DE69218193T2 - Verfahren zur Synthese von Peptiden, Derivate von Aminosäuren zur Verwendung bei dem obengenannten Verfahren und Methoden zu deren Herstellung. - Google Patents
Verfahren zur Synthese von Peptiden, Derivate von Aminosäuren zur Verwendung bei dem obengenannten Verfahren und Methoden zu deren Herstellung.Info
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- C07K1/068—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for heterocyclic side chains
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Description
- Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Synthese von Peptiden, neue Aminosäurederivate, die in dem Verfahren eingesetzt werden und ihre Herstellungsverfahren.
- Peptide sind Verknüpfungen von Aminosäuren. In den meisten Fällen werden sie durch Kondensation der Carboxygruppe einer Aminosäure mit der Aminogruppe einer weiteren Aminosäure unter Eliminierung eines Wassermoleküls hergestellt. Die Verknüpfung kann erzielt werden, indem der zuvor hergestellten Verknüpfung eine weitere Aminosäure hinzugefügt wird oder indem vorab gebildete Peptidfragmente kondensiert werden. Im allgemeinen sind die Aminogruppen und die Carboxygruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, bei allen diesen Kondensationsreaktionen durch Schutzgruppen blokkiert, die leicht anzubringen, während der Kondensationsreaktion stabil und eine bezüglich der anderen selektiv eliminierbar sein müssen. Wenn die das Peptid bildenden Aminosäuren Seitenketten aufweisen, die reaktive funktionelle Gruppen enthalten, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Hydroxy- und Thiolgruppen, ist das Problem des Schutzes sehr schwierig zu lösen, da die Schutzgruppen der funktionellen Gruppen nicht nur während des Schrittes der Kondensation, sondern auch während des Schrittes der Ent fernung der Schutzgruppe einerseits von der α-Aminogruppe und andererseits der α-Carboxygruppe stabil sein müssen. Es ist ferner erforderlich, daß sie am Ende des Verfahrens entfernt werden können und das Peptid intakt gewonnen werden kann. Es wurden zahlreiche Schutzgruppen vorgeschlagen, man stößt jedoch insbesondere bei der Synthese von langkettigen Peptiden auf das Problem, Schutzgruppentypen zu finden, die unabhängig voneinander sind. In zahlreichen Peptidsynthesen besteht der Schritt der Gewinnung des Peptids darin, das geschützte Peptid einer Behandlung mit einer starken Säure zu unterziehen, die alle Schutzgruppen entfernt. Es werden Säuren wie beispielsweise Fluorwasserstoffsäure, Trifluormethansulfonsäure und Trifluoressigsäure verwendet. Diese Behandlung ist jedoch nicht ohne Nachteile. Man beobachtet zahlreiche Nebenreaktionen, beispielsweise bilden sich Benzylcarbokationen oder tert.-Butylcarbokationen, wenn Benzyl- oder tert.-Butylschutzgruppen verwendet werden, und diese reagieren völlig unvorhersehbar mit funktionellen Gruppen, die freigesetzt worden sind, ferner finden Reaktionen der Dehydratisierung oder Alkylierung statt. Es ist daher sehr schwierig, das nicht modifizierte Peptid wiederzugewinnen, wobei dies umso schwieriger ist, je komplizierter das Peptid ist.
- Es besteht daher ein Bedürfnis für ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, das einfach ist und das die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik nicht aufweist.
- Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden in Lösung oder durch Festphasensynthese, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
- - Bildung einer Peptidbindung durch Kondensation eines ersten Derivats einer Aminosäure oder eines zu verlängernden Peptids, bei denen die α-Aminogruppe mit einer Gruppe geschützt ist, die unter tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), 9- Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz), α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl (Ddz) und 2-Nitrophenylsulfenyl (Nps) ausgewählt ist, und worin die vorliegende(n) und zu schützende(n) funktionelle(n) Gruppe(n) in der oder den Seitenketten der Aminosäure oder des Peptids mit einer Gruppe Y der Formel R¹-CH=CH-CH&sub2;- blockiert ist (sind), wobei R¹ ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe bedeutet, in Form von Carbonaten, wenn es sich um alkoholische funktionelle OH-Gruppen han delt, in Form von Thiocarbonaten oder Thiomethylencarbamaten, wenn es sich um funktionelle Gruppen -SH handelt, in Form von Ethern oder Carbonaten, wenn es sich um phenolische funktionelle OH-Gruppen handelt, in Form von Carbamaten, wenn es sich um funktionelle Amino- oder Imino- Gruppen handelt und in Form von Estern, wenn es sich um funktionelle COOH-Gruppen handelt, mit einem zweiten Derivat einer Aminosäure oder eines zu verlängernden Peptids, bei denen die Säuregruppe -COOH in α-Stellung in Form einer Estergruppe -COOR² geschützt ist, wobei R² eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die gegebenenfalls am aromatischen Ring substituiert sind, oder Phenacyl bedeutet, oder in Form einer Amidgruppe - CONR³R&sup4;, wobei R³ und R&sup4;, die identisch oder voneinander verschieden sind, ein Wasserstoffatom, eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe oder eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe bedeuten, die ggf. am aromatischen Ring substituiert sind, wobei die Gruppen R², R³ und/oder R&sup4; ggf. an ein Polymer vom Polystyrol- oder Polyacryltyp gebunden sind, und worin die vorliegende(n) und zu schützende(n) funktionelle(n) Gruppe(n) in der oder den Seitenketten der Aminosäure oder des Peptids mit einer Gruppe Y der Formel R¹-CH=CH-CH&sub2;- blokkiert ist (sind), wobei R¹ ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe bedeutet, in Form von Carbonaten für alkoholische funktionelle OH-Gruppen, von Thiocarbonaten oder Thiomethylencarbamaten für funktionelle Gruppen -SH, von Ethern oder Carbonaten für phenolische funktionelle OH- Gruppen, von Carbamaten für funktionelle Amino- oder Iminogruppen und von Estern für funktionelle Gruppen - COOH,
- - ggf. Bildung einer letzten Peptidbindung durch Kondensation des zuvor erhaltenen Peptids mit einem Aminosäurederivat oder einem Peptid, worin die Aminogruppe in α- Stellung erforderlichenfalls mit einer üblichen Schutzgruppe geschützt ist und worin die vorliegende(n) und zu schützende(n) funktionelle(n) Gruppe(n) in der oder den Seitenketten der Aminosäure oder des Peptids mit der vorstehend angegebenen Gruppe Y blockiert ist (sind),
- - erforderlichenfalls Entfernen der ggf. vorliegenden Schutzgruppe der α-Aminogruppe und/oder der Schutzgruppen Y der funktionellen Gruppen in den Seitenketten und/oder der Schutzgruppe der α-Säuregruppe, wobei die Schutzgruppen der α-Aminogruppe, die nicht vom Y-Typ sind, und der α-Carbonsäuregruppe mit bekannten Verfahren abgespalten werden, und die Schutzgruppen Y alle durch eine milde Katalyse mit einer Verbindung eines Edelmetalls, wie eines Metalls aus der Gruppe von Platin, Ruthenium, Rhodium, Osmium, Iridium, Platin oder Palladium, gleichzeitig abgespalten werden.
- Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Peptide hergestellt werden, die teilweise oder gänzlich Aminosäurereste enthalten, deren Seitenketten eine oder mehrere reaktive funktionelle Gruppen aufweisen.
- Es können beliebige natürliche oder synthetische, bekannte Aminosäuren verwendet werden, und insbesondere Aminosäuren, deren Seitenketten eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweisen, sowie Peptide, die aus diesen Aminosäuren bestehen. Sie können in D-, L- oder DL-Form vorliegen. Von den Aminosäuren mit funktionellen Gruppen können beispielsweise genannt werden: Arginin (Arg), Asparaginsäure (Asp) cystein (Cys), Glutaminsäure (Glu), Histidin (His), Lysin (Lys), Hydroxylysin, Hydroxyprolin (Hyp), Serin (Ser), Threonin (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosin (Tyr), Thyroxin (Thy), Ornithin (Orn), α-Aminopimelinsäure und α-Aminosuberinsäure.
