DE69216498T2

DE69216498T2 - Fluoreszierendes Etikett

Info

Publication number: DE69216498T2
Application number: DE69216498T
Authority: DE
Inventors: Nanibhushan Dattagupta; Juergen Dr Koecher
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1991-08-13
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 1997-04-30
Anticipated expiration: 2012-08-07
Also published as: EP0527433A1; ATE147400T1; DE69216498D1; EP0527433B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine neue Fluoreszenzmarkierungs- Verbindung, die enzymatisch in eine Nukleinsäure eingebaut werden kann. Die markierte Nukleinsäure kann zum Nachweis auf Vorliegen einer DNA- oder RNA-Squenz von Interesse in einer Probennukleinsäure verwendet werden.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Die Technik der Hybridisierung eines markierten Oligonukleotids an eine Proben DNA fur einen sequenzspezifischen Nukleinsäurenachweis wurde ein machtvolles Werkzeug in der analytischen Molekularbiologie. Ursprünglich erfolgte das Markieren hauptsächlich mit radioaktiven Isotopen. Jedoch haben radioaktiv markierte Sonden typischerweise den Nachteil der Instabilität, niedrigen Auflösung und alle übrigen Nachteile der Handhabung von Radioisotopen. Um das Markieren mit radioaktiven Isotopen zu umgehen, wurde in jüngster Zeit eine Vielzahl von Verfahren für die nicht-radioaktive Markierung und Nachweis entwickelt.
Zum Beispiel beschreiben K. Mühlegger et al "Synthesis and Use of New Digoxigenin-Labeled Nudeotides in Non-Radioaktive Labeling and Detection of Nucleic Acids", Nucleosides & Nucleotides, 8 (5 & 6), Seiten 1161-1163 (1989) die chemische Synthese und den Einbau in die DNA von neuen Digoxigeninabgeleiteten 5-Aminoallyl-2'-deoxyuridin-5-triphosphaten. Die Hybridisierung und anschließender Nachweis durch ELISA- Technik erlaubt den Nachweis homologer DNA bis hinab zu 0,1 pg.
Hans-Joachim Höltke et al, "Non-Radioactive Labeling of RNA Transcripts In Vitro with the Hapten Digoxigenin (DIG); Hybridization and ELISA-Based Detectionlt, Nucleic Acids Research, 18 (19) ,Seiten 5843-5851 (1990), beschreiben ein Alternativverfahren zur Markierung von Nukleinsäuresonden mit dem Cardenolid Digoxigenin. Jedoch erfordert der Nachweis von Digoxigenin in nachteiliger Weise ein Sekundärreagenz, wie einen an ein Enzym verknüpften Antikörper.
EP-A2-63879 beschreibt chemisch stabile neue Nukleotidderivate, die Biotin, Imino-Biotin, Lipomsäure und andere Determinante enthalten, die covalent an den Pyrimidinoder Purinring geknüpft sind, und deren Biosynthese. Diese Verbindungen reagieren spezifisch und ausschließlich mit Proteinen, wie Avidin oder Antikörpern. Dies kann für den Nachweis und die Lokalisierung von Nukleinsäurekomponenten nutzbar gemacht werden.
US-Patent Nr. 4,617,261 offenbart nicht-radioaktive Markierungsreagenzien aus einer alkylierenden Interkalationseinheit, wie z.B. eine Psoraleneinheit, einen divalenten Linker und eine monovalente Markierungseinheit, wie Biotin. Diese Reagenzien werden zur Markierung von Nukleinsäuren verwendet.
Schließlich beschreiben Dirks et al, Experimental Cell Research, 194, Seiten 310-315 (1991), die Verwendung von Fluoreszein-, Digoxigenin- und Biotin-(di)deoxyxtps und Terminale Deoxynukleotidyl-Transferase für die Markierung im kleinen Umfang von synthetischen Oligonukleotiden zur Verwendung als Sonden bei dem in situ-Nachweis von multiplen RNA-Sequenzen. Offensichtlich vertreibt Boehringer Mannheim Fluoreszein-12dUTP für diesen Zweck. Siehe BM Biochemica, 8 (5), Seite 15 (September 1991).
Trotz dieser bekannten Verfahren besteht immer noch ein Bedürfnis nach Markierung für Nukleinsäuren, die leicht zu erhalten sind, einfach in die Nukleinsäuresonden einzubauen sind, und einfach nachzuweisen sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zur Befriedigung dieses Bedürfnisses wurde nun eine neue Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung mit der Formel
A - B¹ - B² - B³ - C
entwickelt, worin
A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids oder Nukleosids oder ein Derivat davon bedeutet;
B¹ bedeutet ein divalentes Spacer-Radikal oder eine Einfachbindung;
B² bedeutet ein divalentes Spacer-Radikal;
B³ bedeutet ein divalentes Spacer-Radikal oder eine Einfachbindung; und
c bedeutet ein Cumarinradikal mit der Formel
worin
R¹ Wasserstoff oder Cyano bedeutet;
R² bedeutet Phenyl oder Thiazolyl, gebunden an der 2-, 4- oder 5-Position, worin das Phenyl unsubstituiert oder durch Nitro, Cyano, Amino, -NH-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH&sub2;, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH-, (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-CH&sub3;, Carboxy, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxycarbonyl, C&sub1; &sub4;-Alkoxycarbonyloxy, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylaminocarbonyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylcarbonylamino substituiert ist, und entweder weiter unsubstituiert oder mit C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, Fluor, Chlor oder Brom substituiert ist, und worin das Thiazolyl unsubstituiert oder mit Chlor, Cyano, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxycarbonyl monosubstituiert oder disubstituiert ist, oder das Thiazolyl ist an der 4- und 5-Position mit einem Benzolring fusioniert, der entweder unsubstituiert oder mit Carboxyl, Amino oder Hydroxyl substituiert ist;
R³ bedeutet Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxycarbonyl-C&sub1;&submin;&sub4;-alkyl oder Phenylsulphonyl, worin das C&sub1;&submin; &sub4;-Alkyl unsubstituiert oder durch Hydroxyl, Amino, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxycarbonyl substituiert ist, und worin das Phenylsulphonyl unsubstituiert oder durch Chlor, Brom oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl monosubstituiert oder disubstituiert ist;
