CN102816862A

CN102816862A - miRNA 222在前列腺癌血清学诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN102816862A
Application number: CN2012103516840A
Authority: CN
Inventors: 王玉琢; 石建党; 张琚; 成飒; 杨阔; 杜小玲; 原辉; 徐勇; 罗飞
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明涉及一种微小RNA（miR-222，如SEQ ID NO：1所示）在前列腺癌血清学诊断试剂盒中的应用，具体涉及检测血液样品中miR-222的试剂在制备用于对象前列腺癌诊断试剂盒中的应用。所述试剂是对微小RNAmiR-222及其前体具有特异性的试剂，具体是：对miR-222及其前体有检测特异性的探针和PCR引物。本发明还涉及一种前列腺癌诊断试剂盒，包括：聚合酶链反应试剂；miR-222特异性引物；线虫miR-39参照寡核苷酸序列；线虫miR-39特异性引物；荧光染料SYBR-GREEN1；使用说明书。当检测结果显示对象血液中miR-222或其前体的水平高于对照血清中的水平，则提示所述对象罹患前列腺癌，该试剂盒可有效用于临床前列腺癌的辅助诊断。

Description

miRNA 222在前列腺癌血清学诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及一种微小RNA（micro RNA，miRNA，miR）222在前列腺癌血清学诊断试剂盒中的应用。属于生物医学材料技术领域。

背景技术

前列腺癌（prostate carcinoma,PCa）为欧美国家男性常见恶性肿瘤和主要死亡原因之一。

随着我国人均寿命延长和生活方式的西化，PCa发病率呈逐年增加趋势，它被列为中国21世纪增长最快的肿瘤之一。本项目在前期工作中筛选出的19个在前列腺癌组织中表达上调的miRNAs序列的基础上，进一步检测其在临床血清样本中的含量，寻找人前列腺癌转移患者的血清学生物标志物。

目前前列腺癌诊断指标的研究工作主要集中在以下几个方面：(I)PSA亚型和其它的激肽释放酶(如血清KLK2)；(II)DNA生物标志物,包括一些表观遗传学生物标志物(如GSTPi甲基化),基因融合(如TMPRSS2:ERG融合)和杂合性缺失等;(III)RNA生物标志物,如非编码的前列腺特异的RNA PCA3（曾被称为DD3）和α-甲基酰基辅酶A消旋酶（Alpha-methylacyl CoA racemase，AMACR)mRNA在前列腺癌中的表达；(IV)蛋白分子标志物，如PSA，前列腺特异膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA),前列腺干细胞抗原(prostatestem cell antigen，PSCA)[14]等。尽管许多候选的生物学标志物在不断地被发现,尚无新的指标和方法应用于临床检测。

miRNAs是一种新的不编码蛋白的内源性小RNAs，它们通过抑制蛋白质翻译过程在细胞增殖、凋亡以及分化等生物学功能方面发挥着重要的调控作用。通过miRNAs微列阵、Northern blot和实时PCR等手段，在多种类型人肿瘤中已经发现了一些miRNAs表达上调和下调的现象。有研究报道了miRNA在乳腺癌和肝癌转移中发挥了重要的作用。近年研究发现，人血浆和血清中存在其它组织来源的miRNAs，它们可以以一种可抵抗内源性RNA酶活性的形式存在。测定血浆或血清中肿瘤来源miRNAs的含量可以作为肿瘤检测的手段之一。近年有研究者报道从血清和其它一些体液中miRNA的水平可以诊断一些处于早期的疾病。2008年Mitchell报道，miR-141在前列腺癌组患者血清中比对照组高46倍，而且其灵敏度为60%，特异性为100%。对于血清中miRNAs的深入研究可为寻找疾病生物标志物提供新的独特视角。

有研究报道，miR-222在肝癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、甲状腺乳头状癌、黑色素瘤等大部分人类肿瘤中频繁高表达。它通过靶向作用于抑癌基因如p27、p57，PTEN，前凋亡因子Bim、Bmf等，抑制细胞凋亡、促进细胞生长和迁移，参与肿瘤的发生发展过程。目前的研究结果提示miRNA-222可能是一种致癌miRNA，在人类多种肿瘤的发生和发展阶段扮演着至关重要的角色。

发明内容

本发明的目的是提供检测血液中miR-222的试剂在制备用于前列腺癌血清学诊断的试剂盒中的应用。

本发明利用我们发明的异种移植模型和新一代测序技术，对转移和非转移前列腺癌异种移植组织系中miRNAs的转录组学进行了深入的研究，初步发现miR－222与前列腺癌的恶性程度相关(Watahiki et al.,PLOS One 2011)。

