EA025126B1

EA025126B1 - Рекомбинантная бактерия и способ получения хондроитина биотехнологическим путем

Info

Publication number: EA025126B1
Application number: EA201291455A
Authority: EA
Inventors: Антонио Трилли; Иммаколата Бузиелло; Симона Дали; Франческа Багатин
Original assignee: Ньосис С.П.А.
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2016-11-30
Also published as: MX2013000100A; JP2013531995A; CN104974972B; GEP201706720B; HRP20171624T1; NZ603990A; CA2801843C; US8609394B2; PH12012502479B1; US20120010399A1; CN103228781B; EP2591127A1; PT2591127T; IL223830B; US8771992B2; PL2591127T3; EA201291455A1; CA2801843A1; CN103228781A; ES2644443T3

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантной бактерии, продуцирующей хондроитин, которую получают путем инактивации гена, кодирующего фермент, ответственный за присоединение остатков фруктозы к линейному остову хондроитина, в бактерии, продуцирующей фруктозилированное производное хондроитина, а также к способу получения хондроитина путем культивирования указанной бактерии.

Description

Настоящее изобретение связано с новой рекомбинантной бактерией, продуцирующей хондроитин, и способом получения хондроитина биотехнологическим путем.

В настоящем изобретении термин хондроитин относится к линейному полисахариду, определяемому как линейный гликозаминогликан, составленный альтернативными остатками Ό-глюкуроновой кислоты (О1еиЛ) и Ν-ацетил-Э-галактозамина (ΟαΙΝΛο). связанными посредством связей β1-3 (О1сил- -ОаШАс) и β1-4 (ОаВДАс->С,1сСА).

Предпосылки создания изобретения

Хондроитинсульфат является гликозаминогликаном, в котором глюкуроновая кислота (О1сИЛ) и Νацетил-Э-галактозамин (ОаШЛс) линейно и альтернативно связаны соответственно βΙ-3-связью и β 1-4связью, с образованием линейной полисахаридной цепи, которая в различной степени сульфирована по остаткам ОаШЛс.

В организме животных он присутствует в хрящах и соединительной ткани, играя важную роль в клеточной адгезии, регенерации тканей, в прорастании нервов и пр.

Получение хондроитина неживотного происхождения является важной и необходимой ступенью на пути к получению хондроитинсульфата неживотного происхождения. В доступной патентной литературе описано несколько способов получения хондроитина неживотного происхождения.

Кроме того, было клонировано и секвенировано несколько генов хондроитинсинтазы, полученных как из животных, так и из микроорганизмов.

Предложен способ получения хондроитина с помощью рекомбинантной грамположительной бактерии ВасШик со встроенным геном хондроитинсинтазы, полученным из Ра51еигейа тийошйа (И8 2007/0281342 А1).

В другом изобретении описан способ получения хондроитина путем встраивания обоих генов, кГоС и к&А, полученных из ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4, в бактерию, получающую ИЭР-глюкуроновую кислоту (№О 2008/133350).

В другом изобретении описан ίη νίίτο синтез хондроитина в ферментативной системе, содержащей как хондроитинсинтазу ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4, так и предшественники реакции (И8 2009/0263867 А1).

Известно, что ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4 способна получать капсулярный полисахарид (полисахарид К4), имеющий такую же структуру остова, что и структура остова хондроитина, с которым остатки фруктозы соединяются через остатки О1сИА (см., например, Ν. Уо1р1, С1усосои). ί. 25: 451-457(2008)). Следовательно, полисахарид К4 состоит из повторяющегося трисахаридного элемента, содержащего фрагмент Ό-глюкуроновой кислоты (С1сИА) и фрагмент Ν-ацетил-Э-галактозамина (Са1NАс), соединенного посредством β 1-3 (С1сиА>-Са^Ас), и остатка фруктозы, связанного с С3-гидроксильной группой остатка С1сИА. Остатки фруктозы, таким образом, образуют разветвления полученного в результате линейного полисахарида.

Удаления остатков фруктозы достигали путем гидролиза в кислых условиях (Ν. Уо1р1, Е1есйорйоге515 25, 692-696 (2004)).

Несмотря на обширные и тщательные исследования как кластера генов капсулярных антигенов ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4, так и метаболических путей, ведущих к образованию сахаров, образующих линейный полисахарид К4, до сих пор не удалось идентифицировать гликозилтрансферазную активность, ответственную за присоединение фруктозных фрагментов к линейному полисахариду, с получением полисахарида К4.

Элементом новизны настоящего изобретения является непосредственное получение высокомолекулярного хондроитина с помощью рекомбинантной бактерий, полученной путем инактивации гена, кодирующего фермент, ответственный за добавление остатков фруктозы к хондроитиновому остову, что позволяет избежать необходимости подвергать полисахарид К4 гидролитическому удалению остатков фруктозы, связанных с фрагментами С1сИА, для получения хондроитина.

Подробное описание изобретения

Целью настоящего изобретения является получение рекомбинантной бактерии, продуцирующей хондроитин, определяемый как линейный гликозаминогликан, состоящий из альтернативных остатков Όглюкуроновой кислоты (С1сИА) и Ν-ацетил-Э-галактозамина (ОаВДАс), соединенных соответственно β13-связью и β 1-4-связью, характеризующегося тем, что в указанной бактерии ген, кодирующий фермент, ответственный за присоединение остатков фруктозы к остову хондроитина, является инактивированным.

Следовательно, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложена рекомбинантная бактерия, продуцирующая хондроитин, характеризующаяся тем, что указанная бактерия получена таким путем, при котором исходно присутствующий в нем ген, который кодирует белок, ответственный за присоединение остатков фруктозы к остову хондроитина, подвергают инактивации, при этом указанная инактивация включает в себя делецию или замену, полностью или частично, указанного гена, или его дезинтеграцию путем вставки дополнительной нуклеотидной последовательности. В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения рекомбинантную бактерию согласно на- 1 025126 стоящему изобретению, полученную путем инактивации гена, кодирующего белок, обладающий фруктозилтрансферазной активностью, получают из бактерии, которая относится к роду ЕксйейсЫа сой и предпочтительно принадлежит группе 2 К-антигенов, которая включает в себя хорошо известные серотипы, такие как К1, К5, К7, К12.

Хотя согласно репрезентативному воплощению настоящего изобретения рекомбинантная бактерия, способная продуцировать хондроитин, получена из ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4, тем не менее может быть использована любаая из бактерий, принадлежащих к группе К-антигенов, независимо от того, имеет ли они какую-либо генную гомологию с ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4. Примеры указанных бактерий включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Наешорййик, такие как Н. тПиеп/ае (ВгапеГог5-Не1апбег Р., СагЬойубг. Ке8., уо1. 88, 1ап 15, 1981), Сашру1ойас1ег, например С. .)е.)ит (МсЫайу Ό.Ι, 1агге11 Н.С., Ы 1., КЫеи Ы.Н., Ушодгабоу Е., 8/утап51й С.М., Вйккоп 1.К., РЕВ8 1, уо1. 272, № 17, 4407-4422, 8ер1. 2005), С1оеосар§а, например С. де1айпо§а (КаипдкотЬооп 8., СЫб1йа18опд А., Виппад В., Шйогп Ό., Нагуеу Ν.ν., \Уа1ег Ке8., уо1. 40, № 20, 3759-3766, Оес. 2006), а также У1Ьгю, например V. сйо1егае (Ктге1 Υ.Α., \νί6та1т С., 8епсйепкоуа 8.Ν., 1ап88оп Р.Е., \Vе^пι^аиЬ А., Еиг. 1. Вюсйет, уо1. 247, 402-410, 1и1у 1997).