wobei es auch möglich ist, daß einer der Radikale R² oder R³ eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, ein Hydroxyl, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxycarbonyl bedeutet, oder damit substituiert ist, oder in eine solche Gruppe der Hydrolyse oder Hydrierung umgewandelt werden kann.
Da die neue Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids oder Nukleosids oder eines Derivats davon enthält, kann die neue Fluoreszenzmarkierung leicht enzymatisch in Nukleinsäuren unter Verwendung von Enzymen, wie einer Terminalen Transferase und DNA- und RNA-Polymerasen eingebaut werden. (Die Verwendung von DNA- oder RNA-Polymerasen erfordert im allgemeinen einen Primer und eine Matrize nach konventionellen Verfahren.) Da ferner die neue Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung ebenfalls einen Cumarin- Fluoreszenzfarbstoffrest umfaßt, fluoresziert die neue Fluoreszenzmarkierung, wodurch ein visuelles Signal ausgelöst wird, das auf das Vorliegen einer Nukleinsäure-Sequenz von Interesse in einer Nukleinsäureprobe hinweist.
Die Erfindung umfaßt daher einen Test auf die Anwesenheit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz in einer Probe, wobei die Probe einer Markierungssonde unter hybridisierenden Bedingungen unterworfen wird, und die Probe anschließend auf das Hybridisierungsprodukt getestet wird, wobei die Verbesserung darin besteht, daß die Sonde mit der neuen Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung markiert ist.
Die Erfindung umfaßt ferner ein diagnostisches Testkit zur Verwendung beim Nachweis der bestimmten Nukleinsäure-Sequenz in einer Probe, wobei das Kit die neue Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung umfaßt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der neuen Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung mit der zuvor erwähnten Formel bedeutet der Rest A vorzugsweise den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids, ausgewählt aus AMP, ADP; ATP; GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2me AMP, 2me ADP, 2me ATP, 1Me GMP, 1Me GDP, 1Me GTP, 5Me CMP, 5Me CDP, 5Me CTP, 5MeO CMP, 5MeO CDP, 5MeO CTP, Deoxy-, Dideoxy-Nukleotide davon und andere Derivate davon.
B¹, B² und B³ bedeuten vorzugsweise unabhangig oder zusammen eine Spacer-Kette von bis zu 50 Atomen, ausgewählt aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, wobei es auch für B¹ oder B³ möglich ist, daß sie eine Einfachbindung darstellen. Insbesondere bedeuten B¹, B² und B³ unabhängig voneinander oder zusammen eine Spacer- Kette von ca. 2 - 20 Atomen, ausgewählt aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, wobei es auch möglich ist, daß B¹ oder B³ eine Einfachbindung bedeuten.
Zum Beispiel hat ein solches Spacer eine Kettenlänge zwischen den Radikalen A und C von bis zu 50 Atomen, wobei die Möglichkeit von Verzweigungen nicht eingerechnet wurde. Solche Spacer können polyfunktionale Peptidradikale; Kohlenwasserstoff wie ein Alkylen, ein Alkenylen, ein Alkynylen, ein Arylen und substituierte Derivate davon; Polyalkohol; Polyalkoxid; Polyether; Polyamin; Polyimin; Kohlenhydrat; -C=CH-CH&sub2; -NH-;
-Glycyl-Glycyl-Glycyl-; -NH (CH&sub2;) &sub5;-CO-; das Sperminradikal; das Spermidinradikal; -NH- (CH&sub2;) 6-NH-; oder -NH-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-;
-CH=CH-CH&sub2;-NH-CO-(CH&sub2;)&sub5;-NH-CO-(CH&sub2;)&sub3;
-NH-(CH&sub2;)&sub6;-NH-CO-(CH&sub2;Y&sub5;-NH-CO-(CH&sub2;)&sub3;-.
Das Cumarinradikal ist vorzugsweise aus solchen mit der obenerwähnten Formel ausgewählt, worin R² Phenyl oder Thiazolyl, gebunden in der 2-, 4- oder 5-Position, bedeutet, worin Phenyl unsubstituiert oder durch Carboxyl, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkylcarbonyloxy, Amino, -NH-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH&sub2;- C&sub1;&submin;&sub4;- Alkyl, Cyano, Fluor, Chor oder Brom substituiert ist, und worin Thiazolyl unsubstituiert oder durch Chlor, Cyano oder Carboxyl substituiert ist, oder das Thiazolyl ist an der 4bis 5-Position mit einem Benzolring fusioniert, der entweder unsubstituiert oder durch Carboxyl oder Amino substituiert ist; R³ bedeutet Wasserstoff, Methyl, Ethyl, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-OH, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH&sub2; oder -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-COOH; wobei es ebenfalls möglich ist, daß einer der Radikale R² und R³ eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, ein Hydroxyl, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub2;- Alkoxycarbonyl bedeutet, oder damit substituiert ist.
Besonders bevorzugt sind Cumarinradikale mit der oben erwähnten Formel, worin R² Phenyl oder Thiazolyl, gebunden in der 2-Position, bedeutet, worin Phenyl unsubstiuiert oder durch para-Carboxyl, para-Amino, para-NH-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, para- CH&sub2;-NH&sub2;, Cyano, Methyl oder Ethyl substituiert ist, und worin Thiazolyl unsubstituiert oder durch Chlor, Cyano oder Carboxyl substituiert ist, oder das Thiazolyl an der 4- und 5-Position mit einem Benzolring fusioniert ist, der entweder unsubstituiert oder durch Carboxyl oder Amino substituiert ist; wobei es ebenfalls möglich ist, daß einer der Radikale R² und R³ eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, Hydroxyl oder Carboxyl bedeutet, oder dadurch substituiert ist.
Bevorzugt ist die Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung beispielsweise eine Verbindung mit der Formel:
