CN101809169B - 通过靶向dnmt3a和dnmt3b恢复甲基化的方法 - Google Patents

Abstract

公开了通过施用有效量的一个或多个足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一个或多个的miR-29来恢复期望的DNA甲基化模式，诱导甲基化沉默的肿瘤抑制基因(TSG)的再表达，和/或在有此需要的受试者中体外和体内抑制致瘤性的方法。

Description

通过靶向DNMT3A和DNMT3B恢复甲基化的方法

交叉引用相关申请 

本申请要求2007年7月31日提交的美国临时申请案60/962,795和2008年7月30日提交的PCT/US 2008/071532的权益，其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。 

关于联邦政府支助的研究的声明 

本发明是在无任何政府支助的情况下进行的，因此政府在本发明中不具有权利。 

背景 

肺癌是美国癌症死亡率的首要病因，其发病率为每年大约213,000例新发病例并且具有很高的死亡率¹⁵。尽管使用新型药物和治疗方案，但在过去20年中肺癌患者的预后一直没有显著改变，因此强调了对新型治疗策略的需要。靶向表观基因组(epigenome)代表了极具前景的癌症治疗策略¹⁶。 

异常的DNA甲基化已显示在肺癌中起着重要作用¹⁷： 

1)启动子甲基化是负责沉默TSGs^18-20例如CDKN2A、CDH13、FHIT、WWOX、CDH1和RASSF1A的机制之一； 

2)维持和从头(de novo)DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3B的mRNA表达据报导分别在102例NSCLC的53％和58％中升高，并且显示DNMT1 mRNA水平是存活的独立预后因子¹³； 

3)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达相对于正常肺组织在肺肿瘤中升高¹²； 

4)人DNMT3B启动子中显著增加启动子活性的特定多态性与增加的肺癌风险相关²¹； 

5)DNMT1-介导的DNA甲基化的抑制在小鼠中使烟草致癌物诱导的肺癌减少50％以上²²。 

MicroRNA(miRNA)(19-25个核苷酸的非编码RNA，其通过对部分或全部互补位点的碱基配对而诱导它们的靶mRNA的翻译抑制或切割，从而调控基因表达)参与至关重要的生物过程，包括发育、细胞分化、细胞凋亡和增殖^1，2。最近，已确定了特定癌症的具有诊断和预后意义的特定miRNA表达特征谱(关于综述，参考文献3-5)。值得注意的是，通过使用不同的miRNA靶基因预测算法(PicTar⁸，TargetScan3.1⁹，MiRanda¹⁰和miRGen¹¹)，已用计算机(in silico)预测了之前显示在NSCLC中被下调^6，7的miR-29家族的成员与DNMT3A和B基因的3′非翻译区(3′UTR)中的位点互补(图1)。 

在报导的在肺癌中被下调的miRNA中，miR-29家族(29a，29b和29c)具有吸引人的对DNMT3A和3B(从头甲基转移酶)的3′非翻译区(UTR)的互补性^8-11，所述酶是在肺癌中经常被上调¹²并且与不良预后相关¹³的参与DNA甲基化的两个至关重要的酶。 

虽然现在认为miRNA在癌发生中起作用，但miRNA的表达在肺癌中(相对于其正常对应物(counterpart))是不同的。此外，对该异常表达的重要性理解甚少。 

因此，存在确定miR-29是否可靶向DNMT3A和DNTM3B以及确定miR-29的恢复是否可使肺癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)中的异常甲基化模式恢复正常的需要。 

发明概述 

在一个广泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受试者中恢复期望的DNA甲基化模式的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一种或多种的一种或多种miR-29。 

在另一个广泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受试者中诱导甲基化沉默的肿瘤抑制基因(TSG)的再表达的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一种或多种的一种或多种 miR-29。在某些实施方案中，TSG包括FHIT和WWOX中的一种或多种。 

在另一个广泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受试者中体外和体内抑制致瘤性的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一种或多种的一种或多种miR-29。 

本文所描述的方法可用于患有恶性肿瘤例如肺癌的受试者。 

在另一个方面，本文描述了用于非小细胞肺癌(NSCLC)的表观遗传调控的方法。 

在某些实施方案中，内源miR-29b用作起始DNMT3B mRNA的逆转录的引物。 

在另一个方面，在本文中描述了用于降低总DNA甲基化的方法，包括施用有效量的一种或多种靶向DNMT3A和DNMT3B的miR-29，其中miR-29的表达促成癌细胞中DNA的表观遗传修饰。 

在另一个方面，在本文中描述了用于通过组合至少一种核苷类似物与一种或多种足以阻断从头和维持DNMT途径的miR-29来获得DNA低甲基化的方法。在某些实施方案中，核苷类似物包括地西他滨。 

在另一个方面，在本文中描述了用于增加肿瘤抑制基因(TSG)的表达的方法，包括用一种或多种mi-R29转染细胞。在某些实施方案中，TSG包括FHIT和WWOX蛋白中的一种或多种。 

在另一个方面，本文描述了用于在细胞中体外抑制细胞生长和/或诱导细胞凋亡(相对于混杂(scrambled)对照)的方法，包括用一种或多种miR-29转染一种或多种细胞。 

在另一方面，在本文中描述了用于下调FHIT和/或WWOX酶的表达水平的方法，包括通过用一个或多个miR-29家族成员转染细胞来调控DNMT3A和/或DNMT3B。在某些实施方案中，细胞是肺癌细胞。 

在另一个方面，本文中描述了用于减少总DNA甲基化的方法，包括在肺癌细胞中诱导mi-R29的表达。 

在另一个方面，本文中描述了用于恢复TSG的表达的方法，包括在肺癌细胞中诱导mi-R29的表达。 

在另一个方面，本文描述了用于体外和体内抑制致瘤性的方法， 包括在肺癌细胞中诱导mi-R29的表达。 

在另一个方面，本文中描述了开发单独地或与其他疗法组合使用合成的miR-29的表观遗传疗法的方法，以在癌细胞中重新激活肿瘤抑制基因和使异常的甲基化模式恢复正常。在某些实施方案中，癌细胞是肺癌细胞。 

在另一个方面，本文中描述了诊断受试者是否患有肺癌相关疾病，处于发生其的风险中，或对于其具有减少的存活预后的方法，包括测量受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平；其中测试样品中miR基因产物的水平相对于对照样品中相应miR基因产物的水平的改变表示受试者患有肺癌相关疾病，或处于发生其的风险中；以及其中至少一种miR基因产物选自miR29a、miR-29b、miR-29c和其组合。 

在其他方面，在本文中描述了与各种细胞的诱导肺癌的状态相关的标志物。已发现高于任何此类标志物或此类标志物的组合的正常表达水平与患者中肺癌相关疾病的存在相关。提供了检测样品中肺癌相关疾病的存在；样品中所述疾病的不存在；肺癌相关疾病的分期；以及与患者中肺癌相关疾病的评估、预防、诊断、表征和治疗相关的肺癌相关疾病的其他特征的方法。还提供了治疗肺癌相关疾病的方法。 

在其他方面，在本文中描述了用于治疗患有肺癌相关疾病或处于发生肺癌相关疾病的风险中的患者的方法。此类方法可包括减少标志物的表达和/或干扰标志物的生物学功能。在一个实施方案中，方法包括给患者提供与标志物核酸或其区段互补的反义寡核苷酸或多核苷酸。例如，可通过递送表达标志物核酸或其片段的反义多核苷酸的载体来给患者提供反义多核苷酸。在另一个实施方案中，方法包括给患者提供特异性结合标志物蛋白或所述蛋白的片段的抗体、抗体衍生物或抗体片段。 

当根据附图进行阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。 

附图概述 

本专利或申请文件包含至少一个以彩色制成的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由Office提供。 

图1.DNMT3A和3B的3′UTR区中对于miR-29的互补位点 

Hsa-mi-R29a [SEQ ID NO：1] 

Hsa-mi-R29b [SEQ ID NO：2] 

Hsa-mi-R29c [SEQ ID NO：3] 

845-869 DNMT3A [SEQ ID NO：4] 

843-869 DNMT3A [SEQ ID NO：5] 

846-869 DNMT3A [SEQ ID NO：6] 

1184-1209 DNMT3B [SEQ ID NO：7] 

244-267 DNMT3B [SEQ ID NO：8] 

1374-1398 DNMT3B [SEQ ID NO：9] 

1182-1209 DNMT3B [SEQ ID NO：10] 

1185-1209 DNMT3B [SEQ ID NO：11] 

根据TARGETSCAN 3.1软件，大写和粗体字母标识完全碱基配对。PICTAR软件在miR-29a与DNMT3B之间鉴别出两个额外的配对区域，用星号*标出。 

图2.MiR-29直接靶向DNMT3A和B。 

图2a).在用miR-29转染后A549细胞中DNMT3表达的萤光素酶测定的结果。 

图2b).上图，在用miR-29或阴性对照转染A549细胞后，通过qRT-PCR对DNMT3A和DNMT3B mRNA的表达的评估；下图，利用反义分子(AS)沉默miR-29诱导了增加的DNMT3A和DNMT3B mRNA的表达。 

图2c).从用DNMT3A和B-3′UTR的GFP抑制载体+miR 29或混杂寡核苷酸共转染的A549细胞提取的蛋白质的Western印迹。 

图2d).miR-29b用作逆转录其预测的DNMT3B mRNA靶的内源引物。黑色字体：DNMT3B cDNA(RefSeq# NM_175848)；蓝色字体：实验获得的经克隆和测序的cDNA(分析了8个克隆)；红色字体：推导的RNA 序列和相应的miR-29b。 

3’UTR-DNMT3B 1178-1217：TTTAACACCTTTTACTCTTCTTAC- ATTTTGTAG[SEQ ID NO：12] 

cDNA(8)：TTTAACACCTTTTACTCTTCTTAA：T 

A-ADAPTER[SEQID NO：13] 

RNA：3’AAAUGAGAAGAAUU：A 

U 5’[SEQ ID NO：14] 

Hsa-miR-29b：3’UUGUGACUAAAGUUUA U 5’[SEQ ID NO：2] 

上方下划线标示的黑色和蓝色核苷酸在靶和实验的cDNA之间不具有同源性。下方下划线标示的红色核苷酸代表与miR-29b序列缺少同源性的与cDNA互补的RNA序列。粗体的核苷酸代表PICTAR预测的配对位点。 

图3.miR-29对癌细胞表观基因组的恢复作用。 

图3a).由miR-29对A549细胞(在转染后48和72小时收获)诱导的总DNA甲基化改变。将结果与未转染的细胞(模拟)和用混杂寡核苷酸转染的细胞(Scr)相比较。利用LC/MS-MS确定总DNA甲基化状态。 

图3b).通过qRT PCR进行的用miR-29或阴性对照转染后48小时的A549和H1299细胞中FHIT和WWOX mRNA水平的测定；miR-29诱导FHIT和WWOX mRNA的再表达。 

图3c).在用miR-29或阴性对照转染后72小时，A549和H1299细胞中的FHIT和WWOX蛋白的免疫印迹；至72小时时，miR-29诱导增加的FHIT和WWOX蛋白的表达。免疫印迹图像上方的数字表示相对于GAPDH基因的条带强度(上行：FHIT；下行：WWOX)。 

图3d).使用MassARRAY系统的FHIT和WWOX启动子区域的定量DNA甲基化数据的图示。各方块表示被分析的单个CpG或CpG组，并且各箭头表示样品。以从亮绿(较低甲基化频率)延伸至亮红(较高的甲化频率)的色码显示各实验的甲基化频率。 

图4.miR-29对A549细胞的致瘤性的作用。 

图4a).用miR-29、混杂(Scr)寡核苷酸体外转染的或模拟转染 的(模拟)A549细胞的生长曲线。曲线表示3个不同实验的平均细胞数目。 

图4b).测量用混杂(Scr)寡核苷酸或miR-29寡核苷酸(100nM终浓度)转染的A549细胞中的活细胞百分数。24小时后，收获细胞，将其悬浮于具有膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶的结合缓冲液中，然后通过流式细胞术估量细胞死亡。误差棒表示SD。 

图4c).注射了预先用miR-29、scr寡核苷酸转染的或模拟转染的(注射前48小时)A549细胞的裸小鼠中移植瘤的生长曲线。 

图4d).在注射后21天在裸鼠中，模拟-、Scr-和miR-29-转染的A549细胞的肿瘤移植物的大小的比较。图像显示来自每一个类别的5只小鼠中的平均大小的肿瘤。 

图4e).裸小鼠的肿瘤重量±SD。 

图5.NSCLC中DNMT3A蛋白表达水平与总存活负相关。Kaplan-Meier曲线显示172个在肿瘤中具有不同的DNMT3A表达水平(相对于邻近正常肺)的NSCLC患者的存活。具有更高的DNMT3A表达的患者具有更短的总存活(P＝0.029)。DNMT3B蛋白表达水平与存活存在朝向相似的相关性的趋势，但对于DNMT1不存在这样的相关性。 

图6.内源miR-29水平与DNMT3A/B mRNA水平的相关性。通过qRT PCR在14个NSCLC中测定的DNMT3A、3B的内源mRNA水平与miR-29的内源水平之间的负相关性。R＝回归系数。□＝回归线；◆＝实际样品相关性。 

实施方案的描述 

在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本文以更全面地描述本发明涉及的现有技术。 

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学领域)技术人员通常所理解的意义相同的意义。标准技术用于在本 领域技术人员的能力范围之内的分子、遗传学和生物化学方法。此类技术在文献中得到详尽的解释。参见，例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual，第2版，由Sambrook，Fritsch和Maniatis编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，第I和II卷(Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(Gait ed.，1984)；Mullis等，美国专利：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(Hames & Higgins eds.，1984)；Transcription And Translation(Hames & Higgins eds.，1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，1986)；Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(Miller和Calos eds.，1987，Cold Spring HarborLaboratory)；Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，第I-IV卷(Weir和Blackwell，eds.，1986)；The Laboratory Rat，主编：Mark A.Suckow；作者：Sharp和LaRegina.CRC Press，Boston，1988，所述文献通过引用合并入本文)和化学方法。 

如说明书和权利要求中所使用的，除非上下文清楚地指出，否则单数形式“a”“an”和“the”包括复数指示物。例如，术语“a cell”包括多个细胞，包括其混合物。 

如在本文中可互换使用的，“miR基因产物”、“microRNA”、“miR”或“miRNA”是指来自miR基因的未加工的(例如，前体)或已加工的(例如，成熟)RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白质，因此术语“miR基因产物”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为“miR前体”或“miR prec”，其通常包括长度大约70-100个核苷酸的RNA转录物。可通过用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut或 RNA酶III(例如大肠杆菌(E.coli)RNA酶III))将其消化成具有活性的19至25个核苷酸的RNA分子来加工miR前体。该具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称为“已加工的”miR基因转录物或“成熟的”miRNA。 