- Das Verfahren kann in flüssiger Phase oder in Festphase durchgeführt werden.
- Die Gruppe Y, die die funktionellen Gruppen der Seitenketten schützt, ist vorzugsweise eine Gruppe der Formel CH&sub2;=CH-CH&sub2;-, die mit dem Ausdruck All bezeichnet wird. Wenn die fuktionellen Gruppen phenolische OH-Gruppen sind, werden sie vorzugsweise in Form von Ethern geschützt.
- Die bevorzugten Schutzgruppen der Aminogruppe in α-Stellung des ersten Aminosäurederivats oder des zu verlängernden Peptids sind die Gruppen tert.-Butyloxycarbonyl (Boc) und 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc).
- Die α-amino-geschützten Derivate werden aus Aminosäuren hergestellt, indem zunächst die Schutzgruppe der Aminogruppe in α-Stellung und anschließend die Schutzgruppe(n) Y nach an sich bekannten Verfahren oder nach den nachstehend beschriebenen Verfahren oder in umgekehrter Reihenfolge eingeführt werden.
- Die Säuregruppe in α-Stellung des anderen Aminosäurederivats oder zu verlängernden Peptids wird in Form von Estern oder Amiden durch Gruppen geschützt, die für ihre Stabilität bei der Eliminierung der vorstehend genannten Schutzgruppen der α-Aminogruppe und insbesondere bei der Eliminierung der Schutzgruppen Boc und Fmoc dieser Gruppe bekannt sind, wie dies in den die Peptide betreffenden Veröffentlichungen beschrieben ist, wie insbesondere in "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, Band 15/1 und /2, Synthese von Peptiden, 1994 und in "Principle of Peptide Synthesis" von M. Bodansky, Springer-Verlag, 1984. Am häufigsten wird die Säuregruppe in Form des Esters mit einer C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylgruppe oder einer Benzylgruppe geschützt.
- Wenn die Merrifield-Synthese in Festphase verwendet wird, können die Schutzgruppen der Säuregruppe während der unterschiedlichen Arbeitsgänge an ein unlösliches Harz über Spacergruppen gebunden sein, die unter den Bedingungen der Entfernung der α-Aminoschutzgruppe ebenfalls stabil sind. Es sind zahlreiche Kombinationen möglich, die in der Literatur beispielsweise in "Solid-phase peptide synthesis: a silver anniversary report" von G. Barany & Co., 1987, Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 705-739, und in "Solid phase peptide synthesis" von J.M. Stewart und J.D. Young (1984) beschrieben sind.
- Das Harz ist im allgemeinen ein Polystyrol, beispielsweise ein mit 1 % Divinylbenzol gepfropftes Polystyrol, oder vom Polyacryltyp, beispielsweise ein vernetztes Copolymer von N- Acrylylpyrrolidon und dem Methylester von N-Acrylyl-β- Alanin.
- Die Herstellung der Derivate, in denen die α-Säuregruppe und die funktionellen Gruppen der Seitenketten geschützt sind, wird nach üblichen Verfahren oder vorzugsweise aus den vorstehend genannten α-aminogeschützten Derivaten über eine Veresterung oder Amidbildung, wonach ggf. ein Fixierschritt an einem Harz folgt, falls in Festphase gearbeitet werden soll, und über ein anschließendes Entfernen der Schutzgruppe der α-Aminogruppe durchgeführt.
- Die Bildung der Peptidbindung zwischen den beiden Aminosäurederivaten oder Peptiden wird durch bekannte Verfahren im allgemeinen mit Anhydriden, wirksamen Estern oder speziellen Kupplungsreagentien durchgeführt. Diese Verfahren sind vollkommen standardisiert und werden hier nicht im Detail beschrieben. Sie werden insbesondere in den vorgenannten Veröffentlichungen dargelegt.
- Gegebenenfalls kann eine letzte Peptidbindung durch Fixierung eines letzten Derivats einer Aminosäure oder eines Peptids gebildet werden, bei denen die α-Aminogruppe erforderlichenfalls mit einer der bekannten üblicherweise in der Peptidsynthese verwendeten Schutzgruppen geschützt ist, beispielsweise mit einer der oben genannten Schutzgruppen, der Gruppe Benzyloxycarbonyl (Z) oder der Gruppe Allyloxycarbonyl, und bei denen die vorliegende(n) und zu schützende(n) funktionelle(n) Gruppe(n) in der oder den Seitenketten der Aminosäure oder des Peptids durch die oben genannte Gruppe Y blockiert ist (sind). Es können beispielsweise Verbindungen wie Pyroglutaminsäure oder N-Acetyl-Derivate von Aminosäuren oder Peptiden als N-terminal Verbindungen verwendet werden.
- Während der Bildung der Peptidbindungen bleiben die funktionellen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, blockiert.
- Am Ende der Synthese können die Schutzgruppen der α-Aminogruppe und/oder der α-Säuregruppe und/oder der funktionellen Gruppen der Seitenketten des gebildeten Peptids erforderlichenfalls unabhängig voneinander und in beliebiger Reihenfolge entfernt werden. Die Schutzgruppe der α-Aminogruppe wird im allgemeinen im Falle der Gruppen Boc, Moz, Ddz und Nps durch milde saure Spaltung oder im Falle der Gruppe Fmoc durch basische Spaltung entfernt.
- Wenn die Schutzgruppe die Gruppe Boc ist, wird sie vorzugsweise mit einer starken Säure entfernt, wie Trifluoressigsäure in Dichlormethan oder Chlorwasserstoffgas in Dioxan. Die Gruppe Fmoc wird im allgemeinen mit einem sekundären Amin in einem Lösungsmittel entfernt, und vorzugsweise mit Piperidin in Dimethylformamid oder in N- Methylpyrrolidon.
- Die Gruppen vom Allyltyp, wie die Gruppen, die die funktionellen Gruppen der Seitenketten schützen, werden alle gleichzeitig entfernt, insbesondere mit einer katalytischen Menge einer Rhodium(I)-Verbindung und vorzugsweise mit einer Palladium(0)- oder Palladium(II)-Verbindung in einem Lösungsmittel oder einem geeigneten Lösungsmittelsystem in Gegenwart von nucleophilen Akzeptoren oder Protonendonatoren, wie beispielsweise Morpholin, Dimedon oder weiteren deprotonierbaren Verbindungen mit mobilem Wasserstoff.
- Ein für das Entfernen der Schutzgruppe gut geeignetes Verfahren besteht darin, das Peptid mit Trimethylzinnhydrid in Gegenwart einer katalytischen Menge von Palladium(0)-Tetrakis(triphenylphosphin) oder Palladium(II)-Dichlorbis(triphenylphosphin) und einer schwach sauren Verbindung, wie Essigsäure oder p-Nitrophenol, oder von Pyridiniumacetat oder Wasser in einem Lösungsmittelmedium umzusetzen. Es können sehr unterschiedliche Lösungsmittel verwendet werden, wie Benzol, Toluol, Diethylether, Tetrahydrofuran, Dichlormethan, Aceton, Ethylacetat und Dimethylformamid.
- Das Entfernen der Schutzgruppen kann ferner mit einer katalytischen Menge von Palladium(0)-Tetrakis(triphenylphosphin) in Gegenwart von N,N-Dimethylsilylamin und Trimethylsilylacetat in einem aprotischen Lösungsmittelmedium mit niedrigem Siedepunkt, wie Dichlormethan, durchgeführt werden, wobei die erhaltene Verbindung anschließend mit Methanol behandelt wird.
- Das Entfernen der Schutzgruppe der α-Säuregruppe des Peptids wird im allgemeinen auf herkömmliche Weise durchgeführt, beispielsweise durch saure Spaltung mit Fluorwasserstoffsäure, Trifluormethansulfonsäure oder Trifluoressigsäure.
