
Figure imgf000021_0001
Tabla 15
T l 11
Figure imgf000021_0002
Tabla 16
T l 11
Figure imgf000021_0003
Tabla 17
T l 171
Figure imgf000021_0004
Como puede observarse a partir de los resultados de las Tablas 14 a 17, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era más estable en la composición que contenía polisorbato 20 al 0,02 % y 0,1 mg/ml de metionina.
Ejemplo 7: Evaluación de la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y la concentración de alcohol de azúcar
Los presentes inventores probaron las influencias del pH y la concentración de alcohol de azúcar como estabilizador sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, usando el polisorbato 20 al 0,02 % y 0,1 mg/ml de metionina seleccionados en los Ejemplos anteriores, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenó en las composiciones que se muestran en la Tabla 18 a continuación a 25 °C durante 0-4 semanas, y a continuación se analizó mediante IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. En las Tablas 19, 20 y 21 a continuación, IE-HPLC (%), SE-HPLC (%) y RP-HPLC (%) indican % de área/% de área inicial, que indica el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial. La Tabla 19 muestra el área de IE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento, la Tabla 20 muestra el área de SE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento y la Tabla 21 muestra el área de RP-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento.
Tabla 18
T l 11
Figure imgf000022_0001
Tabla 19
T l 11
Figure imgf000022_0002
Tabla 20
T l 21
Figure imgf000022_0003
Tabla 21
T l 211
Figure imgf000022_0004
continuación
Figure imgf000023_0002
Como puede observarse a partir de los resultados de las Tablas anteriores, los resultados de IE-HPLC indicaron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era mayor en el orden de pH 5,2, pH 5,6 y pH 6,0. Los resultados de RP-HPLC indicaron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era mayor en el orden de pH 6,0, pH 5,6 y pH 5,2. Los resultados de SE-HPLC indicaron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era mayor en el orden de pH 5,2, pH 5,6 y pH 6,0. En otras palabras, los resultados de IE-HPLC, RP-HPLC y SE-HPLC indicaron que el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era estable a pH 5,6.
Entre tanto, los resultados de IE-HPLC y SE-HPLC indicaron que el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración no difirió significativamente entre las concentraciones de manitol a pH 5,6. Sin embargo, en los resultados de RP-HPLC, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era más estable en manitol al 5 % que en manitol al 10 % o 15 % a pH 5,6.
Ejemplo 8: Evaluación de la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con el pH y el tipo de tampón
Los presentes inventores probaron las influencias del pH y el tipo de tampón como estabilizador sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, usando el polisorbato 20 al 0,02 % y 0,1 mg/ml de metionina y manitol al 5 % seleccionados en los Ejemplos anteriores, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenó en las composiciones que se muestran en la Tabla 22 a continuación a 25 °C durante 0-4 semanas, y a continuación se analizó mediante IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC.
En las Tablas 23, 24 y 25 a continuación, IE-HPLC (%), SE-HPLC (%) y RP-HPLC (%) indican % de área/% de área inicial, que indica el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial. La Tabla 23 muestra el área de IE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento, la Tabla 24 muestra el área de SE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento y la Tabla 25 muestra el área de RP-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento.
Tabla 22
T l 22
Figure imgf000023_0001
Tabla 23
T l 2
Figure imgf000023_0003
Tabla 24
[Tabla 24]
Figure imgf000024_0002
Tabla 25
T l 2
Figure imgf000024_0003
Como puede observarse a partir de los resultados de las Tablas 23 a 25, los resultados de SE-HPLC o RP-HPLC indicaron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración no difirió significativamente entre pH 5,6 y pH 5,8. Los resultados de IE-HPLC indicaron que el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era más estable a pH 5,6 que a pH 5,8. Los resultados de SE-HPLC mostraron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración no difirió significativamente entre los tampones al mismo pH. Además, los resultados de IE-HPLC o RP-HPLC indicaron que el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración era más estable en histidina al mismo pH.
