JP7425195B2

JP7425195B2 - 調節ｔ細胞培養用組成物及びその用途

Info

Publication number: JP7425195B2
Application number: JP2022529596A
Authority: JP
Inventors: ミョンホチャン; チュンピョホン; チェハキム; ヘリキム
Original assignee: GI Cell Inc
Current assignee: GI Cell Inc
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: SA522432641B1; CA3152351A1; US11702633B2; WO2021101273A2; CN114901807B; MX2022006000A; JP2022547352A; US20220290102A1; CN114901807A; WO2021101273A3; TWI812901B; KR102325857B1; AU2020387479A1; EP4063490A4; KR102325857B9; IL291909A; AU2020387479B2; EP4063490A2; TW202132562A; CN117004564A

Description

本発明は、Ｔ細胞培養のための培養用組成物及びこれを用いた調節Ｔ細胞培養方法に関する。

Ｔ細胞は、細胞媒介免疫において中心的な役割を担う。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のようなＴ細胞の表面に存在する受容体により、Ｂ細胞をはじめとする他のリンパ球と区別され得る。また、Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞毒性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、又はＣＴＬ）、中央メモリＴ細胞（ＴＣＭ細胞）及びエフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ細胞）が含まれるメモリＴ細胞（ＴＭ細胞）、ナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ）Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞）、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、及び調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）のように種々のＴ細胞を含む。

このうち、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、他の細胞の免疫応答を抑制する作用を有するＴ細胞である。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、免疫反応中にＴ細胞媒介免疫を抑制し、胸腺の陰性選別過程で脱出した自己反応性Ｔ細胞を抑制する役割を担う。Ｔｒｅｇ細胞は、自然調節Ｔ細胞（ｎａｔｕｒａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ，ｎＴｒｅｇ）及び誘導調節Ｔ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ，ｉＴｒｅｇ）に大別できる。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞と知られた自然調節Ｔ細胞は胸腺で生成される。誘導調節Ｔ細胞は、天然発生Ｔｒｅｇ細胞と多数の属性を共有するが、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞からＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞に転換される特徴が、代表的な差異点として知られている。

このように、各種の自己免疫体系の異常によって発生する疾病と関連して、調節Ｔ細胞の重要性に対する研究が活発に行われている。１９７０年代の初めにＧｅｒｓｈｏｎによって抑制Ｔ細胞という概念が導入されて初めて提示された以来（ＲＫＧｅｒｓｈｏｎａｎｄＫＫｏｎｄｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７０，１８：７２３－３７）、免疫学の多数の分野で調節Ｔ細胞の生物学的特性及び機能を究明するための研究がなされてきた。特に、１９９５年にＳａｋａｇｕｃｈｉによってＣＤ２５が自然発生ＣＤ４＋調節Ｔ細胞の重要な表現型マーカーとして働き得ることが提示されて以来（ＳＳａｋａｇｕｃｈｉｅｔ，ａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９５，１５５：１１５１－１１６４）、自己抗原（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）に対する末梢寛容（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の誘導において調節Ｔ細胞が有する役割及び重要性に関する研究が重点的に行われた。

調節Ｔ細胞は、免疫抑制性サイトカインとして知られたＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＬ－３５などを分泌できることが知られている（ＨＮｉｓｈｉｋａｗａｅｔ，ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，１２７：７５９－７６７）。免疫抑制性サイトカインを分泌する調節Ｔ細胞は、ＩＬ－１０などを分泌し、自己免疫疾患の原因となる抗原特異的Ｔ細胞を免疫寛容性抗原提示細胞で誘導することによって、免疫学的に耐性を誘導できることを証明する研究が行われている（Ｓ．Ｋａｒｕｍｕｔｈｉｌ－Ｍｅｌｅｔｈｉｌｅｔ，ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１５，６４：１３４１－１３５７）。

このように、調節Ｔ細胞の自己免疫疾患を治療する用途は多く知られているが、それを効果的に使用するために増幅させ得る具体的な方法はまだ足りない状況である。

したがって、本発明者らは、調節Ｔ細胞を効果的に培養する方法について研究した結果、ＩＬ－２タンパク質とＣＤ８０タンパク質を単一の分子中に含む新規な融合タンパク質二量体が調節Ｔ細胞を効果的に増殖させることができることを確認し、本発明を完成するに至った。

上記目的達成のために、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含む調節Ｔ細胞培養用組成物又は培地を提供する。

また、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を用いた調節Ｔ細胞培養方法を提供する。

また、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が含まれた培地で培養された調節Ｔ細胞を有効成分として含む薬学的組成物を提供する。

本発明の培養組成物を用いると、Ｔ細胞を効果的に増殖させるだけでなく、特に、調節Ｔ細胞を効果的を増殖させることができる。特に、従来のＩＬ－２を用いた培養法に比べて、調節Ｔ細胞の生存率が顕著に増加することを確認した。のみならず、収得された調節Ｔ細胞においてＦｏｘｐ３＋発現量が増加することを確認した。したがって、このような増殖方法は、調節Ｔ細胞を用いた細胞治療剤分野に活用可能である。

図１Ａは、本発明で使用された融合タンパク質二量体の模式図である。
図１Ｂは、収得した融合タンパク質二量体（ＧＩ－１０１）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図１Ｃは、吸光度による融合タンパク質二量体（ＧＩ－１０１）の含有量を示すものである。
図１Ｄは、収得した融合タンパク質二量体（ＧＩ－１０１）をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析したものである。
図２Ａは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図２Ｂは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析したものである。
図３Ａは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｖ２融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図３Ｂは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｖ２融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析したものである。
図３Ｃは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図３Ｄは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析したものである。
図４Ａは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したものである。
図４Ｂは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析したものである。
図５は、融合タンパク質二量体を用いてＴｒｅｇ細胞を培養する方法に関する模式図である。
図６は、含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物で培養された調節Ｔ細胞の数を示すものである。
図７は、含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物で培養された調節Ｔ細胞の生存率を示すものである。
図８は、含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物で培養された調節Ｔ細胞の数を示すものである。
図９は、含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物で培養された調節Ｔ細胞の生存率を示すものである。
図１は、含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物を用いて培養した調節Ｔ細胞のＩＬ－１０分泌能を示すものである。
図１１は、含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物を用いて培養した調節Ｔ細胞のＩＬ－１０分泌能を示すものである。
図１２Ａ及び図１２Ｂは、最適化工程において含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物で培養時に増殖された調節Ｔ細胞の数を示すものである。
図１３Ａ及び図１３Ｂは、最適化工程において含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物で培養時に調節Ｔ細胞の生存率を示すものである。
図１４Ａ及び図１４Ｂは、最適化工程において含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物で培養時に調節Ｔ細胞の数を示すものである。
図１５Ａ及び図１５Ｂは、最適化工程において含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物で培養時に調節Ｔ細胞の生存率を示すものである。
図１６Ａ～図１６Ｃは、最適化工程において含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物で培養された細胞の特性をＦＡＣＳで分析した結果を示すものである。
図１７Ａ～図１７Ｃは、最適化工程において含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物で培養時にＦｏｘｐ３が発現した調節Ｔ細胞の数を示すものである。
図１８Ａ～図１８Ｃは、最適化工程において含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物で培養された細胞の特性をＦＡＣＳで分析した結果を示すものである。
図１９Ａ～図１９Ｃは、最適化工程において含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物で培養時にＦｏｘｐ３が発現した調節Ｔ細胞の数を示すものである。
図２０は、最適化工程において含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物で培養された調節Ｔ細胞のＩＬ－１０分泌能を示すものである。
図２１は、最適化工程において含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物で培養された調節Ｔ細胞のＩＬ－１０分泌能を示すものである。