我们优化了从血清中提取miRNA的方法以及用实时定量PCR检测miRNA的方法；整理和收集了百余份前列腺癌患者的病理资料和血清样本；对用异种移植模型筛选出的在转移前列腺癌组织中上调的19个miRNA序列进行了临床血清样本的检测，揭示了miR－222在前列腺癌患者血清中和组织中含量明显升高。该发明对开发中国人群前列腺癌的血清学临床诊断方案中具有重要的应用前景。

本发明首先提供了一种检测血液样品中微小RNA miR-222及其前体的试剂在制备用于对对象前列腺癌诊断和治疗方案选择的试剂盒中的应用，所述试剂是对微小RNAmiR-222及其前体具有特异性的试剂，具体是：对miR-222及其前体有检测特异性的PCR引物和探针以及利用该探针制备的基因芯片。

所述miR-222的序列如SEQ ID NO：1所示；

在一个优选例中，所述特异性引物选自SEQ ID NO:2所示序列；

在一个优选例中，所述特异性探针选自SEQ ID NO:5所示序列。

本发明通过检测血液中miR-222的含量来诊断对象是否患有前列腺癌。

在一个优选例中，通过实时定量PCR方法对miR-222进行测定，包括：（1）提取对象血液样品中的RNA，并添加人工合成的线虫miR-39寡聚核苷酸作为参照物；（2）利用反转录方法合成cDNA；（3）采用实时定量PCR方法检测样品中miR-222的含量；（4）用线虫miR-39的含量作为参照进行标准化。如果对象血清中miR－222含量与正常对照组相比明显升高，则诊断该对象罹患前列腺癌。

当检测结果显示对象血液中微小RNA miR-222或其前体的水平高于对照血清中的水平，则提示所述对象罹患前列腺癌。

其次，本发明同时提供了一种前列腺癌诊断试剂盒，该试剂盒检测的目标核酸为具有SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列的miR-222，具体包括：

（1）聚合酶链反应试剂；包括热启动Taq DAN聚合酶（2.5U/ul）及其反应缓冲液，dNTP（10mM）；

（2）miR-222特异性引物；在一个优选例中，所述miR-222特异性引物选自SEQ IDNO:2所示序列；

（3）线虫miR-39参照寡核苷酸序列：5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’（SEQIDNO:3）；

（4）线虫miR-39特异性引物：5’-CCGGGTGTAAATCAGCTTGAAA-3’（SEQ ID NO:4）；

（5）荧光染料SYBR-GREEN 1；

（6）使用说明书。

本发明的优点和有益效果：

利用本试剂盒中提供的试剂，结合本领域研究人员熟知的RNA提取试剂和通用miRNA反转录试剂，本发明可以特异性地检测血清中miR-222的含量，有效用于临床前列腺癌的辅助诊断。

附图说明

图1为内参miRNA和目的miRNA的实时PCR扩增曲线和溶解曲线，可见溶解曲线均为单峰，无非特异性峰出现；

图2为qRT-PCR检测miR-222在正常人和前列腺癌患者血清中的表达量柱高=x^-+SE；

图3为miR-222在前列腺癌患者血清中相对表达量ROC曲线分析。

图4为前列腺组织的miR-222FISH照片（200×）A：Normal prostate B：PCa-1（gleason score：6分）C：PCa-2（gleason score：9分）。

具体实施方式

实施例1

本发明首先提供了一种检测血液样品中微小RNA miR-222及其前体的试剂在制备用于对对象前列腺癌诊断和治疗方案选择的试剂盒中的应用，所述试剂是对微小RNAmiR-222（如SEQ ID NO：1所示）及其前体具有特异性的试剂，具体是：对miR-222及其前体有检测特异性的PCR引物和探针及使用该探针制备的基因芯片。

所述的特异性引物选自SEQ ID NO:2所示序列；

所述的特异性探针选自SEQ ID NO:5所示序列。

实施例2、前列腺癌诊断试剂盒

本发明所述试剂盒检测的目标核酸为具有SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列的 miR-222，具体包括：

（3）线虫miR-39参照寡核苷酸序列：5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’（SEQID NO:3）；