“标志物”是与其在正常或健康组织或细胞中的表达水平相比，其在组织或细胞中改变的表达水平与疾病状态相关的基因或蛋白质。 

标志物的“正常”的表达水平是标志物在未患肺癌相关疾病的人受试者或患者的肺细胞中的表达水平。 

标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平高于用于估量表达的测定的标准误，在某些实施方案中，至少2倍，在其他实施方案中，3、4、5或10倍于对照样品(例如，来自未患有标志物相关疾病的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平。 

标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平比对照样品(例如，来自未患有标志物相关疾病的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平低至少2倍，在其他实施方案中低3、4、5或10倍。 

“试剂盒”是包含至少一种试剂，例如用于特异性检测标志物的表达的探针的任何产品(例如，包装或容器)。可以以用于进行本发明的方法的单位的形式推销(promote)、分配或销售试剂盒。 

“蛋白质”包括标志物蛋白和它们的片段；变异标志物蛋白和它们的片段；包含标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的肽和多肽；以及包含标志物或变异标志物蛋白，或标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的融合蛋白。 

在第一广泛的方面，本文中提供了其表达在与不同肺癌相关的癌细胞中，相对于正常对照细胞，发生改变的特定microRNA的鉴定。 

可通过天然加工途径(例如使用完整的细胞或细胞裂解物)或通 过合成加工途径(例如使用分离的加工酶，例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。应理解，还可通过生物或化学合成(而不用从miR前体加工)直接产生具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。当在本文中通过名称提及microRNA时，除非另外指出，否则所述名称相应于前体和成熟形式。 

在一个方面，在本文中提供了诊断受试者是否患有肺癌或处于发展肺癌的风险中的方法，该方法包括测量来自受试者的受试样品中至少一种miR基因产物的水平和将受试样品中的miR基因产物水平与对照样品中的相应miR基因产物水平相比较。如本文所使用的，“受试者”可以是患有或怀疑患有肺癌的任何哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是患有或怀疑患有肺癌的人。 

在一个实施方案中，测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自miR29a、miR-29b、miR-29c和其组合。在特定实施方案中，miR基因产物是miR-29b。 

肺癌相关疾病可以是起于肺组织的任何障碍或癌症。此类癌症通常与肿瘤块的形成和/或存在相关，并且可以是例如任何形式的肺癌，例如不同组织学的肺癌(例如，腺癌、鳞状细胞癌)。此外，肺癌可以与特定的预后(例如，低存活率、快速进展)相关。 

可在从受试者获得的生物样品(例如，细胞、组织)中测量至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过常规的活组织检查技术从怀疑患有肺癌相关疾病的受试者中取出组织样品(例如，来自肿瘤)。在另一个实施方案中，可从受试者中取出血液样品，并且可通过标准技术分离血细胞(例如，白细胞)以用于DNA提取。优选在开始放射疗法、化学疗法或其他疗法之前从受试者获得血液或组织样品。可从受试者的未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体或从相应于受试者的样品的大部分细胞的培养细胞获得相应的对照组织或血液样品。然后将对照组织或血液样品与来自受试者的样品一起进行处理，以便可将从受试者的样品的细胞中给定的miR基因产生的miR基因产 物的水平与来自对照样品的细胞的相应的miR基因产物的水平进行比较。生物样品的参照miR表达标准也可用作对照。 

与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，从受试者获得的样品中miR基因产物水平的改变(例如，增加或减少)表示受试者中存在肺癌相关疾病。 

在一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平高于对照样品中相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“上调”)。如本文中所使用的，当来自受试者的细胞或组织样品中miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，miR基因产物的表达“上调”。 

在另一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平低于对照样品中相应miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“下调”)。如本文中所使用的，当从来自受试者的细胞或组织样品中的该基因产生的miR基因产物的量低于从对照细胞或组织样品中的相同基因产生的量时，miR基因的表达“下调”。 

可根据一个或多个RNA表达标准确定对照和正常样品中相对miR基因表达。所述标准可包括例如0 miR基因表达水平、标准细胞系中的miR基因表达水平、受试者的未受影响的组织中miR基因的表达水平或之前获得的正常人对照的群体的miR基因表达的平均水平。 

可使用适合用于检测生物样品中RNA表达水平的任何技术测量样品中miR基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞、组织)中的RNA表达水平的合适技术(例如，Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)对于本领域技术人员来说是熟知的。在特定的实施方案中，使用Northern印迹分析检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过在核酸提取缓冲液存在的情况下进行匀浆，接着进行离心来从细胞纯化总的细胞RNA。沉淀核酸，然后通过用DNA酶处理和沉淀来除去DNA。然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离RNA分子，并将其转移至硝酸纤维素滤器。然后通过加热将RNA固定在滤器上。使用适当标记的与所述RNA互补的DNA或RNA探针进行特定RNA 的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等人，eds.，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，Chapter 7，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

用于给定的miR基因产物的Northern印迹杂交的合适的探针可根据核酸序列产生，其包括但不限于与目的miR基因产物具有至少大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或完全的互补性的探针。用于制备标记的DNA和RNA探针的方法以及用于其与靶核苷酸序列的杂交的条件描述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等人，eds.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapters 10和11，其公开内容通过引用合并入本文。 

在一个非限定性实例中，可用例如放射性核素例如³H、³²P、³³P、 ¹⁴C或³⁵S；重金属；能够用作已标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗体)；荧光分子；化学发光分子；酶等来标记核酸探针。 

可通过Rigby等人(1977)，J.Mol.Biol.113：237-251的切口平移法(nick translation method)或Fienberg等人(1983)，Anal.Biochem.132：6-13的随机引物法(其全部公开内容通过引用合并入本文)将探针标记至高比放射性(specific activity)。后者是选择用于从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的³²P-标记的探针的方法。例如，按照切口平移法通过用高放射性的核苷酸置换预先存在的核苷酸，可能制备具有大大超过10⁸cpm/微克的比放射性的³²P-标记的核酸探针。然后可通过将杂交滤器暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。暴露于杂交滤器的照相胶片的光密度扫描提供了miR基因转录物水平的精确测量。使用另一个方法，可通过计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences，Piscataway，NJ获得的 Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager定量miR基因转录物水平。 

当不能进行DNA或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引物法将类似物例如dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰 基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子。可通过与偶联至荧光染料或产生颜色反应的酶的结合生物素的蛋白质例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗体(例如抗生物素抗体)反应来检测生物素化的探针寡核苷酸。 

除了Northern和其他RNA杂交技术外，可使用原位杂交技术来测定RNA转录物的水平。该技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，其包括将整个细胞置于显微镜盖玻片上和用含有放射性标记的或另外标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核酸含量。该技术特别适合用于分析来自受试者的组织活检样品。原位杂交技术的实施在美国专利5,427,916(其全部公开内容通过引用合并入本文)中进行了更详细的描述。 

在一个非限定性实例中，用于给定的miR基因产物的原位杂交的合适的探针可从核酸序列产生。并且包括但不限于与目的miR基因产物具有至少大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或完全的互补性的探针，如上所述的。 

细胞中miR基因转录物的相对数目还可通过对miR基因转录物进行逆转录，然后通过聚合酶链式反应扩增经逆转录的转录物(RT-PCR)来进行测定。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的“持家”基因的mRNA的水平相比较来定量miR基因转录物的水平。用作内部标准的合适的“持家”基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于进行定量和半定量RT-PCR的方法和其变型对于本领域技术人员来说是熟知的。 

在一些情况下，可能期望同时测定样品中多个不同miR基因产物的表达水平。在其他情况下，可能期望测定与癌症关联的所有已知miR基因的转录物的表达水平。评估数百种miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平非常费时并且需要大量的总RNA(例如，对于每一个Northern印迹需要至少20μg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。 

为了克服这些限制，可构建以微芯片形式(即，微阵列)存在的寡 核苷酸文库(oligolibrary)，该文库包含特异于一组miR基因的一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，且将它们与微阵列上的探针寡核苷酸杂交以产生杂交特征谱或表达特征谱来测定生物样品中多个microRNA的表达水平。然后将受试样品的杂交特征谱与对照样品的杂交特征谱比较，从而确定在肺癌细胞中具有改变的表达水平的microRNA。 

如本文中所使用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如，通过杂交)的分子。“miR-特异性探针寡核苷酸”或“特异于miR的探针寡核苷酸”是指具有选择用于与特定miR基因产物或特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。 

特定样品的“表达特征谱”或“杂交特征谱”本质上是样品的状态指纹；虽然两种状态可能具有相似表达的任何特定基因，但同时评价大量基因允许产生对于细胞的状态是独特的基因表达特征谱。即，正常组织可与癌(例如，肿瘤)组织相区别，并且在癌组织中，可确定不同的预后状态(例如，良好的或不良的长期存活希望)。通过比较不同状态中癌组织的表达特征谱，获得关于哪个基因在这些状态的各状态中是很重要(包括基因的上调和下调)的信息。在癌组织中差异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果的差异表达的鉴定允许以许多方法使用该信息。 

在一个非限定性实例中，可评估特定的治疗方案(例如，以确定化疗药物是否改善特定患者的长期预后)。类似地，可通过将患者样品与已知的表达特征谱比较来进行或确认诊断。此外，这些基因表达特征谱(或个体基因)允许筛选抑制肺癌表达特征谱或将不良预后特征谱转变成更好的预后特征谱的药物候选物。 

因此，本文中还提供了诊断受试者是否患有肺癌或处于发展肺癌的风险中的方法，该方法包括逆转录获自受试者的受试样品的RNA以 提供一组靶寡脱氧核苷酸，将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交特征谱，和将受试样品杂交特征谱与从对照样品或参照标准产生的杂交特征谱比较，其中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有肺癌或处于发展肺癌的风险中。 

在一个实施方案中，微阵列包含大部分所有已知的人miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸。在特定的实施方案中，微阵列包含一种或多种选自miR29a、miR-29b、miR-29c和其组合的miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸。 

可利用基因特异性寡核苷酸探针(所述探针从已知的miRNA序列产生)制备微阵列。对于各miRNA，阵列可包含两种不同的寡核苷酸探针，一种探针包含活性成熟序列，而另一种探针特异于miRNA的前体。阵列还可包含可用作杂交严格性条件的对照的对照，例如与人直系同源物只相异于少数几个碱基的一个或多个小鼠序列。还可将来自两个物种的tRNA或其他RNA(例如，rRNA、mRNA)印制在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。还可将用于非特异性杂交的一个或多个合适的对照包含在微芯片上。为了该目的，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性选择序列。 

可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5′-胺修饰，并且使用可商购获得的微阵列系统例如GeneMachine OmniGrid^TM 100Microarrayer和Amersham CodeLink^TM活化的载玻片进行印制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡聚物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交物变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂交条件(例如在25℃下于6X SSPE/30％甲酰胺中进行18小时，然后在37℃下于0.75X TNT(TrisHCl/NaCl/Tween 20)中清洗40分钟)下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置上，发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上的其中发生结合的确切位置，从而允许自动 检测和定量。输出信号由一列杂交事件组成，其标示了特定cDNA序列的相对丰度，从而标示了患者样品中相应的互补miR的相对丰度。 

根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素蛋白-Alexa647缀合物直接检测包含生物素的转录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法扫描微阵列。阵列上的各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。 

使用阵列对于miRNA表达的检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点上鉴定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成熟分子和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用2.5μg总RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRNA(每物种数百个)允许对数个物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核苷酸探针。这样的工具允许分析各已知的miR在不同条件下的跨物种表达。 

除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于miRNome的大部分(优选整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于进行miR基因表达特征谱分析，以分析miR的表达模式。可使不同的miR特征与已建立的疾病标志物关联或直接与疾病状态关联。 

按照本文中描述的表达特征谱分析法，对来自怀疑患有肺癌相关疾病的受试者的样品的总RNA进行定量逆转录以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。然后将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供样品的杂交特征谱。结果是显示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交特征谱。杂交特征谱包括来自靶寡脱氧核苷酸(其来自样品)与微阵列中的miRNA-特异性探针寡核苷酸结合的信号。所述特征谱可记录为结合的存在或不存在(信号对0信号)。 

更优选地，记录的特征谱包括来自各杂交的信号的强度。将所述特征谱与从正常的(即非癌的)对照样品产生的杂交特征谱相比较。 信号的改变表示受试者中存在癌症或发生癌症的倾向。 

用于测量miR基因表达的其他技术也在本领域技术人员的能力范围之内，并且包括用于测量RNA转录和降解的速率的各种技术。 

本文中还提供了测定患有肺癌的受试者的预后的方法，该方法包括测量受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，所述水平与肺癌相关疾病的特定预后(例如，良好或积极的预后，不良或不利的预后)相关。 

根据这些方法，与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比较，测试样品中与特定预后相关的miR基因产物的水平的改变表明受试者患有具有特定预后的肺癌。在一个实施方案中，miR基因产物与不利的(即，不良的)预后相关。不利预后的实例包括但不限于低存活率和快速疾病发展。在某些实施方案中，这样测量至少一种miR基因产物的水平，即通过逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将该靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交特征谱，然后将受试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较来进行测量。 

不希望受任何理论束缚，据信，细胞中一种或多种miR基因产物水平的改变可导致这些miR的一种或多种预期的靶失调，这可导致肺癌形成。因此，改变miR基因产物水平(例如，通过减少在肺癌细胞中被上调的miR基因产物的水平，通过增加在肺癌细胞中被下调的miR基因产物的水平)可成功地治疗肺癌。 

因此，本文中还提供了抑制受试者中的肿瘤发生的方法，所述受试者患有或怀疑患有肺癌，其中至少一种miR基因产物在受试者的癌细胞中失调(例如，下调，上调)。当至少一种分离的miR基因产物(例如，miR-29家族)在癌细胞中被下调时，方法包括施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，或其分离的变体或生物活性片段，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖。 

例如，当miR基因产物在受试者的癌细胞中被下调时，对受试者施用有效量的分离的miR基因产物可抑制癌细胞的增殖。对受试者施 用的分离的miR基因产物可与在癌细胞中被下调的内源野生型miR基因产物(例如，miR基因产物)相同或其可以是其变体或生物活性片段。 

如本文所定义的，miR基因产物的“变体”是指与相应的野生型miR基因产物具有低于100％的同一性并且具有相应的野生型miR基因产物的一种或多种生物活性的miRNA。这样的生物活性的实例包括但不限于靶RNA分子的表达的抑制(例如，抑制靶RNA分子的翻译，调节靶RNA分子的稳定性，抑制靶RNA分子的加工)和与肺癌相关的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。此类变体包括物种变体和其为miR基因中一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)的结果的变体。在某些实施方案中，变体与相应的野生型miR基因产物至少大约70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的同一。 

如本文所定义的，miR基因产物的“生物活性片段”是指miR基因产物的RNA片段，其具有相应的野生型miR基因产物的一个或多个生物活性。如上所述，此类生物活性的实例包括但不限于靶RNA分子的表达的抑制和与肺癌相关的细胞过程的抑制。在某些实施方案中，生物活性片段的长度是至少大约5、7、10、12、15或17个核苷酸。 

