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ES2545119T3 - Métodos basados en microARN y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres sólidos - Google Patents

Métodos basados en microARN y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres sólidos Download PDF

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ES2545119T3
ES2545119T3 ES12154339.1T ES12154339T ES2545119T3 ES 2545119 T3 ES2545119 T3 ES 2545119T3 ES 12154339 T ES12154339 T ES 12154339T ES 2545119 T3 ES2545119 T3 ES 2545119T3
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Carlo M. Croce
George A. Calin
Stefano Volinia
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Ohio State University Research Foundation
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Abstract

Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de páncreas, de próstata o de estómago, que comprende: medir el nivel de al menos un primer producto génico de miR-214 en una muestra de tejido de páncreas, de próstata o de estómago del sujeto, en el que una alteración en el nivel del primer producto génico en la muestra, en relación con el nivel del primer producto génico de miR-214 en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de páncreas, de próstata o de estómago.

Description

Métodos basados en microARN y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres sólidos
5 Antecedentes de la invención
El cáncer, el crecimiento incontrolado de células malignas, es un problema de salud importante de la era médica moderna y es una de las principales causas de muerte en los países desarrollados. En los Estados Unidos, una de cada cuatro muertes está provocada por cáncer (Jemal, A. et al., CA Cancer J. Clin. 52: 23-47 (2002)). Entre los cánceres, los que surgen de órganos y tejidos sólidos, conocidos como cánceres sólidos, conocidos como cánceres sólidos (por ejemplo, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer pancreático) están entre los cánceres humanos más habitualmente identificados.
Por ejemplo, el cáncer de próstata es el tumor maligno no cutáneo diagnosticado más frecuentemente entre
15 hombres en países industrializados y, en los Estados Unidos, 1 de cada 8 hombres desarrollarán cáncer de próstata durante su vida (Simard, J. et al., Endocrinoloy 143(6): 2029-40 (2002)). La incidencia del cáncer de próstata ha aumentado drásticamente durante las últimas décadas y el cáncer de próstata es ahora una causa principal de muerte en los Estados Unidos y en Europa Occidental (Peschel, R. E. y J. W. Colberg, Lancet 4: 233-41 (2003); Nelson, W. G. et al., N. Engl. J. Med 349(4): 366-81 (2003)). Los hombres con cáncer de próstata están afectados por una reducción media de 40 % en la esperanza de vida. Si se detecta de forma temprana, antes de la metástasis y propagación local más allá de la cápsula, el cáncer de próstata puede con frecuencia curarse (por ejemplo, usando cirugía). Sin embargo, si se diagnostica después de su propagación y metábasis de la próstata, el cáncer de próstata es normalmente una enfermedad letal con tasas de curación bajas. Aunque la exploración basada en antígeno específico de próstata (PSA) ha ayudado al diagnóstico temprano del cáncer de próstata, no es ni altamente
25 sensible ni específico (Punglia et al., N. Engl. J. Med 349(4): 335-42 (2003)). Esto significa que se asocia con el ensayo un alto porcentaje de diagnósticos de falso negativo y falso positivo. Las consecuencias son tanto muchos casos de cánceres pasados por alto como biopsias de seguimiento innecesarias para las personas sin cáncer.
El cáncer de mama sigue siendo la segunda causa principal de muertes relacionadas con cáncer en mujeres, afectando a más de 180.000 mujeres en los Estados Unidos cada año. Para las mujeres en Norteamérica, las probabilidades en tiempo de vida de tener cáncer de mama son ahora de una de cada ocho. Aunque el descubrimiento de BRCA1 y BRCA2 fueron etapas importantes en la identificación de factores genéticos clave implicados en cáncer de mama, se ha hecho evidente que las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 representan solamente una fracción de la susceptibilidad heredada a cáncer de mama (Nathanson, K. L., et al., Human Mol. Gen.
35 10(7): 715-720 (2001); Anglican Breast Cancer Study Group. Br. J. Cancer 83(10): 1301-08 (2000); y Syrjakoski, K., et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1529-31 (2000)). A pesar de investigación considerable sobre terapias para cáncer de mama, el cáncer de mama sigue siendo difícil de diagnosticar y tratar eficazmente, y la alta mortalidad observada en pacientes con cáncer de mama indica que se necesitan mejoras en el diagnóstico, tratamiento y prevención de la enfermedad.
Excluyendo cáncer de piel, el cáncer colorrectal, es el tercer cáncer diagnosticado con más frecuencia en los Estados Unidos y Canadá (después de pulmón y mama en mujeres, y pulmón y próstata en hombres). La Sociedad Americana del Cáncer estima que habrá aproximadamente 145.000 casos nuevos de cáncer colorrectal diagnosticados en los Estados Unidos en 2005 (Cancer Facts and Figures 2005. Atlanta, GA: American Cancer
45 Society, 2005. Disponibles en wvw.cancer.org/do-croot/STT/stt_0.asp, accedida el 19 de diciembre de 2005). El cáncer colorrectal es la segunda causa principal de muerte por cáncer entre hombres y mujeres en los Estados Unidos y Canadá (después del cáncer de pulmón).
La incidencia anual del cáncer pancreático es casi equivalente a la mortalidad anual, que se estima que es de
31.860 y 31.270, respectivamente, en los Estados Unidos en 2004 (Cancer Facts and Figures 2004. Atlanta, GA: American Cancer Society, 2004. Disponible en www.cancer.org/docroot/STT/stt_0_2004.asp, accedida el 21 de agosto de 2005). Los pacientes con cáncer pancreático localmente avanzado y metastásico tienen diagnósticos negativos, y el diagnóstico generalmente se realiza demasiado tarde para que la cirugía o la radioterapia sea curativa (Burr, H. A., et al., The Oncologist 10(3): 183-190, (2005)). La quimioterapia puede proporcionar alivio de los
55 síntomas para algunos pacientes con cáncer pancreático avanzado, pero su impacto en la supervivencia ha sido moderado hasta la fecha.
En los Estados Unidos, se diagnostica a más de 20.000 individuos cáncer de estómago (gástrico) cada año. La Sociedad Americana del Cáncer estima que habrá 22.710 casos nuevos de cáncer colorrectal diagnosticados en los Estados Unidos en 2004 (Cancer Facts and Figures 2004. Atlanta, GA: American Cancer Society, 2004. Disponible en wwv.cancer.org/ docroot/ STT/stt_0_2004.asp, accedida el 21 de agosto de 2005). Debido a que el cáncer de estómago puede aparecer sin síntomas, puede estar en estadios avanzados en el momento en que se realice el diagnóstico. Después el tratamiento se dirige a aumentar la comodidad del paciente y mejorar su calidad de vida.
65 El cáncer de pulmón provoca más muertes en todo el mundo que cualquier otra forma de cáncer (Goodman, G. E., Thorax 57: 994-999 (2002)). En los Estados Unidos, el cáncer de pulmón es la causa principal de muerte por cáncer
tanto en hombres como en mujeres. En 2002, la tasa de muerte de cáncer de pulmón fue una estimación de 134.900 muertes, que excede el total combinado de cáncer de mama, próstata y colon. Misma referencia. El cáncer de pulmón también es la causa principal de muerte por cáncer en todos los países Europeos, y los números de muertes relacionadas con cáncer de pulmón están aumentando rápidamente también en los países en desarrollo.
5 La tasa de supervivencia a cinco años entre todos los pacientes de cáncer de pulmón, independientemente del estadio de la enfermedad en el momento de diagnóstico, es solo de aproximadamente 13 %. Esto se diferencia de una tasa de supervivencia a los cinco años de 46 % entre casos detectados cuando la enfermedad aún está localizada. Sin embargo, solamente 16 % de los cánceres de pulmón se descubren antes de que la enfermedad se haya propagado. La detección temprana es difícil ya que los síntomas clínicos con frecuencia no se observan hasta que la enfermedad ha alcanzado un estadio avanzado. A pesar de la investigación sobre terapias para este y otros cánceres, el cáncer de pulmón sigue siendo difícil de diagnosticar y tratar eficazmente.
Claramente, la identificación de marcadores y genes que son responsables de la susceptibilidad a formas
15 particulares de cáncer sólido (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer pancreático) es uno de los principales retos a los que se enfrenta la oncología en la actualidad. Existe la necesidad de identificar medios para la detección temprana de individuos que tengan una susceptibilidad genética al cáncer de modo que puedan instituirse regímenes de exploración e intervención más agresivos para la detección y tratamiento temprano del cáncer. Los genes de cáncer también pueden revelar rutas moleculares clave que pueden manipularse (por ejemplo, usando fármacos de peso molecular grande o pequeño) y pueden conducir a tratamientos más eficaces independientemente del estadio de cáncer cuando se diagnostique por primera vez un cáncer particular.
Los microARN son una clase de ARN no codificantes, pequeños que controlan la expresión génica hibridando con y
25 desencadenando la represión de la traducción o, menos frecuentemente, la degradación de una diana de ARN mensajero (ARNm). El descubrimiento y estudio de los miARN ha revelado mecanismos reguladores de genes mediados por miARN que desempeñan papeles importantes en el desarrollo de los organismos y diversos procesos celulares, tales como diferenciación celular, crecimiento celular y muerte celular (Cheng, A. M., et al., Nucleic Acids Res. 33: 1290-1297 (2005)). Estudios recientes sugieren que la expresión aberrante de los miARN particulares puede estar implicada en enfermedades humanas, tales como trastornos neurológicos (Ishizuka, A., et al., Genes Dev. 16: 2497-2508 (2002)) y cáncer. En particular, se ha descubierto expresión errónea de miR-16-1 y/o miR-15a en leucemias linfocíticas crónicas humanas (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 15524-15529 (2002)).
35 El documento WO 2005/078139 analiza la asociación entre genes de miARN y elementos cromosómicos implicados en la etiología de diferentes cánceres y sugiere que el cáncer puede tratarse restaurando el nivel de expresión génica de miARN al normal.
Claramente, existe una gran necesidad en la técnica de métodos mejorados para detectar y tratar cánceres sólidos (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer pancreático). La presente invención proporciona nuevos métodos para el diagnóstico de cáncer pancreático. También se desvelan métodos para el diagnóstico y tratamiento de cánceres sólidos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento de cánceres sólidos.
45 Compendio de la invención
La presente invención se basa, en parte, en la identificación de miARN específicos que tienen niveles de expresión alterados en cánceres sólidos particulares.
En consecuencia, la invención abarca métodos para diagnosticar si un sujeto tiene un cáncer sólido. De acuerdo con los métodos de la invención, el nivel de al menos un primer producto génico de miR-214 en una muestra de ensayo se compara con el nivel del producto génico de miR correspondiente en una muestra de control. Una alteración (por ejemplo, un aumento, una reducción) en el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo, en relación con el nivel del producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto
55 tiene un cáncer sólido. El cáncer sólido puede cáncer de mama, cáncer pancreático cáncer de próstata.
También se desvelan métodos en los que el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-191, miR-17-5p y combinaciones de los mismos. Como alternativa, el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama o cáncer de pulmón y el al menos un
65 producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-210, miR-213 y una combinación de los mismos.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de próstata o cáncer de páncreas y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo es miR218-2.
5 También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-125b-1, miR-125b-2, miR-145, miR-21 y combinaciones de los mismos. Como alternativa, el cáncer sólido es cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-29b-2, miR146, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-10b, miR-145, miR-181a, miR-140, miR-213, miR-29a prec, miR-181b-1, miR199b, miR-29b-1, miR-130a, miR-155, let-7a-2, miR-205, miR-29c, miR-224, miR-100, miR-31, miR-30c, miR-17-5p, miR-210, miR-122a, miR-16-2 y combinaciones de los mismos.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de colon y el al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-24-1, miR-29b-2, miR-20a, miR-10a,
15 miR-32, miR-203, miR-106a, miR-17-5p, miR-30c, miR-223, miR-126*, miR-128b, miR-21, miR-24-2, miR-99b prec, miR-155, miR-213, miR-150, miR-107, miR-191, miR-221, miR-9-3 y combinaciones de los mismos.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de pulmón y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-205, miR-200b, miR-9-1, miR-210, miR148, miR-141, miR-132, miR-215, miR-128b, let-7g, miR-16-2, miR-129-1/2 prec, miR-126*, miR-142-as, miR-30d, miR-30a-5p, miR-7-2, miR-199a-1, miR-127, miR-34a prec, miR-34a, miR-136, miR-202, miR-196-2, miR-199a-2, let7a-2, miR-124a-1, miR-149, miR-17-5p, miR-196-1 prec, miR-10a, miR-99b prec, miR-196-1, miR-199b, miR-191, miR-195, miR-155 y combinaciones de los mismos se usa para diagnosticar cáncer de pulmón.
25 También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido es cáncer pancreático y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-103-1, miR-103-2, miR-155, miR-204 y combinaciones de los mismos.
En una realización, el miR-214 y al menos un producto génico de miR adicional seleccionado del grupo que consiste en miR-103-2, miR-103-1, miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-24-1, miR-191, miR-23a, miR-26a-1, miR-125a, miR-130a, miR-26b, miR-145, miR-221, miR-126*, miR-16-2, miR-146, miR99b, miR-128b, miR-155, miR-29b-2, miR-29a, miR-25, miR-16-1, miR-99a, miR-224, miR-30d, miR-92-2, miR-199a-1, miR-223, miR-29c, miR-30b, miR-129-1/2, miR-197, miR-17-5p, miR-30c, miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a-5p, miR-132, miR-181b-1, miR-152 prec, miR-23b, miR-20a, miR-222, miR-27a, miR-92-1, miR-21, miR-129-1/2 prec, miR-150,
35 miR-32, miR-29b-1 y combinaciones de los mismos se usan para diagnosticar cáncer pancreático.
En otra realización, el producto génico de miR-214 y al menos un miR adicional en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en let-7d, miR-128a prec, miR-195, miR-203, let-7a-2 prec, miR-34a, miR-20a, miR-218-2, miR-29a, miR-25, miR-95, miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148, miR-191, miR-21, let-7i, miR-198, miR-199a-2, miR-30c, miR-17-5p, miR-92-2, miR-146, miR-181b-1 prec, miR-32, miR-206, miR-184 prec, miR-29a prec, miR-29b-2, miR-149, miR-181b-1, miR-196-1 prec, miR-93-1, miR-223, miR-16-1, miR-101-1, miR124a-1, miR-26a-1, miR27a, miR-24-1, miR-106a, miR-199a-1 y combinaciones de los mismos se usa para diagnosticar el cáncer de próstata.
45 En una realización adicional, el producto génico de miR y un producto génico de miR adicional se selecciona del grupo que consiste enomiR-223, miR-21, miR-218-2, miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR-191, miR-221, miR-125b-2, miR-103-1, , miR-222, , miR-125b-1, miR-100, miR-107, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR215, miR-7-2, miR-138-2, miR-24-1, miR-99b, miR-33b, miR-24-2 y combinaciones de los mismos.
El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse usando diversas técnicas que se conocen bien por los expertos en la materia (por ejemplo, RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa, análisis de transferencia de Northern, detección de hibridación en solución). En una realización particular, el nivel de al menos un primer miR214 se mide por transcripción inversa de al menos ARN de miR-214 de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar al menos un oligodesoxinucleótido diana de miR-106a, hibridando el oligodesoxinucleótido diana
55 con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparando el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación de una muestra de control. Una alteración en la señal de al menos un primer producto génico de miR214 en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene un cáncer sólido. Los oligonucleótidos diana pueden hibridarse con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
La presente divulgación también abarca métodos para inhibir tumorogénesis en un sujeto que tiene, o se sospecha
65 que tiene, un cáncer sólido (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon), en el que al menos un producto génico de miR está desregulado (por
ejemplo, regulado negativamente, regulado positivamente) en las células de cáncer del sujeto. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado negativamente en las células de cáncer, el método comprende administrar una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado, una variante aislada o un fragmento biológicamente activo del producto génico de miR o variante, de modo que se inhiba la proliferación de células 5 cancerosas en el sujeto. El al menos un producto génico de miR aislado puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos. El producto génico de miR no puede ser miR-15a
o miR-16-1. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado positivamente en las células cancerosas, el método puede comprender administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR (denominado en la presente memoria un “compuesto de inhibición de la expresión de miR”), de modo que se inhibe la proliferación de células cancerosas en el sujeto. El al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR puede ser específico para un producto génico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
15 Los métodos para inhibir la tumorogénesis en un sujeto pueden comprender adicionalmente la etapa de determinar la cantidad de al menos un producto génico de miR en células cancerosas del sujeto, y comparar ese nivel del producto génico de miR en las células con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en células de control. Si la expresión del producto génico de miR está desregulada (por ejemplo, regulada negativamente, regulada positivamente) en células cancerosas, los métodos comprenden además alterar la cantidad del al menos un producto génico de miR expresado en las células cancerosas. La cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas puede ser menor que la cantidad de producto génico de miR expresado en una célula de control (por ejemplo, células de control), y se administra al sujeto una cantidad eficaz del producto génico de miR regulado negativamente, variante aislada o fragmento biológicamente activo del producto génico de miR o variante.
25 Los productos génicos de miR adecuados incluyen miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos, entre otros. El producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. La cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas puede ser mayor que la cantidad del producto génico de miR expresado en la célula de control (por ejemplo, células de control), y puede administrarse al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR regulado positivamente. Los compuestos adecuados para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR incluyen, pero sin limitación, compuestos que inhiben la expresión de miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
35 La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas para tratar cánceres sólidos (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon). Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un producto génico de miR aislado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El al menos un producto génico de miR puede corresponder a un producto génico de miR que tenga una nivel reducido de expresión en células cancerosas en relación con las células de control. El producto génico de miR aislado puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR218-2 y combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR puede
45 ser específico de un producto génico de miR cuya expresión es mayor en células cancerosas que en células de control. El compuesto de inhibición de la expresión de miR puede ser específico para uno o más productos génicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
También se desvelan métodos para identificar un inhibidor de tumorogénesis, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR en la célula. El método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en cánceres sólidos (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer
55 de estómago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon). Un aumento en el nivel del producto génico de miR en la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. El al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en células de cáncer sólido pueden seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos.
El método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con aumento de los niveles de expresión en cánceres sólidos. Una reducción en el nivel del producto génico de miR en la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativa de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. El al menos un producto génico de miR asociado con niveles de 65 expresión aumentados en células de cáncer sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-21, miR-175p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1,
miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
5 La FIGURA 1 representa un análisis de agrupamiento de 540 muestras, que representan 6 cánceres sólidos (parte superior) y los tejidos normales respectivos. Los miARN incluidos en el árbol (n=137) representan aquellos cuyo nivel de expresión (intensidad con fondo restado) fue mayor que el valor umbral (256) en al menos 50 % de las muestras analizadas. Las series se centraron en la mediana y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlace medio usando métrica de correlación no centrada. Los colores indican la diferencia en el nivel de expresión de la mediana para los microARN de cada muestra. La FIGURA 2 representa un análisis no supervisado de los datos de expresión de microARN. Los perfiles de microARN de 540 muestras (indicadas en la parte superior del panel) que abarcaban mama, colon, pulmón, páncreas, próstata y estómago (tejidos normales y tumores) se filtraron, centraron y normalizaron para cada
15 característica. Los datos se sometieron a agrupamiento jerárquico tanto en las muestras (orientadas horizontalmente) como en las características (orientadas verticalmente) con enlace medio y correlación de Pearson como una medida de similitud. Los nombres de las muestras se indican en la parte superior de la figura y los nombres de los miARN a la izquierda. El ID de la sonda se indica entre paréntesis, ya que el mismo microARN puede medirse por diferentes oligonucleótidos. Los colores indican la diferencia en los niveles de expresión de la mediana para los microARN en cada muestra. La FIGURA 3 representa la expresión de miARN regulados diferencialmente entre cánceres sólidos (parte superior). Se representan sesenta y un microARN, que están presentes en al menos 90 % de los cánceres sólidos tisulares (derecha del panel). El árbol presenta los valores de expresión absolutos medios para cada uno de los microARN enumerados después de transformación log2. La media se calculó sobre todas las muestras del
25 mismo histotipo tumoral o tejido. Los genes se centraron en la media y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlace medio usando la distancia Euclídea. La FIGURA 4 representa el factor de cambio en la expresión de miARN presentes en al menos 75 % de los tumores sólidos con al menos un valor absoluto de tumor mayor que 2 en diferentes muestras de cáncer (parte superior), en relación con muestras normales. El árbol presenta la transformación log2 del factor de cambio medio (cáncer frente a normal). La media se calculó sobre todas las muestras del mismo histotipo tumoral o tejido. Las matrices se centraron en la media y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlaces medio usando métrica de correlación no centrada. La FIGURA 5 representa el factor de cambio en la expresión de miARN presentes en los distintivos de al menos 50 % de los tumores sólidos en muestras de cáncer frente a normales. El árbol representa la transformación log2
35 del factor de cambio medio (cáncer frente a normal). La media se calculó sobre todas las muestras del mismo histotipo tumoral o tejido. Las matrices se centraron en la media y se normalizaron usando Gene Cluster 2.0. Se realizó agrupamiento de enlace medio usando métrica de correlación no centrada. La FIGURA 6A representa gráficas de barra que indican que las UTR 3’ de diferentes genes que codifican proteína de cáncer permiten la regulación del cáncer por microARN. La represión relativa de expresión de luciferasa de luciérnaga (Factor de Cambio) se normalizó a un control de luciferasa de renilla. PLAG1, gen de adenoma pleiomórfico 1; TGFBR2, receptor de factor de crecimiento transformante beta II; Rb, gen de retinoblastoma. Se usó pGL-3 (Promega) como el vector vacío. Se usaron oligoARN miR-20a, miR-26a-1 y miR106 (con sentido y mezclados) para transfecciones. Se muestra en el panel inferior un segundo experimento que usa versiones mutadas de cada ARNm diana que carecen del sitio de complementariedad del extremo de miARN
45 5’ (MUT). Todos los experimentos se realizaron dos veces por triplicado (n=6). La FIGURA 6B representa transferencias de Western que indican que, en ciertos cánceres (por ejemplo, pulmón, mama, colon, gástrico), los niveles de proteína RB1 (Rb) presentan una correlación inversa con el nivel de expresión de miR-106a. Se usó β actina como un control para normalización. N1, muestra normal; T1 y T2, muestra tumoral. La FIGURA 7 representa transferencias de Northern que muestran regulación negativa de la expresión de miR145 (parte superior) y regulación positiva de la expresión de miR-21 (parte inferior) en muestras de cáncer de mama (serie P y serie numerada) en relación con muestras normales. Se realizó normalización con una sonda específica de U6. La FIGURA 8 representa transferencias de Northern que muestran regulación positiva de la expresión de miR
55 103 y regulación negativa de la expresión de miR-155 (parte superior) en diferentes muestras de cáncer pancreático endocrino (WDET, tumores endocrinos pancreáticos bien diferenciados, WDEC, carcinomas endocrinos pancreáticos bien diferenciados y ACC, carcinomas de células de acinos pancreáticos) en relación con muestras normales (serie K), así como regulación positiva de la expresión de miR-204 (parte inferior) en insulinomas (serie F) en relación con muestras normales (serie K) y muestras no secretoras/no actuantes (serie NF). Se realizó normalización con una sonda específica para ARN 5S.
