DE69332413T2

DE69332413T2 - Interleukin-2 analoge mit niedriger toxizität zur verwendung in der immuntherapie

Info

Publication number: DE69332413T2
Application number: DE69332413T
Authority: DE
Inventors: A. Grimm; Keith Heaton
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 1992-04-14
Filing date: 1993-04-13
Publication date: 2003-06-26
Anticipated expiration: 2013-04-14
Also published as: WO1993020849A1; EP0673257A4; JPH07508714A; EP0673257B1; EP0673257A1; AU4284393A; CA2133831A1; DE69332413D1; US5229109A; CA2133831C; ATE226086T1

Description

Die Regierung besitzt an der vorliegenden Erfindung Rechte, die sich aus dem Forschungsstipendium Nr. CA 45225 des National Institute of Health ergeben.

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gebiete der Immuntherapie und der Krebsbehandlung. Die Erfindung zielt auf die Identifizierung und Selektion von Zytokinen mit niedriger Toxizität ab, und auf die Verwendung von erhöhten Dosierungen solcher Zytokine bei Strategien zur klinischen Behandlung und bei der Anti-Krebstherapie. Insbesondere ist die günstige Verwendung von Interieukin-2-Analogen mit niedriger Toxizität, die ihre tumoriziden Wirkungen beibehalten, offenbart. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung derartiger Interieukin-2-Analogen mit niedriger Toxizität in der adoptiven Immuntherapie.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Humanes Interleukin 2 (IL-2) ist ein potentes immunregulatorisches Zytokin, das zuerst als ein Lymphokin, das in der Lage ist, die Proliferation von aktivierten T- Zellen in vitro über einen langen Zeitraum hinweg zu fördern, beschrieben wurde (Morgan et al., 1976; Ruscetti et al, 1977). Danach wurde von IL-2 auch gezeigt, dass es verschiedene andere Immunfunktionen moduliert, einschließlich dem Ausüben einer Wirkung auf zytotoxische T-Zellen (Gillis et al., 1980), natürlichen Killerzellen (Ortaldo et al., 1984), aktivierten B-Zellen (Mingari et al., 1984) und Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) (Grimm et al., 1982; Mazumder & Rosenberg, 1984).
Eine cDNA, die das humane IL-2 kodiert, ist kloniert (Taniguchi et al., 1983) und die primäre Proteinsequenz abgeleitet worden. In eukaryotischen Zellen wird IL-2 als ein Vorläufer-Polypeptid mit 153 Aminosäuren synthetisiert, von welchen 20 Aminosäuren entfernt werden, um das reife, sekretierte IL-2 zu erzeugen. Unter Verwendung von molekularbiologischen Techniken ist aktives, rekombinantes humanes IL-2 in E. coli (Rosenberg et al., 1984), in Insektenzellen (Smith et al., 1985) und in Säugetier-COS-Zellen (Taniguchi et al., 1983) hergestellt worden.
Die "Proceedings of 83rd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research" (1992), Band 33, Seite 324, Zusammenfassung 1933, zeigt, dass bestimmte IL-Analoge die LAK-Aktivität in humanen PBMC-Populationen in etwa demselben Maß stimulieren konnten wie natives IL-2, wie in einem Chrom- Zytotoxizität-Test gemessen.
Die biologischen Wirkungen von IL-2 werden durch die Bindung an spezifische Rezeptoren an der Oberfläche von Zielzellen vermittelt. Es sind zumindest drei verschiedene Formen von IL-2-Rezeptoren (IL-2Rs) bekannt: der Rezeptor mit niedriger Affinität (Kd = 10-30 nM); mit mittlerer Affinität (Kd = 0,8-2 nM); und mit hoher Affinität (Kd = 10-50 pM) (Waldmann et al., 1989). Der IL-2R mit niedriger Affinität ist eine Polypeptidkette mit Mr ~55 kD, als p55 oder IL-2Rα bezeichnet (Leonard et al., 1984; Nikaido et al., 1984; Cosman et al., 1984), wogegen der IL-2R mit mittlerer Affinität eine Polypeptidkette mit Mr ~70-75 kD, als p75 oder IL-2Rβ bezeichnet (Hatakeyama et al., 1989), ist. Ein zwischen p55 und p75 ausgebildeter Komplex mit zusätzlichen Komponenten entspricht dem IL-2R mit hoher Affinität (Hatakeyama et al., 1989; Herrmann & Diamantstein, 1988).
Die biologischen Funktionen eines jeden dieser Rezeptoren wurden untersucht, indem man die Wirkungen der Bindung von IL-2 an Zellen, die natürliche oder rekombinante Rezeptoren exprimieren, studierte. Es wurde gezeigt, dass IL-2 die Lymphokin-aktivierte Tötung (lymphokine activated killing (LAK)) mittels dem IL-2-Rezeptormolekül p75 mit mittlerer Affinität aktiviert und nicht mittels dem p55 + p75-Komplex mit hoher Affinität.
In den letzten Jahren hat sich die Verabreichung von IL-2 als von einigem Nutzen in der Krebstherapie erwiesen und insbesondere bei der Behandlung von bestimmten Patienten mit Nierenzellenkrebs. Zur Zeit zeigen etwa 20% der Patienten mit Nierenkrebs Zeichen für Tumorregression, wenn sie mit der optimal tolerierbaren Dosierung von IL-2 behandelt werden. Allerdings ist die klinische Nützlichkeit der IL-2-Immuntherapie zur Zeit wegen Problemen mit deutlicher Toxizität begrenzt. Die mit der IL-2-Behandlung bei Menschen verbundene Toxizität ist derartig, dass nur 10% oder weniger der optimalen Dosis, wie aus Tierstudien abgeleitet, toleriert werden kann. Darum können leider die "heilenden Dosierungen" (curative doses), die in Tiermodellen erzielt werden, in menschlichen Patienten nicht erreicht werden.
Des weiteren werden selbst bei den zur Zeit verwendeten Dosierungen Toxizitätssymptome, einschließlich zum Beispiel Unwohlsein, Brechreiz und Erbrechen, Durchfall, Flüssigkeitsretention, Hypotonie und sogar Organstörung, bei Patienten, die sich einer IL-2-Therapie unterziehen, oft beobachtet (Rosenberg et al., 1989). Überdies, und besonders besorgniserregend, kann die IL-2-Behandlung manchmal zum Tod des Patienten rühren, wobei die Mortalitätsrate, die der IL-2- Toxizität zurechenbar ist, in einer Behandlungsstudie 1,5% betrug (Rosenberg et al., 1989).
Man glaubt, dass einer der Schlüsselmechanismen bei der IL-2-induzierten Tumorabstoßung in Krebspatienten die Induktion der Lymphokin-aktivierten Tötung (lymphokine activated killing) (LAK) ist. Man hat gezeigt, dass LAK-Zellen extrem potente tumorizide Lymphozyten sind. Im Gegensatz dazu glaubt man, dass die schädigenden toxischen Nebenwirkungen aus der Elaboration von sekundären Zytokinen, wie z. B. den Interleukinen-1 (IL-1s) und den Tumor-Nekrose- Faktoren (TNFs), resultieren.
Die Erzeugung eines Zytokins, das eine reduzierte Toxizität gegenüber menschlichen Zellen hat, würde zur Entwicklung von wirksameren Verfahren bei der klinischen Immuntherapie führen. Insbesondere wäre die Identifizierung von weniger toxischen Zytokinen, die dennoch LAK induzieren können, wichtig bei der Entwicklung von neuen therapeutischen Anti-Krebsstrategien mit weitreichenden Anwendungen. Die Identifizierung einer IL-2-Variante mit derartigen Eigenschaften wäre besonders vorteilhaft, da sie die Entwicklung eines breiteren therapeutischen Fensters für die IL-2-Behandlung erlaubte und erlauben würde, die etablierten klinischen IL-2-Dosierungen auf die heilenden Spiegel, die in Tier- Tumor-Modellen als wirksam bekannt sind, zu erhöhen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung erstrebt, einen oder mehrere dieser oder anderer Nachteile, die im Stand der Technik inhärent sind, zu überwinden, indem Verfahren zur menschlichen Immuntherapie mit reduzierten toxischen Nebenwirkungen bereitgestellt werden. Die Erfindung bezieht sich auf die Identifizierung und Selektion von Zytokinen mit niedriger Toxizität und insbesondere auf die Verwendung von erhöhten Dosierungen derartiger Zytokine bei der klinischen Immuntherapie und der Krebsbehandlung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die günstige Verwendung von Interleukin-2-Analogen (IL-2) mit niedriger Toxizität, die ihre tumoriziden Wirkungen beibehalten. Weitere Aspekte der Erfindung betreffen die Verwendung von Interleukin-2-Analogen mit niedriger Toxizität bei der Herstellung von aktivierten Zellen zur Verwendung in der adoptiven Immuntherapie.
