JP6030056B2 - バイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産 - Google Patents

Description

本発明はコンドロイチンを産生する新規組換え微生物と、バイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産方法に関する。

本発明においてコンドロイチンなる用語はβ１−３（ＧｌｃＵＡ→ＧａｌＮＡｃ）結合とβ１−４（ＧａｌＮＡｃ→ＧｌｃＵＡ）結合により結合したＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の残基が交互に配列することにより構成される直鎖状グリコサミノグリカンとして定義される直鎖状多糖を意味する。

コンドロイチン硫酸はグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が夫々β１−３結合とβ１−４結合により直鎖状に交互に結合し、そのＧａｌＮＡｃ残基が種々の程度まで硫酸化された直鎖状多糖鎖を形成するグリコサミノグリカンである。

コンドロイチン硫酸は動物では軟骨と結合組織に存在し、細胞接着、組織再生、神経伸長等に重要な役割を果たす。

非動物起源からのコンドロイチンの生産は非動物由来コンドロイチン硫酸の生産に重要な望ましい手段である。

入手可能な特許文献には非動物由来コンドロイチンの数種の生産方法が記載されている。

更に、動物と微生物の両方に由来する数種のコンドロイチンシンターゼ遺伝子がクローニングされ、配列決定されている。

パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）に由来するコンドロイチンシンターゼ遺伝子を導入した組換えグラム陽性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を使用することによるコンドロイチンの生産方法が提案されている（ＵＳ２００７／０２８１３４２Ａ１）。

別の発明は大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４に由来するｋｆｏＣ遺伝子とｋｆｏＡ遺伝子の両方をＵＤＰ−グルクロン酸産生細菌に導入することによるコンドロイチンの生産方法を記載している（ＷＯ２００８／１３３３５０）。

別の発明は大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４コンドロイチンシンターゼと反応前駆体の両方を含む酵素系におけるインビトロコンドロイチン合成について記載している（ＵＳ２００９／０２６３８６７Ａ１）。

コンドロイチンではＧｌｃＵＡ残基にフルクトース残基が結合するが、大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４がコンドロイチンと同一の主鎖構造をもつ莢膜多糖（Ｋ４多糖）を産生できることは知られている（例えばＮ．Ｖｏｌｐｉ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，２５：４５１−４５７（２００８）参照）。従って、Ｋ４多糖はβ１−３（ＧｌｃＵＡ→ＧａｌＮＡｃ）により結合したＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）部分及びＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分と、ＧｌｃＵＡ残基のＣ３−ヒドロキシル基と結合したフルクトース残基からなる繰り返し三糖単位から構成される。従って、フルクトース残基は得られる直鎖状多糖の分枝を構成する。

フルクトース残基の除去は酸性条件下の加水分解処理により行われている（Ｎ．Ｖｏｌｐｉ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５，６９２−６９６（２００４））。

大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４莢膜抗原遺伝子クラスターと、Ｋ４直鎖状多糖を構成する糖鎖に至る代謝経路はいずれも詳細に研究されているが、フルクトース部分を直鎖状多糖に付加してＫ４多糖を生じる反応に関与するグリコシルトランスフェラーゼ活性はこれまでに同定されていない。

本発明の新規特徴はコンドロイチン主鎖へのフルクトース残基の付加に関与する酵素をコードする遺伝子を不活性化することにより得られる組換え微生物による高分子量コンドロイチンの直接生産であり、その結果、コンドロイチンを得るためにＧｌｃＵＡ部分と結合したフルクトース残基をＫ４多糖から加水分解により除去する必要がなくなる。

米国特許出願公開第２００７／０２８１３４２号明細書 国際公開第２００８／１３３３５０号 米国特許出願公開第２００９／０２６３８６７号明細書

Ｎ．Ｖｏｌｐｉ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．（２００８）２５：４５１−４５７ Ｎ．Ｖｏｌｐｉ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５，６９２−６９６（２００４）

本発明の目的は夫々β１−３結合とβ１−４結合により結合したＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の残基が交互に配列することにより構成される直鎖状グリコサミノグリカンとして定義されるコンドロイチンを産生する組換え微生物を提供することであり、前記微生物ではコンドロイチン主鎖へのフルクトース残基の付加に関与する酵素をコードする遺伝子が不活性化されていることを特徴とする。

従って、本発明の１側面によると、コンドロイチンを産生する組換え微生物が提供され、前記微生物はこの微生物に元々存在する遺伝子である直鎖状コンドロイチン主鎖へのフルクトース残基の付加に関与する蛋白質をコードする遺伝子を不活性化することにより得られることを特徴とし、前記不活性化は前記遺伝子の全部もしくは一部の欠失もしくは置換又は付加的ヌクレオチド配列の挿入による破壊を含む。

