DE69520088T2

DE69520088T2 - Interferon-gamma-induzierendes Polypeptid monoklonal Antikörper, und Zusammensetzung für Interferon-gamma gebunden Krankheiten

Info

Publication number: DE69520088T2
Application number: DE69520088T
Authority: DE
Inventors: Shimpei Okayama-shi Ushio; Kakuji Kurashiki-shi Torigoe; Tadao Okayama-shi Tanimoto; Haruki Ibaraki-shi Okamura; Toshio Okayama-shi Kunikata; Mutsuko Okayama-shi Taniguchi; Keizo Akaiwa-gun Kohno; Shigeharu Okayama-shi Fukuda; Masashi Okayama-shi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-11-15
Filing date: 1995-11-10
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2015-11-11
Also published as: TW581771B; AU3779695A; TW464656B; CA2162353C; DE69520088D1; EP0712931B1; EP0962531A2; DK0712931T3; EP0712931A2; DK0962531T3; AU700948B2; EP0962531A3; DK0712931T4; EP0712931A3; ES2329099T3; EP0962531B1; DE69535989D1; ES2156199T3; EP0712931B2; DE69520088T3

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, das die Interferon-γ (im folgenden abgekürzt als "IFN-γ") Produktion durch immunkompetente Zellen induziert, einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für das Polypeptid und ein Mittel bzw. Agens für assoziierte Krankheiten, welches das Polypeptid als einen wirksamen Bestandteil aufweist.
Beschreibung des Standes der Technik
IFN-γ ist ein Protein, das antivirale, antionkotische und immunregulatorische Eigenschaften aufweist und das durch immunkompetente Zellen, die mit Antigenen oder Mitogenen stimuliert wurden, produziert wird. Aufgrund dieser biologischen Eigenschaften wurde von IFN-γ seit seiner Entdeckung angenommen, daß es als Antitumoragens verwendet werden kann, und es wurde intensiv in klinischen Versuchen als ein therapeutisches Agens für maligne Tumoren im allgemeinen, einschließlich Gehirntumoren untersucht. IFN-γ Präparationen, die heute kommerziell erhältlich sind, können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden, d. h. natürliche IFN-γ, die durch immunkompetente Zellen produziert werden und rekombinante IFN-γ, die durch Transformanten produziert werden, welche hergestellt wurden durch das Einführen von DNAs, welche die natürlichen IFN-γ kodieren, in Mikroorganismen der Spezies Escherichia coli. In den oben genannten klinischen Versuchen werden diese beide IFN-γ als "exogenes IFN-γ" an Patienten verabreicht.
Bei diesen IFN-γ werden die natürlichen IFN-γ normalerweise gebildet durch das Kultivieren von etablierten immunkompetenten Zellen in Nährkulturmedium, das mit IFN-γ induzierenden Substanzen für die IFN-γ Bildung ergänzt ist, und das Reinigen der gebildeten IFN-γ. Es ist bekannt, daß die Art der IFN-γ indu zierenden Substanzen einen starken Einfluß ausübt auf die IFN-γ Ausbeute, die Möglichkeit der IFN-γ Reinigung und die Sicherheit des Endprodukts. Im allgemeinen werden Mitogene wie Concanavalin A (Con A), Lens culinaris, Phytolacca americana, Endotoxin und Lipopolysaccharide verwendet. Diese Mitogene weisen jedoch Probleme auf hinsichtlich ihrer molekularen und qualitativen Verschiedenheit, die abhängig ist von ihrer Herkunft und den Reinigungsmethoden; außerdem weisen sie die Schwierigkeit auf, sie in der gewünschten Menge und mit einer konstanten IFN-γ Induktionsfähigkeit zu erhalten. Außerdem induzieren die meisten dieser Mitogene unerwünschte Nebenwirkungen wenn sie lebenden Körpern verabreicht werden, einige von ihnen sind sogar giftig. Daher bereitet es erhebliche Schwierigkeiten die IFN-γ Produktion durch die direkte Verabreichung solcher Mitogene an lebende Körper zu induzieren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben durch ihre Forschungen an Zytokinen, die durch Säugetierzellen gebildet werden in der Mäuseleber eine Substanz gefunden, welche die IFN-γ Produktion induziert. Sie isolierten die Substanz unter Verwendung einer Vielzahl von Reinigungsmethoden, welche die Säulenchromatographie als eine Haupttechnik umfaßte, sie studierten die Eigenschaften und Merkmale und zeigten, daß die Substanz ein Protein mit den folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften ist:

(1) Molekulargewicht Es wurde ein Molekulargewicht von 19.000 ± 5.000 Daltons in einer Sodium-Dodecyl-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gezeigt;
(2) Isoelektrischer Punkt (pI) Es wurde ein isoelektrischer Punkt von 4,8 ± 1,0 in einer Chromatofokusierung gezeigt;
(3) Teilweise Aminosäuresequenz Es weist die teilweise Aminosäuresequenzen in SEQ ID NOs : 4 und 5 auf; und
(4) Biologische Aktivität Es induziert die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen.

Es kann daraus geschlossen werden, daß die Substanz eine neue Substanz ist, weil kein Protein mit diesen physikalisch chemischen Eigenschaften bekannt ist. Die Erfinder setzten ihre Studien an Mäuseleberzellen fort und haben gefunden, daß die DNA dieser Substanz aus 471 Basenpaaren besteht und die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 kodiert.
SEQ ID NO: 3:
Aufbauend auf diese Befunde haben die Erfinder ihre Studien an menschlichen Leberzellen weiter fortgesetzt, und sie haben eine DNA erhalten, die für eine weitere neue Substanz kodiert, welche die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert. Sie zeigten, daß die Substanz ein Polypeptid ist, und sie entschlüsselten seine DNA, wobei sie herausfanden, daß sie eine Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 besitzt.
SEQ ID NO: 1
Sie führten die DNA in Escherichia coli ein, um das Polypeptid zu exprimieren und um es in der Kultur in einer beachtlich hohen Ausbeute zu produzieren.
Wie oben beschrieben, besitzt das Polypeptid die Eigenschaft die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen zu induzie ren, und es wird angenommen bzw. erwartet, daß es in einer Vielzahl von Bereichen als IFN-γ induzierende Substanz, als antivirales Agens, als Antitumoragens, als antibakterielles Agens, als immunregulatorisches Agens und als Blutplättchenverstärkendes Agens verwendet werden kann. Im allgemeinen wird die Entwicklung von Verfahren zur effizienten Reinigung biologisch aktiver Polypeptide hin zu solchen mit einer relativ hohen Reinheit und zum gleichzeitigen Testen vieler Proben unausweichlich benötigt, wenn die Polypeptide in Arzneimittel eingebracht werden sollen. Obwohl das geeignetste Material, welches diese Reinigung und Tests erlaubt, ein monoklonaler Antikörper ist, existiert kein spezifischer für das Polypeptid, das erhalten wurde.
Kürzlich wurden einige Arzneimittel, die als einen aktiven Bestandteil Zytokine wie Interferon-α, Interferon-β TNF-α, TNF-β, Interleukin 2 und Interleukin 12 sowie IFN-γ enthalten, entwikkelt und andere werden bezüglich ihrer tatsächlichen Verwendung untersucht. Die Arzneimittel können als Antitumoragens, antivirales Agens, Antiseptikum und immunregulatorisches Agens verwendet werden und, falls notwendig, können sie zusammen mit anderen Medikamenten verwendet werden.
Im Gegensatz zu chemisch synthetisierten Arzneimitteln besitzen die genannten Arzneimittel als das größte Kennzeichen das Merkmal, daß sie Patienten für eine relativ lange Zeitspanne verabreicht werden können, ohne ernsthafte Nebenwirkungen zu induzieren, aber sie besitzen den Nachteil, daß ihre therapeutischen Wirkungen für gewöhnlich relativ gering sind und sie Krankheiten nicht wesentlich lindern oder heilen konnten, wenn sie alleine verwendet wurden, wobei starke Schwankungen in Abhängigkeit von der Art der Krankheiten und der zu behandelnden Symptome auftraten. Daher werden solche Arzneimittel heute als ergänzendes Agens zu chemisch synthetisierten Agenzien bei der Behandlung von schweren Erkrankungen wie malignen Tumoren oder als Mittel zur Verlängerung des Lebens des Patienten verwendet.
Zusammenfassung der Erfindung
In Anbetracht des Gesagten ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein neues Polypeptid zur Verfügung zu stellen, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine DNA, die für das Polypeptid kodiert, zur Verfügung zu stellen.
Ferner ist es Ziel der vorliegenden Erfindung, eine vermehrungsfähige rekombinante DNA, welche die DNA und einen selbst vermehrungsfähigen Vektor enthält, zur Verfügung zu stellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung eine Transformante zur Verfügung zu stellen, die erhalten wird durch das Einführen der rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids unter Verwendung der Transformante zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für das Polypeptid, zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Hybridom, das die Fähigkeit besitzt, den monoklonalen Antikörper zu bilden, zur Verfügung zu stellen.
Es ist weiterhin Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers zur Verfügung zu stellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Reinigungsverfahren für die Reinigung des Polypeptids unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein Nachweisverfahren für das Testen des Polypeptids unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein pharmazeutisches Agens für IFN-γ assoziierte Krankheiten zur Verfügung zu stellen.
Das erste Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein Polypeptid humanen Ursprungs, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert und die vollständige Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt oder einen Teil der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, umfaßt, wobei der Teil wenigstens die ersten zehn Aminosäuren, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, umfaßt (wobei das Symbol "Xaa" "Isoleucin" oder "Threonin" bedeutet).
Das zweite Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch eine DNA, die das Polypeptid kodiert.
Das dritte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch eine vermehrungsfähige rekombinante DNA, welche die DNA und einen selbst vermehrungsfähigen Vektor enthält.
Das vierte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch eine Transformante, erhältlich durch das Einführen der vermehrungsfähigen rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt.
Das fünfte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, welches das Einführen der rekombinanten DNA in einen Wirt, das Kultivieren der Transformante in einem Nährkulturmedium und das Gewinnen des gebildeten Proteins aus der resultierenden Kultur umfaßt.
Das sechste Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für ein Polypeptid humanen Ursprungs, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert und die vollständige Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt oder einen Teil der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt umfaßt, wobei der Teil wenigstens die ersten zehn Aminosäuren, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, umfaßt (wobei das Symbol "Xaa" "Isoleucin" oder "Threonin" bedeutet).
Das siebte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein Hybridom, das fähig ist den monoklonalen Antikörper zu produzieren.
Das achte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers umfassend das Kultivieren des Hybridoms, das fähig ist, den Antikörper in vitro, d. h. in Nährkulturmedium oder in vivo, d. h. im Körper eines Tieres zu bilden und Gewinnen des Antikörpers aus der resultierenden Kultur oder der Körperflüssigkeit.
Das neunte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein Reinigungsverfahren für das Polypeptid umfassend das Zusammenbringen des monoklonalen Antikörpers mit einer Mischung, die das Polypeptid und Verunreinigungen enthält, um das Polypeptid zu adsorbieren und das Desorbieren des Polypeptids von dem Antikörper.
Das zehnte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein Verfahren zum Nachweis des Polypeptids umfassend das Zusammenbringen von Proben mit dem monoklonalen Antikörper, um sie immunologisch reagieren zu lassen.
Das elfte Ziel der vorliegenden Erfindung wird erreicht durch ein pharmazeutisches Agens, welches das Polypeptid als einen wirksamen Bestandteil aufweist.
Die Erfindung wird jetzt nur exemplarisch detaillierter beschrieben, unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
1 ein HPLC Elutionsmuster eines Peptidfragments zeigt, das erhalten wurde durch Trypsinieren eines Proteins aus Mäuseleber.
2 eine Abbildung der Struktur der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA pHIGIF zeigt.
3 eine Abbildung der Struktur der rekombinanten DNA pKGFHH2 zeigt.

4 eine Abbildung des Western Blots zeigt, welche die Reaktivität des erfindungsgemäßen gereinigten Polypeptids und humanen Interleukins 12 mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper H-1mAb zeigt.

HIGIF cDNA:	cDNA, die das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert
KGFHH2 cDNA:	cDNA, die das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert
Ptac:	tac Promotor
rrnBT1T2:	Terminator des Ribosom RNA Operons
GST:	Glutathion-S-Transferase-Gen
AmpR:	Ampicillinresistenzgen
pBR322ori:	Replikationsinitiationsstelle von Escherichia coli

Wie bereits oben beschrieben, besitzt das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz, die von jener herkömmlicher Polypeptide abweicht, und es induziert die IFN-γ Produktion wenn es alleine oder zusammen mit einem Kofaktor auf immunkompetente Zellen einwirkt.
Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids durch das Einführen der DNA in einen selbst vermehrungsfähigen Vektor, wodurch eine rekombinante DNA gebildet wird, und das herkömmliche Einführen der rekombinanten DNA in einen Wirt, der die Fähigkeit besitzt, ohne Schwierigkeiten zu proliferieren, aber der nicht fähig ist, das Polypeptid zu produzieren.
Gewöhnlicherweise exprimiert die vermehrungsfähige rekombinante DNA gemäß der vorliegenden Erfindung die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids durch ihre Einführung in einen Wirt, der die Fähigkeit besitzt ohne Schwierigkeiten zu proliferieren, der aber nicht die Fähigkeit besitzt, das Polypeptid zu produzieren.
Die Transformante produziert das erfindungsgemäße Polypeptid wenn sie kultiviert wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird direkt in der gewünschten Menge erhalten wenn die Transformante gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert wird.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden eines neuen Polypeptids, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert. Während Studien an Zytokinen, die durch Säugetierzellen produziert werden, haben die Erfinder nachgewiesen, daß in der Mäuseleber ein neues Protein existiert, das die Fähigkeit besitzt, die IFN-γ Produktion zu induzieren. Sie isolierten das Protein unter Verwendung von zwei oder mehreren Reinigungsverfahren umfassend hauptsächlich die Säulenchromatographie, und sie bestimmten einen Teil der Aminosäuresequenz. Basierend auf der Sequenz synthetisierten sie chemisch einen Primer, wobei sie als Matrize bzw. "template" eine mRNA isoliert aus Mäuseleberzellen verwendeten, und sie unterwarfen das Protein einer reversen Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) in Gegenwart des Primers, um DNA-Fragmente, die das Protein teilweise kodieren, zu gewinnen. Unter Verwendung der DNA-Fragmente als Sonde studierten sie intensiv eine cDNA Bibliothek, die alternativ aus der mRNA hergestellt wurde, und sie erhielten ein DNA-Fragment, das aus 471 Basenpaaren besteht und die Basensequenz von SEQ ID NO: 3 besitzt. Das Entschlüsseln der Basensequenz zeigte, daß das Protein, das aus Mäuseleber isoliert wurde, aus 157 Aminosäuren besteht und die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 besitzt, wobei das Symbol "Xaa" "Methionin" oder "Threonin" bedeutet.
Aufbauend auf diese Befunde untersuchten die Erfinder die mRNA weiter, die aus menschlichen Leberzellen gewonnen wurde, und sie haben dabei gefunden, daß ein neues Gen existiert, das ein Polypeptid kodiert, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert. Das Gen besitzt die Basensequenz in SEQ ID NO: 2, und ihre Entschlüsselung zeigte, daß sie ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 besitzt, wobei das Symbol "Xaa" "Isoleucin" oder "Threonin" bedeutet.
SEQ ID NO: 2:
Die Techniken, die verwendet wurden um die Aminosäuresequenz und die Basensequenz in SEQ ID NOs: 1 und 2 zu offenbaren, sind im folgenden zusammengefaßt:

(1) Ein Protein, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert, wurde aus Mäuseleberzellen isoliert und stark aufgereinigt, wofür herkömmliche Reinigungsverfahren umfassend die Chromatographie als eine Haupttechnik, kombiniert wurden;
(2) das resultierende gereinigte Protein wurde mit Trypsin verdaut, zwei Polypeptidfragmente wurden aus der resultierenden Mischung isoliert, und ihre Aminosäuresequenz wurde bestimmt;
(3) aus Mäuseleberzellen wurde eine mRNA gewonnen und als "template" der reversen Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unterworfen, wobei DNA Fragmente in Gegenwart eines Oligonucleotids als Primer, der basierend auf der oben erwähnten partiellen Aminosäuresequenz chemisch synthetisiert wurde, erhalten wurden. Die Fragmente wurden gescreent und unter Verwendung eines Oligonucleotids als Sonde, die, basierend auf diesen partiellen Aminosäuresequenzen chemisch synthetisiert wurde. Anschließend wurde ein DNA Fragment, das teilweise das Protein kodiert, gewonnen;
(4) eine cDNA Bibliothek wurde markiert und mit der resultierenden cDNA Bibliothek, die mit der mRNA als "template" hergestellt wurde, hybridisiert. Anschließend wurde eine Transformante, die eine starke Hybridisierung zeigte, ausgewählt;
(5) eine cDNA wurde aus der Transformante isoliert und die Basensequenz wurde bestimmt und entschlüsselt. Der Vergleich der entschlüsselten Aminosäuresequenz mit der partiellen Aminosäuresequenz zeigte, daß das Protein die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 besitzt und, in Mäusen, die Basensequenz in SEQ ID NO: 3 die Aminosäuresequenz kodiert;
(6) ein DNA Fragment, das die Basensequenz in SEQ ID NO: 3 besitzt, wurde hergestellt, markiert und mit einer cDNA Bibliothek, die unter Verwendung einer mRNA aus humanen Leberzellen als "template" hergestellt wurde, hybridisiert. Anschließend wurde eine Transformante, die eine starke Hybridisierung zeigte, ausgewählt; und
(7) die cDNA wurde aus der Transformante hergestellt, ihre Basensequenz bestimmt und entschlüsselt, wobei gezeigt werden konnte, daß das erfindungsgemäße Polypeptid, ein humanes Polypeptid, jene mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 einschließt, die durch die Basensequenz in SEQ ID NO: 2 kodiert werden.