Ein entscheidender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung, dass bestimmte humane IL-2-Analoge, insbesondere solche, die für den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität spezifisch sind, ihre tumoriziden Aktivitäten beibehalten, wohingegen sie reduzierte Toxizität aufweisen. Derartige IL-2-Analoge sind darum "IL-2-Analoge mit niedriger Toxizität", was ein Begriff ist, der hier verwendet wird, um auf ein IL-2-Analog oder eine Mutante mit Unterschieden in der Aminosäuresequenz im Vergleich zum nativen IL-2 zu verweisen, wobei das Analog eine geringere Produktion von sekundärem Zytokin als natives IL-2 induziert. Sekundäre Zytokine sind Moleküle wie z. B. die Interleukine 1 (IL-1s) und die Tumor-Nekrose-Faktoren (TNFs) und schließen zum Beispiel IL-1β, TNFα, TNFβ und IFN-γ ein.
Es wird in Betracht gezogen, dass bevorzugte IL-2-Analoge mit niedriger Toxizität zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung humane IL-2-Analoge sein werden, die eine wesentliche Bindung an den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität zeigen, aber keine wesentliche Bindung an den Il-2- Rezeptor mit hoher Affinität. Die IL-2-Rezeptoren, auf die hier Bezug genommen wird, sind die im Stand der Technik etablierten, zum Beispiel siehe Waldmann (1989). Als solcher ist der IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität ein Polypeptid mit Mr ~70-75 kD, hier p75 genannt. Der IL-2-Rezeptor mit hoher Affinität ist ein Komplex, der, neben anderen Komponenten, p75 und ein Polypeptid mit Mr ~50-55 kD (genannt p55) enthält, und dieser Rezeptor wird der p55 + p75-Komplex genannt.
IL-2-Analoge mit niedriger Toxizität können darum auch als Analoge definiert werden, die eine mutierte, oder in anderer Weise veränderte, p55-Bindungsstelle haben. Man glaubt, dass die für die Bindung von p55 wichtige Region im Allgemeinen zwischen den Resten 30-60 des IL-2-Moleküls liegt, und insbesondere innerhalb der α-Helix B, die von den Resten 33-46 gebildet wird (Sauvé et al., 1991). Noch genauer glaubt man, dass die Reste Lysin 35, Arginin 38, Phenylalanin 42 und Lysin 43 eine wichtige Rolle bei dieser Wechselwirkung spielen (Sau vé et al., 1991). Man zieht daher in Betracht, dass IL-2-Analoge mit Mutationen oder Modifikationen innerhalb dieser Gegenden, oder dieser speziellen Reste, sich als IL-2-Analoge mit niedriger Toxizität, die geeignet sind für eine erfindungsgemäße Verwendung, erweisen.
Der Begriff "wesentliche Bindung" wird verwendet, um anzuzeigen, dass IL-2 oder ein IL-2-Analog an ein gegebenes Rezeptorpolypeptid bindet, oder in anderer Weise damit funktionell wechselwirkt. Man zieht in Betracht, dass IL-2-Analoge, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, wesentlich an den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität binden werden, aber nicht an den mit hoher Affinität. Als solche werden sie an den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität auf im Wesentlichen dieselbe Art und Weise wie natives IL-2 binden. Im Gegensatz dazu glaubt man, dass nützliche Analoge eine Bindung an den Rezeptor mit hoher Affinität in der Größenordnung von zwischen etwa 1% und etwa 25%, und vorzugsweise von zwischen etwa 2% und etwa 10%, im Vergleich zu nativem IL-2, aufweisen werden.
Die Toxizität von IL-2 oder einem IL-2-Analog wird vorzugsweise bestimmt, indem man die Freisetzung von sekundären Zytokinen aus Lymphozyten als Antwort auf die Stimulation durch das IL-2-Molekül misst. Das kann erreicht werden, indem man die Mengen an verschiedenen hergestellten Zytokinen, zum Beispiel IL-1β, TNFα, TNFβ und IFN-γ mit einem beliebigen angemessenen Verfahren, wie z. B. mit ELISA oder einem Radioimmun-Assay, misst. Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung der Erfinder, dass die Verwendung von Proben von frischem menschlichem Blut, das Lymphozyten enthält, besonders vorteilhaft für die Durchführung solcher Tests ist. Man glaubt, dass sowohl die menschliche Quelle als auch der neu-isolierte Charakter derartiger Lymphozyten wichtig ist, weil dies die klinische Situation am nächsten widerspiegelt. Dementsprechend glaubt man darum, dass es bevorzugt ist, frische menschliche mononukleare Zellen oder Lymphozyten des peripheren Blutes (PBMC bzw. PBL) zu verwenden, um die Zytokin-induzierte Aktivität eines IL-2-Analogs zu analysieren.
IL-2-Analoge, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden eine geringere Zytokin-induzierende Aktivität aufweisen als natives IL-2. In bevorzugten Ausführungsformen zieht man in Betracht, dass sie eine Reduktion von 25% und 70% und vorzugsweise von 40% und 75%, im Vergleich zum nativen Molekül, aufweisen werden.
Es wird ferner in Betracht gezogen, dass IL-2-Analoge, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ihre Fähigkeit, das Lymphokin-aktivierte Töten (lymphokine activated killing) (LAK) zu stimulieren, beibehalten, da man glaubt, dass dies einer der wirksamen klinischen Mechanismen, die der IL-2- Therapie zugrunde liegen, ist. Die Fähigkeit, die Lymphokin-aktivierte Tötung zu stimulieren, wird hier als die Fähigkeit eines Lymphokins, wie z. B. ein IL-2- Analog, definiert, Lymphozyten in einen aktivierten Zustand zu versetzen, sodass sie Lymphokin-aktivierte "Killerzellen" werden und in der Lage sind. Tumorzellen zu lysieren. Man glaubt, dass die Befähigung, LAK zu induzieren, eine Eigenschaft ist, die sich aus der Bindung an den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität ergibt.
Durch Tests unter Einsatz von PBMC- oder PBL- haben die Erfinder entdeckt, dass bestimmte humane IL-2-Analoge, wie z. B. F42K (Hoffman La-Roche) zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind. F42K ist eine Phenylalanin-zu- Lysin-Mutante an der Aminosäureposition 42. Um F42K zu erzeugen, würde man Stellen-spezifische Mutagenese an der nativen IL-2-Sequenz durchführen, wie z. B. an der humanen IL-2-Sequenz, die im US-Patent 4,992,367 offenbart ist. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von IL-2-Analogen, wie z. B. F42K, wie hier beschrieben, ist das von Sauvé und Kollegen entwickelte (Sauvé et al., 1991; Collins et al., 1988; Ju et al., 1987).
Um ein derartiges/derartige IL-2-Analog(e) zu erzeugen würde man sich eine cDNA, die IL-2, vorzugsweise humanes IL-2, kodiert, beschaffen und einen Aminosäureaustausch im Protein konstruieren, indem man die DNA-Sequenz, die das IL-2-Protein kodiert, spezifisch mutiert. Dies würde man erreichen, indem man die Protein- und DNA-Sequenzen analysiert und ein Oligonukleotid entwirft, das ein spezifisch geändertes Kodon enthält, wobei das Oligonukleotid dann mit dem korrespondierenden nativen Abschnitt der DNA-Sequenz ausgetauscht werden könnte. Nachdem man den Nukleotidaustausch zum Beispiel durch Sequenzieren bestätigt, könnte die geänderte DNA verwendet werden, um die Expression des IL-2-Analogs in einer rekombinanten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle zu steuern und das IL-2-Analog könnte dann aufgereinigt werden.
Man zieht in Betracht, dass andere Analoge oder Mutanten erzeugt werden können, die auch niedrige Toxizität haben und gemäß der vorliegenden Erfindung daher nützlich sind. Um das zu erreichen, könnte man einfach ein neues IL-2- Analog erzeugen, zum Beispiel durch Stellen-spezifische Mutagenese, und dann bestimmen, ob das Analog die Kriterien für ein Analog mit niedriger Toxizität, wie sie hier aufgestellt sind, erfüllt. Das bedeutet, dass man seine Fähigkeit, im Wesentlichen an den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität, aber nicht an den IL-2- Rezeptor mit hoher Affinität zu binden, testen würde; seine Fähigkeit, LAK zu induzieren; und seine Fähigkeit, reduzierte Induktionsaktivität für sekundäre Zytokine aufzuweisen. Derartige Techniken für die Herstellung von Protein- Varianten oder -Mutanten durch Stellen-spezifische Mutagenese der kodierenden DNA-Sequenz werden dem Fachmann bekannt sein.
