MX2013000100A - Produccion biotecnologica de condroitina. - Google Patents
Produccion biotecnologica de condroitina.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona con condroitina que se produce cultivando un microorganismo recombinante que se obtiene por inactivación de un gen que codifica una enzima responsable de la adición de residuos de fructosa al polisacárido de condroitina lineal, en un microorganismo que produce un derivado fructosilado de condroitina.
Description
PRODUCCION BIOTECNOLOGICA DE CONDROITINA ^
Campo de la Invención
La presente invención se relaciona con un nuevo microorganismo recombinante que produce condroitina y con un método para la producción biotecnológica de condroitina.
En la presente invención, el término condroitina indica un polisacárido lineal definido como un glicosaminoglicano lineal constituido por residuos alternados de ácido D-glucurónico (GlcUA) y N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) unidos por enlaces ß1-3 (GlcUA?GalNAc) y ß1-4 (GalNAc?GlcUA) .
Antecedentes de la Invención
El sulfato de condroitina es un glicosaminoglicano en el que el ácido glucurónico (GlcUA) y una N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) se enlazan lineal y alternativamente por el enlace ß1-3 y ß1-4, respectivamente, para formar una cadena de polisacárido lineal que es sulfatada en grados variados en sus residuos GalNAc.
Está presente en animales, en cartílagos y tejido conectivo, jugando un papel importante en la adhesión celular, regeneración de tejido, extensión nerviosa y similares .
La producción de condroitina de fuentes no animales es una etapa importante y deseable hacia la producción de sulfato de condroitina no derivado de animales. La literatura
Ref. 237590 de patente disponible describe varios métodos para la producción de condroxtina no derivada de animales .
Además, varios genes de condroitina sintasa, derivados de animales y microorganismos, se han clonado y secuenciado.
Un método para la producción de condroitina se ha proporcionado usando una bacteria de Bacillus Gram positiva recombinante, introducida con un gen de de condroitina sintasa derivado de Pasteurella multocida (US 2007/0281342 Al) .
Una invención adicional describe un método para producir condroitina introduciendo los genes kfoC y kfoA genes, derivados de Escherichia coli 05: 4:H4, en una bacteria que produce UDP-ácido glucurónico (WO2008/133350) .
Otra invención describe una síntesis de condroitina in vi tro en un sistema enzimático que comprende condroitina sintasa de Escherichia coli 05:K4:H4 y los precursores de reacción (US2009/0263867 Al) .
Es sabido que Escherichia coli 05:K4:H4 es capaz de producir un polisacárido capsular (el polisacárido K4) que tiene la misma estructura que la de la condroitina, al cual se enlazan los residuos de fructosa a los residuos GlcUA (ver, por ejemplo, N. Volpi, Glycocon . J., 25:451-457 (2008) ) . Por lo tanto, el polisacárido K4 consiste de una unidad de trisacárido repetida que comprende un radical del ácido D-glucurónico (GlcUA) y un radical de N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) enlazado por un ß1-3 (GlcUA ? GalNAc) y un residuo de fructosa enlazado al grupo C3-hidroxilo del residuo GlcUA. De esta manera, los residuos de fructosa constituyen ramificaciones del polisacárido lineal resultante.
La remoción de los residuos de fructosa se ha logrado por el tratamiento hidrolltico en condiciones acidas (N. Volpi, Electrophoresis 25, 692-696 (2004)).
Aunque el grupo del gen antígeno de la cápsula de Escherichia coli 05:K4:H4 y las rutas metabólicas que conducen a los azúcares que constituyen el polisacárido lineal K4 se han estudiado extensivamente, no se ha identificado hasta ahora la actividad de glicosil-transíerasa responsable de la adición de los radicales de fructosa al polisacárido lineal para dar el polisacárido K4.
La nueva característica de la presente invención es la producción directa de condroitina de alto peso molecular por un microorganismo recombinante obtenido inactivando un gen que codifica una enzima responsable de la adición de los residuos de fructosa a la estructura de condroitina, obviando de esta manera, la necesidad de presentar el polisacárido K4 para la remoción hidrolítica de los residuos de fructosa enlazados a los radicales GlcUA para obtener la condroitina.
Breve Descripción de las figuras
Las Figuras la- Id muestran esquemáticamente las modificaciones genéticas a las que la cepa 05:K4:H4 Ul-41 de Escherichia. coli se sometió, resultando en la construcción de K4 de E. coli (AkfoE/kanR) y K4 de E. coli (AkfoE) :
Fig. la) un fragmento ADN que porta un cásete de resistencia de canamicina (canamicina) , flanqueado por dos secuencias de recombinación de FRT (siglas en inglés para Sitios de Reconocimiento de Flipasa) ; el gen de resistencia de canamicina se deriva del molde del plásmido pKD4 usando los sitios de cebado Pl y P2.