在特定的实施方案中，可将分离的miR基因产物与一种或多种另外的抗癌疗法组合来对受试者施用。适当的抗癌疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法和其组合(例如，放化疗(chemoradiation))。 

当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中被上调时，方法包括对受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因产物的表达的化合物(在本文中称为miR基因表达-抑制化合物)，以便癌细胞的增殖被抑制。在特定的实施方案中，至少一种miR表达-抑制化合物特异于选自miR29家族的miR基因产物(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c和其组合)。 

如本文中所使用的，术语“治疗”、“医治”和“疗法”是指改善与疾病或病况例如肺癌相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减少疾病或病况的症状的严重性或频率。术语“受试者”、 “患者”和“个体”在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施方案中，动物是人。 

如本文中所使用的，分离的miR基因产物的“有效量”是足以在患有肺癌的受试者中抑制癌细胞增殖的量。通过考虑因素例如受试者的大小和体重；疾病侵入的程度；受试者的年龄、健康和性别；施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的miR基因产物的有效量。 

例如，分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量。肿瘤块的大致重量可通过计算肿瘤块的大致体积来测定，其中1立方厘米的体积大约等于1克。基于肿瘤块的重量的分离的miR基因产物的有效量可在大约10至500微克/克肿瘤块的范围之内。在某些实施方案中，肿瘤块可以是至少大约10微克/克肿瘤块，至少大约60微克/克肿瘤块或至少大约100微克/克肿瘤块。 

分离的miR基因产物的有效量还可基于待治疗的受试者的大致或估计的体重。优选，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用这样的有效量。例如，对受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可在大约5至大约3000微克/kg的体重，大约700至1000微克/kg的体重的范围内，或大于大约1000微克/kg的体重。 

本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用分离的miR基因产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次(例如，作为单次注射或沉积(deposition))miR基因产物。可选择地，可以每天1次或2次对受试者施用miR基因产物，进行大约3至大约28天，特别地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理解，对受试者施用的miR基因产物的有效量可包括在整个给药方案期间施用的基因产物的总量。 

如本文中使用的，“分离的”miR基因产物是合成的或通过人工 介入从天然状态改变或取出的miR基因产物。例如，合成的miR基因产物，或部分或完全从其天然状态的共存材料分离的miR基因产物被认为是“分离的”。分离的miR基因产物可以以大体上纯化的形式存在，或可以存在于已将所述miR基因产物递送入其中的细胞中。因此，有意地被递送至细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据一个特定的实施方案，本文所描述的分离的miR基因产物可用于制造用于治疗受试者(例如，人)中的肺癌的药物。 

分离的miR基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成RNA分子或合成试剂的提供商包括例如Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，U.S.A.)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，U.S.A.)、Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。 

可选择地，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒表达miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或H1 RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质粒还可包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。 

可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。还可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至癌细胞并且在其中直接表达。下面更详细地论述重组质粒将miR基因产物递送至癌细胞的用途。 

miR基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后通过合适的加工系统(包括但不限于癌细胞中现有的 加工系统)将该前体分子加工成功能性miR基因产物。其他合适的加工系统包括例如体外果蝇细胞裂解物系统(例如，如属于Tuschl等人的美国公开专利申请2002/0086356中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如属于Yang等人的美国公开专利申请2004/0014113中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文)。 

适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒以表达基因产物的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Zeng等(2002)，MolecularCell 9：1327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20：446-448；Brummelkamp等(2002)，Science 296：550-553；Miyagishi等(2002)，Nat.Biotechnol.20：497-500；Paddison等(2002)，Genes Dev.16：948-958；Lee等(2002)，Nat.Biotechnol.20：500-505；和Paul等(2002)，Nat.Biotechnol.20：505-508，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV立即早期启动子(intermediate-early promoter)控制下编码miR前体RNA的序列。如本文中所使用的，“在启动子的控制下”是指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3′端，以便启动子可起始miR基因产物编码序列的转录。 

miR基因产物还可从重组病毒载体表达。预期miR基因产物可从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA或所述RNA可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒载体将miR基因产物递送至癌细胞的用途。 

本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括但不限于U6或H1RNA pol III启动子序列，或巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载体还可包 含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。 

可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向性。 

例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。可通过对载体进行工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来制备本发明的AAV载体，使之靶向不同的细胞。例如，在血清型2型基因组上表达血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV 2/2。AAV 2/2载体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而产生AAV 2/5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，Rabinowitz，J.E.，等(2002)，J.Virol.76：791-801，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RNA的核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达的RNA产物的回收在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Dornburg(1995)，Gene Therapy 2：301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6：608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therapy1：5-14；和Anderson(1998)，Nature 392：25-30，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达miR基因产物的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等(2002)，Nat.Biotech.20：1006-1010，其全部公开内容通过引用合并入本文。用于表达miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Samulski等(1987)，J.Virol. 61：3096-3101；Fisher等(1996)，J.Virol，70：520-532；Samulski等(1989)，J.Virol.63：3822-3826；美国专利5,252,479；美国专利5,139,941；国际专利申请WO 94/13788；和国际专利申请WO93/24641，其全部公开内容通过引用合并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体表达miR基因产物。 

在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6 RNA启动子控制下的与polyT终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“与polyT终止序列有效连接”是指编码有义或反义链的核酸序列以5′方向与polyT终止信号紧密邻接。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。 

在本发明的治疗方法的其他实施方案中，可对受试者施用有效量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表达”是指治疗后miR基因产物的前体和/或活性成熟形式的产量低于治疗前产生的量。通过使用例如上述用于诊断方法的测定miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定miR的表达在癌细胞中是否已被抑制。抑制可在基因表达的水平上(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或在加工的水平上(例如，通过抑制miR前体至成熟的活性miR的加工)发生。 

如本文中所使用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是足以在患有癌症(例如，肺癌)的受试者中抑制癌细胞的增殖的量。通过考虑因素，例如受试者的大小和体重；疾病侵入的程度；受试者的年龄、健康和性别；施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的miR表达抑制化合物的有效量。 

例如，表达抑制化合物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量，如本文中所描述的。抑制miR表达的化合物的有效量还可基于待治疗的受试者的大致的或估计的体重，如本文中所描述的。 

本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用抑制miR表达的化合物的适当的给药方案。 

用于抑制miR基因表达的合适的化合物包括双链RNA(例如短或小干扰RNA或“siRNA”)、反义核酸和酶促RNA分子例如核酶。这些化合物中的每一种可被靶向给定的miR基因产物并且干扰靶miR基因产物的表达(例如，抑制其翻译，诱导其切割或破坏)。 

例如，给定的miR基因的表达可通过用分离的双链RNA(“dsRNA”)分子诱导miR基因的RNA干扰来抑制，所述双链RNA分子与miR基因产物的至少一部分具有至少90％、例如至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性。在特定的实施方案中，dsRNA分子是“短或小干扰RNA”或“siRNA”。 

用于本方法的siRNA包括长度大约17个核苷酸至大约29个核苷酸、优选长度大约19至大约25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包含通过标准Watson-Crick碱基配对相互作用(在下文中称为“碱基配对”)退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含与靶miR基因产物内包含的核酸序列大体上同一的核酸序列。 

如本文中所使用的，siRNA中与靶mRNA内包含的靶序列“大体上同一”的核酸序列是与靶序列同一的核酸序列或与靶序列相异于1或2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义和反义链可包括两个互补的单链RNA分子或可包括其中两个互补部分碱基配对并且通过单链“发夹结构”区域共价连接的单个分子。 

siRNA还可以是与天然存在的RNA相异于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的经改变的RNA。这样的改变可包括非核苷酸材料的添加(例如至siRNA的末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸的添加)，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修饰或用脱氧核糖核苷酸对siRNA中的一个或多个核苷酸的置换。 

siRNA的一条或两条链还可包含3′悬突。如本文中所用的，“3′悬突”是指从双链RNA链的3′-末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包含至少一个长度为1至大约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为1至大约5个核苷酸、长度为1至大约4个核苷酸或长度为大约2至大约4个核 苷酸的3′悬突。在特定的实施方案中，3′悬突存在于siRNA的两条链上，且其长度为2个核苷酸。例如，siRNA的各条链可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′悬突。 

siRNA可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于属于Gewirtz的美国公开专利申请2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请2004/0018176，两者的全部公开内容通过引用合并入本文。 

给定的miR基因的表达还可通过反义核酸抑制。如本文中所使用的，“反义核酸”是指通过RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用与靶RNA结合的核酸分子，其改变靶RNA的活性。适合用于本方法的反义核酸是通常包含与miR基因产物中的连续核酸序列互补的核酸序列的单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸(PNA))。反义核酸可包含与miR基因产物中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补的核酸序列。 

不希望受任何理论束缚，据信，反义核酸激活RNA酶H或降解miR基因产物/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。 

反义核酸还可包含对核酸主链或对糖和碱基部分(或它们的等价物)的修饰，从而增加靶特异性、核酸酶抗性、递送或与分子的功效相关的其他性质。此类修饰包括胆固醇部分、双链体嵌入剂例如吖啶或一种或多种抗核酸酶基团。 

反义核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测的示例性方法在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 261：1004以及属于Woolf等人的美国专利5,849,902，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

给定的miR基因的表达还可通过酶促核酸(enzymatic nucleicacid)抑制。如本文中所使用的“酶促核酸”是指包含与miR基因产物的连续核酸序列具有互补性的底物结合区并且能够特异性切割miR 基因产物的核酸。酶促核酸底物结合区可以例如与miR基因产物中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补。酶促核酸还可包括在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。 

用于本方法的示例性酶促核酸包括从头甲基转移酶包括DNMT3A和DNMT3B，如本文中的实施例中所描述的。 

酶促核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995)，Nucl.Acids Res.23：2092-96；Hammann等人(1999)，Antisense andNucleic Acid Drug Dev.9：25-31；以及属于Cech等人的美国专利4,987,071，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

至少一种miR基因产物或至少一种用于抑制miR表达的化合物的施用将在患有肺癌的受试者中抑制癌细胞的增殖。 

如本文中所使用的，“抑制癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性或暂时地阻止或减缓细胞的生长。如果受试者中癌细胞的数目在施用miR基因产物或miR基因表达抑制化合物后保持恒定或减少，那么可推断癌细胞增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿瘤生长的速度下降，则也可推断癌细胞增殖被抑制。 

受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转移性肿瘤块的大小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通过免疫组织学方法、流式细胞术或经设计用于检测癌细胞的特征表面标志物的其他技术来测量。 

肿瘤块的大小可通过直接目测观察或通过诊断成像法例如X射线、磁共振成像、超声和闪烁造影术(scintigraphy)来测定。可在使用造影剂或不使用造影剂的情况下使用用于测定肿瘤块的大小的诊断成像法，这在本领域内是已知的。肿瘤块的大小还可通过物理方法例如组织块的触诊或利用测量仪器例如测径器测量组织块来测定。 

可通过适合用于将此类化合物递送至受试者的癌细胞的任何方法来对受试者施用miR基因产物或miR基因表达抑制化合物。例如，可 通过适合于用此类化合物或用包含编码此类化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用miR基因产物或miR表达抑制化合物。 

在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。 

用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知的，包括例如核酸至细胞的细胞核或前核(pronucleus)的直接注射、电穿孔、脂质体转移或由亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、基因枪或微粒加速、磷酸钙沉淀以及由病毒载体介导的转染。 

例如，细胞可用质脂体转移化合物例如DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等价物例如LIPOFECTIN进行转染。使用的核酸的量对于实施本发明不是至关重要的；可接受的结果可用0.1-100微克核酸/10⁵个细胞来获得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大约0.5微克质粒载体/10⁵个细胞的比例。 

还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用miR基因产物或miR基因表达抑制化合物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内递送。合适的胃肠外施用途径包括例如血管内施用(例如，静脉内团注(bolus injection)、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织外周(peri-tissue)和组织内注射(例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其他安置装置(例如，视网膜丸剂(retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或凝胶状材料的植入物)；以及吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和直接注射入肿瘤。 

在本方法中，miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物可以以裸露的RNA形式、与递送试剂一起或以包含表达miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)的形式对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TKO亲脂试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)和脂质体。 

含有表达miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的重组质粒和病毒载体以及用于将此类质粒和载体递送至癌细胞的技术在本文中进行了论述和/或在本领域内是熟知的。 

在特定的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体还可增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常包括中性的或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多用于制备脂质体的方法，例如如Szoka等人(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467；和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公开内容通过引用合并入本文)中所描述的方法。 

用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合在癌细胞中普遍的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。 

用于本方法的脂质体还可进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体在表面具有调理作用-抑制部分或所述部分被整合入脂质体结构。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制部分和配体。 

用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体膜结合的巨大的亲水聚合物。如本文中所使用的，调理作用-抑制部分，当其通过化学或物理方式(例如通过将脂溶性锚嵌入膜本身或通过与膜脂质的活性基团直接结合)附着至膜时，与脂质体膜“结合”。此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的保护性表面层；例如，如美国专利4,920,016中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

适合于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有大约500至大 约40,000道尔顿，更优选大约2,000至大约20,000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性的、分支的或树枝状聚酰胺-胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基化学连接的聚木糖醇和聚乙烯醇，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶(carrageenan)；胺化的多糖或低聚糖(线性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例如与碳酸的衍生物反应从而与羧基连接的多糖或低聚糖。优选，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化的脂质体”。 

可通过许多熟知的技术中的任一种将调理作用抑制部分结合至脂质体膜。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺脂质可溶性锚结合，然后再与膜结合。类似地，可使用Na(CN)BH₃和溶剂混合物(例如以30∶12比例的四氢呋喃和水)在60℃下通过还原胺化作用，用硬脂酰胺脂质可溶性锚衍生葡聚糖(dextran)聚合物。 

用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持更长时间。因此，此类脂质体有时称为“隐形(stealth)”脂质体。已知隐形脂质体在通过多孔或“渗漏”微脉管系统供养的组织中积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如肺肿瘤将有效地积累这些脂质体；参见Gabizon等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，18：6949-53。此外，减少的通过RES的吸收通过阻止脂质体在肝和脾中的大量积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适合用于将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。 

可在对受试者施用前，按照本领域已知的技术将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物配制为药物组合物，有时称为“药剂”。因此，本发明包括用于治疗肺癌的药物组合物。 

在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物或其分离的变体或生物活性片段，和药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，至少一种miR基因产物相应于在肺癌细胞中，相对于适当的对照细胞具有减少的表达水平的miR基因产物。在某些实施方案中，分离的miR基因产物选自miR29a、miR-29b、miR-29c和其组合。 

在其他实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制化合物。在特定的实施方案中，至少一种miR基因表达抑制化合物对于miR基因(所述miR基因的表达在肺癌细胞中比在对照细胞中高)是特异性的。在某些实施方案中，miR基因表达抑制化合物对于一种或多种选自miR29a、miR-29b、miR-29c和其组合的miR基因产物是特异性的。 

本发明的药物组合物的特征在于至少是无菌的且无热原的。如本文中所用的，“药物组合物”包括用于人和兽医用途的制剂。制备本发明的药物组合物的方法在本领域技术人员的能力范围内，例如如Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文。 

