HK1210044B - 包括胃泌酸调节素和免疫球蛋白片段的蛋白质缀合物的液体制剂 - Google Patents

Description

包括胃泌酸调节素和免疫球蛋白片段的蛋白质缀合物的液体 制剂

技术领域

本发明涉及包括长期(long-lasting)胃泌酸调节素缀合物的不含白蛋白的液体制剂，其中包括胃泌酸调节素衍生物、变体、前体或片段的胃泌酸调节素肽连接至免疫球蛋白Fc区，其与天然胃泌酸调节素相比可增加长期胃泌酸调节素缀合物的生理活性持续时间和长期保持其体内稳定性。本发明还涉及制备该液体制剂的方法。

背景技术

肥胖被定义为异常或过度脂肪积累的情况，其可损害健康并且源于能量摄入超过能量消耗的能量失衡。肥胖在过去不是严重的健康问题，但随着经济增长，肥胖人群随经济富裕增加而增加，并且各种肥胖相关疾病的数量也逐渐增加。根据世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)的报告，世界上超过15亿成年人超重，其中超过5亿肥胖，并且肥胖人群在1980和2008之间增加约两倍(世界卫生组织，Fact sheet on obesity andoverweight，2011)。不仅在高收入国家，而且在低收入国家中肥胖人群的百分比目前也在增加。超重和肥胖导致血压和胆固醇水平增加，并且引起或恶化各种疾病。另外，肥胖问题在儿童或青少年中更加严重，增加了糖尿病、心脏病、高血压或高脂血的发病率，并且还可导致死亡或残疾。

如上所述，肥胖是全球性疾病和社会问题，但在过去认为肥胖可通过个人努力被克服，因此没有特别重视肥胖治疗。然而，肥胖并不容易治疗，因为其是与食欲控制和能量代谢机制相关的复杂疾病。因此，肥胖的治疗不仅需要患者自身的努力，而且还需要能够治疗与食欲控制和能量代谢相关的异常机制的方法。因此，已尝试研发治疗肥胖的药物。

这样尝试的结果是研发了包括利莫那班(Rimonabant)(Sanofi-Aventis)、西布曲明(Sibutramine)(Abbott)、Contrave(Takeda)、奥利司他(Orlistat)(Roche)及类似物的药物，但这些药物具有缺点，即其显示胎儿副作用或具有不足的肥胖治疗效果。据报告，利莫那班(Sanofi-Aventis)显示中枢神经系统障碍，西布曲明(Abbott)和Contrave(Takeda)显示心血管副作用，而奥利司他(Roche)显示给予1年时仅约4kg的减重效果。因此，当前很少或没有肥胖治疗剂可安全地被开处方给肥胖患者。

近来，胰高血糖素衍生物已得到众多关注。当血糖水平由于药物治疗、疾病、激素或酶缺陷、或类似原因开始下降时，胰腺产生胰高血糖素。胰高血糖素作用以刺激肝细胞将储存的糖原分解成葡萄糖，然后释放到血液中，以使血糖水平升高至正常水平。除增加血糖水平的效果外，胰高血糖素据报告还抑制食欲和激活脂肪细胞的激素敏感性脂酶(HSL)以促进脂解，从而显示抗肥胖效果。在胰高血糖素衍生物中，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)正在作为降低糖尿病患者的高血糖的治疗剂被研发，并且作用于刺激胰岛素合成和分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、增加葡萄糖利用度和抑制食物摄入。已知从蜥蜴的毒液分离的艾塞那肽-4(exendin-4)与GLP-1具有约50％的氨基酸同源性，并且激活GLP-1受体以降低糖尿病患者的高血糖。然而，肥胖治疗性药物，包括GLP-1，据报告会引起副作用，如呕吐和恶心。

因此，作为GLP-1的替代品，能够与两种肽(GLP-1和胰高血糖素)的受体结合的胃泌酸调节素正在受到关注。胃泌酸调节素是由前胰高血糖素(胰高血糖素的前体)制成的肽，并且是有效的抗肥胖剂，因为其抑制食物摄入，如同GLP-1，促进饱腹感，并且显示脂解活性，如同胰高血糖素。

基于胃泌酸调节素肽的双重功能，关于肥胖治疗药物研发的研究已积极进行。例如，韩国专利登记号925017公开了用于治疗人肥胖的口服、胃肠外、粘膜、直肠、皮下或透皮药物组合物，其包括胃泌酸调节素作为活性成分。然而，据报告，包括胃泌酸调节素的肥胖治疗剂具有短的体内半衰期，并且显示低的肥胖治疗效果，即使在一日三次以高剂量给予这些治疗剂时。因此，已尝试通过修饰胃泌酸调节素增加胃泌酸调节素的体内半衰期或肥胖治疗效果。

例如，双重激动剂胃泌酸调节素(Merck)通过如下获得：用D-丝氨酸置换胃泌酸调节素的氨基酸2位处的L-丝氨酸以增加二肽基肽酶-IV(DPP-IV)耐受性，和附接胆固醇部分至C端以增加血液半衰期。ZP2929(Zealand)通过如下获得：用D-丝氨酸置换胃泌酸调节素的氨基酸2位处的L-丝氨酸以增加DPP-IV耐受性，用丙氨酸置换氨基酸17位处的精氨酸以增加蛋白酶耐受性，用赖氨酸置换氨基酸27位处的甲硫氨酸以增加氧化稳定性，和分别用天冬氨酸、丙氨酸和丝氨酸置换氨基酸20和24位处的谷氨酰胺以及氨基酸28位处的天冬酰胺，以增加脱酰胺稳定性。双重激动剂胃泌酸调节素(Merck)具有1.7小时的增加的体内半衰期，长于天然胃泌酸调节素的半衰期(8-12分钟)，但其仍具有很短的体内半衰期，并且以数mg/kg的极高剂量被给予。因此，胃泌酸调节素或其衍生物具有两个大劣势，即，半衰期短和医疗效果低。由于这些劣势，其应每日以高剂量给予。为克服这些劣势，研究增加胃泌酸调节素的血液半衰期同时保持其体内活性的方法，从而研发胃泌酸调节素衍生物。另外，利用这种技术，通过结合载体至胃泌酸调节素衍生物制备非肽基聚合物，并且发现蛋白质缀合物由于增加了其血液半衰期同时保持体内活性可显示较好抗肥胖效果(韩国专利申请号10-2012-0064110)。

通常，蛋白质和肽具有很短的半衰期，并且在暴露于各种因素如不适的温度、水-空气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂和微生物污染后由于单体聚集和血管表面吸附发生变性如沉淀。这种变性是不可逆的，因此变性的蛋白质和肽丧失了内在的物理化学性质和生理活性效果。另外，蛋白质和肽是不稳定的，并且易受外在因素如温度、湿度、氧、UV射线或类似物影响，从而发生物理或化学变化，包括联合、聚合或氧化，导致活性显著损失(韩国专利登记号10-0389726)。

此外，被吸附的蛋白质和肽容易通过变性过程而聚集，并且变性的蛋白质和肽在被给予人体时充当人体中抗体形成的诱因，因此，应给予足够稳定形式的蛋白质和肽。因此，已研究了防止溶液中的蛋白质和肽变性的不同方法(John Geigert,J.ParenteralSci.Tech.,43,No5,220-224,1989；David Wong,Pharm.Tech.October,34-48,1997；WeiWang.,Int.J.Pharm.,185,129-188,1999；Willem Norde,Adv.Colloid Interface Sci.,25,267-340,1986；Michelle et al.,Int.J.Pharm.120,179-188,1995)。