（5）荧光染料SYBR-GREEN 1；

（6）使用说明书。

实施例3、诊断效果实验

1、利用我们发明的异种移植模型（即将前列腺癌组织移植到免疫缺欠小鼠的肾包膜中，所得到的组织系与临床肿瘤的病理特征高度相关）和新一代测序技术，对转移性和非转移性前列腺癌异种移植组织系（来自于同一个前列腺癌患者的手术标本）中miRNAs的转录组学进行了深入的研究。通过比较我们鉴定出104个表达差异的miRNAs，除了一些已知的miRNAs和它们的异型体（isomiRs），还有一部分是尚未被发现的新的miRNAs。其中21个miRNAs已经被发现和前列腺癌的发生有关，5个miRNAs已经被报道在前列腺癌转移中发挥作用，这也从侧面证明了我们采用的研究手段的有效性。除了那些已经被证明和前列腺癌转移相关的miRNAs外，我们还发现了36个迄今为止尚未被报道的miRNAs(Watahiki et al.,PLOS One 2011)，这其中可能存在着潜在的可作为中国人群前列腺癌患者血清学生物标志物的miRNAs。

2、血清中微量miRNA的提取

由于miRNA在血清中的含量很少，在实验前期，我们参阅了大量的文献，尝试了纯化柱试剂盒提取法和液相Trizol提取法提取miRNA。发现Trizol法提取的miRNA的量和纯度更好一些（miRNA的蛋白含量及盐分含量更少）。在用Trizol法中我们进行了两方面的优化：（1）血清中含蛋白量较多，可以加大Trizol的含量，以使所含的蛋白质得到充分的变性；并用酚/氯仿/异戊醇进行多次抽提，以将所含的蛋白质进行充分的去除；（2）因为miRNA分子量很小，在加入异丙醇沉淀这步中，不容易沉淀下来，可以适量的延长沉淀时间，以使miRNA充分的沉淀下来增加miRNA的得率。

3、血清中微量miRNA的检测方法

采用All-in-One^TM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA。

根据miRNA的特点和PCR扩增原则，采用所发明的试剂盒在MJ Opticon II定量PCR仪上检测miR-222和线虫miR-39的含量。miRNA的相对表达量使用2-^ΔΔCt法计算。

4、检测在前列腺癌组织中表达上调的miRNAs在前列腺癌患者血清中的含量

（1）我们对天津医科大学第二附属医院泌尿研究所提供的百余份临床资料和病人病历信息等进行了整理工作，筛选出了28例正常人，49例高分级（7-9分）前列腺癌患者病历，13例低分级前列腺患者病历，并取得其血液样本。

（2）对这些临床样本进行miRNA提取，QRT-PCR检测得到如下结果：

从所收集的血清样品中提取RNA，利用特异于miR－222的PCR引物，采用反转录－实时定量PCR的方法检测该miRNA的表达水平。所使用的PCR引物能够特异、有效地扩增待检测序列（图1）。所得到的数据用SPSS软件对其进行独立样本T检验分析，miR-222在前列腺癌患者血清中表达升高（图2）。

表1miR－222在正常组和前列腺癌组血清中的相对表达倍数

（3）灵敏度和特异性分析

应用SPSS软件对miR-222的qRT-PCR数据进行ROC曲线作图，分析其检测前列腺癌组血清的灵敏度和特异性：miR-222在阈值为4.06时，灵敏度和特异性分别为40.3%和88.6%（图3）。

5.miR－222在前列腺组织中的表达水平

本实验是利用选自SEQ ID NO:5所示序列的地高辛标记的寡核苷酸探针，采用本领域同行技术人员熟知的荧光原位杂交技术，检测了miR-222在前列腺癌组织中的表达。首先将特异性探针与石蜡组织切片中的成熟miRNA进行杂交，之后用罗丹明标记的抗地高辛抗体进行孵育，用DAPI染核，从而使杂交体带上荧光标签，在荧光显微镜下检测即可对其定位或定量分析。

通过本探针的杂交检测证实，miR-222在前列腺癌组织中比在正常组织中荧光探针的信号更多、更强，证实miR-222在前列腺癌组织中表达升高（图4）。

Claims

1.检测血液样品中微小RNA miR-222及其前体的试剂在制备用于对对象前列腺癌诊断和治疗方案选择的试剂盒中的应用，所述试剂是对微小RNA miR-222及其前体具有特异性的试剂，具体是：对miR-222及其前体有检测特异性的PCR引物和探针以及利用该探针制备的基因芯片。

2.如权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述miR-222的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒检测的目标核酸为具有SEQ IDNO：1所示多核苷酸序列的miR-222，具体包括：

（1）聚合酶链反应试剂；

（2）miR-222特异性引物，如SEQ ID NO:2所示；

（3）线虫miR-39参照寡核苷酸序列，如SEQ IDNO:3所示；

（4）线虫miR-39特异性引物，如SEQ IDNO:4所示；

（5）荧光染料SYBR-GREEN 1；

（6）使用说明书。