調節Ｔ細胞増殖用組成物及び培地
本発明の一側面として、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含む調節Ｔ細胞増殖用組成物を提供する。また、前記融合タンパク質二量体を有効成分として含む調節Ｔ細胞増殖用培地を提供する。

前記調節Ｔ細胞増殖用培地は、Ｔ細胞培養用培地に、前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が添加された培地であってよい。このとき、前記Ｔ細胞培養用培地は、アミノ酸（ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）、糖類（ｓｕｇａｒｓ）、無機塩（ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｓ）及びビタミンからなる群から選ばれるいずれか一つを含むことができる。好ましくは、前記Ｔ細胞培養用培地は、アミノ酸、糖類、無機塩及びビタミンを全て含むものであってよい。また、前記培地はさらに、ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）、ＨＥＰＥＳ（ＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、タンパク質、炭水化物、メルカプトエタノール、成長因子をさらに含むことができる。また、前記調節Ｔ細胞培養用培地は、レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ）をさらに含むことができる。一具体例としては、前記調節Ｔ細胞増殖用培地は、下記の表３又は表４の基本成分を含むことができる。

本明細書で使われた用語“細胞培養用培地”は、細胞を培養するために用いられた培地を意味し、具体的に調節Ｔ細胞、より具体的にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を培養するための培地を意味する。試験管内で（ｉｎｖｉｔｒｏ）細胞成長及び生存のために細胞が必要とする成分を含有するか、或いは細胞成長及び生存を助ける成分を含有する。具体的に、前記成分は、ビタミン、必須又は非必須アミノ酸、及び微量元素であってよい。前記培地は、細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは調節Ｔ細胞、さらに好ましくはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の培養に用いられる培地であってよい。

本発明に係る前記細胞培養培地は、アミノ酸成分、ビタミン成分、無機塩成分、その他成分及び精製水から構成され、
ａ）前記アミノ酸成分は、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－リシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－プロリン、β－アラニン、γ－アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、ホモセリン、トリヨードチロシン、チロキシン及びジオキソフェニルアラニンからなる群から選ばれる少なくともいずれか一つのアミノ酸又はその組合せであり、好ましくは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン及びＬ－バリンからなる群から選ばれる少なくともいずれか一つのアミノ酸又はその組合せであり、
ｂ）前記ビタミン成分は、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、塩化コリン、ｉ－イノシトール及びアスコルビン酸からなる群から選ばれる少なくともいずれか一つのビタミン又はその組合せであり、好ましくは、ｉ－イノシトール、チアミン塩酸塩、ナイアシンアミド及びピリドキシン塩酸塩からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上のビタミン又はその組合せであり、
ｃ）前記無機塩成分は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ_４－５Ｈ２_Ｏ）、硫酸第二鉄七水和物（ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、リン酸二水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｈ_２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ）、硝酸第2鉄九水和物（Ｆｅ（ＮＯ_３）_３・９Ｈ_２Ｏ）及び炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）からなる群から選ばれる少なくともいずれか一つの無機塩又はその組合せであり、好ましくは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）及びリン酸二水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｈ_２Ｏ）からなる群から選ばれる少なくともいずれか一つの無機塩又はその組合せであり、
ｄ）前記その他成分は、Ｄ－グルコース（デキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンＮａ、チミジン、リノール酸、リポ酸、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン、２’－デオキシアデノシン、２’－デオキシシチジンＨＣｌ、２’－デオキシグアノシンからなる群から選ばれる少なくとも一つのその他成分又はその組合せであり、好ましくは、ピルビン酸ナトリウムでよい。
ｅ）精製水は、上記のアミノ酸、ビタミン、無機塩及びその他成分を溶解させるために使用され、１次以上の蒸留を経て得られる又はフィルターで精製された水であってよい。
また、本発明に係る前記細胞培養培地に成長因子又はサイトカインをさらに含むことができる。前記成長因子としてＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦなどを単独又は２種以上使用できるが、これに特に制限するものではない。前記サイトカインとしてＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０又はＩＬ－１７などを単独又は２種以上使用できるが、これに特に制限するものではない。

本明細書で使われる用語“Ｔ細胞”は、抗原特異的な適応免疫を主管するリンパ球の一つを意味する。Ｔ細胞は、まだ抗原に出会っていない未接触Ｔ細胞（ｎａｉｖｅＴｃｅｌｌ）と、抗原に出会って成熟したＴ細胞、及び記憶Ｔ細胞に分類される。このとき、前記成熟したエフェクターＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞及び自然殺傷Ｔ細胞を含む。

本明細書で使われる用語“ヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌ又はＴｈｃｅｌｌ）”は、他の白血球の分化及び活性化を調節することによって体液性免疫を促進する細胞のことを指す。細胞表面にＣＤ４タンパク質を有することから、ＣＤ４＋Ｔ細胞ともいう。ヘルパーＴ細胞は、細部機能によって、さらに、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇに分類されてよい。Ｔｈ１細胞は、インターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ，ＩＦＮ－γ）と腫瘍壊死因子ベータ（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｂｅｔａ，ＴＮＦ－β）を分泌することにより、大食細胞の内部でエンドソームとリソソームが融合してエンドリソソームを形成するように誘導する。一方、Ｔｈ２細胞は、種々のインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）を分泌し、Ｂ細胞を形質細胞に分化させる。Ｔｈ１７細胞は、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）を分泌し、好中性白血球を集まらせる。

本明細書で使われる用語“調節Ｔ細胞（ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ）”は、自然調節Ｔ細胞（ｎａｔｕｒａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ，ｎＴｒｅｇ）又は誘導調節Ｔ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ，ｉＴｒｅｇ）を含む。本明細書において、調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞を含む。前記調節Ｔ細胞は、免疫反応を抑制することにより、免疫の恒常性を維持し、自己免疫反応などを遮断する。

本明細書で使われる用語“細胞毒性Ｔ細胞”は、グランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）やパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）のような細胞毒性物質を分泌し、ウイルスに感染された細胞や腫瘍細胞などを殺す細胞である。細胞表面にＣＤ８タンパク質を有することから、ＣＤ８Ｔ細胞ともいう。ヘルパーＴ細胞とは逆に、細胞性免疫を媒介してウイルス及び癌細胞を除去する。

本明細書で使われる用語“自然殺傷Ｔ細胞”は、ヘルパーＴ細胞及び細胞毒性Ｔ細胞に比べて少ない割合で分布するエフェクターＴ細胞の一つを意味する。自然殺傷Ｔ細胞は、細胞表面にＴ細胞のようなＴ細胞抗原受容体（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）を有しているが、ＮＫ１．１のような自然殺害細胞特異的な分子も有している。自然殺傷Ｔ細胞は、ガンマインターフェロン、インターロイキン－４などを分泌して免疫反応を調節する役割を担う。