本発明の好ましい側面によると、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質をコードする遺伝子の不活性化により得られる本発明の組換え微生物は大腸菌種に属する細菌、好ましくはＫ１、Ｋ５、Ｋ７、Ｋ１２等の周知血清型を含むＫ抗原のグループ２に属する細菌に由来する。

本発明の代表的な態様によると、コンドロイチンを産生することが可能な組換え微生物は大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４に由来するが、大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４と遺伝子相同性をもつか否かに拘わらず、Ｋ抗原群に属する微生物のいずれをも利用することができる。前記微生物の例としては、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）等のヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属（Ｂｒａｎｅｆｏｒｓ−Ｈｅｌａｎｄｅｒ Ｐ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．８８，Ｊａｎ １５，１９８１）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）等のカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属（ＭｃＮａｌｌｙ ＤＪ，Ｊａｒｒｅｌｌ ＨＣ，Ｌｉ Ｊ，Ｋｈｉｅｕ ＮＨ，Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ Ｅ，Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ，Ｂｒｉｓｓｏｎ ＪＲ．，ＦＥＢＳ Ｊ．，Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．１７，４４０７−４４２２，Ｓｅｐｔ．２００５）、グロエオカプサ・ゲラチノーサ（Ｇ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）等のグロエオカプサ（Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ）属（Ｒａｕｎｇｓｏｍｂｏｏｎ Ｓ，Ｃｈｉｄｔｈａｉｓｏｎｇ Ａ，Ｂｕｎｎａｇ Ｂ，Ｉｎｔｈｏｒｎ Ｄ，Ｈａｒｖｅｙ ＮＷ，Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．２０，３７５９−３７６６，Ｄｅｃ．２００６）及びコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）等のビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（Ｋｎｉｒｅｌ ＹＡ，Ｗｉｄｍａｌｍ Ｇ，Ｓｅｎｃｈｅｎｋｏｖａ ＳＮ，Ｊａｎｓｓｏｎ ＰＥ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ａ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４７，４０２−４１０，Ｊｕｌｙ １９９７）に属する細菌が挙げられる。

より好ましくは、コンドロイチンを産生する本発明の組換え微生物が由来する細菌はフルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質をコードするｋｆｏＥ遺伝子を含む大腸菌血清型Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４である。

ｋｆｏＥ遺伝子は他の微生物に由来する細菌莢膜形成に関与すると思われる遺伝子に対して有意相同性をもつことが本発明者らにより発見された遺伝子を含む大腸菌Ｋ４抗原遺伝子クラスター（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０７９６０２）内に位置することが分かっている（Ｔ．Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｎ．Ｓｕｇｉｕｒａ，Ａ．Ｔａｗａｄａ，Ｋ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ ａｎｄ Ｋ．Ｋｉｍａｔａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７７，Ｎｏ．２４，２１５６７−７５，Ｊｕｎｅ １４，２００２）。

本発明の組換え微生物を得るために使用するのに最も好ましい細菌はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳ）からアクセション番号ＡＴＣＣ２３５０２として入手可能な大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４株Ｕ１−４１である。

本発明の代表的な態様によると、組換え微生物はコンドロイチンを産生する微生物であり、不活性化される遺伝子は以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（Ｂ）１アミノ酸以上の欠失、置換又は挿入により改変された配列番号２のアミノ酸配列を含み、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質、
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の相同性をもつアミノ酸配列を含み、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質
から構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子である。

本発明の微生物は不活性化される遺伝子がｋｆｏＥ遺伝子又は以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡとハイブリダイズし、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の相同性をもつヌクレオチド配列を含み、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ
から構成される群から選択されるＤＮＡである微生物である。

本発明の目的はコンドロイチンを産生する微生物であって、ｋｆｏＥ不活性化がそのヌクレオチド配列の改変（例えば上記ヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の全部又は一部の欠失又は置換）により得られるものである。

本発明の別の目的はｋｆｏＥ不活性化が上記ヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に１ヌクレオチド以上を挿入することにより得られる微生物である。

本発明の最も好ましい側面によると、大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４株Ｕ１−４１（以下、大腸菌Ｋ４と言う）の組換え誘導体は推定フルクトシルトランスフェラーゼをコードするｋｆｏＥ遺伝子のヌクレオチド欠失による不活性化により得られる。