Ejemplo 9: Evaluación de las influencias de la presencia o ausencia de conservante y la concentración de conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración
Los presentes inventores probaron las influencias de la presencia o ausencia de un conservante como estabilizador y la concentración del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración sobre la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración. Específicamente, usando tampón de histidina (pH 5,6), polisorbato 20 al 0,02 %, 0,1 mg/ml de metionina y manitol al 5 %, seleccionados en los ejemplos anteriores, el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración se almacenó en las composiciones que se muestran en la Tabla 26 a continuación a 25 °C durante 0-4 semanas y a continuación se analizó por IE-HPLC, SE-HPLC y RP-HPLC. En las Tablas 27, 28 y 29 a continuación, IE-HPLC (%), SE-HPLC (%) y RP-HPLC (%) indican % de área/% de área inicial, que indica el porcentaje de retención del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en relación con el valor inicial. La Tabla 27 muestra el área de IE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento, la Tabla 28 muestra el área de SE-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento y la Tabla 29 muestra el área de RP-HPLC (%) del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración después del almacenamiento.
Tabla 26
T l 2
Figure imgf000024_0001
Tabla 27
T l 271
Figure imgf000025_0001
Tabla 28
T l 21
Figure imgf000025_0002
Tabla 29
T l 21
Figure imgf000025_0003
Como se puede observar en las Tablas 26 a 29, los resultados de IE-HPLC, SE-HPLC o RP-HPLC indicaron que la estabilidad del conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración no cambió incluso en presencia del conservante y no difirió de acuerdo con la concentración del mismo.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD.
<120 > Una formulación líquida de conjugado de proteínas que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina
<130> OPA13128
<150> 10-2012-0124725
<151> 06-11-2012
<160> 49
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> oxintomodulina
<400> 1
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210>2
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 2
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 3
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Ala Trp Leu Lys Asn Thr Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 4
Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210>5
<211> 39
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 5
Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210>6
<211> 42
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 6
Xaa Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Ala Ala His Ser Gln Gly Thr
20 25 30
Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp
35 40
<210>7
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 7
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys
20 25 30
<210>8
<211> 29
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 8
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Lys
20 25
<210> 9
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<220>
<221> VARIANTE
<222> (20)
<223> Xaa = ácido alfa-metilglutámico
<400>9
Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Xaa Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 10
<211> 40
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 10
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
35 40
<210> 11
<211> 43
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 11
Xaa Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Ala Ala His Ser Gln Gly Thr
20 25 30
Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Lys
35 40
<210> 12
<211> 38
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 12
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Gly
1 5 10 15
Gly Gly His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met
20 25 30
Glu Glu Glu Ala Val Lys
35
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<220>
<221> VARIANTE
<222> (16)
<223> Xaa = ácido alfa-metilglutámico
<220>
<221> VARIANTE
<222> (20)
<223> Xaa = ácido alfa-metilglutámico
<400> 13
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Glu Ala Val Xaa Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys
20 25 30
<210> 14
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<220>
<221> VARIANTE
<222> (20)
<223> Xaa = ácido alfa-metilglutámico
<220>
<221> VARIANTE
<222> (24)
<223> Xaa = ácido alfa-metilglutámico
<400> 14
Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Xaa Leu Phe lie Xaa Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 15
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<220>
<221> VARIANTE
<222> (24)
<223> Xaa = ácido alfa-metilglutámico
<400> 15
Xaa Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Xaa Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 16
<211> 34
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 16
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gly Gly His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu
20 25 30
Glu Lys
<210> 17
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 17
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 18
<211> 40
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 18
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
35 40
<210> 19
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 19
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 20
<211> 40
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 20
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe lie Glu Trp lie Arg Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
35 40
<210> 21
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 21
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Leu Glu Glu
Figure imgf000034_0001
Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Val Arg Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = desamino-histidilo
<400> 22
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
Figure imgf000034_0002
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys
20 25 30
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 23
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Cys Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 24
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 25
Figure imgf000035_0001
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 26
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 27
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Cys Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 28
<211> 29
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 28
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 29
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = d-serina.
<400> 29
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 30
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<400> 30
Xaa Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 31
<211> 37
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = d-serina.
