[go: up one dir, main page]

DE69420307T2 - Automatisierte Allyl-Deprotektion bei der Festphasesynthese - Google Patents

Automatisierte Allyl-Deprotektion bei der Festphasesynthese

Info

Publication number
DE69420307T2
DE69420307T2 DE69420307T DE69420307T DE69420307T2 DE 69420307 T2 DE69420307 T2 DE 69420307T2 DE 69420307 T DE69420307 T DE 69420307T DE 69420307 T DE69420307 T DE 69420307T DE 69420307 T2 DE69420307 T2 DE 69420307T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
allyl
amino acid
acid
protected
derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69420307T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69420307D1 (de
Inventor
Fernando Albericio
Steven A. Kates
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Biosystems LLC
Original Assignee
PerSeptive Biosystems Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PerSeptive Biosystems Inc filed Critical PerSeptive Biosystems Inc
Publication of DE69420307D1 publication Critical patent/DE69420307D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69420307T2 publication Critical patent/DE69420307T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C07K1/122—Hydrolysis with acids different from HF
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J23/00—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00
    • B01J23/38—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00 of noble metals
    • B01J23/40—Catalysts comprising metals or metal oxides or hydroxides, not provided for in group B01J21/00 of noble metals of the platinum group metals
    • B01J23/44—Palladium
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/02—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides
    • B01J31/0234—Nitrogen-, phosphorus-, arsenic- or antimony-containing compounds
    • B01J31/0235—Nitrogen containing compounds
    • B01J31/0237—Amines
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
    • B01J31/24—Phosphines, i.e. phosphorus bonded to only carbon atoms, or to both carbon and hydrogen atoms, including e.g. sp2-hybridised phosphorus compounds such as phosphabenzene, phosphole or anionic phospholide ligands
    • B01J31/2404—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, the phosphine-P atom being a ring member or a substituent on the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00281—Individual reactor vessels
    • B01J2219/00286—Reactor vessels with top and bottom openings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/005—Beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00686—Automatic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2231/00—Catalytic reactions performed with catalysts classified in B01J31/00
    • B01J2231/60—Reduction reactions, e.g. hydrogenation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
    • B01J2531/80—Complexes comprising metals of Group VIII as the central metal
    • B01J2531/82—Metals of the platinum group
    • B01J2531/824—Palladium
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/02—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides
    • B01J31/04—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides containing carboxylic acids or their salts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

    Hintergrund
  • Im letzten Vierteljahrhundert wurden Techniken zur organischen Synthese diverser Moleküle biologischer Relevanz entwickelt und verfeinert. Insbesondere wurden zur Peptidsynthese raffinierte Verfahren entwickelt. Diese Verfahren ermöglichten die chemische Synthese natürlich vorkommender Peptide, die für Forschungs- oder therapeutische Zwecke von Interesse sind. Darüber hinaus wurden zahlreiche Peptidstrukturen synthetisiert, für die es kein bekanntes, natürlich vorkommendes Gegenstück gibt. Es ist nunmehr möglich, auf synthetische Weise verzweigte oder cyclische Peptide oder Peptide, in welchen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) glykolysiert, sulfatiert, phosphoryliert oder in sonstiger Weise derivatisiert sind, herzustellen. Eine Zusammenfassung des Peptidsynthesegebiets findet sich bei Barany et al. (1987), 30 "INT. J. PEPT. PROT. RES.", 705-739 und Fields et al. (1992), in "SYNTHETIC PEPTIDES: A USER'S GUIDE", 77-183 (Herausgeber Grant).
  • Seit vielen Jahren wurden Peptidstrukturen in einem mühseligen Verfahren, das signifikant hohe Kenntnisse erforderte und fehleranfällig war, manuell synthetisiert. In jüngster Zeit wurden Instrumente zu einer automatisierten Peptidsynthese entwickelt. Dies bedeutete einen Fortschritt, der in signifikanter Weise den Bereich und die Varietät herstellbarer Peptidstrukturen erweiterte. Eine Automatisierung ermöglicht die Herstellung von Peptiden in größerem Maßstab als zuvor versucht werden konnte. Die Ausstattung mit automatisierten Geräten für eine Peptidsynthese und die einschlägige Software haben in hohem Maße für akademische und in der Industrie tätige Forscher auf Gebieten jenseits der organischen Synthese und Proteinchemie die Peptidsynthese verfügbar gemacht. Synthetisierte Peptidstrukturen dienen nunmehr als Werkzeuge auf so unterschiedlichen Gebieten, wie die Ernährung, die Mikrobiologie, die Immunologie, die Physiologie und die Medizin.
  • Mit der zunehmenden Kompliziertheit und Vielfältigkeit von beschriebenen Peptidsynthesetechniken wurde man sich jedoch zunehmend der vielen Beschränkungen und unerwünschten Nebenreaktionen, die hervorgerufen werden können, bewußt. Viele davon sind für ein spezielles Synthesereagens oder einen speziellen Typ von Aminosäurederivaten spezifisch und beschränken effektiv den Bereich von Bedingungen und Kombinationen, in welchen solche Reagenzien verwendet werden können. In Barany et al. (1987) a.a.O. auf Seiten 727-730 wird auch über zahlreiche reagenz- und aminosäurespezifische unerwünschte Nebenreaktionen berichtet.
  • Zahlreiche zusätzliche und unerwartete Beschränkungen und unerwünschte Nebenreaktionen traten auch auf, wenn versucht wurde, manuelle Peptidsynthesetechniken zur Benutzung auf Instrumenten für eine automatisierte Peptidsynthese anzupassen. Versuche zur Anpassung vorhandener Peptidsynthesemethoden zur Benutzung in einer automatisierten Vorrichtung und zur Entwicklung neuer und in einmaliger Weise für automatisierte Geräte geeigneter Methoden sind derzeit im Gange. Zahlreiche erwünschte Peptidsynthesetechniken haben sich insoweit bislang als bei automatisierten Geräten undurchführbar erwiesen.
  • So haben sich beispielsweise Synthesereaktionen unter Benutzung allylgeschützter Aminosäurederivate als an ein automatisiertes Vorgehen kaum anpassbar erwiesen. Die Entfernung der Allylgruppe hat sich wegen der Natur und der phy sikalischen Eigenschaften des zur Allylentschützung benutzten Katalysators während einer automatisierten Synthese als besonders schwierig erwiesen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung einer Allylschutzgruppe aus einem allylgeschützten Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure. Das Verfahren umfaßt die folgenden Stufen: Bereitstellen eines löslichen Organometallkatalysators unter inerter Atmosphäre in einem eine organische Säure und einen Akzeptor umfassenden Lösungsmittel, Kontaktieren des Katalysators mit dem allylgeschützten Aminosäurederivat und Inkubieren des allylgeschützten Aminosäurederivats mit dem Katalysator während einer zur katalytischen Entfernung der Allylschutzgruppe aus dem Aminosäurederivat ausreichenden Zeitspanne dergestalt, daß ein allylentschütztes Aminosäurederivat erhalten wird. Danach wird das allylentschützte Aminosäurederivat vom Katalysator abgetrennt. In höchst vorteilhafter Weise eignet sich das erfindungsgemäße Allylentschützungsverfahren zur Verwendung bei einem Gerät zur automatisierten Peptidsynthese. Der Erfolg beruht in hohem Maße auf dem hierin berichteten Auffinden von Bedingungen, unter welchen der Organometallkatalysator löslich ist. Bei automatisierten Festphasenpeptidsynthesereaktionen ist es besonders wichtig, homogene Flüssigphasebedingungen zu erreichen, um ein Schmutzigwerden des Festphaseträger oder den Aufbau eines Staudrucks im Reaktionsgefäß oder in der Säule eines automatisierten Geräts zu vermeiden.
  • Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei dem löslichen Organometallkatalysator um einen Organopalladiumkatalysator. Vorzugsweise wird ein Organopalladium(0)- Katalysator verwendet. Besonders bevorzugt wird Tetraki striphenylphosphinpalladium(0). Der vorliegende organische Metallkatalysator wird in einem eine organische Säure und einen Akzeptor enthaltenden Lösungsmittel bereitgestellt. Geeignete organische Säuren sind Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und dgl. Essigsäure hat sich als für den Erfindungszweck geeignete organische Säure erwiesen. Geeignete Akzeptoren sind Morpholin, N-Methylmorpholin, Dimedon, N-Methylanilin und N, N'-Dimethylbarbitursäure. Als besonders geeigneter Akzeptor hat sich N-Methylmorpholin erwiesen. Die vorliegende organische Säure und der vorliegende Akzeptor können in vorteilhafter Weise in einem Chloroform- , Methylenchlorid- oder Benzollösungsmittel untergebracht werden. Der vorliegende Katalysator wird unter einer inerten Atmosphäre bereitgestellt und mit dem allylgeschützten Aminosäurederivat kontaktiert. Die Inkubation zur Allylentschützung erfolgt ebenfalls unter einer inerten Atmosphäre. Akzeptable Allylentschützungsergebnisse wurden erreicht, wenn ein löslicher Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0)- Katalysator unter einer inerten Atmosphäre in einem zusätzlich etwa 5% Essigsäure und etwa 2,5% N-Methylmorpholin enthaltenden Chloroformlösungsmittel bereitgestellt wird.
  • Die hierin beschriebene automatisierbare Allylentschützungsmethode kann zur Entschützung eines allylgeschützten Derivats einer an einem festen Träger befestigten, biologisch relevanten Aminosäure benutzt werden. Die Methode- eignet sich zur Verwendung bei Polyethylenglykol/Polystyrol-Propfcopolymerträgern oder Polystyrolträgern. Das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure kann an dem festen Träger über einen heterobifunktionellen Stiel oder Linker, wie 5-(4-(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5- dimethoxyphenoxy)valeriansäure, 5-[(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl)-aminoxanthen-2- oxy]valeriansäure oder p-Alkoxybenzylalkohol, befestigt sein. Weiterhin kann das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure in einem synthetisierten Peptid, das aus miteinander durch Peptidbindungen verknüpften, biologisch relevanten Aminosäureresten gebildet ist, vorhanden sein. Die Allylentschützung eines derartigen synthetisierten Peptids kann entweder vor oder nach der Abspaltung des Peptids von einem Träger erfolgen. Wie hierin beschrieben wird, eignet sich die vorliegende automatisierbare Allylentschützungsmethode in höchst vorteilhafter Weise zur automatisierten Herstellung cyclischer Peptide einschließlich von cyclischen Kopf-Schwanz-Peptiden, verzweigten Peptiden und multiplen antigenen Peptiden. Eine Allylentschützung kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden, und zwar unabhängig davon, ob sich die Allylschutzgruppe an einer funktionellen Gruppe an einem Alpha-Kohlenstoff oder einer funktionellen Gruppe in der Seitenkette des allylgeschützten Aminosäurederivats befindet.
  • Gemäß einem zweiten allgemeinen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen Organopalladiumkatalysators. Das vorliegende Verfahren umfaßt folgende Stufen: Bereitstellen einer festen Organopalladiumverbindung, wie Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0), Bereitstellen eines eine organische Säure und einen Akzeptor umfassenden Lösungsmittels, in welchem durch Kontaktieren des Lösungsmittels mit einer Inertgasquelle inerte Bedingungen hergestellt wurden, und Vereinigen der festen Organopalladiumverbindung mit dem Lösungsmittel und einer Inertgasatmosphäre dergestalt, daß ein Gemisch entsteht. Dieses Gemisch wird unter einer Inertgasatmosphäre während einer zum Auflösen der festen Organopalladiumverbindung in dem Lösungsmittel ausreichenden Zeit inkubiert und gehalten. Dabei entsteht ein löslicher Organopalladiumkatalysator. Der erhaltene lösliche Katalysator eignet sich besonders gut zur Verwendung bei automatisierten Peptidsynthesemaßnahmen, bei welchen ein allylgeschütztes Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure verwendet wird, einschließlich der Synthese cyclischer Peptide, verzweigter Peptide und multipler antigener Peptide. Das vorliegende Katalysatorherstellungsverfahren kann bei einem Gerät zur automatisierten Peptidsynthese durchgeführt werden.