Fig. Ib) La estructura detallada del racimo del gen de antígeno K de la cepa 05:K4:H4 Ul-41 de E. coli, en donde kfoD y kfoF son los genes de flanqueo de kfoE.
Fig. l'c) ADN cromosómico K4 de E. coli (ñkfoE/kanR) que muestra la interrupción del gen kfoE sustituyendo un fragmento del ADN original con el gen de resistencia de canamicina (canamicina) .
Fig. Id) ADN cromosómico K4 de E. coli (AkfoE) que muestra la eliminación final de la mayoría del gen kfoE .
La Figura 2 muestra los resultados de la amplificación de PCR llevada a cabo en 3 transformantes de K4 de E. coli (AkfoE/kanR) para verificar la secuencia de las regiones de flanqueo restantes de kfoE 3' y 5' :
carriles: 1 y 10 muestran el marcador de peso molecular (escalón de 1 Kb) ;
carriles 2-4: producto de PCR del término kfoE 3' de los 3 transformantes;
carriles 6-8: producto de PCR del término KfoE 5' residual de los 3 transformantes;
carriles 5 y 9: producto de PCR de la cepa 05:K4:H4 Ul-41 de Escherichia coli obtenida usando los pares de cebadores 3' y 5' respectivamente.
La Figura 3 muestra un cromatograma del polisacárido producido por DSM23644 de E. coli analizado por Electroforesis capilar después de la digestión con Condroitinasa ABC, en donde se muestra el ?-disacárido insaturado (Adi-OS) , típico de la digestión de condroitina con Condroitinasa ABC (pico 8) .
La Figura 4 muestra un espectro de 13C-RMN de la condroitina producida por DSM23644 de E. coli obtenida de acuerdo con el Ejemplo 3.
Descripción Detallada de la Invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un microorganismo recombinante que produzca condroitina, definido como un glicosaminoglicano lineal que consiste de residuos alternados de ácido D-glucurónico (GlcUA) y N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) enlazado por el enlace ß1-3 y el enlace ß1-4 respectivamente, caracterizado porque en tal microorganismo se inactiva un gen que codifica una enzima responsable de la adición de los residuos de fructosa a la estructura de condroitina.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de esta invención, se proporciona un microorganismo recombinante que produce condroitina, caracterizado porque tal microorganismo se obtiene sometiendo un gen originalmente presente en el mismo, el cual codifica una proteína responsable de la adición de residuos de fructosa a la estructura de condroitina lineal, para la inactivación, incluyendo tal inactivación eliminación o sustitución completamente o parte de tal gen, o interrupción por inserción de una secuencia nucleotídica adicional. De acuerdo con un aspecto preferido de esta invención, el microorganismo recombinante de la presente invención obtenido por inactivación del gen que codifica una proteína que tiene una actividad de fructosil-transferasa, se deriva de una bacteria que pertenece a la especie de Escherichia coli, y de preferencia, pertenece al grupo 2 del antígeno que incluye los serotipos bien conocidos, tales como Kl, K5, K7, K12.
Aunque, de acuerdo con una modalidad representativa de esta invención, el microorganismo recombinante que tiene la capacidad de producir condroitina se deriva de Escherichia coli 05:K4:H4, puede emplearse cualquiera de los microorganismos que pertenecen al grupo de antígeno K, sin tomar en cuenta si comparten cualquier homología de gen con Escherichia coli 05:K4:H4. Ejemplos de tales microorganismos incluyen bacterias que pertenecen a los géneros Haemophilus, tales como H. influenzae (Branefors-Helander P.f Carbohydr. Res., Vol. 88, 15 de enero de 1981), Campylobacter, tales como C. jejuni (McNally DJ, Jarrell HC, Li J, Khieu NH, Vinogradov E, Szymanski CM, Brisson JR., FEBS J. , vol. 272, No. 17, 4407-4422, septiembre de 2005), Gloeocapsa, tales como G. gelatinosa (Raungsomboon S, Chidthaisong A, Bunnag B, Inthorn D, Harvey NW, Water Res. Vol. 40, No. 20, 3759-3766, diciembre de 2006) y Vibrio, tales como V. cholerae (Knirel YA, Widmalm G, Senchenkova SN, Jansson PE, Weintraub A, Eur. J. Biochem, Vol. 247, 402-410, julio de 1997).
Más preferentemente, la bacteria de la cual se deriva el microorganismo recombinante de esta invención que produce condroitina es la el serotipo 05:K4:H4 de Escherichia coli, el cual contiene el gen kfoE, que codifica una proteina que tiene una actividad de fructosil-transferasa .