oder die Verbindung mit der Formel
Die neue Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung kann hergestellt werden durch eine Vielzahl gutbekannter Herstellungsverfahren. Im allgemeinen wird sie aus einer Cumarinfarbstoffkomponente und der Nukleotid- oder Nukleosidkomponente aufgebaut, wovon beide eine derivatisierbare Stelle besitzen. Die derivatisierbaren Stellen auf den beiden Komponenten werden dann chemisch mit dem Spacer verknüpft.
Beispielsweise können die neuen Fluoreszenzmarkierungs- Verbindungen gemäß der Erfindung wie folgt hergestellt werden:
(1) Umsetzen einer Verbindung der Formel A-Z mit einer Verbindung der Formel L-B¹¹-M unter Bildung von A-B¹-H, worin Z z.B. Wasserstoff oder Brom bedeutet, L bedeutet eine reaktive Doppelbindung oder eine Aminogruppe, M bedeutet eine Aminogruppe. Daserhaltene Produkt hat die Formel A-C=C-B¹¹-NR-H oder A-NR-B¹¹-NR-H, worin R Wasserstoff, Alkyl oder Phenyl bedeutet, und die Einheiten -C= C-B¹¹-NHR- und
-NHR-B¹¹-NHR- für B¹ stehen, oder
(2) falls B¹ eine Einfachbindung ist, Umsetzen der Verbindung A-Z mit einer Verbindung der Formel V-B²²-W unter Bildung von A-B¹-B²-H, worin V -COOR bedeutet, R bedeutet C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl und W bedeutet z.B. Amino. In diesem Fall hat das erhaltene Produkt die Formel A-CO-B²²-NR-H, worin R Wasserstoff, Alkyl oder Phenyl bedeutet, und die Einheit -CO-B²²-NR- bedeutet die Kombination -B¹-B²-; dann
(3) falls B³ keine Einfachbindung ist, Umsetzen einer Verbindung der Formel C-Q mit einer Verbindung der Formel X- B³³-Y unter Bildung von C-B³-OR, worin Q z.B. Wasserstoff bedeutet, X bedeutet COR', R' bedeutet C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl und Y bedeutet Halogen, z.B. Brom. In diesem Fall hat das erhaltene Produkt die Formel C-B³³-COOR, wobei die Einheit -B³³-CO- B³ bildet; dann
(4) Umsetzen des Produkts aus Schritt (1) mit V-B²²-W und dann mit dem Produkt aus Schritt (3), oder, falls B³ eine Einfachbindung ist, mit C-Q; oder
(5) Umsetzen des Produkts aus Schritt (2) mit dem Produkt aus Schritt (3), oder, falls B³ eine Einfachbindung ist, mit
Siehe z.B. P.R. Langer et al, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 78, 6633 (1981); DE 4,026,613; und H. Heitzmann und F.M. Richards, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 71, Seite 3537 (1974).
Die Cumarinverbindungen der Formel C-Q können hergestellt werden durch
(a) Umsetzen eines m-Aminophenols der Formel
worin R³ und Q die obigen Bedeutungen haben, mit einem Formylessigsäurederivat der Formel
worin R² die obige Bedeutung hat und R&sup5; Cyano, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxycarbonyl oder Carboxyl bedeutet;
mit der Maßgabe, daß, wenn R&sup5; CN, zunächst ein Iminoderivat der Formel
gebildet wird, und dieses Iminoderivat unter Eliminierung der Iminogruppe hydrolysiert wird, oder
(b) Umsetzen eines Salicylaldehyds der Formel
worin R³ und Q die obigen Bedeutungen haben, mit einem Essigsäurederivat der Formel
worin R² die obige Bedeutung hat und R&sup6; Cyano, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxycarbonyl oder Carboxyl bedeutet;
mit der Maßgabe, daß wenn R&sup6; = CN ist, zunächst ein Iminoderivat der Formel
gebildet wird, und dieses Iminoderivat unter Eliminierung der Iminogruppe hydrolysiert wird; oder
(c) in Fall, wo R¹ Cyano bedeutet, wird das Zwischenprodukt oder das Produkt in (a) und (b) mit Cyanidionen unter Erhalt des Imino-Cyano-Intermediats der Formel
oder des Cyano-Intermediats der Formel
umgesetzt, worin jeweils R², R³ und Q die obigen Bedeutungen haben, und dieses Intermediat wird zum Cyanocumarinderivat oxidiert und wahlweise zusätzlich hydrolysiert.
Einzelheiten der Verfahrensparameter zur Herstellung der Cumarinausgangsmaterialien sind in Einzelheiten in U.S. Ser.No. 07/610,864 wiedergegeben, dessen Offenbarung durch Bezugnahme hiermit aufgenommen ist.
Die Ausgangsmaterialien L-B¹¹-M, V-B²²-W und X-B³³-Y sind gut bekannte Produkte.
Die Ausgangsmaterialien A-Z sind dem Fachmann gut bekannt und handelsüblich erhältlich.
Die erfindungsgemäßen neuen Fluoreszenzmarkierungs- Verbindungen können in Nukleinsäuren unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, eingebaut werden. Falls erwünscht, kann z.B. die neue Fluoreszenzmarkierungs -Verbindung in eine Nukleinsäure Sequenz eingebaut werden, indem man die Sondensequenz der neuen Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung in Gegenwart einer Terminalen Transferase aussetzt. Die neue Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung sollte hierdurch am Ende der dann existierenden Nukleinsäuresonden-Sequenz ohne das Erfordernis einer Matrize eingebaut werden.
Solch eine markierte Nukleinsäuresonde kann zum Nachweis auf Vorliegen einer Nukleinsäure-Sequenz von Interesse in einer Nukleinsäureprobe verwendet werden. Die markiert Nukleinsäure ist für alle konventionellen Hybridisierungstest-Formate und im allgemeinen für jedes Format, das möglicherweise auf die Bildung eines Hybridisierungsprodukts oder -aggregats, welches die markierte Nukleinsäure enthält, anwendbar. Solche Formate sind dem Fachmann gut bekannt.
Wie andere Cumarinfarbstoffe sind die neuen erfindunsgemäßen Fluoreszenzmarkierungs-Verbindungen starke Farbstoffe und besitzen hervorragende lichtaussendende Eigenschaften. Als solche können die Nukleinsäuren, die mit der neuen erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung markiert sind, im allgemeinen visuell und in niedriger Konzentration nachgewiesen werden.
Die Erfindung wird nun unter Bezuguahme auf die folgenden nicht- limitierenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: Herstellung der Verbindung 3