  • Gemäß einer dritten allgemeinen Ausführungsform betrifft die hierin beschriebene Erfindung eine lösliche Organometallkatalysatorzusammensetzung. Vorzugsweise enthält die Zusammensetzung eine Organopalladiumverbindung, z. B. Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0), welche unter einer inerten Atmosphäre in einem Lösungsmittel mit einer darin befindlichen organischen Säure und einem darin befindlichen Akzeptor gelöst ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Lösungsmittel um ein Chloroformlösungsmittel mit darin enthaltener Essigsäure und darin enthaltenem N- Methylmorpholin. Wie bereits ausgeführt, stellt der vorliegende lösliche Katalysator einen signifikanten Fortschritt auf dem einschlägigen Gebiet dar, indem er nämlich die Automatisierung zahlreicher erwünschter Peptidsynthesemaßnahmen einschließlich der Synthese cyclischer Peptide, verzweigter Peptide und multipler antigener Peptide, ermöglicht. In der Tat ist ein Allylschutz in hohem Maße selbst bei der Synthese linearer Peptide erwünscht, indem nämlich die Allylgruppe bei Benutzung in Verbindung mit sonstigen weit verbreiteten Aminosäureschutzgruppen, wie tert.- Butyloxycarbonylgruppen und 9- Fluorenylmethyloxycarbonylgruppen, einen zusätzlichen Grad an Orthogonalität liefert. Mit der vorliegenden Erfindung kann die Allylschutzchemie nunmehr als Alternativstrategie zur tert.-Butyloxycarbonyl- und 9- Fluorenylmethyloxycarbonylchemie für den zeitweiligen Schutz von Alpha-Aminogruppen während der linearen Verlän gerung synthetischer Peptide angesehen werden.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist ein Fließbild eines automatisierten Peptidsynthesegeräts, das für die automatisierte Allylentschützung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgestaltet ist.
  • Fig. 2 enthält Hochdruckflüssigchromatograhie(HPLC)- Chromatogrammaufzeichnungen zum Vergleich einer manuellen Allylentschützung von Modellpeptiden auf einem Polyethylenglykol/Polystyrol(PEG/PS)-Propf-Copolymer-Träger mit der manuellen Allylentschützung auf einem Polystyrol(PS)- Träger.
  • Fig. 3 veranschaulicht schematisch die retrosynthetische Analyse von Tachykininantagonistenpeptid.
  • Fig. 4 enthält die HPLC-Chromatogrammaufzeichnung eines rohen cyclischen Peptidmodells (Nebenbild) direkt nach der Abspaltung von einem PEG-PS-Träger.
  • Fig. 5 veranschaulicht schematisch eine allgemeine Strategie zur Herstellung eines verzweigten Peptids.
  • Fig. 6 enthält die HPLC-Chromatogrammaufzeichnung eines rohen verzweigten Peptids (Nebenbild) direkt nach der Abspaltung vom Träger.
  • Fig. 7 stellt schematisch ein PEG-PS-Harz mit einem daran gebundenen multiplen antigenen Peptid(MAP)-Kern mit der Eignung zur Herstellung eines Doppelepitop-MAP dar.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Die vorliegende Erfindung basiert auf dem zuvor erwähnten Auffinden von Bedingungen, unter denen ein Organometallkatalysator, z. B. ein Organopalladiumkatalysator, zur Allylentschützung löslich ist. In automatisierten Systemen zur Festphasenpeptidsynthese ist es wichtig, daß in Bezug auf sämtliche Komponenten mit Ausnahme des festes Trägers homogene (d. h. Flüssigphase-) Reaktionsbedingungen erreicht werden. Somit ermöglicht die vorliegende Beschreibung von Methoden oder Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung eines löslichen Organopalladiumkatalysators sowie der löslichen Katalysatorzusammensetzung eine signifikante Verbreiterung der zur Automatisierung geeigneten Synthesechemie. Manuelle Syntheseverfahren werden selbstverständlich auch in hohem Maße durch die Verfügbarkeit des vorliegenden löslichen Katalysators zur Allylentschützung vereinfacht.
  • Die Allylschutzchemie ist als zweckmäßiges Werkzeug zur Verwendung bei der Synthese zahlreicher komplexer oder labiler Peptide anerkannt, sie wurde allerdings lange Zeit nicht genügend genutzt, und zwar in Folge des erforderlichen hohen Grades an technischen Kenntnissen sowie aufgrund der Schwierigkeit, unlösliche Substanzen in Peptidsynthesereaktionen einzuführen und anschließend feste Nebenprodukte von dem gewünschten Produkt abzutrennen. Der Allylschutz bei der Festphasenpeptidsynthese und hierfür benutzte Reagenzien werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/715297 beschrieben.
  • Allylschutzgruppen besitzen die allgemeine-chemische Struktur
  • worin bedeuten:
  • X die Stelle der Befestigung der Schutzgruppe an einer biologisch relevanten Aminosäure oder einem Derivat hiervon und R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; unabhängig voneinander Wasserstoff, lineare oder verzweigtkettige C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppen, C&sub6;-C&sub1;&sub0;- Arylgruppen, lineare oder verzweigtkettige substituierte C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppen und substituierte C&sub6;-C&sub1;&sub0;-Arylgruppen.
  • Die geringe Größe der Allylkernstruktur macht einen Allylschutz bei Synthesen, bei welchen die sterische Hinderung von Bedeutung ist, zweckmäßig. Somit werden kleinere Substituenten, z. B. Wasserstoff, für R¹, R², R³, R&sup4; und R&sup5; bevorzugt. Allylgruppen sind für den Schutz von Aminosäureseitenketten zweckmäßig, sie können jedoch auch zum Schutz von Alpha-Carboxy- und Aminosubstituenten benutzt werden. Somit eignen sich Allylgruppen zum temporären Schutz funktioneller Alpha-Aminogruppen während der Synthese eines gewünschten Peptids.
  • Wie bereits ausgeführt, bezeichnet X die Stelle der Befestigung der Allylschutzgruppe an einer biologisch relevanten Aminosäure oder einem Derivat derselben. Die Aminosäuren biologischer Relevanz sind in biologischen Systemen natürlich vorkommende Aminosäuren, beispielsweise die in natürlichen Peptiden und Proteinen gefundenen 20 Aminosäuren. Dies bedeutet, daß als biologisch relevante Aminosäuren Alananin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin anzusehen sind. Der vorliegende Ausdruck umfaßt zusätzlich Aminosäuremetaboliten, beispielsweise Ornithin, bei der es sich um eine Komponente des Harnstoffcyclus handelt. Obwohl nicht so sehr in natürlichen Systemen genutzt, kann Ornithin in die Sequenz eines synthetisierten Peptids eingebaut und anschlie ßend in Arginin umgewandelt werden. Durch den vorliegenden Ausdruck werden sowohl die L- als auch die D- Konfigurationen der genannten Aminosäuren umfaßt. Allerdings wird im folgenden Text - sofern nicht speziell angegeben - die L-Konfiguration gewählt. Aminosäuren, die sich zwar in der Natur nicht finden, jedoch von biologischer Relevanz sind, d. h. biologische Aktivität entfalten, fallen auch unter den vorliegenden Ausdruck. Jede der genannten Aminosäuren wird nach den Regeln der IUPAC-Ius-Kommission biochemischer Nomenklatur (vgl. 247 "J. BIOL. CHEM.", 997- 983 (1972)) abgekürzt und bezeichnet.
  • Bestimmte biologisch relevante Aminosäuren tragen als funktionelle Gruppen bezeichnete Seitenkettensubstituenten, für die während der Peptidsynthese ein Allylschutz zweckmäßig sein kann. So können die sauren (Carboxyl) funktionellen Seitenkettengruppen der Asparaginsäure und Glutaminsäure sowie die funktionellen Seitenkettenhydroxylgruppen von Serin und Threonin neben der funktionellen Seitenkettenphenolgruppe von Tyrosin durch Allygruppen geschützt werden. Für diese Aminosäuren ist die unmittelbare Befestigungsstelle für die Allylgruppe an die Aminosäure (X) ein Sauerstoffatom. Allylschutzgruppen können in ähnlicher Weise an einem in der basischen (Amino) funktionellen Seitenkettengruppen von Lysin und Ornithin, den funktionellen Seitenkettenamidogruppen von Asparagin und Glutamin, den funktionellen Seitenkettenimidazolgruppen von Histidin und der funktionellen Seitenkettenguanidinogruppe von Arginin vorhandenen Stickstoff hängen. In gleicher Weise können Allylschutzgruppen an einem in der funktionellen Seitenkettensulfhydrylgruppe von Cystein oder der funktionellen Seitenkettenthioethergruppe von Methionin vorhandenen Schwefelatom befestigt sein. Darüber hinaus können die genannten funktionellen Seitenkettengruppen mit weiteren Substituenten des in biologischen Systemen gefundenen Typs oder mit Substituenten, die natürlicherweise zwar nicht vorkommen, jedoch in sonstiger Weise von Interesse sind, derivatisiert sein. Somit können die funktionellen Aminosäureseitenkettengruppen sulfatiert, glykosyliert, phosphoryliert, iodiert, alkyliert oder lipidiert sein.
  • Die vorliegenden allylgeschützten Derivate biologisch relevanter Aminosäuren sind zur Festphasenpeptidsynthese geeignete Derivate. Somit sind Aminosäurederivate, bei welchen eine oder mehrere funktionelle Gruppe(n) (beispielsweise der Aminosubstituent des Alpha-Kohlenstoffs - im folgenden als Nα -funktionelle Gruppe bezeichnet -) mit Ausnahme der durch einen Allylsubstituenten geschützten Gruppe durch eine glatt abspaltbare zeitweilige Schutzgruppe geschützt ist (sind), für Peptidsynthesereaktionen geeignet. Beispiele für solche zeitweilige Schutzgruppen sind tert.-Butyl-, tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, Adamantanyloxycarbonyl-, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-, 2-(3,5- Dimethoxyphenyl)-2-propyloxycarbonyl-, Dithiasuccinoyl-, Biphenylylisopropyloxycarbonyl-, 2,2,5,7,8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl- oder Phenylisopropyloxycarbonylgruppen.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der zeitweiligen Schutzgruppe um eine solche, die an dem Aminosäurederivat unter einem ersten Satz von hierin zur Entfernung der Allylgruppe beschriebenen Bedingungen stabil haften bleibt, jedoch bei Einwirkung eines zweiten Satzes von Bedingungen, unter denen die Allylgruppe stabil an dem Aminosäurederivat haften bleibt, glatt von dem Aminosäurederivat freigesetzt wird. Diese wechselseitige Ausschließlichkeit von Entschützungsbedingungen wird als Orthogonalität bezeichnet. Somit sind, wie später noch eingehender beschrieben werden wird, Allylschutzgruppen orthogonal zu tert.-Butyloxycarbonylgruppen und zu 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppen. Von diesen wer den 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppen bevorzugt.
  • Die vorliegenden Aminosäurederivate können an einem festen Träger, z. B. einem Träger für die Festphasenpeptidsynthese, befestigt werden. Geeignete Träger sind Harze, Membranen, poröses Glas, Quarz, Polydimethylacrylamide, Baumwolle, Papier, Polystyrole und Polyethylenglykol/Polystyrol- Propfcopolymere. Von diesen eignen sich auch die Polyethylen/Polystyrol-Propfcopolymere des aus der US- Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/576634 beschriebenen Typs.
  • Aminosäurederivate werden in typischer Weise durch kovalente Bindungen an dem Träger befestigt. Diese kovalente Bindung kann direkt oder indirekt sein. Somit kann ein Aminosäurederivat zur Festphasenpeptidsynthese über eine heterobifunktionelle verbindende Gruppe, die auch als Stiel bezeichnet wird, an den Träger gebunden sein. Der Stiel dient zur Verstärkung der sterischen Zugänglichkeit des an den Träger gebundenen Aminosäurederivats für Peptidsynthesereaktionen und ist nach Beendigung der Synthese glatt abspaltbar. Die Allylschutzgruppe kann - wenn zum Schutz eines Alpha-Carbonsäuresubstituenten während der Peptidsynthese verwendet - im Stiel eingeschlossen sein. Geeignete Stiele oder Linker sind 5-(4-(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5- dimethoxyphenoxy)valeriansäure, 5-[(9- Fluorenylmethyloxycarbonylaminoxanthen-2-oxy]valeriansäure und p-Alkoxybenzylalkohol. Die in den US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/576232 und 07/576233 beschriebenen Stiele sind ebenfalls geeignet.
