DE936287C - Verfahren zur Gewinnung von Vitaminen der B-Gruppe - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von Vitaminen der B12-Gruppe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Vitaminen der B12 Gruppe.
• Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen in mehr oder weniger hohem Ausmaß zur Bildung von Vitamin B12 befähigt sind. So erwiesen sich verschiedene Stämme von Mycobact. smegmatis, Lactobacillus arabinosus, Bacillus subtilis, Strept. roseochromogenum, Str. griseus und Str. antibioticus als Vitamin-B,2-Bildner. Auch über die Isolierung von Vitamin B12 aus einem griseinbildenden Stamm von Strept. griseus ist bereits berichtet worden. An anderer Stelle wurde besonders bei einem Bacillus-megatherium-Stamm eine sehr erhebliche Vitamin-Bi.-Bildung festgestellt. Ferner wurde die Bildung des »animal protein factors« durch Strept. aureofaciens und die Isolierung von kristallisiertem Vitamin B12 aus einem streptomycin-bildenden Stamm von Streptomyces griseus beschrieben. Schließlich soll noch Erwähnung finden, daß die Bildung reichlicher Mengen von Vitamin B12 (bis a y/ccm) durch einen Stamm von Streptomyces olivaceus bekannt ist. Auch andere Streptomyces-Arten erwiesen sich zur Bildung von Vitamin B12 (bis a y/ccm) befähigt, und in einer vergleichenden Untersuchung wurden zahlreiche Actinomyceten als Vitamin-B12-Bildner erkannt.
• In den vorerwähnten Arbeiten wurden Medien zur Erzeugung von Vitamin B12 empfohlen, die außer Kohlenhydraten, den üblichen Nährsalzen und Kobaltionen proteinreiche Materialien, wie z. B. Sojabohnen- und Erdnußextraktrückstände, Getreideschlempen, Maisquellwasser, Kaseinhydrolysate, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton usw., enthalten. Alle diese bisher benutzten Medien bieten jedoch noch keine Basis für die Vitamin-B1.-Erzeugung in großem Maßstab, da die erforderlichen Rohstoffe; wie z. B. Pepton, Fleischextrakt, Kasein usw., entweder zu kostspielig oder infolge ihres Eiweißgehaltes, wie z. B. bei Verwendung von pflanzlichen Extraktrückständen, Getreide- oder Melassenschlempen usw., zu leicht infizierbar sind und daher eine streng sterile Gärführung' erforderlich machen.
• Um die Vitamin-B12-Produktion in größtem Ausmaß durchführen zu können, mußte daher ein Ausgangsmaterial gesucht werden, das möglichst billig ist und keine absolut sterile Gärführung notwendig macht, zugleich aber eine zufriedenstellende Vitamin-B"-Produktion ermöglicht.
• Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, die bei der Zellstofferzeugung anfallenden Sulfitablaugen und Sulfitablaugenschlempen als Substrate zur Züchtung von Mikroorganismen zu verwenden.
• Es ist bereits bekannt, daß verschiedene Hefen oder hefeartige Mikroorganismen zur Züchtung in Sülfitablaugen befähigt sind. Ferner wurde die Erzeugung von Mycelmassen, z. B. von Aspergillus niger oder Oospora lactis in Sulfitablaugen mit Erfolg durchgeführt. Auch zur Gewinnung verschiedener Gärprodukte erwiesen sich Sulfitablaugen als geeignet; so wird vor allem die Spriterzeugung aus Sulfitablaugen in großtechnischem Maßstab durchgeführt. Bei allen diesen Prozessen ist es notwendig, die Sulfitablaugen in der Weise vorzubereiten, daß man sie neutralisiert und von schwefliger Säure befreit, um sie für das Wachstum von Mikroorganismen,geeignet zu machen. Bei anderen Prozessen müssen die Sulfitablaugen noch viel weitgehender von schädlichen Stoffen befreit werden. Dies gilt z. B. für deren Vergärung auf Milchsäure, wobei zunächst Kalziumsulfit ausgefällt werden muß. Noch empfindlicher sind die Butanol-Aceton erzeugenden Clostridien. Zur erfolgreichen Durchführung der Butanol-Aceton-Gärung in Sulfitablaugen erwies sich nicht nur deren weitgehende Befreiung von Furfurol und Ameisensäure als notwendig, sondern auch die Ausfällung der Ligninsulfosäuren in Form von basischen Erdalkalisalzen.