Verbindung 2

wurde hergestellt durch Umwandeln der entsprechenden Carboxylsäure 1
durch bekannte Verfahren, wie es bereits für die Aktivierung von Biotin beschrieben ist, siehe z.B. H. Heitzmann und F.M. Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3537 (1974). Die Carbonsäure und ihre Herstellung wurde in der Patentanmeldung DE 4026613 beschrieben.
Eine Lösung von 500 mg 6-Aminocapronsäure (3,45 x 10&supmin;³ mol) in 3 ml H&sub2;O, eingestellt auf einen pH 9 mit 0,1 m Na&sub2;CO&sub3;, wird zu einer Lösung von 50 mg der Verbindung 2 (10&supmin;&sup4; mol) in 50 ml DMF bei Raumtemperatur zugegeben. Es präzipitiert sofort ein gelbes Material. Die Reaktionsmischung wird 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dünnschichtchromatografie (TLC) zeigt, daß die erwünschte Reaktion aufgetreten ist (Toluol/Methanol 5:4, Silicagel).
Verbindung 1: rf (Retentionsfaktor) 0,90
Verbindung 1 nach Hydrolyse des NHS-Esters: rf = 0,29 neues Produkt Verbindung 3: Rf -0,25
Die Reaktionsmischung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft und 15 ml H&sub2;O werden zum zurückbleibenden gelben Rückstand zugegeben. Die gebildete Suspension wird auf einen pH = 1 mit 8 N HCl eingestellt und zentrifugiert. Der Überstand, der beinahe farblos ist, wird entfernt, und weitere 15 ml H&sub2;O werden zugegeben, um das Präzipitat zu resuspendieren. Die Suspension wird zentrifugiert und der überstand entfernt. Nach sorgfältiger Vakuumtrocknung des Präzipitats ist die Ausbeute der Verbindung 3 mit der Formel
43 mg (83 %).