El gen kfoE se sabe que se localiza dentro el racimo del gen de antígeno K4 de E. coli (GenBank AB079602) que contiene los genes encontrados por los inventores que poseen una homología significativa con los genes de otros microorganismos, que están probablemente involucrados en la producción de una cápsula bacteriana (T. Ninomiya, N. Sugiura, A. Tawada, K.Sugimoto, H. Watanabe y K. Kimata, J. Biol. Chem., Vol. 277, No. 24, 21567-75, 14 de junio de 2002) .
La bacteria usada más preferentemente para obtener el microorganismo recombinante de la presente invención es la cepa 05:K4:H4 Ul-41 de Escherichia coli, disponible en ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, US) bajo el número de acceso ATCC23502.
De acuerdo con una modalidad representativa de esta invención, el microorganismo recombinante es un microorganismo que produce condroitina, en donde el gen sometido a inactivación es un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de los siguientes (A) , (B) y (C) :
(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2
(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 modificada por eliminación, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos y que tiene una actividad de fructosil-transferasa.
(C) una proteína que comprende una secuencia de aminoácido que tiene una homología de por lo menos 50% con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 y que tiene una actividad de fructosil-transferasa.
El microorganismo de acuerdo con esta invención, es un microorganismo en donde el gen inactivado es el gen kfoE o un ADN seleccionado del grupo que consiste de los siguientes (a) , (b) y (c) :
(a) un ADN que comprende una secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1
(b) un ADN que se híbrida con un ADN que comprende la secuencia nucleotídica complementaria a la SEC ID NO: 1 y que codifica una proteína que tiene una actividad de fructosil-transferasa.
(c) un ADN que comprende una secuencia nucleotídica que tiene una homología de por lo menos 50% con la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y que codifica una proteína que tiene una actividad de fructosil-transferasa .
Un objetivo de la presente invención es un microorganismo que produce condroitina, en donde la inactivación de kfoE se obtiene por modificación de su secuencia nucleotídica, tal como por eliminación o sustitución, completamente o en parte, la secuencia nucleotídica descrita bajo (a), (b) o (c) anteriores.
Otro objetivo de la presente invención es un microorganismo, en donde la inactivación de kfoE se obtiene por inserción, uno o más nucleótidos, en la secuencia nucleotídica descrita bajo (a), (b) o (c) anteriores.
De acuerdo con un aspecto más preferido de esta invención, el derivado recombinante de la cepa 05:K4:H4 Ul-41 de Escherichia coli (de ahora en adelante referida como E. coli K4) se obtiene por inactivación del gen kfoE, que codifica una fructosil -transferasa putativa, por medio de la eliminación de nucleótido.
La presente invención describe cómo la interrupción del gen kfoE conduce a la producción directa del polisacárido K4 que carece de los residuos de fructosa, es decir, de condroitina .
De acuerdo con un aspecto adicional preferido de esta invención, E. coli K4 recombinante de la presente invención se obtiene usando un método para interrumpir los genes cromosómicos en los que los cebadores de PCR proporcionan la homología al gen dirigido (Datsenko and Wanner, PNAS, Vol . 97, No. 12, 6640-6645, 6 de junio de 2000).
La cepa K4 de E. coli de la presente invención se ha sometido a la inactivación del gen kfoE cromosómico, sustituyendo primero la mayoría de la secuencia nucleotídica con un gen de resistencia de canamicina exógeno ("primera modificación genética") y luego eliminando el gen insertado usando un vector de expresión de FLP recombinasa ("segunda modificación genética") .
La cepa K4 de E. coli recombinante obtenida después de la primera modificación genética, referida como E. coli K4 (AkfoE/kanR) se ha depositado el 30 de abril de 2010 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con el Tratado de Budapest, bajo el número de acceso DSM23578.
La cepa K4 de E. coli obtenida después de la segunda modificación genética, referida como E. coli K4 (AkfoE) se ha depositado el 26 de mayo de 2010 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con el Tratado de Budapest, bajo el número de acceso DSM23644.
La inactivación del gen kfoE se logró por medio de 3 transformaciones bacterianas sucesivas, primero con el plasmido de expresión de recombinasa Red (pKD 6) , segundo con un fragmento de ADN derivado de un plasmido de molde (pDK4) modificado convenientemente para proporcionar homología con el gen kfoE y tercer con el plásmido auxiliar que expresa la enzima FLP recombinasa (pCP20) .
Para obtener la primera modificación genética de K4 de E. coli, se han usado el plásmido pKD46 (GenBank: AY048746) y el fragmento de ADN lineal. El plásmido de p D46, usado en la primera etapa de transformación de K4 de E. coli consiste de 2154 nucleótidos del fago lambda y del gen que codifica la resistencia a ampicilina. Este plásmido promueve una velocidad de recombinación mejorada cuando se usan fragmentos dé ADN lineales.
El fragmento de ADN lineal usado en la transformación subsecuente de K4 de E. coli se ha obtenido por PCR usando varios pares de cebadores que incluyen las extensiones de homología al gen kfoE y el plásmido de molde pKD4 que porta un cásete de resistencia de canamicina (GenBank: AY 048743) .