  • Das vorliegende allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure kann in einem synthetisierten Peptid, das aus miteinander über Peptidbindungen verbundenen biolo gisch relevanten Aminosäureresten gebildet ist, enthalten sein. Die Peptidsynthesetechniken, nach welchen ein derartiges Peptid gebildet wird, sind bekannt. Die hierin beschriebenen Techniken stellen ein repräsentatives Beispiel für die zahlreichen Syntheseverfahren dar. Kombinationen und Abänderungen hiervon stehen zur Verfügung. Das vorliegende Peptid kann entweder an einem festen Träger befestigt oder löslich sein. In den meisten Fällen ist das Peptid erwartungsgemäß an einem festen Träger befestigt. Das Peptid kann aus einem linearen Peptid, in welchem Peptidbindungen die Alpha-Kohlenstoffatome einer Reihe von Aminosäureresten verbinden, mit einem endständigen Aminosäurerest mit einem Carboxylsubstituenten des Alpha-Kohlenstoffs (die Cα - Carboxylgruppe) entweder frei in Lösung oder kovalent, ggf. über einen Stiel (vgl. oben), an einen festen Träger gebunden, bestehen. Der andere endständige Aminosäurerest eines solchen linearen Peptids besitzt eine Nα -funktionelle Gruppe, die entweder frei in Lösung vorliegt oder durch eine geeignete zeitweilige Schutzgruppe, z. B. eine Allylgruppe oder eine der zuvor beschriebenen üblichen Gruppen, geschützt ist. Eine Allylentschützung eines in einem solchen Peptid enthaltenen allylgeschützten Aminosäurederivats kann dessen funktionelle Seitenkettengruppe freigeben. Andererseits kann die Allylschutzgruppe entweder an der endständigen Nα -funktionellen oder der Cα -funktionellen Gruppe vorhanden sein.
  • Alternativ kann es sich bei dem vorliegenden Peptid um ein verzweigtes Peptid, in welchem mindestens eine zusätzliche Reihe von Aminosäureresten, die miteinander über Peptidbindungen verbunden sind, an der funktionellen Seitenkettengruppe mindestens eines in der Kette benachbarter Peptidbindungen, die von dem ersten, an den Träger gebundenen Aminosäurerest ausgehen, vorhandenen Aminosäurerests hängt, bestehen. So können Peptidverzweigungen sowohl von den funktionellen Nα - als auch Seitenketten (Epsilon, N')- Gruppen von Lysin abzweigen. Wie hierin beschrieben, können aus einer Matrix von Lysinresten, die miteinander über Peptidbindungen an sowohl den Nα - als auch N'-Stellen verknüpft sind, mehrfach verzweigte Strukturen gebildet werden. Solche mehrfach verzweigte Strukturen werden im folgenden als "multiple antigene Peptide" bezeichnet.
  • Als weitere Alternative kann das vorliegende Peptid aus einem cyclischen Peptid bestehen. Hierunter ist zu verstehen, daß beispielsweise ein oder beide Ende(n) einer Kette von miteinander durch Peptidbindungen verbundenen Aminosäureresten an Peptidbindungen mit anderen Aminosäureresten im selben Peptid teilnehmen können. Es können auch cyclische Peptide gebildet werden, bei welchen zwei im selben Peptid vorhandene funktionelle Seitenkettengruppen von Aminosäuresubstituenten in einer Peptidbindung verknüpft sind. Solche Schleifenstrukturen können zwischen den Seitenketten von Asparagin- oder Glutaminsäure und Lysin oder Ornithin gebildet werden. Es kann auch eine Stamm- und -Schleife- Peptidstruktur, bei der die funktionelle Seitenkettengruppe eines Aminosäurerests an eine endständige funktionelle Nα - oder Cα -Gruppe gebunden ist, gebildet werden. Ein cyclisches Kopf-Schwanz-Peptid ist eines, bei welchem die endständigen Carboxy- und Aminogruppen miteinander verbunden sind. Ein cyclisches Kopf-Schwanz-Peptid kann an einen festen Träger an der Stelle einer funktionellen Seitenkettengruppe, d. h. an der Seitenketten-Carboxylgruppe von Asparaginsäure, gebunden sein.
  • Unabhängig davon, ob die Allylschutzgruppe eines solchen Peptids an einer funktionellen Seitenketten- oder alphaendständigen Gruppe vorhanden ist, kann die erfindungsgemäße Allylentschützung Maßnahmen zur Bildung cyclischer oder verzweigter Peptidstrukturen einschließlich von multiplen antigenen Peptiden vorangehen, folgen oder in sonstiger Weise im Zusammenhang mit diesen benutzt werden.
  • Wie zuvor zusammengefaßt, basiert die vorliegende Erfindung auf dem Auffinden von Bedingungen, unter welchen der zur Allylgruppenentfernung benutzte Katalysator löslich ist. Bei zahlreichen in Betracht gezogenen Ausführungsformen handelt es sich bei dem vorliegenden Katalysator um einen Organopalladiumkatalysator, vorzugsweise einen Organopalladium(0)-Katalysator. Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) [Pd(PPh&sub3;)&sub4;] stellt den erfindungsgemäß bevorzugten Katalysator dar. Bei bislang bekannten Verfahren wurde dieser Katalysator in Form eines suspendierten Feststoffs eingesetzt. Es werden nunmehr Bedingungen beschrieben, die sich zur Benutzung bei Peptidsynthesereaktionen eignen und unter denen der bevorzugte Katalysator löslich ist. Somit ermöglicht die vorliegende Erfindung die Automatisierung von Peptidsynthesen, bei denen eine Allylentschützung erforderlich oder erwünscht ist.
  • Es wird hierin beschrieben, daß der vorliegende Katalysator in einem Lösungsmittel, in welchem zusätzlich eine organische Säure und ein geeigneter-Akzeptor vorhanden sind, gelöst werden kann. Geeignete Lösungsmittel für Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) sind beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid und Benzol, vorzugsweise Chloroform (CHCl&sub3;). Dimedon, N-Methylanilin, N,N'- Dimethylbarbitursäure, Morpholin oder N-Methylmorpholin können als Akzeptoren verwendet werden. Die bevorzugten Akzeptoren sind Morpholin und N-Methylmorpholin. N- Methylmorpholin (NMM) wird besonders bevorzugt, da es sich gezeigt hat, daß es als Akzeptor wirkt, ohne in unerwünschter Weise die 9-Fluorenylmethyloxycarbonylschutzchemie zu stören. Somit kann unter geeigneten Bedingungen die Allylchemie zur 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchemie voll or thogonal gemacht werden. Wie hierin beschrieben, wird N- Methylmorpholin deshalb besonders bevorzugt, weil es keine unerwünschte Neigung aufweist, als Base und nicht als Akzeptor oder Fänger für Allylradikale während der Katalyse zu wirken. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann jede in das vorliegende Lösungsmittel einmischbare geeignete organische Säure verwendet werden. Es können Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure verwendet werden. Von diesen hat sich Essigsäure (HOAc) als besonders gut geeignet erwiesen.
  • Somit wird gemäß bevorzugter Ausführungsformen Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) in einem Essigsäure und N- Methylmorpholin in Chloroform umfassenden Lösungsmittel gelöst. In diesem Lösungsmittel kann die Essigsäure in einer Konzentration zwischen etwa 3 und etwa 7, zweckmäßigerweise zwischen etwa 4 und etwa 6 und vorzugsweise von etwa 5% vorhanden sein. Die N-Methylmorpholinkonzentration hierbei beträgt etwa 1 bis etwa 4, zweckmäßigerweise etwa 2 bis etwa 3 und vorzugsweise etwa 2,5%. Somit wird gemäß der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegende Katalysator in einem Chloroformlösungsmittel mit zusätzlich etwa 5% Essigsäure und etwa 2,5% N-Methylmorpholin gelöst.
  • Der erfindungsgemäße lösliche Organopalladiumkatalysator kann unter normalen atmosphärischen Bedingungen verwendet werden. Vorzugsweise wird er jedoch unter einer Inertgasatmosphäre benutzt. Inerte Bedingungen werden vorzugsweise in dem Lösungsmittel beispielsweise durch Hindurchperlenlassen von gasförmigem Argon (Ar) vor dem Kontaktieren des Lösungsmittels mit festem Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) hergestellt. Inerte Bedingungen werden danach während der Verwendung des löslichen Katalysators für die Allylentschützung aufrechterhalten. Zur Herstellung einer Inertgasatmosphäre für den vorliegenden löslichen Katalysator kann jedes beliebige Inertgas benutzt werden.
  • Um den gewünschten Grad und die gewünschte Geschwindigkeit der Allylentschützung sicherzustellen, wird eine ausreichende Menge des festen Organopalladiumkatalysators in dem hierin beschriebenen Lösungsmittel gelöst. Die jeweils geeignete Menge an Katalysator hängt vom gewünschten Volumen und der gewünschten Endkonzentration des für eine spezielle Entschützungsreaktion benötigten löslichen Katalysators ab. Die spezielle Art, das Volumen und die Konzentration des zu entschützenden allylgeschützten Aminosäurederivats beeinflussen ebenfalls die Menge an in dem vorliegenden Lösungsmittel zu lösenden festen Katalysators. Geeignete Katalysatormengen für eine spezielle Entschützungsreaktion lassen sich durch einfache Routineversuche ermitteln. In typischer Weise wird die gewünschte Menge an dem erfindungsgemäßen löslichen Organopalladiumkatalysator als Anzahl chemischer Äquivalente über die chemischen Äquivalente der zu entfernenden (zu entschützenden) Allylschutzgruppen hinaus berechnet. Dieser Praxis folgen die folgenden Untersuchungsstudien und das folgende repräsentative Beispiel.
  • Die hierin beschriebene Erfindung und ihre Bedeutung als Fortschritt auf dem Gebiet der Festphasensynthese lassen sich anhand der folgenden Diskussion und veranschaulichenden Studien noch besser verstehen.
  • Auftauchen der Allylschutzchemie bei der Synthese organischer und biochemischer Moleküle
  • 1950 führten Stevens und Watanabe die Allyloxycarbonyl(Aloc)-Gruppe zum Schutz von Amin- und Alkoholeinheiten ein (Stevens und Watanabe (1950), 72 "J. AM. CHEM. Soc.", 725 bis 727). Die Abspaltung der Aloc-Gruppe erfolgte durch katalytische Hydrogenolyse unter Verwendung von Platin- oder Palladiumkatalysatoren, die Verwendung von metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak oder die Verwendung von Phosphoniumiodid in Eisessig (HOAc). Unglücklicherweise verliefen diese Verfahren zur Entfernung der Aloc-Gruppe nicht geradewegs, wodurch die Brauchbarkeit dieser Gruppe bei organischen Synthesen beschränkt wurde. Tsuji und Trost entwickelten später verbesserte Reaktionsbedingungen für eine palladiumkatalysierte Allylentschützung, worauf das Potential der Allyl(Al)-Schutzgruppe bei organischen Synthesen erkannt wurde (Tsuji (1980) "ORGANIC SYTHESIS WITH PALLADIUM COMPOUNDS", (Springer-Verlag, Verl.); Trost (1980), 13 "Acc. CHEM. RES.", 385-393).
  • Hayakawa et al. dehnten die Aloc- und Allylgruppenstrategie für den Schutz von Internucleotidbindungen und Nucleosidbasen bei der Lösungs- und Festphasensynthese von Nucleinsäuren aus. (Hayakawa et al. (1990), 112 "J. AM. CHEM. Soc.", 1691-1696). Die gleichzeitige Entschützung der allylgeschützten Phosphate und Aloc-geschützten Aminoligomeren erfolgte mithilfe eines Gemischs aus Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0), Triphenylphosphin und einem großen Überschuß an Butylamin und Ameisensäure in Tetrahydrofuran (THF) bei 50 ºC während 0,5 bis 1 h.
  • Guibe et al. untersuchten die selektive Abspaltung von Aloc- und Allylgruppen für die Alpha-Amino- bzw. Seitenkettenfunktionen biologisch relevanter Aminosäuren (Dangles et al. (1987), 52 "J. ORG. CHEM.", 4984-4993; Guibe et al. (1986), 27 "TETRAHEDRON LETT.", 2365-2368; Merzouk und Guibe (1992), 33 "TETRAHEDRON LETT.", 477-480). Guibe untersuchte den Einfluß unterschiedlicher Akzeptoren als Allylgruppenfänger und fand, daß die Verwendung von Tributylzinnhydrid (Bu&sub3;SnH) und Silylaminen die Bildung von unerwünschtem Allylamin unterdrückt.