Более предпочтительно, чтобы указанная бактерия, из которой получена рекомбинантная бактерия согласно настоящему изобретению, продуцирующая хондроитин, являлась бактерией ЕксйейсЫа сой серотипа О5:К4:Н4, который содержит ген кГоЕ, кодирующий белок, который обладает фруктозилтрансферазной активностью.

Известно, что ген кГоЕ локализован внутри генного кластера антигенов К4 Е. сой (СепВапк АВ079602), который содержит гены, которые, как было обнаружено авторами настоящего изобретения, имеют существенную гомологию с генами из других бактериями, такими, которые, вероятнее всего, участвуют в образовании бактериальной капсулы (Т. №пот1уа, Ν. 8идшга, А. Та\уаба, К. 8ид1то1о, Н. VаΐапаЬе апб К. ГОтаЫ, Вю1. Сйет., уо1. 277, № 24, 21567-75 1ипе 14, 2002).

Наиболее предпочтительной бактерией, используемой для получения рекомбинантной бактерии согласно настоящему изобретению, является ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4, штамм И1-41, доступный из АТСС (Американская Коллекция Типовых Культур, Мапа88а8-Уцд1ша, И8) под номером доступа АТСС23502.

В соответствии с репрезентативным воплощением настоящего изобретения указанная рекомбинантная бактерия является бактерией, продуцирующей хондроитин, при этом ген, подвергаемый инактивации, является геном, кодирующим белок, выбранный из группы, состоящей из следующих белков (А), (В) и (С):

(A) белка, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО: 2 и обладающего фруктозилтрансферазной активностью;

(B) белка, содержащего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NО: 2, модифицированную путем делеции, замены или вставки одной или нескольких аминокислот и обладающую фруктозилтрансферазной активностью;

(C) белка, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% гомологию с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО NО: 2 и обладающую фруктозилтрансферазной активностью.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, в которой инактивированным геном является ген кГоЕ или нуклеотидная последовательность выбранная из группы, состоящей из следующих (а), (Ь) и (с):

(a) нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО NО: 1 и кодирующей белок, обладающий фруктозилтрансферазной активностью;

(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, содержащей нуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности 8ЕО ГО NО: 1 и кодирует белок, обладающий фруктозилтрансферазной активность; и (c) нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% гомологию с нуклеотидной последовательностью 8ЕО ГО NО: 1, и кодирующей белок, обладающий фруктозилтрансферазной активностью.

Объектом настоящего изобретения является продуцирующая хондроитин бактерия, в которой инактивацию гена кГоЕ получают путем модификации его нуклеотидной последовательности, например путем делеции или замены, полностью или частично, нуклеотидной последовательности, описанной выше в подпунктах (а), (Ь) или (с).

Другим объектом настоящего изобретения является бактерия, в которой инактивацию гена кГоЕ получают путем вставки одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидную последовательность, описанную выше в подпунктах (а), (Ь) или (с).

Согласно наиболее предпочтительному аспекту настоящего изобретения рекомбинантное производное штамма И1-41 ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4 (который далее будет обозначаться как Е. сой К4) получают путем инактивации гена кГоЕ, кодирующего предполагаемую фруктозилтрансферазу, посредством нуклеотидной делеции.

В настоящем изобретении описано то, как дезинтеграция гена кГоЕ приводит к непосредственному получению полисахарида К4, лишенного фруктозных остатков, то есть хондроитина.

- 2 025126

Согласно дальнейшему предпочтительному аспекту настоящего изобретения рекомбинантная Е. соН К4 согласно изобретению получена способом дезинтеграции хромосомных генов, в котором ПЦРпраймеры обеспечивают гомологию с геном-мишенью (Эа^спко апй ХУаппсг. ΡΝΑδ, νοί. 97, № 12, 66406645, .1иис 6, 2000).

Рекомбинантный штамм К4 Е. соН согласно настоящему изобретению подвергают инактивации хромосомного гена кГоЕ, во-первых, путем замены большей части его нуклеотидной последовательности экзогенным геном с резистентностью к канамицину (первая генетическая модификация), а затем путем делеции встроенного гена с помощью вектора, экспрессирующего рекомбиназу РЬР (вторая генетическая модификация).

Рекомбинантный штамм К4 Е.соН, полученный после первой генетической модификации, обозначаемый здесь как Е. сой К4 (ЛкГоЕ/кап^к), был депонирован 30 апреля 2010 г. в Немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (НсШхсНс §атт1ипд νοп МЮоогдапктсп ипй 2с11ки11игсп СтЬН, 1п1юГГсп51га55С 7В, 381 24 Вгаип8сЙ№е1д, Сеттапу) в соответствии с Будапештским Соглашением под номером доступа ΌδΜ23578.

Рекомбинантный штамм К4 Е.соН, полученный после второй генетической модификации, обозначаемый здесь как Е. соН К4 (ЛкГоЕ), был депонирован 26 мая 2010 г. в Немецкой Коллекции микроорганизмов и клеточных культур (НсШхсНс §атт1ипд νοп МЮоогдапктсп ипй 2с11ки11игсп СтЬН, 1пНо£Гсп81га88С 7В, 381 24 ВтаищсНетшд, Ссгтапу) в соответствии с Будапештским Соглашением под номером доступа Ό8Μ23644.

Инактивации гена кГоЕ добивались путем 3 последовательных трансформаций бактерии, во-первых, плазмидой, экспрессирующей красную рекомбиназу (рКИ46), во-вторых, фрагментом ДНК, полученным из матрицы плазмиды (рИК4), соответствующим образом модифицированной для получения гомологии с геном кГоЕ, и в-третьих, плазмидой-помощником, экспрессирующей фермент рекомбиназу РЬР (рСР20).

Для того чтобы получить первую генетическую модификацию Е. соН К4, использовали оба элемента: и плазмиду рКН46 (СспВапк: ΑΥ048746), и линейный фрагмент ДНК. Плазмида рКН46, используемая на первой стадии трансформации Е. соН К4, состоит из 2154 нуклеотидов из фага лямбда и из гена, кодирующего резистентность к ампициллину. Указанная плазмида вызывает промоцию и повышение скорости рекомбинации при использовании линейных фрагментов ДНК.

Линейный фрагмент ДНК, используемый в последующей трансформации Е. соН К4, получен методом ПЦР с использованием нескольких пар праймеров, которые включают в себя расширение гомологии и для гена кГоЕ, и для матрицы плазмиды рКИ4, несущей кассету резистентности к канамицину (СспВапк: ΑΥ 048743).

Данная процедура дает возможность генерировать линейный фрагмент ДНК, несущий кассету резистентности к канамицину, имеющий на своих концах 5'- и 3'-гомологичные концы гена кГоЕ.

В одном из воплощений настоящего изобретения трансформацию бактерии осуществляли путем электропорации, которая была выбрана в силу ее способности легко вырабатывать двойные трансформанты, которые могут быть получены из планшетов, содержащих как ампициллин, так и канамицин.