Este procedimiento fue capaz de generar un fragmento de ADN lineal que porta un c sete de resistencia de canamicina, que tiene los términos homólogos kfoE 5' y 3' en sus extremos .
En una modalidad de esta invención, la transformación bacteriana se efectuó por electroporación que se seleccionó debido a su capacidad para generar transformantes fácilmente dobles que podrían recuperarse de las placas que contienen ampicilina y canamicina.
Sin embargo, aunque la electroporación es la técnica preferida, este resultado podría obtenerse por cualquier método de transformación conocido, tal como transformación de cloruro de calcio o transformación de dextrano-DEAE.
Con el objetivo de verificar la localización correcta de la sustitución de la secuencia de ADN original con el cásete de resistencia de canamicina en los transformantes de K4 de E. coli (AkfoE/kanR) , se han realizado varias amplificaciones de PCR, usando 2 pares de cebadores específicos cercanos al locus: el primer par de cebadores fue capaz de demostrar la formación de una nueva unión entre el término 5' restante de kfoE y el gen kan insertado, mientras que el segundo par cebador fue capaz de demostrar la formación de una nueva unión entre el gen kan insertado y el término 3' restante de kfoE.
El plásmido auxiliar usado para remover el cásete de resistencia de canamicina ("segunda modificación genética) fue el plásmido pCP20, que porta el gen de FLP recombinasa de levadura y un gen de resistencia de ampicilina. Los plásmidos pKD46 y pCP20 son vectores sensibles a la temperatura que se removieron subsecuentemente de las cepas transformantes de K4 de E. coli después del crecimiento a 43 °C.
Se ha realizado un análisis de secuenciación en K4 de E. coli (AkfoE/kanR) para confirmar la sustitución del gen kfoE, completamente o en parte, con el cásete de resistencia de canamicina. Asimismo, un análisis de secuenciación se ha realizado en K4 de E. coli (AkfoE) para verificar la eliminación subsecuente del cásete de resistencia de canamicina, resultando en la producción final de la cepa bacteriana interrumpida de kfoE .
El método usado para la construcción exitosa de un K4 de E. coli recombinante capaz de producir una variante no glucosilada de un glicosaminoglicano natural es una aplicabilidad general y puede aplicarse ventajosamente a otros productos glucosilados , en donde es deseable evitar tal glucosilación . En conclusión, se desarrolló un método general para obtener microorganismos capaces de producir variantes no glucosiladas de glicosaminoglicanos naturales .
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la producción biotecnológica de condroitina, que comprende las siguientes etapas:
(1) cultivar, en el un medio apropiado, el microorganismo recombinante y
(2) recuperar la condroitina producida de su caldo de cultivo.
Cualquier microorganismo recombinante capaz de producir condroitina obtenida de acuerdo con el método descrito anteriormente para inactivar un gen que codifica una enzima responsable de la adición de los residuos de fructosa a condroitina, puede usarse en la etapa de cultivo.
De acuerdo con una modalidad preferida de esta invención, una bacteria recombinante obtenida de K4 de E. coli, tal como DSM23644 de E. coli, se emplea como el microorganismo recombinante que tiene la capacidad producir directamente condroitina.
El método adoptado para el cultivo de la bacteria DSM23644 de E. coli, es un método general aplicable al cultivo de los miembros del género Escherichia. Este método se basa en el uso preferido, pero no exclusivo, de un medio de cultivo que contiene por litro: 9.7 g de K2HP04 3H20, 8 g de KH2P04, 0.5 g de citrato de sodio 5H20, 0.2 g de MgCl2 7H20, 20 g de ácidos casamino, 20 g de (NH4)2S04, 2 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura. Los altos niveles de producción de condroitina pueden obtenerse modificando apropiadamente la composición del medio basal y/o proporcionar nutrientes adicionales al cultivo por medio de alimentaciones de sustrato .
Las condiciones de cultivo se definen para maximizar el crecimiento bacteriano y la producción de condroitina. Típicamente, el cultivo se lleva a cabo a temperaturas entre 25°C y 40°C durante 8h a 72 h.
De preferencia, el sobrenadante se colecta por centrifugación y se usa para la purificación subsecuente y caracterización de la condroitina producida.
La purificación de condroitina se obtuvo de acuerdo con una adaptación de los métodos descritos por Rodríguez and Jann (Eur. J. Biochem., Vol. 177, 117-124, octubre de 1988).
En forma breve, el método adoptado para purificar la condroitina se basa en varias etapas de precipitación, partiendo del sobrenadante de cultivo y un secado final al vacío. La identidad del producto recuperado puede verificarse mediante un número de métodos, de preferencia, por una combinación de métodos que proporcionan evidencia de la estructura de la cadena de polisacárido y de la ausencia de residuos de fructosa.