本药物组合物包含至少一种与药学上可接受的载体混合的miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种含有编码它们的序列的核酸)(例如，按重量计算0.1至90％)，或其生理学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的药物组合物额外包含一种或多种抗癌剂(例如，化学治疗剂)。本发明的药物制剂还可包含至少一种被脂质体封装的miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种含有编码它们的序列的核酸)和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包含为miR29a、miR-29b和miR-29c的一种或多种的miR基因或基因产物。 

特别适合的药学上可接受的载体是水、缓冲的水、生理盐水、0.4％的盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸等。 

在特定的实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抗核酸酶降解的miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种含有编码它们的序列的核酸)。 

本领域技术人员可通过将一个或多个在2′-位置上进行修饰的核糖核苷酸掺入miR基因产物来容易地合成抗核酸酶的核酸。适当的2′-修饰的核糖核苷酸包括在2′-位置上用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。 

本发明的药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂(osmolalityadjusting agent)、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括例如生理上生物相容性缓冲剂(例如，氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合络合物(例如，DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)的添加，或任选地，钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的添加。本发明的药物组合物可以以液体形式包装使用或可以进行冻干。 

对于本发明的固体药物组合物，可使用常规无毒性的固体的药学上可接受的载体：例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。 

例如，用于口服施用的固体药物组合物可包含上文所列的任何载体和赋形剂以及10-95％，优选25％-75％的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可包含封装在上文所述的脂质体中的按重量计算0.01-20％，优选1％-10％的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和喷射剂。需要时还可包含载体例如卵磷脂以用于鼻内递送。 

本发明的药物组合物还可包含一种或多种抗癌剂。在特定的实施方案中，组合物包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合 物(或至少一种含有编码它们的序列的核酸)和至少一种化学治疗剂。适合于本发明的方法的化学治疗剂包括但不限于DNA-烷化剂、抗肿瘤抗生素剂、抗代谢剂(anti-metabolic agent)、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、激素拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、CDK抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三链螺旋DNA、核酸适体和分子修饰的病毒、细菌和外毒素剂(exotoxic agent)。用于本发明的组合物的适当的试剂的实例包括但不限于阿糖胞苷(cytidinearabinoside)、甲氨蝶呤、长春新碱、依托泊苷(VP-16)、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、顺铂(CDDP)、地塞米松、arglabin、环磷酰胺、溶肉瘤素(sarcolysin)、甲基亚硝脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、长春碱、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、过氧化氢、奥沙利铂、伊立替康、托泊替康、亚叶酸、卡莫司汀、链佐星、CPT-11、紫杉醇、它莫西芬、达卡巴嗪、利妥昔单抗、柔红霉素、1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶(arabinofuranosylcytosine)、伊马替尼、氟达拉滨、多西他赛、FOLFOX4。 

本文中还提供了鉴定肿瘤发生抑制剂的方法，所述方法包括给细胞提供测试试剂和测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，方法包括给细胞提供测试试剂和测量至少一种在癌细胞中具有减少的表达水平的miR基因产物的水平。在提供试剂后，相对于适当的对照细胞(例如，未提供试剂)，细胞中miR基因产物的水平的增加表示测试试剂是肿瘤发生的抑制剂。在特定的实施方案中，至少一种在癌细胞中具有减少的表达水平的miR基因产物选自miR29a、miR-29b、miR-29c和其组合。 

在其他实施方案中，方法包括给细胞提供测试试剂和测量至少一种在癌细胞中具有增加的表达水平的miR基因产物的水平。在提供试剂后，与适当的对照细胞(例如，未提供试剂)相比较，细胞中miR基因产物水平的减少表示测试试剂是肿瘤发生的抑制剂。在特定的实施方案中，至少一种在癌细胞中具有增加的表达水平的miR基因产物 选自miR29a、miR-29b、miR-29c和其组合。 

适当的试剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白质、核酸)。试剂可重组产生、合成产生，或其可从天然来源分离(即，纯化)。用于给细胞提供此类试剂的各种方法(例如，转染)在本领域内是熟知的，且下文中描述了几种这样的方法。用于检测至少一种miR基因产物的表达的方法(例如，Northern印迹、原位杂交、RT-PCR、表达特征谱分析)在本领域内也是熟知的。在下文中也描述了几种此类方法。 

现通过下列非限定性实施例举例说明本发明。 

实施例1 

在肺癌患者中，MiR-29的表达与DNMT3A和3B呈负相关。此外，miR-29直接靶向DNMT3A和3B。肺癌细胞系中增强的miR-29的表达恢复DNA甲基化的正常模式，诱导甲基化沉默的肿瘤抑制基因(TSG)例如FHIT和WWOX¹⁴的再表达，并在体外和体内抑制致瘤性。 

这些发现支持miR-29在NSCLC的表观遗传调控中的作用，从而为开发用于治疗肺癌的基于miR的策略提供了理论依据。 

利用组织微阵列(TMA)的免疫组织化学分析来分析172个配对的非肿瘤性/原发性NSCLC组织对。如图5所示，更高的DNMT3A蛋白的表达与更低的总存活显著相关(P＝0.029)。在该患者群体中未观察到DNMT1和DNTM3B与存活的统计学上显著的相关性。 

为了在体内验证这些miRNA-靶相互作用，将DNMT3A和DNTM3B的互补位点克隆入萤火虫萤光素酶基因的3′UTR并且与miR-29a、mi-R29b或miR-29c一起共转染入A459(NSCLC)细胞。 

如图2a中所示，相对于混杂寡核苷酸，所有3种miRNA(miR-29a、mi-R29b或miR-29c)显著减少萤光素酶的活性。为了估计单个miR-29序列的异位表达是否诱导内源DNMT3A和DNTM3B mRNA水平的下调，我们还在用混杂RNA或用miR-29转染的A549和H1299肺癌来源的细胞中进行了定量RT-PCR(qRT-PCR)。 

单个miR-29的过表达诱导了DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的显著降低(图2b，上图)，然而用反义分子沉默miR-29诱导了DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的上调(图2b，下图)(只显示A549细胞的结果)。 

为了证明miR-29的过表达可下调Dnmt3A和3B蛋白的表达，我们使用GFP-报告载体QBI-GFP25。 

简而言之，我们将DNMT3A和DNMT3B的3′UTR克隆到QBI-GFP25载体的GFP编码序列的下游，从而允许含有DNMT3A或DNMT3B的3′UTR的融合GFP蛋白表达。用GFP-3A/3B-3′UTR-载体和miR-29a、29b、29c或混杂寡核苷酸共转染A549细胞。在用miR-29转染的细胞中观察到GFP蛋白，特别地GFP-3B-3′UTR蛋白的表达显著降低(图2c)；蛋白质表达结果与通过qRT-PCR获得的结果一致，其中内源DNMT3BmRNA因miR-29的表达而更显著降低(图2b)。 

然而不希望受理论束缚，现认为与DNMT3A相比，DNMT3B的优先下调可能归因于miR-29与3B 3′-UTR的预测的配对“种子”的数目(对于29a，3个；对于29b，1个；对于29c，1个)总体上比与3A 3′-UTR的(对于各miR-29，1个)更多。 

此外，DNMT3B 3′UTR为miR-29a和为29b/c配对提供了相异不超过1个核苷酸的配对位点。因此，根据miRNA可通过一个基因上的多个靶位点协同作用的“协同原理”，使用miR-29家族的任何成员的转染可导致对DNMT3B比对DNMT3A更强的沉默^10，23。 

为了显示DNMT3B 3′UTR与miR-29b的直接的功能性相互作用，通过使用miRNA作为内源细胞质引物在mRNA模板上合成cDNA，将最近描述的检测方法用于检测真核细胞中的miRNA-mRNA复合物²⁴。内源miR-29b，在Pictar-预测的与3′UTR相互作用的位点上⁸，能够用作起始DNMT3B mRNA的逆转录的“天然”引物(图2d)。 

然后确定DNMT3A和DNMT3B mRNA的表达在原发性NSCLC组织中与miR-29的水平是否呈负相关。通过qRT-PCR²⁵就DNMT3A和DNMT3B mRNA的表达水平以及就miR-29a、29b和29c的表达分析14(14)个NSCLC。在DNMT3A mRNA与miR-29a(P＝0.02)和miR-29c(P＝0.02)之间观察到 统计学上显著的负相关(图6)。 

观察到DNMT3B mRNA水平与miR-29a(P＝0.02)和miR-29c(P＝0.04)的相似的负相关性。虽然DNMT3A和DNMT3B mRNA水平与miR-29b水平存在朝向负相关的趋势，但相关性在统计学上不显著(DNMT3A P＝0.14，DNMT3B P＝0.09)，这可能归因于分析的癌症数量较少或归因于这样的事实，即虽然miR-29a和29c分别只从第7和第1号染色体上的一个染色体位置转录，但成熟miR-29b可从不同染色体上的两个不同原始转录本(7q32.3上的miR-29b-1/miR-29a簇和1q32.2上的miR-29b-2/miR-29c簇)转录。用于qRT-PCR以测定miR-29b的成熟产物的探针不能区别29b-1或29b-2基因产物。 

miR-29靶向DNMT3A和DNMT3B的发现显示此类miRNA的表达促成了癌症中的DNA表观遗传修饰。为了阐明该问题，用miR-29a、miR-29b、miR-29c或混杂寡核苷酸转染A549细胞，然后使用LC-MS/MS方法²⁶在48和72小时后分析总DNA甲基化。 

如图3a中所示，相对于对照，所有三种miR-29减少总DNA甲基化。miR-29b的作用显示更强，在48小时后产生30％的减少，在72小时后产生40％的减少。在用miR-29b处理的细胞中观察到的总甲基化减少的百分数与利用DNMT1抑制剂例如地西他滨²⁶观察到的相当，并且对于任一方法来说都是不完全的。然而不希望受理论束缚，本发明者在本文中现认为可通过将地西他滨(或其他核苷类似物)与miR-29组合来获得更强的总DNA低甲基化，从而阻断从头和维持DNMT途径。 

为了表征甲基化变化对基因表达的作用，分析在肺癌中通常被启动子甲基化沉默的两种TSG，FHIT和WWOX¹⁴的mRNA表达水平。 

如图3b上图中所示，转染A549细胞后48小时，FHIT表达分别被miR-29a、29b和29c的表达增加大约65％、89％和74％，并且WWOX mRNA水平分别被miR-29a和29b增加大约40％和60％；在H1299细胞中观察到相似的趋势(图3b，下图)。 

在两个细胞系中也都观察到FHIT和WWOX蛋白的增加的表达(图3c)。 

为确定miR-29是否通过改变这些基因的启动子甲基化来调控FHIT和WWOX的表达，使用MassARRAY系统²⁷(定量高通量DNA甲基化分析)在用miR-29b转染的A549和H1299细胞中检查FHIT和WWOX的调控区域的甲基化状态。设计两个亚硫酸氢盐反应(每个基因CpG岛一个)，对于FHIT和WWOX，其分别覆盖7个CpG和11个CpG。在miR-29b转染的H1299和A549细胞中，FHIT的MassARRAY分析分别显示平均19.1％和54.3％的甲基化减少，然而在H1299中对于WWOX，与混杂寡核苷酸相比较，显示平均32.1％的减少(图3d)。 

还估量了miR-29的再表达对A549细胞的致瘤性的作用。miR-29在A549中的异位表达在体外抑制细胞生长(图4a)，并且相对于混杂对照转染诱导了细胞凋亡(图4b)。 

还在体内观察到miR-29对A549的致瘤性的抑制作用。相对于模拟对照和混杂寡核苷酸转染的细胞，利用miR-29的转染抑制了A549移植肿瘤的生长(图4c，4d，4e)，从而说明了此类miRNA的可能的抗瘤作用。 

因此，本实施例显示miR-29家族成员的表达在肺癌中与DNMT3A和DNMT3B的表达呈负相关并且此类miRNA下调两种酶的表达水平。 

此外，肺癌细胞中此类miRNA的增强的表达导致减少的总DNA甲基化，恢复TSG的表达，且在体外和体内抑制致瘤性。这些结果可用于开发单独地或与其他疗法组合使用合成的miR-29的新型表观遗传疗法，以在肺癌中重新激活肿瘤抑制基因，并且使异常的甲基化模式恢复正常。由于在其他常见人恶性肿瘤中观察到miR-29家族成员的表达的丧失，因此可将该方法扩展至其他人恶性肿瘤的治疗。 

方法。 

样品 

我们从The Ohio State University的Pathology Core Facility获得172个肺癌样品，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌和神经内分泌大细胞癌(统称为非小细胞肺癌(NSCLC))，以进行关于DNMT表达的组织微阵列(TMA)。这些患者的临床特征(组织学诊断、性别、年龄、 TNM状态和存活时间)是可获得的。 

从Cooperative Human Tissue Network-Midwestern Division，Columbus，OH购得原发性肺癌组织(8个鳞状细胞癌和6个腺癌)以进行qRT-PCR分析。按照厂商说明书，利用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取法来分离总RNA。 

组织微阵列 

组织微阵列(TMA)：各阵列包含每一个肺癌的4个样品以及多个适当的肺和其他正常组织的点。用抗DNMT1、DNTM3A和DNMT3B蛋白的抗血清对TMA染色(通常对于每一种抗血清使用2个TMA)，将肺癌中每一个此类酶的表达与临床特征相比较以寻找显著相关性。使用1∶150的稀释度的GeneTex的DNMT1抗血清(GTX13537，San Antonio，TX)、1∶25的稀释度的Novus Biologicals的DNMT3A抗血清(ab-4897，Littleton，CO)和1∶32的稀释度的Abgent的DNTM3B抗血清(AP1035a，San Diego，CA)在肺癌TMA上估量DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的表达。将来自TMA块的4微米切片置于带正电荷的载玻片上，置于60℃烘箱中1小时，然后冷却，然后通过二甲苯和梯度乙醇溶液(进行至水)而脱蜡和再水化。将载玻片在3％过氧化氢中淬灭5分钟以封闭内源过氧化物酶。在TRS(Dako，Carpinteria，CA)溶液中于95℃下收回(retrieve)抗原，进行25分钟。将载玻片于室温下暴露于第一抗血清进行1小时，然后于室温下暴露于第二抗血清(1∶200)进行20分钟；第二抗血清是山羊抗小鼠(对于DNMT1)和山羊抗兔(对于DNMT3A和DMT3B)。在应用生物素化的第二抗血清之前，针对内源生物素封闭所有载玻片。使用Vectastain Elite(Vector，cat# PK-6100)进行生色团检测，进行30分钟。底物生色团是DAB+(Dako，cat# K3468)。使用苏木精对载玻片进行复染，通过梯度乙醇溶液脱水，然后盖上盖玻片。 

由对临床特征不知情的病理学家阅读TMA并且对其打分；通过将个体样品中的阳性细胞的百分数乘以染色强度来测定表达评分；以1至3的等级评估染色强度，其中1是最低强度的染色，3是最高强度。 例如，具有10％的强度为3的阳性细胞的样品被赋予30的评分，与具有30％的强度为1的阳性细胞的样品评分相同。 