- Wenn das von allen Schutzgruppen freie Peptid gewonnen werden soll, wird vorzugsweise zuerst die Schutzgruppe der α- Aminogruppe entfernt, wenn sie nicht vom Allyltyp ist. Während dieses Arbeitsgangs werden die Schutzgruppen vom Allyltyp in den Seitenketten nicht angegriffen. Danach werden gleichzeitig alle Schutzgruppen vom Allyltyp und zuletzt, falls sie nicht bereits im Laufe einer der vorhergehenden Behandlungen entfernt wurde, die Schutzgruppe der α- Säuregruppe entfernt.
- Durch das erfindungsgemäße Verfahren können sehr reine Peptide hergestellt werden. Das Entfernen der Schutzgruppe der α-Aminogruppe kann durchgeführt werden, ohne daß die Schutzgruppen der funktionellen Gruppen der Seitenketten modifiziert werden, und daher ohne Auftreten von Nebenreaktionen; die funktionellen Gruppen der Seitenketten werden alle durch die gleiche Behandlung freigesetzt.
- Die Erfindung betrifft ferne neue Aminosäurederivate, die in dem Verfahren verwendet werden. Diese neuen Derivaten weisen die allgemeine Formel
- auf, worin bedeuten:
- X die Gruppe tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz), α,α-Dimethyl-3,5-dimethyloxybenzyloxycarbonyl (Ddz) oder 2- Nitrophenylsulfenyl (Nps),
- T -OH, -OR², wobei R² eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die ggf. am aromatischen Ring substituiert sind, oder Phenacylgruppe bedeutet, oder -NR³R&sup4;, wobei R³ und R&sup4;, die gleich oder voneinander verschieden sind, Wasserstoff, eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe oder eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die ggf. am aromatischen Ring substituiert sind, bedeuten,
- R' Wasserstoff und
- R den Rest der Seitenkette einer Aminosäure, die mindestens eine der funktionellen Gruppen -OH, -SH, > NH, =NH, -NH&sub2;, - COOH enthält, oder
- R' und R miteinander verbunden den Rest einer cyclischen Aminosäure, die mindestens eine der vorgenannten funktionellen Gruppen aufweist,
- Y¹ die Gruppe Y-O- - , worin Y die Formel R¹-CH=CH-CH&sub2;- auf weist, wobei R¹ Wasserstoff oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe bedeutet, wenn Y¹ das Wasserstoffatom der funktionellen Gruppe(n) -OH, -SH, > NH, =NH, oder -NH&sub2; ersetzt, welche im Rest R oder in dem Rest, der durch die Verbindung von R mit R' gebildet wird, enthalten ist (sind), außer wenn X die Gruppe tert.- Butyloxycarbonyl, T die Gruppe -OH und R den Rest der Seitenkette von Lysin bedeutet, oder
- Y¹ die Gruppe Y-O- -NH-CH&sub2;- (die in der vorliegenden Beschreibung auch als Methylencarbamat bezeichnet wird), wobei Y die oben angegebene Bedeutung aufweist, wenn Y¹ das Wasserstoffatom der funktionellen Gruppe(n) -SH ersetzt, die im Rest R oder in dem Rest, der durch die Verbindung von R an R' gebildet wird, enthalten ist (sind), oder
- Y¹ die Gruppe Y mit der oben genannten Bedeutung, wenn Y¹ das Wasserstoffatom der funktionellen Gruppe(n) -COOH und/oder phenolischen OH-Gruppe(n) ersetzt, die im Rest R oder dem Rest, der durch die Verbindung von R an R' gebildet wird, enthalten ist (sind), außer wenn X die Gruppe tert.- Butyloxycarbonyl, T die Gruppe -OH und R den Rest der Seitenkette von Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Tyrosin bedeuten, und
- n = 1, wenn R nur eine einzige funktionelle Gruppe enthält, oder n = 1 oder 2, wenn R zwei funktionelle Gruppen enthält.
- Die erfindungsgemäßen neuen Derivate können in D-, L- oder DL-Form vorliegen. Wenn T die Gruppe OH bedeutet, können sie in Form von Salzen mit Verbindungen vorliegen, die üblicherweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, beispielsweise mit Dicyclohexylamin.
- Die Gruppen R bedeuten alleine oder in Kombination mit R' die Reste von beliebigen bekannten natürlichen oder synthetischen Aminosäuren, die mindestens eine funktionelle Gruppe -OH, -SH, > NH, =NH, -NH&sub2; und -COOH in ihrer Seitenkette enthalten. Von den Aminosäuren, die diese Gruppen enthalten, können insbesondere genannt werden: Arginin (Arg), Asparaginsäure (Asp), Cystein (Cys), Glutaminsäure (Glu), Histidin (His), Lysin (Lys), Hydroxylysin, Hydroxyprolin (Hyp), Serin (Ser), Threonin (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosin (Tyr), Thyroxin (Thy), Ornithin (Orn), α-Aminopimelinsäure und α- Aminosuberinsäure.
- Die bevorzugten Derivate sind Derivate, worin Y die Allylgruppe CH&sub2;=CH-CH&sub2;- bedeutet. Bevorzugte Derivate sind insbesondere Derivate, worin X die Gruppe Boc oder Fmoc bedeutet und T die Gruppe -OH oder -OR² ist, worin R² eine C&sub1;&submin;&sub5;- Alkylgruppe oder eine Benzylgruppe bedeutet.
- Von den insbesondere verwendeten Verbindungen können die folgenden Verbindungen genannt werden: Boc-Ser(Alloc)-OH, Boc-Thr(Alloc)-OH, Boc-Thr(Alloc)-OCH&sub3;, Boc-His(Alloc)-OH, Boc-Arg(Alloc)-OH, Boc-Arg(Alloc)&sub2;-OH, Boc-Cys(Alloc)-OH, Fmoc-Asp(OAll)-OH, Fmoc-Glu(OAll)-OH, Fmoc-Cys-(Alloc)-OH, Fmoc-Lys-(Alloc)-OH, Fmoc-Thyr(All)-OH, Fmoc-Ser(Alloc)-OH, Fmoc-Thr(Alloc)-OH, Fmoc-His(Alloc)-OH, Fmoc-Argoc(Alloc)-OH, Fmoc-Arg(Alloc)&sub2;-OH, Boc-Cys(Allocam)-OH und Fmoc-Cys(Allocam)-OH; Alloc bezeichnet die Gruppe CH&sub2;=CH-CH&sub2;-O- - und Allocam die Gruppe CH&sub2;=CH-CH&sub2;-O- -NH-CH&sub2;-.
- Die neuen Derivate können auf unterschiedliche Weise hergestellt werden.
- Wenn Y¹ die Gruppe Y-O- - bedeutet, worin Y die Formel R¹-CH=CH=CH&sub2;- aufweist, wobei R die oben genannten Bedeutungen hat, werden sie vorzugsweise durch Umsetzung von Chlorformiat der Formel Y-O- -Cl mit der Verbindung der Formel
- worin Y, X, T, R und R' die oben genannten Bedeutungen aufweisen, je nach der Art der im Rest R oder in dem Rest, der durch die Verbindung von R mit R' gebildet wird, vorliegenden funktionellen Gruppe(n) in wasserfreiem Medium oder in neutralem oder basischem wäßrigen Medium bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50 ºC hergestellt.
- Wenn die zu schützende funktionelle Gruppe der Seitenkette eine Amino- oder Iminogruppe ist, werden die beiden Ausgangsverbindungen insbesondere in wäßrigem Medium bei einem basischen pH-Wert von 7 bis 12 umgesetzt.
- Wenn die Gruppe R der Rest von Serin ist, werden die Verbindungen in wäßrigem neutralen Medium umgesetzt.
- Wenn R der Rest von Threonin ist, ist das Medium vorzugsweise wasserfrei und es wird das Chlorformiat Y-O- -Cl mit dem Threoninderivat der Formel
- worin X die oben genannten Bedeutungen aufweist und T die Gruppe -OR² oder -NR³R&sup4; bedeutet, wobei R², R³ und R&sup4; die vorgenannten Bedeutungen aufweisen, in Gegenwart von Dimethylaminopyridin umgesetzt, worauf ggf. eine enzymatische Behandlung zur Freisetzung der α-Säuregruppe durchgeführt wird.