Descripción detallada
La presente divulgación se basa, en parte, en la identificación de microARN particulares cuya expresión está 65 alterada en células cancerosas asociadas con diferentes cánceres sólidos, tales como cáncer de colon, de estómago, pancreático, de pulmón, de mama y de próstata, en relación con células de control normales.
Como se usa en la presente memoria de forma intercambiable un “producto génico de miR”, “microARN”, “miR” o “miARN” se refiere al transcrito de ARN no procesado (por ejemplo, precursor) o procesado (por ejemplo, maduro) de un gen de miR. Ya que los productos génicos de miR no se traducen a proteína, la expresión “productos génicos de miR” no incluye proteínas. El transcrito génico de miR no procesado también se denomina un “precursor de miR”
5 o “miR prec” y normalmente comprende un transcrito de ARN de aproximadamente 70-100 nucleótidos de longitud. El precursor de miR puede procesarse por digestión con una RNAsa (por ejemplo, Dicer, Argonaut o RNAsa III (por ejemplo RNAsa III de E. coli)) en una molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa. Esta molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa también se denomina el transcrito génico de miR “procesado” o miARN “maduro”.
10 La molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa puede obtenerse del precursor de miR mediante vías de procesamiento naturales (por ejemplo, usando células intactas o lisados celulares) o mediante vías de procesamiento sintéticas (por ejemplo, usando enzimas de procesamiento aisladas, tales como Dicer, Argonaut o RNAsa III aislada). Se entiende que la molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa también puede producirse directamente por síntesis biológica o química, sin haberse procesado a partir del precursor de miR. Cuando se hace
15 referencia a un microARN en la presente memoria por nombre, el nombre corresponde a las formas tanto precursoras como maduras, a no ser que se indique de otro modo.
Las Tablas 1a y 1b representan las secuencias de nucleótidos de microARN humanos maduros y precursores particulares.
Tabla 1b-Secuencias de microARN maduro humano.
Nombre de miARN Maduro
Secuencia de miARN Maduro (5’ a 3’) SEC ID Nº microARN precursor correspondiente; véase Tabla 1a
let-7a
ugagguaguagguuguauaguu 310 let-7a-1; let-7a-2; let-7a-3; let-7a-4
let-7b
ugagguaguagguugugugguu 311
let-7b
let-7c
ugagguaguagguuguaugguu 312
let-7c
let-7d
agagguaguagguugcauagu 313 let-7d; let-7d-v1
let-7e
ugagguaggagguuguauagu 314
let-7e
let-7f
ugagguaguagauuguauaguu 315 let-7f-1; let-7f-2-1; let-7f-2-2
let-7g
ugagguaguaguuuguacagu 316
let-7g
let-7i
ugagguaguaguuugugcu 317
let-7i
miR-1
uggaauguaaagaaguaugua 318 miR-1b; miR-1b-1; miR-1b-2
miR-7
uggaagacuagugauuuuguu 319 miR-7-1; miR-7-1a; miR-7-2; miR-7-3
miR-9
ucuuugguuaucuagcuguauga 320 miR-9-1; miR-9-2; miR-9-3
miR-9*
uaaagcuagauaaccgaaagu 321 miR-9-1; miR-9-2; miR-9-3
miR-10a
uacccuguagauccgaauuugug 322
miR-10a
miR-10b
uacccuguagaaccgaauuugu 323
miR-10b
miR-15a
uagcagcacauaaugguuugug 324 miR-15a; miR-15a-2
miR-15b
uagcagcacaucaugguuuaca 325
miR-15b
miR-16
uagcagcacguaaauauuggcg 326 miR-16-1; miR-16-2; miR-16-13
miR-17-5p
caaagugcuuacagugcagguagu 327 miR-17
miR-17-3p
acugcagugaaggcacuugu 328 miR-17
miR-18
uaaggugcaucuagugcagaua 329 miR-18; miR-18-13
miR-19a
ugugcaaaucuaugcaaaacuga 330 miR-19a; miR-19a-13
miR-19b
ugugcaaauccaugcaaaacuga 331 miR-19b-1; miR-19b-2
miR-20
uaaagugcuuauagugcaggua 332 miR-20 (miR-20a)
miR-21
uagcuuaucagacugauguuga 333 miR-21; miR-21-17
miR-22
aagcugccaguugaagaacugu 334
miR-22
miR-23a
aucacauugccagggauuucc 335
miR-23a
miR-23b
aucacauugccagggauuaccac 336
miR-23b
miR-24
uggcucaguucagcaggaacag 337 miR-24-1; miR-24-2; miR-24-19; miR24-9
miR-25
cauugcacuugucucggucuga 338
miR-25
miR-26a
uucaaguaauccaggauaggcu 339 miR-26a; miR-26a-1; miR-26a-2
miR-26b
uucaaguaauucaggauaggu 340
miR-26b
miR-27a
uucacaguggcuaaguuccgcc 341
miR-27a
miR-27b
uucacaguggcuaaguucug 342 miR-27b-1; miR-27b-2
miR-28
aaggagcucacagucuauugag 343
miR-28
miR-29a
cuagcaccaucugaaaucgguu 344 miR-29a-2; miR-29a
miR-29b
uagcaccauuugaaaucagu 345 miR-29b-1; miR-29b-2
miR-29c
uagcaccauuugaaaucgguua 346
miR-29c
miR-30a-5p
uguaaacauccucgacuggaagc 347 miR-30a
miR-30a-3p
cuuucagucggauguuugcagc 348 miR-30a
miR-30b
uguaaacauccuacacucagc 349 miR-30b-1; miR-30b-2
miR-30c
uguaaacauccuacacucucagc 350
miR-30c
miR-30d
uguaaacauccccgacuggaag 351
miR-30d
miR-30e
uguaaacauccuugacugga 352
miR-30e
miR-31
ggcaagaugcuggcauagcug 353
miR-31
miR-32
uauugcacauuacuaaguugc 354
miR-32
miR-33
gugcauuguaguugcauug 355 miR-33; miR-33b
miR-34a
uggcagugucuuagcugguugu 356
miR-34a
miR-34b
aggcagugucauuagcugauug 357
miR-34b
miR-34c
aggcaguguaguuagcugauug 358
miR-34c
miR-92
uauugcacuugucccggccugu 359 miR-92-2; miR-92-1
miR-93
aaagugcuguucgugcagguag 360 miR-93-1; miR-93-2
miR-95
uucaacggguauuuauugagca 361
miR-95
miR-96
uuuggcacuagcacauuuuugc 362
miR-96
miR-98
ugagguaguaaguuguauuguu 363
miR-98
miR-99a
aacccguagauccgaucuugug 364
miR-99a
miR-99b
cacccguagaaccgaccuugcg 365
miR-99b
miR-100
uacaguacugugauaacugaag 366
miR-100
miR-101
uacaguacugugauaacugaag 367 miR-101-1; miR-101-2
miR-103
agcagcauuguacagggcuauga 368 miR-103-1
miR-105
ucaaaugcucagacuccugu 369
miR-105
miR-106-a
aaaagugcuuacagugcagguagc 370
miR-106-a
miR-106-b
uaaagugcugacagugcagau 371
miR-106-b
miR-107
agcagcauuguacagggcuauca 372
miR-107
miR-122a
uggagugugacaaugguguuugu 373 miR-122a-1; miR-122a-2
miR-124a
uuaaggcacgcggugaaugcca 374 miR-124a-1; miR-124a-2; miR-124a-3
miR-125a
ucccugagacccuuuaaccugug 375 miR-125a-1; miR-125a-2
miR-125b
ucccugagacccuaacuuguga 376 miR-125b-1; miR-125b-2
miR-126*
cauuauuacuuuugguacgcg 377 miR-126-1; miR-126-2
miR-126
ucguaccgugaguaauaaugc 378 miR-126-1; miR-126-2
miR-127
ucggauccgucugagcuuggcu 379 miR-127-1; miR-127-2
miR-128a
ucacagugaaccggucucuuuu 380 miR-128; miR-128a
miR-128b
ucacagugaaccggucucuuuc 381
miR-128b
miR-129
cuuuuugcggucugggcuugc 382 miR-129-1; miR-129-2
miR-130a
cagugcaauguuaaaagggc 383
miR-130a
miR-130b
cagugcaaugaugaaagggcau 384
miR-130b
miR-132
uaacagucuacagccauggucg 385 miR-132-1
miR-133a
uugguccccuucaaccagcugu 386 miR-133a-1; miR-133a-2
miR-133b
uugguccccuucaaccagcua 387
miR-133b
miR-134
ugugacugguugaccagaggg 388 miR-134-1; miR-134-2
miR-135a
uauggcuuuuuauuccuauguga 389 miR-135a; miR-135a-2 (miR-135-2)
miR-135b
uauggcuuuucauuccuaugug 390
miR-135b
miR-136
acuccauuuguuuugaugaugga 391 miR-136-1; miR-136-2
miR-137
uauugcuuaagaauacgcguag 392
miR-137
miR-138
agcugguguugugaauc 393 miR-138-1; miR-138-2
miR-139
ucuacagugcacgugucu 394
miR-139
miR-140
agugguuuuacccuaugguag 395 miR-140; miR-140as; miR-140s
miR-141
aacacugucugguaaagaugg 396 miR-141-1; miR-141-2
miR-142-3p
uguaguguuuccuacuuuaugga 397 miR-142
miR-142-5p
cauaaaguagaaagcacuac 398 miR-142
miR-143
ugagaugaagcacuguagcuca 399 miR-143-1
miR-144
uacaguauagaugauguacuag 400 miR-144-1; miR-144-2
miR-145
guccaguuuucccaggaaucccuu 401 miR-145-1; miR-145-2
miR-146
ugagaacugaauuccauggguu 402 miR-146-1; miR-146-2
miR-147
guguguggaaaugcuucugc 403
miR-147
miR-148a
ucagugcacuacagaacuuugu 404 miR-148a (miR-148)
miR-148b
ucagugcaucacagaacuuugu 405
miR-148b
miR-149
ucuggcuccgugucuucacucc 406
miR-149
miR-150
ucucccaacccuuguaccagug 407 miR-150-1; miR-150-2
miR-151
acuagacugaagcuccuugagg 408
miR-151
miR-152
ucagugcaugacagaacuugg 409 miR-152-1; miR-152-2
miR-153
uugcauagucacaaaaguga 410 miR-153-1-1; miR-153-1-2; miR-153-21; miR-153-2-2
miR-154
uagguuauccguguugccuucg 411 miR-154-1; miR-154-2
miR-154*
aaucauacacgguugaccuauu 412 miR-154-1; miR-154-2
miR-155
uuaaugcuaaucgugauagggg 413
miR-155
miR-181a
aacauucaacgcugucggugagu 414
miR-181a
miR-181b
aacauucauugcugucgguggguu 415 miR-181b-1; miR-181b-2
miR-181c
aacauucaaccugucggugagu 416
miR-181c
miR-182
uuuggcaaugguagaacucaca 417 miR-182; miR-182as
miR-182*
ugguucuagacuugccaacua 418 miR-182; miR-182as
miR-183
uauggcacugguagaauucacug 419
miR-183
miR-184
uggacggagaacugauaagggu 420 miR-184-1; miR-184-2
miR-185
uggagagaaaggcaguuc 421 miR-185-1; miR-185-2
miR-186
caaagaauucuccuuuugggcuu 422 miR-186-1; miR-186-2
miR-187
ucgugucuuguguugcagccg 423
miR-187
miR-188
caucccuugcaugguggagggu 424
miR-188
miR-189
gugccuacugagcugauaucagu 425 miR-189-1; miR-189-2
miR-190
ugauauguuugauauauuaggu 426 miR-190-1; miR-190-2
miR-191
caacggaaucccaaaagcagcu 427 miR-191-1; miR-191-2
miR-192
cugaccuaugaauugacagcc 428
miR-192
miR-193
aacuggccuacaaagucccag 429 miR-193-1; miR-193-2
miR-194
uguaacagcaacuccaugugga 430 miR-194-1; miR-194-2
miR-195
uagcagcacagaaauauuggc 431 miR-195-1; miR-195-2
miR-196a
uagguaguuucauguuguugg 432 miR-196a; miR-196a-2 (miR196-2)
miR-196b
uagguaguuuccuguugg 433
miR-196b
miR-197
uucaccaccuucuccacccagc 434
miR-197
miR-198
gguccagaggggagauagg 435
miR-198
miR-199a
cccaguguucagacuaccuguuc 436 miR-199a-1; miR-199a-2
miR-199a*
uacaguagucugcacauugguu 437 miR-199a-1; miR-199a-2; miR-199s; miR-199b
miR-199b
cccaguguuuagacuaucuguuc 438
miR-199b
miR-200a
uaacacugucugguaacgaugu 439
miR-200a
miR-200b
cucuaauacugccugguaaugaug 440
miR-200b
miR-200c
aauacugccggguaaugaugga 441
miR-200c
miR-202
agagguauagggcaugggaaga 442
miR-202
miR-203
gugaaauguuuaggaccacuag 443
miR-203
miR-204
uucccuuugucauccuaugccu 444
miR-204
miR-205
uccuucauuccaccggagucug 445
miR-205
miR-206
uggaauguaaggaagugugugg 446 miR-206-1; miR-206-2
miR-208
auaagacgagcaaaaagcuugu 447
miR-208
miR-210
cugugcgugugacagcggcug 448
miR-210
miR-211
uucccuuugucauccuucgccu 449
miR-211
miR-212
uaacagucuccagucacggcc 450
miR-212
miR-213
accaucgaccguugauuguacc 451
miR-213
miR-214
acagcaggcacagacaggcag 452
miR-214
miR-215
augaccuaugaauugacagac 453
miR-215
miR-216
uaaucucagcuggcaacugug 454
miR-216
miR-217
uacugcaucaggaacugauuggau 455
miR-217
miR-218
uugugcuugaucuaaccaugu 456 miR-218-1; miR-218-2
miR-219
ugauuguccaaacgcaauucu 457 miR-219; miR-219-1; miR-219-2
miR-220
ccacaccguaucugacacuuu 458
miR-220
miR-221
agcuacauugucugcuggguuuc 459
miR-221
miR-222
agcuacaucuggcuacugggucuc 460
miR-222
miR-223
ugucaguuugucaaauacccc 461
miR-223
miR-224
caagucacuagugguuccguuua 462
miR-224
miR-296
agggcccccccucaauccugu 463
miR-296
miR-299
ugguuuaccgucccacauacau 464
miR-299
miR-301
cagugcaauaguauugucaaagc 465
miR-301
miR-302a
uaagugcuuccauguuuugguga 466
miR-302a
miR-302b*
acuuuaacauggaagugcuuucu 467 miR-302b
miR-302b
uaagugcuuccauguuuuaguag 468
miR-302b
miR-302c*
uuuaacauggggguaccugcug 469 miR-302c
miR-302c
uaagugcuuccauguuucagugg 470
miR-302c
miR-302d
uaagugcuuccauguuugagugu 471
miR-302d
miR-320
aaaagcuggguugagagggcgaa 472
miR-320
miR-321
uaagccagggauuguggguuc 473
miR-321
miR-323
gcacauuacacggucgaccucu 474
miR-323
miR-324-5p
cgcauccccuagggcauuggugu 475 miR-324
miR-324-3p
ccacugccccaggugcugcugg 476 miR-324
miR-325
ccuaguagguguccaguaagu 477
miR-325
miR-326
ccucugggcccuuccuccag 478
miR-326
miR-328
cuggcccucucugcccuuccgu 479
miR-328
miR-330
gcaaagcacacggccugcagaga 480
miR-330
miR-331
gccccugggccuauccuagaa 481
miR-331
miR-335
ucaagagcaauaacgaaaaaugu 482
miR-335
miR-337
uccagcuccuauaugaugccuuu 483
miR-337
miR-338
uccagcaucagugauuuuguuga 484
miR-338
miR-339
ucccuguccuccaggagcuca 485
miR-339
miR-340
uccgucucaguuacuuuauagcc 486
miR-340
miR-342
ucucacacagaaaucgcacccguc 487
miR-342
miR-345
ugcugacuccuaguccagggc 488
miR-345
miR-346
ugucugcccgcaugccugccucu 489
miR-346
miR-367
aauugcacuuuagcaaugguga 490
miR-367
miR-368
acauagaggaaauuccacguuu 491
miR-368
miR-369
aauaauacaugguugaucuuu 492
miR-369
miR-370
gccugcugggguggaaccugg 493
miR-370
miR-371
gugccgccaucuuuugagugu 494
miR-371
miR-372
aaagugcugcgacauuugagcgu 495
miR-372
miR-373*
acucaaaaugggggcgcuuucc 496 miR-373
miR-373
gaagugcuucgauuuuggggugu 497
miR-373
miR-374
uuauaauacaaccugauaagug 498
miR-374
La presente invención abarca métodos para diagnosticar si un sujeto tiene un cáncer sólido, que comprende medir el nivel de al menos un primer producto génico miR-214 en una muestra de ensayo del sujeto y comparar el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo con el nivel correspondiente del producto génico de miR en una
5 muestra de control. Como se usa en la presente memoria un “sujeto” puede ser cualquier mamífero que tenga, o se sospeche que tiene, un cáncer sólido.
También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, 10 miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos. También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el producto génico de miR es miR-21, miR-191 o miR-17-5p. También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el producto génico de miR no es miR-15a o miR-16-1. También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el producto génico de miR no es miR 159-1 o 15 miR-192. También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el producto génico de miR no es miR186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR
175. También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el producto génico de miR no es miR-21,
20 miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el producto génico de miR no es miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el producto génico de miR no es miR-15a, miR-16-1, miR-182, miR-181, miR-30, miR-15a, miR16-1, miR-15b, miR-16-2, miR-195, miR-34, miR-153, miR-21, miR-217, miR-205, miR-204, miR-211, miR-143, miR
25 96, miR-103, miR-107, miR-129, miR-9, miR-137, miR-217, miR-186.
Los cánceres sólidos pueden ser cualquier cáncer que surja de órganos y tejidos sólidos. Dichos cánceres se asocian normalmente con la formación y/o presencia de masas tumorales y pueden ser carcinomas, sarcomas y linfomas. Los ejemplos específicos de cánceres sólidos que pueden diagnosticarse por los métodos desvelados en 30 la presente memoria incluyen, pero sin limitación, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de estómago (gástrico), cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer bronquial, cáncer testicular, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer peniano, melanoma y otros cánceres de la piel, cáncer de hígado, cáncer esofágico, cánceres de la cavidad oral y faringe (por ejemplo, cáncer de lengua, cáncer de boca), cánceres del sistema digestivo (por ejemplo, cáncer intestinal, cáncer de la vesícula biliar), cánceres de huesos y articulaciones,
35 cánceres del sistema endocrino (por ejemplo, cáncer tiroideo), cáncer de cerebro, cáncer de ojo, cánceres del sistema urinario (por ejemplo, cáncer de riñón, cáncer de la vejiga urinaria), enfermedad de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin. Los cánceres sólidos pueden no ser uno o más de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer pancreático o cáncer gastrointestinal.
40 También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama o cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-210, miR=213 y una combinación de los mismos.
También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de colon, cáncer de
45 estómago, cáncer de próstata o cáncer de páncreas y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo es miR-218-2.