本発明はｋｆｏＥ遺伝子の破壊がフルクトース残基を欠失するＫ４多糖、即ちコンドロイチンの直接産生にどのように繋がるかを開示する。

本発明の別の好ましい側面によると、本発明の組換え大腸菌Ｋ４はＰＣＲプライマーにより標的遺伝子に対する相同性を提供して染色体遺伝子を破壊する方法を使用することにより得られる（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，６６４０−６６４５，Ｊｕｎｅ ６，２０００）。

本発明の組換え大腸菌Ｋ４株は、先ずそのヌクレオチド配列の大半を外来カナマイシン耐性遺伝子で置換（「第１の遺伝子改変」）した後に挿入した遺伝子をＦＬＰリコンビナーゼ発現ベクターにより欠失させる（「第２の遺伝子改変」）ことにより、染色体ｋｆｏＥ遺伝子を不活性化されている。

第１の遺伝子改変後に得られた組換え大腸菌Ｋ４株（大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）と言う）はブダペスト条約に従い、２０１０年４月３０日付けでＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ドイツにアクセション番号ＤＳＭ２３５７８として登録された。

第２の遺伝子改変後に得られた組換え大腸菌Ｋ４株（大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ）と言う）はブダペスト条約に従い、２０１０年５月２６日付けでＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ドイツにアクセション番号ＤＳＭ２３６４４として登録された。

ｋｆｏＥ遺伝子の不活性化は第１にＲｅｄリコンビナーゼ発現プラスミド（ｐＫＤ４６）、第２にｋｆｏＥ遺伝子に対する相同性を提供するように適切に改変された鋳型プラスミド（ｐＤＫ４）に由来するＤＮＡ断片、第３に酵素ＦＬＰリコンビナーゼを発現するヘルパープラスミド（ｐＣＰ２０）による３段階の連続的な細菌形質転換により実施した。

大腸菌Ｋ４の第１の遺伝子改変を得るために、ｐＫＤ４６プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ０４８７４６）と直鎖状ＤＮＡ断片の両方を使用した。第１段階の大腸菌Ｋ４形質転換で使用したｐＫＤ４６プラスミドはファージλに由来する２１５４ヌクレオチドとアンピシリン耐性をコードする遺伝子から構成される。このプラスミドは直鎖状ＤＮＡ断片を使用する場合に組換え率の増加を促進する。

次の大腸菌Ｋ４の形質転換に使用した直鎖状ＤＮＡ断片はｋｆｏＥ遺伝子とカナマイシン耐性カセットを含む鋳型プラスミドｐＫＤ４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ０４８７４３）の両方に対する相同性伸長部を含む数個のプライマー対を使用してＰＣＲにより得た。

この方法によると、カナマイシン耐性カセットが挿入され、ｋｆｏＥ ５’及び３’相同末端をその末端にもつ直鎖状ＤＮＡ断片を作製することができた。

本発明の１態様では、アンピシリンとカナマイシンの両方を添加したプレートから回収可能な二重形質転換体を容易に作製できるという理由からエレクトロポレーションを選択し、細菌形質転換を実施した。

しかし、エレクトロポレーションは好ましい技術であるが、塩化カルシウム形質転換法やデキストラン−ＤＥＡＥ形質転換法等の任意の公知形質転換法によりこの結果を得ることができる。

大腸菌Ｋ４の形質転換体（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）において元のＤＮＡ配列がカナマイシン耐性カセットにより置換されている位置が正しいことを確認する目的で、２個の隣接する遺伝子座特異的なプライマー対を使用して数回のＰＣＲ増幅を実施し、第１のプライマー対はｋｆｏＥの残存する５’末端と挿入されたｋａｎ遺伝子の間の新しい連結部の形成を実証することができ、第２のプライマー対は挿入されたｋａｎ遺伝子とｋｆｏＥの残存する３’末端の間の新しい連結部の形成を実証することができた。

カナマイシン耐性カセットを除去（「第２の遺伝子改変」）するために使用したヘルパープラスミドは酵母ＦＬＰリコンビナーゼ遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＣＰ２０とした。ｐＫＤ４６プラスミドとｐＣＰ２０プラスミドはいずれも温度感受性ベクターであり、４３℃で増殖後に大腸菌Ｋ４の形質転換体株から除去された。

大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）でシーケンシング解析を行い、ｋｆｏＥ遺伝子の全部又は一部がカナマイシン耐性カセットで置換されていることを確認した。同様に、大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ）でシーケンシング解析を行い、その後のカナマイシン耐性カセットの欠失の結果、最終的にｋｆｏＥ破壊細菌株が作製されたことを確認した。