  • Anfänglich wurde das Potential der Allylchemie bei der Festphasenpeptidchemie als Stiel zur Befestigung des wachsenden Peptids an dem Harz erkannt. Kunz und Birr führten die Verwendung von an ein Aminomethylpolystyrolharz gekoppelter 4-Bromcrotonsäure als Allylanker ein (Kunz und Dombo (1988), 27 "ANGEW. CHEM. INT. ED." ENGL. 711-713; Kunz et al. (1988) in "PEPTIDES", 1988: PROCEEDINGS OF THE TWENTIETH EUROPEAN PEPTIDE SYMPOSIUM 154-156 (Jung und Bayer, Hrsg.); Becker et al. (1988) in "PEPTIDES", 1988: PROCEEDINGS OF THE TWENTIETH EUROPEAN PEPTIDE SYMPOSIUM 157-159 (Jung und Bayer, Hrsg.). Das Peptid wurde von dem Harz durch Behandeln mit Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) [Pd(PPh&sub3;)&sub4;] in THF und in Gegenwart eines Akzeptors, wie Morpholin, Dimedon, N- Methylanilin oder N,N'-Dimethylbarbitursäure, abgelöst. Unter diesen milden neutralen Bedingungen wurde die Herstellung von Glykopeptiden mit empfindlichen O-glykosidischen Bindungen möglich. Weiterhin berichtete Kunz über die Verwendung von Nα -endständigen 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Gruppen in Kombination mit C-endständigen Allylestern als alternative Methode zur Herstellung von O-Glykopeptiden in Lösung (Ciommer und Kunz (1991), "SYNLETT.", 593-595; Friedrich-Bochnistschek et al. (1989), 54 "J. ORG. CHEM." 751--756).
  • Blankemeyer-Menge und Frank beschrieben die Synthese verschiedener geschützter Peptidfragmente auf Cellulosescheiben mit 4-(4'-Methoxytrityloxy)-but-2-enyloxhexansäure als Allylanker (Blankemeyer-Menge und Frank (1988), 29 "TETRAHEDRON LETT.", 5871-5874). Die Entschützung der Allylesterbindung wurde durch Behandeln mit Pd(PPh&sub3;)&sub4; in trockenem Tetrahydrofuran und anschließendem Zusatz einer Lösung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in THF erreicht. Zur Vermeidung einer Abspaltung der Fmoc-Gruppe wurde als Akzeptor HOBt anstelle von Morpholin verwendet. Guibe und Loffet benutzten an Aminomethylpolystyrol gekoppelte 4-Trityloxy but-(Z)-2-enyloxyessigsäure als Allylstiel (Guibe et al. (1989), 30 "TETRAHEDRON LETT.", 2641-2644; Loffet et al. (1990) in "PEPTIDES: CHEMISTRY, STRUCTURE AND BIOLOGY: PROCEEDINGS OF THE ELEVENTH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM", 1015-1016, (Rivier und Marshall, Hrsg.). Dieser Stiel wurde durch Hydrostannolyse mit Bu&sub3;SnH abgespalten. Später untersuchte Albericio Abspaltungsbedingungen für die von Kunz und Frank beschriebenen zwei Allylverankerungsgruppen 4-Bromcrotonsäure und 4- Trityloxy-but-(Z) -2-enyloxyessigsäure (Lloyd-Williams et al. (1991), 33 "TETRAHEDRON LETT.", 4207-4210). Albericio fand, daß die Durchführung der Abspaltungsreaktion durch Behandeln der Allylverankerungsgruppe mit THF : Dimethylsulfoxid (DMSO) : 0,5 M HCl (2 : 2 : 1) unter Verwendung von Morpholin als Akzeptor und Pd(PPh&sub3;)&sub4; als Katalysator optimale Ergebnisse lieferte.
  • Hudson und Loffet untersuchten unabhängig voneinander die Verwendung der Allylgruppe bei der Festphasenpeptidsynthese äls Seitenkettenschutzgruppe (Biancalana et al. (1992) in "INNOVATION AND PERSPECTIVES IN SOLID PHASE SYNTHESIS: PEPTIDES, POLYPEPTIDES AND OLIGONUCLEOTIDES", 135-152 (Epton, Hrsg.); Lyttle und HudSOn (1992) in "PEPTIDES - CHEMISTRY AND BIOLOGY: PROCEEDINGS OF THE TWELFTH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM", 583-584 (Smith und Rlvier, Hrsg.); Loffet und Zhang (1992) in "INNOVATION AND PERSPECTIVES IN SOLID PHASE SYNTHESIS: PEPTIDES, POLYPEPTIDES AND OLIGONÜCLEOTIDES", 77-82 (EptOn, Hrsg.)). Dle milden Bedingungen zur Entschützung von Allylfunktionen waren mit den klassischen, auf Fmoc/tert.-Butyl(tBu) basierenden Methoden verträglich und lieferten somit eine dritte Orthogonalitätsdimension für Schutzschemata für den Aufbau von Peptiden.
  • In jüngster Zeit berichteten Albericio et al. über die Herstellung cyclischer Kopf-Schwanz-Peptide, von Seitenkettenlaktampeptiden, Glyko- und Sulfopeptiden und verzweigten Peptiden über eine dreidimensionale orthogonale Festphasenstrategie unter Benutzung von Fmoc-, tBu- und Allylschutzgruppen (Albericio et al. (1993) in "PEPTIDES 1992: PROCEEDINGS OF THE TWENTY-SECOND EUROPEAN PEPTIDE SYMPOSIUM" (Schneider und Eberle, Hrsg.); Kates et al. (1993), 34 "TETRAHEDRON LETT.", 1549-1552). Als die darin beschriebenen Untersuchungen sich ihrem Ende näherten, wurde von Trzeciak und Bannwarth über eine identische Strategie unter Benutzung der Allylchemie zur Herstellung von cyclischen Kopf-Schwanz-Peptiden berichtet (Trzeciak und Bannwarth (1992), 32 "TETRAHEDRON LETT.", 4557-4660).
  • Benutzung der Allylentschützungschemie im Zusammenhang mit Polyethylenglykol/Polystyrol-Pfropfträgern für die Festphasensynthese
  • In jüngster Zeit wurde von Barany eine neue Familie von Polyethylenglykol/Polystyrol(PEG/PS)-Propfträgern beschrieben. Diese Träger verbessern den Synthesewirkungsgrad und den Bereich von Reaktionen, die an harzgebundenen Peptidketten durchgeführt werden können (Barany et al. (1993) in "PEPTIDES 1992 : PROCEEDINGS OF THE TWENTY-SECOND EUROPEAN PEPTIDE SYMPOSIUM" (Schneider und Eberle, Hrsg.); Barany et al. (1992) in "PEPTIDES - CHEMISTRY AND BIOLOGY: PROCEEDINGS OF THE TWELFTH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM", 603-604 (Smith und Rivier, Hrsg.); Zalipsky et al. (1985) in "PEPTIDES - STRUCTURE AND FUNCTION: PROCEEDINGS OF THE NINTH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM", 257-260 (Deber et al., Hrsg.)). PEG-PS-Träger besitzen jeweils eine definierte und reproduzierbare Struktur mit 20 bis 70 Gew.- % Polyethylenglykol. Diese Träger quellen in einem Bereich von Lösungsmitteln, die für den stufenweisen Aufbau von Peptidketten optimal sind, merklich. PEG-PS-Träger wurden in Reaktoren mit sowohl chargenweisem Fluß als auch kontinuierlichem Fluß mit vernachlässigbarem Staudruck benutzt.
  • Zur Ausdehnung des Wirkungsbereichs dieser Träger und ihrer Vorteile bei der Festphasenpeptidsynthese, wurde die Entschützung der Allylgruppe auf PEG-PS exploriert. Es wurden verschiedene Modellpeptide mit der Sequenz Y-Ala-Xaa-Gln- Lys-Thr-Asp(OAl)-Thr-Pro-NH&sub2;, mit Xaa = Ala, Met oder Trp und Y = Fmoc oder H parallel auf PEG-PS- und Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Harzen unter Verwendung eines 5-(4-(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5- dimethoxyphenoxy)valeriansäure (PAL)-Stiels oder Linkers zur Vermittlung der Befestigung der Peptide an dem Träger hergestellt. Diese Modellpeptide dienten zur Überprüfung der Bedingungen für die Entschützung der Allylgruppe im Zusammenhang mit einer Unterdrückung der Oxidation von Met und der Rückalkylierung von Trp.
  • Die Einzelheiten der Peptidsynthese waren folgende:
  • Materialien: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asp(OAl)-OH und Fmoc- Asp-OAl wurden jeweils nach bereits veröffentlichten Maßnahmen hergestellt (Lyttle und Hudson (1992) in "PEPTIDES- CHEMISTRY AND BIOLOGY: PROCEEDINGS OF THE TWELFTH AMERICAN PETPTIDE SYMPOSIUM", 583-584 (Smith und Rivier, Hrsg.); Belshaw et al. (1990), 20 "SYN. COMM." 3157-3160)). Die restlichen Fmoc- Aminosäuren und sämtliche sonstigen Peptidsynthesereagenzien wurden von Millipore Corporation erworben. tBu diente zum Schutz der funktionellen Seitenketteneinheiten von Asp, Glu, Thr und Tyr; für Lys wurde tert.-Butyloxycarbonyl (Boc) verwendet, für Arg wurde 2,2,5,7,8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) verwendet. Die Seitenketten von Asn, Gln und Trp waren ungeschützt. Sämtliche Lösungsmittel waren von HPLC-Reinheit oder äquivalenter Reinheit und wurden ohne weitere Reinigung benutzt.
    • Peptidsynthese: Standardkettenverlängerung
  • Unter Verwendung des in Fig. 1 dargestellten Millipore 9050 PlusTM PepSynthesizer wurde automatisch bei kontinuierlichem Fluß eine Festphasensynthese durchgeführt. Die Synthesen erfolgten - sofern nicht anders angegeben - auf einem Fmoc-PAL-PAG-PS-Träger (0,27 mmol Fmoc/g Harz). Der Träger wurde nach einem bekannte Verfahren hergestellt (Barany et al. (1993) in "PEPTIDES 1992: PROCEEDINGS OF THE TWENTY-SECOND EUROPEAN PEPTIDE SYMPOSIUM" (Schneider und Eberle, Hrsg.)). Die Strömungsgeschwindigkeit der Einheitspumpe wurde auf 5,0 ml/min eingestellt. Geschützte Aminosäurereste wurden nach folgendem Protokoll an das Harz addiert: Fmoc-Gruppenentschützung mit 2% 1,8-Diazabicyclo[5,4,0] - undec-7-en (DBU) und 2% Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) während 7 min. anschließende 12-minütige Wäsche mit DMF, danach 30-minütige Aminosäurekopplung und schließlich 8 weitere Minuten lang Wäsche mit DMF. Hierauf wurden jeweils 4 Äquivalente Fmoc-Aminosäure und HOBt zusammen mit einer für eine Endkonzentration von 0,3 M ausreichenden Menge Benzotriazol-1-yl-oxy- tris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP) in einer Lösung von 0,6 M N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) in DMF gelöst und dem Träger mit dem wachsenden Peptid zugeführt. Asn und Gln wurden als Pentafluorphenylester in DMF (0,3 M Lösung) mit 4 Äquivalenten HOBt eingearbeitet. Dieser Prozeß wurde mit den verschiedenen vorher gewählten Fmoc-geschützten Aminosäuren wiederholt, bis das gewünschte Peptid erhalten wurde.
  • Manuelle Allylentschützung: Im vorliegenden Falle wurden die zuvor von Albericio entwickelten und danach von anderen (Forschern) angepaßten Entschützungsbedingungen mit bestimmten weiteren Verfeinerungen benutzt (Lloyd-Williams et al. (1991), 33 "TETRAHEDRON LETT.", 4207-4210; Biancalana et al. (1992) in "INNOVATION AND PERSPECTIVES IN SOLID PHASE SYNTHESIS: PEPTIDES, POLYPEPTIDES AND OLIGONUCLEOTIDES", 135-152 (Epton, Hrsg.)). Die Seitenkettenentschützung der Allylgruppe erfolgte manuell in einer mit einer Polyethylenscheibe und einem Einlaß für gasförmiges Ar ausgestatteten 5-ml- Polypropylenspritze. Bei einer typischen Studie wurde das an dem Harz befestigte Peptid (50 mg Peptidharz, 15 umol Peptid) mit Pd(PPh&sub3;)&sub4; (50 mg, 43 umol) und Morpholin (50 ul, 0,57 mmol) in DMSO : THF : 0,5 N HCl (2 : 2 : 1, 2 ml Gesamtvolumen) während 2 h bei 25ºC unter Ar behandelt. Das Harz wurde dreimal sukzessive jeweils 2 min (pro Wäsche) mit THF, DMF, CH&sub2;Cl&sub2; bzw. 0,5% DIEA in CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Danach wurde das Harz (jeweils pro Wäsche) dreimal 15 min mit 0,02 M Natriumdiethyldithiocarbamat in DMF, fünfmal 2 min mit DMF und dreimal 2 min mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Auf diese Weise wurden Metallionen und sonstige Nebenprodukte entfernt. Das Harz wurde danach im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Harz wurde in zwei Proben unterteilt. Die hierbei erhaltenen Peptidharzproben wurden entweder zunächst nach dem geschilderten Standardverfahren zur Entfernung der Fmoc- Gruppe mit Piperidin-DMF behandelt oder vor der Abspaltung vom Träger mit DMF gewaschen.