• Zur Verwertung der Sulfitablaugen sind mithin bereits zahlreiche mikrobiologische Prozesse herangezogen worden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet nun eine weitere neuartige Verwertungsmöglichkeit von Sulfitablaugen; da sich überraschenderweise zeigte, daß verschiedene vitamin-B12 bildende Mikroorganismen nach der Adaptation in Sulfitablauge gezüchtet und zur Produktion von vitamin-B12 haltigem Mycel benutzt werden können. Vor allem Streptomyceten, wie z. B. Streptomyces olivaceus u. a., erwiesen sich zur Züchtung in neutralisierten Sulfitablaugen als geeignet, was nicht ohne weiteres zu erwarten war, da bekannt ist, daß dieselben nach der bisherigen Meinung recht empfindlich und wählerisch in ihren Ernährungsansprüchen sind. Besonders überraschend ist es aber, daß die Sulfitablaugen zwecks Erzeugung von Vitamin B12 durch Züchtung von Streptomyces-Arten nicht so weitgehend vorbehandelt werden müssen, wie dies z. B. bei ihrer Vergärung auf Milchsäure (Ausfällung von Sulfit) oder auf Butanol-Aceton (Ausfällung von Sulfit und Lig-ninsulfosäur.en) notwendig ist, und daß sogar noch nicht einmal die Abtreibung von Schwefeldioxyd erforderlich ist, wie dies z. B. zur Hefezüchtung und Spriterzeugung, sowie alle anderen bisher in Sulfitablaugen durchgeführten Züchtungs- und Gärprozesse, notwendig ist. Es genügt erfindungsgemäß vielmehr lediglich eine Neutralisation der Sulfitablauge.
• Zur Züchtung der Vitamin B12 erzeugenden Streptomyces-Arten können sowohl die überwiegend hexosehaltigen Nadelholzsulfitablaugen als auch die überwiegend pentosehaltigen Laub-_holzsulfitablaugen oder die nach der Spritgewinnung aus Nadelholzsulfitablaugen anfallenden Schlempen dienen. Auf Grund der mit Sulfitablaugen gemachten Erfahrungen ist es daher nicht mehr weiter überraschend, daß auch Holzhydrolysate in praktisch gleicher Weise zur Züchtung von Vitamin B12 bildenden Streptomyceten dienen können.
• Die Züchtung der vitamin-B12 =bildenden Streptomyces-Arten in Sulfitablaugenoder Sulfitablaugenschlempen wird vorteilhafterweise in der Submerskultur unter Belüftung vorgenommen. Dabei zeigte sich aber, daß es nicht unter allen Umständen möglich ist, ein Mycel mit zufriedenstellendem Vitamin-B12-Gehalt zu erzeugen. Abgesehen von der Eignung des -verwendeten Stammes ist die erfolgreiche optimale Durchführung des Prozesses noch von einer Anzahl bestimmter Faktoren abhängig. Vor allem ist hierfür von entscheidender Bedeutung, daß man die submers-aerobe Züchtung in Sulfitablaugen so leitet, daß dabei ein fadenförmiges Mycel entsteht, da Mycelbruchstücke und Sporen von Streptomyceten technisch nur schwer vom Kulturmedium abgetrennt werden können, während das fadenförmige, innig verfilzte Mycel leicht gewonnen werden kann. Für die Entstehung eines vitamin-B"-reichen fadenförmigen Mycels von Streptomyces-Arten ist - wie ermittelt wurde - die pH-Führung in der Vorkultur sowie bei der Hauptgärung und die Vermeidung einer Zerschlagung des Mycels durch das Belüftungssystem von entscheidender Bedeutung. Diese Verfahrensschritte müssen gemeinsam angewendet werden, um die Züchtung vitamin-B" reicher Streptomyceten in Sulfitablaugen.oder Sulfitablaugenschlempen mit Erfolg und optimalen Ergebnissen.durchzuführen.