天然グリコサミノグリカンの非グリコシル化変異体を産生することが可能な組換え大腸菌Ｋ４の構築に使用するのに成功したこの方法は汎用性があり、このようなグリコシル化を防止することが望ましい他のグリコシル化物にも有利に適用することができる。結論として、天然グリコサミノグリカンの非グリコシル化変異体を産生することが可能な微生物を得るための一般方法が開発された。

本発明の別の目的はバイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産方法であって、
（１）適切な培地で組換え微生物を培養する工程と、
（２）そのブロス培養物から産生されたコンドロイチンを回収する工程
を含む方法を提供することである。

コンドロイチンへのフルクトース残基付加に関与する酵素をコードする遺伝子を不活性化するための上記方法により得られたコンドロイチンを産生することが可能な任意組換え微生物を培養工程で使用することができる。

本発明の好ましい態様によると、コンドロイチンを直接産生することが可能な組換え微生物として大腸菌ＤＳＭ２３６４４等の大腸菌Ｋ４から得られる組換え細菌を利用する。

細菌大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養に採用される方法はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のメンバーの培養に適用可能な一般方法である。前記方法は限定されないが、１リットル当たりＫ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ ９．７ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ８ｇ、クエン酸ナトリウム・５Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＭｇＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ、カザミノ酸２０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ２０ｇ、グルコース２ｇ、酵母エキス１０ｇを含有する培養培地を使用することが好ましい。基礎培地の組成を適切に調節すること及び／又は基質供給により培地に他の栄養素を提供することにより、更に高いコンドロイチン産生レベルに達することができる。

細菌増殖とコンドロイチン産生を最大にするように培養条件を決定する。通常では、２５℃〜４０℃の温度で８時間〜７２時間培養を行う。

好ましくは遠心により上清を回収し、産生されたコンドロイチンのその後の精製と性状解析に使用する。

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｊａｎｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１７７，１１７−１２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８８）により記載されている方法の変法によりコンドロイチン精製を行った。

要約すると、コンドロイチンを精製するために採用した方法は主に培養上清から出発する数工程の精製と最終減圧乾燥からなる。回収した産生物の種類は多数の方法により確認することができ、多糖鎖の構造とフルクトース残基の不在を立証する方法を併用すると好ましい。

精製した産生物にフルクトースが存在しないことは天然Ｋ４多糖からフルクトースを遊離することが知られている条件下で産生物の酸加水分解後に、その結果として遊離したフルクトースの特定のアッセイにより有利に確認することができる。この試験は細菌大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養物から回収された多糖がフルクトースを含有しないことを常に示したが、これに対して大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４株Ｕ１−４１から得られる天然Ｋ４多糖はＫ４多糖の構造式から予想される量のフルクトースを含有する多糖を常に産生した。

天然Ｋ４多糖は分解しないが、フルクトースを含有しないコンドロイチン多糖を完全に分解して二糖とすることが知られている酵素コンドロイチナーゼＡＢＣを使用し、細菌大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養物から回収された産生物を消化することにより産生物の種類を更に確認した。

換言するならば、コンドロイチナーゼＡＢＣは天然Ｋ４多糖を消化することができない。細菌大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養物から回収された産生物のコンドロイチナーゼＡＢＣ消化実験の結果、完全消化から予想される量の二糖産物が得られ、多糖主鎖の種類と特にフルクトース残基の不在が確認された。

本発明の１態様によると、Ｋ４フルクトシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子としてのｋｆｏＥの機能を確認するために、野生型ｋｆｏＥヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドを構築し、大腸菌Ｋ４株（ΔｋｆｏＥ）に導入し、失われた機能の補完を行った。

要約すると、ｋｆｏＥ遺伝子を増幅し、ｐＴｒｃＨｉｓプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，５７９１ Ｖａｎ Ａｌｌｅｎ Ｗａｙ ＰＯ Ｂｏｘ ６４８２ Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限部位にクローニングした。構築物ｐＴｒｃＨｉｓ−ｋｆｏＥを使用し、エレクトロポレーションにより組換え大腸菌（ΔｋｆｏＥ）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したプレートで３７℃にて形質転換体を選択した。

構築物ｐＴｒｃＨｉｓ−ｋｆｏＥを含む大腸菌（ΔｋｆｏＥ）形質転換体を培養し、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｊａｎｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１７７，１１７−１２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８８）に従ってＫ４多糖を精製し、回収した生成物中に存在するフルクトースを定量するために、０．２Ｍトリフルオロ酢酸で１時間９９℃にて加水分解前後に遊離フルクトースを測定した。加水分解前後に定量した遊離フルクトースを原料Ｋ４分子と結合したフルクトースとみなした。