También se desvelan en la presente memoria métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-125b-1, 50 miR-125b-2, miR-145, miR-21 y combinaciones de los mismos. Como alternativa, el cáncer sólido es cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21; miR-29b-2, miR-146, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-10b, miR-145, miR-181a, miR-140, miR-213, miR-29a prec, miR-181b-1, miR-199b, miR-29b-1, miR-130a, miR-155, let-7a-2, miR-205, miR-29c, miR-224, miR-100, miR31, miR-30c, miR-17-5p, miR-210, miR-122a, miR-16-2 y combinaciones de los mismos. Como alternativa, el cáncer 55 sólido puede ser cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b, miR-125b-1, miR-125b-2, let7a-2, let7a-3, let-7d, miR-122a, miR-191, miR206, miR-210, let-7i, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR-29b), miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-194, miR-204, miR-213, let-7f-2, miR-101, miR-128b, miR-136, miR-143, miR-149, miR-191, miR
196-1, miR-196-2, miR-202, miR-103-1, o miR-30c. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-125b-1, let-7a-2, let-7i, miR-100, let-7g, miR-31, miR-32a-1, miR-33b, miR-34a-2, miR-101-1, miR-135-1, miR-142as, miR-142s, miR-144, miR-301, miR-29c, miR-30c, miR106a, o miR-29b-1. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR 5 puede no ser miR-159-1 o miR-192. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto 10 génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-1961, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de mama y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129
15 2, miR-9 o miR-137.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-24-1, miR-29b-2, miR-20a, miR-10a, miR-32, miR-203, miR-106a, miR-17-5p, miR-30c, miR-223, miR-126*, miR-128b, miR-21, miR-24-2, miR20 99b prec, miR-155, miR-213, miR-150, miR-107, miR-191, miR-221, miR-9-3 y combinaciones de los mismos. Como alternativa el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR
192. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b
25 1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR
175. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el cáncer sólido puede
30 ser cáncer de colon y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
También se desvelan en el presente documento métodos en los que el cáncer sólido es cáncer de pulmón y el producto génico de miR en la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-205, miR35 200b, miR-9-1, miR-210, miR-148, miR-141, miR-132, miR-215, miR-128b, let-7g, miR-16-2, miR-129-1/2 prec, miR126*, miR-142-as, miR-30d, miR-30a-5p, miR-7-2, miR-199a-1, miR-127, miR-34a prec, miR-34a, miR-136, miR-202, miR-196-2; miR-199a-2, let-7a-2, miR-124a-1, miR-149, miR-17-5p, miR-196-1 prec, miR-10a, miR-99b prec, miR196-1, miR-199b, miR-191, miR-195, miR-155 y combinaciones de los mismos. Como alternativa el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. Como 40 alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-191, miR-126*, miR-210, miR-155, miR-143, miR-205, miR-126, miR-30a-5p, miR-140, miR-214, miR218-2, miR-145, miR-106a, miR-192, miR-203, miR-150, miR-220, miR-192, miR-224, miR-24-2, miR-212, miR-9, miR-17, miR-124a-1, miR-95, miR-198, miR-216, miR-219-1, miR-197, miR-125a, miR-26a-1, miR-146, miR-199b, let7a-2, miR-27b, miR-32, miR-29b-2, miR-33, miR-181c, miR-101-1, miR-124a-3, miR-125b-1 o let7f-1. Como 45 alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el al menos un producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-182, miR-181, miR-30, miR-15a, miR-143, miR-205, miR-96, miR-103, miR-107, miR-129, miR-137, miR-186, miR-15b, miR-16-2, miR-195, miR-34, miR-153, miR-217, miR-204, miR-211, miR-9, miR-217, let-7a-2 o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser let-7c, let-7g, miR-7-3, miR-210, miR-31, miR-34a-1, miR-a-2, miR-99a, miR-100, miR-125b-2, miR-132, miR-135-1, 50 miR-195, miR-34, miR-123, miR-203. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, 55 miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de pulmón y el producto génico de miR puede no ser
60 miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el al menos un producto génico de miR medido en la muestra de ensayo se puede seleccionar del grupo que consiste en miR-103-1, miR65 103-2, miR-155, miR-204 y combinaciones de los mismos.
En una realización de la presente invención, el miR-214 y al menos un producto génico de miR adicional seleccionado del grupo que consiste en miR-103-2, miR-103-1, miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b-2, miR125b-1, miR-24-1, miR-191, miR-23a, miR-26a-1, miR-125a, miR-130a, miR-26b, miR-145, miR-221, miR-126*, miR16-2, miR-146, miR-99b, miR-128b, miR-155, miR-29b-2, miR-29a, miR-25, miR-16-1, miR-99a, miR-224, miR-30d,
5 miR-92-2, miR-199a-1, miR-223, miR-29c, miR-30b, miR-129-1/2, miR-197, miR-17-5p, miR-30c, miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a-5p, miR-132, miR-181b-1, miR-152 prec, miR-23b, miR-20a, miR-222, miR-27a, miR-92-1, miR21, miR-129-1/2 prec, miR-150, miR-32, mIR-106a, miR-29b-1 y combinaciones de los mismos se usan para diagnosticar cáncer pancreático.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR
15 27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer pancreático y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
En otra realización de la peresente invenciónel producto génico de miR-214 y al menos otro miR adicionalse
25 selecciona del grupo que consiste en let-7d, miR-128a prec, miR-195, miR-203, let-7a-2 prec, miR-34a, miR-20a, miR-218-2, miR-29a, miR-25, miR-95, miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148, miR-191, miR-21, let-7i, miR-198, miR-199a-2, miR-30c, miR-17-5p, miR-92-2, miR-146, miR-181b-1 prec, miR-32, miR-206, miR-184 prec, miR-29a prec, miR-29b-2, miR-149, miR-181b-1, miR-196-1 prec, miR-93-1, miR-223, miR-16-1, miR-101-1, miR124a-1, miR-26a-1, miR-214, miR-27a, miR-24-1, miR-106a, miR-199a-1 y combinaciones de los mismos se usan para diagnosticar el cáncer de próstata.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1,
35 miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR=142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de próstata y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-1292, miR-9 o miR-137.
En una realización adicional de la presente invención, el producto génico de miR-214 y al menos un miR adicional se
45 selecciona del grupo que consiste en miR-223, miR-21, miR-218-2, miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR191, miR-221, miR-125b-2, miR-103-1, miR-214, miR-222, miR-212 prec, miR-125b-1, miR-100, miR-107, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-24-1, miR-99b, miR-33b, miR-24-2 y combinaciones de los mismos, se usa para diagnosticar cáncer de estómago.
También se desvelan métodos en los que el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR-182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, 55 miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215,
o miR-32. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-153-2, miR-202, miR139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el cáncer sólido puede ser cáncer de estómago y el producto génico de miR puede no ser miR-181b, miR-181c, miR-181d, miR-30, miR-15b, miR-16-2, miR-153-1, miR-217, miR-205, miR204, miR-103, miR-107, miR-129-2, miR-9 o miR-137.
El nivel de al menos un producto génico de miR puede medirse en una muestra biológica (por ejemplo, células,
65 tejidos) obtenida del sujeto. Por ejemplo, puede retirarse una muestra tisular (por ejemplo, de un tumor) de un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer sólido por técnicas de biopsia convencionales. Como alternativa, puede
retirarse una muestra sanguínea del sujeto, y pueden aislarse células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos) para extracción de ADN por técnicas convencionales. La muestra de sangre o tejido se obtiene preferentemente del sujeto antes del inicio de la radioterapia, quimioterapia u otro tratamiento terapéutico. Puede obtenerse una muestra de tejido o sangre de control correspondiente de tejidos no afectos del sujeto, de un individuo humano normal o
5 población de individuos normales, o de células cultivadas correspondientes a la mayoría de las células en la muestra del sujeto. La muestra de tejido o sangre de control se procesa después junto con la muestra del sujeto, de modo que los niveles de producto génico de miR producido a partir de un gen de miR dado en células de la muestra del sujeto puede compararse con los niveles de producto génico de miR correspondientes de células de la muestra de control. Puede usarse también un patrón de expresión de miR de referencia para la muestra biológica como un control.
Una alteración (por ejemplo, un aumento o reducción) del nivel de un producto génico de miR en la muestra obtenida del sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de la presencia de un cáncer sólido en el sujeto. El nivel del al menos un producto génico de miR en la 15 muestra de ensayo puede ser mayor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está “regulada positivamente”). Como se usa en la presente memoria, la expresión de un producto génico de miR está “regulada positivamente” cuando la cantidad de producto génico de miR en una muestra celular o tisular de un sujeto es mayor que la cantidad del mismo producto génico en una muestra celular o tisular de control. El nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo puede ser menor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está “regulada negativamente”). Como se usa en la presente memoria, la expresión de un gen de miR está “regulada negativamente” cuando la cantidad de producto génico de miR producida de ese gen en una muestra celular o tisular de un sujeto es menor que la cantidad producida del mismo gen en una muestra celular o tisular de control. La expresión génica de miR relativa en las muestras de control y normales
25 puede determinarse con respecto a uno o más patrones de expresión de ARN. Los patrones pueden comprender, por ejemplo, un nivel de expresión génica de miR cero, el nivel de expresión génica de miR en una línea celular convencional, el nivel de expresión génica de miR en tejidos no afectados del sujeto, o el nivel medio de expresión génica de miR previamente obtenido para una población de controles humanos normales.
El nivel de un producto génico de miR en una muestra puede medirse usando cualquier técnica que sea adecuada para detectar los niveles de expresión de ARN en una muestra biológica. Se conocen bien por los expertos en la materia técnicas adecuadas (por ejemplo, análisis de transferencia de Northern, RT-PCR, hibridación in situ) para determinar los niveles de expresión de ARN en una muestra biológica (por ejemplo, células, tejidos). El nivel de al menos un producto génico de miR puede detectarse usando análisis de transferencia de Northern. Por ejemplo,
35 puede purificarse ARN celular total de células por homogeneización en presencia de tampón de extracción de ácidos nucleicos, seguido de centrifugación. Los ácidos nucleicos se precipitan, y el ADN se retira por tratamiento con DNasa y precipitación. Las moléculas de ARN se separan después por electroforesis en gel en geles de agarosa de acuerdo con técnicas convencionales, y se transfieren a filtros de nitrocelulosa. Después se inmoviliza el ARN en los filtros por calentamiento. Se consigue detección y cuantificación de ARN específico usando sondas de ADN o ARN marcadas de forma apropiada complementarias del ARN en cuestión. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulo 7.
Pueden producirse sondas adecuadas para hibridación de transferencia de Northern de un producto génico de miR dado a partir de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla 1a y Tabla 1b e incluyen, pero sin
45 limitación, sondas que tienen complementariedad de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o completa con un producto génico de miR de interés. Se describen métodos para preparación de sondas de ADN y ARN marcadas, y las condiciones para hibridación de las mismas con secuencias de nucleótidos diana en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulos 10 y 11.
Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede marcarse con, por ejemplo, un radionúclido, tal como 3H, 32P, 33P, 14C
o 35S; un metal pesado; un ligando capaz de actuar como un miembro de par de unión específico para un ligando marcado (por ejemplo, biotina, avidina o un anticuerpo); una molécula fluorescente; una molécula quimioluminiscente; una enzima o similares.
55 Las sondas pueden marcarse a alta actividad específica por el método de traslación de muesca de Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113: 237-251 o por el método de cebadores aleatorios de Fienberg et al. (1983), Anal. Biochem.
132: 6-13. Este último es el método elegido para sintetizar sondas marcadas con 32P de alta actividad específica a partir de ADN monocatenario o de moldes de ARN. Por ejemplo, reemplazando nucleótidos preexistentes con nucleótidos altamente radiactivos de acuerdo con el método de traslación de muescas, es posible preparar sondas de ácido nucleico marcadas con 32P con una actividad específica bastante mayor de 108 cpm/microgramo. Después puede realizarse detección autorradiográfica de la hibridación exponiendo los filtros hibridados a película fotográfica. La exploración densitométrica de las películas fotográficas expuestas a los filtros hibridados proporciona una medición precisa de los niveles de transcrito génico de miR. Usando otro enfoque, los niveles de transcrito génico de
65 miR pueden cuantificarse por sistemas de formación de imágenes computarizada, tales como el Phosphorimager Molecular Dynamics 400-B 2D disponible de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ.
Cuando el marcaje con radionúclidos de sondas de ADN o ARN no es práctico, puede usarse el método de cebadores aleatorios para incorporar un análogo, por ejemplo, el análogo de dTTP 5-(N-(N-biotinil-épsilonaminocaproil)-3-aminoalil)desoxiuridina trifosfato, en la molécula sonda. El oligonucleótido sonda biotinilado puede detectarse por reacción con proteínas de unión a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (por 5 ejemplo, anticuerpos antibiotina) acoplados a colorantes fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.
Además de Northern y otras técnicas de hibridación de ARN, la determinación de los niveles de transcritos de ARN puede conseguirse usando la técnica de hibridación in situ. Esta técnica requiere menos células que la técnica de transferencia de Northern, e implica depositar células completas en un cubreobjetos de microscopio y explorar el contenido de ácido nucleico de la célula con una solución que contenga sondas de ácido nucleico radiactivas o marcadas de otro modo (por ejemplo, ADNc o ARN). Esta técnica es particularmente adecuada para analizar muestras de biopsia tisular de sujetos. La práctica de la técnica de hibridación in situ se describe en más detalle en la Patente de Estados Unidos Nº 5.427.916. Pueden producirse sondas adecuadas para hibridación in situ de un producto génico de miR dado a partir de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla 1a y Tabla 1b,
15 e incluyen, pero sin limitación, sondas que tienen complementariedad de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o completa con un producto génico de miR de interés, como se ha descrito anteriormente.
El número relativo de transcritos génicos de miR en células también puede determinarse por transcripción inversa de transcritos génicos de miR, seguido de amplificación de los transcritos de transcripción inversa por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de los transcritos génicos de miR pueden cuantificarse en comparación con un patrón interno, por ejemplo, el nivel de ARNm de un gen “constitutivo” presente en la misma muestra. Un gen “constitutivo” adecuado para su uso como un patrón interno incluye, por ejemplo, miosina y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Se conocen bien por los expertos en la materia métodos para
25 realizar RT-PCR cuantitativa y semicuantitativa, y variaciones de la misma.
En algunos casos, puede ser deseable determinar simultáneamente el nivel de expresión de una pluralidad de productos génicos de miR diferentes en una muestra. En otros casos, puede ser deseable determinar el nivel de expresión de los transcritos de todos los genes de miR conocidos correlacionados con cáncer. La evaluación de los niveles de expresión específicos de cáncer para cientos de genes o productos génicos de miR consume tiempo y requiere una gran cantidad de ARN total (por ejemplo, al menos 20 µg para cada transferencia de Northern) y técnicas autorradiográficas que requieren isótopos radiactivos.
Para superar estas limitaciones, puede construirse una oligobiblioteca, en formato de microplaca (es decir, una
35 micromatriz), que contenga un conjunto de sondas oligonucleotídicas (por ejemplo, oligodesoxinucleótidos) que son específicas para un conjunto de genes de miR. Usando dicha micromatriz, puede determinarse el nivel de expresión de múltiples microARN en una muestra biológica por transcripción inversa de los ARN para generar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, e hibridarlos para explorar los oligonucleótidos de la micromatriz para generar un perfil de hibridación, o expresión. El perfil de hibridación de la muestra de ensayo puede después compararse con el de una muestra de control para determinar qué microARN tienen un nivel de expresión alterado en células de cáncer sólido. Como se usa en la presente memoria, “oligonucleótido sonda” u “oligodesoxinucleótido sonda” se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana. “Oligonucleótido diana” u “oligodesoxinucleótido diana” se refiere a una molécula para detectar (por ejemplo, mediante hibridación). Por “oligonucleótido sonda específico de miR” u “oligonucleótido sonda específico para un miR” se entiende un
45 oligonucleótido sonda que tiene una secuencia seleccionada para hibridar con un producto génico de miR específico, o con un transcrito inverso del producto génico de miR específico.
Un “perfil de expresión” o “perfil de hibridación” de una muestra particular es esencialmente una identificación del estado de la muestra; aunque dos estados pueden tener cualquier gen particular expresado de forma similar, la evaluación de varios genes permite simultáneamente la generación de un perfil de expresión génica que es único para el estado de la célula. Es decir, el tejido normal puede distinguirse del tejido canceroso (por ejemplo, tumoral), y dentro del tejido canceroso, pueden determinarse diferentes estados de pronóstico (por ejemplo, buenas o malas perspectivas de supervivencia a largo plazo). Comparando los perfiles de expresión de tejido de cáncer sólido en diferentes estados, se obtiene información con respecto a qué genes son importantes (incluyendo regulación tanto 55 positiva como negativa de los genes) en cada uno de estos estados. La identificación de secuencias que se expresan diferencialmente en tejido de cáncer sólido, así como la expresión diferencial que da como resultado diferentes resultados de pronóstico, permiten el uso de esta información de varias maneras. Por ejemplo, puede evaluarse un régimen de tratamiento particular (por ejemplo, para determinar si un fármaco quimioterapéutico actúa para mejorar el pronóstico a largo plazo en un paciente particular). De forma similar, el diagnóstico puede realizarse
o confirmarse comparando muestras de pacientes con perfiles de expresión conocidos. Además, estos perfiles de expresión génica (o genes individuales) permiten la exploración de candidatos farmacológicos que suprimen el perfil de expresión de cáncer sólido o convierten un perfil de pronóstico malo en un perfil de pronóstico mejor.
En consecuencia, la invención proporciona métodos para diagnosticar si un sujeto tiene un cáncer sólido, que
65 comprenden transcribir de forma inversa al menos ARN de miR-214 de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar al menos un oligodesoxinucleótido diana de miR-214, hibridar el oligodesoxinucleótido diana con
una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específico de miARN que incluyen al menos un oligonucleótido sonda específico de ARN de miR-214 para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control o patrón de referencia, en el que una alteración de la señal de ARN del primer miR-214 es
5 indicativa de que el sujeto tiene un cáncer sólido. También se desvelan micromatrices que comprenden oligonucleótidos sonda específicos de miARN para una parte sustancial de todos los miARN humanos conocidos. La micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
La micromatriz puede prepararse a partir de sondas oligonucleotídicas específicas de genes generadas de secuencias de miARN conocidas. La serie puede contener dos sondas oligonucleotídicas diferentes para cada miARN, una que contiene la secuencia activa, madura y la otra que es específica para el precursor del miARN. La
15 serie también puede contener controles, tales como una o más secuencias de ratón que difieren de ortólogos humanos en solamente algunas bases, que pueden actuar como controles para las condiciones de rigurosidad de hibridación. También pueden imprimirse ARNt u otros ARN (por ejemplo, ARNr, ARNm) de ambas especies en la microplaca, proporcionando un control positivo interno, relativamente estable, para hibridación específica. También pueden incluirse en la microplaca uno o más controles apropiados para hibridación no específica. Para este fin, las secuencias se seleccionan basándose en la ausencia de cualquier homología con cualquier miARN conocido.
La micromatriz puede fabricarse usando técnicas conocidas en este campo. Por ejemplo, los oligonucleótidos sonda de una longitud apropiada, por ejemplo, 40 nucleótidos, se modifican con amina 5’ en la posición C6 y se imprimen usando sistemas de micromatrices disponibles en el mercado, por ejemplo, el Microarrayer GeneMachine 25 OmniGrid™ 100 y portaobjetos activados Amersham CodeLink™. El oligómero de ADNc marcado correspondiente a los ARN diana se prepara por transcripción inversa del ARN diana con cebador marcado. Después de la síntesis de primera cadena, los híbridos de ARN/ADN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados preparados de este modo se hibridan después con la microplaca de micromatriz en condiciones de hibridación, por ejemplo, SSPE 6X/formamida 30 % a 25 ºC durante 18 horas, seguido de lavado en TNT 0,75X (Tris HCl/NaCl/Tween 20) a 37 ºC durante 40 minutos. En las posiciones de la serie en las que el ADN sonda inmovilizado reconoce un ADNc diana complementario en la muestra, se produce hibridación. El ADNc diana marcado marca la posición exacta en la serie donde se produce unión, permitiendo la detección y cuantificación automática. El resultado consiste en una lista de acontecimientos de hibridación, que indican la abundancia relativa de secuencias de ADNc específicas, y por lo tanto la abundancia relativa de los miR complementarios correspondientes, en la
35 muestra del paciente. El oligómero de ADNc marcado puede ser un ADNc marcado con biotina, preparado a partir de un cebador marcado con biotina. La micromatriz se procesa después por dirección directa de los transcritos que contienen biotina usando, por ejemplo, conjugado de estreptavidina-Alexa 647, y se explora utilizando métodos de exploración convencionales. Las intensidades de la imagen de cada punto en la serie son proporcionales a la abundancia del miR correspondiente en la muestra del paciente.
El uso de la serie tiene varias ventajas para la detección de expresión de miARN. En primer lugar, la expresión global de varios cientos de genes puede identificarse en la misma muestra en un punto temporal. En segundo lugar, mediante el diseño cuidadoso de las sondas oligonucleotídicas, puede identificarse la expresión de moléculas tanto maduras como precursoras. En tercer lugar, en comparación con análisis de transferencia de Northern, la microplaca
45 requiere una cantidad pequeña de ARN, y proporciona resultados reproducibles usando 2,5 µg de ARN total. El número relativamente limitado de miARN (algunos cientos por especie) permite la construcción de una micromatriz común para varias especies, con sondas oligonucleotídicas distintas para cada una. Dicha herramienta permitiría el análisis de expresión entre especies para cada miR conocido en diversas condiciones.
Además del uso para los ensayos de nivel de expresión cuantitativa de miR específicos, una microplaca que contiene oligonucleótidos sonda específicos de miARN correspondientes a una parte sustancial del miRNoma, preferentemente el miRNoma completo, puede emplearse para llevar a cabo la determinación de perfiles de expresión génica de miR, para análisis de patrones de expresión de miR. Las identificaciones de miR distintas pueden asociarse con marcadores de enfermedad establecidos, o directamente con una patología.
55 De acuerdo con los métodos de realizaciones de perfiles de expresión descritos en la presente memoria, el ARN total de una muestra de un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido) se transcribe de forma inversa cuantitativamente para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana marcados complementarios del ARN en la muestra. Los oligodesoxinucleótidos diana se hibridan después con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra. El resultado es un perfil de hibridación para la muestra que representa el patrón de expresión de miARN en la muestra. El perfil de hibridación comprende la señal de la unión de los oligodesoxinucleótidos diana de la muestra con los oligonucleótidos sonda específicos de miARN en la micromatriz. El perfil puede registrarse como la presencia o ausencia de unión (señal frente a señal cero). Más preferentemente, el perfil registrado incluye la
65 intensidad de la señal de cada hibridación. El perfil se compara con el perfil de hibridación generado de una muestra de control normal, es decir, no cancerosa. Una alteración en la señal es indicativa de la presencia de, o propensión a
desarrollar, cáncer en el sujeto.
Otras técnicas para medir la expresión génica de miR también están dentro de la experiencia de este campo, e incluyen diversas técnicas para medir las tasas de transcripción y degradación de ARN.