Alternativ dazu ist es sogar möglich, dass chemisch modifizierte IL-2-Varianten die wünschenswerten Eigenschaften der niedrigen Toxizität aufweisen. Da die Form und die Eigenschaften der Aminosäurenseitengruppen-Substituenten teilweise die Kapazität zur Wechselwirkung eines Polypeptids bestimmen, zieht man in Betracht, dass auch andere Verfahren des Änderns der Seitenkettengruppe als das Ersetzen durch Genmanipulation, nützlich sein können. Ein jedes der zahl reichen Verfahren zur chemischen Modifikation, die dem Fachmann bekannt sind, könnte darum eingesetzt werden, um ein IL-2-Analog zu erzeugen, das, wie hier offenbart, routinemäßig auf vorteilhafte Eigenschaften getestet werden könnte.
Wie weiter oben diskutiert könnten sich Analoge, die eine mutierte oder anderweitig veränderte p55-Bindungsstelle haben, als nützliche IL-2-Analoge mit niedriger Toxizität erweisen. Man zieht darum in Betracht, dass es insbesondere wünschenswert sein könnte, ein IL-2-Analog, durch entweder gentechnische oder chemische Modifikation zu erzeugen, welches (eine) Mutation(en) hat/haben, die sich innerhalb der Reste 30-60 befindet/befinden, und mehr bevorzugt, innerhalb der Reste 33-46, die die α-Helix B bilden, und noch mehr bevorzugt, innerhalb eines der Reste 35, 38,42 oder 43.
IL-2 kann aus verschiedenen Quellen mit unterschiedlichen Verfahren hergestellt werden, wie in zahlreichen US-Patenten offenbart. Diese schließen zum Beispiel die Herstellung von IL-2 aus T-Zellen, wie z. B. aus hybriden T-Zelllinien der Maus oder malignen T-Zelllinien des Menschen mit ein, wie in den US-Patenten 4,407,945 und 4,473,642 bzw. 4,401,756 offenbart. Alternativ dazu könnte die Expression von IL-2 in Säugerzellen und seine Herstellung erreicht werden, indem man den im US-Patent 4,992,367 offenbarten Verfahren folgt.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Interleukin-2-Analogs mit niedriger Toxizität in einer pharmakologisch verträglichen Form zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung des Immunsystems eines Tieres bereit. Ein bevorzugtes IL-2-Analog zur Verwendung in einem solchen Verfahren ist das IL-2- Analog F42K, da Verfahren zu seiner Herstellung klar etabliert sind. Allerdings, wie oben diskutiert, zieht man in Betracht, dass jedes IL-2-Analog, das die Kriterien für niedrige Toxizität erfüllt, verwendet werden kann.
Man zieht in Betracht, dass eine derartige Stimulierung des Immunsystems durch IL-2 -Analoge mit niedriger Toxizität besondere Nützlichkeit bei der Behandlung von humanem Krebs haben wird, und noch genauer, bei der Behandlung von humanem Nierenzellenkrebs oder einem Melanom. IL-2-Analoge mit niedriger Toxizität werden darum eine Nützlichkeit bei der humanen Therapie haben in sehr ähnlicher Weise, wie sie natives IL-2 hat, aber mit dem besonderen Vorteil, dass sie bei höheren Dosierungen verabreichbar sind.
Verschiedene Verfahren werden als für die Verabreichung der IL-2-Analogen an humane Patienten erachtet. Natürlich können sie in einer therapeutisch wirksamen Menge in jeder geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, z. B. wie sie zur Zeit für die Therapie mit dem nativen IL-2 verwendet wird. Allerdings können im Vergleich zu denen, wie sie für die native Verbindung verwendet werden, die maximalen therapeutischen Dosen eines Analogs erhöht sein. Als besonders geeignete stabile pharmazeutische Zusammensetzung wird die im US-Patent 5,037,644 beschriebene erachtet, die für die parenterale Verabreichung von IL-2 entwickelt wurde. Alternativ dazu könnten die IL-2-Analogen in einer Form mit langsamer Freisetzung verabreicht werden, zum Beispiel als Liposomenstruktur bzw. verkapselt in einer bioabbaubaren Polymermatrix, wie in den US-Patenten 4,863,740 bzw. 4,832,686 offenbart.
Falls erwünscht, könnten Zusammensetzungen mit IL-2-Analog auch in Kombination mit wirksamen Dosen von anderen therapeutischen Agenzien verabreicht werden. Zum Beispiel mit DTIC bei der Behandlung von Patienten mit malignem Melanom, wie in den US-Patenten 4,999,339 und 5,066,489 offenbart; oder mit Flavon-8-Essigsäure bei der Behandlung von Patienten mit Nierenkrebs, wie im US-Patent 5,061,488 offenbart. Auch könnten sie in Verbindung mit einem Immuntoxin, das selektiv an humane Tumorzellen bindet, wie im US-Patent 4,894,227 beschrieben, verwendet werden.
Die IL-2-Analogen könnten täglich durch kontinuierliche Infusion gegeben werden oder an abwechselnden Tagen, vielleicht während andere immuntherapeutische Agenzien an anderen Tag verabreicht werden. Die Dosen der IL-2- Analogen wären relativ zu den Dosen des nativen IL-2 erhöht. Während die Dosen erhöht werden, sollten sie natürlich genau überwacht werden, um festzustellen falls toxische Nebenwirkungen bei einer bestimmten erhöhten Dosis auftauchten. Derartige klinische und experimentelle Analysen sind dem Fachmann wohl bekannt und wären, zum Beispiel, auch verwendet worden, um die jetzige Dosis an nativem IL-2, die in der Therapie verwendet wird, zu ermitteln.
Zusätzlich zur Verwendung bei der direkten Infusionstherapie zieht man in Betracht, dass die IL-2-Analogen auch einen Nutzen in der adoptiven Immuntherapie haben werden. Die adoptive Immuntherapie ist ein Ansatz zur Krebsbehandlung, bei dem Immunzellen mit antitumoraler Reaktivität mit oder ohne andere Verbindungen in einen Tumor-belasteten Patienten überführt werden. Ein besonderer Ansatz für die adoptive Immuntherapie unter Verwendung von IL-2 und Lymphokin-aktivierten Tötungszellen (LAK) wurde im US-Patent 4,690,915 beschrieben. Es wird vorgeschlagen, dass diese Technik genauso geeignet ist für die Verwendung mit den IL-2-Analogen mit niedriger Toxizität, die hier beschrieben werden.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen darum verbesserte Verfahren zur ex vivo-Herstellung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) und deren Verwendung in der adoptiven Immuntherapie. Um in dieser Art LAK-Zellen herzustellen, würde man eine Zusammensetzung, die Lymphozyten umfasst, die mit den Lymphozyten des Tieres, das zu behandeln ist, histokompatibel sind, ex vivo in Gegenwart eines IL-2-Analogen mit niedriger Toxizität inkubieren. Man kann dann derartige LAK-Zellen verwenden, um das Immunsystem des Tieres zu stimulieren, zum Beispiel als ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, indem man dem Tier eine therapeutisch wirksame Menge der LAK-Zellen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen zur Durchführung der adoptiven Immuntherapie zieht man in Betracht, dass die Zusammensetzung, die die histokompatiblen Lymphozyten umfasst, eine Zusammensetzung ist, die mononukleare Zellen aus dem peripheren Blut enthält, die man aus dem zu behandelnden Tier erhielt. Man würde diese Zellen dann mit dem IL-2-Analog, und vorzugsweise mit F42K für eine Zeitspanne inkubieren, die ausreicht die Stimulation zu erlauben, so wie zum Beispiel drei bis vier Tage lang. Man könnte dann wünschen, die Fähigkeit der Zellen, frische Tumorzellen, aber nicht normale Zellen zu lysieren, zu testen, d. h. die Gegenwart von LAK-Aktivität zu bestätigen. Als Nächstes würde man die LAK-Zellen dem Tier oder Patienten, aus dem die Blutprobe entnommen wurde, per Infusion einbringen, oder in anderen Worten, dem autologen Tier oder Patienten. Falls erwünscht, zieht man auch in betracht, dass man zusätzlich das IL-2- Analog selbst während dieser Zeitspanne dem Tier oder Patienten verabreichen könnte.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1. TNF-α-Produktion durch PBMC als Antwort auf natives IL-2 und die IL-2-Analogen R38A (R38A ist eine Arginine-zu-Alanin-Mutante an Position 38 von IL-2) und F42K. Experiment 1.