Однако несмотря на то, что электропорация является предпочтительной технологией, такой результат может быть достигнут любым известным способом трансформации, таким как трансформация хлоридом кальция или декстран-ОЕАЕ-трансформация.

Для того чтобы проверить корректность локализации замены исходной ДНК-последовательности кассетой резистентности к канамицину в трансформантах Е. соН К4 (ДкГоЕ/каи^к), было предпринято несколько ПЦР-амплификации с использованием 2 близлежащих локус-специфических пар праймеров: с помощью первой пары праймеров можно было продемонстрировать образование нового соединения между оставшимся 5'-концом кГоЕ и встроенным геном кап, тогда как с помощью второй пары праймеров можно было продемонстрировать образование нового соединения между встроенным геном кап и оставшимся 3'-концом кГоЕ.

Плазмидой-помощником, используемой для удаления кассеты резистентности к канамицину (вторая генетическая модификация), была плазмида рСР20, несущая дрожжевой ген рекомбиназы РЬР и ген резистентности к ампициллину. Обе плазмиды, рКО46 и рСР20, являются чувствительными к температуре векторами, которые последовательно удаляли из трансформантных штаммов Е. соН К4 путем нагревания при 43°С.

Анализ секвенирования был предпринят в отношении Е. соН К4 (ЛкГоЕ/кап^к) с целью подтверждения замены гена кГоЕ, полностью или частично, кассетой резистентности к канамицину. Сходным образом, был предпринят анализ секвенирования в отношении Е. соН К4 (ЛкГоЕ) с целью последующей проверки осуществления делеции кассеты резистентности к канамицину, приводящего к окончательному получению бактериального штамма с дезинтеграцией гена кГоЕ.

Способ, используемый для успешного конструирования рекомбинантного штамма Е. соН К4, способного получать негликозилированный вариант природного гликозаминогликана, имеет многопрофильную применимость и может быть успешно использован в отношении других гликозилированных продук- 3 025126 тов, когда такое гликозилирование желательно предотвратить. В заключение, был разработан способ получения бактерии, способной продуцировать негликозилированные варианты природных гликозаминогликанов.

Другой объект настоящего изобретения связан с обеспечением способа биотехнологического получения хондроитина, включающего в себя следующие стадии:

(1) культивирование в подходящей среде бактерии и (2) извлечение хондроитина, получаемого из его бульонной культуры.

Любая рекомбинантная бактерия, способная продуцировать хондроитин, полученная согласно описанному выше способу инактивации гена, кодирующего фермент, ответственный за присоединение остатков фруктозы к хондроитину, может быть использована на стадии культивирования.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения рекомбинантная бактерия, полученная из штамма Е. сой К4, такого как Е. сой Ό8Μ23644, используется в качестве рекомбинантной бактерии, обладающего способностью продуцировать непосредственно хондроитин.

Способ, привлеченный для культивирования бактерии Е. сой Ό8Μ23644, является общим способом, применимым для культивирования членов рода ЕксйейсЫа. Указанный способ основан на предпочтительном, но не исключительном, применении культивационной среды, содержащей на 1 л: К₂НРО₄ 3Н₂О 9,7 г, КН₂РО₄ 8 г, цитрата натрия 5Н₂О 0,5 г, МдС1₂ 7Н₂О 0,2 г, казаминовых кислот 20 г, (ΝΗ₄)₂8Ο₄ 20 г, глюкозы 2 г, дрожжевого экстракта 10 г. Более высокие уровни получения хондроитина могут быть достигнуты путем соответствующей модификации композиции базальной среды и/или добавления в культуру дополнительных питательных веществ посредством подпитки субстратной подложки.

Условия культивирования определяются таким образом, чтобы максимизировать бактериальный рост и получение хондроитина. Обычно культивирование производят при температурах 25 и 40°С в течение периода от 8 до 72 ч.

Супернатант собирают предпочтительно путем центрифугирования и используют для последующей очистки и характеристики получаемого хондроитина.

Очистку хондроитина осуществляли в соответствии с адаптированными способами, описанными Ройпдие/ и 1аии (Еиг. 1. В&сйет, νοί. 177, 117-124, Октябрь, 1988).

Вкратце, указанный способ, заимствованный для очистки хондроитина, основан на нескольких стадиях преципитации, начиная с культурального супернатанта и кончая сушкой под вакуумом. Идентичность получаемого продукта может быть установлена целым рядом способов, предпочтительно путем комбинирования способов, дающих возможность подтвердить структуру полисахаридной цепи и отсутствие в ней фруктозных остатков.

Отсутствие фруктозы в очищенном продукте может быть успешно установлено путем кислотного гидролиза полученного продукта, в условиях, при которых, как известно, фруктоза высвобождается из нативного полисахарида К4, с последующим специальным анализом по определению фруктозы, высвобождаемой вследствие этого. Указанный тест стабильно показывал, что полисахарид, извлекаемый из культур бактерии Е. сой Ό8Μ23644, не содержит фруктозу, в отличие от нативного полисахарида К4, полученного из штамма Ш-41 ЕксйейсЫа сой О5:К4:Н4, который постоянно получал полисахарид, содержащий фруктозу в количествах, ожидаемых в соответствии со структурной формулой полисахарида К4.

Дальнейшее подтверждение идентичности продукта, извлекаемого из культур бактерии Е. сой Ό8Μ23644, было получено путем переваривания указанного продукта ферментом хондроитиназой АВС, которая, как известно, полностью расщепляет до дисахаридов полисахарид хондроитин, свободный от остатков фруктозы, но не расщепляет нативный полисахарид К4.

Иными словами, хондроитиназа АВС не способна расщепить нативный полисахарид К4. Эксперименты по расщеплению хондроитиназой АВС продукта, извлекаемого из культур бактерии Е. сой Ό8Μ23644, дают количество дисахаридного продукта, ожидаемого в случае полного расщепления, таким образом подтверждая природу полисахаридного остова и, в частности, отсутствие фруктозных остатков.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения, для подтверждения функции к&Е в качестве гена, кодирующего фруктозилтрансферазную активность К4, конструировали рекомбинантную плазмиду, несущую нуклеотидную последовательность к&Е, и вводили в штамм К4 Е. сой (Дк&Е), чтобы способствовать восполнению утраченной функции.

Вкратце, ген к&Е амплифицировали и клонировали в плазмиду рТгсНк (1п\Цгодеп Сотротайоп, 5791 Уап А11еп ТОау РО Вох 6482 Саткйай, Сай&тша) внутри рестрикционных сайтов №о1 и ВатН1. Конструкцию рТтсН18-к&Е использовали для трансформации путем электропорации рекомбинантной Е. сой (Ак&Е), и трансформанты отбирали при 37°С на планшетах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина.

Трансформанты Е. сой (Дк&Е), несущие конструкцию рТгсНк-к&Е. культивировали и полисахарид К4 очищали в соответствии со способом Ройпдие/ и 1апп (Еиг. 1. В&сйет, νο1. 177, 117-124, ОсЮЬег 1988), и с целью количественного определения фруктозы, присутствующей в полученном продукте, свободную фруктозу определяли как до, так и после гидролиза под действием 0,2 М трифторуксусной кислоты в течение 1 ч при 99°С. Свободную фруктозу, определяемую до и после гидролиза, принимали за

- 4 025126 фруктозу, связанную со стартовой молекулой К4. В продукте, извлеченном из культуры Е. сой Ό8Μ23644, трансформированной конструкцией рТтсШк-кГоЕ, было показано наличие связанной фруктозы, что подтверждает то, что в данном штамме утрата фруктозилтрансферазной активности была восполнена плазмидой.