- Wenn Y¹ die vorstehende Gruppe Y ist und das Wasserstoffatom einer Gruppe -COOH oder einer phenolischen OH-Gruppe ersetzt, wird eine Verbindung der Formel Y-Br in basischem Medium mit dem Kupferkomplex der Aminosäure ggf. in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol oder Ethanol, bei einer Temperatur von 0 bis 50 ºC umgesetzt, worauf nach dem Entfernen des Kupfers die Schutzgruppe X nach bekannten Verfahren, beispielsweise mit Fluorformiat, Chlorformiat oder Tetrachlorethylcarbonat von X, eingeführt wird; ggf. wird die α-COOH-Gruppe in einen Ester -COOR² oder ein Amid -CONR³R&sup4; umgewandelt, wobei R², R³ und R&sup4; die vorstehenden Bedeutungen aufweisen.
- Wenn Y¹ die Gruppe Y-O- -NH-CH&sub2;- bedeutet, wobei Y die vorstehende Bedeutung aufweist, und Y¹ das Wasserstoffatom einer Gruppe -SH ersetzt, beispielsweise in Cystein, wird das Hydroxymethylcarbamat der Gruppe vom Allyltyp mit der Aminosäure, vorzugsweise das Hydrochlorid, in saurem Medium bei einer Temperatur von 0 bis 50 ºC ggf. in einem aprotischen Lösungsmittel, wie Dichlormethan, umgesetzt, worauf die Schutzgruppe X nach bekannten Verfahren eingeführt wird, beispielsweise nach den oben genannten Verfahren; anschliessend wird ggf. die α-COOH-Gruppe wie oben beschrieben umgewandelt.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie einzuschränken. In allen Beispielen liegen die Aminosäuren und ihre Derivate in L-Form vor.
- 5,1 g Boc-His-OH (0,02 mol) werden in 10 ml 2N NaOH und 10 ml Wasser gelöst. Das Gemisch wird auf 0 ºC abgekühlt und gerührt. Es werden 2 ml Allylchlorformiat (0,019 mol) tropfenweise zugegeben, wobei der pH-Wert mit 2N NaOH auf 7 bis 7,5 gehalten wird. Anschließend wird 1 h bei 0 ºC weitergerührt. Die Lösung wird einmal mit Ethylether (Et&sub2;O) gewaschen und dann mit konzentrierter HCl bis pH 2 bis 3 angesäuert. Das Produkt wird dreimal mit EtOAc extrahiert, mit H&sub2;O gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels werden 3,9 g des gewünschten Produkts als Feststoff/Schaum (Ausbeute 57 %) erhalten.
- Durch Anfärben mit Ninhydrin (nach üblicher Abspaltung der Gruppe Boc durch Verdampfen der Chlorwasserstoffsäure) werden zwei Flecken bei der Dünnschichtchromatographie (DC) in dem Lösungsmittel CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/AcOH (90/8/2) erhalten. Die Strukturen der beiden τ- und τ-Isomeren wurden mit NMR bestätigt.
- 5,48 g Boc-Arg-OH (0,02 mol) werden in einem Gemisch von 40 ml 2N NaOH und 12 ml Dioxan bei 50 ºC gelöst und gerührt. Der pH-Wert der Lösung beträgt etwa 14. Es werden bis zu einem pH-Wert von 12 etwa 5 ml Allylchlorformiat zugegeben. Dann werden weiterhin 5 ml Allylchlorformiat zugegeben, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 2N NaOH bei etwa 11,5 bis 12 gehalten wird. Nach dem Zusatz des Chlorformiats wird 2 h weitergerührt.
- Die wäßrige Phase wird zweimal mit Et&sub2;O gewaschen und dann mit konzentrierter HCl auf pH 3 angesäuert. Das Produkt wird dreimal mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase enthält drei Produkte, das Ausgangsprodukt, das Produkt mit nur einer Gruppe Alloc und das Produkt mit zwei Gruppen Alloc. Sie wird mit H&sub2;O bei pH 3 zur Entfernung des Ausgangsprodukts und anschließend mit H&sub2;O bei pH 6 gewaschen, um das Monoallocderivat in der wäßrigen Phase zu erhalten.
- Die organische Phase wird dann über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter Erhalt von 0,8 g Boc-Arg(Alloc)&sub2;-OH in Form von Öl verdampft.
- [α]²&sup0;D: + 2,1(c 1,CH&sub3;OH).
- Die Struktur wurde mit NMR bestätigt.
- Die vorhergehende wäßrige Phase wird mit NaCl gesättigt. Das Produkt Boc-Arg(Alloc)-OH wird dreimal mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet. Man erhält 0,3 g Boc-Arg(Alloc)-OH in Form von Schaum (Struktur mit NMR bestätigt).
- [α]²&sup0;D : - 3,8 (c 1,CH&sub3;OH)
- Jedes Produkt ergibt durch Anf ärben mit Ninhydrin einen einzigen Fleck in der DC (Lösungsmittel CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/ACOH (90/8/2)).
- 4,1 g Boc-Ser-OH (0,02 mol) werden in 15 ml 2N NaOH gelöst. Es werden zehnmal abwechselnd 9 ml Allylchlorformiat (0,085 mol) und 80 ml 2N NaOH zugegeben. Man läßt 1 h reagieren.
- Das Reaktionsgemisch wird mit konzentrierter HCl bis pH 2 bis 3 angesäuert. Die organische Phase wird mit EtOAc (dreimal) extrahiert, anschließend mit Wasser bis zum vollständigen Entfernen von Boc-Ser-OH gewaschen.
- Das Lösungsmittel wird unter Erhalt eines Öls (0,8 g) verdampft. Dieses Öl wird in Ethylether gelöst. Man setzt ein Äquivalent Dicyclohexylamin (DCHA) und anschließend Hexan zu. Man erhält 1 g des gewünschten Produkts in Form des DCHA-Salzes (Struktur mit NMR bestätigt). Schmelzpunkt: 111 - 113 ºC.
- [α]²&sup0;D : + 19,1 (c 1,CH&sub3;OH).
- Nach Anfärben mit Ninhydrin ein Fleck in der DC in dem Lösungsmittel CHCl&sub3;/MeOH/ACOH (90/8/2).
- 8,24 g Thr-OMe HCl (0,05 mol) werden in 20 ml 2N NaOH gelöst. Es werden 10 ml Wasser und 30 ml Aceton zugesetzt, und es wird gerührt. Es werden tropfenweise 20 g Boc-F (40 % in Dimethoxyethan (DME), 0,065 mol) zugegeben, wobei der pH- Wert durch Zusatz von 2N NaOH auf 7 bis 7,5 und die Reaktionstemperatur auf 10 bis 15 ºC gehalten wird. Nach dem Zusatz von Boc-F wird 15 min weitergerührt.
- Das Produkt wird dreimal mit tert.-Butylmethylether (TBME) extrahiert, und die organische Phase wird mit Wasser gewaschen und anschließend über MgSO&sub4; getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhält man ein farbloses Öl. Das Öl wird mit Hexan gewaschen. Man erhält 7 g (0,03 mol) Boc- Thr-OMe. Diese werden in 50 ml trockenem CH&sub2;Cl&sub2; bei 0 ºC gelöst. Es werden 3,66 g Dimethylaminopyridin (DMAP) (0,03 mol) und 3,82 ml Allylchlorformiat (0,036 mol) zugegeben. Das Gemisch wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt; das Lösungsmittel wird verdampft; es werden Ethylether und Wasser zugegeben; die organische Phase wird zweimal mit 1N HCl, zweimal mit 5%igem NaHCO&sub3; und zweimal mit gesättigter NaCl- Lösung gewaschen. Das reine Produkt wird durch Chromatographie an Kieselsäure (Elutionslösung CHCl&sub3;) abgetrennt. Man erhält 4,6 g reines Boc-Thr(Alloc)-OMe (Ausbeute 48 %).