定量RT-PCR。按照厂商说明书，使用TaqMan MicroRNA测定试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)以一式三份进行miRNA的定量RT-PCR(qRT-PCR)分析。将18S RNA用于标准化；如之前所述¹进行其他目的基因的qRT-PCR分析。利用基因特异性引物和IQ SYBRGreen Supermix(Biorad，Hercules，CA)将RNA逆转录成cDNA。GAPDH用作标准化对照。关于miR-29的沉默，按照厂商的方案通过使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用100nM(终)反义miR-29a、29b-1、29c或混杂反义miR(Fidelity Systems，Gaithersburg，MD)在6孔板中转染A549和H1299细胞。 

细胞培养。将来自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)的A549和H1299肺癌细胞维持在具有10％FBS和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的RPMI培养基1640中。 

靶向DNMT 3′UTR的萤光素酶报告基因测定法。为了进行萤光素酶报告基因实验，通过PCR从人基因组DNA扩增979bp的DNMT3A 3′UTR区段和978bp的DNMT3B 3′UTR区段，然后利用紧在萤光素酶的终止密码子上游的XbaI位点，将其插入具有SV40启动子的pGL3-对照载体(Promega)。使用下列引物组产生特定片段： 

DNMT3A-UTR Fw：5’-GCTCTAGAGCCGAAAAGGGTTGGACATCAT-3’，[SEQ ID NO：15] 

DNMT3A-UTR Rv：5’-GCTCTAGAGCGCCGAGGGAGTCTCCTTTTA-3’；[SEQ ID NO：16] 

DNMT3B-UTR Fw：5’-GCTCTAGAGCTAGGTAGCAACGTGGCTTTT-3’，[SEQ ID NO：17] 

DNMT3B-UTR Rv：5’-GCTCTAGAGCGCCCCACAAAACTTGTCAAC-3’.[SEQ ID NO：18] 

DNMT 3A的扩增的3′UTR在位点583上含有XbaI限制性位点，因此我们将上游3′UTR(DNMT 3A 3′-UTRup＝583bp)和下游片段(DNMT3A 3′-UTRdown＝396bp)分开地克隆入pGL3载体。预测的miR-29的配对种子位于DNMT3A 3′-UTR下游片段，将其用于进行萤光素酶测定。 

按照厂商的方案，通过使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用0.4μg萤火虫萤光素酶报告载体和0.08μg含有海肾萤光素酶的对照载体pRL-TK载体(Promega)在12孔板中共转染A549细胞。对于每一个孔，使用100nM(终)的前体miR-29a、29b-1、29c或混杂miR(Ambion)。在转染后24小时，通过使用双重-萤光素酶测定法(Promega)连续测量萤火虫和海肾萤光素酶活性。以一式三份进行实验。 

评估DNMT 3′UTR对蛋白质表达的作用的GFP-抑制构建体。对于GFP-抑制，通过PCR从人基因组DNA扩增1472bp的DNMT3A 3′UTR区段和1566bp的DNMT3B 3′UTR区段(相应于3′UTR的全长)，然后利用位于载体(其在GFP编码序列的末端没有终止密码子)的GFP编码序列的3’的BamHI-EcoRI克隆位点，将其插入QBI-GFP25载体(Autofluorescent Proteins，Canada)。使用下列引物组产生特定片段： 

DNMT3A-GFP Fw：5’-CGGGATCCGCAGGATAGCCAAGTTCAGC-3’，[SEQID NO：19] 

DNMT3A-GFP Rv：5’-CCCAAGCTTAAGTGAGAAACTGGGCCTGA-3’；[SEQ ID NO：20] 

DNMT3B-GFP Fw：5’-CGGGATCCCTCGATCAAACAGGGGAAAA-3’，[SEQID NO：21] 

DNMT3B-GFP Rv：5’-CCCAAGCTTGTTACGTCGTGGCTCCAGTT-3’[SEQID NO：22]. 

按照厂商的方案使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用2μg含有DNMT3A的3′UTR(QBI-GFP25-DNMT3A)或DNMT3B的3′UTR(QBI-GFP25-DNMT3B)的GFP抑制载体和100nM(终)的前体miR29a、29b-1、29c或混杂寡核苷酸(Ambion)在12孔板中共转染A549细胞。作为另外的对照，还用GFP载体(无miR)转染一组细胞。在24 小时后收获细胞。如之前所述²进行蛋白质提取和免疫印迹分析。使用下列第一抗血清：兔多克隆抗-GFP，1∶1000(Novus Biologicals，Littleton，CO)。 

miR 29b-DNMT3B RNA复合物的检测。为了检测miR-29b-DNMT3BRNA复合物，我们使用由Vatolin S.等描述的方法³来确定内源miR-29b在A549细胞中是否能够用作逆转录DNMT3B mRNA的引物。将cDNA克隆入pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。使用下列引物组和接头(adapter)序列(GSP意指基因特异性引物)： 

GSP-DNMT3B：5’-GAGATGACAGGGAAAACTGC-3’；[SEQ ID NO：23] 

GSP-DNMT3B 5N：5’-ACAGGGAAAACTGCAAAGCT-3’；[SEQ ID NO：24] 

接头：5’- 

CGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAA-3’；[SEQ IDNO：25] 

接头：5N：5’-CTGAAGGAGTAGAAA-3’[SEQ ID NO：26]. 

引物5N代表来自用于使PCR条带的检测更灵敏的GSP序列和接头的嵌套引物(nested primer)。 

总甲基化研究。如之前所述⁴测定在用混杂miRNA和用miR-29转染后A549细胞的总甲基化状态。对于该测定，如上对于萤光素酶测定所描述的，转染2×10⁶个A549细胞，48和72小时后收集细胞。 

定量DNA甲基化。使用EpiTYPER甲基化分析测定法(Sequenom，San Diego，CA)进行FHIT和WWOX的调控区域的定量DNA甲基化分析。设计两个亚硫酸氢盐反应(每个基因CpG岛一个反应)，对于FHIT和WWOX其分别覆盖7个CpG和11个CpG。在转染后48小时提取混杂-或miR-29b-转染的A549/H1299的DNA，对1μg DNA进行亚硫酸氢盐处理，体外转录，用RNA酶A进行切割，然后经历基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析以确定甲基化模式，如所描述的⁵。使用下列引物扩增FHIT和WWOX基因的调控区： 

FHIT Fw：5’-GGGGAGGTAAGTTTAAGTGGAATATTGTT-3’[SEQ ID NO：27] 

FHIT Rv：5’-CACCCCCAAAACCAAAAACTATAAC-3’[SEQ ID NO：28] 

WWOX Fw：5’-TTGAAAGAAAGTTTTTTAAAATTAGGAAAT-3’[SEQ IDNO：29] 

WWOX Rv：5’-TCAAAAAAACAAAACCTAAAAAAAA-3’[SEQ ID NO：30]. 

使用由Stanford University提供的Heatmap builder version1.0产生图3d中的热图(heatmap)。 

FHIT和WWOX蛋白的Western印迹分析。如之前所述²进行蛋白质提取和免疫印迹分析。使用下列第一抗血清：兔多克隆抗-FHIT，1∶1000(Zymed，San Francisco，CA)；小鼠单克隆抗-WWOX，1∶500(如参考文献2中)。使用Molecular Dynamics Personal Densitometer SI和IMAGEQUANT 5.2软件(Image Products International，Chantilly，VA)进行FHIT、WWOX和Gapdh的信号的定量。 

细胞生长曲线。将A549细胞(5×10⁴)涂板在6x多孔板中，24小时后，按照厂商的方案，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用终浓度100nM的来自Ambion的混杂寡核苷酸或miR-29寡核苷酸进行转染。作为对照，还包括未转染的(模拟)细胞。收获细胞，以24小时的间隔使用ViCell计数器(Beckman Coulter，Fullerton，CA)计数细胞。各样品以一式三份进行实验。 

细胞凋亡和流式细胞术研究。按照厂商的方案，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用100nM终浓度的来自Ambion的混杂寡核苷酸或miR-29寡核苷酸转染A549细胞(2×10⁵)。24小时后，按照提供商的说明书，将细胞重悬浮于含有膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶的结合缓冲液(BD Biosciences，San Diego，CA)中，然后使用Beckman-Coulter model EPICS XL细胞计数器(Beckman-Coulter)通过流式细胞术进行估量。各样品以一式三份进行实验。 

体内研究。按照制度化的指导方针(institutional guideline)进行动物研究。按照厂商的方案通过使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，A549细胞用100nM(终浓度)的混杂(Scr)寡核苷酸或miR-29a、-29b或-29c体外转染，或进行模拟转染。在转染后48小时时，将3×10⁶个活细胞皮下注射入6周龄雌性裸小鼠(Charles RiverBreeding Laboratories，Wilmington，MA)的左胁腹，每组5只小鼠。在注射后7天测量肿瘤直径，然后每5天测量一次。在注射后第21天，杀死小鼠，在尸体剖检后测量肿瘤的重量。通过使用公式V(以mm³表示)＝A×B²/2测定肿瘤体积，其中A是最大直径，B是垂直直径。 

统计分析。P值是双向的(two-sided)，并使用SPSS软件包(SPSS10.0)来获得。从诊断的时间直至最后一次跟踪观察的日期计算总存活。检查最后一次跟踪观察时活着的患者的数据。为了进行存活分析和产生Kaplan-Meier(KM)曲线，通过将样品分成两组(高和低表达，按照DNMT评分＜10(低)或＞10(高))来将利用免疫组织化学染色测量的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B水平转变成离散变量。可获得各组的存活曲线，并且通过使用时序检验(log-ranktest)进行比较。为了评估miRNA表达和DNMT表达之间的相关性，我们使用皮尔森相关性(Pearson correlation)和线性回归分析(SPSS软件包)。这些函数检查每一对测量值(一个来自miRNA，另一个来自DNMT)以确定两个变量是趋向于一起还是反向移动，即miRNA的更大的值(高表达)是否与DNMT表达的更低的值相关。 

实施例2 

用于诊断、分期、预后、监控和治疗肺癌相关疾病的方法、试剂和试剂盒。 

应理解，本文所中有实施例在它们的范围内将被认为是非限定性的。在下面部分更详细地描述各个方面。 

诊断方法 

在一个实施方案中，提供了评估患者是否患有肺癌相关疾病或具有高于正常的发生肺癌相关疾病的风险的诊断方法，所述方法包括将患者样品中标志物的表达水平与对照例如来自无肺癌相关疾病的患者的样品中的标志物的正常表达水平相比较的步骤。 

与正常水平相比，患者样品中显著更高的标志物表达水平表示患者患有肺癌相关疾病或具有高于正常的发生肺癌相关疾病的风险。 

选择标志物以使该方法的阳性预测值为至少大约10％，在某些非限定性实施方案中，大约25％、大约50％或大约90％。也优选用于本方法的是与正常细胞相比较在至少大约20％，在某些非限定性实施方案中，大约50％或大约75％的细胞中差异表达至少2倍的标志物。 

在一个评估患者是否患肺癌相关疾病的诊断方法(例如，新检测(“筛查”)、复发的检测、反射测试(reflex testing))中，方法包括比较：a)患者样品中标志物的表达水平，和b)对照非肺癌相关疾病样品中标志物的正常表达水平。与正常水平相比较患者样品中显著更高的标志物表达水平表示患者患有肺癌相关疾病。 

还提供了用于评估抑制患者的肺癌相关疾病的疗法的效果的诊断方法。此类方法包括比较：a)在对患者提供至少一部分治疗之前从患者获得的第一样品中标志物的表达，和b)在提供部分治疗后从患者获得的第二样品中标志物的表达。相对于第一样品中标志物的表达水平，第二样品中显著更低的标志物的表达水平表示疗法对于抑制患者的肺癌相关疾病是有效的。 

应理解，在此类方法中，“疗法”可以是治疗肺癌相关疾病的任何疗法，包括但不限于药物组合物、基因疗法和生物疗法例如抗体和趋化因子的施用。因此，本文中描述的方法可用于评估治疗前、治疗期间和治疗后的患者，例如用于评估疾病状态的减轻。 

在某些方面，诊断方法关注于使用化学或生物试剂的疗法。此类方法包括比较：a)从患者获得的并且在化学或生物试剂存在的情况下维持的第一样品中标志物的表达，和b)从患者获得的并且在所述试剂不存在的情况下维持的第二样品中标志物的表达。相对于第一样品中 标志物的表达水平，第二样品中显著更低的标志物的表达水平表示试剂对于抑制患者的肺癌相关疾病是有效的。在一个实施方案中，第一和第二样品可以是从患者获得的单个样品的部分或从患者获得的混合样品的部分。 

评估预后的方法 

还提供了用于评估患者的肺癌相关疾病的进展的监控方法，所述方法包括：a)在第一时间点检测患者样品中标志物的表达；b)在随后的时间点及时重复步骤a)；和c)比较步骤a)和b)中检测的表达水平，从而监控患者的肺癌相关疾病的进展。与第一时间点上的样品的标志物的表达水平相比，在随后的时间点上的样品中显著更高的标志物的表达水平表示肺癌相关疾病已向前发展，而显著更低的表达水平表示肺癌相关疾病已消退。 

还提供了用于确定肺癌相关疾病是否已恶化或可能在将来恶化的诊断方法，所述方法包括比较：a)患者样品中标志物的表达水平，和b)对照样品中标志物的正常表达水平。与正常水平相比较，患者样品中显著更高的表达水平表示肺癌相关疾病已恶化或可能在将来恶化。 

评估抑制性、治疗性和/或有害组合物的方法 

还提供了用于选择抑制患者的肺癌相关疾病的组合物的检测方法。该方法包括步骤：a)从患者获得含有细胞的样品；b)在多种受试组合物存在的情况下分别维持样品的等分；c)比较各等分中标志物的表达；和d)选择其中的一种受试组合物，所述组合物，相对于在其他受试组合物存在的情况下标志物的表达水平，显著减少含有该受试组合物的等分中标志物的表达水平。 

另外提供了评估化合物在引起肺癌相关疾病中的有害潜能的检测方法。该方法包括步骤：a)在化合物存在和不存在的情况下维持分开的细胞等分；和b)比较各等分中标志物的表达。相对于在化合物不存在的情况下维持的等分中标志物的表达水平，在化合物存在的情况下维持的等分中显著更高的标志物的表达水平表示化合物具有这样的有害潜能。 

此外，还提供了抑制患者的肺癌相关疾病的方法。该方法包括步骤：a)从患者获得含有细胞的样品；b)在多种组合物存在的情况下分别维持样品的等分；c)比较各等分中标志物的表达；和d)对患者施用至少一种组合物，所述组合物，相对于在其他组合物存在的情况下标志物的表达水平，在含有该组合物的等分中显著降低标志物的表达水平。 