  • Abspaltungsbedingungen: Die Peptidharzproben wurden mit einem als Reagenz R bezeichneten Gemisch aus TFA : Anisol : β- Mercaptoethanol (95 : 3 : 2) 2 h lang behandelt. Die Filtrate wurden gesammelt. Das Harz wurde nochmals mit TFA gewaschen. Nach Zugabe von kaltem Ether zu den vereinigten Extrakten wurde die Lösung auf -70ºC gekühlt. Nach Entfernen des Überstands wurde der gebildete Niederschlag mehrere Male mit kaltem Ether gewaschen, in Essigsäure gelöst und lyophilisiert.
  • Struktur- und physikalische Analyse der synthetisierten Peptide: Aminosäureanalyse: Die Peptide und Peptidharze wurden mit gasförmiger Chlorwasserstoffsäure (HCl) hydrolysiert (Bidlingmeyer et al. (1984), 336 "J. CHROMATOGR.", 93- 104). Die Aminosäureanalyse erfolgte mithilfe eines Waters FemtotagTM-Chemikaliensets bzw. -kits.
    • Massenspektrometrie
  • Die Massenspektren wurden mit einem matrixgestützten Laserdesorptions-Flugzeitinstrument (LD-MS), Prototyp der Firma Waters, aufgezeichnet.
  • HPLC: Die HPLC erfolgte mithilfe einer Vorrichtung der Firma Waters mit zwei Lösungsmittelzufuhrsystemen (Modell 600), einer automatischen Einspritzdüse (Modell Wisp 712), einem UV-Detektor mit programmierbarer Wellenlänge (Modell 490) oder einem Detektor mit programmierbarer Photodiodenanordnung (Modell 994) und einem 860 Networking Computer zur Steuerung des Systembetriebs und zur Datensammlung. Die hierin verwendeten HPLC-Analysesäulen waren Delta Pak C&sub1;&sub8; (3,9 · 150 mm, 5 um)-100-Å-Säulen. Die Lösung A zur Umkehrphasenanalyse bestand aus 0,1% Trifluoressigsäure(TFA) in H&sub2;O, die Lösung B aus 0,1% TFA in CH&sub3;CN.
  • Selbstverständlich sind die beschriebenen speziellen Bedingungen und Geräte lediglich Beispiele für zahlreiche akzeptable Methoden zur Durchführung der Peptidsynthese und einer manuellen Allylentschützung. Somit sind die geschilderten Maßnahmen in keiner Weise als Beschränkung anzusehen.
  • Eine Analyse der HPLC-Chromatogramme der nach dem geschilderten Protokoll erhaltenen Modellpeptide belegt, daß auf beiden Trägern, d. h. den PEG-PS- und PS-Trägern, eine Abspaltung der allylgeschützten Seitenkettengruppe erfolgte. Die Reinheit des Peptids war jedoch - wie Fig. 2 ausweist -bei Verwendung der PEG-PS-Träger höher. Bei den HPLCchromatogrammaufzeichnungen der einzelnen Modellpeptide wurde ein linearer Gradient über 30 min bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min mit den Lösungen B und A in einem anfänglichen Verhältnis von 1 : 9 und einem Endverhältnis von 7 : 3 angelegt. Sämtliche Peptide lieferten die erwarteten Ergebnisse bei der LD-MS. Infolge des Einbaus einer großen Menge Polyethylenglykol existiert PEG-PS in gequollenem Zustand. Die Polyethylenglykolspacer dieses Harzes erlaubten eine vollständige Solubilisation reaktionsfähiger Stellen, was die Peptidsynthesereaktion noch effizienter machte.
  • Die eingehaltenen Bedingungen führten jedoch in zahlreichen Fällen auch zu einer unerwünschten Entschützung der Nα - Fmoc-Gruppe. Eine Entschützung der Nα -Fmoc-Gruppe war nicht überraschend, da Morpholin als Base wirken kann. Weiterhin erwies sich die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel unter den Entschützungsbedingungen als mit Met-haltigen Peptiden unverträglich obwohl eine Allylentschützung erreicht wurde, wurde auch ein zweites Produkt, das als aus der Oxidation des Met-Restes herrührend identifiziert wurde, erhalten. Die Allylentschützungsbedingungen waren mit Trp-haltigen Peptiden verträglich, da keine Rückalkylierung von Trp feststellbar war. Dadurch wurden die bisher veröffentlichten Erkenntnisse bestätigt (Lyttle und Hudson (1992) in "PEPTIDES - CHEMISTRY AND BIOLOGY: PROCEEDINGS OF THE TWELFTH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM", 583-584 (Smith und Rivier, Hrsg.)). Schließlich wurde auch der Wirkungsgrad der Allylentschützung gegenüber dem von anderen Autoren veröffentlichten Wirkungsgrad verbessert, wenn sie in inerter Atmosphäre durchgeführt wurde.
  • Hindernisse, die bei der Anpassung der Allylschutzchemie an eine automatisierte Synthese auftraten
  • Eine Standardallylentschützung nach den bekannten und zuvor beschriebenen Techniken benutzt einen in einem geeigneten Lösungsmittel suspendierten und unter inerter Atmosphäre gehaltenen festen Palladiumkatalysator. Dieser Versuch ist bei einem Peptidsynthesegerät mit chargenweisem und kontinuierlichem Fluß nicht durchführbar, da bei der Zufuhr des unlöslichen Palladiumkatalysators zum Reaktionsgefäß Probleme auftreten. Beispielsweise müssen die hauptsächlich vom Palladiumkatalysator herrührenden unerwünschten festen Nebenprodukte am Ende der Allylentschützungsstufe vollständig entfernt werden. Jede dieser Erwägungen stellt herausfordernde Hindernisse bei der Entwicklung eines automatisierten Protokolls, das die Entfernung der Allylgruppen in der selben Reaktionssäule oder im selben Reaktionsgefäß, wie sie (es) für die Peptidverlängerung in einem Gerät des in Fig. 1 dargestellten Typs verwendet wird, ermöglicht, dar. Automatisierbare Entschützungsmaßnahmen, die in einer beliebigen Stufe während des Syntheseprotokolls durchgeführt werden können, sind somit vonnöten.
  • Auffinden von Allylentschützungsbedingungen, die mit der Automatisierung vollständig verträglich sind; Verwendung derselben zur Herstellung empfindlicher Glyko- und Sulfopeptide
  • Es war wichtig, daß die bei einer automatischen Einstellung zur Entfernung der Allylgruppe eingehaltenen selektiven Entschützungsbedingungen in voller Orthogonalität mit sonstigen Schutzgruppen (beispielsweise Fmoc) gehalten wurden und labile Aminosäuren (beispielsweise Met, Trp, Tyr(SO&sub3;H)) erhielten sowie für leicht an die Durchführung auf einem automatisierten Peptidsynthesegerät anpassbare homogene Reaktionsbedingungen sorgten. Die vorliegende Erfindung verkörpert den erfolgreichen Höhepunkt von mit dem Ziel der Entwicklung einer vollständig automatisierbaren Allylentschütungsstrategie, die diesen Kriterien genügt, durchge führten Studien. Insbesondere wurden Bedingungen aufgefunden, unter denen der Palladiumkatalysator löslich ist und eine unerwünschte Fmoc-Entschützung verhindert wird. Die nunmehr beschriebenen Bedingungen sind mit der Synthese von Glyko- und Sulfopeptiden vollständig verträglich. Die vorliegende Beschreibung spezieller Bedingungen und Geräte repräsentiert eine unter zahlreichen akzeptablen Strategien zur Ausführung der vorliegenden Erfindung. Somit darf das Folgende nicht als auch nur irgendwie geartete Beschränkung der beanspruchten Erfindung angesehen werden.
  • Der mit kontinuierlichem Fluß arbeitende Millipore 9050 PlusTM PepSynthesizer wurde entsprechend Fig. 1 modifiziert, um den neuen Bedingungen, unter denen das erfindungsgemäße Allylentschützungsschema ausgeführt wird, Rechnung zu tragen. Die Automatisierung wurde durch die Benutzung einer zur erfindungsgemäßen Herstellung komplexer Peptide geeigneten Software noch weiter erleichtert. Wie noch näher beschrieben werden wird, wurde das vorliegende Syntheseprotokoll auf die automatisierte Allylgruppenentschützung von in den biologisch relevanten Aminosäuren und deren Derivaten, die sich zur Synthese von cyclischen Kopf- Schwanz-Peptiden, verzweigten Peptiden und multiplen antigenen Peptiden (MAPs) eignen, vorhandenen Säure-, Base-, Guanidino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen oder sonstigen funktionellen Gruppen angewandt. Die Studien, die in der vorliegenden Auffindung einer automatisierbaren Allylentschützungsstrategie kulminierten, werden nunmehr im folgenden detailliert beschrieben.
  • Die automatisierte Entschützung von Allylgruppen erforderte zunächst, daß das Problem einer Übertragung des festen Palladiumkatalysators auf die Reaktionssäule und die Entfernung unlöslicher, vom Katalysator herrührender Nebenprodukte, gelöst wird. Eine in situ automatisierte Allylentschüt zung sollte erwartungsgemäß mit höherem Wirkungsgrad ablaufen, wenn sich der Katalysator in Lösung befindet. Auf diese Weise läßt sich eine Entschützungsreaktion "im Festzustand" vermeiden. Weiterhin war vorhersehbar, daß das Vorhandensein unlöslicher Materialien in der Säule oder im Reaktionsgefäß eines automatisierten Geräts in signifikanter Weise die Zufuhr von Lösungsmitteln in folgenden Stufen durch Schaffung eines Staudrucks komplizieren. Der von Albericio zur Verwendung während der Allylentschützungsstufe beschriebene Lösungsmittelcocktail war zweiphasig und nicht homogen, indem nämlich der Katalysator in fester Form suspendiert blieb (Lloyd-Williams et al. (1991), 33 "TETRAHEDRON LETT.", 4207-4210). Für manuelle Entschützungsmaßnahmen, bei welchen Ar nach dem im vorherigen Abschnitt beschriebenen Protokoll durch das Gemisch perlengelassen wurde, wurde die Reaktion durch die Anwesenheit eines in festem Zustand befindlichen Katalysators nicht beeinträchtigt, da die Lösung wirksam gerührt wurde. Bei einem automatisierten und mit kontinuierlichem Fluß arbeitenden Gerät, z. B. dem Millipore 9050 PlusTM PepSynthesizer, ist es jedoch von wesentlicher Bedeutung, eine homogene Lösung zur gleichmäßigen Dispersion der Entschützungslösung auf dem Harz an der Hand zu haben.
  • Zur Vermeidung einer zweiphasigen Lösung benötigte man zum Ersatz der wäßrigen 0,5 M HCl-Lösung eine organische Säure. Eine organische Säure, die sich zum Ersatz einer wäßrigen 0,5 M HCl-Lösung eignet, war HOAc. Folglich wurde ein Gemisch aus DMSO : THF (1 : 1) mit 5% HOAc und 2,5% Morpholin zubereitet. Dabei erhielt man eine mischbare Lösung, die manuell die Allylgruppe an einem Modellpeptid der Sequenz H-Ala-Met-Gln-Lys-Thr-Asp(OAl)-Thr-Pro-NH&sub2; entschützte. Dieses Modellpeptid wurde ganz allgemein nach dem zuvor beschriebenen Protokoll unter der vorliegenden Modifizierung der manuellen Entschützungsstufe hergestellt.
  • Bei dieser Modifizierung war immer noch eine Oxidation des Met-Rests in Stellung 7 des Modellpeptids feststellbar. Folglich wurde das DMSO : THF-(1 : 1)-Gemisch durch DMF ersetzt. Bei dieser weiteren Modifizierung erfolgte die Allylentschützung mit DMF mit 5% HOAc und 2,5% Morpholin ohne Met-Oxidation. Unglücklicherweise blieb der Katalysator in diesem Gemisch unlöslich, was seinen Gebrauch bei einem automatisierten Gerät ausschloß.