5 La presente divulgación también proporciona métodos para determinar el pronóstico de un sujeto con un cáncer sólido, que comprenden medir el nivel de al menos un producto génico de miR que está asociado con un pronóstico particular en un cáncer sólido (por ejemplo, un pronóstico bueno o positivo, un pronóstico malo a adverso), en una muestra de ensayo del sujeto. De acuerdo con estos métodos, una alteración del nivel de un producto génico de miR
10 que está asociado con un pronóstico particular en la muestra de ensayo, en comparación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene un cáncer sólido con un pronóstico particular. El producto génico de miR puede asociarse con un pronóstico adverso (es decir, negativo). Los ejemplos de un pronóstico adverso incluyen, pero sin limitación, baja tasa de supervivencia y rápida progresión de enfermedad. El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse por ARN de transcripción inversa a
15 partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridando los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparando el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control.
20 Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que las alteraciones en el nivel de uno o más productos génicos de miR en células pueden dar como resultado la desregulación de una o más dianas pretendidas para estos miR, lo que puede conducir a la formación de cánceres sólidos. Por lo tanto, la alteración del nivel del producto génico de miR (por ejemplo, reduciendo el nivel de un producto génico de miR que está regulado positivamente en células de cáncer sólido, aumentando el nivel de un producto génico de miR que está regulado negativamente en células de
25 cáncer sólido) puede tratar exitosamente el cáncer sólido.
En consecuencia, la presente divulgación abarca métodos para inhibir la tumorogénesis en un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, un cáncer sólido en el que al menos un producto génico de miR está desregulado (por ejemplo, regulado positivamente, regulado negativamente) en las células cancerosas del sujeto. Cuando el al menos un 30 producto génico de miR aislado está regulado negativamente en las células cancerosas (por ejemplo, miR-145, miR155, miR-218-2), el método comprende administrar una cantidad eficaz del al menos un producto génico de miR aislado o una variante aislada o fragmento biológicamente activo de los mismos, de modo que se inhiba la proliferación de células cancerosas en el sujeto. El producto génico de miR aislado que se administra puede no ser miR-15a o miR-16-1. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR 159-1 o miR-192. Como 35 alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-186, miR-101-1, miR-194, miR-215, miR-106b, miR-25, miR-93, miR-29b, miR-29a, miR-96, miR-182s, miR=182as, miR-183, miR-129-1, let-7a-1, let-7d, let-7f-1, miR-23b, miR-24-1, miR-27b, miR-32, miR-159-1, miR-192, miR-125b-1, let-7a-2, miR-100, miR-196-2, miR-148b, miR-190, miR-21, miR-301, miR-142s, miR-142as, miR-105-1 o miR-175. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-301, miR-142as, miR-142s, miR-194, miR-215 o miR-32. Como alternativa, el producto génico 40 de miR puede no ser miR-148, miR-10a, miR-196-1, miR-152, miR-196-2, miR-148b, miR-10b, miR-129-1, miR-1532, miR-202, miR-139, let-7a, let-7f o let-7d. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-30, miR15b, miR-16-2, miR-217, miR-205, miR-204, miR-103, miR-107, miR-9 y miR-137. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b, miR-125b-1, miR-125b-2, let7a-2, let7a-3, let-7d, miR-122a, miR-191, miR-206, miR-210, let-7i, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR-29b), miR
45 123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-194, miR-204, miR-213, let-7f-2, miR-101, miR-128b, miR-136, miR-143, miR-149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-103-1 o miR-30c. Como alternativa, el producto génico de miR puede no ser miR-21, miR-125b-1, let-7a-2, let-7i, miR-100, let-7g, miR-31, miR-32a-1, miR-33b, miR-34a-2, miR-101-1, miR-135-1, miR-142as, miR-142s, miR-144, miR-301, miR-29c, miR-30c, miR-106a o miR-29b-1.
50 Por ejemplo, cuando un producto génico de miR está regulado negativamente en una célula cancerosa en un sujeto, la administración de una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado al sujeto puede inhibir la proliferación de la célula cancerosa. El producto génico de miR aislado que se administra al sujeto puede ser idéntico al producto génico de miR natural endógeno (por ejemplo, un producto génico de miR mostrado en la Tabla 1a o Tabla 1b) que está regulado negativamente en la célula cancerosa o puede ser una variante o fragmento biológicamente activo del
55 mismo. Como se define en la presente memoria una “variante” de un producto génico de miR se refiere a un miARN que tiene menos de 100 % de identidad con un producto génico de miR natural correspondiente y posee una o más actividades biológicas del producto génico de miR natural correspondiente. Los ejemplos de dichas actividades biológicas incluyen, pero sin limitación, inhibición de la expresión de la molécula de ARN diana (por ejemplo, inhibiendo la traducción de una molécula de ARN diana, modulando la estabilidad de una molécula de ARN diana,
60 inhibiendo el procesamiento de una molécula de ARN diana) e inhibición de un proceso celular asociado con cáncer sólido (por ejemplo, diferenciación celular, crecimiento celular, muerte celular). Estas variantes incluyen variantes de especie y variantes que son la consecuencia de una o más mutaciones (por ejemplo, una sustitución, una deleción, una inserción) en un gen de miR. La variante puede ser al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a un producto génico de miR natural correspondiente.
Como se define en la presente memoria, un “fragmento biológicamente activo” de un producto génico de miR se refiere a un fragmento de ARN de un producto génico de miR que posee una o más actividades biológicas de un producto génico de miR natural correspondiente. Como se ha descrito anteriormente, los ejemplos de dichas actividades biológicas incluyen, pero sin limitación, inhibición de la expresión de una molécula de ARN diana e
5 inhibición de un proceso celular asociado con cáncer sólido. El fragmento biológicamente activo puede ser de al menos aproximadamente 5, 7, 10, 12, 15 o 17 nucleótidos de longitud. Un producto génico de miR aislado puede administrarse a un sujeto en combinación con uno o más tratamientos antineoplásicos adicionales. Los tratamientos antineoplásicos adecuados incluyen, pero sin limitación, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de las mismas (por ejemplo, quimiorradiación).
Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado positivamente en las células cancerosas, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un producto génico de miR, denominado en la presente memoria compuesto de inhibición de la expresión génica de miR, de modo que se inhiba la proliferación de células de cáncer sólido. El al menos un compuesto de
15 inhibición de la expresión de miR es específico para un producto génico de miR seleccionado del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos. Un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR puede administrarse a un sujeto en combinación con uno o más tratamientos antineoplásicos adicionales. Los tratamientos antineoplásicos adecuados incluyen, pero sin limitación, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de los mismos (por ejemplo, quimiorradiación).
Los términos “tratar”, “tratando” y “tratamiento”, como se usan en la presente memoria, se refieren a aliviar síntomas asociados con una enfermedad o afección, por ejemplo, un cáncer sólido, incluyendo prevenir o retardar la aparición
25 de los síntomas de la enfermedad, y/o reducir la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad o afección. Se define que los términos “sujeto”, “paciente” e “individuo” en la presente memoria incluyen animales, tales como mamíferos, incluyendo, pero sin limitación, primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedoras o murinas. Preferentemente el animal es un ser humano.
Como se usa en la presente memoria, una “cantidad eficaz” de un producto génico de miR aislado es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece cáncer sólido. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un producto génico de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y peso del sujeto; el alcance de la penetración de la
35 enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.
Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar. El peso aproximado de una masa tumoral puede determinarse calculando el volumen aproximado de la masa, en la que un centímetro cúbico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado basándose en el peso de una masa tumoral puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-500 microgramos/gramo de masa tumoral. La masa tumoral puede ser de al menos aproximadamente 10 microgramos/gramo de masa tumoral, al menos aproximadamente 60 microgramos/gramo de masa tumoral o al menos aproximadamente 100 microgramos/gramo de masa tumoral.
45 Una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado también puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar. Preferentemente, dichas cantidades eficaces se administran por vía parenteral o por vía entérica, como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado que se administra a un sujeto puede variar de aproximadamente 53.000 microgramos/kilogramo de peso corporal, de aproximadamente 700-1000 microgramos/kg de peso corporal o más de aproximadamente 1000 microgramos/kg de peso corporal.
Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para la administración de un producto génico de miR aislado a un sujeto dado. Por ejemplo, puede administrarse un producto génico de miR al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Como alternativa,
55 puede administrarse un producto génico de miR una vez o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho días, más particularmente de aproximadamente siete a aproximadamente diez días. En un régimen de dosificación particular, se administra un producto génico de miR una vez al día durante siete días. Cuando un régimen de dosificación comprende múltiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz del producto génico de miR administrado al sujeto puede comprender la cantidad total de producto génico administrado durante el régimen de dosificación completo.
Como se usa en la presente memoria, un producto génico de miR “aislado” es uno que se sintetiza, o se altera o retira del estado natural mediante intervención humana. Por ejemplo, un producto génico de miR sintético, o un producto génico de miR parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural, se 65 considera que está “aislado”. Un producto génico de miR aislado puede existir en forma sustancialmente purificada,
o puede existir en una célula en la que se ha suministrado el producto génico de miR. Por lo tanto, un producto
génico de miR que se suministra deliberadamente a, o se expresa en, una célula se considera un producto génico de miR “aislado”. También se considera que un producto génico de miR producido dentro de una célula a partir de una molécula precursora de miR es una molécula “aislada”. Los productos génicos de miR aislados descritos en la presente memoria pueden usarse para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer sólido en un sujeto
5 (por ejemplo, un ser humano).
Pueden obtenerse productos génicos de miR aislados usando varias técnicas convencionales. Por ejemplo, los productos génicos de miR pueden sintetizarse químicamente o producirse recombinantemente usando métodos conocidos en este campo. Los productos génicos de miR pueden sintetizarse químicamente usando fosforamiditas
10 ribonucleosídicas protegidas apropiadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los proveedores comerciales de moléculas de ARN sintéticas o reactivos de síntesis incluyen, por ejemplo, Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, Estados Unidos), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, IL, Estados Unidos), Glen Research (Sterling, VA, Estados Unidos), ChemGenes (Ashland, MA, Estados Unidos) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido).
15 Como alternativa, los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de plásmidos de ADN circulares o lineales recombinantes usando cualquier promotor adecuado. Los promotores adecuados para expresar ARN a partir de un plásmido incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras de pol III de ARN U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los
20 plásmidos recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para expresión de los productos génicos de miR en células cancerosas.
Los productos génicos de miR que se expresan a partir de plásmidos recombinantes pueden aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales. Los productos génicos de miR que se expresan a partir
25 de plásmidos recombinantes también pueden suministrarse a, y expresarse directamente en, las células cancerosas. El uso de plásmidos recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente.
Los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de un plásmido recombinante separado, o pueden
30 expresarse a partir del mismo plásmido recombinante. Los productos génicos de miR pueden expresarse como moléculas precursoras de ARN a partir de un único plásmido, y las moléculas precursoras se procesan en el producto génico de miR funcional por un sistema de procesamiento adecuado, incluyendo, pero sin limitación, sistemas de procesamiento existentes dentro de una célula cancerosa. Otros sistemas de procesamiento adecuados incluyen, por ejemplo, el sistema de lisado celular de Drosophila in vitro (por ejemplo, como se describe en la
35 Solicitud de Patente Publicada en Estados Unidos N 2002/0086356 de Tuschl et al.) y el sistema de RNAsa III de E. coli (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2004/0014113 de Yang et al.).
La selección de plásmidos adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para insertar
40 secuencias de ácido nucleico en el plásmido para expresar los productos génicos, y métodos para suministrar el plásmido recombinante a las células de interés están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9: 1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; y Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508.
45 Un plásmido que expresa los productos génicos de miR puede comprender una secuencia que codifica un ARN precursor de miR bajo el control del promotor intermedio-temprano de CMV. Como se usa en la presente memoria, “bajo el control” de un promotor significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican el producto génico de miR se localizan 3’ del promotor, de modo que el promotor puede iniciar la transcripción de las secuencias
50 codificantes del producto génico de miR.
Los productos génicos de miR también pueden expresarse a partir de vectores virales recombinantes. Se contempla que los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de dos vectores virales recombinantes separados, o del mismo vector viral. El ARN expresado a partir de dos vectores virales recombinantes puede aislarse de sistemas
55 de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales, o puede expresarse directamente en células cancerosas. El uso de vectores virales recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente.
Los vectores virales recombinantes comprenden secuencias que codifican los productos génicos de miR y cualquier
60 promotor adecuado para expresar las secuencias de ARN. Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, las secuencias promotoras de pol III de ARN U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los vectores virales recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión de los productos génicos de miR en una célula cancerosa.
Puede usarse cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias codificantes para los productos génicos de miR; por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociados (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), Rhabdovirus, virus de leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores virales pueden modificarse por seudotipación de los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos superficiales de
5 otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de cápsida viral, según sea apropiado.
Por ejemplo, los vectores lentivirales pueden seudotiparse con proteínas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VSV), rabia, Ébola, Mokola y similares. Pueden realizarse vectores de AAV para dirigirse a células diferentes modificando por ingeniería genética los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápsida. Por ejemplo, un vector de AAV que expresa una cápsida de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina AAV 2/2. Este gen de cápsida de serotipo 2 en el vector de AAV 2/2 puede reemplazarse por un gen de cápsida de serotipo 5 para producir un vector de AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores de AAV que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápsida están dentro de la experiencia de la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz, J. E., et al. (2002), J. Virol. 76: 791-801.
15 La selección de vectores virales recombinantes, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar ARN en el vector, métodos para suministrar el vector viral a las células de interés y recuperación de los productos de ARN expresados están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Domburg (1995), Gene Therapy
2: 301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therapy 1: 5-14; y Anderson (1998), Nature 392: 25-30.
Son vectores virales particularmente adecuados los derivados de AV y AAV. Se describen un vector de AV adecuado para expresar los productos génicos de miR, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para suministrar el vector a células diana, en Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010. Se describen
25 vectores de AAV adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para construir el vector de AAV recombinante y métodos para suministrar los vectores a células diana en Samulski et al. (1987), J. Virol. 61: 30963101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patente de Estados Unidos Nº 5.252.479; Patente de Estados Unidos Nº 5.139.941; Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/13788; y Solicitud de Patente Internacional Nº WO 93/24641. En una realización, los productos génicos de miR se expresan a partir de un único vector de AAV recombinante que comprende el promotor intermedio temprano de CMV.
Un vector viral de AAV recombinante puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifique un ARN precursor de miR en conexión operativa con una secuencia de terminación poliT bajo el control de un promotor de ARN U6 humano. Como se usa en la presente memoria, “en conexión operativa con una secuencia de terminación
35 poliT” significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas con sentido o antisentido están inmediatamente adyacentes a la señal de terminación poliT en la dirección 5’. Durante la transcripción de las secuencias de miR del vector, las señales de terminación poliT actúan para terminar la transcripción.
Como alternativa, puede administrarse al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto que inhibe la expresión de miR. Como se usa en la presente memoria, “inhibir la expresión de miR” significa que la producción del precursor y/o la forma madura, activa del producto génico de miR después del tratamiento es menor que la cantidad producida antes del tratamiento. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si se ha inhibido la expresión de miR en una célula cancerosa, usando, por ejemplo, las técnicas para determinar el nivel de transcrito de miR analizadas anteriormente para el método de diagnóstico. La inhibición puede producirse al nivel de la expresión
45 génica (es decir, inhibiendo la transcripción de un gen de miR que codifica el producto génico de miR) o el nivel de procesamiento (por ejemplo, inhibiendo el procesamiento de un precursor de miR en un miR activo, maduro).
Como se usa en la presente memoria, una “cantidad eficaz” de un compuesto que inhibe la expresión de miR es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece un cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido). Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un compuesto de inhibición de la expresión de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y el peso del sujeto; el alcance de la penetración de la enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.
55 Por ejemplo, una cantidad eficaz del compuesto de inhibición de la expresión puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar, como se describe en la presente memoria. Una cantidad eficaz de un compuesto que inhibe la expresión de miR también puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar, como se describen en la presente memoria.
Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para administrar un compuesto que inhibe la expresión de miR a un sujeto dado.
Los compuesto adecuados para inhibir la expresión génica de miR incluyen ARN bicatenario (tal como ARN de interferencia corto o pequeño o “ARNip”), ácidos nucleicos antisentido y moléculas de ARN enzimático, tales como
65 ribozimas. Cada uno de estos compuestos puede dirigirse a un producto génico de miR dado e interferir con la expresión (por ejemplo, inhibir la traducción, inducir la escisión o destrucción) del producto génico de miR diana.
Por ejemplo, la expresión de un gen de miR dado puede inhibirse induciendo la interferencia de ARN del gen de miR con una molécula de ARN bicatenario (“ARNbc”) aislada que tiene al menos 90 %, por ejemplo al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de homología de secuencia con al menos una parte del producto génico de miR. La molécula de ARNbc puede ser un “ARN de interferencia corto o pequeño” o “ARNip”.
5 El ARNip útil en los presentes métodos comprende ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El ARNip comprende una cadena de ARN con sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria hibridadas entre sí por interacción de formación de pares de bases de Watson-Crick convencionales (en lo sucesivo en la presente memoria “con formación de pares de bases”). La cadena con sentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una secuencia de ácido nucleico contenida dentro del producto génico de miR diana.
Como se usa en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico en un ARNip que es “sustancialmente
15 idéntico” a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana es una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a la secuencia diana, o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleótidos. Las cadenas con sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenarias, complementarias, o pueden comprender una única molécula en la que dos partes complementarias forman pares de bases y están ligadas covalentemente por un área de “horquilla” monocatenaria.
El ARNip también puede ser ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el extremo o los extremos del ARNip o en uno o más nucleótidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen al ARNip resistente a la digestión por nucleasa, o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNip con
25 desoxirribonucleótidos.
Una o ambas cadenas del ARNip también puede comprender un saliente 3’. Como se usa en la presente memoria, un “saliente 3’” se refiere a al menos un nucleótido no emparejado que se extiende desde el extremo 3’ de una cadena de ARN bicatenaria. Por lo tanto, el ARNip puede comprender al menos un saliente 3’ de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) de longitud, de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. El saliente 3’ puede estar presente en ambas cadenas del ARNip, y es de 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3’ de ácido ditimidílico (“TT”) o ácido diuridílico (“uu”).
35 El ARNip puede producirse de forma química o biológica, o puede expresarse a partir de un plásmido recombinante
o vector viral, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2002/0173478 de Gewirtz y en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2004/0018176 de Reich et al.
La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico antisentido. Como se usa en la presente memoria, un “ácido nucleico antisentido” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une a ARN diana por medio de interacciones de ARN-ARN, ARN-ADN o ARN-ácido peptidonucleico, que alteran la actividad del
45 ARN diana. Son ácidos nucleicos antisentido adecuados para su uso en los presentes métodos ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, ARN, ADN, quimeras de ARN-ADN, ácido peptidonucleico (PNA)) que generalmente comprenden una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. El ácido nucleico antisentido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. Se proporcionan secuencias de ácido nucleico para los productos génicos de miR en las Tablas 1a y 1b. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que los ácidos nucleicos antisentido activan RNasa H u otra nucleasa celular que digiere la doble cadena de producto génico de miR/ácido nucleico antisentido.
55 Los ácidos nucleicos antisentido también pueden contener modificaciones de la cadena principal de ácido nucleico o de los restos de azúcar y base (o su equivalente) para potenciar la especificidad diana, resistencia a nucleasa, suministro u otras propiedades relacionadas con la eficacia de la molécula. Dichas modificaciones incluyen restos de colesterol, intercaladores bicatenarios, tales como acridina, o uno o más grupos resistentes a nucleasa.
Pueden producirse ácidos nucleicos antisentido de forma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Están dentro de la experiencia de la técnica métodos ejemplares para producir y ensayar; véase, por ejemplo, Stein y Cheng (1993), Science 261: 1004 y Patente de Estados Unidos Nº 5.849.902 de Woolf et al.
65 La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico enzimático. Como se usa en la presente memoria, un “ácido nucleico enzimático” se refiere a un ácido nucleico que comprende una región de unión
a sustrato que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico contigua de un producto génico de miR, y que es capaz de escindir específicamente el producto génico de miR. La región de unión al sustrato de ácido nucleico enzimático puede ser, por ejemplo, 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. Los ácidos nucleicos
5 enzimáticos también pueden comprender modificaciones en los grupos de base, azúcar y/o fosfato. Un ácido nucleico enzimático ejemplar para su uso en los presentes métodos es una ribozima.
Los ácidos nucleicos enzimáticos pueden producirse de forma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR
10 aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en Werner y Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23: 2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9: 25-31; y Patente de Estados Unidos Nº 4.987.071 de Cech et al.
La administración de al menos un producto génico de miR, o al menos un compuesto para inhibir la expresión de
15 miR, inhibirá la proliferación de células cancerosas en un sujeto que tiene un cáncer sólido. Como se usa en la presente memoria, “inhibir la proliferación de una célula cancerosa” significa destruir la célula, o detener permanente
o temporalmente o ralentizar el crecimiento de la célula. La inhibición de la proliferación de células cancerosas puede inferirse si el número de dichas células en el sujeto permanece constante o se reduce después de la administración de los productos génicos de miR o los compuestos de inhibición de la expresión del gen de miR. Una
20 inhibición de la proliferación de células cancerosas puede también inferirse si el número absoluto de dichas células aumenta, pero la tasa de crecimiento tumoral disminuye.
El número de células cancerosas en el cuerpo de un sujeto puede determinarse por medición directa, o mediante estimación del tamaño de las masas tumorales primaras o metastásicas. Por ejemplo, el número de células
25 cancerosas en un sujeto puede medirse por métodos inmunohistológicos, citometría de flujo, u otras técnicas diseñadas para detectar marcadores de superficie característicos de células cancerosas.