本明細書で使われる用語“記憶Ｔ細胞”は、抗原を認知したＴ細胞が分化及び選別過程を経た後に長期間生存しているが、後で抗原が再度侵入すると素早く活性化されてエフェクターＴ細胞の機能を果たし得る潜在的能力を有する細胞を意味する。未接触（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞が抗原に出会って活性化された状態の細胞、又はエフェクターＴ細胞が、インターロイキン－７とインターロイキン－１５の影響を受けて長期生存可能な記憶Ｔ細胞に分化する。

このとき、前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体は、培養培地内に１ｎＭ～２，０００ｎＭで含まれてよい。また、前記二量体は、１ｎＭ～１、０００ｎＭ、又は１ｎＭ～５００ｎＭで含まれてよい。また、前記二量体は、２ｎＭ～３００ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎＭ～８０ｎＭ、２０ｎＭ～７０ｎＭ、又は４０ｎＭ～５０ｎＭで含まれてよい。具体的に、前記融合タンパク質二量体は、培地内に１ｎＭ、３．２ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭで含まれてよい。

ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体

本明細書で使われる用語“ＩＬ－２”又は”インターロイキン－２”は、別に断りのない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含めて任意の脊椎動物供給源から得た任意の野生型ＩＬ－２を意味する。前記ＩＬ－２は、動物細胞から得られたものであってもよいが、ＩＬ－２を生産できる組換え細胞から得られたものも含む。また、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２又はその変異体であってよい。

本明細書ではＩＬ－２或いはその変異体を総称して“ＩＬ－２タンパク質”或いは“ＩＬ－２ポリペプチド”と表現することもある。ＩＬ－２、ＩＬ－２タンパク質、ＩＬ－２ポリペプチド、及びＩＬ－２変異体は、例えば、ＩＬ－２受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的に結合する。この特異的な結合は、当業者に知られた方法で確認できる。

前記ＩＬ－２の一具体例は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有してよい。また、このとき、前記ＩＬ－２は、成熟した形態であってよい。具体的に、前記成熟したＩＬ－２は、信号配列を含まないものであってよく、配列番号１０のアミノ酸配列を有するものであってよい。このとき、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２のＮ末端又はＣ－末端の一部が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片を含む概念として用いられてよい。

また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であってよい。また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であってよい。

本明細書で使われる用語“ＩＬ－２変異体”は、全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）ＩＬ－２又は上述したＩＬ－２の断片のアミノ酸の一部が置換された形態を意味する。すなわち、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２又はその断片と異なるアミノ酸配列を有してよい。ただし、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と同等又は類似の活性を有してよい。ここで、“ＩＬ－２活性”は、例えば、ＩＬ－２受容体に特異的に結合することを意味でき、この特異的結合は、当業者に知られた方法で測定できる。

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２のアミノ酸の一部が置換されたものであってよい。アミノ酸置換によるＩＬ－２変異体の一具体例としては、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが置換されたものでよい。

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目又は７２番目のアミノ酸の少なくともいずれか一つが他のアミノ酸に置換されたものでよい。のみならず、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列のＮ末端の一部分が欠失した形態である場合、配列番号１０のアミノ酸配列において相補的に対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてよい。例えば、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号３５のアミノ酸配列において５８番目、６２番目、６５番目、８１番目又は９２番目のアミノ酸の少なくともいずれか一つが他のアミノ酸に置換されたものでよい。これらはそれぞれ、配列番号１０のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸残基にそれぞれ該当する。一具体例によれば、ＩＬ－２活性が維持される限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、或いは１０個のアミノ酸が置換されてよい。さらに他の具体例によれば、１個から５個までのアミノ酸が置換されてよい。

一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。

また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものでよい。

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、５箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が全て他のアミノ酸に置換されたものでよい。

このとき、前記置換によって導入される“他のアミノ酸”は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つであってよい。ただし、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、前記配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目はアルギニンに置換できなく、４２番目はフェニルアラニンに置換できなく、４５番目はチロシンに置換できなく、６１番目はグルタミン酸に置換できなく、７２番目はロイシンに置換できない。

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンは、アルギニン以外のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンはアラニンに置換（Ｒ３８Ａ）されてよい。

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、フェニルアラニン以外のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、アラニンに置換（Ｆ４２Ａ）されてよい。

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンは、チロシン以外のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンはアラニンに置換（Ｙ４５Ａ）されてよい。

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、グルタミン酸以外のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸はアルギニンに置換（Ｅ６１Ａ）されてよい。

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンは、ロイシン以外のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換の場合、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンはグリシンに置換（Ｌ７２Ｇ）されてよい。

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる少なくともいずれか一つの置換が起きたものでよい。

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる位置において２箇所、３箇所、４箇所又は５箇所の位置でアミノ酸置換が起きてよい。

また、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＦ４２Ａの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＹ４５Ａの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＥ６１Ｒの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。

また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇの置換が起きたものでよい。

好ましくは、前記ＩＬ－２変異体の一具体例は、配列番号１０のアミノ酸配列において、下記（ａ）～（ｄ）の組合せから選ばれるいずれか一つの組合せの置換が起きたものでよい：
（ａ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ
（ｂ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ
（ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ
（ｄ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ

このとき、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、配列番号１０と相補的に対応する位置にアミノ酸置換を有し得る。また、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列の断片である場合にも、配列番号１０と相補的に対応する位置のアミノ酸が置換されてよい。

具体的に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号６、２２、２３又は２４のアミノ酸配列を有するものであってよい。

また、前記ＩＬ－２変異体は、生体内で低い毒性を有することを特徴とするものであってよい。このとき、上記の“生体内で低い毒性”とは、ＩＬ－２がＩＬ－２受容体のアルファ鎖（ＩＬ－２Ｒα）と結合して誘発される副作用であってよい。前記ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合による副作用を改善させる目的で様々なＩＬ－２変異体が開発されており、このようなＩＬ－２変異体は、米国特許第５，２２９，１０９号及び大韓民国特許第１０－１６６７０９６号に開示されたものを使用することができる。特に、本出願で記述されるＩＬ－２の変異体は、ＩＬ－２受容体のアルファ鎖（ＩＬ－２Ｒα）と結合力が低いため、生体内毒性が野生型ＩＬ－２に比べて低い。

本明細書で使われる用語“ＣＤ８０”は、“Ｂ７－１”とも呼ばれ、樹状細胞、活性化されたＢ細胞、及び単核球に存在する膜タンパク質である。ＣＤ８０は、Ｔ細胞の活性化と生存に必須である共刺激信号を提供する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞表面に存在する異なる２つのタンパク質であるＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に対するリガンドとして知られている。ＣＤ８０は２８８個のアミノ酸から構成されており、具体的に、配列番号１１のアミノ酸配列を有するものであってよい。また、本明細書において“ＣＤ８０タンパク質”は、全長ＣＤ８０又はＣＤ８０断片を意味する。