Beispiel 2: Herstellung der Verbindung 6

15,8 mg der Verbindung 3 (3 x 10&supmin;&sup5; mol) und 5 mg N- Hydroxysuccinimid (5,05 x 10&supmin;&sup5; mol) werden in 3 ml DMF gelöst. Zu dieser Lösung werden 10,7 mg Dicyclohexylcarbodiimid (5,19 x 10&supmin;&sup5; mol), gelöst in 2 ml DMF, zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur ca. 7 Stunden gerührt, es werden weitere 27 mg festes N- Hydroxysuccinimid (2,7 x 10&supmin;&sup4; mol) und 53 mg festes Dicyclohexylcarbodiimid (2,57 x 10&supmin;&sup4; mol) zur Reaktionslösung zugegeben. Nach Rühren für weitere 17 Stunden wurde der Großteil der Carbonsäure 3 in den N-Hydroxysuccinimidester 4 mit der Formel
nach TLC (Toluol/Methanol 5 : 4, Silicagel, rf der neuen Verbindung 4 = 0,83) umgewandelt.
Eine Lösung von 4,9 mg 5-Allylamino-dUTP (Verbindung 5 mit der Formel
8 x 10&supmin;&sup6; mol), die entsprechend P.R. Langer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6633 (1981), hergestellt wird, wird in 7 ml H&sub2;O auf einen pH von 9,4 mit 0,1 M Na&sub2;CO&sub3; eingestellt. Die die aktivierte Verbindung 4 (siehe oben) enthaltende Mischung wird zu 5-Allylamino-dUTP-Lösung bei Raumtemperatur zugegeben. Es prazipitiert sofort ein gelbes Material. TLC kann das neue fluoreszierende Nukleotid (t-BuOH 3,5/Aceton 2,5/konz. NH&sub3;/1,5 HOAc 1,5/H&sub2;O 1, Cellulose, Rf= 0,72) nachweisen.
Die Suspension wird 4,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Anschließende Chromatografie des Rückstands auf einer Sephadex G 10-Säule (Pharmacia) mit H&sub2;O als Eluent ergibt 1,4 mg der Verbindung 6 (16 %) mit der Formel

Beispiel 3: Einbau der Verbindung 6 in ein 18mer Oligonukleotid durch das Enzym Terminale Deoxynukleotidyl -Transferase

Das fluoreszierende Nukleotid 6 wird in ein 18mer Oligonukleotid (Sequenz: CTC TAT TGA TTA CCA TGA) durch die Terminale Deoxynukleotidyl-Transferase (Boehringer Mannheim) wie folgt eingebaut:
5,9 µg 18mer Oligonukleotid (synthetisiert in einem Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) automatisierten Oligonukleotid-Synthesizer unter Verwendung ihrer Reagenzien) und 140 µg Verbindung 6 wurden in einem Reaktionspuffer, der 140 mmol/l K-Cacodylat, 30 mmol/l Tris-Puffer pH 7,6, 1 mmol/l CoCl&sub2; und 0,1 mmol/l Dithiothreitol (DTT) (Gesamtvolumen 50 µl) enthielt, gelöst. Der enzymatische Einbau erfolgte durch Zugabe von 21 Einheiten Terminaler Deoxynukleotidyl-Transferase und Inkubation für 19 Stunden bei 37ºC.
20 % denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (57 V/cm, 1 Stunde, Puffer: 90 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA, pH 8, bei Raumtemperatur) zeigte eine fluoreszierende DNA-Bande, die bereits visuell nachgewiesen werden konnte.
Elektrophorese derselben Kontrollmischung ohne Inkubation bei 37ºC führt zu keiner nachweisbaren fluoreszierenden DNA. Dies weist daraufhin, daß das neue Fluoreszenz-Nukleotid 6 covalent in das Oligonukleotid eingebaut wird und nicht nur nicht-spezifisch daran gebunden ist.
Ethidiumbromid-Färbung weist ebenso daraufhin, daß eine Verlängerung des Oligonukleotids aufgetreten ist.

Beispiel 4: Einbau der Verbindung 6 in ein Hairpin- Oligonukleotid durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase

5 µl 5 x Reaktionspuffer (enthaltend GSO mmol/l Kaliumphosphat pH = 7,4, 32,5 mmol/l MgCl&sub2;, 5 mmol/l DTT und 160 µg/ml RSA) und 5 µl einer 5 x Nukleosidtriphosphatmischung (enthaltend 2,5 mmol/l dATP, dCTP, dGTP und das fluoreszierende Nukleotid 6 anstelle von dTTP) werden mit 2 µg eines 6gmer Hairpin-Oligonukleotids (Sequenz:
AGATTTTCTAGATTTCATCTTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTTTAATACGACT CACTATAG, Synthese wie in Beispiel 3) beschrieben, und 5,5 Einheiten Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (Gesamtvolumen 25 µl) zusammengegeben. Die Mischung wird 50 Minuten bei 35ºC inkubiert. 20%ige denaturierende Polyacrylamidgel- Elektrophorese (experimentelle Bedingungen siehe Beispiel 3) der Reaktionsmischung weist daraufhin, daß der Einbau des Fluoreszenz-Nukleotids 6 erfolgt ist, da eine fluoreszierende DNA-Bande sichtbar ist. Die Gelelektrophorese der gleichen Mischung jedoch ohne Enzym führt zu keiner fluoreszierenden Bande. Dies weist daraufhin, daß das fluoreszierende Nukleotid 6 covalent in die DNA eingebaut und nicht spezifisch daran gebunden ist.