Fig. 2. TNF-α-Produktion durch PBMC als Antwort auf natives IL-2 und die IL-2-Analogen R38A und F42K. Experiment 2.
Fig. 3. TNF-β-Produktion durch PBMC als Antwort auf natives IL-2 und die IL-2-Analogen R38A und F42K. Experiment 1.
Fig. 4. TNF-β-Produktion durch PBMC als Antwort auf natives IL-2 und die IL-2-Analogen R38A und F42K. Experiment 2.
Fig. 5. IL-1β-Produktion durch PBMC als Antwort auf natives IL-2 und die IL-2-Analogen R38A und F42K. Experiment 1, 35 Minuten.
Fig. 6. IFN-γ-Produktion durch PBMC als Antwort auf natives IL-2 und die IL-2-Analogen R38A und F42K. Experiment 1.
Fig. 7. IFN-γ-Produktion durch PBMC als Antwort auf natives IL-2 und die IL-2-Analogen R38A und F42K. Experiment 2.
Fig. 8. Kinetiken der LAK-Erzeugung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Interleukin 2 (IL-2) ist ein Zytokin, das das Immunsystem stimuliert und seine biologischen Wirkungen im Anschluss an die Bindung an spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche von Zielzellen ausübt. IL-2 hat viele biologische Wirkungen, zum Beispiel weiß man, dass es die Stimulation von aktivierten B- und T-Zellen (einschließlich zytotoxischer T-Zellen), von natürlichen Killer(NK)-Zellen und von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) induziert. Rekombinantes humanes IL-2 kann hergestellt werden wie beschrieben in den US-Patenten 4,992,367, 4,407,945, 4,473,642 und 4,401,756.
IL-2 ist mit einigem Erfolg klinisch bei der Behandlung von Nierenzellkrebs und Melanom verwendet worden, und weitere klinische Verwendungen sind derzeit in Untersuchung, wie z. B. bei der allgemeinen Normalisierung der Immunfunktionen. Allerdings hat die IL-2-Therapie beim Menschen ein großes Problem - das der Toxizität. Die nachteiligen toxischen Nebenwirkungen, die mit der IL-2- Therapie assoziiert sind, sind in der Elaboration von sekundären Zytokinen, wie z. B. den Interleukinen 1 (IL-1s) und den Tumor-Nekrose-Faktoren (TNFs), zum Beispiel IL-1β und TNF-α begründet. IL-1s und TNFs sind wohl bekannt dafür, dass sie dramatische hämodynamische Änderungen induzieren, die in den Flüssigkeitsveriagerungen und der Hypotonie, die die hauptsächlichen Begrenzungen für die Verwendung von IL-2 beim Menschen sind, resultieren. Diese Toxizität bedeutet, dass die "heilenden" Dosen, die in Tiermodellen erzielt werden, in Menschen, die nur 10% oder weniger der in Tierstudien beschriebenen optimalen Dosis tolerieren, nicht angenähert werden können.
Die Induktion des Lymphokin-aktivierten Tötens (LAK) ist einer der vorgeschlagenen Mechanismen, die bei der beobachteten Tumorabstossung bei Krebspatienten, die eine IL-2-Therapie duchlaufen, wirksam sein sollen. In der Tat sind LAK extrem potente tumoricide Lymphozyten. Es ist sowohl in humanen wie auch in Tiersystemen bekannt, dass IL-2 das LAK über das IL-2 RezeptorMolekül mit mittlerer Affinität, p75, aktiviert, und nicht über den hochaffinen p55 + p75- Komplex.
Die Identifizierung einer IL-2-Variante oder -Mutante, die ihre LAK- induzierenden Fähigkeiten beibehält, aber die eine geringere assoziierte Toxizität hat, wäre im klinischen Rahmen besonders nützlich. Im Lichte der oben diskutierten Information dachten die Erfinder, dass die Identifizierung eines IL-2- Analogen, das an den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität, aber nicht an den mit hoher Affinität, bindet, ein solches Molekül mit niedriger Toxizität bereitstellen könnte.
Die Wechselwirkung zwischen IL-2 und IL-2-Rezeptoren ist unter Verwendung von gentechnischen Methoden untersucht worden und Stellen in IL-2, die mit verschiedenen Rezeptorpolypeptiden wechselwirken, wurden bestimmt. Zum Beispiel hat man bestimmt, dass Asp-20 am NH&sub2;-Terminus von IL-2 die Bindung an den IL-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität, p75, kontrolliert (Collins et al., 1988). Eine Anhäufung von bestimmten Aminosäuren, die die Bindungsstelle von IL-2 für den IL-2-Rezeptor mit niedriger Affinität, p55, bilden, ist auch identifiziert worden (Sauvé et al., 1991). In solchen Studien hat man nachgewiesen, dass IL-2- Moleküle mit Mutationen bei Arginin 38 (→ Alanin) oder Phenylalanin 42 (→ Lysin) nicht länger an den niederaffinen Rezeptor p55 binden konnten, aber ihre Affinität für den mittleren Rezeptor p75 behielten (Sauvé et al., 1991).
Die jetzigen Erfinder untersuchten das Vermögen der IL-2-Mutanten Arg→Ala und Phe→Lys, beschrieben von Sauvé et al. (1991), LAK in Abwesenheit von Proliferation zu induzieren und die Produktion der sekundären Zytokine IL-1s, TNFs und IFN-γ zu stimulieren. Diese Studien führten zur Erhellung von vorteilhaften Eigenschaften der IL-2-Analogen, die vorher unbekannt waren. Wie hier, weiter unten, offenbart, fanden die Erfinder, dass in Studien, die mononukleare Zellen oder Lymphozyten aus frischem humanem peripherem Blut (PBMC bzw. PBL) verwendeten, diese IL-2-Analogen humane LAK aktivieren konnten, mit signifikant weniger Freisetzung von sekundären Zytokinen. Da die sekundären Zytokine das hauptsächliche Toxizitätsproblem bei der klinischen Behandlung darstellen, ist dies ein besonders wichtiges Ergebnis.
Derartige Ergebnisse sind zuvor nicht berichtet worden. In der Tat sind keine Studien dokumentiert, die irgendwelche Unterschiede bei der von diesen IL-2- Analogen verursachten Herstellung oder Freisetzung von sekundären Zytokinen, enthüllten, im Vergleich zu der, die mit nativem IL-2 beobachtet wird. In dieser Hinsicht glaubt man, dass die Wahl von frischen humanen PBMC oder PBL durch die Erfinder besonders wichtig ist, da derartige humane Zellen genau die Zelltypen repräsentieren, die bei der klinischen Antwort beteiligt sein werden.
Die IL-2-Analogen können in therapeutisch wirksamen Mengen von 1000 U/kg/Tag bis 100.000.000 U/kg/Tag in jeglicher geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, zum Beispiel die, die zur Zeit für die Therapie mit nativem IL-2 verwendet werden. Sie könnten auch in einer Form mit langsamer Freisetzung verabreicht werden, zum Beispiel als eine Liposomen struktur, oder verkapselt in einer bioabbaubaren Polymermatrix, wie in den US- Patenten 4,863,740 bzw. 4,832,686 offenbart.
Falls gewünscht, könnte die Behandlung mit IL-2-Analog mit anderen Therapien kombiniert werden, wie z. B. Radiotherapie, Chemotherapie, Operation oder mit der Verabreichung von anderen therapeutischen Agenzien, oder sogar mit Immuntoxinen. Zusätzlich zur Verwendung bei der direkten Infusionstherapie wird in Betracht gezogen, dass die IL-2-Analogen auch in der adoptiven Immuntherapie nützlich sein werden. Sie könnten verwendet werden, um die Zellen eines Patienten zu einem aktivierten Zustand in vitro zu stimulieren, und die aktivierten Zellen könnten demselben Patienten wieder verabreicht werden, um den Fähigkeiten des Körpers, Krankheiten zu bekämpfen, eine weitere Dimension hinzuzufügen.
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen. Dem Fachmann sollte offensichtlich sein, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken Techniken darstellen, die vom Erfinder als gut funktionierend bei der Anwendung der Erfindung aufgefunden wurden und darum erachtet werden kann, dass sie bevorzugte Formen für ihre Anwendung darstellen.