ｐＴｒｃＨｉｓ−ｋｆｏＥにより形質転換された大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養物から回収された産生物は結合したフルクトースの存在を示し、この株ではフルクトシルトランスフェラーゼ活性の喪失がプラスミドにより補完されたことが確認された。

大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）と大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ）の構築において大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４株Ｕ１−４１に実施した遺伝子改変を模式的に示す。ａ）カナマイシン耐性カセット（カナマイシン）とその両側に２個のＦＲＴ（Ｆｌｉｐｐａｓｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔｓ）組換え配列を含むＤＮＡ断片。カナマイシン耐性遺伝子はＰ１及びＰ２プライミング部位を使用することによりｐＫＤ４プラスミド鋳型から得られる。ｂ）大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４株Ｕ１−４１のＫ抗原遺伝子クラスターの詳細な構造であり、ｋｆｏＤとｋｆｏＦはｋｆｏＥのフランキング遺伝子である。ｃ）元のＤＮＡの断片をカナマイシン耐性遺伝子（カナマイシン）で置換することによるｋｆｏＥ遺伝子の破壊を示す大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）染色体ＤＮＡ。ｄ）ｋｆｏＥ遺伝子の大半の最終欠失を示す大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ）染色体ＤＮＡ。 残存する３’及び５’ｋｆｏＥフランキング領域の配列を確認するために３個の大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）形質転換体で実施したＰＣＲ増幅の結果を示す。レーン１及び１０は分子量マーカー（１Ｋｂラダー）を示す；レーン２〜４：３個の形質転換体の残存するｋｆｏＥ ３’末端のＰＣＲ産物；レーン６〜８：３個の形質転換体の残存するＫｆｏＥ ５’末端のＰＣＲ産物；レーン５及び９：夫々３’及び５’プライマー対を使用することにより得られた大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４株Ｕ１−４１のＰＣＲ産物。 大腸菌ＤＳＭ２３６４４により産生された多糖をコンドロイチナーゼＡＢＣによる消化後にキャビラリー電気泳動法により解析したクロマトグラムを示し、コンドロイチナーゼＡＢＣによるコンドロイチン消化の特徴である不飽和Δ−二糖（Δｄｉ−０Ｓ）が認められる（ピーク８）。 実施例３により得られた大腸菌ＤＳＭ２３６４４により産生されたコンドロイチンの^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

［実施例１］
大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）株の構築
鋳型としてのｐＫＤ４ベクターと以下のＰＣＲプライマー：
ＯＬ１５１：ａｔｇｃｔｔｃｔａａｔａａｔｇｔｃｔｇｇｔｔｃｃｔａｔｇｔｔｃａａｃａａｇａａｔｇｔｇｔａｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃ（配列番号３）
ＯＬ１５２：ｔｃａｔａｃｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｔｔａａａａａｔｔｔｃａｔａｔａａｔｃｔａａａｔｇｃａｃａｔａｔｇａａｔａｔｃｃｔｃｃｔ ｔａ（配列番号４）
を使用してＰＣＲによりｋａｎ^Ｒ遺伝子とｋｆｏＥ相同末端の両方を含む直鎖状ＤＮＡ断片（図１ａ）の構築を行った。

各オリゴヌクレオチド配列において、最初から４０個のヌクレオチドはｋｆｏＥ遺伝子相同性を提供し、残りの２０個のヌクレオチドはｐＫＤ４鋳型プラスミド相同性を提供する（Ｐ１及びＰ２プライミング部位）。

以下の条件：９４℃×３分、（９４℃×１分、４０℃×１分、６８℃×２分）×５サイクル、（９４℃×１分、５９℃×１分、６８℃×２分）×３０サイクル、６８℃×１０分、４℃×１０分に従い、鋳型ＤＮＡ１２０ｎｇでＰＣＲを実施した。

ＰＣＲ産物をゲル精製し、細菌を形質転換した。

大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４株Ｕ１−４１（図１ｂ）を作製し、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，６６４０−６６４５，Ｊｕｎｅ ６，２０００）に従ってエレクトロポレーションによりｐＫＤ４６プラスミドで形質転換した後、アンピシリン含有培地にプレーティングした。