• Es wurde nämlich gefunden, daß z. B. bei Strept. olivaceus nur solche Vorkulturen geeignet sind; in denen während ihrer Aufzucht der pH-Wert niemals unter 6,6 absinkt, da es sonst nicht gelingt, bei der Hauptgärung ein Mycel mit hohem Vitamin-B,2-Gehalt zu erzeugen. Ferner muß ein Anstieg des pH-Wertes über 7,3 vermieden werden. Ein solcher Anstieg wird normalerweise auch nicht eintreten, da die Vorkultur zur Weiterzüchtung verwendet wird, bevor noch der PH-Wert ansteigt. Auch während der Hauptzüchtung muß dafür Sorge getragen werden, daß der PH-Wert nicht unter 6,6 sinkt und daß der PH-Wert, solange noch assimilierbarer Zucker im Medium vorhanden ist, also Wachstum stattfinden kann, nicht über 7,3 ansteigt, damit eine vorzeitige Autolyse vermieden wird. Die Aufrechterhaltung des optimalen pH-Bereiches gelingt entweder durch Anwendung eines eiweißreichen Mediums, aus dem während der Entwicklung der Streptomyceten Ammoniak frei wird, oder dadurch, daß während der Heranzüchtung der Vorkultur und der Hauptkultur fortlaufend der günstigste pH-Bereich durch Zusatz von Ammoniak, Soda oder anderen Neutralisationsmitteln eingestellt wird. Der zweite erfindungsgemäß wesentlicheFaktor zur Erzeugung eines vitamin-13,2-reichen Streptomyceten-Mycels ist die Vermeidung einer Zerschlagung des @lycels durch die Belüftung. Es muß daher ein Belüftungssystem angewendet werden, bei dem das Mycel in schonender Weise mit Luft versorgt wird, also eine heftige Bewegung, die zu einem Zerreißen von Mycelfäden führt, vermieden wird.
• Charakteristisch für das vorliegende Verfahren ist, daß die erwähnten Faktoren gemeinsam berücksichtigt werden müssen, wenn erfindungsgemäß die Erzeugung eines vitamin-B,2-reichen Streptomyces-Mycels in Sulfitablaugen erzielt werden soll; neben einer optimalen PH-Führung bei der Züchtung der Vor- und Hauptkultur ist mithin die Zerreißung der Mycelfäden zu vermeiden.
• Ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal des Verfahrens ist, daß lediglich die Heranführung der Vorkultur unter streng sterilen Bedingungen vorgenommen wird, während bei der zur Gewinnung des v itamin-B"-haltigen Mycels dienenden Hauptgärung auf die Einhaltung absolut steriler Bedingungen verzichtet werden kann.
• Es ist wohl bekannt, daß bei manchen Gärprozessen, wie z. B. bei der Sprit- oder Hefeerzeugung, eine absolut sterile Gärführung nicht notwendig ist. In diesen Fällen hängt dies damit zusammen, daß man unter solchen Bedingungen arbeitet, die eine Infektionsgefahr von vornherein auf ein Mindestmaß herabdrücken, indem vor allem bei tiefen PH-Werten gearbeitet wird oder indem anaerobe Verhältnisse vorliegen oder indem durch Alkoholbildung eine Infizierbarkeit eingeschränkt wird.
• Im vorliegenden Fall muß aber bei einem hohen PH-Wert gearbeitet werden, also unter Bedingungen, die von vornherein eine hohe bakterielle Infektionsgefahr mit sich bringen. Aber -auch die anderen für die bisher bekanntgewordenen Verfahren der nicht absolut sterilen Gärführung zutreffenden Voraussetzungen fehlen in diesem Fall. Die nicht absolut sterile Gärführung wird vielmehr erfindungsgemäß in der Weise erzielt, daß man solche Mikroorganismen anwendet, die außer Vitamin B12 noch ein Antibiotikum bilden, durch das das Aufkommen von Fremdorganismen verhindert oder zumindest beträchtlich eingeschränkt wird. Außerdem wird die Infektionsgefahr durch die Verwendung der nur neutralisierten, nicht aber von schwefliger Säure befreiten Sulfitablaugen noch weiter eingeschränkt.