低压冻干被应用于一些蛋白质和肽药物以实现稳定性目的。然而，低压冻干的产物的不便在于其必须被重新溶解在注射水中以使用。另外，在低压冻干的情况下，需要对大容量冷冻干燥机或类似物大量投资，因为低压冻干过程被包括在生产过程中。进一步，利用喷雾干燥器生产粉末状蛋白质和肽的方法也在被应用，但在这种情况下，经济效益由于低产率而减少，并且高温暴露可不利地影响蛋白质的稳定性。

为克服这些限制，已进行这样的研究：其中稳定剂被添加至溶液中的蛋白质和肽，以抑制蛋白质和肽的物理化学变化，同时保持其体内效率——即使在长期储存后。人血清白蛋白，一种蛋白质，已被广泛用作各种蛋白质药物的稳定剂，并且其性能已被证实(Edward Tarelli等，Biologicals(1998)26，331-346)。

纯化人血清白蛋白的方法包括灭活生物污染物如支原体、朊病毒、细菌和病毒，和筛选或检查一种或多种生物污染物或病原体。然而，始终存在患者暴露于未完全去除或灭活的生物污染物的风险。例如，筛选过程包括检查来自供体的人血液是否包含某种病毒，但这个过程不一定是可靠的。具体地，不能检测到在极少数供体中存在的特定病毒。

不同蛋白质由于其化学差异可在储存过程中在不同条件下以不同速率被逐步灭活。也就是说，通过稳定剂对储存期的延长对于不同蛋白质而言不是相同的。因此，用于提供储存稳定性的稳定剂的适当比例、浓度和种类根据目标蛋白质的物理化学性质而不同。当稳定剂组合使用时，由于其之间的竞争和相互作用，其可导致不同于期望效果的不利效果。进一步，由于蛋白质的属性或浓度可在储存期间发生变化，所用的稳定剂可显示不同于意图的效果。因此，需要大量努力和措施来稳定溶液中的蛋白质。

具体地，胃泌酸调节素和免疫球蛋白Fc的缀合物是其中作为生理活性肽的胃泌酸调节素连接于免疫球蛋白Fc区的缀合物。因此，由于缀合物的分子重量和体积肯定不同于天然胃泌酸调节素，需要稳定化蛋白质的特殊组合物。

进一步，由于胃泌酸调节素(其是生理活性肽)和免疫球蛋白Fc区是具有不同物理化学性质的肽或蛋白质，其应被同时稳定化。然而，如上所述，不同蛋白质或蛋白质由于其化学差异可在储存期间在不同条件下以不同速率被逐步灭活，并且在适于蛋白质或肽的稳定剂组合使用时，由于其之间的竞争和相互作用，其可导致不同于期望效果的不利效果。因此，在长期胃泌酸调节素缀合物的情况下，找到同时稳定化作为生理活性肽的胃泌酸调节素和免疫球蛋白Fc区的的组合物有很大的困难。

在这种情况下，本发明人做出了大量努力以提供可长期储存而不担心病毒污染的稳定液体制剂，从而发现了稳定剂，该稳定剂包括缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，并且可进一步包括添加剂如等渗剂或氨基酸和防腐剂以反复使用，可增加长期胃泌酸调节素衍生物的稳定性，并且可利用该稳定剂制备成本有效且稳定的液体制剂，从而完成本发明。

公开内容

技术问题

本发明的一个目的是提供长期胃泌酸调节素缀合物的液体制剂，包括药理学上有效量的长期胃泌酸调节素缀合物，其中作为生理活性肽的胃泌酸调节素连接至免疫球蛋白Fc区；和不含白蛋白的稳定剂。

本发明的另一目的是提供制备上述液体制剂的方法。

本发明的再一目的是提供预防或治疗肥胖或糖尿病的组合物，其包括液体胃泌酸调节素缀合物制剂，该液体胃泌酸调节素缀合物制剂包括连接至免疫球蛋白Fc区的生理活性肽胃泌酸调节素。

本发明的再一目的是提供预防或治疗肥胖或糖尿病的方法，包括给予对象上述液体制剂。

问题解决方案

为实现以上目的，一方面，本发明提供长期胃泌酸调节素缀合物的液体制剂，包括药理学上有效量的长期胃泌酸调节素缀合物，其中作为生理活性肽的胃泌酸调节素连接至免疫球蛋白Fc区；和不含白蛋白的稳定剂，其中稳定剂包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂。

如本文所用，术语“液体制剂”指加工成液体形式的药物制剂，并且意图包括所有液体内用制剂和外用制剂。现有技术没有报道适于药理学上有效量的包括连接至免疫球蛋白Fc结构域的胃泌酸调节素的胃泌酸调节素缀合物的本发明液体制剂。因此，本发明的液体制剂可包括药理学上有效量的胃泌酸调节素缀合物——该胃泌酸调节素缀合物包括连接至免疫球蛋白Fc结构域的胃泌酸调节素——和不含白蛋白的稳定剂，其中稳定剂包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂。另外，本发明的液体制剂可进一步包括防腐剂。

在本发明中，稳定剂可进一步包括一种或多种组分，选自等渗剂、糖、多元醇和氨基酸。糖醇可以是选自甘露醇、山梨醇和甘油的一种或多种，并且液体制剂中的糖醇浓度可以为2-15％(w/v)。进一步，缓冲剂可以是选自柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲剂的一种或多种，并且可具有4.5至7.0的pH范围。等渗剂可以是氯化钠，非离子型表面活性剂可以是聚山梨醇酯或泊洛沙姆，并且可以0.001-0.1％(w/v)的浓度存在。氨基酸可以是甲硫氨酸。因此，本发明的液体制剂可包括稳定剂，该稳定剂包含pH范围为4.8至6.0的缓冲剂、选自甘露醇和山梨醇的一种或多种糖醇和聚山梨醇酯20。

另外，本发明的液体制剂可进一步包括选自间甲酚、苯酚和苄醇的一种或多种防腐剂。液体制剂中的防腐剂浓度可以为0.001-1％(w/v)。

具体地，本发明的液体制剂可包括药理学上有效量的长期胃泌酸调节素缀合物、5-50mM组氨酸、2-15％(w/v)甘露醇、0.01-1mg/mL甲硫氨酸和0.001-0.1％(w/v)聚山梨醇酯20。除这些组分外，液体制剂还可进一步包括0.001-1％(w/v)间甲酚。

如本文所用，术语“稳定剂”指使成分如活性成分保持稳定一定时间段的物质。基于本发明的目的，该术语指能够使长期胃泌酸调节素缀合物稳定储存的物质。蛋白质如长期胃泌酸调节素缀合物的储存稳定性，不仅对于保证精确剂量，而且对于抑制胃泌酸调节素衍生物缀合物的抗原物质的可能性生成，都是非常重要的。

本发明中的稳定剂优选包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，从而赋予长期胃泌酸调节素缀合物稳定性。另外，稳定剂可优选进一步包括选自等渗剂、糖、多元醇和氨基酸的一种或多种组分。

缓冲剂起作用以保持液体制剂的pH，使得液体制剂的pH不发生快速变化，从而使长期胃泌酸调节素缀合物稳定。缓冲剂的实例可包括药学上可接受的pH缓冲剂，包括碱性盐(磷酸钠、磷酸钾、或其一氢或二氢盐)、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸钠、乙酸和组氨酸，或者也可使用这些缓冲剂的混合物。缓冲剂优选是柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂，更优选组氨酸缓冲剂。缓冲剂的浓度优选为5-100mM，更优选5-50mM。缓冲剂的pH优选为4.0-8.0，更优选4.5-7.0，还更优选5.0-6.0。