Durch lange andauernde Forschungsarbeiten haben die Erfinder das erfindungsgemäße Polypeptid gefunden, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert und, wie aus SEQ ID NO: 1 ersichtlich ist, unterscheidet es sich von herkömmlichen bekannten Polypeptiden. Das erfindungsgemäße Polypeptid schließt natürliche und rekombinante Polypeptide ein, solange sie die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 oder hierzu Homologe besitzen. Varianten, die homologe Aminosäuresequenzen zu jener in SEQ ID NO: 1 besitzen, können erhalten werden durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren in SEQ ID NO: 1 gegen andere Aminosäuren, ohne daß die inhärente biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids verändert wird. Abhängig von den Wirten in welche die DNAs, sogar bei Verwendung derselben DNAs, eingeführt werden und abhängig von den Bestandteilen und den Bedingungen der Kultivierung, wie Temperatur und pH-Wert, der Transformanten, welche die DNA enthalten, können Varianten gebildet werden, denen eine oder mehrere Aminosäuren nahe der N- und/oder C-Termini in SEQ ID NO: 1 fehlen, oder die zusätzlich eine oder mehrere Aminosäuren nahe dem N-Terminus in SEQ ID NO: 1 enthalten, durch die Modifikation der inneren Enzyme der Wirte nach der DNA Expression, wobei die inhärenten biolo gischen Eigenschaften des Polypeptids beibehalten werden. Das erfindungsgemäße Polypeptid schließt solche Varianten ein, sofern sie die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induzieren.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann hergestellt werden durch Kultivieren von Transformanten in Nährkulturmedien, die DNRs enthalten, die das Polypeptid kodieren, und Gewinnen des gebildeten Polypeptids aus den resultierenden Kulturen. Die Transformanten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können beispielsweise erhalten werden durch das Einführen von DNAs in Wirte, wobei die DNAs die Basensequenz in SEQ ID NO: 2 aufweisen, homologe Basensequenzen hierzu und komplementäre Sequenzen zu diesen Basensequenzen. Eine oder mehrere Basen in diesen Basensequenzen kann/können durch andere Basen durch die Degeneration des genetischen Codes ersetzt werden, ohne daß die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids verändert wird. Um die Produktion des Polypeptids in Wirten unter Verwendung solcher DNAs zu exprimieren, können eine oder mehrere Basen in Basensequenzen, die das erfindungsgemäße Polypeptid oder seine Varianten kodieren, gegen andere Basen ausgetauscht werden.
Jede DNA kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern sie eine dieser Basensequenzen besitzt, unabhängig von ihrer Herkunft, d. h., solche aus natürlichen Quellen oder künstlich synthetisierte. Die natürlichen Quellen schließen beispielsweise humane Leberzellen ein, aus denen das Gen erhalten werden kann, das die DNA mit der Basensequenz in SEQ ID NO: 6 enthält.
SEQ ID NO: 6:
Das Herstellungsverfahren ist das folgende: Fraktionieren einer kommerziell erhältlichen humanen Leber mRNA, die mit Poly(A) ergänzt ist, auf einem Sucrose-Gradienten-Puffer, um die gereinigte mRNA zu isolieren. Einwirken einer reversen Transkriptase und einer Polymerase auf die mRNA als "template", wodurch eine doppelsträngige cDNA gebildet wird, Einführen der cDNA in einen geeigneten selbst vermehrungsfähigen Vektor und Einführen der resultierenden rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt, wie Escherichia coli. Kultivieren der resultierenden Transformante in einem Nährkulturmedium und Gewinnen der proliferierten Transformanten, welche die DNA, die das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, durch das Verfahren der Koloniehybridisierung. Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung ist erhältlich durch die Behandlung der Transformanten mit herkömmlichen Verfahren. Um die erfindungsgemäße DNA künstlich herzustellen wird sie beispielsweise durch chemische Synthese basierend auf der Basensequenz in SEQ ID NO: 2 hergestellt oder durch Einführen einer DNA, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 kodiert in einen geeigneten Vektor, wodurch eine rekombinante DNA gebildet wird, Einführen der rekombinanten DNA in einen geeigneten Wirt, Kultivieren der resultierenden Transformante in einem Nährkulturmedium, Isolieren der proliferierenden Zellen aus der Kultur und Gewinnen von Plasmiden, welche die gewünschte DNA enthalten, aus den Zellen.
Im allgemeinen wird die DNA in Wirte in Form einer rekombinanten DNA eingeführt. Eine solche rekombinante DNA enthält für gewöhnlich die DNA und einen selbst vermehrungsfähigen Vektor, und sie kann im allgemeinen direkt mit Hilfe von rekombinanter DNA Technologie hergestellt werden, sofern die DNA zur Verfügung steht. Beispiele eines solch selbst vermehrungsfähigen Vektors sind Plasmidvektoren wie pKK223-2, pGEX-2T, pRL-λ, pBTrp2 DNA, pUB110, YEp13, Ti Plasmid, Ri Plasmid und pBI121. Unter diesen Vektoren können pKK223-2, pGEX-2T, pRL-λ, pBTrp2 DNA, pUB110 und YEp13 geeigneterweise verwendet werden wenn die erfindungsgemäße DNA in Prokaryonten wie Hefen und anderen Mikroorganismen der Spezies Escherichia coli und Bacillus subtilis exprimiert werden, während das Ti Plasmid, Ri Plasmid und pBI121 geeigneterweise für die Expression in Tier- und Pflanzenzellen verwendet werden.
Um die erfindungsgemäße DNA in diese Vektoren einzuführen, können herkömmliche Verfahren aus diesem Bereich willkürlich verwendet werden: Gene, welche die erfindungsgemäße DNA und selbst vermehrungsfähige Vektoren enthalten werden mit Restriktionsenzymen und/oder Ultraschall geschnitten, und die resultierenden DNA Fragmente und Vektorfragmente werden ligiert. Um die Gene und Vektoren zu schneiden erleichtern Restriktionsenzyme, die spezifisch mit Nucleotiden reagieren, insbesondere Typ II Restriktionsenzyme wie Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I und Pst I, die Ligation von DNA Fragmenten und Vektorfragmenten. Um DNA Fragmente und Vektorfragmente zu ligieren werden sie, falls notwendig zunächst reassoziiert bzw. annealt und anschließend mit einer DNA Ligase in vivo oder in vitro behandelt. Die so erhaltenen rekombinanten DNAs können direkt in geeignete Wirte eingeführt werden, und dies erlaubt die unbegrenzte Vermehrung der DNAs durch Kultivieren der Transformanten.
Die rekombinanten DNAs, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können in geeignete Wirte wie Hefen oder anderen Mikroorganismen der Spezies Escherichia coli und Bacillus subtilis eingeführt werden: wenn Mikroorganismen der Spezies Escherichia coli als Wirt verwendet werden, werden sie in Gegenwart der rekombinanten DNAs und Calciumionen kultiviert, und das Verfahren der kompetenten Zellen und das Protoplasten-Verfahren werden verwendet wenn Mikroorganismen der Spezies Bacillus subtilis als Wirt verwendet werden. Um die gewünschten Transformanten zu klonieren werden sie durch das Verfahren der Koloniehybridisierung ausgewählt oder durch das Kultivieren aller Transformanten in Nährkulturmedium und Selektion jener, die Polypeptide produzieren, welche die Fähigkeit besitzen, die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen zu induzieren.
Die so erhaltenen Transformanten produzieren das erfindungsgemäße Polypeptid intrazellulär oder extrazellulär wenn sie in Nährkulturmedium kultiviert werden. Beispiele solcher Nährkulturmedien sind jene in allgemein flüssiger Form, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralien sowie Aminosäuren und/oder Vitamine als Spurenelemente enthalten. Die Kohlenstoffquellen, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Saccharide wie Stärke, Stärkehydrolisate, Glucose, Fructose und Sucrose ein. Die Stickstoffquellen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Stickstoff, der organische und anorganische Verbindungen enthält wie Ammoniak und seine Salze, Harnstoff, Nitrate, Pepton, Hefeextrakt, entfettete Sojabohne, Maisquellwasser und Rindfleischextrakt ein. Transformanten werden in Nährkulturmedium inokuliert bzw. überimpft und bei einer Temperatur von 25–65°C bei einem pH-Wert von 5–8 für ca. 1–10 Tage unter aeroben Bedingungen unter Rühren und Belüften etc. inkubiert, wodurch Kulturen erhalten werden, die das erfindungsgemäße Polypeptid enthalten. Obwohl die vollständigen Kulturen als solche als IFN-γ Induktor verwendet werden können, werden sie, falls notwendig, der Ultrazentrifugation und/oder zell-lysierenden Enzymen unterworfen, um die Zellen zu zerstören, gefolgt von Filtrieren oder Zentrifugieren der resultierenden Suspensionen, um die intakten Zellen und Zellbestandteile zu entfernen und anschließendem Reinigen der resultierenden Überstände, die das erfindungsgemäße Polypeptid enthalten. Die Reinigungsverfahren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können sind beispielsweise solche, die allgemein in diesem Bereich verwendet werden um biologisch aktive Substanzen zu reinigen, d. h. Konzentration, Aussalzen, Dialyse, Trennen durch Sedimentation, Gelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatofokusierung, Gelelektrophorese und Isoelektrophorese und, falls notwendig können zwei oder mehrere von ihnen kombiniert werden. Die resultierenden gereinigten Lösungen, die das erfindungsgemäße Polypeptid enthalten, können in Flüssigkeiten konzentriert und/oder in Feststoffe lyophilisiert werden, um ihrer Endverwendung gerecht zu werden.
Wie oben beschrieben, besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid eine Aktivität die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen zu induzieren. Daher kann das erfindungsgemäße Polypeptid willkürlich als therapeutisches und/oder prophylaktisches Agens verwendet werden, beispielsweise für virusverursachte Krankheiten wie AIDS und Condyloma accuminata, bösartige Tumoren wie Nierenkrebs, Granulom, Mycosis fungoides und Gehirntumor und Immunerkrankungen wie Gelenkrheuma und Allergie.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann bei Koexistenz im Nährkulturmedium die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induzieren oder es kann Säugetieren für die Therapie und/oder die Prävention von IFN-γ assoziierten Krankheiten direkt verabreicht werden. Im erstgenannten Fall werden Leukozyten, die aus peripherem Blut von Säugetieren gewonnen wurden oder etablierte immunkompetente Zellen wie HBL-38 Zellen, Mo Zellen, Jurkat Zellen, HuT78 Zellen, EL4 Zellen und L12-R4 Zellen in Nährkulturmedium suspendiert, das ca. 0,1 ng bis ca. 1 μg pro ml, vorzugsweise ca. 1–100 ng pro ml des erfindungsgemäßen Polypeptids enthält, um die IFN-γ Produktion zu induzieren. Falls notwendig können solche Nährkulturmedien mit T-Zell-Stimulantien wie Mitogen, Interleukin 2 und Anti-CD 3 Antikörper ergänzt werden, und die Zellen werden bei einer Temperatur von ca. 30– 40°C und einem pH-Wert von ca. 5–8 für ca. 1–100 Stunden kultiviert, wobei die Medien gegen frische ersetzt werden. IFN-γ kann aus den resultierenden Kulturen durch eines oder mehrerer herkömmlicher Verfahren, die allgemein für das Reinigen biologisch aktiver Substanzen verwendet werden, beispielsweise Konzentration, Aussalzen, Dialyse, Trennen durch Sedimentation, Gelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Chromatofokusierung, Gelelektrophorese und Isoelektrophorese gewonnen werden.
Um IFN-γ assoziierte Krankheiten zu behandeln und/oder zu verhindern wird das erfindungsgemäße IFN-γ induzierende Agens Säugetieren direkt verabreicht: beispielsweise werden die IFN-γ induzierenden Agenzien Säugetieren oral verabreicht nachdem sie in eine angemessene Form gebracht wurden oder sie werden den Säugetieren intradermal, subkutan, muskulär, intravenös oder peritoneal gespritzt. Die Säugetiere, denen das erfindungsgemäße Polypeptid verabreicht werden kann, sind nicht auf den Menschen beschränkt und schließen andere Tiere wie Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen, Hund, Katze, Kuh, Pferd, Ziege, Schaf, Schwein und Affe ein. Da das erfindungsgemäße Polypeptid eine starke IFN-γ Induktivität und eine extrem niedrige Toxizität besitzt, induziert es die IFN-γ Produktion bereits in einer geringen Menge ohne dabei ernste Nebenwirkungen hervorzurufen, selbst wenn es den Säugetieren in einer relativ hohen Dosis verabreicht wird. Daher induziert das erfindungsgemäße Polypeptid sanft eine gewünschte Menge von IFN-γ ohne den Dosisbereich strikt zu kontrollieren. Es ist überflüssig zu erwähnen, daß das erfindungsgemäße Polypeptid die Sicherheitsanforderungen eines Arzneimittels erfüllt.
Der monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung reagiert spezifisch mit einem Polypeptid, das eine spezifische Aminosäuresequenz aufweist.
Das Hybridom gemäß der vorliegenden Erfindung produziert den monoklonalen Antikörper wenn es in vitro kultiviert wird.
Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung erleichtert die Produktion des Antikörpers in einer gewünschten Menge.
Das Verfahren zur Reinigung des Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt sein effizientes Gewinnen mit einer relativ hohen Qualität aus einer Mischung, die das Polypeptid und Verunreinigungen enthält.
In dem Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung reagiert in Proben nur das Polypeptid immunologisch. Wenn der Immunreaktionsbereich mit Hilfe einer geeigneten Technik gemessen wird, kann das Polypeptid qualitativ oder quantitativ untersucht werden.
Der monoklonale Antikörper gemäß der vorliegende Erfindung schließt solche im allgemeinen ein, die spezifisch sind für das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 oder homologe Sequenzen hierzu besitzt, unabhängig von ihrer Quelle, Herkunft und Klasse. Die homologen Aminosäuren schließen solche ein, die erhalten werden durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren in SEQ ID NO: 1 gegen andere Aminosäuren, durch das Hinzufügen einer oder mehrerer Aminosäuren zu den N- und/oder C-Termini in der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1, oder durch den Verlust einer oder mehrerer Aminosäuren in den N- und/oder C-Termini der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1, während im wesentlichen die IFN-γ Produktion induzierende Aktivität für immunkompetente Zellen nicht verloren geht.
Der monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden bei Verwendung des Polypeptids oder seiner antigenen Fragmente: beispielsweise kann der Antikörper erhalten werden durch das Herstellen von Hybridoma unter Verwendung von Säugetierzellen, die fähig sind unendlich zu proliferieren und Antikörper produzierender Zellen, die aus Säugetieren, die mit den Fragmenten immunisiert wurden, gewonnen wurden, dem Selektieren von Klonen von Hybridoma, die fähig sind den monoklonalen Antikörper zu produzieren und dem Kultivieren der Klone in vivo oder in vitro.
Das Polypeptid als ein Antigen kann erhalten werden durch Kultivieren von Transformanten, in die eine DNA, welche die Amino säuresequenz in SEQ ID NO: 1 oder eine Homologe davon kodiert, eingeführt wurde, und im allgemeinen werden sie vollständig oder in einer teilweise gereinigten Form verwendet. Die antigenen Fragmente können durch chemische oder enzymatische Hydrolyse des vollständigen oder teilweise gereinigten Polypeptids gewonnen werden oder sie können durch Peptidsynthese basierend auf der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 synthetisiert werden.
Das Immunisierungsverfahren, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt gewöhnlich bekannte ein: beispielsweise werden Antigene alleine oder in Kombination mit geeigneten Adjuvantien Säugetieren intravenös, intradermal, subkutan oder intraperitoneal gespritzt, und sie werden für einen vorbestimmten Zeitraum gefüttert. Jedes Säugetier kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung ohne besondere Einschränkung verwendet werden, sofern gewünschte Antikörper produzierende Zellen unabhängig von der Spezies, dem Gewicht und dem Geschlecht des Tieres erhalten werden können. Im allgemeinen werden Nager wie Ratten, Mäuse und Hamster verwendet und aus diesen wird das geeignetste Tier ausgewählt, während die Kompatibilität mit den oben genannten Säugetierzellen, die zur unendlichen Proliferation fähig sind, bewertet wird. In Abhängigkeit von der Spezies und dem Gewicht der verwendeten Tiere liegt die Gesamtmenge der Antigene im allgemeinen in einem Bereich von ca. 5–500 μg pro Tier und wird 2–5-mal in einem Zeitraum von 1–2 Wochen verabreicht. 3–5 Tage nach der letzten Verabreichung wird die Milz des Tieres herausgenommen und in eine Suspension von Milzzellen als Antikörper produzierende Zelle dispergiert.
Die Antikörper produzierenden Zellen und die, wie oben beschrieben, erhaltenen Säugetierzellen wurden in einer Zellfusionsmischung, welche die gewünschten Hybridoma enthielt, fusioniert. Die Säugetierzellen, die fähig sind unendlich zu proliferieren schließen Zellstämme aus Mausmyeloma wie P3-NS1-Ag4-1 Zellen (ATCC TIB18), P3-X63-Ag8 Zellen (ATCC TIB9), SP2/O-Ag14 Zellen (ATCC CRL1581) und Mutanten davon ein. Die Verfahren zur Zellfusion, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen herkömmliche ein, die einen elektrischen Stromstoß und einen Zellfusionsbeschleuniger wie Polyethylenglycol und Sendai Virus (HVJ) verwenden: beispielsweise werden Antikörper produzierende Zellen und solche Säugetierzellen in einem Verhältnis von ca. 1 : 1 bis 1 : 10 in Fusionsmedium, das Fusionsbeschleuniger enthält, suspendiert und bei 30–40°C für ca. 1–5 min inkubiert. Herkömmliche Medien wie Minimum Essential Medium (MEM), RPMI 1640 Medium und Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) werden bevorzugt als Fusionsmedium ohne den Zusatz von Seren wie Kälberserum verwendet.
Um die gewünschten Hybridoma zu selektieren wurde die resultierende Zellfusionsmischung in Selektionsmedium wie HAT Medium überführt und bei ca. 30–40°C für 3 Tage bis 3 Wochen inkubiert, wobei die Zellen mit Ausnahme der Hybridoma sterben. Die Hybridoma wurden in herkömmlicher Weise kultiviert, und die in den Kulturen sezernierten Antikörper wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität mit dem Polypeptid untersucht. Beispiele für einen solchen Assay sind herkömmlich für den Nachweis von Antikörpern verwendete wie Enzym-Immunassay, Radioimmunassay und Bioassay. Beispielsweise beschreibt "Tan-Clone-Kotai-Jikken-Manual (experimentelles Handbuch für monoklonale Antikörper)", herausgegeben von Sakuji TOYAMA und Tamie ANDO, veröffentlicht von Kodansha Scientific, Ltd., Tokyo, Japan, S. 105 – 152 (1991) eine Vielzahl davon.