BEISPIEL I

BEREITSTELLUNG VON p75-SPEZIFISCHEN HUMANEN IL-2- ANALOGEN

1. Molekularbiologische Techniken

IL-2-Analoge-Proteine wurden unter Verwendung von Stellen-spezifischer Mutagenese in E. coli hergestellt, wie hier weiter unten beschrieben, und ebenso in Sauvé et al. (1991); Collins et al. (1988); und Ju et al. (1987). Man glaubt, dass das folgende Verfahren für die Herstellung eines jeden IL-2-Analogen unter Verwendung von Stellen-spezifischer Mutagenese angemessen ist. Natürlich wird das speziell hergestellte IL-2-Analoge von der Wahl des zu modifizierenden Restes und dem Design eines angemessenen Oligonukleotids abhängen.
Man zieht in Betracht, dass mit der Erzeugung eines Expressionsplasmids für die Expression von IL-2 und IL-2-Analogen, wie in Ju et al. (1987) beschrieben, Vorteile gefunden werden. IL-2-Expressionsplasmide können zum Beispiel aus den mit niedriger Kopienzahl kompatiblen Plasmid pRK24BcIts konstruiert werden, das das Gen für einen Temperatursensitiven Repressor trägt (Casadaban & Cohen, 1980). Folgend auf seine Freisetzung aus pIL2-2B (Smith et al., 1985) durch Verdau mit angemessenen Restriktionsenzymen, wie z. B. BamHI und AhaI- II, sollte ein cDNA-Insert, das für humanes IL-2 kodiert, in das Plasmid inseriert werden. Man denkt, dass es vorteilhaft ist, wenn die cDNA, die die reife IL-2- cDNA kodiert, in das Plasmid derart inseriert wird, dass sie stromabwärts des PL- Promotors ist und ein Markergen, zum Beispiel ein Tetrazyklinresistenzgen, unterbricht. Das kann unter Verwendung von Techniken der DNA-Manipulation, wie z. B. unter Einsatz der Restriktionsenzymtechnologie und der Stumpfen- Enden-Ligation (blunt end ligation) erreicht werden.
Für die in vitro-Mutagenese sollten synthetische Oligonukleotide, wie in Matteucci & Caruthers (1981) beschrieben, hergestellt werden. Die Oligonukleotide sollten in der Größenordnung von etwa 20 bis etwa 30 Nukleotide lang sein und so entworfen sein, dass sie spezifische Aminosäuresubstitutionen kodieren, d. h. sie sollten mit der nativen DNA-Sequenz übereinstimmen außer am Kodon der zu ändernden Aminosäure. Zum Beispiel würde man, um Arginin an der Position 38 zu Alanin zu ändern, das Kodon, das der Position 38 entspricht, ändern, um Alanin zu spezifizieren, d. h. es zu GCA, GCC, GCG ändern. Um Phenylalanin an der Position 42 zu Lysin zu ändern, würde man das Kodon, das der Position 42 entspricht, ändern, um Lysin zu spezifizieren, d. h. es zu AAA oder AAG ändern. Man glaubt auch, dass es vorteilhaft ist, Oligonukleotide zu erzeugen, die auch eine neue Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease einschließen, die verwendet werden kann, um die Aufnahme der mutierten Sequenz an der richtigen Stelle im IL-2-Gen zu überwachen.
Eine Modifikation des von Morinaga et al. (1984) beschriebenen Verfahrens wird als angemessene Vorgehensweise für die Stellen-spezifische Mutagenese erachtet. Das IL-2-enthaltende Plasmid sollte mit (einer) Restriktionsendonuklease(n) verdaut werden, um lineare Moleküle herzustellen und Moleküle mit Lücken, die durch Verdau mit (einer) anderen Restriktionsendonuklease(n) hergestellt wurden, die so gewählt ist/sind, um die Insertion eines neuen Oligonukleotids zu erleichtern. Die großen Fragmente eines solchen Verdaus sollten auf Agarose-Minigelen gereinigt werden und für eine jede Mutagenese sollte die lineare und die Lückenaufweisende Plasmid-DNA mit 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonukleotiden in einem kleinen Volumen (etwa 12,5 ul) eines angemessenes Puffers, wie z. B. Polymerase-Ligase-Puffer (0,1 M NaCl, 6,5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 4,5 mM MgCl&sub2;, 100 mM 2-Mercaptoethanol), gemischt werden. Die Probe sollte erhitzt werden, um die Plasmidmoleküle zu denaturieren, zum Beispiel 5 Minuten lang bei 100ºC. Die Reaktionsmischung sollte dann langsam abgekühlt werden, zum Beispiel durch 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, 30 Minuten bei 4ºC und 10 Minuten bei 0ºC, um Renaturierung der Plasmid-DNA, die Bildung von Heteroduplexmolekülen und Anlagerung (annealing) des Oligonukleotids zu erlauben.
Nach der Renaturierung sollten Nukleotide zugegeben werden, zum Beispiel 1 mM ATP und 500 um jeweils von dATP, dCTP, dGTP und TTP, zusammen mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (etwa 3 Einheiten) und T&sub4;DNA- Ligase (etwa 1 Einheit), und die Reaktion sollte inkubiert werden, zum Beispiel 2-3 Stunden lang bei 15ºC. Eine Probe der Ligationsreaktion sollte dann für die Transformation (Maniatis et al, 1982) von kompetenten E. coli Zellen verwendet werden, z. B. von MC1061 (pRK248cIts)-Zellen. Kolonien, die mutierte Plasmide enthalten, können durch Hybridisierung mit dem 5'-³²P-markierten Oligonukleotid identifiziert werden. Plasmid-DNA von positiven Kolonien kann dann nach der Miniprep-Methode (Birnboim & Doly, 1979) hergestellt werden und für eine zweite Runde Transformation und Screening verwendet werden. Plasmid-DNA von positiven sekundären Transformationen kann auf die Gegenwart der vorhergesagten neuen Restriktionsstelle, die vom Oligonukleotid kodiert wird, analysiert werden, um den korrekten Ort der Mutation zu verifizieren.
Man zieht in Betracht, dass man gewöhnlich die neue Nukleotidsequenz zu bestätigen wünscht, indem man eine Sequenzanalyse durchführt, zum Beispiel unter Verwendung der Dideoxykettenabbruchmethode, wie für doppelsträngige Plasmide modifiziert. Um eine solche Analyse durchzuführen, würde man Plasmid-DNA linearisieren und mit einem synthetischen Oligonukleotid-Primer in Polymerasereaktionspuffer (6,6 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6,6 mM MgCl&sub2;, 13 mM NaCl, 5 mM Dithiothreitol) mischen. Die Probe sollte dann durch Erhitzen bei 100ºC denaturiert werden und dann 5 Minuten lang bei 0ºC gekühlt. Zu dieser Reaktion sollte man 10 um, zum Beispiel von [α-³²P]dATP mit etwa 400 Ci/mmol und 0,01 M Dithiothreitol hinzufügen. Die Mischung sollte in vier Aliquots aufgeteilt werden, und die Aliquots für die vier Dideoxykettenabbruchsreaktionen, wie in Sanger et al., (1977) beschrieben, verwendet werden.