- 1,123 g Boc-Thr(Alloc)-OMe (3,5 mol) werden in 10 ml EtOH und 20 ml H&sub2;O gelöst. Anschließend werden 50 mg Cystein HCl H&sub2;O zugegeben. Der pH-Wert wird mit 0,1'N NaOH auf 6,2 eingestellt. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wird bei 35 ºC ± 2 ºC gehalten. Es werden 50 mg rohes Papain zugegeben. Der pH-Wert des Gemisches wird durch Zusatz von 0,1N NaOH um 6,2 gehalten. Es wurden 35 ml (3,5 mol) 0,1N NaOH verbraucht. Der pH-Wert wird auf 8,5 eingestellt. Die wäßrige Lösung wird zweimal mit TBME gewaschen und anschließend mit konzentrierter HCl auf pH 2 bis 3 angesäuert. Das Produkt wird mit TBME extrahiert.
- Die organische Phase wird einmal mit H&sub2;O gewaschen, über Celite filtriert und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird verdampft. Man gewinnt 0,7 g Produkt in Form von Öl.
- Das Öl wird in Ether gelöst. Man setzt ein Äquivalent DCHA und anschließend Hexan zu. Man beläßt das Produkt für einige Stunden in der Kälte. Es werden 0,53 g des erwarteten Produkts in Form des DCHA-Salzes als weißer Feststoff (Ausbeute 31 %) gewonnen; Schmelzpunkt: 108-109 ºC.
- [α]²&sup0;D : + 22 (c 1,CH&sub3;OH)
- Durch Anfärben mit Ninhydrin wird in der DC in dem Lösungsmittel CHCl&sub3;/MeOH/AcOH (90/8/2) ein Fleck erhalten.
- 2,21 g Boc-Cys-OH (10 mmol) werden mit 2N NaOH und Wasser behandelt. Der pH-Wert wird auf 8 gehalten. Es werden gleichzeitig 1,6 ml Allylchlorformiat (15 mmol) und 2N NaOH zugesetzt, wobei der pH-Wert auf 7 bis 8 gehalten wird. Am Ende der Zugabe wird das Gemisch auf pH 2,5 angesäuert und anschließend dreimal mit AcOEt extrahiert. Die AcOEt-Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet, und man erhält nach Verdampfung des Lösungsmittels ein Öl. Das Öl wird zusammen mit Ether und Hexan mehrere Male verdampft. Das viskose Öl wird bei Raumtemperatur aufbewahrt. Das Produkt verfestigt sich. Man erhält durch Filtrieren 2,8 g des erwarteten Produkts in Form eines weißen Feststoffs (Ausbeute 92 %). Die Struktur wird durch NMR bestätigt. Schmelzpunkt 69-71 ºC.
- [α]²&sup0;D : - 47,3 (c 1,CH&sub3;OH)
- 1,15 g Lys(Alloc)-OH (5 mmol) werden in 10 ml Aceton, 10 ml 0,5N NaOH und 10 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert beträgt etwa 9. Es werden 2,23 g 9-Fluorenylmethylcarbonat und Tetrachlorethylcarbonat (Fmoc-OTCE) zugegeben, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 2N NaOH auf 7 bis 8 eingestellt wird. Am Ende der Reaktion wird der pH-Wert auf 9 bis 9,5 eingestellt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit Ether gewaschen und anschließend auf einen pH-Wert von etwa 2,5 angesäuert. Das Produkt wird dreimal mit EtOAc extrahiert. Die EtOAc- Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet. Nach Verdampfung des Lösungsmittels erhält man einen Schaum. Der Schaum wird in Ether gelöst. Es wird Hexan zugegeben, und anschließend wird das Gemisch ultrageschallt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren erhalten. Man erhält 1,82 g des gewünschten Produkts (Ausbeute 80 %); Schmelzpunkt: 88-90 ºC.
- [α]²&sup0;D : -11,3 (c 1,Dimethylformamid (DMF)).
- 0,44 g Tyr(All)-OH (2 mmol) werden in einem Gemisch aus H&sub2;O und Aceton (1/1) suspendiert. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 0,5N NaOH auf 8 eingestellt. Es werden 0,9 g Fmoc-OTCE auf einmal zugegeben. Der pH-Wert wird auf 7 bis 8 gehalten. Das zunächst trübe Reaktionsgemisch wird klar und wird dann zur Emulsion. Es wird 12 h bei Raumtemperatur weitergerührt.
- Das Reaktionsgemisch wird bis zu einem pH-Wert von etwa 2,5 angesäuert und dreimal mit AcOEt extrahiert. Es wird Wasser zugegeben. Der pH-Wert wird auf 9,5 eingestellt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und bis zu einem pH-Wert von etwa 2,5 angesäuert und dreimal mit EtOAc extrahiert. Das Produkt wird über MgSO&sub4; getrocknet, worauf es in EtOAc/Et&sub2;O/Hexan ausgefällt wird. Man erhält 100 mg des gewünschten Produkts. Schmelzpunkt: 75-78 ºC.
- [α]²&sup0;D : -21,3 (c 1,DMF).
- 1,11 g Glu(OAll)-OH HCl (5 mmol) werden in 10 ml 0,5N NaOH, 20 ml Wasser und 20 ml Aceton gelöst. Es werden 2,64 g Fmoc-OTCE auf einmal zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 1N NaOH auf 7,5 gehalten. Am Ende der Reaktion wird der pH-Wert auf 8,5 eingestellt, und die wäßrige Phase wird viermal mit Et&sub2;O gewaschen und anschließend bis zu einem pH-Wert von etwa 2,5 angesäuert. Das Produkt wird dreimal mit Et&sub2;OAc extrahiert. Die erhaltene organische Phase wird dreimal mit Wasser (pH 2,5) und Wasser (pH 6) gewaschen und anschließend über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird verdampft. Das Produkt wird in Et&sub2;O gelöst. Es wird Hexan zugegeben und anschließend wird das trübe Gemisch ultrageschallt. Es fällt ein Feststoff aus. Man erhält 1 g gewünschtes Produkt (Ausbeute 48 %). Schmelzpunkt: 102-105 ºC.
- [α]²&sup0;D : - 17,1 (c 1,DMF).
- 2,1 g Asp(OAll)-OH HCl (10 mmol) werden in 30 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) suspendiert. Es werden 5,02 ml Et&sub3;N (36 mmol) zugegeben. Das Gemisch wird viskos. 8,18 g Fmoc-OTCE werden auf einmal zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 18 h bei 40 ºC unter Argon gerührt. Es werden Wasser und EtOAc zugegeben. Der pH-Wert wird auf 9 eingestellt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und anschließend bis zu einem pH-Wert von etwa 2,5 angesäuert. Das Produkt wird dreimal mit EtOAc extrahiert. Die EtOAc-Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet. Es wird nach Verdampfen des Lösungsmittels ein Schaum erhalten. Das Produkt fällt in MeOH/Et&sub2;O/Hexan aus. Man erhält 0,53 g des gewünschten Produkts. Schmelzpunkt: 140 ºC.
- [α]²&sup0;D : + 5,9 (c 1,DMF).
- 0,44 g Boc-Arg(Alloc)&sub2;-OH (1 mmol) werden mit 10 mml Trifluoressigsäure und CH&sub2;Cl&sub2; (1/1) 30 min behandelt. Anschließend wird das Lösungsmittel an einem Rotationsverdampfer verdampft. Der Rückstand wird zweimal zusammen mit CH&sub2;Cl&sub2; verdampft. Der Rückstand wird in 10 ml Aceton und 30 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird mit 2N NaOH auf 9 eingestellt. Es werden 1,2 Äquivalente Fmoc-OTCE zugegeben, wobei der pH-Wert auf 8 bis 9 gehalten wird. Am Ende des Zusatzes wird eine Emulsion erhalten. Die trübe wäßrige Phase wird viermal mit Ether gewaschen und anschließend mit konzentrierter HCl bis zu einem pH-Wert von etwa 2,5 angesäuert. Das Produkt wird dreimal mit AcOEt extrahiert. Die organische Phase wird unter MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird verdampft und man erhält ein Öl. Das Öl wird mit Et&sub2;O- Hexan behandelt und anschließend ultrageschallt. Es werden 100 mg des gewünschten Produkts in Form eines weißen Feststoffs abgetrennt. Schmelzpunkt: 78-80 ºC.