Описание графического материала

На фиг. 1 схематически показаны генетические модификации, которым подвергали штамм Ш-41 ЕксйепсЫа сой О5:К4:Н4 при получении конструкции Е. сой К4 (ДкГоЕ/каи^к) и Е. сой К4 (ДкГоЕ):

a) фрагмент ДНК, несущий кассету резистентности к канамицину (канамицин), фланкирован двумя рекомбинационными последовательностями РКТ (мишени, распознаваемые флиппазой); ген резистентности к канамицину получен из матрицы плазмиды рКЭ4 с помощью сайтов примирования Р1 и Р2;

b) подробная структура кластера генов К-антигена штамма И1-41 Е. сой О5:К4:Н4, где кГоЭ и кГоР являются фланкирующими генами гена кГоЕ;

c) хромосомная ДНК Е. сой К4 (ДкГоЕ/каи^К) с показанной дезинтеграцией гена кГоЕ путем замены фрагмента исходной ДНК геном резистентности к канамицину (канамицин);

ά) хромосомная ДНК Е. сой К4 (ДкГоЕ) с показанной финальной делецией большей части гена кГоЕ.

На фиг. 2 показаны результаты ПЦР-амплификации, выполненной на 3 трансформантах Е. сой К4 (ДкГоЕ/каи^к), с целью верификации последовательности остальных фланкирующих областей 3'- и 5'-кГоЕ:

полосы 1 и 10 соответствуют молекулярному весу маркера (ДНК-маркер в 1000 нуклеотидов);

полосы 2-4: продукт ПЦР оставшегося З'-конца кГоЕ указанных 3 трансформантов;

полосы 6-8: продукт ПЦР оставшегося 5'-конца кГоЕ указанных 3 трансформантов;

полосы 5 и 9: продукт ПЦР штамма И1-41 ЕксйепсЫа сой О5:К4:Н4, полученного соответственно с помощью 3'- и 5'-пар праймеров.

На фиг. 3 показана хроматограмма полисахарида, получаемого штаммом Е. сой Ό8Μ23644, анализируемая методом капиллярного электрофореза после расщепления хондроитиназой АВС, где показан ненасыщенный Д-дисахарид (Δάί-0δ), типичный для расщепления хондроитина под действием хондроитиназы АВС (пик 8).

На фиг. 4 показан ¹³С-ЯМР-спектр хондроитина, получаемого посредством штамма Е.сой Ό8Μ23644, полученного в соответствии с примером 3.

Примеры

Пример 1. Конструирование штамма Е. сой К4 (ДкГоЕ/каи^к).

Конструирование линейного фрагмента ДНК (фиг. 1а), несущего оба гомологичных конца генов каи^к и кГоЕ, осуществляли методом ПЦР с помощью вектора рКЭ4 в качестве матрицы и следующих ПЦР-праймеров: ОЙ151: а1дсйс!аа1аа1д1с1ддйсс1а1дйсаасаадаа1д1д1аддс1ддадс1дсйс (8ЕЦ ГО N0: 3) ОЙ152: 1са1ас1дсадсс1ссйаааааШса1а1аа1с1ааа1дсаса1а1даа1а1сс1ссйа (8ЕЦ ГО NО: 4).

В каждой олигонуклеотидной последовательности первые 40 нуклеотидов обеспечивают гомологию гена кГоЕ, а оставшиеся 20 нуклеотидов обеспечивают гомологию матрицы плазмиды рКЭ4 (сайты примирования Р1 и Р2).

ПЦР осуществляли со 120 нг ДНК-матрицы в соответствии со следующими условиями: 94°Сх3 мин, (94°Сх1 мин, 40°Сх1 мин, 68°Сх2 мин.)х5 циклов, (94°Сх1 мин, 59°Сх1 мин, 68°Сх2 мин.)х30 циклов, 68°Сх10 мин, 4°Сх10 мин.

Продукт ПЦР был очищен в геле, и бактерии были трансформированы.

Штамм И1-41 ЕксйепсЫа сой О5:К4:Н4 (фиг. 1Ь) был получен и трансформирован плазмидой рКЭ46 в соответствии с тем, как описано ЭаЦепко и Ааииет (ΡΝΑδ, уо1. 97, № 12, 6640-6645, 1иие 2000), затем его наносили на содержащую ампициллин среду.

Ампициллин-резистентные трансформанты были идентифицированы и изолированы.

Два трансформанта верифицировали путем экстракции плазмиды и ПЦР с использованием следующих праймеров и в следующих условиях:

Ой-149: ссас!са1ааа1сс1са1адад (8ЕЦ ГО NО: 5), ОЙ150: ссаасйасййдасаасда! (8ЕЦ ГО NО: 6) при 94°Сх3 мин, (94°Сх1 мин, 43°Сх1 мин, 68°Сх2,5 мин.)х30 циклов, 68°Сх10 мин, 4°Сх10 мин.

Продукт ПЦР подвергали анализу методом электрофореза в 0,8% агарозном геле и идентифицировали продукт размером в 1799 пар нуклеотидов, в полном соответствии с ожидаемым размером продукта.

Один из двух трансформантов рКЭ46 подвергли последующей электропорации с использованием ДНК-фрагмента, несущего и кассету резистентности к канамицину, и гомологичные концы кГоЕ.

Используя селекцию планшетов в среде, содержащей как ампициллин, так и канамицин, изолировали рекомбинанты, несущие замену большей части нуклеотидной последовательности кГоЕ геном резистентности к канамицину.

Три двойных трансформанта были верифицированы путем ПЦР-амплификации обеих, 3'- и 5'фланкирующих областей кГоЕ, с использованием следующих подходящих для этого праймеров: ОЬ153: аа!ссдасддддас1д1адай (8ЕЦ ГО №: 7), ОЙ142: аас!дйсдссаддс1саад (8ЕЦ ГО NО: 8), ОЙ143: дсдййсссйдГссада! (8ЕЦ ГО NО: 9), ОЬ1 54: дс!аа1д1а1а1дайдссадд1 (8ЕЦ ГО NО: 10) при 95°Сх5 мин, (94°Сх1 мин,

- 5 025126

47°Сх1 мин, 68°Сх2 мин)х30 циклов, 68°Сх100 мин, 4°Сх10 мин.

Продукты ПЦР подвергали анализу методом электрофореза в 0,8% агарозном геле и идентифицировали соответственно два продукта размером в 1773 пары нуклеотидов для З'-концевой амплификации и размером в 769 пар нуклеотидов для 5'-концевой амплификации гена кГоЕ, в полном соответствии с ожидаемым размером продукта (фиг. 2).

В порядке верификации ориентации гена резистентности к канамицину и для того, чтобы удостовериться в корректном направлении тринскрипции гена, был осуществлен дополнительный анализ трансформантов путем секвенирования Е. сой К4 (АкГоЕ/каи^к) (фиг. 1с)) с использованием следующих олигонуклеотидов: ОЬ153: аа1ссдасддддас!д1адай (8ЕЦ ГО N0: 7) ОЬ154: дс1аа1д1а1а1дайдссадд1 (8ЕЦ ГО N0: 10).