Hybridoma, die Antikörper spezifisch für das Polypeptid produzieren, werden einfach durch limitierte Verdünnung kloniert, wodurch das Hybridom gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird.
Der monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden durch Kultivieren des Hybridoms in vivo, d. h. in Tieren, oder in vitro. Für die Kultur können herkömmli che Verfahren zur Kultivierung von Säugetierzellen verwendet werden. Beispielsweise wird im Falle der in vivo-Kultur der monoklonale Antikörper aus der Bauchhöhle und/oder dem Blut des Tieres gewonnen. Die Hybridoma H-1 und H-2, die weiter unten beschrieben sind, weisen eine erhöhte Produktivität des monoklonalen Antikörpers auf und besitzen das Merkmal, daß sie einfach in vivo und in vitro kultiviert werden können. Herkömmliche Verfahren, die für die Reinigung von Antikörpern im allgemeinen angewandt werden, können verwendet werden um den monoklonalen Antikörper aus den Kulturen und aus der Bauchhöhle und dem Blut des Tieres zu gewinnen. Beispiele solcher Verfahren schließen Aussalzen, Dialyse, Filtration, Konzentration, Zentrifugation, trennende Sedimentationsgelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie, high-performance liquid Chromatographie (HPLC), Gelelektrophorese und Isoelektrophorese ein und, falls notwendig können zwei oder mehrere von diesen in Kombination verwendet werden. Die resultierenden gereinigten monoklonalen Antikörper können in flüssiger Form konzentriert oder in fester Form zu Produkten getrocknet werden, um ihrer Endverwendung gerecht zu werden.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper ist extrem hilfreich für das Reinigen des erfindungsgemäßen Polypeptids mittels Immunaffinitätschromatographie. Eine solche Reinigungstechnik umfaßt das Zusammenbringen des monoklonalen Antikörpers mit einer Mischung, die das Polypeptid und Verunreinigungen wie andere Proteine als das Polypeptid enthält, wodurch das Polypeptid an dem Antikörper adsorbiert und das Desorbieren des Polypeptids von dem Antikörper. Diese Schritte werden für gewöhnlich in einem wässrigen System ausgeführt. Der monoklonale Antikörper wird für gewöhnlich in einer immobilisierten Form verwendet um wasserunlösliche Träger, die in zylindrischen Säulen gepackt sind, zu binden. Kulturen von Transformanten oder ihre teilweise gereinigten Produkte werden auf die Säulen geladen, wodurch das Polypeptid im wesentlichen an den monoklonalen An tikörper adsorbiert. Durch Änderung des den Antikörper umgebenden pH-Wertes desorbiert das Polypeptid einfach von dem Antikörper. Für den Fall, daß beispielsweise ein monoklonaler Antikörper der Klasse IgG verwendet wird, desorbiert das adsorbierte Polypeptid und eluiert von der Säule bei einem sauren pH-Wert, für gewöhnlich einem pH-Wert von 2–3, während im Fall der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der Klasse IgM das Polypeptid bei einem alkalischen pH-Wert für gewöhnlich einem pH-Wert von 10–11 desorbiert und von der Säule eluiert.
Das Verfahren zur Reinigung gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt einen relativ hohen Reinheitsgrad des Polypeptids bei einem Minimum an Arbeit, Kosten und Zeit. Wie oben beschrieben, besitzt das Polypeptid eine Aktivität zur Induktion der IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen, und das gereinigte Polypeptid kann als IFN-γ Induktor für Zellkultur verwendet werden um IFN-γ zu produzieren, und es kann für die Behandlung und/oder die Prävention von Viruserkrankungen wie AIDS und Condyloma, bösartigen Tumoren wie Nierenkrebs, Granulom, Mycosis fungoides und Gehirntumor und Immunerkrankungen wie Gelenkrheuma und Allergie verwendet werden. Wenn das Polypeptid die Zellzytotoxizität von Killerzellen verstärkt, kann es zusammen mit Interleukin 2 und/oder Tumornekrosisfaktor verwendet werden, um den therapeutischen Effekt zu verstärken, und die Nebenwirkungen bei der Behandlung von angenommener Immunität gegenüber bösartigen Tumoren einschließlich fester Tumoren wie Lungenkrebs, Nierenkrebs und Brustkrebs zu verringern.
Der monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt eine relativ weite Anwendbarkeit in einer Vielzahl von Bereichen, in denen der Nachweis des Polypeptids benötigt wird. Wenn er in markierten Immunassays wie Radioimmunassay, Enzymimmunassay und Fluoreszenzimmunassay verwendet wird, kann der monoklonale Antikörper das Polypeptid in Proben sofort und genau qualitativ und quantitativ nachweisen. In solchen Assays wird der monoklonale Antikörper vor der Verwendung markiert, bei spielsweise mit radioaktiven Isotopen, Enzymen und/oder fluoreszierenden Substanzen. Der Antikörper reagiert spezifisch mit dem Polypeptid, wodurch eine Immunreaktion hervorgerufen wird, und er weist bereits eine geringe Menge des Polypeptids in Proben durch Messen der Menge der Immunreaktion dieser markierten Substanzen nach. Im Vergleich zum Bioassay besitzt der markierte Immunassay folgende Merkmale: er kann viele Proben gleichzeitig untersuchen, er reduziert die Versuchszeit und die Laborkosten und stellt Daten mit einer relativ hohen Genauigkeit zur Verfügung. Daher ist das Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich für die Kontrolle der Produktionsschritte des Polypeptids und für die Qualitätskontrolle der Endprodukte. Obwohl die vorliegende Erfindung die Techniken für das Markieren monoklonaler Antikörper oder Markierungsassays nicht im Detail beschreibt, weil sie sich selbst nicht auf die Erfindung beziehen, sind diese Techniken im Detail beschrieben in "Enzyme Immunoassay", herausgegeben von P. Tijssen, übersetzt von Eiji ISHIKAWA, veröffentlicht von Tokyo-Kagaku-Dojin, S. 196–348 (1989).
Das erfindungsgemäße Agens für assoziierte Krankheiten induziert die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen wenn es Menschen verabreicht wird, und es übt eine therapeutische und/oder prophylaktische Wirkung auf IFN-γ assoziierte Krankheiten aus. Wenn das Polypeptid eine verstärkende Aktivität auf die Zytotoxizität von Killerzellen oder auf die Induktion der Bildung von Killerzellen besitzt, übt es eine starke Wirkung bei der Behandlung von schweren Erkrankungen einschließlich bösartiger Tumoren aus.
Das Polypeptid, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, besitzt entweder die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 (wobei das Symbol "Xaa" "Isoleucin" oder "Threonin" bedeutet) oder eine hierzu homologe Aminosäuresequenz, und es induziert die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen. Beispiele einer solchen homologen Aminosäuresequenz schließen sol che ein, die zu der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 korrespondieren, wobei eine oder mehrere Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind ebenso wie solche, worin eine oder mehrere Aminosäuren zu den N- und/oder C-Termini hinzugefügt sind und ebenso wie solche worin eine oder mehrere Aminosäuren in den N- und/oder C-Termini fehlerhaft sind. Es können alle Polypeptide, beispielsweise solche die aus natürlichen Quellen durch Zellkultur isoliert wurden und solche die künstlich durch rekombinante DNA Technologie und Peptidsynthese synthetisiert wurden, im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern sie eine dieser Aminosäuresequenzen und Eigenschaften besitzen.
Aus wirtschaftlichem Gesichtspunkt wird die rekombinante DNA Technologie vorteilhafterweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet: nach der Technologie werden DNAs, die solche Aminosäuresequenzen kodieren, in geeignete Wirte eingeführt, die von Mikroorganismen und Tieren abgeleitet sind, wodurch Transformanten erhalten werden, die anschließend in üblicher Weise in Nährkulturmedien kultiviert werden, und die resultierenden Kulturen werden mittels herkömmlicher Techniken, die für die Reinigung von Zytokinen verwendet werden, gereinigt, wodurch das gewünschte Polypeptid erhalten wird.
Wie oben beschrieben, besitzt das Polypeptid die Fähigkeit die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen zu induzieren. Wenn es Menschen verabreicht wird, induziert das erfindungsgemäße Agens für assoziierte Krankheiten die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen im Körper und übt eine befriedigende therapeutische und/oder prophylaktische Wirkung auf IFN-γ assoziierte Krankheiten aus. Das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 besitzt Eigenschaften die Zytotoxizität von Killerzellen wie NK-Zellen, LAK-Zellen (Lymphokinaktivierende Killerzellen), zytotoxischen T-Zellen zu verstärken, und die Bildung von Killerzellen zu induzieren, ebenso wie es die Eigenschaft besitzt die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen zu induzieren, so daß die Killerzellen die Poly peptid assoziierten Krankheiten behandeln und/oder verhindern. Daher bedeutet der Begriff "assoziierte Krankheiten" so wie er im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, allgemein Krankheiten, die IFN-γ assoziierten Krankheiten und solche, die direkt oder indirekt durch IFN-γ und/oder Killerzellen behandelt und/oder verhindert werden können, einschließen: beispielsweise virale Krankheiten wie Hepatitis, Herpessyndrom, Condyloma und AIDS; bakterielle Krankheiten wie Candidiasis und Malaria; feste bösartige Tumoren wie Nierenkrebs, Mycosis fungoides und chronische granulomatöse Erkrankung; bösartige Tumoren der Blutzellen wie adulte T-Zell-Leukämie, chronische myeloische Leukämie und bösartige Leukämie und Immunkrankheiten wie Allergie und Rheuma. Wenn das Polypeptid zusammen mit Interleukin 3 verwendet wird, übt es eine starke Wirkung auf die Behandlung oder die Remission von Leukämie und Myelom ebenso wie Leukopenie und Thrombopenie aus, die durch Bestrahlungen und chemotherapeutische Agenzien zur Behandlung von bösartigen Tumoren induziert werden.
Das erfindungsgemäße Agens kann weiträumig in der Behandlung und/oder Verhinderung der zuvor genannten assoziierten Krankheiten als Antitumoragens, antivirales Agens, Antiseptikum, immuntherapeutisches Agens, Blutplättchen bildendes Agens und Leukozyten verstärkendes Agens verwendet werden. Obwohl es in Abhängigkeit von der Art des Agens, das für solche Zwecke und nach Art der zu behandelnden assoziierten Krankheiten variiert, wird das erfindungsgemäße Agens für gewöhnlich in ein Agens in flüssiger Form, als Paste oder als Feststoff verarbeitet, welches das Polypeptid in einer Menge von 0,000001–100 w/w %, vorzugsweise 0,0001–0,1 w/w % auf einer trockenen festen Basis (engl.: dry solid basis (d. s. b.)) enthält.
Das erfindungsgemäße Agens kann als Ganzes oder verarbeitet zu Zusammensetzungen durch Mischen mit einem physiologisch geeigneten Träger, Adjuvans, Füllstoff, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisator wie Serumalbumin, Gelatine, Saccharide einschließ lich Maltose und Trehalose etc. verwendet werden und, falls notwendig kann es weiterhin mit einer oder mehreren anderen biologisch aktiven Substanzen vermischt werden wie Interferon-α, Interferon-β, Interleukin 2, Interleukin 3, Interleukin 12, TNF-α, TNF-β, Carboquon, Cyclophosphamid, Aclarubicin, Thiotepa, Bisulfan, Ancitabin, Cytarabin, 5-Fluoruracil, 5-Fluor-1-(tetrahydro-2-furyl)-uracil, Methotrexat, Actinomycin D, Chromomycin A3, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Mitomycin C, Vincristin, Vinblastin, L-Asparaginase, Radiogoldcolloidal, Krestin^®, Picibanil, Lentinan und Maruyama Vaccine. Unter diesen Kombinationen ist besonders jene, die aus dem Polypeptid und Interleukin 2 besteht besonders geeignet, weil Interleukin 2 als Kofaktor für das Polypeptid wirkt, wenn das Polypeptid die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert. Die gemeinsame Verwendung des Polypeptids und eines natürlichen oder rekombinanten humanen Interleukin 2 induziert eine beschriebene Menge an IFN-γ Produktion selbst dann wenn das Polypeptid die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen im wesentlichen nicht induziert.
Die gemeinsame Verwendung des Polypeptids und Interleukin 12 erzielt eine höhere Menge an IFN-γ Induktivität, die durch die Verwendung von nur einem der beiden nicht erreicht werden kann.
Das erfindungsgemäße Agens für assoziierte Krankheiten schließt solche in einer Einheit-Dosis-Form ein, was ein physikalisch getrenntes und geformtes Arzneimittel bedeutet, das für die Verabreichung geeignet ist und welches das Polypeptid in einer täglichen Dosis oder in einer Dosis von 1/40 bis ein Vielfaches davon (bis zu 4-fach) der täglichen Dosis enthält. Beispiele solcher Arzneimittel sind Injektionen, Flüssigkeiten, Pulver, Granulate, Tabletten, Kapseln, Unterzungenarzneimittel, Augenlösungen, Nasentropfen und Zäpfchen.
Das erfindungsgemäße Agens kann oral oder parenteral den Patienten verabreicht werden und, wie weiter unten beschrieben wird, kann es verwendet werden um Antitumorzellen in vitro zu aktivieren. In beiden Darreichungsformen übt das Agens eine befriedigende Wirkung in der Behandlung und/oder in der Prävention der assoziierten Krankheiten aus. Obwohl es in Abhängigkeit von den Arten der assoziierten Krankheiten und ihren Symptomen variiert, kann das Agens den Patienten oral verabreicht werden oder es kann den Patienten parenteral in das intradermale Gewebe, in das subkutane Gewebe, in die Muskeln und Venen in einer Dosis im Bereich von ca. 1,0–50 mg/Applikation, vorzugsweise ca. 1 μg/Applikation bis 1 mg/Applikation, 1–4-mal täglich oder 1–5-mal wöchentlich für einen Tag bis zu einem Jahr verabreicht werden.
Das Agens gemäß der vorliegenden Erfindung kann ebenso in der sogenannten "Antitumorimmuntherapie" unter Verwendung von Interleukin 2 verwendet werden. Im allgemeinen ist die Antitumorimmuntherapie grob eingeteilt in (i) ein Verfahren zur direkten Verabreichung von Interleukin 2 an den Körper des Patienten mit bösartigen Tumoren und (ii) ein Verfahren zum Einführen von Antitumorzellen, die in vitro durch Interleukin 2 aktiviert wurden (adoptive Immuntherapie). Die immuntherapeutische Wirkung kann signifikant erhöht werden wenn gleichzeitig das Polypeptid verabreicht wird. Im Verfahren (i) wird das Polypeptid den Patienten in einer Menge von ca. 0,1 μg/Applikation/Erwachsener bis 1 mg/Applikation/Erwachsener 1–10-mal gleichzeitig oder vor der Gabe von Interleukin 2 verabreicht. Die Dosis von Interleukin 2 ist für gewöhnlich auf eine Dosis im Bereich von ca. 10.000 bis 1.000.000 Einheiten/Applikation/Erwachsener festgesetzt, obwohl sie in Abhängigkeit der Arten der bösartigen Tumoren, der Patientensymptome und der Polypeptiddosis variiert. Im Verfahren (ii) werden mononukleäre Zellen und Lymphozyten, die aus Patienten mit bösartigen Tumoren gewonnen wurden, in Gegenwart von Interleukin 2 und ca. 1 ng bis 1 mg des Polypeptids pro 1 × 10⁶ Zellen dieser Blutzellen kulti viert. Nach Kultivierung für eine vorbestimmte Zeitspanne werden NK-Zellen und LAK-Zellen aus der Kultur gewonnen und in den Körper des Patienten eingeführt. Krankheiten die mit der vorliegenden Antitumorimmuntherapie behandelt werden können sind beispielsweise feste bösartige Tumoren wie Dickdarmkrebs, Magenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Zungenkrebs, Blasenkrebs, Chorionkrebs, Hepatom, Prostatakrebs, Gebärmutterkrebs, Kehlkopfkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, malignes Melanom, Kaposi's Sarkom, Gehirntumor, Neuroblastom, Eierstockkrebs, Hodenkrebs, Osteosarkom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Nierenkrebs, Hypernephrom, Hämangioendotheliom und bösartige Blutzellentumore wie Leukämie und malignes Lymphom.
Die folgenden Beispiele erklären die vorliegende Erfindung, und die hier verwendete rekombinante DNA Technologie ist für sich genommen herkömmlicherweise im Stand der Technik bekannt: beispielsweise ist eine solche Technologie beschrieben bei J. Sambrook et al. in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Auflage (1989), veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA und by Masami MURAMATSU in "Laboratory Manual for Genetic Engineering" (1988), veröffentlicht von Maruzen Co., Ltd., Tokyo, Japan.
Beispiel A-1
Herstellung des gereinigten Polypeptids
600 weiblichen, 8 Wochen alten CD-1 Mäusen wurde intraperitoneal 1 mg/Maus toter Corynebacterium parvum (ATCC 11827) injiziert, die zuvor bei 60°C für eine Stunde erhitzt worden waren, und die Mäuse wurden für 7 Tage auf herkömmliche Weise gefüttert und mit 1 μg/Maus eines gereinigten Lipopolysaccharids, das aus Escherichia coli gewonnen wurde, intravenös injiziert. 1–2 Stunden nach der intravenösen Injektion wurden die Mäuse geopfert, um ihr Blut zu gewinnen, anschließend wurden ihre Lebern herausgenommen, die Lebern wurden in einem Homogenisator in dem 8-fachen Volumen eines 50 mM Phosphatpuffers (pH 7,3) zerkleinert, und die gebildete Suspension wurde extrahiert. Der gebildete Extrakt wurde bei 8.000 rpm für 20 min zentrifugiert, und ca. 9 l des Überstandes wurde mit gesättigtem Ammoniumsulfat in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,3) gemischt, wodurch ein Sättigungsgrad von 45 w/v % erreicht wurde. Die gebildete Lösung wurde bei 4°C für 18 Stunden stehengelassen und bei ca. 8.000 rpm für 30 min zentrifugiert, wodurch ca. 19 l Überstand erhalten wurden, welcher das erfindungsgemäße Polypeptid enthielt.
Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die mit ca. 4,6 l "PHENYL SEPHAROSE", einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden beladen war, wobei die Säule mit 50 nM Phosphatpuffer (pH 7,3), der 1 M Ammoniumsulfat enthielt, equilibriert worden war, und die Säule wurde mit einer frischen Präparation des gleichen Puffers gewaschen, und es wurde bei einer SV (engl.: space velocity = Raumgeschwindigkeit) von 0,57 ein linearer Gradientenpuffer im Bereich von 1 M bis 0,2 M Ammoniumsulfat in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,3) zugeführt. Die Fraktionen, die das erfindungsgemäße Polypeptid enthielten, eluierten bei 0,8 M Ammoniumsulfat, sie wurden gesammelt und zu ca. 4,8 l Lösung vereinigt, die anschließend mit Hilfe eines Membranfilters konzentriert wurde und für 18 Stunden bei 4°C gegen einen 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) dialysiert wurde und auf eine Säule geladen wurde, die mit ca. 250 ml "DEAE-SEPHAROSE", einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden bestückt worden war. Die Säule wurde mit einer frischen Präparation desselben Puffers gewaschen, und es wurde bei SV 1,2 ein linearer Gradientenpuffer im Bereich von 0 M bis 0,2 M Natriumchlorid in 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) zugeführt, wodurch ca. 260 ml Fraktionen eluiert und gesammelt wurden, die das erfindungsgemäße Polypeptid enthielten, das bei einer Konzentration von ca. 0,13 M Natriumchlorid eluierte.
Fraktionen die das erfindungsgemäße Polypeptid enthielten, wurden gesammelt, vereinigt, konzentriert und gegen 25 mM Bis-Trispuffer (pH 7,1) bei 4°C für 18 Stunden dialysiert. Die dia lysierte Lösung wurde auf eine Säule aufgetragen, die mit ca. 24 ml "MONO-P", einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden beladen worden war, und die dialysierte Lösung wurde mit 10 v/v % Polypuffer 74 (pH 4,0) eluiert, wobei der pH-Wert von 7 auf 4 erniedrigt wurde, wodurch ca. 23 ml Eluat erhalten wurden, welches das erfindungsgemäße Polypeptid enthielt. Das Eluat wurde konzentriert, auf eine Säule geladen, die mit "SUPER-DEX 75", einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden bestückt und mit einer Mischlösung (pH 7,2) mit 7 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 3 mM Natriumdiyhdrogenphosphat und 139 mM Natriumchlorid equilibriert worden war, und das Eluat wurde der Gelfiltrationschromatographie zugeführt, wobei Fraktionen, die das erfindungsgemäße Polypeptid mit ca. 19.000 Daltons enthielten, mit einer frischen Präparation derselben Lösung eluiert wurden. Die Fraktionen wurden für die Verwendung in Beispiel A-2 vereinigt und konzentriert. Die Ausbeute des erfindungsgemäßen Polypeptids betrug ca. 0,6 μg/Maus.
Beispiel A-2
Teilweise Aminosäuresequenz des Polypeptids
Ein Teil einer wässrigen Lösung, die das gereinigte Polypeptid aus Beispiel A-1 enthielt, wurde bis zu einem Volumen von ca. 50 μl konzentriert und anschließend mit 25 μl einer Lösung gemischt, die 3 w/v % SDS, 60 v/v % Glycerol und 60 mg/ml Dithiothreitol enthielt. Die gebildete Mischung wurde bei 50°C für 30 min inkubiert, auf ein 15 w/v % Polyacrylamidgel geladen und in herkömmlicher Weise elektrophorisiert. Das Gel wurde gefärbt, indem es in einer Mischlösung aus 10 v/v % wässriger Essigsäurelösung und 50 v/v % wässrigem Methanol, die 0,1 w/v % Coomassie Brilliant blue R 250 enthielt, geschwenkt wurde, das Gel wurde durch wiederholtes Waschen in einer Mischlösung aus 12 v/v % wässrigem Methanol und 7 v/v % wässriger Essigsäurelösung entfärbt, und es wurde durch Schwenken in destilliertem Wasser für 18 Stunden gewaschen. Ein Teil des Gels, der mit Coomassie Brilliant blue gefärbt war und das erfindungsgemäße Polypeptid enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und lyophilisiert.
Das lyophilisierte Gel wurde in 0,6 ml Lösung bestehend aus 100 mM Natriumhydrogencarbonat mit 2 μg/ml "TPCK TRYPSIN", 0,5 mM Calciumchlorid und 0,02 v/v % wässriger Tween 20 Lösung geschwenkt, gefolgt von der Inkubation bei 37°C für 18 Stunden, wodurch das Protein trypsiniert wurde. Die gebildete Lösung wurde zentrifugiert, wodurch ein Überstand erhalten wurde, während das gebildete Präzipitat in 1 ml eines 1 v/v % wässrigen Trifluoracetat mit 0,001 v/v % Tween 20 geschwenkt, für 4 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und zentrifugiert wurde, wodurch ein Überstand erhalten wurde. Das neu gebildete Präzipitat wurde wie oben beschrieben nacheinander behandelt mit 70 v/v % wässrigem Trifluoracetat, das 0,001 v/v % Tween 20 enthielt, und mit 50 v/v % wässrigem Acetonitril, wodurch ein Überstand erhalten wurde. Der gebildete Überstand und der bereits weiter oben erhaltene Überstand wurden vereinigt und konzentriert, wodurch 250 μl erhalten wurden, die anschließend durch Zentrifugation filtriert wurden.
Die gebildete wässrige Lösung, welche die Peptidfragmente enthielt, wurde auf eine "HPLC ODS-120T" geladen, eine Säule für HPLC, die kommerziell erhältlich ist bei Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, die zuvor mit 0,1 v/v % wässrigem Trifluoracetat equilibriert worden war, und die Säule wurde mit 0,1 v/v % wässrigem Trifluoracetat gewaschen und mit 0,1 v/v % Trifluoracetat bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/min beladen, wobei die Konzentration des wässrigen Acetonitrils von 0 v/v % bis 70 v/v % gesteigert wurde, und die Konzentration des Peptids in dem Eluat wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers bei Wellenlängen von 214 nm und 280 nm überwacht. Fraktionen, die ca. 75 min und ca. 55 min nach dem Beginn der Elution eluierten, wurden jeweils gesammelt (im folgenden als "Peptidfragment A" und "Peptidfragment B" bezeichnet). Das Elutionsmuster ist in 1 gezeigt.
Die Peptidfragmente A und B wurden mit Hilfe von "MODEL 473 A", einem Proteinsequenziergerät analysiert, das kommerziell erhältlich ist bei Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, USA, wobei sich zeigte, daß sie die Aminosäuresequenzen in SEQ ID NOs: 4 und 5 aufweisen.
Beispiel A-3
DNA-Basensequenz, die das Protein kodiert und Aminosäuresequenz des Polypeptids
Beispiele A-3-1
Herstellung der Gesamt-RNA
3 g feuchter Mausleberzellen, die gemäß dem Verfahren in Beispiel A-1 hergestellt wurden, wurden gewogen, in 20 ml einer Mischlösung, die 6 M Guanidinisothiocyanat, 10 mM Natriumcitrat und 0,5 w/v % SDS enthielt, geschwenkt und mit einem Homogenisator zerkleinert. 35 ml Zentrifugenröhrchen wurden mit 25 ml 0,1 M EDTA (pH 7,5), das 5,7 M Cäsiumchlorid enthielt, beladen, und der obere Teil der Lösungen in den Röhrchen wurde mit 10 ml der homogenisierten Zellsuspension überschichtet, anschließend wurden die Röhrchen bei 25.000 rpm für 20 Stunden zentrifugiert, wodurch die RNA Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden vereinigt, auf 15 ml Zentrifugenröhrchen verteilt und mit den gleichen Volumina einer Mischlösung aus Chloroform und Isobutanol (= 4 : 1 des Volumens) gemischt. Die Röhrchen wurden für 5 min geschüttelt und bei 4°C und 10.000 rpm für 10 min zentrifugiert, die gebildeten Wasserschichten wurden gesammelt, vereinigt, mit dem 2,5-fachen Volumen an Ethanol gemischt und bei –20°C für 2 Stunden stehengelassen, um die Gesamt-RNAs zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde gesammelt, vereinigt, mit 75 v/v % wässrigem Ethanol gewaschen und in 0,5 ml sterilisiertem destillierten Wasser für die Verwendung in Beispiel A-3-2 gelöst. Die Ausbeute an RNAs betrug ca. 5 mg, d. s. b.
Beispiel A-3-2
Herstellung von DNA Fragmenten, die das Polypeptid teilweise kodieren
1 μm der Gesamt-RNAs aus Beispiel A-3-1 wurde gemischt mit 4 μl 25 mM Magnesiumchlorid, 2 μl einer Lösung bestehend aus 10 × PCR Puffer, 100 mM Tris-HCl Puffer (pH 8,3) und 500 mM Kaliumchlorid, 8 μl eines 1 mM dNTP Mixes, 1 μl einer Lösung enthaltend 1 unit/μl RNase Inhibitor, 1 μl einer Lösung enthaltend 2,5 units/μl reverse Transkriptase und 1 μl eines 2,5 μM Randomhexamers, die RNAs wurden ferner mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 μl aufgefüllt. Die Mischlösung wurde in Reaktionsröhrchen gegeben und in herkömmlicher Weise nacheinander bei 25°C für 10 min bei 42°C für 30 min, bei 99°C für 5 min und bei 5°C für 5 min inkubiert, wobei die reverse Transkriptase Reaktion stattfand, anschließend wurde eine wässrige Lösung gewonnen, die den ersten Strang der cDNA enthielt.
Zu 20 μl der wässrigen Lösung wurden hinzugefügt 4 μl 25 mM Magnesiumchlorid, 8 μl 10 × PCR Puffer, 0,5 μl einer Lösung enthaltend 2,5 units/μl AmpliTaq DNA Polymerase, kommerziell erhältlich bei Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, USA und jeweils 1 pM der Primer 1 und 2 als Senseprimer oder Anti-Senseprimer. Die Mischlösung wurde mit destilliertem sterilisierten Wasser auf 100 μl aufgefüllt und in herkömmlicher Weise nacheinander bei 94°C für 1 min, bei 45°C für 2 min, bei 72°C für 3 min wiederholt für 40 Zyklen inkubiert, wodurch unter Verwendung der ersten Strang cDNA als template ein DNA Fragment amplifiziert wurde, welches das erfindungsgemäße Polypeptid teilweise kodiert. Die Primer 1 und 2 waren Oligonucleotide, die basierend auf den Aminosäuresequenzen Pro-Glu-Asn-Ile-Asp-Asp-Ile und Phe-Glu-Asp-Met-Thr-Asp-Ile in SEQ ID NOs: 4 und 5 chemisch synthetisiert wurden und die Basensequenzen 5'-RTRTCRTCDATRTTYTCNGG-3' und 5'-TTYGARGAYATGACNGAYAT-3' aufwiesen.
Ein Teil des gebildeten PCR Produktes wurde mittels Elektrophorese in einem 2 w/v % Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran übertragen, mit 0,4 N Natriumhydroxid fixiert, mit 2 × SSC gewaschen, luftgetrocknet, in einer Prähybridisierungslösung enthaltend 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 w/v % SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA geschwenkt und bei 65°C für 3 Stunden inkubiert. Als Sonde 1 wurde ein Oligonucleotid mit einer Basensequenz 5'-TTYGARGARATGGAYCC-3', basierend auf der Aminosäuresequenz Phe-Glu-Glu-Met-Asp-Pro in SEQ ID NO: 4 synthetisiert und mit [γ-³²P]ATP und T4 Polynucleotidkinase markiert.
SEQ ID NO: 4:
Die Nylonmembran wurde in einer Lösung enthaltend 1 pM der Sonde 1, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 w/v % SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA geschwenkt und bei 45°C für 24 Stunden inkubiert, wobei die Hybridisierung stattfand. Die erhaltene Nylonmembran wurde in 6 × SSC gewaschen und in herkömmlicher Weise autoradiographiert, wobei sich zeigte, daß das PCR Produkt das gewünschte DNA Fragment enthielt.
Das verbleibende PCR Produkt wurde mit 50 ng "pT7 BLUE T", einem Plasmidvektor, der kommerziell erhältlich ist bei Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japan, einer angemessenen Menge an T4 Ligase und weiterhin mit 100 mM ATP gemischt, wodurch eine Konzentration von 1 mM erreicht wurde, anschließend wurde bei 16°C für 18 Stunden inkubiert, um das DNA Fragment in den Plasmidvektor zu inserieren. Die so erhaltene DNA wurde in den Stamm Escherichia coli Nova Blue, ein Mikroorganismus der Spezies Escherichia coli, der kommerziell erhältlich ist bei Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, eingeführt, wodurch eine Transformante erhalten wurde, die anschließend auf ein Plattenmedium enthaltend 10 g/l Bactotrypton, 2,5 g/l Natriumchlorid, 15 g/l Bactoagar, 100 mg/l Ampicillin, 40 mg/l X-Gal und 23,8 mg/l Isopropyl-β-D-Thiogalacto-Pyranosid (im nachfolgenden als "IPTG" abgekürzt) inokuliert wurde und bei 37°C für 24 Stunden inkubiert wurde, um Kolonien zu bilden. Eine Nylonmembran wurde in herkömmlicher Weise auf das Plattenmedium gelegt und für ca. 30 Sekunden liegengelassen, wodurch die Kolonien daran anhefteten. Die Nylonmembran wurde anschließend von der Platte abgezogen und für 7 min in einer Lösung enthaltend 0,5 N Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid geschwenkt, wodurch die Zellen lysiert wurden. Daran anschließend wurde die Nylonmembran weiterhin für 3 min in 0,5 M Tris-HCl Puffer (pH 7,2) enthaltend 1,5 M Natriumchlorid, geschwenkt, mit 2 × SSC gewaschen, in 0,4 N Natriumhydroxid für 20 min geschwenkt, um die DNA zu fixieren, mit 5 × SSC gewaschen, luftgetrocknet, in einer Prähybridisierungslösung enthaltend 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 w/v % SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA geschwenkt und bei 65°C für 3 Stunden inkubiert. Die auf der Nylonmembran gebildeten Kolonien wurden in herkömmlicher Weise mit der Sonde 1 hybridisiert, mit 6 × SSC gewaschen und wie oben beschrieben autoradiographiert, anschließend wurden Transformanten selektiert, die mit der Sonde 1 stark hybridisierten.
Die Transformanten wurden in L-broth (pH 7,2) enthaltend 100 μg/ml Ampicillin inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden inkubiert, anschließend wurden Zellen aus der Kultur gesammelt, und es wurde rekombinante DNA mit Hilfe des herkömmlichen Alkali-SDS-Verfahrens gewonnen. Die Analyse mit Hilfe des Dideoxy-Verfahrens zeigte, daß die rekombinante DNA ein DNA Fragment enthielt, das aus Basensequenzen besteht, die den Basen zwischen den Positionen 85 bis 281 in SEQ ID NO: 3 entsprechen.
Beispiel A-3-3
Herstellung von mRNA
0,05 ml einer wässrigen Lösung, welche die Gesamt-RNAs aus Beispiel A-3-1 enthielt, wurde in ein Teströhrchen gegeben, mit 0, 5 ml 10 mM Tris-HCl Puffer (pH 7, 5) enthaltend 1 mM EDTA und 0,1 w/v % SDS gemischt und auf 1 ml mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt. Zu der Mischung wurde 1 ml "OLIGO-TEX-dT30 SUPER", ein Oligo-d(T)₃₀ Latex, das kommerziell erhältlich ist bei Nippon Roche K. K., Tokyo, Japan, hinzugefügt, anschließend wurde bei 65°C für 5 min inkubiert um die RNAs zu denaturieren und für 3 min in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt. Die daraus resultierende Mischung wurde mit 0,2 ml 5 M Natriumchlorid gemischt, bei 37°C für 10 min inkubiert und bei 10.000 rpm bei 25°C für 10 min zentrifugiert. Das Präzipitat in Form eines Pellets wurde in 0,5 ml sterilisiertem destillierten Wasser suspendiert und bei 65°C für 5 min inkubiert um die mRNA aus der Olgio-d(T)₃₀ Latex zu extrahieren. Die Ausbeute an mRNA betrug ca. 5 μg.
Beispiel A-3-4
Herstellung der cDNA Bibliothek
Die cDNA Bibliothek wurde aus mRNA in Beispiel A-3-3 unter Verwendung von "cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", ein cDNA Klonierungskit, der kommerziell erhältlich ist bei Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, hergestellt. Die Herstellungsverfahren waren wie folgt: in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß wurden nacheinander 4 μl einer Lösung zur Synthese des ersten Stranges der cDNA, 1 μl Natriumpyrophosphatlösung, 1 μl einer Lösung humanen Placentaribonucleaseinhibitors, 2 μl Deoxynucleosidtriphosphatmix und 1 μl Oligod(T)₁₆ Primer hinzugefügt. Die resultierende Mischung wurde mit 2 μl mRNA aus Beispiel A-3-3 gemischt, auf 19 μl mit sterilsiertem destillierten Wasser aufgefüllt, mit 1 μl einer Lösung enthaltend 20 units reverse Transkriptase, gemischt und bei 42°C für 40 min inkubiert, wodurch eine Reaktionsmischung erhalten wurde, die den ersten Strang der cDNA enthielt.
Die so erhaltene Mischung wurde gemischt mit 37,5 μl einer Lösung zur Synthese des zweiten Strangs der cDNA, 0,8 units Ribonuclease H, abgeleitet von Escherichia coli, 23 units DNA Polymerase, und die Mischung wurde auf 100 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser ausgefüllt. Die resultierende Mischung wurde nacheinander bei 12°C für 60 min und bei 22°C für 60 min inkubiert, mit 2 units T4 DNA Polymerase gemischt und bei 37°C für 10 min inkubiert, wodurch eine Reaktionsmischung erhalten wurde, die den zweiten Strang der cDNA enthielt. Zu der Reaktionsmischung wurden 4 μl 0,25 M EDTA (pH 8,0) hinzugefügt, um die Reaktion zu suspendieren, und die resultierende Mischung wurde in herkömmlicher Weise mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol behandelt, um die gewünschte cDNA zu präzipitieren, anschließend wurde das Präzipitat gewonnen.