El tamaño de una masa tumoral puede determinarse por observación visual directa, o por métodos de formación de imágenes de diagnóstico, tales como rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética, ultrasonidos y
30 escintigrafía. Pueden emplearse métodos de formación de imágenes de diagnóstico usados para determinar el tamaño de la masa tumoral con o sin agentes de contraste, como se conoce en la técnica. El tamaño de una masa tumoral también puede determinare por medios físicos, tales como palpación de la masa tisular o medición de la masa tisular con un instrumento de medición, tal como un calibrador.
35 Los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR pueden administrarse a un sujeto por cualquier medio adecuado para suministrar estos compuestos a células cancerosas del sujeto. Por ejemplo, los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión de miR pueden administrarse por métodos adecuados para transfectar células del sujeto con estos compuestos, o con ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican estos compuestos. Las células se transfectan con un vector plasmídico o viral
40 que comprende secuencias que codifican al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR.
Se conocen bien en la técnica métodos de transfección para células eucariotas e incluyen, por ejemplo, inyección directa del ácido nucleico en el núcleo o pronúcleo de una célula; electroporación; transferencia de liposomas o
45 transferencia mediada por materiales lipófilos; suministro de ácidos nucleicos mediado por receptor, biobalística o aceleración de partículas; precipitación con fosfato cálcico y transfección mediada por vectores virales.
Por ejemplo, las células pueden transfectarse con un compuesto de transferencia liposómico, por ejemplo, DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio metilsulfato, Boehringer-Mannheim) o un equivalente, tal como
50 LIPOFECTINA. La cantidad de ácido nucleico usada no es crítica; pueden conseguirse resultados aceptables con 0,1-100 microgramos de ácido nucleico/105 células. Por ejemplo, puede usarse una relación de aproximadamente 0,5 microgramos de vector plasmídico en 3 microgramos de DOTAP por cada 105 células.
También puede administrarse un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR a
55 un sujeto por cualquier vía de administración entérica o parenteral adecuada. Las vías de administración entéricas adecuadas para los presentes métodos incluyen, por ejemplo, suministro oral, rectal o intranasal. Las vías de administración parenterales adecuadas incluyen, por ejemplo, administración intravascular (por ejemplo, inyección de embolada intravenosa, infusión intravenosa, inyección de embolada intraarterial, infusión intraarterial e instilación por catéter en la vasculatura); inyección peri e intratisular (por ejemplo, inyección peritumoral e intratumoral,
60 inyección intrarretinal o inyección subretinal); inyección o deposición subcutánea, incluyendo infusión subcutánea (tal como por bombas osmóticas); aplicación directa al tejido de interés, por ejemplo por un catéter y otro dispositivo de colocación (por ejemplo, un gránulo retinal o un supositorio o un implante que comprenda un material poroso, no poroso o gelatinoso); e inhalación. Son vías de administración particularmente adecuadas inyección, infusión e inyección directa en el tumor.
En los presentes métodos, puede administrarse un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión de producto génico de miR al sujeto como ARN desnudo, en combinación con un reactivo de suministro, o como un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido recombinante o vector viral) que comprende secuencias que expresan el producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión del producto génico de miR. Los
5 reactivos de suministro adecuados incluyen, por ejemplo, el reactivo lipófilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (por ejemplo, polilisina) y liposomas.
Se analizan en la presente memoria y/o se conocen bien en la técnica plásmidos recombinantes y vectores virales que comprenden secuencias que expresan los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR, y técnicas para suministrar dichos plásmidos y vectores a células cancerosas.
Se usan liposomas para suministrar un producto génico de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a un sujeto. Los liposomas también pueden aumentar la semivida en sangre de los productos génicos o ácidos nucleicos. Pueden formarse liposomas 15 adecuados a partir de lípidos formadores de vesículas convencionales, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros o cargados negativamente y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía por la consideración de factores, tales como el tamaño de liposoma deseado y la semivida de los liposomas en el torrente sanguíneo. Se conocen diversos métodos para preparar liposomas, por ejemplo, como se describe en Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; y Patentes de Estados Unidos Nº 4.235.871, 4.501.728,
4.837.028 y 5.019.369.
Los liposomas para su uso en los presentes métodos pueden comprender una molécula ligando que dirige el liposoma a células cancerosas. Se prefieren ligandos que se unan a receptores prevalentes en células cancerosas, tales como anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos celulares tumorales.
25 Los liposomas para su uso en los presentes métodos también pueden modificarse para evitar la eliminación por el sistema de macrófagos mononucleares (“MMS”) y el sistema reticuloendotelial (“RES”). Dichos liposomas modificados tienen restos de inhibición de la opsonización en la superficie o incorporados en la estructura del liposoma. Un liposoma puede comprender tanto un resto de inhibición de la opsonización como un ligando.
Los restos inhibidores de la opsonización para su uso en la preparación de los liposomas son normalmente polímeros hidrófilos grandes que se unen a la membrana del liposoma. Como se usa en la presente memoria, un resto inhibidor de opsonización está “unido” a una membrana del liposoma cuando está química o físicamente unido a la membrana, por ejemplo, por la intercalación de un anclaje soluble en lípidos en la membrana en sí misma, o por
35 unión directamente con grupos activos de lípidos de membrana. Estos polímeros hidrófilos inhibidores de opsonización forman una capa superficial protectora que reduce significativamente la captación de los liposomas por el MMS y RES; por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.920.016.
Los restos inhibidores de opsonización adecuados para modificar liposomas son preferentemente polímeros solubles en agua con un peso molecular medio en número de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 Dalton, y más preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 Dalton. Dichos polímeros incluyen derivados de polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG); por ejemplo, metoxi PEG o PPG y estearato de PEG o PPG; polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida o poli N-vinil pirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas
o dendriméricas; ácidos poliacrílicos; polialcoholes, por ejemplo, polivinilalcohol y polixilitol a los que se unen
45 químicamente grupos carboxílicos o amino, así como gangliósidos, tales como gangliósido GM1. También son adecuados copolímeros de PEG, metoxi PEG o metoxi PPG o derivados de los mismos. Además, el polímero inhibidor de opsonización puede ser un copolímero en bloque de PEG y un poliamino ácido, polisacárido, poliamidoamina, polietilenamina o polinucleótido. Los polímeros inhibidores de opsonización también pueden ser polisacáridos naturales que contienen aminoácidos o ácidos carboxílicos, por ejemplo, ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido manurónico, ácido hialurónico, ácido péctico, ácido neuramínico, ácido algínico, carragenina; polisacáridos u oligosacáridos aminados (lineales o ramificados); o polisacáridos u oligosacáridos carboxilados, por ejemplo, que han reaccionado con derivados de ácidos carbónicos con enlace resultante de grupos carboxílicos. Preferentemente, el resto de inhibición de la opsonización es un PEG, PPG o un derivado de los mismos. Los liposomas modificados con PEG o derivados de PEG se denominan en ocasiones “liposomas PEGilados”.
55 El resto inhibidor de la opsonización puede estar unido a la membrana del liposoma por una cualquiera de numerosas técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida de PEG puede estar unido a un anclaje soluble en lípidos de fosfatidiletanolamina, y después unido a una membrana. De forma similar, un polímero de dextrano puede derivatizarse con un anclaje soluble en lípidos de estearilamina mediante aminación reductora usando Na(CN)BH3 y una mezcla de disolvente, tal como tetrahidrofurano y agua en una relación 30:12 a 60 ºC.
Los liposomas modificados con restos inhibidores de opsonización permanecen en la circulación durante mucho más tiempo que los liposomas no modificados. Por esta razón, dichos liposomas se denominan en ocasiones liposomas “sigilosos”. Se sabe que los liposomas sigilosos se acumulan en tejidos alimentados por microvasculatura porosa o 65 “filtrante”. Por lo tanto, el tejido caracterizado por dichos defectos de microvasculatura, por ejemplo, tumores sólidos, acumularán eficazmente estos liposomas; véase Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18: 6949-53.
Además, la captación reducida por el RES reduce la toxicidad de los liposomas sigilosos evitando la acumulación significativa de los liposomas en el hígado y el bazo. Por lo tanto, los liposomas que se modifican con restos inhibidores de la opsonización son particularmente adecuados para suministrar los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a células tumorales.
Los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR pueden formularse como composiciones farmacéuticas, denominadas en ocasiones “medicamentos”, antes de administrarlos a un sujeto, de acuerdo con técnicas conocidas en este campo. En consecuencia, la presente divulgación abarca composiciones farmacéuticas para tratar un cáncer sólido. La composición farmacéutica puede comprender al menos un producto génico de miR aislado, o una variante aislada o fragmento biológicamente activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El al menos un producto génico de miR puede corresponder a un producto génico de miR que tiene un nivel reducido de expresión en células de cáncer sólido en relación con células de control adecuadas, El producto génico de miR aislado puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-218-2 o combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR. El al menos un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR puede ser específico para un gen de miR cuya expresión es mayor en células de cáncer sólido que en células de control. El compuesto de inhibición de la expresión génica de miR es específico para uno o más productos génicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a y combinaciones de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas se caracterizan como al menos estériles y sin pirógenos. Como se usa en la presente memoria, las “composiciones farmacéuticas” incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Los métodos para preparar las composiciones farmacéuticas están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo como se describe en Remington’s Pharmaceutical Science, 17ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).
Las presentes composiciones farmacéuticas comprenden al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) (por ejemplo, de 0,1 a 90 % en peso), o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos, mezclados con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente uno o más agentes antineoplásicos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos). Las formulaciones farmacéuticas también pueden comprender al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican), que están encapsulados por liposomas y un vehículos farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un gen o producto génico de miR que no es miR-15 y/o miR-16.
Son vehículos farmacéuticamente aceptables especialmente adecuados agua, agua tamponada, solución salina normal, solución salina 0,4 %, glicina 0,3 %, ácido hialurónico y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que es resistente a la degradación por nucleasas. Un experto en la materia puede sintetizar fácilmente ácidos nucleicos que son resistentes a nucleasa, por ejemplo, incorporando uno o más ribonucleótidos que se modifican en la posición 2’ en el producto génico de miR. Los ribonucleótidos modificados 2’ adecuados incluyen los modificados en la posición 2’ con fluoro, amino, alquilo, alcoxi y O-alilo.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también excipientes y/o aditivos farmacéuticos convencionales. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen estabilizadores, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, tampones y agentes de ajuste de pH. Los aditivos adecuados incluyen, por ejemplo, tampones fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato de trometamina), adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida) o complejos de quelado de calcio (tales como, por ejemplo, DTPA de calcio, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo cloruro cálcico, ascorbato cálcico, gluconato cálcico o lactato cálcico). Las composiciones farmacéuticas pueden envasarse para su uso en forma líquida, o pueden liofilizarse.
Para composiciones farmacéuticas sólidas, pueden usarse vehículos farmacéuticamente aceptables sólidos no tóxicos convencionales; por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.
Por ejemplo, una composición farmacéutica sólida para administración oral puede comprender cualquiera de los vehículos y excipientes enumerados anteriormente y 10-95 %, preferentemente 25 %-75 %, del al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican). Una composición farmacéutica para administración por aerosol (de inhalación) puede comprender 0,01-20 % en peso, preferentemente 1 %-10 % en peso, del al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) encapsulado en un liposoma como se ha descrito anteriormente, y un propulsor. También puede incluirse un vehículo según se desee; por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además uno o más agentes antineoplásicos. Las composiciones comprenden al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) y al menos un agente quimoterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos que son adecuados para los métodos desvelados en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes de ADN, agentes antibióticos antitumorales, agentes antimetabólicos, agentes estabilizadores de tubulina, agentes desestabilizadores de tubulina, agentes antagonistas de hormonas, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de proteína quinasa, inhibidores de HMG-CoA, inhibidores de CDK, inhibidores de ciclina, inhibidores de caspasa, inhibidores de metaloproteinasa, ácidos nucleicos antisentido, ADN de triple hélice, aptámeros de ácidos nucleicos y agentes virales, bacterianos y exotóxicos modificados molecularmente. Los ejemplos de agentes adecuados para las composiciones incluyen, pero sin limitación, arabinósido de citidina, metotrexato, vincristina, etopósido (VP-16), doxorrubicina (adriamicina), cisplatino (CDDP), dexametasona, arglabina, ciclofosfamida, sarcolisina, metilnitrosourea, fluorouracilo, 5-fluorouracilo (5FU), vinblastina, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, peróxido de hidrógeno, oxaliplatino, irinotecán, topotecán, leucovorina, carmustina, estreptozocina, CPT-11, taxol, tamoxifeno, dacarbacina, rituximab, daunorrubicina, 1-β-Darabinofuranosilcitosina, imatinib, fludarabina, docetaxel, FOLFOX4.
También se desvelan métodos para identificar un inhibidor de tumorogénesis, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR en la célula. El método comprende proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en células cancerosas. Un aumento del nivel del producto génico de miR de la célula después de que se proporcione el agente, en relación con una célula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente), es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. Al menos un producto génico de miR asociado con los niveles de expresión reducidos en células cancerosas puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-155, miR-218-2 y combinaciones de los mismos.
Como alternativa, el método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión aumentados en células cancerosas. Una reducción del nivel del producto génico de miR en la célula después de que se proporciones el agente, en relación con una célula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente) es indicativa de que el agente de ensayo es un inhibidor de tumorogénesis. Al menos un producto génico de miR que puede estar asociado con niveles de expresión aumentados en células cancerosas se selecciona del grupo que consiste en miR-21, miR-175p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a.
Los agentes adecuados incluyen, pero sin limitación fármacos (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos) y macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos). El agente puede producirse de forma recombinante, sintética o puede aislarse (es decir purificarse) de una fuente natural. Se conocen bien en la técnica diversos métodos para proporcionar dichos agentes a una célula (por ejemplo, transfección), y varios de dichos métodos se han descrito anteriormente en la presente memoria. También se conocen bien en la técnica métodos para detectar la expresión de al menos un producto génico de miR (por ejemplo, transferencia de Northern, hibridación in situ, RT-PCR, perfiles de expresión). Varios de estos métodos también se han descrito anteriormente en la presente memoria.
La invención se ilustrará ahora por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplificación
Los siguientes Materiales y Métodos se usaron en los Ejemplos:
Muestras
Se usaron un total de 540 muestras, incluyendo 363 muestras de tumores primarios y 177 tejidos normales, en este estudio (Tabla 2). Se representaron los siguientes cánceres sólidos: carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de próstata, carcinoma de estómago, carcinoma de colon y tumores endocrinos pancreáticos. Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado de cada paciente y se confirmaron histológicamente. Las muestras normales se emparejaron con muestras de individuos aquejados de carcinoma de pulmón y estómago, y de individuos normales para el resto de los tejidos. Todas las muestras de mama normales se obtuvieron agrupando 5 tejidos normales no relacionados. El ARN total se aisló de tejidos usando reactivo TRIzol™ (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones de fabricante.
Micromatrices de microARN
Se realizó análisis de micromatrices como se ha descrito previamente (Liu, C.-G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101: 11755-11760 (2004)). Brevemente, se usaron 5 µg de ARN total para la hibridación en microplacas de
5 micromatrices de miARN. Estas microplacas contienen sondas oligonucleotídicas de 40 unidades específicas de gen, aplicadas puntualmente por tecnologías de contacto y unidas covalentemente a una matriz polimérica. Las micromatrices se hibridaron en SSPE 6x (NaCl 0,9 M/NaH2PO4 60 mM ⋅ H2O/EDTA 8 mM, pH 7,4)/formamida 30 % a 25 ºC durante 18 h, se lavaron en TNT 0,75x (Tris⋅HCl/NaCl/Tween 20) a 37 ºC durante 40 minutos, y se procesaron usando detección directa en los transcritos marcados con biotina por conjugado de estreptavidina-Alexa647
10 (Molecular Probes). Los portaobjetos procesados se exploraron usando un explorador de micromatrices (GenePix Pro, Axon), con el láser ajustado a 635 nm, a ajustes de PMT fijos y una resolución de exploración de 10 mm. Los datos se confirmaron por transferencia de Northern como se describe (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101: 11755-11760 (2004); Iorio, M. V., et al., Cancer Res. 65: 7065-7070 (2005)).
15 Tabla 2. Muestras usadas en el estudio (tumores y normales correspondientes).
Tipo de tumor Muestras de cáncer Muestras Normales
Carcinoma de pulmón 123 123 Carcinoma de mama 79 6* Carcinoma de colon 46 8 Carcinoma gástrico 20 21 Tumores pancreáticos endocrinos 39 12 Cáncer de próstata 56 7 Todos los tejidos (527) 363 177
* Grupos de 5 tejidos de mama normales no relacionados por muestra (para un total de 30 individuos no relacionados).
Análisis computacional
Se analizaron imágenes de micromatrices usando GenePix Pro (Axon). De los valores medios de los puntos
20 repetidos de cada miARN se restó el fondo, se normalizaron y se sometieron a análisis adicional. Se realizó normalización usando un método de normalización de mediana por microplaca, usando la mediana de la serie como una referencia. Finalmente, se seleccionaron los miARN medidos como presentes en al menos la menor de la dos clases en un conjunto de datos. Las ausencias tuvieron un umbral de 4,5 antes del análisis estadístico. Este nivel es el nivel de intensidad mínimo medio detectado en los experimentos. La nomenclatura de microARN fue de acuerdo
25 con el Buscador del Genoma (www.genome.ucsc.edu) y la base de datos de microARN en el Centro Sanger (Griffiths-Jones, S., Nucleic Acids Res 32: D109-11(2004)); en caso de discrepancias los inventores siguieron la base de datos de microARN. Se identificaron microARN expresados diferencialmente usando el procedimiento de ensayo de t dentro de análisis significativo de micromatrices (SAM) (Tusher, V. G., et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 5116-21 (2001). SAM calcula una puntuación para cada gen basándose en el cambio de la expresión en relación
30 con la desviación típica de todas las mediciones. Dentro de SAM, se usó el ensayo de t. Los distintivos de microARN se determinaron aplicando el método de centroides hundidos más cercanos. Este método identifica un subgrupo de genes que caracteriza mejor cada cáncer sólido de su homólogo normal respectivo. Se calculó el error de predicción por medio de validación cruzada 10 veces, y para cada cáncer se obtuvo el distintivo de miR que daba como resultado el error mínimo de predicción. Se realizó un ensayo de nueva toma de muestras por análisis de
35 permutación aleatoria para calcular el p valor del distintivo compartido.
Ejemplo 1: Identificación de un distintivo de expresión de microARN en cánceres sólidos humanos
Estadística
40 La comparación de cánceres combinados/tejido normal se realizó usando un número reducido de muestras de pulmón (80 muestras de cáncer y 40 normales), para equilibrar los diferentes tejidos numéricamente, produciendo un total de 404 muestras. Para análisis estadístico, se retuvieron 137 miR, cuyos valores de expresión estaban por encima de 256 (valor umbral) en al menos 50 % de las muestras, de las 228 que se midieron. Se usó un ensayo de
45 T para identificar microARN expresados diferencialmente (Tabla 3). Los p valores del ensayo de T se corrigieron para múltiples procedimientos de ensayo y para controlar las tasas de error de Tipo I. Se obtuvieron p valores ajustados realizando una nueva toma de muestras con 500.000 permutaciones (Jung, S. H., et al. Biostatistics 6: 157-69 (2005)). Este análisis se realizó para evaluar los resultados usando el mismo método que Lu y colaboradores (Lu, J., et al., Nature 435: 834-8(2005)).
50 Como una alternativa al ensayo de T, se usó análisis de significación de micromatrices (SAM) para identificar microARN expresados diferencialmente. Este procedimiento permite el control de la tasa de detección falsa (FDR). El delta se eligió para dar como resultado una FDR menor de o igual a 0,01. Después se identificaron los subconjuntos de microARN que daban como resultado la mejor clasificación tumoral, es decir, que predecían mejor
55 las dos clases (cáncer y normal), usando el método de los centroides hundidos más cercanos, como se implementa en PAM (análisis de predicción de micromatrices). Se calculó el error de predicción por medio de validación cruzada 10 veces. Los microARN se seleccionaron produciendo el error de clasificación equivocada mínimo después de validación cruzada.
5 Resultados
Por el ensayo de T, se obtuvieron 43 miR expresados diferencialmente con un p valor ajustado por debajo de 0,05 (Tabla 3). Se sobreexpresaron 26 miR y 17 se infraexpresaron en relación con tejidos normales correspondientes cuando los seis cánceres sólidos se agruparon entre sí (mama, colon, pulmón, páncreas, próstata, estómago). Estos 10 resultados indicaron que el espectro de miARN expresados en cánceres sólidos es muy diferente del de células normales (43 de 137 miARN, 31 %). Usando SAM, se identificaron 49 miARN expresados diferencialmente, de los cuales 34 estaban regulados positivamente (Tabla 4). Usando PAM, se identificaron 36 miARN sobreexpresados en cáncer (indicado por puntuaciones de cáncer positivas) y 21 miR regulados negativamente (indicados por puntuaciones de cáncer negativas) como expresados diferencialmente (Tabla 5). Sin embargo, estos análisis no
15 están adaptados para identificar alteraciones en la expresión de miR que da como resultado uniformemente transformación, debido a que la expresión de miR es muy específica de tejido (He, L., et al. Nature 435: 828-833 (2005); véase también FIG. 1 y FIG. 2).
El agrupamiento de miR basado en perfiles de expresión derivados de 363 muestras de cáncer sólido y 177
20 normales usando 228 miR se muestra en la FIGURA 1. El árbol, que muestra una muy buena separación entre los diferentes tejidos, se construyó usando 137 miARN diferentes que se expresaron en al menos 50 % de las muestras usadas en el estudio.