样品中标志物的表达水平可以例如通过检测下列物质在样品中的存在来估量：相应的标志物蛋白或所述蛋白的片段(例如，通过使用特异性结合所述蛋白或蛋白片段的试剂，例如抗体、抗体衍生物、抗体片段或单链抗体)、相应的标志物核酸(例如，核苷酸转录物或其互补序列)或所述核酸的片段(例如，通过将从样品获得的转录的多核苷酸与在其上附着有一个或多个具有完整的所述核酸的序列或其区段或其互补序列的核酸的基质接触)、由相应的标志物蛋白直接(即，催化)或间接产生的代谢产物。 

可使用至少一个或多个(例如，2、3、5或10或更多个)肺癌相关疾病标志物进行任何上述方法。在此类方法中，将多个标志物(其中至少一个是标志物)中的每一个在样品中的表达水平与多个标志物中的每一个在从未患有肺癌相关疾病的对照人获得的相同类型的样品中的正常表达水平相比较。相对于该标志物的相应的正常或对照水平，一个或多个标志物或其一些组合在样品中显著改变的(即，如在上述使用单个标志物的方法中所详细说明的增加或减少)表达水平表示患者患有肺癌相关疾病。对于所有上述方法，选择标志物以使方法的阳性预测值是至少大约10％。 

候选试剂的实例 

候选试剂可以是本领域已知的药理学试剂(pharmacologicagent)或可以是之前未知的具有任何药理活性的试剂。试剂可以是天然产生的或实验室中设计的。它们可从微生物、动物或植物分离，或可重组产生或通过任何适当的化学方法合成。它们可以是小分子、核酸、蛋白质、肽或模拟肽(peptidomimetics)。在某些实施方案中， 候选试剂是具有大于50且小于大约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构性相互作用所必需的官能团。还在生物分子中发现候选试剂，包括但不限于：肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。 

可从多种来源(包括合成的或天然化合物的文库)获得候选试剂。存在例如许多可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物学方法进行修饰，并且可用于产生组合文库。在某些实施方案中，候选试剂可使用组合文库方法领域中的许多方法中的任一方法来获得，所述方法包括非限定性实例：生物文库法；空间可定位平行固相或溶液相文库法(spatially addressable parallel solidphase or solution phase libraries)；需要解卷积(deconvolution)的合成文库法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。 

在某些其他实施方案中，可将某些药理学药剂经历定向或随机化学修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以产生结构类似物。 

用于鉴定治疗肺癌相关疾病的治疗剂的相同方法还可用于验证体外研究产生的前导化合物(lead compound)/试剂。 

候选试剂可以是上调或下调一个或多个肺癌相关疾病应答途径的试剂。在某些实施方案中，候选试剂可以是影响这样的途径的拮抗剂。 

用于治疗肺癌相关疾病的方法 

本文提供了用于治疗、抑制、减轻或逆转肺癌相关疾病应答的方法。在本文所述的方法中，对有此需要的个体施用干扰信号级联的试剂，所述个体例如但不限于其中这样的并发症还不明显的肺癌相关疾病患者和已具有至少一种肺癌相关疾病应答的患者。 

在前一种情况下，这样的治疗用于预防此类肺癌相关疾病应答的 发生和/或减轻它们发生的程度。在后一种情况下，这样的治疗用于减轻此类肺癌相关疾病应答发生的程度，阻止它们进一步发展或逆转肺癌相关疾病应答。 

在某些实施方案中，干扰肺癌相关疾病应答级联的试剂可以是对此类应答特异的抗体。 

标志物的表达 

可以以许多方式抑制标志物的表达，所述方式包括非限定性实例：可对肺癌相关疾病细胞提供反义寡核苷酸以抑制标志物的转录、翻译或两者。备选地，可对细胞提供编码特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当的启动子/调节子区域有效连接的多核苷酸，以产生抑制所述蛋白的功能或活性的细胞内抗体。标志物的表达和/或功能还可通过用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理肺癌相关疾病细胞来抑制。通过使用本文中描述的方法，可筛选多种分子，特别地包括足够小以使它们能够穿过细胞膜的分子，以鉴定抑制标志物的表达或抑制标志物蛋白的功能的分子。可对患者提供如此鉴定的化合物以抑制患者的肺癌相关疾病细胞。 

任何标志物或标志物的组合，以及与所述标志物组合的任何特定标志物可用于本文中描述的组合物、试剂盒和方法中。一般地，期望使用这样的标志物，对于所述标志物，肺癌相关疾病细胞中该标志物的表达水平与正常肺细胞中相同标志物的表达水平之间的差异尽可能大。虽然该差异可以小至用于估量标志物的表达的方法的检测极限，但期望差异至少大于估量方法的标准误，在一些实施方案中，与正常组织中相同标志物的表达水平相比，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000倍或更大的差异。 

已公认，某些标志物蛋白被分泌至围绕细胞的细胞外空间。由于此类标志物蛋白可在肺癌相关体液样品中检测，因此将这些标志物用于组合物、试剂盒和方法的某些实施方案，所述体液样品可以比组织活检样品更容易地从人患者收集。此外，用于检测标志物蛋白的体内技术包括将抗所述蛋白的标记抗体引入受试者。例如，抗体可用其在 受试者中的存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标记物进行标记。 

为了确定任何特定的标志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳动物细胞例如人肺细胞系中表达标志物蛋白，收集细胞外液体，估量蛋白质在细胞外液体中的存在或不存在(例如，使用特异性结合所述蛋白的标记抗体)。 

应理解，含有肺细胞的患者样品可用于本文中所述的方法。在这些实施方案中，标志物的表达水平可通过估量样品中标志物的量(例如，绝对量或浓度)来估量。当然，可在估量样品中标志物的量之前将细胞样品经历多种收集后制备和贮藏技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。 

还应理解，可使标志物流出细胞进入消化系统、血流和/或间质间隙。可以例如通过检查血清或血浆来检测流出的标志物。 

组合物、试剂盒和方法可用于检测标志物蛋白的表达，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。例如，可将免疫学方法用于检测完整细胞上的此类蛋白，或可将基于计算机的序列分析法用于预测至少一个细胞外结构域(即，包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可检测标志物蛋白的表达而无需裂解细胞(例如，使用特异性结合蛋白的细胞表面结构域的标记抗体)，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。 

标志物的表达可通过用多种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法中的任一种来估量。此类方法的非限定性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸逆转录法以及核酸扩增法。 

在特定的实施方案中，标志物的表达可使用特异性结合标志物蛋白或其片段(包括已经历所有或部分其正常翻译后修饰的标志物蛋白)的抗体(例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标 记的抗体)、抗体衍生物(例如，缀合有底物或蛋白质或蛋白质-配体对的配体的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)来估量。 

在另一个特定的实施方案中，标志物的表达通过下述来估量：从患者样品的细胞制备mRNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，然后将mRNA/cDNA与为标志物核酸的互补序列的参照多核苷酸或其片段杂交。任选地，可在与参照多核苷酸杂交前使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种来扩增cDNA；优选，其不进行扩增。同样可使用定量PCR检测一个或多个标志物的表达以估量标志物的表达水平。备选地，可使用检测标志物的突变或变体(例如，单核苷酸多态性、缺失等)的许多方法中的任一种来检测患者中标志物的存在。 

在相关实施方案中，将获自样品的转录的多核苷酸的混合物与在其上固定有多核苷酸(其与标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多个核苷酸残基)互补或同源)的基质接触。如果可在基质上差异地检测到互补或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的发色团或荧光团检测或固定至不同的选择的位置)，那么可使用单个基质(例如，固定在所选择的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时估量多个标志物的表达水平。当使用包括将一个核酸与另一个核酸杂交的估量标志物表达的方法时，期望在严格杂交条件下进行杂交。 

在某些实施方案中，可使用质谱法或表面等离子共振术进行生物标志物测定(biomarker assay)。在不同的实施方案中，鉴定活性抗肺癌相关疾病的试剂的方法可包括a)提供含有一个或多个标志物或其衍生物的细胞的样品；b)从所述细胞制备提取物；c)将所述提取物与含有标志物结合位点的标记核酸探针混合；和，d)在测试试剂存在或不存在的情况下测定标志物与核酸探针之间的复合物的形成。测定步骤可包括将所述提取物/核酸探针混合物经历电泳迁移率试验(electrophoretic mobility shift assay)。 

在某些实施方案中，测定步骤包括选自酶联免疫吸附测定 (ELISA)、基于荧光的测定和超高通量测定，例如，表面等离子共振术(SPR)或荧光相关光谱(FCS)测定的测定。在此类实施方案中，SPR传感器用于指导生物分子相互作用的实时观察，因为SPR对金属-电介质表面上的微小折射率改变非常敏感。SPR是对大约200nm的SPR传感器/样品介面内的10⁵至10^-6折射率(RI)单位的改变敏感的表面技术。因此，SPR光谱法用于监控沉积在传感层上的薄有机薄膜的生长。 

因为组合物、试剂盒和方法依赖于一种或多种标志物的表达水平的差异的检测，因此期望标志物的表达水平显著大于用于估量至少一种正常细胞和受肺癌影响的细胞中的表达的方法的最小检测极限。 

应理解，通过使用一种或多种标志物对另外的患者样品进行常规筛选，将了解某些标志物在不同类型的细胞，包括特定的肺癌相关疾病细胞中过表达。 

此外，通过就标志物的表达评估更大数量的患者样品，并且使从其获得样品的个体患者的结果相互关联，还将确认某些标志物的改变的表达与肺癌相关疾病强相关以及其他标志物的改变的表达与其他疾病强相关。从而组合物、试剂盒和方法可用于表征患者的肺癌相关疾病的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种。 

当组合物、试剂盒和方法用于表征患者的肺癌相关疾病的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种时，期望选择标志物或标志物组以使在至少大约20％，在某些实施方案中，至少大约40％、60％或80％和基本上所有患者(其患有相应分期、分级、组织学类型或性质的肺癌相关疾病)中获得阳性结果。可选择本发明的标志物或标志物组以使对于一般群体可获得大于大约10％的阳性预测值(在非限定性的实例中，外加大于80％的测定特异性)。 

当多个标志物用于组合物、试剂盒和方法时，可在单个反应混合物(即，使用针对各个标记物的试剂，例如不同的荧光探针)或在相应于一个或多个标志物的单独的反应混合物中，将患者样品中各标志物的表达水平与相同类型的非肺癌样品中多个标志物中的每一个的正常表达水平相比较。在一个实施方案中，相对于相应的正常水平，样 品中一个以上的标志物的显著增加的表达水平表示患者患有肺癌相关疾病。当使用多个标志物时，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多个单独的标志物；在某些实施方案中，可能期望使用更少的标志物。 

为了使组合物、试剂盒和方法的灵敏性最大化(即在干扰可归因于患者样品中非肺来源的细胞的情况下)，期望本文中所使用的标志物是具有受限制的组织分布(例如通常不在非肺组织中表达)的标志物。 

应认识到，组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生肺癌相关疾病的风险的患者和他们的医学顾问将是特别有用的。被认为具有增加的发生肺癌相关疾病的风险的患者包括例如具有肺癌相关疾病家族史的患者。 

可以以多种方法估量正常人肺组织中标志物的表达水平。在一个实施方案中，该正常表达水平通过下述来估量：估量一部分表现正常的肺细胞中标志物的表达水平且将该正常表达水平与一部分怀疑为异常的肺细胞中的表达水平相比较。备选地，特别是当由于常规进行本文中所述的方法而可获得进一步的信息时，可使用标志物的正常表达的群体平均值。在其他实施方案中，标志物的“正常”表达水平可通过估量标志物在从未患有肺癌的患者获得的患者样品、在怀疑肺癌相关疾病在患者中发作之前从患者获得的患者样品、编档保存的患者样品等中的表达来进行测定。 

本文中还提供了用于估量肺癌相关疾病细胞在样品(例如编档保存的组织样品或从患者获得的样品)中的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述的相同，除了必要时，使组合物、试剂盒和方法适用于除了患者样品外的样品。例如，当待使用的样品是石蜡包埋的(parafinized)编档保存的人组织样品时，可能必需在用于估量样品中标志物表达水平的组合物、试剂盒或方法中调整化合物的比例。 

产生抗体的方法 

本文中还提供了制备产生用于估量患者是否患有肺癌相关疾病的抗体的分离的杂交瘤的方法。在该方法中，合成或分离(例如通过从其中表达其的细胞纯化或通过体内或体外转录和翻译编码蛋白质或肽的核酸)含有完整标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽。使用蛋白质或肽免疫脊椎动物例如哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔或绵羊。任选地(和优选地)可用蛋白质或肽免疫脊椎动物至少另外一次，从而使脊椎动物呈现强烈的针对蛋白质或肽的免疫应答。从免疫的脊椎动物分离脾细胞，使用多种方法中的任一种将其与永生化的细胞系融合从而形成杂交瘤。然后使用标准方法筛选以该方式形成的杂交瘤，从而鉴定一个或多个产生特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本文还提供了通过该方法制备的杂交瘤和使用这样的杂交瘤制备的抗体。 

估量功效的方法 

本文还提供了估量测试化合物抑制肺癌相关疾病细胞的功效的方法。如上所述，标志物的表达水平的差异与肺细胞的异常状态相关。虽然公认，某些标志物的表达水平的变化可能由肺细胞的异常状态引起，但同样公认，其他标志物的表达水平的变化诱导、维持和促进此类细胞的异常状态。因此，抑制患者的肺癌相关疾病的化合物将使一个或多个标志物的表达水平改变至更接近该标志物的正常表达水平(即，所述标志物在正常肺细胞中的表达水平)的水平。 

因此本方法包括将在测试化合物存在的情况下维持的第一肺细胞样品中的标志物的表达与在测试化合物不存在的情况下维持的第二肺细胞样品中的标志物的表达相比较。在测试化合物存在的情况下标志物的显著减少的表达表示该测试化合物抑制肺癌相关疾病。肺细胞样品可以例如是获自患者的正常肺细胞的单个样品的等分、获自患者的正常肺细胞的混合样品、正常肺细胞系的细胞、获自患者的肺癌相关疾病细胞的单个样品的等分、获自患者的肺癌相关疾病细胞的混合样品、肺癌相关疾病细胞系的细胞等。 

在一个实施方案中，样品是获自患者的肺癌相关疾病细胞，并且检测多种据认为对于抑制各种肺癌相关疾病是有效的化合物，以鉴定 可能最佳地抑制患者的肺癌相关疾病的化合物。 

同样可将该方法用于估量疗法抑制患者的肺癌相关疾病的功效。在该方法中，估量一个或多个标志物在样品对(一个样品经历疗法，另一个不经历疗法)中的表达水平。与估量测试化合物的功效的方法一样，如果疗法诱导显著更低的标志物表达水平，则疗法对于抑制肺癌相关疾病是有效的。如上，如果来自选择的患者的样品用于本方法，那么可在体外估量备选疗法以选择对于抑制患者的肺癌相关疾病最可能有效的疗法。 