• Im folgenden soll die Erfindung an Hand von einigen Beispielen erläutert werden. Beispiel i i oo Teile Fichtenholzablaugenschlempe mit einem Gehalt von o,8°/o reduzierender Substanz werden mit o,5 % eines Hefehydrolysates, o,2% Diamonphösphat, 0,0250/0 Magnesiumsulfat und i mg°/o Kobaltsulfat versetzt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 7,2 wird mit 5 bis ioo/o einer Vorkultur des Streptomyces olivaoeus beimpft. Die Vorkultur wird in der Weise erzeugt, daß eine Sporensuspension des Organismus unter submersen Bedingungen zur Entwicklung gebracht wird, wobei man folgendes Medium verwendet: 1,5 % technische Glukose, o,5 % Hefehydrolysat, o,2 % Diamonphosphat und o,o25 % Magnesiumsulfat. Es wird dafür Sorge getragen, daß der pH-Wert während der etwa 24stündigen Vorzüchtung zwischen 6,6 und 7,3 gehalten wird. In dem mit dieser Vorkultur beimpften oben angeführten Hauptmedium findet unter submers-aeroben Bedingungen bei etwa 27° eine lebhafte Entwicklung des Streptomyces olivaceus in Mycelform statt. Der PH-Wert wird in den Grenzen 6,6 bis 7,3 gehalten, was einerseits durch Zusatz von Ammoniak, andrerseits durch Zusatz von Schwefelsäure erreicht wird. Nach einer Züchtungsdauer von 36 bis ,48 Stunden ist das Reduktionsvermögen des Mediums praktisch verschwunden bzw. .auf einen konstanten Wert abgesunken. Durch Filtration auf einem Saugfilter erhält man einen Mycelbrei, der in üblicher Weise gewaschen und getrocknet wird. Bezogen auf verbrauchte reduzierende Substanz erhält man 35 bis ¢5 % an Trockenmycel mit einem Vitamin-Bi.-Gehalt von q.o bis 6o mg j e kg. Beispiel e ioo Teile Buchenholzsulfitablauge werden in üblicher Weise mit Kalk neutralisiert und nach dem Abtrennen der unlöslichen Anteile auf einen Gehalt von o,611/o reduzierender Substanz eingestellt. Im übrigen wird in der gleichen Weise wie im Beispiel i vorgegangen. Sobald bei der Züchtung des Streptomyces der Zuckergehalt auf o,2a/o gefallen ist, läßt man kontinuierlich weitere Mengen des gleichen Mediums zufließen unter gleichzeitiger Entnahme der gleichen Menge anvergorener Flüssigkeit. Im Verlauf der weiteren Züchtung steigert man allmählich die Konzentration des zufließenden Mediums in dem Ausmaß, wie die reduzierende Substanz verbraucht wird, so daß im Fermenter ein annähernd konstanter Gehalt an reduzierender Substanz aufrechterhalten wird. Der Prozeß wird so lange durchgeführt, als.das Streptomyces-Wachstum einwandfrei und der Gehalt des Mycels an Vitamin B12 zufriedenstellend ist. Die Gewinnung des Mycels erfolgt in der gleichen Weise wie in Beispiel i. Bezogen auf verbrauchte reduzierende Substanz erhält man q.o bis 45 % an Trockenmycel mit einem Vitamin-B12-Gehalt von 2o bis 30 mg je kg. Beispiel 3 ioo Teile Fichtenholzsulfitablauge werden wie in Beispiele vorbereitet und auf ein Reduktionsvermögen von o,8 % eingestellt. Man beimpft mit io°/o einer Vorkultur des -Streptomyces, die in einem Medium hergestellt wurde, das i,5 % technische Glukose, 0,5°/o Pepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,5 % Natriu.mchlorid enthält. Nach 36- bis 48stiin diger Züchtung unter submers-aeroben Bedingungen wird das Mycel durch Filtration geerntet, gewaschen und getrocknet. - Bezogen auf verbrauchte reduzierende Substanz erhält man q.o bis 45)/o an Trockenmycel mit einem Vitamin-Bl2-Gehalt von 5obis6omgjekg.