在本发明的一个实施例中，测量了长期胃泌酸调节素缀合物根据液体制剂的缓冲剂pH的稳定性。即，在25℃下储存长期胃泌酸调节素缀合物0-4周同时改变缓冲剂的pH后，分析缀合物的余量，由此显示，胃泌酸调节素缀合物在pH 5.6、pH 5.8和pH 6.0下更稳定(实施例3、表2至5、实施例7、表18至21、实施例8和表22至25)。因此，发现本发明中最稳定缓冲剂的pH范围为5.0至6.0。在本发明的一个实施例中，测量长期胃泌酸调节素缀合物根据液体制剂的缓冲剂种类的稳定性。具体地，在将胃泌酸调节素缀合物与0.02％聚山梨醇酯20、0.1mg/mL甲硫氨酸和5％甘露醇在25℃下储存0-4周后，分析缀合物的余量。SE-HPLC分析结果表明，缀合物的余量在相同pH的缓冲剂之间无显著差异。IE-HPLC或RP-HPLC分析结果表明，组氨酸在相同pH下最稳定(实施例8和表22至25)。

糖醇起作用以增加长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性。在本发明中，糖醇可以是选自甘露醇、山梨醇和甘油的一种或多种。优选地，糖醇可以是甘露醇。液体制剂中的糖醇浓度优选为1-20％(w/v)，更优选2-15％(w/v)。

在本发明的一个实施例中，分析了作为稳定剂的糖醇的种类对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，将胃泌酸调节素缀合物在25℃下在柠檬酸盐缓冲剂(pH5.6)中储存的0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC进行分析。结果是，缀合物在存在甘露醇或山梨醇的情况下比相同浓度的甘油存在的情况下更稳定。RP-HPLC分析结果表明，缀合物在在存在甘露醇的情况下与存在山梨醇相比更稳定一点(实施例4和表6至9)。换句话说，证明甘露醇或山梨醇的添加显示良好的稳定性，但缀合物在存在甘露醇的情况下最稳定。

在本发明的一个实施例中，分析了作为稳定剂的糖醇的浓度对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，将胃泌酸调节素缀合物在25℃下储存0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC进行分析。结果是，在存在2％甘露醇或15％甘露醇的情况下、生成蛋白质沉淀，而在存在5％甘露醇或10％甘露醇的情况下，缀合物稳定(实施例5、表10至13、实施例7和表18至21)。

非离子型表面活性剂起作用以降低蛋白质溶液的表面张力，以防止蛋白质吸附到疏水表面上或聚集。可用于本发明的非离子型表面活性剂的优选实例包括聚山梨醇酯系非离子型表面活性剂和泊洛沙姆系非离子型表面活性剂，其可单独使用或两种或更多种组合使用。液体制剂中不适宜使用高浓度的非离子型表面活性剂。本发明的液体制剂包含0.2％(w/v)或更少浓度的非离子型表面活性剂，优选0.001-0.1％(w/v)。

本发明的稳定剂可包含氨基酸，如甲硫氨酸。甲硫氨酸通过抑制杂质生成起作用以额外稳定化蛋白质，该杂质例如由蛋白质的氧化反应导致。

在本发明的一个实施例中，测试了作为稳定剂的非离子型表面活性剂的浓度和氨基酸存在与否对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，将胃泌酸调节素缀合物在25℃下储存在柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.6)和10％甘露醇中0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC进行分析。结果是，胃泌酸调节素缀合物在存在0.02％聚山梨醇酯20和0.1mg/mL甲硫氨酸的情况下最稳定(实施例6和表14至17)。

等渗剂在体内以溶液给予长期胃泌酸调节素缀合物时起作用以使渗透压保持在适当的水平，并且可另外起作用以进一步稳定化溶液中的长期胃泌酸调节素缀合物。等渗剂的典型实例包括水溶性无机盐，如氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠及类似物。等渗剂的浓度优选为0-200mM，并且其含量可被适当地控制。

本发明稳定剂优选不包含白蛋白。可用作蛋白质稳定剂的人血清白蛋白由人血液制成，因此可被人病原体病毒污染，并且明胶或牛血清白蛋白在一些患者内可引起疾病或可引起过敏反应。本发明的不含白蛋白的稳定剂不包含外源蛋白质如人或动物血清白蛋白或纯化的明胶，因此不易受病毒感染。

在可另外被使用以增加储存长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的糖和多元醇中糖的优选实例包括单糖如甘露糖、葡萄糖、岩藻糖和木糖，和多糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖和葡聚糖，多元醇的优选实例包括聚丙烯、低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量聚丙二醇及类似物。这些糖和多元醇可单独使用或两种或更多种组合使用。

除上述缓冲剂、等渗剂、糖醇、氨基酸和非离子型表面活性剂外，本发明的液体制剂还可进一步包括不损害本发明的效果范围内的本领域已知的其他组分或物质。

本发明的长期胃泌酸调节素缀合物的液体制剂包括药理学上有效量的长期胃泌酸调节素缀合物——该长期胃泌酸调节素缀合物包括连接至免疫球蛋白Fc区的生理活性肽胃泌酸调节素——和不含白蛋白的稳定剂，其中稳定剂可包含pH范围为4.8至7.0的缓冲剂、选自甘露醇和山梨醇的一种或多种糖醇、和聚山梨醇酯20。更具体地，稳定剂可包含pH范围为5.0至6.0的缓冲剂、甘露醇和聚山梨醇酯20。另外，稳定剂可进一步包括选自等渗剂、糖、多元醇和氨基酸的一种或多种组分。

本发明的不含白蛋白、包含高浓度的长期胃泌酸调节素缀合物、赋予长期胃泌酸调节素缀合物稳定性的液体制剂不易受病毒感染，简单，并且显示良好的储存稳定性，因此与其他稳定剂或低压冻干制剂相比可以经济的方式被提供。

另外，由于本发明的液体制剂包括与天然胃泌酸调节素相比长期具有生理活性的长期胃泌酸调节素缀合物，其与常规胃泌酸调节素制剂相比可在人体内长期保持蛋白质活性，因此可用作有效的药物制剂。另外，本发明的液体制剂甚至对高浓度的长期胃泌酸调节素缀合物也赋予良好的稳定性。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素”指由作为胰高血糖素前体的前胰高血糖素产生的肽。在本发明中，胃泌酸调节素意为包括天然胃泌酸调节素及其前体、衍生物、片段和变体。优选地，胃泌酸调节素具有SEQ ID NO：1(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)的氨基酸序列。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素衍生物”意为包括通过胃泌酸调节素的氨基酸序列中氨基酸的添加、缺失或置换获得并且激活胰高血糖素和GLP-1受体的水平可高于天然胃泌酸调节素激活的水平的肽、肽衍生物或肽模拟物。在本发明中，胃泌酸调节素衍生物可具有SEQ ID NOS：2至34中的任一种氨基酸序列。优选地，胃泌酸调节素衍生物可具有SEQID NO：23或25的氨基酸序列。更优选地，其可具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素片段”指在天然胃泌酸调节素的氨基或羧基端具有一个或多个氨基酸的片段，其中添加的氨基酸也可以是非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)。这种胃泌酸调节素片段具有调控体内血糖水平的功能。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素变体”是具有不同于天然胃泌酸调节素的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基并且具有激活GLP-1和胰高血糖素受体的功能的肽。胃泌酸调节素变体可通过天然胃泌酸调节素氨基酸序列中的一些氨基酸的置换、添加、缺失、修饰、或其组合中的任一种来制备。

制备胃泌酸调节素变体、衍生物和片段的方法可单独或组合应用。例如，本发明还包括这样的肽：具有一个或多个不同于天然胃泌酸调节素的氨基酸和N端氨基酸残基的脱氨基，并且具有激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的功能。