Tabla 3. miR regulados diferencialmente en 6 tipos de cáncer sólido frente a tejidos normales (estadística de ensayo 25 de T)*. miR ID Media de Cáncer Media Normal Estadística de ensayo p sin procesar p Aj
miR-21 Nº 47 11,538663 9,648338 7,861136 2,00E-06 2,00E-06 miR-141 Nº 137 9,024091 7,905398 6,238014 2,00E-06 2,00E-06 miR-212 Nº 208 13,540651 14,33617 -6-57942 2,00E-06 2,00E-06 miR-128a prec Nº 113 12,32588 13,522675 -6,76388 2,00E-06 2,00E-06 miR-138-2 Nº 133 11,739557 13,144746 -7,01204 2,00E-06 2,00E-06 miR-218-2 Nº 121 11,279787 12,539366 -7,40557 2,00E-06 2,00E-06 miR-23b Nº 51 14,169748 15,949736 -8,37744 2,00E-06 2,00E-06 miR-195 Nº 184 10,343991 9,172985 5,763262 2,00E-06 1,00E-05 miR-212 prec Nº 209 12,686966 13,661763 -5,83132 4,00E-06 1,00E-05 miR-29b-2 Nº 95 11,27556 9,940731 5,660854 2,00E-06 1,40E-05 miR-199a-1 Nº 191 10,032008 8,920183 5,528849 2,00E-06 3,00E-05 miR-9-3 Nº 28 11,461922 12,570412 -5,43006 2,00E-06 4,60E-05 miR-128a Nº 114 13,024235 13,856624 -5,35102 6,00E-06 7,20E-05 let-7a-1 Nº 1 12,616569 13,455246 -5,35346 2,00E-06 7,20E-05 let-7b Nº 5 13,42636 14,068521 -5,17701 1,00E-05 0,000146 miR-16-2 Nº 39 10,460707 9,305895 5,048375 4,00E-06 0,000224 miR-199a-2 Nº 192 9,714225 8,759237 4,862553 1,00E-05 0,000494 miR-152 prec Nº 151 11,388676 12,357529 -4,83716 2,00E-06 0,00053 miR-16-1 Nº 38 10,443169 9,338182 4,755258 1,00E-05 0,00071
miR-30d Nº 72 13,982017 14,775206 -4,5707 1,20E-05 0,001476 miR-34n Nº 78 10,675566 9,63769 4,467301 2,60E-05 0,00217 miR-17-5p Nº 41 11,567244 10,281468 4,341834 3,80E-05 0,0034
miR-128b Nº 115 10,930395 9,947746 4,304764 3,80E-05 0,003912 miR-20a Nº 46 11,409852 10,19284 4,304678 3,20E-05 0,003912 miR-181b-1 prec Nº 211 9,577504 8,804294 4,285968 4,80E-05 0,004126 miR-132 Nº 121 9,599947 8,775966 4,284737 5,60E-05 0,004126 miR-200b Nº 195 9,475221 8,527243 4,221511 4,00E-05 0,0052 let-7a-3 Nº 4 10,436089 9,511546 4,08952 0,000104 0,008242
miR-138-1 Nº 132 8,299613 9,200253 -4,05204 5,60E-05 0,00931 miR-29c Nº 65 11,291005 10,326912 4,019385 0,000144 0,010312 miR-29a Nº 62 11,381359 10,461075 4,013697 0,00015 0,010398
miR-96
Nº 86 11,37218 12,136636 -3,94825 0,000138 0,012962
miR-191
Nº 177 13,498207 12,729872 3,817228 0,000158 0,02015
miR-27a
Nº 59 10,399338 9,548582 3,715048 0,000344 0,028096
let-7g
Nº 15 10,819688 10,01157 3,653239 0,000426 0,033874
miR-9-1
Nº 24 10,102819 9,212988 3,651886 0,000388 0,033874
miR-125a
Nº 107 10,960998 10,005312 3,651356 0,000452 0,033874
miR-95
Nº 84 9,435733 8,751331 3,59406 0,000478 0,039594
miR-155
Nº 157 12,505359 13,231221 -3,58369 0,000614 0,040394
miR-199b
Nº 194 9,755066 9,082751 3,55934 0,000588 0,04314
miR-24-2
Nº 54 12,611696 11,612557 3,518774 0,00087 0,048278
let-7e
Nº 11 12,497795 13,055093 -3,51589 0,00054 0,048354
miR-92-1
Nº 81 16,081074 16,592426 -3,50446 0,000928 0,49828
* -Cuarenta y tres miR tienen un p valor ajustado menor de 0,05. Veintiséis miR están sobreexpresados y 17 regulados negativamente en carcinomas de mama, colon, pulmón, páncreas, próstata, estómago.
Tabla 4. miR regulados diferencialmente en 6 tipos de cáncer sólido frente a tejidos normales (SAM, análisis de significación de micromatrices)*. miR ID Valor d. devtip Valor p Valor q Factor de R
miR-21
Nº 47 3,156 0,24 0 0 2,593
miR-23b
Nº 51 -3,117 0,212 0 0 0,443
miR-138-2
Nº 133 -2,514 0,2 0 0 0,402
miR-218-2
Nº 221 -2,383 0,17 0 0 0,384
miR-29b-2
Nº 95 2,246 0,236 0 0 1,868
miR-128ª prec
Nº 113 -2,235 0,177 0 0 0,368
miR-195
Nº 184 2,085 0,203 0 0 1,695
miR-141
Nº 137 2,08 0,179 0 0 2,459
miR-199a-1
Nº 191 1,987 0,201 0 0 1,945
miR-9-3
Nº 28 -1,97 0,204 0 0 0,433
miR-16-2
Nº 39 1,966 0,229 0 0 1,788
miR-17-5p
Nº 41 1,964 0,296 0 0 0,725
miR-20a
Nº 46 1,898 0,283 0 0 0,969
miR-16-1
Nº 38 1,87 0,232 0 0 1,447
miR-212 prec
Nº 209 -1,854 0,167 0 0 0,509
miR-34a
Nº 78 1,756 0,232 0 0 1,219
miR-152 prec
Nº 151 -1734 0,2 0 0 0,46
miR-199a-2
Nº 192 1,721 0,196 0 0 1,838
miR-128b
Nº 115 1,674 0,238 0 0 1,266
miR-212
Nº 208 1,659 0,121 0 0 0,627
let-7a-1
Nº 1 -1,628 0,157 0 0 0,461
miR-200b
Nº 195 1,626 0,225 0 0 1,432
miR-128a
Nº 114 -1,619 0,156 0 0 0,511
miR-29c
Nº 65 1,611 0,24 0 0 1,225
let-7a-3
Nº 4 1,581 0,226 0 0 1,109
miR-29a
Nº 62 1,565 0,229 0 0 1,706
miR-24-2
Nº 54 1,555 0,284 0 0 0,831
miR-138-1
Nº 132 1,551 0,222 0 0 0,432
miR-125a
Nº 107 1,541 0,262 0 0 1,164
miR-106a
Nº 99 1,514 0,275 0 0 0,952
miR-132
Nº 121 1,496 0,192 0 0 2,158
miR-20d
Nº 72 -1,491 0,174 0 0 0,424
miR-9-1
Nº 24 1,478 0,244 0 0 0,763
miR-27a
Nº 59 1,448 0,229 0 0 1,174
miR-181b-1 prec
Nº 211 1,435 0,18 0 0 1,525
let-7g
Nº 15 1,394 0,221 0 0 1,072
miR-96
Nº 86 -1,384 0,194 0 0 0,519
miR-191
Nº 177 1,372 0,201 0 0 1,165
miR-93-1
Nº 83 1,363 0,266 0 0 0,775
miR-136
Nº 130 -1,355 0,267 0 0 0,364
miR-205
Nº 201 1,343 0,309 0 0 1,281
miR-185
Nº 170 1,287 0,222 0,001 0,001 0,609
miR-125b-1
Nº 109 1,262 0,283 0,001 0,001 1,215
miR-10a
Nº 30 1,252 0,227 0,001 0,001 1,643
miR-95
Nº 84 1,247 0,19 0,001 0,001 1,509
miR-199b
Nº 194 1,228 0,189 0,001 0,001 1,246
miR-10b
Nº 32 1,219 0,232 0,002 0,001 1,342
let-7i
Nº 10 1,216 0,203 0,002 0,001 1,026
miR-210
Nº 205 1,213 0,237 0,002 0,001 1,088
* -Treinta y cinco miR están sobreexpresados y 14 están regulados negativamente en carcinomas de mama, colon, pulmón, páncreas, próstata, estómago (Delta = 0,9, FDR=0,001).
Tabla 5. MicroARN seleccionados por PAM (análisis de predicción de micromatriz) en 6 tipos de cáncer sólido frente a tejidos normales miR ID Puntuación de cáncer sólido Puntuación de tejidos normales
miR-21 miR-138-2 miR-218-2 miR-23b miR-128a prec miR-29b-2 miR-195 miR-17-5p miR-9-3 miR-212 prec miR-20a miR-141 miR-199a-1 miR-16-2 miR-152 prec miR-16-1 miR-34a miR-212 let-7a-1 miR-128a miR-128b miR-24-2 miR-29c miR-199a-2 let-7a-3 miR-191 miR-125a miR-30d miR-29a miR-106a miR-93-1 miR-200b let-7g miR-27a miR-96 let-7b miR-138-1 miR-9-1 miR-181b-1 prec miR-155 miR-132 miR-136 Nº 47 Nº 133 Nº 221 Nº 51 Nº 113 Nº 95 Nº 184 Nº 41 Nº 28 Nº 209 Nº 46 Nº 137 Nº 191 Nº 39 Nº 151 Nº 38 Nº 78 Nº 208 Nº 1 Nº 114 Nº 115 Nº 54 Nº 65 Nº 192 Nº 4 Nº 177 Nº 107 Nº 72 Nº 62 Nº 99 Nº 83 Nº 195 Nº 15 Nº 59 Nº 86 Nº 5 Nº 132 Nº 24 Nº 211 Nº 157 Nº 121 Nº 130 0,0801 -0,055 -0,0535 -0,0516 -0,0498 0,0457 0,0404 0,0383 -0,0357 -0,0342 0,0322 0,0322 0,0319 0,0315 -0,0283 0,0277 0,0269 -0,0265 -0,0264 -0,0259 0,0254 0,0244 0,0224 0,0223 0,0221 0,0188 0,0186 -0,0185 0,0184 0,0177 0,0163 0,0159 0,0158 0,0157 -0,0156 -0,0152 -0,0151 0,0136 0,0134 -0,0128 0,0127 -0,0112 -0,2643 0,1815 0,1765 0,17 0,1642 -0,1508 -0,1333 -0,1263 0,1176 0,1129 -0,1061 -0,1061 -0,1053 -0,1037 0,0933 -0,0913 -0,0886 0,0875 0,0872 0,0855 -0,0839 -0,0803 -0,0738 -0,0736 -0,073 -0,062 -0,0613 0,061 -0,0608 -0,0584 -0,0537 -0,0524 -0,0521 -0,0518 0,0514 0,0501 0,0499 -0,0448 -0,0442 0,0423 -0,0418 0,037 * -T=1.5 y error de clasificación equivocada = 0,176. Treinta y seis miR sobreexpresados en cáncer están indicados por puntuaciones de cáncer positivas; 21 miR regulados negativamente están indicados por puntuaciones de cáncer negativas.
let-7i
Nº 10 0,0103 -0,034
miR-210
Nº 205 0,0074 -0,0245
miR-205
Nº 201 0,0073 -0,024
*. miR-185
Nº 170 0,0071 -0,0234
miR-24-1
Nº 52 0,007 -0,023
miR-199b
Nº 194 0,0064 -0,021
miR-125b-1
Nº 109 0,006 -0,0199
miR-206 prec
Nº 203 -0,005 0,0166
miR-10a
Nº 30 0,0045 -0,015
miR-95
Nº 84 0,0045 -0,0149
let-7c
Nº 11 -0,0039 0,013
miR-124a-3
Nº 106 -0,0028 0,0091
miR-10b
Nº 32 0,002 -0,0066
miR-185 prec.
Nº 171 -0,0014 0,0047
miR-92-1
Nº 81 -2,00E-04 5,00E-04
Ejemplo 2: Identificación de distintivos de expresión de microARN asociados con diversos cánceres sólidos humanos.
5 Resultados
Para identificar microARN que son pronóstico de estado de cáncer asociado con tumores sólidos, sin incurrir en una desviación debido a la especificidad de tejido, se usó un enfoque alternativo. En primer lugar, se obtuvieron seis distintivos específicos de tejido, uno para cada histotipo de cáncer, realizando ensayos de PAM independientes 10 (resumidos en las Tablas 6 y 7). Se muestran distintivos específicos para cada cáncer en las Tablas 8-13: por ejemplo, mama-Tabla 8; colon-Tabla 9; pulmón-Tabla 10; páncreas-Tabla 11; próstata-Tabla 12; estómago-Tabla 13. Usando estos datos, se identificaron microARN desregulados que se compartían entre los distintivos de miARN de diferentes histotipos (Tabla 14). Para calcular los p valores para este análisis comparativo, se realizó un ensayo de nueva toma de muestras con 1.000.000 de permutaciones aleatorias sobre la identidad del miARN. El p valor se
15 definió como la frecuencia relativa de puntuaciones de simulación que sobrepasaban la puntuación real. Se identificaron 21 microARN regulados erróneamente que eran comunes de al menos 3 tipos de cánceres sólidos (p valor = 2,5x10-3) (Tabla 14).
Tabla 6. MicroARN usados para clasificar cánceres humanos y tejidos normales*.
Cáncer miR regulados miR regulados Error de clasificación equivocada después de positivamente negativamente validación cruzada 10 veces
Mama 15 12 0,08 Colon 21 1 0,09 Pulmón 35 3 0,31 Páncreas 65 2 0,02 Próstata 39 6 0,11 Estómago 22 6 0,19
* -Se realizó normalización de la mediana y se usó el método de los centroides hundidos más cercanos para seleccionar miARN predictivos.
Tabla 7. microARN desregulados en cánceres comunes sólidos*.
Cáncer Regulados Regulados Regulados Regulados positivamente por PAM positivamente por SAM negativamente por PAM negativamente por SAM
Mama 15 3 (FDR=0,33) 12 47 Colon 21 42 (FDR<=0,06) 1 5 Pulmón 35 38 (FDR<=0,01) 3 3 Páncreas 55 50 (FDR<=0,01) 2 8 Estómago 22 22 (FDR=0,06) 6 4 Próstata 39 49 (FDR=0,06) 6 3
* -El análisis de predicción de micromatrices (PAM) identifica los genes que caracterizan mejor cánceres y tejidos normales, mientras que el análisis de significación de micromatrices (SAM) identifica los que tienen expresión diferencial en las dos clases. Las tasas de detección falsa (FDR) calculadas en SAM se indican entre paréntesis.
Tabla 8. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de micromatriz (PAM) en cáncer de mama (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-21 (Nº 47) 0,0331 -0,4364 miR-29b-2 (Nº 95) 0,0263 -0,3467 miR-146 (Nº 144) 0,0182 -0,2391 miR-125b-2 (Nº 111) -0,0174 0,2286 miR-125b-1 (Nº 109) -0,0169 0,222 miR-10b (Nº 32) -0,0164 0,2166 miR-145 (Nº 143) -0,0158 0,2076 miR-181a (Nº 158) 0,0153 -0,201 miR-140 (Nº 136) -0,0122 0,1613 miR-213 (Nº 160) 0,0116 -0,1527 miR-29a prec (Nº 63) 0,0109 -0,1441 miR-181b-1 (Nº 210) 0,0098 -0,1284 miR-199b (Nº 194) 0,0089 -0,1172 miR-29b-1 (Nº 64) 0,0084 -0,1111 miR-130a (Nº 120) -0,0076 0,1001 miR-155 (Nº 157) 0,0072 -0,0951 let-7a-2 (Nº 3) -0,0042 0,0554 miR-205 (Nº 201) -0,004 0,0533 miR-29c (Nº 65) 0,0032 -0,0423 miR-224 (Nº 228) -0,003 0,0399 miR-100 (Nº 91) -0,0021 0,0283 miR-31 (Nº 73) 0,0017 -0,022 miR-30c (Nº 70) -7,00E-04 0,009 miR-17-5p (Nº 41) 7,00E-04 -0,0089 miR-210 (Nº 205) 4,00E-04 -0,0057 miR-122a (Nº 101) 4,00E-04 -0,005 miR-16-2 (Nº 39) -1,00E-04 0,0013
* 27 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,008. Diecisiete miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 12 miR regulados negativamente se indican por puntuaciones de cáncer negativas.
Tabla 9. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de micromatriz (PAM) en colon (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-24-1 (Nº 52) 0,0972 -0,5589 miR-29b-2 (Nº 95) 0,0669 -0,3845 miR-20a (Nº 46) 0,0596 -0,3424 miR-10a (Nº 30) 0,0511 -0,2938 miR-32 (Nº 75) 0,0401 -0,2306 miR-203 (Nº 197) 0,0391 -0,2251 miR-106a (Nº 99) 0,0364 -0,2094 miR-17-5p (Nº 41) 0,0349 -0,2005 miR-30c (Nº 70) 0,0328 -0,1888 miR-223 (Nº 227) 0,0302 -0,1736 miR-126* (Nº 102) 0,0199 -0,1144 miR-128b (Nº 115) 0,0177 -0,102 miR-21 (Nº 47) 0,0162 -0,0929 miR-24-2 (Nº 54) 0,0145 -0,0835 miR-99b prec (Nº 88) 0,0125 -0,0721 miR-155 (Nº 157) 0,0092 -0,0528 miR-213 (Nº 160) 0,0091 -0,0522 miR-150 (Nº 148) 0,0042 -0,0243 miR-107 (Nº 100) 0,003 -0,0173 miR-191 (Nº 177) 0,0028 -0,0159
miR-221 (Nº 224) 0,002 -0,0116 miR-9-3 (Nº 28) -0,0014 0,0083
* 22 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,09. Veintiún miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 1 miR regulado negativamente se indica por una puntuación de cáncer negativa
Tabla 10. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de micromatriz (PAM) en cáncer de pulmón (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-21 (Nº 47) 0,175 -0,175 miR-205 (Nº 201) 0,1317 -0,1317 miR-200b (Nº 195) 0,1127 -0,1127 miR-9-1 (Nº 24) 0,1014 -0,1014 miR-210 (Nº 205) 0,0994 -0,0994 miR-148 (Nº 146) 0,0737 -0,0737 miR-141 (Nº 137) 0,0631 -0,0631 miR-132 (Nº 121) 0,0586 -0,0586 miR-215 (Nº 213) 0,0575 -0,0575 miR-128b (Nº 115) 0,0559 -0,0559 let-7g (Nº 15) 0,0557 -0,0557 miR-16-2 (Nº 39) 0,0547 -0,0547 miR-129-1/2 prec (Nº 118) 0,0515 -0,0515 miR-126 (Nº 102) -0,0406 0,0406 miR-142-as (Nº 139) 0,0366 -0,0366 miR-30d (Nº 72) -0,0313 0,0313 miR-30a-5p (Nº 66) -0,0297 0,0297 miR-7-2 (Nº 21) 0,0273 -0,0273 miR-199a-1 (Nº 191) 0,0256 -0,0256 miR-127 (Nº 112) 0,0254 -0,0254 miR-34a prec (Nº 79) 0,0214 -0,0214 miR-34a (Nº 78) 0,0188 -0,0188 miR-136 (Nº 130) 0,0174 -0,0174 miR-202 (Nº 196) 0,0165 -0,0165 miR-196-2 (Nº 188) 0,0134 -0,0134 miR-199a-2 (Nº 192) 0,0126 -0,0126 let-7a-2 (Nº 3) 0,0109 -0,0109 miR-124a-1 (Nº 104) 0,0081 -0,0081 miR-149 (Nº 147) 0,0079 -0,0079 miR-17-5p (Nº 41) 0,0061 -0,0061 miR-196-1 prec (Nº 186) 0,0053 -0,0053 miR-10a (Nº 30) 0,0049 -0,0049 miR-99b prec (Nº 88) 0,0045 -0,0045 miR-196-1 (Nº 185) 0,0044 -0,0044 miR-199b (Nº 194) 0,0039 -0,0039 miR-191 (Nº 177) 0,0032 -0,0032 miR-195 (Nº 184) 7,00E-04 -7,00E-04 miR-155 (Nº 157) 7,00E-04 -7,00E-04
* 38 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,31. Treinta y cinco miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 3 miR regulados negativamente se indican por una puntuaciones de cáncer negativas.