- [α]²&sup0;D: - 9,1 (c 1,DMF).
- Es werden 10 g Cystein-Hydrochlorid (0,063 mol) in 60 ml Trifluoressigsäure gelöst. Es wird langsam eine Lösung von Allylhydroxymethylcarbamat (9,04 g, 0,069 mol) in 60 ml CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 10 min gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel verdampft. Man erhält einen weißen Feststoff. Es werden 1,1 Äquivalente HCl (1N) zugegeben. Die Lösung wird verdampft, worauf der Rückstand zusammen mit C&sub2;H&sub5;OH verdampft wird. Man erhält das erwartete Produkt in Form eines Feststoffes, der unter Vakuum getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 95 %.
- Es werden 10 mmol von HCl Cys(Allocam)-OH, das zuvor hergestellt worden ist, in 20 ml Wasser bei pH 9 gelöst. Es werden langsam etwa 12 mmol Boc-F (40 Vol.-% in DME) zugegeben, wobei der pH-Wert durch Zusatz von NaOH (2N) auf 9 gehalten wird. Nach dieser Zugabe wird 30 min weitergerührt. Die wäßrige Phase wird zweimal mit Ethylether gewaschen, worauf auf pH 3 angesäuert wird. Das Produkt wird mit AcOEt extrahiert, mit H&sub2;O gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird verdampft, und man erhält das erwartete Produkt in Form eines Öls.
- Es werden 10 mmol HCl Cys(Allocam)-OH in 50 ml Wasser und 5 ml Dioxan gelöst. Durch Zusatz von NaOH (2N) wird der pH- Wert auf 11,5 eingestellt. Es werden tropfenweise 0,9 mmol Fmoc-F (30 Vol.-% in DME) zugegeben, wobei der pH-Wert durch Zusatz von NaOH (2N) auf 11,5 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird nach dieser Zugabe 1 h weitergerührt. Das Gemisch wird zweimal mit Ethylether extrahiert und anschliessend mit konzentrierter HCl auf pH 3 angesäuert. Das Produkt wird dreimal mit AcOEt extrahiert, mit H&sub2;O gewaschen und anschließend über MgSO&sub4; getrocknet. Man erhält das erwartete Produkt in einer Ausbeute von 75 %.
- Die Herstellung wird in Festphase mit den folgenden Zyklen durchgeführt:
- 1. Zyklus: 0,5 g (0,71 mäquivalente pro Gramm) Boc-Leu-PAM-P werden in ein gerührtes Reaktionsgefäß gegeben (PAM = Phenylacetamidomethyl, P = Polystyrol - 1 % Divinylbenzol).
- Es wird zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und jedesmal filtriert. Man behandelt mit 50 Vol.-% Trichloressigsäure (TFA) in CH&sub2;Cl&sub2; (1 min und anschließend 30 min) und filtriert. Es wird mit Isopropanol gewaschen und anschließend filtriert. Es wird zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und filtriert. Man setzt 2 Äquivalente (314 mg) BOP (Benzotriazolyl-N-oxytrisdimethylaminophosphoniumhexafluorphosphat), 2 Äquivalente (124 mg) Boc-Gly, 7,2 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 0,4 ml (6,6 Äquivalente) Diethylisopropylamin (DIEA) zu. Der pH-Wert wird erforderlichenfalls mit einer kleinen zusätzlichen Menge DIEA auf 9 eingestellt.
- Der Kaiser-Test ist nach 30minütiger Kupplung negativ.
- Es wird filtriert und zweimal mit CH&sub3;OH und zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, wobei jedesmal filtriert wird. Das Harz ist für den zweiten Zyklus fertig. Die gleichen Vorgehensweisen werden für jeden Zyklus wiederholt, mit der einzigen Ausnahme, daß die Art der Aminosäure geändert wird.
- 2. Zyklus: 2 Äquivalente (194 mg) Boc-Asp(OAll)-OH
- 3. Zyklus: 2 Äquivalente (228 mg) Boc-Tyr(All)-OH
- 4. Zyklus: 2 Äquivalente (334 mg) Boc-Ser(Alloc)-OH DCHA
- 5. Zyklus: 2 Äquivalente (332 mg) Boc-Arg(Alloc)&sub2;-OH
- Anschließend wird mit 50 % TFA in CH&sub2;Cl&sub2; 1 min und anschließend 30 min behandelt. Man wäscht mit Isopropanol (einmal), CH&sub2;Cl&sub2; (zweimal), 10 Vol.-% Essigsäure (AcOH) in CH&sub2;Cl&sub2; und CH&sub2;Cl&sub2; (zweimal), wobei jedesmal filtriert wird. Anschließend wird mit 49 mg PdCl&sub2;(PPh&sub3;)&sub2; und dann mit 2,5 Äquivalenten AcOH und 7 ml CH&sub2;Cl&sub2; behandelt, worauf bezogen auf die Allylgruppen 2 Äquivalente Bu&sub3;SnH zugegeben werden. Das Gemisch wird 10 min geschüttelt. Man wäscht mit CH&sub2;Cl&sub2; und filtriert (zweimal). Es werden 25 mg PdCl&sub2;(PPh&sub3;)&sub2;, 1,5 Äquivalente AcOH und 7,5 ml CH&sub2;Cl&sub2; und anschließend 1 Äquivalent Bu&sub3;SnH zugegeben, und man schüttelt das Gemisch 10 min. Anschließend wird mit CH&sub2;Cl&sub2; (fünfmal), CH&sub3;OH (fünfmal) und CH&sub2;Cl&sub2; (fünfmal) gewaschen, wobei jedesmal filtriert wird, und das Harz wird im Vakuum 2 h getrocknet. Man erhält so 0,65 g Peptid-PAM-P. Das Peptid wird vom Harz mit 10 % Fluorwasserstoffsäure in Anisol getrennt. Nach der Verdampfung der HF wird das Peptid vom Harz mit einer wäßrigen 10%igen Essigsäurelösung extrahiert. Die Lösung, die das Peptid enthält wird, lyophilisiert. Das Peptid wird mit einer Ausbeute von 52 % und einer mit Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmten Reinheit über 80 % hergestellt.
- Die Herstellung wird in Festphase durchgeführt. Das Harz Boc-Gly-P' (P' = "Merrifield"-Harz, mit 1 % Divinylbenzol vernetztes Chlormethylpolystyrol) wird mit einer TFA-Lösung (50 Vol.%) in CH&sub2;Cl&sub2; 30 min behandelt. Nach dem Waschen mit Isopropanol (iPrOH), CH&sub2;Cl&sub2; und anschließend Dimethylformamid (DMF) werden 2 Äquivalente Boc-Arg(Alloc)&sub2;-OH und 2 Äquivalente des Kupplungsmittels O-Benzotriazolyl-N-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU) zugegeben. Dann wird Dusopropylethylamin (iPr&sub2;NEt) bis pH 9 zugegeben. Das Gemisch wird 30 min gerührt. Der Kaiser-Test verläuft negativ. Das Harz wird zweimal mit CH&sub3;OH und anschließend CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die Boc-Gruppe des Boc-Arg(Alloc)&sub2;-Gly-P' wird durch Behandlung mit einer TFA-Lösung (50 Vol.-%) in CH&sub2;Cl&sub2; entfernt. Anschließend wird auf die gleiche Weise Fmoc-Ala- OH an das Harz gekuppelt. Das erhaltene Harz wird mit PdCl&sub2;(PPh)&sub2; (4 Mol-% pro Allylgruppe) und mit AcOH (2,5 Äquivalente) in CH&sub2;Cl&sub2; vermischt. Dann wird Bu&sub3;SnH (2 Äquivalente) auf einmal zugesetzt. Das Gemisch wird 10 min gerührt. Man filtriert das Harz, wäscht zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2;, CH&sub3;OH und anschließend CH&sub2;Cl&sub2;. Die Vorgehensweise wird zweimal wiederholt. Das Harz wird dann mit einer durch HBr gesättigten TFA-Lösung 2 h bei Raumtemperatur behandelt. Nach Filtrierung und Verdampfung des Lösungsmittels erhält man das Tripeptid mit einer Ausbeute von 78 %.