La ausencia de fructosa del producto purificado puede verificarse venta osamente por medio de una hidrólisis acida del producto, en las condiciones conocidas para liberar la fructosa del polisacárido K4 nativo, seguido de una prueba específica para cualquier fructosa liberada como una consecuencia. Esta prueba mostró consistentemente que el polisacárido recuperado de los cultivos de la bacteria DSM23644 de E. coli no contuvo fructosa, en contraste con el polisacárido K4 nativo obtenido de la cepa 05:K4:H4 Ul-41 de Escherichia coli que produjo consistentemente un polisacárido que contiene fructosa en las cantidades esperadas de la fórmula estructural del polisacárido K4.
Una confirmación adicional de la identidad del producto recuperado de los cultivos de la bacteria DS 23644 de ?. coli se obtuvo sometiendo el producto a digestión con la enzima Condroitinasa ABC, la cual se conoce que degrada completamente a disacáridos el polisacárido de condroitina libre de fructosa, pero no el polisacárido de K4 nativo.
En otras palabras, la Condroitinasa ABC es incapaz de digerir el polisacárido K4 nativo. Los experimentos de digestión de la Condroitinasa ABC del producto recuperado de los cultivos de la bacteria DSM23644 de E. coli, produjo las cantidades del producto de disacárido esperado de una digestión completa, confirmando de esta manera la naturaleza de la estructura del polisacárido y, en particular, la ausencia de los residuos de fructosa.
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, para confirmar la función de kfoE como el gen que codifica la actividad de fructosil-transferasa K4 , un plásmido recombinante que porta la secuencia nucleotídica kfoE de tipo silvestre, se ha construido e introducido en la cepa K4 de E. coli (AkfoE) para mediar la complementación de la función perdida.
En forma breve, el gen kfoE se ha amplificado y clonado en el plásmido pTrcHis (Invitrogen Corporation, 5791 Van Alien Way PO Box 6482 Carlsbad, California) dentro de los sitios de restricción Ncol y BamHI . La construcción pTrcHis-kfoE se ha usado para transformar por electroporacion E. coli recombinante (AkfoE) y las transformantes se han seleccionado a 37°C, sobre placas que contienen 100 g/mL de amplicilina .
Las transformantes de E. coli (AkfoE) que portan la construcción pTrcHis-kfoE se han cultivado y el polisacárido K4 purificado de acuerdo con Rodríguez and Jann (Eur. J. Biochem. , Vol . 177, 117-124, octubre de 1988) y para cuantificar la fructosa presente en el producto recuperado, libre de fructosa, se determinó antes y después de la hidrólisis con ácido trifluoroacético 0.2 M durante 1 h a 99°C. La prueba libre de fructosa antes y después de la hidrólisis se ha tomado como la fructosa enlazada a la molécula K4 iniciadora.
El producto recuperado del cultivo de DSM23644 de E. coli transformado por pTrcHis-kfoE mostró la presencia de fructosa enlazada, confirmando que en esta capa la pérdida de la actividad de fructosil-transferasa se complementó por el plásmido.
EJEMPLOS
Ejemplo 1:
Construcción de la cepa K4 de E. coli (AkfoE/kanR)
La construcción del fragmento de ADN lineal (Figura la) que porta el gen kanR y los términos homólogos kfoE se logró por PCR usando el vector pKD4 como un molde y los siguientes cebadores de PCR:
0L151:
atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID NO: 3)
OL152 :
tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcct ta (SEC ID NO: 4) .
En cada secuencia de oligonucleótido, los primeros 40 nucleótidos proporcionan la homología del gen kfoE y los restantes 20 nucleótidos proporcionan la homología del plásmido del molde pKD4 (sitios de cebadores Pl y P2) .
PCR se realizó en 120 ng del ADN de molde de acuerdo con las siguientes condiciones:
94°C x 3 min, (94°C x 1 min, 40°C x 1 min, 68°C x 2 min) x 5 ciclos, (94°C x 1 min, 59°C x 1 min, 68°C x 2 min) x 30 ciclos, 68°C x 10 min, 4°C x 10 min.
El producto de PCR se purificó en gel y se transformaron las bacterias .
La cepa 05:K4:H4 Ul-41 de Escherichia coli (Figura Ib) se preparó y se transformó por electroporación con el plásmido pKD46 de acuerdo con Datsenko and Wanner (PNAS, Vol . 97m No. 12, 6640-6645, 6 de junio de 2000) luego se colocó en placas en un medio que contiene ampicilina.
Las transformantes resistentes a ampicilina se identificaron y aislaron.