本文述及的氨基酸根据IUPAC-IUB的命名规则简写如下：

丙氨酸A； 精氨酸R；

天冬酰胺N； 天冬氨酸D；

半胱氨酸C； 谷氨酸E；

谷氨酰胺Q； 甘氨酸G；

组氨酸H； 异亮氨酸I；

亮氨酸L； 赖氨酸K；

甲硫氨酸M； 苯丙氨酸F

脯氨酸P； 丝氨酸S；

苏氨酸T； 色氨酸W；

酪氨酸Y； 缬氨酸V。

在本发明中，胃泌酸调节素衍生物包括任何通过SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的氨基酸置换、添加、缺失或翻译后修饰(例如，甲基化、酰基化、泛素化、或分子内共价结合)制备并且可激活胰高血糖素和GLP-1受体的肽。关于氨基酸的置换或添加，不仅可使用在人蛋白质中常见的20种氨基酸，而且可使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.和Genzyme Pharmaceuticals。包括这些氨基酸和非典型肽序列的肽可被合成和购自商品供应商，例如，American Peptide Company或Bachem(USA)或Anygen(韩国)。

在本发明的具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素衍生物是新型的肽，其包括下式1的氨基酸序列：

式1

R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2

其中

R1是组氨酸、去氨基-组氨酰基、二甲基-组氨酰基(N-二甲基-组氨酰基)、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、β-羧基咪唑并丙酰基或酪氨酸；

X1是Aib(氨基异丁酸)、d-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、丝氨酸或d-丝氨酸；

X2是谷氨酸或谷氨酰胺；

X3是亮氨酸或酪氨酸；

X4是丝氨酸或丙氨酸；

X5是赖氨酸或精氨酸；

X6是谷氨酰胺或酪氨酸；

X7是亮氨酸或甲硫氨酸；

X8是天冬氨酸或谷氨酸；

X9是谷氨酸、丝氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失缺失；

X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或丝氨酸或缺失；

X11是丙氨酸、精氨酸或缬氨酸或缺失；

X12是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸或缬氨酸或缺失；

X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X14是天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸或缺失；

X15是苯丙氨酸或缺失；

X16是异亮氨酸或缬氨酸或缺失；

X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X18是色氨酸或缺失；

X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸或缬氨酸或缺失；

X20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺或精氨酸或缺失；

X21是天冬酰胺或缺失；

X22是丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸或缺失；

X23是半胱氨酸或赖氨酸或缺失；

X24是具有2至10个由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成的氨基酸的肽，或缺失；和

R2是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)、GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)或缺失(除了式1的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同的情况)。

为增加野生型胃泌酸调节素对于胰高血糖素受体和GLP-1受体的活性，可用4-咪唑并乙酰基(通过使SEQ ID NO：1的氨基酸序列的1位的组氨酸的α碳缺失获得)、去氨基-组氨酰基(通过缺失N端氨基获得)、二甲基-组氨酰基(N-二甲基-组氨酰基)(通过用两个甲基修饰N端氨基获得)、β-羟基咪唑并丙酰基(用羟基置换N端氨基获得)、或β-羧基咪唑并丙酰基(用羧基置换N端氨基获得)置换本发明的胃泌酸调节素衍生物。另外，可用增强疏水键和离子键或其组合的氨基酸置换GLP-1受体结合区。进一步，部分胃泌酸调节素序列可用GLP-1或艾塞那肽-4的氨基酸序列置换，以增加GLP-1受体的活性。

此外，部分胃泌酸调节素序列可用增强α螺旋的序列置换。优选地，式1的氨基酸序列的第10、14、16、20、24和28位氨基酸可用包括下列的已知稳定α螺旋的氨基酸或氨基酸衍生物置换：Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO₂)、Phe(4-NH₂)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)和Ala(苯并噻吩基)，并且待插入的α螺旋稳定化氨基酸或氨基酸衍生物的类型和数量不限。优选地，氨基酸序列的第10和14、12和16、16和20、20和24、以及24和28位氨基酸也可用谷氨酸或赖氨酸置换以形成环，并且待插入的环数量不限。最优选地，胃泌酸调节素衍生物可具有选自下式2至6的氨基酸序列。

在具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素衍生物是新型的肽，其包括通过用艾塞那肽或GLP-1的氨基酸序列置换胃泌酸调节素的氨基酸序列获得的下式2的氨基酸序列：

式2

R1-A-R3

在另一具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素衍生物是新型的肽，其包括通过经由适当的氨基酸连接体连接胃泌酸调节素的部分氨基酸序列的和艾塞那肽或GLP-1的部分氨基酸序列制备的下式3的氨基酸序列：

式3

R1-B-C-R4

在再一具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素衍生物是新型的肽，其包括其中胃泌酸调节素的部分氨基酸序列被增强与GLP-1受体的疏水结合的氨基酸置换的下式4的氨基酸序列。例如，其是其中第26位的Leu被增加疏水性的氨基酸Ile或Val置换的肽。

式4

R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3

在再一具体实施方式中，本发明的胃泌酸调节素衍生物是新型的肽，其包括其中天然胃泌酸调节素的部分氨基酸序列被缺失、添加、或被其他氨基酸置换以增加天然胃泌酸调节素激活GLP-1受体和胰高血糖素受体的能力的下式5的氨基酸序列：

式5

R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5

在式2至5中，R1如在式1中所述；

A选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO：42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQID NO：43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ IDNO：46)、和SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO：47)；

B选自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：41)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQ ID NO：42)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQID NO：43)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：44)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQ ID NO：45)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQ IDNO：46)、SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQ ID NO：47)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(SEQ ID NO：48)、和SQGTFTSDYSRYLD(SEQ ID NO：49)；

C是具有2至10个由丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的组合组成的氨基酸的肽；

D1是丝氨酸、谷氨酸或精氨酸；

D2是精氨酸、谷氨酸或丝氨酸；

D3是精氨酸、丙氨酸或缬氨酸；

D4是精氨酸、缬氨酸或丝氨酸；

D5是谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸；

D6是异亮氨酸、缬氨酸或丝氨酸；

D7是甲硫氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；

D8是苏氨酸、甘氨酸或丙氨酸；

E1是丝氨酸、Aib、Sar、d-丙氨酸或d-丝氨酸；

E2是丝氨酸或谷氨酸；

E3是精氨酸或赖氨酸；

E4是谷氨酰胺或赖氨酸；

E5是天冬氨酸或谷氨酸；

E6是谷氨酰胺、半胱氨酸或赖氨酸；

E7是半胱氨酸或赖氨酸或缺失；

R3是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)或GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)；

R4是HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)；和

R5是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)或GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)或缺失(除了式2至5的氨基酸序列与SEQ IDNO：1相同的情况)。

优选地，本发明的胃泌酸调节素衍生物可以是下式6的新型肽：

式6

R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2

其中R1是组氨酸、去氨基-组氨酰基、4-咪唑并乙酰基或酪氨酸；

X1是Aib(氨基异丁酸)、甘氨酸或丝氨酸；

X2是谷氨酸或谷氨酰胺；

X3是亮氨酸或酪氨酸；

X4是丝氨酸或丙氨酸；

X5是赖氨酸或精氨酸；

X6是谷氨酰胺或酪氨酸；

X7是亮氨酸或甲硫氨酸；

X8是天冬氨酸或谷氨酸；

X9是谷氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X10是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸或缺失；

X11是丙氨酸或精氨酸或缺失；

X12是丙氨酸或缬氨酸或缺失；

X13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X14是天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸或缺失；

X15是苯丙氨酸或缺失；

X16是异亮氨酸或缬氨酸或缺失；

X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或α-甲基-谷氨酸或缺失；

X18是色氨酸或缺失；

X19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸或缺失；

X20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸或精氨酸或缺失；

X21是天冬酰胺或缺失；

X22是苏氨酸或缺失；

X23是半胱氨酸、赖氨酸或缺失；

X24是具有2至10个由甘氨酸组成的氨基酸的肽或缺失；和

R2是KRNRNNIA(SEQ ID NO：35)、GPSSGAPPPS(SEQ ID NO：36)、GPSSGAPPPSK(SEQID NO：37)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQ ID NO：38)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQ ID NO：39)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQ ID NO：40)或缺失(除了式6的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同的情况)。