  • Der vorliegende Katalysator Pd(PPh&sub3;)&sub4; ist in CHCl&sub3; und CH&sub2;Cl&sub2; löslich, in Benzol mäßig löslich. Voruntersuchungen zeigten, daß Pd(PPh&sub3;)&sub4; in einer 5% HOAc und 2,5% Morpholin enthaltenden Lösung von CHCl&sub3; vollständig löslich war. Dieses Ergebnis war attraktiv, da CHCl&sub3; ein Lösungsmittel darstellte, das mit der Festphasenpeptidsynthese und PEG-PS verträglich war. Bei einer weiteren Modifizierung wurde das Modellpeptid mit Pd(PPh&sub3;)&sub4; in einer Lösung von CHCl&sub3; mit 5% HOAc und 2,5% Morpholin behandelt. Diese Bedingungen ermöglichten die Entschützung der Allylgruppe, sie waren jedoch nicht mit der Nα -Fmoc-Gruppe verträglich.
  • Bei weiteren Versuchen zur Beseitigung einer unbeabsichtigten Nα -Fmoc-Entschützung wurde das Morpholin aus der Allylentschützungslösung weggelassen. Die Behandlung des Modellpeptids mit Pd(PPh&sub3;)&sub4; in einer Lösung von CHCl&sub3; mit 5% HOAc lieferte das gewünschte ungeschützte Peptid und ein nicht gekennzeichnetes Produkt. Dieses Ergebnis legte nahe, daß Morpholin nicht vornehmlich als Akzeptor sondern als die Nα -Fmoc-Gruppe entschützende Base wirkt.
  • Folglich wurde bei einer endgültigen Modifizierung der Allylentschützungsbedingungen Morpholin durch ein tertiäres Amin, nämlich N-Methylmorpholin (NMM) ersetzt. Die Behandlung des Modellpeptids mit Pd(PPh&sub3;)&sub4; in einer Lösung von CHCl&sub3; mit 5% HOAc und 2,5% NMM liefert das ungeschützte Peptid und konservierte gleichzeitig die Nα -Fmoc-Gruppe. Dieses erfolgreiche Ergebnis legte den Schluß nahe, daß dann, wenn für den Ablauf der Allylentschützung ein Akzeptor erforderlich war, Verunreinigungen oder Nebenprodukte aus dem Katalysator die Hauptquelle darstellten.
  • Aus den geschilderten Modifizierungen und Verfeinerungen der Bedingungen, unter denen eine Allylentschützung durchgeführt wurde, kristallisierte sich das im folgenden und in dem repräsentativen Beispiel beschriebene Entschützungsprotokoll als der erfolgreiche, vollständig automatisierbare Höhepunkt der vorliegenden Studien heraus. Das bevorzugte, automatisierbare Allylentschützungsprotokoll der vorliegenden Erfindung wurde mit den zuvor beschriebenen linearen Peptidsynthesemaßnahmen, die ansonsten für eine Automatisierung auf einem Millipore 9050 PlusTM PepSynthesizer geeignet sind, integriert. Damit wurden dann vollständig automatisierte Peptidsynthesen unter Verwendung von allylgeschützten Aminosäurederivaten durchgeführt.
  • Die zur Automatisierung benutzte Strategie bestand darin, Pd(PPh&sub3;)&sub4; wie eine Standardaminosäure zu behandeln und den Katalysator in einer Aminosäurephiole zu lagern. Die Phiole wurde mit Ar gespült und zur Erhaltung einer inerten Atmosphäre verschweißt. Die bevorzugte Allylentschützungslösung der vorliegenden Erfindung, d. h. CHCl&sub3; mit 5% HOAc und 2,5 % NMM, wurde in der Spritze 3 aufgezogen und in die Aminosäurephiole mit Pd(PPh&sub3;)&sub4; abgegeben. Danach wurde das erhaltene Gemisch mindestens einem Durchperlcyclus unterworfen, um sicherzustellen, daß der Katalysator vollständig aufgelöst (in Lösung gegangen) war, bevor er an die Reaktionssäule abgegeben wurde. Die Allylentschützungslösung wurde etwa 2 h lang durch die Säule umgewälzt. Die Verwendung der Spritze 3 zur Allylentschützung erforderte, daß die Spritze 2 mit für eine einzige Aktivierungschemie für die anschließende Verlängerung der Peptidkette geeigneten Reagenzien gefüllt war. Zur Herstellung cyclischer Peptide (die im folgenden beschrieben wird) ist die Spritze 2 DIEAbeschickt. Phosphonium- oder Uroniumsalze dienen zur Aktivierung während sowohl der Peptidverlängerung als auch der Cylclisierungsstufe. Zu diesem Zweck eignen sich die in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/766895 beschriebenen Phosphonium- und Uroniumsalze. Die Hilfs(Aux)- Flasche, die im rechten oberen Eck des Synthesemoduls (Fig. 1) dargestellt ist, enthielt eine Lösung von 0,5% DIEA und 0,5% Natriumdiethyldithiocarbamat in DMF zur Entfernung von möglicherweise einen Staudruck hervorrufenden Nebenprodukten. Diese Lösung wurde nach dem Wiederaufbereiten der Reaktionssäule zugeführt. Bei dem zuvor beschriebenen manuellen Entschützungsprotokoll wurde das Harz mit getrennten Lösungen von 0,5% DIEA in CH&sub2;Cl&sub2; und 0,5% Natriumdiethyldithiocarbamat in DMF gewaschen. Diese beiden Lösungen wurden im Rahmen der vorliegenden automatisierten Entschützungsstrategie vereinigt, wobei keine nachteiligen Wirkungen feststellbar waren. Vor der Fortsetzung des Syntheseprotokolls wurde eine letzte DMF-Wäsche durchgeführt. Das im folgenden beschriebene repräsentative Beispiel veranschaulicht ein spezielles Protokoll zur Durchführung der erfindungsgemäßen Allylentschützungsstrategie.
  • Wurde das in dem repräsentativen Beispiel beschriebene automatisierte Entschützungsprotokoll eingehalten, waren während der Synthese von Modellpeptiden keine reagenzverursachten Nebenprodukte feststellbar. Weiterhin lieferten unterschiedliche Quellen und Lose von Pd(PPh&sub3;)&sub4; ähnliche Ergebnisse, was belegt, daß die nucleophile Spezies in Bezug zu dem Palladiumkatalysator als solchem stand und nicht auf darin enthaltene Verunreinigungen zurückzuführen war.
  • Glyko- und Sulfopeptide präsentieren besonders schwierige Syntheseerwägungen (Albericio et al. (1993) in "PEPTIDES 1992: PROCEEDINGS OF THE TWENTY-SECOND EUROPEAN PEPTIDE SYMPOSIUM" (Schneider und Eberle, Hrsg.)). Folglich bestand großes Interesse an der Anwendbarkeit der vorliegenden automatisierten Allylentschützungsstrategie auf die Synthese dieser schwierigen Peptide.
  • Zur Synthese sulfatierter Tyrosinpeptide erfordert die Entfernung der Allylgruppe milde Spaltungsbedingungen. Die empfindliche Schwefel-Sauerstoff-Bindung erwies sich bei Verwendung von 0,5 M HCl als Protonenquelle im Rahmen der bekannten Entschützungsmaßnahmen als instabil. Die vorliegenden Bedingungen einer Pd(PPh&sub3;)&sub4;-katalysierten Entschützung in einer Lösung von CHCl&sub3; mit 5% HOAc und 2,5% NMM im Rahmen eines zuvor ganz allgemein beschriebenen Syntheseprotokolls und zusammen mit einem Peptidamidlinker, der milde Spaltungsbedingungen erfordert {[5-[(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl)-aminoxanthen-2- oxy)valeriansäure (XAL)} ermöglichten ein Verfahren zur Synthese sulfatierter Peptide. Bezüglich der Synthese von Glyko- und Sulfopeptiden vgl. auch Botems et al. (1992) in "PEPTIDES - CHEMISTRY AND BIOLOGY: PROCEEDINGS OF THE TWELFTH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM", 601-602 (Smith und Rivier, Hrsg.); Han et al. (1993) in "PROCEEDINGS OF THE FIRST CHINESE PEPTIDE SYMPOSIUM", im Druck (Yu-cang, Hrsg.).
  • Benutzung der vorliegenden automatisierbaren Entschützungsstrategie bei der Synthese cyclischer Peptide
  • Um die Wirksamkeit der vorliegenden automatisierbaren Allylentschützungsbedingungen noch weiter zu belegen, wurde die erfindungsgemäße Allylstrategie auf die automatisierte Synthese eines cyclischen Peptids angewandt. Rovero veröffentlichte vor kurzem die Synthese des Tachykininantagonisten peptids MEN 10355, cyclo-(Asp-Tyr-D-Trp-Val-D-Trp-D-Trp- Arg) (Rovero (1991), 32 "TETRAHEDRON LETT.", 2639-2642). Dieses war als cyclisches Kopf-Schwanz-Peptidmodell gewählt worden. Der für die Synthese dieses cyclischen Heptapeptids gewählte Versuch basierte auf der zuvor dargelegten automatisierten Allylentschützungsstrategie und ist schematisch in Fig. 3 dargestellt.
  • Eine lineare Synthese des cyclischen Modellpeptids erfolgte unter Benutzung einer kombinierten Fmoc/tBu-Schutzstrategie entsprechend den zuvor allgemein beschriebenen Maßnahmen in Verbindung mit einem Fmoc-Asp(O-PAC-PEG-PS)-OAl- Ausgangsharz. PAC bezeichnet den zur Befestigung des Peptids an dem PEG-PS-Träger benutzten p- Alkoxybenzylalkoholstiel. Zur Synthese des vorliegenden Tachykininantagonistenpeptidmodells wurde ein Nα -Fmoc-, Cα -allylgeschütztes Asp-Derivat über die Carboxyfunktion der Seitenkette an den PAC-Stiel gebunden. Nach Beendigung der linearen Synthese erfolgte eine Entschützung der Cα - Allylschutzgruppe mit der bevorzugten Lösung von Pd(PPh&sub3;)&sub4; in CHCl&sub3; mit 5% HOAc und 2,5% NMM.
  • Danach erfolgte die automatisierte Cyclisierung nach folgendem Protokoll:
  • Automatisierte Cyclisierung: Das vorliegende Protokoll stellt eine Anpassung der Originalmethode von Felix et al. für die harzgebundene Cyclisierung zur Verwendung bei allylentschützten Peptiden bei automatisierter Einstellung dar (Felix et al. (1988), 31 "INT. J. PEPTIDE PROTEIN RES.", 232-238). Nach der Nα -Fmoc-Entschützung der letzten Aminosäure wurden 4 Äquivalente HOBt und PyBOP, die sich in der Aminosäurephiole nach derjenigen mit dem Palladiumkatalysator befanden (vgl. Fig. 1), bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M in einer Lösung von 0,6 M DIEA in DMF (aus Spritze 2) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde dem allylentschützten, an den Träger gebundenen Peptid zugeführt. Die Cyclisierung wurde so lange ablaufen gelassen, bis die Ninhydrinreaktion negativ war. Danach wurde mit DMF (15 s, 3 ml/min) und CH&sub2;Cl&sub2; (6 min. 3 ml/min) gewaschen.
  • Nach der Nα -Fmoc-Entfernung, der PyBOP-HOBt-DIEAvermittelten Cyclisierung und Entfernung der tBu- Seitenkettenschutzgruppen wurde das cyclische Peptid nach dem hierin präsentierten Abspaltungsprotokoll vom Träger gelöst. Die Reinheit des hierbei erhaltenen cyclischen Peptids war derjenigen bei Durchführung der Cyclisierung auf manuellem Weg ähnlich. Eine HPLC-Chromatogrammdarstellung des nach den vorliegenden automatisierten Maßnahmen hergestellten cyclischen Kopf-Schwanz-Peptidmodells ist in Fig. 4 dargestellt. Die Darstellung zeigt das rohe entschützte cyclische Peptid unmittelbar nach der Abspaltung vom Träger bei Einwirkenlassen eines linearen Gradienten, bei dem die über 30 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min zugeführten relativen Mengen Lösung B/ Lösung A von 1/3 bis 11/9 eingestellt wurden. Eine LD-MS-Analyse des rohen cyclischen Peptids lieferte ein Masseäquivalent (MH&spplus;) von 1092,3 Dalton.