アンピシリン耐性形質転換体を同定し、単離した。

プラスミド抽出と以下のプライマー及び条件：
ＯＬ１４９：ｃｃａｃｔｃａｔａａａｔｃｃｔｃａｔａｇａｇ（配列番号５）
ＯＬ１５０：ｃｃａａｃｔｔａｃｔｔｃｔｇａｃａａｃｇａｔ（配列番号６）
９４℃×３分、（９４℃×１分、４３℃×１分、６８℃×２．５分）×３０サイクル、６８℃×１０分、４℃×１０分
を使用したＰＣＲにより２個の形質転換体を確認した。

ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動により解析し、予想産物寸法と完全に一致する１７９９塩基対の寸法の産物を同定した。

カナマイシン耐性カセットとｋｆｏＥ相同末端の両方を含むＤＮＡ断片を使用して２個のｐＫＤ４６形質転換体のうちの一方を次にエレクトロポレーションに供した。

アンピシリンとカナマイシンの両方を含有する培地でのプレート選択を使用し、ｋｆｏＥヌクレオチド配列の大半がカナマイシン耐性遺伝子で置換された組換体を単離した。

以下の適切なプライマー：
ＯＬ１５３：ａａｔｃｃｇａｃｇｇｇｇａｃｔｇｔａｇａｔｔ（配列番号７）
ＯＬ１４２：ａａｃｔｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃａａｇ（配列番号８）
ＯＬ１４３：ｇｃｇｔｔｔｔｃｃｃｔｔｇｔｃｃａｇａｔ（配列番号９）
ＯＬ１５４：ｇｃｔａａｔｇｔａｔａｔｇａｔｔｇｃｃａｇｇｔ（配列番号１０）
を使用し、９５℃×５分、（９４℃×１分、４７℃×１分、６８℃×２分）×３０サイクル、６８℃×１０分、４℃×１０分でｋｆｏＥ ３’及び５’フランキング領域の両方のＰＣＲ増幅により３個の二重形質転換体を確認した。

ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動により解析し、予想産物寸法に完全に一致する夫々ｋｆｏＥ遺伝子の３’末端増幅の１７７３塩基対と５’末端増幅の７６９塩基対の寸法の２個の産物を単離した（図２）。

カナマイシン耐性遺伝子の向きを確認すると共に遺伝子転写方向が正しいことを確かめるために、以下のオリゴヌクレオチド：
ＯＬ１５３：ａａｔｃｃｇａｃｇｇｇｇａｃｔｇｔａｇａｔｔ（配列番号７）
ＯＬ１５４：ｇｃｔａａｔｇｔａｔａｔｇａｔｔｇｃｃａｇｇｔ（配列番号１０）
を使用して大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）（図１ｃ）のシーケンシング解析により形質転換体を更に解析した。

得られたヌクレオチド配列を配列番号１４と言う。

［実施例２］
大腸菌Ｋ４（ΔｋｆｏＥ）株の構築
カナマイシン耐性カセットを含まず、ｋｆｏＥ遺伝子の大半を欠失し、結果として機能喪失を伴う大腸菌Ｋ４株（ΔｋｆｏＥ）を得るために、大腸菌Ｋ４株（ΔｋｆｏＥ／ｋａｎ^Ｒ）をｐＣＰ２０プラスミドで更に形質転換した。

エレクトロポレーション工程後、アンピシリンを含有する培地で３０℃にて形質転換体を選択後、コロニー精製した。

推定形質転換体を非選択プレートで４３℃にて増殖後、全抗生物質耐性の喪失について試験した。

以下のオリゴヌクレオチド：
ＯＬ１６９：ｔｇａｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔａａａｃｃｔｔｇｇｔｇ（配列番号１１）
ＯＬ１６６：ｔａｃｔｇｔｔｔｃｔｇｃｔｔｇｃｃｃｃｃｇａｇｔｔ（配列番号１２）
を使用して残存するｋｆｏＥフランキング３’及び５’末端（図１ｄ）の両方をシーケンシングすることにより大腸菌Ｋ４株（ΔｋｆｏＥ）形質転換体を確認した。

得られたヌクレオチド配列を配列番号１３と言う。

［実施例３］
大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養とコンドロイチン解析
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｊａｎｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１７７，１１７−１２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８８）に従って大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養を行った。

要約すると、解凍した培養ストック０．５ｍｌから出発し、１リットル当たりＫ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ ９．７ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ８ｇ、クエン酸ナトリウム・５Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ＭｇＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ ０．２ｇ、カザミノ酸２０ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、グルコース２ｇ、酵母エキス１０ｇから構成されるブロス培地２０ｍｌを加えたフラスコに接種し、１８０ｒｐｍ及び振幅２．５ｃｍで振盪下に３７℃で１６時間インキュベートし、無性段階の培養を実施した。