更优选地，本发明的胃泌酸调节素衍生物可选自SEQ ID NOs：2至34的肽。还更优选地，本发明的胃泌酸调节素衍生物可以是实施例1的表1描述的胃泌酸调节素衍生物。

胃泌酸调节素具有两种肽——GLP-1和胰高血糖素——的活性。GLP-1具有通过胰岛素分泌降低血糖水平的效果，但胰高血糖素具有增加血糖水平的效果。进一步，GLP-1抑制食物摄入和抑制胃排空，而胰高血糖素具有通过促进脂解和增加能量代谢减轻体重的效果。因此，GLP-1和胰高血糖素具有不同生物学效果。因此，在两种肽以缀合物存在的情况下，如果这两种肽中任一者的效果大于另一者，则可产生不利效果。例如，如果胰高血糖素的效果大于GLP-1，则血糖水平可升高，并且如果GLP-1的效果大于胰高血糖素，则可产生副作用如恶心和呕吐。另外，两种肽的效果可根据两种肽活性的比例而不同。因此，胃泌酸调节素衍生物和其缀合物不仅限于具有增加的活性的衍生物。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素缀合物”指缀合物包括胃泌酸调节素和另一成员。该另一成员可以是具有有益功能的任何物质，该有益功能包括增加胃泌酸调节素的血液半衰期或延迟胃泌酸调节素进入肾脏的释放。本发明的缀合物可共价结合于胃泌酸调节素或形成微球，以增加胃泌酸调节素的血清稳定性或延迟胃泌酸调节素进入肾脏的释放或改变胃泌酸调节素与其受体的结合活性。可形成包括胃泌酸调节素的缀合物的载体可选自白蛋白、转铁蛋白、抗体、抗体片段、弹性蛋白、肝素、多糖如几丁质、纤连蛋白、及可结合于胃泌酸调节素以增加胃泌酸调节素的血清稳定性的类似物。优选地，载体是免疫球蛋白Fc区。

可用于本发明的免疫球蛋白Fc可以是人免疫球蛋白Fc、具有其类似物的序列的免疫球蛋白Fc、或源自动物(包括牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠)的免疫球蛋白Fc。进一步，免疫球蛋白Fc区可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其组合或杂合。进一步，本发明中的免疫球蛋白Fc区的各结构域可以是源自选自IgG、IgA、IgD、IgE、和IgM的不同免疫球蛋白的结构域的杂合。可选地，免疫球蛋白Fc区是由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体，该单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。优选地，免疫球蛋白Fc区是衍生自人血液中最丰富的IgG或IgM的免疫球蛋白Fc区。最优选地，其是衍生自已知增加配体结合蛋白质的半衰期的IgG的免疫球蛋白Fc。免疫球蛋白Fc可通过用具体蛋白酶处理天然IgG来制备，或由利用重组技术的转化细胞来制备。优选地，其是在大肠杆菌(E.coli)中制备的重组人免疫球蛋白Fc。

同时，IgG还可被细分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且在本发明中，这些子类的组合或杂合也是可以的。优选地，IgG是IgG2和IgG4子类，最优选地，其是基本上不具有效应功能如补体依赖性细胞毒性(CDC)的IgG4的Fc区。换句话说，在本发明中用作药物载体的最优选免疫球蛋白Fc区是衍生自人IgG4的非糖基化Fc区。人衍生的Fc区比非人衍生的Fc区更优选，非人衍生的Fc区可在人体内充当抗原并引起不期望的免疫应答，如针对该抗原生成新的抗体。

在本发明中，可通过利用非肽基聚合物或通过基因重组技术制备胃泌酸调节素缀合物。优选地，可通过经由非肽基聚合物将胃泌酸调节素连接至免疫球蛋白Fc区来制备缀合物。

非肽基聚合物可连接至胃泌酸调节素和免疫球蛋白Fc中的每一个。非肽基聚合物的各个端可分别连接至免疫球蛋白Fc区和胃泌酸调节素衍生物的氨基或巯基。

如本文所用，术语“胃泌酸调节素缀合物”指与天然胃泌酸调节素相比具有增加长期效果的胃泌酸调节素缀合物。长期缀合物的实例包括但不限于，其中由天然胃泌酸调节素的氨基酸序列中的氨基酸修饰、置换、添加或缺失产生的胃泌酸调节素衍生物连接至可生物降解的聚合物如聚乙二醇(PEG)的缀合物、其中具有良好长期性的蛋白质如白蛋白或免疫球蛋白连接至胃泌酸调节素的缀合物、其中具有在体内结合于白蛋白的能力的脂肪酸连接至胃泌酸调节素的缀合物、或其中胃泌酸调节素封装在可生物降解的纳米颗粒中的缀合物。

如本文所用，术语“非肽基聚合物”指包括通过任意共价键(代替肽键)相互连接的两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物。在本发明中，非肽基聚合物可与非肽基连接体互换地使用。

用于通过常规框内融合方法获得的融合蛋白的肽连接体具有缺点：其容易被体内蛋白酶酶切，因此无法获得通过载体增加活性药物血清半衰期的期望效果。然而，在本发明中，类似于载体，可利用具有蛋白酶耐受性的聚合物来保持肽的血清半衰期。因此，任何非肽基聚合物可无限制地用于本发明，只要其是具有上述功能的聚合物，即，具有体内蛋白酶耐受性的聚合物。非肽基聚合物具有如下范围内的分子量：1至100kDa，优选1至20kDa。本发明的连接至免疫球蛋白Fc区的非肽基聚合物可一种聚合物或不同聚合物的组合。

用于本发明的非肽基聚合物可具有能够结合于免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物的反应基团。处于非肽基聚合物两端的反应基团优选选自反应性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。

琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺丙酸基、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧基甲基、或琥珀酰亚胺基碳酸基。具体地，当非肽基聚合物其两端具有反应性醛基时，非具体反应可被最小化，并且生理活性多肽和免疫球蛋白可分别有效结合于非肽基聚合物两端。通过利用醛键的还原性烷基化生成的最终产物远比通过酰胺键连接的更稳定的。醛反应基团在低pH下选择性地结合于N端，并可在高pH如pH 9.0下与赖氨酸残基形成共价键。

非肽基聚合物两端的反应基团可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具有马来酰亚胺基，并且另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。当两端具有反应性羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，可通过已知的化学反应将羟基激活成多种反应基团，或可利用具有市售的修饰过的反应基团的聚乙二醇制备本发明的长效缀合物。

本发明的缀合物可以是其中非肽基聚合物的各端分别连接至免疫球蛋白Fc区和胃泌酸调节素衍生物的胺基或巯基的缀合物。

同时，在本发明中，非肽基聚合物的两端包括免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物可结合的反应基团。反应基团的实例包括但不限于，醛基、丙醛基或丁醛基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺衍生物(琥珀酰亚胺丙酸基、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧基甲基或琥珀酰亚胺基碳酸基)及类似物。

处于作为非肽基聚合物的连接体的两端的反应基团可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具有马来酰亚胺基，并且在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。例如，当非肽基聚合物在一端具有反应性醛基并且在另一端具有反应性马来酰亚胺基时，非具体反应可被最小化，并且生理活性多肽和免疫球蛋白可有效结合于非肽基聚合物的两端。可用于本发明的非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。优选地，非肽基聚合物是聚乙二醇。另外，本领域已知的其衍生物和可容易通过本领域已知的方法制备的衍生物被包括在本发明的范围内。

在本发明的一个实施例中，利用包括丙醛基一者或马来酰亚胺基和醛基两者的非肽基聚合物PEG，通过将胃泌酸调节素或其衍生物经由共价键连接至免疫球蛋白Fc区，合成缀合物。