本明細書で使われる用語“ＣＤ８０断片”とは、ＣＤ８０の切断型を意味する。また、前記ＣＤ８０断片は、ＣＤ８０の細胞外ドメインであってよい。ＣＤ８０断片の一具体例としては、ＣＤ８０の信号配列であるＮ末端から１番目～３４番目のアミノ酸が除外されたものでよい。具体的に、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～２８８番目のアミノ酸から構成されたタンパク質であってよい。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～２４２番目のアミノ酸から構成されたタンパク質であってよい。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～２３２番目のアミノ酸から構成されたタンパク質であってよい。また、また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～１３９番目のアミノ酸から構成されたタンパク質であってよい。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の１４２番目～２４２番目のアミノ酸から構成されたタンパク質であってよい。前記一実施例として、ＣＤ８０断片は、配列番号２のアミノ酸配列を有するものであってよい。

また、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質は、リンカー或いはキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）によって結合したものでよい。具体的に、前記ＩＬ－２又はその変異体及び前記ＣＤ８０（Ｂ７－１）又はその断片は、リンカー或いはキャリアによって結合したものでよい。本明細書において、リンカーとキャリアとが互換して使用されることもある。

前記リンカーは、２つのタンパク質を連結させる。リンカーの一具体例としては、１個～５０個のアミノ酸、アルブミン又はその断片、又は免疫グロブリンのＦｃドメインなどを含むことができる。このとき、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域及び軽鎖定常領域１（ＣＨ１）は含まないタンパク質を意味する。前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭであってよく、好ましくはＩｇＧ４であってよい。このとき、野生型免疫グロブリンＧ４のＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有するものであってよい。

また、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインの他、Ｆｃドメイン変異体であってもよい。また、本明細書で使われる用語“Ｆｃドメイン変異体”は、野生型Ｆｃドメインの糖鎖形態（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ）と異なるか、野生型Ｆｃドメインに比べて増加した糖鎖、野生型Ｆｃドメインに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形態であってよい。また、無糖鎖（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｆｃドメインも含まれる。Ｆｃドメイン或いは変異体は、培養条件或いはホストの遺伝子操作によって含有量が調節されたシアル酸（ｓｉａｌｉｃａｃｉｄ）、フコシル化（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を有するようにしたものでよい。

また、化学的方法、酵素的方法、及び微生物を用いる遺伝工学的エンジニアリング方法などのような通常の方法で免疫グロブリンのＦｃドメインの糖鎖を変形させることができる。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭのＦｃ領域が混合された形態であってよい。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、前記Ｆｃドメインの一部のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された形態であってよい。前記Ｆｃドメイン変異体の一具体例としては、配列番号１２のアミノ酸配列を有するものでよい。

融合タンパク質は、Ｆｃドメインをリンカー（或いは、キャリア）としてそのＮ末端とＣ末端にそれぞれＣＤ８０とＩＬ－２タンパク質が連結されるか或いはＩＬ－２とＣＤ８０が連結された構造を有してよい（図１Ａ）。ＦｃドメインのＮ末端或いはＣ末端とＣＤ－８０或いはＩＬ－２との連結は、任意にリンカーペプチドによってなされてよい。

具体的に、前記融合タンパク質は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）によってなされたものでよい：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
このとき、前記構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
前記Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
前記Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
前記Ｘは、ＣＤ８０タンパク質であり、
前記Ｙは、ＩＬ－２タンパク質であり、
前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
前記ｎ及びｍはそれぞれ独立に、Ｏ又は１である。

好ましくは、前記融合タンパク質は、構造式（Ｉ）によってなされたものでよい。前記ＩＬ－２タンパク質は、上述した通りである。また、前記ＣＤ８０タンパク質は、上述した通りである。一具体例によれば、ＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、１個から５個までのアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体であってよい。ＣＤ８０タンパク質は、野生型ＣＤ８０のＮ末端或いはＣ末端から連続して約３４個までのアミノ酸残基が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片であってよい。或いは、ＣＤ８０タンパク質は、Ｔ細胞表面受容体（Ｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ２８に結合する活性を有する細胞外免疫グロブリン様ドメインであってよい。

具体的に、前記融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列を有するものであってよい。さらに他の具体例によれば、融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％或いは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。このとき、同一性は、例えば、パーセント相同性、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢｌａｓｔＮｓｏｆｔｗａｒｅのような相同性比較ソフトウェアによって決定されてよい。

前記ＣＤ８０タンパク質とＦｃドメインとの間にはペプチドリンカー（１）が含まれてよい。前記ペプチドリンカー（１）は、５～８０個の連続したアミノ酸、２０～６０個の連続したアミノ酸、又は２５～５０個の連続したアミノ酸、又は３０～４０個のアミノ酸からなってよい。一具体例として、ペプチドリンカー（１）は、３０個のアミノ酸からなってよい。また、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも一つのシステインを含むことができる。具体的に、１個、２個又は３個のシステインを含むことができる。また、前記ペプチドリンカー（１）は、免疫グロブリンのヒンジに由来するものでよい。一具体例では、前記ペプチドリンカー（１）が配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってよい。

前記ペプチドリンカー（２）は、１～５０個の連続したアミノ酸、又は３～３０個の連続したアミノ酸、又は５～１５個のアミノ酸からなってよい。一具体例として、前記ペプチドリンカー（２）は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは１～１０の整数）であってよい。このとき、（Ｇ４Ｓ）ｎにおいて、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってよい。一実施例として、前記ペプチドリンカー（２）が配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってよい。

本発明の他の側面は、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質が２個結合した二量体を提供する。前記ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質は、上述した通りである。

このとき、二量体を構成する融合タンパク質間の結合は、リンカー内に存在するシステインによって二硫化結合によってなされたものでよいが、これに限定されない。二量体を構成する融合タンパク質は、同一のものでもよく、互いに異なる融合タンパク質であってもよい。好ましくは、前記二量体は、ホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）であってよい。前記二量体を構成する融合タンパク質の一実施例は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。

調節Ｔ細胞培養方法
本発明のさらに他の側面としては、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が含まれた培地でＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞を培養する段階を含む調節Ｔ細胞を培養する方法を提供する。

このとき、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞は、血液細胞から得られたものでよい。このとき、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ）から分離されたものでよい。又は、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞は、血液細胞でＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞を特異的に増殖させて得たものでよい。又は、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞は、ＰＢＭＣからＣＤ４－Ｔ細胞を除去した後、ＣＤ４＋細胞から得てもよい。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞の分離は、抗ＣＤ４抗体を用いて分離されてよく、一実施例では、抗ＣＤ４抗体が結合したビーズを用いて分離した。また、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の分離は、抗ＣＤ２５＋抗体を用いて分離されてよい。特に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋及びＣＤ１２７－であるＴ細胞を分離することによって調節Ｔ細胞を分離することができる。

前記培地は、従来使用されている培地であってよい。好ましくは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞に最適化された培地であってよい。一具体例では、表３及び表４に開示するように、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＴｅｘＭＡＣＳ培地にＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｌ－グルタミン及び２－メルカプトエタノールを添加した培地であってよい。また、前記培地は、レチノイン酸（Ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ）をさらに含むことができる。また、前記培地は、ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び／又はストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）をさらに含むことができる。

このとき、前記調節ＣＤ４＋Ｔ細胞を前記培地に、１日～３０日、２日～２０日培養できる。また、３日～１０日培養でき、４日～６日培養できる。

一方、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する段階；又は、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養する段階によって得られたものでよい。