2. Herstellung und Reinigung von IL-2-Analogen

Bakterienzellen, die die IL-2-Analog-Expressionsplasmide enthalten, sollten bei 30ºC bis zur frühen logarithmischen Phase (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 0,5) in einem passenden Medium, wie z. B. M9-Medium (Maniatis et al., 1982) kultiviert werden. Die Kulturen sollten dann durch einen Transfer auf 42ºC für etwa 2 Stunden induziert werden, bis die OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,0 ± 0,1 ist. Die Proben der Kulturen könnten dann durch Zentrifugieren pelletiert werden, z. B. bei 12.000 · g, 1 Minute lang bei 4ºC. Aus diesen Zell-Pellets können Extrakte gemacht werden durch heftiges Vortexen und Erhitzen auf 100ºC in Laemmli-Probenpuffer (Laemmli, 1970).
Die IL-2-Analogen können mit einem jeden der vielen Verfahren, die im Stand der Technik für die Herstellung von unmodifiziertem IL-2 bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel, indem man das im US-Patent 4,992,367 für die Herstellung von humanem IL-2 offenbarte Verfahren anwendet. Alternativ dazu könnte die Anwendung des von Smith et al. (1985) beschriebenen Verfahrens gewünscht sein. Die Analogen könnten auch durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt werden unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der rekombinantes humanes IL-2 bindet, wie in Bailon et al. (1987) beschrieben. Beispiele für monoklonale Antikörper, die für rekombinantes humanes IL-2 spezifisch sind, schließen 5B1 (Bailon et al., 1987) und die in den US-Patenten 4,772,572 und R. E. 33252 (eine Wiedererteilung des US-Patents 4,473,493) offenbarten Antikörper mit ein. Falls erwünscht, könnte man die IL-2 Analogen durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS/PAGE), vorzugsweise unter Verwendung von 15% Polyacrylamidgelen, wie von Laemmli (1970) beschrieben, analysieren.

BEISPIEL II

p75-SPEZIFISCHE HUMANE IL-2-ANALOGE ERZEUGEN LYMPHOKIN-AKTIVIERTE TÖTUNG (LYMPHOKINE ACTIVATED KILLING) BEI VERMINDERTER SEKUNDÄRER ZYTOKINSEKRETION

Die folgenden rekombinanten humanen IL-2-Analogen, wie oben beschrieben erzeugt, wurden von Hoffmann-La Röche erhalten:
R38A - Arginin (R) an Position 38 → Alanin (A)
F42K - Phenylalanin (F) an Position 42 → Lysin (K)

1. Rezeptorbindung

Der IL-2-spezifische Bindungstest wurde im Wesentlichen wie von Rob et al., (1981) beschrieben durchgerührt, mit den wie folgt beschriebenen Modifikationen. Um während der Zellkultivierung anwesendes IL-2 zu entfernen, wurden Zellen einmal durch Zentrifugieren (500 · g, 5 Minuten lang) gewaschen und in Bindungspuffer (RPMI 1640, 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 25 mM Hepes, pH 7,2) resuspendiert. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert und die Waschmethode wurde dreimal wiederholt. Jeder Test enthielt etwa 6 · 10&sup5; Zellen und 40 pM ¹²&sup5;I-IL-2 (50 uCi/ug) in 0,15 ml Bindungspuffer. Nichtspezifische Bindung wurde durch Einschluss von 50 nM unmarkiertem humanem rIL-2 im Test bestimmt. Inkubationen wurden im Duplikat oder Triplikat 20 Minuten lang bei 37ºC durchgeführt. Zellgebundene Radioaktivität wurde von ungebundener Radioaktivität wie beschrieben (Kilian et al., 1986) abgetrennt und die spezifische Bindung wurde berechnet.
Für diese Analoge, R38A und F42K, durch Punkt-spezifische Mutation erstellt, wurde gefunden, dass sie ihre Fähigkeit, den IL-2-Rezeptor p75 zu binden, beibehalten, während sie minimal (10% bzw. 2%) an den hochaffinen p55 + p75- Rezeptorkomplex binden.

2. Sekundäre Zytokinherstellung

Als Nächstes wurden weitere Eigenschaften von rekombinantem humanem IL-2 und den zwei humanen IL-2-Analogen R38A und F42K analysiert. Zuerst wurden die Fähigkeiten derselben Konzentrationen von IL-2 und von den Analogen verglichen, mononukleare Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells) zur Sekretion von IL-1β und TNF-α in vitro zu stimulieren. Bis zu 7 Tage lang wurden mit 24 Stunden-Intervallen die Überstände der LAK-Kultur aus dem oben beschriebenen Experiment gesammelt und auf den IL-1β und TNF-α- Gehalt unter Verwendung von ELISA-Methodik getestet. Im Handel erhältliche ELISA-Kits wurden von R&D-Systems (TNF-α und TNF-β), Immunotec (IL-1α und IL-1β) und Endogen (IFN-γ) erworben. Die ELISAs wurden gemäß den vom Hersteller gelieferten Protokollen durchgeführt.
Sowohl IL-1β als auch TNF-α waren signifikant erniedrigt (p < 0,05, 3-Weg- ANOVA) bei allen Zeitpunkten bei der Verwendung des Analogs F42K im Vergleich zu dem, das als Antwort auf natives IL-2 hergestellt wurde. Die IL-1β- Sekretion verminderte sich um bis zu 43% (F42K) und 28% (R38A), und TNF-α verminderte sich sogar um 77% (F42K) und 66% (R38A).

3. LAK-Erzeugung

Als Nächstes wurden die Fähigkeiten von optimalen Konzentrationen von IL-2 und den Analogen verglichen, mononukleare Zellen des peripheren Bluts (peripheral blood mononuclear cells) zur Erzeugung von Lymphokin-aktivierter Tötung (lymphokine activated killing) (LAK) in vitro zu stimulieren.
Frische mononukleare Zellen des peripheren Blutes (PBMC), erhalten aus Leukopharese von normalen humanen Spendern, wurden über einem Ficoll-Hypaque- Gradienten isoliert. Diese Zellen wurden in Kultur gebracht unter Verwendung des Serumfreien Mediums AIM V (Gibco), ergänzt mit entweder 0,5 nM nativem rekombinantem IL-2 oder 1 nM von einer der IL-2-Mutanten, R38A oder F42K. Nicht-adhärente Zellen wurden auf Zytotoxizität gegen Daudi-Ziele (Daudi targets) getestet mit einem 4-stündigen &sup5;¹Cr-Freisetzungstest, wobei spezifische Lyse als das Mittel von drei Werten dargestellt ist. Zell-freie Überstände von 3-tägigen PBMC-Kulturen wurden mit einem ELISA auf den Zytokin-Gehalt analysiert. Diese Daten werden als das Mittel von zwei Werten dargestellt und sind für zwei durchgeführte Experimente repräsentativ.
Die Erzeugung von LAK, wie durch den &sup5;¹Cr-Zytotoxizitätstest gegen Daudi- Ziele bestimmt, war signifikant, allerdings leicht erniedrigt für beide Analoge im Vergleich zu nativem IL-2, wie unten gezeigt:

% maximale spezifische Lyse 100 : 1 Effektor : Ziel-Verhältnis

natives IL-2: 62
R38A: 55
F42K: 54
Die Kinetiken der LAK-Aktivierung waren auch identisch, wobei onkolytische Aktivität zuerst am Tag 3 festgestellt wurde und an den Tagen 3-7 einen Höhepunkt erreichte (Fig. 8).