如本文中所描述的，人肺细胞的异常状态与标志物的表达水平的变化相关。还提供了用于评估测试化合物的有害潜能的方法。该方法包括在测试化合物存在和不存的情况下维持分开的人肺细胞等分。比较各等分中标志物的表达。在测试化合物存在的情况下维持的等分中标志物的显著更高的表达水平(相对于在测试化合物不存在的情况下维持的等分)表示测试化合物具有有害的潜能。各种测试化合物的相对有害潜能可通过比较相关标志物的表达水平的增强或抑制的程度，通过比较其表达水平被增强或抑制的的标志物的数目，或通过比较两者来估量。 

分离的蛋白质和抗体 

一个方面涉及分离的标志物蛋白和其生物活性部分，以及适合用作免疫原以引发抗标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，天然标志物蛋白可使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中，含有完整的标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。除重组表达外，可使用标准肽合成技术化学合成此类蛋白质或肽。 

“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源(所述蛋白质源自于其)的其他污染性蛋白，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品。术语“基本上不含细胞材料”包括其中将蛋白质与从其分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞材 料的蛋白质包括具有低于大约30％、20％、10％或5％(按干重计算)的异种蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白质制剂。 

当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，其也优选基本上不含培养基，即，培养基占据低于大约20％、10％或5％的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成产生蛋白质时，其优选基本上不含化学前体或其他化学药品，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学药品分离。因此，此类蛋白质制剂具有低于大约30％、20％、10％、5％(按干重计算)的化学前体或除了目的多肽外的化合物。 

标志物蛋白的生物活性部分包括含有与标志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且展示相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。标志物蛋白的生物活性部分可以是其长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，其中标志物蛋白的其他区域被缺失的其他生物活性部分可通过重组技术来制备，并且可就标志物蛋白的天然形式的一种或多种功能活性对其进行评估。在某些实施方案中，有用的蛋白质与此类序列之一基本上同一(例如，至少大约40％，在某些实施方案中，50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一)并且保持相应的天然发生的标志物蛋白的功能活性但因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。 

此外，标志物蛋白的区段文库可用于产生用于筛选和随后选择变异标志物蛋白或其区段的多肽的多样化(variegated)群体。 

预测医学 

本文中还提供了动物模型和标志物在预测医学领域中的用途，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监控临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因此，本文中还提供了用于测定一个或多个标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否处于发生肺癌相关疾病的风险中的诊断测定。此类测定可用于预后或预测目的，从而在肺癌相关疾病发作之前预防性治疗个体。 

在另一个方面，方法可用于相同个体的至少周期性筛查以观察该个体是否已暴露于改变他/她的表达模式的化学药品或毒素。 

另一方面涉及监控试剂(例如，被施用以抑制肺癌相关疾病或治疗或预防任何其他障碍的药物或其他化合物(例如，以了解这样的治疗可能具有的任何系统性作用))在临床试验中对标志物的表达或活性的影响。 

药物基因组学 

标志物还可用作药物基因组学标志物。如本文中所用的，“药物基因组学标志物”是其表达水平与患者中特定临床药物应答或易感性相关的目的生物化学标志物。药物基因组学标志物表达的存在或量与预测的患者应答和更特别地患者的肿瘤对用特定药物或药物种类的疗法的应答相关。通过估量患者中一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在或量，可选择最适合于患者的或预测具有更大的成功程度的药物疗法。 

监控临床试验 

监控试剂(例如，药物化合物)对标志物的表达水平的影响不仅可用于基础药物筛选，而且还可用于临床试验。例如，可在接受肺癌相关疾病治疗的受试者的临床试验中监控试剂影响标志物表达的有效性。 

在一个非限定性实施方案中，本发明提供了用于监控利用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、模拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法，该方法包括步骤(i)在施用试剂之前从受试者获得施用前的样品；(ii)检测一个或多个选择的标志物在施用前的样品中的表达水平；(iii)从受试者获得一个或多个施用后样品；(iv)检测标志物在施用后样品中的表达水平；(v)将施用前样品中标志物的表达水平与施用后样品中标志物的表达水平相比较；以及(vi)相应地改变试剂至受试者的施用。 

例如，在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效剂量，从而需要增加剂量。相反地，减少的标志基因的表达可表明有效治疗， 从而不需要改变剂量。 

电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法 

如本文中所使用的，“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或包含可用电子设备直接阅读和存取的数据或信息的任何适当介质。此类介质可包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质以及磁带；光学存储介质例如光盘；电子存储介质例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盘和这些类别的混合体例如磁性/光学存储介质。可对介质进行改造或设定以用于在其上记录本文中所述的标志物。 

如本文中所用的，术语“电子设备”旨在包括任何适当的计算或处理设备或其他经改造或设定用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例包括独立的计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网；电子器具例如个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机(pager)等；以及局域和分布式处理系统。 

如本文中所使用的，“记录”是指在电子设备可读介质上存储或编码信息的过程。本领域技术人员可容易地采用任何用于在介质上记录信息的方法来产生包含本文中所述的标志物的材料。 

许多软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上存储本发明的标志物信息。为了获得或产生在其上记录了标志物的介质，可使用许多数据处理程序构建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或数据库)。通过以可读形式提供标志物，可常规存取用于多种目的的标志物序列信息。例如，本领域技术人员可使用可读形式的核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具中的序列相比较。搜索工具用于鉴定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或区域。 

因此，本文中还提供了用于保存进行确定受试者是否具有肺癌相关疾病或对肺癌相关疾病的易感性的方法的说明书的介质，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在并且基于标志物的存在或 不存在来确定受试者是否具有肺癌相关疾病或对肺癌相关疾病的易感性和/或推荐用于肺癌相关疾病或肺癌相关疾病前状况(pre-lungcancer-related disease condition)的特定治疗。 

本文中还提供了电子系统和/或在网络中提供了用于确定受试者是否患有肺癌相关疾病或具有对与标志物相关的肺癌相关疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否患有肺癌相关疾病或具有对肺癌相关疾病的易感性和/或推荐用于肺癌相关疾病或肺癌相关疾病前状况的特定治疗。方法还可包括接收与受试者相关的表型信息和/或从网络获取与受试者相关的表型信息的步骤。 

本文中还提供了网络，用于确定受试者是否患有肺癌相关疾病或具有对与标志物相关的肺癌相关疾病的易感性的方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或肺癌相关疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获取的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有肺癌相关疾病或具有对肺癌相关疾病的易感性。方法还包括推荐用于肺癌相关疾病或肺癌相关疾病前状况的特定治疗的步骤。 

本文中还提供了用于确定受试者是否患有肺癌相关疾病或具有对肺癌相关疾病的易感性的商业方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或肺癌相关疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获得的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有肺癌相关疾病或具有对肺癌相关疾病的易感性。方法还包括推荐用于肺癌相关疾病或肺癌相关疾病前状况的特定治疗的步骤。 

本文中还提供了可用于测定阵列中一个或多个基因的表达的阵列。在一个实施方案中，阵列可用于测定组织中基因的表达，从而确定阵列中基因的组织特异性。这样，可就表达同时测定直至大约7000或更多个基因。这使得能够产生显示在一个或多个组织中特异性表达的一组基因的特征谱。 

除了此类定性测定外，本文中还提供了基因表达的定量。因此，不仅组织特异性而且一组基因在组织中的表达水平也是可确定的。因此，可基于基因本身的组织表达和在该组织中的表达水平来对基因进行分类。这可用于例如确定组织间基因表达的关系。因此，可干扰一个组织，然后可测定对第二组织中的基因表达的影响。在本说明书中，可测定一种细胞类型对另一种细胞类型(响应生物刺激)的影响。 

此类测定可用于例如在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效果。如果试剂被治疗性施用以治疗一种细胞类型但其对另一种细胞类型具有不期望的作用，则所述方法提供了确定不期望的作用的分子基础的测定，从而提供共施用中和剂(counteracting agent)或另外治疗不期望的作用的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可在分子水平上测定不期望的生物学效应。因此，可确定和中和试剂对非靶基因的表达的作用。 

在另一个实施方案中，阵列可用于监控阵列中一个或多个基因的表达的时程。如本文中所公开的，这可发生在各种生物学背景(例如肺癌相关疾病的发生，肺癌相关疾病的进展)和过程(例如与肺癌相关疾病相关的细胞转化)中。 

阵列还可用于确定基因的表达或其他基因的表达在相同细胞或不同细胞中的作用。如果不能调控最终或下游靶，那么这提供了例如用于治疗性干预的备选分子靶的选择。 

阵列还可用于确定一个或多个基因在正常和异常细胞中的差异表达模式。这提供了可用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。 

替代标志物(Surrogate Marker) 

标志物可用作一种或多种障碍或疾病状态或导致肺癌相关疾病状态的状况的替代标志物。如本文中所使用的，“替代标志物”是与疾病或障碍的不存在或存在，或与疾病或障碍的进展相关的目的生物化学标志物。此类标志物的存在或量不依赖于疾病。因此，此类标志物可用于指示特定的疗程在减轻疾病状态或障碍中是否有效。当疾病状态或障碍的存在或程度难以通过标准方法来评估，或当在达到潜在危 险的临床终点之前期望评估疾病进展时，替代标志物是特别有用的。 

标志物还可用作药效标志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“药效标志物”是与药物作用特异性相关的目的生物化学标志物。药效标志物的存在或量与将对其施用药物的疾病状态或障碍无关；因此，标志物的存在或量表示药物在受试者中的存在或活性。例如，药效标志物可表示药物在生物组织中的浓度，因为标志物在该组织中表达或转录，或者不表达或转录与药物的水平相关。这样，药物的分布或吸收可通过药效标志物来监控。类似地，药效标志物的存在或量可与药物的代谢产物的存在或量相关，这样标志物的存在或量表示药物在体内的相对分解速率。 

药效标志物在增加药物作用的检测的灵敏性中特别有用，特别是当以低剂量施用药物时。由于即使少量的药物也可足以激活多轮的标志物转录或表达，因此扩增的标志物可以以比药物本身更容易检测的量存在。同样，标志物由于其本身的性质而可以更容易地进行检测；例如，通过使用本文中描述的方法，可将抗体用于针对蛋白标志物的基于免疫的检测系统，或可使用标志物特异性放射性标记探针来检测mRNA标志物。此外，药效标志物的使用可提供由于药物治疗而产生的超出可直接观察的范围的风险的基于机制的预测。 

用于检测的方案 

检测肺癌相关疾病的方法包括例如在一段时间内测量各标志物基因在来自受试者的生物样品中的表达水平和将该水平与对照生物样品中标志物基因的水平相比较。 

当标志物基因是本文中描述的基因之一并且表达水平差异表达(例如，比对照中的表达水平更高或更低)时，受试者被判断为患有肺癌相关疾病。当标志物基因的表达水平落在容许的范围内时，受试者不可能患有肺癌相关疾病。 

可通过测量对照中标志物基因的表达水平来预先测定对照的标准值，以比较表达水平。例如，可基于上述标志物基因在对照中的表达水平来测定标准值。例如，在某些实施方案中，容许的范围基于标准 值采用±2S.D.。在测定标准值后，可通过只测量来自受试者的生物样品中的表达水平并将该值与测定的对照的标准值相比较来进行检测方法。 

标志物基因的表达水平包括标志物基因至mRNA的转录和至蛋白质的翻译。因此，基于相应于标志物基因的mRNA的表达强度或由标志物基因编码的蛋白质的表达水平的比较，进行检测肺癌相关疾病的一个方法。 

可根据各种基因分析方法在肺癌相关疾病的检测中测量标志物基因的表达水平。具体地，可使用例如利用与此类基因杂交的核酸作为探针的杂交技术，或利用与标志物基因杂交的DNA作为引物的基因扩增技术。 

可基于标志物基因的核苷酸序列设计用于检测的探针或引物。本文中描述了各标志物基因的核苷酸序列的标识号。 

此外，应理解，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与肺癌相关疾病相关的具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。 

也应理解，标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此，除非明确指出，否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外源标志物基因。 

同样，应理解，“标志物基因的同源物”是指来源于除了人以外的物种的基因，其在严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。 

含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此，“互补链”是指由A:T(对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。 

此外，“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列，而且还指具有在某些情况下至少40％，在某些情况下50％，在某些情况下60％，在某些情况下70％，至少80％、90％和95％或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程度可利用算法BLAST等来测定。 

此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针，或用作扩增标志物基因的引物。当用作引物时，多核苷酸通常包含15bp至100bp，在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。当用作探针时，DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时，3′区域必须与标志物基因互补，而5′区域可连接至限制性内切酶识别序列或标签(tag)。 

“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样，通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中，术语“寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。 

可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行利用杂交技术的肺癌相关疾病的检测。此外，可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤中使用PCR扩增监控法，可更加定量地分析标志物基因的表达。 

在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5′-3′外切核酸酶活性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。 

还可通过检测标志物基因编码的蛋白质来进行检测肺癌相关疾病的方法。在下文中，标志物基因编码的蛋白质被描述为“标志物蛋白”。对于此类检测方法，可通过使用结合各标志物蛋白的抗体来应用例如， Western印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。 

用于检测的结合标志物蛋白的抗体可通过任何适当的技术来产生。同样，为了检测标志物蛋白，可适当地标记这样的抗体。备选地，可不标记抗体，而是标记特异性结合抗体的物质例如蛋白A或蛋白G以间接检测标志物蛋白。更特别地，此类检测方法可包括ELISA法。 

可以例如通过将标志物基因或其部分插入表达载体，将构建体导入适当的宿主细胞来产生转化株，培养所述转化株以表达重组蛋白，然后从培养物或培养上清液纯化表达的重组蛋白来获得用作抗原的蛋白质或其部分肽。备选地，可化学合成由基因编码的氨基酸序列或含有由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。 

此外，可通过使用指数(不仅生物样品中标志物基因的表达水平而且标志物蛋白的活性)来进行肺癌相关疾病的检测。标志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物活性。可使用各种方法测量每一种蛋白的活性。 

即使在常规检测中患者未被诊断为患有肺癌相关疾病(尽管症状暗示此类疾病)，这样的患者是否患有肺癌相关疾病也可通过按照本文中所述的方法进行检测来容易地确定。 

更特别地，在某些实施方案中，当标志物基因是本文描述的基因之一时，其症状至少暗示对肺癌相关疾病的易感性的患者中标志物基因的表达水平的增加或减少表明症状主要由肺癌相关疾病引起。 

此外，检测可用于确定肺癌相关疾病是否在患者中得到改善。换句话说，本文中描述的方法可用于判断肺癌相关疾病治疗的治疗效果。此外，当标志物基因是本文描述的基因之一时，已被诊断为患有肺癌相关疾病的患者中标志物基因的表达水平的增加或减少意味着疾病已向前发展。 

还可基于表达水平的差异测定肺癌相关疾病的严重性和/或易感性。例如，当标志物基因是本文描述的基因之一时，标志物基因的表达水平的增加程度与肺癌相关疾病的存在和/或严重性相关。 

此外，标志物基因本身的表达可通过向基因的转录调控区导入突 变来控制。本领域技术人员理解此类氨基酸置换。同样，被突变的氨基酸的数目不受特别限制，只要活性得到保持即可。通常，其在50个氨基酸以内，在某些非限定性实施方案中，在30个氨基酸以内，在10个氨基酸以内，或在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任何位点，只要活性得到保持即可。 