このとき、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ２５＋Ｔ細胞はそれぞれ、血液細胞から得られたものでよい。このとき、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ２５＋Ｔ細胞のそれぞれは、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ）から分離されたものであるか、血液細胞でＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ２５＋Ｔ細胞を特異的に増殖させて得たものでよい。又は、ＰＢＭＣでＣＤ４－Ｔ細胞又はＣＤ２５－Ｔ細胞を除去した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ２５＋Ｔ細胞を得ることができる。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞の分離は、抗ＣＤ４抗体を用いて分離されてよく、一実施例では、抗ＣＤ４抗体が結合したビーズを用いて分離した。また、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の分離は、抗ＣＤ２５＋抗体を用いて分離されてよい。特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ２５＋Ｔ細胞からＣＤ４＋、ＣＤ２５＋及びＣＤ１２７－であるＴ細胞を分離することによって調節Ｔ細胞を分離することができる。

取得された調節Ｔ細胞及びその用途

本発明のさらに他の側面として、前記培養方法によって得られた調節Ｔ細胞を提供する。

本発明のさらに他の側面として、上述した方法によって得られた調節Ｔ細胞を有効成分として含む調節Ｔ細胞媒介性疾患治療用組成物を提供する。

このとき、前記培養方法によって得られた調節Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３＋の発現量が増加したものでよい。本明細書で使われた用語“Ｆｏｘｐ３”は、スカルフィン（ｓｃｕｒｆｉｎ）と呼ばれるタンパク質である。前記タンパク質は、調節Ｔ細胞の調節機序経路に関与するタンパク質であって、調節Ｔ細胞のマーカーとして知られている。好ましくは、前記得られた調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞であってよい。

本明細書で使われた用語“調節Ｔ細胞媒介性疾患”は、調節Ｔ細胞の異常又は欠乏によって誘導される疾患を意味し、具体的には、炎症性疾患又は自己免疫性疾患であることを特徴とし得る。

本発明の一具体例として、前記炎症性疾患は、ループス、シェーグレン症候群、リウマチ性関節炎、線維筋炎、硬皮症、強直性脊椎炎、ベーチェット病、アフタ口内炎、ギランバレー症候群、円形脱毛症、皮膚筋炎、クローン病、大膓炎、結節性多発動脈炎、再発性多発軟骨炎及び自己免疫血小板減少症からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とし得る。また、本発明の一具体例として、前記自己免疫性疾患は、リウマチ性関節炎、全身性硬皮症、膵臓細胞抗体によるインスリン依存性小児期糖尿病、円形脱毛症、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ口内炎、慢性甲状腺炎、一部後天性再生不良性貧血、一次性肝硬変、潰瘍性大膓炎、ベーチェット病、クローン病、シリコウシス、アスベストシス、ＩｇＡ腎臓疾患、連鎖状球菌感染後糸球体腎炎、シェーグレン症候群、ギランバレー症候群、皮膚筋炎、多発性筋炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性脳脊髓炎、重症筋無力症、グレーブス甲状腺亢進症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、線維組織炎、側頭動脈炎、ウィルソン病、ファンコーニ症候群、多発性骨髄腫及び全身性紅斑性ループスからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とし得る。

本発明の組成物は、薬剤学的に許容される担体及び／又は添加物などを含むことができる。例えば、滅菌水、生理食塩水、寛容の緩衝剤（リン酸、クエン酸、その他有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、又は保存剤などを含むことができる。また、バイオポリマーなどの有機物、ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）などの無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマー又はコポリマー、ポリエチレングリコールポリマー又はコポリマー及びその化学的誘導体、そしてそれらの混合組成物を利用できるが、これに限定されるものではない。前記安定剤としては、例えば、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ硫酸ナトリウムなどを使用することができる。前記酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル又はエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなどのキレート剤を使用することができる。前記懸濁剤は、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどを使用することができる。前記等張化剤としては、例えば、Ｄ－マンニトール、ソルビトールなどを使用することができる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシベンゾ酸メチル、パラオキシベンゾ酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾールなどを使用することができる。

収得された調節Ｔ細胞を用いた治療方法

本発明のさらに他の側面として、前記調節Ｔ細胞を調節Ｔ細胞媒介性疾患を有する個体に投与する段階を含む調節Ｔ細胞媒介性疾患治療方法を提供する。このとき、調節Ｔ細胞及び調節Ｔ細胞媒介性疾患は、上述した通りである。

本発明のさらに他の側面として、調節Ｔ細胞媒介性疾患の治療のための前記調節Ｔ細胞の用途を提供する。

以下、本発明を下記実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

製造例１．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）の製造：ＧＩ－１０１

ヒトＣＤ８０断片、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカー結合のＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２つのアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端から順に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号８）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチドを合成し、ｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^TM）に導入して配列番号９の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％の濃度である環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“ＧＩ－１０１”と命名した。

精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅｐｒｏｔｅｉｎＡｒｅｓｉｎが含まれたクロマトグラフィーを用いて精製した。２５ｍＭＴｒｉｓ、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の条件で融合タンパク質を結合させた。その後、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３の１００ｍＭの酢酸で溶出した。ｐＨ９の２０％の１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌを回収用チューブに入れ、融合タンパク質を回収した。回収された融合タンパク質を１６時間ＰＢＳバッファーで透析して変えた。

その後、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて、時間による２８０ｎｍ波長での吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色し、その純度を確認した（図１Ｂ）。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて検出したとき、２．７８ｍｇ／ｍｌの濃度で融合タンパク質が含まれていることを確認した（図１Ｃ）。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図１Ｄに示した通りである。

製造例２．Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）二量体の製造：Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２

Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、Ｉｇヒンジ（配列番号３８）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２つのアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）を含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４５）をＮ末端からこの順に含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯＴＭ）に導入して配列番号４４の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％の濃度である環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２”と命名した。

前記精製及び融合タンパク質の回収は、前記製造例１と同じ方法で行った。分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色してその純度を確認した（図３Ａ）。その結果、前記融合タンパク質は二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図３Ｂに示した通りである。

製造例３．Ｆｃ－ＩＬ－２二量体の製造：Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ

Ｆｃドメイン及び野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、Ｉｇヒンジ（配列番号３８）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び野生型ＩＬ－２（配列番号１０）を含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４３）をＮ末端からこの順に含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯＴＭ）に導入して配列番号４２の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％の濃度である環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ”と命名した。

前記精製及び融合タンパク質の回収は、前記製造例１と同じ方法で行った。分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色してその純度を確認した（図３Ｃ）。その結果、前記融合タンパク質は二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図３Ｄに示した通りである。

製造例４．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２野生型二量体の製造：ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ

ヒトＣＤ８０断片、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２野生型タンパク質を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカー結合のＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及びＩＬ－２野生型（配列番号１０）をＮ末端からこの順に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４１）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチドを合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯＴＭ）に導入して配列番号４６の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％の濃度である環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ”と命名した。

その後、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて、時間による２８０ｎｍ波長での吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色してその純度を確認した（図４Ａ）。その結果、前記融合タンパク質は二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図４Ｂに示した通りである。