Beispiel 5: Fluoreszierende Nukleotide (Vergleich)

Die folgenden Kombinationen verschiedener Nukleosid- Triphosphate und Fluoreszenzfarbstoffe wurden synthetisiert. - Fluoreszein, angeheftet an 5-Allylamino-dUTP (Verbindung 7) - Fluorescaminderivat, angeheftet an 5-Allylamino-dUTP (Verbindung 8)
-Fluorescaminderivat, angeheftet an 8-6-Aminohexylamino) dATP (Verbindung 9)

COOH

NH&sub2;
-Fluorescaminderivat, angeheftet an 8-(6-Aminohexylamino)-dATP (Verbindung 10)
- Fluorescaminderivat, angeheftet an 8-(6-Aminohexylamino)-ATP (Verbindung 11)
Fluorescamin wurde von Aldrich (Milwaukee, WI) NHS- Fluorescein (5- und 6-Isomermischung) von Molecular Probes (Eugene, OR) und 8-(6-Aminohexylamino)-ATP von Sigma (St. Louis, MO) erworben.
5-Allylamino-dUTP wird wie oben beschrieben erhalten, und 8- (6-Aminohexylamino)-dATP wird nach einem Verfahren, veröffentlicht von C.-Y. Lee et al, Arch. Biochem. Biophys. 178, 8 (1977) synthetisiert. Die Kopplung der Aminogruppenhaltigen Nukleotide an Fluorescamin (20-facher Überschuß im Vergleich zu Nukleotid) erfolgt in einer Mischung von Aceton und 9,1 M Na&sub2;CO&sub3; pH 10 bei Raumtemperatur. Nach Bestatigung durch TLC, daß die Reaktion abgeschlossen ist, wird die Reaktionsmischung unter Vakuum zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wird auf Sephadex G 10 (Pharmacia) mit Wasser als Eluent chromatografiert.
Die Kopplung von NHS-Fluorescein an Nukleotide erfolgt in Na&sub2;CO&sub3;-Lösung (pH 9 - 9,5). Die Reinigung erfolgt auf die gleiche Weise, wie für die Fluorescamin-Konjugate beschrieben.
Die in Beispiel 3 beschriebenen Experimente werden mit den oben erwähnten fluoreszierenden Nukleotiden wiederholt. Die Ergebnisse der Experimente mit diesen Nukleotiden 7 - 11 geben keinen Hinweis auf den Einbau der Fluoreszenz-Einheit in ein Oligonukleotid durch die Terminale Deoxynukleotidyl- Transferase, wie es für das fluoreszierende Nukleotid 6 in Beispiel 3 beschrieben ist.
Unter den gleichen Bedingungen kann 5-Allylamino-dUTP 5- bis 10-fach eingebaut werden, und 8-(6-Aminohexylamino)- ATP ist 1- bis 2-fach in ein Oligonukleotid einbaubar.
Das Experiment mit Verbindung 7 wurde unter Einsatz verschiedener Konzentrationen noch einmal untersucht. Es wurde gefunden, daß diese Verbindung für die Terminale Deoxynukleotidyl-Transferase ebenfalls akzeptabel ist und in ein einzelsträngiges Oligonukleotid, wie in Beispiel 3 beschrieben, eingebaut werden kann. Wichtig für ein erfolgreiches Experiment ist die richtige Konzentration der Verbindung 7 in der Reaktionsmischung. Es konnte gezeigt werden, daß die Einbaurate höher bei relativ niedrigen Konzentrationen (kleiner als 0,5 mmol/l) ist, wogegen höhere Konzentration des Nukleotids 7 zu einer Abnahme oder einem nicht-nachweisbaren Einbau führen.

Beispiel 6: Verwendung des Produkts des Beispiels 4 für die Hybridisierung

Das in Beispiel 4 beschriebene Oligonukleotid kann eine partielle doppelsträngige Struktur vor Einbau eines fluoreszierenden dNTPS führen. Der einzelstrangige Teil des Moleküls ist eine spezifische Sequenz eines äußeren Membranhauptproteins von Chlamydia trachomitis.
Die genomische DNA-Probe aus Chlamydia trachomitis wird in 0,5 M NaOH denaturiert und auf einen Streifen Nitrocellulosepapier (Schleicher & Schuell, Inc. Keene, NH, USA) aufgetragen. Das Papier wird dann in eine wäßrige Lösung von 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 1,5 M NaCl, eingetaucht und gespült. Dann wird das Papier im Vakuumofen 4 Stunden bei 80ºC getrocknet. Dann wird das Papier mit dem Produkt aus Beispiel 4 nach einer Prozedur, beschrieben von Dattagupta et al, Analytical Biochemistry, 177, 85 (1989) prähybridisiert. Nach Hybridisierung wird die Fluoreszenz entweder visuell unter Verwendung einer Handlampe oder in ähnlicher Weise wie Polyacrylamid-Gele fotografiert. Das Auftreten von Fluoreszenz beim Proben-DNA-Spot ist ein Hinweis auf positive Ergebnisse.