Zu der so erhaltenen cDNA wurden in dieser Reihenfolge 2 μl L/K Puffer, 250 pM Eco RI Adapter und 2,5 units T4 DNA Ligase hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde auf 20 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt und bei 15°C für 16 Stunden inkubiert, um den Eco RI Adapter an beide Enden der cDNA zu ligieren. Die Reaktionsmischung wurde mit 2 μl 0,25 M EDTA gemischt um das verbleibende Enzym zu inaktivieren und einer Molekularsiebchromatographie zugeführt um intakte Eco RI Adapter zu inaktivieren. Zu der resultierenden Mischung wurden 40 μl L/K Puffer und 80 units T4 Polynucleotidkinase hinzugefügt, und die Mischung wurde auf 400 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt, anschließend wurde sie bei 37°C für 30 min inkubiert um die Eco RI Schnittstellen zu methylieren. Die resultierende Mischung wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol behandelt um die gewünschte DNA zu präzipitieren, anschließend wurde die DNA gewonnen. Zu der DNA wurden 1,5 μl L/K Puffer enthaltend eine angemessene Menge an λgt 10 Armen und 2, 5 units T4 DNA Ligase hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde auf 15 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt, bei 15°C für 16 Stunden inkubiert um die Ligation zu bewirken und einem herkömmlichen in vitro Verpackungsverfahren zu geführt, um einen Phagen, der die rekombinante λDNA enthält, zu erhalten.
Beispiel A-3-5
Klonierung der rekombinanten DNA
Eine Impfkultur des Stammes Escherichia coli NM514 wurde in herkömmlicher Weise mit dem Phagen aus Beispiel A-3-4 infiziert, und die infizierten Zellen wurden auf eine Agarplatte (pH 7,0) enthaltend 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid und 15 g/l Bacto-Agar inokuliert und bei 37°C für 16 Stunden zur Bildung von Plaques inkubiert. Die Agarplatte wurde mit einer Nylonmembran bedeckt und für 30 Sekunden liegengelassen, wodurch die Plaques an sie anhefteten. Die Nylonmembran wurde von der Platte abgezogen und nacheinander in einer wässrigen Lösung enthaltend 0,5 M Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid für 7 min sowie in 0,5 M Tris-HCl Puffer (pH 7,0) enthaltend 1,5 M Natriumchlorid für 3 min geschwenkt. Die Nylonmembran wurde mit 2 × SSC gewaschen, luftgetrocknet, in 0,4 N Natriumhydroxid für 20 min geschwenkt, mit 5 × SSC gewaschen, luftgetrocknet, in einer Lösung enthaltend 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 w/v % SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA geschwenkt und bei 65°C für 3 Stunden inkubiert. Danach wurde die so behandelte Nylonmembran inkubiert in einer Lösung enthaltend eine angemessene Menge des DNA Fragments als Sonde 2, das in Beispiel A-3-2 erhalten wurde und markiert war mit ³²P unter Verwendung des "READY PRIME DNA LA-BELLING SYSTEM", einem DNA Markierungskit, der kommerziell erhältlich ist bei Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 w/v SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA, und die Mischung wurde bei 60°C für 20 Stunden inkubiert, um die Hybridisierung zu bewirken. Die Reaktionsmischung wurde der Autoradio graphie, wie oben beschrieben, zugeführt, um Phagen DNA Klone zu selektieren, die stark mit der Sonde 2 hybridisierten.
Unter Verwendung herkömmlicher Techniken wurden die Klone in Escherichia coli amplifiziert, anschließend wurde rekombinante DNA aus den Zellen extrahiert. Die rekombinante DNA wurde mit Eco RI, einem Restriktionsenzym, gespalten. Der Plasmidvektor pUCl9 (ATCC 37254) wurde mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten, und die gebildeten geschnittenen DNA Fragmente und Plasmidfragmente wurden mit DNA Ligase ligiert, wodurch eine rekombinante DNA erhalten wurde, die anschließend mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens unter Verwendung kompetenter Zellen in den Stamm Escherichia coli JM109 (ATCC 53323) eingeführt wurde, wodurch eine Transformante erhalten wurde.
Beispiel A-3-6
Bestimmung der Basensequenz der DNA und der Aminosäuresequenz des Polypeptids
Die Transformante aus Beispiel A-3-5 wurde in L-broth (pH 7,2) inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden unter Schütteln inkubiert. Die resultierenden proliferierenden Zellen wurden gesammelt und mit einem herkömmlichen Alkali-SDS Verfahren behandelt, wodurch eine rekombinante DNA erhalten wurde, welche die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung aufwies. Die Analyse in einem automatischen Sequenziergerät unter Verwendung eines Fluorphotometers zeigte, daß die rekombinante DNA die Basensequenz in SEQ ID NO: 3 aufweist. Die Decodierung der Basensequenz zeigte, daß sie die Aminosäuresequenz in SEG ID NO: 3 kodiert. Die Aminosäuresequenz weist die teilweisen Aminosäuresequenzen in SEQ ID NOs: 4 und 5 auf, die den Aminosäurepositionen von 79 bis 103 und von 26 bis 43 in SEQ ID NO: 3 entsprechen, und dies bedeutet, daß in Mäusen das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 ebenfalls von der DNA in SEQ ID NO: 3 kodiert wird, wobei das Symbol "Xaa" "Methionin" oder "Threonin" bedeutet:
SEQ ID NO: 5:
In den folgenden Beispielen A-4 bis A-7 wird eine cDNA, die ein anderes Polypeptid kodiert, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert, aus humaner Leber mRNA hergestellt, wobei als Sonde ein DNA Fragment mit der Basensequenz in SEQ ID NO: 3 verwendet wird. Die cDNA wurde hinsichtlich ihrer Basensequenz analysiert und decodiert, um die Aminosäuresequenz des Polypeptids zu bestimmen. Die cDNA wurde in Escherichia coli exprimiert, und anschließend wurden die Merkmale und Eigenschaften des gebildeten Polypeptids untersucht.
Beispiel A-4
Basensequenz der DNA, die für das Polypeptid kodiert und Aminosäuresequenz des Polypeptids
Beispiel A-4-1
Herstellung der cDNA Bibliothek
Die cDNA Bibliothek wurde aus einer humanen Leber RNA hergestellt, die mit "POLY A" ergänzt wurde, einem Produkt, das kommerziell erhältlich ist bei Clonatec-BIOSOFT, Paris Cedex, Frankreich unter Verwendung von "cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS", einem cDNA Klonierungskit, der kommerziell erhältlich ist bei Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA. Die Herstellungsverfahren waren wie folgt: In ein 1,5 ml Reaktionsröhrchen wurden nacheinander gegeben 10 μl einer Lösung zur Synthese des ersten Stranges der cDNA, 2,5 μl 1 mM Natriumpyrophosphat, 2,5 μl einer Lösung enthaltend 1 μg/l humanen Plazentaribonucleaseinhibitor, 5 μl einer Lösung enthaltend 1 μg/l Deoxynucleotidtriphosphatmischung, 2,5 μl einer Lösung enthaltend 1 μg/l Oligo-dT Primer, 5 μl humane Leber RNA ergänzt mit Poly(A), und die Mischung wurde auf 45 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt. Anschließend wurde die resultierende Mischung mit 5 μl einer Lösung enthaltend 100 units einer reversen Transkriptase gemischt und bei 42°C für 40 min inkubiert, wodurch eine Reaktionsmischung erhalten wurde, die den ersten Strang der cDNA enthielt.
Zu der Reaktionsmischung wurden hinzugefügt 93,5 μl einer Lösung zur Synthese des zweiten Strangs der cDNA, 4 units Ribonuclease H die von Escherichia coli abgeleitet ist, 115 units DNA Polymerase, und die Mischung wurde auf 250 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt. Die resultierende Mischung wurde nacheinander bei 12°C für 60 min, bei 22°C für 60 min und bei 70°C für 10 min inkubiert, mit 10 units T4 Polymerase gemischt und weiterhin bei 37°C für 10 min inkubiert. Zu der Reaktionsmischung wurden 10 μl 0, 25 M EDTA (pH 8, 0) hinzugefügt um die Reaktion zu suspendieren, und die resultierende Mischung wurde in herkömmlicher Weise mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol behandelt um die gewünschte zweite Strang cDNA zu präzipitieren, anschließend wurde das Präzipitat gewonnen.
Zu der so erhaltenen zweite Strang cDNA wurden hinzugefügt 2 μl L/K Puffer (pH 8,0), 250 pM Eco RI Adapter und 2,5 units T4 DNA Ligase, und die resultierende Lösung wurde auf 20 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt und bei 15°C für 16 Stunden inkubiert, um die Eco RI Adapter an beide Enden der cDNA zu ligieren. Die resultierende Mischung wurde anschließend mit 2 μl 0, 25 M EDTA gemischt um die Reaktion zu suspendieren und der Molekularsiebchromatographie zugeführt um intakte Eco RI Adapter zu entfernen. Zu der resultierenden Mischung wurden 40 μl L/K Puffer (pH 8,0) und 80 units T4 Polynucleotidkinase hinzugefügt, und die Mischung wurde auf 400 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt, anschließend wurde bei 37°C für 30 min inkubiert um die Eco RI Schnittstellen zu methylieren. Die resultierende Mischung wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol behandelt um die gewünschte cDNA zu präzipitieren, anschließend wurde die cDNA ge wonnen. Zu der cDNA wurden 1,5 μl L/K Puffer (pH 8, 0) enthaltend eine angemessene Menge an λgt 10 Armen, und 2,5 units T4 DNA Ligase hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde auf 15 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt, bei 15°C für 16 Stunden inkubiert um die Ligation zu bewirken und einem herkömmlichen in vitro Verpackungsverfahren zugeführt um einen Phagen zu erhalten, der eine rekombinante λDNA aufweist.
Beispiel A-4-2
Klonierung der rekombinanten DNA
Eine Impfkultur des Stammes Escherichia coli NM514 wurde in herkömmlicher Weise mit dem Phagen aus Beispiel A-4-1 infiziert, und die inifizierten Zellen wurden auf eine Agarplatte (pH 7,0) enthaltend 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid und 15 g/l Bacto-Agar inokuliert und bei 37°C für 16 Stunden zur Bildung von Plaques inkubiert. Unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wurde die Agarplatte mit einer Nylonmembran bedeckt, die für 30 Sekunden liegengelassen wurde, wodurch die Plaques an sie anhefteten. Anschließend wurde die Nylonmembran von der Platte abgezogen und nacheinander in einer wässrigen Lösung enthaltend 0,5 N Natriumhydroxid und 1,5 M Natriumchlorid für 7 min sowie in 0,5 M Tris-HCl Puffer (pH 7,0) enthaltend 1,5 M Natriumchlorid für 3 min geschwenkt. Die Nylonmembran wurde mit 2 × SSC gewaschen, luftgetrocknet, in 0,5 N Natriumhydroxid für 20 min geschwenkt, mit 5 × SSC gewaschen, luftgetrocknet, in einer Lösung enthaltend 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 w/v % SDS und denaturierte Lachssperma DNA geschwenkt und bei 65°C für 3 Stunden inkubiert. Um die gewünschte rekombinante DNA zu klonieren wurde ein DNA Fragment mit der Basensequenz in SEQ ID NO: 3 mit ³²P markiert unter Verwendung von "RERDY PRIME DNA LABELLING SY-STEM", einem DNA Markierungskit, der kommerziell erhältlich ist bei Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, USA, wodurch die Sonde 3 erhalten wurde. Die Herstellungsverfahren waren wie folgt: in ein 1,5 ml Reaktionsröhrchen wurde 25 ng eines DNA Fragments, das nach dem Verfahren in Beispiel A-3-5 hergestellt wurde, gegeben, die Mischung wurde auf 45 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt, bei 95°C für 3 min inkubiert und in ein anderes Reaktionsröhrchen überführt. In dem Reaktionsröhrchen wurden 5 μl [α-³²P]dCTP Lösung hinzugefügt und durch Inkubation bei 37°C für 30 min markiert. Danach wurde das resultierende Produkt, welches das markierte DNA Fragment enthielt, einer herkömmlichen Molekularsiebchromatographie zugeführt, um intaktes [α-³²P] zu entfernen.
Die oben genannte Nylonmembran wurde in einer Mischlösung enthaltend 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 w/v % SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachssperma DNA geschwenkt, und die Mischung wurde bei 60°C für 20 Stunden inkubiert um die Hybridisierung zu bewirken und anschließend weiter bei Raumtemperatur in 6 × SSC für 20 min und in 2 × SSC für 20 min inkubiert. Das resultierende Produkt wurde gewaschen und der Autoradiographie, wie oben beschrieben, zugeführt, um Phagen DNA Klone zu selektieren, die stark mit der Sonde 3 hybridisierten. Unter Verwendung von herkömmlichen Techniken wurden die DNA Klone in Escherichia coli amplifiziert, anschließend wurde eine rekombinante DNA aus den Zellen extrahiert. Die rekombinante DNA wurde mit Eco RI, einem Restriktionsenzym, gespalten. Der Plasmidvektor pUC19 (ATCC 37254) wurde mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten, und die gespaltenen DNA Fragmente und Plasmidfragmente wurden mit DNA Ligase ligiert, wodurch eine rekombinante DNA erhalten wurde, die anschließend in den Stamm Escherichia coli JM109 (ATCC 53323) mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens unter Verwendung von kompetenten Zellen eingeführt wurde, wodurch eine Transformante erhalten wurde, welche die erfindungsgemäße DNA aufweist.
Beispiel A-4-3
Bestimmung der Basensequenz und der Aminosäuresequenz des Polypeptids
Die Transformante aus Beispiel A-4-2 wurde in L-broth (pH 7,2) enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden unter Schütteln kultiviert. Die proliferierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und mit einem herkömmlichen Alkali-SDS Verfahren behandelt um eine rekombinante DNA zu extrahieren. Die Analyse der Basensequenz in einem automatischen Sequenziergerät unter Verwendung eines Fluorphotometers zeigte, daß die rekombinante DNA die Basensequenz in SEQ ID NO: 6 aufweist. Die von der Basensequenz abgeleitete Aminosäuresequenz ist ebenfalls in SEQ ID NO: 6 gezeigt, und dies bedeutet, daß das erfindungsgemäße Polypeptid eine Aminosäuresequenz beispielsweise jene in SEQ ID NO: 1 aufweist, und daß das Polypeptid von der DNA mit der Basensequenz in SEQ ID NO: 2 kodiert wird. In SEQ ID NO: 6 bedeutet die Aminosäure, die als "Xaa" gezeigt ist "Isoleucin" oder "Threonin".
Beispiel A-5
Herstellung von vermehrungsfähiger rekombinanter DNA und Transformante
In ein 0,5 ml Reaktionsröhrchen wurden hinzugefügt 8 μl 25 mM Magnesiumchlorid, 10 μl 10 × PCR Puffer, 8 μl 1 mM dNTP Mix, 0,5 μl einer Lösung enthaltend 2,5 units/μl AmpliTaq DNA Polymerase und 1 ng der rekombinanten DNA aus Beispiel A-4-2. Die resultierende Mischung wurde mit angemessenen Mengen zweier Oligonucleotide als Senseprimer oder Anti-Senseprimer gemischt, welche die Basensequenzen 5'-CGAGGGATCCTACTTTGGCAAGCTTG-3' und 5'-CAAGGRATTCCTAGTCTTCGTTTTG-3' aufweisen und die basierend auf den Basensequenzen nahe der N- und C-Termini in SEQ ID NO: 1 chemisch synthetisiert und auf ein Volumen von 100 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt worden waren. Die resultierende Mischung wurde in herkömmlicher Weise nacheinan der bei 94°C für 1 min, bei 60°C für 2 min und bei 72°C für 3 min inkubiert, und dieser Inkubationszyklus wurde 40-mal wiederholt, wodurch ein PCR Produkt erhalten wurde, das anschließend mit Bam HI und Eco RI als Restriktionsenzyme gespalten wurde, wodurch ein Bam HI-Eco RI DNA Fragment erhalten wurde. Das so erhaltene Bam HI-Eco RI DNA Fragment wurde mit einer angemessenen Menge an sterilisiertem destillierten Wasser gemischt. Die Lösung wurde gemischt mit 10 ng "pGEX-2T", einem Plasmidvektor der kommerziell erhältlich ist bei Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, der zuvor mit Bam HI und Eco RI als Restriktionsenzym gespalten worden war, 10 μl 10 × Ligationspuffer und einer angemessenen Menge an 10 mM ATP in einer Endkonzentration von 1 mM, anschließend wurde die Lösung bei 16°C für 18 Stunden inkubiert, wodurch die vermehrungsfähige rekombinante DNA pHIGIF erhalten wurde.
Die rekombinante DNA pHIGIF wurde in den Stamm Escherichia coli DH5α, der kommerziell erhältlich ist bei Toyobo Co., Ltd., Tokyo, Japan eingeführt und die resultierende Transformante "HIGIF" wurde in L-broth (pH 7,2) enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden unter Schütteln inkubiert. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, wodurch die proliferierten Transformanten erhalten wurden, die anschließend einem herkömmlichen Alkali-SDS Verfahren zugeführt wurden, um die rekombinante DNA pHIGIF zu extrahieren. Die Analyse der rekombinanten pHIGIF mit Hilfe des Dideoxyverfahrens zeigte, wie in 2 gezeigt, die "HIGIF cDNA" oder cDNA in SEQ ID NO: 2, ligiert an die Enden stromabwärts der Gene für den Tac Promotor und Glutathion-S-Transferase.