Se verificaron dos transformantes por la extracción del plásmido y PCR usando los siguientes cebadores y condiciones:
OL149: ccactcataaatcctcatagag (SEC ID NO: 5)
OL150: ccaacttacttctgacaacgat (SEC ID NO: 6)
a 94°C x 3 min, (94°C x 1 min, 43°C x 1 min, 68°C x 2.5 min) x 30 ciclos, 68°C x 10 min, 4°C x 10 min.
El producto de PCR se analizó por electroforesis en gel de 0.8% de agarosa y se identificó un producto con un tamaño de 1799 pares de bases, completo, de acuerdo con el tamaño del producto esperado.
Uno de los dos transformantes de pKD46 se sometió a una electroporación subsecuente, usando el fragmento de ADN que porta el cásete de resistencia de canamicina y los términos homólogos de kfoE.
La selección de la placa en el medio que contiene ampicilina y canamicina, se usó para aislar los recombinantes que portan la sustitución de la mayoría de la secuencia nucleotídica de kfoE con el gen de resistencia de canamicina.
Se verificaron tres transíorinantes dobles por amplificación de PCR de las regiones de flanqueo de kfoE 3' y 5', usando los siguientes cebadores apropiados:
OLI 53: aatccgacggggactgtagatt (SEC ID NO: 7)
OL142: aactgttcgccaggctcaag (SEC ID NO: 8)
OL143: gcgttttcccttgtccagat (SEC ID NO: 9)
OLI 54: gctaatgtatatgattgccaggt (SEC ID NO: 10)
a 95°C x 5 min, (94°C x 1 min, 47°C x 1 min, 68°C x 2 min) x 30 ciclos, 68°C x 10 min, 4°C x 10 min.
Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de 0.8% de agarosa y se identificaron dos productos con un tamaño de 1773 pares de bases para la amplificación de término 3' y 769 pares de bases para la amplificación del término 5' del gen kfoE, respectivamente, completos, de acuerdo con los tamaños de los productos esperados (Figura 2) .
Para verificar la orientación del gen de resistencia de canamicina y para asegurar la dirección correcta de la transcripción del gen, se llevó a cabo un análisis adicional por análisis de secuenciación de K4 de E. coli (AkfoE/kanR) (Figura le), usando los siguientes oligonucleótidos :
OL153: aatccgacggggactgtagatt (SEC ID NO: 7)
OL154: gctaatgtatatgattgccaggt (SEC ID NO: 10).
La secuencia nucleotídica resultante se identifica por la SEC ID NO: 14.
Ejemplo 2:
Construcción de la cepa 4 de E. coli (AkfoE)
Para obtener la cepa K4 de E. coli (AkfoE) que carece del cásete de resistencia de canamicina y que porta una eliminación de la mayoría del gen kfoE con la pérdida de la función esperada, se realizó una transformación adicional de la cepa K4 de E. coli (AkfoE/kanR) con el plásmido pCP20.
Después de la etapa de electroporación, los transformantes se seleccionaron en el medio que contiene ampicilina a 30 °C y luego se purificó la colonia.
Los transformantes putativos se crecieron en placas no selectivas a 43 °C y luego se probaron para la pérdida de todas las resistencias a antibióticos.
Los transformantes de la cepa K4 de E. coli (AkfoE) se verificaron secuenciando los términos restantes kfoE de flanqueo 3' y 5' (Figura Id), usando los siguientes oligonucleótidos :
OL169: tgaggtgattgttggtaaaccttggtg (SEC ID NO: 11)
OL166: tactgtttctgcttgcccccgagtt (SEC ID NO: 12).
La secuencia nucleotídica resultante se identifica por la SEC ID NO: 13.
Ejemplo 3:
Cultivación de DSM23644 de E. coli y análisis de condroitina
La cultivación de DSM23644 de E. coli se llevó a cabo de acuerdo con Rodríguez and Jann (Eur. J. Biochem. , Vol. 177, 117-124, octubre de 1988) .
En forma breve, la etapa vegetativa del cultivo se realizó partiendo de 0.5 mi de reserva de cultivo congelado, inoculando un matraz que contiene 20 mi de caldo de cultivo que consiste, por litro, de: 9.7 g de 2HP04 3H20, 8 g de KH2P04, 0.5 g de citrato de sodio 5H20, 0.2 g de MgCl2 de 7H20, 20 g de ácidos casamino, 20 g de sulfato de amonio, 2 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura, incubado a 37°C durante 16 h, con agitación a 180 rpm y 2.5 cm de desplazamiento.
La etapa de cultivación del sobrenadante se llevó a cabo en un cultivo por lotes, en un matraz con mamparas de 500 mi que contiene 85 mi de caldo de cultivo como se describió anteriormente, inoculado con 0.05% de cultivo vegetativo preparado como se describió anteriormente, e incubado a 37 °C durante 48 h con agitación a 180 rpm y 25 cm de desplazamiento .