製造例５．ｈＣＤ８０－Ｆｃ二量体の製造：ｈＣＤ８０－Ｆｃ

ヒトＣＤ８０断片及びＦｃドメインを含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカー結合のＩｇヒンジ（配列番号３）及びＦｃドメイン（配列番号４）をＮ末端からこの順に含む融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３９）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチドを合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯＴＭ）に導入して配列番号４０の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％の濃度である環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“ｈＣＤ８０－Ｆｃ”と命名した。

精製はＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅｐｒｏｔｅｉｎＡｒｅｓｉｎが含まれたクロマトグラフィーを用いて精製した。２５ｍＭＴｒｉｓ、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の条件で融合タンパク質を結合させた。その後、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３の１００ｍＭの酢酸で溶出した。ｐＨ９の２０％の１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌを回収用チューブに入れ、融合タンパク質を回収した。回収された融合タンパク質を１６時間ＰＢＳバッファーで透析して変えた。

その後、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて、時間による２８０ｎｍ波長での吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色してその純度を確認した（図２Ａ）。その結果、前記融合タンパク質は二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図２Ｂに示した通りである。

準備例１．調節Ｔ細胞培養のための培養用組成物

準備例１．１．ＣＤ４＋細胞培養組成物

下記のような組成でＣＤ４＋細胞培養用培地を製造した。このとき、基本成分の培地を製造した後、添加成分であるＧＩ－１０１、ＧＩ－１０１ＷＴ、ｈＣＤ８０－Ｆｃ、Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２又はＦｃ－ＩＬ－２ｗｔを使用前に添加した。

準備例１．２．ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞培養組成物
下記のようなＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞培養用培地を製造した。

実施例１．ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体の調節Ｔ細胞増殖程度確認

実施例１．１．調節Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ製造

分離されたＣＤ４＋細胞において調節Ｔ細胞の増殖を刺激するために、ＭＡＣＳＧＭＰＥｘｐＡｃｔＴｒｅｇＫｉｔ（Ｃａｔ＃：１７０－０７６－１１９）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調節Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ（ｂｅａｄ）を準備した。具体的に、調節Ｔ細胞の増殖刺激用ビーズが含まれたＭＡＣＳＧＭＰＥｘｐＡｃｔＴｒｅｇＫｉｔ内試薬を新しいチューブ（ｔｕｂｅ）に移し、前記チューブをマグネット（ｍａｇｎｅｔ）で１分間待機後に上清液を除去してビーズ（ｂｅａｄ）を分離した。このとき、ＭＡＣＳＧＭＰＥｘｐＡｃｔＴｒｅｇＫｉｔ内試薬は、２×１０^５個の細胞数当たりに１μＬを使用した。ビーズ分離後に、添加成分を含まない表１又は表２（基本成分のみ含む）のＣＤ４＋細胞培養組成物を０．５ｍＬ～１ｍＬ追加してビーズを溶いた。

実施例１．２．ＣＤ４＋Ｔ細胞の分離

購入したＰＢＭＣ（Ｃａｔ＃：ＳＥＲ－ＰＢＭＣ－２００－Ｆ）（Ｚｅｎ－Ｂｉｏ．Ｉｎｃ，ＮＣ２７７０９，ＵＳＡ）の細胞数を測定した。その後、３００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、上澄バッファー液を除去後に、１×１０^７細胞数当たりに８０μＬのＭＡＣｓバッファーを追加して細胞ペレットを溶いた。その後、１×１０^７細胞数当たりに２０μＬのＣＤ４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｃａｔ＃：１３０－０４５－１０１）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を分注しタッピングして十分に混ぜた。その後、４℃～８℃で１５分間反応させた。

洗浄のために１０ｍＬのＭＡＣｓバッファーを追加後に３００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、上清液除去後に、１×１０^８細胞数当たりに５００μＬのＭＡＣｓバッファーを追加して細胞ペレット（Ｃｅｌｌｐｅｌｌｅｔ）を溶いた。その後、ＬＳカラムを準備後に３ｍＬのＭＡＣｓバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）を流した。前記で準備した細胞懸濁液をＬＳカラム（Ｃａｔ＃：１３０－０４２－４０１）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通過させた。ＬＳカラムについている細胞（Ｃｅｌｌ）が十分に洗浄されるように３ｍＬのＭＡＣｓバッファーを３回流した。その後、ＬＳカラムをマグネットスタンド（Ｍａｇｎｅｔｓｔａｎｄ）から分離後に３ｍＬのＭＡＣｓバッファーを入れ、ピストンで圧力をかけてＣＤ４＋細胞を回収した。その後、３００×ｇで５分間遠心分離した。その後、上清液除去後に細胞数を測定した。

また、実施例１．１で準備したビーズが含まれた調節Ｔ細胞培養液を、前記で分離したＣＤ４＋Ｔ細胞に接種した。

実施例１．３．ＣＤ４＋Ｔ細胞培養

６ウェルプレートに、実施例１．２で準備したＣＤ４＋細胞を１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、添加物質としてＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、ＧＩ－１０１＿ＷＴ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ二量体（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２二量体（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ二量体（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ二量体（５０ｎＭ）をそれぞれ含む表１又は表２の細胞培養組成物条件下に、ＣＤ４＋細胞を培養した。６ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を示す際に、２５Ｔフラスコに継代培養した。２５Ｔフラスコの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、７５Ｔフラスコに継代培養した。７５Ｔフラスコの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、最終的に細胞を得た。

実施例１．４．ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞分離

実施例１．３で回収したＣＤ４＋細胞を１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。また、上清液を除去し、１：２００にＦＡＣＳバッファーに希釈したＦｃｂｌｏｃｋ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃４２２３０２）１ｍＬを入れて氷に１０分間放置した後、５０ｕｌＣＤ４－ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃３１７４２９）、５０ｕｌＣＤ２５－ＰＥ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃３５６１０８）、５０ｕｌＣＤ１２７－ＰＥ（ＢＤ，ｃａｔ＃５５７９３８）を入れて氷に２０分間放置した。その後、４ｍＬＦＡＣＳバッファーをさらに入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。その後、上清液の除去後にＦＡＣＳバッファーを３ｍＬ入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。その後、上清液を除去し、ＦＡＣＳバッファー３ｍＬに細胞を溶いた。最後に、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａを用いてＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を分離した。

実施例１．５．ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞培養

前記実施例１．４で分離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで４８ウェルプレートに播種し、これと同時に、実施例１．１のように、調節Ｔ細胞の増殖を刺激するために２×１０^５個の細胞数当たりに１μＬＭＡＣＳＧＭＰＥｘｐＡｃｔＴｒｅｇＫｉｔ（Ｃａｔ＃：１７０－０７６－１１９）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からビーズ（ｂｅａｄｓ）を分離した。前記分離したビーズを、添加成分を含まない表３又は表４（基本成分のみ含む）の細胞培養組成物（０．５ｍＬ～１ｍＬ）に溶いた後、実施例１．４で得たＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を播種したウェルプレートに添加した。その後、添加物質としてＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、ＧＩ－１０１＿ＷＴ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ（５０ｎＭ）をそれぞれ含む表３又は表４の細胞培養組成物条件下にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を培養した。

培養時に、４８ウェルプレート上で細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、２４ウェルプレートで継代培養した。２４ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、１２ウェルプレートで継代培養した。１２ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、６ウェルプレートで継代培養した。６ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、２５Ｔフラスコで継代培養した。２５Ｔフラスコの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、７５Ｔフラスコで継代培養した。１７５Ｔフラスコで継代培養して細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、最終収得した。