- Die Herstellung wird in Festphase durchgeführt. Das Harz Boc-Gly-P' wird mit einer TFA-Lösung (50 Vol.-%) in CH&sub2;Cl&sub2; 30 min behandelt. Nachdem einmal mit iPrOH, zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; und anschließend mit DFM gewaschen wurde, werden 2 Äquivalente Fmoc-Lys(Alloc)-OH in DMF und 2 Äquivalente TBTU in DMF zugegeben, der pH-Wert des Reaktionsmediums wird durch Zusatz von iPr&sub2;NET (etwa 6 Äquivalente) auf 9 eingestellt. Die Kupplungsreaktion wird mit der Kaiser-Test verfolgt. Sie ist nach 30 min beendet. Das Harz wird zweimal mit CH&sub3;OH und anschließend zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die Fmoc-Gruppe von Fmoc-Lys(Alloc)-Gly-P' wird mit einem Gemisch von Piperidin (30 Vol.-%) und DMF während 10 min entfernt. Anschließend wird auf die gleiche Weise Z-Ala-OH an das Harz gekuppelt.
- Das Harz wird in einem Gemisch von CH&sub2;Cl&sub2;, PdCl&sub2;(PPh&sub3;)&sub2; (4 Mol-% pro Allylgruppe) suspendiert und es wird ACOH (2,5 Äquivalente) zugegeben. Anschließend wird auf einmal Bu&sub3;SNH (2 Äquivalente) zugegeben. Das Gemisch wird 10 min gerührt. Das Harz wird zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2;, zweimal mit CH&sub3;OH und anschließend zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Der Arbeitsgang der Entfernung der Schutzgruppe wird einmal wiederholt. Das Harz Z-Ala-Lys-Gly-P' wird mit durch NH&sub3; gesättiges CH&sub3;OH 3 Tage behandelt, und nach Filtration und Verdampfung des Lösungsmittels wird das Tripeptid mit einer Ausbeute von 65 % erhalten.
Claims (17)
1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden in Lösung oder
durch Festphasensynthese, gekennzeichnet durch folgende
Schritte:
- Bildung einer Peptidbindung durch Kondensation eines
ersten Derivats einer Aminosäure oder eines zu
verlängernden Peptids, bei denen die α-Aminogruppe mit
einer Gruppe geschützt ist, die unter
tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc),
Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz), α,α-Dimethyl-3,5-
dimethoxybenzyloxycarbonyl (Ddz) und
2-Nitrophenylsulfenyl (Nps) ausgewählt ist, und worin die
vorliegende(n) und zu schützende(n) funktionelle(n)
Gruppe(n) in der oder den Seitenketten der Aminosäure
oder des Peptids mit einer Gruppe Y der Formel
R¹-CH=CH-CH&sub2;- blockiert ist (sind), wobei R¹ ein
Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe bedeutet, in
Form von Carbonaten, wenn es sich um alkoholische
funktionelle OH-Gruppen handelt, von Thiocarbonaten
oder Thiomethylencarbamaten, wenn es sich um
funktionelle Gruppen -SH handelt, von Ethern oder
Carbonaten, wenn es sich um phenolische funktionelle OH-
Gruppen handelt, von Carbamaten, wenn es sich um
funktionelle Amino- oder Iminogruppen handelt, und
von Estern, wenn es sich um funktionelle Gruppen
-COOH handelt, mit einem zweiten Derivat einer
Aminosäure oder eines zu verlängernden Peptids, bei
denen die Säuregruppe -COOH in α-Stellung in Form einer
Estergruppe -COOR², wobei R² eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe,
eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die
gegebenenfalls am aromatischen Ring substituiert sind, oder
Phenacyl bedeutet, oder in Form einer Amidgruppe
-CONR³R&sup4; geschützt ist, wobei R³ und R&sup4;, die identisch
oder voneinander verschieden sind, ein
Wasserstoffatom, eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe oder eine Arylgruppe oder
eine Aralkylgruppe bedeutet, die gegebenenfalls am
aromatischen Ring substituiert sind, wobei die
Gruppen R², R³ und/oder R&sup4; gegebenenfalls an ein Polymer
vom Polystyroltyp oder Polyacryltyp gebunden sind,
und bei denen die vorliegende(n) und zu schützende(n)
funktionelle(n) Gruppe(n) an der oder den
Seitenketten der Aminosäure oder des Peptids mit einer Gruppe
Y der Formel R¹-CH=CH-CH&sub2;- blockiert ist (sind),
wobei R¹ ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe
bedeutet, in Form von Carbonaten für funktionelle
alkoholische OH-Gruppen, von Thiocarbonaten oder
Thiomethylencarbamaten für funktionelle Gruppen -SH, von
Ethern oder Carbonaten für phenolische funktionelle
OH-Gruppen, von Carbamaten für funktionelle
Aminooder Iminogruppen und von Estern für funktionelle
Gruppen -COOH,
- gegebenenfalls Bildung einer letzten Peptidbindung
durch Kondensation des zuvor erhaltenen Peptids mit
einem Derivat einer Aminosäure oder eines Peptids,
bei denen die α-Aminogruppe erforderlichenfalls mit
einer üblichen Schutzgruppe geschützt ist und die
vorliegende(n) und zu schützende(n) funktionelle(n)
Gruppe(n) in der oder den Seitenketten der Aminosäure
oder des Peptids mit der obengenannten Gruppe Y
blokkiert ist (sind),
- erforderlichenfalls Eliminierung der gegebenenfalls
vorliegenden Schutzgruppe der α-Aminogruppe und/oder
der Schutzgruppen Y der funktionellen Gruppen in den
Seitenketten und/oder der Schutzgruppe der
α-Säuregruppe, wobei die Schutzgruppen der α-Aminogruppe,
die nicht vom Typ Y sind, und der α-Säuregruppe durch
bekannte Verfahren abgespalten werden und wobei alle
Schutzgruppen Y durch eine milde Katalyse mit einer
Verbindung eines Edelmetalls, wie eines Metalls aus
der Gruppe von Platin, Ruthenium, Rhodium, Osmium,
Iridium, Platin oder Palladium, gleichzeitig
abgespalten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Gruppe Y, die die funktionellen Gruppen der
Seitenketten schützt, eine Gruppe der Formel CH&sub2;=CH-CH&sub2;- ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die α-Aminogruppe des ersten Derivats der
Aminosäure oder des zu verlängernden Peptids durch die
Gruppe Boc oder Fmoc geschützt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die α-Säuregruppe des zweiten Derivats der
Aminosäure oder des zu verlängernden Peptids in Form
eines Esters mit einer C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylgruppe oder einer
Benzylgruppe geschützt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
zunächst die Schutzgruppe der α-Aminogruppe, falls sie
nicht vom Allyltyp ist, abgespalten wird, anschließend
gleichzeitig alle Schutzgruppen der funktionellen
Gruppen der Seitenketten vom Allyltyp abgespalten werden
und dann, die Schutzgruppe der α-Säuregruppe
abgespalten wird, falls sie nicht bereits im Laufe der
vorhergehenden Behandlungen entfernt wurde.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Schutzgruppen der α-Aminogruppen des
Peptids mit einer starken Säure abgespalten werden, wenn
die Aminogruppen mit Boc-Gruppen geschützt sind, oder
mit einem sekundären Amin in einem Lösungsmittel, wenn
die Aminogruppen mit der Gruppe Fmoc geschützt sind.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Gruppen Y der funktionellen Gruppen der
Seitenketten des Peptids mit einer katalytischen Menge
einer Rhodium(I)-Verbindung oder einer
Palladium(0)- oder Palladium(II)-Verbindung in einem Lösungsmittel in
Gegenwart von nucleophilen Akzeptoren oder
Protonendonatoren abgespalten wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Gruppen Y entfernt werden, indem das Peptid mit
Tributylzinnhydrid in Gegenwart einer katalytischen
Menge Palladium(0)-Tetrakis (triphenylphosphin) oder
Palladium(II)-Dichlorbis(triphenylphosphin) und einer
schwach sauren Verbindung, wie Essigsäure oder
p-Nitrophenol, oder von Pyridiniumacetat oder Wasser in einem
Lösungsmittelmedium umgesetzt wird, oder indem das
Peptid mit einer katalytischen Menge
Palladium(0)-Tetrakis(triphenylphosphin) in Gegenwart von
N,N-Dimethylsilylamin und Trimethylsilylacetat in einem aprotischen
Lösungsmittelmedium mit niedrigem Siedepunkt umgesetzt
und anschließend die erhaltene Verbindung mit Methanol
behandelt wird.