本发明的缀合物与天然胃泌酸调节素相比具有良好的GLP-1受体和胰高血糖素受体活性。而且，其上结合了Fc区，该Fc区增加其体内血液半衰期以长期保持其体内活性。

如本文所用，术语“防腐剂”指用于防止由微生物污染引起异常反应或分解的物质。本发明的液体制剂可进一步包括防腐剂。防腐剂通常用于最有可能被微生物污染的多剂量制剂，但并不限于此，并且也可用于低压冻干的制剂或单剂量制剂以预防微生物污染。本发明的液体制剂可包括选自间甲酚、苯酚和苄醇的一种或多种防腐剂。液体制剂中的防腐剂浓度可以为0.001-1％(w/v)。具体地，本发明的液体制剂包括的防腐剂优选是间甲酚。本发明的液体制剂可以是多剂量制剂。

另一方面，本发明提供制备长期胃泌酸调节素缀合物的液体制剂的方法。

具体地，在本发明的一个实施方式中，制备液体制剂的方法可包括步骤：a)制备长期胃泌酸调节素缀合物；和b)将制备的长期胃泌酸调节素缀合物与包含缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂的稳定剂混合。

在本发明的另一实施方式中，制备液体制剂的方法可包括步骤：a)制备长期胃泌酸调节素缀合物；和b)将制备的长期胃泌酸调节素缀合物与包含缓冲剂、糖醇和非离子表面活性剂的稳定剂和防腐剂混合。

优选地，步骤b)中的稳定剂可进一步包括选自等渗剂、糖、多元醇和氨基酸的一种或多种。

再一方面，本发明提供预防或治疗肥胖或糖尿病的药物组合物，其包括上述液体制剂。

如本文所用，术语“预防”指抑制或延迟目标疾病发展的一切行为。如本文所用，术语“预防”意为给予本发明的缀合物以抑制或延迟糖尿病状况，如异常血糖水平或异常隔离分泌或肥胖状况如体重或身体脂肪增加的发展。

如本文所用，术语“治疗”指缓解、改善或减轻已患疾病的症状的一切行为。如本文所用，术语“治疗”意为给予本发明的缀合物以缓解、改善或减轻上述糖尿病状况或肥胖状况，以正常化血糖水平和胰岛素分泌和减少体重或身体脂肪。

如本文所用，术语“肥胖”指身体脂肪过量。25或更高的身体质量指数(＝体重(kg)除以身高(m))被定义为肥胖。肥胖通常源自能量摄入超过能量消耗的能量失衡。肥胖是影响整个身体并且很有可能导致糖尿病和高脂血的代谢疾病。另外，肥胖与性功能障碍、关节炎、和心血管疾病发展风险增加相关，并且在一些情况下也与癌症的发展相关。

如本文所用，术语“糖尿病”是一种代谢疾病，其中胰岛素分泌不足或不发挥正常功能。糖尿病的特征在于血糖水平增加，并且引发多种健康问题。在糖尿病的情况下，葡萄糖随尿液排出。

本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”意为足以呈现治疗性效果并且不产生副作用的量。本发明的药物组合物的活性成分剂量可根据疾病类型、患者年龄、体重、健康状况、性别、和药物敏感性、给药途径、给药模式、给药频率、治疗持续时间、与本发明的组合物组合或同时使用的药物、和医学领域已知的其他因素由本领域技术人员容易确定。

再一方面，本发明提供预防或治疗肥胖或糖尿病的方法，包括给予对象液体制剂。

在此，液体制剂、肥胖和糖尿病如上所述。

如本文所用，术语“对象”指疑患肥胖或糖尿病的对象。具体地，该术语意为患有上述疾病或具有上述疾病的发展风险的哺乳动物，包括人、大鼠和家养动物。另外，对象可以是任何可通过本发明的液体制剂衍生物治疗的对象。

本发明的治疗方法可包括给予药学有效量的包括液体制剂的药物组合物。该组合物的每日总剂量可通过医师的适当医学判断来确定，并且该组合物可被给予一次或数次。然而，基于本发明的目的，对于任何具体患者而言，组合物的具体治疗有效剂量可根据医学领域公知的各种因素而不同，该因素包括待实现的响应的种类和程度、具体组合物——根据是否有其他试剂一起使用、患者年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给药时间和途径、组合物分泌速率、治疗持续时间、与本发明的组合物组合或同时使用的其他药物和医学领域已知的其他因素。

发明有利效果

包括长期胃泌酸调节素缀合物的本发明液体制剂包括缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，并且不包含人血清白蛋白和可能对人体有害的因子，因此不易受病毒感染。另外，本发明的胃泌酸调节素缀合物包括连接至免疫球蛋白Fc区的胃泌酸调节素，因此与天然胃泌酸调节素相比具有大的分子量、延长的生理活性、和良好的储存稳定性。

附图简述

图1a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单PEG化的胃泌酸调节素衍生物(SEQ IDNO：25)而获得的结果的图。

图1b是显示通过SOURCE 15Q纯化柱纯化单PEG化的胃泌酸调节素衍生物(SEQ IDNO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合物而获得的结果的图。

图1c是显示通过SOURCE ISO纯化柱纯化单PEG化的胃泌酸调节素衍生物(SEQ IDNO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合物而获得的结果的图。

图2a是显示在25℃下储存0-2周后在实施例3中通过IE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH的稳定性而获得的结果的图形图。图2a中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图2b是显示在25℃下储存0-2周后在实施例3中通过SE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH的稳定性而获得的结果的图形图。图2b中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图2c是显示在25℃下储存0-2周后在实施例3中通过RP-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH的稳定性而获得的结果的图形图。图2c中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图3a是显示在25℃下储存0-4周后在实施例4中通过IE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇种类和等渗剂存在与否的稳定性而获得的结果的图形图。图3a中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图3b是显示在25℃下储存0-4周后在实施例4中通过SE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇种类和等渗剂存在与否的稳定性而获得的结果的图形图。图3b中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图3c是显示在25℃下储存0-4周后在实施例4中通过RP-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇种类和等渗剂存在与否的稳定性而获得的结果的图形图。图3c中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图4a是显示在25℃下储存0-4周后在实施例5中通过IE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图4a中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图4b是显示在25℃下储存0-4周后在实施例5中通过SE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图4b中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图4c是显示在25℃下储存0-4周后在实施例5中通过RP-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图4c中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图5a是显示在25℃下储存0-4周后在实施例6中通过IE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据表面活性剂浓度和氨基酸存在与否的稳定性而获得的结果的图形图。图5a中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图5b是显示在25℃下储存0-4周后在实施例6中通过SE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据表面活性剂浓度和氨基酸存在与否的稳定性而获得的结果的图形图。图5b中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图5c是显示在25℃下储存0-4周后在实施例6中通过RP-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据表面活性剂浓度和氨基酸存在与否的稳定性而获得的结果的图形图。图5c中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图6a是显示在25℃下储存0-4周后在实施例7中通过IE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和糖醇浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图6a中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图6b是显示在25℃下储存0-4周后在实施例7中通过SE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和糖醇浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图6b中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图6c是显示在25℃下储存0-4周后在实施例7中通过RP-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和糖醇浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图6c中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图7a是显示在25℃下储存0-4周后在实施例8中通过IE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和缓冲剂醇种类的稳定性而获得的结果的图形图。图7a中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图7b是显示在25℃下储存0-4周后在实施例8中通过SE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和缓冲剂醇种类的稳定性而获得的结果的图形图。图7b中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图7c是显示在25℃下储存0-4周后在实施例8中通过RP-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和缓冲剂醇种类的稳定性而获得的结果的图形图。图7c中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图8a是显示在25℃下储存0-4周后在实施例9中通过IE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据防腐剂存在与否和长期胃泌酸调节素浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图8a中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图8b是显示在25℃下储存0-4周后在实施例9中通过SE-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据防腐剂存在与否和长期胃泌酸调节素浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图8b中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