Tabla 11. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de micromatriz (PAM) en cáncer pancreático (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-103-2 (Nº 96) 0,4746 -1,582 miR-103-1 (Nº 97) 0,4089 -1,3631 miR-24-2 (Nº 54) 0,4059 -1,3529 miR-107 (Nº 100) 0,3701 -1,2336 miR-100 (Nº 91) 0,3546 -1,182 miR-125b-2 (Nº 111) 0,3147 -1,0489 miR-125b-1 (Nº 109) 0,3071 -1,0237 miR-24-1 (Nº 52) 0,2846 -0,9488 miR-191 (Nº 177) 0,2661 -0,887 miR-23a (Nº 50) 0,2586 -0,8619 miR-26a-1 (Nº 56) 0,2081 -0,6937 miR-125a (Nº 107) 0,1932 -0,644 miR-130a (Nº 120) 0,1891 -0,6303 miR-26b (Nº 58) 0,1861 -0,6203 miR-14 (Nº 143) 0,1847 -0,6158 miR-221 (Nº 224) 0,177 -0,59 miR-126* (Nº 102) 0,1732 -0,5772 miR-16-2 (Nº 39) 0,1698 -0,5659 miR-146 (Nº 144) 0,1656 -0,552 miR-214 (Nº 212) 0,1642 -0,5472 miR-99b (Nº 89) 0,1636 -0,5454 miR-128b (Nº 115) 0,1536 -0,512 miR-155 (Nº 157) -0,1529 0,5098 miR-29b-2 (Nº 95) 0,1487 -0,4956 miR-29a (Nº 62) 0,1454 -0,4848 miR-25 (Nº 55) 0,1432 -0,4775 miR-16-1 (Nº 38) 0,1424 -0,4746 miR-99a (Nº 90) 0,1374 -0,4581 miR-224 (Nº 228) 0,1365 -0,4549 miR-30d (Nº 72) 0,1301 -0,4336 miR-92-2 (Nº 82) 0,116 -0,3865 miR-199a-1 (Nº 191) 0,1158 -0,3861 miR-223 (Nº 227) 0,1141 -0,3803 miR-29c (Nº 65) 0,113 -0,3768 miR-30b (Nº 68) 0,1008 -0,3361 miR-129-1/2 (Nº 117) 0,1001 -0,3337 miR-197 (Nº 189) 0,0975 -0,325 miR-17-5p (Nº 41) 0,0955 -0,3185 miR-30c (Nº 70) 0,0948 -0,316 miR-7-1 (Nº 19) 0,0933 -0,311 miRs-93-1 (Nº 83) 0,0918 -0,3061 miR-140 (Nº 136) 0,0904 -0,3015 miR-30a-5p (Nº 66) 0,077 -0,2568 miRs-132 (Nº 121) 0,0654 -0,2179 miR-181b-1 (Nº 210) 0,0576 -0,1918 miR-152 prec (Nº 151) -0,0477 0,1591 miR-23b (Nº 51) 0,0469 -0,1562 miR-20a (Nº 46) 0,0452 -0,1507 miRs-222 (Nº 225) 0,0416 -0,1385 miR-27a (Nº 59) 0,0405 -0,1351 miRs-92-1 (Nº 81) 0,0332 -0,1106 miRs-21 (Nº 47) 0,0288 -0,0959 miR-129-112 prec (Nº 118) 0,0282 -0,0939 miR-150 (Nº 148) 0,0173 -0,0578 miR-32 (Nº 75) 0,0167 -0,0558 miR-106a (Nº 99) 0,0142 -0,0473 miR-29b-1 (Nº 64) 0,0084 -0,028
* 57 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,02. Cincuenta y siete miR se sobreexpresan y 2 se regulan negativamente en cáncer (indicado por puntuaciones positivas y negativas, respectivamente).
Tabla 12. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de micromatriz (PAM) en cáncer de próstata (cáncer frente a tejidos normales)*. miR Puntuación de cáncer Puntuación normal
let-7d (Nº 8)
0,0528 -0,4227
miR-128a prec (Nº 113)
-0,0412 0,3298
miR-195 (Nº 184)
0,04 -0,3199
miR-203 (Nº 197)
0,0356 -0,2851
let-7a-2 prec (Nº 2)
-0,0313 0,2504
miR-34a (Nº 78)
0,0303 -0,2428
miR-20a (Nº 46)
0,029 -0,2319
miR-218-2 (Nº 221)
-0,0252 0,2018
miR-29a (Nº 62)
0,0247 -0,1978
miR-25 (Nº 55)
0,0233 -0,1861
miR-95 (Nº 84)
0,0233 -0,1861
miR-197 (Nº 189)
0,0198 -0,1587
miR-135-2 (Nº 128) 0,0198 -0,1582 miR-187 (Nº 173) 0,0192 -0,1535 miR-196-1 (Nº 185) 0,0176 -0,1411 miR-148 (Nº 146) 0,0175 -0,1401 miR-191 (Nº 177) 0,017 -0,136 miR-21 (Nº 47) 0,0169 -0,1351 let-7i (Nº 10) 0,0163 -0,1303 miR-198 (Nº 190) 0,0145 -0,1161 miR-199a-2 (Nº 192) 0,0136 -0,1088 miR-30c (Nº 70) 0,0133 -0,1062 miR-11-5p (Nº 41) 0,0132 -0,1053 miR-92-2 (Nº 82) 0,012 -0,0961 miR-146 (Nº 144) 0,0113 -0,0908 miR-181b-1 prec (Nº 211) 0,011 -0,0878 miR-32 (Nº 75) 0,0109 -0,0873 miR-206 (Nº 202) 0,0104 -0,083 miR-184 prec (Nº 169) 0,0096 -0,0764 miR-29a prec (Nº 63) -0,0095 0,076 miR-29b-2 (Nº 95) 0,0092 -0,0739 miR-149 (Nº 147) -0,0084 0,0676 miR-181b-1 (Nº 210) 0,0049 -0,0392 miR-196-1 prec (Nº 186) 0,0042 -0,0335 miR-93-1 (Nº 83) 0,0039 -0,0312 miR-223 (Nº 227) 0,0038 -0,0308 miR-16-1 (Nº 38) 0,0028 -0,0226 miR-101-1 prec (Nº 92) 0,0015 -0,0123 miR-124a-1 (Nº 104) 0,0015 -0,0119
miR-26a-1 (Nº 56) 0,0015 -0,0119 miR-214 (Nº 212) 0,0013 -0,0105 miR-27a (Nº 59) 0,0011 -0,0091 miR-24-1 (Nº 53) -8,00E-04 0,0067 miR-106a (Nº 99) 7,00E-04 -0,0057 miR-199a-1 (Nº 191) 4,00E-04 -0,0029
* -T=1, 45 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,11. Treinta y nueve miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 6 miR regulados negativamente se indican por puntuaciones de cáncer negativas.
Tabla 13. MicroARN seleccionados por análisis de predicción de micromatriz (PAM) en cáncer de estómago (cáncer frente a tejidos normales)*.
miR
Puntuación de cáncer Puntuación normal
miR-223 (Nº 227)
0,1896 -0,1806
miR-21 (Nº 47)
0,1872 -0,1783
miR-218-2 (Nº 221)
-0,1552 0,1478
miR-103-2 (Nº 96)
0,1206 -0,1148
miR-92-2 (Nº 82)
0,1142 -0,1088
miR-25 (Nº 55)
0,1097 -0,1045
miR-136 (Nº 130)
-0,1097 0,1045
miR-191 (Nº 177)
0,0946 -0,0901
miR-221 (Nº 224)
0,0919 -0,0876
miR-125b-2 (Nº 111)
0,0913 -0,0869
miR-103-1 (Nº 97)
0,0837 -0,0797
miR-214 (Nº 212)
0,0749 -0,0713
miR-222 (Nº 225)
0,0749 -0,0713
miR-212 prec (Nº 209)
-0,054 0,0514
miR-125b-1 (Nº 109)
0,0528 -0,0503
miR-100 (Nº 91)
0,0526 -0,0501
miR-107 (Nº 100)
0,0388 -0,0369
miR-92-1 (Nº 81)
0,0369 -0,0351
miR-96 (Nº 86)
-0,0306 0,0291
miR-192 (Nº 178)
0,0236 -0,0224
miR-23a (Nº 50)
0,022 -0,021
miR-215 (Nº 213)
0,0204 -0,0194
miR-7-2 (Nº 21)
0,0189 -0,018
miR-138-2 (Nº 133)
-0,0185 0,0176
miR-24-1 (Nº 52)
0,0151 -0,0144
miR-99b (Nº 89)
0,0098 -0,0093
miR-33b (Nº 76)
-0,0049 0,0046
miR-24-2 (Nº 54)
0,0041 -0,0039
* -T=1, 28 miR seleccionados, error de clasificación equivocada después de validación cruzada de 0,19. Veintidós miR sobreexpresados en cáncer se indican por puntuaciones de cáncer positivas; 6 miR regulados negativamente se indican por puntuaciones de cáncer negativas.
Tabla 14. Los microARN compartidos por los distintivos de los 6 cánceres sólidos*.
miR
N Tipo de Tumor
miR-21
6 Mama Colon Pulmón Páncreas Próstata Estómago
miR-17-5p
5 Mama Colon Pulmón Páncreas Próstata
miR-191
5 Colon Pulmón Páncreas Próstata Estómago
miR-29b-2
4 Mama Colon Páncreas Próstata
miR-223
4 Colon Páncreas Próstata Estómago
miR-128b
3 Colon Pulmón Páncreas
miR-199a-1
3 Pulmón Páncreas Próstata
miR-24-1
3 Colon Páncreas Estómago
miR-24-2
3 Colon Páncreas Estómago
miR-146
3 Mama Páncreas Próstata
miR-155
3 Mama Colon Pulmón
miR-181b-1
3 Mama Páncreas Próstata
miR-20a
3 Colon Páncreas Próstata
miR-107
3 Colon Páncreas Estómago
miR-32
3 Colon Páncreas Próstata
miR-92-2
3 Páncreas Próstata Estómago
miR-214
3 Páncreas Próstata Estómago
miR-30c
3 Colon Páncreas Próstata
miR-25
3 Páncreas Próstata Estómago
miR-221
3 Colon Páncreas Estómago
miR-106a
3 Colon Páncreas Próstata
* -La lista incluye 21 microARN regulados positivamente habitualmente en 3 o más (N) tipos de cánceres sólidos (p valor = 2,5x10-3).
Para maximizar la concisión, se calcularon los niveles de expresión absolutos medios de los miR desregulados para 5 los 6 pares de cáncer/normal. Usando el nivel de expresión de los miR en el subconjunto exhaustivo, los diferentes tejidos se clasificaron correctamente independientemente de su estado de enfermedad (FIGURA 3).
La FIGURA 4 muestra la expresión diferencial de los microARN comunes entre los diferentes tejidos tumorales, en relación con los tejidos normales. El árbol presenta los diferentes tipos de cáncer según el factor de cambio en el
10 subconjunto de miARN. Los tejidos de próstata, colon, estómago y pancreático son más similares entre ellos, mientras que los tejidos de pulmón y de mama se representaron por un distintivo bastante diferente (FIGURA 4). Este árbol claramente muestra qué miARN están asociados con un histotipo de cáncer particular.
Sorprendentemente, miR-21, miR-191 y miR-17-5p están significativamente sobreexpresados en todos, o en 5 de 6,
15 de los tipos tumorales que se consideraron. Se indicó que miR-21 estaba sobreexpresado en glioblastoma y que tenía propiedades antiapoptóticas (Chan, J. A., et al., Cancer Res. 65: 6029-6033 (2005)). El cáncer de pulmón comparte una parte de su distintivo con el cáncer de mama y una parte con los otros tumores sólidos, incluyendo miR-17/20/92, los tres de los cuales son miembros del grupo de microARN que coopera activamente con c-Myc para acelerar la linfomagénesis (He, L., et al., Nature 435: 828-833 (2005)). La identificación de estos microARN como sobreexpresados es una excelente confirmación del enfoque de los inventores. Un segundo grupo de miARN que está activado incluye miR-210 y miR-213, junto con miR-155, que ya se había indicado que estaba amplificado en linfomas de células grandes (Eis, P. S., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 102: 3627-3632 (2005)), niños con linfoma de Burkitt (Metzler, M., et al., Genes Chromosomes Cancer 39: 167-169 (2004)) y diversos linfomas de linfocitos B (Kluiver, J, et al., J. Pathol., publicado digitalmente en línea, 22 de julio de 2005). Estos microARN son los únicos regulados positivamente en cáncer de mama y pulmón. miR-218-2 está uniformemente regulado negativamente en cánceres de colon, estómago, próstata y páncreas, pero no en carcinomas de pulmón y mama.
Varias observaciones refuerzan estos resultados. En primer lugar, en el presente estudio, los niveles de expresión tanto del pre-miARN precursor como del miARN maduro se determinaron para la mayoría de los genes. Debe observarse que con la excepción de miR-212 y miR-128a, en todos los otros casos, la región expresada de forma anómala era la correspondiente al producto génico activo. En segundo lugar, como se muestra en la FIGURA 3, la variación de expresión de los miARN en el subconjunto exhaustivo era con frecuencia unívoca (concretamente regulación positiva o negativa) entre los diferentes tipos de cánceres, lo que sugiere un mecanismo común en la tumorogénesis humana. En tercer lugar, los datos de micromatrices se validaron por hibridación de solución para 12 muestras de mama (miR-125b, miR-145 y miR-21; Iorio, M. V., et al., Cancer Res. 65: 7065-7070 (2005)) y 17 muestras normales y pancreáticas endocrinas (miR-103, miR-155 y miR-204; datos no mostrados), lo que confirma fuertemente la precisión de los datos de micromatrices.
Ejemplo 3: Identificación de dianas predichas para microARN que están desregulados en tumores sólidos.
Materiales y métodos:
Predicciones de diana de oncogén y supresor de tumores
Se usaron las predicciones de TargetScan más recientes (Abril de 2005) para identificar dianas de microARN potenciales. Estas incluyen esencialmente las dianas de UTR 3’ indicadas por Lewis et al. (Lewis, B. P., et al, Cell
120: 15-20 (2005)), con algunos cambios que surgen de las definiciones de límite génico actualizadas del mapeo del Buscador de Genoma de UCSC de Abril de 2005 de los ARNm RefSeq para el ensamblaje de genoma humano hg17. Entre las dianas potenciales, se especificaron genes de cáncer conocidos (supresores de tumores y oncogenes) de acuerdo con su identificación en el Censo Génico del Cáncer, al que puede accederse en el sitio de Internet www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/, o como se indica por OMIM en www.ncbi.nlm.nih.gov.
Ensayos in vitro de diana
Para experimentos de indicador de luciferasa, se amplificaron segmentos UTR 3’ de Rb1, TGFBR2 y Plag1 que se predice que interaccionarán con microARN asociados con cáncer específico por PCR a partir de ADN genómico humano y se insertaron en el vector de control pGL3 (Promega) usando el sitio XbaI inmediatamente cadena abajo del codón de terminación de la luciferasa. La línea celular megacariocítica humana, MEG-01, se cultivó en FBS 10 % en medio RPMI 1640, complementado con aminoácido no esencial 1x y 1 mmol de piruvato sódico a 37 ºC en una atmósfera humidificada de CO2 5 %. Las células se cotransfectaron en placas de 12 pocillos usando siPORT neoFX (Ambion, Austin, TX), de acuerdo con el protocolo del fabricante, con 0,4 µg del vector indicador de luciferasa de luciérnaga y 0,08 µg del vector de control que contiene luciferasa de Renilla, pRL-TK (Promega). Para cada pocillo, se usaron oligonucleótidos de microARN (Dharmacon Research, Lafayette, CO) y oligonucleótidos antisentido o mezclados (Ambion) a una concentración de 10 nM. Las actividades de luciferasa de luciérnaga y Renilla se midieron consecutivas a las 24 horas después de la transfección usando ensayos de luciferasa dobles (Promega).
Transferencia de Western para RB1
Los niveles de proteína RB1 se cuantificaron usando un anticuerpo anti-RB1 monoclonal de ratón (Santa Cruz, CA) usando procedimientos convencionales para transferencia de Western. La normalización se realizó con anticuerpo anti Actina monoclonal de ratón (Sigma).
Resultados
Es necesario entender la importancia funcional de la desregulación del microARN en cáncer. En tumores sólidos, parece que el acontecimiento de microARN más habitual es la ganancia de expresión, mientras que la pérdida de expresión en cáncer es un acontecimiento más limitado, y más específico de tejido. Los inventores usaron un enfoque consecuente de tres etapas en el siguiente orden: en primer lugar, predicción informática de dianas, después ensayo de luciferasa para la primera validación de dianas relevantes para cáncer y, finalmente, correlación de tumor ex vivo entre la expresión del miARN (por micromatriz) y expresión de proteína diana (por transferencia de Western) para un par de interacción miARN:ARNm específico. Las dianas relevantes para miARN de cáncer podrían ser genes de cáncer recesivos (por ejemplo, supresores de tumores) o dominantes (por ejemplo, oncogenes). Para ensayar la hipótesis de que los microARN que se desregulan en tumores sólidos se dirigen a oncogenes o supresores de tumores conocidos, las dianas predichas para estos miARN se determinaron usando Target-Scan, una base de datos de dianas de microARN de UTR 3’ conservadas (Lewis, B. P., et al, Cell 120: 15-20 (2005)). TargetScan contenía 5.121 predicciones para 18 miARN que están desregulados en tumores sólidos, en las 22.402 predicciones totales (26,5 %). Se predijeron ciento quince de 263 (44 %) genes de cáncer bien conocidos como
5 dianas para estos 18 miARN (Tabla 15). Debido a que un alto porcentaje de genes de cáncer son dianas de miR que están desregulados en tumores sólidos, es poco probable que estas predicciones se deban a la casualidad (P<0,0001 en ensayo exacto de Fisher).
Las predicciones informáticas para tres genes de cáncer diferentes, Retinoblastoma (Rb), receptor de TGF-beta-2
10 (TGFBR2) y gen de adenoma pleiomórfico 1 (PLAG1), se confirmaron experimentalmente por ensayos in vitro. Usando un ensayo de indicador de luciferasa, tres microARN ensayados (miR-106a, miR-20a y miR-26a-1) provocaron una reducción significativa de la traducción de proteínas en relación con los oligoARN de control mezclados en células MEG-01 transfectadas (FIGURA 6). Se descubrió, por ejemplo, que las UTR 3’ de retinoblastoma interaccionaban funcionalmente con miR-106a. La importancia biológica de esta interacción
15 miARN:ARNm se refuerza por informes previos que muestran que el gen de Rb1 se transcribe de forma normal en cánceres de colon, mientras que diversas fracciones de células no expresan proteína Rb1 (Ali, A.A., et al., FASEB J.
7: 931-937 (1993)). Este hallazgo sugiere la existencia de un mecanismo postranscripcional para regular Rb1 que podría explicarse por sobreexpresión de miR-106a conjunta en carcinoma de colon (FIGURA 4). Además, mir-20a está regulado negativamente en cáncer de mama (FIGURA 4) y la proteína TFGBR2 se expresa en el epitelio de
20 células de cáncer de mama (Buck, M. B., et al., Clin. Cancer Res. 10: 491-498 (2004)). Por el contrario, la sobreexpresión de mir-20a en cáncer de colon puede representar un mecanismo nuevo para regular negativamente TGFBR2, además de inactivación mutacional (Biswas, S., et al., Cancer Res. 64: 687-692 (2004)).
Finalmente, se ensayó un conjunto de muestras de paciente para verificar si la expresión de la proteína RB1 se
25 correlacionaba con la expresión de miR-106a (FIGURA 5 y FIGURA 6B). Como se esperaba, en muestras de tumor gástrico, de próstata y de pulmón RB1 estaba regulado negativamente (con respecto al normal emparejado) y se descubrió que miR-106a estaba sobreexpresado, mientras que en muestras de tumor de mama, donde miR-106a está ligeramente regulado negativamente (FIGURA 5 y FIGURA 6B), RB1 se expresa a niveles ligeramente mayores que en el control normal emparejado.
30 Estas pruebas experimentales refuerzan la hipótesis de que genes clave del cáncer están regulados por expresión aberrante en miR en cánceres sólidos. Estos datos añaden nuevos ejemplos a la lista de microARN con importantes dianas de genes de cáncer, como se ha mostrado previamente por Johnsson et al. (Johnson, S. M., et al., Cell 120: 635-647 (2005)) para la interacción let-7:Ras, O’Donnell et al. (O’Donnell, K. A., et al., Nature 435: 839-843 (2005))
35 para la interacción miR-17-5p:cMyc, y Cimmino et al. (Cimmino, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1394413949 (2005)) para la interacción mir-16:Bcl2. Notablemente, miR-17-5p y miR-16 son miembros del distintivo de cáncer sólido de miARN descrito en la presente memoria.