Полученная в результате нуклеотидная последовательность идентифицирована как §ЕЦ ГО N0: 14.

Пример 2. Конструирование штамма Е. сой К4 (АкГоЕ).

Чтобы получить штамм Е. сой К4 (АкГоЕ), лишенный кассеты резистентности к канамицину и несущий делецию большей части гена кГоЕ с сопутствующей потерей функции, предприняли дополнительную трансформацию штамма Е. сой К4 (АкГоЕ/каи^к) плазмидой рСР20.

После стадии электропорации трансформанты отбирали на среде, содержащей ампициллин, при 30°С, а затем колонию подвергали очистке.

Предполагаемые трансформанты выращивали на неселективных планшетах при 43 °С, а затем тестировали на предмет потери резистентности ко всем антибиотикам.

Трансформанты штамма Е. сой К4 (АкГоЕ) верифицировали путем секвенирования оставшихся фланкирующих 3'- и 5'-концов кГоЕ (фиг. 16)), с использованием следующих олигонуклеотидов: 0Ь1 69: 1дадд1дайдйдд1ааассйдд1д (8ЕЦ ГО N0: 11), 0Ь1 66: 1ас1д1йс1дсйдсссссдадй (8ЕЦ ГО N0: 12).

Полученная в результате нуклеотидная последовательность идентифицирована как §ЕЦ ГО N0: 13.

Пример 3. Культивирование Е. сой Ό8Μ23644 и анализ хондроитина.

Культивирование Е. сой Ό8Μ23644 осуществляли согласно Робпдиех и 1аии (Еиг. 1. Вюсйет., уо1. 177, 117-124, 0с1оЬег 1988).

Вкратце, вегетативную стадию культивирования осуществляли, начиная с 0,5 мл размороженного штамма, засевая матрас, содержащий 20 мл культурального бульона, состоящего, из расчета на 1 л, из 9,7 г К₂НР0₄ 3Н₂0, 8 г КН₂Р0₄, 0,5 г цитрата натрия 5Н₂О, М§С1₂ 7Н₂О 0,2 г, казаминовых кислот 20 г, сульфата аммония 20 г, глюкозы 2 г, дрожжевого экстракта 10 г, инкубировали при 37°С в течение 16 ч, со встряхиванием при 180 об/мин и с горизонтальным смещением в 2,5 см.

Последующую стадию культивирования проводили в периодической культуре, в 500-мл встряхиваемом матрасе, содержащем 85 мл бульонной культуры, как описано выше, высеваемой с 0,05% вегетативной культуры, полученной, как описано выше, и инкубируемой при 37°С в течение 48 ч, со встряхиванием при 180 об/мин и с горизонтальным смещением в 2,5 см.

В конце инкубации культуру собирали путем центрифугирования и супернатант подвергали очистке с целью выделения и получения характеристик хондроитина.

Очистку хондроитина осуществляли в соответствии с адаптированным способом, описанным Ко6гщиех и 1аии (Еиг. 1. Вюсйет., уо1. 177, 117-124, 0с1оЬет 1988).

Вкратце, полисахарид осаждали из культурального супернатанта с помощью цетавлона (алкилтриметиламмония бромид, СЛ§ N0 : 71 92-88-3), экстрагировали с помощью 0,5 М №0Н при 3°С, производили нейтрализацию и последовательно очищали 3 циклами преципитации 80% этанолом.

Конечную стадию очистки осуществляли 90% холодным фенолом, рН 6,8, для осаждения контаминирующих белков, восстанавливая таким образом водную фазу путем центрифугирования. Очищенный хондроитин восстанавливали из водной фазы путем осаждения 80% этанолом и сушили под вакуумом.

Для установления природы получаемого хондроитина было использовано несколько аналитических подходов. Первый подход был основан на присутствии или отсутствии фруктозы в извлекаемом из культуры продукте после кислотного гидролиза, осуществляемого посредством обработки 0,2 М трифторуксусной кислотой в течение 1 ч при 99°С.

Чтобы количественно оценить присутствие фруктозы в полученном продукте, свободную фруктозу определяли как перед гидролизом, так и после него. Анализ фруктозы проводили ферментативным путем с помощью набора Еи/уР1и5 сахарозыГО-глюкозыГО-фруктозы, поставляемого компанией В10С0НТК0Е (ВюСоп1го1 8у81ет8 1пс. 12822 §Е 32п6 51гее1 Вейеуие, \УЛ 98005, Иийеб 81а1е8).

Разницу между свободной фруктозой, присутствующей после гидролиза, и фруктозой, присутствующей перед гидролизом, принимали в качестве фруктозы, связанной с исходной молекулой К4.

Продукт, извлеченный из культуры Е. сой Ό8Μ23644, не обнаруживал наличие связанной фруктозы, что подтверждает то, что данный штамм получает полисахарид, свободный от фруктозы.

Отсутствие связанной фруктозы в полисахариде, извлеченном из культур Е. сой Ό8Μ2 3644, как описано выше, было подтверждено ферментативным расщеплением хондроитиназой АВС. Дополнительно было продемонстрировано, что при расщеплении очищенного хондроитина хондроитиназой АВС получался ненасыщенный А-дисахарид (Α6ί-0δ), типичный для расщепленного хондроитина, что под- 6 025126 тверждается капиллярным электрофорезом (СЕ) с использованием технологии мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЕСК) (фиг. 3). Подтверждение структуры ΔΦί-08 было получено с помощью соответствующего ссылочного стандартного Δ-дисахарида (с эквивалентной электрофоретической элюцией). Количественное определение полученного ΔΦί-08 осуществляли с помощью дополнительной калибровочной кривой.

Наконец, очищеный хондроитиновый полисахарид, получаемый Е. сой Ό8Μ23644, был охарактеризован ¹³С-ЯМР (фиг. 4).

С использованием такой технологии было показано, что искомый продукт является спектрально идентичным продукту, полученному после удаления фруктозы из нативного полисахарида К4 путем кислотного гидролиза.

Пример 4. Опосредованное плазмидой восполнение функции к&Е.

В порядке верификации функции к&Е как гена, кодирующего активность фруктозилтрансферазы К4, конструировали рекомбинантную плазмиду, несущую нуклеотидную последовательность к&Е дикого типа, и вводили ее в штамм К4 Е. сой (ΔΕ&Ε), чтобы способствовать восполнению утраченной функции.

Ген к&Е амплифицировали с использованием следующих олигонуклеотидов: ОЬ172: асааса!дйас1аа1аа1д1с1дд11сс1а1д11с (8ЕЦ ГО N0: 15), ОЬ173: ас1дда1ссйа1са1ас1дсадсс&сйа (8Е0 ГО N0: 16).

Плазмиду рТгсН18 (4400 п.н. - 1иуйгодеи Согрогайои, 5791 Уап А11еп \Уау РО Вох 6482 СагПЪаФ, Са11&гша) использовали для введения амплифицированного и очищенного в геле гена к&Е (1569 п.н.) в соответствующие сайты клонирования.