Beispiel A-6
Herstellung des Polypeptids aus der Transformante
Die Transformante HIGIF aus Beispiel A-5 wurde in T-broth (pH 7,2) enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden unter Schütteln inkubiert, wodurch eine Impfkultur erhalten wurde. 18 l Aliquots einer frischen Präparation T-broth (pH 7,2) wurden in einen 30 l Rüttelfermenter gegeben, mit 1 v/v % der Impfkultur inokuliert und bei 37°C unter Belüften und Schütteln kultiviert. Während der Kultivierung wurden aus der Kultur Proben entnommen und bezüglich ihrer Absorption bei einer Wellenlänge von 650 nm überwacht, und als die Absorption einen Wert von ca. 1,5 erreicht hatte wurde IPTG zu der Kultur in einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben. Anschließend wurde die Kultur für weitere 5 Stunden inkubiert, anschließend zentrifugiert um die Zellen von der Kultur zu trennen. Die Zellen wurden in einer Mischlösung (pH 7,2) enthaltend 139 mM Natriumchlorid, 7 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 3 mM Natriumdihydrogenphosphat suspendiert, in herkömmlicher Weise mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert um einen Überstand zu erhalten.
Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die mit "GLUTATHION SEPHAROSE 4B", einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, bestückt war und die zuvor mit einer Mischlösung (pH 7,2) enthaltend 139 mM Natriumchlorid, 7 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 3 mM Natriumdihydrogenphosphat equilibriert worden war. Die Säule wurde mit einer frischen Präparation der gleichen Mischlösung gewaschen, und es wurden 100 U Thrombin zu 1 ml des Gels in der Säule hinzugefügt, wodurch eine enzymatische Spaltungsreaktion bewirkt wurde, während die Säule bei Raumtemperatur für 16 Stunden stehengelassen wurde. Die Säule wurde mit einer frischen Präparation der gleichen Mischlösung beladen um das Reaktionsprodukt zu eluieren, und das Eluat wurde auf eine Säule geladen, die mit "SUPERDEX 75", einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, bestückt worden war, anschließend wurden Fraktionen, die ca. 18.500 Daltons entsprachen, gesammelt. Die Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert und lyophilisiert, wodurch ein festes Produkt erhalten wurde, welches das erfindungsgemäße Polypeptid in einer Ausbeute von ca. 80 μg pro 1 l Kultur enthielt.
Beispiel A-7
Physikalisch-chemische Eigenschaft des Polypeptids
Beispiel A-7-1
Molekulargewicht
In Übereinstimmung mit dem Verfahren, das beschrieben ist bei U. K. Laemmli in Nature, Vol. 227, S. 680–685 (1970), wurde das gereinigte Polypeptid, welches nach dem Verfahren in Beispiel A-6 hergestellt wurde, in einem Sodium-Dedecylsulfat (SDS) Polyacrylamidgel ohne reduzierende Mittel elektrophorisiert, wobei sich im wesentlichen eine einzelne Proteinbande mit einer IFN-γ Induktivität bei einer Position, die ca. 18.500 ± 3.000 Daltons entsprach, zeigte. Die Markerproteine, die in diesem Versuch verwendet wurden waren Kälberserumalbumin (MW = 67.000 Daltons), Ovalbumin (MW = 45.000 Daltons), Sojabohnentrypsininhibitor (MW = 20.100 Daltons) und α-Lactalbumin (MW = 14.400 Daltons).
Beispiel A-7-2
Isoelektrischer Punkt
Das gereinigte Polypeptid aus Beispiel A-6 wurde chromatofokusiert, wobei sich ein isoelektrischer Punkt von ca. 4, 9 ± 1, 0 zeigte.
Beispiel A-7-3
Aminosäuresequenz enthaltend den N-Terminus
Das gereinigte Polypeptid aus Beispiel A-6 wurde mit Hilfe eines "MODEL 473 A", einem Proteinsequenziergerät, das kommerziell erhältlich ist bei Perkin-Elmer Corp., Instrument Div., Norwalk, USA analysiert, und es zeigte sich, daß es die Peptidstruktur "Gly-Ser-" besitzt, verbunden mit dem Tyrosinrest in der N-terminalen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 7, durch das Hinzufügen von Glutathion-S-Transferase und durch die Spaltung mit Thrombin.
SEQ ID NO: 7:
Beispiel A-7-4(a)
Biologische Aktivität
Aus weiblichen, 8 Wochen alten C3H/HeJ Mäusen wurden die Milzen entnommen, die anschließend in serumfreiem RPMI 1640 Medium (pH 7,4) suspendiert wurden, und die resultierenden Zellen wurden mit einer frischen Präparation des gleichen Mediums gewaschen und in Gey Lösung (pH 8,0) geschwenkt, wodurch Hämolyse bewirkt wurde. Die resultierenden Milzzellen wurden in RPMI 1640 Medium (pH 7,4), das mit 10 v/v % Kälberserum ergänzt war in einer Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert. 10 ml Aliquots der Zellsuspension wurden auf Plastikpetrischalen, die einen Durchmesser von 9 cm aufwiesen, verteilt und bei 37°C für 1 Stunde in einem 5 v/v % CO₂ Inkubator inkubiert. Für die Verwendung in dem folgenden Versuch zur IFN-γ Induktion wurden nur Zellen verwendet, die in den resultierenden Kulturen schwammen, sie wurden gesammelt und mit RPMI 1640 Medium (pH 7,4), das mit 10 v/v % Kälberserum ergänzt worden war, gewaschen.
Maus-Milzzellen wurden in RPMI 1640 Medium (pH 7,4), das mit 10 v/v % Kälberserum ergänzt worden war in einer Zelldichte von 1 10⁷ Zellen/ml suspendiert, und es wurden 0,15 ml Aliquots davon in 96 well Mikroplatten gegeben, anschließend wurden zu jedem well 0,05 ml einer Lösung eines gereinigten Polypeptids, das mit einer frischen Präparation des gleichen Mediums verdünnt worden war, gegeben, und die Zellen wurden mit oder ohne den Zusatz von 0,05 ml 2,5 μg/ml Concanavalin A oder 50 units/ml Interleukin 2 bei 37°C für 24 Stunden in einem 5 v/v % CO₂ Inkubator inkubiert. Nachdem die Kultivierung beendet war, wurden 0,1 ml des resultierenden Überstandes in jedem well getestet, um die Aktivität des gebildeten IFN-γ mit Hilfe eines Enzymimmunassays zu bestimmen. Als Kontrolle wurde ein System verwen det, das dem oben beschriebenen System entsprach, und es wurde wie oben beschrieben behandelt, mit dem Unterschied, daß kein gereinigtes Polypeptid, Concanavalin A und Interleukin 2 verwendet wurde. Als IFN-γ Standard wurde eine Maus IFN-γ Präparation Gg02-901-533, die vom Nationalen Gesundheitsinstitut, USA erhalten wurde, verwendet, und die Aktivität wurde in internationalen units (IU) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Anmerkung: In der Tabelle bedeutet "Probe" das erfindungsgemäße Polypeptid.
Beispiel A-7-4 (b)
Induktion der IFN-γ Produktion in humanen Lymphozyten
Unter Verwendung einer Spritze die Heparin enthielt, wurde einem gesunden Spender Blut entnommen, das anschließend zweifach mit serumfreiem RPMI 1640 Medium (pH 7,4) verdünnt wurde, und es wurde auf Ficoll überschichtet. Anschließend wurde bei 2.000 rpm für 20 min zentrifugiert um Lymphozyten zu erhalten, die anschließend mit RPMI 1640 Medium (pH 7,4) das mit 10 v/v Kälberserum ergänzt worden war, gewaschen wurden, in einer frischen Präparation des gleichen Mediums in der Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert wurden und wie in Beispiel A-7-4(a) behandelt wurden, mit der Ausnahme, daß ein humaner IFN-γ Standard, Gg23-901-530, der vom Nationalen Gesundheitsinstitut, USA erhalten wurde, als IFN-γ Standard verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Anmerkung: In der Tabelle bedeutet "Probe" das erfindungsgemäße Polypeptid.
Die Ergebnisse in den Tabellen 1 und 2 beweisen, daß das erfindungsgemäße Polypeptid eine Aktivität besitzt, die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen von Säugetieren, einschließlich des Menschen und der Maus zu induzieren. In den Kontrollgruppen wurde keine signifikante IFN-γ Produktion gefunden, während in den Systemen mit dem Polypeptid eine IFN-γ Produktion beobachtet wurde. Diese Aktivität des Polypeptids ist stark erhöht, wenn es in Kombination mit Concanavalin A oder Interleukin 2 als Kofaktor verwendet wird.
Beispiel A-7-4(c)
Produktion von IFN-γ durch immunkompetente Zellen
Von gesunden Spendern wurde mit Hilfe von heparinhaltigen Spritzen frisches Blut entnommen und mit serumfreiem RPMI 1640 Medium (pH 7,4) zweifach verdünnt. Das verdünnte Blut wurde auf Ficoll überschichtet und zentrifugiert um Lymphozyten zu erhalten die anschließend mit RPMI 1640 Medium (pH 7,4), das mit 10 v/v % Kälberserum ergänzt worden war, gewaschen und in einer frischen Präparation des gleichen Mediums in einer Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert wurden. Die Zellsuspension wurde auf 96-well Mikroplatten in einer Menge von 0,15 ml/well verteilt.
Ein Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, wurde mit RPMI 1640 Medium (pH 7,4), das mit 10 v/v fötalem Kälberserum ergänzt worden war, zu einer angemessenen Konzentration verdünnt, und die verdünnte Lösung wurde auf die Mikroplatten in einer Menge von 0,05 ml/well verteilt, anschließend wurde den Mikroplatten 0,05 ml/well einer frischen Präparation des gleichen Mediums hinzugefügt, das mit oder ohne 2,5 μg/ml Concanavalin A oder 50 units/ml rekombinantem humanen Interleukin 2 ergänzt worden war, und die Mikroplatten wurden bei 37°C für 24 Stunden in einem Inkubator unter 5 v/v % CO₂ Bedingungen inkubiert. Nach der Kultivierung wurden 0,1 ml eines Kulturüberstandes in jedem well als Probe verwendet und hinsichtlich des IFN-γ Gehaltes mit Hilfe eines herkömmlichen Enzymimmunassays untersucht. Als Kontrolle wurde ein System ohne das Polypeptid verwendet und in der gleichen Weise wie oben beschrieben behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Für die Tabelle wurde der IFN-γ Gehalt unter Verwendung von Gg-23-901-530, einem internationalen Standard für Interferon, human (HuIFN-γ), das vom Nationalen Gesundheitsinstitut, Bethesda, MD, USA erhalten wurde, kalibriert und in internationalen units (IU) ausgedrückt.
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, daß Lymphozyten als immunkompetente Zellen IFN-γ produzieren, wenn das Polypeptid auf sie einwirkt. Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, verstärkt die gemeinsame Verwendung des Polypeptids und Interleukin 2 oder Concanavalin A als Kofaktor die IFN-γ Produktion.
Beispiel A-7-4 (d)
Verstärkung der Zytotoxizität durch NK-Zellen
Gesunden Spendern wurde mit heparinhaltigen Spritzen frisches Blut entnommen und zweifach mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) enthaltend 140 mM Natriumchlorid verdünnt. Das Blut wurde auf PERCOLL überschichtet und zentrifugiert und anschließend einer PERCOLL Gradientenzentrifugation zugeführt, wodurch stark verdichtete Lymphozyten erhalten wurden.
Die Lymphozyten wurden in RPMI 1640 Medium (pH 7,2) enthaltend 10 μg/ml Kanamycin, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 10 v/v fötales Kälberserum in einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde auf 12-well Mikroplatten in einer Menge von 0,5 ml/well verteilt. Ein Polypeptid das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, wurde mit einer frischen Präparation des gleichen Mediums geeignet verdünnt, und die verdünnte Lösung wurde auf die Mikroplatten in einer Menge von 1,5 ml/well verteilt, anschließend wurde auf die Mikroplatten 0,5 ml/well einer frischen Präparation des gleichen Mediums mit oder ohne 50 units/ml rekombinantem humanen Interleukin 2 verteilt, anschließend wurden die Mikroplatten in einem Inkubator bei 37°C für 24 Stunden unter 5 v/v CO₂ Bedingungen inkubiert, die Mikroplatten wurden mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) enthaltend 140 mM Natriumchlorid gewaschen, wodurch kultivierte Lymphozyten enthaltend NK-Zellen als Effektorzellen erhalten wurden. K-562 Zellen (ATCC CCL 243), abgeleitet von humaner chronischer myelogener Leukämie, als eine NK-Zellen empfängliche Zielzelle, die in herkömmlicher Weise mit ⁵¹Cr markiert wurden, wurden auf 96-well Mikroplatten zu 1 × 10⁴ Zellen/well verteilt, und die Effektorzellen wurden zu jedem well in einem Verhältnis ((Effektorzellen): (Zielzellen)) von 2,5 : 1, 5 : 1 oder 10 : 1 hinzufügt und in einem Inkubator bei 37°C für 4 Stunden unter 5 v/v % CO₂ Bedingungen inkubiert. Unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens wurde die Radioaktivität jedes Überstandes in jedem well gemessen, um die toten Zielzellen zu zählen. In jedem System wurde der Prozentsatz (%) der toten Zielzellen im Verhältnis zu den Zielzellen berechnet um den Zytotoxizitätsbereich zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß das Polypeptid eine Aktivität zur Verstärkung der Zytotoxizität durch NK-Zellen besitzt. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, verstärkt die gleichzeitige Anwesenheit von Interleukin 2 die Zytotoxizität.
Beispiel A-7-4 (e)
Induktion der Bildung von LAK-Zellen
Unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wurden ⁵¹Cr markierte Raji Zellen (ATCC CCL 86), abgeleitet von humanem Burkitt Lymphom als einer Zielzelle, die für NK-Zellen nicht empfänglich ist, in 96 well Mikroplatten zu 1 × 10⁴ Zellen/well gegeben und für 72 Stunden kultiviert. Kultivierte Lymphozyten enthaltend LAK-Zellen als Effektorzelle, die wie in Beispiel A-7-4(d) beschrieben hergestellt wurden und Zielzellen wurden zu den Mikroplatten in einem Verhältnis von 5 : 1, 10 : 1 oder 20 1 hinzugefügt, und die Mikroplatten wurden in einem Inkubator bei 37°C für 4 Stunden unter 5 v/v % CO₂ Bedingungen inkubiert. Danach wurde die Radioaktivität jedes Überstandes in jedem well gemessen, und die Zytotoxizität (%) wurde wie in Beispiel A-7-4(d) beschrieben, berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, daß das Polypeptid eine Aktivität besitzt, die Bildung von LAK-Zellen zu induzieren. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, verstärkt die gleichzeitige Anwesenheit von Interleukin 2 die Induktion.
Beispiel A-7-4 (f)
Akuter Toxizitätstest
Unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wurde ein gereinigtes Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, perkutan, peroral oder intraperitoneal 8 Wochen alten Mäusen verabreicht. Im Ergebnis war die LD_5O des gereinigten Polypeptids ca. 1 mg/kg oder höher, unabhängig von der Art der Verabreichung. Dies beweist, daß das Polypeptid sicher in Arzneimittel zur Verabreichung an Menschen inkorporiert werden kann.
Es ist bekannt, daß IFN-γs durch den Infektionsschutz gegen Baktieren, die wachstumsverhindernde Aktivität in bösartigen Tumoren und die immunregulatorische Aktivität, stark mit der humanen Biophylaxe verbunden sind. Wie oben bereits beschrieben, wurden die IFN-γs als Mittel für assoziierte Krankheiten des Menschen entwickelt, und die Zielkrankheiten, Dosen, Verabreichungswege und Sicherheit wurden intensiv untersucht. Wie in "Cytokines in Cancer Therapy" herausgegeben von Frances R. Balkwill, übersetzt von Yoshihiko WATANABE (1991), veröffentlicht von Tokyo-Kagaku-Dojin, Tokyo, Japan beschrieben ist, wurden nahezu befriedigende Ergebnisse erzielt, wenn eine Behandlung unter Verwendung von Killerzellen wie NK-Zellen und LAK-Zellen auf eine Vielzahl von humanen Krankheiten einschließlich der Antitumorimmuntherapie angewendet wurden. Kürzlich wurde festgestellt, daß eine Verbindung besteht zwischen dem therapeutischen Effekt und der Induktion von Killerzellen oder der Verstärkung der Zytotoxizität von Killerzellen unter Verwendung von Zytokinen. Beispielsweise berichtete T. FUJIOKA in "British Journal of Urology", Vol. 73, Nr. 1, S. 23 – 31 (1994), daß in der Antitumorimmuntherapie bei der Verwendung von LAK-Zellen und Interleukin 2, das Interleukin 2 die LAK-Zellbildung stark induzierte, und eine bemerkenswerte Krebs-Metastase-inhibitorische Wirkung auf menschliche Krebsarten ausübte, ohne ernsthafte Nebenwirkungen zu induzieren.
Daher konnte gezeigt werden, daß IFN-γs und Killerzellen die Behandlung und/oder die Prävention einer Vielzahl von humanen Krankheiten stark beeinflussen und zu deren vollständiger Behandlung oder Rückgang stark beitragen. Unter diesen Umständen und wie aus den Ergebnissen der Beispiele A-7-4(c) und A-7-4(f) ersichtlich ist, induziert das Polypeptid die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen und verstärkt die Zytotoxizität durch NK-Zellen oder induziert die Bildung von LAK-Zellen ohne ernsthafte Nebenwirkungen zu bewirken. Diese Tatsachen zeigen, daß das erfindungsgemäße Polypeptid wiederholt den Menschen verabreicht werden kann ohne ernste Nebenwirkungen zu induzieren, und daß es eine befriedigende Wirkung in der Behandlung und/oder der Prävention von Krankheiten, die in engem Zusammenhang mit IFN-γs und Killerzellen stehen, ausübt.