• Beispiel q.
• ioo Teile einer nach der teilweisen Verhefung anfallenden Buchenholzsulfitablauge mit einem Gehalt von o,6% an reduzierender Substanz werden nach Abtrennung des größten Teils der Hefe aufgekocht und nach Ergänzung des Stickstoffs und des Phosphates mit einer wie in Beispiel i vorbereiteten Kultur des Streptomyces beimpft. Nach 24-stündiger Züchtung unter submers-:aeroben Bedingungen werden 9o Teile des Mediums entnommen und zur Mycelgewinnung verwendet. Die restlichen io Teile dienen zum Anstellen eines in gleicher Weise vorbereiteten Mediums. Dieser Prozeß wird so lange fortgesetzt, als das Mycelwachstum einwandfrei und der Gehalt an Vitamin B12 zufriedenstellend ist. Man erhält 35 bis q.o% an Trockenmycel, bezogen auf verbrauchte reduzierende Substanz mit einem Vitamin-B12 Gehalt von 3o bils 35 mg je kg Trockensubstanz.
• Die nicht absolut sterile Gärführung in der Hauptgärbütte bringt den Vorteil mit sich, daß das Verfahren im größten Ausmaß durchgeführt werden kann, was bei den bisher üblichen Methoden, also bei Verwendung absolut steriler Fermenter, nur mit hohen Kosten möglich ist.
• Ein weiterer beträchtlicher Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß die Sulfitablaugen erfindungsgemäß nicht von schwefliger Säure befreit werden müssen, wie dies für alle bisher bekanntgewordenen mikrobiologischen Prozesse erforderlich ist, die sich der Sulfitablaugen als Ausgangsmaterial bedienen. Erfindungsgemäß ist es nur notwendig, die Sufitablaugen zu neutralisieren und auf den gewünschten pH-Wert einzustellen. Derartige Maßnahmen stellen einen sehr bedeutsamen Formschritt in der mikrobiologischen Verwertung von Sulfitablaugen dar. Ein außerordentlicher Vorteil ist ferner darin zu sehen, daß die aus dem Zellstoff-Kochprozeß stammenden Sulfitablaugen von vornherein steril sind. Es können sowohl die überwiegend hexösehaltigen Nädelholzsulfitablaugen als auch die überwiegend pentosehaltigen Laubholzsulfitablaugen verwendet werden. Schließlich können auch die bei der Spritgewinnung aus Sulfitablaugen oder Holzhydrolysaten anfallenden Schlempen, die gleichfalls beim Verlassen der Destillierapparate steril sind, als Ausgangsmaterialien dienen. Die erfindungsgemäße Verwendung von Sulfitablaugen oder Sulfitablaugenschlempen zur Erzeugung von vitamin-B12 haltigem Streptomyceten-Mycel besitzt daher auch wesentliche wirtschaftliche Vorteile, da die betreffenden Rohprodukte in größtem Ausmaß anfallen und bisher nicht ausreichend verwertet werden können.

Claims (5)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Gewinnung von Vitaminen der B12-Gruppe durch Züchtung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat Ablaugen der Zellstofferzeugung und/ oder Sulfitablaugenschlempen mit oder ohne Zusatz geeigneter Zuckerarten und/oder Nichtzuckerstoffen anderer Herkunft verwendet werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß als vitamin-B12 erzeugende Organismen vor allem Streptomyces-Arten verwendet werden.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Vorbereitung der Sulfitablaugen auf die Entfernung der schwefligen Säure verzichtet wird. q..
4. Verfahren nach denAnsprüchen i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die submers-aerobe Züchtung der Streptomyces-Arten durch die pH-Führung, z. B. etwa 6,6 bis 7,3 und die schonende Art der Belüftung so geleitet wird, daß dabei ausschließlich oder überwiegend unverletztes fadenförmiges Mycel entsteht.
5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen i bis q., dadurch gekennzeichnet, daß in der Hauptgärbütte auf absolut sterile Bedingungen verzichtet wird, indem vitamin-B12 bildende Mikroorganismen verwendet werden, die zugleich ein Antibiotikum erzeugen.