Tabla 15. Oncogenes y genes supresores de tumores predichos por TargetScanS como dianas de microARN del 40 subconjunto de cáncer exhaustivo.* Gen de miARN Nombre del Descripción del gen gen
homólogo de oncogén viral de leucemia murina de Abelson v-abl 2 miR-26a, miR-146 ABL2 (arg, gen relacionado con Abelson) miR-107 AF5q31 gen fusionado con ALL1 de 5q31 miR-20, miR-125b AKT3 homólogo de oncogén viral de timoma murino v-akt 3 miR-26a, miR-155 miR-125b APC poliposis adenomatosa de colon
factor de intercambio de nucleótidos de guanina de RHO (GEF) 12 miR-26a, miR-218 ARHGEF12
(LARG) miR-107, miR-221 ARNT translocador nuclear de receptores de hidrocarburos de arilo miR-192 ATF1 factor de transcripción activador 1 miR-26a ATM ataxia telangiectasia mutada (incluye grupos de complementación A,
C y D) miR-24 AXL tirosina quinasa receptora de AXL miR-26a, miR-107, miR-146, miR-155 miR-138, miR-92 BCL11A CLL de linfocitos B/linfoma 11A miR-20 BCL11B CLL de linfocitos B/linfoma 11B (CTIP2) miR-21 BCL2 CLL de linfocitos B/linfoma 2 miR-26a, miR-26a miR-20, BCL6 CLL de linfocitos B/linfoma 6 (proteína de dedo de cinc 51) miR-92 BCL9 CLL de linfocitos B/linfoma 9 miR-26a, miR-223 miR-221, CBFB subunidad beta del factor de unión al núcleo miR-125b miR-218 CCDC6 Dominio superenrollado que contiene 6 ciclinas D1
(PRAD1:adenomatosis paratiroidea 1) miR-20 CCND1
miR-26a, miR-20
CCND2 ciclina D2
miR-26a, miR-107, miR-92
CDK6 quinasa dependiente de ciclina 6
miR-20
CDKN1A inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1A (p21, Cip1)
miR-221, miR-92
CDKN1C inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1C (p57, Kip2)
miR-24
CDX2 factor de transcripción de caja homeótica de tipo caudal 2
miR-92
CEBPA CCAAT/proteína de unión potenciadora (C/EBP), alfa
miR-26a
CLTC clatrina, polipéptido pesado (Hc)
miR-218
COL1A1 colágeno, tipo I, alfa 1
miR-26a
CREBBP proteína de unión a CREB (CBP)
miR-20
CRK homólogo del oncogén CT10 del virus del sarcoma aviar v-crk
miR-20
CSF1 factor estimulante de colonias 1(macrófagos)
miR-221, miR-192
DDX6 polipéptido 6 de la caja DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) (helicasa de
ARN, 54 kD)
miR-138
DEK oncogén DEK (unión a ADN)
miR-20
E2F1 factor de transcripción de E2F 1
miR-20
ELK3 ELK3, proteína de dominio ETS (proteína accesoria de SRF 2)
miR-24
ELL gen de ELL (gen de leucemia rica en lisina 11-19)
miR-26a, miR-138
ERBB4 tipo homólogo de oncogén viral de leucemia eritroblástica aviar v-erb
a 4
miR-221, miR-155, miR-125b
ETS1 homólogo 1 del oncogén E26 de virus de eritroblastosis aviar v-ets
miR-20
ETV1 gen variante de ets 1
miR-125b
ETV6 gen variante de ets 6 (oncogén TEL)
miR-223
FAT homólogo de supresor de tumores FAT (Drosophila)
miR-223, miR-125b, miR-218
FGFR2 receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 2
miR-92
FLI1 integración de virus de leucemia de Friend 1
miR-24, miR-20
FLT1 tirosina quinasa 1 relacionada con fins (factor de crecimiento
endotelial vascular/receptor de factor de permeabilidad vascular)
miR-221
FOS homólogo del oncogén viral de osteosarcoma murino v-fos FBJ
miR-92
FOXG1B G1B de caja forkhead
miR-223
FOXO3A O3A de caja forkhead box
miR-125b
GOLGA5 autoantígeno de golgi, subfamilia a de golgina, 5 (PTC5)
miR-138
GPHN gefirina (GPH)
miR-107, miR-223, miR-20,
HLF factor de leucemia hepática
miR-218
miR-26a, miR-107
HMGA1 gancho AT de grupo de alta movilidad 1
miR-20
HOXA13 A13 de caja homeótica
miR-92
HOXA9 A9 de caja homeótica
miR-125b
IRF4 factor regulador de interferón 4
miR-146, miR-20, miR-138
JAZF1 yuxtapuesto con otro gen de dedo de cinc 1
miR-92
JUN homólogo del oncogén 17 del virus de sarcoma aviar v-jun
miR-155
KRAS homólogo del oncogén viral de sarcoma de rata de Kirsten 2 v-Ki-ras
2
miR-218
LASP1 proteína LIM y SH3 1
miR-218
LHFP compañero de fusión de HMGIC de lipoma
miR-125b, miR-218
LIFR receptor de factor inhibidor de leucemia
miR-223
LMO2 dominio de LIM solamente 2 (tipo rombotina 1) (RBTN2)
miR-223, miR-155, miR-125b, MAF
homólogo del oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico (aviar)
miR-92
v-maf
miR-92
MAP2K4 proteína quinasa quinasa activada por mitógeno 4
miR-146, miR-20
MAP3K8 proteína quinasa quinasa activada por mitógeno 8
miR-125b
MAX proteína MAX
miR-218
MCC mutada en cánceres colorrectales
miR-24
MEN1 neoplasia endocrina múltiple I
miR-138
MLLT6 leucemia mieloide/linfoide o de linaje mixto (homólogo de trithorax,
Drosophila) translocado a 6 (AF17)
miR-192
MSN moesina
miR-24
MYB homólogo del oncogén viral de mieloblastosis aviar v-myb
miR-107, miR-223, miR-146,
MYBL1 tipo homólogo de oncogén viral de mieloblastosis aviar v-myb 1
miR-221, miR-155, miR-218
miR-107, miR-20
MYCN derivado de neuroblastoma de oncogén relacionado con virus de
mielocistomatosis aviar v-myc
miR-107, miR-92
MYH9 miosina, polipéptido pesado 9, no muscular
miR-24
MYST4 histona acetiltransferasa MYST (leucemia monocítica) 4 (MORF)
miR-20
NBL1 neuroblastoma, supresión de tumorogenicidad 1
miR-125b
NIN nineína (proteína que interacciona con GSK3B)
miR-26a, miR-107
NKTR secuencia de reconocimiento de tumor de citolítica natural
miR-92
NOTCH1 homólogo de Notch 1, asociado a translocación (Drosophila) (TAN1)
miR-24
NTRK3 tirosina quinasa neurotrófica, receptor, tipo 3
miR-125b
PCSK7 subtilisina de proproteína convertasa/quexina tipo 7
miR-24, miR-146
PER1 homólogo de periodo 1 (Drosophila)
miR-146, miR-125b. miR-138, PHOX2B
homeocaja de tipo emparejado 2b
miR-155
PICALM proteína de ensamblaje de clatrina de unión a fosfatidilinositol (CALM)
miR-24, miR-26a
PIM1 oncogén pim-1
miR-24, miR-26a, miR-21,
PLAG1 gen de adenoma pleiomórfico 1
miR-107, miR-20, miR-155
miR-218
RAB8A RAB8A, miembro de la familia de oncogén RAS
miR-24, miR-221
RALA homólogo A del oncogén viral de leucemia de simio v-ral (relacionado
con ras)
miR-138
RARA receptor de ácido retinoico, alfa
miR-20, miR-192
RB1 retinoblastoma 1 (incluyendo osteosarcoma)
miR-20,
RBL1 tipo retinoblastoma 1 (p107)
miR-20
RBL2 tipo retinoblastoma 2 (p130)
miR-155, miR-138
REL homólogo de oncogén viral de reticuloendoteliosis aviar v-rel
miR-20, miR-138
RHOC familia del gen homólogo de ras, miembro C
miR-20, miR-192
RUNX1 factor de transcripción relacionado con runt 1 (AML1)
miR-107, miR-223
SEPT6 septina 6
miR-146, miR-20, miR-125b
SET translocación de SET
miR-21, miR-20, miR-155,
SKI homólogo de oncogén viral de sarcoma aviar v-ski
miR-218
miR-26a, miR-146
SMAD4 SMAD, homólogo 4 de madres contra DPP (Drosophila)
miR-155
SPI1 oncogén de integración proviral de virus formador de focos de bazo
(SFFV) spi1
miR-125b
SS18 translocación de sarcoma sinovial, cromosoma 18
miR-107, miR-155
SUFU supresor de homólogo fusionado (Drosophila)
miR-92
TAF15 ARN polimerasa II TAF15, factor asociado a proteína de unión a caja
TATA (TBP), 68 kDa
miR-26a, miR-221, miR-138
TCF12 factor de transcripción 12 (HTF4, factores de transcripción de hélice
bucle-hélice 4)
miR-21, miR-20
TGFBR2 factor de crecimiento transformante, receptor beta II (70-80 kD)
miR-24, miR-26a, miR-92
TOP1 topoisomerasa (ADN) I
miR-138
TPM4 tropomiosina 4
miR-120
TRIP11 factor de interacción con el receptor de hormona tiroidea 11
miR-92
TSC1 esclerosis tuberosa 1
miR-20
TSG101 gen de susceptibilidad tumoral 101
miR-20
TUSC2 candidato supresor de tumores 2
miR-24
VAV1 oncogén vav 1
miR-125b
VAV2 oncogén vav 2
miR-107
WHSC1 candidato de síndrome de Wolf-Hirschhorn 1 (MMSET)
miR-138
WHSC1L1 tipo candidato 1 de síndrome de Wolf-Hirschhorn 1 (NSD3)
miR-26a
WNT5A familia del sitio de integración de MNDTV de tipo wingless, miembro
5A
miR-26a, miR-20, miR-125b
YES1 homólogo del oncogén viral de sarcoma de Yamaguchi 1 v-yes-1
miR-107, miR-221
ZNF198 proteína de dedo de cinc 198
miR-218 ZNFN1A1 proteína de dedo de cinc, subfamilia 1A, 1 (Ikaros)
* -Los genes de cáncer conocidos (por ejemplo, supresores de tumores, oncogenes) comprenden los identificados en el Censo de Genes de Cáncer en www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census o presentados por OMIM en www.ncbi.nlm.nih.gov.
Aunque la presente invención se ha mostrado particularmente y se ha descrito con referencia a realizaciones preferidas de la misma, se entenderá por los expertos en la materia que pueden realizarse diversos cambios en la forma y detalles de la misma sin alejarse de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CROCE, CARLO M. CALIN, GEORGE A. VOLINIA, STEFANO
<120> MÉTODOS BASADOS EN MICRO ARN Y COMPOSICIONES PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE CÁNCERES SÓLIDOS
<130> 1-28349
<140> 12/160.061
<141>
<150> PCT/US07/000159
<151>
<150> 60/756.585
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<160> 498
<170> PatentIn versión 3.5
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<211> 90
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22
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22
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22
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21
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<400> 314 ugagguagga gguuguauag u
21
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<400> 315
ugagguagua gauuguauag uu
22
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21
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19
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21
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21
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23
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21
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23
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22
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22
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22
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22
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22
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23
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23
<210> 332 <211> 22
<212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 332 uaaagugcuu auagugcagg ua
22
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22
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22
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21
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23
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22
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<400> 338 cauugcacuu gucucggucu ga
22
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22
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<400> 340 uucaaguaau ucaggauagg u
21
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20
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22
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22
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20
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22
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23
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21
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22
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20
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21
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21
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19
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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22
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<210> 370 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 370 aaaagugcuu acagugcagg uagc 24
<210> 371 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 371 uaaagugcug acagugcaga u
21
<210> 372 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 372 agcagcauug uacagggcua uca
23
<210> 373 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 373 uggaguguga caaugguguu ugu
23
<210> 374 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 374 uuaaggcacg cggugaaugc ca
22
<210> 375 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 375 ucccugagac ccuuuaaccu gug
23
<210> 376 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 376 ucccugagac ccuaacuugu ga
22
<210> 377 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 377 cauuauuacu uuugguacgc g
21
<210> 378 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 378 ucguaccgug aguaauaaug c
21
<210> 379 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 379 ucggauccgu cugagcuugg cu
22
<210> 380 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 380 ucacagugaa ccggucucuu uu
22
<210> 381 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 381 ucacagugaa ccggucucuu uc
22
<210> 382 <211> 21
<212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 382 cuuuuugcgg ucugggcuug c
21
<210> 383 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 383 cagugcaaug uuaaaagggc
20
<210> 384 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 384 cagugcaaug augaaagggc au
22
<210> 385 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 385 uaacagucua cagccauggu cg
22
<210> 386 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 386 uugguccccu ucaaccagcu gu
22
<210> 387 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 387 uugguccccu ucaaccagcu a
21
<210> 388 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 388 ugugacuggu ugaccagagg g
21
<210> 389 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 389 uauggcuuuu uauuccuaug uga
23
<210> 390 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 390 uauggcuuuu cauuccuaug ug
22
<210> 391 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 391 acuccauuug uuuugaugau gga
23
<210> 392 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 392 uauugcuuaa gaauacgcgu ag
22
<210> 393 <211> 17 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 393 agcugguguu gugaauc 17
<210> 394 <211> 18 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 394 ucuacagugc acgugucu
18
<210> 395 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 395 agugguuuua cccuauggua g
21
<210> 396 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 396 aacacugucu gguaaagaug g
21
<210> 397 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 397 uguaguguuu ccuacuuuau gga
23
<210> 398 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 398 cauaaaguag aaagcacuac
20
<210> 399 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 399 ugagaugaag cacuguagcu ca <210> 400 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
<400> 400 uacaguauag augauguacu ag
22
<210> 401 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 401 guccaguuuu cccaggaauc ccuu
24
<210> 402 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 402 ugagaacuga auuccauggg uu
22
<210> 403 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 403 guguguggaa augcuucugc
20
<210> 404 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 404 ucagugcacu acagaacuuu gu
22
<210> 405 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 405 ucagugcauc acagaacuuu gu
22
<210> 406 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 406 ucuggcuccg ugucuucacu cc
22
<210> 407 <211> 22 <212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 407 ucucccaacc cuuguaccag ug
22
<210> 408 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 408 acuagacuga agcuccuuga gg
22
<210> 409 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 409 ucagugcaug acagaacuug g
21
<210> 410 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 410 uugcauaguc acaaaaguga
20
<210> 411 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 411 uagguuaucc guguugccuu cg
22
<210> 412 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 412 aaucauacac gguugaccua uu
22
<210> 413 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 413 uuaaugcuaa ucgugauagg gg
22
<210> 414 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 414 aacauucaac gcugucggug agu
23
<210> 415 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 415 aacauucauu gcugucggug gguu
24
<210> 416 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 416 aacauucaac cugucgguga gu
22
<210> 417 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 417 uuuggcaaug guagaacuca ca
22
<210> 418 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 418 ugguucuaga cuugccaacu a
21
<210> 419 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 419 uauggcacug guagaauuca cug
23
<210> 420 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 420 uggacggaga acugauaagg gu
22
<210> 421 <211> 18 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 421 uggagagaaa ggcaguuc
18
<210> 422 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 422 caaagaauuc uccuuuuggg cuu
23
<210> 423 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 423 ucgugucuug uguugcagcc g
21
<210> 424 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 424 caucccuugc augguggagg gu <210> 425 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
<400> 425 gugccuacug agcugauauc agu
23
<210> 426 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 426 ugauauguuu gauauauuag gu
22
<210> 427 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 427 caacggaauc ccaaaagcag cu
22
<210> 428 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 428 cugaccuaug aauugacagc c
21
<210> 429 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 429 aacuggccua caaaguccca g
21
<210> 430 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 430 uguaacagca acuccaugug ga
22
<210> 431 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 431 uagcagcaca gaaauauugg c
21
<210> 432 <211> 21 <212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 432 uagguaguuu cauguuguug g
21
<210> 433 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 433 uagguaguuu ccuguuguug g
21
<210> 434 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 434 uucaccaccu ucuccaccca gc
22
<210> 435 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 435 gguccagagg ggagauagg
19
<210> 436 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 436 cccaguguuc agacuaccug uuc
23
<210> 437 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 437 uacaguaguc ugcacauugg uu
22
<210> 438 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 438 cccaguguuu agacuaucug uuc
23
<210> 439 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 439 uaacacuguc ugguaacgau gu
22
<210> 440 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 440 cucuaauacu gccugguaau gaug 24
<210> 441 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 441 aauacugccg gguaaugaug ga <210> 442 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
<400> 442 agagguauag ggcaugggaa ga
22
<210> 443 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 443 gugaaauguu uaggaccacu ag
22
<210> 444 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 444 uucccuuugu cauccuaugc cu
22
<210> 445 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 445 uccuucauuc caccggaguc ug
22
<210> 446 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 446 uggaauguaa ggaagugugu gg
22
<210> 447 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 447 auaagacgag caaaaagcuu gu
22
<210> 448 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 448 cugugcgugu gacagcggcu g
21
<210> 449
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 449 uucccuuugu cauccuucgc cu
<210> 450
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 450 uaacagucuc cagucacggc c
<210> 451
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 451 accaucgacc guugauugua cc
<210> 452
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 452 acagcaggca cagacaggca g
<210> 453
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 453 augaccuaug aauugacaga c
<210> 454
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 454 uaaucucagc uggcaacugu g
<210> 455
<211> 24
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 455 uacugcauca ggaacugauu ggau 24
<210> 456
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 456 uugugcuuga ucuaaccaug u
<210> 457
<211> 21
<212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 457 ugauugucca aacgcaauuc u <210> 458 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
21
<400> 458 ccacaccgua ucugacacuu u
21
<210> 459 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 459 agcuacauug ucugcugggu uuc
23
<210> 460 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 460 agcuacaucu ggcuacuggg ucuc 24
<210> 461 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 461 ugucaguuug ucaaauaccc c
21
<210> 462 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 462 caagucacua gugguuccgu uua
23
<210> 463 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 463 agggcccccc cucaauccug u
21
<210> 464 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 464 ugguuuaccg ucccacauac au
22
<210> 465 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 465 cagugcaaua guauugucaa agc
23
<210> 466 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 466 uaagugcuuc cauguuuugg uga <210> 467 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
23
<400> 467 acuuuaacau ggaagugcuu ucu
23
<210> 468 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 468 uaagugcuuc cauguuuuag uag
23
<210> 469 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 469 uuuaacaugg ggguaccugc ug
22
<210> 470 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 470 uaagugcuuc cauguuucag ugg
23
<210> 471 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 471 uaagugcuuc cauguuugag ugu
23
<210> 472 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 472 aaaagcuggg uugagagggc gaa
23
<210> 473 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 473 uaagccaggg auuguggguu c
21
<210> 474 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 474 gcacauuaca cggucgaccu cu
22
<210> 475 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 475 cgcauccccu agggcauugg ugu
23
<210> 476 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 476 ccacugcccc aggugcugcu gg
22
<210> 477 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 477 ccuaguaggu guccaguaag u
21
<210> 478 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 478 ccucugggcc cuuccuccag
20
<210> 479 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 479 cuggcccucu cugcccuucc gu
22
<210> 480 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 480 gcaaagcaca cggccugcag aga
23
<210> 481 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 481 gccccugggc cuauccuaga a
21
<210> 482 <211> 23
<212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 482 ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu
23
<210> 483 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 483 uccagcuccu auaugaugcc uuu
23
<210> 484 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 484 uccagcauca gugauuuugu uga
23
<210> 485 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 485 ucccuguccu ccaggagcuc a
21
<210> 486 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 486 uccgucucag uuacuuuaua gcc
23
<210> 487 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 487 ucucacacag aaaucgcacc cguc
24
<210> 488 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 488 ugcugacucc uaguccaggg e
21
<210> 489 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 489 ugucugcccg caugccugcc ucu
23
<210> 490 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 490 aauugcacuu uagcaauggu ga
22
<210> 491 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 491 acauagagga aauuccacgu uu
22
<210> 492 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 492 aauaauacau gguugaucuu u
21
<210> 493 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 493 gccugcuggg guggaaccug g
21
<210> 494 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 494 gugccgccau cuuuugagug u
21
<210> 495 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 495 aaagugcugc gacauuugag cgu
23
<210> 496 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 496 acucaaaaug ggggcgcuuu cc
22
<210> 497 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 497 gaagugcuuc gauuuugggg ugu
23
<210> 498 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 498 uuauaauaca accugauaag ug
22

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de páncreas, de próstata o de estómago, que comprende:
    medir el nivel de al menos un primer producto génico de miR-214 en una muestra de tejido de páncreas, de próstata o de estómago del sujeto, en el que una alteración en el nivel del primer producto génico en la muestra, en relación con el nivel del primer producto génico de miR-214 en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de páncreas, de próstata o de estómago.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que un aumento en el nivel del primer producto génico de miR-214 se usa para diagnosticar cáncer pancreático.
  3. 3.
    El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el primer producto génico de miR y al menos un producto génico de miR adicional se usan para diagnosticar cáncer pancreático, seleccionándose al menos un producto génico de miR adicional de:
    miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-128b, miR-199a-1, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR181b-1, miR-20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a, miR-103-2, miR-103-1, miR-100, miR-125b-2, miR-125b-1, miR-23a, miR-26a-1, miR-125a, miR-130a, miR-26b, miR-145, miR-126*, miR-16-2, miR-99b, miR-155, miR-29a, miR-16-1, miR-99a, miR-224, miR-30d, miR-29c, miR-30b, miR-129-1/2, miR-197, miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a-5p, miR-132, miR-152 prec, miR-23b, miR-222, miR-27a, miR92-1, miR-129-1/2 prec, miR-150, miR-29b-1 y combinaciones de los mismos.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1, en el que un aumento en el nivel del primer producto génico de miR-214 se usa para diagnosticar cáncer de próstata.
  5. 5.
    El método de las reivindicaciones 1 o 4, en el que el primer producto génico de miR y al menos un producto génico de miR adicional se usan para diagnosticar cáncer de próstata, seleccionándose el al menos un producto génico adicional de miR de:
    miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR-199a-1, miR-146, miR-181b-1, miR-20a, miR-32, miR92-2, miR-30c, miR-25, miR-106a, let-7d, miR-128a prec, miR-195, miR-203, let-7a-2 prec, miR-34a, miR-218-2, miR-29a, miR-95, miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148, let-7i, miR-198, miR-199a-2, miR-17-5p, miR-181b-1 prec, miR-206, miR-184 prec, miR-29a prec, miR-149, miR-181b-1 prec, miR-196-1 prec, miR-93-1, miR-16-1, miR-101-1, miR-124a-1, miR-26a-1, miR-27a, miR-24-1 y combinaciones de los mismos.
  6. 6.
    El método de la reivindicación 1, en el que un aumento en el nivel del primer producto génico de miR-214 se usa para diagnosticar cáncer de estómago.
  7. 7.
    El método de las reivindicaciones 1 o 6, en el que el primer producto génico de miR y al menos un producto génico de miR adicional se usan para diagnosticar cáncer de estómago, seleccionándose el al menos un producto génico adicional de miR de:
    miR-21, miR-191, miR-223, miR-24-1, miR-24-2, miR-107, miR-92-2, miR-25, miR-221, miR-218-2, miR-103-2, miR-136, miR-125b-2, miR-103-1, miR-222, miR-212prec, miR-125b-1, miR-100, miR-92-1, miR-96, miR-192, miR-23a, miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-99b, miR-24-1 y combinaciones de los mismos.
  8. 8.
    Un método para diagnosticar si un sujeto tiene cáncer de páncreas, de próstata o de estómago de acuerdo con la reivindicación 1, en el que medir el nivel del al menos un producto génico de miR-214 comprende:
    (1)
    transcribir de forma inversa:
    (2)
    hidridar:
    el al menos un oligodesoxinucleótido diana de miR-214 con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN que incluyen al menos un oligonucleótido sonda específico de ARN de miR214 para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra; en donde determinar si hay una alteración en el nivel del primer producto génico de miR-214 en la muestra, en relación al nivel del primer producto génico de miR-214 en una muestra de control comprende:
    (3)
    comparar:
    el perfil de hibridación de la muestra en relación a un perfil de hibridación generado de una muestra control, en donde una alteración en la señal de miR-214 es indicativa de que el sujeto tiene cáncer de páncreas, de próstata
    o de estómago.
    al menos un ARN de miR-214 de la muestra obtenida del sujeto para proporcionar al menos un oligodesoxinucleótido diana de miR-214; y
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