在另一个方面，本文中提供了治疗肺癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的筛选方法。一个或多个标志物基因选自本文中描述的基因。可通过选择能够增加或减少标志物基因的表达水平的化合物来获得肺癌相关疾病的治疗剂。 

应理解，表述“增加基因的表达水平的化合物”是指促进基因转录、基因翻译或蛋白质活性的表达的步骤中的任一步骤的化合物。另一方面，表述“减少基因的表达水平的化合物”，如本文中所用的，是指抑制这些步骤中的任一步骤的化合物。 

在特定的方面，可在体内或体外进行筛选肺癌相关疾病的治疗剂的方法。该筛选方法可以例如通过下列步骤来进行：(1)对动物受试者施用候选化合物；(2)测量动物受试者的生物样品中标志物基因的表达水平；或(3)选择与对照(其未与候选化合物接触)中标志物基因的表达水平相比较增加或减少标志物基因的表达水平的化合物。 

在另一个方面，本文中提供了这样的方法，其通过将动物受试者与候选化合物接触，然后监控化合物对来源于动物受试者的生物样品中标志物基因的表达水平的作用来评估药剂的候选化合物对标志物基因的表达水平的功效。来源于动物受试者的生物样品中标志物基因的表达水平的变化可使用与上述检测方法中所用的相同的技术来监控。此外，基于评估，可通过筛选来选择药剂的候选化合物。 

试剂盒 

在另一个方面，提供了各种诊断和检测试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒可用于估量患者是否患有肺癌相关疾病。试剂盒包含用于估量标志物的表达的试剂。在另一个实施方案中，试剂盒可用于估量化学或生物试剂用于抑制患者的肺癌相关疾病的适合性。此类试剂盒 包含用于估量标志物的表达的试剂，并且可包含一种或多种此类试剂。 

在另外的实施方案中，试剂盒可用于估量肺癌相关疾病细胞的存在或治疗肺癌相关疾病。此类试剂盒包含特异性结合标志物蛋白或所述蛋白的片段的抗体、抗体衍生物或抗体片段。此类试剂盒还可包含多种抗体、抗体衍生物或抗体片段，其中多种此类抗体试剂特异性结合标志物蛋白或所述蛋白的片段。 

在另外的实施方案中，试剂盒可用于估量肺癌相关疾病细胞的存在，其中试剂盒包含特异性结合标志物核酸或所述核酸的片段的核酸探针。试剂盒还可包含多种探针，其中每一种探针特异性结合标志物核酸或所述核酸的片段。 

本文中所述的组合物、试剂盒和方法尤其可具有下列用途：1)估量患者是否患有肺癌相关疾病；2)估量人患者中肺癌相关疾病的分期；3)估量患者中肺癌相关疾病的分级；4)估量患者中肺癌相关疾病的性质；5)估量患者中发生肺癌相关疾病的可能性；6)估量患者中与肺癌相关疾病相关的细胞的组织学类型；7)制备用于治疗肺癌相关疾病和/或评估患者是否患有肺癌相关疾病的抗体、抗体片段或抗体衍生物；8)估量肺癌相关疾病细胞的存在；9)估量一种或多种测试化合物抑制患者的肺癌相关疾病的功效；10)估量疗法抑制患者的肺癌相关疾病的功效；11)监控患者的肺癌相关疾病的进展；12)选择抑制患者的肺癌相关疾病的组合物或疗法；13)治疗患有肺癌相关疾病的患者；14)抑制患者的肺癌相关疾病；15)评估测试化合物的有害潜能；和16)在处于发生肺癌相关疾病的风险中的患者中预防肺癌相关疾病的发生。 

试剂盒可用于评估肺癌相关疾病细胞(例如在样品例如患者样品中)的存在。试剂盒包含多种试剂，每一种所述试剂能够特异性结合标志物核酸或蛋白。适合于结合标志物蛋白的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。适合于结合标志物核酸(例如基因组DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定至基质的寡核苷酸(标记或未标记的)、未与基质结合的标记的寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探针等。 

试剂盒可任选地包含用于进行本文中所述的方法的另外的成分。例如，试剂盒可包含适合于使互补核酸退火或适合于使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如SSC缓冲液)、一个或多个样品隔室、描述方法的进行的说明书、正常肺细胞样品、肺癌相关疾病细胞样品等。 

动物模型 

在广泛的方面，提供了用于产生用于评估至少一种肺癌相关疾病的非人动物模型的方法。该方法包括将动物暴露于重复剂量的至少一种据认为引起肺癌的化学药品。在某些方面，该方法还包括收集一种或多种选择的动物样品；和将收集的样品与一种或多种潜在的肺癌起始或发生的指示物(indicia)相比较。 

在广泛的方面，提供了产生动物模型的方法，该方法包括：在无特定化学药品的环境中维持动物并且用至少一种据认为引起肺癌的化学药品敏化动物。在某些实施方案中，通过多次连续暴露敏化动物的肺的至少一部分。在另一个广泛的方面，提供了筛选有效地抗至少一种肺癌相关疾病的试剂的方法。该方法通常包括：对受试动物施用至少一种试剂，确定试剂是否减轻或加重肺癌相关疾病的一个或多个症状；使一个或多个症状的减轻与试剂抗肺癌相关疾病的有效性相互关联；或使一个或多个症状的减轻的不存在与试剂的无效性相互关联。动物模型用于评估一个或多个代谢途径，所述代谢途径促成了至少一种肺癌相关疾病的起始、进展、严重性、病状、攻击性、分级、活性、失能(disability)、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在的致病或病理特征中的至少一种。可利用：层次聚类(hierarchicalclustering)、特征网络构建(signature network construction)、质谱蛋白组学分析、表面等离子共振术、线性统计建模、偏最小二乘法判别分析(partial leasts quares discriminant analysis)和多次线性回归分析中的一种或多种来进行分析。 

在特定的方面，通过检查一个或多个标志物或其功能等同物的表达水平来就至少一种肺癌相关疾病评估动物模型。 

由本文中描述的方法产生的动物模型将使得能够筛选可用于治疗或预防肺癌相关疾病的治疗剂。因此，方法可用于鉴定用于治疗或预防肺癌相关疾病的治疗剂。方法包括对由本文中所述方法产生的动物模型施用候选试剂，评估与未施用候选试剂的对照动物模型相比动物模型中至少一种肺癌相关疾病应答。如果至少一种肺癌相关疾病应答在症状上减轻或在发生上延迟，则候选试剂是用于治疗或预防肺癌相关疾病的试剂。 

在另一个方面，本文中提供了肺癌相关疾病的动物模型，其中一个或多个标志物基因或功能上与标志物基因等同的基因的表达水平在所述动物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等同的基因”通常是编码具有与由标志物基因编码的蛋白质的已知活性相似的活性的蛋白质的基因。功能上等同的基因的代表性实例包括受试动物的标志物基因对应物，其是动物本身固有的。 

肺癌相关疾病动物模型可用于检测由于肺癌相关疾病而引起的生理学变化。在某些实施方案中，动物模型可用于揭示标志物基因的另外的功能和评估其靶为标志物基因的药物。 

在一个实施方案中，肺癌相关疾病动物模型可通过控制对应物基因的表达水平或施用对应物基因来产生。方法可包括通过控制选自本文中所述的基因的基因的表达水平来产生肺癌相关疾病动物模型。在另一个实施方案中，方法可包括通过施用由本文中所描述的基因编码的蛋白质或施用抗所述蛋白的抗体来产生肺癌相关疾病动物模型。还应理解，在某些其他实施方案中，可过表达标志物，以便可使用适当的方法测量标志物。 

在另一个实施方案中，肺癌相关疾病动物模型可通过导入选自此类基因的基因，或通过施用由这样的基因编码的蛋白质来产生。 

在另一个实施方案中，肺癌相关疾病可通过抑制选自此类基因的基因的表达或由这样的基因编码的蛋白质的活性来诱导。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制表达。蛋白质的活性可通过施用抑制所述活性的物质例如抗体来有效地控制。 

动物模型可用于阐明肺癌相关疾病背后的机制，还可用于检测通 过筛选获得的化合物的安全性。例如，当动物模型产生肺癌相关疾病的症状时，或当牵涉某种肺癌相关疾病的测量值在动物中改变时，可构建筛选系统以探测具有减轻疾病的活性的化合物。 

如本文中所使用的，表述“表达水平的增加”是指下列情况的任一种：在人工表达作为外源基因导入的标志物基因的情况下；在受试动物本身固有的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译得到增强的情况下；或在作为翻译产物的蛋白质的水解被抑制的情况下。如本文中所用的，表述“表达水平的减少”是指其中受试动物的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译被抑制的状态，或其中作为翻译产物的蛋白质的水解被增强的状态。基因的表达水平可以例如通过DNA芯片上信号强度的差异来测定。此外，翻译产物(蛋白质)的活性可通过与正常状态中的活性相比较来测定。 

也在预期的范围内的是：动物模型可包括转基因动物，包括例如其中已人工导入并且表达标志物基因的动物；标志物基因敲除动物；和其中已用另一个基因置换标志物基因的基因敲入动物。已向其中导入了标志物基因的反义核酸、核酶、具有RNAi作用的多核苷酸或用作诱饵核酸的DNA等的转基因动物可用作转基因动物。此类转基因动物还包括例如这样的动物，在所述动物中标志物蛋白的活性已通过将突变导入基因的编码区而被增强或被抑制，或氨基酸序列已被修饰而变得抗水解或对水解敏感。氨基酸序列中的突变包括置换、缺失、插入和添加。 

本文中所引用的所有专利、专利申请和参考文献以其全文通过引用合并入本文。虽然对于制备和使用其的本领域技术人员来说已十分详尽地描述和例示了本发明，但各种改变、修饰和改进是显然的，且不背离本发明的精神和范围。本领域技术人员易于理解，本发明可进行适当地改变以适合实现目的和获得提及的目标和有利方面以及其中固有的那些。 

本文中所描述的方法和试剂代表优选实施方案，是示例性的，并且不意欲限制本发明的范围。其中的改进和其他用途对于本领域技术人员来说显然的。这些改进包括在本发明的精神内并且由权利要求的 范围界定。对于本领域技术人员来说，同样极显然的是可对本文中公开的发明进行各种替代和改进而不背离本发明的范围和精神。 

应理解，虽然本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开，但本领域技术人员可采用本文中公开的概念的改进和变化，并且此类改进和变化被认为在由所附权利要求界定的本发明的范围内。 

虽然通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。 

因此，本发明不意欲限定于本文中公开的预期用于进行本发明的特定实施方案，而是意欲包括落在权利要求的范围内的所有实施方案。 

本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的公开案和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见提供于下列参考书目中。 

本文中引用的任何文献的引用不意欲作为任何前述内容是相关现有技术的承认。关于日期的所有声明和关于这些文献的内容的所有陈述基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。 

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另外的参考文献(如方法部分所列的) 

1.Chen，C.et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Rees.33，e179(2005). 

2.Fabbri，M.et al.WWOX gene restoration prevents lung cancer growth in vitro andin vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，15611-15616(2005). 

3.Vatolin，S.，Navaratne，K.，Weil，R.J.A novel method to detect functionalmicroRNA targets.J.Mol.Biol.358，983-996(2006). 

4.Liu，Z.et al.Characterization of in vitro and in vivo hypomethylating effects ofdecitabine in acute myeloid leukemia by a rapid，specific and sensitive LC-MS/MS method. Nucleic Acids Res.doi：10.1093/nar/gkl1156(2007). 

5.Ehrich，M.et al.Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patternsby base-specific cleavage and mass spectrometry.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，15785-15790(2005). 

Claims (10)

1.合成的miR-29在制备用于开发表观遗传疗法的组合物中的用途，其中所述合成的miR-29，单独地或与其他治疗组合，用于在肺癌细胞中再激活肿瘤抑制基因并且使异常的甲基化模式恢复正常，其中所述miR-29选自：如SEQ ID NO：1所示的miR-29a，如SEQ ID NO：2所示的miR-29b，和如SEQ ID NO：3所示的miR-29c。 

2.一种或多种miR-29在制备用于在肺癌细胞中恢复期望的DNA甲基化模式的组合物中的用途，其中所述一种或多种miR-29靶向DNMT3A和DNMT3B中的一种或多种，并且其中所述一种或多种miR-29选自：如SEQ ID NO：1所示的miR-29a，如SEQ ID NO：2所示的miR-29b，和如SEQ ID NO：3所示的miR-29c。 

3.一种或多种miR-29在制备用于在肺癌细胞中诱导甲基化沉默的肿瘤抑制基因(TSG)的再表达的组合物中的用途，其中所述一种或多种miR-29靶向DNMT3A和DNMT3B中的一种或多种，并且其中所述一种或多种miR-29选自：如SEQ ID NO：1所示的miR-29a，如SEQ ID NO：2所示的miR-29b，和如SEQ ID NO：3所示的miR-29c。 

4.权利要求3的用途，其中所述TSG包括FHIT和WWOX中的一种或多种。 

5.一种或多种miR-29在制备用于在肺癌细胞中抑制致瘤性的组合物中的用途，其中所述一种或多种miR-29靶向DNMT3A和DNMT3B中的一种或多种，并且其中所述一种或多种miR-29选自：如SEQ ID NO：1所示的miR-29a，如SEQ ID NO：2所示的miR-29b，和如SEQ ID NO：3所示的miR-29c。 

6.权利要求5的用途，其中抑制致瘤性包括非小细胞肺癌(NSCLC)的表观遗传调控。 

7.一种或多种miR-29在制备用于减少肺癌细胞中的总DNA甲基化的组合物中的用途，其中所述一种或多种miR-29靶向DNMT3A和DNMT3B，其中所述miR-29的表达促成肺癌细胞中的DNA表观遗传修饰，并且其中所述一种或多种miR-29选自：如SEQ ID NO：1所示的miR-29a，如SEQ ID NO：2所示的miR-29b，和如SEQ ID NO：3所示的miR-29c。 

8.至少一种核苷类似物与足以阻断从头和维持DNMT途径的一种或多种miR-29在制备用于在肺癌细胞中获得DNA低甲基化的组合物中的用途，其中所述一种或多种miR-29选自：如SEQ ID NO：1所示的miR-29a，如SEQ ID NO：2所示的miR-29b，和如SEQ ID NO：3所示的miR-29c。 

9.权利要求8的用途，其中所述核苷类似物包括地西他滨。 

10.一种或多种miR-29家族成员在制备用于上调肺癌细胞中的FHIT和/或WWOX酶的表达水平的组合物中的用途，其中组合物中的一种或多种miR-29家族成员调控DNMT3A和/或DNMT3B，并且其中所述一种或多种miR-29家族成员选自：如SEQ ID NO：1所示的miR-29a，如SEQ ID NO：2所示的miR-29b，和如SEQ ID NO：3所示的miR-29c。 

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