その結果、ＲＰＭＩ１６４０培地を含む調節Ｔ細胞培養培地組成物において調節Ｔ細胞増殖は表５及び図６、細胞生存率は表６及び図７の通りであった。また、ＴｅｘＭＡＣＳ培地を含む培養組成物において調節Ｔ細胞増殖の結果は表７及び図８、細胞生存率は表８及び図９に示した。

実施例１．６．免疫抑制性サイトカイン分泌能確認：インターロイキン－１０

前記実施例１．５から得られた調節Ｔ細胞のＩＬ－１０分泌能を評価するために、細胞数を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに合わせて培養した後に培養上清液を収得し、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）分析を行った。

まず、ＨｕｍａｎＩＬ－１０ＥＬＩＳＡＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃ＫＡＣ１３２１）のインキュベーションバッファーを１００ｕｌずつマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に分注した後、キャリブレーション（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）又は調節Ｔ細胞培養上清液サンプル（ｓａｍｐｌｅ）をそれぞれ１００ｕｌずつ入れて分注した。その後、マイクロプレートを接着フィルム（Ａｄｈｅｓｉｖｅｆｉｌｍ）で覆い、２時間、室温（１８℃～２５℃）、７００ｒｐｍでシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）でシェークしながら反応させた。その後、ウェル（ｗｅｌｌ）当たりに約１５０μＬ洗浄バッファーでマイクロウェルストリップ（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓｔｒｉｐ）を３回洗浄した。

洗浄後に、標本希釈剤（ＳｐｅｃｉｍｅｎＤｉｌｕｅｎｔ）を１００ｕｌずつ入れた。その後、ａｎｔｉ－ＩＬ－１０－ＨＲＰを５０ｕｌ入れた後、２時間、室温、７００ｒｐｍでシェークしながら反応させた後、ウェル当たりに約１５０μＬ洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄後に、ＴＭＢを１００ｕｌずつ入れ、１５分間室温で反応させた後、１００ｕｌストップソリューション（ｓｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて反応を終了した。その後、４５０ｎｍを使用して各マイクロウェルの蛍光値を測定した。

その結果、含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物から培養された細胞のインターロイキン－１０分泌能は、図１０の通りであり、含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物から培養された細胞のインターロイキン－１０分泌能は、図１１の通りであった。図１０及び図１１から、ＧＩ－１０１を培養組成物に添加した調節Ｔ細胞からインターロイキン－１０が高く発現することを確認した。

実施例２．最適化培養工程でＧＩ－１０１による調節Ｔ細胞増殖確認

実施例２．１．ＣＤ４＋Ｔ細胞分離

購入したＰＢＭＣ（Ｃａｔ＃：ＳＥＲ－ＰＢＭＣ－２００－Ｆ）（Ｚｅｎ－Ｂｉｏ．Ｉｎｃ，ＮＣ２７７０９，ＵＳＡ）の細胞数を測定した。その後、３００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、上澄バッファー液の除去後に、１×１０^７細胞数当たりに８０μＬのＭＡＣｓバッファーを追加して細胞ペレットを溶いた。その後、１×１０^７細胞数当たりに２０μＬのＣＤ４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｃａｔ＃：１３０－０４５－１０１）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を分注しタッピングして十分に混ぜ合わせた。その後、４℃～８℃で１５分間反応させた。

洗浄のために１０ｍＬのＭＡＣｓバッファーを追加後に、３００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、上清液の除去後に、１×１０^８細胞数当たりに５００μＬのＭＡＣｓバッファーを追加して細胞ペレットを溶いた。その後、ＬＳカラムを準備後に、３ｍＬのＭＡＣｓバッファーを流した。上記で準備した細胞懸濁液をＬＳカラム（Ｃａｔ＃：１３０－０４２－４０１）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通過させた。ＬＳカラムについている細胞が十分に洗浄されるように３ｍＬのＭＡＣｓバッファーを３回流した。その後、ＬＳカラムをマグネットスタンド（Ｍａｇｎｅｔｓｔａｎｄ）から分離後に３ｍＬのＭＡＣｓバッファーを入れ、ピストンで圧力をかけてＣＤ４＋細胞を回収した。その後、３００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後に上清液を除去し、細胞数を測定した。

前記分離されたＣＤ４＋細胞において調節Ｔ細胞の増殖を刺激するために、添加成分を含まない表１又は表２（基本成分のみ含む）のＣＤ４＋細胞培養組成物を０．５ｍＬ～１ｍＬ追加して、前記実施例１．１のように分離して準備したビーズを溶き、これを、前記ＰＢＭＣから分離されたＣＤ４＋細胞に接種した。

実施例２．２．ＣＤ４＋Ｔ細胞培養

６ウェルプレートに、実施例２．１で準備したＣＤ４＋細胞を１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、添加物質としてＧＩ－１０１（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）、ＧＩ－１０１＿ＷＴ（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）、又はＣＤ８０－Ｆｃ二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）をそれぞれ含む表１又は表２の細胞培養組成物の条件下にＣＤ４＋を培養した。６ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、２５Ｔフラスコで継代培養した。２５Ｔフラスコの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、７５Ｔフラスコで継代培養した。７５Ｔフラスコの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、最終的に細胞を得た。

実施例２．３．ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞分離

実施例２．２で回収したＣＤ４＋細胞を、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。また、上清液を除去し、１：２００にＦＡＣＳバッファーに希釈したＦｃｂｌｏｃｋ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃４２２３０２）１ｍＬを入れて氷に１０分間放置した。その後、５０ｕｌＣＤ４－ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃３１７４２９）、５０ｕｌＣＤ２５－ＰＥ／Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃３５６１０８）、５０ｕｌＣＤ１２７－ＰＥ（ＢＤ，ｃａｔ＃５５７９３８）を２番サンプルに入れ、氷に２０分間放置した。

その後、４ｍＬＦＡＣＳバッファーをさらに入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。その後、上清液を除去し、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーを入れた後、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。その後、上清液を除去し、ＦＡＣＳバッファー３ｍＬに細胞を溶いた。最後に、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａでＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を分離した。

実施例２．４．ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞培養

２４ウェルプレートに、実施例２．３で分離された全てのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を播種し、これと同時に、実施例２．１のように調節Ｔ細胞の増殖を刺激するために、２×１０^５細胞数当たりに１μＬＭＡＣＳＧＭＰＥｘｐＡｃｔＴｒｅｇＫｉｔ（Ｃａｔ＃：１７０－０７６－１１９）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からビーズ（ｂｅａｄｓ）を分離し、添加成分を含まない表３又は表４（基本成分のみ含む）の細胞培養組成物（０．５ｍＬ～１ｍＬ）にビーズを溶いた。その後、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を播種したウェルプレートに添加した。

その後、添加物質としてＧＩ－１０１（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）、ＧＩ－１０１＿ＷＴ（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ二量体（３．２ｎＭ／５０ｎＭ）をそれぞれ含む表３又は表４の細胞培養組成物の条件下にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を培養した。２４ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、１２ウェルプレートで継代培養した。１２ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、６ウェルプレートで継代培養した。６ウェルプレートの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、２５Ｔフラスコで継代培養した。２５Ｔフラスコの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、７５Ｔフラスコで継代培養した。