Beispiel B-1
Herstellung der Hybridoma B-1
Beispiel B-1-1
Herstellung der Transformante KGFHH2
Zu einem 0,5 ml Reaktionsröhrchen wurden hinzugefügt 8 μl 25 mM Magnesiumchlorid, 10 μl 10 × PCR Puffer, 1 μl 25 mM dNTP Mix, 1 μl 2,5 units/μl AmpliTaq DNA Polymerase, 1 ng einer rekombinanten DNA, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 8 aufweist, die aus einem Phagen DNA Klon hergestellt wurde und die eine DNA enthält, welche das Polypeptid in SEQ ID NO: 1 kodiert, und eine angemessene Menge eines Senseprimers und eines Anti-Senseprimers, nämlich 5'-ATAGAATTCAAATGTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3', chemisch synthetisiert basierend auf einer Aminosäuresequenz nahe der N- und C-Termini von SEQ ID NO: 1 und 5'-ATAAAGCTTCTAGTCTT CGTTTTGAAC-3', und die Mischlösung wurde auf ein Gesamtvolumen von 100 μl mit sterilisiertem destillierten Wasser aufgefüllt. Die Mischlösung wurde in herkömmlicher Weise nacheinander bei 94°C für 1 min bei 43°C für 1 min und bei 72°C für 1 min inkubiert, und diese aufeinanderfolgende Inkubation wurde dreimal wiederholt. Die resultierende Mischung wurde weiterhin nacheinander bei 94°C für 1 min, bei 60°C für 1 min und bei 72°C für 1 min inkubiert, und diese aufeinanderfolgende Inkubation wurde 40-mal wiederholt, wodurch die PCR Reaktion bewirkt wurde.
Die resultierende PCR Reaktionsmischung und "pCR-Script SK (+)", ein Plasmidvektor, der kommerziell erhältlich ist bei Stratagene Cloning Systems, California, USA, wurden mit DNA Ligase ligiert, wodurch eine rekombinante DNA erhalten wurde, die anschließend in kompetente Zellen von "Escherichia coli XL-1 Blue MRF'Kan", ein Mikroorganismus, der kommerziell erhältlich ist bei Stratagene Cloning Systems, California, USA eingeführt wurde um den Mikroorganismus zu transformieren. Die so erhaltene Transformante wurde in L-broth (pH 7,2) enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden unter Schütteln inkubiert, anschließend wurde die resultierende Kultur zentrifugiert um die proliferierten Transformanten zu sammeln, und die rekombinanten DNAs wurden unter Verwendung eines herkömmlichen Alkali-SDS Verfahrens isoliert. Ein Teil der rekombinanten DNAs wurde verwendet und unter Verwendung eines Dideoxyverfahrens analysiert und es zeigte sich, daß sie eine DNA enthielten, die Eco RI und Hind III Schnittstellen an den 5'- und 3'-Termini von SEQ ID NO: 8, ein Methionincodon, das die Polypeptidsynthese initiiert und Positionen in den Stellen, die jenen vor und nach den N- und C-Termini von SEQ ID NO: 8 entsprechen und ein TAG Codon, welches die Polypeptidsynthese terminiert, besitzt.
SEQ ID NO: 8:
Die verbleibenden rekombinanten DNAs wurden mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Hind III gespalten, und 0,1 μg der resultierenden Eco RI-Hind III DNA Fragmente, die erhalten wurden mit "DNA LIGATION KIT Version 2", einem DNA Ligationskit, der kommerziell erhältlich ist bei Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japan und 10 ng "pKK223-3", einem Plasmidvektor, der kommerziell erhältlich ist bei Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, der zuvor mit den oben genannten Restriktionsenzymen gespalten wurde, wurden durch ihre Inkubation bei 16°C für 30 min ligiert, wodurch eine vermehrungsfähige rekombinante DNA "pKGFHH2" erhalten wurde. Unter Verwendung von kompetenten Zellen wurde der Stamm Escherichia coli Y1090 (ATCC 37197) mit der vermehrungsfähigen rekombinanten DNA pKGFHH2 transformiert, und die gebildete Transformante "KGFHH2" wurde in L-broth (pH 7,2) enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und bei 37°C für 18 Stunden unter Schütteln inkubiert. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert um die proliferierten Transformanten zu sammeln, und ein Teil davon wurde mit Hilfe eines herkömmlichen SDS-Alkaliverfahrens behandelt, um die rekombinante DNA pKGFHH2 zu extrahieren. Wie in 3 dargestellt ist, zeigte die Analyse mit Hilfe des Dideoxyverfahrens, daß in der rekombinanten DNA pKGFHH2 die KGFHH2 cDNA, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 8 besitzt, stromabwärts eines Tac-Promotors ligiert war.
Beispiel B-1-2
Herstellung des Polypeptids aus der Transformante KGFHH2
L-broth (pH 7,2) enthaltend 50 μg/ml Ampicillin wurde durch Autoklavieren sterilisiert, auf 37°C abgekühlt, mit der Transformante KGFHH2 aus Beispiel B-1-1 inokuliert und bei der gleichen Temperatur für 18 Stunden unter Schütteln inkubiert, wodurch eine Impfkultur erhalten wurde. 18 l einer frischen Präparation des gleichen Mediums wurden in einem 20 l Rüttelfermenter gegeben, wie oben beschrieben sterilisiert, auf 37°C abgekühlt, mit 1 v/v o der Impfkultur inokuliert und bei der gleichen Temperatur für 8 Stunden unter Belüften und Rühren inkubiert. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert um die Zellen zu sammeln, die anschließend in einer Mischlösung (pH 7,3) bestehend aus 150 mM Natriumchlorid, 16 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 4 mM Natriumdihydrogenphosphat suspendiert, mit Ultraschall aufgeschlossen und zentrifugiert wurden, um Zellrückstände zu entfernen und einen Überstand zu erhalten.
Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat in einer Endkonzentration von 40 w/v % hinzugefügt und bis zur Homogenität gelöst, und die Lösung wurde zentrifugiert um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde zunächst mit 150 mM Phosphatpuffer (pH 6,6) enthaltend 1,5 M Ammoniumsulfat gemischt, anschließend auf eine Säule geladen, die mit "PHENYL SEPHAROSE" einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden bestückt worden war, und die zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6, 6) enthaltend 1,5 M Ammoniumsulfat equilibriert worden war, anschließend wurde die Säule mit einer frischen Präparation des glei chen Puffers gewaschen, und die Säule wurde mit einem Gradientenpuffer von Ammoniumsulfat im Bereich von 1,5 M bis 0 M in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,6) beladen.
Fraktionen, die bei ca. 1,0 M Ammoniumsulfat eluierten, wurden vereinigt, membranfiltriert, gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) bei 4°C für 18 Stunden dialysiert und auf eine Säule geladen, die mit "DEAE 5PW", einem Produkt, das kommerziell erhältlich ist bei Tosoh Corporation, Tokyo, Japan bestückt war und die zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) equilibriert worden war, anschließend wurde die Säule mit einer frischen Präparation des gleichen Puffers gewaschen, und es wurde ein linearer Gradientenpuffer enthaltend Natriumchlorid im Bereich von 0 M bis 0, 2 M in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6, 5) auf die Säule geladen, wobei Fraktionen gesammelt wurden, die bei 0,05 M Natriumchlorid eluierten.
Danach wurden die Fraktionen mit einer Membran konzentriert und auf eine Säule geladen, die mit "SUPER DEX 75", einem Produkt von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden bestückt war, und die mit Phosphat-gepufferter-Kochsalzlösung (im folgenden als "PBS" abgekürzt) equilibriert worden, anschließend wurde eine frische Präparation PBS auf die Säule geladen, um Fraktionen zu sammeln, die ca. 18.500 Daltons entsprachen. Auf diese Weise wurde eine wässrige Lösung enthaltend ca. 5,2 mg eines gereinigten Proteins erhalten. Die Gesamtausbeute im Verlauf der gesamten Reinigung betrug ca. 10%.
Das gereinigte Protein wurde analysiert und es zeigte sich, daß es die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften besitzt: wenn es in einem SDS-Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen elektrophoresiert wurde, zeigte sich das gereinigte Protein als eine Hauptproteinbande mit einer IFN-γ Induktivität bei einer Position die 18.500 ± 3.000 Daltons entsprach und ergab einen pI von 4,9 ± 1,0 in der Chromatofokusierung. Die Aminosäuresequenz, welche den N-Terminus des gereinigten Proteins aufweist, besaß die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 9, die identisch ist zu jener in SEQ ID NO: 1, in der Methionin an ihren N-Terminus angeheftet ist.
SEQ ID NO: 9:
Beispiel B-1-3
Präparation der Hybridoma H-1
10 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden intraperitoneal mit 20 μg/Maus des gereinigten Polypeptids, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde zusammen mit einem vollständigen Freund's Adjuvans injiziert. Die Mäuse wurden noch zweimal mit der gleichen Dosis in einem Zeitabstand von 2 Wochen injiziert und weiterhin intravenös mit der gleichen Dosis eine Woche nach der letzten Injektion injiziert, ihre Milzen wurden extrahiert und suspendiert, um eine Zellsuspension zu erhalten.
Die Milzzellen und SP2/O-Ag14 Zellen eines Mausmyeloms (ATCC CRL 1581) wurden in RPMI 1640 Medium (pH 7,2), das auf 37°C vorgewärmt wurde, in Zelldichten von jeweils 3 × 10⁴ Zellen/ml bzw. 1 × 10⁴ Zellen/ml suspendiert und zentrifugiert um das Sediment zu sammeln. 1 ml eines serumfreien RPMI 1640 Mediums (pH 7,2) enthaltend 50 w/v % Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1.500 Daltons wurde über 1 min dem Sediment tropfenweise hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 37°C für 1 min inkubiert, anschließend wurde der Mischung ein serumfreies RPMI 1640 Medium (pH 7,2) bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ml tropfenweise hinzugefügt, die Mischung wurde zentrifugiert und das gebildete Sediment gesammelt. Das so erhaltene Sediment wurde in HAT Medium suspendiert, auf 96 well Mikroplatten in einer Menge von 200 μl/well verteilt und bei 37°C für eine Woche inkubiert, anschließend wurden die Hybridoma selektiert.
Die Menge an Antikörpern, die in den Überstand jedes wells sekregiert wurde, wurde mit Hilfe eines Enzymimmunassays basierend auf der Immunreaktion der Antikörper mit dem gereinigten Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, untersucht, und Hybridoma, die fähig waren Antikörper zu produzieren, die stark mit dem gereinigten Polypeptid reagierten, wurden selektiert. Eine klonierte Hybridomazelle H-1, die fähig ist den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zu produzieren, wurde in herkömmlicher Weise durch wiederholte Behandlung dieser Hybridoma durch limitierte Verdünnung erhalten.
Beispiel B-2
Herstellung des monoklonalen Antikörpers H-1mAb und Analyse im Western Blot
Beispiel B-2-1
Herstellung des monoklonalen Antikörpers H-1mAb
Hybridoma H-1 Zellen, die mit Hilfe des Verfahrens im Beispiel B-1-3 erhalten wurden, wurden in RPMI 1640 Medium (pH 7,2), das mit 5 v/v % Kälberserum ergänzt worden war in einer Zelldichte von ca. 1 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert, und in einem Inkubator bei 37°C unter 5 v/v % CO₂ inkubiert, wobei der Maßstab der Kultur vergrößert wurde ("scaling up"). Als die Zelldichte der Kultur einen vorbestimmten Bereich erreicht hatte, wurden 1 × 10⁷ Zellen/Maus der proliferierten Hybridoma H-1 Zellen intraperitoneal in 8 Wochen alte BALB/c Mäuse injiziert, denen zuvor 0,5 ml/Maus Pristan intraperitoneal injiziert worden war, anschließend wurden die Mäuse in herkömmlicher Weise für eine Woche gefüttert.
Die Bauchhöhlenflüssigkeit der Mäuse wurde gesammelt, mit PBS dreifach verdünnt, mit Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 50 w/v % gemischt, bei 4°C für 24 Stunden stehengelassen und zentrifugiert um das Sediment zu sammeln. Das Sediment wurde gegen eine wässrige Lösung enthaltend 20 mM Kaliumdihydrogenphosphat (pH 6,7) bei 4°C über Nacht dialysiert und auf eine Hydroxyapatitsäule geladen, die zuvor mit einer frischen Präparation der gleichen wässrigen Lösung equilibriert worden war, anschließend wurde ein linearer Gradient enthaltend Kaliumdihydrogenphosphatpuffer (pH 6,7) im Bereich von 20 mM bis 300 mM auf die Säule geladen, wodurch eine wässrige Lösung erhalten wurde, die den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper H-1mAb aufwies. Die Ausbeute betrug ca. 5 mg pro Maus. Herkömmliche Analysen zeigten, daß der Antikörper zur Klasse Igel gehört.
Beispiel B-2-2
Analyse im Western Blot
1 μg eines gereinigten Polypeptids, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, wurde einer Mischlösung bestehend aus 100 mg Dithiothreitol, 0,5 μl einer 10 w/v % wässrigen SDS-Lösung und 1 ml Glycerol hinzugefügt, die Mischung wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und in einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoresiert. Das resultierende Gel wurde in herkömmlicher Weise auf eine Nitrozellulosemembran transferiert, die anschließend in einem Kulturüberstand der Hybridoma H-1 Zellen für 1 Stunde geschwenkt und mit 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5) enthaltend 0,05 v/v % Tween 20 gewaschen wurde, um überschüssige Mengen an Antikörpern zu entfernen. Die Membran wurde anschließend für 1 Stunde in PBS enthaltend einen aus Kaninchen gewonnenen Anti-Maus Ig-Antikörper geschwenkt, um eine Immunreaktion zu bewirken, sie wurde mit 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5) enthaltend 0,05 v/v % Tween 20 gewaschen und in 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,5) enthaltend 0,005 v/v % Hydrogenperoxid und 0,3 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidin geschwenkt, wodurch eine Färbung bewirkt wurde.
Als Kontrolle wurde ein System, das rekombinantes humanes Interleukin 12 anstelle des gereinigten Polypeptids aufwies, verwendet und wie oben beschrieben behandelt. Als Markerproteine wurden Kälberserumalbumin (MW = 67.000 Daltons), Ovalbumin (MW = 45.000 Daltons), Kohlensäureanhydrase (MW = 30.000 Daltons), Trypsininhibitor (MW = 20.100 Daltons) und α-Lactalbumin (MW = 14.400 Daltons) verwendet. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Wie aus 4 klar ersichtlich ist, reagierte der monoklonale Antikörper H-1mAb spezifisch mit dem gereinigten Polypeptid (Spur 1), das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 gewonnen wurde, aber nicht mit humanem Interleukin 12 (Spur 2). Dies beweist, daß der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper spezifisch mit dem Polypeptid mit einer spezifischen Aminosäuresequenz reagiert.
Beispiel B-3
Präparation des Hybridoms H-2 und monoklonaler Antikörper H-2mAb
Das Hybridom H-2, ein monokloner Antikörper, wurde ebenfalls nach dem Verfahren in Beispiel B-2-1 hergestellt, mit dem Unterschied, daß P3-X63-Ag8 Zellen (ATCC TIB9) anstelle von SP/O-14Ag Zellen verwendet wurden.
Beispiel B-3-2
Präparation des monoklonalen Antikörpers H-2mAb
Das Hybridom H-2 in Beispiel B-3-1 wurde genauso wie in Beispiel B-2-1 kultiviert, und die Kultur wurde gereinigt, wodurch ca. 5,6 mg des monoklonalen Antikörpers H-2mAb pro BALB/c Maus erhalten wurde. Herkömmliche Analysen zeigten, daß der monoklonale Antikörper zur Klasse IqM gehört und daß er spezifisch mit dem gereinigten Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, reagiert, als er in einem Western Blot wie in Beispiel B-2-2 analysiert wurde.
Beispiel B-4
Reinigung des Polypeptids durch Immunaffinitätschromatographie
Beispiel B-4-1
Präparation des Gels für die Immunaffinitätschromatographie
8 mg des monoklonalen Antikörpers H-1mAb, der nach dem Verfahren in Beispiel B-2-1 erhalten wurde, wurde gewogen und gegen 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) enthaltend 0,5 M Natriumchlorid bei 4°C über Nacht dialysiert. 4 g "CNBr-activated Sepharose 4B", ein wasserunlöslicher Träger, der kommerziell erhältlich ist bei Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, wurde mit 1 mM wässriger Chlorsäurelösung gequollen, anschließend mit einer frischen Präparation des gleichen Puffers und 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) enthaltend 0,5 M Natriumchlorid gewaschen, mit ca. 10 ml einer wässrigen Lösung des monoklonalen Antikörpers, der wie oben beschrieben erhalten wurde, gemischt und anschließend bei Raumtemperatur und bei 4°C über Nacht unter sanftem Rühren inkubiert. Danach wurde das resultierende Gel nacheinander gewaschen mit 1 M wässriger Ethanolaminlösung (pH 8,0), 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) enthaltend 0, 5 M Natriumchlorid, und 0,1 M Rcetatpuffer (pH 4,0), und diese Waschschritte wurden fünfmal wiederholt. Abschließend wurde das Gel mit PBS gewaschen, wodurch ein Gel für die Immunaffinitätschromatographie erhalten wurde. Herkömmliche Analysen zeigten, daß ca. 6 mg monoklonaler Antikörper H-1mAb mit 1 ml des Gels verbunden waren.
Beispiel B-4-2
Reinigung des Polypeptids mit Hilfe der Immunaffinitätschromatographie
10 ml des Gels für die Immunaffinitätschromatographie aus Beispiel B-4-1 wurde auf eine Plastikzylindersäule geladen, mit PBS gewaschen und mit 10 ml einer verdünnten Fraktion von Phenylsepharose, enthaltend ca. 0,1 mg/ml des Polypeptids, das nach den Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, beladen.
Die Säule wurde mit einer frischen Präparation von PBS gewaschen, und mit 0, 1 M Glycin-HCl Puffer (pH 2, 5) enthaltend 1 M Natriumchlorid beladen, um Fraktionen mit einer IFN-γ induzierenden Aktivität zu sammeln. Die Fraktionen wurden vereinigt, gegen PBS bei 4°C über Nacht dialysiert, konzentriert und hinsichtlich der IFN-γ induzierenden Aktivität und den Proteingehalt untersucht, und es zeigte sich, daß dieses Reinigungsverfahren ein gereinigtes Polypeptid mit einer Reinheit von 95 w/w oder höher in einer Ausbeute von ca. 100 % lieferte.
Beispiel B-5
Nachweis des Polypeptids im Enzymimmunassay
Kaninchen wurden in herkömmlicher Weise mit dem gereinigten Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, immunisiert, und ihr Blut wurde gesammelt. Aus dem Blut wurden Immunglobulin G Antikörper isoliert und in PBS zu einer Konzentration von 20 μg/ml verdünnt, und die Lösung wurde auf 96 well Mikroplatten in einer Menge von 100 μl/well verteilt. Die Mikroplatten wurden bei Raumtemperatur für 3 Stunden inkubiert, anschließend wurden die Lösungen, die IgG enthielten, von den Mikroplatten entfernt, es wurden PBS enthaltend 1 w/v Kälberserumalbumin zu den Mikroplatten in einer Menge von 200 μl/well hinzugefügt, und sie wurden bei 4°C über Nacht stehengelassen.