  • Benutzung der vorliegenden automatisierbaren Allylentschützungsstrategie bei der Synthese verzweigter Peptide
  • Die automatisierte Allylentschützungsstrategie gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich auch zur Synthese verzweigter Peptide des in Fig. 5 dargestellten Typs. Um diesen Aspekt der Erfindung zu erläutern, wurde ein Fmoc- Lys(Aloc)-PAL-PEG-PS-Harz hergestellt. Eine lineare Synthese von Prothrombin erfolgte nach dem zuvor allgemein diskutierten Protokoll unter Verwendung einer kombinierten Fmoc/tBu-Strategie für eine übliche Peptidverlängerung. Da nach erfolgte eine Seitenkettenentschützung der Aloc-Gruppe von Lys mit Pd(PPh&sub3;)&sub4; in der bevorzugten Lösung von CHCl&sub3; mit 5% HOAc und 2,5% NMM. Danach erfolgte eine lineare Synthese von Leu-Enkephalin durch Kettenverlängerung von der Epsilon-Aminogruppe (N') der Lysinseitenkette. Zur Gewährleistung einer Verlängerung an der gewünschten (Seitenketten-) Stelle wurde die letzte Aminosäure von Prothrombin (Ala in Stellung 9) während der Synthese von Leu- Enkephalin Nα -Boc-geschützt.
  • Somit können erfindungsgemäß verzweigte Peptide durch Integrieren des folgenden Protokolls mit der automatisierten Allylentschützung und den hierin beschriebenen Peptidsynthesetechniken hergestellt werden.
  • Synthese verzweigter Peptide: Die letzte Aminosäure der ersten Verzweigung wurde mit einer Boc-Gruppe anstelle einer Fmoc-Gruppe Nα -geschützt, um eine weitere Verlängerung der anfänglichen Kette zu verhindern. Nach Befestigung der Boc- Aminosäure an dem harzgebundenen Peptid wurde die Allylseitenkettenschutzgruppe unter Benutzung der hierin beschriebenen automatisierten Allylentschützungsbedingungen entfernt. Sämtliche folgenden Kopplungen des Sekundärverzweigungspolypeptids wurden nach dem zuvor beschriebenen linearen Syntheseprotokoll, jedoch mit der Ausnahme, daß die erste Aminosäure der zweiten Verzweigung 45 min lang gekoppelt wurde, durchgeführt.
  • Das erhaltene verzweigte Peptidbeispiel wurde ganz allgemein nach dem hierin beschriebenen Spaltungsprotokoll vom Harz gelöst. Die Entfernung der tBu- Seitenkettenschutzgruppen und der Nα -Boc-Gruppe lieferte das gewünschte verzweigte Peptid Cα -(Prothrombin)-N'-(Leu- Enkephalin)-Lys-NH&sub2;. Eine HPLC-Chromatogrammaufzeichnung dieses in roher Form erhaltenen und unmittelbar nach der Freisetzung von dem Harz analysierten Produkts ist in Fig. 6 dargestellt. Die Aufzeichnung entstand durch Einwirkenlassen eines linearen Gradienten, bei dem die relativen Anteile Lösung B / Lösung A während 30 min bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,0 ml/min von 1/9 bis 9/l eingestellt wurden, auf das rohe verzweigte Peptid. Eine LD-MS- Analyse des rohen verzweigten Peptids lieferte ein Masseäquivalent (MH&spplus;) von 1671,3 Dalton.
  • Benutzung der vorliegenden automatisierbaren Allylentschützungsstrategie bei der Synthese multipler antigener Peptide
  • Der Erfolg und die Einfachheit der zuvor diskutierten Synthese verzweigter Peptide veranschaulichte, daß sich die vorliegende Strategie auch gut zur Synthese von als MAPs bekannten multiplen antigenen Peptiden eignet (Tam (1988), 85 "PROC. NATL. ACAD. SCI. USA", 5409-5413; Tam et al. (1990), 171 "J. Exs. MED.", 299-306). MAPs dienen zur Herstellung von Peptidimmunogenen ohne Verwendung eines Proteinträgers, z. B. von Rinderserumalbumin, Thyroglobulin oder Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin. Statt dessen wird eine kleine verzweigte Lysinkernmatrix zur Vervielfältigung des Peptidantigens zu einer Mehrzahl von Kopien benutzt.
  • Zur Herstellung eines MAP mit einem Epitop kann nach den hierin beschriebenen Maßnahmen Boc-Lys(Boc)-OH und Fmoc- Lys(Fmoc)-OH für die Boc- bzw. Fmoc-Chemie benutzt werden. Die derzeitige Strategie zur Gewinnung von MAPs mit zwei Epitopen erfordert die Boc-Chemie, da Fmoc-Lys(Boc)-OH erforderlich ist.
  • Mit der erfindungsgemäßen Strategie läßt sich die Herstellung von MAPs mit zwei Epitopen mit Fmoc-Chemie unter Verwendung einer Kernmatrix des in Fig. 7 allgemein darge stellten Typs erreichen und automatisieren. Zur Veranschaulichung dieser Anwendungsart der vorliegenden Allylentschützungsstrategie wurde ein [Fmoc-Lys(Aloc)]&sub4;-β-Ala-PAL- PEG-PS-Kernharz hergestellt. Eine lineare Synthese von Prothrombin unter Verwendung eines Fmoc/tBu-Schutzes erfolgte in der im vorherigen Abschnitt beschriebenen Weise mit anschließender Seitenkettenentschützung der Aloc-Gruppe von Lys und linearer Verlängerung von Leu-Enkephalin von der N'-Gruppe von Lysin ausgehend. Diese Maßnahmen lieferten das gewünschte Doppelepitop-MAP.
    • Repräsentatives Beispiel
  • Die bevorzugte automatisierte Allylentschützungsstrategie der vorliegenden Erfindung wurde nach dem folgenden Protokoll, das in Verbindung mit den zuvor beschriebenen automatisierbaren Peptidsynthesemaßnahmen benutzt wurde, durchgeführt.
  • Automatisierte Entschützung: Der PepSynthesizer wurde für eine Allylentschützung entsprechend Fig. 1 ausgestaltet. Bei einer typischen Synthese wurde der Pd(PPh&sub3;)&sub4;-Katalysator (125 mg, 108 umol) in einer unter Ar verschweißten Aminosäurephiole gelagert. Die den Katalysator enthaltende Phiole wurde in dem Aminosäuremodul nach der letzten Aminosäure der Sequenz positioniert. Der Katalysator wurde in Spritze 3 (im unteren linken Teil des Synthesemoduls in Fig. 1 dargestellt) bis zu einer Endkonzentration von 0,14 M mit einer Lösung von 5% HOAc und 2,5% N-Methylmorpholin (NMM) in CHCl&sub3; in Lösung gebracht. Zum vollständigen Auflösen des Katalysators wurden 20 Durchperlcyclen durchgeführt. Die erhaltene Allylentschützungslösung wurde dem Peptidharz (500 mg, 0,3 mmol/g) zugeführt und 2 h durch die Säule umgewälzt. Danach wurde die Säule mit einer Lösung von 0,5% DIEA und 0,5% Natriumdiethyldithiocarbamat in DMF (aus der Aux-Flasche zugeführt, 10 min. 6 ml/min) und DMF (10 min. 6 ml/min) gewaschen, um den Träger für den nächsten Synthesecyclus vorzubereiten.
  • Relevante Parameter dieses repräsentativen Protokolls werden wie folgt zusammengefaßt: Tabelle 1
    • Äquivalente
  • Für den Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet ergeben sich oder eröffnen sich unter Einsatz von nicht mehr als Routineversuchen zahlreiche Äquivalente zu den speziellen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung. Diese und sämtliche anderen derartigen Äquivalente fallen unter die folgenden Patentansprüche.
    • SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATION: (i) ANMELDER
  • (A) NAME: BIOSEARCH, INC.
  • (B) STRASSE: 75 WIGGINS AVE
  • (C) STADT: BEDFORD
  • (D) STAAT: MA
  • (E) LAND: USA
  • (F) POSTLEITZAHL (ZIP): 01730
  • (G) TELEFON: 617-275-9200
  • (H) TELEFAX: 617-275-5550
  • (I) TELEX:
    • (ii)TITEL DER ERFINDUNG: AUTOMATISIERTE ALLYLENTSCHÜTZUNG BEI DER FESTPHASENSYNTHESE (iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 2 (iv)KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: HAMILTON, BROOK, SMITH & REYNOLDS, P. C.
  • (B) STRASSE: TWO MILITIA DRIVE
  • (C) STADT: LEXINGTON
  • (D) STAAT: MA
  • (E) LAND: USA
  • (F) ZIP: 02173
    • (v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, Version #1,25
    • (vi)DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER: US
  • (B) ANMELDETAG:
  • (C) KLASSIFIKATION:
    • (viii)ANWALT/AGENT-INFORMATION:
  • (A) NAME: CARROL; ALICE O
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33 542
  • (C) REFERENZ/AKTENNUMMER: MIL92-03
    • (ix)TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
  • (A) TELEFON: 617-861-6240
  • (B) TELEFAX: 617-861-9540
  • (C) TELEX: 951-794
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LANGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
    • (ii)ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii)HYPOTHETISCH: Ja (iv)ORIGINALQUELLE:
  • (C) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: SYNTHETISCHES PEPTID
    • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
  • (B)LAGE: 1
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = N- terminaler Schutz/ Bemerkung: "der N-terminale Alaninrest ist ggf. durch eine zeitweilige 9- Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe geschützt"
    • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
  • (B) LAGE: 2
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = variierender Rest/ Bemerkung: "die durch einen Alanin- (ala), Methionin-(Met) oder Tryptophan-(Trp)-Rest eingenommene Stelle"
    • (ix)MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
  • (B)LAGE: 6
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = Seitenkettenschutz/ Bemerkung: "Asparaginsäurerest mit Al- lylseitenkettenschutzgruppe"
    • (ix)MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
  • (B) LAGE: 8
  • (D) SONSTIGE INFORMATION: /Markierung = Amid Cterminal / Bemerkung: "C-terminales Amid" (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LANGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: ringförmig
    • (ii)MOLEKÜLTYP: Peptid (iii)HYPOTHETISCH: Ja (iv)URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  • (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: Synthetisches Peptid, Tachykininantagonist MEN 10355
    • (ix)MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
  • (B)LAGE: 2
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = D- Aminosäure
    • (ix) MERKMAL.
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
  • (B)LAGE: 4
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = D- Aminosäure
    • (ix) MERKMAL;
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
  • (B)LAGE: 5
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = D- Aminosäure (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Claims (37)

1. Verfahren zur Entfernung einer Allylschutzgruppe aus einem allylgeschützten Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure in folgenden Stufen:
(a) Bereitstellen eines Organopalladiumkatalysators unter inerter Atmosphäre in einem eine organische Säure und einen Akzeptor umfassenden Lösungsmittel;
(b) Kontaktieren des Katalysators mit dem allylgeschützten Aminosäurederivat;
(c) Inkubieren der allylgeschützten Aminosäure mit dem Katalysator während einer zur katalytischen Entfernung der Allylschutzgruppe von dem Aminosäurederivat ausreichenden Zeit dergestalt, daß ein allylentschütztes Aminosäurederivat erhalten wird, und
(d) Abtrennen des allylentschützten Aminosäurederivats vom Katalysator.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem löslichen Organopalladiumkatalysator um einen Organopalladium(0)-Katalysator handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem löslichen Organopalladiumkatalysator um Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem löslichen Organopalladiumkatalysator um Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) handelt und die Stufen
(a) bis (c) in einer inerten Atmosphäre durchgeführt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel aus Chloroform, Methylenchlorid oder Benzol besteht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die organische Säure aus Ameisen-, Essig- oder Propionsäure besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Akzeptor aus Dimedon, N-Methylanilin, N,N'-Dimethylbarbitursäure, Morpholin oder N-Methylmorpholin besteht.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem löslichen Organopalladiumkatalysator um Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) handelt und der lösliche Katalysator in einer inerten Atmosphäre in einem Essigsäure und N-Methylmorpholin in Chloroform umfassenden Lösungsmittel bereitgestellt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Lösungsmittel etwa 5% Essigsäure und etwa 2,5% N-Methylmorpholin in Chloroform umfaßt.
10. Verfahren zur Entfernung einer Allylschutzgruppe aus dem allylgeschützten Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure in folgenden Stufen:
(a) Bereitstellen eines löslichen Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0)-Katalysators in einem Essigsäure und N-Methylmorpholin in Chloroform umfassenden Lösungsmittel unter inerter Atmosphäre;
(b) Kontaktieren des Katalysators mit dem allylgeschützten Aminosäurederivat unter einer inerten Atmosphäre;
(c) Inkubieren des allylgeschützten Aminosäurederivats mit dem Katalysator unter einer inerten Atmosphäre während einer zur katalytischen Entfernung der Allylschutzgruppe aus dem Aminosäurederivat ausreichenden Zeit dergestalt, daß ein allylentschütztes Aminosäurederivat erhalten wird, und
(d) Abtrennen des allylentschützten Aminosäurederivats vom Katalysator.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Lösungsmittel etwa 5% Essigsäure und etwa 2,5% N-Methylmorpholin in Chloroform umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure aus einem Derivat von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin oder Valin besteht.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Nα -funktionelle Gruppe des allylgeschützten Derivats einer biologisch relevanten Aminosäure durch eine Allylgruppe geschützt ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das allylgeschützte Derivat der biologisch relevanten Aminosäure weiter durch eine tert.-Butyl-, tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, Adamantanyloxycarbonyl-, 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl-, 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)- 2-propyloxycarbonyl-, Dithiasuccinoyl-, Biphenylylisopropyloxycarbonyl-, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6- sulfonyl- oder Phenylisopropyloxycarbonylgruppe geschützt ist.