9. Derivate von Aminosäuren, die zur Herstellung von
Peptiden geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie
die allgemeine Formel
aufweisen, worin bedeuten:
X tert.-Butyloxycarbonyl (Boc),
9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz), α,α-
Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl (Ddz) oder 2-
Nitrophenylsulfenyl (Nps),
T -OH, -OR², wobei R eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe, eine
Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die gegebenenfalls am
aromatischen Ring substituiert sind, oder Phenacyl
bedeutet, oder -NR³R&sup4;, wobei R³ und R&sup4;, die identisch oder
voneinander verschieden sind, ein Wasserstoffatom, eine
C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe oder eine Arylgruppe oder eine
Aralkylgruppe bedeuten, die gegebenenfalls am aromatischen
Ring substituiert sind,
R' Wasserstoff und
R den Rest der Seitenkette einer Aminosäure, die
mindestens eine der funktionellen Gruppen -OH, -SH, > NH,
-NH, -NH&sub2; und -COOH enthält, oder
R' und R miteinander verbunden den Rest einer
cyclischen Aminosäure, die mindestens eine der vorgenannten
funktionellen Gruppen aufweist,
Y¹ die Gruppe Y-O- -, wobei Y die Formel R¹-CH=
CH-CH&sub2;- aufweist, wobei R¹ ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-
Alkylgruppe bedeutet, wenn Y¹ das Wasserstoffatom der
funktionellen Gruppe(n) -OH, -SH, > NH, =NH, oder -NH&sub2;
ersetzt, die in dem Rest R oder in dem Rest, der durch
die Verbindung von R mit R' gebildet wird, enthalten
ist (sind), außer, wenn X die Gruppe
tert.-Butyloxycarbonyl, T die Gruppe -OH und R den Rest der Seitenkette
von Lysin bedeuten, oder
Y¹ die Gruppe Y-O- -NH-CH&sub2;-, wobei Y die oben
angegebene Bedeutung aufweist, wenn Y¹ das
Wasserstoffatom der funktionelle(n) Gruppe(n) -SH ersetzt, die im
Rest R oder dem Rest, der durch die Verbindung von R
mit R' gebildet wird, enthalten ist (sind), oder
Y¹ die Gruppe Y der Formel R -CH=CH-CH&sub2;-, wobei R¹ die
oben angegebenen Bedeutungen aufweist, wenn Y¹ das
Wasserstoffatom der funktionellen Gruppe(n) -COOH und/oder
phenolisches -OH ersetzt, die im Rest R oder dem Rest,
der durch die Verbindung von R mit R' gebildet wird,
enthalten ist (sind), außer, wenn X die Gruppe tert.-
Butyloxycarbonyl, T die Gruppe -OH und R den Rest der
Seitenkette von Asparaginsäure, Glutaminsäure oder
Tyrosin oder T die Gruppe -OR², wobei R eine Alkylgruppe
ist und R den Rest der Seitenkette von Tyrosin bedeuten
oder R² eine Alkylgruppe oder Aralkylgruppe ist und R
den Rest der Seitenkette von Glutaminsäure bedeutet,
und
n = 1, wenn R nur eine einzige funktionelle Gruppe
enthält oder n = 1 oder 2, wenn R zwei funktionelle
Gruppen enthält.
10. Derivate nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch
gekennzeichnet, daß Y die Gruppe CH&sub2;=CH-CH&sub2;- bedeutet.
11. Derivate nach Anspruch 9 oder 10, dadurch
gekennzeichnet, daß T die Gruppe -OH oder eine Gruppe -OR
bedeutet, wobei R eine C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylgruppe oder eine
Benzylgruppe ist, und X die Gruppe Boc oder Fmoc bedeutet.
12. Verfahren zur Herstellung der Aminosäurederivate der
Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß, wenn Y¹ die
Gruppe Y-O- - bedeutet, worin Y die Formel
R¹-CH=CH-CH&sub2;- aufweist, in der R¹ Wasserstoff oder eine
C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe ist, ein Chlorformiat der Formel
Y-O- -Cl
mit einer Verbindung der Formel
wobei Y, X,
T, R und R' die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen,
in wasserfreiem Medium oder in einem neutralen oder
basischen wäßrigen Medium je nach der Art der in dem Rest
R oder in dem Rest, der durch R und R' gebildet wird,
vorliegenden funktionellen Gruppe(n) bei einer
Temperatur von 0 bis 50 ºC umgesetzt wird.
13. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch
gekennzeichnet, daß, wenn die funktionelle zu schützende
Seitengruppe eine Amino- oder Iminogruppe ist, die
Reaktion in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 7
bis 12 durchgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß, wenn R der Serinrest ist, die Reaktion in
neutralem wäßrigem Medium durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß, wenn R den Threoninrest bedeutet, das Chlorformiat
Y-O- -Cl
in wasserfreiem Medium mit der Verbindung der
Formel
worin X die oben angegebenen
Bedeutungen aufweist und T die Gruppe -OR² oder -NR³R&sup4;
ist, wobei R², R³ und R&sup4; die oben angegebenen
Bedeutungen haben, in Gegenwart von Dimethylaminopyridin
umgesetzt wird.
16. Verfahren zur Herstellung der Aminosäurederivate der
Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß, wenn Y¹ die
Gruppe Y der Formel R¹-CH=CH-CH&sub2;- ist, wobei R¹
Wasserstoff oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe bedeutet, eine
Verbindung der Formel Y-Br, wobei Y die obengenannte
Bedeutung hat, in basischem Medium mit einem Kupferkomplex
der Aminosäure, gegebenenfalls in einem mit Wasser
mischbaren Lösungsmittel, bei einer Temperatur im
Bereich von 0 bis 50 ºC umgesetzt wird, worauf die
Schutzgruppe X nach Entfernen des Kupfers zugegeben
wird und gegebenenfalls die Gruppen -COOH in α-Stellung
in einen Ester -COOR oder ein Amid -CONR³R&sup4; umgewandelt
werden, wobei R², R³ und R&sup4; die obengenannten
Bedeutungen aufweisen.
17. Verfahren zur Herstellung der Aminosäurederivate der
Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß, wenn Y¹ die
Gruppe Y-O- -NH-CH&sub2;- bedeutet, wobei Y die obengenannte
Bedeutung hat, das Hydroxymethylcarbamat der Gruppe vom
Allyltyp mit einer Aminosäure oder ihrem Hydrochlorid
in saurem Medium bei einer Temperatur von 0 bis 50 ºC
gegebenenfalls in einem aprotischen Lösungsmittel,
umgesetzt wird, worauf die Schutzgruppe X eingeführt wird
und gegebenenfalls die Gruppen -COOH in α-Stellung wie
vorher umgewandelt werden.
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