Die Phosphat-gepufferte-Kochsalzlösung wurde von den Mikroplatten entfernt, die anschließend mit PBS enthaltend 0,05 v/v Tween 20 gewaschen wurden, und es wurden 100 μl/well einer Lösung, die hergestellt wurde durch angemessene Verdünnung des gereinigten Polypeptids, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1–2 erhalten wurde, und PBS enthaltend 0,5 w/v % Kälberserumalbumin hinzugefügt, anschließend reagierte die Mischlösung bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Schütteln. Die Mikroplatten wurde mit PBS enthaltend 0,05 v/v % Tween 20 gewaschen, und es wurden 100 μl/well einer Lösung enthaltend einen monoklonalen Antikörper H-1mAb, der mit Biotin markiert war, hinzugefügt, anschließend reagierte die Mischlösung bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Schütteln, die Mikroplatten wurden mit PBS enthaltend 0,05 v/v % Tween 20 gewaschen, es wurden 100 μl/well einer Lösung enthaltend einen Komplex aus Meerrettich-Peroxidase und Streptavidin hinzugefügt, und die resultierende Mischung reagierte weiterhin bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Schütteln. Anschließend wurden die Mikroplatten mit PBS enthaltend 0,05 v/v % Tween 20 gewaschen, und die Aktivität der Meerrettich-Peroxidase, verbunden mit dem gereinigten Polypeptid wurde hinsichtlich Absorption bei einer Wellenlänge von 492 nm unter Verwendung von O-Phenylendiamin als Substrat gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
Anmerkung: Das Symbol "*" bedeutet den statistischen Wert einer Dreifachbestimmung.
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 6 klar ersichtlich ist, bestimmt die Nachweismethode gemäß der vorliegenden Erfindung das Polypeptid sehr genau in einen Bereich von 50 bis 1.000 pg/ml.
Beispiel B-6
Nachweis des Polypeptids im Radioimmunassay
Kaninchen wurden in herkömmlicher Weise mit dem gereinigten Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, immunisiert, ihr Blut wurde gesammelt, und anschließend wurden IgG Antikörper isoliert. Für den Radioimmunassay wurde der Antikörper in herkömmlicher Weise an Polystyrenbeads adsorbiert, und in PBS enthaltend 2 w/v % Kälberserumalbumin bei 4°C über Nacht stehengelassen, wodurch ein immobilisierter Antikörper erhalten wurde.
1 bead wurde in ein Probenröhrchen gegeben, in 0,2 ml einer Lösung, die hergestellt wurde durch Verdünnen des gereinigten Polypeptids das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, mit PBS enthaltend 0,5 w/v % Kälberserumalbumin geschwenkt und bei 4°C für 4 Stunden stehengelassen. Anschließend wurde das bead mit PBS enthaltend 0, 05 v/v % Tween 20 und 0, 5 w/v % Kälberserumalbumin gewaschen, in 0,2 ml (1 × 10⁵ cpm) einer Lösung enthaltend den monoklonalen Antikörper H-2mAb, der nach dem Verfahren in Beispiel B-3-2 erhalten wurde und mit ¹²⁵I markiert wurde, geschwenkt und bei 4°C über Nacht stehengelassen. Nachdem die überschüssige Menge an ¹²⁵I-markiertem Antikörper entfernt wurde, wurde das Bead mit PBS enthaltend 0,05 v/v % Tween 20 und 0,5 w/v % Kälberserumalbumin gewaschen, anschließend wurde die Radioaktivität des Beads mit Hilfe eines Gamma-Zählers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Anmerkung: Das Symbol "*" bedeutet den statistischen Wert einer Dreifachbestimmung.
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 7 klar ersichtlich ist, bestimmt das erfindungsgemäße Nachweisverfahren das Polypeptid sehr genau in einem Bereich von ca. 100 bis 1.000 pg/ml.
Beispiel C-1
Lösung
Das Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, wurde in physiologischer Kochsalzlösung enthaltend 1 w/v 6 humanes Serumalbumin als Stabilisator verdünnt, wodurch eine 1 mg/ml Polypeptidlösung erhalten wurde, die anschließend durch Membranfilter sterilisiert wurde, wodurch eine Lösung erhalten wurde.
Das Produkt besitzt eine befriedigende Stabilität und kann als Injektion, Augenlösung und als Nasentropfen für die Behandlung und/oder die Prävention von assoziierten Krankheiten wie malignen Tumoren, viralen Erkrankungen, bakteriellen infektiösen Erkrankungen und Immunerkrankungen verwendet werden.
Beispiel C-2
Trockene Injektion
Das Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, wurde in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung enthaltend 1 w/v % gereinigte Gelatine als Stabilisator gelöst, und die Lösung wurde in herkömmlicher Weise mit einem Membranfilter sterilisiert. 1 ml Aliquots der sterilisierten Lösung wurden auf Gefäße verteilt, lyophilisiert und verschlossen.
Das Produkt besitzt eine befriedigende Stabilität und kann als trockene Injektion zur Behandlung und/oder Prävention von assoziierten Krankheiten wie malignen Tumoren, viralen Erkrankungen, bakteriellen Erkrankungen und Immunerkrankungen verwendet werden.
Beispiel C-3
Salbe
"HI-BIS-WAKO 104", ein Carboxyvinylpolymer, das kommerziell erhältlich ist bei Wako Pure Chemicals, Tokyo, Japan, und gereinigte Trehalose wurden in destilliertem Wasser in Konzentrationen von jeweils 1,4 w/w % bzw. 2,0 w/w % gelöst, und das Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, wurde gleichmäßig in der Lösung gelöst, anschließend wurde der pH-Wert der resultierenden Lösung auf pH 7,2 eingestellt, wodurch eine Paste erhalten wurde, die ca. 1 mg/g des Polypeptids aufwies.
Das Produkt ließ sich ausreichend gut verteilen und wies eine befriedigende Stabilität auf, so daß es als Salbe zur Behandlung und/oder zur Prävention von assoziierten Krankheiten wie malignen Tumoren, viralen Erkrankungen, bakteriellen infektiösen Erkrankungen und Immunerkrankungen verwendet werden kann.
Beispiel C-4
Tablette
Das Polypeptid, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde und LUMIN, d. h. [Bis-4-(1-ethylquinolin)] [γ-4'-(1-Ethylquinolin)]-pentamethionincyanin, als ein Zellaktivator, wurden bis zur Homogenität mit "FINETOSE^®", einer wasserfreien kristallinen α-Maltose, die kommerziell erhältlich ist bei Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan gemischt, und die Mischung wurde in herkömmlicher Weise mit Hilfe einer Tablettenmaschine zu Tabletten geformt, wobei jede ca. 200 mg schwer war und das Polypeptid sowie das LUMIN in jeweils ca. 1 mg enthielt.
Das Produkt, das befriedigende Schluckeigenschaften, Stabilität und zellaktivierende Aktivität aufweist, kann als Tablette für die Behandlung und/oder Prävention von assoziierten Krankheiten wie malignen Tumoren, viralen Erkrankungen, bakteriellen infektiösen Erkrankungen und Immunerkrankungen verwendet werden.
Beispiel C-5
Adoptives immuntherapeutisches Mittel
Mononukleäre Zellen wurden aus dem peripheren Blut eines Patienten mit malignem Lymphom isoliert, in RPMI 1640 Medium (pH 7,2), das mit 10 v/v % humanem AB Serum ergänzt und bei 37°C vorgewärmt worden war, in einer Zelldichte von ca. 1 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert, und mit ca. 1,0 μg/ml des Polypeptids, das nach dem Verfahren in Beispiel B-1-2 erhalten wurde, und ca. 100 units/ml rekombinantem humanen Interleukin 2 gemischt, anschließend wurde die resultierende Mischung in einem 5 v/v % CO₂ Inkubator bei 37°C für eine Woche inkubiert, und die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um LAK-Zellen zu sammeln.
Die so erhaltenen LAK-Zellen wiesen eine starke Zytotoxizität auf Lymphomzellen auf, wenn sie in den Körper des Spenderpati enten eingeführt wurden, und sie wiesen eine höhere Zytotoxizität auf als jene, die mittels adoptiver Immuntherapie unter Verwendung von Interleukin 2 alleine erreicht werden kann. Zytotoxische T-Zellen, erhältlich durch die gleiche Behandlung von Lymphozyten, die in Tumorgewebe des Patienten eingewandert waren, anstelle der oben beschriebenen Lymphozyten, wurden in den Spenderpatienten injiziert, wobei sich der gleiche Effekt wie mit den LAK-Zellen zeigte. Das adoptive immuntherapeutische Mittel kann willkürlich verwendet werden um solide maligne Tumoren wie Nierenkrebs, malignes Melanom, Dickdarmkrebs, Enddarmkrebs und Lungenkrebs zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden eines neuen Polypeptids, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert. Das Polypeptid ist eine Substanz, die eine teilweise oder vollständig offenbarte Aminosäuresequenz sowie eine stabile Aktivität der Induktion der IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen aufweist.
Das Polypeptid besitzt eine starke IFN-γ Induktivität, so daß es eine gewünschte Menge an IFN-γ Produktion mit nur einer geringen Menge induzieren kann. Das Polypeptid bewirkt keine ersten Nebenwirkungen, selbst dann nicht wenn es in einer relativ hohen Dosis verabreicht wird, weil es nur eine extrem niedrige Toxizität aufweist. Daher besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid den Vorteil, daß es sofort eine gewünschte Menge an IFN-γ Produktion induziert ohne daß die Dosis streng kontrolliert wird.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper reagiert spezifisch mit dem Polypeptid und wird vielfältig für die Reinigung und den Nachweis des Polypeptids verwendet. Der Antikörper wird in einer gewünschten Menge unter Verwendung von Hybridoma hergestellt.
Das erfindungsgemäße Mittel für assoziierte Krankheiten übt einen befriedigenden Effekt in der Therapie und/oder der Prävention von assoziierten Krankheiten wie malignen Tumoren, viralen Erkrankungen, bakteriellen infektiösen Erkrankungen und Immunerkrankungen aus. Darüber hinaus weist das Mittel eine Aktivität der Steigerung der Zytotoxizität durch Killerzellen oder der Induktion der Bildung von Killerzellen auf und übt einen signifikanten Effekt in der Behandlung von ernsten Erkrankungen wie malignen Tumoren aus.
Daher ist die vorliegende Erfindung eine bedeutende Erfindung, die einen bemerkenswerten Effekt aufweist und einen großen Beitrag zu diesem Umfeld leistet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid humanen Ursprungs, das die IFN-γ Produktion durch immunkompetente Zellen induziert und die vollständige Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt oder einen Teil der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, umfaßt, wobei der Teil wenigstens die ersten zehn Aminosäuren, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, umfaßt (wobei das Symbol „Xaa" „Isoleucin" oder „Threonin" bedeutet). SEQ ID NO: 1:
Polypeptid nach Anspruch 1, das ein Molekulargewicht von ungefähr 18.500 ± 3.000 Dalton in einer Sodium-dodecyl-Polyamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und einen isoelektnschen Punkt von ungefähr 4,9 ± 1,0 in einer chromatographischen Fokusierung aufweist.
DNA, die das Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
DNA nach Anspruch 3, die eine Basensequenz aufweist, die einen Teil oder die vollständige Basensequenz entweder wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt oder eine komplementäre Basensequenz zu SEQ ID NO: 2 enthält. SEQ ID NO: 2:
DNA nach Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 2 durch andere Basen durch die Degeneration des genetischen Codes ersetzt sind ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 (wobei das Symbol „Xaa" „Isoleucin" oder „Threonin" bedeutet) zu verändern, welche die Aminosäuresequenz, die von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, darstellt.
DNA nach Anspruch 3, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 6 aufweist (wobei das Symbol „Xaa" „Isoleucin" oder „Threonin" bedeutet). SEQ ID NO: 6:
DNA nach Anspruch 3, die von Menschen abgeleitet ist.
Vermehrungsfähige rekombinante DNA, die einen selbst vermehrungsfähigen Vektor und eine DNA aufweist, die das Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Vermehrungsfähige rekombinante DNA nach Anspruch 8, die eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Basensequenz in SEQ ID NO: 2 und komplementären Basensequenzen zu SEQ ID NO: 2.
Vermehrungsfähige rekombinante DNA nach Anspruch 9, wobei eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 2 durch andere Basen durch die Degeneration des genetischen Codes ersetzt sind ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 zu verändern.
Vermehrungsfähige rekombinante DNA nach Anspruch 8, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 6 aufweist (wobei das Symbol „Xaa" „Isoleucin" oder „Threonin" bedeutet).
Vermehrungsfähige rekombinante DNA nach Anspruch 8, wobei die DNA vom Menschen abgeleitet ist.
Vermehrungsfähige rekombinante DNA nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein Plasmidvektor ist.
Transformante, erhältlich durch das Einführen einer vermehrungsfähigen rekombinanten DNA in eine geeignete Wirtszelle, wobei die vermehrungsfähige rekombinante DNA einen selbst vermehrungsfähigen Vektor und eine DNA, die das Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert, umfaßt.
Transformante nach Anspruch 14, die eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Basensequenz in SEQ ID NO: 2 und komplementären Basensequenzen zu SEQ ID NO: 2.
Transformante nach Anspruch 15, wobei eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 2 durch andere Basen durch die Degeneration des genetischen Codes ersetzt sind ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 zu verändern.
Transformante nach Anspruch 14, welche die Basensequenz in SEQ ID NO: 6 aufweist (wobei das Symbol „Xaa" „Isoleucin" oder „Threonin" bedeutet).
Transformante nach Anspruch 14, wobei die DNA vom Menschen abgeleitet ist.
Transformante nach Anspruch 14, wobei der Vektor ein Plasmidvektor ist.
Transformante nach Anspruch 14, wobei der Wirt ein Mikroorganismus der Spezies Escherichia coli ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, das die Schritte umfaßt (a) Kultivieren einer Transformante in einem Nährkulturmedium, die fähig ist das Polypeptid nach Anspruch 1 zu bilden, hergestellt durch das Einführen einer vermehrungsfähigen rekombinanten DNA, die einen selbst vermehrungsfähigen Vektor und eine DNA, die für das Polypeptid kodiert, aufweist in einen geeigneten Wirt, und (b) Gewinnen des gebildeten Polypeptides aus der resultierenden Kultur.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die DNA eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Basensequenz in SEQ ID NO: 2 und komplementären Basensequenzen zu SEQ ID NO: 2.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei eine oder mehrere Basen in SEQ ID NO: 2 durch andere Basen durch die Degeneration des genetischen Codes ersetzt sind ohne die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 zu verändern.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die DNA die Basensequenz in SEQ ID NO: 6 aufweist (wobei das Symbol „Xaa" „Isoleucin" oder „Threonin" bedeutet).
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die DNA vom Menschen abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Vektor ein Plasmidvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Wirt ein Mikroorganismus der Spezies Escherichia coli ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das gebildete Polypeptid durch eine oder mehrere Techniken ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Konzentration, Aussalzen, Dialyse, Trennen durch Sedimentation, Gelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatofokusierung, Gelelektrophorese, und Elektrophorese des isoelektrischen Punktes gereinigt wird.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch ist für das Polypeptid nach Anspruch 1.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 29, der zur IgG oder IgM Klasse gehört.
Hybridom, das den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 29 bildet.
Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, das die Schritte umfaßt: Kultivieren eines Hybridoms, das fähig ist den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 29 zu bilden, entweder in einem Nährkulturmedium oder im Körper eines Tieres, und Gewinnen des Hybridoms aus der resultierenden Kultur oder der Körperflüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der monoklonale Antikörper aus der Kultur oder der Körperflüssigkeit durch eine oder mehrere Techniken gewonnen wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aussalzen, Dialyse, Filtration, Konzentration, Zentrifugation, Trennen durch Sedimentation, Gelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelelektrophorese, und Isoelektrophorese.
Verfahren zur Reinigung des Polypeptides nach Anspruch 1, das die Schritte umfaßt: Zusammenbringen einer Mischung, die das Polypeptid und Verunreinigungen enthält, mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für das Polypeptid, und Desorbieren des Polypeptides, das an den Antikörper adsorbiert ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei der monoklonale Antikörper mit einem Wasserunlöslichen Träger verbunden ist.
Verfahren zum Nachweis des Polypeptides nach Anspruch 1, das den Schritt umfaßt: Zusammenbringen eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch ist für das Polypeptid, mit einer Probe, wodurch eine Immunreaktion bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der monoklonale Antikörper mit einem Mitglied markiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer radioaktiven Substanz, einem Enzym und einer fluoreszierenden Substanz.
Agens für assoziierte Krankheiten, welches das Polypeptid nach Anspruch 1 als einen aktiven Bestandteil aufweist.
Agens nach Anspruch 38, wobei das Polypeptid die Zytotoxizität durch Killerzellen erhöht und/oder die Bildung von Killerzellen induziert.
Agens nach Anspruch 39, wobei die Killerzelle ein Mitglied ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NK-Zellen, LAK-Zellen (Lymphokin-aktivierende Killerzellen), und zytotoxischen T-Zellen.
Agens nach einem der Ansprüche 38 bis 40, das eine oder mehrere zusätzliche biologisch aktive Substanzen enthält.
Agens nach Anspruch 41, wobei die biologisch aktiven Substanzen anti-Tumor Agenzien und Zytokine sind.
Agens nach einem der Ansprüche 38 bis 42, das als Stabilisator einen oder mehrere Mitglieder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serumalbumin, Gelatine, Maltose und Trehalose enthält.
Anti-Tumor immuntherapeutisches Agens nach einem der Ansprüche 38 bis 43.
Anti-Tumor Agens nach einem der Ansprüche 38 bis 43.
Antivirales Agens nach einem der Ansprüche 38 bis 43.
Antiseptikum nach einem der Ansprüche 38 bis 43.
Agens nach einem der Ansprüche 38 bis 47, das 0,000001–100 w/w % des Polypeptides auf einer trockenen, festen Basis enthält.