нг вектора рТгсНй. обработанного ферментами рестрикции №о1 апф ВатН1, и 75 нг гена к&Е. имеющего совместимые Рсй/ВатН1-переваренные концы, подвергали реакции лигирования при 25°С в течение 15 мин.

Затем 50 мкл ОН5а-компетентных клеток ЕксйепсЫа сой (1пуйгодеп Согрогайоп, 5791 Уап А11еп \Уау РО Вох 6482 СагПЪаФ, С’аН&пиа) подвергали электропорации с использованием 5 мкл лигирующей смеси, и при 37°С было отобрано пять трансформантов на планшетах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина.

После очистки колонии сконструированную плазмиду рТгсНй-к&Е экстрагировали и расщепляли под действием рестрикционного фермента Μ& I, который способен разрезать ДНК-конструкцию внутри встроенной последовательности к&Е.

Посредством анализа путем гель-элктрофореза 3 из 5 трансформантов после обработки ферментом Μ& I имели ожидаемую длину в 5887 п.н., и анализ последовательности подтвердил корректность инсерции гена к&Е.

Верифицированную конструкцию рТгсНй-к&Е использовали для трансформации путем электропорации рекомбинантного штамма Е. сой Ό8Μ23644, и трансформанты отбирали на планшетах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина.

Отобранные трансформанты культивировали в условиях, описанных в примере 3, и полисахарид К4 подвергали очистке в соответствии с методикой, описанной РоФпдие/ и 1аии (Еиг. 1. Вюсйет, уо1. 177, 117-124, Ос&Ъег 1988).

С целью количественного определения фруктозы, присутствующей в полученном продукте, свободную фруктозу определяли как до, так и после гидролиза под действием 0,2 М трифторуксусной кислоты в течение 1 ч при 99°С. Свободную фруктозу, определяемую до и после гидролиза, принимали за фруктозу, связанную со стартовой молекулой К4. В продукте, извлеченном из культуры Е. сой Ό8Μ23644, трансформированной конструкцией рТгсШк-к&Е, было показано наличие связанной фруктозы, что подтверждает то, что в данном штамме утрата фруктозилтрансферазной активности была восполнена плазмидой.

Анализ фруктозы проводили ферментативным путем с помощью набора Еп/уР1и5 сахарозыГОглюкозыГО-фруктозы.

Продукт, извлеченный из культуры Е.сой Ό8Μ23644, трансформированной конструкцией рТгсНйк&Е, не обнаруживал наличие связанной фруктозы, что подтверждает то, что в данном штамме утрата фруктозилтрансферазной активности была восполнена плазмидой.

- 7 025126

Список последовательностей <110> НЬОСИС С.П.А.

<120> ПОЛУЧЕНИЕ ХОНДРОИТИНА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ ПУТЕМ <130> С71589 <160> 16 <170> РаРепИп ν^ΓΕίοη 3.5 <210> 1 <211> 1566 <212> ДНК <213> ЕзсНегасЫа соП <220>

<221> ген <222> (1) . . (1566) <400 1

аЬдсЬЬсЬаа	ЪааЪдЪс^дд	ЪЬссАаЪдЪЬ	саасаадаа^	^аддддссда	аЬЫзддЬЬсб	60
аЮсОссаа	дсЪЪЪсЪЪсс	Ъ1Аас1сзаа1з	ааасда'Ь'Ьа!;	:Ааадс=Аса	адТаТсТТТа	120
дддсаОдаОд	д1зсаЛдса.а1з	аВа1ьс^дд1ьВ	Ъзассддаад	а-ЬЪЪЪдРдр-Ь	ТдасааасаТ	180
да^СаСдааЬ	дд£АдсСАсд	1;ааСааад1;а	асааСда^сс	с£дСсда£ад	ЬаасСЬдаса	240
ЬЬадддсаад	сда^адСАас	сдса^ддааС	С^ааСаддад	аСааада^да	саааддсЬЬа	300
сааггагьдь	ЪЪддсда^ас	асАсАСАааа	аааа£1:се£д	саддддадда	аГГадГадеа	360
аааадТсаТс	сАда^даааа	Ъйайсаайдд	дсса1А1А1А	асдааасада	дТТаададсс	420
дТсадОадад	аадаЪааРаа	ааа1ьд^аа1ьВ	ЪдЪддд^аЪз	А АА 1_Аас	аааассдааб	480
ГСГСГСаСГа	дддаа^СадЪ	£асС£саааа	ЫАда1:С1:еа	сддсддсасС	СааааадГаГ	540
сасдасадсЬ	а^ад^АСадс	сСсСа^аСас	ςίςίс^даСЪ	ддс(Ада£АС	ЬддасаСаЫ;	600
аа^асаЪасЬ	а1:аад1:сааа	ад1:асааСас	асаасссадс	д£дсаСА£аа	ЬдааСЪаЬдс	660
аТЬасаасаа	ааЪссд'ЬЬа^	саааЬсаад£	'Ьсааа'Ьдааа	дЪаааа^'Ьда	адсбдаабса	720
аааТддЫТд	ааасйайзсс	сддадаа'Ыьа	аада^с^а^а	«АссааздтА	аТТддаассд	780
ЬЫздаЬсаЬа	Ъсадааадад	1: Са Ьаадс1;Ь	дааЪаЪЬЪаЪ	аЪааЪасдас	дЬЬаааЬдаа	840
ььасъсдеьь	ГЪГсСсдссЪ	ассааа^ааС	аМАСаасаа	аса£а££аас	аадЬСдСЬЬа	900
дасСЪсаСсд	а£ <Ад1;дсаа	адаа£а1: сас	есаа1Адаеа	сСдасааааа	ЬаСасЪдсаа	960
даГТГаГГГТ	а^даааааас	да!Ададсдд	д1АадсаадС	аса£аасада	ТГТаааТаТГ	1020
даЪссаааЪд	сааааЪддаа	ЪЪЪЪааЪааЪ	ааЪа^аадсд	ААааДаа	Тда^аСТсТЪ	1080
Ьа^даСасЬа	а^аааМАа^:	сссаад1:даа	сАдсааСаСа	ааасАаЪЪаС	дса^ддсдаЬ	1140
ЬОаОдсМзЬа	д1заа£а£аа1з	ЪЪЪЪаасЪЪЪ	адаасЪддЪа	дааЪасаадЪ	ОСОГдаОссс	1200
ададдаЬТда	ассасЪсЬдд	адаааЪаад'Ь	аЫАаЪдд'Ьд	аЪ'Ь'Ь'Ьсд'Ы^а	Тдабабадсб	1260

- 8 025126

аааГГаГсас	аГСсааСасГ	адддсСсСаС	даСГддаГаа	ГГдсаддаГа	СГаГаГааГа	1320
аабааааааа	аЬаааасЬса	ЬадЬаЬЬдаа	ЬЬсааааЬЬа	аЬаЬЬдаЬаа	ЬаааЬЬдЬЬЬ	1330
даааГГсааГ	саасаГСГдГ	ГГсГаГааГа	ааададаааГ	аГГсааГсГс	сдаааааГса	1440
ГГдГаГдсда	ГдсаааСаса	ГГГаГГГГГа	СсааГдсГГс	сссГГсаГГс	сдаГдасааа	1500
ааааддсаад	аГдсасЬаГГ	ГдсГааГдса	ЬГЬадаГГаГ	аГдаааГГГЬ	ЬааддаддсГ	1560