Beispiel 7: Herstellung der Verbindung 13

11,6 mg der Verbindung 3 (2,2 x 10&supmin;&sup5;mol), 22,6 mg 1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidmethiodid (7,6 x 10&supmin;&sup5; mol) und 16,2 mg N-Hydroxysulfosuccinimid (Natriumsalz, 7,5 x 10&supmin;&sup5; mol) in 1 ml DMF werden auf 50ºC 7,5 Stunden erhitzt. Nach TLC (Toluol/Ethanol 5:4, Silicagel) wurde der Großteil der Carbonsäure 3 in den N-Hydroxysulfosuccinimidester 12 mit der Formel
umgewandelt.
Die Reaktionsmischung wird auf Raumtemperatur gekühlt, und eine Lösung von 8 - (6 -Aminohexyl) aminoadenosin-5'-triphosphat (Lisalz, Sigma, 10&supmin;&sup5; mol) in 100 µl H&sub2;O und 20 µl Pyridin (2,5 x 10&supmin;&sup4; mol) werden zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht sind nur Spuren einer neuen Verbindung nachweisbar. Diese Mischung wird dann 3 Stunden ultraschallbehandelt, es werden 2 mg 4-Dimethylaminopyridin (1,6 x 10&supmin;&sup5;) zugegeben, und die Mischung wird weitere 5 Stunden ultraschallbehandelt. Nach TLC (t-BuOH 3,5/Aceton 2,5/konz. NH&sub3; 1,5/HOAc1,5/H&sub2;O 1, Cellulose, rf = 0,72) ist nun ein neues Produkt einfach nachweisbar. Die Reaktionsmischung wird unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Die Chromatografie des Rückstands (3mal) auf einer Sephadex G 10-Säule (Pharmacia) mit Wasser als Eluent ergibt 3,5 mg der Verbindung 13 (29 %) mit der Formel

Beispiel 8: Einbau der Verbindung 13 in ein 18mer Oligonukleotid durch das Enzym Terminale Deoxynukleotidyl-Transferase

Das fluoreszierende Ribonukleotid 13 wird in ein 18mer Oligonukleotid (Sequenz: CTC TAT TGA TTA CCA TGA) durch die Terminale Deoxynukleotidyl-Transferase (Pharmacia) wie folgt eingebaut:
1,8 µg 18mer Oligonukleotid (synthetisiert in einem automatisierten Oligonukleotid-Synthesizer von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) unter Verwendung ihrer Reagenzien) und 2,5 µg Verbindung 13 wurden in einem Reaktionspuffer mit 140 mmol/l K-Cacodylat, 30 mmol/l Tris- Puffer pH 7,6, 1 mmol/l CoCl&sub2; und 0,1 mmol/l Dithiothreitol (DTT) (Gesamtvolumen 50 µl) gelöst. Die enzymatische Verlängerung erfolgte durch Zugabe von 22 Einheiten Terminale Deoxynukleotidyl-Transferase und Einbau für 16,5 Stunden bei 37ºC.
20 % denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (experimentelle Bedingungen siehe Beispiel 3) zeigen eine fluoreszierende DNA-Bande, die visuell nachgewiesen werden kann.
Ethidiumbromid-Färbung weist ebenfalls daraufhin, daß eine Verlängerung des Oligonukleotids aufgetreten ist.
Kein Einbau kann nachgewiesen werden, falls die Konzentration der Verbindung 13 in der Markierungsmischung 5- bis 10-fach erhöht wird.

Beispiel 9: Einbau der Verbindung 13 in die RNA- Transkripte durch T7-RNA-Polymerase

RNA-Transkripte, die das fluoreszierende Ribonukleotid 13 enthalten, werden nach dem in der europäischen Patentanmeldungen EP 427073 und EP 427074 beschriebenen Verfahren erhalten:
5 µl 5 x Transkriptionspuffer (enthaltend 200 mmol/l Trispuffer pH 8, 50 mmol/l MgCl&sub2;, 50 mmol/l NaCl, 5 mmol/l Dithiothreitol (DTT) und 350 µg/ml RSA), 5 µl einer 5 x Ribonukleosid-Triphosphatmischung (enthaltend 2,5 mmol/l CTP, GTP und UTP und fluoreszierende Verbindung 13 anstelle von ATP), RNA Guard (Pharmacia, 36 Einheiten) und ³²P-UTP (10 µCi) werden mit 100 pg eines 69mer Hairpin-Oligonukleotids (Sequenz, wie in Beispiel 4 beschrieben) und 67 Einheiten von T7 RNA-Polymerase (Pharmacia (Gesamtvolumen 25 µl)) zusammen gegeben. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. 20%ige denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (experimentelle Bedingungen siehe Beispiel 3) und anschließende Autoradiografie kann RNA-Moleküle nachweisen.

Claims

1. Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung der Formel

A - B¹ - B² - B³ - C

entwickelt, worin

A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids oder Nukleosids oder ein Derivat davon bedeutet;

B¹ bedeutet ein divalentes Spacer-Radikal oder eine Einfachbindung;

B² bedeutet ein divalentes Spacer-Radikal;

B³ bedeutet ein divalentes Spacer-Radikal oder eine Einfachbindung; und

C bedeutet ein Cumarinradikal mit der Formel

worin

R¹ Wasserstoff oder Cyano bedeutet;

R² bedeutet Phenyl oder Thiazolyl, gebunden an der 2-, 4- oder 5-Position, worin das Phenyl unsubstituiert oder durch Nitro, Cyano, Amino, -NH-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH&sub2;, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH-, (CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub3;-CH&sub3;, Carboxy, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxycarbonyl, C&sub1;&submin; &sub4;-Alkoxycarbonyloxy, Hydroxy, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylaminocarbonyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylcarbonylamino substituiert ist, und entweder weiter unsubstituiert oder mit C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, Fluor, Chlor oder Brom substituiert ist, und worin das Thiazolyl unsubstituiert oder mit Chlor, Cyano, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxycarbonyl monosubstituiert oder disubstituiert ist, oder das Thiazolyl ist an der 4- und 5-Position mit einem Benzolring fusioniert, der entweder unsubstituiert oder mit Carboxyl, Amino oder Hydroxyl substituiert ist;