<400> 31
Xaa Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn lie Ala
35
<210> 32
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)
<223> Xaa = 4-imidazoacetilo
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 32
Xaa Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 33
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> derivado de oxintomodulina
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)
<223> Xaa = ácido aminoisobutírico
<400> 34
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
Figure imgf000039_0001
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 35
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 35
Lys Arg Asn Arg Asn Asn lie Ala
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 36
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 37
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 38
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 39
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Lys
1 5 10 15
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo R2
<400> 40
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys
20
<210> 41
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 41
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg
1 5 10 15
Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 42
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 42
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 43
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 43
Figure imgf000041_0001
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 44
Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly
20 25
<210> 45
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 45
Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 1 0 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly
20 25
<210> 46
<211> 26
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 46
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Ala Ala
20 25
<210> 47
<211> 28
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo A o B
<400> 47
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Met Asn Gly
2 0 25
<210> 48
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo B
<400> 48
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu
1 5 10 15
Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp
20
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> grupo B
<400> 49

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, que comprende una cantidad farmacológicamente activa de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración en la que el conjugado derivado de oxintomodulina comprende un derivado de oxintomodulina, que es un péptido fisiológicamente activo, que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 24, 25 o 26; una región Fc de inmunoglobulina; y
un polímero no peptidílico, en la que el polímero no peptidílico une covalentemente el derivado de oxintomodulina y la región Fc de inmunoglobulina,
y un estabilizador sin albúmina, en la que el estabilizador contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados de manitol y sorbitol y polisorbato 20.
2. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el estabilizador contiene además uno o más agentes isotónicos, azúcares, alcoholes polihídricos o aminoácidos.
3. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el agente isotónico es cloruro de sodio.
4. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el aminoácido es metionina.
5. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el derivado de oxintomodulina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
6. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los aminoácidos en las posiciones 10 y 14, posiciones 12 y 16, posiciones 16 y 20, posiciones 20 y 24 y posiciones 24 y 28 de la secuencia de aminoácidos se pueden sustituir con ácido glutámico o lisina para formar anillos.
7. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el derivado de oxintomodulina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
8. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el derivado de oxintomodulina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
9. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM.
10. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada dominio de la región Fc de inmunoglobulina es un híbrido de dominios que proceden de diferentes inmunoglobulinas seleccionadas de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM.
11. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la región Fc de inmunoglobulina es un dímero o multímero que consiste en inmunoglobulinas de cadena sencilla compuestas de dominios del mismo origen.
12. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4.
13. La formulación líquida de un conjugado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4 humana aglicosilada.
14. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polímero no peptidílico es polietilenglicol, polipropilenglicol, un copolímero de etilenglicol/propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, un polisacárido, polivinil etil éter, un polímero biodegradable, incluyendo ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA); un polímero lipídico, ácido hialurónico; o una combinación de los mismos.
15. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el polímero no peptidílico es polietilenglicol.
16. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el polisacárido es dextrano, una quitina o una combinación de los mismos.
17. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de manitol o sorbitol en la formulación líquida es 2-15 % (p/v).
18. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el tampón es un tampón citrato, acetato, histidina o fosfato.
19. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de polisorbato 20 en la formulación líquida es 0,001-0,1 % (p/v).
20. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además uno o más conservantes seleccionados de mcresol, fenol o alcohol bencílico.
21. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con la reivindicación 20, en la que la concentración del conservante en la formulación líquida es 0,001-1 % (p/v).
22. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la formulación es para administración de dosis múltiples.
23. La formulación líquida de un conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende; histidina 5-50 mM; 2-15 % (p/v) de manitol; 0,01-1 mg/ml de metionina; y 0,001-0,1 % (p/v) de polisorbato 20.
24. Un procedimiento de preparación de la formulación líquida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) preparar el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y
b) mezclar el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, preparado en la etapa a), con un estabilizador que contiene un tampón que tiene un pH que varía de 4,8 a 6,0, uno o más alcoholes de azúcar seleccionados del grupo que consiste en manitol y sorbitol y polisorbato 20.
25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que la etapa b) comprende mezclar el conjugado derivado de oxintomodulina de larga duración, preparado en la etapa a), con histidina 5-50 mM; 2-15 % (p/v) de manitol; 0,01-1 mg/ml de metionina; y 0,001-0,1 % (p/v) de polisorbato 20.
26. El procedimiento de la reivindicación 24 o 25, en el que la etapa b) comprende además la adición de un conservante.
27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que el estabilizador contiene además uno o más agentes isotónicos, azúcares, alcoholes polihídricos o aminoácidos.
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