Al final de la incubación, el cultivo se cosechó por centrifugación y el sobrenadante se sometió a purificación para aislar y caracterizar la condroitina producida.
La purificación de la condroitina se obtuvo de acuerdo con una adaptación de los métodos descritos por Rodríguez and Jann (Eur. J. Biochem. , Vol. 177, 117-124, octubre de 1988). En forma breve, el polisacárido se precipitó del sobrenadante de cultivo por Cetavlon (bromuro de alquil-trimetilamonio, CAS NO: 71 92-88-3), extraído con NaOH 0.5 M a 3°C, neutralizado y purificado subsecuentemente por 3 ciclos de precipitación con etanol al 80%.
Se llevó a cabo una etapa de purificación final con fenol frío al 90% a pH 6.8, para precipitar las proteínas contaminantes, recuperando de esta manera la fase acuosa por centrifugación. La condroitina purificada se recuperó de la fase acuosa por centrifugación con etanol al 80% y se secó al vacío.
Se usaron varios métodos analíticos para verificar la naturaleza de la condroitina producida.
El primer método se basó en la presencia o ausencia de fructosa en el producto recuperado del cultivo después de la hidrólisis ácida llevada a cabo con ácido trifluoroacético 0.2 M durante 1 h a 99°C.
Para cuantificar la fructosa presente en el producto recuperado, se determinó la fructosa libre antes y después de la hidrólisis. La fructosa se probó enzimáticamente usando el kit de Sucrosa/D-Glucosa/D-Fructosa EnzyPlus, suministrado por BIOCONTROL (BioControl Systems Inc. 12822 SE 32nd Street Bellevue, WA 98005, Estados Unidos) .
La diferencia entre la fructosa libre presente después de la hidrólisis y la presente antes de la hidrólisis se tomó como la fructosa enlazada a la molécula K4 de partida.
El producto recuperado del cultivo de DSM23644 de E. coli no mostró la presencia de fructosa enlazada, confirmando que esta cepa produce un polisacárido libre de fructosa.
La ausencia de fructosa enlazada del polisacárido recuperado de los cultivos de DSM23644 de E. coli como se describió anteriormente, se confirmó por la digestión enzimática con Condroitinasa ABC. Se demostró además que la condroitina purificada, cuando se digirió con Condroitinasa ABC, produjo el ?-disacárido insaturado (Adi-OS) típico de la digestión de condroitina como se confirmó por Electroforesis •Capilar (CE, por sus siglas en inglés) , usando la técnica de Cromatografía Electrocinética Micelar (MECK, por sus siglas en inglés) (Figura 3) . La confirmación de la estructura de Adi-OS se obtuvo mediante el uso del estándar de referencia del ?-disacárido apropiado (elución electroforética equivalente) . La determinación cuantitativa del Adi-OS obtenida se obtuvo por medio de una curva de calibración externa.
Por último, el polisacárido de condroitina purificado producido por DSM23644 de E. coli se caracterizó por C13 RMN (Figura 4) .
Esta técnica mostró que el producto en cuestión fue espectralmente idéntico con el producto obtenido después de la remoción de la fructosa del polisacárido K4 nativo por hidrólisis ácida.
Ejemplo 4:
Complementación mediada por el plásmido de función kfoE.
Para verificar la función de kfoE como el gen que codifica la actividad de f uctosil-transferasa K4, se construyó un plásmido recombinante que porta la secuencia nucleotídica kfoE de tipo silvestre y se introdujo en la cepa K4 de E. coli (AkfoE) para mediar la complementación de la función perdida.
El gen kfoE se amplificó usando los siguientes oligonucleótidos :
OL172: acaacatgttactaataatgtctggttcctatgttc (SEC ID NO:
15)
OLI 73: actggatccttatcatactgcagcctcctta (SEC ID NO: 16).
El plásmido pTrcHis (4400 pb - Invitrogen Corporation, 5791 Van Alien Way PO Box 6482 Carlsbad, California) se usó para introducir el gen kfoE amplificado y purificado con gel (1569 pb) en sitios de clonación apropiados.
70 ng del vector pTrcHis digerido por las enzimas de restricción Ncol y BamHI y 75 ng del gen kfoE que tiene extremos digeridos Pcil/BamHI compatibles se sometieron a una reacción de ligación a 25 °C durante 15 min.
Después, 50 pL de las células competentes DH5a de Escherichia coli (Invitrogen Corporation, 5791 Van Alien Way PO Box 6482 Carlsbad, California) se sometieron a electroforesis con 5 \i de la mezcla de ligación y se seleccionaron cinco transformantes a 37°C, en placas que contienen 100 g/mL de ampicilina.
Después de la purificación de la colonia, el plásmido construido pTrcHis-kfoE se extrajo y se digirió por la enzima de restricción Mfe I, la cual fue capaz de cortar la construcción de ADN dentro de la secuencia de kfoE insertada.