上記のようなブロス培地８５ｍｌを加えた５００ｍｌバッフル付きフラスコに上記のように調製した無性培養物０．０５％を接種し、１８０ｒｐｍ及び振幅２５ｃｍで振盪下に３７℃で４８時間インキュベートし、回分培養で次の培養段階を実施した。

インキュベーション後、培養物を遠心により回収し、産生されたコンドロイチンを単離及び性状解析するために上清を精製した。

Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｊａｎｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１７７，１１７−１２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８８）により記載されている方法の変法に従ってコンドロイチン精製を行った。

要約すると、セタブロン（アルキルトリメチルアンモニウムブロマイド，ＣＡＳ Ｎ°７１９２−８８−３）により培養上清から多糖を沈殿させ、３℃にて０．５Ｍ ＮａＯＨで抽出し、中和後、３サイクルの８０％エタノール沈殿により精製した。

９０％冷フェノール（ｐＨ６．８）を用いて最終精製工程を実施し、汚染性蛋白質を沈殿させ、水相を遠心により回収した。精製したコンドロイチンを８０％エタノール沈殿と減圧乾燥により水相から回収した。

産生されたコンドロイチンの種類を確認するために数種の解析アプローチを使用した。

第１のアプローチは０．２Ｍトリフルオロ酢酸で１時間９９℃にて実施した酸加水分解後に培養物から回収された産生物中のフルクトースの有無を調べた。

回収した産生物中に存在するフルクトースを定量するために、遊離フルクトースを加水分解前後に測定した。ＢＩＯＣＯＮＴＲＯＬ（ＢｉｏＣｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．１２８２２ ＳＥ ３２ｎｄ Ｓｔｒｅｅｔ Ｂｅｌｌｅｖｕｅ，ＷＡ ９８００５，米国）の製品であるＥｎｚｙＰｌｕｓ Ｓｕｃｒｏｓｅ／Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ／Ｄ−Ｆｒｕｃｔｏｓｅキットを使用してフルクトースを酵素定量した。

加水分解後と加水分解前に存在する遊離フルクトースの差を原料Ｋ４分子と結合したフルクトースとみなした。

大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養物から回収された産生物は結合したフルクトースの存在を示さず、この株がフルクトースを含有しない多糖を産生することを確認した。

上記のように大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養物から回収された多糖には結合したフルクトースが存在しないことをコンドロイチナーゼＡＢＣによる酵素消化により確認した。精製コンドロイチンをコンドロイチナーゼＡＢＣで消化すると、コンドロイチン消化の特徴である不飽和Δ−二糖（Δｄｉ−０Ｓ）を生じることも判明し、Ｍｉｃｅｌｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＭＥＣＫ）技術を使用したキャビラリー電気泳動（ＣＥ）により確認された（図３）。適切なΔ−二糖参照標準（等電点電気泳動溶出）を利用してΔｄｉ−０Ｓ構造を確認した。得られたΔｄｉ−０Ｓの定量を外部検量曲線により行った。

最後に、大腸菌ＤＳＭ２３６４４により産生された精製コンドロイチン多糖をＣ^１３ ＮＭＲにより性状解析した（図４）。

この技術によると、試験した産生物は酸加水分解により天然Ｋ４多糖からフルクトースの除去後に得られた産生物とスペクトルが一致することが判明した。

［実施例４］
プラスミドによるｋｆｏＥ機能の補完
Ｋ４フルクトシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子としてのｋｆｏＥの機能を確認するために、野生型ｋｆｏＥヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドを構築し、大腸菌Ｋ４株（ΔｋｆｏＥ）に導入し、喪失した機能の補完を行った。

以下のオリゴヌクレオチド：
ＯＬ１７２：ａｃａａｃａｔｇｔｔａｃｔａａｔａａｔｇｔｃｔｇｇｔｔｃｃｔａｔｇｔｔｃ（配列番号１５）
ＯＬ１７３：ａｃｔｇｇａｔｃｃｔｔａｔｃａｔａｃｔｇｃａｇｃｃｔｃｃｔｔａ（配列番号１６）
を使用することによりｋｆｏＥ遺伝子を増幅した。

ｐＴｒｃＨｉｓプラスミド（４４００ｂｐ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，５７９１ Ｖａｎ Ａｌｌｅｎ Ｗａｙ ＰＯ Ｂｏｘ ６４８２ Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用し、増幅・ゲル精製後のｋｆｏＥ遺伝子（１５６９ｂｐ）を適切なクローニング部位に導入した。

ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化したｐＴｒｃＨｉｓベクター７０ｎｇと、対合するＰｃｉＩ／ＢａｍＨＩ消化末端をもつｋｆｏＥ遺伝子７５ｎｇを２５℃で１５分間ライゲーション反応させた。

次に大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，５７９１ Ｖａｎ Ａｌｌｅｎ Ｗａｙ ＰＯ Ｂｏｘ ６４８２ Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）５０μＬにライゲーション混合液５μＬをエレクトロポレーションし、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するプレートで３７℃にて５個の形質転換体を選択した。

コロニー精製後、構築したプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ−ｋｆｏＥを抽出し、挿入されたｋｆｏＥ配列の内側のＤＮＡ構築物を切断することが可能なＭｆｅＩ制限酵素により消化した。

ゲル電気泳動解析によると、ＭｆｅＩ消化後の５個の形質転換体のうちの３個は予想通りの５８８７ｂｐの長さを示し、配列解析により、ｋｆｏＥ遺伝子の正しい挿入が確認された。

確認されたｐＴｒｃＨｉｓ−ｋｆｏＥ構築物を使用し、エレクトロポレーションにより組換え大腸菌ＤＳＭ２３６４４を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したプレートで形質転換体を選択した。

選択した形質転換体を実施例３に記載した条件に従って培養し、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｊａｎｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１７７，１１７−１２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８８）に従ってＫ４多糖を精製した。

回収した産生物中に存在するフルクトースを定量するために、０．２Ｍトリフルオロ酢酸で１時間９９℃にて酸加水分解前後に遊離フルクトースを測定した。ＥｎｚｙＰｌｕｓ Ｓｕｃｒｏｓｅ／Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ／Ｄ−Ｆｒｕｃｔｏｓｅキットを使用してフルクトースを酵素定量した。

加水分解後と加水分解前に存在する遊離フルクトースの差を原料Ｋ４分子と結合したフルクトースとみなした。

ｐＴｒｃＨｉｓ−ｋｆｏＥにより形質転換された大腸菌ＤＳＭ２３６４４の培養物から回収された産生物は結合したフルクトースの存在を示し、この株ではフルクトシルトランスフェラーゼ活性の喪失がプラスミドにより補完されたことが確認された。

Claims (10)

1. β１−３（ＧｌｃＵＡ→ＧａｌＮＡｃ）結合とβ１−４（ＧａｌＮＡｃ→ＧｌｃＵＡ）結合により結合したＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の残基が交互に配列することにより構成される直鎖状グリコサミノグリカンとして定義されるコンドロイチンを産生する組換え微生物であって、
   前記微生物が、大腸菌Ｏ５：Ｋ４：Ｈ４Ｕ１−４１株に由来し、
   前記微生物において、元々存在する、直鎖状コンドロイチン主鎖へのフルクトース残基の付加に関与する酵素をコードするｋｆｏＥ遺伝子が、前記遺伝子の全部もしくは一部の欠失もしくは置換又は付加的ヌクレオチド配列の挿入による破壊により不活性化されており、並びに
   前記ｋｆｏＥ遺伝子が、
   （Ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードすることを特徴とする、組換え微生物。
2. 不活性化されているｋｆｏＥ遺伝子が、
   （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡである、請求項１に記載の組換え微生物。
3. ｋｆｏＥ遺伝子がその全部又は一部をカナマイシン耐性カセットで置換後に前記カセットを除去することにより不活性化されており、その結果、ｋｆｏＥ遺伝子の全部又は一部が欠失している、請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換え微生物。
4. 大腸菌ＤＳＭ２３５７８又は大腸菌ＤＳＭ２３６４４である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
5. 大腸菌ＤＳＭ２３６４４である、請求項４に記載の組換え微生物。
6. 大腸菌ＤＳＭ２３５７８及び大腸菌ＤＳＭ２３６４４から選択される組換え微生物を利用するバイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産方法。
7. 組換え微生物が大腸菌ＤＳＭ２３６４４である、請求項６に記載の方法。
8. バイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産方法であって、
   ａ．請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え微生物を適切な培地で培養する工程、
   ｂ．微生物培養物中に存在するコンドロイチンを回収し、精製する工程
   を含む、方法。
9. 組換え微生物が大腸菌ＤＳＭ２３５７８又は大腸菌ＤＳＭ２３６４４である、請求項８に記載のバイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産方法。
10. 組換え微生物が大腸菌ＤＳＭ２３６４４である、請求項９に記載の方法。

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