4. FACS-Analvsen

PBMC aus Kultur wurden mit PBS, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid gewaschen. Zu etwa einer Million Zellen wurde der FITC-markierte monoklonale Antikörper gegen den IL-2-Rezeptor p55 oder ein nicht-spezifischer Kontroll-Maus-IgG (Becton-Dickinson) gegeben. Einer 30-minütigen Inkubation folgend wurden die Zellen zweimal unter Verwendung eines Sorvall Cell Washer 2L gewaschen, dann in PBS und 1% Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen wurden dann auf einem Becton-Dickinson FACScan analysiert und die Ergebnisse wurden als Prozent der Zellen im Tor (gated cells), die nach Subtraktion der nicht- spezifischen Hintergrundfluoreszenz positiv für p55 sind, dargestellt.
In der FACS-Analyse verdoppelte sich die Prozentzahl der Zellen, die p55 exprimieren (30% vs. 15%) in Kulturen, die 72 Stunden lang mit F42K stimuliert worden waren, aber nicht bei R38A oder nativem IL-2, was auf einen differenziellen Abwurf (shedding) und/oder Intemalisierung des p55-Rezeptors hinweist. Die oben präsentierten Daten weisen auf das Potenzial der erfindungsgemäßen IL- 2-Analogen, wie z. B. F42K, als wertvolle Alternativen zum nativen IL-2 in Immuntherapieanwendungen hin. Die Beibehaltung der Induktion von LAK- Aktivität, gekoppelt mit der Reduktion von sekundärer Zytokinherstellung, zeigen zum ersten Mal, dass diese Analogen wahrscheinlich ein wirksames, doch weniger toxisches Mittel der Krebsimmuntherapie bereitstellen würden.

BEISPIEL III

IMMUNTHERAPIE-PROTOKOLLE

Man glaubt, dass die hier offenbarten IL-2-Analogen in all den Behandlungsanwendungen beim Menschen von Nutzen sind, bei denen IL-2 zur Zeit verwendet wird. Überdies wird die Verwendung von Analogen wie z. B. F42K eine merkliche Weiterentwicklung bei derartigen Behandlungsprotokollen darstellen, da die Dosen erhöht werden können, ohne dass die zur Zeit mit der IL-2-Behandlung beobachteten toxischen Nebenwirkungen erzeugt werden. Man zieht in Betracht, dass die IL-2-Analogen bei der Behandlung von verschiedenen Tumoren und insbesondere bei der Behandlung von Patienten mit Nierenzellenkrebs oder Melanom nützlich sein werden. Sie mögen auch einen Nutzen bei der Normalisierung der Immunantwort eines Patienten haben, wie im US-Patent 4,908,433 beschrieben.
Für die Verwendung bei der humanen Behandlung können die IL-2-Analogen als pharmazeutische Zusammensetzungen genau wie natives IL-2, aber mit steigenden Dosen, verabreicht werden. Geeigneterweise wird ein Arzneimittel formuliert, das die Verabreichung des Arzneistoffes in einer Menge von 1000 U/kg/Tag bis 10&sup8; U/kg/Tag erlaubt. Falls erwünscht, könnten Zusammensetzungen mit dem IL- 2-Analogen in Kombination mit wirksamen Dosen von anderen therapeutischen Agenzien verabreicht werden. Zum Beispiel mit DTIC zur Behandlung von malignem Melanom, wie in den US-Patenten 4,999,339 und 5,066,489 offenbart; oder mit Flavon-8-Essigsäure für die Behandlung von Nierenkrebs, wie im US- Patent 5,061,488 offenbart.
Die Antitumoraktivität in Menschen könnte auch erhöht werden, indem man eine pharmakologisch wirksame Menge eines IL-2-Analogen und ein Immuntoxin, das selektiv an menschliche Tumorzellen bindet, wie im US-Patent 4,894,227 beschrieben, verabreicht. Man glaubt, dass das besonders nützlich für die therapeutische Behandlung von Eierstock- und Brustkrebsen und Melanomen wäre, wo die Zahl an selektiven Tumormarkem und spezifischen Immuntoxinen relativ groß ist.
Die IL-2-Analogen könnten täglich durch kontinuierliche Infusion gegeben werden oder an abwechselnden Tagen, wobei vielleicht andere immuntherapeutische Agenzien an dem anderen Tag verabreicht werden. Die Dosen der IL-2-Analogen wären relativ zu den Dosen an nativem IL-2 erhöht. Während die Dosen erhöht werden, sollten sie natürlich genau überwacht werden, um festzustellen, falls toxische Nebenwirkungen bei einer bestimmten erhöhten Dosis auftauchten. Solche klinischen und experimentellen Analysen sind dem Fachmann wohl bekannt, wie die Bestimmung der Dosis, die zur Zeit bei der IL-2-Therapie verwendet wird, beispielhaft zeigt.
Man zieht in Betracht, dass die IL-2-Analogen mit einer jeden der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Zeit im Stand der Technik für die Herstellung zur menschlichen Verabreichung bekannt sind, kombiniert werden könnten. Man glaubt, dass Vorteile gefunden werden, die stabilen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die insbesondere für die parenterale Verabreichung von IL- 2 entwickelt wurden, wie im US-Patent 5,037,644 offenbart, zu verwenden. In solchen Zusammensetzungen ist eine therapeutisch wirksame Menge von IL-2 in einem wässrigen, inerten Carrier-Medium gelöst, das einen oder mehrere biokompatible nicht-ionische polymere Detergenzien, die als Lösungsvermittler und/oder Stabilisierer für IL-2 dienen, umfasst. Geeignete biokompatible nicht-ionische polymere Detergenzien schließen zum Beispiel Octylphenoxypolyethoxyethanol- Verbindungen, Polyethylen, Glykolmonostearat-Verbindungen; und Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester ein.
Alternativ könnte IL-2 in einer Form verabreicht werden, die für seine langsame Freisetzung gestaltet ist. Zum Beispiel als eine Liposomenstruktur mit Phospho lipiden und/oder Steroidlipiden, wie im US-Patent 4,863,740 offenbart. Oder ansonsten formuliert innerhalb einer biokompatiblen, bioabbaubaren Polymermatrix, wie z. B. einer Kollagen- oder Albuminmatrix, oder einem Polymer oder Copolymer der Milchsäure, eines Lactids, eines Glycolids oder von Glutaminsäure, wie im US-Patent 4,832,686 beschrieben. Im letzteren Fall könnte die IL-2-Kapsel mit langsamer Freisetzung sogar geformt werden und implantiert werden, um in eine Stelle zu passen, aus der malignes Gewebe entfernt worden war.
Zusätzlich zur Verwendung in der direkten Infusionstherapie zieht man in Betracht, dass die IL-2-Analogen auch in der adoptiven Immuntherapie nützlich sein werden. Die adoptive Immuntherapie ist ein Ansatz zur Behandlung von Krebs, bei dem Immunzellen mit Antitumorreaktivität in den Tumor-belasteten Patienten transferiert werden, siehe Rosenberg et al. (1977) und Rosenberg (1974). Es wurde gezeigt, dass natives IL-2 ein nützlicher Hilfsstoff für die adoptive Immuntherapie ist, worin es verwendet wird, um die Entwicklung von Killer-T-Zellen zu stimulieren (Rosenberg, 1985). Überdies hat die adoptive Therapie unter Verwendung von IL-2 ihre Einsatzfähigkeit bei der Behandlung einer Vielzahl von fortgeschrittenen metastatischen Krebsen bei Menschen gezeigt (Rosenberg et al., 1985).
Dementsprechend wird vorgeschlagen, dass die IL-2-Analogen mit niedriger Toxizität, wie hier offenbart, in einem Protokoll für adoptive Immuntherapie verwendet werden können in einer Art und Weise, die dem nativen Molekül ähnlich ist. Man zieht in Betracht, dass die folgenden Protokolle in der Verwendung von IL-2-Analogen bei adoptiven Immuntherapiemethoden nützlich sind.
So kann eine vereinfachte Vorgehensweise vorgenommen werden: ernte frische humane mononukleare Zellen des peripheren Bluts oder Lymphozyten (PBMC bzw. PBL), zum Beispiel durch Zellauftrennung unter Verwendung eines IBM- Zellauftrenners und akzeptierten Techniken. Als Nächstes inkubiere diese Zellen über Nacht mit den IL-2-Analogen und bringe dann die induzierten Zellen lang sam und kontinuierlich per Infusion in die Patienten ein. Eine solche Therapie könnte zunächst 2 bis 3 Mal pro Woche gegeben werden. Allerdings könnte sie vielleicht zu selteneren Intervallen, die sich über einen viel längeren Zeitraum ausdehnen, gegeben werden, um sicherzustellen, dass eine Infiltration in den Tumor stattfindet.
Ein ähnlicher Ansatz für die adoptive Immuntherapie bei Patienten mit einem anderen Krebs als Sarkoma ist detaillierter im US-Patent 4,690,915 beschrieben worden. Diese Technik verwendet humanes IL-2 und Lymphokin-aktivierte Killerzellen (lymphokine activated killing cells) (LAK) und es wird vorgeschlagen, dass diese Methodologie besonders angemessen für die Verwendung mit IL-2- Analogen mit niedriger Toxizität wäre. Um ein solches Verfahren durchzuführen, würde man mononukleare Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells) mit dem IL-2-Analog, zum Beispiel drei bis vier Tage lang, inkubieren. Man würde dann die Fähigkeit der resultierenden LAK-Zellen testen, frische Tumorzellen, aber nicht normale Zellen, zu lysieren. Die LAK-Zellen würden dann in den autologen Patienten per Infusion eingebracht, vorzugsweise gemeinsam mit der intravenösen Verabreichung des Analogs selbst, alle 8 Stunden oder so. Man zieht ferner in Betracht, dass Patienten bis zu 90 Dosen des IL-2- Analogen und von 2,8 bis 12,6 · 1010 aktivierte Zellen erhalten können.