R³ bedeutet Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxycarbonyl-C&sub1;&submin;&sub4;-alkyl oder Phenylsulphonyl, worin das C&sub1;&submin; &sub4;-Alkyl unsubstituiert oder durch Hydroxyl, Amino, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxycarbonyl substituiert ist, und worin das Phenylsulphonyl unsubstituiert oder durch Chlor, Brom oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl monosubstituiert oder disubstituiert ist;

oder wo einer der Radikale R² oder R³ eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, Hydroxyl, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub4;- Alkoxycarbonyl bedeutet, oder damit substituiert ist, oder in eine solchen Gruppe durch Hydrolyse oder Hydrierung umgewandelt werden kann.

2. Fluoreszenzmarkierungs -Verbindung nach Anspruch 1, worin

A den Rest eines natürlichen oder synthetischen Nukleotids bedeutet, ausgewählt aus AMP, ADP; ATP; GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me AMP, 2Me ADP, 2Me ATP, 1Me GMP, 1Me GDP, 1Me GTP, 5Me CMP, 5Me CDP, 5Me CTP, 5MeO CMP, 5MeO CDP, 5MeO CTP, Deoxy-, Dideoxy- Nukleotide davon und andere Derivate davon.

3. Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung nach Anspruch 1, worin

B¹, B² und B³ unabhängig oder zusammen eine Spacer-Kette von bis zu ca. 50 Atomen bedeuten, ausgewählt aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, wobei es gegebenenfalls möglich ist, daß B¹ oder B³ eine Einfachbindung bedeuten.

4. Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung nach Anspruch 1, worin

B¹, B² und B³ unabhängig oder zusammen eine Spacer-Kette von ca. 2 - 20 Atomen bedeuten können, ausgewählt aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, wobei es ebenfalls möglich ist, daß B¹ oder B³ eine Einfachbindung bedeuten.

5. Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung nach Anspruch 1, worin

B¹, B² und B³ unabhängig oder zusammen eine Spacer-Kette bedeuten, umfassend ein polyfunktionales Radikal eines Mitglieds ausgewählt aus Peptid, Kohlenwasserstoff, Polyalkohol, Polyether, Polyamin, Polyimin, Polyalkoxid und Kohlenhydrat, wobei es ebenfalls möglich ist, daß B¹ oder B³ eine Einfachbindung bedeuten.

6. Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung nach Anspruch 1, worin

B¹, B² und B³ unabhängig oder zusammen eine Spacer-Kette bedeuten, welche -Glycyl-Glycyl-Glycyl ist oder eine Spacer- Kette, die -NH(CH&sub2;)&sub5;-CO- ist, wobei es ebenfalls möglich ist, daß B¹ oder B³ eine Einfachbindung bedeuten.

7. Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung nach Anspruch 1, worin

R² Phenyl oder Thiazolyl bedeutet, das an der 2-, 4- oder 5- Position verknüpft ist, worin Phenyl unsubstituiert ist, oder durch Carboxyl, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylcarbonyloxy, Amino, -NH-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH&sub2;, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, Cyano, Fluor, Chlor oder Brom substituiert ist, und worin Thiazolyl unsubstituiert ist, oder durch Chlor, Cyano oder Carboxyl substituiert ist, oder das Thiazolyl ist an der 4- und 5-Position mit einem Benzolring fusioniert, der entweder unsubstituiert ist, oder durch Carboxyl oder Amino substituiert ist;

R³ bedeutet Wasserstoff, Methyl, Ethyl, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-OH, -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-NH&sub2; oder -(CH&sub2;)&sub1;&submin;&sub4;-COOH;

oder eines der Radikale R² und R³ bedeutet eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, Hydroxyl, Carboxyl oder C&sub1;&submin;&sub2;- Alkoxycarbonyl oder ist damit substituiert.

8. Fluoreszenzmarkierungs -Verbindung nach Anspruch 1, worin

R² Phenyl oder Thiazolyl, gebunden in der 2-Position, bedeutet, worin Phenyl unsubstituiert ist, oder mit para- Carboxyl, para-Amino, para-NH-C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, para-CH&sub2;-NH&sub2;, Cyano, Methyl oder Ethyl substituiert ist, und worin Thiazolyl unsubstituiert ist, oder durch Chlor, Cyano oder Carboxyl substituiert ist, oder das Thiazolyl ist an der 4- und 5-Position mit einem Benzolring fusioniert, der entweder unsubstituiert ist oder durch Carboxyl oder Amino substituiert ist;

oder eines der Radikale R² und R³ bedeutet eine primäre oder sekundäre Aminogruppe, Hydroxyl oder Carboxyl, oder ist damit substituiert.

9. Fluoreszenzmarkierungs -Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel

oder der Formel

10. Diagnostisches Kit zur Verwendung beim Nachweis auf die Anwesenheit einer bestimmten Nukleinsäure- Sequenz in einer Probe, wobei das Kit eine Fluoreszenzmarkierungs-Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.