15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure aus einem Derivat von Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Methionin, Ornithin, Serin, Threonin oder Tyrosin besteht, dessen funktionelle Gruppe in der Seitenkette durch eine Allylschutzgruppe geschützt ist und dessen Nα -funktionelle Gruppe durch tert.-Butyl-, tert.- Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, Adamantanyl-oxycarbonyl-, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-, 2- (3,5-Dimethoxyphenyl)-2-propyloxycarbonyl-, Dithiasucci-noyl-, Biphenylylisopropyloxycarbonyl-, 2,2,5,7,8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl- oder Phenylisopropyloxycarbonylgruppe geschützt ist.
16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure aus einem in der Seitenkette sulfatierten, glykosylierten, phosphorylierten, iodierten, alkylierten oder lipidierten Derivat von Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Methionin, Ornithin, Serin, Threonin oder Tyrosin besteht, wobei die betreffende modifizierte Aminosäureseitenkette durch eine Allylschutzgruppe geschützt ist und wobei ferner die Nα -funktionelle Gruppe des Aminosäurederivats durch eine tert.-Butyl-, tert.- Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, Adamantanyl-oxycarbonyl-, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-, 2- (3,5-Dimethoxyphenyl)-2-propyloxycarbonyl-, Dithiasucci-noyl-, Biphenylylisopropyloxycarbonyl-, 2,2,5,7,8- Pentamethylchroman-6-sulfonyl- oder Phenylisopropyloxycarbonylgruppe geschützt ist.
17. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure an einen festen Träger gebunden ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nα -funktionelle Gruppe des allylgeschützten Derivats einer biologisch relevanten Aminosäure durch eine Allylgruppe, welche die Bindung des geschützten Aminosäurederivats an den festen Träger vermittelt, geschützt ist.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem festen Träger um einen Polyethylenglykol/Polystyrol- Pfropfcopolymerträger oder einen Polystyrolträger handelt.
20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure an einen festen Träger über einen 5-(4-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy)- valeriansäure-, 5-[(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)- aminoxanthen-2-oxy]valeriansäure- oder p-Alkoxybenzylalkohollinker oder -stiehl gebunden ist.
21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure in einem synthetisierten Peptid, welches aus miteinander über Peptidbindungen verknüpften biologisch relevanten Aminosäureresten gebildet ist, vorhanden ist.
22. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das allylgeschützte Derivat einer biologisch relevanten Aminosäure in einem synthetisierten Peptid vorhanden ist, welches aus miteinander über Peptidbindungen verknüpften biologisch relevanten Aminosäureresten gebildet ist, wobei das Peptid über einen 5-(4-(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5- dimethoxyphenoxy)valeriansäurestiehl oder -linker an einen Polyethylenglykol/Polystyrol-Pfropfcopolymerträger gebunden ist und wobei das Peptid aus biologisch relevanten Aminosäurederivaten, deren Nα - funktionelle Gruppen durch 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- oder Allylgruppen geschützt sind, gebildet wurde.
23. Verfahren zur Herstellung eines löslichen Organopalladiumkatalysators in folgenden Stufen:
(a) Bereitstellen einer festen Organopalladiumverbindung;
(b) Bereitstellen eines Lösungsmittels mit einer darin befindlichen organischen Säure und einem darin befindlichen Akzeptor;
(c) Kontaktieren des Lösungsmittels mit einer Inertgasquelle zur Schaffung inerter Bedingungen in dem Lösungsmittel;
(d) Vereinigen der festen Organopalladiumverbindung mit dem Lösungsmittel unter einer Inertgasatmosphäre zur Bildung eines Gemischs, und
(e) Inkubieren des Gemischs unter einer Inertgasatmosphäre während einer zum Auflösen der festen Organopalladiumverbindung in dem Lösungsmittel ausreichenden Zeit dergestalt, daß ein löslicher Organopalladiumkatalysator gebildet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei der Organopalladiumverbindung um eine Organopalladium(0)- Verbindung handelt.
25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei dem löslichen Organopalladiumverbindung um Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) handelt.
26. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die organische Säure aus Ameisen-, Essig- oder Propionsäure besteht.
27. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Akzeptor aus Di medon, N-Methylanilin, N,N'-Dimethylbarbitursäure, Morpholin oder N-Methylmorpholin besteht.
28. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die organische Säure aus Essigsäure und der Akzeptor aus N-Methylmorpholin bestehen.
29. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Organopalladiumverbindung aus Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0) und das Lösungsmittel aus etwa 5% Essigsäure und etwa 2,5% N-Methylmorpholin enthaltendem Chloroform bestehen.
30. Zusammensetzung, enthaltend unter einer inerten Atmosphäre eine in einem eine organische Säure und einen Akzeptor enthaltenden Lösungsmittel gelöste Organopalladiumverbindung.
31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, enthaltend eine Organopalladium(0)- Verbindung.
32. Zusammensetzung nach Anspruch 30, enthaltend Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0).
33. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das Lösungsmittel aus Chloroform, Methylenchlorid oder Benzol besteht.
34. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei die organische Säure aus Ameisen-, Essig- oder Propionsäure besteht.
35. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei der Akzeptor aus Dimedon, N-Methylanilin, N,N'-Dimethylbarbitursäure, Morpholin oder N-Methylmorpholin besteht.
36. Zusammensetzung nach Anspruch 30, enthaltend Tetrakistriphenylphosphinpalladium(0), welches unter einer inerten Atmosphäre in einem Essigsäure und N-Methylmorpholin enthaltenden Chloroformlösungsmittel gelöst ist.
37. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das Chloroformlösungsmittel etwa 5% Essigsäure und etwa 2,5% N-Methylmorpholin enthält.
DE69420307T 1993-04-05 1994-03-29 Automatisierte Allyl-Deprotektion bei der Festphasesynthese Expired - Lifetime DE69420307T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4527393A 1993-04-05 1993-04-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69420307D1 DE69420307D1 (de) 1999-10-07
DE69420307T2 true DE69420307T2 (de) 2000-01-27

Family

ID=21936946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69420307T Expired - Lifetime DE69420307T2 (de) 1993-04-05 1994-03-29 Automatisierte Allyl-Deprotektion bei der Festphasesynthese

Country Status (4)

Country Link
US (2) US5861351A (de)
EP (1) EP0623626B1 (de)
JP (1) JP3600268B2 (de)
DE (1) DE69420307T2 (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE219098T1 (de) * 1995-12-22 2002-06-15 Univ Technologies Int Wiederverwendbarer festtäger für oligonukleotid- synthese, verfahren zur herstellung davon und verfahren zur verwendung davon
US6849428B1 (en) * 1997-03-05 2005-02-01 New England Biolabs, Inc. Intein-mediated protein ligation of expressed proteins
US7135564B1 (en) * 1998-07-02 2006-11-14 University Technologies International Inc. Reusable solid support for oligonucleotide synthesis
CA2391966A1 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Protecting groups useful in the synthesis of polysaccharides, natural products, and combinatorial libraries
KR100484434B1 (ko) * 2002-05-30 2005-04-20 부산대학교 산학협력단 커피유래 3-메틸-1,2-사이클로펜탄다이온을 유효성분으로 하는 항산화제 및 항노화제
US20040082783A1 (en) * 2002-08-06 2004-04-29 Schafmeister Christian E. Bis (amino acid) molecular scaffolds
EP1701976A2 (de) * 2003-12-31 2006-09-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Peptidsynthese und entschützung mit cosolvenz
GB2457402B (en) * 2006-12-01 2011-10-19 Univ Columbia Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
KR20210004980A (ko) * 2018-05-04 2021-01-13 폴리펩티드 라보라토아르 프랑스 재순환 루프를 갖는 자동화된 합성 반응기 시스템

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4314942A (en) * 1979-01-10 1982-02-09 Schering Corporation Deprotection of allylic esters, carbonates and carbamates catalyzed by palladium compounds
US4870199A (en) * 1986-04-30 1989-09-26 Sandoz Pharm. Corp. Processes for the synthesis of diprotected R[R*,S*]-3,5-dihydroxy-6-oxohexanoate esters
DE3803545A1 (de) * 1987-06-19 1988-12-29 Orpegen Med Molekularbioforsch Allylische seitenketten enthaltendes festphasensystem, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung in festphasenreaktionen
US5124448A (en) * 1989-02-23 1992-06-23 Merck & Co., Inc. Deblocking process for allyl esters with regeneratable polymer supported Pd(O)
US5384309A (en) * 1989-07-17 1995-01-24 Genentech, Inc. Cyclized peptides and their use as platelet aggregation inhibitors
DE3938850A1 (de) * 1989-08-31 1991-03-07 Orpegen Med Molekularbioforsch Neue allylester und ihre verwendung zum aufbau von festphasensystemen fuer festphasenreaktionen
FR2675804B1 (fr) * 1991-04-25 1995-04-07 Propeptide Sa Procede de synthese de peptides, nouveaux derives d'acides amines mis en óoeuvre dans ce procede et leurs procedes de preparation.
EP0518295A3 (en) * 1991-06-14 1993-09-01 Millipore Corporation Allyl side chain protection in peptide synthesis

Also Published As

Publication number Publication date
DE69420307D1 (de) 1999-10-07
EP0623626A1 (de) 1994-11-09
US5777077A (en) 1998-07-07
EP0623626B1 (de) 1999-09-01
US5861351A (en) 1999-01-19
JPH0753588A (ja) 1995-02-28
JP3600268B2 (ja) 2004-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69430312T2 (de) Peralkylierte oligopeptidmischungen
DE69434998T2 (de) Topologisch getrennte, kodierende Festphasen-Bibliotheken
DE68929045T2 (de) Verfahren zur herstellung und auswahl von peptiden mit spezifischen eigenschaften
DE69130831T2 (de) Synthese äquimolarer mischungen vielzähliger oligomere, speziell oligopeptidmischungen
Kates et al. Automated allyl cleavage for continuous-flow synthesis of cyclic and branched peptides
DE69435011T2 (de) Selektiv spaltbare Linker, die auf einer Methionin- und einer Estergruppe basieren
DE69521815T2 (de) Proteinsynthese mittels nativer chemischer ligation (07.01.97)
DE3788910T2 (de) Methode für die Synthese eines Peptides, das eine nicht peptidartige Bindung enthält.
DE60017955T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen zur peptidsynthese
Loffet et al. Allyl‐based groups for side‐chain protection of amino‐acids
Mahto et al. A reversible protection strategy to improve Fmoc‐SPPS of peptide thioesters by the N‐acylurea approach
DE69222091T2 (de) Peptid-Synthese an fester Phase
DE69420307T2 (de) Automatisierte Allyl-Deprotektion bei der Festphasesynthese
DE69926061T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen zur peptidsynthese (t-20)
DE69225597T2 (de) Peptide mit einer lanthionin-brücke
DE69628194T2 (de) Verfahren zum nachweis von verbindungen die bestimmte zielmoleküle binden
DE69426885T2 (de) Linear substituierte oligoalkylenimin-bibliotheken
DE69423753T2 (de) Polyoximverbindungen und deren herstellung
DE2659758A1 (de) Carba-derivate von somatostatin, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel
DE60124376T2 (de) Funktionalisierter festträger zur organischen synthese von peptiden und kleinen molekülen
DE69218193T2 (de) Verfahren zur Synthese von Peptiden, Derivate von Aminosäuren zur Verwendung bei dem obengenannten Verfahren und Methoden zu deren Herstellung.
Xue et al. A covalently constrained congener of the Saccharomyces cerevisiae tridecapeptide mating pheromone is an agonist
DE69133186T2 (de) Isolierte Metallopeptide, Zusammensetzungen und Methoden zur Synthese
WO1992022566A1 (de) Geschützter aminosäurebaustein, herstellung und verwendung
EP0518295A2 (de) Allylseitenkettenschütz in Peptidsynthese

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: APPLIED BIOSYSTEMS, LLC (N. D. GES. D. STAATES, US