图8c是显示在25℃下储存0-4周后在实施例9中通过RP-HPLC评价长期胃泌酸调节素缀合物根据防腐剂存在与否和长期胃泌酸调节素浓度的稳定性而获得的结果的图形图。图8c中的各图显示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。

发明实施方式

在下文中，参考实施例对本发明进行进一步详细描述。然而要理解，这些实例仅以示例为目的，并非意图限制本发明的范围。

实施例1：合成胃泌酸调节素和胃泌酸调节素衍生物

为测量本发明的液体制剂中的胃泌酸调节素和胃泌酸调节素衍生物的稳定性，合成具有下表1所示氨基酸序列的胃泌酸调节素衍生物。

表1

胃泌酸调节素和胃泌酸调节素衍生物

在上表中，在每个SEQ ID NOS:19、20、22、25、26、27、32、33和34中粗体字母显示的氨基酸残基在一起形成环，并且X表示的氨基酸残基意为非天然氨基酸α-甲基-谷氨酸。另外，CA表示4-咪唑并乙酰基，DA表示去氨基-组氨酰基和(d)S表示d-丝氨酸。

实施例2：制备包括胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合 物(胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)连接至免疫球蛋白Fc区)

首先，为在胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)的第30位氨基酸的半胱氨酸残基处PEG化MAL-10K-ALD PEG，使胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)和MAL-10K-ALD PEG以1：3的摩尔比和3㎎/ml的蛋白质浓度在室温下彼此反应3小时。在此，反应在存在1M胍的情况下在50mM Tris缓冲剂(pH 8.0)中进行。在反应完成后，将反应溶液施加于SOURCE S柱以纯化在半胱氨酸处单PEG化的胃泌酸调节素衍生物(柱：SOURCE S，流速：2.0ml/min，梯度：A0→100％50min B(A：20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇，B：A+1M KCl))(图1a)。图1a是显示通过SOURCE S纯化柱纯化单PEG化胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)而获得的结果的图。

然后，使纯化的单PEG化的胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc以1：5的摩尔比和20㎎/ml的蛋白质浓度在4℃下彼此反应16小时。反应在存在20mM SCB作为还原剂的情况下在100mM磷酸钾缓冲剂(pH 6.0)中进行。在反应完成后，将反应溶液施加于SOURCE 15Q纯化柱(柱：SOURCE 15Q，流速：2.0ml/min，梯度：A0→4％1min B→20％80minB(A：20mM Tris-HCl，pH 7.5，B：A+1M NaCl))(图1b)和源ISO纯化柱(柱：SOURCE ISO，流速：2.0ml/min，梯度：B 0→100％100min A(A：20mM Tris-HCl，pH 7.5，B：A+1.1M AS))(图1c)，以纯化包括胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合物。图1b是显示通过SOURCE 15Q纯化柱纯化包括胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合物而获得的结果的图，图1c是显示通过Source ISO纯化柱纯化包括胃泌酸调节素衍生物(SEQ ID NO：25)和免疫球蛋白Fc的缀合物而获得的结果的图。

如上所述制备的胃泌酸调节素缀合物被研发以增加胃泌酸调节素的血液半衰期。其包括以位点特异性方式彼此共价连接的免疫球蛋白Fc区、非肽基聚合物和胃泌酸调节素，并且具有显著增加的血液半衰期。

实施例3：评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH的稳定性

为评价液体制剂中长期胃泌酸调节素缀合物(实施例2中制备)的稳定性，将长期胃泌酸调节素缀合物以表2所示的组成在25℃下储存0-2周，然后通过离子交换-高效液相色谱(IE-HPLC)、尺寸排阻-高效液相色谱(SE-HPLC)和反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分析。关于胃泌酸调节素缀合物的储存，柠檬酸盐缓冲剂用作缓冲剂，甘露醇用作糖醇，和聚山梨醇酯20用作非离子型表面活性剂。在下表3、4和5中，IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示面积％/起始面积％，其表示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。表3显示储存后长期胃泌酸调节素缀合物的IE-HPLC面积(％)，表4显示储存后长期胃泌酸调节素缀合物的SE-HPLC面积(％)，和表5显示储存后长期胃泌酸调节素缀合物的RP-HPLC面积(％)。

表2

表3

表4

表5

由上述表3的IE-HPLC(％)结果可见，胃泌酸调节素缀合物在较低pH下更稳定。在表4的SE-HPLC结果中，胃泌酸调节素缀合物在pH 5.2下最稳定，并且在表5的RP-HPLC结果中，胃泌酸调节素缀合物在pH 5.6下最稳定。虽然在不同分析方法之间pH稳定性有所不同，但在RP-HPLC分析方法中不同pH之间的保留差异最大。这表明胃泌酸调节素缀合物在pH5.6下最稳定。

实施例4：评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇种类和等渗剂存在与否的稳定 性

发明人测试了作为稳定剂的糖醇的种类和作为等渗剂的氯化钠存在与否对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，利用在实施例3中选择的柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.6)，将长期胃泌酸调节素缀合物以下表6所示的组成在25℃下储存0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC分析。在下表7、8和9中，IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示面积％/起始面积％，其表示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。表7显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的IE-HPLC面积(％)，表8显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的SE-HPLC面积(％)，和表9显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的RP-HPLC面积(％)。

表6

表7

表8

表9

由上表6至9可见，相同浓度的长期胃泌酸调节素缀合物在甘露醇或山梨醇中比在甘油中更稳定。RP-HPLC的结果表明长期胃泌酸调节素缀合物在甘露醇中比在山梨醇中更稳定一点。另外，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性在作为等渗剂的氯化钠存在与不存在之间无显著差异。

实施例5：评价长期胃泌酸调节素缀合物根据糖醇浓度的稳定性

发明人测试了作为稳定剂的糖醇的浓度对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，利用柠檬酸盐缓冲剂(在上述实施例中选择的pH 5.6和甘露醇)，将长期胃泌酸调节素缀合物以下表10所示的组成在25℃下储存0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC分析。在下表11、12和13中，IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示面积％/起始面积％，其表示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。表11显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的IE-HPLC面积(％)，表12显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的SE-HPLC面积(％)，和表13显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的RP-HPLC面积(％)。

表10

表11

表12

表13

在表10至13中可见，长期胃泌酸调节素缀合物在存在5％甘露醇或10％甘露醇的情况下稳定。然而，在存在2％甘露醇或15％甘露醇的情况下形成蛋白质沉淀。IE-HPLC或SE-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性在10％甘露醇和5％甘露醇之间相似。RP-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性在10％甘露醇中比在5％甘露醇中更稳定。

实施例6：评价长期胃泌酸调节素缀合物根据表面活性剂浓度和氨基酸存在与否 的稳定性

发明人测试了作为稳定剂的表面活性剂的浓度和氨基酸存在与否对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。利用在上述实施例中选择的柠檬酸盐缓冲剂(pH5.6)和柠檬酸盐缓冲剂和10％甘露醇，将长期胃泌酸调节素缀合物以下表14所示的组成在25℃下储存0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC分析。在下表15、16和17中，IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示面积％/起始面积％，其表示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。表15显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的IE-HPLC面积(％)，表16显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的SE-HPLC面积(％)，和表17显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的RP-HPLC面积(％)。

表14

表15

表16

表17

由表14至17的结果可见，长期胃泌酸调节素缀合物在包含0.02％聚山梨醇酯20和0.1mg/mL甲硫氨酸的组合物中最稳定。

实施例7：评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和糖醇浓度的稳定性

发明人测试了pH和作为稳定剂的糖醇的浓度对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，利用上述实施例中选择的0.02％聚山梨醇酯20和0.1mg/mL甲硫氨酸，将长期胃泌酸调节素缀合物以下表18所示的组成在25℃下储存0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC分析。在下表19、20和21中，IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示面积％/起始面积％，其表示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。表19显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的IE-HPLC面积(％)，表20显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的SE-HPLC面积(％)，和表21显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的RP-HPLC面积(％)。