Por medio del análisis de electrofóresis en gel, 3 de 5 transformantes después de la digestión de Mfe I mostraron la longitud esperada de 5887 pb y el análisis de las secuencias confirmó la inserción correcta del gen kfoE.
La construcción pTrcHis-kfoE verificada se usó para transformar por electroporación DSM23644 de E. coli recombinante y los transformantes se seleccionaron sobre placas que contienen 100 pg/mL de ampicilina.
Los transformantes seleccionados se cultivaron de acuerdo con las condiciones descritas en el Ejemplo 3 y el polisacárido K4 se purificó de acuerdo con Rodríguez and Jann (Eur. J. Biochem., Vol. 177, 117-124, octubre de 1988).
Para cuantificar la fructosa presente en el producto recuperado, se determinó la fructosa libre antes y después de la hidrólisis con ácido trifluoroacético 0.2 M durante 1 h a 99°C. La fructosa se probó enzimáticamente usando el kit de Sucrosa/D-Glucosa/D-Fructosa EnzyPlus.
La diferencia entre la fructosa libre presente después de la hidrólisis y la presente antes de la hidrólisis se tomó como la fructosa enlazada a la molécula K4 de partida.
El producto recuperado del cultivo de DSM23644 de E. coli transformado por pTrcHis-kfoE mostró la presencia de fructosa enlazada, confirmando que en esta cepa la pérdida de la actividad de f uctosil-transferasa se complementó por el plásmido .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (16)
1. Microorganismo recombinante que produce condroitina, definido como un glicosaminoglicano lineal constituido por residuos alternados de ácido D-glucurónico (GlcUA) y N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) enlazada por enlaces ß1-3 (GlcUA ? GalNAc) y ß1-4 (GalNAc ? GlcUA) , caracterizado porque en tal microorganismo se inactiva el gen kfoE originalmente presente que codifica una enzima responsable de la adición de residuos de fructosa a la estructura de condroitina lineal, mediante eliminación o sustitución completamente o en parte de tal gen o interrupción por inserción de una secuencia nucleotídica adicional, y en donde tal gen kfoE codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2 (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 modificada por eliminación, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos y que tiene una actividad de fructosil-transíerasa; y (C) una proteína que comprende una secuencia de aminoácido que tiene una homología de por lo menos 50% con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 y que tiene una actividad de fructosil-transferasa.
2. Microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen kfoE inactivado es un ADN seleccionado del grupo que consiste de: (a) un ADN que comprende una secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1; (b) un ADN que se híbrida con un ADN que comprende la secuencia nucleotídica complementaria a la SEC ID NO: 1 y que codifica una proteína que tiene una actividad de fructosil-transferasa; y (c) un ADN que comprende una secuencia nucleotídica que tiene una homología de por lo menos 50% con la secuencia nucleotídica de la SEC ID NO: 1 y que codifica una proteína que tiene una actividad de f uctosil-transferasa.
3. Microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el gen kfoE se inactiva por sustitución total o parcial del mismo con un cásete de resistencia de canamicina y su remoción subsecuente, resultando en la eliminación total o parcial del gen kfoE.
4. Microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se deriva de una bacteria que pertenece a un género seleccionado de Escherichia, Haemophilus, Ca pylobacter, Gloeocapsa y Vibrio.
5. Microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se deriva de una bacteria que pertenece a la especie Escherichia coli.
6. Microorganismo recombinante de conformidad la reivindicación 5, caracterizado porque se deriva de un serotipo de la especie de Escherichia coli que pertenece al grupo 2 de antígeno K.
7. Un microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque se deriva de la cepa de 05 :K4 :H4U1-41 de Escherichia coli.
8. Microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque es DSM23578 de Escherichia coli o DSM23644 de Escherichia coli.
9. Un microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque es DSM23644 de Escherichia coli.
10, Método para la producción biotecnológica de condroitina, caracterizado porque se emplea un microorganismo recombinante seleccionado de DSM23578 de Escherichia coli y DSM23644 de Escherichia coli.
11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el microorganismo recombinante es DSM23644 de Escherichia coli.
12. Método para la producción biotecnológica de condroitina, caracterizado porque comprende las siguientes etapas : a. cultivar en un medio apropiado el microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 b. recuperar y purificar la condroitina presente en el cultivo microbiano.
13. Método para la producción biotecnológica de condroitina de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el microorganismo recombinante es DSM23578 de Escherichia coli o DSM23644 de Escherichia coli.
14. Método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el microorganismo recombinante es DSM23644 de Escherichia coli.
15. Condroitina producida biotecnológicamente , caracterizada porque se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-14.
16. Condroitina producida biotecnológicamente de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el microorganismo recombinante es DSM 23644 de Escherichia coli.
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