表３又は表４の添加物質が３．２ｎＭ処理されたグループに対しては、７５Ｔフラスコの細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、最終収得した。前記表３又は表４の添加物質が５０ｎＭ処理されたグループに対しては、１７５Ｔフラスコで継代培養して細胞が８０％以上のコンフルエンシーを示す際に、最終収得した。

その結果、含ＲＰＭＩ１６４０培地培養組成物において細胞増殖結果は、表９、図１２Ａ及び図１２Ｂ、細胞生存率は、表１０、図１３Ａ及び図１３Ｂの通りである。また、含ＴｅｘＭＡＣＳ培地培養組成物において細胞増殖結果は、表１１、図１４Ａ及び図１４Ｂ、細胞生存率は、表１２、図１５Ａ及び図１５Ｂの通りである。

実施例２．５．細胞特性確認

実施例２．４で回収したＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞を、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。また、上清液を除去し、１：２００にＦＡＣＳバッファーに希釈したＦｃｂｌｏｃｋ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃４２２３０２）１００ｕｌを入れて氷に１０分間放置し、さらに、２．５ｕｌＣＤ４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔ＃４５－００４８－４２）、２．５ｕｌＣＤ２５－ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＢＤ，ｃａｔ＃５５７７５３）、２．５ｕｌＣＤ１２７－ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃３５１３３０）を入れて氷に２０分間放置した。

その後、１ｍＬＦＡＣＳバッファーをさらに入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。Ｆｉｘａｔｉｏｎ／ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅとＦｉｘａｔｉｏｎ／ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＤｉｌｕｅｎｔを１：３に混合した溶液を準備し、前記遠心分離して得た細胞から上清液を除去して１００ｕｌを入れ、氷に３０分間放置した。その後、１ｍＬＦＡＣＳバッファーをさらに入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離を２回反復した。その後、上清液を除去し、１００ｕｌＦＡＣＳバッファーと２．５ｕｌＦｏｘｐ３－ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ｃａｔ＃３２０１１６）を入れ、氷に２０分間放置した。その後、１ｍＬＦＡＣＳバッファーをさらに入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心分離した。その後、上清液を除去し、ＦＡＣＳバッファー２００ｕｌに細胞を溶いた。最後に、ＣｙｔｅｋＡｕｒｏｒａ装備で細胞特性を分析した。

その結果、含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物から培養された細胞特性に対するＦＡＣＳ分析結果は、図１６Ａ～図１６Ｃ通りであり、前記培養条件で確認されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋発現Ｔ細胞数は、表１３、図１７Ａ～図１７Ｃの通りであった。また、含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物から培養された細胞特性に対するＦＡＣＳ分析結果は、図１８Ａ～図１８Ｃの通りであり、前記培養条件で確認されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋発現Ｔ細胞数は、表１４及び図１９Ａ～図１９Ｃの通りであった。

実施例２．６．免疫抑制性サイトカイン分泌能確認：インターロイキン－１０

前記実施例２．４から得られた調節Ｔ細胞のＩＬ－１０分泌能を評価するために、細胞数を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに合わせて培養した後、培養上清液を収得してＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）分析を行った。

まず、ヒトＩＬ－１０ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃ＫＡＣ１３２１）のインキュベーションバッファーを１００ｕｌずつマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に分注した後、キャリブレーション（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）又は調節Ｔ細胞培養上清液サンプル（ｓａｍｐｌｅ）をそれぞれ１００ｕｌずつ入れて分注した。その後、マイクロプレートを接着フィルム（Ａｄｈｅｓｉｖｅｆｉｌｍ）で覆い、２時間、室温（１８℃～２５℃）、７００ｒｐｍでシェーカー（ｓｈａｋｅｒ）でシェークしながら反応させた。その後、ウェル当たりに約１５０μＬ洗浄バッファーでマイクロウェルストリップ（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓｔｒｉｐ）を３回洗浄した。

洗浄後に、標本希釈剤（ＳｐｅｃｉｍｅｎＤｉｌｕｅｎｔ）を１００ｕｌずつ入れた。その後、ａｎｔｉ－ＩＬ－１０－ＨＲＰを５０ｕｌ入れ、２時間、室温、７００ｒｐｍでシェークしながら反応させた後、ウェル当たりに約１５０μＬ洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄後に、ＴＭＢを１００ｕｌずつ入れ、１５分間室温で反応させた後、１００ｕｌストップソリューション（ｓｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れ、反応を終了した。その後、４５０ｎｍを使用して各マイクロウェルの蛍光値を測定した。

その結果、含ＲＰＭＩ１６４０培地組成物から培養された細胞のインターロイキン－１０分泌能は、図２０の通りであり、含ＴｅｘＭＡＣＳ培地組成物から培養された細胞のインターロイキン－１０分泌能は、図２１の通りである。図２０及び図２１から、ＧＩ－１０１を培養組成物に添加した調節Ｔ細胞からインターロイキン－１０が高く発現することを確認した。

Claims

ＩＬ－２タンパク質の変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含む分離された調節Ｔ細胞増殖用組成物であって、
前記融合タンパク質二量体は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
を含み、式中、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質の変異体であり、
前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立に、０又は１であり、
前記ＩＬ－２タンパク質変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ及びＦ４２Ａの置換を含み、
前記ＣＤ８０タンパク質断片が、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含む、前記組成物。
前記ＣＤ８０は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の分離された調節Ｔ細胞増殖用組成物。
前記融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の分離された調節Ｔ細胞増殖用組成物。
前記調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－細胞である、請求項１に記載の分離された調節Ｔ細胞増殖用組成物。
ＩＬ－２タンパク質の変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を含む分離された調節Ｔ細胞増殖用培地であって、
前記融合タンパク質二量体は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
を含み、式中、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質の変異体であり、
前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立に、０又は１であり、
前記ＩＬ－２タンパク質変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ及びＦ４２Ａの置換を含み、
前記ＣＤ８０タンパク質断片が、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含む、前記培地。
ＣＤ４＋Ｔ細胞培養用培地をさらに含む、請求項５に記載の分離された調節Ｔ細胞増殖用培地。
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞培養用培地は、アミノ酸（ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）、糖類（ｓｕｇａｒｓ）、無機塩（ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｓ）及びビタミンを含む、請求項６に記載の分離された調節Ｔ細胞増殖用培地。
ＩＬ－２タンパク質の変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が含まれた培地で分離された調節Ｔ細胞を培養する段階を含む分離された調節Ｔ細胞培養方法であって、
前記融合タンパク質二量体は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
を含み、式中、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質の変異体であり、
前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立に、０又は１であり、
前記ＩＬ－２タンパク質変異体が、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ及びＦ４２Ａの置換を含み、
前記ＣＤ８０タンパク質断片が、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含む、前記培養方法。
前記分離された調節Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞である、請求項８に記載の分離された調節Ｔ細胞培養方法。
１日～２０日培養する、請求項８に記載の分離された調節Ｔ細胞培養方法。
前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養する段階；又はＣＤ２５＋Ｔ細胞を培養する段階によって得られたものである、請求項９に記載の分離された調節Ｔ細胞培養方法。