дсадГа 1566

31п '51 и Ьеи 31у А1а 15

Ьеи А1а Азп Ьуз Агд 30

С1у Шз А1а Не Туг

Н1з Азр Туг 51и Тгр

Азр Зег Азп Ьеи ТЬг 30

11е 51 у Азр Ьуз Азр 95

Ьеи РЬе Ьуз Ьуз 11е 110

Рго Азр 61и Азп Туг 125

А1а Уа1 Зег Агд С1и 140

РЬе Агд Ьуз Рго Азп 160

Азр РЬе ТЬг А1а А1а 175

Зег 11е Туг Уа1 Зег 190

Туг Ьуз Зег Ьуз Υη 205

- 9 025126

61η Туг ТЬг ТЬг 61п Агд А1а РЬе Азп 61и Ьеи Суз Не ТЬг ТЬг Ьуе 210 215 220

Зег Уа1 11е Ьуз Зег Зег Зег Азп 61и Зег Ьуз 11е 61и А1а 61и Зег

225 230 235 240

Ьуз Тгр РЬе 61и ТЬг 11е Рго 61у 61и Ьеи Ьуз 11е Туг ТЬг Рго Мер

245 250 255

Ьеи Ьеи 61и Рго РЬе Азр Шз 11е Агд Ьуз Зег Туг Ьуз Ьеи 61и Туг

260 265 270

Ьеи Туг Азп ТЬг ТЬг Ьеи Азп 61и Ьеи РЬе Уа1 РЬе Зег Агд Ьеи Рго 275 280 285

Азп Азп 11е Ьеи ТЬг Азп 11е Ьеи 11е Зег Суз Ьеи Азр РЬе 11е Азр 290 295 300

Ьеи Суз Ьуз 61и Туг Нтз Зег 11е Азр ТЬг Азр Ьуз Азп 11е Ьеи 61п

305 310 315 320

Азр Ьеи РЬе Туг 61и Ьуз ТЬг 11е 51и Агд Уа1 Зег Ьуз Туг 11е ТЬг

325 330 335

Азр Ьеи Азп 11е Азр Рго Азп А1а Ьуз Тгр Азп РЬе Азп Азп Азп 11е 340 345 350

Зег νβΐ Зег 11е Азп Азр 11е Ьеи Туг Азр ТЬг Азп Ьуз РЬе 11е Рго 355 360 365

Зег 61и Ьеи 61п Туг Ьуз ТЬг 11е Мер Н±з 61у Азр Ьеи Суз РЬе Зег 370 375 380

Азп 11е 11е РЬе Азп РЬе Агд ТЬг 61у Агд 11е 61п Уа1 РЬе Азр Рго

385 390 395 400

Агд 61у Ьеи Азп Шз Зег 61у 61и 11е Зег 11е Туг 61у Азр РЬе Агд

405 410 415

Туг Азр 11е А1а Ьуз Ьеи Зег Шз Зег 11е Ьеи 61у Ьеи Туг Азр Тгр 420 425 430

11е 11е А1а 61у Туг Туг 11е 11е Азп Ьуз Ьуз Азп Ьуз ТЬг Н±з Зег 435 440 445

11е 61и РЬе Ьуз 11е Азп 11е Азр Азп Ьуз Ьеи РЬе 61и 11е 61п Зег 450 455 460

ТЬг РЬе АЛа1 Зег 11е 11е Ьуз 61 и Ьуз Туг Зег 11е Зег 61и Ьуз Зег

465 470 475 480

Ьеи Туг А1а Мер 61п 11е Шз Ьеи РЬе Ьеи Зег Мер Ьеи Рго Ьеи Шз

485 490 495

Зег Азр Азр Ьуз Ьуз Агд 61п Азр А1а Ьеи РЬе А1а Азп А1а РЬе Агд 500 505 510

Ьеи Туг 61и 11е РЬе Ьуз 61и А1а А1а νβΐ 515 520 <210> 3 <211> 60 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 10 025126 <220>

<223> ОЬ151 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1) . . (60) <400> 3 абдсббсбаа баабдбсбдд ЪбссЬабдбб саасаадааб дбдбаддсбд дадсбдсббс 60 <210> 4 <211> 62 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОЫ52 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1)..(62) <400> 4 бсабасбдса дссбссббаа ааабббсаба баабсбаааб дсасабабда абабссбссб 60

6а 62 <210> 5 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 01.149 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1)..(22) <400> 5 ссасбсабаа абссбсабад ад 22 <210> 6 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 01.150 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1)..(22) <400> 6 ссаасСбасС СсСдасаасд ас 22

- 11 025126 <210> 7 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> 01,153 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1) . . (22) <400> Ί ааСссдасдд ддасЬд1;ада Шт 22 <210> 8 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОЫ42 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1)..(20) <400> 8 аасСдСТсдс саддсТсаад 20 <210> 9 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОЫ43 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1)..(20) <400> 9 дсдСТСДссс СТдДссадаД 20

<210>	10
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	ОЫ54
<220>
<221>	олигонуклеотид

- 12 025126 <222> (1) . . (23) <400> 10 дсЪааСдВаС а£даС£дсса дд£ 23 <210> 11 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОЫ69 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1)..(27) <400> 11

КдаддКдаКС дККддКааас сККддЪд 27 <210> 12 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОЫбб <221> олигонуклеотид <222> (1)..(25) <400> 12

Сас^д^СЪсЬ дсбСдссссс дадбс 25 <210> 13 <211> 167 <212> ДНК <213> ЕЁсЬегтсЫа со11 <220>

<221> ген <222> (1)..(167) <223> перестроенный
<400> 13
абдсСбсбаа	бааСдСсСдд	С^ссЪаЪдЪЪ	саасаадааЕ	дЬд^аддсЕд	дадсЬдсЕ'Ьс	60
даадСбссСа	басСбСсСад	адааЪаддаа	сЕЬсддаа'Ьа	ддаасЬаадд	адда'Ьа'Ь'Ьса	120
ЬаГдбдсабС	СадаСбаба!;	даааЪЪЪЪСа	аддаддсСдс	ад£а£да		167