表18

表19

表20

表21

由上表结果可见，IE-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的高低顺序为pH 5.2、pH 5.6和pH 6.0。RP-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的高低顺序为pH 6.0、pH 5.6和pH 5.2。SE-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性在pH 5.2、pH 5.6和pH 6.0之间无显著差异。换句话说，IE-HPLC、RP-HPLC和SE-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物在pH 5.6下稳定。

同时，IE-HPLC和SE-HPLC的结果表明，在pH 5.6下长期胃泌酸调节素缀合物在不同甘露醇浓度之间无显著差异。然而，在RP-HPLC的结果中，在pH 5.6下长期胃泌酸调节素缀合物在5％甘露醇中比在10％或15％甘露醇中更稳定。

实施例8：评价长期胃泌酸调节素缀合物根据pH和缓冲剂种类的稳定性

发明人测试了pH和作为稳定剂的缓冲剂种类对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，利用在上述实施例中选择的0.02％聚山梨醇酯20、0.1mg/mL甲硫氨酸和5％甘露醇，将长期胃泌酸调节素缀合物以表22所示的组成在25℃下储存的0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC分析。

在下表23、24和25中，IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示面积％/起始面积％，其表示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。表23显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的IE-HPLC面积(％)，表24显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的SE-HPLC面积(％)，和表25显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的RP-HPLC面积(％)。

表22

表23

表24

表25

由表23至25的结果可见，SE-HPLC或RP-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性在pH 5.6和pH 5.8之间无显著差异。IE-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物在pH 5.6比在pH 5.8更稳定。SE-HPLC的结果显示，长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性在相同pH的不同缓冲剂之间无显著差异。另外，IE-HPLC或RP-HPLC的结果表明，长期胃泌酸调节素缀合物在相同pH的组氨酸中是最稳定的。

实施例9：评价防腐剂存在与否和长期胃泌酸调节素缀合物浓度对长期胃泌酸调 节素缀合物的稳定性的影响

发明人测试了作为稳定剂的防腐剂存在与否和长期胃泌酸调节素缀合物浓度对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，利用在上述实施例中选择的组氨酸缓冲剂(pH 5.6)、0.02％聚山梨醇酯20、0.1mg/mL甲硫氨酸和5％甘露醇，将长期胃泌酸调节素缀合物以下表26所示的组成在25℃下储存0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC分析。在下表27、28和29中，IE-HPLC(％)、SE-HPLC(％)和RP-HPLC(％)表示面积％/起始面积％，其表示长期胃泌酸调节素缀合物相对于起始值的保留百分比。表27显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的IE-HPLC面积(％)，表28显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的SE-HPLC面积(％)，和表29显示在储存后长期胃泌酸调节素缀合物的RP-HPLC面积(％)。

表26

表27

表28

表29

在表26至29中可见，IE-HPLC、SE-HPLC或RP-HPLC的结果表明，即使在存在防腐剂的情况下长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性也无变化，并且不根据其浓度而差异。

虽然以示例为目的描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员会理解，可以有不同改动、添加和替换，而不脱离如所附权利要求公开的本发明的范围和精神。

Claims (29)

1.长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，包括：

药理活性量的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物，其中所述胃泌酸调节素衍生物缀合物包括

胃泌酸调节素衍生物，所述胃泌酸调节素衍生物是生理活性肽并且包括选自SEQ IDNOS:2-34的氨基酸序列，以及

免疫球蛋白Fc区；和

不含白蛋白的稳定剂，其中所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，

其中所述缓冲剂的pH范围为4.5至7.0。

2.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述稳定剂进一步包含选自等渗剂、糖、多元醇和氨基酸的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂防止所述长期胃泌酸调节素衍生物缀合物聚集。

4.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。

5.根据权利要求4所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区的各结构域是源自选自IgG，IgA，IgD，IgE和IgM的不同免疫球蛋白的结构域的杂合体。

6.根据权利要求4所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体，所述单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。

7.根据权利要求4所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。

8.根据权利要求7所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述免疫球蛋白Fc区是人非糖基化IgG4Fc区。

9.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述缀合物利用非肽基聚合物或重组技术来制备。

10.根据权利要求9所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述非肽基聚合物选自聚丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物，包括聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)；脂质聚合物；几丁质；透明质酸；及其组合。

11.根据权利要求9所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述非肽基聚合物是聚乙二醇。

12.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述糖醇是选自甘露醇、山梨醇和甘油的一种或多种。

13.根据权利要求12所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述液体制剂中所述糖醇的的浓度为2-15％(w/v)。

14.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述缓冲剂是选自柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲剂的一种或多种。

15.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述胃泌酸调节素衍生物包括选自SEQ ID NO：24-26的氨基酸序列。

16.根据权利要求2所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述等渗剂是氯化钠。

17.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述非离子型表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆。

18.根据权利要求17所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述液体制剂中所述非离子型表面活性剂的浓度为0.001-0.1％(w/v)。

19.根据权利要求2所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述氨基酸是甲硫氨酸。

20.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述稳定剂包含pH范围为4.8至6.0的缓冲剂、选自甘露醇和山梨醇的一种或多种糖醇、和聚山梨醇酯20。

21.根据权利要求1所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，进一步包括选自间甲酚、苯酚和苄醇的一种或多种防腐剂。

22.根据权利要求21所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述液体制剂中所述防腐剂的浓度为0.001-1％(w/v)。

23.根据权利要求21所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述防腐剂是间甲酚。

24.根据权利要求21所述的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，其中所述制剂用于多剂量给予。

25.长期胃泌酸调节素衍生物缀合物的液体制剂，包括：

药理学上有效量的长期胃泌酸调节素衍生物缀合物，其中所述胃泌酸调节素衍生物缀合物包括

胃泌酸调节素衍生物，所述胃泌酸调节素衍生物是生理活性肽并且包括选自SEQ IDNOS:2-34的氨基酸序列，以及

免疫球蛋白Fc区；和

5-50mM组氨酸；2-15％(w/v)甘露醇；0.01-1mg/mL甲硫氨酸；0.001-0.1％(w/v)聚山梨醇酯20；和具有4.5至7.0范围内的pH的缓冲剂。

26.权利要求25所述的液体制剂，进一步包括0.001-1％(w/v)间甲酚。

27.制备权利要求1、2、4至20和25中任一项所述的液体制剂的方法，所述方法包括步骤：

a)制备长期胃泌酸调节素衍生物缀合物，其中所述胃泌酸调节素衍生物缀合物包括

胃泌酸调节素衍生物，所述胃泌酸调节素衍生物是生理活性肽并且包括选自SEQ IDNOS:2-34的氨基酸序列，和

免疫球蛋白Fc区；和

b)混合步骤a)中制备的所述长期胃泌酸调节素衍生物缀合物与稳定剂，所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，其中所述缓冲剂的pH范围为4.5至7.0。

28.制备权利要求21至24和26中任一项所述的液体制剂的方法，所述方法包括步骤：

a)制备长期胃泌酸调节素衍生物缀合物，其中所述胃泌酸调节素衍生物缀合物包括

胃泌酸调节素衍生物，所述胃泌酸调节素衍生物是生理活性肽并且包括选自SEQ IDNOS:2-34的氨基酸序列，和

免疫球蛋白Fc区；和

b)混合步骤a)中制备的所述长期胃泌酸调节素衍生物缀合物与稳定剂和防腐剂，所述稳定剂包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，

其中所述缓冲剂的pH范围为4.5至7.0。

29.权利要求27或28所述的方法，其中所述稳定剂进一步包含选自等渗剂、糖、多元醇和氨基酸的一种或多种。