QUELLENANGABEN

Die folgenden Quellenangaben werden hier ausdrücklich durch die Quellenangabe inkorporiert, insoweit sie beispielhafte Verfahrens- oder andere Details zusätzlich zu denen, die hier ausgeführt sind, zur Verfügung stellen.
Bailon et al., BioTechnology, 5: 1195, 1987.
Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 7: 1513, 1979.
Casadaban & Cohen, J. Mol. Biol., 138: 179, 1980.
Collins et al., Proc. Natl. Acad. Bei. U.S.A., 85: 7709-7713, 1988.
Cosman et al., Nature, 312: 768-771, 1984.
Gillis et al., J. Immunol., 124: 1954, 1980.
Grimm et al., J. Exp. Med, 155: 1823, 1982.
Hatakeyama et al., Science, 244: 551-556, 1989.
Herrmann & Diamantstein, Eur. J. Immunol., 18: 1051-1057, 1988.
Ju et al., J. Biol. Chem., 262: 5723-5731, 1987.
Kilian et al., J. Immunol., 137: 1538,1986.
Laemmli, Nature, 227: 680, 1970.
Leonard et al., Nature, 311: 626-631, 1984.
Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N. Y. 1982.
Matteucci & Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103: 3185, 1981.
Mazumder & Rosenberg, J. Exp. Med., 159: 495, 1984.
Mingari et al., Nature, 312: 641, 1984.
Morgan et al., Science, 193: 1007, 1976.
Morinaga et al., Bio/Technology, 636, 1984.
Nikaido et al., Nature, 311: 631-635, 1984.
Ortaldo et al., J. Immunol., 133: 779, 1984.
Robb et al., J. Exp. Med, 154: 1455, 1981.
Rosenberg et al., Adv. Cancer Res., 25: 323, 1977.
Rosenberg, Cancer Treat. Rep., 68: 233, 1984.
Rosenberg et al., Science, 223: 1412, 1984.
Rosenberg, J. Natl. Cancer Instl, 75: 595, 1985.
Rosenberg et al. N. Eng. J. Med., 313: 1485, 1985.
Rosenberg et al., Arm. Surg., 210(4): 474, 1989.
Ruscetti et al., J. Immunol., 119: 131, 1977.
Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Bei. U.S.A., 74: 5463, 1977.
Sauvé et al., Proc. Natl. Acad. Bei. U.S.A., 88: 4636, 1991.
Smith et al., Proc. Natl. Acad. Bei. U.S.A., 82: 8404, 1985.
Taniguchi et al., Nature, 302: 305, 1983.
Waldmann, Annu. Rev. Biochem., 58: 875-911, 1989.

Claims

1. Verwendung eines Interleukin-2 -Analogen mit niedriger Toxizität zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung des Immunsystems eines Tiers, wobei das Interleukin-2-Analoge eine wesentliche Bindung an den Interleukin-2-Rezeptor mit mittlerer Affinität zeigt, aber keine wesentliche Bindung an den Interleukin-2-Rezeptor mit hoher Affinität.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Interleukin-2-Analoge eine Aminosäure-Substitution oder -Modifikation innerhalb der α-Helix B besitzt, die durch Reste 33-46 gebildet wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Interleukin-2-Analoge mit niedriger Toxizität F42K ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Arzneimittel für die parenterale Verabreichung formuliert ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Interleukin-2-Analoge in einem bioabbaubaren Polymer oder einer Kapsel mit langsamer Freisetzung verkapselt ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Interleukin-2-Analoge in einem Liposom verkapselt ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-6, wobei das Arzneimittel so formuliert ist, dass es die Verabreichung in einer Menge von 1000 U/kg/Tag bis 100.000.000 U/kg/Tag erlaubt.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das Arzneimittel für die Behandlung von Krebs vorgesehen ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Arzneimittel für die Behandlung von Nierenzellkrebs oder einem Melanom vorgesehen ist.

10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1-9, wobei das Arzneimittel für die Verabreichung an einen menschlichen Patienten angepasst ist.

11. Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen zur Verwendung in der adoptiven Immuntherapie eines Tieres, wobei die Verbesserung das Inkubieren einer Zusammensetzung umfasst, die Lymphozyten umfasst, die mit den Lymphozyten des Tieres, das ex vivo in Gegenwart eines Interleukin-2-Analogen mit niedriger Toxizität zu behandeln ist, histokompatibel sind, wobei das Analoge eine wesentliche Bindung an den IL- 2-Rezeptor mit mittlerer Affinität, aber keine wesentliche Bindung an den IL- 2-Rezeptor mit hoher Affinität.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Interleukin-2-Analoge eine Aminosäuresubstitution oder -modifikation innerhalb der α-Helix B, die durch die Reste 33-46 gebildet wird, besitzt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Interleukin-2-Analoge mit niedriger Toxizität F42K ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, wobei das Interleukin-2-Analoge in einem bioabbaubaren Polymer oder einer Kapsel mit langsamer Freisetzung verkapselt ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, wobei das Interleukin-2-Analoge in einem Liposom verkapselt ist.