<210> 14 <211> 1559 <212> ДНК <213> ЕзсИегасЫа соЦ

- 13 025126 <220>

<221> ген <222> (1)..(1559) <223> перестроенный <400> 14

аИдсМзсСаа	Ьаа'ЬдЪс^дд	^Ссс'Ьа'ЬдЪС	саасаадаа1:	дСдСаддс^д	дадсСдОДСс	60
даадА^ссАа	ЕасА^АсАад	адааАаддаа	сАЕсддаа^а	ддаасССсаа	даЕсссссас	120
дсУдссдсаа	дсас£саддд	сдсаадддсЕ	дс^аааддаа	дсддаасасд	1:адааадсса	130
дЪссдсадаа	асдд^дсЪда	ссссдда^да	аЪдЪсадс^а	сЕдддсЪа1зс	Ъддасааддд	240
аааасдсаад	сдсааадада	аадсаддСад	с1зедсадАдд	дс1:Саса£дд	сда^адсЪад	300
асАдддсддС	ЪЪ^аСддаса	дсаадсдаас	сддааМ^дсс	адсСддддсд	ссс1:с1:дд£а	360
аддЪЪдддаа	дссс^дсааа	дЪааас^дда	ЪддсЪЪЪсЪЪ	дссдссаадд	а^сЪдаЪддс	420
дсадддда'Ьс	аадаЕс'Ьда'Ь	саададасад	даЕдаддаЕс	дЕ'Ь'Ьсдса^д	а'ЬЕдаасаад	430
аЕддаЕ^дса	сдсаддАЪсЪ	ссддссдсОДЕ	ддд1сддадад	дсЪаЪАсддс	ЕаЕдасЕддд	540
сасаасадас	ааЪсддсЪдс	Ъс^ааЪдссд	ссд£д£Ъссд	дсЪдЪсадсд	саддддсдсс	600
сддС1:с1:С1:е	ИдИсаадасс	дасс^д^ссд	д^дсссидаа	1:даасСдсад	дасдаддсад	660
сдсддсЪаЪс	д1аддс1эддсс	асдасдддсд	‘Ь'Ьсс'Ысдсдс	адсАдАдсзс	дасдЕСдСса	720
сЕдаадсддд	аадддасАдд	сЕдсСаС^дд	дсдаадЕдсс	ддддсаддаС	сСссЕдСсаС	730
сАсассААдс	^ссУдссдад	ааадСаСсса	ЕсаСддсСда	Сдсаа^дсдд	сддсЕдса^а	840
сдсС^даСсс	ддсЬасс1:дс	ссаЬ'Ьсдасс	ассаадсдаа	асаСсдса^с	дадсдадсас	900
дЪасЪсддаС	ддаадссдд1;	сСОДдАсдаЪс	аддаЪдаАсЪ	ддасдаадад	саСсаддддс	960
^сдсдссадс	сдаасЪдЪЪс	дссаддс1са	аддсдсдсаС	дсссдасддс	даддаСсСсд	1020
^сдЪдассса	ЪддсдаЪдсс	ЪдсЪ1здссда	аЪаЪсаЪддЪ	ддааааЪддс	сдсЪЪЪЪсЪд	1030
да^'Ьса'Ьсда	сЬд1эддссдд	сЕддд'Ьд'Ьдд	сддассдсЬа	Ьсаддаса^а	дсд’ЬЕддсЬа	1140
сссдЪдаСаС	ЪдсАдаадад	сСОДддсддсд	ааСдддсАда	ссдс^СссА с	дЪдс£1:Сасд	1200
дЪаЪсдссдс	ЪсссдаЪЪсд	садсдсаЪсд	ссЬЪсЪаЪсд	сс££с££дас	дад££с££с£	1260
дадсдддасЕ	сЬдддд'Ь'Ьсд	аааЕдассда	ссаадсдасд	сссаассЕдс	саЕсасдада	1320
АЕАсдаАЕсс	ассдссдссА	АсСаСдааад	дССдддсС^с	ддааСсдССС	Ьссдддасдс	1330
сддсАддаАд	аСссЪссадс	дсдддда^сЕ	саСдсСддад	СЕсССсдссс	ассссадсСС	1440
саааадсдсЬ	с£даад£1:сс	^а^асЬЪСсС	ададааЬадд	аасЫ:сддаа	Саддаас^аа	1500
ддадда1;а1;С	са^аСдСдса	1:еЪада1;СаС	а1здааа£Л ϋΐ	1:ааддаддс£	дсадСаСда	1559

<210> 15 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

- 14 025126 <220>

<223> ОЫ72 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1) . . (36) <400> 15 асаосабдбС асСаабааСд бсбддЬВсс! абдВТс 36 <210> 16 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ОЫ73 <220>

<221> олигонуклеотид <222> (1)..(31) <400> 16 асбддабссЪ бабсабасбд садссбссТб а 31

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантная бактерия, продуцирующая хондроитин, представляющий собой линейный гликозаминогликан, образованный остатками Ό-глюкуроновой кислоты (О1сИА) и Ν-ацетил-Эгалактозамина (ОаВДАс), связанными посредством связей β1-3 (ОкИА^-ОаШАс) и β1-4 (Оа1NАс^Ο1сυА), отличающаяся тем, что указанная рекомбинантная бактерия получена из бактерии, принадлежащей к группе К-антигена, которая включает роды ЕксйепсЫа, НаеторйЛик, Сатру1оЬас1сг. О1оеосарка или У&гю, причем в указанной бактерии ген к£оЕ делетирован или инактивирован путем полного или частичного его замещения либо посредством вставки в него нуклеотидной последовательности, где указанный ген кодирует фермент, ответственный за присоединение остатков фруктозы к линейному остову хондроитина, выбранный из группы, состоящей из:

(A) белка, содержащего аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 2, обладающего фруктозилтрансферазной активностью;

(B) белка, содержащего аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 2, модифицированную путем делеции, замещения или вставки одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего фруктозилтрансферазной активностью; и (C) белка, содержащего аминокислотную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 50% аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0: 2, и обладающего фруктозилтрансферазной активностью.
2. Рекомбинантная бактерия по п.1, в которой ген к&Е имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(a) нуклеотидной последовательности, которая содержит последовательность ЗЕО ГО N0: 1 и кодирует белок, обладающий фруктозилтрансферазной активностью;

(b) нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, обладающий фруктозилтрансферазной активностью, и гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности ЗЕО ГО N0: 1; и (c) нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок, обладающий фруктозилтрансферазной активностью, и содержит нуклеотидную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 50% нуклеотидной последовательности ЗЕО ГО N0: 1.
3. Рекомбинантная бактерия по любому из пп.1 и 2, в которой ген к&Е инактивирован путем полного или частичного его замещения кассетой резистентности к канамицину с ее последующим удалением, что приводит к полной или частичной делеции гена к&Е.
4. Рекомбинантная бактерия по п.3, происходящая из бактерии вида ЕксйепсЫа сой.
5. Рекомбинантная бактерия по п.4, происходящая из серотипа бактерии вида ЕксйейсЫа сой, принадлежащего группе 2 К-антигена.
6. Рекомбинантная бактерия по п.5, происходящая из штамма И1-41 ЕксйепсЫа сой 05:К4:Н.
7. Рекомбинантная бактерия по любому из пп.1 и 2, представляющая собой ЕзсйепсЫа сой Ό8Μ23578 или ЕксйепсЫа сой Ό8Μ23644.
8. Рекомбинантная бактерия по п.7, представляющая собой ЕксйепсЫа сой Ό8Μ23644.
9. Способ получения хондроитина биотехнологическим путем, включающий следующие стадии:

- 15 025126 (A) культивирование в соответствующей среде рекомбинантной бактерии по любому из пи. 1-8;

(B) извлечение из культуральной среды продуцированного бактериями хондроитина и его очистку.
10. Способ по п.9, где указанной рекомбинантной бактерией является ЕзсйепсЫа сой Ό8Μ23578 или ЕзсйепсЫа сой ϋ8Μ23644.
11. Способ по п.9, где указанной рекомбинантной бактерией является ЕзсйепсЫа сой ϋ8Μ23644.

8ΕΩ Ю №3 8ΕΩ Ю №4 а) (δΑίοΕ Р1 | РКТ Канамицин РКТ | Р2 3‘ к(оЕ| Ь) кШ I 5'кТоЕ кТоЕ З'ИоЕ I кТоР